JP6297034B2 - 癌幹細胞を検出するためのEpCAMアプタマー - Google Patents
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Description
本明細書で引用される又は参照される文書はすべて、及び本明細書で引用される文書にて引用された又は参照された文書はすべて、本明細書又は参照によって本明細書に組み入れられる文書にて言及されたいかなる製品についての製造元の指示書、説明、製品仕様書及び製品概要とともに、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
配列番号1は、EpCAMに特異的に結合するアプタマーのヌクレオチド配列である。
配列番号2は、EpCAMに特異的に結合するアプタマーのヌクレオチド配列である。
配列番号3は、EpCAMに特異的に結合するアプタマー/siRNAキメラのヌクレオチド配列である。
用語「及び/又は」、たとえば、「X及び/又はY」は、「X及びY」又は「X又はY」のいずれかを意味し、双方の意味又はいずれかの意味について明白な支持を提供するように理解されるべきである。
アプタマーの幾つかの独特の特性によってそれらは多種多様な分子生物学用途での使用及び潜在的な医薬剤としての使用で魅力的なツールになっている。第1に、ほとんどのアプタマーが高い親和性で標的に結合するということは、ピコモルからナノモルの範囲での典型的な解離定数を示す。アプタマーの結合部位には標的分子の割れ目及び溝が含まれ、多数の現在利用可能な医薬剤と非常に類似する拮抗活性を生じる。第2に、アプタマーは広い範囲の温度及び保存条件にわたって構造的に安定であり、その独特の三次構造を形成する能力を維持する。第3に、アプタマーは、モノクローナル抗体を作出するのに必要とされる高価で且つ作業の多い生物系とは対照的に化学的に合成することができる。
SELEX(商標)(試験管内選択法)と呼ばれる反復工程を用いて、事実上あらゆる特定の標的に結合するアプタマーを選択することができる。工程はたとえば、US5270163及びUS5475096に記載されている。SELEX(商標)法は、核酸が、種々の二次構造や三次構造を形成する十分な能力及びモノマーでもポリマーでもよい事実上あらゆる化合物とのリガンドとして作用する(すなわち、特異的な結合対を形成する)ようにそのモノマーの範囲内で利用可能な十分な化学的汎用性を有するという独特の見識に基づく。いずれのサイズまたは組成の分子も標的となり得る。
結合親和性は互いに対する分子の結合又は親和性の強さの測定を表す。標的及び他の分子に関する本明細書のアプタマーの結合親和性はKdという点で定義される。解離定数は、当該技術で既知の方法によって決定することができ、たとえば、Caceci,Mら、Byte(1984)9:340−362にて述べられたもののような方法によって複合体混合物についてさえ計算することができる。解離定数を測定する例は、たとえば、表面プラスモン共鳴分析を記載しているUS7602495;US6562627、US6562627及びUS2012/00445849にて記載されている。別の例では、Kdは、Wong及びLohman,(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90,5428−5432によって開示されたもののような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて確定される。
ホスホジエステル形態でのオリゴヌクレオチドが所望の効果の前に、たとえば、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼのような細胞内及び細胞外の酵素によって体液中で迅速に分解され得るという点で治療剤として核酸を使用することにて遭遇する可能性のある課題の1つが明らかになる。本開示はまた、本明細書で記載されるようなRNA類似体及び/又はヌクレアーゼ消化からの保護のようなRNAアプタマーの1以上の特徴を改善するように設計された追加の修飾も含む。
本開示のアプタマー分子を親和性リガンドとして用いて標的分子(たとえば、EpCAMを持っている癌幹細胞)を分離し、精製することができ、プローブとして用いて標的分子(たとえば、EpCAMを持っている癌幹細胞)を追跡し、モニターし、検出し、定量することができ、又は生理的に関連する反応を阻止し、許容し、活性化し、若しくは触媒して治療効果を達成することができる。それらは、医薬剤として作用し、特定の標的に結合し、特定の分子を所望の部位に向かわせることができる。
幹細胞の分化による成人の細胞の再生の最も良く知られた例は造血系である。造血幹細胞及び前駆細胞のような発生上未成熟な前駆細胞は、分子シグナルに応答して種々の種類の血液細胞及びリンパ系細胞を徐々に形成する。幹細胞は上皮組織及び間葉組織を含む他の組織でも見いだされる。癌幹細胞は、たとえば、正常な幹細胞における遺伝的な損傷の結果として又は幹細胞及び/又は分化した細胞の調節不能な増殖によってこれらの細胞種のいずれかから生じ得る。
一例では、本開示のRNAアプタマー分子を対象から得られた生物試料から濃縮する。通常、対象は癌幹細胞を含有する腫瘍を有する又は腫瘍を有することが疑われるものであろう。用語「濃縮された」又は「濃縮」又はその変形は、特定の種類の細胞(すなわち、癌幹細胞)の比率が未処理の細胞の集団(たとえば、試料中の細胞)に比べたとき高い細胞の集団を表すのに本明細書では使用される。
