KR101993427B1 - 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 CD45 또는 CD66b에 특이적으로 결합 하고, dUTP(deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 소수성 작용기로 치환되어 있는 변형된 염기를 5 내지 20개 포함하고, 총 25 내지 100개의 염기로 이루어진다.

Description

백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 {White blood cell specific aptamer and the use thereof}
본 발명은 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백혈구에 특이적인 CD45 또는 CD66b 압타머 및 이를 이용하여 백혈구를 분리 및 제거하는 방법에 관한 것이다.
압타머 (Aptamer)는 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산) 물질이다. 압타머는 일반적으로 40~100mer로 구성되며, 항체처럼 높은 친화력을 가지고 이들 표적단백질과 결합한다. 압타머는 시험관증폭선택법 (SELEX)이라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성 (보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다.
백혈구 (leukocyte, White Blood Cell, WBC)는　혈액에서　적혈구를 제외한 나머지　세포들을 일컫는다. 백혈구는 혈액을　원심분리할 때　혈장층과 적혈구층 사이에 흰색의 층인 버피 코트 (buffy coat)를 형성하며, 이 층의 색이 희기 때문에 백혈구라고 한다. 정상 성인은 혈액 1L 당 약 4.5~11.0×109개를 가지고 있다. 적혈구와 마찬가지로　골수에서 생성되며 수명은 백혈구 종류에 따라 다르다.
백혈구는 적혈구와 달리 종류가 다양한데,　세포질의 특이 과립의 존재 여부에 따라 크게 과립성 백혈구 (granulocyte)와 무과립성 백혈구 (agranulocyte)로 나눈다. 그리고 과립성 백혈구에는　호산구 (eosinophil),　호염기구 (basophil),　호중구 (neutrophil)가 있으며, 무과립성 백혈구에는　림프구 (lymphocyte)와　단핵구 (monocyte)가 있다. 비율은 호중구가 54~62%로 가장 많으며, 그 다음에는 림프구가 25~45%, 단핵구 4~8%, 호산구와 호염기구가 약 5% 정도를 차지한다.
전혈로부터 혈액성분제제를 제조하는 과정에서 상당량의 백혈구가 적혈구제제 및 혈소판제제에 잔존하게 된다 (Arch Pathol Lab Med 1994; 118:392-404). 이러한 혈액제제 내에 포함된 백혈구로 인하여 비용혈성 발열수혈반응 (nonhemolytic febrile transfusion reaction), HLA 동종면역, 혈소판수혈불응 (platelet refractoriness), 거대세포 바이러스감염 등의 부작용이 발생하며 (Arch Pathol Lab Med 1994; 118:392-404; Hematol Oncol Clin North Am 1995; 9:69-90; Transfus Med Rev 2000; 14:34-52), 이를 예방하기 위하여 백혈구가 제거된 혈액제제의 사용이 권고되고 있다 (Transfusion 2001; 41:1310-9).
또한 혈액 내 다량 존재하는 백혈구 때문에 연구 또는 치료용 목적의 줄기세포 분리에 어려움이 있다. 특히 유핵적혈구 (fetal nucleated red blood cell, FnRBC), 순환종양세포 (circulating tumor cells, CTCs), 및 암줄기세포 (cancer stem cells, CSCs)는 혈액 내 낮은 농도로 존재 (< 10 / ml) 하기 때문에 이들 표적세포들의 분리 수율 (yield), 순도 (purity)를 높이기 위해서는 백혈구 제거가 선행되어야 한다. 백혈구의 대표적인 표지마커인 CD45와 과립성 백혈구에 존재하는 CD66b 마커를 검출하는 것으로 백혈구세포를 동정, 분리 할 수 있다.
순환종양세포가 암종의 전이에서 중요한 역할을 하고 있음은 널리 알려져 있다 (Transfus Med 2005; 15:37-43. Eur J Haematol 1999; 63:29-34). 암에서의 순환종양세포의 검출, 수 측정 및 분석은 진행된 병기의 환자들을 위한 유망하고 새로운 진단분야이다. 그러나, 순환종양세포들은 매우 드물고 구할 수 있는 표본의 양이 매우 제한되므로, 순환종양세포 분석은 엄청난 분석적, 기술적인 과제를 가진다. 순환종양세포들의 분자적 특성해석은 전이 및 기존의 치료에 대 한 내성기전에 대해 더 잘 이해하게 하며, 순환종양세포와 암줄기 세포와의 관계를 밝히는 것은 새로운 치료의 표적으로 이용될 수 있다.
암줄기세포는 모든 암세포가 암을 형성할 수 있는 능력을 가진 것이 아니라, 암세포의 일부분만이 암을 형성할 수 있는 능력을 가지고 있어서, 이 암줄기세포만이 암 치료 후 줄어든 암세포를 재생하는데 관여함으로써 암의 재발이나 전이에 깊은 영향을 미친다. 암줄기세포는 현재 화학요법이나 방사선 치료법에 재성을 갖는 것으로 생각하고 있으며 이러한 이유로 인해 치료 후에도 다시 암이 재발하게 되는 것으로 사료된다. 인체를 구성하는 장기에는 각기 고유한 성체줄기세포가 있어서 장기가 손상받을 때 장기를 재생하고 유지하는 역할을 하듯이, 암조직에도 일반장기처럼 암조직을 유지하는 암줄기세포가 존재한다는 이론과 증거들이 2000년대 초반부터 본격 제기되고 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003).
현재 산전 유전 진단을 위해 흔히 사용되는 융모막 융모검사나 양수천자는 유전 진단에 적합하나 침습적 방법으로 드물게 태아와 산모에게 치명적인 위험을 초래할 수 있다. 따라서 모체의 말초 혈액으로부터 분리된 순수한 태아 세포를 이용한 비침습적인 산전 유전 진단 법이 관심의 대상이 되어 왔다. 모체 혈액 내에 존재하는 태아 유핵적혈구 (fetal nucleated red blood cell; FnRBC)는 비침습적 산전 유전 분석에 있어 가장 좋은 세포로 알려져 있다. 즉 태아 유핵적혈구는 수명이 짧아서 이전 임신에 의한 오진을 배제할 수 있고 태아의 유전자를 모두 포함하고 있고 백혈구 세포보다 더 일찍, 산모의 혈액에서 발견되기 때문이다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 백혈구의 세포 표면에 발현된 CD45 또는 CD66b를 특이적으로 인지하여 혈액 내 소량 존재하는 줄기세포들의 분리효율을 증가시키기 위한 전처리 방법을 제공하고, 이를 이용하여 여러 세포가 혼재되어 있는 혈액으로부터 백혈구만을 선택적으로 분리, 제거할 수 있도록 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는CD45 또는 CD66b에 특이적으로 결합하고, dUTP (deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 트립토판 등과 같은 소수성 작용기로 치환된 변형된 염기를 포함하는, CD45와 CD66b 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 또다른 목적은 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머를 이용하여 상기 압타머들을 이용한 혈액내의 백혈구 분리 또는 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일양상에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 CD45 또는 CD66b에 특이적으로 결합 하고, dUTP(deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 및 트립토판으로 이루어진 군에서 선택된 소수성 작용기로 치환되어 있는 변형된 염기를 5 내지 20개 포함하고, 총 25 내지 100개의 염기로 이루어진다.
