CN104854243B - 用于检测癌症干细胞的EpCAM适配子 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及RNA适配子及其应用，具体而言，涉及特异性结合EpCAM并显示优良的肿瘤渗透能力的适配子。

Description

用于检测癌症干细胞的EpCAM适配子
相关申请和通过引用并入
本文所引用或参考的所有文献，以及本文所引文献中引用或参考的所有文献，连同本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的所有制造商的使用说明、描述、产品说明书和产品手册，均通过引用以其整体并入本文中。
技术领域
本公开涉及RNA适配子及其应用，具体而言，涉及特异性结合EpCAM并显示优良肿瘤渗透能力的适配子。
发明背景
上皮细胞粘附分子EpCAM(也称为CD326或ESA)为多效分子，能够促进和防止上皮细胞-细胞粘附。它是以低水平在多种人上皮组织中表达的30-40kDa I型糖基化膜蛋白。EpCAM在大多数实体癌症中过表达。例如，在多于98％的患有结肠直肠癌的患者中发现了EpCAM的密集表达。二十年的研究已阐明了EpCAM在肿瘤发生中的作用。EpCAM不是拮抗细胞凋亡，而是通过诱导增殖起作用，其对上调原癌基因c-myc及细胞周期素A和E的细胞周期调控，以及通过Wnt通路进入细胞核的信号转导具有直接影响。
最近发现小部分的癌细胞具有无限的增殖潜力，并能够自我更新和生成分化的癌细胞后代。这些所谓的癌症干细胞(CSC)耐受化疗和放疗。据认为细胞毒性药物和辐射主要杀伤大肿瘤细胞，但不杀伤癌症干细胞。因此，为了有效根除癌症，必须靶向和清除癌症干细胞以及它们的后代细胞。
上皮细胞粘附分子已被确定为多种实体癌症的癌症干细胞标志物，包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌和肝癌。EpCAM在多种癌症中的表达似乎与患者的预后负相关(Baeuerle PA et al(2007).Br J Cancer96:417-23)。使用抗EpCAM抗体的初始临床试验未能提供客观的临床反应。据认为大体积的抗体限制了单克隆抗体的分布和递送。另外，依赖于抗体的细胞毒性依赖于抗体的CH2中的糖类组分，其在抗体制备期间可显著改变。因此，需要较小的和更有效的EpCAM靶向分子用于靶向性癌症治疗。
发明概述
考虑到当前的抗EpCAM抗体治疗的不同成功，发明人试图开发出靶向EpCAM癌症干细胞标志物的耐核酸酶RNA适配子。因为适配子比抗体小10-20倍，它们具有极好的组织渗透特性，并因此在癌症靶向上优于抗体。虽然适配子显示出良好的前景，但将它们用作用于免疫组织化学的探针的报道有限。虽然不希望受到理论的束缚，由于这些多聚阴离子核酸适配子与带正电荷的位点如核中存在的组蛋白的静电引力，已提出在组织学方案中与用适配子替换抗体相关的一项困难可能来自它们的非特异性染色。
本公开描述了具有诊断和治疗潜力的针对EpCAM的RNA适配子。
本公开提供了分离的RNA适配子，其特异性结合EpCAM，其中所述适配子不是具有序列5’–GCGACUGGUUACCCGGUCG-3’(SEQ ID NO:1)的DT3。
本公开提供了分离的RNA适配子，其特异性结合EpCAM，所述适配子包含序列5’–ACGUAUCCCUUUUCGCGUA-3’(SEQ ID NO:2)。在一个实例中，所述EpCAM为人EpCAM。
在一个实例中，本公开的适配子具有针对表达于乳腺肿瘤细胞系上的EpCAM的约90nM或更小的解离常数。在另一个实例中，解离常数为约65nM或更小。在另一个实例中，解离常数为约45nM或更小。在另一个实例中，针对MDA-MB-231细胞的解离常数为约87nM。在另一个实例中，针对MCF7细胞的解离常数为约64nM。在另一个实例中，针对T47D细胞的解离常数为约41nM。
在另一个实例中，本公开的适配子针对表达于结肠癌细胞系(HT29细胞)上的EpCAM具有约37nM的解离常数。
在另一个实例中，分离的RNA适配子基本上由SEQ ID NO:2所示的序列组成。
在另一个实例中，分离的RNA适配子由SEQ ID NO:2所示的序列组成。
在另一个实例中，分离的RNA适配子包含SEQ ID NO:2所示的序列，其中序列长度为19-100个碱基。在另一个实例中，序列长度为19-40个碱基。在另一个实例中，序列长度为19-30个碱基。在另一个实例中，序列长度为19-25个碱基。如本文所用的术语“碱基”应理解为是指核苷酸碱基或残基，其为鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)或胞嘧啶(C)。所述碱基可在胞嘧啶和鸟嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶以及鸟嘌呤和尿嘧啶之间形成氢键。
在另一个实例中，所述序列包含SEQ ID NO:2的序列中的一个或多个取代。在另一个实例中，所述序列包含SEQ ID NO:2序列中的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个取代。在另一个实例中，所述序列包含位于SEQ ID NO:2所示的适配子的茎区中的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个取代。在一个实例中，所述茎区为预测的适配子的二维结构的区域。
在一个实例中，适配子包含一个或多个修饰(经修饰的适配子)，其能改善适配子的稳定性(体外或体内)。合适的修饰在本文其他地方有论述。在一个实例中，嘧啶碱基经2’-氟代(2’-F)修饰。在另一个实例中，RNA适配子的3’端被修饰以防止其被核酸酶消化。在另一个实例中，适配子通过将5’端与荧光团或反向的dT或与PEG分子结合而被修饰。
本公开还提供了分离的RNA适配子，其与包含SEQ ID NO:2所示的序列的适配子具有基本上相同的结合EpCAM的能力，其中所述适配子不是具有序列5’–GCGACUGGUUACCCGGUCG-3’(SEQ ID NO:1)的DT3。
在一个实例中，适配子特异性结合EpCAM+细胞。在另一个实例中，所述EpCAM+细胞为干细胞。在另一个实例中，所述干细胞为分离的癌症干细胞。在另一个实例中，所述癌症干细胞特征在于：(i)表达EpCAM，(ii)为致瘤性的，(iii)能够自我更新，(iv)能够分化，并且(v)耐受常规治疗引起的细胞凋亡。
可选地，癌症干细胞可以描述为从诸如生物样品的来源分离的、富集的或纯化的。在另一个实例中，癌症干细胞代表基于EpCAM+表达富集的细胞群。在另一个实例中，所述细胞群包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的癌症干细胞。
在一个实例中，表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞存在于体内。在另一个实例中，表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞存在于体外。在另外的实例中，表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞存在于获自个体的生物样品中。
在另一个实例中，本公开的表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞可以表达一种或多种其他的抗原，包括CD44、ABCG2、β-连环蛋白、CD117、CD133、ALDH、VLA-2、CD166、CD201、IGFR和EGF1R。
在另一个实例中，根据本公开的癌症干细胞为乳腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、胰腺癌干细胞、结肠癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞、卵巢癌干细胞或头颈癌干细胞。
本公开还提供了包含本文所述的RNA适配子的诊断剂。
在一个实例中，所述诊断剂包含与可检测标记结合的本公开的RNA适配子。
本领域技术人员应理解，本发明的适配子避免可能与非特异性抗体结合有关的复杂状态，并因此提供优良的信噪比。
在一个实例中，本文所述的诊断剂被用于检测体内或体外表达EpCAM的癌症干细胞。
在一个实例中，本公开的RNA适配子在诊断上可用于检测患有肿瘤或疑似患有肿瘤的个体或获自患有肿瘤或疑似患有肿瘤的个体的生物样品中的表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞的存在。能够通过将所述适配子与可检测标记结合来促进检测。可检测标记的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。
