CN114630907A - 用于细胞靶向和标记的抗cd3核酸适配体 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了识别细胞表面上的CD3蛋白复合物的高亲和力核酸适配体序列。所述核酸适配体可以用作递送载体的靶向部分，或用作免疫治疗和免疫诊断的分子组分，或用于分离、纯化受试者中的CD3+T细胞，或表征受试者中的CD3+T细胞。

Description

用于细胞靶向和标记的抗CD3核酸适配体
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月26日提交的申请号为62/879,401的美国临时申请；2019年7月26日提交的申请号为62/879,413的美国临时申请；以及2019年7月26日提交的申请号为PCT/IB2019/000890的PCT申请的优先权。上述每一项申请均以引用方式全部并入本文。
背景技术
分化簇3(CD3)是一种含有一个γ亚基、一个δ亚基和两个ε亚基的蛋白质复合物，其与T细胞受体(TCR)结合形成CD3γε和CD3δε异源二聚体，并在TCR与肽-MHC复合物结合时传递细胞内信号。CD3亚基高度同源，每个亚基都有一个小的细胞质结构域和一个包含负电荷残基的跨膜结构域，通过这些结构其与TCR跨膜区的正电荷残基缔合。TCR含有α、β、ζ和η亚基，并以与ζζ同源二聚体或ζη异源二聚体相关联的αβ异源二聚体形式存在。继而TCR与CD3γε和CD3δε异源二聚体相关联。
核酸适配体是具有独特三维构型的短单链寡聚核苷酸。与抗体一样，核酸适配体与靶标高特异性结合，通常可以调节靶标的生物活性。核酸适配体相对于抗体具有许多优势，包括缺乏免疫原性、化学合成可控且廉价、稳定性高以及组织渗透良好。核酸适配体也可以连接到纳米颗粒、药物、成像剂和其他用作靶标部分的核酸上。
发明内容
本技术提供了与CD3结合的DNA和RNA适配体，可用于靶向、标记或分选T细胞。
因此，在一个方面，该技术提供了与CD3ε/γ或CD3ε/δ蛋白复合物结合的核酸适配体。所述核酸适配体包括具有本文所述的几种核酸序列中任一种的多核苷酸。
本发明的另一方面是标记、纯化或分选表达CD3的细胞的方法。将所述细胞与带有标记物(如荧光标记物或放射性同位素)的抗CD3核酸适配体一起孵育。
该技术的另一方面是用于体外或体内靶向T细胞的递送载体，其包含上述抗CD3核酸适配体。
本技术的另一个方面是将递送载体靶向受试者T细胞的方法。该方法包括向受试者施用所述递送载体。
此外，该技术提供了包含上述药物递送载体的药物组合物。
本技术可进一步总结为以下特征列表。
1.一种包含序列GX1X2TX3GX4X5X6X7X8X9GGX10CTGG的核酸适配体，其中X1是G或A；X2和X6是A、T或G；X3是T，或G；X4和X9是G或C；X5是C或T；X7是T、G或C；并且X8和X10是C、T或A(SEQID NO:109)或其变体；并且其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
2.一种包含序列GGGX1TTGGCX2X3X4GGGX5CTGGC的核酸适配体，其中X1和X2是A、T或G；X3是T、C或G；X4和X5是A、T或C(SEQ ID NO:110)或其变体，其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
3.一种包含序列GX1TTX2GX3X4X5X6CX7GGX8CTGGX9G的核酸适配体，其中X1是A或G；X2是T或G；X3和X7、X9是G或C；X4是T或C；X5是A或T；X6是T、C或G；X8是A或C(SEQ ID NO:111)或其变体，其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
4.一种包含序列GGGTTTGGCAX1CGGGCCTGGC的核酸适配体，其中X1是G、C或T(SEQ IDNO:112)或其变体，其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
5.一种包含序列GCAGCGAUUCUX1GUUU的核酸适配体，其中X1是U或没有碱基(SEQ IDNO:113)或其变体，其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
6.根据1-5中任一项所述特征的核酸适配体，其中所述核酸适配体与人CD3ε/γ和/或CD3ε/δ相结合，解离常数为约0.2pM至约250nM。
7.根据1-5中任一项所述特征的核酸适配体，其中所述核酸适配体与非人形式的CD3ε/γ和/或CD3ε/δ相结合，解离常数为约20nM至约800nM。
8.根据1-7中任一项所述特征的核酸适配体，其包含选自SEQ ID NO:1至108的序列。
9.根据1-8中任一项所述特征的核酸适配体，其包含所述序列的变体，其中一个或多个碱基被非天然存在的碱基取代，或其中一个或多个所述碱基被删除或相应的核苷酸被连接子取代。
10.根据9所述特征的核酸适配体，其中所述一个或多个非天然存在的碱基选自甲基肌苷、二氢尿苷、甲基鸟苷和硫脲苷。
11.根据1-10中任一项所述特征的核酸适配体与CD3+T细胞结合但不激活CD3+T细胞。
12.一种用于将试剂、染料、用于共价偶联的官能团或生物活性剂递送至T细胞的载体，其中所述载体包含1-11中任一项所述特征的核酸适配体。
13.根据特征11或特征12所述的载体，其包含纳米粒子聚合物。
14.根据特征13所述的载体，其中所述纳米粒子聚合物包含聚(β氨基酯)(PBAE)。
15.根据特征13或特征14所述的载体，其中所述核酸适配体与所述聚合物共价连接。
16.根据13-15中任一项所述特征的载体，其中所述试剂是T细胞调节剂或显像剂。
17.根据特征16所述的载体，其中所述T细胞调节剂是携带转基因的病毒载体；其中所述病毒载体用所述聚合物包被；并且其中所述核酸适配体与所述聚合物共价连接。
18.根据特征17所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
19.根据特征17或特征18所述的载体，其中所述转基因编码嵌合抗原受体。
20.根据特征16所述的载体，其中所述T细胞调节剂选自达沙替尼、MEK1/2抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、代谢抑制剂、GSK3β抑制剂、MAO-B抑制剂和Cdk5抑制剂。
21.一种向受试者的T细胞递送试剂的方法，所述方法包括向所述受试者施用特征16-20中任一项所述的载体。
22.一种药物组合物，其包含特征16-20中任一项所述的载体和一种或多种赋形剂。
23.一种从受试者分离T细胞的方法，所述方法包括使用特征1-12中任一项所述的载体从受试者分离T细胞。
附图说明
图1示出了通过对重组人CD3ε/γ和人CD3ε/δ蛋白的混合物进行SELEX获得的抗CD3 DNA适配体(簇，cluster)的前45个核酸序列(SEQ ID NO:1-45，从上到下)。每种复合物都作为C-末端Fc融合物制备。hIgG1Fc被用作反向靶标(counter target)。在给定的一轮SELEX中，所述Cluster按出现频率递减的顺序从上到下排列。
图2A-2E为条形图，其示出了通过SELEX程序(图1)获得的核酸适配体Cluster_1(SEQ ID NO:1)、Cluster_1s(SEQ ID NO:46，相当于其中5’和3’侧翼区已被去除的Cluster_1)、Cluster_2(SEQ ID NO:2)、Cluster_3(SEQ ID NO:3)和Cluster_21(SEQ IDNO:21)与Jurkat细胞(人CD3阳性细胞)结合的结果。为了进行比较，也示出了所述核酸适配体与Ramos细胞(人CD3阴性细胞；对照)的结合。在3nM、10nM和30nM三种核酸适配体浓度下对结合进行检测。
图3A-3E为条形图，其示出了通过SELEX程序(图1)获得的核酸适配体CELTIC_1(SEQ ID NO:1)、CELTIC_1s(SEQ ID NO:46)、CELTIC_2(SEQ ID NO:2)、CELTIC_3(SEQ IDNO:3)和CELTIC_21(SEQ ID NO:21)与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果。为了进行比较，也示出了所述核酸适配体与Ramos细胞(人CD3阴性细胞；对照)的结合。在下列核酸适配体浓度下对结合进行检测:1nM、2.5nM、5nM、7.5nM和10nM。
图4A-4C是传感图，其示出了固定在系列传感SA芯片(Series Sensor SA Chip)上的生物素化核酸适配体CELTIC_1(SEQ ID NO:1)、CELTIC_3(SEQ ID NO:3)和CELTIC_21(SEQ ID NO:21)中的每一种与CD3ε/γ(左栏)、CD3ε/δ(中栏)和对照hIgG1 Fc(右栏)结合的结果。使用单循环动力学方案，通过表面等离子共振对结合进行检测。以3nM、10nM、30nM、50nM和100nM的浓度连续进样核酸适配体。
图5A-5F是条形图，其示出了每个核酸适配体CELTIC_2(SEQ ID NO:2)、CELTIC_3(SEQ ID NO:3)和CELTIC_21(SEQ ID NO:21)及它们缺少侧翼区核苷酸的较短版本CELTIC_2s(SEQ ID NO:47)、CELTIC_3s(SEQ ID NO:48)和CELTIC_21s(SEQ ID NO:49)与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果。在核酸适配体浓度为3nM、10nM和30nM时对结合进行检测。图5A和5D分别示出了CELTIC_2和CELTIC_2s与细胞的结合。图5B和5E分别示出了CELTIC_3和CELTIC_3s与细胞的结合。图5C和5F示出了CELTIC_21和CELTIC_21s与细胞的结合。核酸适配体与Ramos细胞的结合(CD3阴性细胞；对照)用于比较。
图6示出了Cluster1、2、3和21(分别对应SEQ ID NO:1、2、3和21)的序列比对和Cluster1、2和3的序列比对，以显示同源性的核心区域。多重序列比对采用ClustalW算法。在每个Cluster中发现的保守核苷酸用*标记。
图7A和7B示出了通过SELEX程序(图1)获得的数个另外的Cluster(图7A中从上到下的SEQ ID NO:11、7、5、9、22、2、17、14、15、20、18、12、1、8、13、3、4、6、19、10和16，图7B中从上到下的SEQ ID NO:1-22的DNA序列，以及排除和包括序列Cluster21的序列比对(分别为图7A和图7B)。使用ClustalW算法进行多序列比对。在每个Cluster中发现的保守核苷酸用*标记。图7C示出了通过SELEX程序(图1)获得的前45个Cluster的核心序列(SEQ ID NO:57)和由MEME(MultipleEMfor MotifElicitation)确定的碱基分布。
图8A-8G是条形图，其示出了通过SELEX程序获得的核酸适配体(无5’和3’侧翼区)CELTIC_4s(SEQ ID NO:50)，CELTIC_5s(SEQ ID NO:51)，CELTIC_6s(SEQ ID NO:52)，CELTIC_9s(SEQ ID NO:53)，CELTIC_11s(SEQ ID NO:54)，CELTIC_19s(SEQ ID NO:55)和CELTIC_22s(SEQ ID NO:56)与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)的结合结果，以评估结合饱和度和KD。在3nM、10nM和30nM三种核酸适配体浓度下对结合进行检测。为了进行比较，还示出了所述核酸适配体与Ramos细胞(CD3阴性细胞；对照)的结合。
图9A和9B是条形图，其示出了几种选择的核酸适配体在浓度为3nM(图9A)和10nM(图9B)时，与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)和Ramos细胞(CD3阴性细胞，对照)的结合结果的比较。抗CD3OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图10A-10D示出了存在血清时，核酸适配体CELTIC_1s(图10A)、CELTIC_4s(图10B)、CELTIC_11s(图10C)和CELTIC_19s(图10D)的稳定性。将核酸适配体在血清、含5％血清的SELEX缓冲液或含10％血清的RPMI培养基中于37℃孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、30min、10min或0h)后，通过琼脂糖凝胶电泳检测核酸适配体的完整性。