또한, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하고, 25 내지 100개의 염기로 이루어진 백혈구에 선택적으로 결합할 수 있다.
또한, 상기 압타머는 서열번호 4로 이루어진 염기서열을 포함하고, 25 내지 100개의 염기로 이루이루어질 수 있다.
또한, 상기 압타머는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민(amine), 티올(thiol), 비오틴(biotin), 카르복실기(carboxyl group) 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합된 백혈구에 선택적으로 결합할 수 있다.
또한, 상기 압타머는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 형광물질이 결합된 백혈구에 선택적으로 결합할 수 있다.
또한, 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 5-bromodesoxyuridin, fluorescein 및 actey laminofluorene 으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형될 수 있다.
본 발명의 다른 양상에 따른 표적물질을 분리 또는 제거하는 방법은 (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계; (2) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머가 포함된 완충액을 담체와 혼합하는 단계;
상기 단계 (2)의 혼합물을 표적 시료에 처리하는 단계; 및 (4) 상기 단계 (3)의 혼합물을 반응시키는 단계를 포함한다.
또한, 상기 표적물질은 과립성 백혈구인 호산구, 호염기구, 호중구, 무과립성 백혈구인 림프구 및 단핵구중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 생물학적 시료는 인간을 제외한 포유류 생체, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액 및 타액 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또한, 상기 혈액은 전혈, 혈구 또는 버피 코트일 수 있다.
또한, 상기 담체는 자성 구슬 또는 비자성 구슬일 수 있다.
또한, 상기 자성 구슬은 다이나비드, 아가로스 자성 구슬, 세파로스 자성 구슬 또는 스트렙토아비딘 자성 구슬일 수 있다.
또는, 상기 비자성 구슬은 아가로스 구슬, 세파로스 구슬, 스트렙토아비딘 아가로스 구슬 또는 스트렙토아비딘 세파로스 구슬일 수 있다.
또한, 상기 완충액은 이가 양이온을 포함할 수 있다.
또한, 상기 이가 양이온은 Mg2+, Ca2+, Mn2+, Cu2+ 및 Fe2+중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 압타머 완충액 내 이가 양이온의 농도는 0.01mM-200mM일 수 있다.
또한, 상기 완충액은 음전하 폴리머를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 음전하 폴리머는 덱스트란 설페이트, 다중 음이온성 셀룰로즈, 히알루론 산, 다중 음이온성 헤파린, 폴리설포네이트 폴리머, 다중 음이온성 덴드리머, 카복시메틸 덱스트란, 헤파린, 아우린트리카트복실산, 및 수라민중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 상기 압타머 완충액 내 음전하 폴리머의 농도는 0.001mM~10mM 일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머(CD45압타머 또는 CD66b압타머)는 백혈구의 세포 표면에 존재하는 CD45와 CD66b를 각각 특이적으로 인식하는 바, 백혈구의 효과적인 분리 및 제거에 용이하게 이용될 수 있으며, 그에 의하여 제거된 시료는 혈액 내 낮은 농도로 존재하는 줄기세포 검출 및 분리에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 압타머와 표적단백질과의 해리상수 (Kd)를 조사하기 위해 CD45 압타머 서열번호 1 내지 3과 CD66b 압타머 서열번호 4의 클론 각각을 filter binding assay를 수행한 결과이다.
도 2는 CD45 압타머와 백혈구세포간의 상호작용에 있어서 Mg2+ 효과를 도시한 도면이다.
도 3은 CD45 압타머와 스트렙트아비딘 자성 구슬을 미리 conjugation한 것과 이들을 따로 혈액시료에 첨가할 경우, 백혈구 제거율을 도시한 도면이다.
도 4는 혈액시료로부터 CD45 압타머를 이용한 백혈구 제거율에 온도가 미치는 영향을 도시한 도면이다.
도 5는 스트렙트아비딘 자성 구슬의 입자 크기가 0.45um, 1um, 그리고 4.5um의 각각 다른 크기의 자성 구슬을 사용하여 혈액시료로부터 CD45 압타머, CD66b 압타머, 그리고 CD45 압타머, CD66b 압타머 칵테일을 이용하여 백혈구 제거율을 도시한 도면이다.
도 6은 Jurkat 세포와 혈액시료로부터 CD45 압타머와 CD66b 압타머를 함께 사용하여 백혈구 제거율을 도시한 도면이다.
본 발명의 목적 및 효과, 그리고 그것들을 달성하기 위한 기술적 구성들은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 뒤에 설명이 되는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 본 발명을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐를 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 뒤에 설명되는 용어들은 본 발명에서의 구조, 역할 및 기능 등을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있다. 단지 본 실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 오로지 특허청구범위에 기재된 청구항의 범주에 의하여 정의될 뿐이다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 백혈구 표면 CD45 또는 CD66b 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 백혈구 분리, 제거 가능한 CD45 또는 CD66b 압타머 및 이를 이용한 혈액 내 백혈구 분리, 제거방법을 제공하는 것이다.
여기서, CD45 또는 CD66b 단백질은 포유류, 바람직하게는 인간에서 유래하는 것일 수 있다. 상기 CD45 또는 CD66b 압타머는 dUTP (deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 트립토판 등과 같은 소수성 작용기로 치환되어 있는 변형된 염기를 포함하여 25 내지 100개, 바람직하게는 30 내지 80개의 염기로 이루어지고, CD45 또는 CD66b에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다. 상기 변형된 염기 이외의 본 발명의 CD45와 CD66b 압타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, T, 및 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 변형된 염기는 dUTP (deoxyuracil)의 5' 위치가 나프틸기, 벤질기, 피롤벤질기, 트립토판 등과 같은 소수성 작용기로 치환되어 변형된 형태를 의미한다. 소수성 작용기는 벤질기, 나프틸기, 피롤벤질기 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이와 같이 dUTP 염기의 5' 위치가 소수성 작용기로 치환되어 변형됨으로써, 변형되지 않은 경우와 비교하여 CD45 또는 CD66b 단백질과의 친화력 (affinity)이 현저하게 높아지는 이점이 있다.
상기 CD45와 CD66b 압타머 내의 상기 변형된 염기 개수는 5 내지 20개, 바람직하게는 7내지 15개일 수 있다.
이들 압타머는 CD45 또는 CD66b에 특이적인 것일 수 있으며, 이들 CD45 또는 CD66b에 특이적인 압타머는 백혈구세포를 특이적으로 인식하는 것일 수 있다.
