KR20220140727A - 비알코올성 지방간염 (nash) 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
비알코올성 지방간염 (nash) 바이오마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
대상체가 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및/또는 간 섬유증을 포함하는 간 질환을 갖는지를 결정하기 위한 방법, 조성물, 및 키트가 제공된다. 다양한 실시형태에서, 대상체의 간 질환은 비-알코올성 지방간염 (NASH)을 포함한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 2월 10일자로 출원된 미국 임시 출원 제62/972,418호의 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 임의의 목적을 위해 본원에 인용되어 포함된다.
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 예를 들어 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증 또는 간세포 풍선화를 갖는 대상체를 식별하기 위한 바이오마커의 검출 및 간 질병의 특징 규명에 관한 것이다. 다양한 실시형태에서, 간 질병은 비알코올성 지방간염 (NASH)을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 개체에서 간 질병을 특징 규명하기 위한 하나 이상의 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트에 관한 것이다.
하기 설명은 정보의 요약을 제공하고, 본원에 제공된 정보 또는 참조된 간행물 중 임의의 것이 본 출원에 대한 선행 기술이라고 인정하는 것이 아니다.
비알코올성 지방간 질병 (NAFLD)은 알코올 병력의 부재하에, 염증 및 섬유증을 갖거나 또는 갖지 않는, 간 지방증의 존재로 정의된다. NAFLD는 비알코올성 지방간 (NAFL)과 비알코올성 지방간염 (NASH)으로 세분된다. NAFL에서 간 지방증은 유의한 염증의 증거 없이 존재하는 반면 NASH에서 간 지방증은 알코올성 지방간염과 조직학적으로 구별할 수 없는 간 염증과 연관된다.
비만의 유병률이 급증한 결과, NAFLD는 전 세계적으로 유행병이 되었고, 북미에서 간 질병의 주요 원인이다. 그러나, NAFL 및 NASH의 발생률에 대한 정확한 인구-기반 데이터는 희소한데, 이는 부분적으로 진단이 조직병리학 문서를 필요로 하기 때문이다. NAFLD의 주요 위험 인자는 복부 비만, 제2형 당뇨병, 혈중 높은 수준의 중성지방 (지방) 및 고혈압이다. 미국에서, NAFLD는 인구의 20 내지 40%에서 존재하고 NASH는 비만 인구의 약 25%에서 존재한다. NASH 환자의 10 내지 29 퍼센트는 간경변이 발병하고, 이들 중 4 내지 27%는 간암이 발병한다.
NASH를 가진 대부분의 사람은 증상을 갖지 않는다. 일부는 우상복부 통증, 간비대, 또는 비특이적 증상 예컨대 복부 불편감, 쇠약, 피로 또는 불쾌감을 가질 수 있다. 의사 또는 간호사는 정기적인 혈액 검사의 결과로부터 NASH의 존재를 의심할 수 있다. NAFLD에서, 간 효소 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)가 종종 높다.
NASH를 확인하기 위한 현재의 최적 표준(gold standard)은 간 생검의 조직학적 평가로, 이는 고가이고, 침습적이며, 통증, 출혈, 또는 심지어 사망을 유발할 수 있다.
NASH를 포함하는 간 질병의 다양한 단계를 식별하고 구별할 수 있는 간단한 혈액 검사 (그리고 그에 따라 간 생검에 대한 필요성을 감소시킴)는 매우 바람직할 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체가 간 질병을 갖는지를 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 또는 간세포 풍선화를 갖는 대상체를 식별하는 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 간 질병은 비알코올성 지방간염 (NASH)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체가 비알코올성 지방간염 (NASH)을 갖는지를 결정하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, NASH를 갖는 대상체를 식별하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, NASH를 갖는 대상체를 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 또는 간세포 풍선화를 갖는 대상체와 구별하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, NASH의 중증도를 결정하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 본원의 방법은 대상체가 간 지방증을 갖는지를 결정하기 위한 것으로, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 1이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, INHBC, 및 BPIB1로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 1 내지 12이거나, 또는 N은 2 내지 12이거나, 또는 N은 3 내지 12이거나, 또는 N은 4 내지 12이거나, 또는 N은 5 내지 12이거나, 또는 N은 1 내지 5이거나, 또는 N은 2 내지 5이거나, 또는 N은 3 내지 5이거나, 또는 N은 4 내지 5이다. 일부 실시형태에서, N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10이거나, 또는 N은 11이거나, 또는 N은 12이다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체가 간 지방증을 갖는지를 결정하는 방법이 제공되고, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 1이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, INHBC, 및 BPIB1로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1 및 INHBC로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, INHBC, 및 BPIB1로부터 선택되고, N개의 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 FBP12, RECQ1, BGLR, CNDP1, SOM2, 및 GRID2로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 적어도 2이고, N개의 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, INHBC, 및 BPIB1로부터 선택되고, N개의 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 INSL5, HEXB, 및 ERN1로부터 선택된다. 일부 이러한 실시형태에서, N개 바이오마커 단백질 각각은 PTGR1, INHBC, BPIB1, FBP12, RECQ1, BGLR, CNDP1, SOM2, GRID2, INSL5, HEXB, 및 ERN1로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 PTGR1, CNDP1, 및 ERN1; PTGR1, INSL5, 및 HEXB; INHBC, HEXB, 및 CNDP1; 또는 BPIB1, CNDP1, INSL5, HEXB, 및 ERN1로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본원의 방법은 대상체가 간 염증을 갖는지를 결정하기 위한 것으로, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 1이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 MAAI, SAA2, RPN1, 및 PCOC2로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 MAAI, SAA2, RPN1, PCOC2, CA198, CTCF, 및 TACD2로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 1 내지 14이거나, 또는 N은 2 내지 14이거나, 또는 N은 3 내지 14이거나, 또는 N은 4 내지 14이거나, 또는 N은 5 내지 14이거나, 또는 N은 6 내지 14이거나, 또는 N은 7 내지 14이거나, 또는 N은 8 내지 14이거나, 또는 N은 1 내지 8이거나, 또는 N은 2 내지 8이거나, 또는 N은 3 내지 8이거나, 또는 N은 4 내지 8이거나, 또는 N은 5 내지 8이다. 일부 실시형태에서, N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10이거나, 또는 N은 11이거나, 또는 N은 12이거나, 또는 N은 13이거나, 또는 N은 14이다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체가 간 염증을 갖는지를 결정하는 방법이 제공되고, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 CA198, CTCF, 및 TACD2; 또는 PPAC, ADIPO, PYY, FCG3B, TRXR1, ACY1, 및 CCL23로부터 선택된다. 일부 이러한 실시형태에서, N개 바이오마커 단백질 각각은 MAAI, SAA2, RPN1, PCOC2, CA198, CTCF, TACD2, PPAC, ADIPO, PYY, FCG3B, TRXR1, ACY1, 및 CCL23로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 PCOC2, PYY, 및 TRXR1; TACD2, TRXR1, 및 ACY1; CA198 및 TRXR1; CA198, FCG3B, 및 ACY1; RPN1, PYY, 및 ACY1; TACD2, PPAC, 및 TRXR1; CTCF, ADIPO, 및 TRXR1; 또는 SAA2, PPAC, 및 ACY1로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본원의 방법은 대상체가 간세포 풍선화를 갖는지를 결정하기 위한 것으로, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 1이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, ATL2, 및 CNN2로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 1 내지 5이거나, 또는 N은 2 내지 5이거나, 또는 N은 3 내지 5이거나, 또는 N은 4 내지 5이거나, 또는 N은 1 내지 2이거나, 또는 N은 1 내지 3이거나, 또는 N은 1 내지 4이다. 일부 실시형태에서, N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체가 간세포 풍선화를 갖는지를 결정하는 방법이 제공되고, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 AK1BA 및 CTLA4로부터 선택된다. 일부 이러한 실시형태에서, N개 바이오마커 단백질 각각은 PTGR1, ATL2, CNN2, AK1BA 및 CTLA4로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, N은 적어도 3이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 3개는 AK1BA, PTGR1, 및 ATL2로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본원의 방법은 대상체가 간 섬유증을 갖는지를 결정하기 위한 것으로, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 1이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 ATL2, NFASC, 및 FCRL3로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, N은 1 내지 8이거나, 또는 N은 2 내지 8이거나, 또는 N은 3 내지 8이거나, 또는 N은 4 내지 8이거나, 또는 N은 5 내지 8이거나, 또는 N은 6 내지 8이거나, 또는 N은 7 내지 8이거나, 또는 N은 1 내지 2이거나, 또는 N은 1 내지 3이거나, 또는 N은 1 내지 4이거나, 또는 N은 1 내지 5이거나, 또는 N은 1 내지 6이거나, 또는 N은 1 내지 7이다. 일부 실시형태에서, N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 대상체가 간 섬유증을 갖는지를 결정하는 방법이 제공되고, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 CO7, COL11, VGFR2, WNT5A, 및 PLOD3로부터 선택된다. 일부 이러한 실시형태에서, N개 바이오마커 단백질 각각은 ATL2, NFASC, FCRL3, CO7, COL11, VGFR2, WNT5A, 및 PLOD3로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 ATL2 및 VGFR2이거나; 또는 ATL2, COL11, 및 WNT5A; 또는 ATL2, CO7, 및 WNT5A로부터 선택된다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 대상체는 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화 및/또는 간 섬유증이 발병할 위험이 있다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 대상체는 NASH가 발병할 위험이 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 대상체는 비만, 복부비만, 대사증후군, 심혈관질환 및 당뇨로부터 선택되는 NASH 동반이환을 가질 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 대상체는 비만일 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플의 단백질 바이오마커를 바이오마커 포획 시약 세트와 접촉시키는 단계를 포함하며, 바이오마커 포획 시약 세트의 각각의 바이오마커 포획 시약은 검출되는 상이한 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 항체 또는 압타머이다. 일부 실시형태에서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 압타머이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 압타머는 느린 오프-속도(off-rate) 압타머이다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 느린 오프-속도 압타머는 변형을 갖는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 각각의 느린 오프-속도 압타머는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프-속도(t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 샘플은 혈청 샘플 및 혈장 샘플로부터 선택될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 간 섬유증, 및/또는 NASH를 갖는 경우, 대상체는 체중 감량, 혈당 조절, 알코올 회피, 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대한 대상체 검사, 대상체에 위우회술(gastric bypass surgery) 수행, 및 대상체에게 약물 투여로부터 선택되는 요법이 권장될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 목적을 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 방법은 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 의료 자원의 이용을 예측 및/또는 관리하기 위해 본 방법으로부터 획득된 정보를 사용하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 N개 바이오마커 단백질 포획 시약을 포함하며, 이는 표 1, 3, 5, 또는 7로부터 선택되는 N개 바이오마커 단백질에 결합하고, N은 적어도 1이다. 일부 실시형태에서, N개 바이오마커 포획 시약 각각은 상이한 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 각각의 포획 시약은 항체 또는 압타머이다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 적어도 하나의 압타머는 느린 오프-속도 압타머일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 각각의 압타머는 느린 오프-속도 압타머일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 느린 오프-속도 압타머는 소수성 변형을 갖는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 각각의 느린 오프-속도 압타머는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프-속도(t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플의 바이오마커를 바이오마커 포획 시약 세트와 접촉시키는 단계를 포함하며, 바이오마커 포획 시약 세트의 각각의 바이오마커 포획 시약은 검출되는 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커 포획 시약 세트의 각각의 바이오마커 포획 시약은 검출되는 상이한 바이오마커에 특이적으로 결합한다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 항체 또는 압타머일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 압타머일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 적어도 하나의 압타머는 느린 오프-속도 압타머일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 적어도 하나의 느린 오프-속도 압타머는 변형을 갖는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형은 소수성 변형이다. 일부 실시형태에서, 변형은 소수성 염기 변형이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 도 1에 나타낸 변형으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 느린 오프-속도 압타머는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프 속도 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합한다.
본원에 기재된 임의의 실시형태에서, 샘플은 혈액 샘플일 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액 샘플은 혈청 샘플 및 혈장 샘플로부터 선택될 수 있다.
도 1은 압타머에 사용될 수 있는 특정 핵염기 변형을 나타낸다.
도 2는 본원에 기재된 다양한 컴퓨터 구현 방법으로 사용하기 위한 비제한적 예시적인 컴퓨터 시스템을 나타낸다.
도 2는 본원에 기재된 다양한 컴퓨터 구현 방법으로 사용하기 위한 비제한적 예시적인 컴퓨터 시스템을 나타낸다.
본 발명은 특정 대표적인 실시형태와 함께 기술될 것이지만, 본 발명은 청구항에 의해 정의되며, 이들 실시형태에 제한되는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다.
당업자는 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 다수의 방법 및 물질이 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있는 것을 인식할 것이다. 본 발명은 결코 기재된 방법 및 물질에 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치, 및 물질이 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있으나, 특정 방법, 장치, 및 물질이 본원에 기재된다.
본원에 언급된 모든 간행물, 공개된 특허 문서, 및 특허 출원은 각각의 개별적인 간행물, 공개된 특허 문서, 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조에 의해 포함되어 나타낸 것과 동일한 수준으로 본원에 참조에 의해 포함된다.
첨부된 청구항을 포함하여, 이 출원에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a," "an," 및 "the")는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수를 포함하며, "적어도 하나" 및 "하나 이상"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 따라서, "하나의 압타머"에 대한 언급은 압타머들의 혼합물을 포함하며, "하나의 탐침"에 대한 언급은 탐침들의 혼합물 등을 포함한다.
본원에 사용된 바, 용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다(includes)", "포함하는(including)", "함유하다(contains)", "함유하는(containing)", 및 이의 임의의 변형은 구성 또는 구성들의 목록을 포함(comprise)하거나, 포함(include)하거나, 또는 함유하는 물질의 공정, 방법, 공정이 기재된 생성물(product-by-process), 또는 조성물이 명확하게 열거되지 않은 다른 구성을 포함할 수 있도록 비-배타적 포함을 망라하도록 의도된다.
본 출원은 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖는지를 결정하기 위한 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트를 포함한다. 본 출원은 또한 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하기 위한 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템, 및 키트는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖는 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하기 위해 제공된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커는 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍성화, 및/또는 NASH를 갖는지를 결정하는 데 단독 또는 다양한 조합으로 사용하기 위해 제공된다. 하기에 상세하게 기재된 바와 같이, 예시적인 실시형태는 표 1, 3, 5, 또는 7에 제공된 바이오마커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커는 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 임의의 단계의 NASH를 갖는지를 결정하는 데 단독 또는 다양한 조합으로 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커는 대상체가 2, 3, 또는 4 단계 NASH를 갖는지를 결정하는 데 단독 또는 다양한 조합으로 사용하기 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체는 이미 간 지방증을 갖는 것으로 알려져 있다. 하기에 상세하게 기재된 바와 같이, 예시적인 실시형태는 표 1, 3, 5, 또는 7에 제공된 바이오마커를 포함하고, 이는 다중 압타머-기반 검정을 사용하여 식별되었다. 일부 실시형태에서, 패널에서 바이오마커의 수 및 정체는 바이오마커 값의 특정 조합에 대한 민감도 및 특이성에 기반하여 선택된다. 용어 "민감도" 및 "특이성"은 생물학적 샘플에서 검출된 하나 이상의 바이오마커 수준을 기반으로 질병을 갖거나 또는 질병을 갖지 않는 것으로 개체를 정확하게 분류하는 능력과 관련하여 본원에 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "민감도" 및 "특이성"은 생물학적 샘플에서 검출된 하나 이상의 바이오마커 수준을 기반으로 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖거나, 또는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖지 않는 것으로 개체를 정확하게 분류하는 능력과 관련하여 본원에 사용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, "민감도"는 이들 간 질환 중 하나를 갖는 개체를 정확하게 분류하는 것과 관련된 바이오마커(들)의 성능을 나타낸다. "특이성"은 이들 간 질환 중 하나를 갖지 않는 개체를 정확하게 분류하는 것과 관련된 바이오마커(들)의 성능을 나타낸다. 예를 들어, 대조군 샘플(예컨대, 간 질환을 갖지 않는 것으로 알려진 건강한 개체 또는 대상체로부터의 샘플) 및 시험 샘플(예컨대, 간 질환을 갖는 개체로부터의 샘플) 세트를 시험하는 데 사용된 바이오마커 패널에 대한 85% 특이성 및 90% 민감도는 대조군 샘플 중 85%가 패널에 의해 대조군 샘플로 정확하게 분류되며, 시험 샘플 중 90%가 패널에 의해 시험 샘플로 정확하게 분류된 것을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 바이오마커 패널의 전체 성능은 곡선 아래 면적(AUC) 값으로 나타난다. AUC 값은 수신자 조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 곡선으로부터 유도되고, 이는 본원에 예시된다. ROC 곡선은 시험의 위양성율(1-특이성)에 대한 시험의 진양성율(민감도)의 도표이다. 용어 "곡선 아래 면적" 또는 "AUC"는 수신자 조작 특성(ROC) 곡선의 곡선 아래 면적을 지칭하며, 이들 모두는 당업계에 잘 알려진다. AUC 척도는 완전한 데이터 범위에 걸친 분류기의 정확도를 비교하는 데 유용하다. 더 높은 AUC를 갖는 분류기는 관심 하의 2개의 그룹들(예를 들어, 정상 개체 및 간 질환을 갖는 개체) 사이에서 미지의 것을 정확하게 분류하는 더 높은 역량을 갖는다. ROC 곡선은 2개의 집단들 사이를 구별하는 특정 특성(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 바이오마커 및/또는 추가적인 생체의학적 정보의 임의의 항목)의 성능을 도표화하는 데 유용하다. 전형적으로, 전체 집단에 걸친 특성 데이터는 단일 특성 값을 기반으로 오름차순으로 분류된다. 이어서, 그 특성에 대한 각각의 값에 대해, 데이터에 대한 진양성율 및 위양성율이 계산된다. 진양성율은 그 특성에 대한 값을 초과하는 경우의 수를 센 다음 총 경우의 수로 나눠서 결정된다. 위양성율은 그 특성에 대한 값을 초과하는 대조군의 수를 센 다음 대조군의 총 수로 나눠서 결정된다. 이 정의는 특성이 대조군과 비교하는 경우에 상승되는 시나리오를 지칭하지만, 이 정의는 또한 특성이 대조군과 비교하는 경우에 더 낮은 시나리오(이러한 시나리오에서는, 그 특성에 대한 값 미만의 샘플을 셀 것임)에 적용된다. ROC 곡선은 단일 특성뿐만 아니라 다른 단일 산출량에 대해 생성될 수 있으며, 예를 들어 둘 이상의 특성의 조합이 수학적으로 조합(예를 들어, 덧셈, 뺄셈, 곱셈 등)되어 단일 합값을 제공할 수 있고, 이 단일 합값은 ROC 곡선으로 도표화될 수 있다. 추가로, 단일 산출량 값을 유도하는 다수의 특성의 임의의 조합이 ROC 곡선으로 도표화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플 내의 N개의 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하며, N은 적어도 1이고, N개의 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 대상체로부터의 샘플 내의 PTGR1, INHBC, 및 BPIB1; MAAI, SAA2, RPN1, 및 PCOC2; PTGR1, ATL2, 및 CNN2; 또는 ATL2, NFASC, 및 FCRL3로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 또는 간 섬유증을 각각 갖는지를 결정하기 위한 것이다. 일부 이러한 실시형태에서, 방법은 대상체로부터의 샘플 또는 샘플의 일부를 적어도 하나의 포획 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 각각의 포획 시약은 수준이 검출되는 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 방법은 샘플 또는 샘플로부터의 단백질을 적어도 하나의 압타머와 접촉시키는 단계를 포함하며, 각각의 압타머는 수준이 검출되는 N개의 바이오마커 단백질 중 하나에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바, "비알코올성 지방간 질병" 또는 "NAFLD"는 과도한 알코올 사용의 부재하에, 염증 및 섬유증을 갖거나 또는 갖지 않는, 간에 지방이 침착되는 질환 (간 지방증)을 지칭한다.