图11A和11B是条形图，其示出了核酸适配体CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s、CELTIC_11s、CELTIC_19s和CELTIC_22s在血清存在下的稳定性。通过在37℃下将核酸适配体在血清或含5％血清的SELEX缓冲液中孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、0.5h、10min或0h)来检测稳定性，然后通过流式细胞仪检测核酸适配体与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)的结合。抗CD3OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图12是条形图，示出了通过SELEX(图1)获得的核酸适配体CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s和CELTIC_19s与从健康供体分离的外周血单个核细胞结合的结果。在以下核酸适配体浓度下对结合进行检测:3nM、10nM、30nM、100nM和300nM。抗CD3OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图13A-13D是条形图，其示出了通过SELEX程序(图1)获得的核酸适配体CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s和CELTIC_19s与小鼠CD3阳性EL4细胞结合的结果，以估计结合饱和度和KD。在以下核酸适配体浓度下对结合进行检测：3nM、10nM、30nM、100nM和300nM。为了进行比较，还示出了300nM浓度的核酸适配体与人Jurkat细胞的结合，以及抗CD3145-2C11单克隆抗体(32nM)与人Jurkat细胞的结合(灰色条)。
图14A-14L示出了用1μm浓度的抗CD3 DNA核酸适配体激活人淋巴细胞的图，通过细胞因子的分泌来衡量。在含有10％血清的RPMI培养基中，在共刺激抗CD28抗体存在下，于37℃孵育核酸适配体不同时间(0h、3h、19h、27h或48h)后，通过ELISA检测分泌的细胞因子水平。图14A、14B和14C分别示出了核酸适配体CELTIC_1s对IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。图14D、14E和14F分别示出了被核酸适配体CELTIC_4s处理后IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。图14G、14H和14I分别示出了被核酸适配体CELTIC_11s处理后IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。图14J、14K和14L分别示出了被核酸适配体CELTIC_19s处理后IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。为了进行比较，还示出了抗CD3单克隆抗体在存在或不存在共刺激抗CD28抗体时的激活。
图15A-15C是条形图，其示出了通过检测CD25和CD69活化标记物的表达，在1μm浓度下抗CD3 DNA适配体对人淋巴细胞的激活。在含有10％血清的RPMI培养基中，在有或没有共刺激抗CD28抗体条件下，于37℃孵育核酸适配体48小时后，通过流式细胞仪检测CD4和CD8阳性T淋巴细胞上CD25和CD69表面标记物的水平。图15A示出了仅使用CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s或CELTIC_19s处理细胞获得的表达结果。图15B示出了用与共刺激抗CD28抗体混合的相同的核酸适配体处理细胞获得的表达结果。图15C示出了在孵育3h、19h和27h后，将新鲜核酸适配体溶液与抗CD28抗体混合添加到培养基中，以保持试剂浓度恒定，处理细胞后获得的表达结果。
图16A-16C是条形图，其示出了1μm浓度下抗CD3 DNA适配体对人类淋巴细胞的激活，通过细胞因子的分泌进行检测。在含有10％血清的RPMI培养基中，在37℃下将核酸适配体与共刺激抗CD28抗体一起孵育48小时后，用人Th1/Th2流式细胞仪微球阵列(CytometricBeadArray)检测分泌的细胞因子的水平。图16A示出了用CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s或CELTIC_19s单独处理细胞时，其IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和TNF-α的分泌。图16B示出了用与共刺激抗CD28抗体混合的相同的核酸适配体处理的细胞的细胞因子分泌谱。图16C示出了在孵育3h、19h和27h后，将新鲜核酸适配体溶液与抗CD28抗体混合添加到培养基中，以保持试剂浓度恒定，处理细胞后获得的的细胞因子分泌谱。
图17.1A-17.3B是条形图，其示出了通过SELEX程序(图1)获得的核酸适配体CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s和CELTIC_19s以及针对CD3表位的抗体与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果，以便了解核酸适配体识别CD3的区域。在存在饱和浓度的竞争物的情况下进行结合。在图17.1A、17.2A和17.3A中，在一种浓度(OKT3和HIT3a的浓度为0.1nM或UCHT1的浓度为1nM)以及存在或不存在饱和浓度的未标记抗体(OKT3和HIT3a的浓度为32nM或UCHT1的浓度为10nM)或生物素化核酸适配体(300nM)时，检测了PE标记的CD3特异性单克隆OKT3、UCHT1和HIT3a的抗体的结合。在图17.1B、17.2B和17.3B中，在存在或不存在饱和浓度的未标记抗体(OKT3和HIT3a为32nM，UCHT1为10nM)以及存在PE标记的链霉亲和素的情况下，测试了300nM浓度的生物素化核酸适配体的结合。
图17.4是条形图，其示出了对应于在SELEX(图7C)期间分离的前45个序列家族中发现的计算保守基序的核酸适配体CELTIC_core与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)的结合结果。为了进行比较，还示出了核酸适配体与Ramos细胞(CD3阴性细胞；对照)的结合。在以下核酸适配体浓度下对结合进行检测:3nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、75nM和100nM。抗CD3OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图17.5列出了核酸适配体CELTIC_core(顶部的序列，SEQ ID NO:57)的不同变体(1至13)(分别为SEQ ID NO:58-71)的序列，对应于在SELEX期间分离的前45个序列家族中发现的计算保守基序(图7C)。下划线指序列中碱基被C3间隔基取代的位置，因此形成了一个脱碱基位点。原始核心序列中引入的突变以粗体突出显示。
图17.6A-17.6N是条形图，其示出了与CELTIC_core(图17.5)相比，携带修饰的核酸适配体CELTIC_core1，CELTIC_core2，CELTIC_core3，CELTIC_core4，CELTIC_core5，CELTIC_core6，CELTIC_core7，CELTIC_core8，CELTIC_core9，CELTIC_core10，CELTIC_core11，CELTIC_core12，CELTIC_core13和CELTIC_coreT与Jurkat的结合。在两种核酸适配体浓度(50nM和100nM)下对结合进行检测，并与使用CELTIC_core(50和100nM)和全长CD3_CELTIC_1s(10和50nM)获得的细胞染色进行比较。为了进行比较，还示出了核酸适配体与Ramos细胞(CD3阴性细胞；对照)的结合。抗CD3OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图18列出了核酸适配体CELTIC_core(“0”，SEQ ID NO:57)的不同变体(1至44，SEQID NO:58-102，包括图17.5中已经描述并在图17.6A至17.6N中评估的13个突变体)的序列，对应于在SELEX期间获得的前45个序列家族中发现的计算保守基序(图7C)。下划线是指序列中碱基已被C3间隔基取代的位置，因此产生了一个脱碱基位点。原始核心序列中引入的突变以粗体突出显示。
图19A-19D是条形图，其示出了与CELTIC_core(图17.5)相比，携带修饰的核酸适配体CELTIC_core14至CELTIC_core44与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果。在两种核酸适配体浓度50nM(图19.A为突变体14至37；图19.C为突变体38至44)和100nM(图19.B为突变体14至37；图19.D为突变体38至44)下对结合进行检测，并与使用CELTIC_core(50和100nM)和全长CD3_CELTIC_1s和CD3_CELTIC_19s(10和50nM)获得的细胞染色进行比较。为了进行比较，还示出了核酸适配体与Ramos细胞(CD3阴性细胞；对照)的结合。抗CD3OKT3和抗CD19的单克隆抗体(各32nM)作为阳性对照。
图20总结了与核酸适配体CELTIC_core(SEQ ID NO:57)(图17.5)相比，携带上述修饰的核酸适配体CELTIC_core1至CELTIC_core44(SEQ ID NO:58-102)与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果。
图21A-21F是条形图，其示出了核酸适配体CELTIC_core12，CELTIC_core 40HEGt，CELTIC_core 42HEGt与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)和CD3表位特异性抗体在存在饱和浓度竞争物下的结合结果，以了解核酸适配体识别的CD3区域。图21A、21C和21E，在存在或不存在饱和浓度的未标记抗体(OKT3和HIT3a分别为32nM和10nM)或生物素化核酸适配体(300nM)的情况下，以单一浓度(OKT3和HIT3a为0.1nM，UCHT1为1nM)测试了PE标记的单克隆OKT3、UCHT1和HIT3a抗体与CD3的结合。图21.B,21.D和21.F，在存在或不存在饱和浓度的未标记抗体(OKT3和HIT3a为32nM，UCHT1为10nM)以及存在PE标记的链霉亲和素的情况下，对生物素化核酸适配体浓度为300nM时的结合进行了检测。将结果与全长CD3_CELTIC_1s获得的细胞染色进行比较。
图22A-22F示出了存在血清时核酸适配体CELTIC_core HEG(图22A)、CELTIC_core12(图22B)、CELTIC_core 24HEG(图22C)、CELTIC_core 29HEG(图22D)、CELTIC_core 40HEG(图22E)和CELTIC_core 42HEG(图22F)的稳定性。将核酸适配体在血清、含5％血清的SELEX缓冲液或含10％血清的RPMI培养基中于37℃孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、30min、10min或0h)后，通过琼脂糖凝胶电泳检测核酸适配体的完整性。
图23A-C是条形图，其示出了存在血清时核酸适配体CELTIC_core HEG、CELTIC_core 12(图23A)、CELTIC_core 24HEG、CELTIC_core 29HEG(图23B)、CELTIC_core 40HEG和CELTIC_core 42HEG(图23C)的稳定性。将核酸适配体在血清或含5％血清的SELEX缓冲液中于37℃孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、0.5h、10min或0h)来检测稳定性，然后通过流式细胞仪检测核酸适配体与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)的结合。抗CD3OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图24A-D示出了存在血清时核酸适配体CELTIC_core 40HEG(图24A)、CELTIC_core40HEGt(图24B)、CELTIC_core 42HEG(图24C)和CELTIC_core 42HEGt(图24D)的稳定性。将核酸适配体在血清、含5％血清的SELEX缓冲液或含10％血清的RPMI培养基中于37℃孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、30min、10min或0h)后，通过琼脂糖凝胶电泳检测核酸适配体的完整性。
图25A-25B是条形图，其示出了在存在血清时核酸适配体CELTIC_core 40HEG、CELTIC_core 40HEGt(图25A)、CELTIC_core 42HEG和CELTIC_core 42HEGt(图25B)的稳定性。将核酸适配体在血清或含5％血清的SELEX缓冲液中于37℃孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、0.5h、10min或0h)来检测稳定性，然后通过流式细胞仪检测核酸适配体与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)的结合。抗CD3 OKT3单克隆抗体(32nM)作为阳性对照。