本公开还提供了用于生物样品的组织学检查的如本文所述的RNA适配子或如本文所述的诊断剂。制备组织学制剂的方法是本领域技术人员所熟悉。
本公开还提供了包含如本文所述的RNA适配子的抗癌剂。
在一个实例中，抗癌剂包含本公开的与部分结合的RNA适配子。所述部分可选自：放射性核素、化疗剂、si-RNA或毒素或以上物质的组合。在其他的实例中，抗癌剂包含RNA适配子-生存素siRNA缀合物，其包含序列5’-ACGUAUCCCUUUUCGCGUAAAAUGUAGAGAUGCGGUGGUCCUU-3’(SEQ ID NO:3)。
在一个实例中，如本文所述的抗癌剂被用于治疗个体中的癌症。在一个实例中，所述个体为从用本公开的RNA适配子进行治疗获益的个体。在另一个实例中，所述个体为已诊断患有癌症的个体。在另一个实例中，所述个体为患有实体瘤的个体。在其他的实例中，所述个体为患有选自以下的癌症的个体：乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌或其中存在EpCAM+细胞的任何其他癌症。
本公开的适配子能够与部分结合，并且所述适配子被用于将所述部分引导至肿瘤部位，所述肿瘤部位包含或疑似包含表达EpCAM的癌症干细胞。部分的实例包括能够用于杀伤癌症干细胞的毒素、放射性核素或化疗剂，或者能够用于定位包含表达EpCAM的细胞的肿瘤以及确定其大小的显像剂。
包含本公开的RNA适配子的抗癌剂可另外包含一种或多种有效成分。
本公开还提供了从获自个体的生物样品分离、纯化或富集表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与本公开的RNA适配子或本公开的诊断剂接触。在一个实例中，所述方法在体外进行。
分离、纯化或富集表达EpCAM的细胞的方法为本领域技术人员已知，并且也在本文其他地方有描述。
本公开还提供了鉴定患有或疑似患有癌症的个体中的或获自患有或疑似患有癌症的个体的生物样品中的表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞的方法，所述方法包括将所述细胞与本公开的分离的RNA适配子或本公开的诊断剂接触。
本公开还提供了治疗或预防个体中的癌症的方法，包括向个体提供本文所述的RNA适配子或本文所述的抗癌剂。
在一个实例中，癌症为其中存在或疑似存在表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞的任何癌症。在另一个实例中，个体为已被诊断为患有癌症的个体。在另一个实例中，个体为患有实体瘤的个体。在其他的实例中，个体为患有选自以下的癌症的个体：脑癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌或其中存在EpCAM+细胞的任何其他癌症。
本公开还涉及如本文所述的RNA适配子或抗癌剂在医药中的应用。
本公开还涉及如本文所述的RNA适配子或抗癌剂用于治疗或预防个体中的癌症的用途。
本公开还涉及如本文所述的RNA适配子或抗癌剂在制备用于治疗或预防个体中的癌症的药物中的用途。
本发明还涉及包含与siRNA或核酶结合的本文所述的RNA适配子的递送剂。在一个实例中，所述递送剂包含RNA适配子-生存素siRNA缀合物，其包含序列5’-ACGUAUCCCUUUUCGCGUAAAAUGUAGAGAUGCGGUGGUCCUU-3’。
本公开还提供了包含治疗有效量的如本文所述的RNA适配子、抗癌剂或递送剂，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物。
本公开还提供了用于肿瘤分子成像的如本文所述的RNA适配子或如本文所述的诊断剂。
本发明的RNA适配子的肿瘤渗透能力相比抗体提供了独特的肿瘤分子成像的优势。例如，RNA适配子能够与促进具有表达EpCAM的细胞的肿瘤的检测和成像的试剂结合。合适的试剂的实例包括如本文所述的检测标记。
如本文所述的RNA适配子、诊断剂、抗癌剂、递送剂或药物组合物可以单独使用，或与其他治疗形式组合使用。例如，RNA适配子、诊断剂、抗癌剂、递送剂或药物组合物可以与化疗和/或放疗组合使用。虽然不希望受到理论的束缚，假定化疗剂或放疗剂可通过首先靶向通常为癌症干细胞的后代细胞的快速分裂细胞用于减小肿瘤。所述诊断剂可通过检测肿瘤中的癌症干细胞的存在或缺乏，用于确定任何先前的治疗形式清除癌症干细胞的效果。然后，可将包含本公开的RNA适配子的抗癌剂、递送剂或药物组合物施用到肿瘤部位，以特异性消减癌症干细胞。因此，包含RNA适配子的抗癌剂、递送剂或药物组合物可与化疗或放疗一起使用，或者在化疗或放疗后使用。还涉及本公开的RNA适配子能够与靶向癌症干细胞上存在的抗原的一种或多种其他的适配子组合。
应理解，本公开的每个实例加上必要的变更适用于治疗、预防或减轻个体中的癌症的方法。
应理解，本公开的每个实例加上必要的变更适用于肿瘤的分子成像。
附图说明
图1.使用适配子和抗体检测石蜡包埋的组织中的EpCAM。
A:通过EpCAM适配子DT3和23、对照适配子和抗EpCAM抗体323/A3，对乳腺癌(T47D、MCF7和MDA-MB-231)、结肠癌(HT-29)和胶质母细胞瘤(U118MG)异种移植物肿瘤进行免疫荧光染色(蓝色:核；红色:EpCAM阳性染色)。B:以抗EpCAM抗体BerEP4进行免疫组织化学，并通过苏木精和伊红染色评估所有肿瘤，以进行形态确认。在37℃下进行适配子染色15min，而在4℃下进行323/A3染色过夜，并在室温下进行BerEP420min。所有的荧光图像均在60x下采集，而光学显微图像在20x下采集。图像代表至少3次单独的实验。比例尺：50μm。
图2.EpCAM适配子-siRNA嵌合体的结构
用于通过EpCMA适配子引导的siRNA体内递送的嵌合体由3个元件组成：与EpCMA配子连接的siRNA的引导链(A)、siRNA的过客链(B)和连接子。图2C显示了组装的siRNA-适配子嵌合体。为了促进分子成像，Dy647荧光染料与siRNA的过客链的5’端连接(C)。通过细胞质中的Dicer酶加工后预计的终产物显示在(D)中。
图3.使用非变性琼脂糖凝胶进行嵌合体分析。
退火后，在2％非变性琼脂糖凝胶中分析嵌合体和单个组分的长度。用染色RNA。较长链的分析生成了3条条带(分别为25bp、55bp和200bp)，这可能与其不稳定性、复杂结构(43nt为ΔG-7.5kcal/mol)有关，而较短的链仅检测到1条条带(20bp,21nt为ΔG-0.5kcal/mol)。在两条链退火后，显示出1条条带(嵌合体，50bp)，表明生成了新的稳定结构(64nt为ΔG-42.6kcal/mol)。
图4.EpCAM适配子-siRNA嵌合体被EpCAM阳性HT-29结肠腺癌细胞特异性内化。
将DY-647标记的EpCAM适配子-siRNA嵌合体与所示的人癌症细胞一起在37℃下孵育30min，然后使用激光扫描共聚焦显微镜显像。对于每组图面，荧光图像在上面，且光学(相衬)图像在下面。(A)嵌合体与HEK-293T(EpCAM阴性)和HT-29(EpCAM阳性)癌症细胞系的结合和亚细胞分布。(B)显示单个HT-29细胞中的荧光标记的EpCAM适配子-siRNA嵌合体的标点图的放大的显微图。比例尺＝20μm。
图5.乳腺肿瘤的异种移植物模型中，适配子-siRNA嵌合体的体内靶向功效。
(A)将T47D导管癌细胞(EpCAM阳性)原位异种移植至8周大的NOD/SCID小鼠的第4乳腺中。当肿瘤达到约0.2cm3的体积时，通过尾静脉注射将Dy647标记的siRNA-EpCAM适配子嵌合体与嵌合体(1nmol/只小鼠)一起给予小鼠。注射后，在所示的不同时间点使用Xenogen IVIS Lumina II成像系统测量荧光密度。(B)嵌合体的相对荧光信号强度-时间特性。用背景(在0分钟时测得的荧光值)将每个时间点的荧光值标准化。(C)注射后4小时，当荧光从活的动物成像消失时，切开图中所示的肿瘤和器官，并立即使用Xenogen IVISLumina II成像系统测量荧光强度。(D)siRNA-适配子嵌合体的生物分布和肿瘤摄取特性。用背景的荧光值将来自每个器官和肿瘤的荧光值标准化。相对嵌合物量显示在右侧的直方图中。
图6.EpCAM适配子-siRNA嵌合体介导的生存素表达的抑制。
不使用转染试剂如Lipofectamine 2000，在完全细胞培养基(含有10％胎牛血清)中用不同浓度的嵌合体(10nM和40nM)将HT-29细胞孵育24hr。在用PBS洗涤3次后，用生长培养基将细胞再孵育48h，然后进行细胞裂解，在12％SDS-PAGE凝胶上分离，并进行HT-29细胞中生存素蛋白的Western印记分析的Western分析(A)。将β-肌动蛋白用作内部上样对照。(B)通过siRNA-适配体嵌合体进行生存素蛋白的敲低。生存表达水平被标准化为生存素蛋白表达水平与β-肌动蛋白表达水平的比值。
