JP6279573B2 - 癌幹細胞を検出するためのｃｄ１３３アプタマー - Google Patents

Description

関連出願及び参照による組み入れ
本明細書で引用される又は参照される文書はすべて、及び本明細書で引用される文書にて引用された又は参照された文書はすべて、本明細書又は参照によって本明細書に組み入れられる文書にて言及されたいかなる製品についての製造元の指示書、説明、製品仕様書及び製品概要とともに、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

本開示はＲＮＡアプタマー及びその使用に関するものであり、特に、ＣＤ１３３に特異的に結合し、優れた腫瘍浸透性を示すアプタマーに関する。

プロミニン−１としても知られるＣＤ１３３は、原形質膜におけるコレステロールに関連する５回膜貫通の高度にグリコシル化された膜糖タンパク質である。このタンパク質は、体性幹細胞及び前駆細胞を含む広い集団の細胞を特徴付けることが知られ、種々の発生している上皮細胞及び分化した細胞にて発現されているにもかかわらず、その正確な機能は未だ解明中である。しかしながら、それは、二元細胞運命、腸管上皮の分化及びリンパ球生成にとって決定的であるＮｏｔｃｃｈシグナル伝達経路に繋がりがあるとされている（Ulasovら2011. Mol Med 17:103-12)。多数の癌における癌幹細胞（ＣＳＣ）のマーカーであると考えられるために、近年、さらなる関心がこの分子に示されている。実際、相次ぐ証拠は、ＣＤ１３３が、多数の癌にてＣＳＣ上で発現されることを示しており、免疫欠損マウスではその陰性の対応するものに比べてＣＤ１３３＋細胞の高い腫瘍形成能がある(Dittfeldら2009. Radiother Oncol 92:353-61)。

近年、免疫療法は癌の治療にて大きな効果を有している。しかしながら、抗体の使用は、ヒト化抗体でさえ、致命的であり得る有害な副作用を招き得る(Hanselら2010. Nat Rev Drug Discov 9:325-38)。このことが「さらに大きな且つさらに良好な」選択肢の探索につながっている。とりわけ、核酸が細胞に入れないために残念な結果になっているにもかかわらず、治療剤として核酸を使用する試みが幾つかあった(Shigdarら2011. Br Haematol 155:3-13)。

アプタマーと呼ばれる化学的な抗体はこの２０年間ますます臨床応用に利用されている。実際、アプタマーの１つ、ペガプタニブ（抗ＶＥＧＦアプタマー）はＦＤＡによって認可されており、さらに幾つかが臨床試験中である。治療法にアプタマーを使用することへの高い関心は、それらが免疫原性を示さない、化学的に合成されるためにバッチ間の変動が少ない、従来の抗体より安定であるという事実を含む幾つかの理由による。サイズが小さいために、それらは優れた腫瘍浸透性も示す。しかしながら、それらの最も重要な特徴は、機能を失うことなくこれらのアプタマーをナノ粒子、薬剤、造影剤、又は他の核酸治療剤に連結する能力である(Mengら2012. PLoS One 7:e33434)。この機能化は、現在の治療手段よりも少ない副作用で新しい且つさらに標的化された治療法をもたらしている(Mengら2012 supra)。大部分受動的な過程である従来の治療に比べて、標的化された送達系ははるかに有効性が大きい。アプタマーが有効な薬剤送達剤であるために、アプタマーは細胞表面におけるその標的に結合し、短時間以内に内部移行しなければならない。

癌幹細胞は腫瘍組織の形成及び増殖に関与し、当然化学療法に耐性であるということが、何故、従来の化学療法は当初腫瘍を退縮させるが、完全に撲滅することができず、結果的に最終的な再発を生じるのかを説明していることは最近十分に理解されている。癌幹細胞の仮説によれば、ＣＤ１３３陽性細胞は長期の腫瘍増殖を決定するので、臨床的転帰に影響することが疑われる。組織塊におけるＣＤ１３３陽性細胞の比率及びその形態的な構造は、腫瘍悪性度、切除の程度又は患者の年齢とは無関係に無増悪生存及び全生存についての有意な予後因子であったことが最近見いだされている。

ＣＤ１３３陽性癌幹細胞を検出し、標的化する現在の組織病理学的技法は、従来の抗体に基づく系を使用するが、利用可能な抗ＣＤ１３３抗体の大きさ及び組織に浸透することが相対的にできないことのために感度を欠く。

従って、ＣＤ１３３＋細胞に対するアプタマーの生成は癌の撲滅において有利であろう。このことは、迅速に内部移行し、優れた腫瘍浸透性を示すＣＤ１３３に特異的なアプタマーを生成している本発明者によって対処されている。

本開示は、ＣＤ１３３に特異的に結合する単離されたＲＮＡアプタマーを提供する。一例ではＣＤ１３３はヒトＣＤ１３３である。

一例では、本開示のアプタマーはＨＴ−２９細胞上で発現されたＣＤ１３３について８２〜１４５ｎＭの範囲での解離定数を有する。別の例では、本開示のアプタマーはＨｅｐ３Ｂ細胞上で発現されたＣＤ１３３について３２〜５２ｎＭの範囲での解離定数を有する。

一例では、単離されたＲＮＡアプタマーはコンセンサス配列５’−ＣＣＣＵＣＣＵＡＣＡＵＡＧＧＧ−３’（配列番号１）を含む。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、以下：
（ｉ）５’−ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＵＡ ＡＡＣ ＧＣＵ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＵＵ ＡＣＵ ＡＵＡ ＧＡＧ ＣＵＵ ＣＧＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＵ ＣＡＣ ＡＡＣ−３’（配列番号２）；
（ｉｉ）５’−ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＵＡ ＡＡＣ ＧＣＵ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＵＵ ＡＣＵ ＡＵＡ Ｇ−３’（配列番号３）；
（ｉｉｉ）５’−ＧＣＵ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＵ−３’（配列番号４）；
（ｉｖ）５’−ＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＵＧ Ｇ−３’（配列番号５）；及び
（ｖ）５’−ＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ Ｇ−３’（配列番号１）から選択される配列を含む。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、コンセンサス配列５’−ＣＡＧＡＡＣＧＵＡＵＡＣＵＡＵＵＣＵＧ−３’（配列番号６）を含む。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、コンセンサス配列５’−ＡＧＡＡＣＧＵＡＵＡＣＵＡＵＵ−３’（配列番号７）を含む。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、配列５’−ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＵＡ ＡＡＣ ＧＣＵ ＣＡＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＣＧＣ ＵＵＡ ＵＵＧ ＵＵＵ ＧＣＵ ＡＵＧ ＵＵＡ ＧＡＡ ＣＧＵ ＡＵＡ ＣＵＡ ＵＵＵ ＣＧＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＵ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＧＧ Ｃ−３’（配列番号８）を含む。

特定の例では、本開示は２’−フルオロ−ピリジンで修飾され、ＣＤ１３３に特異的に結合する単離されたＲＮＡアプタマーを提供する。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、配列番号１又は配列番号６の配列から本質的に成る。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、配列番号１又は配列番号６の配列から成る。

別の例では、単離されたＲＮＡアプタマーは、コンセンサス配列ＣＣＣＵＣＣＵＡＣＡＵＡＧＧＧ（配列番号１）、又はコンセンサス配列ＣＡＧＡＡＣＧＵＡＵＡＣＵＡＵＵＣＵＧ（配列番号６）、又はコンセンサス配列ＡＧＡＡＣＧＵＡＵＡＣＵＡＵＵ（配列番号７）を含み、その際、配列の長さは１５塩基〜１００塩基である。別の例では、長さは１５〜４０塩基の間である。別の例では、配列の長さは１９塩基〜１００塩基の間である。さらなる例では、長さは１９〜４０塩基の間である。

配列は、アプタマーの結合ループを維持するコンセンサス配列内で１以上のアミノ酸置換を含み得る。一例では、配列はコンセンサス配列内で１以上の置換を含む。一例では、配列はコンセンサス配列内で少なくとも１、２、３、４、５又は６の置換を含む。別の例では、配列は配列番号１又は配列番号６に係るアプタマーの幹領域内で少なくとも１、２、３、４、５又は６の置換を含む。一例では、幹領域はアプタマーの予測される二次元構造の領域である。

一例では、アプタマーは（試験管内又は生体内で）アプタマーの安定性を改善する１以上の修飾を含む（修飾されたアプタマー）。好適な修飾は本明細書のどこかで考察される。一例では、ピリジン塩基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）で修飾される。別の例では、ＲＮＡアプタマーの３’末端を修飾してヌクレアーゼ消化からそれを保護する。別の例では、５’末端を蛍光色素分子又は逆位ｄＴに結合することによってアプタマーを修飾する。

本開示はまた、配列番号１又は配列番号６又は配列番号７の配列を含むアプタマーと実質的に同じＣＤ１３３に結合する能力を有する単離されたＲＮＡアプタマーも提供する。

一例では、アプタマーはＣＤ１３３^＋細胞に特異的に結合する。別の例では、ＣＤ１３３^＋細胞）は幹細胞である。別の例では、幹細胞は単離された癌幹細胞である。別の例では、癌幹細胞は、（ｉ）ＣＤ１３３を発現している、（ｉｉ）腫瘍形成性である、（ｉｉｉ）自己再生が可能である、（ｉｖ）分化することが可能である及び（ｖ）従来の治療法によるアポトーシスに耐性であることを特徴とする。

癌幹細胞は、たとえば、生物試料のような供給源から単離された、濃縮された、又は精製された、のように代わりに記載され得る。別の例では、癌幹細胞は、ＣＤ１３３^＋発現に基づいて濃縮された細胞の集団を表す。別の例では、細胞の集団は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の癌幹細胞を含む。

一例では、ＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞は生体内に存在する。別の例では、ＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞は試験管内に存在する。さらなる例では、Ｃ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞は対象から得た生物試料に存在する。

別の例では、本開示のＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞はＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、β−カテニン、ＣＤ１１７、ＡＬＤＨ、ＶＬＡ−２、ＣＤ１６６、ＣＤ２０１、ＩＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、及びＥＧＦ１Ｒを含む１以上の追加の抗原を発現し得る。

別の例では、本開示に係る癌幹細胞は、脳腫瘍幹細胞、乳癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、結腸癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、皮膚癌幹細胞又は黒色腫幹細胞である。

本開示はまた本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーを含む診断剤も提供する。

一例では、診断剤は検出可能な標識に結合させた本開示のＲＮＡアプタマーを含む。

本発明のアプタマーは非特異的な抗体結合に関連し得る合併症を回避するので、優れたシグナル対ノイズの比を提供することが当業者によって理解される。

一例では、本明細書で記載されるような診断剤を用いて生体内又は試験管内にてＣＤ１３３を発現している癌幹細胞を検出する。

一例では、本開示のＲＮＡアプタマーを診断上用いて、対象において又は腫瘍を有する若しくは腫瘍を有することが疑われる対象から得られた生物試料においてＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞の存在を検出することができる。検出可能な標識にアプタマーを結合させることによって検出を円滑にすることができる。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、高電子密度標識、ＭＲＩ用の標識及び放射性物質が挙げられる。

本開示はまた、生物試料の組織検査にて使用するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は本明細書で記載されるような診断剤も提供する。組織標本を調製する方法は当業者によく知られているであろう。

本開示はまた、本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーを含む抗癌剤も提供する。

一例では、抗癌剤はある部分に結合させた本開示のＲＮＡアプタマーを含む。

一例では、本明細書で記載されるような抗癌剤を用いて対象における癌を治療する。一例では、対象は本開示のＲＮＡアプタマーによる治療から利益を受けるものである。別の例では、対象は癌を有すると診断されているものである。さらなる例では、対象は、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、黒色腫又はＣＤ１３３^＋細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有するものである。

本開示のアプタマーをある部分に結合させることができ、アプタマーを用いてＣＤ１３３を発現している癌幹細胞を含む又は含むことが疑われる腫瘍の部位にその部分を向かわせることができる。部分の例には、癌幹細胞を殺傷するのに使用することができる毒素、放射性核種又は化学療法剤、又はＣＤ１３３を発現している細胞を含む腫瘍の位置取りをする若しくは寸法決めをするのに使用することができる造影剤が挙げられる。

本開示のＲＮＡアプタマー含む抗癌剤はさらに１以上の有効成分を含むことができる。

本開示はまた、対象から得られた生物試料からＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞を単離する、精製する又は濃縮する方法を提供し、該方法は、本開示のＲＮＡアプタマー又は本開示の診断剤に細胞を接触させるステップを含む。一例では、方法は試験管内で実施される。

ＣＤ１３３を発現している細胞を単離する、精製する又は濃縮する方法は当業者に既知であり、本明細書のどこかでも記載される。

本開示はまた、対象にて又は癌を有する若しくは癌を有すると疑われる対象から得られる生物試料にてＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞を特定する方法も提供し、該方法は、本開示の単離されたＲＮＡアプタマー又は本開示の診断剤に細胞を接触させるステップを含む。

本開示はまた、本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は本明細書で記載されるような抗癌剤を対象に提供するステップを含む、対象にて癌を治療する又は予防する方法も提供する。