图26是条形图，其示出了末端带有化学修饰的核酸适配体CELTIC_core 42HEG(5’端为四嗪基团，3’端为生物素)与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果。在以下核酸适配体浓度下对结合进行检测：15nM、25nM、35nM、50nM和75nM，并与在3’或5’端用生物素修饰的核酸适配体CELTIC_core 42HEG获得的细胞染色进行比较。为了进行比较，还示出了核酸适配体与Ramos细胞(CD3阴性细胞；对照)的结合。抗CD3 OKT3和抗CD19单克隆抗体(各32nM)作为阳性对照。
图27示出了通过在重组CD3ε/γ和CD3ε/δ蛋白混合物上SELEX获得的五种最常见的抗CD3 RNA适配体(Cluster)的核酸序列(SEQ ID NO:103-107，从上到下)的比对，每种蛋白制备为C-末端Fc融合。使用hIgG1Fc作为反向靶标。最后三轮SELEX是以Jurkat(CD3阳性)细胞为靶标，Ramos(CD3阴性)细胞为反向靶标。采用ClustalW算法进行多重序列比对。在每个Cluster中发现的保守核苷酸用*标记。
图28示出了通过SELEX程序获得的前5个Cluster中获得的核心序列(SEQ ID NO:108)和通过MEME(Multiple Em for Motif Elicitation)确认的碱基分布(图27)。
图29A-29B示出了ARACD3-0010209(SEQ ID NO:103)、ARACD3-0270039(SEQ IDNO:105)、ARACD3-2980001(SEQ ID NO:104)、ARACD3-3130001(SEQ ID NO:106)和ARACD3-3700006(SEQ ID NO:107)的序列和Mfold预测的二级结构。数字表示缺少侧翼区核苷酸的核酸适配体的碱基数。其还描述了通过SELEX获得的5个Cluster中发现的核心序列的二级结构。在37℃、1MNa+下，通过Quikfold3.0(Zuker等人，2003)计算了每种核酸适配体的二级结构和自由能。
图30A-30E是条形图，其示出了通过SELEX(图27)获得的核酸适配体ARACD3-0010209、ARACD3-0270039、ARACD3-2980001、ARACD3-3130001和ARACD3-3700006与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)结合的结果。为了进行比较，还示出了核酸适配体与Ramos细胞(CD3阴性细胞；对照)的结合。在30nM、100nM和300nM三种核酸适配体浓度下对结合进行检测。
图31A-31C示出了固定在SeriesSensorSAChip上的生物素化核酸适配体ARACD3-3700006，ARACD3-0010209，和ARACD3-3130001与CD3ε/γ(左栏)、CD3ε/δ(中栏)和对照hIgG1 Fc(右栏)结合的结果的传感图。使用单循环动力学方案，通过表面等离子共振对结合进行检测。以3nM、10nM、30nM、100nM和300nM的浓度进行核酸适配体的连续上样。
图32A-32C示出了存在血清时抗CD3 RNA适配体ARACD3-3700006和ARACD3-0010209的稳定性和完整性。图32A(条形图)示出了，将核酸适配体在血清或含5％血清的DPBS培养基中于37℃孵育不同时间(24h、4h、2h、1h、30min、10min或0h)来检测稳定性，然后通过流式细胞仪检测核酸适配体与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)的结合。图32B-C示出了将核酸适配体在血清、含5％血清的DPBS缓冲液或含10％血清的RPMI培养基中于37℃孵育不同时间(24小时、4小时、2小时、1小时、30分钟、10分钟或0小时)后，通过琼脂糖凝胶电泳检测的其完整性。
图33示出了通过SELEX程序(图27)获得的核酸适配体ARACD3-3700006和ARACD3-0010209与从健康供体分离的外周血单个核细胞的结合结果。在下列核酸适配体浓度下对结合进行检测：3nM、10nM、30nM、100nM和300nM。
图34A-34B是条形图，其示出了通过SELEX(图27)获得的核酸适配体ARACD3-3700006和ARACD3-0010209与小鼠CD3阳性EL4细胞结合以估计结合饱和度和KD的结果。在以下核酸适配体浓度下对结合进行检测:3nM、10nM、30nM、100nM和300nM。为了进行比较，还示出了300nM浓度的核酸适配体与人Jurkat细胞的结合。
图35A-35F是曲线图，其示出了抗CD3 RNA适配体在1μm浓度对淋巴细胞的激活，通过细胞因子的分泌进行检测。在含有10％血清的RPMI培养基中，在存在共刺激抗CD28抗体的情况下，将核酸适配体于37℃孵育不同时间段(0h、16h、24h或48h)后，通过ELISA检测分泌的细胞因子的水平。图35A、35B和35C分别示出了被核酸适配体ARACD3-3700006处理后IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌。图35D、35E和35F分别示出了被核酸适配体ARACD3-0010209处理后IFNγ、IL-2和TNF-α的分泌。为了进行比较，还示出了存在或不存在共刺激抗CD28抗体时抗CD3单克隆抗体的激活。
图36A-36C是条形图，其示出了1μm浓度的抗CD3 RNA适配体对人类淋巴细胞的激活，通过CD25和CD69激活标记物的表达来检测。将核酸适配体在含有10％血清的RPMI培养基中，存在或不存在共刺激抗CD28抗体下，于37℃孵育48h后，通过流式细胞仪检测CD4和CD8阳性T淋巴细胞上的CD25和CD69表面标记物水平。图36A示出了仅用ARACD3-3700006或ARACD3-0010209获得的表达结果。图36B示出了用相同的核酸适配体与共刺激抗CD28抗体混合处理细胞后获得的表达结果。图36C示出了在培养3h、19h和27h后，将新鲜核酸适配体溶液与抗CD28抗体混合添加到培养基中，以保持试剂浓度恒定，处理细胞后获得的表达结果。
图37A-37C是条形图，其示出了1μm浓度的抗CD3 RNA核酸适配体对人淋巴细胞的激活，通过细胞因子的分泌进行检测。在含10％血清的RPMI培养基中，在存在共刺激抗CD28抗体的情况下，于37℃孵育核酸适配体48h后，使用人Th1/Th2流式细胞术微球阵列检测分泌的细胞因子水平。图37A示出了仅使用ARACD3-3700006或ARACD3-0010209处理的细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10和TNF-α的情况。图37B示出了用与共刺激抗CD28抗体混合的相同核酸适配体处理后细胞的细胞因子分泌谱。图37C示出了在培养3h、19h和27h后，将新鲜核酸适配体溶液与抗CD28抗体混合添加到培养基中，以保持试剂浓度恒定，处理细胞后获得的细胞因子分泌谱。
图38A-38F是条形图，其示出了通过SELEX程序(图27)获得的核酸适配体ARACD3-3700006和ARACD3-0010209与Jurkat细胞(CD3阳性细胞)和对CD3表位具有特异性的抗体在存在饱和浓度的竞争物的情况下结合的结果，以便了解核酸适配体识别CD3的区域。在图38A、38C和38E中，在一种浓度(OKT3和HIT3a为0.1nM，UCHT1为1nM)，不存在或存在饱和浓度的未标记抗体(OKT3和HIT3a为32nM，UCHT1为10nM)或生物素化核酸适配体(300nM)的情况下，检测了PE标记的CD3特异性单克隆OKT3、UCHT1和HIT3a抗体的结合。在图38B、38D和38F中，对不存在或存在饱和浓度的未标记抗体(OKT3和HIT3a为32nM，UCHT1为10nM)，以及存在PE标记的链霉亲和素时浓度为300nM的生物素化核酸适配体的结合进行了测试。
具体实施方式
本技术涉及抗CD3核酸适配体，公开了分离CD3特异性核酸适配体的方法，以及抗CD3核酸适配体的各种用途，包括作为针对T细胞的治疗剂的递送载体的靶向部分和作为药物组合物的组分。
本技术的抗CD3核酸适配体的实施方案可以使用几种共有序列来描述。DNA适配体可以包括以下共有序列或其变体:
1.GX1X2TX3GX4X5X6X7X8X9GGX10CTGG，其中X1为G或A；X2和X6为A、T或G；X3为T或G；X4和X9为G或C；X5为C或T；X7为T、G或C；X8和X10为C、T或A(SEQ ID NO:109)。
2.GGGX1TTGGCX2X3X4GGGX5CTGGC其中X1和X2为A、T或G；X3为T、C或G；X4和X5为A、T或C(SEQ ID NO:110)。
3.GX1TTX2GX3X4X5X6CX7GGX8CTGGX9G，其中X1为A或G；X2为T或G；X3和X7、X9为G或C；X4为T或C；X5为A或T；X6为T、C或G；X8为A或C(SEQ ID NO:111)。
4.GGGTTTGGCAX1CGGGCCTGGCG，其中X1为G、C或T(SEQ ID NO:112)。
5.GCAGCGAUUCUX1GUUU其中X1为U或无碱基(SEQ ID NO:113)。
核酸适配体是具有二级和三级结构的DNA和RNA寡核苷酸，可赋予与靶分子的高亲和力并与靶分子特异性结合。使用分子捕获技术产生核酸适配体是已知的(参见A.D.EllingtonandJ.W.Szostak.Nature346:818-822，1990；和C.TuerkandL.Gold.Science249:505-510，1990)。核酸适配体可以用作靶向装置，将分子制剂递送至特定的靶位点。某些肿瘤与特定抗原相关，基于这些抗原，可以设计肿瘤结合核酸适配体以辅助出于诊断或治疗目的的肿瘤靶向。
通常，可以使用已知方法从核酸序列库中鉴定和分离核酸适配体。核酸序列库与靶分子一起孵育，选择结合后的寡核苷酸，并在下一步骤中扩增，例如通过聚合酶链式反应(PCR)。使用由靶分子组成的亲和柱进一步纯化产物。所述核酸适配体可以包括DNA、RNA或PNA，碱基可以是天然的也可以是非天然的。天然碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。非天然存在的碱基包括，例如，甲基肌苷、二氢尿苷、甲基鸟苷、硫尿苷、2’-O-甲基嘌呤、2’-氟嘧啶和本领域普通技术人员熟知的许多其它碱基。PNA碱基可以包括与酰胺(肽样骨架)连接的天然或非天然碱基。核酸序列的主链可以是如PNA的酰胺、或如DNA或RNA中的磷酸二酯、硫代磷酸二酯、硫代磷酸酯、亚甲基硫代磷酸酯、或这些化学结构的修饰物。
所述核酸适配体的核酸序列可以仅包含靶结合序列，所述靶结合序列可以包括恒定区和可变区或者仅包括可变区。恒定区序列可用于促进靶结合序列的结合、扩增、复制或切割。
核酸适配体可与递送至靶或靶位点的试剂偶联，用于各种目的，例如检测、成像、诊断、治疗或预防。所述试剂包括细胞、纳米颗粒、激素、疫苗、半抗原、毒素、酶、免疫系统调节剂、抗氧化剂、维生素、造血系统的功能试剂、蛋白质(如链霉亲和素或亲和素或它们的突变)、金属和其它无机物、病毒颗粒、抗原(如氨基酸)、肽、糖和多糖、受体、顺磁标记和荧光标记、药物化合物、放射性同位素和放射性核素(如93P、95mTc、99Tm、186Re、188Re、189Re、111In、14C、38)。
可以与核酸适配体偶联的药物化合物包括，例如，常规化疗药物、抗生素、皮质类固醇、诱变剂(例如硝基脲)、抗代谢药和激素拮抗剂。
可与核酸适配体偶联的大分子包括有丝分裂原、细胞因子和生长因子。可能有用的细胞因子包括肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-3等)、干扰素蛋白、IFNIFN-α、INF-β和IFN-M，激素(包括糖皮质激素)、阿糖胞苷和抗病毒药物(如阿昔洛韦和更昔洛韦)。
可以使用众所周知的方法，包括化学和生物技术，将核酸适配体与试剂偶联，其可以生成共价键和非共价键(C.-P.D.Tu等人，Gene10:177-83，1980；A.S.Boutorine等人，Anal.Biochem.Bioconj.Chem.1:350-56，1990；S.L.CommerfordBiochem，10:1993-99，1971；D.J.Hnatowich等人，J.Nucl.Med.36:2306-14，1995)。共价键可以使用例如化学共轭反应、螯合剂或由磷酸二酯键形成的键来形成。非共价键包括分子相互作用，如链霉亲和素与生物素之间的相互作用、氢键和其他形式的离子相互作用。示例的螯合剂包括DTPA、SHNH和多齿螯合剂(如N2S2和N3S)(A.R.Fritzberg等，J.Nucl.Med.23:592-98，1982)。核酸适配体也可以结合到细胞表面或纳米颗粒上，以在体外或体内将细胞或纳米颗粒引导到特定位置。
使用一种称为指数富集的配体选择进化(SELEX)方法选择核酸适配体(Ellington等人，1990；Tuerk等人，1990年)。SELEX是一种通过体外选择和扩增的重复过程筛选非常大的寡核苷酸组合库的方法。该方法包括从候选的混合物中进行选择以及逐步迭代的结构改进，使用相同的一般选择主题，以实现几乎任何期望的结合亲和力和选择性标准。从核酸的混合物开始，优选包括随机序列的片段，该方法包括以下步骤:在有利于结合的条件下使混合物与靶标接触，从已经与靶分子结合的那些核酸中分隔出(partitioning)(即分离(separating))未结合的核酸，解离核酸-靶标对，扩增从核酸-靶标对中解离的核酸以产生富含配体的核酸混合物，然后重复结合、分离、解离和扩增的步骤，循环次数根据需要而定。