本開示のRNAアプタマー分子を診断目的で試験管内にて用いて悪性腫瘍組織における癌幹細胞の存在を判定することができる。方法にはEpCAM+癌幹細胞の存在について生物試料を調べることが関与する。たとえば、生物試料を本開示の標識したRNAアプタマーと接触させ得、試料における細胞に特異的に結合するRNAアプタマーの能力を決定する。アプタマーによる結合はEpCAMを持っている細胞の存在を指し示す。一例では、EpCAMを持っている細胞は癌幹細胞である。
本開示のRNAアプタマー分子をある部分に結合させて使用し、その部分をEpCAM+細胞、好ましくは癌幹細胞に向かわせることができる。部分の例には、癌幹細胞を殺傷するのに使用することができる毒素、放射性核種又は化学療法剤が挙げられる。
細胞へのsiRNA又はリボザイムの送達に本開示のRNAアプタマー分子を用いることができる。好適なsiRNA又はリボザイムの例は状況に左右されるであろう。本開示に従って使用するのに好適であるsiRNA又はリボザイムの例にはATP結合性のカセット膜トランスポータ、幹細胞性遺伝子(Bmi−1、Notch1、Sox2、Oct−4、Nanog、β−カテニン、Smo、ネスチン、ABCG2、Wnt2及びSCF等)、GAPDH(グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ)及びサバイビンを標的とするものが挙げられる。
本開示の一例では、本開示に係るRNAアプタマー、抗癌剤又は薬剤送達剤は薬学上許容可能なキャリア及び/又は賦形剤を含む組成物の形態で投与される。組成物の賦形剤又は他の要素は投与に使用される経路及び装置に従って適合させることができる。
本開示の単離されたRNAアプタマー分子は単独で、又は本明細書で記載される方法に係る1以上の追加のRNAアプタマーとの併用で使用することができる。一例では、癌幹細胞の検出、精製又は濃縮を円滑にするRNAアプタマーと本開示のRNAアプタマー分子を併用することができる。一例では、追加のRNAアプタマーはCD133+細胞に特異的に結合するものである。一例では、追加のRNAアプタマーは配列5’−CCCUCCUACAUAGGG−3’を含む。別の例では、追加のRNAアプタマーは配列5’−CAGAACGUAUACUAUUCUG−3’を含む。
本開示は本明細書で開示される方法を実施するための診断キットも提供する。一例では、診断キットはEpCAMを発現している細胞(癌幹細胞)を検出するための本明細書で記載されるようなRNAアプタマー又は診断剤を含む。
方法
アプタマー
以前記載された(Shigdar Sら (2011). Cancer Sci 102:991-998)ようにヒトEpCAMに対するアプタマーを生成し、性状分析した。アプタマーDT3及び対照アプタマーは以前記載された(上記Shigdar Sら)が、アプタマー23は、その5’末端に近赤外線蛍光色素TYE665を結合させた19塩基のヌクレオチドである。本発明者らの以前のアプタマーと同様の方法(上記Shigdar Sら)を用いてこのアプタマーを性状分析した。
この試験に用いたヒト臓器の細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。それらは、膠芽細胞腫U118−MG、乳癌MCF−7、MDA−MB−231及びT47D、並びに結腸直腸腺癌HT−29だった。細胞は、10%ウシ胎児血清で補完したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(オーストラリア、ビクトリア州のInvitrogen)(MCF−7、T47D、HT−29及びU118−MG)又は10%ウシ胎児血清を伴ったロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640(RPMI1640)(Invitrogen)(MDA−MB−231)による培養にて増殖させ、維持した。細胞は、5%CO2を含有する湿気のある雰囲気にて37℃で維持した。異種移植試験については、トリプシン処理によって単個細胞懸濁液を回収し、PBSで洗浄し、BALB/c−Foxn1nuメスマウスにおける移植のために0.1mLのPBSに再懸濁させた。腫瘍がいったんおよそ5〜8mm3に達したら、それらを切除し、10%の中性緩衝化ホルマリンで固定し、その後、処理し、包埋した。動物の処置はすべて科学目的での動物の管理及び使用のためのオーストラリア実務規則に従ってディーキン大学動物倫理員会によって認可された。
ポリリジンを被覆したスライド上で異種移植腫瘍のそれぞれに由来する切片を4μmに切断し、その後、Histoclearによって脱パラフィンを行い、エタノール勾配によって再水和を行った。トリス−EDTA緩衝液(10mMのトリス、1mMのEDTA、0.05%のTween20、pH9.0)を用いてマイクロ波オーブンにて20分間、熱誘導の抗原賦活化を行い、スライドを冷却した後、リン酸緩衝生理食塩水における0.1mg/mLのtRNA、0.1mg/mLのサケ精子DNA及び1mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)によるブロッキングを20分間行った。ブロッキング工程に続いて、0.1%のTween20を含有するPBSでスライドを2分間、2回洗浄し、その後、アプタマー又は抗体のいずれかと共にインキュベートした。アプタマーは以前記載された(上記Shigdar Sら)ように調製した。