JP2014500024A - 腫瘍細胞溶解を媒介する二重特異性アプタマー - Google Patents
腫瘍細胞溶解を媒介する二重特異性アプタマー Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014500024A JP2014500024A JP2013542415A JP2013542415A JP2014500024A JP 2014500024 A JP2014500024 A JP 2014500024A JP 2013542415 A JP2013542415 A JP 2013542415A JP 2013542415 A JP2013542415 A JP 2013542415A JP 2014500024 A JP2014500024 A JP 2014500024A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- binding
- aptamers
- aptamer
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/16—Aptamers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
腫瘍特異抗原(TSA)及びエフェクター細胞特異抗原(ESA)と強い特異性で結合する癌治療のための二重特異性アプタマーが開示される。
Description
本発明は、腫瘍特異抗原(TSA)及びエフェクター細胞特異抗原(ESA)と強い特異性で結合する癌治療のための二重特異性アプタマーに関する。
アプタマーは、ほとんど全てのクラスの分子と結合できる一本鎖DNA又はRNAである。アプタマーの規定された剛体的三次元構造は、多様な標的の特異的で強い親和性を示す分子認識を可能にする。アプタマーは長さが15から85ヌクレオチドで変動し、5−25kDaの見かけの分子質量をもたらし得る。
アプタマーは、単離組換えタンパク質(“フィルターSELEX”)又は全細胞(“細胞SELEX”)を基にして選別を実施するSELEXと称されるプロセスによって見出される。
いくつかの特徴は、抗体及び他のタンパク質系形態を超える、以下の特異的で競合的なアプタマーの利点を提供する:
−おそらく免疫原性は存在しない。アプタマーは、動物及びヒトの治療的応用で用いられる用量より1000倍高い前臨床用量で投与された場合、弱い免疫原性を示すか又は全く免疫原性を示さない。多くのモノクローナル抗体の有効性は抗体そのものに対する免疫応答によって極めて制限されるが、アプタマーに対する抗体を誘発することは非常に困難であり、これはおそらく、T細胞はMHCを介してアプタマーを提示できず、さらに一般的には細胞外核酸を認識するように免疫応答を訓練できないためである。
−高い正確性及び再現性を有する化学合成によって容易で、おそらくは高い費用効率で製造される。種々の製造経費で変動が予想されない。アプタマーはストリンジェントな変性条件によって精製され、非常に高い純度が担保される。
−高い親和性及び選択性を達成できる。治療用アプタマーは化学的に強靭である。熱または変性剤によって変性したアプタマーは本質的に数分以内に容易に再生し、凍結乾燥粉末として1年までの長期間の間室温で保存可能であり、したがって非常に長い貯蔵寿命を示す。改変された場合には熱耐性及びヌクレアーゼ耐性である。
−良好な可溶性(>150mg/mL)及び比較的低分子量である(抗体の150kDaに対してアプタマーは10−50kDa)。
アプタマーは、単離組換えタンパク質(“フィルターSELEX”)又は全細胞(“細胞SELEX”)を基にして選別を実施するSELEXと称されるプロセスによって見出される。
いくつかの特徴は、抗体及び他のタンパク質系形態を超える、以下の特異的で競合的なアプタマーの利点を提供する:
−おそらく免疫原性は存在しない。アプタマーは、動物及びヒトの治療的応用で用いられる用量より1000倍高い前臨床用量で投与された場合、弱い免疫原性を示すか又は全く免疫原性を示さない。多くのモノクローナル抗体の有効性は抗体そのものに対する免疫応答によって極めて制限されるが、アプタマーに対する抗体を誘発することは非常に困難であり、これはおそらく、T細胞はMHCを介してアプタマーを提示できず、さらに一般的には細胞外核酸を認識するように免疫応答を訓練できないためである。
−高い正確性及び再現性を有する化学合成によって容易で、おそらくは高い費用効率で製造される。種々の製造経費で変動が予想されない。アプタマーはストリンジェントな変性条件によって精製され、非常に高い純度が担保される。
−高い親和性及び選択性を達成できる。治療用アプタマーは化学的に強靭である。熱または変性剤によって変性したアプタマーは本質的に数分以内に容易に再生し、凍結乾燥粉末として1年までの長期間の間室温で保存可能であり、したがって非常に長い貯蔵寿命を示す。改変された場合には熱耐性及びヌクレアーゼ耐性である。
−良好な可溶性(>150mg/mL)及び比較的低分子量である(抗体の150kDaに対してアプタマーは10−50kDa)。
SELEXTM法
アプタマーを作製する適切な方法は、一般的には図2に示す、“指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)”(“SELEXTM”)と呼ばれるプロセスによる。SELEXTMプロセスは、標的分子と高い特異性で結合する核酸分子のin vitro進化のための方法で、例えば以下に記載されている:米国特許出願07/536,428(1990年6月11日出願、現時点では放棄)、米国特許5,475,096号(発明の名称“Nucleic Acid Ligands”)及び米国特許5,270,163(WO 91/19813もまた参照されたい、発明の名称“Nucleic Acid Ligands”)、SELEXTMが同定した核酸リガンド(すなわち各アプタマー)は、ある標的化合物又は分子の特異的なリガンドである。SELEXTMプロセスは、実質的に任意の化学物質(モノマーであれポリマーであれ)のリガンドとして機能するために(すなわち特異的結合対を形成するために)、核酸は多様な二次元及び三次元構造を形成する十分な能力並びにそれらのモノマー内に利用可能な十分な化学的融通性有するという固有の識見に基づく。任意のサイズ又は組成の分子が標的として供され得る。
アプタマーを作製する適切な方法は、一般的には図2に示す、“指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)”(“SELEXTM”)と呼ばれるプロセスによる。SELEXTMプロセスは、標的分子と高い特異性で結合する核酸分子のin vitro進化のための方法で、例えば以下に記載されている:米国特許出願07/536,428(1990年6月11日出願、現時点では放棄)、米国特許5,475,096号(発明の名称“Nucleic Acid Ligands”)及び米国特許5,270,163(WO 91/19813もまた参照されたい、発明の名称“Nucleic Acid Ligands”)、SELEXTMが同定した核酸リガンド(すなわち各アプタマー)は、ある標的化合物又は分子の特異的なリガンドである。SELEXTMプロセスは、実質的に任意の化学物質(モノマーであれポリマーであれ)のリガンドとして機能するために(すなわち特異的結合対を形成するために)、核酸は多様な二次元及び三次元構造を形成する十分な能力並びにそれらのモノマー内に利用可能な十分な化学的融通性有するという固有の識見に基づく。任意のサイズ又は組成の分子が標的として供され得る。
SELEXTMは、出発点として任意抽出配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリー又はプールに依存する。前記オリゴヌクレオチドは改変又は未改変DNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドであり得る。いくつかの例では、プールは、100%ランダムな又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、任意抽出配列内に取り込まれた少なくとも1つの固定及び/又は保存配列を含むランダムな又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、その5’及び/又は3’末端に少なくとも1つの固定及び/又は保存配列を含むランダムな又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含み、前記はオリゴヌクレオチドプールの全分子によって共有される配列を含むことができる。固定配列は、例えばPCRプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、RNAポリメラーゼ(例えばT3、T4、T7及びSP6)のためのプロモーター配列、制限部位、又はホモポリマー配列(例えばポリA又はポリT鎖)、触媒性コア、アフィニティーカラムとの選択的結合のための部位、及び対象のオリゴヌクレオチドのクローニング及び/又は塩基配列決定を促進する他の配列の如き配列である。保存配列は、先に述べた固定配列以外の、同じ標的と結合する多数のアプタマーによって共有される配列である。
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは任意抽出された配列部分に加えて効率的な増幅に必要な固定配列を含む。典型的には、出発プールのオリゴヌクレオチドは、固定された5’及び3’末端配列を含み、前記は30−50のランダムヌクレオチドの内部領域とフランキングする。任意抽出ヌクレオチドは、化学合成及びランダム切断細胞性核酸のサイズ選別を含む多数の方法にしたがって作製できる。試験核酸の配列多様性はまた、選別/増幅反応前又は反応時に変異導入によって導入するか又は増加させることができる。
プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは任意抽出された配列部分に加えて効率的な増幅に必要な固定配列を含む。典型的には、出発プールのオリゴヌクレオチドは、固定された5’及び3’末端配列を含み、前記は30−50のランダムヌクレオチドの内部領域とフランキングする。任意抽出ヌクレオチドは、化学合成及びランダム切断細胞性核酸のサイズ選別を含む多数の方法にしたがって作製できる。試験核酸の配列多様性はまた、選別/増幅反応前又は反応時に変異導入によって導入するか又は増加させることができる。
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は任意の長さを有することができ、リボヌクレオチド及び/又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。さらに前記ランダム配列部分は、改変若しくは非天然ヌクレオチド又はヌクレオチドアナローグを含むことができる。例えば以下を参照されたい:米国特許5,958,691号;米国特許5,660,985号;米国特許5,958,691号;米国特許5,698,687号;米国特許5,817,635号;米国特許5,672,695号;PCT特許公開WO 92/07065号。ランダムオリゴヌクレオチドは、当業界で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いてホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成できる。例えば以下を参照されたい:Froehler et al., Nucl. Acid Res. 14:5399-5467, 1986及びFroehler et al., Tet. Lett. 27:5575-5578, 1986。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、液相法、例えばトリエステル合成法を用いて合成できる。例えば以下を参照されたい:Sood et al., Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) and Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449, 1978。自動DNA合成装置で実施される典型的な合成では1014−1016の個々の分子が得られ、前記はほとんどのSELEXTM実験で十分な数である。配列設計時のランダム配列の領域が十分に大きければ、各合成分子が固有配列であるだろうという蓋然性は高くなる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、DNA合成装置による自動化学合成によって作製できる。任意抽出配列を合成するために、4ヌクレオチド全ての混合物を合成プロセス中の各ヌクレオチド添加工程で添加し、ヌクレオチドをランダムに取り込ませる。上述のように、ある実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、他の実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドは、一続きの非ランダム配列又は部分的ランダム配列を含むことができる。部分的ランダム配列は、各添加工程で異なる分子比で4ヌクレオチドを添加することによって作出できる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、DNA合成装置による自動化学合成によって作製できる。任意抽出配列を合成するために、4ヌクレオチド全ての混合物を合成プロセス中の各ヌクレオチド添加工程で添加し、ヌクレオチドをランダムに取り込ませる。上述のように、ある実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含むが、他の実施態様では、ランダムオリゴヌクレオチドは、一続きの非ランダム配列又は部分的ランダム配列を含むことができる。部分的ランダム配列は、各添加工程で異なる分子比で4ヌクレオチドを添加することによって作出できる。
オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーはRNAでもDNAでもよい。出発ライブラリーとしてRNAライブラリーが用いられる場合には、前記は、典型的にはT7 RNAポリメラーゼ又は改変T7 RNAポリメラーゼを用いてin vitroでDNAライブラリーを転写することによって作製され、精製される。続いてRNA又はDNAライブラリーを結合に好ましい条件下で標的と混合し、同じ一般的選別構成を用いて結合、分離及び増幅を工程毎に反復し、実質的に任意の所望される結合親和性及び選択性基準を達成する。より具体的には、核酸の出発プールを含む混合物で出発するとき、SELEXTM法は以下の工程を含む:(a)結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程;(b)特異的に標的分子と結合した核酸分子から未結合核酸分子を分離する工程;(c)核酸-標的複合体を解離させる工程;(d)核酸-標的複合体から分離させた核酸を増幅して、核酸のリガンド-濃縮混合物を得る工程;及び(e)結合、解離、分離及び増幅工程を所望の回数だけ反復して、標的分子に対して高度に特異的で高い親和性を有する核酸リガンドを得る工程。RNAアプタマーを選別する場合には、SELEXTM方法はさらに、(i)工程(d)の増幅の前に、核酸標的複合体から解離させた核酸を逆転写する工程;及び(ii)このプロセスを再度開始する前に工程(d)の増幅核酸を転写する工程を含む。
極めて多数の可能な配列及び構造を含む核酸混合物には与えられた標的に対して広範囲の結合親和性が存在する。例えば20ヌクレオチドの任意抽出セグメントは420の候補物の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を有するものは標的と結合する蓋然性が高い。分離、、解離及び増幅後に、より高い結合親和性をもつ候補物のために第二の核酸混合物が作製、濃縮される。得られる核酸混合物がただ1つの配列又は数配列を主として含むまで、選別ラウンドを重ねて最良のリガンドが徐々に選ばれていく。続いてこれら配列をクローニングし、塩基配列を決定して、純粋なリガンド又はアプタマーとして個々に試験する。
選別及び増幅サイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。もっとも一般的な事例では、結合強度の顕著な改善がサイクルの繰り返しにより達成されるまで選別/増幅が継続される。本方法は典型的には約1014の異なる核酸種を判断するために用いられるが、約1018の異なる核酸種を判断するために用いることができる。一般的には、核酸アプタマー分子は、5から20サイクル工程で選別される。ある実施態様では、不均質性は最初の選別ステージでのみ導入され、反復プロセスでは導入されない。