SELEX基于这样一种认识：在含有大量可能序列和结构的核酸混合物中，存在对给定靶的广泛的结合亲和力。包含例如20-核苷酸随机片段的核酸混合物可以具有420种候选可能性。对靶具有较高亲和力常数的那些随机片段最有可能发生结合。在分离、解离和扩增后，产生第二种核酸混合物，使具有较高结合亲和力的候选物被富集。额外的几轮选择逐渐偏向最佳配体，直到得到的核酸混合物主要由仅一个或几个序列组成。然后可以对其进行克隆、测序，并单独测试其作为纯配体的结合亲和力。
对选择和扩增的循环进行重复，直至达到预期目标。在最普遍的情况下，选择/扩增会持续进行，直到重复该循环后结合强度没有显著提高。迭代选择/扩增的方法足够灵敏，能够在包含至少65000个序列变体的混合物中分离出单个序列变体。该方法甚至能够在含有1014个序列的混合物中分离出少量高亲和力序列。原则上，该方法可用于对多达约1018种不同的核酸进行采样。测试混合物的核酸优选包括随机序列部分以及进行有效扩增所需的保守序列。核酸序列变体可以通过多种方式产生，包括随机核酸序列的合成和从随机切割的细胞核酸中进行序列大小选择。可变序列部分可以包含完全或部分随机序列；它还可以包含与随机序列结合的保守序列的子部分。可以在选择/扩增迭代之前或期间通过诱变引入或增加测试核酸中的序列变异。
在许多情况下，不一定需要重复SELEX步骤，直到鉴定出单个核酸配体。靶标特异性核酸配体溶液可以包括核酸结构或基序(motif)家族，其具有许多保守序列和许多不显著影响核酸配体对靶的亲和力的可被取代或添加的序列。通过在完成前终止SELEX过程，可以确定核酸配体溶液家族中许多成员的序列，从而可以确定对核酸配体溶液的全面描述。
在SELEX解析了核酸配体家族的描述后，在某些情况下，可能需要根据SELEX实验期间收到的信息专门进一步进行一系列SELEX分析。例如，在第二系列SELEX中，核酸配体家族的保守区域可以被固定，而配体结构中的所有其他位置都是随机的。在替代实施方案中，核酸配体家族最具代表性成员的序列可用作SELEX方法的基础，其中原始核酸序列库不是完全随机的，而是偏向含有最常见的配体。通过这些方法，可以优化SELEX过程以获得最优选的核酸配体。
本发明的核酸适配体可以具有任何期望的长度。所述核酸适配体可以包括至少约15种寡核苷酸。优选地，所述核酸适配体可以包括至多约80个核苷酸。
现代技术允许鉴定或产生具有任何所需平衡常数(KD)的核酸适配体。在一些实施方案中，所述核酸适配体的平衡常数(KD)包括约1pM至约10.0μM；约1pM至约1.0μM；约1pM至约100nM；约100pM至约10.0μM；约100pM至约1.0μM；约100pM至约100nM；或约1.0nM至约10.0μM；约1.0nM至约1.0μM；约1nM至约200nM；约1.0nM至约100nM；约500nM至约10.0μM；或约500nM至约1.0μM。
所述靶分子可以包括小分子、蛋白质或核酸。对于本文所述的核酸适配体，所述靶分子是CD3ε/γ和/或CD3ε/δ蛋白。
本发明所述的核酸适配体可以用于药物组合物中。
定义
核酸是指单链或双链的DNA、RNA、XNA及任何它们的化学修饰物。
核酸适配体(或配体)是指与另一分子(靶)结合的核酸。在候选核酸群体中，核酸适配体的结合亲和力大于群体的结合亲和力。在多个候选核酸适配体序列中，对于给定的靶可以存在一个以上的核酸适配体。所述核酸适配体对靶分子的结合亲和力可以彼此不同。
核酸序列的变体，例如核酸适配体序列，可以包括具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的序列(如通过序列同一性算法，例如BLAST算法确定的)。变体还可以包括用非天然存在的碱基取代一个或多个碱基，或删除一个或多个碱基，任选地用连接子或键取代核苷酸。变体还可以包括修饰的核酸主链，例如在肽核酸(PNA)中发现的核酸主链。
多个候选核酸适配体序列是多个序列不同的核酸，可以从中选择所需的核酸适配体。候选序列的来源可以来自天然存在的核酸或其片段、化学合成的核酸、酶合成的核酸或通过前述技术的组合制备的核酸。
靶分子是指需要配体的任何感兴趣的化合物。靶分子可以是蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物质、生长因子等，没有限制。靶标还可以是表达所需蛋白质的细胞，所需的核酸适配体与之特异性结合。使用细胞选择核酸适配体可以称为细胞-SELEX(ChenC等，npjPrecisionOncology(2017)1-37)。细胞-SELEX以活细胞为靶标。核酸适配体与活细胞膜蛋白结合。细胞-SELEX的程序包括阳性选择和阴性选择。对于阳性选择，将单链DNA或RNA库与靶细胞一起孵育，并收集结合的序列。将结合的序列与阴性细胞一起培养，收集未结合的序列用于扩增、测序和克隆。在几个交替循环后获得核酸适配体。本公开包括通过与使用活细胞作为靶结合来选择抗CD3的核酸适配体。CD3阳性的Jurkat细胞和CD3阴性的Ramos细胞分别用于阳性和阴性选择。
分离(Separation)(或分隔(partitioning))是指结合到靶分子的配体(本文称为核酸适配体-靶对或序列-靶复合物)可以与未结合到靶分子的核酸分离的任何过程。分离可以通过本领域已知的各种方法完成。核酸-蛋白质对可以与硝酸纤维素滤膜结合，而未结合的核酸不能结合。特异性保留序列-靶标复合物(或特异性保留结合核酸适配体与附着靶复合)的柱可以用于分离。也可以使用液-液分离以及过滤凝胶阻滞和密度梯度离心。分离方法的选择将取决于靶标和序列-靶标复合物的性质，并且可以根据本领域普通技术人员已知的原理和性质进行
扩增是指增加一个分子或一类分子的拷贝数或拷贝数的任何过程或过程步骤的组合。在本申请所公开的实施例中，RNA分子的扩增是通过序列进行的，所述序列包含于三个反应中：制备所选RNA的cDNA拷贝，使用聚合酶链式反应来增加每个cDNA的拷贝数，以及转录cDNA拷贝以获得与所选RNA具有相同序列的RNA分子。本领域技术人员应认识到，本领域已知的任何反应或反应的组合都可以适当地使用，包括直接DNA复制、直接RNA扩增等。所述扩增方法应使扩增混合物的比例基本上代表初始混合物中不同序列的比例。
“随机的”是一个术语，用于描述在给定长度上原则上具有任何可能序列的核酸片段。根据需要，随机序列将具有各种长度，范围从大约8个到100个以上的核苷酸。由于可能存在未知的偏差或核苷酸偏好，随机序列片段产生的化学或酶反应可能不会产生数学上的随机序列。使用术语“随机的”代替“随机”来反映这种偏离非理想性的可能性。在目前已知的技术中，例如顺序化学合成，不存在大的偏差。对于20个核苷酸或更少的短片段，任何可能存在的小的偏好性都会产生可忽略的后果。单次合成的序列越长，任意偏好性的影响就越大。
可以有意地将偏好性引入随机序列中，例如，通过改变合成反应的前体核苷(或脱氧核苷)三磷酸盐的摩尔比。可以需要有意的偏好性，例如，使碱基比例接近给定生物体中各碱基的比例，以影响序列二级结构，或影响序列解链pH或pH敏感性。相比CG碱基对，序列可能偏好于包含更高百分比的AT，从而降低其解链pH。
实施例
实施例1:抗CD3的DNA适配体
文库和引物
为DNA适配体的选择而设计的单链DNA(ssDNA)文库购买自TriLinkBiotechnologies。该库由一个40-核苷酸随机区(N40)组成，两侧有两个恒定区:5’-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-(N40)-TTGACTAGTACAT GACCACTTGA-3’(SEQ ID NO:114)，用作PCR扩增的模板。PCR反应的引物序列为:5’-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-3’(SEQ ID NO:115)(正向引物)和5’生物素-TCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA-3’(SEQ ID NO:116)(反向引物)。在选择的过程中，根据制造商的方案，使用AmpliTaq Gold 360聚合酶试剂盒(AppliedBiosystems)在Eppendorf Mastercycler Nexus中扩增所述文库。使用以下条件:聚合酶活化，95℃初始变性10min，95℃变性30s，45℃退火30s(每次PCR循环递增0.2℃)，72℃延伸1.5min，72℃最终延伸7min。通过在5'末端用生物素修饰的反向引物，使用链霉亲和素偶联磁珠从扩增的双链DNA(dsDNA)进行每轮连续选择，可以生成ssDNA文库。两种引物均为HPLC级纯化引物，购买自Eurogentec。
核酸适配体的选择
SELEX过程包括六轮选择，并在CD3ε/γ(CD3ε/γ)和CD3ε/δ(CD3ε/δ)二聚体组成的重组CD3蛋白ε链上进行，这些二聚体是作为具有恒定人类免疫球蛋白G1 Fc结构域的C端融合体购买的。因此，使用人免疫球蛋白G1(IgG1 Fc)的Fc片段进行阴性选择。所有蛋白均购买自AcroBiosystems。每一轮选择包括以下步骤：反向选择、ssDNA文库与靶标的孵育、可识别靶标的序列的PCR扩增、以及在链霉亲和素修饰的磁珠上分离dsDNA。每个循环前，将ssDNA文库(初始循环2.5nmol)在95℃下变性5min，然后立即在4℃下在选择(SELEX)缓冲液(20mMHEPES，150mMNaCl，5mMKCl，1mMMgCl2和1.5mMCaCl2、pH7.2，不含DNA酶和RNA酶，购自Sigma-Aldrich)中冷却5min。为了消除Fc结构域特异性序列，在热循环仪(EppendorfMastercyclerNexus)中，将ssDNA文库与IgG1-Fc蛋白(0.5nmol，1μM)在37℃下孵育90min。然后将反应混合物通过硝酸纤维素醋酸酯膜(0.45微米HAWP膜，25mm直径，Millipore)过滤，将该膜插入Millipore的25mm直径支撑过滤器支架中，并用选择缓冲液洗涤。过滤前，将HAWP膜在选择缓冲液中浸泡至少30min。过滤后，丢弃附着有IgG1-Fc/ssDNA复合物和与过滤器结合的非特异性ssDNA序列的膜。使用10kDa AMICON Ultra-15 MWCO过滤器浓缩含有未结合序列的滤液，然后与阳性靶标孵育。在第一个循环中，针对重组CD3ε/γ(0.15nmol，0.3μM)和CD3ε/δ(0.15nmol，0.3μM)结构域选择核酸适配体，在热循环仪中以500μL的体积，以37℃温度运行120分钟。从第二轮开始，在每个循环中交替使用CD3ε/γ和CD3ε/δ。然后将反应混合物通过硝酸纤维素醋酸酯膜过滤。用8mL选择缓冲液洗涤过滤器，以去除所有与蛋白连接的低亲和力和低特异性序列。通过在75℃下将膜置于1mL 7M尿素中孵育5min(两次)，洗脱与保留在过滤器上的蛋白质结合的ssDNA。回收的ssDNA溶液在不含DNA酶和RNA酶的水中(Invitrogen)稀释两次，并使用10kDa AMICON Ultra-4 MWCO过滤器浓缩。将序列在水中重新稀释并重新浓缩。所得溶液在Micro Bio-Spin P-6柱(在SSC缓冲液中，Bio-Rad)上纯化，并在5μL线性聚丙烯酰胺(Invitrogen)存在下，在乙醇(HPLC级，Fisher)和pH为5.2的乙酸钠(ThermoScientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国)中沉淀。在-25℃下孵育约1h后，将洗脱的ssDNA在4℃下以21000g离心20分钟，丢弃上清液，用200L去DNA酶和RNA酶水稀释含有ssDNA的团粒，并在空气中放置20min以蒸发乙醇。在PCR反应仪(AmpliTaq Gold360，Applied Biosystems)中，在存在未修饰的正向引物和生物素化的反向引物的情况下，扩增选定的ssDNA序列。为每一轮选择分别选择最佳PCR循环数。为此，扩增过程结束后，在琼脂糖凝胶(3％含有SYBRSafe的TBE缓冲液，Invitrogen)上对经过多次PCR循环获得的dsDNA样本进行迁移。当琼脂糖凝胶上出现对应于dsDNA的条带时，停止PCR反应。然后收集具有扩增后的dsDNA的PCR混合物，用水稀释至最终体积为15mL，并使用10kDaAMICONUltra-15MWCO膜浓缩。将等分浓缩样本储存在-20℃用于测序分析。为了纯化并生成用于下一轮选择的ssDNA链，剩余样品通过扩增的dsDNA上存在的生物素与链霉亲和素包被的磁珠(MyOne Streptavidin Dynabeads)结合。根据制造商的方案，在室温下于结合缓冲液(1M NaCl，5mM Tris，0.5mM pH 8.0的EDTA，无DNA酶和RNA酶，购买自Sigma-Aldrich)中孵育18min。3mg磁珠用于20μg dsDNA。然后，从溶液中分离具有dsDNA的磁珠，并用结合缓冲液(用于孵育的结合缓冲液的两倍体积)洗涤五次，以消除任何剩余的非特异性结合的文库种和PCR反应残留物。DNA链的分离是通过在碱性条件下变性进行的，并通过在50mM NaOH(Sigma-Aldrich的BioUltra)溶液中孵育经修饰的珠子3min来进行。结果，生物素化的DNA链仍然附着在磁珠上，未修饰的感兴趣链被释放到溶液中并被回收。然后将获得的单链DNA在水中稀释至4mL的最终体积，并使用10kDaAMICON Ultra-4MWCO浓缩以去除NaOH。使用微型生物自旋柱(P-6；BioRad)进行选择缓冲液的交换。通过分析ssDNA在琼脂糖凝胶(3％的TBE缓冲液)上的迁移分析回收的ssDNA文库的质量，并通过使用NanoDrop One(ThermoScientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国)检测260nm处的吸光度，计算其浓度。