一例では、癌は、ＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞が存在する又は存在することが疑われる癌である。別の例では、対象は癌を有すると診断されているものである。さらなる例では、対象は、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、黒色腫又はＣＤ１３３^＋細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有するものである。

本開示はまた、薬物での本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は抗癌剤の使用にも関する。

本開示はまた、対象にて癌を治療する又は予防することにおける本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は抗癌剤の使用にも関する。

本開示はまた、対象にて癌を治療する又は予防するための薬物の製造における本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は抗癌剤の使用にも関する。

本発明はまた、ｓｉＲＮＡ又はリボザイムに結合させた本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマーを含む送達剤にも関する。

本開示はまた、薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤と一緒に、治療上有効な量の本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー、抗癌剤又は送達剤を含む組成物も提供する。

本開示はまた、腫瘍の分子イメージングで使用するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は本明細書で記載されるような診断剤も提供する。

本発明のＲＮＡアプタマーの腫瘍浸透能は腫瘍の分子イメージングについて抗体を超える明瞭な利点を提供する。たとえば、ＣＤ１３３を発現している細胞を持っている腫瘍の検出及びイメージングを円滑にする剤にＲＮＡアプタマーを結合することができる。好適な剤の例には本明細書で記載されるような検出標識が挙げられる。

本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー、診断剤、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は単独で、又は他の治療手段と併用で使用され得る。たとえば、ＲＮＡアプタマー、診断剤、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は、化学療法及び／又は放射線療法との併用で使用され得る。理論によって束縛されることを望まないが、化学療法剤又は放射線療法剤は、通常癌幹細胞の子孫細胞である迅速に分割している細胞を第一に標的とすることによって腫瘍を小さくするのに使用することができると仮定されている。診断剤を使用して前の治療手段の有効性を判定し、腫瘍における癌幹細胞の存在又は非存在を検出することによって癌幹細胞を排除することができる。次いで本開示のＲＮＡアプタマーを含有する抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を腫瘍の部位に投与して癌幹細胞を特異的に枯渇させることができる。従って、ＲＮＡアプタマーを含有する抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を化学療法若しくは放射線療法と一緒に、又は化学療法若しくは放射線療法の治療に続いて用いることができる。癌幹細胞に存在する抗原を標的とする１以上の追加のアプタマーと本開示のＲＮＡアプタマーを併用することができることも企図される。

本開示の各例は、対象にて癌を治療する、予防する又は改善する方法に準用されるように解釈されるべきである。

本開示の各例は、腫瘍の分子イメージングに準用されるように解釈されるべきである。

ＲＮＡアプタマーの配列を示す図である。ＣＤ１３３−１−２−２と名付けられた１５量体のＣＤ１３３ＲＮＡアプタマー（配列番号１）及びＣＤ１３３−１−２と名付けられた１９量体のＣＤ１３３ＲＮＡアプタマー（配列番号６）。塩基の修飾：２’−Ｆ−ピリジンＲＮＡ、シチジン（Ｃ）及びウリジン（Ｕ）は２’−Ｆ修飾されている（図での下線を参照）。ヌクレアーゼ消化からそれを保護するためのＩＤＴ−３’。ＲＮＡのＨＰＬＣ等級の精製、合成後：２’−脱保護／脱塩。 試験管内選択法（ＳＥＬＥＸ）を用いたＣＤ１３３アプタマーの単離。（Ａ）ＣＤ１３３を形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して繰り返し行ったＳＥＬＥＸに由来するＦＩＴＣ標識したアプタマーのフローサイトメトリー結合解析を示す図である。各回のフルオレセイン標識したＲＮＡを３７℃にて３０分間標的細胞と共にインキュベートし、その後、フローサイトメトリー解析を行った。（Ｂ）各回の結合は、未選択ライブラリＲＮＡの標的細胞への結合の平均蛍光強度並びに陰性対照細胞への結合平均蛍光強度を差し引いた後、算出した。Ｒ、ＳＥＬＥＸサイクルにおける回数；Ｒ、未選択の無作為ライブラリ。 ＣＤ１３３アプタマーの切り詰めクローンの相互作用についての平衡解離定数（ＫＤ）の決定を示す図である。５×１０^５個の細胞／ｍＬの細胞濃度での種々の濃度のＣＤ１３３アプタマー（１〜２００ｎＭ）における代表的な結合曲線。（Ａ）ＨＴ−２９細胞、（Ｂ）Ｈｅｐ３Ｂ細胞、（Ｃ）Ｔ９８Ｇ細胞、（Ｄ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞。 ＣＤ１３３アプタマーの切り詰めを示す図である。（Ａ）合計４回連続してＣＤ１３３−１を切り詰めた。（ｉ）ＣＤ１３３−１；（ｉｉ）：ＣＤ１３３−１−１、（ｉｉｉ）：ＣＤ１３３−１−２、（ｉｖ）：ＣＤ１３３−１−２−１、（ｖ）：ＣＤ１３３−１−２−２）。（Ｂ）（ｉ）ＣＤ１３３−２を１回切り詰めた：（ｉｉ）ＣＤ１３３−２−１。 ＣＤ１３３アプタマーはＣＤ１３３陽性細胞への結合に続いてエンドサイトーシスにより取り込まれたが、ＣＤ１３３陰性細胞では取り込まれなかった。ＤＹ６４７標識したＣＤ１３３アプタマーを示した癌細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いてイメージングした。パネルの各対について光学（位相）画像は上にあり、蛍光画像は下にある。ＨＴ−２９及びＨｅｐ３ＢはそれぞれＣＤ１３３を発現しているヒトの結腸及び肝臓の癌細胞である。Ｔ９８ＧはＣＤ１３３を発現していないヒトの神経膠腫細胞である。ＨＥＫ２９３ＴはＣＤ１３３を発現していないヒトの非腫瘍細胞株である。尺度線は２０μｍ。 ＣＤ１３３アプタマーはＣＤ１３３陽性細胞への結合に続いてエンドサイトーシスにより取り込まれたが、ＣＤ１３３陰性細胞では取り込まれなかった。エンドサイトーシスを停止させる処理（カリウムの枯渇）の後、アプタマーはもはや細胞に入らず、代わりに細胞表面にとどまる（粒子パターンではなく環構造を形成する）。トランスフェリンを陽性対照として用いてトランスフェリンのエンドサイトーシスを止める処理の有効性を示す。ＨＴ−２９：結腸癌細胞株、Ｈｅｐ３Ｂ：ヒト肝臓癌細胞株。ＤＹ６４７標識したＣＤ１３３アプタマーを示した癌細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いてイメージングした。パネルの各対について光学（位相）画像は上にあり、蛍光画像は下にある。尺度線は２０μｍ。 ＣＤ１３３ＲＮＡアプタマーはＣＤ１３３抗体（ＡＣ１３３）よりもはるかに良好に腫瘍の塊に浸透する。ＣＤ１３３^＋のヒト結腸癌細胞（ＨＴ−２９）及びＣＤ１３３⁻のヒト腎臓上皮（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）及び表皮増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５０μｇ／ｍｌ）及びＢ２７（１００単位／ｍｌ）によって補完された無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にて培養し、腫瘍塊の形成を可能にした。腫瘍塊が３００μｍのサイズに達したら、腫瘍塊を１００ｎＭのＤｙ６４７標識したＣＤ１３３ＲＮＡアプタマー、又は対照アプタマー、並びに等濃度のＰＥ−ＣＤ１３３抗体（ＡＣ１３３）と共に別々に４時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて腫瘍塊をイメージングした。２つのコア（真ん中）の切片を示した。

配列表への手がかり
配列番号１：ＣＤ１３３−２−２アプタマー（１５量体）の配列である
配列番号２：ＣＤ１３３−１アプタマー（８１量体）の配列である
配列番号３：ＣＤ１３３−１−１アプタマー（５８量体）の配列である
配列番号４：ＣＤ１３３−１−２アプタマー（３５量体）の配列である
配列番号５：ＣＤ１３３−１−２−１アプタマー（２１量体）の配列である
配列番号６：ＣＤ１３３−２−１アプタマー（１９量体）の配列である
配列番号７：コンセンサスＣＤ１３３アプタマー配列（１５量体）である
配列番号８：ＣＤ１３３−２アプタマー（８５量体）の配列である。

一般的な技法及び選択された定義
用語「及び／又は」、たとえば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味し、双方の意味又はいずれかの意味について明白な支持を提供するように理解されるべきである。

本明細書に含まれている文書、法令、物質、装置、物品等の考察は、これらの事項のいずれか又はすべてが、本出願の各クレームの優先日の前に存在したので従来技術の基礎の一部を形成する又は本開示に関連する分野における共通する一般的な知識であったという承認として解釈されるべきではない。

本明細書の全体を通して、別段具体的に述べられない又は文脈が別段要求しない限り、単一の工程、物資の組成物、工程の群又は物資の組成物の群は、１つの及び複数の（すなわち、１以上の）これらの工程、物資の組成物、工程の群又は物資の組成物の群を包含するように解釈されるべきである。

本明細書で記載される各例は、別段特に言及されない限り、本開示の他の例のそれぞれ及びすべてに準用されるべきである。

当業者は本開示が具体的に記載されたもの以外の変化及び改変の影響を受け易いことを十分に理解するであろう。本開示はそのような変化及び改変を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書で個々に又はまとめて引用される又は示される工程、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びに当該工程又は特徴の組み合わせのいずれか及びすべて又はいずれか２以上も含む。

本開示は、本明細書で記載される特定の例によって範囲が限定されるべきではなく、例示のみの目的を対象とする。機能的に同等の生成物、組成物及び方法は明らかに本開示の範囲内である。

本開示は、別段指示されない限り、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、細胞生物学及び免疫学の従来の技法を用いて、過度の実験を行わずに実施される。そのような手順は、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，第２版（１９８９），Ｉ，ＩＩ，及びＩＩＩの全巻；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ及びＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて，及びその中でのＧａｉｔによる論文のｐｐｌ−２２；Ａｔｋｉｎｓｏｎら、ｐｐ３５−８１；Ｓｐｒｏａｔら、ｐｐ８３−１１５；及びＷｕら、ｐｐ１３５−１５１；４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，本文すべて；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ及びＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），全シリーズ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．，Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３：３３６−３４２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９）ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編），第２巻，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｎ ｉｎ Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅｎ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｕｌｅｒ，Ｅ．編），第１５巻，第４版，Ｐａｒｔｓ １及び２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．２５，４４９−４７４；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；並びにＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，第３版（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ編，２０００），ＩＳＢＮ０１９９６３７９７０，本文すべて、にて記載されている。

本明細書の全体を通して、文脈が別段要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、言及される工程又は要素又は整数又は工程の群又は要素の群又は整数の群の包含を暗示するが、他の工程又は要素又は整数又は工程の群又は要素の群又は整数の群の排除を暗示しないように理解されるであろう。

用語「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」又は「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、事項の方法、過程又は組成が引用された工程及び／又は成分を有し、追加の工程又は成分を有さないことを意味するように理解されるべきである。

用語「約」は本明細書で使用されるとき、重量、時間、用量等の量のような測定可能な値を指す場合、特定される量からの±２０％、又は±１０％、さらに好ましくは±５％、一層さらに好ましくは±１％、その上さらに好ましくは±０．１％の変動を、そのような変動が開示される方法を実施するのに適当であるため、包含することが意味される。

用語「アプタマー」は本明細書で使用されるとき一般に、単一の定義された配列のオリゴヌクレオチド又は当該オリゴヌクレオチドの混合物のいずれかを指し、その際、混合物はＣＤ１３３に特異的に結合する特性を保持する。本明細書で使用されるとき、「アプタマー」は一本鎖核酸を指す。構造的に、本開示のアプタマーは特異的に結合するオリゴヌクレオチドである。

用語「オリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボース又はその修飾された形態を含有する）、すなわち、ＤＮＡ、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボース又はその修飾された形態を含有する）、すなわち、ＲＮＡ、及びプリン若しくはピリミジン塩基又は修飾されたプリン若しくはピリミジン塩基のＮ−グリコシド若しくはＣ−グリコシドである他の種類のポリヌクレオチド若しくは脱塩基ヌクレオチドに対して一般的である。本開示によれば、用語「オリゴヌクレオチド」には、従来の塩基、糖残基及びヌクレオチド間結合を伴うものだけでなく、これら３つの部分のいずれか又はすべての修飾を含有するものも含まれる。

用語「ＲＮＡアプタマー」は本明細書で使用されるとき、リボヌクレオチド単位を含むアプタマーである。ＲＮＡアプタマーは本明細書で定義されるようなＲＮＡ類似体も包含することが意味される。

本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」及び「結合活性」は標的に結合する又は結合しないリガンド分子／アプタマーの傾向を指すように意図され、標的に結合するリガンド分子／アプタマーの結合又は親和性の強度の測定を表す。当該相互作用のエネルギー論は、それらが相互作用する相手の必要な濃度、それらの相手が会合するのが可能である速度及び溶液における結合した分子と遊離の分子の相対的な濃度を定義するので、「結合活性」及び「結合親和性」にて有意である。エネルギー論は本明細書では、とりわけ、解離定数Ｋ_ｄの決定を介して特徴づけられる。当該技術で知られるように低い解離定数は、互いに対する分子のより強い結合及び親和性を示す。一例では、解離定数は少なくとも１０^−６Ｍである。別の例では、解離定数は少なくとも１０^−８Ｍ及び１０^−９Ｍである。