图7.嵌合体的体外Dicer加工。
用重组人Dicer酶(1单位/反应)孵育嵌合体12小时。在4％Metapher琼脂糖凝胶上对Dicer切割的产物或未切割的产物进行显像。阴性对照嵌合体为无过客链的嵌合体。将双链生存siRNA用作对照来标记21-mer双链RNA在凝胶上的位置。
图8.适配子23在体外对肿瘤球体的有效渗透。
将HT-29或HEK293T细胞培养在干细胞培养基(DMEM/F12，含有20ng/ml EGF和FGF和B27)中。当肿瘤球体达到～300-400μm的大小时，将球体与100nM PE标记的抗EpCAM抗体、DY647标记的EpCAM适配子-23或DY647标记的不结合EpCAM的对照适配子一起孵育。在孵育0.5、1、2或4h后，用PBS洗涤球体2次，并通过荧光共聚焦显微镜成像。还针对每个样品采集了球体的相衬图像。图A为抗体EpCAM的荧光图像，图B为肿瘤球体的相衬图像。图C:适配子EpCAM 23的荧光图像，图D:肿瘤球体的相衬图像。图E:适配子对照的荧光图像，图F:肿瘤球体的相衬图像。
图9.肿瘤球体中的适配子滞留。
将肿瘤球体与EpCAM抗体、适配子-23或对照适配子一起孵育4h。在用PBS洗涤两次后，将肿瘤球体用培养基再孵育24h，然后进行共聚焦显微镜检测。图A:抗体或适配子的荧光图像。图B:肿瘤球体的相衬图。
图10.适配子-23在肿瘤球体渗透中的特异性和选择性。
在分别与EpCAM抗体或适配子23孵育4小时后，用PBS将肿瘤球体洗涤两次，并再培养24h，然后进行共聚焦显微镜检测。图面A:适配子23的荧光图像。图面B:肿瘤球体的相衬。图面C:抗EpCAM抗体的荧光图像。图面D:肿瘤球体的相衬图。
图11.处理后的CSC标志物分析
用EpCAM适配子-Dox(B)或仅Dox(A)处理的HT29球体中的EpCAM、CD44和CD24表达的流式细胞术分析。
图12.体外处理对体内肿瘤生长的影响。
在给予了Dox处理的细胞或EpCAM适配子-Dox处理的细胞的小鼠中，针对时间测量了HT29异种移植物肿瘤大小(以体积计)。
图13.活的动物成像
在单次静脉内注射0.75纳摩尔Dy647-适配子-Dox后HT29肿瘤荧光的时间进程。
图14.适配子-Dox的体内治疗功效
从仅用阿霉素或EpCAM适配子-Dox处理的携带HT29异种移植肿瘤的小鼠中切除的肿瘤(A)。平均肿瘤重量(B)。
图15.PEG-适配子-Dox的生物分布和体内稳定性
经静脉内将PEG-适配子-Dox(5mg Dox/kg)注射入携带HT-29结肠癌异种移植物(s.c)的NOD/SCID小鼠中。通过经适配子ELISA测定的用给定组织/器官的重量(g)标准化的PEG-适配子的百分比(％)注射剂量(ID)描绘在条形图中。
图16.CSC标记物分析的实例
相对于仅用Dox处理，用EpCAM适配子-siRNA嵌合体和Dox(B)处理(i.v.)的MCF-7/ADR肿瘤球体中的EpCAM、CD44和CD24通过流式细胞术的表达。
图17.通过MCF-7/ADR肿瘤异种移植物模型(n＝5)中的适配子-siRNA嵌合体敲低生存素的体内功效
通过蛋白免疫印迹(A)或通过定量RT-PCT(B)得到的生存素表达，其显示了通过EpCAM适配子-siRNA嵌合体得到的体内肿瘤靶向的RNAi的体内功效。
图18.3次处理(n＝8)后的肿瘤重量
在第1、3和5天用EpCAM适配子-siRNA PEG嵌合体的静脉快速浓注，以及在第2、4、6天用阿霉素的静脉快速浓注，处理携带MCF-7/ADR肿瘤的小鼠。在最后(第3次)处理后2天，去除肿瘤并称重。
序列表说明
SEQ ID NO:1是特异性结合EpCAM的适配子的核苷酸序列；
SEQ ID NO:2是特异性结合EpCAM的适配子的核苷酸序列；
SEQ ID NO:3是特异性结合EpCAM的适配子-siRNA嵌合体的核苷酸序列。
发明详述
一般技术和所选定义
术语“和/或”，例如“X和/或Y”，应理解为是指“X和Y”或者“X或Y”，并且应当理解为提供了对两种含义或其中的一种含义的明确支持。
本公开中包括的任何文献、行为、材料、装置、物品等的论述不应理解为承认这些事物中的任一种或所有这些事物组成了现有技术基础的一部分，或者由于其出现于本申请的每项权利要求的优先权日期之前而为与本公开相关的领域中的公共常识。
在整个本说明书中，除非明确地另有所述，或者上下文另有要求，提及单个步骤、组合物、步骤组合或者组合物组合应当理解为包括这些步骤、组合物、步骤组合或者组合物组合中的一项和多项(即，一项或多项)。
除非明确另有所述，本文中描述的每个实例加以必要的修改适用于本公开的其他实例中的每一个。
本领域技术人员理解本公开易于进行除明确描述的那些以外的改变和修饰。应理解，本公开包括所有这样的改变和修饰。本公开还包括本说明书中单独或整体提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有所述步骤或特征的组合或者所述步骤或特征中的任何两项或更多项的组合。
本公开的范围并不限于本文中描述的具体实例，这些具体实例仅旨在用于示例性目的。功能等同产物、组合物和方法显然位于本公开的范围中。
除非另有所示，不需要过多的实验，使用分子生物学、重组DNA技术、细胞生物学和免疫学的常规技术即可实施本公开内容。此类操作描述于，例如，Sambrook,Fritsch &Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratories,New York,第二版(1989)，第I、II和III卷全卷；DNA Cloning:A PracticalApproach,第I和II卷(D.N.Glover,ed.,1985),IRL Press,Oxford,全文；OligonucleotideSynthesis:A Practical Approach(M.J.Gait,ed,1984)IRL Press,Oxford,全文，且尤其是其中的Gait的文章,ppl-22；Atkinson et al,pp35-81；Sproat et al,pp83-115；以及Wuet al,pp 135-151；4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(B.D.Hames& S.J.Higgins,eds.,1985)IRL Press,Oxford,全文；Immobilized Cells and enzymes:APractical Approach(1986)IRL Press,Oxford,全文；Perbal,B.,A Practical Guide toMolecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan,eds.,Academic Press,Inc.),全文,Sakakibara,D.,Teichman,J.,Lien,E.L and Fenichel,R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield,R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85,2149-2154；Barany,G.and Merrifield,R.B.(1979)The Peptides(Gross,E.and Meienhofer,J.eds.),vol.2,pp.1-284,Academic Press,New York.12.Wünsch,E.,ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden derOrganischen Chemie(Müler,E.,ed.),vol.15,第4版.,第1和2部分,Thieme,Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.& Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25,449-474；Handbook of Experimental Immunology,VoIs.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986,Blackwell Scientific Publications)；以及Animal Cell Culture:Practical Approach,第3版(John R.W.Masters,ed.,2000),ISBN0199637970,全文。