在连续几轮的SELEX过程中，选择的严格性逐渐增加(见表1)。例如，降低了靶标和ssDNA文库的浓度，缩短了与蛋白质的孵育时间，增加了筛选后用于膜洗涤的缓冲液体积，并为最后一轮筛选添加了非特异性竞争物(酵母总RNA，Sigma-Aldrich)。
表1:用于每一轮DNA适配体选择的SELEX条件
Figure BDA0003538474230000211
使用Illumina NextSeq MidOutput(150个循环)系统，通过下一代测序分析每个SELEX循环后获得的PCR等分试样以及初始ssDNA文库。该分析在纽约大学基因组技术中心进行。使用Galaxy project网站分析了高通量测序的数据。根据测序结果，选择核酸适配体候选物进行亲和力和特异性检测。
这些核酸适配体的核酸序列如图1、6和7A-7B所示。从Eurogentec Kaneka(比利时烈日)获得DNA适配体，其带有或不带有用于PCR扩增的侧翼区域，作为通过标准固相亚磷酰胺化学合成的HPLC-RP纯化单链寡核苷酸。将生物素作为生物素-三甘醇(生物素-TEG)添加到核酸适配体的5’端，在核酸适配体序列和生物素标记之间引入16原子混合极性间隔区。对于所有核酸适配体，制造商通过HPLC-MS验证了其分子量、纯度和完整性。
遵循相同的合成方法，以便在核心序列CELTIC_core中引入突变，如图17.5和图18所示。在固相合成过程中，通过加入C3间隔区，在核心序列的不同位置创建了脱碱基位点。当需要时，在5’末端修饰官能团和核酸适配体5’位置的第一个核苷酸之间插入另外的六乙二醇(HEG)连接子，以最小化空间位阻。核心序列变体的进一步修饰包括添加3'-3'-脱氧胸苷，作为增强对核酸酶降解的抗性的策略。
最后，通过添加到末端磷酸酯的C6氨基修饰物，用伯胺对核酸适配体的5’末端进行功能化。四嗪官能团通过标准NHS/EDC化学加成为四嗪-PEG5-NHS酯，在核酸适配体序列和四嗪标记之间引入了16原子混合极性间隔区。
实施例2:抗CD3的RNA适配体
文库和引物
初始RNA文库模板和引物由IDT(科罗维尔镇，爱荷华城，美国)合成，命名为ssDNA:5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-(N20)-TTTCTGCAGCGATTCTTGTTT-(N10)-GGAGAATGAGGAACCCAGTGCAG-3’(SEQ ID NO:117)；5’-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCTCTATGGGCAGT CGGTGAT-3’(SEQ ID NO:118)(正向引物)；5’-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3’(反向引物)(SEQ ID NO:119)。合成了与5’-和3’-恒定引物区互补的两个短“阻断”序列(购买自IDT)，以最小化引物对二级结构的影响:5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3’(SEQ ID NO:120)(正向阻断序列)；5’-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3’(SEQ ID NO:121)(反向阻断序列)。还通过IDT合成了与文库恒定中心区互补的另一个生物素化“捕获”序列：5’-Biotin-GTC-PEG-6 Spacer-CAAGAATCGCTGCAG-3’(SEQ ID NO:122)。所有材料均按250nmole的数量级订购，并经过脱盐纯化。
用于RNA适配体选择的RNA文库在最终应用中用2’-氟-(2'-F-)嘧啶进行了修饰，以提高其稳定性。T7引物与文库模板序列相结合，用Taq DNA聚合酶进行引物延伸(Clontech，山景城，加利福尼亚州，美国)。然后使用
Figure BDA0003538474230000231
T7转录试剂盒(Epicentre，麦迪逊，威斯康星州，美国)转录引物延伸材料，使用8M尿素(SequelNE试剂，A部分和B部分)在变性聚丙烯酰胺上纯化，尿素购买自美国生物分析公司(纳蒂克，马塞诸塞州，美国)。在选择期间，根据制造商的方案，使用SuperScript IV反转录酶(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)对文库进行反转录，并使用来自Clontech的TitaniumTaqDNA聚合酶进行扩增。在选择期间，使用以下PCR方案扩增文库(95℃，10秒；60℃，30秒；95℃下初始热启动激活60秒)。然后使用
Figure BDA0003538474230000232
T7转录试剂盒转录RNA文库，并在聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上纯化。将用于4℃过夜纯化后文库回收的凝胶洗脱缓冲液制备为0.5MNH4OAc、1mMEDTA(均购自Teknova)、0.2％SDS(购自Amresco)、pH为7.4。
RNA适配体的选择
RNA文库筛选采用熔化法(Melting-Offapproach)，分9轮进行。选择的第1-6轮是以CD3蛋白的重组ε链为靶标，以IgG1 Fc片段为反向靶标，使用与DNA适配体的选择相同的材料进行。从第7轮开始，对表达CD3蛋白的Jurkat细胞(人急性T细胞白血病细胞系-ATCCTIB-152)和用于阴性选择步骤(细胞-SELEX)的Ramos细胞(人伯基特淋巴瘤细胞系-ATCC CRL-1596)进行筛选。从美国模式细胞集存库(American Type Cell Collection)获得细胞系，并在RPMI-1640培养基(Gibco Invitrogen)中培养，培养基中添加了10％FBS(Gibco Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Gibco Invitrogen)。所有选择均在添加了10％血清基质的1XRPMI培养基中进行，每次SELEX循环包括以下步骤:将RNA文库固定在链霉亲和素包被的磁珠上、反选择、与靶标孵育、反转录识别靶的序列、PCR扩增和转录为RNA。在每一轮之前，用200μL PBS-T(最终浓度为0.01％Tween20，pH为7.4)洗涤缓冲液将链霉亲和素包被的磁珠(MyOne Streptavidin T1DynabeadsTM，通常每20μg DynabeadTM使用1pmol生物素化材料，用量根据要求的严格程度而变化)预洗涤三次。在无血清的1X RPMI培养基中(90℃变性1分钟，60℃退火5分钟，23℃下5分钟)用两倍于文库摩尔量的引物阻断序列和捕获序列对RNA文库进行复性。这样做是为了尽量减少恒定引物区对核酸适配体二级结构的影响，使磁珠通过链霉亲和素-生物素结合相互作用捕获文库，并保护核酸适配体的末端免受核酸外切酶的影响。复性完成后，在室温下孵育15分钟，将文库捕获在磁珠上。然后从溶液中分离磁珠，并在37℃下用200μL选择缓冲液洗涤3次，以消除任何剩余的PBS-T和非特异性结合的文库种。将带有RNA文库的磁珠在200μL的反向靶标制剂中37℃进行反选择孵育30min，使磁珠释放出非特异性序列。然后丢弃非特异性文库成员，用200μL选择缓冲液洗涤磁珠6次，持续7min。阳性选择包括用200μL阳性制剂将磁珠RNA文库在37℃孵育30分钟。在第一个循环中，针对重组CD3ε/γ结构域和CD3ε/δ结构域(各0.1μM)选择核酸适配体，并且从第二轮开始，交替使用CD3ε/γ结构域和CD3ε/δ结构域。在第六轮中，在针对细胞进行选择之前，将文库分成两种阳性条件(分别针对CD3ε/γ或CD3ε/δ)，以确保可以观察到针对两种重组蛋白的应答。然后在恢复期间将第六轮阳性文库汇集在一起，然后进行细胞选择。对于细胞-SELEX轮次，在用200μL选择缓冲液悬浮之前，解冻靶和反靶细胞，以5000×g离心沉淀，并用选择缓冲液洗涤两次。用于孵育的细胞数量是15×106(用于反选择)和1×106–15×106(用于阳性选择)。阳性选择完成后，将含有可以识别靶的序列的上清液与磁珠分离并回收。然后对上清液进行第二次磁分离，以确保磁珠已被完全去除。对于细胞-SELEX循环，在第二次磁分离后，以5000×g离心沉淀靶向的Jurkat细胞。用200μL选择缓冲液洗涤所述沉淀的细胞一次，以去除低亲和力和低特异性的核酸适配体种。在70℃下通过热变性从细胞中回收文库。每一轮中回收的文库均用MPC试剂(Lucigen Corp，米勒顿，威斯康星州，美国)进行蛋白沉淀、乙醇沉淀和样品浓缩，并用含8M尿素的10％变性聚丙烯酰胺纯化。然后根据制造商的说明使用SuperScript IV反转录酶对文库进行反转录，使用
Figure BDA0003538474230000241
TaqDNA聚合酶进行扩增，并根据制造商的说明使用
Figure BDA0003538474230000242
T7转录试剂盒进行转录。然后用含8M尿素的10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化转录产物。切取凝胶切片，在4℃凝胶洗脱缓冲液中洗脱过夜，通过NanoDrop-1000检测在260nm处的吸光度计算RNA文库浓度。
在连续几轮SELEX过程中，RNA文库的浓度逐渐降低。进行了额外的平行评估和“交叉适合度测试”，以便于在选择完成后的生物信息学分析期间识别良好的核酸适配体候选物。
通过使用MiniSeq Mid Output(150个循环)系统(Illumina)进行下一代测序来选择核酸适配体候选物。选择了几种适配子用于进一步检测。为此，2'-脱氧-2'-氟胸苷修饰的RNA适配体购买自Integrated DNA Technologies(IDT，科拉尔维尔，美国)。将生物素作为生物素-三甘醇(生物素-TEG)添加到核酸适配体的5’端，在核酸适配体序列和生物素标记之间引入16原子混合极性间隔区。通过HPLC-MS验证了分子量、纯度和完整性。这些核酸适配体的核酸序列如图27所示。
实施例3:检测抗CD3 DNA适配体对细胞上表达的CD3蛋白的亲和力和特异性
用流式细胞仪评估候选DNA适配体对细胞上表达的CD3蛋白的亲和力和特异性。这些研究是对CD3阳性的Jurkat(人急性T细胞白血病细胞系-ATCC TIB-152)、EL4(淋巴瘤小鼠细胞系-ATCC CRL-2638)和CD3阴性的Ramos(人伯基特淋巴瘤细胞系-ATCC CRL-1596)细胞进行的，通过将其与在添加了5％FBS的选择(SELEX)缓冲液中与生物素化候选核酸适配体孵育来进行。细胞在使用前，于添加有10％FBS(Gibco Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Gibco Invitrogen)的RPMI-1640培养基(Gibco Invitrogen)中培养。实验前，将Jurkat、EL4和Ramos细胞(2.5×105个细胞/孔)接种到96孔板中，并以2500rpm离心2min。弃去上清液，用200μL在37℃预热的SELEX-5％FBS缓冲液洗涤沉淀细胞两次。每次洗涤后，以2500rpm的速度离心2min。候选核酸适配体在95℃下变性5min，然后立即置于4℃冰块上变性5min。随后以两种不同的浓度范围稀释试验样本:3、10、30nM和1、2.5、5、7.5、10nM，然后向每种溶液中加入100nM藻红蛋白标记的链霉亲和素(链霉亲和素-PE，eBioscience)。为了与EL4细胞孵育，还将核酸适配体稀释至100和300nM。将Jurkat、EL4和Ramos细胞重新悬浮在DNA稀释液(100μL/孔)中，并在37℃、5％CO2增湿气体中培养30min。作为对照，将细胞与CD3单克隆抗体(PE标记，OKT3人抗CD3，Invitrogen)、PE-链霉亲和素或其各自不含其他试剂的缓冲液一起孵育。孵育后，以2500rpm离心细胞2min，弃去含有未结合序列的上清液。将沉淀的细胞用SELEX-5％FBS缓冲液(200μL/孔)洗涤并离心两次，以去除所有弱连接和非特异性连接的序列。然后在37℃、5％CO2增湿气体中，用1mg/mL的鲑鱼精子DNA溶液(100μL/孔)洗涤细胞。30min后，通过以2500rpm离心2min除去鲑鱼精子溶液，另外用SELEX-5％缓冲液(200μL/孔)洗涤细胞两次，然后离心。然后固定带有附着DNA序列的Jurkat、EL4和Ramos细胞(BDCellFIX溶液#340181)，并通过流式细胞仪(AttuneNXT Invitrogen.)计数YL-1通道的荧光阳性细胞。