本明細書で使用されるとき、用語「生物試料」は対象に由来する細胞又は細胞の集団又は若干の組織又は体液を指す。ほとんどの場合、試料は対象から取り出されているが、用語「生物試料」は生体内で分析される、すなわち、対象から取り出すことのない細胞又は組織も指すことができる。多くの場合、「生物試料」は対象に由来する細胞を含有するが、用語は、遺伝子の発現レベルを測定するのに使用することができる、たとえば、血液、唾液又は尿の非細胞性分画のような非細胞性の生物物質も指すことができる。生物試料には、組織生検、針生検、擦り取り（たとえば、頬擦り取り）、全血、血漿、血清、リンパ、骨髄、尿、唾液、痰、細胞培養物、胸膜液、心膜液、腹水液又は脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。生物試料は組織生検及び細胞培養物も含む。生物試料又は組織試料は、たとえば、血液、血漿、血清、腫瘍生検、尿、糞便、痰、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚の外区分、呼吸器、腸管及び尿生殖管、涙液、唾液、乳、細胞（血液細胞を含むが、これらに限定されない）、腫瘍、臓器及び試験管内細胞培養成分の試料を含む個体から単離された組織又は流体の試料を指すことができる。一部の実施形態では、試料は、原発腫瘍若しくは転移腫瘍の切除、気管支鏡生検若しくはコア針生検、又は胸膜液の細胞塊に由来する。加えて、穿刺吸引試料も使用することができる。試料は、パラフィン包埋組織又は凍結組織であり得る。試料は、対象から細胞の試料を取り出すことによって得ることができるが、（たとえば、別の人によって単離された）あらかじめ単離された細胞を使用することによって又は生体内で本発明の方法を実施することによって得ることもできる。

用語「に結合する」は本明細書で使用されるとき、ＲＮＡアプタマーが本明細書で記載されるような検出剤、部分、ｓｉＲＮＡ又はリボザイムにつなげられる、連結される又は接合されるいずれかの構成を包含するように意図される。結合を達成する方法は当業者に知られるであろうし、それにはペプチドリンカーを介した、又は鎖全体としてのＲＮＡと剤（たとえば、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム）の直接的な化学合成による結合、連結が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「単離される」は本明細書で使用されるとき、他の成分から単離可能な又は精製されるＲＮＡアプタマー又は幹細胞（たとえば、癌幹細胞）を指すように意図される。単離された細胞は天然に存在し得る環境に由来する細胞を指す。単離された細胞は天然で得られた状態に比べて任意の程度に精製され得る。

用語「リガンド」は本明細書で使用されるとき、標的に結合する能力を有する分子又は他の化学実体を指す。リガンドは、ペプチド、オリゴマー、核酸（たとえば、アプタマー）、小分子（たとえば、化合物）、抗体又はその断片、核酸タンパク質融合体、及び／又は他の親和剤を含むことができる。従って、リガンドは、ライブラリ、特にコンビナトリアルライブラリ、たとえば、本明細書で以下に開示されるようなアプタマーライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、又は本明細書の開示を概観したのち当業者に明らかになるであろう他のライブラリを含む任意の供給源に由来することができる。

用語「修飾されたＲＮＡアプタマー」は本明細書で使用されるとき、単位としてのリボヌクレオチドを含有することに加えて、以下：２’−デオキシ、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、２’−アミノ（好ましくは、非置換の、又は１置換された又は２置換された）、２’−モノ−、ジ−又はトリ−ハロメチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−ハロ−置換されたアルキル、２’−アルキル、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル、メチルホスホネート、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６位にてイオウで置換された又は５位にてハロ若しくはＣ_１５アルキル基で置換された２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン及びピリミジン塩基、脱塩基リンカー、３’−デオキシ−アデノシン並びに他の利用可能な「鎖ターミネータ」又は「非伸長」類似体（ＲＮＡの３’末端にて）又は^３２Ｐ、^３３Ｐ等のような標識の少なくとも１つも含有する高分子を指すことを意味する。上述のすべては、本明細書で開示される標準の合成法を用いてＲＮＡに組み入れることができる。

本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な量」は、ＣＤ１３３を発現している癌幹細胞の数及び／又は癌の１以上の症状を減らす又は抑制するのに十分な、本開示に係るＲＮＡアプタマー、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物の量を意味するように解釈されるべきである。技量のある熟練者は、そのような量は、たとえば、特定の対象及び／又は疾患の種類若しくは重症度若しくはレベルに応じて変化するであろうことに気付くであろう。用語は本開示を特定の量のＲＮＡアプタマーに限定するようには解釈されない。

本明細書で使用されるとき、用語「治療する」又は「治療」又は「治療すること」は、治療上有効な量の本明細書で開示されるようなＲＮＡアプタマー、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を投与し、癌に関連する又は癌が原因となる臨床状態の少なくとも１つの症状を軽減する又は抑制することを意味するように理解されるべきである。

本明細書で使用されるとき、用語「予防する」又は「予防すること」又は「予防」は、治療上有効な量の本開示に係るＲＮＡアプタマー、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物を投与し、癌の少なくとも１つの症状の発症又は進行を止める又は妨げる又は遅らせることを意味するように解釈されるべきである。

本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」は、ＲＮＡアプタマーが、代わりの細胞又は物質よりも特定の細胞又は物質により長い時間及び／又はより大きな親和性でさらに頻繁に、さらに迅速に反応する又は会合することを意味するように解釈されるべきである。たとえば、標的タンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、無関係のタンパク質及び／又はそのエピトープ若しくは免疫原性の断片に結合するよりもより大きな親和性、結合力でさらに容易に及び／又はより長い時間そのタンパク質又はそのエピトープ若しくは免疫原性の断片に結合する。この定義を読むことによって、たとえば、第１の標的に特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、第２の標的に特異的に結合してもよいし、又は結合しなくてもよいことも理解される。よって、「特異的な結合」は、別の分子の排他的な結合又は検出できない結合を必ずしも必要としないので、これは用語「選択的結合」によって包含される。一般に、しかし、必ずではなく、結合への参照は特異的結合を意味する。結合の特異性は、一般に環境又は無関係な分子におけるアプタマー及び他の物質に関する解離定数と比べたときの標的に対するアプタマーの比較した解離定数（Ｋｄ）という点で定義される。通常、標的に関するアプタマーのＫｄは環境における標的と無関係な物質又は随伴物質に関するＫｄよりも２倍、５倍又は１０倍小さいであろう。一層さらに好ましくはＫｄは５０倍、１００倍又は２００倍小さいであろう。

用語「ＣＤ１３３^＋」又は「ＣＤ１３３を発現している細胞」は本明細書で使用されるとき、相互交換可能に使用され得る。用語は好適な手段によって検出することができるＣＤ１３３抗原の細胞表面での発現を包含する。一例では、所与のマーカーについて陽性である細胞に対する参照は、それが、マーカーが細胞表面に存在する程度に応じたそのマーカーの低（ｌｏ又はｄｉｍ）発現又は高（ｂｒｉｇｈｔ，ｂｒｉ）発現のいずれかであり得ることを意味し、用語は蛍光の強度に関する。

本明細書で使用されるとき、用語「対象」はヒト対象又は非ヒト対象を含む任意の対象を意味するように解釈されるべきである。非ヒト対象には、非ヒト霊長類、有蹄動物（ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛及びバイソン）、イヌ、ネコ、ウサギ目動物（ウサギ、野ウサギ、及びナキウサギ）、齧歯類動物（マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びジャービル）、鳥類及び魚類が挙げられ得る。一例では、対象はヒトである。

アプタマー
アプタマーの幾つかの独特の特性によってそれらは多種多様な分子生物学用途での使用及び潜在的な医薬剤としての使用で魅力的なツールになっている。第１に、ほとんどのアプタマーが高い親和性で標的に結合するということは、ピコモルからナノモルの範囲での典型的な解離定数を示す。アプタマーの結合部位には標的分子の割れ目及び溝が含まれ、多数の現在利用可能な医薬剤と非常に類似する拮抗活性を生じる。第２に、アプタマーは広い範囲の温度及び保存条件にわたって構造的に安定であり、その独特の三次構造を形成する能力を維持する。第３に、アプタマーは、モノクローナル抗体を作出するのに必要とされる高価で且つ作業の多い生物系とは対照的に化学的に合成することができる。

理論に束縛されることを望まないで、ＲＮＡアプタマーは一般に、その標的タンパク質へのＲＮＡアプタマーの理論的に高い親和性並びに修飾されていないＲＮＡよりも大きな、修飾されたＲＮＡの血漿安定性のために多数のグループによって好まれる。

本明細書で開示されるのは、ｓｉＲＮＡ又はリボザイム、化学療法剤、放射性同位元素、毒素及び／又は抗原を運ぶ他の剤の効果的な細胞内送達に使用することができるＣＤ１３３抗原に特異的に結合するＲＮＡアプタマー分子である。

アプタマーは、タンパク質又は小分子のような特定の標的分子に結合する一本鎖のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体である。従ってアプタマーは抗体に類似するオリゴヌクレオチドである。一般に、アプタマーは、これらの範囲に入る長さのオリゴヌクレオチドを従来の技法で調製することができるという点で、約１５〜約１００のヌクレオチド、好ましくは約１５〜約４０のヌクレオチド、さらに好ましくは約２０〜約４０のヌクレオチドを含む。任意でアプタマーはさらに、特異的な結合を達成するのに必要である最低およそ６ヌクレオチド、好ましくは１０、さらに好ましくは１４又は１５のヌクレオチドを含むことができる。標的が置かれる環境の面で適当な相互作用を得ることができるのであれば、１０より短い、たとえば、６量体の配列を含有する結合領域のアプタマーが実現可能である。従って、他の物質による干渉がほとんどないのであれば、求められる結合の特異性及び強度はさらに小さくてもよい。

アプタマーの結合は、アプタマーオリゴヌクレオチドによって形成される二次構造に大きく依存する。ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ（又は類似体）のアプタマーの双方が知られる。たとえば、Ｂｕｒｋｅら、（１９９６）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：６５０−６６６；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）．Ｎａｔｕｒｅ ３４６：８１８−２２；Ｈｉｒａｏら、（１９９８）．Ｍｏｌ Ｄｉｖｅｒｓ．４：７５−８９；Ｊａｅｇｅｒら、（１９９８）．ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１７：４５３５；Ｋｅｎｓｃｈら、（２０００）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７５：１８２７１−８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、（１９９５）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：９５９９−９６１０；並びにＵＳ５７７３５９８；ＵＳ６０２８１８６；ＵＳ６１１０９００；ＵＳ６１２７１１９；及びＵＳ６１７１７９５を参照のこと。

所与の標的についてのアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸ（商標）（試験管内選択法）と呼ばれる反復工程を用いて、事実上あらゆる特定の標的に結合するアプタマーを選択することができる。工程はたとえば、ＵＳ５２７０１６３及びＵＳ５４７５０９６に記載されている。ＳＥＬＥＸ（商標）法は、核酸が、種々の二次構造や三次構造を形成する十分な能力及びモノマーでもポリマーでもよい事実上あらゆる化合物とのリガンドとして作用する（すなわち、特異的な結合対を形成する）ようにそのモノマーの範囲内で利用可能な十分な化学的汎用性を有するという独特の見識に基づく。いずれのサイズまたは組成の分子も標的となり得る。

ＳＥＬＥＸ（商標）法は、出発点として無作為化された配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリ又はプールに依存する。オリゴヌクレオチドは修飾された又は未修飾のＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであることができる。一部の例では、プールは１００％無作為の又は部分的に無作為のオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは少なくとも１つの固定された配列及び／又は無作為化された配列内に組み入れられる保存された配列を含有する無作為な又は部分的に無作為なオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、少なくとも１つの固定された配列及び／又はオリゴヌクレオチドのプールにおける全分子によって共有される配列を含み得る５’末端及び／又は３’末端での保存された配列を含有する無作為な又は部分的に無作為なオリゴヌクレオチドを含む。固定された配列は、予備選択目的で組み入れられるプールにおけるオリゴヌクレオチドに共通する配列、たとえば、ＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのハイブリッド形成部位、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列（たとえば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７及びＳＰ６）、制限部位、又はホモポリマー配列、たとえば、ポリＡ若しくはポリＴ領域、触媒コア、アフィニティカラムへの選択的結合のための部位、及び対象オリゴヌクレオチドのクローニング及び／又は配列決定を円滑にする他の配列である。保存された配列は、同一標的に結合する多数のアプタマーによって共有される、前述の固定された配列以外の配列である。

プールのオリゴヌクレオチドは好ましくは効率的な増幅に必要な固定された配列並びに無作為化された配列部分を含む。通常、出発プールのオリゴヌクレオチドは３０〜５０の無作為ヌクレオチドの内部領域に隣接する固定された５’及び３’末端配列を含有する。無作為化されたヌクレオチドは、化学合成及び無作為に切断された細胞の核酸からのサイズ選択を含む多数の方法によって作製することができる。試験核酸における配列変異も選択／増幅の反復の前に又はその間で変異誘発によって導入することができ、又は増やすことができる。