상기 CD45 압타머는 서열번호 1내지 3으로 이루어진 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어지거나, 상기 염기서열 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 15 내지 30개의 염기로 이루어진 염기서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, CD45 압타머는 서열번호 1로 이루어진 염기서열의 5' 말단에 TCAGCCGCCAGCCAGTTC (서열번호 5)를 갖고, 3' 말단에 GACCAGAGCACCACAGAG (서열번호 6)를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 CD66b 압타머는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지거나, 염기서열 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 15 내지 30개의 염기로 이루어진 염기서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, CD66b 압타머는 서열번호 4로 이루어진 염기서열의 5' 말단에 CGAGCGTCCTGCCTTTG (서열번호 7)를 갖고, 3' 말단에 CACCGACAGCCACCCAG (서열번호 8)를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 CD45와 CD66b 압타머는 25 내지 100개, 바람직하게는 30 내지 80개의 염기로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 CD45와 CD66b 압타머는, 혈청 내 안정성 증진을 위하여, 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단 모두가 변형되어 혈청 내 안정성이 증진된 것일 수 있다.
상기 변형은 5' 말단, 3' 말단, 또는 양 말단에 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드 (2'-methoxynucleoside), 2'-아미노 뉴클레오사이드 (2'-aminonucleoside), 아민 링커 (aminelinker), 티올링커 (thiollinker), 및 콜레스테롤 (cholesterol) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합되어 변형된 것일 수 있다.
상기 'idT (inverted deoxythymidine)'는 일반적으로 뉴클레아제 (nuclease)에 대한 내성이 약한 압타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-OH와 결합하여 사슬을 이루지만 idT는 앞 단위체의 3'-OH에 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3' 엑소뉴클레아제 (3' exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
본 발명자들은 상기 CD45와 CD66b 압타머가 혈액 내 백혈구 분리 및 제거에 효과적임을 확인하였다 (실시예 2, 3, 및 실시예 4 참조).
예컨대, 본 발명에 따른 CD45와 CD66b 압타머는 CD45와 CD66b의 세포외 도메인 (extracellular domain)에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 CD45와 CD66b 압타머를 이용하여 백혈구 분리, 제거 방법을 제공한다.
상기 백혈구 분리, 제거 방법은 (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계; (2) 압타머가 포함된 완충액을 자성 구슬 (magnetic bead)와 혼합하는 단계; (3) 상기 단계 (2)의 혼합물을 표적 시료에 처리하는 단계; (4) 상기 단계 (3)의 혼합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 표적물질의 제거 방법을 제공한다. 상기 표적물질은 백혈구 세포일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 포유류, 바람직하게는 인간에서 유래하는 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않고, 인간을 제외한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액, 타액 등일 수 있다.
이하, 백혈구 표면 CD45 또는 CD66b 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 백혈구 검출이 가능하거나 제거 가능한 CD45 또는 CD66b 압타머 및 이를 이용한 혈액 내 백혈구 분리, 제거방법에 대하여 상세하게 설명한다.
상기 압타머는 CD45 또는 CD66b 단백질에 특이적인 것일 수 있으며, 상기 압타머는 백혈구를 특이적으로 인식하는 것일 수 있다. 가장 바람직하게 상기 CD45 압타머는 서열번호 1, 2, 또는 3의 염기서열을 포함하는 것, 또는 해당 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, CD66b 압타머는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 것, 또는 해당 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 압타머들은 서열번호 1, 2, 3 또는 4와 80% 이상의 상동성을 가진 핵산서열일 수 있다. 본원에서 "80% 이상의 상동성을 가지는 핵산서열"이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 80% 이상 100% 미만의 서열에 공통성이 있는 것으로 유사한 CD45 또는 CD66b 단백질에 결합능을 보이는 핵산서열을 의미한다.
본 발명의 구체예에서 CD45 또는 CD66b에 특이적인 압타머의 서열은 하기의 표 1과 같을 수 있다.
서열 번호 염기서열 ID 염기서열 길이
1 2307-11-01 5’-TCA GCC GCC AGC CAG TTC(primer) A5G GCC ACC GGA GA5 C5A C5A
A55 5AA CG5 5AG 55C GG5 5(random region) GAC CAG AGC ACC ACA
GAG(primer)-3’		 76mer
2 2307-11-02 5’-AG TTC(primer) A5G GCC ACC GGA GA5 C5A C5A A55 5AA CG5 5AG 55C GG5 5(random region) GAC CA(primer)-3’ 50mer
3 2307-11-06 5'-5AC CAA GGA GAG A5C 5AC 5AA 555 AA5 G55 AG5 55C C55 G-3' 40mer
4 2415-04-01 5'-CGA GCG TCC TGC CTT TG(primer) GAA GCG A5G A5A A55 5GC 5GA 5C5 GGA 555 5AG GG5 55A 5GC(random region) CAC CGA CAG CCA CCC A G(primer)-3' 76mer
5 2015-01 5'-TCAGCCGCCAGCCAGTTC-3' 18mer
6 2015-02 5'-GACCAGAGCACCACAGAG-3' 18mer
7 2015-03 5'-CGAGCGTCCTGCCTTTG-3' 17mer
8 2015-04 5'-CACCGACAGCCACCCAG-3' 17mer
9 2015-05 3'-Biotin-d(CTC TGT GGT GCT CTG GTC) 18mer
10 2015-06 3'-Biotin-d(CTG GGT GGC TGT CGG TG) 17mer
여기서, 표 1 상의 서열 번호5는 5-(N-benzylcarboxyamide)-2’-deoxyuridine (BzdU)를 의미하며,
이는 하기의 구조를 갖는다.
Figure 112017040669119-pat00001
A = 2'-deoxyAdenosine
G = 2'-deoxyGuanosine
C = 2'-deoxyCytidine
T = 2'-deoxyThymidine(Thymidine)
또한, 본 발명의 일 양상은 서열번호 1 내지 4으로 이루어진 염기서열로부터 선택된 1종 이상의 염기서열로 이루어진, 백혈구세포 특이적 압타머를 제공한다.
상기 압타머는 CD45 또는 CD66b 특이적인 압타머로서, 바람직하게는 백혈구에 특이적인 압타머일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상 약 15∼200 뉴클레오티드일 수 있지만, 예컨대 약 100 뉴클레오티드 이하이고, 바람직하게는 약 80 뉴클레오티드 이하이며, 본 발명의 일 구체예에서 본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머의 길이는 특별히 한정되지 않으나, 대략 96 뉴클레오티드 내외로 개발될 수 있고, 시험관증폭선택 후 과정 (post-SELEX)을 통해 보다 효율적인 20-30 뉴클레오티드 크기로 변형 (modification)되어 사용될 수 있다.