手短には、アプタマーを85℃に5分間加熱し、室温に10分間冷却し、次いで37℃で15分間加熱した。5mMのMgCl2、0.1mg/mLのtRNA、1mg/mLのBSA、10%のデキストラン硫酸及び500μg/mLのヘパリンを含有するPBSの溶液にて100nM濃度でのアプタマーと共に37℃で15分間スライドをインキュベートした。次いでスライドを各5分間3回洗浄し、その後、ビスベンズイミドヘキスト33342(3μg/mL)と共に10分間インキュベートした。次いでVECTASHIELDを用いてスライドを標本にし、カバーグラスをかけてFluoview FV10iレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。直接比較に使用した画像はすべて同一の露出パラメータで撮影し、デジタルコントラストの変更又はバックグランドの差し引きを行わずに提示した。抗EpCAM抗体323/A3(ab8601,Abcam)を用いて抗体染色を行った。抗体染色に先立って、上記で記載されたのと同じプロトコールに従ってスライドを洗浄し、ブロックした。抗体を10μg/mLの濃度に調製し、スライドを4℃で一晩インキュベートした。次いでスライドを5分間3回洗浄し、その後、10μg/mLの濃度でのヤギ抗マウスIgG AlexaFluor 647複合体(Invitrogen)と共に2時間インキュベートし、その後洗浄し、ビスベンズイミドヘキスト33342で染色し、カバーグラスをかけた。陰性対照のスライドは一次抗体をPBSに置き換えることによって得た。さらに、標準のプロトコールに従ってジーロングのSt.John of God病理研究所にて、ヘマトキシリン及びエオシン並びに抗EpCAM抗体BerEP4でスライドを染色した。
80%の集密度でトリプシン処理によって細胞を回収し、洗浄用緩衝液(5mMのMgCl2を伴ったDPBS)に再懸濁させ、数を数えた。遠心(1000×gで5分間)に続いて、細胞ペレットをアッセイ用緩衝液(5mMのMgCl2、0.1mg/mlのtRNA、0.1mg/mlのサケ精子DNA、0.2%[w/v]のアジ化ナトリウム及び5%FCSで補完したDPBS)に再懸濁させ、1×106個/mLに希釈した。ブロッキング工程は4℃で行った。アプタマーの結合は37℃で30分間又は4℃で1時間行い、結合アッセイすべてにおいて塩化マグネシウムの最終濃度は2.5mMだった。
標的タンパク質へのアプタマーの結合を確認するために、以前記載された方法(Willkomm及びHartmann (2005). Weinheim, Wiley-VCH GmbH & Co. KGaA 1:86-94)に従って反復回のRNAをその3’末端にてフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識した。全体を通して琥珀色の試験管を用いて光漂白をできるだけ抑えた。手短には、過ヨウ素酸ナトリウムで試料を酸化した。10mMのエチレングリコールの添加によって酸化を終了させ、その後エタノール沈殿を行った。30モル過剰でFITCを加え、4℃で一晩、反応を完了させた。100μLの結合緩衝液(5mMのMgCl2、0.1mg/mlのtRNA、0.1mg/mlのサケ精子DNAで補完したDPBS)にて氷上で1時間、1μMのFITC標識RNAをトリプシン処理した5×105個のKatoIII細胞又はU118−MG細胞と共にインキュベートし、その後、3回洗浄し、300μLのアッセイ用緩衝液に再懸濁させた。各試料の50,000事象をカウントすることによってFACS Canto IIフローサイトメータ(Becton Dickinson)により蛍光強度を測定した。未選択ライブラリに由来するFITC標識RNAを用いて非特異的結合を測定した。Ellington及び共同研究者ら(Liら (2009). J. Proteome Res 8:2438-48)によって記載された方法に従って、ゼロ回でのRNAの標的細胞への結合の蛍光強度並びに陰性対照細胞への結合の蛍光強度を差し引いた後、各回の結合を算出した。PBS中の2.5μg/mLのヨウ化プロピジウム及び0.5mg/mLのRNA分解酵素Aによる染色によって死細胞にゲートをかけ、それを解析から除外した。
標識の24時間前に、ガラスボトム8−チャンバースライド(Lab−Tek II,Nunc)にてcm2当たり75,000個の密度で細胞を播いた。DY647/Ep23及び対照アプタマーをフローサイトメトリーと同じ方法で調製した。培地の除去に続いて、細胞をアッセイ用緩衝液にて37℃で15分間インキュベートし、2回洗浄した後、2.5mgのMgCl2を伴った100nMのアプタマーと共に37℃で30分間インキュベートした。インキュベートの最後の15分の間にビスベンズイミドヘキスト33342(3μg/mL)(Sigma)を細胞に加えた。アプタマー溶液を取り除き、細胞を結合用緩衝液で各5分間3回洗浄した後、Fluoview FV10iレーザー走査共焦点顕微鏡(Olympus)を用いて視覚化した。