オリゴヌクレオチドの無作為配列部分は、任意の長さであることができ、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾された又は非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むことができる（たとえば、ＵＳ５９５８６９１、ＵＳ５６６０９８５及び国際公開第９２／０７０６５号を参照）。無作為なオリゴヌクレオチドは、当該技術で周知の固相オリゴヌクレオチド合成法を用いてホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成することができる。たとえば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７及びＦｒｏｅｈｌｅｒら、（１９８６）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８を参照のこと。無作為なオリゴヌクレオチドは、たとえば、トリエステル合成法のような液相法を用いて合成することもできる。たとえば、Ｓｏｏｄら、（１９７７）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７及びＨｉｒｏｓｅら、（１９７８）．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９を参照のこと。自動ＤＮＡ合成装置で実施される典型的な合成によってほとんどのＳＥＬＥＸ（商標）実験に十分な数である１０^１４〜１０^１６の個々の分子が得られる。

オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはＤＮＡ合成機にて自動化学合成によって生成され得る。部分的に無作為な配列は各付加工程で異なるモル比にて４つのヌクレオチドを付加することによって創ることができる。

オリゴヌクレオチドの出発ライブラリはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。ＲＮＡライブラリが出発ライブラリとして使用されるべきである例では、それは通常、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又は修飾されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて試験管内でＤＮＡライブラリを転写することによって生成され、精製される。次いでＲＮＡ又はＤＮＡのライブラリが結合に好都合な条件下で標的と混合され、同一の一般的な選択スキームを用いて結合、分別及び増幅の段階的な反復に供され、結合親和性及び選択性の事実上あらゆる所望の基準を達成する。さらに具体的には、核酸の出発プールを含有する混合物で出発して、ＳＥＬＥＸ（商標）法には、（ａ）結合に好都合な条件下で混合物を標的と接触させる；（ｂ）標的分子に特異的に結合している核酸から未結合の核酸を分別する；（ｃ）核酸／標的の複合体を解離させる；（ｄ）核酸／標的の複合体から解離させた核酸を増幅してリガンドを濃縮した核酸の混合物を得る；及び（ｅ）結合、分別、解離及び増幅を所望なだけ多く再び繰り返して標的分子に対して高度に特異的な、親和性の高い核酸リガンドを得る工程が含まれる。ＲＮＡアプタマーが選択されている例では、ＳＥＬＥＸ（商標）法はさらに（ｉ）工程（ｄ）における増幅の前に核酸／標的の複合体から解離させた核酸を逆転写する；及び（ｉｉ）方法を再度始める前に工程（ｄ）からの増幅した核酸を転写する工程を含む。

選択及び増幅のサイクルは所望の目標が達成されるまで繰り返される。一般に、これは、サイクルの反復にて結合強度の有意な改善が達成されなくなるまでである。通常、核酸アプタマー分子は５〜２０サイクルの手順で選択される。

種々の核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られる。非ワトソン／クリック型の相互作用に含まれることが最も一般的に示されている構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称及び非対称のバルジ、偽ノット及びそれらの無数の組み合わせと見なされる。そのようなモチーフのほぼすべての知られる場合は、それらが３０以下のヌクレオチドの核酸配列で形成され得ることを示唆している。この理由で、隣接する無作為化された断片を伴うＳＥＬＥＸ（商標）法は、約２０〜約５０の間のヌクレオチドの無作為化した断片を含有する核酸配列と共に開始することが好まれることが多い。

主要のＳＥＬＥＸ（商標）法を改変して多数の特定の目的を達成している。たとえば、ＵＳ５７０７７９６は、屈曲ＤＮＡのような特定の構造的な特徴を持つ核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と併せたＳＥＬＥＸ（商標）を記載している。ＵＳ５７６３１７７は、標的分子に結合する及び／又は光架橋する及び／又はそれを光で不活化することが可能である光反応基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。ＵＳ５５６７５８８及びＵＳ５８６１２５４は、標的分子に対する高い親和性を有するオリゴヌクレオチドと低い親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間での分別を高い効率で達成するＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。ＵＳ５４９６９３８は、ＳＥＬＥＸ（商標）法を実施した後改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。ＵＳ５７０５３３７はリガンドのその標的に対する共有結合のための方法を記載している。

カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は１以上の非標的分子との交差反応性により核酸リガンド配列を排除することによって標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善する方法である。カウンターＳＥＬＥＸ（商標）は、（ａ）核酸の候補混合物を調製する；（ｂ）候補混合物を標的に接触させる、その際、候補混合物に比べて標的に対する高い親和性を有する核酸は候補混合物の残りから分別され得る；（ｃ）候補混合物の残りに由来する高い親和性の核酸を分別する；（ｄ）高い親和性の核酸を標的から解離させる；（ｅ）非標的分子に対して特定の親和性を持つ核酸リガンドが取り除かれるように高い親和性の核酸を１以上の非標的分子に接触させる；及び（ｆ）標的分子のみに対して高い親和性を持つ核酸を増幅して標的分子への結合について相対的に高い親和性と特異性を持つ核酸配列について濃縮された核酸の混合物を得る工程から構成される。ＳＥＬＥＸ（商標）について上述したように、選択及び増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで必要に応じて繰り返される。

代表的な例では、ＲＮＡアプタマーは、たとえば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２：１８５９−１８６２及びＳｉｎｈａら、（１９８４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、３：１５７−１７１によって記載されたもののような従来の技法を用いて固相支持体カラムにて合成される。最終的なＤＭＴ基は得られたＲＮＡアプタマーから取り外される。或いは、大規模合成が使用されるのであれば、ＲＮＡアプタマーは固相支持体法の規模拡大によって作製することができ、又は特に所望の最終生成物が相対的に短いオリゴヌクレオチドである場合、ＲＮＡアプタマーは液相法を用いて作製することができる。合成法の出発物質は、５’非トリチル化のＲＮＡオリゴリボヌクレオチド又は所望の一次構造の類似体であることができ、それは好ましくは保護された塩基を有することができ、好ましくは固相支持体に結合される。いずれの従来使用される保護基が使用され得る。通常、Ｎ_６−ベンゾイルがアデニンに、Ｎ_４−ベンゾイルがシトシンに、Ｎ_２−イソブチリルがグアニンに、Ｎ_２−ベンゾイルが２−アミノプリンに使用される。他の有用な保護基にはフェノキシアセチル（ＰＡＣ）及びｔ−ブトキシアセチル（ＴＡＣ）が挙げられる。便宜上、ＲＮＡアプタマーの合成には塩基にさらに不安定な保護基が使用されるべきであり、当業者はこれらの基を知っている。そのような基は、塩基性条件下では一般に全く安定であるが、一部の加水分解に供され得る生成されたトリホスホネート又はジホスホネートの加水分解を防ぐのに役立つことができる。他の想定される修飾は米国特許第６，０１１，０２０号にて開示されており、それらには、ＰＥＧ又はコレステロールのような生体利用効率を高める分子の共有結合を介した取り込みが挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、たとえば、２’−デオキシ、２’−ハロ、２’−アミノ（非置換の、又は１置換された又は２置換された）、２’−モノ−、ジ−又はトリ−ハロメチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−ハロ−置換されたアルキル、２’−アルキル、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル、メチルホスホネート、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６位にてイオウで置換された又は５位にてハロ若しくはＣ_１-５アルキル基で置換された２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン及びピリミジン塩基、脱塩基リンカー、３’−デオキシ−アデノシン並びに他の利用可能な「鎖ターミネータ」又は「非伸長」類似体（ＲＮＡの３’末端にて）等のようなヌクレオシド類似体をＲＮＡ合成の間に取り込むことができる。さらに、^３２Ｐ、^３３Ｐ等のような種々の標識を同様に合成の間に取り込むことができ、この方法によって新規のＲＮＡ類似体を生じることができる。他の想定される修飾は米国特許第６，００１，０２０号に開示されており、それには、逆位ＤＴキャップ又は逆位脱塩基キャップ又はそれらの組み合わせのような３’キャップの取り込みが挙げられるが、これらに限定されない。

アプタマーの結合親和性
結合親和性は互いに対する分子の結合又は親和性の強さの測定を表す。標的及び他の分子に関する本明細書のアプタマーの結合親和性はＫ_ｄという点で定義される。解離定数は、当該技術で既知の方法によって決定することができ、たとえば、Ｃａｃｅｃｉ，Ｍら、Ｂｙｔｅ（１９８４）９：３４０−３６２にて述べられたもののような方法によって複合体混合物についてさえ計算することができる。解離定数を測定する例は、たとえば、表面プラスモン共鳴分析を記載しているＵＳ７６０２４９５；ＵＳ６５６２６２７、ＵＳ６５６２６２７及びＵＳ２０１２／００４４５８４９にて記載されている。別の例では、Ｋ_ｄは、Ｗｏｎｇ及びＬｏｈｍａｎ，（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０，５４２８−５４３２によって開示されたもののような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて確定される。

しかしながら、一部の小さなオリゴヌクレオチドについてＫ_ｄの直接的な決定は困難であり、誤解されやすい高い結果をもたらし得ることが認められている。これらの状況下で、標的又は候補を結合することが知られている物質に関して標的分子又は他の候補物質についての競合結合アッセイを実施することができる。５０％阻害が起きる（Ｋ_ｉ）濃度の値が理想的な条件下ではＫ_ｄと同等である。しかしながら、いかなる場合もＫ_ｉはＫ_ｄより小さくない。従って、Ｋ_ｉの決定は、別の方法ではＫ_ｄの値について最大値を設定する。技術的な困難さがＫ_ｄの正確な測定を不可能にするそれらの状況下では、Ｋ_ｉの測定を好都合に置き換えてＫ_ｄの上限を提供することができる。Ｋ_ｉ値は本開示のアプタマーが標的を結合することを確認するのにも使用することができる。

アプタマーの安定性を改善すること
ホスホジエステル形態でのオリゴヌクレオチドが所望の効果の前に、たとえば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外の酵素によって体液中で迅速に分解され得るという点で治療剤として核酸を使用することにて遭遇する可能性のある課題の１つが明らかになる。本開示はまた、本明細書で記載されるようなＲＮＡ類似体及び／又はヌクレアーゼ消化からの保護のようなＲＮＡアプタマーの１以上の特徴を改善するように設計された追加の修飾も含む。

本開示で企図されるオリゴヌクレオチドの修飾には、追加の電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用、及び核酸リガンド塩基又は全体としての核酸リガンドに対する流動性を取り込む他の化学基を提供するものが挙げられるが、これらに限定されない。

ヌクレアーゼに耐性であるオリゴヌクレオチドを生成する修飾には、１以上の置換ヌクレオチド間結合、改変された糖、改変された塩基、又はそれらの組み合わせも挙げることができる。そのような修飾には、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾、８位のプリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５ブロモ又は５−ヨード−ウラシルの置換、骨格の修飾、ホスホロチオエート又はリン酸アルキル修飾、メチル化、並びにイソ塩基イソシチジン及びイソグアノシンのような稀な塩基の対合組み合わせ；キャッピングのような３’及び５’修飾；高分子量の非免疫原性化合物への結合；親油性化合物への結合；及びリン酸骨格修飾が挙げられる。

一例では、本開示のアプタマーに結合される非免疫原性の高分子量化合物はポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。一例では、骨格修飾はリン酸骨格への１以上のホスホロチオエートの取り込みを含む。別の例では、本開示のアプタマーはリン酸骨格への１０未満の、６未満の又は３未満のホスホロチオエートの取り込みを含む。

アプタマーの有用性
本開示のＲＮＡアプタマー分子を親和性リガンドとして用いて標的分子（たとえば、ＣＤ１３３を持っている癌幹細胞）を分離し、精製することができ、プローブとして用いて標的分子（たとえば、ＣＤ１３３を持っている癌幹細胞）を追跡し、モニターし、検出し、定量することができ、又は生理的に関連する反応を阻止し、許容し、活性化し、若しくは触媒して治療効果を達成することができる。それらは、医薬剤として作用し、特定の標的に結合し、特定の分子を所望の部位に向かわせることができる。

本開示のＲＮＡアプタマー分子を試験管内の工程、たとえば、アフィニティ精製混合物で用いて標的分子（たとえば、ＣＤ１３３を持っている癌幹細胞）を精製することができる。アプタマーは、混入物からの標的分子（たとえば、ＣＤ１３３を持っている癌幹細胞）のクロマトグラフィ分離にとって及び細胞培養物又は細胞抽出物からの標的分子の精製にとって理想的である。

一例では、本開示のＲＮＡアプタマー分子を捕捉剤として用いて標的（たとえば、ＣＤ１３３を持っている癌幹細胞）を固相支持体に不動化することができる。固相支持体は、一般にフィルター、ウエハー、ウエハーチップ、膜及び薄膜に関連する構造及び組成を有する基材から構成され得る。しかしながら、固相支持体は、診断、検出又は定量の試験のための試薬を捕捉する若しくは不動化するための樹脂、アフィニティ樹脂、磁気ビーズ又はポリマービーズ、又は診断検出試薬を含む基材から構成され得ることが企図される。