본원에 사용된 바, “간 지방증”은 과도한 알코올 사용의 부재하에 경증, 중등도, 및 중증의 간 지방증을 포함한다.
본원에 사용된 바, "비알코올성 지방간염" 또는 "NASH"는 간에 염증 및/또는 섬유증이 있는 NAFLD를 지칭한다. NASH는 4 단계로 구분될 수 있다. NASH의 단계를 결정하는 예시적인 방법은, 예를 들어, Kleiner 등, 2005, Hepatology, 41(6):1313-1321, 및 Brunt 등, 2007, Modern Pathol., 20:S40-S48에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바, 대상체와 관련된 "비만"은 30 이상의 BMI를 갖는 대상체를 지칭한다.
"생물학적 샘플", "샘플", 및 "시험 샘플"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 개체로부터 획득되거나 달리 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직, 또는 세포를 지칭한다. 이는 혈액(전혈, 백혈구, 말초 혈액 단핵 세포, 백혈구 연층(buffy coat), 혈장, 및 혈청), 가래, 눈물, 점액, 세비액, 비강 흡인물(nasal aspirate), 소변, 타액, 복강안 세척물(peritoneal washing), 복수, 낭종액(cystic fluid), 선액, 림프액, 기관지 흡인물, 관절액, 관절 흡인물, 장기 분비물(organ secretion), 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액을 포함한다. 이는 또한 전술한 모든 것의 실험적으로 분리된 분획을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플을 혈청, 혈장, 또는 특정 유형의 혈액 세포, 예컨대 적혈구 또는 백혈구(white cells)(백혈구(leukocytes))를 함유하는 분획으로 분할될 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플은 개체로부터의 샘플들의 조합, 예컨대 조직과 체액 샘플의 조합일 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한 예를 들어 대변 샘플, 조직 샘플, 또는 조직 생검으로부터와 같은 균질화 고체 물질을 함유하는 물질을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 또한 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유래된 물질을 포함한다. 생물학적 샘플을 획득하기 위한 임의의 적합한 방법이 이용될 수 있으며; 예시적인 방법은 예를 들어 사혈, 면봉 채취법(예를 들어, 구강 면봉 채취법), 및 세침 흡인 생검 절차를 포함한다. 세침 흡인에 민감한 예시적인 조직은 림프절, 폐, 갑상선, 유방, 췌장, 및 간을 포함한다. 샘플은 또한 예를 들어 현미 해부(예를 들어, 레이저 포착 현미 해부(LCM) 또는 레이저 현미 해부(LMD)), 방광 세척, 도말(예를 들어, PAP 도말), 또는 젖관 세척에 의해 수집될 수 있다. 개체로부터 획득되거나 또는 유래된 "생물학적 샘플"은 개체로부터 획득된 후 임의의 적합한 방식으로 처리되었던 임의의 이러한 샘플을 포함한다.
추가로, 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 다수의 개체로부터 생물학적 샘플을 취하고, 이들을 모으거나 또는 각각의 개체의 생물학적 샘플의 분취량을 모음으로써 얻을 수 있다. 모은 샘플은 단일 개체로부터의 샘플에 대해 본원에 기재된 바와 같이 처리될 수 있으며, 예를 들어, 안 좋은 예후가 모은 샘플에서 입증된 경우, 각각의 개별적인 생물학적 샘플은 이어서 재시험되어 어느 개체(들)가 지방증 및/또는 NASH를 갖는지 결정할 수 있다.
"표적", "표적 분자", 및 "피분석물"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 생물학적 샘플 내에 존재할 수 있는 관심 하의 임의의 분자를 지칭한다. "관심 하의 분자"는 단백질의 경우에서와 같은 특정 분자의 임의의 약간의 변형, 예를 들어 아미노산 서열에서의 약간의 변형, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 분자의 정체성을 실질적으로 변경하지 않는 표지 성분과의 접합을 포함한다. "표적 분자", "표적", 또는 "피분석물"은 분자 또는 다분자 구조의 하나의 유형 또는 종들의 복제물 세트를 지칭한다. "표적 분자", "표적", 및 "피분석물"은 분자, 또는 다분자 구조의 하나 초과의 유형 또는 종들을 지칭한다. 예시적인 표적 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 아피바디(affybody), 항체 모방체, 바이러스, 병원균, 독성 물질, 기질, 대사산물, 전이 상태 유사체, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직, 및 전술한 것 중 임의의 것의 임의의 단편 또는 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 단백질이며, 이 경우, 표적 분자는 "표적 단백질"로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바, "포획제" 또는 "포획 시약"은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. "표적 단백질 포획 시약"은 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 비제한적 예시적인 포획 시약은 압타머, 항체, 애드넥틴(adnectin), 안키린, 다른 항체 모방체 및 다른 단백질 스캐폴드, 자가항체, 키메라, 저분자, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 각인 중합체(imprinted polymer), 아비머(avimer), 펩티드모방체, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 합성 수용체, 및 상기 언급된 포획 시약 중 임의의 것의 변형 및 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포획 시약은 압타머 및 항체로부터 선택된다.
용어 "항체"는 임의의 종의 전장 항체 및 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단쇄 항체, Fv 단편, 및 단쇄 Fv 단편을 포함하는 이러한 항체의 단편 및 유도체를 지칭한다. 용어 "항체"는 또한 파지 디스플레이-유도 항체 및 단편, 아피바디, 나노바디 등과 같은 합성-유도된 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바, "마커" 및 "바이오마커"는 상호 교환적으로 사용되어 개체에서의 정상 또는 비정상 과정, 또는 개체에서의 질병 또는 다른 질환을 나타내거나 이의 징후인 표적 분자를 지칭한다. 보다 구체적으로, "마커" 또는 "바이오마커"는 정상이거나 비정상인지 및 비정상인 경우, 만성이거나 급성인지 특정 생리학적 상태 또는 과정의 존재와 연관된 해부학적, 생리학적, 생화학적, 또는 분자적 파라미터이다. 바이오마커는 실험실 검정 및 의학 영상을 포함하는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있으며, 측정 가능하다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 표적 단백질이다.
본원에 사용된 바, "바이오마커 수준" 및 "수준"은, 생물학적 샘플 내의 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 이루어지며, 생물학적 샘플 내의 바이오마커의, 또는 이에 대한, 또는 이에 상응하는 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가, 수준, 발현 수준, 측정된 수준의 비 등을 나타내는 측정량을 지칭한다. "수준"의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하는 데 이용된 특정 분석 방법의 구체적인 설계 및 성분에 의존한다.
표적 분자의 "대조군 수준"은 질병 또는 질환을 갖지 않는 개체로부터, 또는 질병 또는 질환을 갖는 것으로 의심되지 않는 개체로부터의 동일한 샘플 유형의 표적 분자의 수준을 지칭한다. 표적 분자의 "대조군 수준"은 본 방법이 수행될 때마다 결정될 필요가 없으며, 특정 샘플 내의 수준이 정상 수준보다 더 높거나 더 낮은지를 결정하기 위한 참조 또는 역치로 사용되는 사전에 결정된 수준일 수 있다.
본원에 사용된 바, "개체" 및 "대상체"는 상호 교환적으로 사용되어 시험 대상체 또는 환자를 지칭한다. 개체는 포유 동물 또는 비-포유 동물일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 개체는 포유 동물이다. 포유 동물 개체는 인간 또는 비-인간일 수 있다. 다양한 실시형태에서, 개체는 인간이다. 건강하거나 또는 정상인 개체는 관심 하의 질병 또는 질환(예컨대, NASH)이 종래의 진단 방법에 의해 검출될 수 없는 개체이다.
"진단하다", "진단하는", "진단", 및 이의 변형은 그 개체에 관한 하나 이상의 징후, 증상, 데이터, 또는 다른 정보를 기초로 하는 개체의 건강 상황 또는 상태의 발견, 결정, 또는 인식을 지칭한다. 개체의 건강 상황은 건강한 / 정상인 것으로 진단(즉, 질병 또는 질환의 부재의 진단)되거나, 아픈 / 비정상인 것으로 진단(즉, 질병 또는 질환의 존재의 진단 또는 이의 특징의 평가)될 수 있다. 용어 "진단하다", "진단하는", "진단" 등은 특정 질병 또는 질환과 관련하여 질병의 초기 발견; 질병의 특징 규명 또는 분류; 질병의 경과, 차도, 또는 재발의 발견; 및 치료 또는 요법이 개체에 투여된 후 질병 반응의 발견을 포괄한다.
"예후하다", "예후하는", "예후", 및 이의 변형은 질병 또는 질환을 갖는 개체에서의 질병 또는 질환의 향후 과정의 예측(예를 들어, 환자 생존을 예측)을 지칭하며, 이러한 용어는 치료 또는 요법이 개체에 투여된 후 질병 반응의 평가를 포괄한다.
"평가하다", "평가하는", "평가", 및 이의 변형은 "진단하다" 및 "예후하다" 둘 모두를 포괄하며, 질병을 갖지 않는 개체에서의 질병 또는 질환의 향후 과정에 대한 결정 또는 예측뿐만 아니라 질병 또는 질환이 명백하게 질병이 치유되었던 개체에서 재발생될 가능성에 관한 결정 또는 예측을 또한 포괄한다. 용어 "평가하다"는 또한 예를 들어 개체가 치료제에 유리하게 반응할 것 같은지 또는 치료제에 반응하지 않을 것 같은지(또는 예를 들어 유독성 또는 다른 바람직하지 않은 부작용을 경험할 것임)를 예측하는 것, 개체에 투여하기 위한 치료제를 선택하는 것, 또는 개체에 투여되었던 요법에 대한 개체의 반응을 모니터하거나 결정하는 것과 같은 요법에 대한 개체의 반응을 평가하는 것을 포괄한다. 따라서, NASH를 "평가하는 것"은 예를 들어 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 개체에서 NASH의 향후 과정을 예후하는 것; 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화가 NASH로 진행될 것인지 예측하는 것; 특정 단계의 NASH가 더 높은 단계의 NASH로 진행할 것인지 예측하는 것; 등.
본원에 사용된 바, 바이오마커 수준과 관련하여 "검출하는" 또는 "결정하는"은 바이오마커 수준에 상응하는 신호를 관찰하고 보고하기 위해 사용되는 기기 및 그 신호를 발생하는 데 필요한 물질/들 둘 모두의 사용을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 수준은 형광, 화학발광, 표면 플라즈몬 공명, 표면 탄성파, 질량 분광법, 적외선 분광법, 라만 분광법, 원자힘현미경법, 주사 터널링 현미경법, 전자화학적 검출 방법, 핵자기 공명, 퀀텀닷 등을 포함하는 임의의 적합한 방법을 사용하여 검출된다.
본원에 사용된 바, "간 지방증을 갖는 대상체"는 간 지방증으로 진단되었던 대상체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 간 지방증은 일반적으로 NAFLD 또는 NASH에 대해 상기에 기재된 방법에 의해 진단된다.
본원에 사용된 바, "NASH를 갖는 대상체"는 NASH로 진단되었던 대상체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, NASH는 일반적으로 NAFLD에 대해 상기에 기재된 방법에 의해 진단된다. 일부 실시형태에서, 진행된 간 섬유증은 예를 들어 Gambino R 등, Annals of Medicine 2011;43(8):617-49에 따라, NAFLD를 가진 환자에게서 진단된다.
본원에 사용된 바, "간 지방증이 발병할 위험이 있는 대상체"는 간 지방증을 갖는 것으로 진단되지 않았지만, 하나 이상의 NASH 동반이환, 예컨대 비만, 복부비만, 대사증후군, 심혈관질환, 및 당뇨를 갖는 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바, "NASH가 발병할 위험에 있는 대상체"는 하나 이상의 NASH 동반이환, 예컨대 비만, 복부비만, 대사증후군, 심혈관질환, 및 당뇨를 지속적으로 갖는 간 지방증을 갖는 대상체를 지칭한다.
"고체 지지체"는 분자가 공유 또는 비-공유 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 갖는 임의의 기질을 본원에서 지칭한다. "고체 지지체"는 예를 들어 막; 칩(예를 들어, 단백질 칩); 슬라이드(예를 들어, 유리 슬라이드 또는 커버슬립); 컬럼; 중공(hollow), 고체, 반-고체(semi-solid), 기공- 또는 공동(cavity)- 함유 입자, 예컨대, 예를 들어 비드; 젤; 광섬유 재료를 포함하는 섬유; 매트릭스; 및 샘플 용기를 포함할 수 있는 다양한 물리적 형태를 가질 수 있다. 예시적인 샘플 용기는 샘플 웰, 튜브, 모세관, 바이얼, 및 임의의 다른 용기, 샘플을 수용할 수 있는 홈 또는 오목 자국(indentation)을 포함한다. 샘플 용기는 마이크로타이터 판(microtiter plate), 슬라이드, 미세유체(microfluidics) 장치 등과 같은 다중-샘플 플랫폼 상에 보유될 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 재료, 유기 또는 무기 재료로 구성될 수 있다. 포획 시약이 그 상부에 부착되는 고체 지지체의 조성은 일반적으로 부착 방법(예를 들어, 공유 부착)에 의존한다. 다른 예시적인 용기는 조절된 미세액적(microdroplet) 및 미세유체, 또는 벌크 오일/수성 에멀션을 포함하며, 그 내부에서 검정 및 관련 조작이 발생할 수 있다. 적합한 고체 지지체는 예를 들어 플라스틱, 수지, 다당류, 실리카 또는 실리카계 재료, 기능화 유리, 개질된 규소, 탄소, 금속, 무기 유리, 막, 나일론, 천연 섬유(예컨대 예를 들어, 실크, 모직, 및 면직물), 중합체 등을 포함한다. 고체 지지체를 구성하는 재료는 포획 시약의 부착을 위해 사용되는 예를 들어 카복시, 아미노, 또는 하이드록실기와 같은 반응성 기를 포함할 수 있다. 중합체 고체 지지체는 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴로니트릴, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 부틸 고무, 스티렌부타디엔 고무, 천연 고무, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, (폴리)테트라플루오로에틸렌, (폴리)비닐리덴플로라이드, 폴리카보네이트, 및 폴리메틸펜텐을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 고체 지지체 입자는 예를 들어 암호화 입자, 예컨대 Luminex®-유형 암호화 입자, 자성 입자, 및 유리 입자를 포함한다.
바이오마커의 예시적인 용도
다양한 예시적인 실시형태에서, 경증, 중등도, 또는 중증의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화일 수 있는, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 대상체가 갖는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 표 1, 3, 5, 또는 7에 열거된 바이오마커 단백질로부터의 N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계 및 대상체로부터의 샘플 내의 패널의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 N은 적어도 1인, 경증, 중등도, 또는 중증의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화일 수 있는, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 대상체가 갖는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 대상체가 NASH를 갖는지를 결정하기 위해 대상체로부터의 샘플 내의 표 1, 3, 5, 또는 7에 열거된 적어도 하나의 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 경증, 중등도, 또는 중증의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화일 수 있는, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 대상체가 갖는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다.
다양한 실시형태에서, 경증, 중등도, 또는 중증의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화일 수 있는, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 대상체가 갖는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 다양한 실시형태에서, 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH일 수 있거나, 2, 3, 또는 4 단계 NASH일 수 있는 NASH를 대상체가 갖는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖는 대상체가 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH일 수 있거나, 2, 3, 또는 4 단계 NASH일 수 있는 NASH를 갖는지를 결정하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, NASH의 조직학적 단계화를 특징 규명하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법은 본원에 기재된 임의의 분석 방법을 포함하는 임의의 수의 분석 방법에 의해, 혈청 또는 혈장과 같은 개체의 순환에 존재하는 하나 이상의 바이오마커에 상응하는 하나 이상의 바이오마커 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 이들 바이오마커는, 예를 들어 정상 개체 (정상 개체는 비만인 개체일 수 있음)와 비교하여 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 정상 개체 (정상 개체는 비만인 개체일 수 있음)와 비교하여 NASH (예컨대 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH, 또는 2, 3, 또는 4 단계 NASH)를 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 경증, 중등도, 또는 중증의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화일 수 있는, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖는 대상체와 비교하여 NASH (예컨대 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH, 또는 2, 3, 또는 4 단계 NASH)를 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 정상 개체 (정상 개체는 비만인 개체일 수 있음)와 비교하여 간 지방증을 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 정상 개체 (정상 개체는 비만인 개체일 수 있음)와 비교하여 간 염증을 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 정상 개체 (정상 개체는 비만인 개체일 수 있음)와 비교하여 간세포 풍선화를 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커는 정상 개체 (정상 개체는 비만인 개체일 수 있음)와 비교하여 간 섬유증을 갖는 개체에서 상이한 수준으로 존재한다.
개체에서의 바이오마커의 상이한 수준의 검출은 예를 들어 개체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 갖는지 또는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖는 개체가 NASH가 발병했는지를 결정하도록 하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 바이오마커는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH의 발병에 대해 개체 (예컨대 비만인 개체)를 모니터하거나, 또는 NASH의 발병에 대해 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 및/또는 간세포 풍선화를 갖는 개체를 모니터하는 데 사용될 수 있다.
본원의 기재된 임의의 바이오마커는 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 갖는지를 결정하는 데 사용될 수 있는 방식의 일 예로서, 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH로 진단되지는 않았지만, 하나 이상의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH 동반이환을 갖는 개체에서의 기재된 바이오마커 중 하나 이상의 수준은 개체가 간 생검과 같은 침습적 검사를 사용하여 결정될 것보다 더 초기 단계에서 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH가 발병되었음을 나타낼 수 있다. 본 방법은 비-침습적이기 때문에, 이들은 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH가 발병할 위험이 있는 개체 (예컨대, 예를 들어, 비만인 개체)를 모니터하는 데 사용될 수 있다. 더 초기 단계에서 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 검출함으로써, 의료 개입은 더 효과적일 수 있다. 이러한 의료 개입은 체중 감량, 혈당 조절, 알코올 회피, 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대한 대상체 검사, 대상체에 위우회술 수행, 및 대상체에게 약물 투여를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 일부 이러한 실시형태에서, 약물은 피오글리타존, 비타민 E, 및/또는 메트포르민이다. 예를 들어, Sanyal 등, 2010, NEJM, 362: 1675-1685를 참조한다. 일부 예에서, 이러한 초기 개입이 간부전 및 간 이식에 대한 필요성을 지연시키거나 또는 예방할 수 있다.