SELEXTMのある実施態様では、選択標的と極めて強く結合する核酸リガンドの単離に非常に効率的であるので、ただ1回しか選別及び増幅サイクルが要求されない。そのような効率的選別は、例えば、カラムに結合させた標的と結合する核酸の能力が、カラムが最高の親和性をもつ核酸リガンドを十分に分離及び単離させることができる態様で発揮されるクロマトグラフィー型プロセスでもたらされ得る。
選別及び増幅サイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。もっとも一般的な事例では、結合強度の顕著な改善がサイクルの繰り返しにより達成されるまで選別/増幅が継続される。本方法は典型的には約1014の異なる核酸種を判断するために用いられるが、約1018の異なる核酸種を判断するために用いることができる。一般的には、核酸アプタマー分子は、5から20サイクル工程で選別される。ある実施態様では、不均質性は最初の選別ステージでのみ導入され、反復プロセスでは導入されない。
SELEXTMのある実施態様では、選択標的と極めて強く結合する核酸リガンドの単離に非常に効率的であるので、ただ1回しか選別及び増幅サイクルが要求されない。そのような効率的選別は、例えば、カラムに結合させた標的と結合する核酸の能力が、カラムが最高の親和性をもつ核酸リガンドを十分に分離及び単離させることができる態様で発揮されるクロマトグラフィー型プロセスでもたらされ得る。
多くの事例で、ただ1つの核酸リガンドが同定されるまでSELEXTMの反復工程を実施することは必ずしも望ましいことではない。標的特異的核酸リガンドの溶液は、多数の保存配列を有する核酸構造又はモチーフファミリー、及び標的に対して核酸リガンドの親和性に顕著に影響を与えることなく置換又は付加することができる多数の配列を含むことができる。完了前にSELEXTMプロセスを終了することによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することができる。
多様な核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られている。非ワトソン-クリック型相互作用に含まれることがもっとも一般的に示された構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称性又は非対称性出っ張り、シュードノット及び前記の無数の組合せが挙げられる。そのようなモチーフのほとんど全ての公知の事例が、30ヌクレオチドを超えない核酸配列で形成されることを提唱している。この理由から、任意抽出した連続セグメントによるSELEXTM法は、約20から約50ヌクレオチド、いくつかの実施態様では約30から約40ヌクレオチドの任意抽出セグメントを含む核酸配列を用いて開始することがしばしば所望される。ある実施態様では、5’-固定:ランダム:3’-固定配列は約30から約50ヌクレオチドのランダム配列を含む。
多様な核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られている。非ワトソン-クリック型相互作用に含まれることがもっとも一般的に示された構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称性又は非対称性出っ張り、シュードノット及び前記の無数の組合せが挙げられる。そのようなモチーフのほとんど全ての公知の事例が、30ヌクレオチドを超えない核酸配列で形成されることを提唱している。この理由から、任意抽出した連続セグメントによるSELEXTM法は、約20から約50ヌクレオチド、いくつかの実施態様では約30から約40ヌクレオチドの任意抽出セグメントを含む核酸配列を用いて開始することがしばしば所望される。ある実施態様では、5’-固定:ランダム:3’-固定配列は約30から約50ヌクレオチドのランダム配列を含む。
コアのSELEXTM法は、多数の固有の目的を達成するために改変された。例えば、米国特許5,707,796号は、特異的な構造的特徴を有する核酸分子(例えば湾曲DNA)を選別するためにゲル電気泳動と一緒にしたSELEXTMの使用を記載している。米国特許5,763,177号は、標的分子と結合及び/又は光架橋できるか、及び/又は標的分子を光不活化できる光反応基を含む核酸リガンドを選別するためのSELEXTM系の方法を記載している。米国特許5,567,588号及び米国特許5,861,254号は、標的分子に対して高い親和性及び低い親和性を有するオリゴヌクレオチドの非常に効率的な分離を達成するSELEXTM系の方法を記載している。米国特許5,496,938号は、SELEXTMプロセスを実施した後で改善された核酸リガンドを得る方法を記載している。米国特許5,705,337号はリガンドとその標的を共有結合させる方法を記載している。
SELEXTMはまた、標的分子の2つ以上の部位と結合する核酸を得るために、さらに標的の固有の部位と結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために用いることができる。SELEXTMは、想定できる任意の標的と結合する核酸リガンドを単離及び同定する手段を提供し、前記標的には、大小の生物分子(例えば核酸結合タンパク質及びそれらの生物学的機能の部分として核酸と結合することが不明のタンパク質)に加えて補助因子及び他の小分子が含まれる。例えば、米国特許5,580,737号は、カフェイン及び近縁アナローグのテオフィリンと高い親和性で結合することができるSELEXTMによって同定される核酸配列を開示している。
SELEXTMはまた、標的分子の2つ以上の部位と結合する核酸を得るために、さらに標的の固有の部位と結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために用いることができる。SELEXTMは、想定できる任意の標的と結合する核酸リガンドを単離及び同定する手段を提供し、前記標的には、大小の生物分子(例えば核酸結合タンパク質及びそれらの生物学的機能の部分として核酸と結合することが不明のタンパク質)に加えて補助因子及び他の小分子が含まれる。例えば、米国特許5,580,737号は、カフェイン及び近縁アナローグのテオフィリンと高い親和性で結合することができるSELEXTMによって同定される核酸配列を開示している。
逆SELEXTMは、1つ以上の非標的分子と交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。逆SELEXTMは以下の工程を含む:(a)核酸の候補混合物を調製する工程;(b)前記候補混合物を標的と接触させる工程(候補混合物と比較して標的に対して親和性の増進を示す核酸を候補混合物の残りのものから分離することができる);(c)親和性増進核酸を候補混合物の残りのものから分離する工程;(d)親和性増進核酸を標的から解離させる工程;(e)親和性増進核酸を1つ以上の非標的分子と接触させて非標的分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドを除去する工程;及び(f)標的分子にのみ特異的親和性を有する核酸を増幅させて、標的分子との結合について相対的に高い親和性及び特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸混合物を得る工程。SELEXTMについて上記で述べたように、選別及び増幅サイクルは所望の目標が達成されるまで必要に応じて繰り返される。
治療薬及びワクチンとして核酸を使用する際に遭遇する潜在的な1つの問題は、ホスホジエステル型オリゴヌクレオチドは、細胞内及び細胞外酵素(例えばエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ)によって所望の効果が出現する前に体液中で迅速に分解され得るということである。したがって、SELEXTM法は、リガンドに改善された特徴(例えばin vivo安定性の改善又はデリバリーにおける特徴の改善)を付与する改変ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を包含する。そのような改変の例には、リボース及び/又はリン酸基及び/又は塩基位置での化学的改変が含まれる。改変ヌクレオチドを含むSELEXTM同定核酸リガンドは例えば以下に記載されている:米国特許5,660,985号(リボースの2’位、ピリミジンの5位及びプリンの8位で化学的に改変されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する)、米国特許5,756,703号(多様な2’改変ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載する)、及び米国特許5,580,737号(2’-アミノ(2’-NH2)、2’-フルオロ(2’-F)、及び/又は2’-OMe置換で改変された1つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載する)。
本発明で意図される核酸リガンドの改変は、新たな電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電気反応、及び流動性を取り込む他の化学基を核酸リガンドの塩基に又は核酸リガンド全体に提供するものが含まれるが、ただしこれらに限定されない。ヌクレアーゼ耐性のオリゴヌクレオチド集団を作製するための改変はまた、1つ以上の代替ヌクレオチド間結合、変型糖、変型塩基又は前記の組合せを含むことができる。そのような改変には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない:2’-位糖改変、5-位ピリミジン改変、8-位プリン改変、環外アミンでの改変、4-チオウリジンの置換、5-ブロモ若しくは5-ヨード-ウラシルの置換;骨格の改変、ホスホロチオエート又はアルキルホスフェートの改変、メチル化及び通常でない塩基対の組合せ、例えばイソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン。改変はまた3’及び5’改変、例えばキャッピングを含むことができる。アプタマーの選別及び同定に有用なさらに別の方法は例えば米国特許7,803,931号に詳述されている(前記文献は参照により本明細書に含まれる)。
本発明のアプタマーは、DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA又はrRnY 組成から成り得る。Rはプリン、Yはピリミジン、HはA、C、Uであり、DはA、G、Uでありdは2’デオキシで、rは2’ヒドロキシで、mは2’メトキシでfは2’フルオロでnは2’アミンである。
完全ではあるがしばしば低下した自身の免疫系をエフェクター細胞集団の腫瘍への補充の強化によって埋め合わせる治療アプローチが、いくつかの腫瘍関連抗原(TRA)に加えてエフェクター特異抗原(ESA)のために応用される。とりわけ強力なあるESAは、ナチュラルキラー(NK)細胞及びマクロファージのCD16(FcγRIII)である。ほとんどの二重特異性アプローチは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のCD3ε又はナチュラルキラー細胞のCD16αを報告した。二重特異性結合物質を介して腫瘍標的へNK細胞を補充するという考えの立証は、CD19及びCD16に対する二重特異性単鎖Fv抗体により達成された。
抗体のFc領域内の特異的な結合部位とFcγレセプター(FcγR)との相互作用から発する抗体依存細胞性細胞傷害(ADCC)は、多様な腫瘍の治療方法で中心的役割を果たす。158位の特定の多形性はIgG1に対するFcγRIIIa親和性を強化し、ADCCの改善及び結果としてリンパ腫患者の臨床成果の改善と密接に関係する。
完全ではあるがしばしば低下した自身の免疫系をエフェクター細胞集団の腫瘍への補充の強化によって埋め合わせる治療アプローチが、いくつかの腫瘍関連抗原(TRA)に加えてエフェクター特異抗原(ESA)のために応用される。とりわけ強力なあるESAは、ナチュラルキラー(NK)細胞及びマクロファージのCD16(FcγRIII)である。ほとんどの二重特異性アプローチは、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のCD3ε又はナチュラルキラー細胞のCD16αを報告した。二重特異性結合物質を介して腫瘍標的へNK細胞を補充するという考えの立証は、CD19及びCD16に対する二重特異性単鎖Fv抗体により達成された。
抗体のFc領域内の特異的な結合部位とFcγレセプター(FcγR)との相互作用から発する抗体依存細胞性細胞傷害(ADCC)は、多様な腫瘍の治療方法で中心的役割を果たす。158位の特定の多形性はIgG1に対するFcγRIIIa親和性を強化し、ADCCの改善及び結果としてリンパ腫患者の臨床成果の改善と密接に関係する。
CD16は、NK細胞で発現される唯一のFcγレセプターである。2つのアイソフォームCD16α及びCD16βが存在する。CD16αは、免疫複合物を形成した多価IgG1及びIgG3に対し中間の親和性を有するレセプターであるが、IgG2及びIgG4のレセプターではない。CD16αは、食作用、酵素及び炎症媒介物質の分泌、抗体依存細胞傷害性、並びに免疫複合物の除去に必要とされる。ヒトでは、前記は、NK細胞、δγ-T細胞、単球及びマクロファージによって発現される50−70kDaのI型トランスメンブレン活性化レセプターである。CD16αには2つのアロタイプ(158位が異なる)が存在する。V158アロタイプは抗体のFc領域により強い親和性を示す。
FcγRIIIβ(CD16β)は、CD16αと高い関連性を有し、細胞外ドメイン(ECD)内に97%のアミノ酸配列同一性を共有するが、ヒト好中球及び好酸球で発現されるグリコシル-ホスファチジル-イノシトール-(GPI)結合レセプターである。
CD16α及びβの両者のECDはタンパク分解により切断でき、可溶形として結合活性を保持する。主たる可溶性アイソフォームは好中球由来sCD16βである。sCD16αの一定量は健常人に存在し得る。
肝細胞増殖因子レセプター(HGFR)又はc-Metは、胚の発育及び創傷治癒に必須である膜レセプターチロシンキナーゼである。前記は通常は上皮起源の細胞によって発現される。前記は今日TRAとして認識されている。主要な単鎖の前駆体タンパク質は翻訳後に切断されてアルファ及びベータサブユニットを生じ、それらはジスルフィド結合で連結されて成熟レセプターが形成される。そのリガンドである肝細胞増殖因子(HGF)による刺激で、c-Metは、侵襲性増殖として知られるプログラムを集合的に生じるいくつかの生物学的応答を誘発する。
FcγRIIIβ(CD16β)は、CD16αと高い関連性を有し、細胞外ドメイン(ECD)内に97%のアミノ酸配列同一性を共有するが、ヒト好中球及び好酸球で発現されるグリコシル-ホスファチジル-イノシトール-(GPI)結合レセプターである。
CD16α及びβの両者のECDはタンパク分解により切断でき、可溶形として結合活性を保持する。主たる可溶性アイソフォームは好中球由来sCD16βである。sCD16αの一定量は健常人に存在し得る。
肝細胞増殖因子レセプター(HGFR)又はc-Metは、胚の発育及び創傷治癒に必須である膜レセプターチロシンキナーゼである。前記は通常は上皮起源の細胞によって発現される。前記は今日TRAとして認識されている。主要な単鎖の前駆体タンパク質は翻訳後に切断されてアルファ及びベータサブユニットを生じ、それらはジスルフィド結合で連結されて成熟レセプターが形成される。そのリガンドである肝細胞増殖因子(HGF)による刺激で、c-Metは、侵襲性増殖として知られるプログラムを集合的に生じるいくつかの生物学的応答を誘発する。
癌の異常なc-Met活性化又は過剰発現は予後不良と相関性を有し、この場合、異常に活性なc-Met MET [c-met?]は、腫瘍の増殖、新しい血管の形成(脈管形成)、及び他の器官への癌拡散(転移)を始動させる。c-Metは、多くのタイプのヒト悪性疾患(腎臓、肝臓、胃、乳房及び脳の癌を含む)で脱調節される。
癌でc-Metに関してさらに確認されている事項には以下が含まれる:
−周囲組織と比較して多くの腫瘍タイプでレセプター及びリガンドの両方の過剰発現、
−多数の指標で観察される遺伝子増幅、
−細胞株へのc−Metの導入は腫瘍原性及び転移特性を付与する、
−レセプター/リガンド機能の阻害は癌表現型(死亡率、侵襲、増殖及びin vivo腫瘍増殖)を元に戻す、
種々のタイプの多くの癌に利用できる信頼に足る治療方法は存在しない。そのような癌の一例はc-Met過剰発現癌である。
したがって、本発明の好ましい目的はそのような癌、好ましくはc-Metを過剰発現する癌を治療する新規な治療方法を提供することである。
癌でc-Metに関してさらに確認されている事項には以下が含まれる:
−周囲組織と比較して多くの腫瘍タイプでレセプター及びリガンドの両方の過剰発現、
−多数の指標で観察される遺伝子増幅、
−細胞株へのc−Metの導入は腫瘍原性及び転移特性を付与する、