총 뉴클레오티드수가 적으면, 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 또한 비용면에서의 장점도 크다. 또한 화학수식도 용이하고, 생체내 안정성도 높으며, 독성도 낮다고 예상될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 CD45 압타머는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 염기서열에 해당하는 압타머와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 포함한다. 또한 핵산 CD66b 압타머는 서열번호 4의 염기서열에 해당하는 압타머와 80% 이상의 서열 동일성을 가지는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 압타머 상호 간의 서열의 유사성을 볼 때, 상기 서열번호 1 내지 4로 표시되는 핵산서열 중 선택된 어느 하나의 핵산서열에 대하여 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 80% 이상 100% 미만의 서열에 공통성이 있다면, 본 발명에 따른 핵산 압타머와 유사한 CD45 또는 CD66b 및 백혈구 인식능이 있는 것으로 볼 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머에 포함되는 각 뉴클레오티드는 각각, 동일 또는 상이하여, 리보오스(예, 피리미딘 뉴클레오티드의 리보오스)의 2' 부위에서 히드록실기를 포함하는 뉴클레오티드(즉, 미치환인 뉴클레오티드)이거나, 또는 리보오스의 2' 부위에서, 히드록실기가, 임의의 원자 또는 기로 치환되어 있는 뉴클레오티드일 수 있다. 이러한 임의의 원자 또는 기로서는, 예컨대 수소원자, 불소원자 또는 -O- 알킬기(예, -O-Me기), -O-아실기(예,-O-CHO기), 아미노기(예, -NH2기)로 치환되어 있는 뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 또한 적어도 1종의 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -O-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종의 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 또한, 모든 뉴클레오티드가, 리보오스의 2' 부위에서, 히드록실기, 또는 전술한 임의의 원자 또는 기, 예컨대 수소원자, 불소원자, 히드록실기 및 -0-Me기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 동일한 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는, 백혈구세포에 대한 결합성, 안정성 등을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보오스나 디옥시리보스)가 수식된 것일 수 있다. 당잔기에서 수식되는 부위로서는, 예컨대 당잔기의 2' 부위, 3' 부위 및/또는 4' 부위의 산소원자를 다른 원자로 치환한 것 등을 들 수 있다. 수식의 종류로서는, 예컨대 플루오로화, O-알킬화 (예, O-메틸화, O-에틸화), O-알릴화, S-알킬화 (예, S-메틸화, S-에틸화), S-알릴화, 아미노화 (예,-NH)를 들 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 또한, 백혈구에 대한 결합성 등을 높이기 위해, 핵산염기 (예, 푸린, 피리미딘)가 변형 (예, 화학적 치환)된 것이어도 좋다. 이러한 변형으로서는, 예컨대 5' 부위 피리미딘 변형, 6' 및/또는 8' 부위 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모 또는 5-요오드-우리실으로의 치환을 들 수 있다. 또한 뉴클레아제 및 가수분해에 대하여 내성이 있도록, 본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머에 포함되는 인산기가 변형되어 있어도 좋다. 예컨대 P(0)0기가, P(0)S(티오에이트), P(S)S(디티오에이트), P(O)NR2(아미데이트), P(O)R, R(O)OR', CO 또는 CH2(포름아세탈) 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 있어도 좋다〔여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로, H이거나, 또는 치환되어 있거나, 또는 치환되어 있지 않은 알킬(예, 메틸, 에틸)이다〕. 연결기로서는, -O-, -N- 또는 -S-가 예시되고, 이들의 연결기를 통하여 인접하는 뉴클레오티드에 결합할 수 있다.
본 발명에서의 변형은 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5'의 변형을 포함하여도 좋다. 변형은 또한, 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted dT, 핵산, 뉴클레오시드, Myristoyl, Lithocolic-oleyl, Docosanyl, Lauroyl, Stearoyl, Palmitoyl, Oleoyl, Linoleoyl, 그 외 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다. 또한 검출을 위해 압타머의 3' 및 5'의 변형으로서 방사선동위원소 [radioactive substances (32P, 35S, 3H, 125I)], 형광물질 [fluorescent dyes (Cy3, Cy5, 5-bromodesoxyuridin, fluorescein, actey laminofluorene, digoxygenin)] 등을 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는, 본 명세서중의 개시 및 이 기술분야에서의 공지의 방법에 의해 화학 합성할 수 있다.
본 발명은 백혈구 표면 CD45 또는 CD66b 단백질에 매우 특이적으로 결합함으로써, 백혈구 분리 및 제거 가능한 CD45 또는 CD66b 압타머 및 이를 이용한 혈액 내 백혈구 분리, 제거방법을 제공하는 것이다.
상기 백혈구 분리, 제거 방법은 (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계; (2) 압타머가 포함된 완충액을 자성 담체와 혼합하는 단계; (3) 상기 단계 (2)의 혼합물을 표적 시료에 처리하는 단계; (4) 상기 단계 (3)의 혼합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 표적물질의 제거 방법을 제공한다. 상기 표적물질은 백혈구 세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 인간을 제외한 포유류 생체, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액, 타액 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈액 시료는 전혈 (whole blood), 혈구 (blood cell) 또는 버피 코트 '(buffy coat) 등일 수 있다. 전혈에는 약 109개, 농축적혈구에는 약 108-109개, 농축혈소판에는 약 107-108개, 그리고 성분채집혈소판에는 약 106-108개나 되는 많은 양의 백혈구가 함유되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 백혈구는 과립성 백혈구인　호산구 (eosinophil),　호염기구 (basophil),　호중구 (neutrophil)와, 무과립성 백혈구인　림프구 (lymphocyte)와　단핵구 (monocyte)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 “압타머”란 높은 친화성으로 타겟 물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고 핵산을 말한다. 이때, 상기 압타머가 RNA인 경우에는, 염기서열에 있어서 T는 U로 인식될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머는 5' 또는 3', 5' 및 3'의 변형을 포함하여도 좋다. 변형은 티올기 (thiol group, SH), 아민기 (amine group, NH2), 카르복실기 (carboxyl group, COOH), 비오틴 (biotin) 등을 압타머 말단에 부가함으로써 행해질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 담체는 자성 구슬 (magnetic bead) 또는 비자성 구슬 (non-magnetic bead)일 수 있다. 자성 구슬은 다이나비드 (Dyna beads), 아가로스 자성 구슬 (agarose magnetic beads), 세파로스 자성 구슬 (sepharose magnetic beads), 스트렙토아비딘 자성 구슬 (streptavidin magnetic beads) 등일 수 있다. 비자성 구슬은 아가로스 구슬 (agarose bead), 세파로스 구슬 (sepharose beads), 스트렙토아비딘 아가로스 구슬 (streptavidin agarose beads), 스트렙토아비딘 세파로스 구슬 (streptavidin sepharose beads) 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 압타머 완충액은 음전하 폴리머가 포함될 수 있으며, 음전하 폴리머는 바람직하게는 덱스트란 설페이트 (dextran sulfate), 다중 음이온성 셀룰로즈 (polyanionic cellulose), 히알루론 산 (hyaluronic acid), 다중 음이온성 헤파린 (polyanionic heparin), 폴리설포네이트 폴리머 (polysulfonate polymer), 다중 음이온성 덴드리머 (polyanionic dendrimer), 카복시메틸 덱스트란 (carboxymethyl-dextran), 헤파린, 아우린트리카트복실산 (aurintricarboxylic acid), 또는 수라민 (suramin)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 덱스트란 설페이트 일 수 있다. 상기 음전하 폴리머는 압타머의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.