유사하게, 본원에 기재된 바이오마커가 지방증을 갖는 대상체가 NASH가 발병되고 있는지를 결정하는 데 사용될 수 있는 방식의 추가적인 예로서, 지방증을 갖는 개체에서의 기재된 바이오마커 중 하나 이상의 수준은 개체가 NASH가 발병하고 있음을 나타낼 수 있다. 본 방법은 비-침습적이기 때문에, 지방증을 갖는 개체는 NASH의 발병에 대해 모니터될 수 있다. 더 초기 단계에서 NASH를 검출함으로써, 의료 개입은 더 효과적일 수 있다. 이러한 의료 개입은 체중 감량, 혈당 조절, 알코올 회피, 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대한 대상체 검사, 대상체에 위우회술 수행, 및 대상체에게 약물 투여를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 일부 이러한 실시형태에서, 약물은 피오글리타존, 비타민 E, 및/또는 메트포르민이다. 예를 들어, Sanyal 등, 2010, NEJM, 362: 1675-1685를 참조한다. 일부 예에서, 이러한 초기 개입이 간부전 및 간 이식에 대한 필요성을 지연시키거나 또는 예방할 수 있다.
또한, 일부 실시형태에서, 시간의 경과에 따른 개체에서의 하나 이상의 바이오마커의 상이한 발현 수준은 특정 치료 요법에 대한 개체의 반응을 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, 추적 모니터링 동안 하나 이상의 바이오마커의 발현에서의 변화는 특정 요법이 효과적인 것을 나타낼 수 있거나, 치료 요법이 더 적극적으로 혈당을 조절하거나, 더 적극적으로 중량 감량을 추구하는 것 등에 의한 것과 같은 일부 방식으로 변경되어야 함을 시사할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시간에 경과에 따른 개체에서의 하나 이상의 바이오마커의 일정한 발현 수준은 개체의 지방증이 악화되지 않고 있거나, 또는 NASH가 발병되지 않고 있다는 것을 나타낼 수 있다.
독립형 진단 시험으로 바이오마커 수준을 시험하는 것 이외에, 바이오마커 수준은 또한 질병의 이환성의 증가된 위험의 표시인 단일 뉴클레오티드 다형성(SNPs), 또는 다른 유전자 병변 또는 변이의 결정과 함께 수행될 수 있다. (예를 들어, Amos 등, Nature Genetics 40, 616-622 (2009) 참조).
독립형 진단 시험으로서 바이오마커 수준을 시험하는 것 이외에, 바이오마커 수준은 또한 다른 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH 스크리닝 방법, 예컨대 확대된 간의 감지, 혈액 검사 (예를 들어, ALT 및/또는 AST와 같은 특정 간 효소의 상승을 검출하기 위함), 복부 초음파, 및 간 생검과 함께 수행될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 바이오마커를 사용하는 방법은 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH에 대한 더 적극적인 치료, 더 빈번한 추적 스크리닝 등을 실시하는 데 의료적 및 경제적 정당화를 용이하게 할 수 있다. 바이오마커는 또한 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH가 발병할 위험이 있지만, 이들 간 질병으로 진단되지 않았던 개체에게, 진단 시험이 이들은 상기 질병이 발병할 가능성이 있다고 나타내는 경우, 치료를 시작하는 데 사용될 수 있다.
다른 NAFLD 진단 방법과 함께 바이오마커 수준을 시험하는 것에 더하여, 바이오마커에 대한 정보는 또한 다른 유형의 데이터, 특히 NAFLD에 대한 개체의 위험을 나타내는 데이터와 함께 평가될 수 있다. 이러한 다양한 데이터는 자동화 방법, 예컨대 컴퓨터 프로그램/소프트웨어로 평가될 수 있으며, 이는 컴퓨터 또는 다른 기구/장치에서 구현될 수 있다.
바이오마커 및 바이오마커 수준의 검출 및 결정
본원에 기재된 바이오마커에 대한 바이오마커 수준은 임의의 다양한 알려진 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일 실시형태에서, 바이오마커 수준은 포획 시약을 사용하여 검출된다. 다양한 실시형태에서, 포획 시약은 용액 중 바이오마커에 노출될 수 있거나, 또는 포획 시약이 고체 지지체 상에 고정될 때 바이오마커에 노출될 수 있다. 다른 실시형태에서, 포획 시약은 고체 지지체 상의 2차 특성부(secondary feature)와 반응성인 특성부를 보유한다. 이들 실시형태에서, 포획 시약은 용액 중 바이오마커에 노출될 수 있으며, 이어서 포획 시약 상의 특성부가 고체 지지체 상의 2차 특성부와 함께 사용되어 고체 지지체 상에 바이오마커를 고정할 수 있다. 포획 시약은 실시되는 분석의 유형을 기반으로 선택된다. 포획 시약은 압타머, 항체, 애드넥틴, 안키린, 다른 항체 모방체 및 다른 단백질 스캐폴드, 자가항체, 키메라, 저분자, F(ab')2 단편, 단쇄 항체 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 아피바디, 나노바디, 각인 중합체, 아비머, 펩티드모방체, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 및 합성 수용체, 및 이들의 변형 및 단편을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
일부 실시형태에서, 바이오마커 수준은 바이오마커/포획 시약 복합체를 사용하여 검출된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커 수준은 바이오마커/포획 시약 복합체로부터 유도되며, 예를 들어 바이오마커/포획 시약의 상호 작용에 후속되나 바이오마커/포획 시약 복합체의 형성에 의존하는 반응의 결과와 같이 간접적으로 검출된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커 수준은 생물학적 샘플 내의 바이오마커로부터 직접 검출된다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 생물학적 샘플 내의 2개 이상의 바이오마커가 동시 검출되도록 하는 다중 형식을 사용하여 검출된다. 다중 형식의 일부 실시형태에서, 포획 시약은 고체 지지체 상의 별개의 위치에 직접 또는 간접적으로, 공유 또는 비-공유적으로 고정된다. 일부 실시형태에서, 다중 형식은 별개의 고체 지지체를 사용하며, 여기서 각각의 고체 지지체는 예를 들어 퀀텀닷과 같이 고체 지지체와 연관된 고유한 포획 시약을 갖는다. 일부 실시형태에서, 개별적인 장치가 생물학적 샘플 내에서 검출되는 다수의 바이오마커 중 각각의 하나의 검출에 사용된다. 개별적인 장치는 생물학적 샘플 내 각각의 바이오마커가 동시 처리되도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 마이크로타이터 판이 사용되어 판 내 각각의 웰이 생물학적 생물 내에서 검출되는 다수의 바이오마커 중 하나 이상을 분석하는 데 사용되도록 할 수 있다.
하나 이상의 전술한 실시형태에서, 형광 태그가 바이오마커/포획 시약 복합체의 성분을 표지하여 바이오마커 수준을 검출할 수 있도록 사용될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 형광 표지는 알려진 기술을 사용하여 본원에 기재된 임의의 바이오마커에 특이적인 포획 시약과 접합될 수 있으며, 이어서 형광 표지는 상응하는 바이오마커 수준을 검출하는 데 사용될 수 있다. 적합한 형광 표지는 희토류 킬레이트, 형광물질 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 알로피코시아닌, PBXL-3, Qdot 605, 리사민, 피코에리트린, 텍사스 레드, 및 다른 이러한 화합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 형광 표지는 형광 염료 분자이다. 일부 실시형태에서, 형광 염료 분자는 인돌륨 고리 중 3-탄소 상의 치환기가 화학적으로 반응성 기 또는 컨쥬게이트 물질(conjugated substance)을 함유하는 적어도 하나의 치환된 인돌륨 고리 시스템을 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료 분자는 예를 들어 AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680, 또는 AlexaFluor 700과 같은 AlexFluor 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료 분자는 예를 들어 2개의 상이한 AlexaFluor 분자와 같이 제1 유형 및 제2 유형의 염료 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 염료 분자는 제1 유형 및 제2 유형의 염료 분자를 포함하며, 2개의 염료 분자는 상이한 방출 스펙트럼을 갖는다.
형광은 광범위한 범위의 검정 형식과 상용성인 다양한 기기로 측정될 수 있다. 예를 들어, 분광 형광계가 마이크로타이터 판, 현미경 슬라이드, 인쇄된 배열(printed arrays), 큐벳 등을 분석하도록 고안되었다. Principles of Fluorescence Spectroscopy, by J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004를 참조한다. Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, January 2002를 참조한다.
하나 이상의 실시형태에서, 화학발광 태그가 선택적으로 바이오마커/포획 복합체의 성분을 표지하여 바이오마커 수준을 검출할 수 있도록 사용될 수 있다. 적합한 화학발광 물질은 옥살릴 클로라이드, 로다민 6G, Ru(bipy)3 2+ , TMAE(테트라키스(디메틸아미노)에틸렌), 피로갈롤(1,2,3-트리하이드록시벤젠), 루시게닌, 퍼옥시옥살레이트, 아릴 옥살레이트, 아크리디늄 에스테르, 디옥세탄 등 중 임의의 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 검출 방법은 바이오마커 수준에 상응하는 검출 가능한 신호를 발생하는 효소/기질 조합을 포함한다. 일반적으로, 효소는 분광 측정법, 형광, 및 화학발광을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 색소 생산성 기질의 화학적 변경을 촉매한다. 적합한 효소는 예를 들어 루시페라아제, 루시페린, 말산 탈수소효소, 우레아제, 겨자무과산화효소(HRPO), 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 글리코아밀라아제, 라이소자임, 포도당 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 포도당-6-포스페이트 탈수소효소, 우리카아제, 잔틴 산화효소, 락토퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 검출 방법은 측정 가능한 신호를 발생하는 형광, 화학발광, 방사성 핵종, 또는 효소/기질 조합의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중 모드 신호 전달은 바이오마커 검정 형식에서 고유하고, 이로운 특징을 가질 수 있었다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이오마커에 대한 바이오마커 수준은 하기 논의되는 단일 압타머 검정, 다중 압타머 검중, 단일 또는 다중 면역검정, mRNA 발현 프로파일링(expression profiling), miRNA 발현 프로파일링, 질량 분광 분석, 조직학적/세포학적 방법 등을 포함하는 임의의 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
압타머 기반 검정을 사용한 바이오마커 수준의 결정
생물학적 샘플 및 다른 샘플 내의 생리학적으로 유의미한 분자의 검출 및 정량에 대한 검정은 과학적 연구 및 헬스 케어 분야에서 중요한 도구이다. 이러한 검정 중 한 부류는 고체 지지체 상에 고정된 하나 이상의 압타머를 포함하는 마이크로어레이의 사용을 포함한다. 압타머는 각각 고도로 특이적인 방식으로 그리고 매우 높은 친화도로 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "핵산 리간드"인 미국 특허 제5,475,096호를 참조하고; 또한, 예를 들어, 미국 특허 제6,242,246호, 미국 특허 제6,458,543호, 및 미국 특허 제6,503,715호를 참조하며, 이들 각각은 발명의 명칭은 "핵산 리간드 진단 바이오칩"이다. 일단 마이크로어레이가 샘플과 접촉되면, 압타머는 샘플 내에 존재하는 이들의 각각의 표적 분자에 결합하며, 따라서 바이오마커에 상응하는 바이오마커 수준을 결정할 수 있다.
본원에 사용된 바, "압타머"는 표적 분자, 예컨대 바이오마커 단백질에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 핵산을 지칭한다. 친화도 상호 작용은 정도 문제이지만, 이 맥락에서, 이의 표적에 대한 압타머의 "특이적인 결합 친화도"는 압타머가 시험 샘플 내 다른 성분에 결합하는 것보다 일반적으로 훨씬 더 높은 정도의 친화도로 이의 표적에 결합하는 것을 의미하는 것으로 인식된다. "압타머"는 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나의 유형 또는 종들의 핵산 분자의 복제물 세트이다. 압타머는 임의의 수의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "압타머"는 하나 초과의 이러한 분자 세트를 지칭한다. 상이한 압타머는 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 압타머는 DNA 또는 RNA 또는 화학적으로 변형된 핵산일 수 있으며, 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있거나 이중 가닥 영역을 보유할 수 있고, 더 고차원의 구조를 포함할 수 있다. 압타머는 또한 광압타머(photoaptamer)일 수 있으며, 광반응성 또는 화학적으로 반응성 작용기가 압타머 내에 포함되어 이의 상응하는 표적에 공유적으로 연결되도록 한다. 본원에 개시된 임의의 압타머 방법은 동일한 표적 분자에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 하기 추가로 기재된 바, 압타머는 태그를 포함할 수 있다. 압타머가 태그를 포함하는 경우, 압타머의 모든 복제물이 동일한 태그를 가질 필요는 없다. 더욱이, 상이한 압타머가 각각 태그를 포함하는 경우, 이들 상이한 압타머는 동일한 태그 또는 상이한 태그를 가질 수 있다.
압타머는 SELEX 공정을 포함하는 임의의 알려진 방법을 사용하여 식별될 수 있다. 일단 식별되면, 압타머는 화학적 합성 방법 및 효소적 합성 방법을 포함하는 임의의 알려진 방법에 따라 제조되거나 합성될 수 있다.
용어 "SELEX" 및 "SELEX 공정"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되어 일반적으로 (1) 예를 들어 단백질에 높은 친화도로 결합하는 바람직한 방식으로 표적 분자와 상호 작용하는 압타머의 선택과 (2) 이러한 선택된 핵산의 증폭의 조합을 지칭한다. SELEX 공정은 특이적인 표적 또는 바이오마커에 높은 친화도를 갖는 압타머를 식별하는 데 사용될 수 있다.
SELEX는 일반적으로 핵산의 후보 혼합물을 제조하는 단계, 후보 혼합물이 소기의 표적 분자에 결합하여 친화 복합체(affinity complex)를 형성하는 단계, 친화 복합체를 결합되지 않은 후보 핵산으로부터 분리하는 단계, 핵산을 친화 복합체로부터 분리 및 단리하는 단계, 핵산을 정제하는 단계, 및 특이적인 압타머 서열을 식별하는 단계를 포함한다. 상기 공정은 선택된 압타머의 친화도를 추가로 정제하기 위해 다수의 순환을 포함할 수 있다. 상기 공정은 상기 공정의 하나 이상의 지점에서 증폭 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "핵산 리간드"인 미국 특허 제5,475,096호를 참조한다. SELEX 공정은 이의 표적에 공유적으로 결합하는 압타머뿐만 아니라 이의 표적에 비-공유적으로 결합하는 압타머를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "지수 농축에 의한 핵산 리간드의 체계적인 진전:화학-SELEX"인 미국 특허 제5,705,337호를 참조한다.
SELEX 공정은 예를 들어 개선된 생체 내 안정성 또는 개선된 전달 특징과 같은 개선된 특징을 압타머에 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 보유하는 고-친화도 압타머를 식별하는 데 사용될 수 있다. 이러한 변형의 예는 리보오스 및/또는 인산염 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 보유하는 SELEX 공정-식별된 압타머는 발명의 명칭이 "변형된 뉴클레오티드를 보유하는 고친화도 핵산 리간드"인 미국 특허 제5,660,985호에 기술되며, 피리미딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 보유하는 올리고뉴클레오티드가 기재된다. 미국 특허 제5,580,737호는 2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F), 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 보유하는 고도로 특이적인 압타머를 기술하며, 이를 참조한다. 또한, 발명의 명칭이 "SELEX 및 광 SELEX"인 미국 특허출원공개 US 2009/0098549호를 참조하며, 이는 확장된 물리적 및 화학적 특성을 갖는 핵산 라이브러리, 및 SELEX 및 광 SELEX에서의 이들의 사용을 기술한다.
SELEX는 또한 바람직한 오프-속도 특징을 갖는 압타머를 식별하는 데 사용될 수 있다. 발명의 명칭이 "개선된 오프-속도를 갖는 압타머의 생성 방법"인 미국 특허출원공개 US 2009/0004667호를 참조하며, 이는 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생성하기 위한 개선된 SELEX 방법을 기술한다. 그들의 각각의 표적 분자로부터의 더 느린 해리 속도를 갖는 압타머 및 광압타머를 제조하기 위한 방법이 기재된다. 상기 방법은 후보 혼합물을 표적 분자와 접촉시키는 단계, 핵산-표적 복합체의 형성이 발생되도록 하는 단계, 및 느린 오프-속도 농축 공정을 수행하는 단계를 포함하며, 빠른 해리 속도를 갖는 핵산-표적 복합체는 해리되며 재형성되지 않을 것이지만, 느린 해리 속도를 갖는 복합체는 원래대로 남을 것이다. 추가로, 상기 방법은 후보 핵산 혼합물의 제조에서 변형된 뉴클레오티드의 사용을 포함하여 개선된 오프-속도 성능을 갖는 압타머를 생성한다. 비제한적 예시적인 변형된 뉴클레이오티드는 예를 들어 도 1에 나타낸 변형된 피리미딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 염기 변형과 같은 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 소수성 염기 변형과 같은 소수성 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하여 표적 단백질과 소수성 접촉되도록 한다. 일부 실시형태에서, 이러한 소수성 접촉은 압타머에 의한 더 높은 친화도 및/또는 더 느린 오프-속도에 기여한다. 소수성 변형을 갖는 비제한적 예시적인 뉴클레오티드는 도 1에 나타난다. 일부 실시형태에서, 압타머는 소수성 변형을 갖는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하며, 각각의 소수성 변형은 다른 것과 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 압타머 내의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 소수성 변형은 독립적으로 도 1에 나타낸 소수성 변형으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 느린 오프-속도 압타머(소수성 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함하는 압타머 포함)는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프-속도(t½)를 갖는다.
일부 실시형태에서, 검정은 압타머가 그들의 표적 분자에 공유 결합되거나 "광가교"될 수 있도록 하는 광반응성 작용기를 포함하는 압타머를 이용한다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "핵산 리간드 진단 바이오칩"인 미국 특허 제6,544,776호를 참조한다. 이들 광반응성 압타머는 또한 광압타머로 지칭된다. 예를 들어, 미국 특허 제5,763,177호, 미국 특허 제6,001,577호, 및 미국 특허 제6,291,184호를 참조하며, 이들 각각의 발명의 명칭은 "지수 농축에 의한 핵산 리간드의 체계적인 진전: 핵산 리간드의 광선택 및 용액 SELEX"이고; 또한, 예를 들어, 발명의 명칭이 "핵산 리간드의 광선택"인 미국 특허 제6,458,539호를 참조한다. 마이크로어레이가 샘플과 접촉하고, 광압타머가 그들의 표적 분자와 결합하는 기회를 가진 후, 광압타머는 광활성화되고, 고체 지지체는 임의의 비-특이적으로 결합된 분자를 제거하기 위해 세척된다. 광압타머에 결합된 표적 분자는 광압타머 상의 광활성화 작용기(들)에 의해 생성된 공유 결합때문에 일반적으로 제거되지 않기 때문에, 혹독한 세척 조건이 사용될 수 있다. 이 방식에서, 검정은 시험 샘플 내의 바이오마커에 상응하는 바이오마커의 수준을 검출할 수 있도록 한다.
일부 검정 형식에서, 압타머는 샘플과 접촉되기 전에 고체 지지체 상에 고정된다. 그러나, 특정 상황 하에서, 샘플과 접촉 전의 압타머의 고정은 최적의 검정을 제공하지 않을 수 있다. 예를 들어, 압타머의 사전 고정은 고체 지지체의 표면 상에서 압타머와 표적 분자가 비효율적으로 혼합되도록 할 수 있으며, 아마도 압타머가 그들의 표적 분자와 효율적으로 결합하도록 하는 데 너무 긴 반응 시간 및 그로인해 연장된 배양 시간을 초래한다. 추가로, 광압타머가 검정에 이용되며 고체 지지체로 이용되는 물질에 의존할 때, 고체 지지체는 광압타머와 그들이 표적 분자 사이의 공유 결합의 형성을 초래하는 데 사용된 광을 산란 또는 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 더욱이, 이용되는 방법에 따라, 고체 지지체의 표면은 또한 사용된 임의의 표지제에 노출되며 이로 인해 영향을 받을 수 있기 때문에, 그들의 압타머에 결합된 표적 분자의 검출은 부정확성 대상일 수 있다. 마지막으로, 고체 지지체 상의 압타머의 고정은 일반적으로 압타머의 샘플에의 노출 전에 압타머-제조 단계(즉, 고정)를 포함하며, 이 제조 단계는 압타머의 활성 또는 기능성에 영향을 미칠 수 있다.