−レセプター/リガンド機能の阻害は癌表現型(死亡率、侵襲、増殖及びin vivo腫瘍増殖)を元に戻す、
種々のタイプの多くの癌に利用できる信頼に足る治療方法は存在しない。そのような癌の一例はc-Met過剰発現癌である。
したがって、本発明の好ましい目的はそのような癌、好ましくはc-Metを過剰発現する癌を治療する新規な治療方法を提供することである。
驚くべきことに本発明によって、TRA及びESAに対抗する二重特異性アプタマー分子は癌療法のための強力な手段を提供することが見出された。
そのような分子の例はCD16α及びc-Metに対抗する二重特異性アプタマーである。別の例はCD16α及びEGFRに対抗するアプタマーであろう。
本発明で有用な腫瘍抗原のタイプは腫瘍特異抗原(TSA)又は腫瘍付随抗原(TAA)であり得る。TSAは腫瘍細胞に固有であり、身体の他の細胞には生じない。腫瘍付随抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、それどころか、抗原に対して免疫学的耐性状態を誘導できない条件下で正常細胞にも発現する。前記抗原の腫瘍での発現は、免疫系の前記抗原への応答を可能にする条件下で生じ得る。TAAは、免疫系が未成熟で応答能力が無い胎児の発育時に正常細胞で発現される抗原であり得るか、又はそれらは、正常細胞で通常極めて低レベルで存在するが、腫瘍細胞では非常に高レベルで発現される抗原であり得る。TSA及びTAAを一緒にしてTRA又は腫瘍関連抗原と称することができる。
TRAの例は以下である:MUC-1、PSMA、EGFR、ヌクレオリン、シアリルルイスX、PDGFR、VEGF及びVEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、メラノーマプロテオグリカン、p糖タンパク質、エンドグリン、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、ルイスY。
ESAの例は以下である:CD32a/b(FcγRIIa/b)、CD64(FcγRI)、NK細胞のCD16α、細胞傷害性Tリンパ球のCD3ε及びCD28、好中球、単球及びマクロファージのCD89(FcαRI)、樹状細胞のDEC-250及び補体活性化のためのC1q。
好ましいTRAはc-Metである。さらに別の好ましいTRAはEGFRである。
好ましいESAはCD16αである。
そのような分子の例はCD16α及びc-Metに対抗する二重特異性アプタマーである。別の例はCD16α及びEGFRに対抗するアプタマーであろう。
本発明で有用な腫瘍抗原のタイプは腫瘍特異抗原(TSA)又は腫瘍付随抗原(TAA)であり得る。TSAは腫瘍細胞に固有であり、身体の他の細胞には生じない。腫瘍付随抗原は腫瘍細胞に固有ではなく、それどころか、抗原に対して免疫学的耐性状態を誘導できない条件下で正常細胞にも発現する。前記抗原の腫瘍での発現は、免疫系の前記抗原への応答を可能にする条件下で生じ得る。TAAは、免疫系が未成熟で応答能力が無い胎児の発育時に正常細胞で発現される抗原であり得るか、又はそれらは、正常細胞で通常極めて低レベルで存在するが、腫瘍細胞では非常に高レベルで発現される抗原であり得る。TSA及びTAAを一緒にしてTRA又は腫瘍関連抗原と称することができる。
TRAの例は以下である:MUC-1、PSMA、EGFR、ヌクレオリン、シアリルルイスX、PDGFR、VEGF及びVEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、メラノーマプロテオグリカン、p糖タンパク質、エンドグリン、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、ルイスY。
ESAの例は以下である:CD32a/b(FcγRIIa/b)、CD64(FcγRI)、NK細胞のCD16α、細胞傷害性Tリンパ球のCD3ε及びCD28、好中球、単球及びマクロファージのCD89(FcαRI)、樹状細胞のDEC-250及び補体活性化のためのC1q。
好ましいTRAはc-Metである。さらに別の好ましいTRAはEGFRである。
好ましいESAはCD16αである。
本発明の非常に好ましい特徴はしたがって、配列番号:64−87に示すアプタマーから成る群から選択されるアプタマーを提供することであり、配列番号:82及び/又は87が特に好ましい。
これまでのところ、CD16α又はc-Metに対するDNAアプタマーは当業界では提供されていない。
本発明のさらに別の目的は、TRAに対抗する一特異性アプタマーを提供することである。TRAに対抗するそのような一特異性アプタマーの好ましい1つの使用は、本発明の二重特異性アプタマーの構築ブロックとしての使用である。
TRAに対するそのような一特異性アプタマーは、例えばMUC-1、PSMA、EGFR、ヌクレオリン、シアリルルイスX、PDGFR、VEGF及びVEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、メラノーマプロテオグリカン、p糖タンパク質、エンドグリン、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、ルイスYに対抗する(すなわちピコモル、より好ましくはナノモルの範囲のKdで高い特異性により前記と結合する)。
特に好ましい特徴は、c-Met又はEGFRに対して、好ましくはc-Metに対して一特異性のアプタマーを含む。
これまでのところ、CD16α又はc-Metに対するDNAアプタマーは当業界では提供されていない。
本発明のさらに別の目的は、TRAに対抗する一特異性アプタマーを提供することである。TRAに対抗するそのような一特異性アプタマーの好ましい1つの使用は、本発明の二重特異性アプタマーの構築ブロックとしての使用である。
TRAに対するそのような一特異性アプタマーは、例えばMUC-1、PSMA、EGFR、ヌクレオリン、シアリルルイスX、PDGFR、VEGF及びVEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、メラノーマプロテオグリカン、p糖タンパク質、エンドグリン、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、ルイスYに対抗する(すなわちピコモル、より好ましくはナノモルの範囲のKdで高い特異性により前記と結合する)。
特に好ましい特徴は、c-Met又はEGFRに対して、好ましくはc-Metに対して一特異性のアプタマーを含む。
したがって、非常に好ましい特徴では本発明は、配列番号:50−63に開示するアプタマーから成るアプタマーの群から選択される1つ以上のアプタマーに関し、配列番号:53及び/又は54が特に好ましい。
本発明の同じく重要な特徴はESAに対抗する一特異性アプタマーを提供することである。ESAに対抗するそのような一特異性アプタマーの好ましい1つの使用は、本発明の二重特異性アプタマーの構築ブロックとしての使用である。
TRAに対するそのような一特異性アプタマーは、例えばCD32a/b(FcγRIIa/b)、CD64(FcγRI)、NK細胞のCD16α、細胞傷害性Tリンパ球のCD3ε及びCD28、好中球、単球及びマクロファージのCD89(FcαRI)、樹状細胞のDEC-250及び補体活性化のためのC1qに対抗する(すなわちピコモル、より好ましくはナノモルの範囲のKdで高い特異性により前記と結合する)。
特に好ましい特徴はCD16αに対する一特異性アプタマーを含む。
したがって、非常に好ましい特徴では本発明は、配列番号:1−49に開示するアプタマーから成るアプタマーの群から選択される1つ以上のアプタマーに関し、配列番号:4、6及び24が特に好ましい。
本発明の同じく重要な特徴はESAに対抗する一特異性アプタマーを提供することである。ESAに対抗するそのような一特異性アプタマーの好ましい1つの使用は、本発明の二重特異性アプタマーの構築ブロックとしての使用である。
TRAに対するそのような一特異性アプタマーは、例えばCD32a/b(FcγRIIa/b)、CD64(FcγRI)、NK細胞のCD16α、細胞傷害性Tリンパ球のCD3ε及びCD28、好中球、単球及びマクロファージのCD89(FcαRI)、樹状細胞のDEC-250及び補体活性化のためのC1qに対抗する(すなわちピコモル、より好ましくはナノモルの範囲のKdで高い特異性により前記と結合する)。
特に好ましい特徴はCD16αに対する一特異性アプタマーを含む。
したがって、非常に好ましい特徴では本発明は、配列番号:1−49に開示するアプタマーから成るアプタマーの群から選択される1つ以上のアプタマーに関し、配列番号:4、6及び24が特に好ましい。
本発明を例示するために以下の実施例が含まれる。しかしながら、これら実施例は本発明を制限するのではなく、本発明の実施方法を提案しようとするだけであることを理解されたい。さらにまた本実施例は本発明を制限するものと解されるべきではなく、これら実施例の技術的教示は、癌治療用二重特異性アプタマーに関して本発明を実施するために適用し得る本出願の明細書中の任意の技術的教示と組み合わせることができる。
フィルターSELEX
フィルターSELEXは、溶液中で標的タンパク質とアプタマーをインキュベートした後、標的タンパク質をニトロセルロース膜に固定して、標的結合アプタマーの分離及び洗浄を可能にすることを基本とした。選別は全体積100μLのダルベッコー(Dulbecco)PBS(DPBS)中で実施し、選別過程の間ずっと非特異的競合tRNAの濃度及び洗浄体積を増加させるとともに、標的タンパク質の量を減少させてストリンジェンシーを強化する。1ラウンド目については、出発プールの1x1014分子を用い(最終濃度1.66μM)、その後のラウンドではその前のラウンドから得られた出力プールを1μMに調節した。フィルターはKOHで前処理し、フィルターへのDNAプールの非特異的結合を減少させた。
陰性前選別でのフィルター結合アプタマーの除去のために(1ラウンド目では省略する)、50μLのプール/DPBSを前処理フィルターに添加し、2000rpmで1分間遠心分離した。前記のフロースルーをその後の陽性/陰性選別工程で使用するために収集した。
逆選別は、標的とされるべきではない成分からアプタマーを除去することが所望される場合に(例えば用いた組換え標的タンパク質のHis-タグ又はFc-融合部分;1ラウンド目では省略した)、陰性選別のフロースルーにタンパク質及びDPBSを90μLの全体積中に1μMの最終タンパク質濃度で添加することによって適用した。37℃で1時間インキュベートした後、このプール/DPBS溶液を前処理フィルターに添加し、2000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを陽性選別工程で使用するために収集した。
陽性選別は、以前の逆選別の場合の標的タンパク質及び競合物質量を90μLのプール/DPBSフロースルーに、100μLの全体積に1μMのタンパク質となるように添加することによって実施した。陽性選別混合物は37℃で1時間インキュベートし、続いて前処理セントレックス(Centrex)カラムに添加し、2000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。それによってフィルターは所望のタンパク質:プール複合体を捕捉した。これらを前加温した1000μLのDPBS(1ラウンド目では500μL)で2回洗浄し、以前のように遠心分離しフロースルーを廃棄し、200μLの90℃に前加熱した溶出液で2回の1分間インキュベーションによって溶出させ、上記のように遠心分離し両方のフロースルー溶出分画を一緒にした(合計400μL)。この工程の間、熱及び尿素変性標的タンパク質はそれらの正確な折り畳みを喪失し、フロースルーで収集された構造エピトープ結合アプタマーを遊離させた。これらのアプタマーをその後のPCRのためにイソプロパノール沈殿により精製し、10μLのdH2Oに再懸濁した。
フィルターSELEXは、溶液中で標的タンパク質とアプタマーをインキュベートした後、標的タンパク質をニトロセルロース膜に固定して、標的結合アプタマーの分離及び洗浄を可能にすることを基本とした。選別は全体積100μLのダルベッコー(Dulbecco)PBS(DPBS)中で実施し、選別過程の間ずっと非特異的競合tRNAの濃度及び洗浄体積を増加させるとともに、標的タンパク質の量を減少させてストリンジェンシーを強化する。1ラウンド目については、出発プールの1x1014分子を用い(最終濃度1.66μM)、その後のラウンドではその前のラウンドから得られた出力プールを1μMに調節した。フィルターはKOHで前処理し、フィルターへのDNAプールの非特異的結合を減少させた。
陰性前選別でのフィルター結合アプタマーの除去のために(1ラウンド目では省略する)、50μLのプール/DPBSを前処理フィルターに添加し、2000rpmで1分間遠心分離した。前記のフロースルーをその後の陽性/陰性選別工程で使用するために収集した。
逆選別は、標的とされるべきではない成分からアプタマーを除去することが所望される場合に(例えば用いた組換え標的タンパク質のHis-タグ又はFc-融合部分;1ラウンド目では省略した)、陰性選別のフロースルーにタンパク質及びDPBSを90μLの全体積中に1μMの最終タンパク質濃度で添加することによって適用した。37℃で1時間インキュベートした後、このプール/DPBS溶液を前処理フィルターに添加し、2000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを陽性選別工程で使用するために収集した。
陽性選別は、以前の逆選別の場合の標的タンパク質及び競合物質量を90μLのプール/DPBSフロースルーに、100μLの全体積に1μMのタンパク質となるように添加することによって実施した。陽性選別混合物は37℃で1時間インキュベートし、続いて前処理セントレックス(Centrex)カラムに添加し、2000rpmで1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。それによってフィルターは所望のタンパク質:プール複合体を捕捉した。これらを前加温した1000μLのDPBS(1ラウンド目では500μL)で2回洗浄し、以前のように遠心分離しフロースルーを廃棄し、200μLの90℃に前加熱した溶出液で2回の1分間インキュベーションによって溶出させ、上記のように遠心分離し両方のフロースルー溶出分画を一緒にした(合計400μL)。この工程の間、熱及び尿素変性標的タンパク質はそれらの正確な折り畳みを喪失し、フロースルーで収集された構造エピトープ結合アプタマーを遊離させた。これらのアプタマーをその後のPCRのためにイソプロパノール沈殿により精製し、10μLのdH2Oに再懸濁した。
アプタマープールの増幅は二工程PCR設定で達成した。最初の小規模PCR(ssPCR)は、DNA濃度を10ng/μLの標準濃度に調節するために実施し、同時にPCRサイクルモニタリングによって選別アプタマーの量を間接的に調べた。アプタマーが濃縮されればされるほど、所望の濃度を得るために必要なPCRサイクルの数は減少した。次の工程では、大規模PCR(lsPCR)が続きその後の選別ラウンドのために十分なアプタマー材料が得られた。lsPCR溶液をエタノールで沈殿させ、ペレットを乾燥させ、30μLのTE緩衝液(pH8.0)に再懸濁して1.5mLのチューブに移した。
一本鎖アプタマーは、二本鎖PCR生成物の鎖の選別により入手しなければならなかった。3’リボ-改変リバースプライマーの使用は、アンチセンス鎖のアルカリ誘導による鎖の断裂を可能にし、1本の大きなセンス鎖アプタマー及び2本のより小さなアンチセンスフラグメントを生じ、これらをポリアクリルアミドゲル電気泳動、受動ゲル溶出、DNA沈殿によって分離し、仕上げに40μLのDPBS中の懸濁物の濃度を決定して、次のSELEXラウンドに使用できる濃縮アプタマープールを得た。
我々は、NK細胞のCD16α(V158)及びCD16α(F158)の両方と結合するが、CD16βとは結合しない高い特異性(他の細胞又はタンパク質と結合しない)及び高い親和性(2桁のナノモル範囲又はそれ未満のKd)を有するCD16αアプタマーを選別した。
CD16αアプタマーについていくつかの重要な明細事項は下記の表1に示される。
一本鎖アプタマーは、二本鎖PCR生成物の鎖の選別により入手しなければならなかった。3’リボ-改変リバースプライマーの使用は、アンチセンス鎖のアルカリ誘導による鎖の断裂を可能にし、1本の大きなセンス鎖アプタマー及び2本のより小さなアンチセンスフラグメントを生じ、これらをポリアクリルアミドゲル電気泳動、受動ゲル溶出、DNA沈殿によって分離し、仕上げに40μLのDPBS中の懸濁物の濃度を決定して、次のSELEXラウンドに使用できる濃縮アプタマープールを得た。
我々は、NK細胞のCD16α(V158)及びCD16α(F158)の両方と結合するが、CD16βとは結合しない高い特異性(他の細胞又はタンパク質と結合しない)及び高い親和性(2桁のナノモル範囲又はそれ未満のKd)を有するCD16αアプタマーを選別した。