在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”或者变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为意指包括所述的步骤或元件或整体，或者步骤或元件或整体的组合，但不排除任何其他的步骤或元件或整体，或者元件或整体的组合。
术语“由…组成(consists of/consisting of)”应理解为意指方法、过程或组合物具有所述的步骤和/或组分，并且没有其他的步骤或组分。
如本文所用，术语“约”在涉及可测量的值如重量、时间、剂量等的量时，是指包括与所示量的±20％或±10％，更优选±5％，甚至更优选±1％，并且甚至更优选±0.1％的差异，因为这样的差异适合实施所公开的方法。
如本文所用的术语“适配子”一般是指单个定义的序列的寡核苷酸，或者所述寡核苷酸的混合物，其中所述混合物保留了特异性结合EpCAM的特性。如本文所用，“适配子”是指单链核酸。在结构上，本公开的适配子为特异结合性寡核苷酸。
如本文所用的术语“寡核苷酸”通用于多脱氧核糖核苷酸(含有2’-脱氧-D-核糖或其经修饰的形式)，即DNA；多核糖核苷酸(含有D核糖或其经修饰的形式)，即RNA；以及任何其他类型的多核苷酸，其为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或C-糖苷，或者经修饰的嘌呤或嘧啶碱基或无碱基核苷酸。根据本公开的内容，术语“寡核苷酸”不仅包括具有常规碱基、糖残基和核苷酸间连接的那些，还包括包含这3个部分中的任何一个或全部的修饰的那些。
如本文所用的术语“RNA适配子”是包含核糖核苷单元的适配子。RNA适配子还意在包括如本文所定义的RNA类似物。
如本文所用，术语“结合亲和力”和“结合活性”意指配体分子/适配子结合或不结合靶标的倾向，并且描述了对配体分子/适配子结合靶标的结合强度或亲和力的度量。所述相互作用的能量学在“结合活性”和“结合亲和力”上是显著的，因为其确定了相互作用伴侣的必要浓度、这些伴侣能够结合的速率，以及溶液中结合和游离分子的相对浓度。所述能量学在本文中是通过测定解离常数Kd以及其他方式来表征的。如本领域所已知的，低的解离常数指示分子彼此间的较强的结合和亲和力。在一个实例中，解离常数至少为10-6M。在另一个实例中，解离常数至少为10-8何10-9M。
如本文中所用，术语“生物样品”是指来自个体的细胞或细胞群或一定量的组织或流体。最经常情况下，样品已经从个体移除，但术语“生物样品”也可指体内分析的细胞或组织，即未从个体移除的细胞或组织。通常，“生物样品”包含来自个体的细胞，但该术语也可指能够用于测量基因表达水平的非细胞的生物物质，如血液、唾液或尿液的非细胞部分。生物样品包括但不限于组织活检、穿刺活检、刮擦物(例如，口腔刮擦物)、全血、血浆、血清、淋巴、骨髓、尿液、唾液、痰、细胞培养物、胸膜液、心包液、腹水或脑脊液。生物样品还包括组织活检和细胞培养物。生物样品或组织样品可指分离自个体的组织或流体样品，包括但不限于例如血液、血浆、血清、肿瘤活检、尿液、粪便、痰、脊髓液、胸膜液、乳头吸液、淋巴液、皮肤的外部部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、奶、细胞(包括但不限于血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养物组分样品。在一些实施方案中，样品来自原发性或转移性肿瘤的切除术、支气管镜活检或芯针活检，或者来自胸膜液的单元块。另外，可以使用细针吸入样品。样品可以为石蜡包埋的或冷冻的组织。可通过从个体去除细胞样品获得样品，但也可通过使用先前分离的细胞(例如，另一个人分离的)完成，或者通过体内实施本发明的方法。
如本文所用的术语“与…结合”意在包括RNA适配子借以与本文描述的检测试剂、部分、siRNA或核酶连接、附着或接合的任何构建物。实施结合的方法为本领域技术人员已知，并且包括但不限于缀合、通过肽连接子连接或通过直接将RNA和试剂(例如，siRNA或核酶)化学合成为一整条链。
如本文所用的术语“分离的”意指可从其他组分分离的或从其他组分纯化的RNA适配子或干细胞(例如，癌症干细胞)。分离的细胞是指来自其可能天然存在的环境中的细胞。分离的细胞可以被纯化至相对于其可天然获取的状态的任何程度。
如本文所用的术语“配体”是指具有结合靶标能力的分子或其他化学实体。配体可包括肽、寡聚物、核酸(例如，适配子)、小分子(例如，化合物)、抗体或其片段、核酸-蛋白融合物和/或任何其他的亲和试剂。因此，配体可以来自任何来源，包括文库，特别是组合文库，如下文公开的适配子文库、噬菌体展示文库或在本领域技术人员阅览本公开内容后显而易见想到的任何其他的文库。
如本文所用的术语“修饰的RNA适配子”意指多聚分子，其除了包含核糖核苷作为其单元外，还包含以下中的至少一种：2’-脱氧、2’-卤代(包括2’-氟代)、2’-氨基(优选为未取代的或单取代的或双取代的)、2’-单卤代甲基、2’-二卤代甲基或2’-三卤代甲基、2′-O-烃基、2′-O-卤代-取代的烃基、2′-烃基、叠氮基、硫代磷酸、巯基、甲基膦酸酯、荧光素、若丹明、芘、生物素、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-羟基-6-巯嘌呤和在第6位被硫磺取代或者在第5位被卤素或C15烃基取代的嘧啶碱基、非碱基连接子、3′-脱氧-腺苷以及其他可用的“链终止子”或“不可延展的”类似物(在RNA的3′端)，或标记物如32P、33P等。可以使用本文公开的标准合成技术将所有上述基团掺入至RNA中。
如本文所用，术语“治疗有效量”应理解为指足够量的用于减少或抑制表达EpCAM的癌症干细胞的数目和/或癌症的一种或多种症状的根据本公开的RNA适配子、抗癌剂、递送剂或药物组合物。本领域技术人员理解这样的量将根据例如具体个体和/或疾病的类型或严重性或水平而改变。该术语不应理解为将本公开限定于特定量的RNA适配子。
如本文所用的，术语“治疗(treat/treatment/treating)”应理解为指给予治疗有效量的如本文所公开的RNA适配子、抗癌剂、递送剂或药物组合物，减少或抑制与癌症相关的或由癌症引起的临床病况的至少一种症状。
如本文所用的，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”应理解为指给予治疗有效量的根据本公开的RNA适配子、抗癌剂、递送剂或药物组合物，阻止或妨碍或延迟癌症的至少一种症状的发展或进展。
如本文所用的，术语“特异性结合”应理解为指相比其与可选的细胞或底物的反应或结合，RNA适配子与特定细胞或底物反应或结合得更为频繁、更为快速、持续时间更长和/或亲和力更大。例如，相比其结合不相关的蛋白和/或表位或它们的免疫原性片段，特异性结合靶标蛋白的RNA适配子以更大的亲和力、亲和性、更快速地和/或以更长的持续时间结合该蛋白或表位或它们的免疫原性片段。通过阅读本定义，还应理解，例如，特异性结合第一靶标的RNA适配子可以或不可以特异性结合第二靶标。由此，“特异性结合”不是必然要求对另一分子的排外结合或不可检测的结合，这包括在术语“选择性结合”中。通常，但非必然地，提及的结合是指特异性结合。结合的特异性根据适配子对靶标的可比较解离常数(Kd)来定义，所述可比较解离常数是相比适配子与环境中的其他物质或总体上的非相关分子的解离常数而言。通常适配子对于靶标的Kd低于靶标和不相关物质或环境中的伴随物质的Kd的2倍、5倍或10倍。甚至更优选地，Kd为低于50、100或200倍。
如本文所用的术语“EpCAM+”或“表达EpCAM的细胞”可互换使用。该术语包括可通过任何合适的方式检测的CD133抗原的细胞表面表达。提及细胞对于给定标志物为阳性是指它可以是该标志物的低(lo或暗)或高(亮，bri)表达者，这取决于该标志物在细胞表面上存在的程度，其中所述术语涉及荧光强度。其适用于关于通过流式细胞术测得的CD44和CD24的表达。
如本文所用，术语“个体”应理解为指任何个体，包括人或非人个体。非人个体可包括非人的灵长类、有蹄类(牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和美洲野牛)、犬、猫科动物、兔类(家兔、野兔和鼠兔)、啮齿类(小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠)、鸟和鱼。在一个实例中，个体为人。
适配子