압타머가 용액 중 이의 표적을 포획하도록 하고, 이어서 검출 전에 압타머-표적 혼합물의 특이적인 성분을 제거하도록 고안된 분리 단계를 이용하는 압타머 검정이 또한 기술된 적이 있었다(발명의 명칭이 "시험 샘플의 다중 분석"인 미국 특허출원공개 US 2009/0042206호 참조). 기재된 압타머 검정 방법은 핵산(즉, 압타머)을 검출 및 정량하여 시험 샘플 내 비-핵산 표적(예를 들어, 단백질 표적)의 검출 및 정량이 가능하도록 한다. 기재된 방법은 비-핵산 표적을 검출 및 정량하기 위해 핵산 대용물(즉, 압타머)을 생성함으로써 증폭을 포함하는 광범위하게 다양한 핵산 기술이 단백질 표적을 포함하는 더 폭넓은 범위의 소기의 표적에 적용되도록 한다.
압타머는 압타머 바이오마커 복합체(또는 광압타머 바이오마커 공유 복합체)로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하며, 검출 및/또는 정량을 위해 압타머가 단리되도록 구성될 수 있다. 일 실시형태에서, 이들 구조물은 압타머 서열 내에 절단 가능하거나 방출 가능한 요소를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 추가의 기능성, 예를 들어 표지되거나 검출될 수 있는 성분, 스페이서 성분(spacer component) 또는 특이적인 결합 태그 또는 고정화 요소가 압타머 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 압타머는 절단 가능한 모이어티를 통해 압타머에 연결된 태그, 표지, 표지를 분리하는 스페이서 성분 및 절단 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 절단 가능한 요소는 광절단 가능한 링커(photocleavable linker)이다. 광절단 가능한 링커는 비오틴 모이어티 및 스페이서 부분에 부착될 수 있고, 아민의 유도체화를 위한 NHS 기를 포함할 수 있고, 비오틴기를 압타머에 도입하는 데 사용됨으로써, 검정 방법에서 압타머가 나중에 방출되도록 한다.
용액 중 모든 검정 성분과 수행되는 균질 검정은 신호의 검출 전에 샘플 및 시약의 분리가 필요하지 않는다. 이들 방법은 신속하며, 사용하기에 쉽다. 이들 방법은 이의 특이적 표적과 반응하는 분자 포획 또는 결합 시약을 기반으로 하는 신호를 발생한다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 분자 포획 시약은 압타머 또는 항체 등을 포함하며, 특이적인 표적은 표 1, 3, 5, 및/또는 7에 나타낸 바이오마커일 수 있다.
일부 실시형태에서, 신호를 발생하기 위한 방법은 형광단-표지 포획 시약과 이의 특이적인 바이오마커 표적의 상호 작용으로 인한 이방성 신호 변화를 이용한다. 표지된 포획은 이의 표적과 반응할 때, 증가된 분자량이 복합체에 부착된 형광단의 회전 운동을 초래하여 상기 이방성 값이 훨씬 더 느리게 변화되도록 한다. 이방성 변화를 모니터하는 것에 의해, 결합 사건은 용액 중 바이오마커를 정량적으로 측정하는 데 사용될 수 있다. 다른 방법은 형광 편광 검정, 분자 비콘 방법, 시간 분해 형광 소광, 화학 발광, 형광 공명 에너지 전이 등을 포함한다.
생물학적 샘플 내 바이오마커 수준을 검출하는 데 사용될 수 있는 예시적인 용액-기반 압타머 검정은 하기 단계를 포함한다: (a) 생물학적 샘플을 제1 태그를 포함하며 바이오마커에 대한 특이적인 친화도를 갖는 압타머와 접촉시킴으로써 혼합물을 제조하는 단계로서, 압타머 친화 복합체는 바이오마커가 샘플 내에 존재할 때 형성되는, 단계; (b) 상기 혼합물을 제1 포획 요소를 포함하는 제1 고체 지지체에 노출시키고, 제1 태그가 제1 포획 요소와 회합되도록 하는 단계; (c) 제1 고체 지지체와 회합되지 않은 혼합물의 임의의 성분을 제거하는 단계; (d) 제2 태그를 압타머 친화 복합체의 바이오마커 성분에 부착하는 단계; (e) 압타머 친화복합체를 제1 고체 지지체로부터 방출하는 단계; (f) 방출된 압타머 친화 복합체를 제2 포획 요소를 포함하는 제2 고체 지지체에 노출시키고, 제2 태그를 제2 포획 요소와 회합되도록 하는 단계; (g) 비-복합체화 압타머를 압타머 친화 복합체로부터 분할함으로써 임의의 비-복합체화 압타머를 상기 혼합물로부터 제거하는 단계; (h) 압타머를 고체 지지체로부터 용출시키는 단계; 및 (i) 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출함으로써 바이오마커를 검출하는 단계.
압타머를 사용하여 생물학적 샘플 내 바이오마커를 검출하는 비제한적 예시적인 방법은 실시예 7에 기재된다. 또한, Kraemer 등, PLoS One 6(10): e26332를 참조한다.
면역검정을 사용한 바이오마커 수준의 결정
면역검정 방법은 항체의 이의 상응하는 표적 또는 피분석물에 대한 반응을 기반으로 하며, 특이적인 검정 형식에 의존하여 샘플 내 피분석물을 검출할 수 있다. 면역-반응성 기반 검정 방법의 특이성 및 민감도를 개선하기 위해, 단클론 항체 및 이의 단편이 이들의 특이적인 에피토프 인식(epitope recognition)때문에 대체로 사용된다. 다클론 항체가 또한 단클론 항체와 비교하여 표적에 대한 이들의 증가된 친화도때문에 다양한 면역검정에서 성공적으로 사용되어 왔다. 면역검정은 폭넓은 범위의 생물학적 샘플 매트릭스와 사용되도록 고안되었다. 면역검정 형식은 정성적, 반-정량적(semi-quantitative), 및 정량적 결과를 제공하도록 고안되었다.
정량적 결과는 검출되는 특정 피분석물의 알려진 농도로 생성된 표준 곡선의 사용을 통해 생성된다. 미지의 샘플로부터의 반응 또는 신호가 표준 곡선 상에 도표화되며, 미지의 샘플 내 표적에 상응하는 양 또는 수준이 밝혀진다.
수 많은 면역검정 형식이 고안되었다. ELISA 또는 EIA는 피분석물의 검출에 대해 정량적일 수 있다. 이 방법은 피분석물 또는 항체에의 표지의 부착에 의존하며, 표지 성분은 직접 또는 간접적으로 효소를 포함한다. ELISA 시험은 피분석물의 직접, 간접, 경쟁, 또는 샌드위치 검출에 대한 체재를 가질 수 있다. 다른 방법은 예를 들어 방사선 동위원소(I125) 또는 형광과 같은 표지에 의존한다. 추가의 기술은 예를 들어 응집 반응, 비탁 분석법, 혼탁 분석법, 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법, 면역세포화학, 면역조직화학, 유세포 분석법, 루미넥스 검정(luminex assay) 등을 포함한다(ImmunoAssay: A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005 edition 참조).
예시적인 검정 형식은 효소-결합 면역흡착제 검정(ELISA), 방사면역측정법, 형광, 화학발광, 및 형광 공명 에너지 전이(FRET) 또는 시간 분해-FRET(TR-FRET) 면역검정을 포함한다. 바이오마커를 검출하기 위한 절차의 예는 바이오마커 면역침강 후 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 평면 전기 크로마토그래피 등과 같은 크기 및 펩타이드 수준이 분별되도록 하는 정량적 방법을 포함한다.
측정 가능한 표지 또는 신호 발생 물질을 검출 및/또는 정량하는 방법은 표지의 특성에 따라 결정된다. 적절한 효소(검출 가능한 표지가 효소임; 상기 참조)로 촉매화된 반응의 생성물은 제한 없이 형광성, 발광성, 또는 방사성일 수 있거나, 그들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 이러한 검출 가능한 표지를 검출하는 데 적합한 검출기의 예는 제한 없이 x-선 필름, 방사능 계수기, 신틸레이션 계수기(scintillation counter), 분광 광도계, 비색계, 형광 광도계, 광도계(luminometer), 및 농도계일 수 있다.
검출을 위한 임의의 방법은 임의의 적합한 제조, 처리, 및 반응 분석을 가능하도록 하는 임의의 형식으로 수행될 수 있다. 이는 예를 들어 다중-웰 검정 판(예를 들어, 96 웰 또는 386 웰)에서나 임의의 적합한 어레이 또는 마이크로어레이를 사용하여 수행될 수 있다. 다양한 시제에 대한 저장 용액은 수동 또는 로봇식으로 제조될 수 있으며, 모든 후속 피펫팅(pipetting), 희석, 혼합, 분배, 세척, 배양, 샘플 판독, 데이터 수집, 및 분석은 상업적으로 입수 가능한 분석 소프트웨어, 로봇 공학, 및 검출 가능한 표지를 검출할 수 있는 검출 기기를 사용하여 로봇식으로 수행될 수 있다.
유전자 발현 프로파일링을 사용한 바이오마커 수준의 결정
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플 내 mRNA를 측정하는 것은 생물학적 샘플 내 상응하는 단백질의 수준의 검출을 위한 대용으로 이용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이오마커 또는 바이오마커 패널은 적절한 RNA를 검출하여 검출될 수 있다.
일부 실시형태에서, mRNA 발현 수준은 역전사 정량 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR 후 qPCR)으로 측정된다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 생성하는 데 사용된다. cDNA는 qPCR 검정에서 사용되어 DNA 증폭 과정이 진행되면서 형광을 발생할 수 있다. 표준 곡선과 비교하여, qPCR은 세포당 mRNA 복제물의 수와 같은 절대 측정값을 생성할 수 있다. 노던 블랏(northern blot), 마이크로어레이, 전화 검정, 및 모세관 전기영동과 조합된 RT-PCR이 모두 샘플 내 mRNA의 발현 수준을 측정하는 데 사용되었다. Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004를 참조한다.
생체 내
분자 영상화 기술을 사용한 바이오마커의 검출
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이오마커는 분자 영상화 시험에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 영상화제는 생체 내에서 바이오마커를 검출하는 데 사용될 수 있는 포획 시약에 결합될 수 있다.
생체 내 영상화 기술은 개체의 신체에서 특정 질병의 상태를 결정하기 위한 비-침습적 방법을 제공한다. 예를 들어, 신체의 전체 부분 또는 심지어 전신을 3차원 이미지로 볼 수 있어서 신체 내 형태 및 구조에 관한 유용한 정보를 제공한다. 이러한 기술은 본원에 기재된 바이오마커의 검출과 조합되어 생체 내 바이오마커에 관한 정보를 제공할 수 있다.
생체 내 분자 영상화 기술의 사용은 다양한 기술적 발전으로 인해 늘어나고 있다. 이러한 발전은 신체 내에서 강한 신호를 제공할 수 있는 신규 조영제 또는 표지, 예컨대 방사선 표지 및/또는 형광 표지의 개발; 및 유용한 정보를 제공하도록 충분한 민감도 및 정확도를 갖는, 신체 외부로부터 이들 신호를 검출 및 분석할 수 있는, 강력한 신규 영상화 기술의 개발을 포함한다. 조영제는 적합한 영상화 시스템에서 시각화될 수 있어서 조영제가 위치하는 신체의 일부 또는 일부들의 이미지를 제공한다. 조영제는 포획 시약, 예컨대 압타머 또는 항체, 예를 들어 및/또는 펩타이드 또는 단백질, 또는 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 유전자 발현의 검출을 위한), 또는 이들 중 임의의 것과 하나 이상의 거대분자 및/또는 다른 미립자 형태를 함유하는 복합체에 결합되거나 이와 회합될 수 있다.
조영제는 또한 영상화에 유용한 방사성 원자를 특징으로 한다. 적합한 방사성 원자는 섬광조영술 연구를 위한 테크네튬-99m 또는 요오드-123을 포함한다. 다른 용이하게 검출 가능한 모이어티는 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간, 또는 철과 같은 예를 들어 자기 공명 영상(MRI)을 위한 스핀 표지를 포함한다. 이러한 표지는 당업계에 잘 알려지며, 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
표준 영상화 기술은 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층촬영 주사, 양전자 방출 단층촬영(PET), 단일광자 방출 단층촬영(SPECT) 등을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 진단성 생체 내 영상화의 경우, 이용 가능한 검출 기기의 유형은 특정 조형제, 예컨대 특정 방사선 핵종 및 표적(단백질, mRNA 등)에 사용되는 특정 바이오마커를 선택하는 데 주요 인자이다. 선택된 방사선 핵종은 전형적으로 특정 유형의 기기로 검출될 수 있는 붕괴 유형을 갖는다. 또한, 생체 내 진단을 위한 방사선 핵종을 선택할 때, 이의 반감기는 표적 조직에 의한 최대 흡수 기간에서 검출 가능하도록 충분히 길어야 하지만, 숙주의 유해한 방사선이 최소화되도록 충분히 짧아야 한다.
예시적인 영상화 기술은 방사선 핵종이 개체에 종합적으로 또는 국소적으로 투여되는 영상화 기술인 PET 및 SPECT를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 방사선 추적자의 후속 흡수는 시간의 경과에 따라 측정되며, 표적화된 조직 및 바이오마커에 대한 정보를 획득하는 데 사용된다. 이용되는 특정 동위원소의 고에너지(감마선) 방출, 및 그들을 검출하는 데 사용되는 기기의 민감도 및 정교함때문에, 방사능의 2차원 분포는 신체 외부로부터 추정될 수 있다.
PET에서 일반적으로 사용되는 양전자-방출 핵종은 예를 들어 탄소-11, 질소-13, 산소-15, 및 불소-18을 포함한다. 전자 포획 및/또는 감마-방출로 붕괴되는 동위원소는 SPECT에서 사용되며, 예를 들어 요오드-123 및 테크네늄-99m을 포함한다. 아미노산을 테크네튬-99m으로 표지하기 위한 예시적인 방법은 킬레이트화 전구체의 존재 하에 과테크네튬산 이온의 환원으로 불안정한 테크네튬-99m-전구체 복합체를 형성하며, 이어서 이작용성으로 변형된 케모텍틱 펩타이드(chemotactic peptide)의 금속 결합기와 반응하여 테크네튬-99m-케모텍틱 펩타이드 접합체를 형성한다.
항체는 이러한 생체 내 영상화 진단 방법에서 빈번하게 사용된다. 생체 내 진단을 위한 항체의 생산 및 사용은 당업계에 잘 알려진다. 유사하게, 압타머가 이러한 생체 내 영상 진단 방법을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 특정 바이오마커를 식별하는 데 사용되었던 압타머는 적절하게 표지되며, 개체 내로 주입되어 생체 내에서 바이오마커를 검출할 수 있다. 사용된 표지는 이전에 기재된 바와 같이 사용되는 영상 종류에 따라 선택될 수 것이다. 압타머-관련 영상화제는 다른 영상화제와 비교하여 조직 침투, 조직 분포, 동력학, 제거, 역가, 및 선택성에 대한 고유하며 이로운 특성을 가질 수 있다.
이러한 기술은 또한 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)로의 영상화를 통한 유전자 발현 검출을 위해 표지된 올리고뉴클레오티드로 선택적으로 수행될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어 표지로 형광 분자 또는 방사선 핵종을 갖는 인-시츄 혼성화(in situ hybridization)에서 사용된다. 유전자 발현의 검출을 위한 다른 방법은 예를 들어, 보고 유전자의 활성도 검출을 포함한다.
다른 일반적인 유형의 영상화 기술은 광학 영상이며, 대상체 내의 형광 신호는 대상체에 외부에 있는 광학 장치로 검출된다. 이들 신호는 실제 형광 및/또는 생체발광때문일 수 있다. 광학 검출 장치의 민감도에서의 개선은 생체 내 진단 검정을 위한 광학 영상의 유용성을 증가시킨다.
다른 기술의 리뷰를 위해서는, N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009를 참조한다.
조직학/세포학 방법을 사용한 바이오마커의 결정
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이오마커는 조직학적 또는 세포학적 방법을 사용하여 다양한 조직 샘플 내에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 기관지 내 생검 및 기관지 경유 생검, 세침 흡인, 절단 바늘(cutting needle), 및 중심부 생검이 조직학을 위해 사용될 수 있다. 기관지 세척 및 브러싱, 흉막 흡인, 및 객담이 세포학을 위해 사용될 수 있다. 본원에서 식별된 임의의 바이오마커는 질병의 징후로 시료를 착색하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상응하는 바이오마커/들에 특이적인 하나 이상의 포획 시약/들은 샘플의 세포학적 평가에 사용되며, 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 세포 샘플을 수집하는 단계, 세포 샘플을 고정하는 단계, 탈수하는 단계, 세정하는 단계, 세포 샘플을 현미경 슬라이드 상에 고정하는 단계, 세포 샘플을 투과시키는 단계, 피분석물 회수를 위해 처리하는 단계, 착색하는 단계, 탈착색하는 단계, 세척하는 단계, 블록화하는 단계(blocking), 및 완충 용액 중 하나 이상의 포획 시약/들과 반응시키는 단계. 다른 실시형태에서, 세포 샘플은 세포 블록으로부터 제조된다.
일부 실시형태에서, 상응하는 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 포획 시약/들이 조직 샘플의 조직학적 평가에 사용되며, 하기 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 조직 시료를 수집하는 단계, 조직 샘플을 고정하는 단계, 탈수하는 단계, 세정하는 단계, 조직 샘플을 현미경 슬라이드 상에 고정하는 단계, 조직 샘플을 투과시키는 단계, 피분석물 회수를 위해 처리하는 단계, 착색하는 단계, 탈착색하는 단계, 세척하는 단계, 블록화하는 단계, 재탈수하는 단계, 및 완충 용액 중 포획 시약/들과 반응시키는 단계. 다른 실시형태에서, 고정 및 탈수 단계는 동결 단계로 대체된다.
다른 실시형태에서, 상응하는 바이오마커/들에 특이적인 하나 이상의 압타머/들은 조직학적 또는 세포학적 샘플과 반응되며, 핵산 증폭 방법에서 핵산 표적으로서의 역할을 할 수 있다. 적합한 핵산 증폭 방법은 예를 들어 PCR, q-베타 복제효소, 회전환 증폭, 가닥 치환(strand displacement), 나선효소 의존성 증폭, 고리 매개 등온 증폭, 리가아제 연쇄 반응, 및 제한 및 원형화 보조 회전환 증폭(restriction and circularization aided rolling circle amplification)을 포함한다.
일 실시형태에서, 조직학적 세포학적 평가에 사용되기 위한 상응하는 바이오마커에 특이적인 하나 이상의 포획 시약/들은 하기 중 임의의 것을 포함할 수 있는 완충 용액 중에 혼합된다: 블록화 물질, 경쟁자, 세정제, 안정화제, 캐리어 핵산(carrier nucleic acid), 다가 음이온성 물질 등.