CD16αアプタマーについていくつかの重要な明細事項は下記の表1に示される。
表1:CD16 DNA SELEXの明細
標的タンパク質はCD16-6Hisであり、一方CD16β-10Hisを逆選別に適用し、tRNAを非特異的競合物として供した。一定量のアプタマーを再増幅するために必要なPCRサイクルをモニターし強調表現で示す。MTPはマイクロタイタープレートである。
標的タンパク質はCD16-6Hisであり、一方CD16β-10Hisを逆選別に適用し、tRNAを非特異的競合物として供した。一定量のアプタマーを再増幅するために必要なPCRサイクルをモニターし強調表現で示す。MTPはマイクロタイタープレートである。
我々は、c-Met陽性細胞上のc-Metと高い特異性及び親和性で結合するc-Metアプタマー(上記)を選別した。他の腫瘍特異抗原(TSA)(例えばEGFR)を適用する場合は、アプタマーもまた二重特異性アプタマーの構築のために選別及び適用できる。
アプタマーは、DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA又はrRnY 組成から成り得る。Rはプリン、Yはピリミジン、HはA、C、Uであり、DはA、G、Uでありdは2’デオキシで、rは2’ヒドロキシで、mは2’メトキシでfは2’フルオロでnは2’アミンである。
アプタマーは、DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA又はrRnY 組成から成り得る。Rはプリン、Yはピリミジン、HはA、C、Uであり、DはA、G、Uでありdは2’デオキシで、rは2’ヒドロキシで、mは2’メトキシでfは2’フルオロでnは2’アミンである。
入手データ−CD16aアプタマー
DNA及びrRfyアプタマーが、フィルターSELEX及び細胞SELEXによりCD16αに対して選別された(DNAフィルターSELEX:CLN0015-31、細胞SELEX:CLN0118-128、rRfYフィルターSELEX:CLN0047-63)。
CD16と特異的に結合する全てのアプタマーの配列は以下であった:
A)DNAアプタマー
配列番号:1 CLN0015;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCAGAAGAAATATCGAAACCCAGAATGGTCGGCCAGGCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:2 CLN0016;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAAGCACAAGAACTTTCAAAACGCAGAATGCTGGGCTTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:3 CLN0017;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGACGAGAATTTGGAAAACGCGGAACGCCGTCTGGTGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:4 CLN0018;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATCACGTGGTGGGCAAATAACCGGTTGGGGTGGGTCGAGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:5 CLN0019;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAACGGGAAGAAATGTCGAAACCCTTGAAAGGTCACGGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:6 CLN0020;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:7 CLN0021;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCAAGTATGAGCGCAGGAGTTAGGTCCCGTGGCGATGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:8 CLN0022;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAGGTGGGGGACTGGGGACGGGTATGGGCACACGGTATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:9 CLN0023;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGACGTTAAGCTAGCAGGTGTTAGGTCCCGTGGTGATGAATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:10 CLN0024;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGGAGGAGAATTAATAAAAACCCGGGACGGCCGACGGGATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:11 CLN0025;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGAACAAAGCGGGAGAATTATGAAAACGCGGAACGCCACGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:12 CLN0026;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCTAAGAGAAATATCGAAACCCTGGATAGGCTGAGTGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:13 CLN0027;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGGTGTAGGCCCTGTGGTGATGAATCGCGTGTCGAGGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:14 CLN0028;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGCAGCGGAGAAATTTCGAAACCCAGGATGGCCGCGAGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:15 CLN0029;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGACGGGACGAAAAACGGTTGGATGAGGTTGGTTGGGTGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:16 CLN0030;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTAAACCCCAAAACAGTGCAACTAGGTGTAGGTCCCGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:17 CLN0031;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCCAGAGAAATGTCGAAACCCGGTAACGGATGGTAAGCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:18 CLN0032;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGCCACTGGAGAAAGTAAGAAACGCAGAATGCCCAGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:19 CLN0118;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGGACTCGCAAAAGGTGGAACAGGAGTGGGCCCCGCGGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:20 CLN0119;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGCGGCGAGAAATGTCGAAACGGTGAAACCCGCCATGCGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:21 CLN0120;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACCCGTCAGGGGTTCGTTGTGAGGAGAGAGGGTTGGGCCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:22 CLN0121;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGAGTGAAAGAGGCAGGTGTAGGTCCCGTGGAGGTCAGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:23 CLN0122;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGGCGCGAGAAATATCGAAACACCGGACGGTCGCGACGCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:24 CLN0123;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:25 CLN0124;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCCGGGAGAATTAGATTAAAACGCGGAACGCCCCGTGCCCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:26 CLN0125;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGTGTAGGGAGCGGAGTAGGCAGGCGTAGGTCCTGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:27 CLN0126;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCGTTGTCGGGCGCAGGTGTAGGCCTCGTGGTGGTGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:28 CLN0127;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGGGGACAAGGGTCGGGTATGGGCGCCTCGAGAACTGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:29 CLN0128;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATAGGCAACGGGGATGATAACCAGTTGGGGTGGGACGAGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
B)rRfY CD16特異的アプタマー
配列番号:30 CLN0047;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGCGGAAGGTAGGTTATACGAGCGCGCAGGACTGGTAATAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:31 CLN0048;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGTGAGAGGTTAAAGGAAGGGTGCGTTGTCAAAGGCTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:32 CLN0049;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAAGCGAAGGGTCAAAAAGGCCGAGCGGTTTAGGCATCAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:33 CLN0050;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTAAACCCCAAAACAGTGCAACTAGGTGTAGGTCCCGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:34 CLN0051;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCCGGCTTCGAAGGGTGAATACTGAGCGGAAGTGAGAGGAAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:35 CLN0052;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCAAGGAGGTAAAAGGAAGGGTGGTTGCTTGGCGCTAACGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:36 CLN0053;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAATGGAAGGGCGTTATGAACGCTGAGCGCATTAGGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:37 CLN0054;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCTAGTGTTATGACCCTAGAAATAGATGAGTTGAGAGGTCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:38 CLN0055;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCATGTGAAGGGACCAATCCGAGCGACATGGTGCGGGATAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:39 CLN0056;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTATGGAAGGGATAGGGTATCCGAGCGCAGAGGCTGAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:40 CLN0057;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATAGAGGTGAGAGGAAGGGTGTGTTGTATGTTGATAACGAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:41 CLN0058;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTCACGAAGTCAGCAATAATTTGCTGTAGGCGGTGGGGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:42 CLN0059;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGTAGTGGGAGGACGCGGAAAGTCGAGCGCATTAGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:43 CLN0060;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCGGTGGAAGGCTGAACATTGGCGAGCGCATCGGAGATCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:44 CLN0061;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGAGAAACATAAACCATAAACGCAGAAGCTGGCTGTGAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:45 CLN0062;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTTCTTGTAGTGCATCCAATTGCAGAGCGAAGGAGGTGTTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:46 CLN0063;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGTAGTTGAAGGACTTTTGGGTTGAGCGGACTAGGTGTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