또한, 상기 음전하 폴리머는 압타머 분리용으로 이용될 수 있으며, 이 경우, 상기 음전하 폴리머는 표적물질에 결합된 압타머를 표적물질로부터 분리시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 압타머 완충액은 상기 음전하 폴리머 외에 압타머에 대하여 완충작용을 할 수 있는 조성을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어 FBS (fetal bovine serum), MgCl2 등을 더 포함할 수 있다.
상기 CD45와 CD66b 압타머 내의 상기 변형된 염기 개수는 5 내지 15개, 바람직하게는 7 내지 13개일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 CD45 또는 CD66b, CD45와 CD66b 압타머를 자성 구슬과 함께 혈액 시료에 처리한 결과, 백혈구세포가 높은 효율로 효과적으로 제거됨을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> CD45와 CD66b 압타머 발굴
1.1: 변형핵산 라이브러리 합성
CD45 압타머 발굴에 필요한 단일가닥 변형 DNA 라이브러리 (single strand modified DNA library)를 제조하기 위하여, 5' 말단에 비오틴 (Biotin)이 결합된 antisense 라이브러리를 합성하였다. CD66b 압타머 발굴에 필요한 단일가닥 변형 DNA 라이브러리를 제조하기 위하여, 5' 말단에 비오틴이 결합된 antisense 라이브러리를 합성하였다.
이와 같이 합성된 각각의 antisense를 가지고 20μM 5' primer (5'-TCAGCCGCCAGCCAGTTC-3'; 서열번호: 5, 5'-CGAGCGTCCTGCCTTTG-3'; 서열번호: 7), 3' primer (5'-GACCAGAGCACCACAGAG-3'; 서열번호: 6, 5'-CACCGACAGCCACCCAG-3'; 서열번호: 8)와, 0.5mM dNTP (ATP, GTP, CTP, BzdUTP), 0.25U/ul KOD XL (KOD XL DNA polymerase, Novagen), 10X extension buffer (1.2M Tris-HCl pH7.8, 100mM KCl, 60mM (NH4)2SO4, 70mM MgSO4, 1% Triton X-100, 1mg/ml BSA) 상에서 70℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 이중가닥 DNA (double strand DNA)를 각각 제조하였다.
여기에 20mM NaOH 이용하여 elution한 뒤, 80mM HCl 용액으로 중화하여 단일가닥 변형 DNA 라이브러리를 제조하였다. 제조된 DNA 라이브러리는 Amicon ultra-15 (Millipore)를 이용하여 농축한 뒤 UV 흡광기 (spectrophotometer)로 정량하였다.
1.2: 시험관증폭선택법으로 CD45와 CD66b 단백질에 대한 압타머 발굴
CD45 (R&D systems)와 CD66b (R&D systems) 단백질에 결합하는 DNA 압타머를 선별하기 위하여 시험관증폭선택법을 이용하였다.
CD45 또는 CD66b와의 결합: 먼저 상기 합성된 라이브러리를 1nmole을 1X Selection Buffer (1XSB: 40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2)에 넣고 95℃, 70℃, 48℃, 37℃에서 각각 5분간 반응시킨 후, negative selection을 위하여 10X protein competition buffer (10μM prothrombin, 10μM casein, 0.1%(w/v) HSA (human serum albumin, SIGMA) 10μL를 혼합한 뒤, 상층액이 제거된 Hexa-His가 결합되어 있는 Talon bead(50%(w/v) slurry, 10mg/ml Invitrogen)에 첨가하여 37℃에서 10분간 반응 시켰다.
Negative selection 반응 후, 상층액만을 취하여 새로운 tube에 옮긴 후, 각각의 CD45와 CD66b 단백질과 결합시킨 Talon bead에 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1X SB (40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2) 100μL로 각각의 CD45와 CD66b DNA 복합체와 결합한 Talon bead를 5번 세척하였다. 5번째 세척시에는 새로운 plate에 옮겨 세척하였다. 2mM NaOH 용액 85μL를 첨가하여 표적에 결합하는 라이브러리를 분리(elution)한 뒤 8mM HCl 용액 20μL로 중성화 (neutralization)하였다.
증폭: 각각의 CD45와 CD66b 단백질에 결합하는 DNA 라이브러리를 QPCR (quantitative PCR, IQ5 multicolor real time PCR detection system, Bio-rad)을 이용하여 증폭하였다.
CD45 압타머 증폭은 앞서 라이브러리 제조에 사용된 각 5' primer (TCAGCCGCCAGCCAGTTC; 서열번호: 5)와 각 3'primer(Biotin-CTCTGTGGTGCTCTGGTC; 서열번호: 9)를 사용하였고 CD66b 압타머 증폭은 앞서 라이브러리 제조에 사용된 각 5' primer (CGAGCGTCCTGCCTTTG; 서열번호: 7)와 각 3'primer(Biotin-CTGGGTGGCTGTCGGTG; 서열번호: 10)를 사용하였다. 각각 5uM (5 X QPCR master Mix, Novagen), 0.075U/ul KOD (Novagen), 1mM dNTP (Roche Applied science), 25mM MgCl2, 5XSYBR greenⅠ (Invitrogen)를 총부피가 125μL가 되도록 혼 합하여, 96℃ 15초, 55℃ 10초, 68℃ 30분 조건으로 1 cycle, 그리고 96℃ 15초, 72℃ 1분 조건으로 30 cycle을 반복하여 이중가닥 라이브러리 (double strand library)를 제조하였다.
eDNA 제조: eDNA는 enzymatic DNA로 DNA template와 중합효소 (polymerase)를 이용해 생산한 압타머를 의미한다. 상기 QPCR을 통하여 만들어진 DNA 라이브러리를 25μL Myone SA bead(Invitrogen)에 상온에서 10분간 혼합하여 고정하였다. 이 때 혼합된 DNA 양은 QPCR product로 60ul로 하였다. 20mM NaOH 용액을 첨가하여 단일가닥 DNA로 만들어주었다. 그리고 상기 실시예 1.1의 라이브러리 제조와 같은 방법으로 변형된 핵산을 포함하는 DNA를 합성하여 다음 round에 사용하였다. 시험관증폭선택법 라운드 (SELEX round)는 총 8회 수행하였고 보다 선택적인 결합을 위하여 4회부터 6회까지 그리고 7회부터 8회까지 각각 DNA와 단백질 복합체를 10mM 덱스트란 설페이트 (sigma) 용액에 1/200, 1/400로 희석하여 DNA 압타머를 선별하였다.
Pool binding assay: 각각의 CD45와 CD66b 단백질을 이용하여 확보한 DNA pool의 결합력을 알아보기 위하여 filter binding assay을 수행하였다. 각각의 CD45와 CD66b 단백질을 이용하여 확보한 8 round의 pool을 α-P32 ATP (Perkin Elmer)와 TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase, NEB)로 말단에 표지 하였다. 상기 각각의 8 round의 pool 라이브러리 DNA 1μM에 0.25μL α-P32 ATP (5μM, perkinelmer), 0.25μL TdT, 및 10XNEB 완충액 (NEB) 10μL reaction volume으로 37℃에서 30분간 반응시키고, 70℃에서 10분간 정치하여, TdT를 불활성화시켰다. 표지된 DNA pool은 Micro spin G-50 column(GE healthcare)을 이용하여 정제하였다.