"세포학적 프로토콜"은 일반적으로 샘플 수집, 샘플 고착, 샘플 고정화, 및 착색을 포함한다. "세포 제조"는 제조된 세포의 착색을 위한 하나 이상의 압타머의 사용을 포함하는 샘플 수집 후 몇 가지 처리 단계를 포함할 수 있다.
질량 분석 방법을 사용한 바이오마커 수준의 결정
다양한 구성의 질량 분석기가 바이오마커 수준을 검출하는 데 사용될 수 있다. 몇 가지 유형의 질량 분석기가 이용 가능하거나 다양한 구성으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 질량 분석기는 하기 주요 구성 요소를 갖는다: 샘플 주입구, 이온 공급원, 질량 분석기, 검출기, 진공 시스템, 및 기기-제어 시스템, 및 데이터 시스템. 샘플 주입구, 이온 공급원, 및 질량 분석기의 차이가 일반적으로 기기의 유형 및 이의 역량을 규정한다. 예를 들어, 주입구는 모세관-컬럼 액체 크로마토그래피 공급원일 수 있거나, 매트릭스-보조 레이저 탈착(matrix-assisted laser desorption)에서 사용되는 것과 같은 직접적인 프로브 또는 단일 수 있다. 일반적인 이온 공급원은 예를 들어 나노분무 및 마이크로분무를 포함하는 전기분무, 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착이다. 일반적인 질량 분석기는 사중극자 질량 필터, 이온 트랩 질량 분석기, 및 비행 시간 질량 분석기(time-of-flight mass analyzer)를 포함한다. 추가의 질량 분석 방법은 당업계에 잘 알려진다(Burlingame 등, Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman, New York (2000) 참조).
단백질 바이오마커 및 바이오마커 수준은 하기 중 임의의 것에 의해 검출 및 측정될 수 있다: 전기분무 이온화 질량 분석기(ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스-보조 레이저 탈착 비행 시간 질량 분석기(MALDI-TOF-MS), 표면-강화 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석기(SELDI-TOF-MS), 실리콘 상의 탈착/이온화(DIOS), 2차 이온 질량 분석기(SIMS), 사중극자 비행 시간(Q-TOF), ultraflex III TOF/TOF로 불리는 탠덤 비행 시간(TOF/TOF) 기술, 대기압 화학 이온화 질량 분석기(APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, 대기압 광이온화 질량 분석기(APPI-MS), APPI-MS/MS, 및 APPI-(MS)N, 사중극자 질량 분석기, 푸리에 변환 질량 분석기(FTMS), 정량적 질량 분석기, 및 이온 트랩 질량 분석기.
샘플 제조 전략이 사용되어 단백질 바이오마커의 질량 분광학적 특징 규명 및 바이오마커 수준의 결정 전에 샘플을 표지 및 농축한다. 표지 방법은 상대적 및 절대적 정량을 위한 등질량 태그(iTRAQ: isobaric tag for relative and absolute quantitation) 및 세포 배양에서 아미노산으로 표지하는 안정한 동위원소(SILAC)를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 질량 분광학적 분석 전에 후보 바이오마커 단백질에 대한 샘플을 선택적으로 농축시키는 데 사용되는 포획 시약은 압타머, 항체, 핵산, 탐침, 키메라, 저분자, F(ab')2 단편, 단쇄 항체 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv 단편, 핵산, 렉틴, 리간드-결합 수용체, 아피바디, 나노바디, 안키린, 도메인 항체, 대안적인 항체 스캐폴드(예를 들어, 디아바디(diabodies) 등), 각인 중합체, 아비머, 펩티드모방체, 펩토이드, 펩티드 핵산, 트레오스 핵산, 호르몬 수용체, 사이토카인 수용체, 및 합성 수용체, 및 이들의 변형 및 단편을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
전술한 검정들은 본원에 기재된 방법에 유용한 바이오마커 수준을 결정하도록 할 수 있으며, 상기 방법들은 개체로부터의 생물학적 샘플 내에서 표 1, 3, 5, 또는 7의 바이오마커로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 바이오마커를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 본 방법은 본원에 기재된 임의의 바이오마커 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 바이오마커의 수준을 검출하는 단계를 포함한다. 따라서, 기재된 바이오마커 중 일부는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 검출하기 위해 단독으로 유용할 수 있지만, 2개 이상의 바이오마커의 패널을 형성하기 위해 다중 바이오마커 및 바이오마커의 서브세트를 그룹화기 위한 방법도 본원에 기재된다. 본원에 기재된 임의의 방법에 따라, 바이오마커 수준은 개별적으로 검출 및 분류될 수 있거나, 그들은 예를 들어 다중 검정 형식에서와 같이 일괄적으로 검출 및 분류될 수 있다.
바이오마커의 분류 및 질병 점수(disease score)
일부 실시형태에서, 특정 진단 시험에 대한 바이오마커 "시그니처(signature)"는 각각의 바이오마커가 관심 집단에서의 특징적인 수준을 갖는 바이오마커 세트를 보유한다. 일부 실시형태에서, 특징적인 수준은 특정 그룹 내 개체에 대한 바이오마커의 평균 또는 보통 수준을 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 진단 방법은 개체로부터의 미지의 샘플을 두 그룹 중 하나, 예를 들어, 간 지방증 또는 정상으로 배정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 진단 방법은 개체로부터의 미지의 샘플을 두 그룹 중 하나, 예를 들어, 간 지방증 또는 간 섬유증으로 배정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 진단 방법은 개체로부터의 미지의 샘플을 세 그룹: 예를 들어, 정상, NASH를 갖지 않는 간 섬유증, 및 NASH 중 하나로 배정하는 데 사용될 수 있다.
샘플을 둘 이상의 그룹 중 하나로 배정하는 것은 분류로 알려지며, 이 배정을 달성하는 데 사용되는 절차는 분류기 또는 분류 방법으로 알려진다. 분류 방법은 또한 득점 방법으로 지칭될 수 있다. 바이오마커 수준 세트로부터 진단 분류기를 구성하는 데 사용될 수 있는 다수의 분류 방법이 존재한다. 일부 예에서, 분류 방법은 지도형 학습 기술을 사용하여 수행되며, 데이터 세트는 두(다중 분류 상태를 위해, 또는 그 초과) 별개의 그룹 내의 개체로부터 획득된 샘플을 사용하여 수집되며, 구별되기를 희망한다. 각각의 샘플이 속하는 부류(그룹 또는 집단)가 각각의 샘플에 대해 미리 공지되기 때문에, 분류 방법은 소기의 분류 응답을 제공하도록 트레이닝될 수 있다. 진단 분류기를 생성하기 위한 비지도형 학습 기술을 사용하는 것이 또한 가능하다.
진단 분류기를 개발하기 위한 일반적인 접근법은 의사결정 분지도; 배깅(bagging) + 부스팅(boosting) + 포레스트(forest); 규칙 추론 기반 학습; 파젠 윈도우(parzen window); 선형 모델; 로지스틱; 신경망 방법; 비지도형 클러스터링(unsupervised clustering); K-방식; 계층적 오름차순/내림차순; 반-지도형 학습(semi-supervised learning); 프로토타입 방법; 최근접 이웃(nearest neighbor); 커널 밀도 추정; 서포트 벡터 머신; 은닉 마르코브 모델; 볼츠만 학습을 포함하며; 분류기는 단순히 또는 특정 목표 기능을 최소화하는 방식으로 조합될 수 있다. 리뷰를 위해, 예를 들어 Pattern Classification, R.O. Duda, 등, editors, John Wiley & Sons, 2nd edition, 2001을 참조하고; 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, 등, editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조한다.
지도형 학습 기술을 사용하여 분류기를 생성하기 위해, 트레이닝 데이터로 불리는 샘플 세트를 획득한다. 진단 시험의 맥락에서, 트레이닝 데이터는 미지의 샘플이 나중에 배정될 수 있는 별개의 그룹(부류)으로부터의 샘플을 포함한다. 예를 들어, 대조군 집단 내의 개체 및 특정 질병 집단 내의 개체로부터 수집된 샘플은 미지의 샘플(또는 보다 특히 샘플이 획득되었던 개체)이 질병을 갖거나 질병이 없는 것으로 분류할 수 있는 분류기를 개발하는 트레이닝 데이터로 구성될 수 있다. 트레이닝 데이터로부터의 분류기의 개발은 분류기를 트레이닝하는 것으로 알려진다. 분류기 트레이닝에 대한 구체적인 상세 내용은 지도형 학습 기술의 특성에 따라 결정된다. 나이브 베이지안 분류기(naive Bayesian classifier)를 트레이닝하는 것은 이러한 지도형 학습 기술의 일 예이다(예를 들어, Pattern Classification, R.O. Duda, 등, editors, John Wiley & Sons, 2nd edition, 2001 참조; 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, 등, editors, Springer Science+Business Media, LLC, 2nd edition, 2009 참조). 나이브 베이지안 분류기의 트레이닝은 예를 들어 미국 특허출원공개 US 2012/0101002호 및 US 2012/0077695호에 기술된다.
전형적으로, 트레이닝 세트 내 샘플보다 더욱 많은 잠재적인 바이오마커 수준이 존재하기 때문에, 과대적합(over-fitting)을 피하도록 주의하여야 한다. 과대적합은 통계적 모델이 기저 관계 대신 무작위 오류 또는 노이즈를 형성할 때 발생한다. 과대적합은 예를 들어 분류기를 개발하는 데 사용되는 바이오마커의 수를 제한하고, 바이오마커 응답이 서로 독립적인 것으로 가정하고, 이용된 기저 통계 모델의 복잡도를 제한하고, 기저 통계 모델이 데이터에 따르도록 하는 것을 포함하는 다양한 방법으로 피할 수 있다.
바이오마커 세트를 사용한 진단 시험 개발의 예시적인 예는 나이브 베이즈 분류기(naive Bayes classifier), 베이즈 정리 기반 단순 확률적 분류기를 바이오마커의 엄격한 독립적인 처리로 적용하는 것을 포함한다. 각각의 바이오마커는 각각의 부류에서 측정된 RFU 값 또는 로그 RFU(상대적인 형광 단위) 값에 대한 부류-의존적 확률 밀도 함수(pdf)로 설명된다. 한 부류에서의 바이오마커 세트에 대한 공동 pdf는 각각의 바이오마커에 대한 개별적인 부류-의존적 pdf의 결과물인 것으로 추정된다. 이 맥락에서 나이브 베이즈 분류기를 트레이닝하는 것은 부류 의존적 pdf를 특징 규명하기 위해 파라미터를 지정하는 것("모수화")에 해당한다. 부류-의존적 pdf에 대한 임의의 기저 모델이 사용될 수 있지만, 모델은 일반적으로 트레이닝 세트에서 관찰된 데이터를 따라야 한다.
나이브 베이즈 분류기의 성능은 분류기를 구성하며 트레이닝하는 데 사용된 바이오마커의 수 및 품질에 따라 결정된다. 단일 바이오마커는 이의 KS-거리(콜모고로프-스미르노프)에 따라 수행될 것이다. 우수한 KS 거리(예를 들어, 0.3 초과)를 갖는 후속 바이오마커의 첨가는 일반적으로 후속 첨가되는 바이오마커가 제1 바이오마커와 독립적인 경우 분류 성능을 개선할 것이다. 민감도뿐만 아니라 특이성을 분류기 점수로 사용하여, 다수의 높은 득점 분류기가 탐욕 알고리즘(greedy algorithm)(탐욕 알고리즘은 각각의 단계에서 전체적인 최적값을 찾는 기대를 갖고 국소적인 최적 선택을 하는 문제 해결 메타 발견적 학습을 따르는 임의의 알고리즘임)의 변형으로 생성될 수 있다.
분류기 성능을 표현하는 다른 방법은 수신자 조작 특성(ROC), 또는 단순히 ROC 곡선 또는 ROC 도표를 통해서이다. ROC는 이의 판별 역치가 달라지는 이중 분류기 시스템에 대한 민감도 또는 진양성율 대 위양성율(1-특이성 또는 1-진음성율)의 그래프 도표이다. ROC는 또한 양 중 진양의 비율(TPR = 진양성율) 대 음 중 위양의 비율(FPR = 위양성율)을 도표화하여 동일하게 나타낼 수 있다. 또한, 이는 기준이 변화되는 두 조작 특성(TPR 및 FPR)의 비교이기 때문에, 상대적 조작 특성 곡선으로도 알려진다. ROC 곡선 아래 면적(AUC)은 일반적으로 진단 정확도의 개략적인 척도로 사용된다. 이는 0.0 내지 1.0의 값을 취할 수 있다. AUC는 중요한 통계적 특성을 갖는다: 분류기의 AUC는 분류기가 무작위로 선택된 음성 예보다 더 높은 무작위로 선택된 양성 예를 분류할 확률과 동등하다(Fawcett T, 2006. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters .27: 861-874). 이는 월콕슨 순위 검정과 동등하다(Hanley, J.A., McNeil, B.J., 1982. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve. Radiology 143, 29-36.).
예시적인 실시형태는 표 1, 3, 5, 또는 7에 열거된 임의의 수의 바이오마커를 다양하게 조합하여 사용함으로써 간 지방증, 간 염증, 감 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 갖는 개체를 식별하기 위한 진단 시험을 생성한다. 표 1, 3, 5, 또는 7에 열거된 바이오마커는 다수의 방식으로 조합되어 분류기를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이오마커 패널은 선택되는 특정 진단 성능 기준에 따라 상이한 바이오마커 세트로 구성된다. 예를 들어, 특정 바이오마커 조합은 다른 조합보다 더 민감한(또는 더 특이적인) 시험을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 간 지방증을 갖는 개체를 식별하기 위한 바이오마커 패널은 표 1의 바이오마커로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 간 염증을 갖는 개체를 식별하기 위한 바이오마커 패널은 표 3의 바이오마커로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 간세포 풍선화를 갖는 개체를 식별하기 위한 바이오마커 패널은 표 5의 바이오마커로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 간 섬유증을 갖는 개체를 식별하기 위한 바이오마커 패널은 표 7의 바이오마커로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 일단 패널이 하나 이상의 추가적인 바이오마커를 갖거나 또는 갖지 않는 표 1, 3, 5, 및/또는 7로부터의 바이오마커의 특정 세트를 포함하도록 규정되고, 분류기가 트레이닝 데이터 세트로부터 구축되면, 진단 시험 파라미터는 완료된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 하나 이상의 검정에서 실행되어 분류를 위해 사용되는 유의미한 정량적인 바이오마커 수준을 생성한다. 측정된 바이오마커 수준은 분류 방법에 대한 입력으로 사용되며, 이는 부류 지정의 신뢰도를 반영하는 샘플에 대한 선택적인 점수 및 분류를 출력한다.
일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 선택적으로 희석되며 다중 압타머 검정에서 실행되고, 데이터는 하기와 같이 평가된다. 먼저, 검정으로부터의 데이터는 선택적으로 정규화되며 교정되고, 수득된 바이오마커 수준은 베이즈 분류 도식에 대한 입력으로 사용된다. 두 번째, 로그-우도 비율(log-likelihood ratio)을 각각의 측정된 바이오마커에 대해 개별적으로 산출하고, 이어서 합산하여 최종 분류 점수를 생성하며, 이는 또한 진단 점수로도 지칭된다. 수득된 지정뿐만 아니라 전반적인 분류 점수가 보고될 수 있다. 일부 실시형태에서, 각각의 바이오마커 수준에 대해 산출된 개별적인 로그-우도 위험 인자가 또한 보고될 수 있다.
키트
본원에 기재된 바이오마커의 임의의 조합은 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 사용하기 위한 것과 같은 적합한 키트를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 임의의 키트는 형광 모이어티 등과 같은 본원에 기재된 하나 이상의 검출 가능한 표지를 보유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 (a) 생물학적 샘플 내 하나 이상의 바이오마커를 검출하기 위한 하나 이상의 포획 시약(예를 들어, 적어도 하나의 압타머 또는 항체와 같은) 및 선택적으로 (b) 생물학적 샘플이 획득되었던 개체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH (예컨대 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH, 또는 2, 3, 또는 4 단계 NASH)를 갖는지를 예측하기 위한 하나 이상의 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램 제품을 포함한다. 대안적으로, 하나 이상의 컴퓨터 프로그램 제품보다, 상기 단계를 인간에 의해 수동으로 수행하기 위한 하나 이상의 지시서가 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 고체 지지체, 포획 시약, 및 신호 발생 물질을 포함한다. 키트는 또한 장치 및 시약을 사용하고, 샘플을 취급하고, 데이터를 분석하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 추가로, 키트는 컴퓨터 시스템 또는 소프트웨어와 사용되어 생물학적 샘플의 분석 결과를 분석 및 보고할 수 있다.
키트는 또한 생물학적 샘플을 처리하기 위한 하나 이상의 시약(예를 들어, 안정화 완충액, 세정제, 세척제, 또는 완충액)을 보유할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 키트는 또한 예를 들어 완충액, 블록화제, 질량 분석기 매트릭스 물질, 항체 포획제, 양성 대조군 샘플, 음성 대조군 샘플, 소프트웨어 및 정보, 예컨대 프로토콜, 안내 사항, 및 참조 데이터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH의 분석을 위해 제공되며, 상기 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 바이오마커에 대한 PCR 프라이머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH 예후를 갖는 바이오마커의 사용 및 상관 관계에 대한 지시서를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 샘플 DNA를 증폭 또는 단리하기 위한 본원에 기재된 하나 이상의 바이오마커의 보체, 시약, 및/또는 효소를 보유하는 DNA 어레이를 포함할 수 있다. 키트는 실시간 PCR에 대한 시약, 예를 들어 TaqMan 프로브 및/또는 프라이머, 및 효소를 포함할 수 있다.
예를 들어, 키트는 (a) 시험 샘플 내 하나 이상의 바이오마커의 수준을 결정하기 위한 적어도 하나의 포획 시약을 포함하는 시약 및 선택적으로 (b) 시험 샘플 내에서 정량화된 각각의 바이오마커의 양을 하나 이상의 지정된 컷오프에 비교하는 단계를 수행하기 위한 하나 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 상기 비교를 기초로 정량화된 각각의 바이오마커에 대한 점수를 부여하며, 일부 실시형태에서 정량화된 각각의 바이오마커에 대해 부여된 점수를 조합하여 총 점수를 획득한다. 추가로, 일부 실시형태에서, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램은 총 점수를 지정된 점수와 비교하며, 개체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 갖는지를 결정하는 데 비교를 사용한다. 대안적으로, 하나 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램보다, 상기 단계를 사람에 의해 수동으로 수행하기 위한 하나 이상의 지시서가 제공될 수 있다.