图2A-2E示出了结合研究的结果。分析了5种核酸适配体：CELTIC_1、CELTIC_1s、CELTIC_2、CELTIC_3和CELTIC_21。CELTIC_1s与CELTIC_1的不同之处在于它缺少某些侧翼区核苷酸。为了进行比较，还检测了核酸适配体与CD3阴性Ramos细胞(人伯基特淋巴瘤细胞系-ATCCCRL-1596)的结合。所有核酸适配体均优先结合CD3阳性细胞。CELTIC_3在10nM时表现出饱和结合，其在3nM时表现出显著结合，特异性更强。基于这些结果，CELTIC_3与Jurkat细胞结合的表观KD在3nM和10nM之间。还在较低浓度下测试了这些核酸适配体与Jurkat细胞的结合，这证实了它们优先与Jurkat细胞结合。参见图3A-3E。在另一项细胞结合试验中，将核酸适配体CELTIC_2、CELTIC_3、和CELTIC_21与细胞的结合，与它们的较短版本CELTIC_2s、CELTIC_3s、和CELTIC_21s与细胞的结合进行了比较。当侧翼区域被去除时，观察到核酸适配体的特异性提高，参见图5A-5F。在另一项细胞结合试验中，检测了核酸适配体CELTIC_4s、CELTIC_5s、CELTIC_6s、CELTIC_9s、CELTIC_11s、CELTIC_19s和CELTIC_21s与细胞的结合，示出了它们对Jurkat细胞的特异性高于对Ramos细胞的特异性。检测核酸适配体浓度为3nM、10nM和30nM时的结合，参见图8A至8G。图9A和9B分别示出了浓度为3nM和10nM时所有核酸适配体体与Jurkat和Ramos细胞结合的结果的比较。在另一项细胞结合试验中，评估了核酸适配体CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s和CELTIC_19s与小鼠EL4细胞的结合。图13A-13D示出了结合研究的结果。在该试验中获得的细胞的剂量依赖性染色表明，这些核酸适配体具有交叉特异性，可以同时识别人和鼠的CD3蛋白。
相同的实验设置用于评估核酸适配体CELTIC_core的结合亲和力和特异性，所述核酸适配体CELTIC_core对应于在SELEX期间分离的前45个序列家族中发现的计算的保守基序(图7C)。如图17.4所示，核酸适配体缩短至严格保守的21个核苷酸，大大提高了对CD3受体的识别特异性。对于每种测试浓度，当CD3-阴性Ramos细胞上的信号可忽略时，检测了CD3-阳性Jurkat细胞上的信号。特异性的提高是以牺牲亲和力为代价的，因为当亲本序列例如CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s和CELTIC_19s在表观KD超过10nM时信号饱和，而本实验中观察到的表观KD超过50nM。
由于这一保守基序表现出GGG/C重复序列，定义了所谓的“G-四链体”组织，我们设计了一组突变体，以最终确认预测构象中G残基的重要性，确定参与结合特异性和亲和力的关键位置，并引入可改善核酸适配体性质的突变。如前所述，合成了几个序列变体CELTIC_core_1到CELTIC_core_13(图17.5)并在Jurkat和Ramos细胞上以50和100nM的浓度进行测试。作为比较，这些分析中包括了未经修饰的核心序列CELTIC_core(50和100nM)和全长CD3_CELTIC_1s(10和50nM)。图17.6.A至17.6.N所示结果表明，每种修饰对核酸适配体的生物活性都有显著且不可预测的影响:在保守基序(CELTIC_core_1或CELTIC_core_4)的3’端添加GC或G会导致特异性丧失。部分突变破坏了与CD3受体的相互作用(CELTIC_core_2、CELTIC_core_5、CELTIC_core_6和CELTIC_core_13)。当某些位置的G/C核苷酸被碱基位点(CELTIC_core_7至CELTIC_core_11)取代时，也会发生结合丧失，在核酸适配体第16位创建脱碱基位点产生了更好的亲和力但降低了特异性。
在5’-末端(CELTIC_core_T)添加TTT三联体对核心序列的结合特性没有影响，表明可以在生物素标记和核酸适配体之间引入一些空间，而没有任何空间位阻。这一观察结果促使我们进一步评估了所有在5’端带有HEG连接子的序列变体，这些变体引入了更长的C18间隔区。合成了从CELTIC_core_14到CELTIC_core_44的序列变体(图18)，并在Jurkat和Ramos细胞上以50和100nm的浓度进行测试，如前所述(图19A-D)。作为比较，这些分析中包括了未经修饰的核心序列CELTIC_core(50和100nM)、全长CD3_CELTIC_1s和CD3_CELTIC_19s(10和50nM)。对于大多数位置，脱碱基位点或碱基取代破坏了核心序列与Jurkat细胞表面表达的CD3受体的结合。10和12位核苷的去除降低了亲和力(CELTIC_core_23和CELTIC_core_25)，而11位(CELTIC_core_24)或16位(CELTIC_core_29)的相同修饰(不是定义“G-四链体”架构的GGG/C三联体的一部分)分别产生了亲和力和特异性相等或提高的核酸适配体。出乎意料的是，用G替换16位的原始C降低了核酸适配体(CELTIC_core_39)的亲和力，当用A替换时没有影响(CELTIC_core_38)，而T替换时转变为更高的亲和力和特异性(CELTIC_core_40)。同时修饰11和16位会增加亲和力和特异性(CELTIC_core_42)或降低亲和力(CELTIC_core_44)。所有这些来自构象-功能研究的结果(总结见图20)表明，可以通过在GGG/C三联体之外的位置替换和引入脱碱基位点形成“G-四链体”结构，对核心序列进行经验设计获得改进版本。
实施例4：检测抗CD3 RNA核酸适配体对细胞上表达的CD3蛋白的亲和力和特异性
评估了抗CD3 RNA核酸适配体与Jurkat和EL4细胞的结合，以确定其结合的表观KD。除了使用DPBS代替SELEX缓冲液之外，所述结合通常如实施例3所述进行。所述核酸适配体以30nM、100nM和300nM三种浓度使用。对于与EL4细胞孵育核酸适配体，其还被稀释至3nM和10nM，结合研究的结果如图30A-E所示。分析了五种适配子：ARACD3-3700006、ARACD3-0010209、ARACD3-3130001、ARACD3-2980001、和ARACD3-0270039。还检测了核酸适配体与CD3阴性Ramos细胞(对照)的结合，以评估核酸适配体的特异性。在另一种细胞结合试验中，评估了核酸适配体ARACD3-3700006和ARACD3-0010209与小鼠EL4细胞的结合，结合研究的结果如图34A-B所示。本试验中获得的细胞的剂量依赖性染色表明，这些核酸适配体具有交叉特异性，可以同时识别人和鼠的CD3蛋白。
实施例5：通过表面等离子共振检测的抗CD3 DNA适配体的结合
结合亲和力检测采用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)进行。为了分析核酸适配体与CD3蛋白之间的相互作用，按照制造商的说明(GE Healthcare)将1000个共振单位的生物素化核酸适配体固定在S系列传感芯片SA(GE Healthcare)上。SELEX缓冲液用作运行缓冲液。在“单动力学循环”模式下，以30μl/min的流速，通过注射不同浓度的人CD3ε/γ、CD3ε/δ、IgG1 Fc和小鼠CD3ε/δ(Sino Biological)来检测相互作用。使用的最高蛋白浓度为100nM。其他浓度通过3倍稀释获得。使用BIAcore T200评估软件评估了所有相互作用的动力学数据。图4A-4C示出了从这些检测获得的结合曲线的实例。下面的表3提供了从表面等离子共振检测中获得的KD值的汇总。
表3:通过表面等离子共振检测的前5种抗CD3 DNA核酸适配体的KD值
Figure BDA0003538474230000291
与人和鼠CD3ε/δ结合的KD值比较表明，核酸适配体也可以与鼠CD3ε/δ结合，但亲和力较低。此外，观察到与核酸适配体CELTIC_1(表1中的CD3-1)相比，CELTIC_1s(CD3-1s)与CD3蛋白的结合更强。下面的表4提供了从另一组表面等离子共振检测中获得的KD值的汇总。它包括带有和不带有侧翼区的前五种核酸适配体的KD值。
表4：通过表面等离子共振检测的前5种带有或不带有(s)侧翼区域的抗CD3 DNA适配体的KD值。根据记录的传感图，采用稳态分析模式计算数据。
Figure BDA0003538474230000292
下面的表5和表6提供了另外一些核酸适配体的KD值的汇总。表4和表5中所列的KD值是通过在稳态分析模式下进行检测获得的，而表3和表6中的KD值是通过在动力学分析模式下进行检测获得的。
表5：通过表面等离子共振检测的无侧翼区的不同抗CD3 DNA适配体的KD值。根据记录的传感图，采用稳态分析模式计算数据。
Figure BDA0003538474230000293
Figure BDA0003538474230000301
表6：通过表面等离子共振检测的无侧翼区的不同抗CD3 DNA适配体的KD值。根据记录的传感图，使用动力学分析模式计算数据。
Figure BDA0003538474230000302
带“*”标签的条目是指由于传感图的次优拟合而高估的值。NA＝不适用，因为未观察到相互作用。
实施例6：通过表面等离子共振检测的抗CD3 RNA适配体的结合
使用表面等离子共振检测抗CD3 RNA适配体与纯化的重组人CD3ε/γ和CD3ε/δ蛋白的结合。除了用DPBS替换SELEX缓冲液之外，一般按照实施例5所述进行结合研究。使用的最高蛋白浓度为300nM。其他浓度通过3倍稀释获得。抗CD3 RNA适配体与hIgG1 Fc的结合作为对照。还检测了其与小鼠CD3ε/δ(mCD3ε/δ)的结合。这些研究的结果见下面的表7。
表7:通过表面等离子共振检测不同抗CD3 RNA适配体的KD值。根据记录的传感图，使用动力学分析模式计算数据。
Figure BDA0003538474230000303
Figure BDA0003538474230000311
ND＝未测出。
图31A-32C示出了核酸适配体ARACD3-3700006、ARACD3-0010209、和ARACD3-3130001的结合曲线。
实施例7：通过抗CD3 DNA适配体的T细胞活化
为了检测抗CD3 DNA适配体对T细胞的活化作用，同时使用1μM浓度的核酸适配体和CD28对T细胞共刺激。通过ELISA和人Th1/Th2微量样本流式细胞术微球阵列(CBA)检测细胞应对活化而分泌的细胞因子。流式细胞仪检测T细胞表面CD25、CD69活化标记物的表达。所得结果分别示于图14A-14L、15A-15C和16A-16C。
对外周血单个核细胞(PBMCs)进行T细胞活化试验。新鲜制备的PBMCs是从从健康供体(Etablissement
Figure BDA0003538474230000312
ais du Sang，Division rhones-Alpes)获得的血沉棕黄层中分离出来的。用DPBS稀释血液后，通过FICOLL密度梯度(FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.084GEHealthcare)分离PBMCs，用DPBS洗两次，重新悬浮以获得所需的细胞密度，并在RPMI-1640培养基(Gibco Invitrogen)中以37℃，5％CO2进行培养，培养基中添加了10％FBS(GibcoInvitrogen)和1％青霉素/链霉素(Gibco Invitrogen)。
在评估T细胞活化特性之前，如实施例3所述，首先通过流式细胞仪验证抗CD3 DNA适配体与人PBMCs的结合，不同之处在于SELEX缓冲液被添加了10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基替代。使用4种核酸适配子：CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s和CELTIC_19s，浓度为3nM、10nM、30nM、100nM和300nM。图12示出了结合研究的结果。
在四种核酸适配体(CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s和CELTIC_19s)上进行PBMC活化试验，使用或不使用抗CD28单克隆抗体(Invitrogen)作为共刺激剂。包括三个条件，即在3h、19h和27h后，在抗CD28单克隆抗体存在的情况下加入新鲜的核酸适配体溶液，以保持试剂浓度恒定。实验前，将PBMCs接种于24孔板中，密度为2.5×105个细胞/孔，置于400μL含10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI培养基中，并在37℃、5％CO2下孵育4h。候选核酸适配体在95℃下变性5min，然后立即置于4℃的冰块上5min。取100μL上清液(细胞因子基础水平状态)后，在取样100μL上清液(细胞因子基础水平条件)后，将100μL含有1μM DNA适配体和0.5μg/mL在RPMI中稀释的CD28单克隆抗体的刺激溶液添加到孔中。在37℃、5％CO2条件下孵育细胞16、24或48h。或者，将PBMCs用100μL含2μg/mL CD3mAb和5μg/mL CD28mAb的混合液(Invitrogen)；含2μg/mL CD3mAb的溶液；或不含试剂的RPMI培养基(阴性对照)孵育。然后以320g离心5min，回收上清液。通过检测在不同时间间隔采集的培养上清液中分泌的白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)和干扰素γ(IFN-g)的水平来评估PBMC激活。使用Sandwich ELISAs(DUOSET ELISA R&DSystems)进行检测。将100μL未稀释的样本或细胞因子标准品加入到预先用捕获抗体包被的每个孔中过夜。使用生物素化的检测抗体检测IL-2、TNF-a或IFN-g细胞因子结合，检测抗体中含有链霉亲和素-HRP缀合物和TMB底物。加入终止溶液后，使用VARIOSCAN LUX plate reader在450nm读取ELISA板，并参照标准曲线检测细胞因子水平。图14A-14L示出了获得的结果。根据制造商的说明，使用人Th1/Th2流式细胞术微球阵列(CBA)(Becton Dickinson Biosciences)检测48小时后采集的培养上清液中分泌的白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-a)和干扰素γ(IFN-g)的水平。图16A-16C示出了获得的结果。