軽微な改変を伴うが原則的には共焦点顕微鏡について記載されたようにこれを実施した。手短には、カリウムを枯渇させた緩衝液(50mMのHepes、140mMのNaCl、2.5mMのMgCl2及び1mMのCaCl2)又は高張の緩衝液(3mMのKCl及び450mMのスクロースを含有するカリウムを枯渇させた緩衝液)のいずれかで細胞を37℃にて1時間予備処理した。これらの緩衝液はアプタマーとのインキュベート工程及びすすぎ工程すべてにおいても使用した。Alexa Fluor488(Invitrogen)に結合させたヒトのトランスフェリンの内部移行を定量的に特徴づけることによってエンドサイトーシスを阻害することにおけるこれらの処理の有効性を検証した。予備処理後、トランスフェリン(5μg/mL)を細胞に加えた後、37℃で30分間インキュベートした。細胞を各緩衝液で3回洗浄し、FluoView FV10i共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。
共焦点顕微鏡について以前記載されたようにT47D、MCF7、MDA−MB−231、HT29及びU118MGの細胞を調製した。培地の除去に続いて、5%(v/v)の血清を含有するブロッキング緩衝液にて37℃で15分間細胞をインキュベートし、結合緩衝液で2回洗浄した後、200nMのアプタマーと共に37℃で30分間インキュベートした。アプタマー溶液を取り除き、結合緩衝液で細胞を各5分間3回洗浄した。次いで細胞にトランスフェリンを加え、2時間インキュベートした後、最終の15分間のインキュベートの間に細胞にビスベンズイミドヘキスト33342(3μg/mL)(Sigma)を加えた。結合緩衝液で細胞を各5分間3回洗浄した後、FluoView FV10iレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。
ヒトのEpCAMのcDNAをInvitrogenから購入し、哺乳類発現ベクターpcDNA3.1/V5−His−TOPOにクローニングした。組換えの6×ヒスチジンのタグを付けたEpCAMをHEK293Tにて一時的に発現させ、以前記載された(Yeong SSら (2006) J Biol. Chem. 281 (41): 30768-81)ように全細胞の溶解物を調製した。結合緩衝液(5mMのMgCl2、0.1mg/mLのtRNA及び0.1mg/mLサケ精子DNAを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS))にてDELFIA抗マウス−IgGを被覆したプレート(PerkinElmer、カタログ番号4007−0010)の各ウェルを1μg/mLの抗Hisモノクローナル抗体と共に1時間インキュベートし、23℃にてSuperBlock(Pierce)によって1時間ブロックし、その後、結合用緩衝液で何回も洗浄した。組換えEpCAMを含有する細胞溶解物をウェルに加え、37℃で1時間インキュベートし、その後、結合緩衝液で6回洗浄した。EpCAMの細片を湿った環境で使用まで4℃にて保持した。
本開示の切り詰めたアプタマーを生成するために、所望の配列のセンス及びアンチセンスのDNAオリゴヌクレオチドを合成した。EpDT1(第1の切り詰め)は、センスオリゴヌクレオチド5’−TAATACGACTCACTATAGGTCCGTAGTTCTGGCTGACTGGTTACCCGGTCGTACA GCTCG−3’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド5’−CGAGCTGTACGACCGGGTA ACCAGTCAGCCAGAACTACGGACCTATAGTGAGTCGTATTA−3’に由来し、EpDT3(第3の切り詰め)はセンスオリゴヌクレオチド5’−TAATACGA CTCACTATAGCGACTGGTTACCCGGTCG−3’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド5’−CGACCGGGTAACCAGTCGCTATAGTGAGTCGTATTA−3’に由来した。アプタマー23はセンスオリゴヌクレオチド5’−TAATACGACTCACTATAACGTATCCCTTTTCGC GTA−3’及びアンチセンスオリゴヌクレオチド5’−TACGCGAAAAGGGATACGT−3’に由来した(T7 RNAプロモータ配列に下線を引く)。オリゴヌクレオチドの各対は、1×PEI緩衝液(0.1MのTris−HCl、pH8、0.1MのMgCl2、0.5MのNaCl及び0.1Mのジチオスレイトール)にて等モル比で混合し、90℃で5分間加熱し、室温にゆっくり冷却した後、エタノール沈殿を行った。試験管内での転写及びFITC標識は上述のように行った。このクローン(EpDT3)の最終切り詰めである5’−GCGACUGGUUCCCGGUCGdT−3’のフルオロピリミジン版も5’−DY647蛍光タグ及び3’逆位デオキシチミジン(Dharmacon)と共に化学的に合成した。EpCAM陽性及び陰性の細胞株並びに陰性対照(2−O−メチル−ピリミジン)アプタマー(5’−DY647−mGCmGACUmGmGUUmACCCmGmG UCmGdT−3’)を用いて本明細書で記載されるようにDY647/EpDT3の結合親和性を測定した。
EpCAM陽性及び陰性の細胞株並びに陰性対照(2−O−メチル−ピリミジン)アプタマー(5’−DY647−mGCmGACUmGmGUUmACCCmGmG UCmGdT−3’)と共にフローサイトメトリーを用いて、細胞表面に発現されたネイティブなEpCAMに対する上手く行った2−フルオロピリミジンRNAアプタマー種の平衡解離定数(K’d)を測定した。KatoIII細胞又はU118MG細胞(5×105個)を先ずアッセイ用緩衝液でインキュベートし、その後結合緩衝液で2回洗浄した後、100μLのアッセイ用緩衝液における一連の濃度(見かけのK’dのおよそ10倍前後)のFITC標識したアプタマーと共に氷上で1時間インキュベートした。細胞を3回洗浄し、2.5mMのMgCl2を含有する150μLのアッセイ用緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメトリー解析に供した。FITC標識の未選択ライブラリを別の陰性対照として用いた。未選択ライブラリの平均蛍光強度(MFI)をアプタマー/標的細胞のそれから差し引いて特異的結合のMFIを生成した。各アプタマーのK’dは、方程式:
[結合したアプタマー]/[アプタマー]=−(1/KD)×[結合したアプタマー]+([T]tot/KD)
(式中、[T]totは標的の総濃度を表す)
に従ってScatchard解析によって決定した。
2本のRNA鎖を合成し、長鎖を2’−フルオロピリミジンで化学的に修飾した。長鎖では、19ntのEpCAMアプタマーは2つのアミノ酸の架橋を介してサバイビンのsiRNA(Carvalho Aら (2003) J Cell Science 116:2987-2998))のガイド鎖に共有結合する一方で、サバイビンsiRNAのパッセンジャー鎖は短鎖として合成された。長鎖(A)及び短鎖(B)は双方とも、それぞれ43nt及び21ntについて−7.5kcal/モル及び−0.5kcal/モルの遊離エネルギーを持つ不安定な二次構造を有する。それに対して、理論的にはアニーリングの後、予想されるキメラは64ntについて−42.6kcal/モルの遊離エネルギー持つはるかに安定な構造を有する。このことは、アニーリングの後、これら2つの別々の鎖が予想されるアプタマー/siRNAのキメラ(C)を創る可能性が高いことを意味する。さらに、2nt(UU)オーバーハングはアニーリングの後創られ、それはsiRNAのガイド鎖の3’末端からのキメラのDicer酵素消化を促し、最終的に予想される21量体のsiRNAを生じる。蛍光分子(DY647)を短鎖の5’末端に加え、それは、画像解析を円滑にするだけでなく、キメラの構造対称性にも寄与し、Dicer処理の後予想されるsiRNAを生じる。
デキストラン硫酸及びヘパリンの存在下でインキュベートすると、抗EpCAMアプタマーDT3及び23は、100nMの濃度にて37℃15分間でT47D、MCF7及びMDA−MB−231のヒト乳癌異種移植片の非常に感度の高い染色を示した(図1)。実際、T47D及びMCF7よりもはるかに低い量のEpCAMを発現するMDA−MB−231異種移植片の切片の弱い染色によって明らかにされたように、染色パターンは乳房腫瘍細胞の表面に見られるEpCAM発現のレベルによく相関する。同様に、染色は特異性が高いことが示され、EpCAMを発現しないU118MG異種移植片では染色は検出されず、異種移植片切片のいずれにおいても対照アプタマーでは染色されなかった。最適化の過程で、酵素消化のような他の抗原賦活化法と同様に、パラフィン包埋組織を染色するのに知られる唯一の他のアプタマーと共に以前上手く利用された(Zeng Zら (2010). Mod Pathol. 23:1553-1558)ものに対して抗原賦活化法を試した。Zengと共同研究者らが37℃で行われた抗原賦活化によるアプタマーの上手く行った染色を示した(上記、Zeng Zら)一方で、本結果は同調しなかった。代わりに、本発明者らは、96〜100℃で20分間行った抗原賦活化が感度の高い且つ特異的な染色に高度に効果的であることを見いだした。
図1及び図2で示すように、抗EpCAM抗体323/A3を用いた3種の異なる乳癌異種移植片についての抗体染色の強度はアプタマー、特にアプタマー23のそれよりもはるかに弱い。しかしながら、抗体323/A3はHT−29結腸直腸癌異種移植片の中程度から強い染色を示した。彼らの研究室内で使用された蛍光染色のプロトコールの限界の可能性を排除するために、本発明者らは臨床病理研究室に相談し、結果を確認した。その研究室で使用中の標準のEpCAM染色は抗EpCAM抗体BerEP4である。病理診断の実践で使用されるこの抗体についての日常のプロトコールに従って、本発明者らは323/A3抗体を用いて達成されたものと類似する異種移植腫瘍すべての染色を得たということは、本アプタマーが病理で使用中の標準の抗体よりもはるかに感度が高いことを示している。
ここで調べられたヒト癌細胞株すべての間で、MDA−MB−231細胞は最も少ない量のEpCAMを発現する(MCF7における222.1×103結合部位/細胞に対してMDA−MB−231における1.7×103結合部位/細胞)(Prang Nら (2005). Br J Cancer 92:342-349)。興味深いことに、2種のアプタマー(DT3及び23)はMDA−MB−231の異種移植腫瘍にてEpCAMを上手く検出することができた一方で、2種の抗体はこの乳癌異種移植片のごくわずかな染色を示した(図1)。実際、抗体染色を用いて、フローサイトメトリー及び免疫組織化学試験の双方にて(Keller PJら (2010) Breast Cancer Res 12:R87)、MDA−MB−231細胞はEpCAM陰性として分類されるような低レベルのEpCAMの発現を有することが以前報告されている(上記Prang Nら)。対照的に、本発明者らはここで、RNAアプタマーは匹敵する濃度で、低レベルのEpCAMを確実に検出することができることを、抗体がそうはできない腫瘍にて明らかにしている。これらの結果は将来の診断応用のためのこれらアプタマーの有望な潜在性を示唆している。