C)mRfY CD16特異的アプタマー
配列番号:47 CLN0072;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAATGACATATTTCTTATATCGGGTTTGGAGTGCCTTGCCTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:48 CLN0076;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAATGACATTTTCTTATATCGGGTTTGGAGTGCCCTGCCTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:49 CLN0077;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATGTATTGCGGATGATTTTGTATTTAATGTGTATGCCTCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
DNA及びrRfyアプタマーが、フィルターSELEX及び細胞SELEXによりCD16αに対して選別された(DNAフィルターSELEX:CLN0015-31、細胞SELEX:CLN0118-128、rRfYフィルターSELEX:CLN0047-63)。
CD16と特異的に結合する全てのアプタマーの配列は以下であった:
A)DNAアプタマー
配列番号:1 CLN0015;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCAGAAGAAATATCGAAACCCAGAATGGTCGGCCAGGCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:2 CLN0016;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAAGCACAAGAACTTTCAAAACGCAGAATGCTGGGCTTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:3 CLN0017;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGACGAGAATTTGGAAAACGCGGAACGCCGTCTGGTGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:4 CLN0018;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATCACGTGGTGGGCAAATAACCGGTTGGGGTGGGTCGAGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:5 CLN0019;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAACGGGAAGAAATGTCGAAACCCTTGAAAGGTCACGGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:6 CLN0020;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:7 CLN0021;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCAAGTATGAGCGCAGGAGTTAGGTCCCGTGGCGATGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:8 CLN0022;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAGGTGGGGGACTGGGGACGGGTATGGGCACACGGTATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:9 CLN0023;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGACGTTAAGCTAGCAGGTGTTAGGTCCCGTGGTGATGAATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:10 CLN0024;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGGAGGAGAATTAATAAAAACCCGGGACGGCCGACGGGATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:11 CLN0025;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGAACAAAGCGGGAGAATTATGAAAACGCGGAACGCCACGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:12 CLN0026;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCTAAGAGAAATATCGAAACCCTGGATAGGCTGAGTGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:13 CLN0027;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGGTGTAGGCCCTGTGGTGATGAATCGCGTGTCGAGGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:14 CLN0028;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGCAGCGGAGAAATTTCGAAACCCAGGATGGCCGCGAGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:15 CLN0029;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGACGGGACGAAAAACGGTTGGATGAGGTTGGTTGGGTGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:16 CLN0030;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTAAACCCCAAAACAGTGCAACTAGGTGTAGGTCCCGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:17 CLN0031;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCCAGAGAAATGTCGAAACCCGGTAACGGATGGTAAGCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:18 CLN0032;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGCCACTGGAGAAAGTAAGAAACGCAGAATGCCCAGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:19 CLN0118;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGGACTCGCAAAAGGTGGAACAGGAGTGGGCCCCGCGGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:20 CLN0119;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGCGGCGAGAAATGTCGAAACGGTGAAACCCGCCATGCGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:21 CLN0120;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACCCGTCAGGGGTTCGTTGTGAGGAGAGAGGGTTGGGCCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:22 CLN0121;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGAGTGAAAGAGGCAGGTGTAGGTCCCGTGGAGGTCAGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:23 CLN0122;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGGCGCGAGAAATATCGAAACACCGGACGGTCGCGACGCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:24 CLN0123;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:25 CLN0124;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCCGGGAGAATTAGATTAAAACGCGGAACGCCCCGTGCCCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:26 CLN0125;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGTGTAGGGAGCGGAGTAGGCAGGCGTAGGTCCTGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:27 CLN0126;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGCGTTGTCGGGCGCAGGTGTAGGCCTCGTGGTGGTGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:28 CLN0127;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGGGGACAAGGGTCGGGTATGGGCGCCTCGAGAACTGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:29 CLN0128;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATAGGCAACGGGGATGATAACCAGTTGGGGTGGGACGAGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
B)rRfY CD16特異的アプタマー
配列番号:30 CLN0047;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGCGGAAGGTAGGTTATACGAGCGCGCAGGACTGGTAATAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:31 CLN0048;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGTGAGAGGTTAAAGGAAGGGTGCGTTGTCAAAGGCTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:32 CLN0049;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAAGCGAAGGGTCAAAAAGGCCGAGCGGTTTAGGCATCAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:33 CLN0050;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTAAACCCCAAAACAGTGCAACTAGGTGTAGGTCCCGTGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:34 CLN0051;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCCGGCTTCGAAGGGTGAATACTGAGCGGAAGTGAGAGGAAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:35 CLN0052;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCAAGGAGGTAAAAGGAAGGGTGGTTGCTTGGCGCTAACGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:36 CLN0053;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTAATGGAAGGGCGTTATGAACGCTGAGCGCATTAGGGGTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:37 CLN0054;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCTAGTGTTATGACCCTAGAAATAGATGAGTTGAGAGGTCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:38 CLN0055;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCATGTGAAGGGACCAATCCGAGCGACATGGTGCGGGATAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:39 CLN0056;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTATGGAAGGGATAGGGTATCCGAGCGCAGAGGCTGAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:40 CLN0057;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATAGAGGTGAGAGGAAGGGTGTGTTGTATGTTGATAACGAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:41 CLN0058;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTCACGAAGTCAGCAATAATTTGCTGTAGGCGGTGGGGACTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:42 CLN0059;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGTAGTGGGAGGACGCGGAAAGTCGAGCGCATTAGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:43 CLN0060;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGCGGTGGAAGGCTGAACATTGGCGAGCGCATCGGAGATCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:44 CLN0061;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGAGAAACATAAACCATAAACGCAGAAGCTGGCTGTGAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:45 CLN0062;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGTTCTTGTAGTGCATCCAATTGCAGAGCGAAGGAGGTGTTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:46 CLN0063;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCACGTAGTTGAAGGACTTTTGGGTTGAGCGGACTAGGTGTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