표지된 DNA pool 20,000cpm을 100μL 1XSB (40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2)에 넣고 95℃에서부터 1초에 0.1℃씩 37℃까지 천천히 냉각시켰다. 그리고, 1xSB (40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2)를 이용하여 CD45와 CD66b 단백질 각각을 100nM에서 12 point로 serial dilution한 뒤, 상기 가열 및 냉각시킨 각 DNA pool 30μL를 각각 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. Nylon membrane(GE healthcare)에 각 DNA, CD45와 DNA, CD66b의 혼합물을 각각 2μL씩 spotting한 뒤 zorbax resin(Agilent) 5.5μL를 첨가하였다. 그리고 미리 1X SB (40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2) 50μL로 적셔놓은 Durapore filter(Millipore)에 넣고 vacuum을 걸어주었다. 그리고 membrane filter를 100μL의 1X SB (40mM HEPES, 102mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2)로 씻어주었다. Filter plate를 image plate에 overnight expose한 뒤 FLA-5100(Fuji)으로 이미지를 정량화 하였다.
각각의 CD45와 CD66b와 시험관증폭선택법 진행으로 확보한 DNA pool간의 결합 친화력은 상기 filter binding assay를 통하여 얻어진 값을 SigmaPlot 11 (Systat Software Inc.)을 이용하여 구하였다.
CD45와 CD66b 압타머 염기서열 분석: 시험관증폭선택법를 거친 8라운드 pool 시료를 TA cloning kit(솔젠트㈜)를 이용하여 클로닝하였다. 그리고 vector상에 존재하는 M13 primer (CAGGAAACAGCTATGAC)을 가지고 염기서열을 분석하였다.
Clone binding assay: 반복적으로 관찰된 염기서열을 갖는 clone의 결합친화력을 확인하기 위하여 위의 pool binding assay와 같은 방법으로 filter binding assay를 수행하였다. 상기 결합 친화력은 상기 filter binding assay를 통하여 얻어진 값을 SigmaPlot 11(Systat Software Inc.)을 이용하여 구하였으며, 그 결과를 아래의 표 2에 나타내었다. 표 2 중 Bmax는 input 대비 결합한 압타머의 양을 나타낸 것으로, 1에 가까울수록 좋은 성능을 의미하는 것이고, Kd (dissociation constant)는 친화력을 나타내는 수치로 수치가 낮을수록 결합력이 높음을 나타낸다.
CD45와 CD66b 압타머 클론 각각을 filter binding assay를 수행하여 이들 중 CD45 2307-11-01 클론의 Bmax와 CD45 단백질과의 해리상수 (Kd)는 각 0.36과 116nM 결과를 보였다. CD66b 2415-04-01 클론의 경우 Bmax와 CD66b 단백질과의 Kd는 0.25와 3.5nM로서 우수한 친화력을 나타내는 결과를 보였다.
CD45 2307-11-01 클론의 표적단백질과의 결합력을 개선하기 위해 76mer 압타머 길이를 줄여서 선별한 CD45 2307-11-02 클론의 Bmax와 CD45 단백질과의 해리상수 (Kd)는 0.4와 65.2nM로서 두배 정도의 결합력을 개선할 수 있었다. 또한 상기 50mer 길이를 가진 CD45 2307-11-02 압타머 염기서열로부터 random 라이브러리를 제조하여 시험관증폭선택법을 재 진행하였다. 이로부터 CD45 단백질과의 해리상수 (Kd)가 3.2nM인 2307-11-06의 우수한 40mer 압타머를 선별할 수 있었다.
서열 번호 염기서열 ID BMax Kd(dissociation constant) 길이
1 2307-11-01 0.36 116nM 76mer
2 2307-11-02 0.4 65.2nM 50mer
3 2307-11-06 0.5 3.23nM 40mer
4 2415-04-01 0.25 3.5nM 76mer
CD45와 CD66b 압타머 합성: 압타머는 핵산전용 고정상합성기인 Bioautomation사의 머메이드 12 (Mermade 12) 합성기를 사용하여 고정상 압타머 합성 (Solid Phase Oligo Synthesis) 방법으로 자체 합성하였다.
CD45와 CD66b 압타머 분리/정제 및 QC: 상기 변형 핵산체를 가지는 압타머의 합성, 정제 및 동정을 통하여 발굴된 변형 압타머들을 modified-dU-phosphoramidite로부터 핵산 합성기 (Bioautomation사의 Mermade12)를 이용한 phosphoramidite coupling 반응으로 합성하였으며, 합성 후 resin (200nmole-dA(Bz) synthesis column, 1000A(MM1-1000-2))을 t-butylamine:methanol:water (1:1:2 부피비)에 넣고 70℃에서 5시간 동안 deprotection 후 진공 건조를 시킨 다음, C18 column (Waters, Xbridge OST C18 10x50mm)를 사용하여 5ml/min의 속도로 65℃에서 아세트나이트릴 (Acetonitrile)의 농도를 높여가면서 HPLC의 방법으로 분리/정제하였다.
HPLC에서 UV 254 nm 및 290nm를 chromatogram을 분석한 결과 70 ~ 90%의 순도를 보이는 변형 압타머들을 성공적으로 합성하였다. 이들 압타머들은 모두 LCESI MS spectrometer (Waters HPLC systems(Waters)를 이용하여 10,000g/mole 이상의 분자량을 가진 압타머 및 압타머 제제를 0.02% 오차범위 내에 서 정확한 분자량을 측정하였다.
<실시예 2>: 전혈 시료로부터 CD45 압타머를 이용한 백혈구 제거
2.1: Mg2 + 농도에 따른 백혈구 제거율
CD45 압타머와 백혈구세포간의 상호작용에 있어서 Mg2+ 효과를 분석하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, CD45 압타머를 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 (4.5nmol/ml) Mg2 + 를 0, 5, 30, 50, 100mM로 최종 농도가 되게끔 첨가한 후 30분 동안 흔들어서 섞이게 하였다. 이후 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 상온에서 15분간 식혔다. 상기 비오틴-압타머 시료 900pmol와 스트렙트아비딘 자성 구슬 (streptavidin magnetic bead) (100 ul of 10 mg/ml stock solution) 를 혼합하여 4℃에서 밤새도록 반응하였다.
1 ml의 혈액 시료는 1 ml의 blood diluting solution (5% BSA in 1% PBS)와 혼합하여 (1:1비)5ml valve secured syringe에 첨가한뒤 pipetting을 이용해 잘 섞었다. 이때 혈액 내 백혈구 수는 Horiba machine으로 확인하였다. 상기 비오틴-압타머- 스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체 시료 300 ul와 희석된 혈액시료2 ml를 pipetting을 이용해 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 반응하였다.