适配子的几种独特的特性使得它们成为用于大量的分子生物学应用的有吸引力的工具以及用作潜在的药剂。首先，大多数适配子以高亲和力结合靶标，显示皮摩尔至纳摩尔范围内的典型的解离常数。适配子的结合位点包括靶标分子的裂缝和凹槽，产生与许多当前可用的药剂非常类似的拮抗活性。第二，适配子的结构在较广的温度和储存条件范围内是稳定的，保留了形成其独特的三级结构的能力。第三，适配子能够通过化学方法合成，这与制备单克隆抗体所需的昂贵的和劳动密集的生物系统相反。
不希望受到理论的约束，由于RNA适配子对其靶标蛋白的理论上较高的亲和力以及修饰的RNA相比未修饰的RNA的较大的血浆稳定性，RNA适配子通常是许多研究小组优选的。
本文公开了特异性结合EpCAM抗原的RNA适配子分子，其能够用于在细胞内有效递送siRNA或核酶、化疗药物、放射性同位素、毒素和/或其他携带有该抗原的试剂。
适配子为单链的寡核苷酸或寡核苷酸类似物，其结合特定的靶标分子如蛋白或小分子。然而，适配子是抗体的寡核苷酸类似物。通常，适配子包含约15至约100个核苷酸，优选约15至约40个核苷酸，并且更优选约20至约40个核苷酸，其中长度落入这些范围中的寡核苷酸可通过常规技术进行制备。任选地，适配子还可以包含为产生特异性结合所必需的最少约6个核苷酸，优选10个，且更优选14或15个核苷酸。如果可以在放置靶标的环境中获得适当的相互作用，包含短于10个，例如，6-mer的序列的结合区域的适配子是可行的。因此，如果其他物质的干扰很小，可以要求较小的特异性和较小的结合强度。
适配子结合高度依赖于适配子寡核苷酸形成的二级结构。RNA和单链DNA(或类似物)适配子是已知的。参见，例如Burke et al(1996).J.Mol.Biol.264:650-666；Ellington和Szostak(1990).Nature 346:818-22；Hirao et al(1998).Mol Divers.4:75-89；Jaegeret al(1998).EMBO Journal 17:4535；Kensch et al(2000).J.Biol.Chem 275:18271-8；Schneider et al(1995).Biochemistry 34:9599-9610；以及US 5773598；US6028186；US6110900；US6127119；和US 6171795。
适配子对给定靶标的选择
可以通过使用称为SELEXTM(指数富集的配基系统进化技术)的迭代过程来选择结合几乎任何特定靶标的适配子。该方法描述于，例如US5270163和US5475096中。SELEXTM方法是基于以下独特的见解：核酸具有足够的形成多种二维和三维结构的能力，以及在其单体中适用的充当几乎任何化合物(不管是单体还是聚合物)的配体(即，形成特异性结合对)的足够的化学多功能性。任何大小或组成的分子均可用作靶标。
SELEXTM方法在开始时依赖于包含随机序列的大的单链寡核苷酸文库或池。所述寡核苷酸可以为修饰的或未修饰的DNA、RNA或DNA/RNA杂交物。在一些实例中，所述池包含100％随机化或部分随机化的寡核苷酸。在其他实例中，所述池包含随机化的或部分随机化的寡核苷酸，其包含掺入在随机化序列中的至少一个固定的序列和/或保守序列。在其他实例中，所述池包含随机化的或部分随机化的寡核苷酸，所述寡核苷酸在其5′端和/或3′端包含至少一个固定的序列和/或保守序列，其可以包含所述寡核苷酸池的所有分子所共有的序列。固定的序列为池中寡核苷酸所共有的序列，其掺入是为了预选目的，如CpG基序、PCR引物的杂交位点、RNA聚合酶的启动子序列(例如，T3、T4、T7和SP6)、限制位点或均聚序列，如多聚A或多聚T束、催化核心、用于选择性结合至亲和柱的位点，以及其他的有助于目标寡核苷酸的克隆和/或测序的序列。保守序列为除先前描述的固定的序列外，结合相同靶标的多种适配子所共有的序列。
所述池的寡核苷酸优选包括随机化的序列部分以及有效扩增所必需的固定的序列。通常，起始池的寡核苷酸包含固定的5’和3’末端序列，其位于30-50个随机化核苷酸的内部区域的侧面。可以多种方式制备随机化的核苷酸，包括化学合成和从随机切割的细胞核酸进行尺寸选择。也可在选择/扩增迭代之前或期间通过诱变引入或增加测试核酸中的序列变异。
寡核苷酸的随机序列部分可为任何长度，并且可包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并且可包含修饰的或非天然的核苷酸或核苷酸类似物(参见，例如US 5958691、US5660985和WO 92/07065)。可使用本领域熟知的固相寡核苷酸合成技术从磷酸二酯连接的核苷酸合成随机寡核苷酸。参见，例如Froehler et al.,(1986).Nucl.Acid Res.14:5399-5467和Froehler et al(1986)Tet.Lett.27:5575-5578。也可使用溶液相合成法如三脂合成方法合成随机寡核苷酸。参见，例如Sood et al(1977).Nucl.Acid Res.4:2557和Hiroseet al(1978).Tet.Lett.,28:2449。在自动化DNA合成仪上进行的典型合成产生1014-1016个个体分子，这一数字对于大多数SELEXTM实验已足够。
可以通过在DNA合成仪上自动化化学合成来生成寡核苷酸的起始文库。可以通过在每个另外的步骤中以不同的摩尔比添加4种核苷酸来生成部分随机序列。
寡核苷酸的起始文库可以为RNA或DNA。在将RNA文库被用作起始文库的情况下，通常通过在体外使用T7RNA聚合酶或修饰的T7RNA聚合酶转录DNA文库来生成RNA文库，并进行纯化。然后，在有助于结合的条件下将RNA或DNA文库与靶标混合，并使用相同的通用选择方案对其进行结合、分离和扩增的逐步迭代，以达到几乎任何所需的结合亲和力和选择性标准。更具体而言，以包含核酸的起始库的混合物起始，SELEXTM方法包括如下步骤：(a)在有利于结合的条件下将混合物与靶标接触；(b)将未结合的核酸从与靶标分子特异性结合的那些核酸中分离开来；(c)解离核酸-靶标复合物；(d)扩增从核酸-靶标复合物分离的核酸以产生富集了配体的核酸混合物；以及(e)根据需要尽可能多地重复结合、分离、解离和扩增步骤循环，以产生针对靶标分子的高特异性、高亲和力的核酸配体。在选择了RNA适配子的那些情况下，SELEXTM法还包括如下步骤：(i)逆转录从核酸-靶标复合物解离的核酸，然后进行步骤(d)中的扩增；以及(ii)转录来自步骤(d)的所扩增的核酸，然后重新开始所述过程。
重复选择和扩增循环直到达到预期目标。通常，这重复至直到重复循环结合力得不到显著改善。通常，以5-20个循环操作选择核酸适配子分子。
已知存在多种核酸一级、二级和三级结构。显示最常涉及非沃森-克里克类型的相互作用的结构或基序被称为发卡环、对称和非对称凸起、假节及其众多的组合。几乎所有已知的这类基序的例子表明它们可在不多于30个核苷酸的核酸序列中形成。出于这一原因，通常优选的是，使用连续的随机化片段的SELEXTM程序以包含约20至约50个核苷酸的随机化片段的核酸序列开始。
对核心的SELEXTM方法进行了修改，以实现许多特定目标。例如，US 5707796描述了使用SELEXTM结合凝胶电泳来选择具有特定结构特征的核酸分子，如弯曲的DNA。US 5763177描述了基于SELEXTM的方法，其被用于挑选包含能够与靶标分子结合和/或光交联和/或光失活靶标分子的光反应性基团的核酸配体。US 5567588和US 5861254描述了基于SELEXTM的方法，其实现了对靶标分子具有高和低亲和力的寡核苷酸之间的高效分离。US 5496938描述了在实施SELEXTM过程后获得改良的核酸配体的方法。US 5705337描述了将配体与其靶标共价连接的方法。
反SELEXTM是通过消除与一种或多种非靶标分子交叉反应的核酸配体序列来改善核酸配体对靶标分子的特异性的方法。反SELEXTM包括以下步骤：(a)制备候选的核酸混合物；(b)将候选混合物与靶标接触，其中可以将相对于候选混合物对靶标具有增加的亲和力的核酸与候选混合物的剩余部分分离；(c)将亲和力增加的核酸与的候选混合物的剩余部分分离；(d)从靶标中解离亲和力增加的核酸；(e)将所述亲和力增加的核酸与一种或多种非靶标分子接触，以便将对非靶标分子具有特定亲和力的核酸配体去除；以及(f)扩增仅对靶标分子具有特定亲和力的核酸，以产生以相对较高亲和力和特异性结合靶标分子的核酸序列富集的核酸混合物。如上文针对SELEXTM所描述的，如有必要重复选择和扩增循环直至达到预期目标。