最后，通过分析CD4和CD8阳性T细胞表面的CD25和CD69活化标志物的表达，评估PBMCs的活化。在不同试验条件下培养48小时并收集培养上清液用于ELISA和CBA分析后，将PBMCs转移到96孔板中，并以2500rpm离心2min。弃去上清液，将沉淀的细胞用200μL DPBS-0.2％BSA洗涤两次。每次洗涤后，以2500rpm的转速离心2min。然后用在DPBS-0.2％BSA(1μl/试验)中稀释的抗CD4、抗CD8、抗CD25和抗CD69单克隆抗体(Miltenyi)孵育细胞。在4℃孵育10min后，以2500rpm转速离心细胞2min，并用DPBS-0.2％BSA(200μL/孔)洗涤两次。细胞用CellFix溶液(BD Biosciences)固定，荧光阳性细胞通过流式细胞仪(AttunNext；Invitrogen)在BL3(抗CD4-PerCP-Vio700)、YL1(CD69-PE)、YL2(CD8-PE-Vio-615)和YL4(CD25-PE-Vio770)通道上计数。图15A-15C示出了获得的结果。
经抗CD3单克隆抗体联合或不联合抗CD28单克隆抗体处理的细胞，除IL-5外，所有测得的细胞因子的分泌均增加，CD25和CD69活化标记物的表面表达上调。即使与共刺激抗CD28抗体结合，也没有一种受试核酸适配体能够激活表面标记物表达的细胞因子的分泌。通过反复添加新鲜溶液以补偿血清中核酸适配体的降解来保持其浓度恒定，不会形成更持久的活化曲线。
实施例8:通过抗CD3 RNA适配体的T细胞活化
使用实施例7中所述的程序，通过将细胞用浓度为1μM的核酸适配体和CD28共刺激一起孵育来检测抗CD3 RNA适配体对T细胞的活化。通过ELISA和人Th1/Th2微球免疫分析系统检测细胞应对激活而分泌的细胞因子。流式细胞仪检测T细胞表面CD25、CD69活化标记物的表达。图35A-F、37A-C和36A-C分别示出了获得的结果。
如在实施例7中已经观察到的，用与或不与抗-CD28单克隆抗体组合的抗-CD3单克隆抗体处理的细胞表现出除IL-5之外所有被检测的细胞因子分泌增加并且CD25和CD69活性标记的表面表达上调。即使与共刺激抗CD28抗体联合使用，所有受测的核酸适配体均未能激活表面标记物的细胞因子分泌的表达。通过反复添加新鲜溶液以补偿血清中核酸适配体的降解来保持其浓度恒定，不会形成更持久的活化曲线。
实施例9：抗CD3 DNA适配体的功能稳定性
在含有5％胎牛血清(FBS)的SELEX缓冲液或仅含胎牛血清(FBS)中检测了抗CD3DNA适配体(CELTIC_1s，CELTIC_4s，CELTIC_9s，CELTIC_11s，CELTIC_19s和CELTIC_22s)的稳定性。生物素化的核酸适配子在95℃下变性5min，然后立即在冰块上冷却至4℃持续5min。然后在添加有5％FBS的SELEX缓冲液或纯FBS中，将序列稀释至最终浓度2μM。样本在37℃下培养10min、30min、1h、2h、4h或24h；对照样品含有未在37℃孵育的新鲜制备的核酸适配体。然后向每种溶液中加入100nM链霉亲和素-PE，并将核酸适配体与如前所述的阳性CD3Jurkat细胞一起孵育。然后使用流式细胞仪在YL-1通道上，基于37℃下荧光阳性细胞数随孵育时间的变化，检测核酸适配体在含5％FBS的SELEX缓冲液或纯FBS中的半衰期。检测结果见图11A和11B。即使在含有5％血清的SELEX缓冲液中孵育24h，所有核酸适配体都是稳定的。在纯FBS中稀释DNA适配体显示，在37℃孵育2h后，序列逐渐降解。
实施例10：抗CD3 RNA适配体的功能稳定性
在含有5％FBS的杜尔贝科磷酸盐缓冲液(DPBS)中或仅FBS中检测了核酸适配体ARACD3-3700006和ARACD3-0010209的稳定性。使用实施例9中所述的程序，不同之处在于在85℃下进行变性。检测结果如图32-A所示。在含有5％血清的DPBS中孵育的两种核酸适配体都是稳定的，即使孵育为24小时也是如此。当在纯血清中孵育时，30分钟后丧失一半的结合活性。
实施例11：使用凝胶电泳的抗CD3 DNA适配体的血清稳定性
在含有5％胎牛血清(FBS)的选择(SELEX)缓冲液、含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基或纯胎牛血清(FBS)培养基中，研究了抗CD3 DNA适配体(CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s)的稳定性。核酸适配体在95℃变性5min，然后立即在冰块上冷却至4℃持续5min。然后在添加有5％FBS的SELEX缓冲液、添加有10％FBS的RPMI培养基或纯FBS血清中将序列稀释至最终浓度为2μM。样本在37℃下培养10min、30min、1h、2h、4h或24h；对照样品含有未在37℃孵育的新制备的核酸适配体。然后通过在琼脂糖凝胶上迁移，使用如下的电泳方法检测核酸适配体在它们各自的缓冲液中的半衰期：将采自不同孵育时间的核酸适配体样品与上样缓冲液(ThermoScientific，沃尔瑟姆，萨诸塞州，美国)混合，并将15L每种样品置于含有SYBRsafe(Invitrogen)作为DNA染色标记的新制备的3％琼脂糖凝胶上。DNA适配体在琼脂糖凝胶上的迁移在1XTBE缓冲液(Invitrogen)中进行，施加100V持续20min。使用Bio-Rad成像系统对凝胶进行了可视化处理，结果如图10A-10D所示。所有被测试的核酸适配体在SELEX-5％FBS缓冲液中至少稳定24h。在含有10％FBS的RPMI培养基中37℃孵育24h后，CELTIC_4s和CELTIC_11s降解。然而，在纯血清中稀释DNA适配体会使得孵育1小时后强度降低。这些结果与实施例9中流式细胞仪报告的稳定性完全一致。
实施例12：使用凝胶电泳的抗CD3 RNA适配体的血清稳定性
在含有5％FBS的DPBS缓冲液、含有10％FBS的RPMI培养基或纯FBS中研究了抗CD3RNA适配体(ARACD3-3700006和ARACD3-0010209)的稳定性。将适配体在85℃变性5min，然后立即在冰块上冷却至4℃持续5min。然后在添加有5％FBS的DPBS缓冲液、添加有10％FBS的RPMI培养基或纯FBS血清中将序列稀释至最终浓度2μM。样本在37℃培养10min、30min、1h、2h、4h或24h；对照样品含有未在37℃孵育的新制备的核酸适配体。然后通过在琼脂糖凝胶上迁移，使用如下变性电泳方法检测核酸适配体在它们各自缓冲液中的半衰期:将采自不同孵育时间的核酸适配体样品与含甲酰胺的上样缓冲液(ThermoScientific，沃尔瑟姆，萨诸塞州，美国)混合，在85℃变性5分钟后，将15μL各样品置于含有SYBRsafe(Invitrogen)作为RNA染色标记的新制备的3％琼脂糖凝胶上。RNA适配体在琼脂糖凝胶上的迁移在1XTBE缓冲液(Invitrogen)中进行，施加100V，持续20min。使用Bio-Rad成像系统对凝胶进行了可视化处理，结果如图32B-C所示。两种核酸适配体在DPBS-5％FBS和RPMI-10％FBS中均至少稳定4h。在纯血清中孵育30min后RNA适配体强度降低。这些结果与实施例10中流式细胞仪报告的稳定性完全一致。
实施例13：用抗CD3单克隆抗体竞争结合法进行抗CD3 DNA适配体的表位检测
为了收集更多关于CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s核酸适配体识别区域的信息，使用参照单克隆抗体对CD3阳性Jurkat细胞进行竞争结合试验，基本上如实施例3所述，但有以下变化。
Jurkat细胞与PE标记的单克隆抗体(okt3-PE-0.1nM；UCHT1-PE-1nM或HIT3a-PE-0.1nM-均购买自ThermoScientific，沃尔瑟姆，萨诸塞州，美国)，在37℃下，在存在过量的各种竞争物(未标记的OKT3-32nM；未标记的UCHT1-10nM；未标记的HIT3a-32nM-均购买自ThermoScientific，沃尔瑟姆，萨诸塞州，美国和核酸适配体-300nM)。然后通过流式细胞仪评估标记的抗CD3单克隆抗体与细胞的结合。
在相反的实验环境中，Jurkat细胞与CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19sDNA适配体(固定浓度300nM)一起孵育，含有或不含有饱和浓度的未标记的单克隆抗体(OKT3–32nM；UCHT1-10nM；未标记的HIT3a-32nM)。使用链霉亲和素-PE检测后，通过流式细胞仪评估生物素化核酸适配体与细胞的结合。
图17.1.A、17.2.A和17.3.A示出了含有或不含有饱和浓度的竞争物时，PE标记的抗CD3单克隆抗体的结合结果。对于每种受试抗体，使用过量的其未标记形式会抑制或完全消除其PE标记的形式的结合，从而验证了实验条件。当使用核酸适配体作为竞争物时，检测到最大信号，表明受试候选物未能干扰三种参照抗体的结合。
图17.1.B、17.2.B和17.3.B示出了含有或不含有饱和浓度的单克隆抗体时，抗CD3适配体的结合结果。当将核酸适配体与或不与竞争物同时孵育时，测出了相似的信号，表明抗体未能干扰受测序列的结合。
在抗CD3核酸适配体和受试的参照单克隆抗体之间没有观察到竞争，这表明核酸适配体对人CD3受体的靶向区域不同于OKT3、HIT3a和UCHT1表位。据报道，OKT3和UCHT1抗体在结合时会激活T淋巴细胞。CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s对替代CD3表位的识别与实施例7中观察到的人类PBMC缺乏激活特性一致。
实施例14：用抗CD3单克隆抗体的竞争结合法进行抗CD3 RNA适配体的表位检测
为了收集更多关于ARACD3-3700006和ARACD3-0010209核酸适配体识别区域的信息，使用参照单克隆抗体对CD3阳性Jurkat细胞进行竞争结合试验，基本上如实施例13所述，但使用DPBS-5％FCS代替SELEX缓冲液-5％FCS。
图38-A、38-C和38-E示出了含有或不含有饱和浓度的竞争物时PE标记的抗CD3单克隆抗体的结合结果
对于每种受试抗体，使用过量的其未标记形式会抑制或完全消除其PE标记形式的结合，从而验证了实验条件。当使用核酸适配体作为竞争物时，检测到最大信号，表明受试候选物未能干扰三种参照抗体的结合。
图38.B、38-D和38-F示出了在含有或不含有饱和浓度的单克隆抗体时，抗CD3核酸适配体的结合结果。当核酸适配体与或不与竞争物一起孵育时，检测到相似的信号，表明抗体未能干扰受试序列的结合。
在抗CD3适配体和受试的参照单克隆抗体之间没有观察到竞争，这表明核酸适配体对人CD3受体的靶向区域不同于OKT3、HIT3a和UCHT1表位。据报道，OKT3和UCHT1抗体在结合时会激活T淋巴细胞。CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s对替代CD3表位的识别与实施例8中观察到的人类PBMC缺乏激活特性一致。
实施例15：从核心序列衍生的稳定性改进的抗CD3 DNA适配体工程
基于在CD3阳性和CD3阴性细胞上进行的结合研究中获得的结果，并如实施例3所述，为了进一步研究核酸适配体在血清中的稳定性，我们选择了一系列从核心序列衍生的、具有改进的表观亲和力和靶向特异性的序列优化抗CD3适配体。这些分析是在含有5％胎牛血清(FBS)的选择(SELEX)缓冲液、含有10％FBS的RPMI培养基或纯FBS中孵育核酸适配体CELTIC_core、CELTIC_core_12和5’-末端修饰有HEG的CELTIC_core_24，CELTIC_core_29，CELTIC_core_40和CELTIC_core_42进行的。在各种孵育时间之后，如先前分别在实施例11和13中所述，通过流式细胞仪和琼脂糖凝胶电泳对未降解的核酸适配体进行定量。
如图22A-F和23A-C所示，在每种受试血清条件下，核酸适配体CELTIC_core、CELTIC_core_24和CELTIC_core_29似乎都非常不稳定，在SELEX-5％FBS中孵育4小时或在纯血清中孵育30分钟后，没有完整/功能性核酸适配体残留。如实施例11和13中已经观察到的，两种方法获得的结果完全一致。作为比较，亲本全长CELTIC_1s和CELTIC_19s序列在SELEX-5％胎牛血清中24小时稳定，在纯血清中至少1小时内稳定。另一方面，CELTIC_core_12，CELTIC_core_40和CELTIC_core_42在两种稳定性读出中表现更好。CELTIC_core_12是迄今为止最稳定的核酸适配体，在SELEX-5％FBS和含有10％FBS的RPMI培养基中培养24小时后完全未降解。在纯血清中，其降解仅在4h后才开始发生。CELTIC_core_40和CELTIC_core_42是比未经修饰的CELTIC_core序列更稳定的中间实例，但其在纯血清中孵育4小时后完全降解。值得注意的是，尽管CELTIC_core_12、CELTIC_core_29和CELTIC_core_42在11位仅相差一个核苷酸，但它们表现出完全不同的稳定性。此外，在CELTIC_core_29第16位引入第二个脱碱基位点，形成了CELTIC_core_42，这似乎是一个稳定序列的策略。