상기 혼합액이 들어 있는 syringe를 자석(Magnet)안에 두고 15분간 정치하였다. 이후 밸브를 열어 백혈구가 제거된 혈액 시료를 용출하여 collection tube에 모았다. 용출된 시료 내 비오틴-압타머- 스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체와 결합하지 않고 배출된백혈구 수를 Horiba machine을 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, Mg2 + 농도가 50mM까지 사용하였을 때 백혈구 제거율은 85%로 증가하였으며 50mM 이상의 Mg2+ 이 존재 시 오히려 백혈구 제거율은 감소하였다. 적절한 농도의 Mg2 + 사용이 CD45 압타머가 백혈구세포와의 상호작용을 가지고 있음을 확인하였으며 이후의 실험에서는 50mM Mg2 + 농도를 사용하였다.
2.2: Pre-conjugation
CD45 압타머와 스트렙트아비딘 자성 구슬을 섞은 뒤밤새도록 반응(conjugation)을 시킨 후 혈액시료에 첨가한 것과 이들을 바로 혈액시료에 첨가할 경우, 백혈구 제거율을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 비오틴-CD45 압타머를 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 Mg2 + 를 50mM 최종 농도가 되게끔 첨가하였다. 이후 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 상온에서 15분간 식혔다. 상기 비오틴-압타머 시료(200 ul of 100 ug/mL CD45 압타머 solution) 와 스트렙트아비딘 자성 구슬(100 ul of 10 mg/ml stock solution)을 혼합한 후 4℃에서 밤새도록 반응하였다. 또한 비오틴-CD45 압타머 시료와 스트렙트아비딘 자성 구슬을 혼합한 후 바로 혈액시료에 첨가하여 사용하였다.
1 ml의 혈액 시료는 1 ml의 blood diluting solution (5% BSA in 1% PBS)와 혼합하여 (1:1비) 5ml valve secured syringe에 첨가한뒤 pipetting을 이용해 잘 섞었다.이때 혈액 내 백혈구 수는 Horiba machine으로 확인하였다. 상기 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체 시료 (300 ul) 와 희석된 혈액시료(2 ml)를 pipetting을 통해 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 반응하였다.
상기 혼합액이 들어 있는 syringe를 자석(Magnet)안에 두고 15분간 정치하였다. 이후 밸브를 열어 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체와 결합하지 않은 혈액시료를 용출하여 collection tube에 모았다. 용출된 시료 내 백혈구 수를 Horiba machine을 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 나타낸 바와 같이, 비오틴-CD45 압타머와 스트렙트아비딘 자성 구슬을 미리 혼합하여 준비한 복합체를 사용하였을 때 백혈구 제거율은 약 85%인 반면, 비오틴-CD45 압타머 시료와 스트렙트아비딘 자성 구슬을 바로 혈액시료에 첨가한 경우에는 백혈구 제거율은 약 75%로서 압타머와 자성 담체를 미리 제조한 복합체를 사용하는 것이 백혈구 제거에 더 효과적임을 확인할 수 있었다. 이후의 실험에서는 압타머와 자성 담체를 미리 제조한 복합체를 사용하였다.
2.3: 백혈구 제거 온도
혈액시료로부터 CD45 압타머를 이용한 온도에 따른 백혈구 제거율을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, CD45 압타머 를 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 (4.5nmol/ml) Mg2 + 를 50mM 최종 농도가 되게끔 첨가하였다. 이후 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 상온에서 15분간 식혔다. 상기 비오틴-압타머 시료 900pmol 와 스트렙트아비딘 자성 구슬(100 ul of 10 mg/ml stock solution)을 혼합한 것을4℃, 상온, 그리고 37℃ 에서 밤새도록 반응하였다.
1 ml의 혈액 시료는 1 ml의 blood diluting solution (5% BSA in 1% PBS)와 혼합하여 (1:1비) 5ml valve secured syringe에 첨가한뒤 pipetting을 이용해 잘 섞었다. 이때 혈액 내 백혈구 수는 Horiba machine으로 확인하였다. 상기 다른 온도에서 pre-conjugation된 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체 시료(300 ul) 와 희석된 혈액시료(2 ml)를 pipetting을 통해 잘 섞은 후 4℃, 상온, 그리고 37℃ 에서 1시간 반응하였다.
상기 혼합액이 들어 있는 syringe를 자석 (Magnet)안에 두고 15분간 정치하였다. 이후 밸브를 열어 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체와 결합하지 않은 혈액시료를 용출하여 collection tube에 모았다. 용출된 시료 내 백혈구 수를 Horiba machine을 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 비오틴-CD45 압타머와 스트렙트아비딘 자성 구슬을 미리 혼합하는 pre-conjugation 온도는 4℃에서 백혈구 제거율이 우수하였다. 또한 pre-conjugation된 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체 시료와 희석된 혈액시료와의 반응 온도는 37℃에서 백혈구 제거율이 우수하였다. 따라서 이후의 실험에서는 pre-conjugation 온도는 4℃에서 진행하였으며 압타머와 혈액시료와의 반응온도는 37℃에서 진행하였다.
<실시예 3>: 전혈 시료로부터 CD45와 CD66b 압타머를 이용한 백혈구 제거
혈액시료로부터 CD45 압타머, CD66b 압타머, 그리고 CD45 압타머, CD66b 압타머 칵테일을 이용한 백혈구 제거율을 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이때 스트렙트아비딘 자성 구슬의 입자 크기가 0.45um, 1um, 그리고 4.5um의 각각 다른 크기의 자성 구슬을 사용하였다.
먼저, 각각의 압타머를 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 (각각 4.5nmol/ml) Mg2 + 를 50mM 최종 농도가 되게끔 첨가하였다. 이후 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 상온에서 15분간 식혔다. 상기 비오틴-압타머 시료 각 450pmol 와 스트렙트아비딘 자성 구슬(100 ul of 10 mg/ml stock solution)을 혼합한 것을 혈액시료에 첨가하여 4℃에서 밤새도록 반응하였다. 압타머 칵테일 시료는 450pmol CD45 압타머 와 450pmol 의 CD66b 압타머 를 혼합하였다.
1 ml의 혈액 시료는 1 ml의 blood diluting solution (5% BSA in 1% PBS)와 혼합하여 (1:1비) 5ml valve secured syringe에 첨가한뒤 pipetting을 이용해 잘 섞었다. 이때 혈액 내 백혈구 수는 Horiba machine으로 확인하였다. pre-conjugation된 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체 시료 (300 ul)와 희석된 혈액시료(2ml)를 pipetting을 통해 잘 섞은 후 37℃ 에서 1시간 반응하였다.
상기 혼합액이 들어 있는 syringe를 자석(Magnet)안에 두고 15분간 정치하였다. 이후 밸브를 열어 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체와 결합하지 않은 혈액시료를 용출하여 collection tube에 모았다. 용출된 시료내 백혈구 수를 Horiba machine을 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 나타낸 바와 같이, 입자 크기가 0.45um, 1um, 그리고 4.5um의 각각 다른 크기의 자성 구슬을 사용한 경우 모두 백혈구 제거율은 비슷한 수준으로 확인되었다.