固相支持体は、ガラス、鋼鉄のような金属の表面及び素材、セラミック素材又はポリマー素材、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド及びフッ化ポリビニリデン等、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない所望の用途に応じたいずれの素材を含み得る。

ＣＤ１３３抗原
元々ＡＣ１３３として知られるＣＤ１３３は糖タンパク質（プロミニン１としても知られる）である。それは細胞突起物に特に局在する５回膜貫通糖タンパク質の一員である。ＣＤ１３３は造血幹細胞、内皮前駆細胞、膠芽細胞腫、神経及び神経膠幹細胞、カリエス小児脳腫瘍、並びに成人の腎臓、乳腺、気管、唾液腺、胎盤、消化管、精巣及び他の細胞種にて発現される。

ＣＤ１３３を発現している癌幹細胞の単離及び精製
幹細胞の分化による成人の細胞の再生の最も良く知られた例は造血系である。造血幹細胞及び前駆細胞のような発生上未成熟な前駆細胞は、分子シグナルに応答して種々の種類の血液細胞及びリンパ系細胞を徐々に形成する。幹細胞は上皮組織及び間葉組織を含む他の組織でも見いだされる。癌幹細胞は、たとえば、正常な幹細胞における遺伝的な損傷の結果として又は幹細胞及び／又は分化した細胞の調節不能な増殖によってこれらの細胞種のいずれかから生じ得る。

癌幹細胞は、腫瘍形成性の幹細胞、すなわち、広範に又は無制限に増殖する能力を有し、癌細胞の大半を生み出す細胞を含む癌に由来し得る。根付いた腫瘍の中では、ほとんどの細胞は広範に増殖する能力を失っており、新しい腫瘍を形成し、小さなサブセットの癌幹細胞が増殖し、それによって癌幹細胞を再生すると共に腫瘍形成能を欠く腫瘍細胞を生み出す。癌幹細胞は非対称性に及び対称性に分割し、増殖の変わりやすい速度を示し得る。癌幹細胞には、一時的な増幅細胞又は幹細胞特性を再獲得している前駆細胞が含まれ得る。

幹細胞が単離され得る代表的な癌には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、滑膜腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支癌腫、腎細胞癌腫、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウイルムズ腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽腫を含む固形腫瘍を特徴とする癌が挙げられる。

本開示に従って幹細胞を単離する又は濃縮することができる追加の代表的な癌には、悪性度の低い／濾胞状非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中程度の悪性度の／濾胞状ＮＨＬ、中程度の悪性度のびまん性ＮＨＬ、悪性度の高い免疫芽球性ＮＨＬ、悪性度の高い非切断小細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ及びワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、慢性白血球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、単球性白血病、骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含むＢ細胞リンパ腫及び白血病のような造血系の悪性腫瘍が挙げられる。

ＣＤ１３３を持っている癌幹細胞は本明細書で記載されるようなアプタマー分子を用いて選択され得る。たとえば、蛍光色素に結合しているアプタマーを癌幹細胞の陽性選択に使用することができる。ＣＤ１３３は幾つかの正常細胞で発現されることも知られる。しかしながら、ＣＤ１３３の発現は癌幹細胞にて上方調節されると考えられる。癌幹細胞のマーカーは通常、同じ起源の分化した細胞又は非腫瘍形成性の細胞よりも少なくとも約５倍大きい、たとえば、少なくとも約１０倍大きい、又は少なくとも約１５倍大きい、又は少なくとも約２０倍大きい、又は少なくとも約５０倍大きい、又は少なくとも約１００倍大きいレベルで発現される。選択工程には、集団にて癌幹細胞ではない癌細胞の排除に使用することができる陰性選択マーカーも含まれ得る。

本開示を実施することにおいてＣＤ１３３を持っている細胞の分離は多数の異なる方法によって達成することができることが理解されるであろう。たとえば、本開示のＲＮＡアプタマーは固相支持体に連結されて粗分離を可能にし得る。分離の効率、関連する細胞傷害性、性能の容易さと速度、及び最新の機器及び／又は技術的技量の必要性に応じて異なる有効性の種々の技法が採用され得る。単離又は精製のための手順には、アプタマーをコーティングした磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティクロマトグラフィ及び固相マトリクスに連結したアプタマーによる「パンニング」が挙げられるが、これらに限定されない。正確な単離又は精製のための技法にはＦＡＣＳが挙げられるが、これに限定されない。ＦＡＣＳを準備する方法は技量のある熟練者には明らかであろう。

ＣＤ１３３を発現している癌幹細胞の濃縮
一例では、本開示のＲＮＡアプタマー分子を対象から得られた生物試料から濃縮する。通常、対象は癌幹細胞を含有する腫瘍を有する又は腫瘍を有することが疑われるものであろう。用語「濃縮された」又は「濃縮」又はその変形は、特定の種類の細胞（すなわち、癌幹細胞）の比率が未処理の細胞の集団（たとえば、試料中の細胞）に比べたとき高い細胞の集団を表すのに本明細書では使用される。

一例では、癌幹細胞を濃縮した集団は、少なくとも約０．１％、又は０．５％又は１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％又は２５％又は３０％又は５０％又は７５％のＣＤ１３３を持っている癌幹細胞を含む。この点で、用語「癌幹細胞を含む濃縮された細胞集団」は、「用語Ｘ％の癌幹細胞を含む細胞の集団に対して明白な支持を提供するように解釈され、その際、Ｘ％は本明細書で引用されるようなパーセンテージである。

一例では、細胞の集団は選択可能な形態でＣＤ１３３^＋細胞を含む細胞調製物から濃縮される。この点で、用語「選択可能な形態」は、細胞がＣＤ１３３を持っている細胞の選択を可能にするマーカー（たとえば、細胞表面マーカー）を発現していることを意味するように理解されるであろう。

アプタマー分子を用いた癌の診断
本開示のＲＮＡアプタマー分子を診断目的で試験管内にて用いて悪性腫瘍組織における癌幹細胞の存在を判定することができる。方法にはＣＤ１３３^＋癌幹細胞の存在について生物試料を調べることが関与する。たとえば、生物試料を本開示の標識したＲＮＡアプタマーと接触させ、試料における細胞に特異的に結合するＲＮＡアプタマーの能力を決定することができる。結合はＣＤ１３３を持っている癌幹細胞の存在を指し示す。本開示のＲＮＡアプタマーを用いて、検出可能なシグナルを与えるレポーター基で標識されている本開示の単離されたＲＮＡアプタマーを対象に投与することによって生体内で腫瘍を限局することもできる。次いでフローサイトメトリー、顕微鏡、外部シンチグラフィ、放射断層撮影、光学的イメージング又は放射性核種走査を用いて結合したアプタマーを検出することができる。方法を用いて疾患の程度に関して対象にて癌の病期分類を行い、治療法に応答した変化をモニターすることができる。

ＲＮＡアプタマーを検出可能な標識に結合することによって癌幹細胞の検出を円滑にすることができる。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、高電子密度標識、ＭＲＩ用の標識及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例にはストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質には、ウンベリフォン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、又はフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例にはルミノールが挙げられる。生物発光物質の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、好適な放射性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^９４ｍＴｃ、^１２４Ｉ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^６８Ｇａ、^８６Ｙ、^８２Ｒｂ又は^３Ｈが挙げられる。

たとえば、クレノウポリメラーゼ用いた鋳型伸長によって、Ｔ４ＲＮＡリガーゼが介在する連結によって、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによってアプタマーの３’末端での標識を達成することができる。そのチオールが次いでビオチンを結合するのに用いられる過剰のＧＴＰ−β−Ｓと共に試験管内の転写ミックス補完することによって５’末端での標識を達成することができる。加えて、５’又は３’末端のいずれかへの好適な基の直接的な化学結合を用いてアプタマーを標識することができる。

本開示の抗癌剤
本開示のＲＮＡアプタマー分子をある部分に結合させて使用し、その部分をＣＤ１３３^＋細胞、好ましくは癌幹細胞に向かわせることができる。部分の例には、癌幹細胞を殺傷するのに使用することができる毒素、放射性核種又は化学療法剤が挙げられる。

部分と化学的に合成されるアプタマーによって、又は別に作製されたアプタマーと部分を連結するのに使用される結合、たとえば、非ペプチド共有結合、たとえば、非アミド結合によって、ＲＮＡアプタマーを部分、たとえば、毒素に融合することができる。或いは、ＲＮＡアプタマーと部分が好適なリンカーペプチドのおかげで連結され得る。

有用な毒素分子には、細胞内に存在する場合、有意に細胞傷害性であるペプチド毒素が挙げられる。毒素の例には、サイトトキシン、酵素活性を撹乱し、それによって癌幹細胞を殺傷する代謝撹乱物質（阻害剤及び活性化剤）、及びエフェクター部分の確定した範囲内で細胞をすべて殺傷する放射性分子が挙げられる。代謝撹乱物質は、正常な機能を変化させるように細胞の代謝を変える分子、たとえば、酵素又はサイトカインである。概して、用語、毒素には腫瘍細胞に死を生じるいずれのエフェクターが含まれる。

多数のペプチド毒素は一般化された真核細胞受容体結合ドメインを有し、これらの例では、毒素はＣＤ１３３を持っていない細胞を殺傷するのを防ぐように修飾されなければならない（たとえば、ＣＤ１３３を持っていないが未修飾の毒素に対する受容体を有する細胞を殺傷するのを防ぐように）。そのような修飾は、分子の細胞傷害性機能を保存する方法で為されなければならない。潜在的に有用な毒素には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシン、０−シガ様毒素（ＳＬＴ−Ｉ、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−ＩＩｖ）ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、シガ毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、緑膿菌外毒素、アロリン、サポニン、モデシン及びゲラニンが挙げられるが、これらに限定されない。他の毒素には腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及びリンホトキシン（ＬＴ）が挙げられる。抗腫瘍活性を有する別の毒素は、腫瘍に対して相当な効能を持つジインエンを含有する抗腫瘍抗生物質であるカリケアミシンγ１である（Zein N et al (1988). Science 240:1198-201）。

例として、ジフテリア毒素（その配列は既知である）を本開示のＲＮＡアプタマー分子に結合させることができる。ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）から分泌された天然のジフテリア毒素分子は、分子のアミノ末端から出発して、酵素的に活性のある断片Ａ（ＡＡ１〜１９３）と、転移ドメイン及び一般化された細胞結合ドメイン（ＡＡ４７５〜５３５）を含む断片Ｂ（ＡＡ１９４〜５３５）を特徴とすることができる幾つかの機能的ドメインから成る。

当業者に既知であろう幾つかの方法のいずれかにてＲＮＡアプタマーと毒素部分を連結することができる。たとえば、ＲＮＡアプタマーを毒素（ゲロニン）に結合させる方法はＣｈｕ、ＴＣ ｅｔ ａｌ．ら、（２００６）.Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６（１２）５９８９−５９９２にて記載されている。

部分は、局所レベルで生体の免疫系を活性化する又は阻害する免疫系の調節因子であることもできる。たとえば、腫瘍に送達されるサイトカイン、たとえば、ＩＬ−２のようなリンホカインは腫瘍の近傍で細胞傷害性のＴリンパ球又はナチュラルキラー細胞の増殖を引き起こすことができる。

部分又はレポーター基は、放射性分子、たとえば、放射性ヌクレオチド又はいわゆる感作性物質、たとえば、Ｂａｒｔｈら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｃｔ １９９０：１００−１０７にて記載されたような「ホウ素中性子捕捉療法」（ＢＮＣＴ）における低エネルギーの中性子のビームに暴露された際のホウ素であることもできる。そのような放射性のエフェクター部分を持つ化合物を用いて腫瘍にて癌幹細胞の増殖を阻害することも、イメージング目的のために癌幹細胞を標識することもできる。

放射性ヌクレオチドはα、β又はγの粒子を放射することができる単一原子の放射性分子である。α粒子の放射体の方が、短い距離にわたってはるかに高いエネルギーの放射物を放出するので十分に浸透することなく及び正常な組織を損傷することなく効率的であるのでβ又はγの粒子放射体よりも好まれる。好適なα放射性核種には^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ及び^２１２Ｂｉが挙げられる。

放射性分子は直接又は二官能性のキレートによってアプタマーにしっかり連結されなければならない。このキレートは生体内で放射性分子の溶出及び早すぎる放出を許してはならない。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７−６２（１９９１）。例として、本発明にＢＮＣＴを適合させるために、ホウ素の安定な同位元素、たとえば、ホウ素１０を化合物の抗腫瘍部分又はエフェクター部分として選択することができる。癌幹細胞へのアプタマーの特異的な結合によってホウ素は腫瘍細胞に送達され、腫瘍細胞中で又は腫瘍細胞上で濃縮されるであろう。十分な量のホウ素が蓄積するのを可能にする時間の後、約０．０２５ｅＶのエネルギーを有する低エネルギー中性子のビームによって腫瘍をイメージングすることができ、腫瘍にそれを照射することができる。この中性子照射自体は腫瘍の周囲の健常な組織又は腫瘍自体をほとんど損傷しないが、ホウ素１０（たとえば、腫瘍細胞の表面上の）は中性子を捕捉し、それによって不安定な同位元素であるホウ素１１を形成する。ホウ素１１は直ちに核分裂し、リチウム７の核と約２７９００００Ｅｖのエネルギーのあるα粒子を生じる。これらの重い粒子は細胞１個の直径（１０ミクロン）ほどの路程しか有さないので高度に致死性であるが、非常に限局した形態の放射線である。