作为另一种提高HEG修饰的CELTIC_core_40和CELTIC_core_42稳定性的尝试，研究了添加3'-3'脱氧胸苷的益处。据报道，3’端的这类修饰可增强核苷酸序列对核酸酶降解的抗性。如图32.1A-D和32.2A-B所示，与CELTIC_core_40和CELTIC_core_42相比，3’-末端带有3’-3’-脱氧胸苷的核酸适配体稳定性显著提高。尽管没有超过CELTIC_core，但这些变体在SELEX-5％FBS中24小时稳定，在纯血清中至少2小时内稳定。值得一提的是，尽管存在两个脱碱基位点通常被认为是核酸酶敏感位点，但CELTIC_core_42比CELTIC_core_40更稳定。
实施例16：大多数稳定的和序列优化的抗CD3核心DNA序列衍生物保持交叉特异性
如实施例4中所述，使用BIAcore T200仪器(GEHealthcare)对源自核心序列的最有意义的抗CD3核酸适配体进行结合亲和力检测。为了分析核酸适配体与CD3蛋白之间的相互作用，根据制造商的说明(GE Healthcare)，将生物素化的核酸适配体以低于实施例4中的密度(100-500RU)固定在SeriesSSensorchipsSA(GEHealthcare)上。小鼠和食蟹猴的CD3ε/δ购买自AcroBiosystems。对于人蛋白，使用的最高浓度为100nM，对于小鼠和食蟹猴抗原为1M。其他浓度通过3倍稀释获得。
下面的表8提供了从表面等离子共振检测中获得的KD值的汇总。这些结果证实了核心序列与亲本序列CELTIC_CD3_1s和CELTIC_CD3_19s相比在细胞结合试验中观察到的亲和力下降。在细胞结合试验中鉴定的核心序列的变体(CELTIC_core_12、CELTIC_core_24、CELTIC_core_29、CELTIC_core_40和CELTIC_core_42)都被证实具有比未修饰的核酸适配体更好的与人CD3ε/δ的亲和力。如在实施例4中已经观察到的，与CD3ε/δ的亲和力通常略低，这是包括更多轮CD3ε/δ异构体的SELEX策略的结果。这些序列均未与人IgG1的Fc区结合。在CELTIC_core_24，CELTIC_core_40和CELTIC_core_42的3’末端添加3’-3’-脱氧胸苷并未显著改变KD值。
表8：用表面等离子共振检测的序列优化的抗CD3核心DNA序列衍生物的KD值。根据记录的传感图，使用动力学分析模式计算数据。
Figure BDA0003538474230000381
Figure BDA0003538474230000391
下面的表9提供了用人CD3ε/γ和小鼠以及食蟹猴CD3ε/γ进行表面等离子共振检测获得的KD值的汇总。在这个新的实验设置中，与亲本序列CELTIC_core_1s和CELTIC_core_19s相比，CELTIC_core再次显示出对人CD3ε/γ的亲和力较低，而序列变体CELTIC_core_12、CELTIC_core_24、CELTIC_core_29、CELTIC_core_40和CELTIC_core_42表现出更好的亲和力。在这些条件下，3'-3'脱氧胸苷修饰版本的最后四种核酸适配体表现同样良好。所有这些序列优化的核酸适配体均能够结合鼠和食蟹猴CD3ε/γ异构体，证实了实施例3和5中已经观察到的CD3核酸适配体的交叉特异性。与CELTIC_core、CELTIC_1s或CELTIC_19s相比，报告的与小鼠和食蟹猴CD3ε/γ异构体的相互作用的KD值和与人CD3蛋白相互作用的KD值在相同的范围内，表明所检测的相互作用是真实的。基于这些结果，经抗CD3序列优化的核酸适配体保持交叉特异性并与小鼠，食蟹猴结合，尽管这些核酸适配体是针对人的受体选择的。
表9：用表面等离子共振检测的序列优化的抗CD3核心DNA序列衍生物的KD值。根据记录的传感图，采用稳态分析模式计算数据。
Figure BDA0003538474230000392
实施例17:大多数稳定的和序列优化的抗CD3核心DNA序列衍生物仍然识别不同于 参照抗体的表位
为了收集更多关于CELTIC_core_12，CELTIC_core_40t和CELTIC_42t核酸适配体识别区域的信息，基本上如实施例13所述，在CD3阳性Jurkat细胞上使用参照单克隆抗体进行竞争结合试验。作为比较，全长CD3_CELTIC_1s包括在这些分析中。
PE标记的抗CD3OKT3、UCHT1和HIT3a单克隆抗体与或不与饱和浓度的竞争物结合的结果见图21-.A，21-C和21-E。对于每种受试抗体，使用过量的未标记形式会抑制或完全消除其PE标记形式的结合，从而验证了实验条件。当使用核酸适配体作为竞争物时，检测到最大信号，表明受试候选物未能干扰三种参照抗体的结合。
图21-B、21-D和21-E示出了抗CD3核酸适配体与或不与饱和浓度的单克隆抗体一起使用的结合结果。当存在竞争物和不存在竞争物时孵育核酸适配体，检测到了相似的信号，表明抗体未能干扰受测序列的结合。
在抗CD3核酸适配体和受测的参照单克隆抗体之间没有观察到竞争，这表明核酸适配体对人CD3受体的靶向区域不同于OKT3、HIT3a和UCHT1表位。总之，这些结果表明，序列优化的CELTIC_core_12，CELTIC_core_40t和CELTIC_42t核酸适配体在表位特异性方面与亲本序列没有差异，尽管核苷酸组成和5’-和3’-末端的化学修饰有所变化。与OKT3和UCHT1表位替代的CD3区域(已知这些表位在结合时激活T淋巴细胞)的结合表明，CELTIC_core_12，CELTIC_core_40t和CELTIC_42t核酸适配体不表现出激活特性。
实施例18：通过共价化学对序列优化的抗CD3核心DNA序列衍生物进行功能化，用 于随后的接枝，不会改变其生物特性
最后，我们着手评估3’和5’末端修饰对给定抗CD3核酸适配体生物学特性的影响。当考虑功能化核酸适配体与载体、聚合物或表面的共价偶联时，这个问题尤其重要。为此，我们选择了HEG修饰的CELTIC_core_42，如实施例1中所述通过固相合成法，在CELTIC_core_42的5’或3’端偶联TEG-生物素，或在CELTIC_core_42的5’端引入四嗪-PEG5基团。这些官能团分别允许核酸适配体通过亲和相互作用(据报道，迄今为止与相互作用最强，KD为1015M)偶联至生物素，或通过点击化学(逆电子需求的Diels-Alder)共价偶联至降冰片烯/烯烃/炔烃修饰的配基。
如实施例3中所述，研究了相同核酸适配体的这三种形式与在Jurkat细胞上表达的CD3受体的相互作用。CD3阴性的Ramos细胞作为阴性对照，用于监测引入的化学修饰介导的非特异性相互作用。图33中总结的结果显示，给定核酸适配体的两端都可以用生物素修饰，而对表观亲和力(KD<50nM)和特异性没有任何影响。在5’端引入四嗪功能后，亲和力略有提高(表观KD<25nM)，对CD3靶的特异性没有任何损失。
总之，这些结果表明，可以在不显著干扰其生物学特性的情况下进行抗CD3适体的功能化以用于随后的偶联。
表10：序列一览表
Figure BDA0003538474230000411
Figure BDA0003538474230000421
Figure BDA0003538474230000431
Figure BDA0003538474230000441
Figure BDA0003538474230000451
Figure BDA0003538474230000461
Figure BDA0003538474230000471
对于Cluster1至45，存在于5’-和3’-末端的侧翼区(分别为TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT和TTGACTAGTACATGACCACTTGA)，它们的序列如SEQ ID NO:114所述，但未示出。
如本文所用，“基本上由……组成”允许包括实质上不影响权利要求的基础和新颖特征的材料或步骤。这里对术语“包括”的任何叙述，特别是在对组合物的组分的描述中或在对装置的元件的描述中，可以用“基本上由……组成”或“由……组成”替换。
虽然已经结合某些优选实施例描述了本发明，但是普通技术人员在阅读了前述说明书之后，能够对本文所述的组合物和方法进行各种改变、等同替换和其他改变。

Claims (23)

1.一种包含序列GX1X2TX3GX4X5X6X7X8X9GGX10CTGG的核酸适配体，其中X1是G或A；X2和X6是A、T或G；X3是T，或G；X4和X9是G或C；X5是C或T；X7是T、G或C；X8和X10是C、T或A(SEQ ID NO:109)或其变体；并且其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
2.一种包含序列GGGX1TTGGCX2X3X4GGGX5CTGGC的核酸适配体，其中X1和X2是A、T或G；X3是T、C或G；X4和X5是A、T或C(SEQ ID NO:110)或其变体，其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
3.一种包含序列GX1TTX2GX3X4X5X6CX7GGX8CTGGX9G的核酸适配体，其中X1是A或G；X2是T或G；X3、X7和X9是G或C；X4是T或C；X5是A或T；X6是T、C或G；X8是A或C(SEQ ID NO:111)或其变体，并且其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
4.一种包含序列GGGTTTGGCAX1CGGGCCTGGC的核酸适配体，其中X1是G、C或T(SEQ ID NO:112)或其变体，并且其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
5.一种包含序列GCAGCGAUUCUX1GUUU的核酸适配体，其中X1是U或没有碱基(SEQ ID NO:113)或其变体，并且其中所述核酸适配体与CD3ε/γ或CD3ε/δ相结合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸适配体，其中所述核酸适配体以约0.2pM至约250nM的解离常数与人CD3ε/γ和/或CD3ε/δ相结合。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸适配体，其中所述核酸适配体与非人形式的CD3ε/γ和/或CD3ε/δ相结合，解离常数为约20nM至约800nM。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的核酸适配体，其包含选自SEQ ID NO:1至108的序列。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸适配体，其包含所述序列的变体，其中所述序列的一个或多个碱基被非天然存在的碱基取代，或其中一个或多个碱基被删除或相应的核苷酸被连接子取代。
10.根据权利要求9所述的核酸适配体，其中一个或多个非天然存在的碱基选自甲基肌苷、二氢尿苷、甲基鸟苷和硫尿苷。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸适配体，所述核酸适配体结合但不激活CD3+T细胞。
12.一种用于将试剂、染料、用于共价偶联的官能团或生物活性剂递送至T细胞的载体，其中所述载体包含权利要求1-11中任一项所述的核酸适配体。
13.根据权利要求11或12所述载体，所述载体包含纳米颗粒聚合物。
14.根据权利要求13所述的载体，其中所述纳米颗粒聚合物包括聚(β氨基酯)(PBAE)。
15.根据权利要求13或14所述的载体，其中所述核酸适配体与所述聚合物共价连接。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的载体，其中所述试剂是T细胞调节剂或显像剂。
17.根据权利要求16所述的载体，其中所述T细胞调节剂是携带转基因的病毒载体；其中所述病毒载体用所述聚合物包被；并且其中所述核酸适配体与所述聚合物共价连接。
18.根据权利要求17所述的载体，其中所述病毒载体是慢病毒载体。
19.根据权利要求17或18所述的载体，其中所述转基因编码嵌合抗原受体。
20.根据权利要求16所述的载体，其中所述T细胞调节剂选自达沙替尼、MEK1/2抑制剂、PI3K抑制剂、HDAC抑制剂、激酶抑制剂、代谢抑制剂、GSK3β抑制剂、MAO-B抑制剂和Cdk5抑制剂。
21.一种向受试者的T细胞递送药剂的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求16-20中任一项所述的载体。
22.一种药物组合物，其包含权利要求16-20中任一项所述的载体和一种或多种赋形剂。
23.一种从受试者分离T细胞的方法，所述方法包括使用权利要求1-12中任一项所述的载体从受试者中分离T细胞。
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