在典型的实例中，使用诸如Beaucage et al.(1981)Tetrahedr.Letters22:1859-1862和Sinha et al.,(1984)Nucleosides and Nucleotides 3:157-171所描述的那些的常规技术在固相柱上合成RNA适配子。从产生的RNA适配子去除最终的DMT基团。可选地，如果使用大规模合成，可通过扩大固相载体法规模来制备RNA适配子，或者可通过使用液相技术(特别是所需终产物为相对较短的寡核苷酸时)制备RNA适配子。用于合成方法的起始物质可以是具有所需要的一级结构的5′-非三苯甲基化的RNA寡核糖-核苷酸或类似物，其优选可具有经保护的碱基，并且其优选结合固相载体。可使用任何常规使用的保护基团。通常，N6-苯甲酰基被用于腺嘌呤、N4-苯甲酰基用于胞嘧啶的、N2-异丁酰基用于鸟嘌呤和N2-苯甲酰基用于2-氨基嘌呤。其他有用的保护基团包括苯氧乙酰基(PAC)和t-丁氧乙酰基(TAC)。便利地，应当将更多的碱基不稳定性保护基团用于合成RNA适配子；本领域技术人员知道这些基团。这样的基团可帮助防止生成的三磷酸或二磷酸水解，它们通常在碱性条件下非常稳定，但能够接受一些水解作用。其他预期的修饰在美国专利第6,011,020号中有公布，并且包括但不限于通过共价连接掺入生物可利用的增强性分子如PEG或胆固醇。
另外，在RNA合成期间可掺入核苷酸类似物如2′-脱氧、2′-卤代、2′-氨基(未取代的或单取代的或双取代的)、2′-单卤代甲基、二卤代甲基或三卤代甲基、2′-O-烃基、2′-O-卤素取代的烃基、2′-烃基、叠氮基、硫代磷酸酯、巯基、甲基膦酸酯、荧光素、若丹明、芘、生物素、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-羟基-6-巯嘌呤和在第6位取代为硫或在第5位取代为卤素或C1-5烃基的嘧啶碱基、非碱基连接子、3′-脱氧-腺苷以及其他可用的“链终止子”或“不可延展的”类似物(在RNA的3′端)等。此外，不同的标记物如32P或33P等同样可在合成期间掺入，产生新的通过该方法制备的RNA类似物。其他预期的修饰公布于美国专利第6,011,020号中，并且包括但不限于掺入3′帽，如反向DT帽，或反向的非碱基帽或它们的组合。
适配子的结合亲和力
结合亲和力描述了分子彼此间的结合强度或亲和力的度量。本文中的适配子对于靶标和其他分子的结合亲和力根据Kd进行定义。可通过本领域已知的方法测定解离常数，并且可通过诸如Caceci,M.,et al.,Byte(1984)9:340-362中描述的那些的方法计算甚至复合混合物的解离常数。测量解离常数的实例描述于例如US 7602495(其描述了表面等离子体共振分析)、US 6562627、US 6562627和US 2012/00445849中。在另一个实例中，使用诸如Wong and Lohman,(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5428-5432公开的双过滤硝酸纤维素过滤器结合检测确定Kd。
然而，观察到对于一些小寡核苷酸，难以直接测定Kd，并且可能造成误导性的较高的结果。在这些情况下，可对已知能结合靶标或候选物的物质进行针对靶标分子或其他候选物质的竞争性结合检测。在理想情况下，发生50％抑制时的浓度的值(Ki)等于Kd。然而，在任何情况Ki都不会小于Kd。因此，替代性地，Ki的测定为Kd值设定了最大值。在技术困难阻碍Kd的精确测量的那些情况下，可方便地替换Ki测量来提供Kd的上限。Ki值也可用于确认本公开的适配子结合靶标。
改善适配子稳定性
在使用核酸作为治疗剂中遇到的一个潜在的问题在于在显示所需的效果前，以其磷酸二酯形式存在的寡核苷酸在体液中可被诸如内切酶和外切酶的细胞内酶和细胞外酶快速降解。本公开还包括如本文所述的RNA类似物和/或经设计用于改善RNA适配子的一种或多种特性(如保护免被核酶消化)的另外的修饰。
本公开中预期的寡核苷酸修饰包括但不限于，提供了其他的化学基团的那些，其将额外的电荷、极化性、疏水性、氢键、静电相互作用和流变性掺入至核酸配体碱基或核酸配体整体。
用于产生耐受核酶的寡核苷酸的修饰还可包括一个或多个取代的核苷酸间连接、改变的糖类、改变的碱基或以上的组合。此类修饰包括2′位的糖修饰、5-位的嘧啶修饰、8-位的嘌呤修饰、环外胺的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、硫代磷酸酯或烃基磷酸酯修饰、甲基化和不常见的碱基配对组合如异碱基异胞苷和异鸟苷；3′和5′修饰如加帽；缀合至高分子量非免疫原性化合物；缀合至亲脂性化合物；以及磷酸骨架修饰。
在一个实例中，与本公开的适配子缀合的非免疫原性的高分子量化合物为聚二醇，优选聚乙二醇。在一个实例中，骨架修饰包括掺入一个或多个硫代磷酸酯至磷酸骨架中。在另一个实例中，本公开的适配子包含在磷酸骨架中掺入少于10个、少于6个或少于3个的硫代磷酸酯。
适配子的功用
本公开的RNA适配子分子可用作分离和纯化靶标分子(例如，携带EpCAM的癌症干细胞)的亲和配体；示踪、监测、检测和定量靶标分子(例如，携带EpCAM的癌症干细胞)，或者阻断、允许、激活或催化在生理上与实现治疗效果有关的反应的探针。它们可用作药剂，结合特定靶标以及将特定分子导向期望部位。
本公开的RNA适配子分子可用于体外过程，例如用于纯化靶标分子(例如，携带EpCAM的癌症干细胞)的亲和纯化混合物。适配子对于从污染物层析分离靶标分子(例如，携带EpCAM的癌症干细胞)和从细胞培养物或细胞提取物纯化靶标分子是理想的。
在一个实例中，本公开的RNA适配子分子可用作将靶标(例如，携带EpCAM的癌症干细胞)结合或固定至固相载体的捕获试剂。固相载体可以由具有通常与过滤器、晶片、晶圆芯片、膜和薄膜有关的结构和组成的基底组成。然而，预期固相载体可由这样的基底组成，其包括但不限于树脂、亲和树脂、磁珠或聚合物珠子或任何用于捕获或固定用于诊断、检测或定量研究的试剂的诊断性检测试剂。
固相载体可以基于所需的用途包含任何材料，包括但不限于：玻璃、金属表面，以及诸如钢材、陶瓷材料或聚合物材料如聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺和聚偏二氟乙烯等的材料，或以上的组合。
表达EpCAM的癌症干细胞的分离和纯化
通过干细胞分化进行成体细胞更新的最熟知的实例是造血系统。发育上未成熟的前体细胞如造血干细胞和祖细胞响应分子信号，以逐渐形成多种血液和淋巴样细胞类型。干细胞也发现于其他组织中，包括上皮组织和间质组织。癌症干细胞可起源于这些细胞类型中的任何一种，例如，由于正常干细胞中的遗传损伤或通过干细胞和/或分化细胞的异常调节的增殖而产生。
癌症干细胞可以来源于任何如下的癌症：其包含致瘤干细胞，即具有广泛或无限增殖能力的细胞，并且产生了大多数的癌细胞。在确立的肿瘤中，大多数细胞已丢失了广泛增殖和形成新的肿瘤的能力，并且小部分的癌症干细胞增殖从而再生成癌症干细胞，以及产生缺少致瘤潜力的肿瘤细胞。癌症干细胞可以非对称地和对称地分裂，并且可显示变化的增值速率。癌症干细胞可以包括已重新获得了干细胞性能的短暂扩充细胞或祖细胞。
可从中分离干细胞的代表性癌症包括特征为实体瘤的癌症，包括例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing’s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞癌、胚胎性癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm’s tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
可根据本公开从中分离或富集干细胞的其他代表性癌症包括造血性恶性肿瘤，如B细胞淋巴瘤和白血病，包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞(SL)NHL、中级/滤泡NHL、中级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级小无裂细胞NHL、肿块性疾病(bulky disease)NHL和华氏巨球蛋白血症、慢性白细胞性白血病、急性髓系白血病、慢性髓系白血病、淋巴细胞性白血病、单核细胞性白血病、髓系白血病和前髓系白血病。
可使用本文所述的适配子分子选择具有EpCAM的癌症干细胞。例如，与荧光染料结合的适配子可用于癌症干细胞的阳性选择。还已知EpCAM在一些正常细胞中表达。然而，认为在癌症干细胞中，EpCAM表达上调。癌症干细胞标志物的表达水平通常比相同来源的分化细胞或非致瘤细胞至少高约5倍，例如，至少高约10倍，或至少高约15倍，或至少高约20倍，或至少高约50倍，或至少高约100倍。选择方法还可包括能够用于清除非癌症干细胞群体中的那些癌细胞的阴性选择标志物。