サバイビンのsiRNAの有効性の確認及びEpCAMの中程度の結合親和性を示す以前の結果の確認に続いて、本発明者らはEpCAMアプタマーとサバイビンのsiRNAを用いて最初のアプタマー/siRNAのキメラを設計した(図2)。これら2つのRNA鎖の二次構造は「Nepack」(http://www.nupack.org)を用いて予測した。
予想されたアプタマー/siRNAのキメラを創るための長鎖及び短鎖双方の上手く行くアニーリング(95℃で5分間)を確認するために、ネイティブの高感度アガロースゲル(4%)を使用した。図3から理解できるように、キメラについて明確なバンドが観察されたということは、アニーリングを介して、以前の構造解析を裏付ける安定なキメラ構造が創られていることを示している(図2)。
図4は、アプタマーへのsiRNAの結合がアプタマーの内部移行能に影響を有さなかったことを示している。これらの結果は非特異的結合の欠如と併せて、EpCAM陰性細胞株HEK−293Tへの内部移行がないことによって示されるように、この複合体がEpCAM陽性細胞株へのsiRNAの効率的な送達分子として作用するはずであることを示している。
図5に示すように、注射の後、EpCAMアプタマー/siRNAのキメラは腫瘍にて特異的に濃縮することができ、この結果は4時間の中で連続して検出することができ、ピークはほぼ1時間の時点に存在した。腫瘍及び臓器を切り出し、試験管内で測定すると、アプタマー/siRNAのキメラからの蛍光は依然として腫瘍から、心臓、肝臓、脾臓及び肺よりも大きな強度で検出することができた。腎臓における高い蛍光シグナルは相対的に多い血流体積とキメラの小さな体積(約4nM及び血管を介して部分的に拡散することができた)から多分生じた。理論的に、PEG化のようなさらなる修飾及び完全な化学修飾を介して、さらに良好な血漿安定性及び腎臓や肝臓での蓄積の低さが達成され得る。
EpCAMアプタマー/サバイビンsiRNAのキメラ(64ntのRNAオリゴヌクレオチド)のサバイビンタンパク質の発現を阻害する能力を対照のサバイビンsiRNA(図2Cにて緑色で印を付けたパッセンジャー鎖を含まないキメラのより長い鎖)と比較した。図6で示す結果は、キメラはいったん細胞質に送達されるとDicer酵素によって上手く処理されて細胞にて21量体のsiRNAを生じたことを示している。実際、図7に示すように、試験管内でのDicer消化の解析では、アプタマー/siRNAのキメラは組換えDicer酵素によって上手く切断されて適切に処理された21量体のsiRNAを生じた。
図6から理解できるように、形質移入剤を含まないキメラとの24時間のインキュベートの後、EpCAMアプタマー/サバイビンsiRNAのキメラは、20nM及び100nMの用量で遺伝子サイレンシング能(それぞれ58.4%及び79.8%)を示した。このことは、このキメラが細胞培養及び動物体内の双方でEpCAM陽性細胞を標的とすることができるだけでなく(図4及び図5)、形質移入剤を必要とすることなく試験管内での遺伝子サイレンシングも生じることを示唆した。
EpCAMアプタマー又はEpCAM抗体の腫瘍に浸透する能力を調べるために、本発明者らは試験管内での三次元腫瘍塊モデルを使用した。高レベルのEpCAMを発現するヒト結腸腺癌細胞HT−29及びEpCAMを発現しないヒト腎臓細胞HEK293を幹細胞培養培地(20ng/mLのEGF及びFGF及びB27を伴ったDMEM/F12)にて培養した。腫瘍塊が約300〜400μmのサイズに達したら、腫瘍塊を100nMのPE標識した抗EpCAM抗体、Dy647標識したEpCAMアプタマー23、又はDy647標識したEpCAMに結合しない対照アプタマーと共にインキュベートした。示した時間のインキュベートの後、腫瘍塊をPBSで2回洗浄し、蛍光共焦点顕微鏡を介してイメージングした。腫瘍塊の位相差画像も各試料について撮影した。図8は、EpCAM抗体が4時間後でさえ、腫瘍塊の表面の数層の細胞にしか浸透できなかったことを示している。際立って対照的に、EpCAMアプタマー23は、インキュベートの30分後腫瘍塊のコア又は中心に浸透する一方で、EpCAMに結合しない対照アプタマー腫瘍塊への限定した非特異的な結合を示したに過ぎなかった。腫瘍塊をEpCAM抗体、アプタマー23又は対照アプタマーと共に4時間インキュベートし、PBSで2回洗浄した後、腫瘍塊を培養培地でさらに24時間インキュベートし、その後共焦点顕微鏡観察を行う保持試験を実施した。図9に示すように、EpCAM抗体については検出可能な蛍光はなかった。対照アプタマーについては非常に弱いシグナル(バックグランドノイズに近い)があった。逆に、腫瘍塊全体にわたってアプタマー23についての明瞭に検出可能なシグナルがあった。このことは、アプタマー23が腫瘍塊のコアに浸透できるだけでなく、少なくとも24時間腫瘍細胞によって保持され、それはその効率的な内部移行による可能性が最も高いことを実証している。EpCAMの標的化の特異性及び選択性は、アプタマー23がEpCAMを発現しないHEK293T腫瘍塊への最低限の結合を示した図10に示すデータによってさらに実証された。
非接着性の無血清条件下にて、癌幹細胞(CSC)及び前駆細胞のみが生き残り、自己再生を受け、並びに増殖して腫瘍塊を形成する。本発明者は、3μMの遊離のDox、3μM相当のアプタマーに結合したDox、3μMのDox/陰性対照アプタマー又は溶媒対照の存在下で超低接着性の96ウェルプレートに種々の細胞用量のHT−29結腸癌細胞の単個細胞懸濁液を5日間入れることによってアプタマー/Doxの癌幹細胞を標的化する能力を調べた。腫瘍塊(>50μmのサイズ)の数を数えた。Doxは非CSCのみを殺傷するという臨床試験及び前臨床試験双方の以前の知見と一致して、3μMの遊離のDoxはHT−29腫瘍塊の形成に影響を有さなかった(表3)