本開示の送達剤
細胞へのｓｉＲＮＡ又はリボザイムの送達に本開示のＲＮＡアプタマー分子を用いることができる。好適なｓｉＲＮＡ又はリボザイムの例は状況に左右されるであろう。本開示に従って使用するのに好適であるｓｉＲＮＡ又はリボザイムの例にはＡＴＰ結合性のカセット膜トランスポータ、幹細胞性遺伝子（Ｂｍｉ−１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、β−カテニン、Ｓｍｏ、ネスチン、ＡＢＣＧ２、Ｗｎｔ２及びＳＣＦ等）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）及びサバイビンを標的とするものが挙げられる。

例として、これは抗ＰＳＭＡアプタマーを用いた従来技術にて実証されている。ＰＳＭＡはクラスリンを被覆した窪みを介してエンドソームに内部移行するという知識に基づいて、抗ＰＳＭＡアプタマーは結合したｓｉＲＮＡを、ＰＳＭＡを発現している細胞に運び、ＰＳＭＡタンパク質に結合したアプタマー／ｓｉＲＮＡは内部移行を介して細胞に侵入することが仮定された。次に、ｓｉＲＮＡ部分はＤｉｃｅｒ複合体によるプロセシングを受け、ＲＮＡが誘導するサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が介在する遺伝子スプライシング経路に絡む。これらのグループはこれを達成するのに異なる戦略を利用した。Ｃｈｕら、（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３４，ｅ７３は、抗ＰＳＭＡアプタマーとｓｉＲＮＡを会合させるためのビオチン／ストレプトアビジン架橋が介在する結合法を記載している。ＭｃＮａｍａｒａら、（２００６）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４，１００５−１０１５は、アプタマーとｓｉＲＮＡを連結させるのに「ＲＮＡのみ」のアプタマー／ｓｉＲＮＡのキメラ法を用いた。Ｗｕｌｌｎｅｒら、（２００８）．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、８：５５４−５６５によるその後の研究では、著者らは、ＰＳＭＡ陽性の前立腺癌細胞に真核細胞伸長因子２（ＥＥＦ２）のｓｉＲＮＡを送達するのに抗ＰＳＭＡアプタマーを用い、二価のＰＳＭＡアプタマーをこの目的で使用した。著者らは、一価の抗ＰＳＭＡ／ｓｉＲＮＡキメラと比べて二価のアプタマー構築物の遺伝子ノックダウン能が優れていることを明らかにした。

本開示のＲＮＡアプタマー分子を用いて種々の固形腫瘍におけるＣＤ１３３^＋癌幹細胞に積荷を送達することができる。ゲロニンはタンパク質合成の過程を阻害し、細胞傷害性であるリボソームの毒素である。しかしながら、それは膜不透過性であり、細胞に侵入するためには先導役を必要とする。従って、本開示のＲＮＡアプタマー分子を利用して膜不透過性の毒性有効積荷を癌幹細胞に送達することができる。

細胞傷害性の化学療法剤に対する腫瘍の耐性は、部分的には癌細胞への不十分な送達及び取り込み、及びさらに重要には癌細胞による流出による。Ｄｈａｒら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５：１７３５６−１７３６１にて記載されたように、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ＰＬＧＡに由来する生分解性のナノ粒子（ＮＰ）を用いてこの課題に対処した。手短には、２つのアルキル鎖を導入することによってシスプラチンをそのプロドラッグ、Ｐｔ（ＩＶ）化合物に変換した。これによって化合物の疎水性を高め、ＮＰの疎水性コア内へのパッケージングの工程が容易になった。ナノ沈殿工程の間にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコポリマーとして用いてＰＬＧＡ／ＰＥＧナノ粒子を合成した。ＰＬＧＡ／ＰＥＧ／ＮＰの表面はＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）アプタマーで装飾した。ＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートするとＮＰはエンドサイトーシスを受け、細胞質の還元過程によって、アルキル化されたプロドラッグはシスプラチンに変換された。

本開示はまた同時に存在する薬物送達剤及び造影剤としてのＲＮＡアプタマー分子の使用にまで及ぶ。これは、蛍光量子ドット（ＱＤ）の表面にアプタマーを結合することによって達成することができる。次に、ＱＤ／アプタマーの複合体をＤｏｘと共にインキュベートし、ＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子を形成する。Ｄｏｘ及びＱＤは双方とも蛍光分子である。しかしながら、ＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子におけるそれらの近接性のために、二蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）機構によってそれらは互いの蛍光を消光する。従って、ＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子は非蛍光である。しかしながら、前立腺癌細胞におけるＰＳＭＡが介在するエンドサイトーシスを介したＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子の内部移行によってＱＤ／アプタマー／Ｄｏｘナノ粒子からＤｏｘが放出され、それはＤｏｘ及びＱＤ双方による蛍光の回復を生じる。

医薬組成物
本開示の一例では、本開示に係るＲＮＡアプタマー、抗癌剤又は薬剤送達剤は薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤を含む組成物の形態で投与される。組成物の賦形剤又は他の要素は投与に使用される経路及び装置に従って適合させることができる。

用語「キャリア」及び「賦形剤」は、活性化合物の保存、投与及び／又は生物活性を円滑にするために当該技術で従来使用される物質の組成である（たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980)を参照）。キャリアは活性化合物の望ましくない副作用も軽減し得る。好適なキャリアは、たとえば、安定であり、キャリアにおける他の成分と反応することができない。一例では、キャリアは治療で採用される投与量及び濃度にて受容者における有意な局所性又は全身性の有害効果を生じない。

本開示に好適なキャリアには、従来使用されているもの、たとえば、水、生理食塩水、水性デキストロース、ラクトース、リンガー溶液、緩衝溶液、ヒアルロナンが挙げられ、グリコールは特に（等張な場合）溶液にとって例となる液体キャリアである。好適な医薬キャリア及び賦形剤には、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。

たとえば、抗酸化剤、緩衝溶液、静菌剤等のような他の一般的な添加剤を加えることができる。注射溶液、丸薬、カプセル、顆粒剤又は錠剤を調製するために、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに加えることができる。

本開示のＲＮＡアプタマーを含有する抗癌剤又は薬剤送達剤を非経口で（たとえば、静脈内、皮下、局所又は腹腔内への注射）投与することができる。抗癌剤の有効な投与量は、体重、年齢、性別、全身状態、食事、投与回数、投与方法、排泄及び疾患の重症度に従って決定することができる。一例では、抗癌剤又は薬剤送達剤は１０〜９５重量％のＲＮＡアプタマーを含有する。別の例では、抗癌剤又は薬剤送達剤は２５〜７５重量％のＲＮＡアプタマーを含有する。

投与回数は１日に１回又は数回であり得る。

一例では、ＲＮＡアプタマーの有効な細胞内含量はおよそ１ｎＭ〜１０００ｎＭである。別の例では、ＲＮＡアプタマーの有効な細胞内含量は好ましくは１００ｎＭ〜５００ｎＭである。しかしながら、アプタマーの投与量は上記範囲を下回っても上回ってもよい。

アプタマーの併用
本開示の単離されたＲＮＡアプタマー分子は単独で、又は本明細書で記載される方法に係る１以上の追加のＲＮＡアプタマーとの併用で使用することができる。一例では、癌幹細胞の検出、精製又は濃縮を円滑にするＲＮＡアプタマーと本開示のＲＮＡアプタマー分子を併用することができる。一例では、追加のＲＮＡアプタマーはＳｈｉｇｄａｒ Ｓら、（２０１１）．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ.、１０２（５）：９９１−９９８にて記載されたようなアプタマーＥｐＤＴ３ ５’−ＧＣＧＡＣＵＧＧＵＵＡＣＣＣＧＧＵＣＧ−３’の配列を含む。別の例では、追加のＲＮＡアプタマーは配列５’−ＡＣＧＵＡＵＣＣＣＵＵＵＵＣＧＣＧＵＡ−３’を含む。

キット
本開示は本明細書で開示される方法を実施するための診断キットも提供する。一例では、診断キットはＣＤ１３３を発現している細胞（癌幹細胞）を検出するための本明細書で記載されるようなＲＮＡアプタマー又は診断剤を含む。

キットは緩衝剤及び安定化剤のような補助剤も含み得る。診断キットはさらにバックグランドの干渉を減らす剤、対照試薬及び試験を行うための装置を含み得る。診断キットの使い方に関する指示書も一般に含まれる。

本開示の広く一般的な範囲から逸脱することなく上述の実施形態に対して多数の変化及び／又は改変が為され得ることが当業者によって理解されるであろう。従って、本実施形態はあらゆる点において説明として見なされるべきであって、限定として見なされるべきではない。

実施例
方法
細胞株及び細胞培養
この試験で使用したヒト起源の細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。それらは、ヒト結腸直腸癌ＨＴ−２９、ヒト肝細胞癌Ｈｅｐ３Ｂ、ヒト多形性膠芽細胞腫Ｔ９８Ｇ、及びヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔである。１０％のウシ胎児血清で補完したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（オーストラリア、ビクトリアのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ−２９）又は１０％のウシ胎児血清で補完した最少必須培地（ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｔ９８Ｇ）による培養にて細胞を増殖させ、維持した。細胞を３７℃にて５％ＣＯ_２の雰囲気で維持した。

タンパク質の発現及び細胞ＳＥＬＥＸ
ヒトＣＤ１３３のｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯにクローニングした。組換えの６×ヒスチジンのタグを付けたＣＤ１３３をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にて一時的に発現させた。手短には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ又は６０ｍｍのディッシュに播き、２４時間のインキュベートの後、細胞は７０％の集密度に達し、製造元の指示書に従って抗生剤を含まない培地でリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用いてそれぞれ合計２４又は８μｇのＣＤ１３３によって細胞に形質移入した。７２時間のインキュベートに続いて、形質移入した細胞を細胞ＳＥＬＥＸの標的として用いた。

ＳＥＬＥＸ選択
中心の４０ｎｔが無作為化された配列（下線を引いたＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を伴った５’− ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＣＡ Ａ−Ｎ４０− ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＧＧ ＣＴＣ ＡＣＡ ＡＣＡ ＧＧＣ）を含有するＤＮＡライブラリを合成した（オーストラリアのＧｅｎｅＷｏｒｋｓ）。無作為された配列に隣接するプライマー５’− ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＣＡ Ａ −３’及び５’− ＧＣＣ ＴＧＴ ＴＧＴ ＧＡＧ ＣＣＴ ＣＣＴ ＧＴＣ ＧＡＡ −３’を用いた大規模ＰＣＲを介して元々の合成ライブラリから二本鎖ＤＮＡプールを生成した。Ｄｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７転写キット（米国のＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、大規模ＰＣＲの産物（約１０^１４配列）の一部を試験管内転写の鋳型として用いて当初の２’−フルオロピリミジン修飾したＲＮＡプールを作製した。ＳＥＬＥＸについては、最初の選択では５μＭ又は各反復回では１μＭの濃度でのＲＮＡを１００μＬの結合緩衝液（２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ及び０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子を含有するダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水）で希釈し、８５℃で５分間変性させ、１０分間室温に冷却し、３７℃で１５分間アニーリングした後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にて発現された標的タンパク質と共に４℃で１時間インキュベートした。インキュベートと広範な洗浄に続いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて結合したＲＮＡを逆転写した後、ＰＣＲ増幅と試験管内転写を行い、ＳＥＬＥＸの次の回に使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現されたＨｉｓタグを付けた無関係なタンパク質を用いて４回目から対比選択工程を行ってＨｉｓタグ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は組織培養プレートを特異的に認識する化学種の濃縮を減らした。ＰＣＲ増幅サイクルの数も最適化して非特異的な「パラサイト」ＰＣＲ産物の過剰増幅を防いだ。加えて、選択工程の厳密性を高めて、アプタマーの濃度、インキュベート時間及び洗浄回数の調整を介して高親和性アプタマーの選択を促進した。高特異性のアプタマーを取得するために、使用する細胞の数を徐々に減らす一方でＳＥＬＥＸの進行中、洗浄の厳密性を高め、陰性選択を４回目から含めた。制限断片長多型（ＲＦＬＰ）及び生きた細胞を用いたフローサイトメトリーを用いて濃縮をモニターした。

ＲＦＬＰ解析
選択中のアプタマー候補の濃縮は制限断片長多型（ＲＦＬＰ）によって判定した。手短には、ＲＦＬＰは軽微な改変と共に以前記載されたように行った（Dasら、2009; Missailidis & Hardy 2009）。反復サイクルに由来するおよそ５ｎｇのｃＤＮＡを８サイクルのＰＣＲによって増幅した。０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを伴った製造元（Ｔａｋａｒａ）によって供給された緩衝液Ｔにて４つのヌクレオチドを認識する４種の制限酵素、ＡｆａＩ、ＡｌｕＩ、ＨｈａＩ及びＸｓｐＩ（頻繁なカッター）によって、増幅されたＤＮＡを３７℃で一晩消化した。一晩の消化に続いて、ＤＮＡを６５℃に加熱し、氷上で冷却し、ＴＢＥ緩衝液におけるネイティブ２０％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動を介して分離した。次いでＧｅｌＳｔａｒでゲルを染色し、標準のゲルイメージングシステムを用いて視覚化した。