컴퓨터 방법 및 소프트웨어
일단 바이오마커 또는 바이오마커 패널이 선택되면, 개체에서의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 평가하기 위한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 1) 생물학적 샘플을 수집하거나 달리 획득하는 단계; 2) 분석 방법을 수행하여 생물학적 샘플 내에서 패널 내 바이오마커 또는 바이오마커들을 검출 및 측정하는 단계; 및 3) 바이오마커 수준의 결과를 보고하는 단계. 일부 실시형태에서, 바이오마커 수준의 결과는 예를 들어 제안된 진단("간 지방증", "간 염증", "간 섬유증", "간세포 풍선화", "NASH", "NASH 2, 3, 또는 4 단계" 등) 또는 "양성" 및 "음성"이 정의될 때, 단순히 양성/음성 결과와 같이 정량적 보다 정성적으로 보고된다. 일부 실시형태에서, 개체에서의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 평가하기 위한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 1) 생물학적 샘플을 수집하거나 달리 획득하는 단계; 2) 분석 방법을 수행하여 생물학적 샘플 내에서 패널 내 바이오마커 또는 바이오마커들을 검출 및 측정하는 단계; 3) 임의의 데이터 정규화 또는 표준화를 수행하는 단계; 4) 각각의 바이오마커 수준을 계산하는 단계; 및 5) 바이오마커 수준의 결과를 보고하는 단계. 일부 실시형태에서, 바이오마커 수준은 일부 방식으로 조합되며, 조합된 바이오마커 수준에 대한 단일값이 보고된다. 일부 실시형태에서, 이 접근법에서, 보고된 값은 질병의 존재 또는 부재의 표시인 사전 설정된 역치 값과 비교되는 모든 바이오마커 계산의 합으로부터 결정된 단일 숫자일 수 있다. 또는, 진단 점수는 일련의 막대일 수 있으며, 각각은 바이오마커 값을 나타내고, 반응 패턴은 질병의 존재 또는 부재의 결정을 위한 사전 설정된 패턴과 비교될 수 있다.
본원에 기재된 방법의 적어도 일부 실시형태는 컴퓨터의 사용으로 구현될 수 있다. 컴퓨터 시스템(100)의 일 예는 도 2에 나타난다. 도 2를 참조하면, 시스템(100)은 프로세서(101), 입력 장치(102), 출력 장치(103), 저장 장치(104), 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체 판독기(105a), 통신 시스템(106), 처리 가속(107)(예를 들어, DSP 또는 특정 목적 프로세서), 및 메모리(109)를 포함하여 버스(108)를 통해 전기적으로 결합된 하드웨어 요소로 구성된 것으로 나타난다. 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체 판독기(105a)는 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체(105b)와 추가로 결합되며, 이 조합은 일시적으로 및/또는 더 영구적으로 컴퓨터-판독 가능한 정보를 보유하기 위한 원격, 근거리, 고정형, 및/또는 제거 가능형 저장 장치뿐만 아니라 저장 매체, 메모리 등을 포괄적으로 나타내고, 저장 장치(104), 메모리(109), 및/또는 임의의 다른 이러한 접근 가능한 시스템(100) 자원을 포함할 수 있다. 시스템(100)은 또한 운영 체계(192) 및 기타 코드(193), 예컨대 프로그램, 데이터 등을 포함하는 소프트웨어 요소(작업 메모리(191) 내에 현재 배치된 것으로 나타남)를 포함한다.
도 2와 관련하여, 시스템(100)은 광범위한 유연성 및 설정성(configurability)을 갖는다. 따라서, 예를 들어 단일 아키텍쳐(single architecture)가 현재 바람직한 프로토콜, 프로토콜 변형, 확장 등에 따라 추가로 구성될 수 있는 하나 이상의 서버를 구현하도록 이용될 수 있다. 그러나, 실시형태는 보다 구체적인 적용 요구 사항에 따라 잘 이용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 시스템 요소는 시스템(100) 구성 내부(예를 들어, 통신 시스템(106) 내부) 하위 요소로 구현될 수 있다. 맞춤형 하드웨어가 또한 이용될 수 있고/있거나 특정 요소가 하드웨어, 소프트웨어, 또는 둘 모두에서 구현될 수 있다. 추가로, 네트워크 입력/출력 장치(미도시)와 같은 다른 컴퓨터 장치로의 연결이 이용될 수 있고, 다른 컴퓨터 장치로의 유선, 무선, 모뎀, 및/또는 다른 연결 또는 연결들이 또한 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
일 양태에서, 시스템은 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH 특유의 바이오마커 특성을 보유하는 데이터베이스를 포함할 수 있다. 바이오마커 데이터(또는 바이오마커 정보)는 컴퓨터 구현 방법의 일부로 사용하기 위해 컴퓨터로의 입력으로 이용될 수 있다. 바이오마커 데이터는 본원에 기재된 데이터를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 시스템은 입력 데이터를 하나 이상의 프로세서로 제공하기 위한 하나 이상의 장치를 추가로 포함한다.
시스템은 평가된 데이터 요소의 데이터 세트를 저장하기 위한 메모리를 추가로 포함한다.
다른 양태에서, 입력 데이터를 제공하기 위한 장치는 예를 들어 질량 분석기 또는 유전자 칩 판독기와 같은 데이터 요소의 특징을 검출하기 위한 검출기를 포함한다.
시스템은 데이터베이스 관리 시스템을 추가로 포함할 수 있다. 사용자 요청 또는 문의가 데이터베이스 관리 시스템에 의해 이해되는 적절한 언어로 체재화될 수 있으며, 트레이닝 세트의 데이터베이스로부터의 관련 정보를 추출하여 문의를 처리한다.
시스템은 네트워크 서버 및 하나 이상의 고객이 연결된 네트워크에 연결 가능할 수 있다. 네트워크는 당업계에 알려진 근거리 네트워크(LAN) 또는 광역 네트워크(WAN)일 수 있다. 바람직하게는, 서버는 사용자 요청을 처리하기 위한 데이터베이스 데이터에 접근하기 위해 컴퓨터 프로그램 제품(예를 들어, 소프트웨어)을 실행하는 데 필요한 하드웨어를 포함한다.
시스템은 데이터베이스 관리 시스템으로부터의 지시를 실행하기 위한 운영 체계(예를 들어, UNIX® 또는 Linux)를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 운영 체계는 인터넷과 같은 글로벌 통신 네트워크 상에서 운영되며, 이러한 네트워크에 연결하기 위한 글로벌 통신 네트워크 서버를 이용할 수 있다.
시스템은 당업계에 알려진 그래픽 사용자 인터페이스에서 일반적으로 발견되는 버튼, 풀다운 메뉴(pull down menus), 스크롤 바, 문자를 입력하기 위한 영역 등과 같은 인터페이스 요소를 포함하는 그래픽 디스플레이 인터페이스를 포함하는 하나 이상의 장치를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스 상에 입력된 요청은 하나 이상의 시스템 데이터베이스 내의 관련 정보를 검색하도록 체재화하는 시스템 내 응용 프로그램으로 전송될 수 있다. 사용자에 의해 입력된 요청 또는 문의는 임의의 적합한 데이터베이스 언어로 구성될 수 있다.
그래픽 사용자 인터페이스는 운영 체계의 일부로 그래픽 사용자 인터페이스 코드로 생성될 수 있으며, 데이터를 입력하고/하거나 입력된 데이터를 표시하기 위해 사용될 수 있다. 처리된 데이터의 결과는 인터페이스에 표시되고/되거나 시스템과 통신되는 프린터 상에 인쇄되고/되거나 메모리 장치에 저장되고/되거나 네트워크 상에서 전송될 수 있거나, 컴퓨터 판독 가능한 매체의 형태로 제공될 수 있다.
시스템은 입력 장치와 통신되어 데이터 요소 관련 데이터(예를 들어, 발현값)를 시스템에 제공할 수 있다. 일 양태에서, 입력 장치는 예를 들어 질량 분석기, 유전자 칩, 또는 어레이 판독기 등을 포함하는 유전자 발현 프로파일링 시스템을 포함할 수 있다.
다양한 실시형태에 따른 바이오마커 정보를 분석하기 위한 방법 및 장치는 예를 들어 컴퓨터 시스템 상에서 운영되는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 임의의 적합한 방식으로 구현될 수 있다. 프로세서 및 임의 접근 메모리, 예컨대 원격 접근 가능한 응용 서버, 네트워크 서버, 개인용 컴퓨터, 또는 워크스테이션(workstation)을 포함하는 종래의 컴퓨터 시스템이 사용될 수 있다. 추가의 컴퓨터 시스템 구성은 메모리 장치 또는 정보 저장 시스템, 예컨대 대용량 저장 시스템 및 사용자 인터페이스, 예를 들어 종래의 모니터, 키보드, 및 추적 장치를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 독립형 시스템이거나 서버 및 하나 이상의 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터 네트워크의 일부일 수 있다.
바이오마커 분석 시스템은 데이터 수집, 처리, 분석, 보고, 및/또는 진단과 같은 데이터 분석을 완료하기 위한 기능 및 운영을 제공할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 컴퓨터 시스템은 바이오마커 관련 정보를 수용, 저장, 검색, 분석, 및 보고할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 실행할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 미가공 데이터를 처리하고 보완 데이터를 생성하기 위한 처리 모듈 및 미가공 데이터 및 보완 데이터를 분석하여 질병 상태 및/또는 진단을 생성하기 위한 분석 모듈과 같은 다양한 기능 또는 운영을 수행하는 다중 모듈을 포함할 수 있다. 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 식별하는 것은 질병과 관련된 개체의 상태에 관한 추가의 생체의학적 정보를 포함하는 임의의 기타 정보를 생성 또는 수집하는 단계, 추가의 시험이 바람직할 수 있는지 확인하는 단계, 또는 개체의 건강 상태를 달리 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 일부 실시형태는 컴퓨터 프로그램 제품을 포함하도록 실시될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 응용 프로그램이 데이터베이스를 갖는 컴퓨터 상에서 실행되도록 매체 내에서 구현되는 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드를 갖는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, "컴퓨터 프로그램 제품"은 임의의 유형(예를 들어, 서면, 전자, 자기, 광학, 또는 다른 것)의 물리적 매체 상에 보유되며 컴퓨터 또는 다른 자동화 데이터 처리 시스템과 사용될 수 있는 자연 또는 프로그래밍 언어의 형태의 체계화된 지시 세트를 지칭한다. 이러한 프로그래밍 언어 진술은 컴퓨터 또는 데이터 처리 시스템으로 실행될 때 컴퓨터 또는 데이터 처리 시스템이 진술의 특정 내용에 따라 기능하도록 한다. 컴퓨터 프로그램 제품은 제한 없이 컴퓨터 판독 가능한 매체 내에 내장된 시험 또는 데이터 라이브러리 및/또는 목적 코드 및 공급원 내 프로그램(program in source)을 포함한다. 또한, 컴퓨터 시스템 또는 데이터 처리 장비 장치가 사전 선택된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 컴퓨터 프로그램 제품은 비제한적으로 원출처 코드, 어셈블리 코드, 목적 코드, 기계어, 전술한 것의 암호화 또는 압축 버전, 임의 및 모든 등가물을 포함하는 다수의 형태로 제공될 수 있다.
일 양태에서, 컴퓨터 프로그램 제품은 개체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH (예컨대 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH, 또는 2, 3, 또는 4 단계 NASH)를 갖는지를 나타내기 위해 제공된다. 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행 가능한 프로그램 코드를 구현하는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하며, 프로그램 코드는 개체로부터의 생물학적 샘플에 기인한 데이터를 검색하는 코드를 포함하고, 상기 데이터는 본원에 기재된 하나 이상의 바이오마커에 해당하는 바이오마커 수준 및 개체의 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH 상태를 바이오마커 수준의 함수로 나타내는 분류 방법을 수행하는 코드를 포함한다.
다양한 실시형태가 방법 또는 장치로 기재되었지만, 실시형태는 컴퓨터와 결합된 코드, 예를 들어 컴퓨터 상에 상주하거나 컴퓨터에 의해 접근 가능한 코드를 통해 구현될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 소프트웨어 및 데이터베이스가 상기 논의된 다수의 방법을 구현하는 데 이용될 수 있다. 따라서, 하드웨어에 의해 달성된 실시형태 외에, 이들 실시형태는 이 설명에 개시된 기능을 가능하도록 하는 그 내부에 구현된 컴퓨터 판독 가능한 프로그램 코드를 갖는 컴퓨터 사용 가능한 매체로 구성된 제조 물품의 사용을 통해 달성될 수 있는 것이 또한 주지된다. 따라서, 실시형태는 또한 그들의 프로그램 코드 방식에서도 이 특허에 의해 보호되는 것으로 간주되기를 원한다. 또한, 실시형태는 제한 없이 RAM, ROM, 자기 매체, 광학 매체, 또는 자기-광학 매체를 포함하는 사실상 임의의 종류의 컴퓨터-판독 가능한 메모리에 저장된 코드로 구현될 수 있다. 심지어 보다 일반적으로, 실시형태는 비제한적으로 일반적인 목적의 프로세서, 마이크로코드, 프로그램 가능 논리 배열(PLA), 또는 응용 주문형 집적 회로(ASIC) 상에서 실행되는 소프트웨어를 포함하는 소프트웨어에서나 하드웨어에서나 이의 임의의 조합에서 구현될 수 있다.
실시형태는 반송파뿐만 아니라 전송 매체를 통해 전파된 신호(예를 들어, 전기적 및 광학적)에서 구현된 컴퓨터 신호로 달성될 수 있는 것으로 또한 계획된다. 따라서, 상기 논의된 다양한 유형의 정보는 데이터 구조와 같은 구조로 체재화되며, 전송 매체를 통한 전기적 신호로 전송되거나, 컴퓨터 판독 가능한 매체 상에 저장될 수 있다.
치료 방법
일부 실시형태에서, 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH를 갖는다는 것을 결정한 후, 대상체는 질병의 악화를 지연하거나 또는 예방하기 위해 치료 요법을 받는다. 간 지방증, 간 염증, 간 섬유증, 간세포 풍선화, 및/또는 NASH에 대한 비제한적 예시적인 치료 요법은 체중 감량, 혈당 조절, 알코올 회피, 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대한 대상체 검사, 대상체에 위우회술 수행, 및 대상체에게 약물 투여를 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, 약물은 피오글리타존, 비타민 E, 및/또는 메트포르민이다. 예를 들어, Sanyal 등, 2010, NEJM, 362: 1675-1685를 참조한다.
일부 실시형태에서, NAFLD를 모니터하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체가 NAFLD를 갖는지 결정하는 본 방법은 시간 0에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 대상체에서 NAFLD의 진행을 모니터하기 위해 다시 시간 1 및 선택적으로 시간 2 및 선택적으로 시간 3 등에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 상이한 바이오마커가 개체의 질병의 현재 상태에 따라 그리고/또는 질병이 진행하는 것으로 믿어지거나 예측되는 속도에 따라 상이한 시간 지점에서 사용된다.
기타 방법
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이오마커 및 방법은 의료 보험료 및/또는 생명 보험료를 결정하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법의 결과는 의료 보험료 및/또는 생명 보험료를 결정하는 데 사용된다. 일부 이러한 예에서, 의료 보험 또는 생명 보험을 제공하는 조직은 대상체의 NASH 상태에 대한 정보를 요청하거나 달리 획득하며, 대상체에 대한 적절한 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 데 이 정보를 사용한다. 일부 실시형태에서, 의료 보험 또는 생명 보험을 제공하는 단체에 의해 시험이 요청되거나 지불된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 바이오마커 및 방법은 의료 자원의 이용을 예측 및/또는 관리하는 데 사용된다. 일부 이러한 실시형태에서, 본 방법은 이러한 예측의 목적을 위해 수행되지 않지만, 본 방법으로부터 획득된 정보는 의료 자원 이용의 이러한 예측 및/또는 관리에서 사용된다. 예를 들어, 시험 기관 또는 병원은 특정 기관 또는 특정 지리적 지역에서의 의료 자원의 이용을 예측 및/또는 관리하기 위해 다수의 개체에 대한 본 방법으로부터의 정보를 모을 수 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공되며, 첨부된 청구항에 의해 정의된 적용의 범주를 제한하도록 의도되지 않는다. 하기 실시예에서 기재된 일반적인 분자 생물학 기술은 Sambrook 등., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001)와 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
실시예 1. 바이오마커 식별을 위한 다중 압타머 검정 및 통계적 접근법
다중 압타머 검정을 사용하여 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 또는 간 섬유증의 전조가 되는 바이오마커를 식별하기 위해 시험 샘플 및 대조군 샘플을 분석하였다. 다중 검정은 낮은 검출 한계(1 pM 평균값), 약 7 로그의 동적 영역, 및 약 5%의 평균 변이 계수로 적은 샘플 용량(약 65 μl의 혈청 또는 혈장)으로부터의 혈액 내 대략 5,000개의 단백질을 검출하는 압타머를 포함하였다. 다중 압타머 검정은 일반적으로 예를 들어, Gold 등, (2010) Aptamer-Based Multiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discovery. PLoS ONE 5(12): e15004; 및 미국 특허출원공개 US 2012/0101002호 및 US 2012/0077695호에 기술된다.
간 지방증 분류기
표 1에 나타낸, 안정성 선택에 의해 선택된 12개의 바이오마커 패널은 랜덤 포레스트 알고리즘(random forest algorithm)에 적용되어 모델을 생성하였다. 엘라스틱 넷 로지스틱 회귀 모델(elastic net logistic regression models)은 ROC 곡선 아래 면적 (AUC)을 포함하는, 다양한 모델의 성능을 결정하는데 사용되었다. 결과는 표 1에 열거된 바이오마커의 1 내지 5로 구성된 모델에 대해 표 2에 나타난다. 표 2의 "N/A"의 항목은 나타낸 바와 같이, 모델이 1, 2, 3 또는 4개의 바이오마커로만 구성되었음을 나타낸다.
표 1: 간 지방증에 대한 특정 바이오마커
표 2
간 염증 분류기
표 3에 나타낸, 안정성 선택에 의해 선택된 14개의 바이오마커 패널은 랜덤 포레스트 알고리즘에 적용되어 모델을 생성하였다. 엘라스틱 넷 로지스틱 회귀 모델은 ROC 곡선 아래 면적 (AUC)을 포함하는, 다양한 모델의 성능을 결정하는데 사용되었다. 결과는 표 3에 열거된 바이오마커의 1 내지 8로 구성된 모델에 대해 표 4에 나타난다. 표 4의 공란 항목은 나타낸 바와 같이, 모델이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 바이오마커로만 구성되었음을 나타낸다.
표 3: 간 염증에 대한 특정 바이오마커
표 4
간세포 풍선화 분류기
표 5에 나타낸, 안정성 선택에 의해 선택된 5개의 바이오마커 패널은 랜덤 포레스트 알고리즘에 적용되어 모델을 생성하였다. 엘라스틱 넷 로지스틱 회귀 모델은 ROC 곡선 아래 면적 (AUC)을 포함하는, 다양한 모델의 성능을 결정하는데 사용되었다. 결과는 표 5에 열거된 바이오마커의 1 내지 전체 5로 구성된 모델에 대해 표 6에 나타난다. 표 6의 공란 항목은 나타낸 바와 같이, 모델이 1, 2, 3, 또는 4개의 바이오마커로만 구성되었음을 나타낸다.
표 5: 간세포 풍선화에 대한 특정 바이오마커
표 6
간 섬유증 분류기
표 7에 나타낸, 안정성 선택에 의해 선택된 8개의 바이오마커 패널은 랜덤 포레스트 알고리즘에 적용되어 모델을 생성하였다. 엘라스틱 넷 로지스틱 회귀 모델은 ROC 곡선 아래 면적 (AUC)을 포함하는, 다양한 모델의 성능을 결정하는데 사용되었다. 결과는 표 7에 열거된 바이오마커의 1 내지 4로 구성된 모델에 대해 표 8에 나타난다. 표 8의 공란 항목은 나타낸 바와 같이, 모델이 1, 2, 또는 3개의 바이오마커로만 구성되었음을 나타낸다.