CD66b 압타머만을 사용한 경우에는 백혈구 제거율이 94% 정도인 반면에 CD45 압타머 또는 CD45 압타머와 함께 CD66b 압타머를 함께 사용한 경우에는 94.5%로서 보다 우수하였다. 따라서 이후의 실험에서는 스트렙트아비딘 자성 구슬은 1um를 사용하였다.
<실시예 4>: 전혈 시료로부터 CD45와 CD66b 압타머 칵테일을 이용한 백혈구 제거
Jurkat 세포와 혈액시료로부터 CD45 압타머와 CD66b 압타머를 함께 사용하여 백혈구 제거율을 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. CD45 압타머의 경우 2종의 CD45 압타머 (서열번호 2와 3) 각각을 CD66b 압타머와 혼합하여 백혈구 제거율 비교, 확인하는데 사용하였다. 이때 스트렙트아비딘 자성 구슬의 입자 크기가 1um 크기의 자성 구슬을 사용하였다.
먼저, 각각의 압타머를 멸균된 삼차수에 용해시킨 다음 (각각 4.5nmol/ml) Mg2 + 를 50mM 최종 농도가 되게끔 첨가하였다. 이후 95℃로 5분동안 열을 가한 뒤, 상온에서 15분간 식혔다. 상기 비오틴-압타머 시료 (서열번호 2 CD45 225pmol, 서열번호 3 CD45 225pmol, CD66b 450pmol) 와 스트렙트아비딘 자성 구슬(100 ul of 10 mg/ml stock solution)을 혼합한 것을 혈액시료에 첨가하여 4℃에서 밤새도록 반응하였다. 압타머 칵테일 시료는 225pmol CD45 압타머(서열번호 2), 225pmol CD45 압타머(서열번호 3)과 450pmol의 CD66b 압타머 를 혼합하였다.
1 ml의 혈액 시료는 1 ml의 blood diluting solution (5% BSA in 1% PBS)와 혼합하여 (1:1비) 5ml valve secured syringe에 첨가한뒤 pipetting을 이용해 잘 섞었다. 이때 혈액 내 백혈구 수는 Horiba machine으로 확인하였다. Pre-conjugation된 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체 시료 (300 ul)와 희석된 혈액시료(2ml) 내지 jurkat 세포 시료(2ml)를 pipetting을 통해 잘 섞은 후 37℃ 에서 1시간 반응하였다.
상기 혼합액이 들어 있는 syringe를 자석(Magnet)을 두고 15분간 정치하였다. 이후 밸브를 열어 비오틴-압타머-스트렙트아비딘 자성 구슬 복합체와 결합하지 않은 혈액시료를 용출하여 collection tube에 모았다. 용출된 시료 내 백혈구 수를 Horiba machine을 이용하여 측정하였다.
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, Jurkat 세포로부터 CD45 압타머와 CD66b 압타머를 함께 사용한 경우 백혈구 제거율은 99% 이상이었으며 혈액시료로부터 CD45 압타머와 CD66b 압타머를 함께 사용한 백혈구 제거율은 약 96%로서 단일 압타머를 사용한 경우보다 제거율이 우수함을 확인하였다. 향상된 Kd 값을 가진 CD45 (new 45)를 사용했을때 제거율이 우수함을 확인하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 예에 대하여 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정은 첨부된 특허 청구범위에 속함은 당연한 것이다.
<110> Aptamer Sciences Inc. Agency for Science, Technology and Research <120> White Blood Cell Specific Aptamer and the Use thereof <130> GP170021KR <140> 10-2017-0053294 <141> 2017-04-26 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2307-11-01, wherein n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 1 tcagccgcca gccagttcan ggccaccgga gancnacnaa nnnaacgnna gnncggnnga 60 ccagagcacc acagag 76 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2307-11-02, wherein n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 2 agttcanggc caccggagan cnacnaannn aacgnnagnn cggnngacca 50 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2307-11-06, wherein n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 3 naccaaggag agancnacna annnaangnn agnnnccnng 40 <210> 4 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2415-04-01, wherein n is 5-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine <400> 4 cgagcgtcct gcctttggaa gcganganaa nnngcnganc nggannnnag ggnnnangcc 60 accgacagcc acccag 76 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2015-01 <400> 5 tcagccgcca gccagttc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2015-02 <400> 6 gaccagagca ccacagag 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2015-03 <400> 7 cgagcgtcct gcctttg 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2015-04 <400> 8 caccgacagc cacccag 17 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2015-05 <400> 9 ctctgtggtg ctctggtc 18 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence ID No. 2015-06 <400> 10 ctgggtggct gtcggtg 17

Claims (19)

  1. CD45에 특이적으로 결합 하고, 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하고, 25 내지 100개의 염기로 이루어진,
    백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), idT(inverted deoxythymidine), LNA(Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민(amine), 티올(thiol), 비오틴(biotin), 카르복실기(carboxyl group) 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 결합된,
    백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 압타머는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 형광물질이 결합된,
    백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 5-bromodesoxyuridin, fluorescein 및 acteyl aminofluorene으로 이루어진 군에서
    선택된 1종 이상이 결합되어 변형된,
    백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머.
  7. (1) 생물학적 시료를 준비하는 단계;
    (2) 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 백혈구에 선택적으로 결합하는 압타머가 포함된 완충액을 담체와 혼합하는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)의 혼합물을 표적 시료에 처리하는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (3)의 혼합물을 반응시키는 단계를 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 표적물질은 과립성 백혈구인 호산구, 호염기구, 호중구, 무과립성 백혈구인 림프구 및 단핵구 중 어느 하나를 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 인간을 제외한 포유류 생체, 인간을 포함한 포유류로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액 및 타액 중 어느 하나를 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈구 또는 버피 코트인,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 담체는 자성 구슬 또는 비자성 구슬인,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 자성 구슬은 다이나비드, 아가로스 자성 구슬, 세파로스 자성 구슬 또는 스트렙토아비딘 자성 구슬인,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 비자성 구슬은 아가로스 구슬, 세파로스 구슬, 스트렙토아비딘 아가로스 구슬 또는 스트렙토아비딘 세파로스 구슬인,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  14. 제7항에 있어서,
    상기 완충액은 2가 양이온을 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 2가 양이온은 Mg2+, Ca2+,　Mn2+, Cu2+ 및 Fe2+ 중 하나 이상을 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 압타머 완충액 내 2가 양이온의 농도는 0.01mM-200mM인,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 완충액은 음전하 폴리머를 더 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 음전하 폴리머는 덱스트란 설페이트, 다중 음이온성 셀룰로즈, 히알루론 산, 다중 음이온성 헤파린, 폴리설포네이트 폴리머, 다중 음이온성 덴드리머, 카복시메틸 덱스트란, 헤파린, 아우린트리카트복실산 및 수라민 중 어느 하나 이상을 포함하는,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 압타머 완충액 내 음전하 폴리머의 농도는 0.001mM~10mM인,
    표적물질을 분리 또는 제거하는 방법.
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