C)mRfY CD16特異的アプタマー
配列番号:47 CLN0072;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAATGACATATTTCTTATATCGGGTTTGGAGTGCCTTGCCTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:48 CLN0076;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAATGACATTTTCTTATATCGGGTTTGGAGTGCCCTGCCTAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:49 CLN0077;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCATGTATTGCGGATGATTTTGTATTTAATGTGTATGCCTCGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
DNA CD16αアプタマーのみ性状をさらに調べて、3候補のみを得た。
CLN0020(配列番号:6):
生化学的結合及び親和性:CD16α-6Hisに対して45±29nM(n=10)、V158及びF158の両アロタイプと結合、CD16βとは全く結合せず、His-タグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合は以下の細胞でFACSによって確認した:1)組換えCD16α(V158)-陽性Jurkat細胞株、2)組換えCD16α(F158)-陽性Jurkat細胞株、3)新しく単離したCD16α-陽性PBMC(NK細胞を含む)、4)新しく単離したNK細胞。非特異的結合はCD16α陰性細胞株Jurkat E6.1、CD16α陰性PBMC、GTL-16では認められなかった。セツキシマブ(Bou-Assaly and Mukherji (2010) AJNR Am J Neuroradiol 31(4):626-7)及びCD16α特異的mAb 3G8との競合ドットブロットによるエピトープマッピングは、CLN0020はFc結合ドメインで又はその近傍で結合することを示した(抗体アナローグ、わずかに約10x高い親和性)。構造予測による最小化は、FLアプタマーと類似する特性を示す縮小型(84merに代わり41mer(“MS1”と称する)及び34mer(“MS3”と称する)、下記参照)を生じた。FBS中での血清安定性は半減期が約10時間であることを示した。
CLN0123(配列番号:24):
生化学的結合及び親和性:CD16α-6Hisに対して231nM、V158アロタイプとのみ結合、CD16βとは全く結合せず、His-タグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。CLN0020との競合ドットブロットは、CLN0123は異なるエピトープと結合し、したがってFC結合部位には結合せず、したがって血清IgGと競合しないことを明らかにした。細胞結合は以下の細胞でFACSによって確認した:1)組換えCD16α(V158)-陽性Jurkat細胞株、2)組換えCD16α(F158)-陽性Jurkat細胞株、3)新しく単離したPBMC(NK細胞を含む)、4)新しく単離したNK細胞。非特異的結合はCD16α陰性細胞株Jurkat E6.1、CD16陰性PBMCでは認められなかった。
CLN0018(配列番号:4):
生化学的結合及び親和性:CD16α-6Hisに対して38±26nM(n=4)、V158アロタイプとのみ結合、CD16βとは全く結合せず、His-タグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。FACSによる細胞結合分析は広い非特異的結合を示した。
CLN0020(配列番号:6):
生化学的結合及び親和性:CD16α-6Hisに対して45±29nM(n=10)、V158及びF158の両アロタイプと結合、CD16βとは全く結合せず、His-タグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合は以下の細胞でFACSによって確認した:1)組換えCD16α(V158)-陽性Jurkat細胞株、2)組換えCD16α(F158)-陽性Jurkat細胞株、3)新しく単離したCD16α-陽性PBMC(NK細胞を含む)、4)新しく単離したNK細胞。非特異的結合はCD16α陰性細胞株Jurkat E6.1、CD16α陰性PBMC、GTL-16では認められなかった。セツキシマブ(Bou-Assaly and Mukherji (2010) AJNR Am J Neuroradiol 31(4):626-7)及びCD16α特異的mAb 3G8との競合ドットブロットによるエピトープマッピングは、CLN0020はFc結合ドメインで又はその近傍で結合することを示した(抗体アナローグ、わずかに約10x高い親和性)。構造予測による最小化は、FLアプタマーと類似する特性を示す縮小型(84merに代わり41mer(“MS1”と称する)及び34mer(“MS3”と称する)、下記参照)を生じた。FBS中での血清安定性は半減期が約10時間であることを示した。
CLN0123(配列番号:24):
生化学的結合及び親和性:CD16α-6Hisに対して231nM、V158アロタイプとのみ結合、CD16βとは全く結合せず、His-タグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。CLN0020との競合ドットブロットは、CLN0123は異なるエピトープと結合し、したがってFC結合部位には結合せず、したがって血清IgGと競合しないことを明らかにした。細胞結合は以下の細胞でFACSによって確認した:1)組換えCD16α(V158)-陽性Jurkat細胞株、2)組換えCD16α(F158)-陽性Jurkat細胞株、3)新しく単離したPBMC(NK細胞を含む)、4)新しく単離したNK細胞。非特異的結合はCD16α陰性細胞株Jurkat E6.1、CD16陰性PBMCでは認められなかった。
CLN0018(配列番号:4):
生化学的結合及び親和性:CD16α-6Hisに対して38±26nM(n=4)、V158アロタイプとのみ結合、CD16βとは全く結合せず、His-タグとの結合は無し、データはドットブロットによって得られた。FACSによる細胞結合分析は広い非特異的結合を示した。
DNA c-Metアプタマー
c-Met DNAアプタマーを組換えFc-c-Metを用いフィルターSELEXにより選別した。
c-metと特異的に結合する全てのアプタマーの配列は以下である:
配列番号:50 CLN0001;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGTGGGGAGTAACAGGCTGTTGGTAGGGGTGGACCTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:51 CLN0002;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAAGGAGAAGGTCCAAAACGGCCTGGGTGGTGGGTATGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:52 CLN0003;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:53 CLN0004;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:54 CLN0005;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAAGGAGAAGGCTCAAAACGGCCTGGGTGGTGGGTATGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:55 CLN0006;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGATACAGCAGAATAAGGGAAGGGGCAGATCGGGGTGGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:56 CLN0007;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGCAAACAGCAGGTAGAGGGAAGTGGCAGATCGGGGTGGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:57 CLN0008;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGCGGGGACGAACACATATGGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:58 CLN0009;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGTTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:59 CLN0010;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGACAGTGGGTAGCGGTTAAGGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:60 CLN0011;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGTGGGATAAAAGCATGGTTGGTAGGGGTTGGGGCATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:61 CLN0012;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAGGCGTGTGTATCCCTGTGGTAGGGGTTGGTCGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:62 CLN0013;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGGGTCGGGATTGGGCGGGGTCTGGAAGATCATGTGCCAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:63 CLN0014;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGGGGGAAGACGAGTGTAAGTTGGTAGGGTGGGGTAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
2つのアプタマーのみが低ナノモル結合の基準を満たし、さらに性状を調べた(CLN0008はCLN0004との高い配列類似性により除外した)。
CLN0003(配列番号:53):
生化学的結合及び親和性:Fc-His-c-Metに対して91±40pM(n=3)、Fc結合無し、His-タグ結合無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合はc-Met陽性細胞株GLT-16、MNK-45、EBC-1を用いてFACSによって確認した。Jurkat細胞では非特異的結合は認められなかった。最小化を適用したが成功しなかった(下記参照)。
CLN0004(配列番号:54):
生化学的結合及び親和性:Fc-His-c-Metに対して11±6nM(n=6)、Fc結合無し、His-タグ結合無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合はc-Met陽性細胞株GLT-16、MNK-45、EBC-1を用いてFACSによって確認した。Jurkat細胞では非特異的結合は認められなかった。最小化は、FLアプタマーと類似する特性を示す縮小型(84merに代わり41mer(“MS2”と称する)下記参照)をもたらした。FBS中での血清安定性は半減期が約10時間であることを示した。
c-Met DNAアプタマーを組換えFc-c-Metを用いフィルターSELEXにより選別した。
c-metと特異的に結合する全てのアプタマーの配列は以下である:
配列番号:50 CLN0001;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGTGGGGAGTAACAGGCTGTTGGTAGGGGTGGACCTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:51 CLN0002;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAAGGAGAAGGTCCAAAACGGCCTGGGTGGTGGGTATGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:52 CLN0003;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:53 CLN0004;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:54 CLN0005;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAAGGAGAAGGCTCAAAACGGCCTGGGTGGTGGGTATGTGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:55 CLN0006;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGGATACAGCAGAATAAGGGAAGGGGCAGATCGGGGTGGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:56 CLN0007;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGCAAACAGCAGGTAGAGGGAAGTGGCAGATCGGGGTGGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:57 CLN0008;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGCGGGGACGAACACATATGGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:58 CLN0009;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGTTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:59 CLN0010;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGACAGTGGGTAGCGGTTAAGGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:60 CLN0011;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGTGGGATAAAAGCATGGTTGGTAGGGGTTGGGGCATGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:61 CLN0012;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAAGGCGTGTGTATCCCTGTGGTAGGGGTTGGTCGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:62 CLN0013;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCAGGGTCGGGATTGGGCGGGGTCTGGAAGATCATGTGCCAGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:63 CLN0014;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCGGGGGGGGAAGACGAGTGTAAGTTGGTAGGGTGGGGTAGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