腫瘍塊形成は生体内での腫瘍形成性の代理アッセイなので、本発明者は試験管内で処理した細胞が異種移植の際、腫瘍を生成できるのかどうかを調べた。3μMの遊離のDox又はアプタマー/DoxでHT−29細胞を5日間処理し、1×104個又は1×105個の処理した細胞(マトリゲルと混合して)NOD/SCIDマウス(n=5)に皮下注射した。図12及び表4に示すように、遊離のDoxで処理した細胞は調べたマウスすべてにおいて腫瘍を形成したが、アプタマー/Dox処理した腫瘍移植を受けた後50日目でマウスの細胞に腫瘍は検出されなかった。
本発明者は先ず、オンサイトIVIS Lumina II画像ステーションによる生きている動物のイメージングを介して生体内でアプタマー/Doxの複合体が腫瘍を効率的に標的とすることができるかどうかを検討した。図13に示すように、Dy647標識したアプタマー/Doxはi.v.注射後5分でHT−29異種移植腫瘍(s.c.で約5mmのサイズ)に蓄積し、腫瘍におけるシグナルは約2時間続いた。代表的な極度限界希釈/異種移植アッセイ(ELDA)を用いて生体内で、アプタマー/DoxのCSCを標的とする能力をさらに調べた。この目的で、本発明者は1×106個のHT29細胞をs.c.でNOD/SCIDマウスに注射した。腫瘍が3mmのサイズに達したら、マウスを無作為化し、1日5mg/kgの用量で遊離のDox、EpCAMアプタマー/Dox、又は対照のアプタマー/Doxのいずれかの尾静脈注射によって3日間連続して処理した。最後の処理の1週間後マウスを屠殺した。図14に示すように、たった3回の注射の後、アプタマー/Dox処理群の腫瘍は、遊離のDox又は対照アプタマーに結合されたDoxよりも統計的に有意に小さかった/軽かった。繰り返した実験及び処理された腫瘍から調製した単個細胞懸濁液(図14に示すような)及びELDA(極度限界希釈アッセイ)によってCSCの頻度に対する効果を評価した。表5に示すように、EpCAMアプタマー/Doxの複合体は、播種後9週間で判定されたように生体内で腫瘍形成性を有意に低下させることができた。
PEG/アプタマー/Dox(5mgのDox/kg)をi.v.で担癌マウスに注射した。アプタマーELISAを介して測定した所与の組織/臓器の重量によって正規化したPEG/アプタマーのパーセンテージ(%)IDを図15で示す棒グラフにてプロットした。
ドキソルビシン(Dox)はそれ自体では癌幹細胞を殺傷しない。本発明者はサバイビンsiRNAのCSCを標的とする送達はCSCをDoxに対して感受性にするという仮説を立てた。実際、20nMのキメラ足す300nMのDoxによる72時間の処理(形質移入剤を含まずに)の後、腫瘍塊アッセイの1回目と2回目の双方で腫瘍様塊の数で約80%の減少があった(示さず)ということは、癌幹細胞の有意な部分が排除されていることを示している。本発明者はさらに、極度限界希釈法と組み合わせてNOD/SCIDマウスの第4鼠径乳房脂肪体に処理した細胞を異種移植してCSCの頻度(移植後40日目で)を評価することによって癌幹細胞の腫瘍形成性に対するキメラ足すDoxの効果を確認した(表6)。最終的に図16で示すように、キメラ足す300nMのDoxによる試験管内での腫瘍塊の処理は、遊離のDoxのみに比べて乳癌CSC(EpCAM+/CD44+/CD24−)の有意な減少を生じた(図16)一方で、溶媒対照又は陰性対照のキメラ足すDoxで処理した細胞ではEpCAM+/CD44+/CD24−集団はそれぞれ約22.5%及び21.7%残っていた。これらの結果は、EpCAMアプタマー/サバイビンsiRNAのキメラは試験管内でのMCF7/ADR乳癌薬剤耐性モデルにて癌幹細胞を標的とすることを立証している。
NOD/SCIDマウスにて部位当たり3×106個のMCF7/ADR細胞(マトリゲルと混合して)を移植することによって同所性乳癌モデルを確立した。腫瘍が約200mm3の体積に達したら、我々は尾静脈注射を介した処理を開始した。1、3及び5日目に1ナノモルのEpCAMアプタマー/siRNAのキメラのi.v.(ボーラス)注射によって、及び2、4及び6日目に5mg/kgのドキソルビシンのi.v.(ボーラス)注射によってマウス(n=5)を処理した。10日目に動物を安楽死させ、腫瘍を回収し、異種移植及び生体内極度限界希釈解析に供した。図17に示すように、サバイビンのmRNA及びタンパク質を約60%ノックダウンする能力によってキメラ(PEGなし)の生体内での有効性が明らかにされた。重要なことに、腫瘍(移植後50日目)の癌幹細胞、自己再生及び腫瘍形成性の際立った特徴を評価する異種移植/極度限界希釈解析から明らかなように、Doxの処理と併用したサバイビンsiRNAのEpCAMが標的化した送達は生体内でMCF7/ADR腫瘍にて癌幹細胞の実質的な部分を排除した(表7)。