표 7: 간세포 풍선화에 대한 특정 바이오마커
표 8
실시예 2: 압타머를 사용한 예시적인 바이오마커 검출
샘플 내 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 예시적인 방법은 예를 들어 Kraemer 등, PLoS One 6(10): e26332에 기술되며, 하기 기재된다. 정량의 세 가지 상이한 방법: 마이크로어레이-기반 혼성화, Luminex 비드-기반 방법, 및 qPCR이 기재된다.
시약
HEPES, NaCl, KCl, EDTA, EGTA, MgCl2, 및 Tween-20은 예를 들어 Fisher Biosciences로부터 구매할 수 있다. 덱스트란 설페이트 나트륨염(DxSO4), 공칭 8000 분자량은 예를 들어 AIC로부터 구매할 수 있고, 한 번 교환으로 적어도 20시간 동안 탈이온수에 대해 투석된다. KOD EX DNA 중합 효소는 예를 들어 VWR로부터 구매할 수 있다. 테트라메틸암모늄 클로라이드 및 CAPSO는 예를 들어 Sigma-Aldrich로부터 구매할 수 있고, 스트랩타비딘-피코에리트린(SAPE)은 예를 들어 Moss Inc로부터 구매할 수 있다. 4-(2-아미노에틸)-벤젠설포닐플로라이드 하이드로클로라이드(AEBSF)는 예를 들어 Gold Biotechnology로부터 구매할 수 있다. 스트렙타비딘-코팅 96-웰 플레이트는 예를 들어 Thermo Scientific으로부터 구매할 수 있다(피어스 스트렙타비딘 코팅 플레이트 HBC, 투명, 96-웰, 제품 번호 15500 또는 15501). NHS-PEO4-비오틴은 예를 들어 Thermo Scientific(EZ-링크 NHS-PEO4-비오틴, 제품 번호 21329)로부터 구매할 수 있으며, 무수 DMSO 중에 용해될 수 있고, 단일 사용 분취량으로 동결 저장될 수 있다. IL-8, MIP-4, Lipocalin-2, RANTES, MMP-7, 및 MMP-9는 예를 들어 R&D Systems로부터 구매할 수 있다. 리지스틴 및 MCP-1은 예를 들어 PeproTech로부터 구매할 수 있고, tPA는 예를 들어 VWR로부터 구매할 수 있다.
핵산
종래(아민- 및 비오틴-치환 포함)의 올리고데옥시뉴클레오티드는 예를 들어 Integrated DNA Technologies(IDT)로부터 구매할 수 있다. Z-블록은 서열 5'- (AC-BnBn)7-AC-3'의 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드이며, Bn은 벤질 치환된 데옥시우리딘 잔기를 나타낸다. Z-블록은 종래의 포스포라미디트 화학을 사용하여 합성할 수 있다. 압타머 포획 시약은 또한 종래의 포스포라미디트 화학을 사용하여 합성할 수 있으며, 예를 들어 timberline TL-600 또는 TL-150 가열기 및 생성물을 용출하는 트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB)/ACN의 구배를 사용하여 Waters Autopurification 2767(또는 Waters 600 시리즈 반-자동화 시스템(semi-automated system) 상의 80℃에서 작동하는 예를 들어 21.5x75 mm PRP-3 컬럼 상에서 정제할 수 있다. 검출은 260 nm에서 수행되며, 분획은 최상의 분획을 모으기 전에 주요 피크에 걸쳐 수집한다.
완충액
완충액 SB18은 NaOH로 pH 7.5로 조절된 40 mM HEPES, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 및 0.05%(v/v) Tween-20으로 구성된다. 완충액 SB17은 1 mM의 트리나트륨 EDTA가 보충된 SB18이다. 완충액 PB1은 NaOH로 pH 7.5로 조절된 10 mM HEPES, 101 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM 트리나트륨 EDTA, 및 0.05%(v/v) Tween-20으로 구성된다. CAPSO 용출 완충액은 100 mM CAPSO pH 10.0 및 1 M NaCl로 구성된다. 중화 완충액은 500 mM HEPES, 500 mM HCl, 및 0.05%(v/v) Tween-20을 함유한다. Agilent 혼성화 완충액은 키트(올리고 aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트) 의 일부로 공급되는 전매 제형이다. Agilent 세척 완충액 1은 전매 제형(올리고 aCGH/ChIP-온-칩 세척 완충액 1, Agilent)이다. Agilent 세척 완충액 2는 전매 제형(올리고 aCGH/ChIP-온-칩 세척 완충액 2, Agilent)이다. TMAC 혼성화 용액은 4.5 M 테트라메틸암모늄 클로라이드, 6 mM 트리나트륨 EDTA, 75 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 및 0.15%(v/v) 사르코실로 구성된다. KOD 완충액(10배 농축)은 1200 mM Tris-HCl, 15 mM MgSO4, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 1% v/v Triton-X 100, 및 1 mg/mL BSA로 구성된다.
샘플 제조
혈청(10 μL 분취량으로 -80℃에서 저장됨)을 25℃ 수조 내에서 10분 동안 해동한 후 샘플 희석 전에 얼음 상에 저장한다. 샘플을 8초 동안 온화한 와류로 혼합한다. 6%의 혈청 샘플 용액을 0.6 mM MgCl2, 1 mM 트리나트륨 EGTA, 0.8 mM AEBSF, 및 2 μM Z-블록이 보충된 0.94Х SB17 내에 희석하여 제조하였다. 6% 혈청 저장 용액 중 일부를 SB17 내에서 10배로 희석하여 0.6% 혈청 저장물을 제조하였다. 일부 실시형태에서, 6% 및 0.6% 저장물을 고- 및 저-존재도 피분석물을 각각 검출하는 데 사용한다.
포획 시약(압타머) 및 스트렙타비딘 플레이트 제조
압타머는 그들의 동족 피분석물(또는 바이오마커)의 상대적 존재도에 따라 2개의 혼합물로 분류한다. 저장 농도는 각각의 압타머에 대해 4 nM이고, 각각의 압타머의 최종 농도는 0.5 nM이다. 압타머 저장 혼합물은 사용 전에 SB17 완충액 중에 4배로 희석하고, 95℃에서 5분 동안 가열하고, 15분의 기간에 걸쳐 37℃로 냉각한다. 이 변성-복원 주기는 압타머 형태이성질체 분포를 정규화하며 따라서 가변적 이력에도 불구하고 재현 가능한 압타머 활성을 보장하도록 의도된다. 스트렙타비딘 플레이트는 사용 전에 150 μL 완충액 PB1으로 두 차례 세척한다.
배양 및 플레이트 포획
가열-냉각된 2× 압타머 혼합물(55 μL)을 동일한 부피의 6% 또는 0.6% 혈청 희석액과 조합하여 3% 및 0.3% 혈청을 함유하는 배양 혼합물을 제조한다. 플레이트는 실리콘 실링 매트(Axymat 실리콘 실링 매트, VWR)로 실링하고, 37℃에서 1.5시간 동안 배양한다. 배양 혼합물을 이어서 세척된 96-웰 스트렙타비딘 플레이트의 웰로 옮기고, 37℃로 설정된 Eppendorf Thermomixer 상에서 800 rpm으로 진탕하며 2시간 동안 추가로 배양한다.
수동 검정
달리 명시되지 않는 한, 액체는 쏟아 버린 후 적층된 종이 타월 상에 두 번 두드려서 제거한다. 세척 부피는 150 μL이고, 모든 진탕 배양은 25℃, 800 rpm으로 설정된 Eppendorf Thermomixer 상에서 수행한다. 배양 혼합물을 피펫으로 옮겨서 제거하고, 플레이트를 1 mM 덱스트린 설페이트 및 500 μM 비오틴이 보충된 완충액 PB1으로 1분 동안 두 차례 세척한 후 완충액 PB1으로 15초 동안 네 차례 세척한다. 새롭게 제조된 완충액 PB1 중 1 mM NHS-PEO4-비오틴 용액(150 μL/웰)을 첨가하고, 플레이트를 진탕하면서 5분 동안 배양한다. NHS-비오틴 용액을 제거하고, 플레이트를 20 mM 글리신이 보충된 완충액 PB1으로 세 차례 세척하고, 완충액 PB1으로 세 차례 세척한다. 1 mM DxSO4가 보충된 85 μL의 완충액 PB1을 이어서 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 BlackRay UV 램프(공칭 파장 365 nm) 하에 5 cm의 거리에서 진탕하면서 20분 동안 조사한다. 샘플을 새로운, 세척된 스트렙타비딘-코팅 플레이트 또는 기존 세척된 스트렙타비딘 플레이트의 미사용 웰로 옮겨서 고 및 저 샘플 희석 혼합물을 단일 웰로 조합한다. 샘플을 진탕하면서 실온에서 10분 동안 배양한다. 흡착되지 않은 물질은 제거하고, 플레이트를 각각 30% 글리세롤이 보충된 완충액 PB1으로 15초 동안 여덟 차례 세척한다. 이어서, 플레이트를 완충액 PB1으로 한 차례 세척한다. 압타머를 100 μL CAPSO 용출 완충액으로 실온에서 5분 동안 용출시킨다. 90 μL의 용출액을 96-웰 HybAid 플레이트로 옮기고, 10 μL 중화 완충액을 첨가한다.
반-자동화 검정
흡착된 배양 혼합물을 보유하는 스트렙타비딘 플레이트를 BioTek EL406 플레이트 세척기의 데크 상에 놓고, 이는 하기 단계를 수행하도록 프로그램화된다: 비흡착된 물질을 흡인으로 제거하고, 웰을 1 mM 덱스트란 설페이트 및 500 μM 비오틴이 보충된 300 μL의 완충액 PB1로 네 차례 세척한다. 이어서, 웰을 300 μL의 완충액 PB1로 세 차례 세척한다. 완충액 PB1 중 새롭게 제조(DMSO 중 100 mM 저장물로부터)된 150 μL의 1 mM NHS-PEO4-비오틴용액을 첨가한다. 플레이트를 진탕하면서 5분 동안 배양한다. 액체를 흡인하고, 웰을 10 mM 글리신이 보충된 300 μL 완충액 PB1으로 여덟 차례 세척한다. 1 mM 덱스트란 설페이트가 보충된 100 μL의 완충액 PB1을 첨가한다. 이들 자동화 단계 후, 플레이트를 플레이트 세척기로부터 제거하고, 5 cm의 거리에서 UV 광원(BlackRay, 공칭 파장 365 nm) 하에 결합된 열진탕기 상에 20분 동안 놓는다. 열진탕기는 800 rpm 및 25℃로 설정한다. 20분 조사 후, 샘플을 수동으로 새로운, 세척된 스트렙타비딘 플레이트(또는 기존의 세척된 플레이트의 미사용 웰로)로 옮긴다. 고-존재도(3% 혈청+3% 압타머 혼합물) 및 저-존재도 반응 혼합물(0.3% 혈청+0.3% 압타머 혼합물)을 이 시점에서 단일 웰로 조합한다. 이 "Catch-2" 플레이트를 BioTek EL406 플레이트 세척기의 데크 상에 놓고 이는 하기 단계를 수행하도록 프로그램화된다: 플레이트를 진탕하면서 10분 동안 배양한다. 액체는 흡입하고, 웰을 30% 글리세롤이 보충된 300 μL의 완충액 PB1으로 21 차례 세척한다. 웰을 300 μL의 완충액 PB1으로 다섯 차례 세척하고, 최종 세척물은 흡인한다. 100 μL CAPSO 용출 완충액을 첨가하고, 압타머를 진탕하면서 5분 동안 용출시킨다. 이들 자동화 단계 후, 플레이트를 이어서 플레이트 세척기의 데크로부터 제거하고, 샘플 중 90 μL 분취량을 10 μL 중화 완충액을 보유하는 HybAid 96-웰 플레이트의 웰로 수동으로 옮긴다.
맞춤형 Agilent 8Х15k 마이크로어레이에 대한 혼성화
24 μL의 중화된 용출물을 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고, 10 Cy3 압타머로 구성된 혼성화 대조군 세트를 보유하는 6 μL의 10× Agilent Block(올리고 aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트, 대용량, Agilent 5188-5380)을 각각의 웰에 첨가한다. 30 μL의 2× Agilent 혼성화 완충액을 각각의 샘플에 첨가하고, 혼합한다. 40 μL의 수득된 혼성화 용액을 혼성화 가스켓 슬라이드(Hybridization Gasket Slide, 슬라이드 형태 당 8-마이크로어레이, Agilent)의 각각의 "웰" 내로 수동으로 피펫으로 옮긴다. 20× dT 링커를 갖는 각각의 압타머의 40개의 뉴클레오티드 랜덤 영역에 상보적인 어레이 당 10개의 탐침을 보유하는 맞춤형 Agilent 마이크로어레이 슬라이드를 제조업체의 프로토콜에 따라 가스켓 슬라이드 상에 놓는다. 어셈블리(혼성화 챔버 키트 - SureHyb-사용 가능한, Agilent)를 잠그고, 20 rpm에서 회전하면서 60℃에서 19시간 동안 배양한다.
혼성화 이후 세척
대략 400 mL의 Agilent 세척 완충액 1을 각각의 두 개의 별도의 유리 착색 디쉬에 놓는다. 슬라이드(한 번에 2개 이하)를 해체하고, 세척 완충액 1 내에 잠긴채로 분리한 후 세척 완충액 1을 또한 보유하는 제2 착색 디쉬 내의 슬라이드 랙(slide rack)으로 옮긴다. 슬라이드를 교반하면서 세척 완충액 1 내에서 추가 5분 동안 배양한다. 슬라이드를 37℃에서 사전 평형화된 세척 완충액 2로 옮기고, 교반하면서 5분 동안 배양한다. 슬라이드를 아세토니트릴을 보유하는 제4 착색 디쉬로 옮기고, 교반하면서 5분 동안 배양한다.
마이크로어레이 영상화
마이크로어레이 슬라이드를 100% PMT 설정으로 5 μm 분해능의 Cy3-채널을 사용하는 Agilent G2565CA Microarray Scanner System 및 0.05에서 사용 가능한 XRD 옵션으로 영상화한다. 수득된 TIFF 이미지를 GE1_105_Dec08 프로토콜로 Agilent 특성 추출 소프트웨어 버전 10.5.1.1을 사용하여 처리한다.
Luminex 탐침 설계
비드에 고정된 탐침은 표적 압타머의 40개의 뉴클레오티드 랜덤 영역의 3' 말단에 상보적인 40개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는다. 압타머 상보 영역은 5' 아미노 말단을 보유하는 헥사에틸렌글리콜(HEG) 링커를 통해 Luminex Microspheres에 결합된다. 비오티닐화 검출 데옥시올리고뉴클레오티드는 표적 압타머의 5' 프라이머 영역에 상보적인 17 내지 21개의 데옥시뉴클레오티드를 포함한다. 비오틴 모이어티는 검출 올리고의 3' 말단에 첨부된다.
탐침의 Luminex Microspheres에 대한 결합
탐침은 본질적으로 제조업체의 지시에 따라 Luminex Microplex Microspheres에 결합되지만, 하기 변형을 갖는다: 아미노-말단 올리고뉴클레오티드 양은 2.5×106 미세구 당 0.08 nmol이고, 제2 EDC 첨가는 10 mg/mL로 5 μL이다. 결합 반응은 25℃ 및 600 rpm으로 설정된 Eppendorf ThermoShaker에서 수행한다.
미세구 혼성화
미세구 저장 용액(약 40000 미세구/μL)을 와류 혼합하고, Health Sonics 초음파 세정기(모델: T1.9C)에서 60초 동안 초음파 처리하여 미세구를 현탁시킨다. 현탁된 미세구를 1.5× TMAC 혼성화 용액 내에서 반응 당 2000개의 미세구로 희석하고, 와류 및 초음파 처리에 의해 혼합한다. 비드 혼합물의 반응 당 33 μL를 96-웰 HybAid 플레이트 내로 옮긴다. 1× TE 완충액 중 7 μL의 15 nM 비오티닐화 검출 올리고뉴클레오티드 저장물을 각각의 반응에 첨가하고, 혼합한다. 10 μL의 중화 검정 샘플을 첨가하고, 플레이트를 실리콘 캡 매트 실링재로 실링한다. 플레이트를 먼저 96℃에서 5분 동안 배양하고, 종래의 혼성화 오븐 내에서 교반 없이 50℃에서 밤새 배양한다. 필터 플레이트(Dura pore, Millipore 부품 번호 MSBVN1250, 1.2 μm 기공 크기)를 0.5%(w/v) BSA가 보충된 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액으로 사전습윤시킨다. 혼성화 반응으로부터의 전체 샘플 부피를 필터 플레이트로 옮긴다. 혼성화 플레이트를 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액으로 헹구고, 임의의 잔여 물질을 필터 플레이트로 옮긴다. 샘플은 약 8초에 걸쳐 진공 배기된 150 μL의 완충액으로 낮은 진공 하에서 여과한다. 필터 플레이트를 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액으로 한 차례 세척하고, 필터 플레이트 내 미세구를 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액 내에 재현탁시킨다. 필터 플레이트를 광으로부터 보호하고, Eppendorf Thermalmixer R 상에서 1000 rpm으로 5분 동안 배양한다. 필터 플레이트를 이어서 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액으로 한 차례 세척한다. 1Х TMAC 혼성화 용액 중 75 μL의 10 μg/mL의 스트렙타비딘 피코에리트린(SAPE-100, MOSS, Inc.)을 각각의 반응에 첨가하고, Eppendorf Thermalmixer R 상에서 25℃에서 1000 rpm으로 60분 동안 배양한다. 필터 플레이트를 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액으로 두 차례 세척하고, 필터 플레이트 내의 미세구를 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액 내에 재현탁시킨다. 필터 플레이트를 이어서 Eppendorf Thermalmixer R 상에서 1000 rpm으로 5분 동안 광으로부터 보호하며 배양한다. 필터 플레이트를 이어서 0.5% BSA를 함유하는 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액으로 한 차례 세척한다. 미세구를 0.5% BSA가 보충된 75 μL의 1× TMAC 혼성화 용액 내에 재현탁시키고, Luminex 100 기기 실행 XPonent 3.0 소프트웨어 상에서 분석한다. 적어도 100개의 미세구가 높은 PMT 교정 및 7500 내지 18000의 이중항 판별기 설정 하에 비드 유형 당 계수된다.
QPCR 판독
qPCR에 대한 표준 곡선을 10배 희석 및 비-견본 대조군을 갖는 108 내지 102개의 복제물 범위의 수 중에서 생성한다. 중화된 검정 샘플을 diH2O 중에서 40배 희석한다. qPCR 마스터 혼합물은 2× 최종 농도(2Х KOD 완충액, 400 μM dNTP 혼합물, 400 nM 포워드 및 리버스 프라이머 혼합물, 2Х SYBR Green I, 및 0.5 U KOD EX)로 제조한다. 10 μL의 2× qPCR 마스터 혼합물을 10 μL의 희석된 검정 샘플에 첨가한다. qPCR을 BioRad MyIQ iCycler 상에서 96℃에서 2분 동안 실행한 후 96℃에서 5초 동안 및 72℃에서 30초 동안 40 주기를 실행한다.