フローサイトメトリーアッセイ
８０％の集密度にてトリプシン消化によって細胞を回収し、洗浄緩衝液（２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を伴ったＤＰＢＳ）に再懸濁させ、数えた。遠心（１０００×ｇで５分間）に続いて、細胞ペレットを結合緩衝液（５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ及び０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡで補完したＤＰＢＳ）に再懸濁させ、１×１０６個／ｍＬに希釈した。
標的タンパク質へのアプタマーの結合を確認するために、以前記載された方法（Willkomm及びHartmann (2005). Weinheim, Wiley-VCH GmbH & Co. KGaA 1:86-94)に従って反復サイクルに由来するＲＮＡをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）によって３’末端で標識した。全体を通して琥珀色の試験管を用いて光漂白をできるだけ抑えた。手短には、試料を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した。１０ｍＭのエチレングリコールの添加によって酸化を止め、その後エタノール沈殿を行った。３０モル過剰でＦＩＴＣを加え、４℃で一晩、反応を完了させた。１００μＬの結合緩衝液におけるトリプシン処理したＣＤ１３３タンパク質を形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は形質移入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞５×１０５個と共に１μＭのＦＩＴＣ標識したＲＮＡを氷上で１時間インキュベートし、その後、３回洗浄し、３００μＬの結合緩衝液に再懸濁させた。各試料の５０，０００事象を数えることによってＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で蛍光強度を測定した。未選択のライブラリに由来するＦＩＴＣ標識したＲＮＡを用いて非特異的な結合を測定した。各回の結合は、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及び共同研究者(Liら(2009). J. Proteome Res 8:2438-48)によって記載された方法に従って、標的細胞へのゼロ回目のＲＮＡの結合の平均蛍光強度ならびに陰性対照細胞への結合についての平均蛍光強度を差し引いた後に算出した。

選択されたアプタマーのクローニング、配列決定及び構造解析
反復回数のＲＦＬＰ及びフローサイトメトリーに続いて、６回目は標的タンパク質を選択的に認識するＲＮＡ配列の十分な濃縮を明らかにした。この濃縮されたプールを１０サイクルのＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ産物をｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。個々のクローンからプラスミドＤＮＡを調製し、自動ＤＮＡ配列決定手順を用いてその配列を決定した。ＣｌｕｓｔａｌＸ２(Larkinら(2007) Bioinformatics 23:2947-8)を用いてアプタマーの配列を解析した。プログラムＲＮＡｆｏｌｄ(Hofacker (2003) Nucleic Acids Res 31:3429-31)を用いて二次構造を予測した。

アプタマーの親和性の測定
フローサイトメトリーを用いて細胞表面に発現されたネイティブのＣＤ１３３に対する達成できた２’−フルオロピリミジンＲＮＡアプタマー種の解離定数（Ｋ_ｄ）を測定した。ＣＤ１３３タンパク質で形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は形質移入しなかったＨＥＫ２９３Ｔ細胞（５×１０^５個）を先ずブロッキング緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含有する結合緩衝液）と共にインキュベートし、その後、結合緩衝液で２回洗浄した後、１μＬ容量の結合緩衝液にて連続希釈濃度（見かけのＫ_ｄのおよそ１０倍上下）のＦＩＴＣ標識アプタマーと共に氷上で１時間インキュベートした。細胞を結合緩衝液で３回洗浄し、１５０μＬの結合緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメトリー解析に供した。ＦＩＴＣ標識した未選択のライブラリを陰性対照として使用した。未選択のライブラリの平均蛍光強度（ＭＦＩ）をアプタマー／標的細胞のそれから差し引いて特異的な結合のＭＦＩを生成した。各アプタマーのＫ_ｄは方程式：
［結合したアプタマー］／［アプタマー］＝−（１／Ｋ_ｄ）×［結合したアプタマー］＋（［Ｔ］_ｔｏｔ／Ｋ_ｄ）
に従ってＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって決定され、式中、［Ｔ］_ｔｏｔは標的の総濃度を表す。

アプタマーの切り詰め及び特異性の決定
切り詰めたアプタマーを生成するために、所望の配列のセンス及びアンチセンスのＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。ＣＤ１３３−１−１（第１の切り詰め）はセンスオリゴヌクレオチド、５’− ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＴＡＡ ＡＣＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＡＣ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＣＴＡ ＴＡＧ −３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、５’− ＣＴＡ ＴＡＧ ＴＡＡ ＣＴＣ ＧＴＴ ＣＣＴ ＣＣＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＡＧ ＣＧＴ ＴＴＡ ＴＴＣ ＴＴＧ ＴＣＴ Ｃ −３’に由来し；ＣＤ１３３−１−２（第２の切り詰め）はセンスオリゴヌクレオチド、５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＣＡ ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＡＣ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＧＧ ＡＡＣ ＧＡＧ Ｔ−３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、５’− ＡＣＴ ＣＧＴ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＴＡ ＴＧＴ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＧＧＴ ＴＧＡ ＧＣ −３’に由来し；ＣＤ１３３−１−２−１（第３の切り詰め）はセンスオリゴヌクレオチド、５’− ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＣ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＴＡＧ ＧＧＴ ＧＧ−３’ 及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＡ ＣＣＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＧＧ−３’に由来し；ＣＤ１３３−１−２−２（第４の切り詰め）はセンスオリゴヌクレオチド、ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＣ ＣＣＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＴＡＧ ＧＧ−３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、５’−ＣＣＣ ＴＡＴ ＧＴＡ ＧＧＡ ＧＧＧ−３’に由来する。ＣＤ−１３３−２−１（第１の切り詰め）はセンスオリゴヌクレオチド、５’−ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＣ ＡＧＡ ＡＣＧ ＴＡＴ ＡＣＴ ＡＴＴ ＣＴＧ−３’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、５’−ＣＡＧ ＡＡＴ ＡＧＴ ＡＴＡ ＣＧＴ ＴＣＴ Ｇ−３’に由来する（Ｔ７ＲＮＡプロモータ配列に下線を引いた）。オリゴヌクレオチドの関連する対を等モル比にて１×ＰＥＩ緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．１ＭのＭｇＣｌ_２、０．５ＭのＮａＣｌ及び０．１Ｍのジチオスレイトール）中で混合し、９０℃で５分間加熱し、ゆっくり室温に冷却した後、エタノール沈殿を行った。試験管内の転写及びＦＩＴＣ標識は上述のように行った。５’ＤＹ６４７蛍光タグ及び３’逆位デオキシチミジン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）と共にこれらのクローン（ＣＤ１３３−１−４及びＣＤ１３３−２−１）の最終的な切り詰め、５’−ＤＹ６４７−ＣＣＣ ＴＣＣ ＴＡＣ ＡＴＡ ＧＧＧｄＴ−３’及び５’−ＤＹ６４７− ＣＡＧ ＡＡＣ ＧＴＡ ＴＡＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＧｄＴ−３’を化学的に合成した。ＣＤ１３３陽性（ＨＴ−２９及びＨｅｐ３Ｂ）及びＣＤ１３３陰性（Ｔ９８Ｇ及びＨＥＫ２９３Ｔ）を用いてこれら２つのアプタマー及び陰性対照のアプタマーの結合親和性を測定した。５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を含有するブロッキング緩衝液を用いて４℃にてブロッキング工程を行った一方で３７℃にて３０分間アプタマーの結合を行った。

共焦点顕微鏡
標識の２４時間前に、ガラスボトム８チャンバースライド（Ｌａｂ-ＴｅｋＩＩ、Ｎｕｎｃ）にてｃｍ^２当たり７５，０００細胞の密度で細胞を播いた。ＤＹ６４７−ＣＤ１３３−１−２−２、ＤＹ６４７−ＣＤ１３３−２−１及び対照のアプタマーをフローサイトメトリーと同じ方法で調製した。培地を取り除いた後、５％（ｖ／ｖ）の血清を含有するブロッキング緩衝液にて３７℃で１５分間細胞をインキュベートし、結合緩衝液で２回洗浄した後、２００ｎＭのアプタマーと共に３７℃で３０分間インキュベートした。最終の１５分間のインキュベートの間に細胞にビスベンズイミドヘキスト３３３４２（３μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を加えた。アプタマー溶液を取り除き、結合緩衝液で細胞を各５分間３回洗浄し、その後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて視覚化した。

エンドサイトーシスの阻害
これは、軽微な改変を伴うが、共焦点顕微鏡について記載されたように本質的に行われた。手短には、カリウムを枯渇させた緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２及び１ｍＭのＣａＣｌ_２）又は高張の緩衝液（３ｍＭのＫＣｌ及び４５０ｍＭのスクロースを含有するカリウムを枯渇させた緩衝液）のいずれかで細胞を３７℃にて１時間予備処理した。これらの緩衝液はアプタマーとのインキュベート工程及びすすぎ工程すべてにおいても使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合させたヒトのトランスフェリンの内部移行を定量的に特徴づけることによってエンドサイトーシスを阻害することにおけるこれらの処理の有効性を検証した。予備処理後、トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）を細胞に加えた後、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を各緩衝液で３回洗浄し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。

トランスフェリンによるアプタマーの共局在化
共焦点顕微鏡について以前記載されたようにＨＴ−２９、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｔ９８Ｇ及びＨＥＫ２９３Ｔの細胞を調製した。培地の除去に続いて、５％（ｖ／ｖ）の血清を含有するブロッキング緩衝液にて３７℃で１５分間細胞をインキュベートし、結合緩衝液で２回洗浄した後、２００ｎＭのアプタマーと共に３７℃で３０分間インキュベートした。アプタマー溶液を取り除き、結合緩衝液で細胞を各５分間３回洗浄した。次いで細胞にトランスフェリンを加え、２時間インキュベートした後、最終の１５分間のインキュベートの間に細胞にビスベンズイミドヘキスト３３３４２（３μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を加えた。結合緩衝液で細胞を各５分間３回洗浄した後、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。

腫瘍塊の調製並びにアプタマー及び抗体とのインキュベート
１０００〜２０００個のＨＴ２９細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレートから取り出し、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン及びＢ２７を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて７日間、腫瘍塊を形成させた。７日目に、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有するＰＢＳで腫瘍塊（３００〜４００μｍの大きさ）を３回洗浄し、結合緩衝液を用いて２０分間ブロックした。次いで腫瘍塊を１００ｎＭのアプタマー又はＡＣ１３３抗体と共に３０分間、６０分間、１２０分間、２４０分間、又は２４時間インキュベートした。各時点に続いて腫瘍塊をＰＢＳで３回洗浄し、その後ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉ共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。

細胞ＳＥＬＥＸは複合体タンパク質標的に対するアプタマーの選択を促進する
ＣＤ１３３は２つの細胞外ループを含有する複合体５回膜貫通タンパク質である。タンパク質の細胞外部分のみに対するアプタマーを効果的に選択するために、本発明者らはネイティブな立体配座形態でＣＤ１３３を発現させることができる手順を考案することが必要だった。この目的で、本発明者らはＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面にタンパク質を一時的に発現させることを求めた。リポフェクトアミン２０００を用いて、ＣＤ１３３をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入し、ＳＥＬＥＸ実験に先立って７２時間発現させ、発現はＡＣ１３３抗体の染色によって確認した。ピリミジンすべてに２’フルオロ修飾したリボースを含有するおよそ１×１０^１４種の無作為ＲＮＡライブラリをＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上に発現させたＣＤ１３３と共にインキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲに先立って未結合のＲＮＡを数回の洗浄工程を介して取り除き、工程を合計１２回繰り返した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した無関係なＨｉｓタグ付きタンパク質を用いた陰性選択を介して非特異的な結合を除去した。非放射性のＲＦＬＰを行って反復回の間での化学種の発生を確認し、濃縮の確認は形質移入した及び形質移入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたフローサイトメトリーを用いて決定した。図１に示すように、６回目は、形質移入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び未選択のライブラリに比べてＣＤ１３３を形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合にて２．５倍の増加を示した。

ＳＥＬＥＸ後の操作は最小の腫瘍特異的なアプタマーを生成した
６回目をクローニングし、配列決定し、社内の方法を用いてＦＩＴＣでクローンを蛍光的にタグ標識した。形質移入した及び形質移入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて各クローンの結合特異性を測定し、最も有望な結果は、ＣＤ１３３−１及びＣＤ１３３−２と名付けられた２つのアプタマーによって示された。これら２つのクローンを順次切り詰めてアプタマーの結合領域の構造を維持するのに必要とされ、並びにＫ_ｄを小さくするので結合親和性を高める塩基の最短数を決定した（表１）。