その全身性の循環時間を延ばすために、siRNA/アプタマーのキメラの5’末端に20kDaのPEGを連結した。次いで本発明者は部位当たり3×106個のMCF7/ADR細胞(マトリゲルと混合して)を移植することによって同じ同所性乳癌モデルを用いた。腫瘍が約200mm3の体積に達したら、我々は処理を開始した。1、3及び5日目に1ナノモルのEpCAMアプタマー/siRNAのキメラのi.v.(ボーラス)注射によって、及び2、4及び6日目に5mg/kgのドキソルビシンのi.v.(ボーラス)注射によってマウス(n=8)を処理した。最後(3回目)の処理後2日目に腫瘍を取り出し、その重量を測定し、処理群及び種々の対照群における乳癌幹細胞マーカー(EpCAM+/CD44+/CD24−)陽性細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーを介して検討した。図18に示すように、EpCAM23アプタマー/サバイビンsiRNAのキメラ足すドキソルビシンで処理したマウスに由来する腫瘍は、遊離のドキソルビシンで処理した群を含む他の処理群よりも腫瘍の総塊(重量)を有意に低下させた。さらに、乳癌幹細胞マーカー陽性細胞の比率から判断して、EpCAM23アプタマー/サバイビンsiRNAのキメラ足すドキソルビシンによる処理は乳癌幹細胞のプールを劇的に減らした(表8)。
Claims (21)
- (i) 配列ACGUAUCCCUUUUCGCGUA(配列番号2)又は
(ii)以下:
を含む、EpCAMに特異的に結合するRNAアプタマー。 - 90nM±10%以下のEpCAMに対する解離定数を有し、及び/又は配列の長さが19〜40塩基の間である、請求項1に記載のRNAアプタマー。
- 配列番号2の配列から成る、請求項1又は2に記載のRNAアプタマー。
- アプタマーの安定性を高める1以上の修飾を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 2’−フルオロ修飾されている、請求項4に記載のアプタマー。
- EpCAM+細胞に特異的に結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のアプタマー。
- EpCAM+細胞が癌幹細胞である、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 前記細胞が生体内又は試験管内にある、請求項6又は7に記載のアプタマー。
- 前記細胞が対象から得られる生物試料に存在する、請求項6又は7に記載のアプタマー。
- 前記細胞が、乳癌幹細胞、前立腺癌幹細胞、膵臓癌幹細胞、結腸癌幹細胞、肝臓癌幹細胞、肺癌幹細胞、卵巣癌幹細胞、又は頭頸部の癌幹細胞である請求項6〜9のいずれか1項に記載のアプタマー。
- 酵素、補欠分子族、蛍光物質、生物発光物質、高電子密度標識、MRI用標識及び放射性物質並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な標識に結合させた、請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマーを含む診断剤。
- 生物試料の組織学的検査に使用するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマー又は請求項11に記載の診断剤。
- 毒素、放射性核種及び化学療法剤並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される部分に結合させた請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマーを含む抗癌剤。
- 対象から得られる生物試料からEpCAMを発現している細胞及び/又は癌幹細胞を単離する、精製する又は濃縮するインビトロの方法であって、前記細胞を請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマー又は請求項11に記載の診断剤に接触させるステップを含む、方法。
- 癌を有するか又は癌を有することが疑われる対象から得られる生物試料においてEpCAMを発現している細胞及び/又は癌幹細胞を特定するインビトロの方法であって、前記細胞を請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマー又は請求項11に記載の診断剤に接触させるステップを含む、方法。
- 前記対象が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部の癌、黒色腫又はEpCAM+細胞が存在する任意の他の癌から選択される癌を有する、請求項14又は15に記載の方法。
- 対象において癌を治療する又は予防するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマー又は請求項13に記載の抗癌剤。
- siRNA又はリボザイムに結合させた請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマーを含む送達剤。
- 配列ACGUAUCCCUUUUCGCGUAAAAUGUAGAGAUGCGGUGGUCCUU(配列番号3)を含む、請求項18に記載の送達剤。
- 薬学上許容可能なキャリア及び/又は賦形剤と一緒に、治療上有効な量の請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマー、請求項13に記載の抗癌剤、又は請求項18若しくは19に記載の送達剤を含む組成物。
- 腫瘍の分子イメージングにて使用するための請求項1〜10のいずれか1項に記載のRNAアプタマー又は請求項11に記載の診断剤。
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