전술한 실시형태 및 실시예는 오직 예시로서만 의도된다. 특정 실시형태, 실시예, 또는 특정 실시형태 또는 실시예의 구성은 임의의 청구항의 중요하거나, 필요하거나, 본질적인 구성 또는 특징으로 해석되어야 한다. 다양한 교체, 변경, 치환, 및 다른 변형이 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 출원의 범주를 벗어나지 않고 개시된 실시형태에 이루어질 수 있다. 이는 도면 및 실시예를 포함하는 명세서는 제한하는 것보다는 예시적인 방식으로 간주되어야 하며, 모든 이러한 변경 및 치환은 본 출원의 범주 내에 포함되도록 의도된다. 임의의 방법 또는 공정 청구항에서 열거된 단계는 임의의 실행 가능한 순서로 실행되며, 임의의 실시형태, 실시예, 또는 청구항에 제시된 순서에 제한되지 않는다. 추가로, 상기 언급된 임의의 방법에서, 하나 이상의 구체적으로 열거된 바이오마커는 개별적인 바이오마커로서나 임의의 패널로부터의 바이오마커로서 특히 제외될 수 있다.
Claims (121)
- 대상체가 간 지방증을 갖는지를 결정하는 방법으로서, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 N은 적어도 1이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, INHBC, 및 BPIB1로부터 선택되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 대상체가 간 지방증을 갖는 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N은 1 내지 12이거나, 또는 N은 2 내지 12이거나, 또는 N은 3 내지 12이거나, 또는 N은 4 내지 12이거나, 또는 N은 5 내지 12이거나, 또는 N은 1 내지 5이거나, 또는 N은 2 내지 5이거나, 또는 N은 3 내지 5이거나, 또는 N은 4 내지 5인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10이거나, 또는 N은 11이거나, 또는 N은 12인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1 및 INHBC로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 FBP12, RECQ1, BGLR, CNDP1, SOM2, 및 GRID2로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 INSL5, HEXB, 및 ERN1로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N개 바이오마커 단백질 각각은 PTGR1, INHBC, BPIB1, FBP12, RECQ1, BGLR, CNDP1, SOM2, GRID2, INSL5, HEXB, 및 ERN1로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 PTGR1, CNDP1, 및 ERN1로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 PTGR1, INSL5, 및 HEXB로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 INHBC, HEXB, 및 CNDP1로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 BPIB1, CNDP1, INSL5, HEXB, 및 ERN1로부터 선택되는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 지방증을 갖는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 간 지방증은 경증, 중등도, 또는 중증의 간 지방증인, 방법.
- 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 NASH를 갖는, 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 NASH는 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH인, 방법.
- 대상체가 간 염증을 갖는지를 결정하는 방법으로서, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 N은 적어도 1이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 MAAI, SAA2, RPN1, 및 PCOC2로부터 선택되는, 방법.
- 대상체가 간 염증을 갖는지를 결정하는 방법으로서, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 MAAI, SAA2, RPN1, PCOC2, CA198, CTCF, 및 TACD2로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 대상체가 간 염증을 갖는 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 1 내지 14이거나, 또는 N은 2 내지 14이거나, 또는 N은 3 내지 14이거나, 또는 N은 4 내지 14이거나, 또는 N은 5 내지 14이거나, 또는 N은 6 내지 14이거나, 또는 N은 7 내지 14이거나, 또는 N은 8 내지 14이거나, 또는 N은 1 내지 8이거나, 또는 N은 2 내지 8이거나, N은 3 내지 8이거나, 또는 N은 4 내지 8이거나, 또는 N은 5 내지 8인, 방법.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8이거나, 또는 N은 9이거나, 또는 N은 10이거나, 또는 N은 11이거나, 또는 N은 12이거나, 또는 N은 13이거나, 또는 N은 14인, 방법.
- 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 CA198, CTCF, 및 TACD2로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PPAC, ADIPO, PYY, FCG3B, TRXR1, ACY1, 및 CCL23로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N개 바이오마커 단백질 각각은 MAAI, SAA2, RPN1, PCOC2, CA198, CTCF, TACD2, PPAC, ADIPO, PYY, FCG3B, TRXR1, ACY1, 및 CCL23로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 PCOC2, PYY, 및 TRXR1로부터 선택되는, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 TACD2, TRXR1, 및 ACY1로부터 선택되는, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 CA198 및 TRXR1인, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 CA198, FCG3B, 및 ACY1로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 RPN1, PYY, 및 ACY1로부터 선택되는, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 TACD2, PPAC, 및 TRXR1로부터 선택되는, 방법.
- 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 CTCF, ADIPO, 및 TRXR1로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 SAA2, PPAC, 및 ACY1로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 염증을 갖는, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 간 염증은 경증, 중등도, 또는 중증의 간 염증인, 방법.
- 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 NASH를 갖는, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 NASH는 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH인, 방법.
- 대상체가 간세포 풍선화를 갖는지를 결정하는 방법으로서, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 N은 적어도 1이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 PTGR1, ATL2, 및 CNN2로부터 선택되는, 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 대상체가 간세포 풍선화를 갖는 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 N은 1 내지 5이거나, 또는 N은 2 내지 5이거나, 또는 N은 3 내지 5이거나, 또는 4 내지 5이거나, 또는 N은 1 내지 2이거나, N은 1 내지 3이거나, 또는 N은 1 내지 4인, 방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5인, 방법.
- 제37항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 AK1BA 및 CTLA4로부터 선택되는, 방법.
- 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N개 바이오마커 단백질 각각은 PTGR1, ATL2, CNN2, AK1BA 및 CTLA4로부터 선택되는, 방법.
- 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 3이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 3개는 AK1BA, PTGR1, 및 ATL2인, 방법.
- 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간세포 풍선화를 갖는, 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 간세포 풍선화는 경증, 중등도, 또는 중증의 간세포 풍선화인, 방법.
- 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 NASH를 갖는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 NASH는 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH인, 방법.
- 대상체가 간 섬유증을 갖는지를 결정하는 방법으로서, N개 바이오마커 단백질을 갖는 바이오마커 패널을 형성하는 단계, 및 대상체로부터의 샘플 내의 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 N은 적어도 1이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 ATL2, NFASC, 및 FCRL3로부터 선택되는, 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 대상체가 간 섬유증을 갖는 NASH를 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 N은 1내지 8이거나, 또는 N은 2 내지 8이거나, 또는 N은 3 내지 8이거나, 또는 N은 4 내지 8이거나, 또는 5 내지 8이거나, 또는 N은 6 내지 8이거나, 또는 N은 7 내지 8이거나, 또는 N은 1 내지 2이거나, 또는 N은 1 내지 3이거나, 또는 N은 1 내지 4이거나, 또는 N은 1 내지 5이거나, 또는 N은 1 내지 6이거나, 또는 N은 1 내지 7인, 방법.
- 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 1이거나, 또는 N은 2이거나, 또는 N은 3이거나, 또는 N은 4이거나, 또는 N은 5이거나, 또는 N은 6이거나, 또는 N은 7이거나, 또는 N은 8인, 방법.
- 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, 상기 N개 바이오마커 단백질 중 적어도 하나는 CO7, COL11, VGFR2, WNT5A, 및 PLOD3로부터 선택되는, 방법.
- 제48항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N개 바이오마커 단백질 각각은 ATL2, NFASC, FCRL3, CO7, COL11, VGFR2, WNT5A, 및 PLOD3로부터 선택되는, 방법.
- 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 ATL2 및 VGFR2인, 방법.
- 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 ATL2, COL11, 및 WNT5A로부터 선택되는, 방법.
- 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 N은 적어도 2이고, N개 바이오마커 단백질 중 적어도 2개는 ATL2, CO7, 및 WNT5A로부터 선택되는, 방법.
- 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 섬유증을 갖는, 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 간 섬유증은 경증, 중등도, 또는 중증의 간 섬유증인, 방법.
- 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 NASH를 갖는, 방법.
- 제59항에 있어서, 상기 NASH는 1, 2, 3, 또는 4 단계 NASH인, 방법.
- 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플인, 방법.
- 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 질병의 위험이 있는, 방법.
- 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및/또는 간 섬유증이 발병하거나 또는 이들을 가질 위험이 있는, 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 비만인, 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 샘플 또는 샘플들의 N개 바이오마커 단백질을 N개 바이오마커 포획 시약 세트와 접촉시키는 단계를 포함하고, 바이오마커 포획 시약 세트의 각각의 바이오마커 포획 시약은 검출되는 상이한 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는, 방법.
- 제65항에 있어서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 항체 또는 압타머인, 방법.
- 제66항에 있어서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 압타머인, 방법.
- 제67항에 있어서, 적어도 하나의 압타머는 느린 오프-속도(off-rate) 압타머인, 방법.
- 제68항에 있어서, 적어도 하나의 느린 오프-속도 압타머는 변형을 갖는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제68항 또는 제69항에 있어서, 각각의 느린 오프-속도 압타머는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프 속도 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합하는, 방법.
- 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 간 섬유증, 및/또는 NASH를 갖거나 또는 가질 가능성이 있는, 방법.
- 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결정하는 단계는 분류 모델 또는 엘라스틱 넷 로지스틱 회귀 모델(elastic net logistic regression model)을 사용하여 N개 바이오마커 단백질 수준의 수준을 분석하는 것을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 목적을 위해 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 간 섬유증, 및/또는 NASH를 갖거나 또는 가질 가능성이 있는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료 자원의 이용을 예측하고/하거나 관리하기 위해 상기 방법에서 기인한 정보를 사용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- N개 바이오마커 단백질 포획 시약을 포함하는 키트로서, 상기 N개 바이오마커 단백질 포획 시약은 제1항, 제3항 내지 제12항, 제17항, 제19항, 제20항 내지 제32항, 제37항, 제39항 내지 제43항, 제48항, 및 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항의 N개 바이오마커 단백질에 결합하는, 키트.
- 제76항에 있어서, N개 바이오마커 단백질 포획 시약 각각은 상이한 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는, 키트.
- 제76항 또는 제77항에 있어서, N개 바이오마커 포획 시약 각각은 항체 또는 압타머인, 키트.
- 제78항에 있어서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 압타머인, 키트.
- 제79항에 있어서, 적어도 하나의 압타머는 느린 오프-속도 압타머인, 키트.
- 제80항에 있어서, 적어도 하나의 느린 오프-속도 압타머는 변형을 갖는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 키트.
- 제80항 또는 제81항에 있어서, 각각의 느린 오프-속도 압타머는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프 속도 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합하는, 키트.
- 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터의 샘플에서 N개 바이오마커 단백질을 검출하는데 사용하기 위한, 키트.
- 제83항에 있어서, 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 간 섬유증, 및/또는 NASH를 갖거나 또는 가질 가능성이 있는지를 결정하는 데 사용하기 위한, 키트.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, NASH에 대한 치료가 대상체에게 투여되어야 하는지를 결정하는 단계로서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 지방증 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술(gastric bypass surgery)을 수행하는 단계를 포함하는, 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
a) 대상체로부터의 제1 샘플에서 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제1 샘플은 NASH에 대해 치료되는 대상체 이전의 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료전의 상태를 결정하는, 단계;
b) 대상체에게 NASH에 대한 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 지방증 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 단계;
c) 대상체로부터의 제2 샘플에서 파트 (a)에서 검출된 동일한 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제2 샘플은 대상체가 NASH에 대한 치료를 투여 받은 후에 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료 상태를 결정하는, 단계; 및
d) 치료전의 상태 및 치료 상태를 비교하는 단계,
를 포함하는, 대상체가 NASH에 대한 치료에 반응하는지를 결정하는 단계로서,
상기 대상체는, 상기 비교가 동일한 대상체의 치료전의 상태와 비교해서 간 지방증의 중증도가 감소되었다는 것을 나타내는 경우, NASH 치료에 반응하는 것인, 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 간 생검을 필요로 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 간 지방증의 존재는 대상체가 간 생검이 필요하다는 것을 나타내는, 방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 지방간 질병을 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, NASH에 대한 치료가 대상체에게 투여되어야 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 염증 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
a) 대상체로부터의 제1 샘플에서 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제1 샘플은 NASH에 대해 치료되는 대상체 이전의 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료전의 상태를 결정하는, 단계;
b) 대상체에게 NASH에 대한 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 염증 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 단계;
c) 대상체로부터의 제2 샘플에서 파트 (a)에서 검출된 동일한 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제2 샘플은 대상체가 NASH에 대한 치료를 투여 받은 후에 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료 상태를 결정하는, 단계; 및
d) 치료전의 상태 및 치료 상태를 비교하는 단계로서, 상기 대상체는, 상기 비교가 동일한 대상체의 치료전의 상태와 비교해서 간 염증의 중증도가 감소되었다는 것을 나타내는 경우, NASH 치료에 반응하는 것인, 단계
를 포함하는, 대상체가 NASH에 대한 치료에 반응하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 간 생검을 필요로 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 간 염증의 존재는 대상체가 간 생검이 필요하다는 것을 나타내는, 방법.
- 제17항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 지방간 질병을 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, NASH에 대한 치료가 대상체에게 투여되어야 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간세포 풍선화 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
a) 대상체로부터의 제1 샘플에서 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제1 샘플은 NASH에 대해 치료되는 대상체 이전의 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료전의 상태를 결정하는, 단계;
b) 대상체에게 NASH에 대한 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간세포 풍선화 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 단계;
c) 대상체로부터의 제2 샘플에서 파트 (a)에서 검출된 동일한 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제2 샘플은 대상체가 NASH에 대한 치료를 투여 받은 후에 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료 상태를 결정하는, 단계; 및
d) 치료전의 상태 및 치료 상태를 비교하는 단계로서, 상기 대상체는, 상기 비교가 동일한 대상체의 치료전의 상태와 비교해서 간세포 풍선화의 중증도가 감소되었다는 것을 나타내는 경우, NASH 치료에 반응하는 것인, 단계
를 포함하는, 대상체가 NASH에 대한 치료에 반응하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 간 생검을 필요로 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 간세포 풍선화의 존재는 대상체가 간 생검이 필요하다는 것을 나타내는, 방법.
- 제37항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 지방간 질병을 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, NASH에 대한 치료가 대상체에게 투여되어야 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 섬유증 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
a) 대상체로부터의 제1 샘플에서 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제1 샘플은 NASH에 대해 치료되는 대상체 이전의 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료전의 상태를 결정하는, 단계;
b) 대상체에게 NASH에 대한 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계, 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 섬유증 및/또는 NASH를 치료하는, 단계, 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 단계;
c) 대상체로부터의 제2 샘플에서 파트 (a)에서 검출된 동일한 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 단계로서, 상기 제2 샘플은 대상체가 NASH에 대한 치료를 투여 받은 후에 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료 상태를 결정하는, 단계; 및
d) 치료전의 상태 및 치료 상태를 비교하는 단계로서, 상기 대상체는, 상기 비교가 동일한 대상체의 치료전의 상태와 비교해서 간 섬유증의 중증도가 감소되었다는 것을 나타내는 경우, NASH 치료에 반응하는 것인, 단계
를 포함하는, 대상체가 NASH에 대한 치료에 반응하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 간 생검을 필요로 하는지를 결정하는 단계를 포함하며, 상기 간 섬유증의 존재는 대상체가 간 생검이 필요하다는 것을 나타내는, 방법.
- 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 지방간 질병을 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, NASH에 대한 치료가 대상체에게 투여되어야 하는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제101항에 있어서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계; 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 섬유증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및 간 섬유증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 치료하고/하거나 상기 약물은 NASH를 치료하는, 단계; 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
a) 대상체의 치료전의 상태를 결정하는 단계로서, 대상체로부터의 제1 샘플에서 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 것을 포함하되, 상기 제1 샘플은 NASH에 대해 치료되는 대상체 이전의 대상체로부터 획득됨으로써 대상체의 치료전의 상태를 결정하는, 단계;
b) 대상체에게 NASH에 대한 치료를 투여하는 단계로서, 상기 치료는 당뇨 및/또는 심혈관질환에 대해 대상체를 검사하는 단계; 대상체에게 약물을 투여하는 단계로서, 상기 약물은 간 섬유증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및 간 섬유증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환을 치료하고/하거나 상기 약물은 NASH를 치료하는, 단계; 및/또는 대상체에게 위우회술을 수행하는 단계를 포함하는, 단계;
c) 대상체의 치료 상태를 결정하는 단계로서, 대상체로부터의 제2 샘플에서 파트 (a)에서 검출된 동일한 N개 바이오마커 단백질 각각의 수준을 검출하는 것을 포함하되, 상기 제2 샘플은 대상체가 NASH에 대한 치료를 투여 받은 후에 대상체로부터 획득되는, 단계; 및
d) 치료전의 상태 및 치료 상태를 비교하는 단계로서, 상기 대상체는, 상기 비교가 동일한 대상체의 치료전의 상태와 비교해서 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및 간 섬유증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환의 중증도가 감소되었다는 것을 나타내는 경우, NASH 치료에 반응하는 것인, 단계
를 포함하는, 대상체가 NASH에 대한 치료에 반응하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 간 생검을 필요로 하는지를 결정하는 단계로서, 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및 간 섬유증으로부터 선택되는 적어도 하나의 질환의 존재는 대상체가 간 생검이 필요하다는 것을 나타내는, 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제101항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 지방간 질병을 갖는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제85항, 제87항 내지 제89항, 제91항 내지 제93항, 제95항 내지 제97항, 제99항 내지 제102항, 제104항, 및 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 또는 혈청 샘플인, 방법.
- 제86항, 제90항, 제94항, 제98항, 및 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 샘플 및 제2 샘플은 혈액 샘플, 혈장 샘플, 및 혈청 샘플이고, 제1 샘플 및 제2 샘플은 동일한 유형의 샘플인, 방법.
- 제85항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 질병의 위험이 있는, 방법.
- 제85항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 및/또는 간 섬유증이 발병하거나 또는 이들을 가질 위험이 있는, 방법.
- 제85항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 비만인, 방법.
- 제85항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 샘플 또는 샘플들의 N개 바이오마커 단백질을 N개 바이오마커 포획 시약 세트와 접촉시키는 단계를 포함하고, 바이오마커 포획 시약 세트의 각각의 바이오마커 포획 시약은 검출되는 상이한 바이오마커 단백질에 특이적으로 결합하는, 방법.
- 제111항에 있어서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 항체 또는 압타머인, 방법.
- 제112항에 있어서, 각각의 바이오마커 포획 시약은 압타머인, 방법.
- 제113항에 있어서, 적어도 하나의 압타머는 느린 오프-속도 압타머인, 방법.
- 제114항에 있어서, 적어도 하나의 느린 오프-속도 압타머는 변형을 갖는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
- 제114항 또는 제115항에 있어서, 각각의 느린 오프-속도 압타머는 30분 이상, 60분 이상, 90분 이상, 120분 이상, 150분 이상, 180분 이상, 210분 이상, 또는 240분 이상의 오프 속도 (t½)로 이의 표적 단백질에 결합하는, 방법.
- 제85항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 간 섬유증, 및/또는 NASH를 갖거나 또는 가질 가능성이 있는, 방법.
- 제85항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 결정하는 단계는 분류 모델 또는 엘라스틱 넷 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 N개 바이오마커 단백질 수준의 수준을 분석하는 것을 포함하는, 방법.
- 제85항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 목적을 위해 대상체가 간 지방증, 간 염증, 간세포 풍선화, 간 섬유증, 및/또는 NASH를 갖거나 또는 가질 가능성이 있는지를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제85항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료 보험료 또는 생명 보험료를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제85항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 의료 자원의 이용을 예측하고/하거나 관리하기 위해 상기 방법에서 기인한 정보를 사용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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