2つのアプタマーのみが低ナノモル結合の基準を満たし、さらに性状を調べた(CLN0008はCLN0004との高い配列類似性により除外した)。
CLN0003(配列番号:53):
生化学的結合及び親和性:Fc-His-c-Metに対して91±40pM(n=3)、Fc結合無し、His-タグ結合無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合はc-Met陽性細胞株GLT-16、MNK-45、EBC-1を用いてFACSによって確認した。Jurkat細胞では非特異的結合は認められなかった。最小化を適用したが成功しなかった(下記参照)。
CLN0004(配列番号:54):
生化学的結合及び親和性:Fc-His-c-Metに対して11±6nM(n=6)、Fc結合無し、His-タグ結合無し、データはドットブロットによって得られた。細胞結合はc-Met陽性細胞株GLT-16、MNK-45、EBC-1を用いてFACSによって確認した。Jurkat細胞では非特異的結合は認められなかった。最小化は、FLアプタマーと類似する特性を示す縮小型(84merに代わり41mer(“MS2”と称する)下記参照)をもたらした。FBS中での血清安定性は半減期が約10時間であることを示した。
二重特異性アプタマー
TRA本体とESA本体のリンカーによる結合:
以下の種々のタイプのリンカーを用いた:
−PEG(3)、PEG(6)、PEG(24)
−ヌクレオチド:15dA
−ヌクレオチド“フランキング配列のリンカー配列”(長さは7−24ヌクレオチド)
結合は、抗体中のCDRからFc結合ドメインまでの距離と相関する両アプタマー本体間の距離を構成する態様で達成された(約7.5nm)。
以下の異なる方法による2つのアプタマーのカップリングの達成によって、最終構築物、アプタマー1-C7-NH-CO-PEG(24)-マレイミド-S-C3-アプタマー2が得られた:
1.いくつかの配列及び長さを有するヌクレオチド又は炭素/PEGリンカーを取り込む直接的完全合成;
2.NHS-活性化PEG(24)に対しC7炭素スペーサーを有する5’アミン官能基付加アプタマー及びPEG(24)の他方の末端に結合させたマレイミドに対しC3炭素スペーサーを有する3’チオール官能基付加アプタマーのカップリング。
以下の二重特異性アプタマーが構築された:
CD16 c-Met二重特異性DNAアプタマー
配列番号:64 bsA1;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:65 bsA2;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:66 bsA3;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:67 bsA31;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:68 bsA32;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:69 bsA4;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGAAAAAAAAAAAAAAACCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:70 bsA5;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC/iSp9/GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:71 bsA6;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG/iSp9/CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:72 bsA7;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC/iSp18/GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:73 bsA8;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG/iSp18/CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:74 bsA9;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:75 bsA10;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:76 bsA11;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:77 bsA12;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTC
配列番号:78 bsA13;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGG
配列番号:79 bsA14;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC-C7-NH2及び官能性残基NH2及びSHを有するGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC-C3-SHがPEG(24)によって結合されてアプタマー1-C7-NH-CO-PEG(24)-マレイミド-S-C3-アプタマー2を生じる。
配列番号:80 bsA15:
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:81 bsA16;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:82 bsA17;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:83 bsA18;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTC
配列番号:84 bsA19;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCT
配列番号:85 bsA20;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCT
配列番号:86 bsA21;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:87 bsA22;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
以下の表2は本発明の二重特異性アプタマーの詳細を示す。
TRA本体とESA本体のリンカーによる結合:
以下の種々のタイプのリンカーを用いた:
−PEG(3)、PEG(6)、PEG(24)
−ヌクレオチド:15dA
−ヌクレオチド“フランキング配列のリンカー配列”(長さは7−24ヌクレオチド)
結合は、抗体中のCDRからFc結合ドメインまでの距離と相関する両アプタマー本体間の距離を構成する態様で達成された(約7.5nm)。
以下の異なる方法による2つのアプタマーのカップリングの達成によって、最終構築物、アプタマー1-C7-NH-CO-PEG(24)-マレイミド-S-C3-アプタマー2が得られた:
1.いくつかの配列及び長さを有するヌクレオチド又は炭素/PEGリンカーを取り込む直接的完全合成;
2.NHS-活性化PEG(24)に対しC7炭素スペーサーを有する5’アミン官能基付加アプタマー及びPEG(24)の他方の末端に結合させたマレイミドに対しC3炭素スペーサーを有する3’チオール官能基付加アプタマーのカップリング。
以下の二重特異性アプタマーが構築された:
CD16 c-Met二重特異性DNAアプタマー
配列番号:64 bsA1;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:65 bsA2;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:66 bsA3;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:67 bsA31;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:68 bsA32;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:69 bsA4;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGAAAAAAAAAAAAAAACCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:70 bsA5;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC/iSp9/GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:71 bsA6;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG/iSp9/CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:72 bsA7;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC/iSp18/GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG
配列番号:73 bsA8;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGG/iSp18/CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC
配列番号:74 bsA9;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:75 bsA10;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:76 bsA11;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:77 bsA12;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTC
配列番号:78 bsA13;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGG
配列番号:79 bsA14;
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC-C7-NH2及び官能性残基NH2及びSHを有するGTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC-C3-SHがPEG(24)によって結合されてアプタマー1-C7-NH-CO-PEG(24)-マレイミド-S-C3-アプタマー2を生じる。
配列番号:80 bsA15:
GGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:81 bsA16;
GAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCAGAGGGGAGGGTCGGGTATCGGCGTGTTCGGGGGATCTGCGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:82 bsA17;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:83 bsA18;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCATCAGGCGAGTGCGTAATGGTACGATTTGGGAAGTGGCTTGGGGTGGGATTAGTTTTGGAGTACTC
配列番号:84 bsA19;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCT
配列番号:85 bsA20;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCT
配列番号:86 bsA21;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTCAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
配列番号:87 bsA22;
CCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGAAAAAAAAAAAAAAAGGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC
以下の表2は本発明の二重特異性アプタマーの詳細を示す。
二重特異性アプタマーの詳細
二重特異性アプタマーについて以下の実験を実施した:
−対応するアプタマー本体の結合特性が変化していないことを確認するドットブロット(Kdは下記を参照されたい)
−対応するデータは図2に要約されている
−両タンパク質の同時結合を証明する電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)(両方の標的タンパク質と結合したときのTBEゲルにおけるアプタマーのバンドシフト)は図3に示される。
二重特異性アプタマーについて以下の実験を実施した:
−対応するアプタマー本体の結合特性が変化していないことを確認するドットブロット(Kdは下記を参照されたい)
−対応するデータは図2に要約されている
−両タンパク質の同時結合を証明する電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)(両方の標的タンパク質と結合したときのTBEゲルにおけるアプタマーのバンドシフト)は図3に示される。
選択アプタマーの血清安定性
重要なシングルアプタマー(CLN0004、CLN0020)及び二重特異性構築物(bsA3及びbsA17)についてウシ胎児血清安定性を決定し、血清半減期は6.4−20.3時間であった。得られた結果は図4に示す。
重要なシングルアプタマー(CLN0004、CLN0020)及び二重特異性構築物(bsA3及びbsA17)についてウシ胎児血清安定性を決定し、血清半減期は6.4−20.3時間であった。得られた結果は図4に示す。
腫瘍細胞溶解を評価するADCCアッセイ
以下の細胞株を用いた:
GTL-16:ヒト胃腺癌(Palo Porporato Novara, Merck kGaA)
EBC-1:ヒト扁平上皮肺癌(Health Sc. Res. Resources Bank, JCRB0920, 031496)
全てのADCCアッセイはGTL-16細胞を用いて実施したが、bsA17についてはFBC-1もまた用いて評価した(図5のC部分を参照されたい)。本発明の二重特異性アプタマーはセツキシマブと類似するADCC活性を媒介することは図5から容易に理解できる。図6はbsA22について得られた結果を示す。
以下の細胞株を用いた:
GTL-16:ヒト胃腺癌(Palo Porporato Novara, Merck kGaA)
EBC-1:ヒト扁平上皮肺癌(Health Sc. Res. Resources Bank, JCRB0920, 031496)
全てのADCCアッセイはGTL-16細胞を用いて実施したが、bsA17についてはFBC-1もまた用いて評価した(図5のC部分を参照されたい)。本発明の二重特異性アプタマーはセツキシマブと類似するADCC活性を媒介することは図5から容易に理解できる。図6はbsA22について得られた結果を示す。
Claims (5)
- TRA及びESAと結合する癌治療用二重特異性アプタマー。
- c-Met及びCD16αと結合する、請求項1に記載の二重特異性アプタマー。
- 配列番号:82及び配列番号:87から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項2に記載の二重特異性アプタマー。
- 医薬として使用される、請求項1から3の1項に記載の二重特異性アプタマー。
- 癌の医薬として使用される、請求項4に記載の二重特異性アプタマー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10015522.5 | 2010-12-10 | ||
EP10015522 | 2010-12-10 | ||
PCT/EP2011/006254 WO2012076190A1 (en) | 2010-12-10 | 2011-12-12 | Bispecific aptamers mediating tumour cell lysis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014500024A true JP2014500024A (ja) | 2014-01-09 |
Family
ID=45464479
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013542415A Pending JP2014500024A (ja) | 2010-12-10 | 2011-12-12 | 腫瘍細胞溶解を媒介する二重特異性アプタマー |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8969318B2 (ja) |
EP (1) | EP2649183A1 (ja) |
JP (1) | JP2014500024A (ja) |
CN (1) | CN103261418A (ja) |
AU (1) | AU2011341017A1 (ja) |
CA (1) | CA2820782A1 (ja) |
WO (1) | WO2012076190A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021532745A (ja) * | 2018-07-26 | 2021-12-02 | アラティンガ・バイオ・ティーエヌピー | アプタマーベースのcar t−細胞スイッチ |
JP7488914B2 (ja) | 2020-05-27 | 2024-05-22 | 中央研究院 | 単球特異的アプタマー、及びがんへの薬物送達を増強するためのそれらの使用 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6495927B2 (ja) * | 2014-09-09 | 2019-04-03 | 国立大学法人 東京大学 | Hgf受容体に結合するアプタマー |
US10655097B2 (en) | 2014-12-22 | 2020-05-19 | Saint-Gobain Performance Plastics Corporation | T-cell culture double bag assembly |
US9926524B2 (en) | 2014-12-22 | 2018-03-27 | Saint-Gobain Performance Plastics Corporation | Gas permeable material |
US10280390B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-05-07 | Saint-Gobain Performance Plastics Corporation | System for culture of cells in a controlled environment |
US10221249B2 (en) | 2015-09-10 | 2019-03-05 | Affigen, Llc | Method of making patient specific anti-idiotype antibodies |
AU2016323806A1 (en) | 2015-09-16 | 2018-05-10 | La Jolla Nanomedical | A cellular activity targeted nanoparticle system and methods of producing the nanoparticle system |
EP3416690A4 (en) * | 2016-02-19 | 2020-02-19 | City of Hope | SPECIFIC APTAMER |
US11007211B2 (en) * | 2018-01-07 | 2021-05-18 | City Of Hope | CCR7 aptamers and uses thereof |
KR20210069675A (ko) * | 2018-10-01 | 2021-06-11 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 항-fap 클론 212를 포함하는 이중특이적 항원 결합 분자 |
CN110283826A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-27 | 福州大学 | 一种双特异性核酸适体、衍生物、制备方法及其应用 |
CN111778210B (zh) * | 2020-04-29 | 2022-11-04 | 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) | 一种增强nk细胞对肿瘤细胞靶向杀伤力的培养方法 |
EP4148132A4 (en) | 2020-05-07 | 2024-07-03 | Interoligo Corp | NOVEL NUCLEIC ACID LIGAND AND ITS IDENTIFICATION METHOD |
WO2022144815A1 (en) * | 2021-01-01 | 2022-07-07 | Talkhabifard Majid | Dual-specific aptamer triggering cell-mediated cytotoxicity to lyse her2-positive cancer cells |
WO2023014196A1 (ko) | 2021-08-06 | 2023-02-09 | 인터올리고 주식회사 | 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 삼중음성유방암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002061079A2 (en) * | 2001-01-29 | 2002-08-08 | Isis Innovation Limited | Biligands |
JP2005517392A (ja) * | 2001-11-14 | 2005-06-16 | アフィメート テラポイティクス アーゲー | 二重特異性抗cd19×抗cd16抗体およびその使用 |
JP2008531557A (ja) * | 2005-02-23 | 2008-08-14 | メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド | 生物活性を調節するための二重特異性結合剤 |
WO2010037835A2 (en) * | 2008-10-01 | 2010-04-08 | Micromet Ag | Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009508491A (ja) | 2005-09-15 | 2009-03-05 | デューク ユニバーシティ | アゴニストとしてのアプタマー |
-
2011
- 2011-12-12 CA CA2820782A patent/CA2820782A1/en not_active Abandoned
- 2011-12-12 US US13/992,608 patent/US8969318B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-12-12 EP EP11805767.8A patent/EP2649183A1/en not_active Withdrawn
- 2011-12-12 CN CN2011800589650A patent/CN103261418A/zh active Pending
- 2011-12-12 WO PCT/EP2011/006254 patent/WO2012076190A1/en active Application Filing
- 2011-12-12 JP JP2013542415A patent/JP2014500024A/ja active Pending
- 2011-12-12 AU AU2011341017A patent/AU2011341017A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002061079A2 (en) * | 2001-01-29 | 2002-08-08 | Isis Innovation Limited | Biligands |
JP2005517392A (ja) * | 2001-11-14 | 2005-06-16 | アフィメート テラポイティクス アーゲー | 二重特異性抗cd19×抗cd16抗体およびその使用 |
JP2008531557A (ja) * | 2005-02-23 | 2008-08-14 | メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド | 生物活性を調節するための二重特異性結合剤 |
WO2010037835A2 (en) * | 2008-10-01 | 2010-04-08 | Micromet Ag | Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxc d3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6015039944; J. Biol. Chem. Vol.279, No.52, 2004, pp.53907-53914 * |
JPN6015039945; J. Clin. Invest. Vol.118, No.1, 2008, pp.376-386 * |
JPN6015039946; Abstracts of Papers American Chemical Society Vol.239, 20100321, p.212-BIOT * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2021532745A (ja) * | 2018-07-26 | 2021-12-02 | アラティンガ・バイオ・ティーエヌピー | アプタマーベースのcar t−細胞スイッチ |
JP7488914B2 (ja) | 2020-05-27 | 2024-05-22 | 中央研究院 | 単球特異的アプタマー、及びがんへの薬物送達を増強するためのそれらの使用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20140039042A1 (en) | 2014-02-06 |
US8969318B2 (en) | 2015-03-03 |
CN103261418A (zh) | 2013-08-21 |
EP2649183A1 (en) | 2013-10-16 |
WO2012076190A1 (en) | 2012-06-14 |
AU2011341017A1 (en) | 2013-07-25 |
CA2820782A1 (en) | 2012-06-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2014500024A (ja) | 腫瘍細胞溶解を媒介する二重特異性アプタマー | |
Darmostuk et al. | Current approaches in SELEX: An update to aptamer selection technology | |
JP6279573B2 (ja) | 癌幹細胞を検出するためのcd133アプタマー | |
US20120083521A1 (en) | Aptamers as agonists | |
WO2017127762A1 (en) | Methods for improved aptamer selection | |
US20220251562A1 (en) | Anti-CD3 Aptamers for Use in Cell Targeting and Labeling | |
CN113423833A (zh) | 用于选择功能性适体的方法和组合物 | |
CN105143470B (zh) | 用于将癌症分类为易感于tmepai定向疗法以及治疗所述癌症的方法 | |
TWI821545B (zh) | 具有複數個核酸庫之組合物 | |
WO2013016280A2 (en) | Compositions and methods for selecting aptamers | |
JP6128621B2 (ja) | マイクロベシクルに対する核酸アプタマー | |
KR102501963B1 (ko) | 변형된 뉴클레오사이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 | |
JP2024514266A (ja) | FN3ドメイン-siRNAコンジュゲートおよびその使用 | |
JP2023519215A (ja) | 化学修飾核酸に対するモノクローナル抗体及びその使用 | |
US20210180067A1 (en) | Nucleic acid aptamers | |
JP2023527311A (ja) | 二重特異性個別化アプタマー | |
JP2023553193A (ja) | Tリンパ球結合アプタマー | |
WO2020204151A1 (ja) | Fgf9に対するアプタマー及びその使用 | |
Lin et al. | A modified SELEX approach to identify DNA aptamers with binding specificity to the major histocompatibility complex presenting ovalbumin model antigen | |
Zumrut | Development of Ligand Guided Selection (LIGS) to Identify Specific DNA Aptamers Against Cell Surface Proteins | |
Williams | Multi-Target Ligand-Guided Selection (LIGS) Against B-Cell-Specific Antigens Expressed in a Single Lymphoma Cell Population | |
Gordon | Developing Methods for Discovering Non-Natural and pH Switching Aptamers | |
CN117280033A (zh) | T-淋巴细胞结合适体 | |
KR20230136399A (ko) | EGFRvIII 특이적 압타머 및 이의 용도 | |
IT201900018509A1 (it) | Aptameri e loro usi |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141212 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151005 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160307 |