应理解在实施本公开内容中，能够通过多种不同的方法进行具有EpCAM的细胞的分离。例如，可将本公开的RNA适配子附着于固相载体以允许粗分离。可根据分离效率、相关的细胞毒性、实施的容易程度和速率以及对高级设备和/或专业技能的需求，采用具有不同效率的不同技术。用于分离或纯化的方法可包括但不限于，使用包被适配子的磁珠的磁力分离、亲和色谱法和用与固体基质结合的适配子的“淘选”。提供了精确分离或纯化的技术包括但不限于FACS。制备FACS的方法对本领域技术人员是显而易见的。
表达EpCAM的癌症干细胞的富集
在一个实例中，从获自个体的生物样品富集了本公开的RNA适配子分子。通常，所述个体为患有肿瘤或疑似患有包含癌症干细胞的肿瘤的个体。本文中所用的术语“富集的”或“富集”或其变型描述这样的细胞群体，其中当与未处理的细胞群体(例如，样品中的细胞)相比时，一种特定细胞类型(即，癌症干细胞)的比例增加。
在一个实例中，针对癌症干细胞富集的群体包含至少约0.1％或0.5％或1％或2％或5％或10％或15％或20％或25％或30％或50％或75％的具有EpCAM的癌症干细胞。就此而言，术语“包含癌症干细胞的富集的细胞群体”应理解为为术语“包含X％的癌症干细胞的细胞群体”提供了明确的支持，其中X％为本文所述的百分比。
在一个实例中，以可选择的形式从包含EpCAM+细胞的细胞制剂富集细胞群体。就此而言，术语“可选择的形式”应理解为是指细胞表达允许选择具有EpCAM的细胞的标志物(例如，细胞表面标志物)。
使用适配子分子诊断癌症
本公开的RNA适配子分子可用于体外诊断目的，以确定恶性组织中的癌症干细胞的存在。所述方法包括检测生物样品中EpCAM+癌症干细胞的存在。例如，可将生物样品与本公开的标记的RNA适配子接触，并确定RNA适配子特异性结合样品中的细胞的能力。适配子的结合指示具有EpCAM的细胞的存在。在一个实例中，所述具有EpCAM的细胞为癌症干细胞。
本公开的RNA适配子也可以用于通过给予个体被提供可检测信号的报告基团标记的本公开的分离的RNA适配子，来在体内定位EpCAM+肿瘤。然后，可以使用流式细胞术、显微镜、外部闪烁扫描术、发射断层扫描、光学成像或放射核扫描(radionuclear scanning)来检测结合的适配子。所述方法可以用于结合疾病程度对个体中的癌症进行分级，和监测响应治疗的变化。
可通过将RNA适配子与可检测标记结合来促进癌症干细胞检测。可检测标记的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖甘酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素。合适的荧光物质的实例包括伞形酮(umbellifone)、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白。发光物质的实例包括鲁米诺。生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素，并且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S、18F、64Cu、94mTc、124I、11C、13N、15O、68Ga、86Y、82Rb或3H。
可通过例如使用Klenow聚合酶的模板化延伸，通过T4RNA连接酶介导的连接和末端脱氧核苷酰转移酶来实现适配子的3’端标记。可通过以过量的GTP-β-S补充体外转录混合物来实现5’端标记，然后可将其硫醇用于结合生物素。另外，可将直接化学缀合至5’端或3’端的合适的基团用于标记适配子。
本公开的抗癌剂
可将本公开的RNA适配子分子缀合至部分，并用于将所述部分导向EpCAM+细胞，优选癌症干细胞。部分的实例包括能够用于杀伤癌症干细胞的毒素、放射性核素或化疗剂。
可以通过化学合成部分和适配子，或通过缀合方式，例如，用于连接分别制备的RNA适配子和部分的非肽共价键，例如，非酰胺键，将RNA适配子融合至所述部分，例如毒素。可选地，可通过合适的连接肽连接所述RNA适配子和部分。
有用的毒素分子包括肽毒素，其存在于细胞中时具有明显的细胞毒性。毒素的实例包括细胞毒素、破坏酶活性并从而杀伤癌症干细胞的代谢干扰物(抑制剂和活化剂)，以及能杀伤效应子部分确定半径中的所有细胞的放射性分子。代谢干扰物是能改变细胞代谢而使得正常功能被改变的分子，例如，酶或细胞因子。在广义上，术语毒素包括任何造成肿瘤细胞死亡的效应子。
许多肽毒素具有广泛性的真核受体结合结构域；在这些情况下，必须对毒素进行修饰以防止杀伤不携带EpCAM的细胞(例如，防止杀伤不携带EpCAM但具有针对未修饰的毒素的受体的细胞)。必须以保存所述分子的细胞毒性功能的方式进行这样的修饰。可能有用的毒素包括但不限于：白喉毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、O-志贺样毒素(SLT-I、SLT-II、SLT-IIV)、LT毒素、C3毒素、志贺毒素百日咳毒素、破伤风毒素、假单胞菌外毒素、alorin、皂素、莫迪素(modeccin)和gelanin。其他毒素包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)和淋巴毒素(LT)。具有抗肿瘤活性的另一种毒素为卡里奇霉素γ1，其为包含二炔-烯的抗肿瘤抗生素的，具有针对肿瘤的相当大的效力(Zein N et al(1988).Science 240:1198-201)。
例如，可将白喉毒素(其序列是已知的)缀合至本公开的RNA适配子分子。由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diptheriae)分泌的天然的白喉毒素分子由几个功能域组成，其从分子的氨基末端起始，可以被表征为具有酶促活性的片段A(AA 1-193)和包含转位结构域的片段B(AA 194-535)，以及广义的细胞结合域(AA 475-535)。
可以本领域技术人员已知的几种方式中的任一种连接RNA适配子和毒素部分。例如，将RNA适配子缀合至毒素(白树毒素)的方法描述于Chu TC et al.(2006)Cancer Res 6(12)5989-5992中。
所述部分也可以为在局部水平激活或抑制身体的免疫系统的免疫系统调节物。例如，递送至肿瘤的细胞因子，例如淋巴因子如IL-2，能够引起细胞毒性T-淋巴细胞或自然杀伤细胞在肿瘤附近增殖。
部分或报告基团还可以为放射性分子，例如，放射性同位素或所谓的敏化剂，例如，在特定条件下变得具有放射性的前体分子，例如，在所谓的“硼中子俘获治疗”(BNCT)中，在暴露于低能中子束时的硼，所述BNCT在Barth et al.(1990).Scientific AmericanOct 1990:100-107中有描述。可使用具有此类放射性效应子部分的化合物来抑制肿瘤中的癌症干细胞增殖和标记癌症干细胞用于成像目的。
放射性核素是可发射α、β或γ粒子的单原子放射性分子。α粒子发射器优于β或γ粒子发射器，因为它们在较短的距离释放更高的能量辐射，并因此是有效的，而不会穿透和损伤正常组织。发射合适的α粒子的放射性核素包括211At、212Pb和212Bi。
放射性分子必须直接或通过双官能团螯合剂与适配子紧密连接。该螯合剂不允许洗脱，并因此过早在体内释放放射性分子。Waldmann,Science,252:1657-62(1991)。例如，为了使BNCT适用于本发明，可将硼烦人稳定同位素，例如硼10，选为化合物的抗肿瘤部分或效应子部分。通过适配子与癌症干细胞的特异性结合，硼会被递送至并集中于肿瘤细胞内或肿瘤细胞上。在允许积累足够量的硼的时间后，可以用具有约0.025eV的能量的低能中子束对肿瘤进行成像和辐照。虽然该中子辐照自身对肿瘤周围的健康组织或肿瘤自身造成很少的损伤，硼10(例如，在肿瘤细胞的表面上)会捕获中子，从而形成不稳定同位素硼11。硼11立即裂变产生锂7核子和高能α离子，约279万Ev。这些重粒子是高度致命的但非常局限形式的辐射，因为粒子具有仅约一个细胞直径(10微米)的光程长。
本公开的递送剂
本公开的RNA适配子分子可用于将siRNA或核酶递送至细胞中。合适的siRNA或核酶的实例依赖于环境。适合本公开的应用的siRNA或核酶的实例包括靶向ATP结合盒膜转运蛋白、干性基因(Bmi-1、Notch 1、Sox 2、Oct-4、Nanog、β-连环素、Smo、巣蛋白、ABCG2、Wnt2和SCF等)、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)和生存素的那些。