クローンＣＤ１３３−１を合計４回切り詰めを行ってアプタマーの結合領域を確認した。このクローンは上手く１５ヌクレオチドに切り詰められ、腫瘍特異的抗原に対する最小の公開されたアプタマーになっており、トロンビンに向けられた最小の公開されたＤＮＡアプタマー(Paborskyら(1993) J. Biol Chem 268:20808-11)と大きさが同等である。第２のクローンＣＤ１３３−２も高い親和性及び特異性でＣＤ１３３に結合する可能性について検討された。アプタマーを切り詰めることは低下したＫｄを生じたので標的に対する高い親和性を生じた（表２）。

これら２つのアプタマーの感受性及び特異性の確認は、ＣＤ１３３陽性（ＨＴ−２９及びＨｅｐ３Ｂ）細胞株及びＣＤ１３３陰性（Ｔ９８Ｇ及びＨＥＫ２９３Ｔ）細胞株を用いて決定した（表２）。化学種を商業的に合成し、ＤｙＬｉｇｈｔ蛍光色素分子で標識した場合、Ｋ_ｄはやや高くなった。

ＣＤ１３３特異的なアプタマーは受容体が介在するエンドサイトーシスを介して内部移行する
我々が以前報告したように、有効な癌の治療診断剤として分類されるアプタマーについては、それは標的への結合に続いて効率的に内部移行しなければならない。ＣＤ１３３陽性細胞及びＣＤ１３３陰性細胞と共に３７℃で３０分間インキュベートした後、共焦点顕微鏡を用いて内部移行を定量した。内部移行はＣＤ１３３陰性細胞株で見られる蛍光シグナルの欠如のために特異的であると見なされた。受容体が介在するエンドサイトーシスを介した内部移行はカリウムの枯渇及び高張処理のようなエンドサイトーシスの遮断を介して確認した。これらの処理の有効性はトランスフェリンを用いて以前確認されている(Shigdarら(2011a) Cancer Sci 102:991-8)。

ＣＤ１３３特異的なアプタマーはＣＤ１３３抗体よりも腫瘍塊への優れた浸透を示す
癌の治療診断剤としての我々のアプタマーの有効性を明らかにする試みにおいて、本発明者らは、生体内での標的化のモデルとしての試験管内での腫瘍塊を用いて腫瘍の塊に浸透するアプタマーの可能性を検討した。本発明者らはＨＴ−２９（ＣＤ１３３^＋）及びＨＥＫ２９３Ｔ（ＣＤ１３３⁻）の細胞株の腫瘍塊モデルを生成し、これらの球状塊をＣＤ１３３−１、ＣＤ１３３−２及びＡＣ１３３抗体と共に４時間インキュベートし、その後、共焦点顕微鏡で観察した（図７）。

ＣＤ１３３アプタマー／ドキソルビシン複合体は結腸癌幹細胞を試験管内で排除することができる
わずかな例外はあるが、ドキソルビシンのような化学療法剤は癌幹細胞を殺傷しない。本発明者らは、ＣＤ１３３アプタマーによって化学療法剤が癌幹細胞に送達され、無作為拡散の代わりにエンドサイトーシスを介して遊離の薬剤として細胞に入るのであれば、それらは従来の化学療法剤を有効な癌幹細胞キラーに転換することができるという仮説を立てた。試験管内での結腸癌幹細胞の排除におけるＣＤ１３３アプタマー／ドキソルビシンの能力を調べるために、本発明者らは試験管内腫瘍塊アッセイを行った。

ＣＤ１３３−２−１アプタマーをドキソルビシンに結合させた。腫瘍塊形成を促進する癌幹細胞培地（インスリン、ＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢ２７で補完した無血清のＤＭＥＭ培地）を伴った９６穴超低結合プレートに３つの異なる細胞用量の結腸癌細胞（ＨＴ２９）を播いた。生理食塩水（ＰＢＳ）対照、１μＭのＤＯＸ／アプタマー複合体又は１μＭの遊離のドキソルビシンで細胞を処理した。各ウェルにおける腫瘍塊の形成を処理の３日後に評価した（表３）。

１００個の細胞／ウェルの細胞用量にてＣＤ１３３−２−１アプタマー／ＤＯＸ複合体及び遊離のドキソルビシンは腫瘍塊形成の阻害に効果を示さなかった。しかしながら、５０個の細胞／ウェルの細胞用量ではアプタマー/ＤＯＸによる頻度の軽い低下が認められた。重要なことに、１０個の細胞／ウェルの条件下では１μＭのＤＯＸ／アプタマー複合体の処理は腫瘍塊を形成することが可能である結腸癌幹細胞様の細胞の完全な除去をもたらした。従って、ＣＤ１３３アプタマーを介したドキソルビシンの癌幹細胞標的化送達は、従来の抗癌療法に対する耐性の癌幹細胞の能力の根底にある既知の化学耐性機構を迂回することができる。

備考
癌幹細胞（ＣＳＣ）は癌の根源であり、癌再発の原因であると見なされている。このモデルは、放射線耐性及び化学療法耐性を説明し（Visvader & Lindeman (2012) Cell Stem Cell 10:717-28)、腫瘍の中でのこの集団の細胞を特異的に標的化する多数の試みを導いているので支持を獲得している。ＣＳＣすべてを定義する１つの特異的なマーカーが存在しない一方で、ＣＤ１３３、ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、ＥｐＣＡＭ及びＡＢＣＧ２(Hu及びFu (2012) Cancer Res 2:340-56; Visvader & Lindeman 2012 supra)を含む多数のマーカーが固形腫瘍におけるＣＳＣの集団を定義するのに有用であることが判明している。ＣＤ１３３は脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、結腸癌、肝臓癌、肺癌及び卵巣癌のＣＳＣ集団のマーカーとして関連付けられている。ＣＤ１３３の機能は未だに解明されねばならない一方で、このマーカーは低酸素条件で上方調節され、３種陰性乳癌及び前立腺癌にて血管形成性模倣体と関連付けられているということ(Liuら(2012a) Cancer Biol Ther May 1 13(7); Liuら(2012b) Oncogene Apr 2)は、腫瘍増殖及び転移におけるＣＤ１３３の重要性を示している。これらＣＤ１３３＋細胞が腫瘍の生成、維持及び連続した広がりにいかに決定的であるかを考えて、我々はＣＤ１３３に対するＲＮＡアプタマーを単離した。

本発明者らは以前、別のＣＳＣマーカーを標的とするアプタマーを単離するＳＥＬＥＸ法の成功を記載している(Shigdarら2011a上記参照)。ＣＤ１３３を標的とするアプタマーの単離には、このタンパク質の５回膜貫通の性質及びアプタマーの選択のためのその立体配座形状でタンパク質を使用する必要性のために以前のプロトコールに対する改変が必要とされた。選択プロトコールの成功はＲＦＬＰ解析と同様にフローサイトメトリー結合アッセイを用いて示した。上手く行った展開を６回のＳＥＬＥＸサイクルに続いて示し、幾つかのアプタマーをクローニングした。ＣＤ１３３陽性及びＣＤ１３３陰性の細胞株の双方を用いたさらなる性状分析のために２種のアプタマーを選択した。これらのアプタマーを切り詰めて結合親和性を維持するのに必要とされる最小サイズを決定した。これらのアプタマーの１つ、ＣＤ１３３−１は１５塩基のサイズに切り詰めることができた。この切り詰めによって記載された最小の、トロンビンを標的とするＤＮＡアプタマー(Paborskyら1993上記参照)と同じサイズのこのＲＮＡアプタマーを作製する。これらのアプタマーは双方とも感受性であり、特異的であることが示されたが、さらに重要なことには、これら２種のアプタマーはその標的への結合に続いて受容体が介在するエンドサイトーシスを介して迅速に内部移行した。アプタマーのこの後者の特徴は治療試薬として修飾されるこれらアプタマーにとって必要な要件である。

アプタマーは、それらを腫瘍の塊の治療及びイメージングの双方にとって理想的なエスコートモダリティにする多数の利益を持っている。その小さなサイズは、それらが従来の免疫療法選択肢よりもはるかに効率的に腫瘍に浸透することが可能であることを意味し、これらの核酸が免疫原性を欠くということも少ない副作用につながる。追加の官能化であるナノ粒子における薬物の直接的な結合又は被包のいずれかを介して、アプタマーは非常に有効な薬剤エスコートとして機能することができる。標的化アプタマーへのドキソルビシン、ｓｉＲＮＡ又はリボザイムのような化学療法剤の直接的な結合、及びその表面へのアプタマーの連結を介したナノ粒子の上手く行った官能化の幾つかの報告がある。一部のアプタマーがその標的への結合によって単独で有効であることができる一方で、アプタマーの大半は細胞傷害性物質への導き手としてはるかに上手く行く。

Claims (22)

1. （ｉ）配列５’−ＣＣＣＵＣＣＵＡＣＡＵＡＧＧＧ−３’（配列番号１）；
   （ｉｉ）以下：
   に示すアプタマーの、相補的幹領域を形成する１〜４及び１２〜１５で規定される塩基内に２個又は４個の置換を含んでいてもよいことを除いては配列番号１と同一である配列であって、一方で５〜１１の塩基が、ＣＤ１３３に結合することができるループ構造を形成する、配列；
   （ｉｉｉ）配列５’−ＣＡＧＡＡＣＧＵＡＵＡＣＵＡＵＵＣＵＧ−３’（配列番号６）；又は
   （ｉｖ）以下：
   に示すアプタマーの、相補的幹領域を形成する１〜５及び１５〜１９で規定される塩基内に２個、４個、又は６個の置換を含んでいてもよいことを除いては配列番号６と同一である配列であって、一方で６〜１４の塩基が、ＣＤ１３３に結合することができるループ構造を形成する、配列
   を含む、ＣＤ１３３に特異的に結合するＲＮＡアプタマー。
2. ＣＤ１３３に対して１５０ｎＭ±１０％以下の解離定数を有する、請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
3. 長さが１５〜４０塩基の間、又は１９〜４０塩基の間である、請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
4. 以下
   （ｉ）ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＵＡ ＡＡＣ ＧＣＵ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＵＵ ＡＣＵ ＡＵＡ ＧＡＧ ＣＵＵ ＣＧＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＣＵ ＣＡＣ ＡＡＣ（配列番号２）；
   （ｉｉ）ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＵＡ ＡＡＣ ＧＣＵ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＵＵ ＡＣＵ ＡＵＡ Ｇ（配列番号３）；
   （ｉｉｉ）ＧＣＵ ＣＡＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＧＡ ＧＵ（配列番号４）；
   （ｉｖ）ＣＣ ＡＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ ＧＵＧ Ｇ（配列番号５）；
   及び
   （ｖ）ＣＣ ＣＵＣ ＣＵＡ ＣＡＵ ＡＧＧ Ｇ（配列番号１）
   から選択される配列を含む請求項１に記載のＲＮＡアプタマー。
5. 配列番号１又は配列番号６の配列から成る請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー。
6. アプタマーの安定性を高める１以上の修飾を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載のアプタマー。
7. ２’−フルオロ修飾されている、請求項６に記載のＲＮＡアプタマー。
8. ＣＤ１３３^＋細胞に特異的に結合する請求項１〜７のいずれか１項に記載のアプタマー。
9. ＣＤ１３３^＋細胞が癌幹細胞である請求項１〜８のいずれか１項に記載のアプタマー。
10. 前記細胞が生体内又は試験管内にある請求項８又は９に記載のアプタマー。
11. 前記細胞が対象から得られた生物試料に存在する請求項８〜１０のいずれか１項に記載のアプタマー。
12. 前記癌幹細胞が、脳腫瘍幹細胞、乳癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、結腸癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、皮膚癌幹細胞、又は黒色腫幹細胞である請求項８〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー。
13. 酵素、補欠分子族、蛍光物質、生物発光物質、高電子密度標識、ＭＲＩ用の標識及び放射性物質並びにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される検出可能な標識に結合させた請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーを含む診断剤。
14. 生物試料の組織学的検査に使用するための請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１３に記載の診断剤。
15. 毒素、放射性核種及び化学療法剤並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される部分に結合させた請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーを含む抗癌剤。
16. 対象から得られた生物試料からＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞を単離する、精製する又は濃縮するインビトロの方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１３に記載の診断剤に前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
17. 癌を有する又は癌を有することが疑われる対象から得られる生物試料においてＣＤ１３３を発現している細胞及び／又は癌幹細胞を特定するインビトロの方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１３に記載の診断剤に前記細胞を接触させることを含む、方法。
18. 前記対象が、脳腫瘍、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、皮膚癌、黒色腫又はＣＤ１３３^＋細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有するものである請求項１６又は１７に記載の方法。
19. 対象にて癌を治療する又は予防するために用いられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー又は請求項１５に記載の抗癌剤。
20. ｓｉＲＮＡ又はリボザイムに結合された請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマーを含む送達剤。
21. 薬学上許容可能なキャリア及び／又は賦形剤と一緒に治療上有効な量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー、又は請求項１５に記載の抗癌剤、又は請求項２０に記載の送達剤を含む組成物。
22. 腫瘍の分子イメージングで使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のＲＮＡアプタマー、又は請求項１３に記載の診断剤。