例如，这已在本领域中使用抗PSMA适配子进行了证明。基于对PSMA通过网格蛋白小窝内化至核内体的了解，假定抗PSMA适配子将运载所附着的siRNA至表达PSMA的细胞，并且与PSMA蛋白结合的适配子-siRNA将通过内化进入细胞。接着，siRNA部分将接受Dicer复合物的处理，并送入至RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的基因沉默通路。3个研究小组已使用不同的策略来完成这一过程。Chu et al(2006)Nucleic Acids Res 34,e73描述了用于组装抗PSMA适配子和siRNA的生物素-链霉亲和素桥联介导的缀合方法。McNamara etal.(2006)Nat Biotechnol 24,1005-1015使用“仅RNA”适配子-siRNA嵌合方法来连接适配子和siRNA。在随后的Wullner et al(2008).Curr.Cancer Drug Targets8:554-565的研究中，作者使用抗PSMA适配子来递送真核延长因子2(EEF2)siRNA至PSMA阳性的前列腺癌细胞，二价的PSMA适配子被用于该目的。作者证明，相比单价的抗PSMA-siRNA嵌合体，二价适配子构建物的基因敲低效力较优。
本公开的RNA适配子分子也可用于递送货运物至多种实体瘤中的EpCAM+癌症干细胞。白树毒素是能抑制蛋白合成过程并且具有细胞毒性的核糖体毒素。然而，它不能透膜，并且需要引导物用于其细胞进入。因此，可使用本公开的RNA适配子分子来递送不能透膜的毒素荷载至癌症干细胞。
耐细胞毒化疗剂的肿瘤部分是由于至癌细胞的递送不足和癌细胞摄取不足，并且更重要地，癌细胞的流出。来源于聚(D,L-乳酸-乙醇酸共聚物)PLGA的可生物降解的纳米粒子(NP)被用于解决这一问题，如Dhar et al(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:17356-17361中所述。简而言之，通过引入两个烃基链将顺铂转化为其前药Pt(IV)化合物。这增加了化合物的疏水性，且简化了将其包装在NP的疏水内核中的过程。聚乙二醇(PEG)被用作合成PLGA-PEG纳米粒子的纳米沉淀步骤中的共聚物。以PSMA(前列腺特异性膜抗原)适配子修饰PLGA-PEG-NP表面。当与LNCaP细胞孵育时，NP经历内吞作用，且烃基化的前药通过细胞质还原过程被转化为顺铂。
本公开还延伸至使用RNA适配子分子作为同时的药物递送剂和成像剂。这可通过将适配子缀合至荧光量子点(QD)的表面来实现。接着，用Dox孵育QD-适配子缀合物以形成QD-适配子-Dox纳米粒子。Dox和QD为荧光分子。然而，由于它们在QD-适配子-Dox纳米粒子中相互靠近，它们通过双荧光共振能量转移(FRET)机制淬灭彼此的荧光。因此，QD-适配子-Dox纳米粒子是非荧光的。然而，通过前列腺癌细胞中PSMA介导的内吞作用而进行的QD-适配子-Dox纳米粒子的内化造成Dox从QD-适配子-Dox纳米粒子释放，其引起Dox和QD产生的荧光的恢复。
药物组合物
在公开的一个实例中，根据本公开的RNA适配子、抗癌剂或药物递送剂被以包含药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物形式给药。可以根据用于给药的途径和装置进行组合物中赋形剂或其他元素的选择。
术语“载体”和“赋形剂”是指本领域中常规使用的用于促进活性化合物的储存、给药和/或生物活性的物质(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mac Publishing Company(1980)。载体还可以降低活性化合物的任何不需要的副作用。合适的载体为，例如稳定的，例如，不能与载体中的其他成分反应。在一个实例中，载体在用于治疗的剂量和浓度下不在受体中产生明显的局部或系统副作用。
用于本公开的合适载体包括常规使用的那些，例如，水、盐水、水性葡萄糖、乳糖、林格氏溶液(一种缓冲溶液)、透明质酸和乙二醇为示例性的液体载体，特别(在等渗时)用于溶液。合适的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
可以添加其他的一般添加剂如抗氧化剂、缓冲溶液、抑菌剂等。为了制备可注射的溶液、丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂，可额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂。
可经肠胃外(例如，静脉内、皮下、局部或腹膜注射)给予包含本发明的RNA适配子的抗癌剂或药物递送剂。可根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄和疾病的严重性来确定有效剂量的抗癌剂。在一个实例中，抗癌剂或药物递送剂包含10-95％体重比的RNA适配子。在另一个实例中，抗癌剂或药物递送剂包含25-75％体重比的RNA适配子。
给药频率可为一天一次至几次。
在一个实例中，RNA适配子的有效细胞内含量为约1nM至1000nM。在另一个实例中，RNA适配子的有效细胞内剂量优选为100nM至500nM。然而，适配子的剂量可低于或高于上述范围。
适配子的组合
可根据本文公开的任何方法，单独使用或结合一种或多种另外的RNA适配子使用本公开的分离的RNA适配子分子。在一个实例中，可将本公开的RNA适配子分子与可促进癌症干细胞的检测、纯化或富集的RNA适配子组合。在一个实例中，所述另外的RNA适配子为特异性结合CD133+细胞的适配子。在一个实例中，所述另外的RNA适配子包含5’-CCCUCCUACAUAGGG-3’的序列。在另一个实例中，所述另外的RNA适配子包含5’-CAGAACGUAUACUAUUCUG-3’的序列。
试剂盒
本公开还提供了用于实施本文公开的方法的诊断试剂盒。在一个实例中，诊断试剂盒包含用于检测表达EpCAM的细胞(例如，癌症干细胞)的如本文所述的RNA适配子或诊断剂。
所述试剂盒还可以包含助剂如缓冲试剂和稳定剂。所述诊断试剂盒还可包含用于减少背景干扰的试剂、对照试剂和用于进行测试的装置。通常还包含关于如何使用所述诊断试剂盒的说明书。
本领域技术人员应理解可对上述实施方案进行多种变型和/或修饰，而不脱离本公开的广义总体范围。因此，本申请实施方案在所有方面应理解为示例性，而非非限制性的。
实施例
方法
适配子
生成了针对人EpCAM的适配子，并按先前所述(Shigdar S et al(2011)CancerSci 102:991-998)进行表征。适配子DT3和对照适配子在先前已有描述(Shigdar S et al,同上)，而适配子23为19个碱基的核苷酸，其5’端缀合有近红外荧光染料TYE 665。使用与发明人先前的适配子(Shigdar S et al,同上)相同的方法表征该适配子。
细胞系和培养物和异种移植物模型
用于本研究的人来源的细胞系购自美国典型培养物保藏中心。它们为胶质母细胞瘤U118-MG；乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231和T47D；以及结直肠腺癌HT-29。用补充了10％胎牛血清(MCF-7、T47D、HT-29和U118-MG)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)(Invitrogen,Victoria,Australia)，或者具有10％胎牛血清(MDA-MB-231)的洛斯维·帕克纪念研究所1640(RPMI 1640)(Invitrogen)，将细胞培养和维持在培养物中。37℃下将细胞维持在包含5％CO2的湿润环境中。对于异种移植物研究，通过胰蛋白酶消化收获单细胞悬液，用PBS洗涤，并重悬在0.1mL PBS中，以用于移植入BALB/c-Foxn1nu雌性小鼠中。一旦肿瘤达到约5-8mm3，即将它们切除并固定在10％中性缓冲福尔马林中，然后进行处理和包埋。所有动物方案均得到迪肯大学动物福利委员会的许可，并遵守针对用于科学目的的动物的护理和使用的澳大利亚操作规范。
免疫组织化学
将来自每个异种移植物肿瘤的切片以4μm切割在聚赖氨酸包被的载片上，然后用Histoclear脱去石蜡，并通过分级乙醇再水化。使用Tris-EDTA缓冲液(10mM Tris,1mMEDTA,0.05％Tween 20,pH 9.0)在微波炉中进行热诱导的抗原修复20min，然后让载片冷却，然后用磷酸盐缓冲盐(PBS)中的0.1mg/mL tRNA、0.1mg/mL鲑鱼精DNA和1mg/mL牛血清白蛋白(BSA)封闭20min。在封闭步骤后，将载片在包含0.1％Tween 20的PBS中洗涤两次，每次2min，然后与适配子或抗体一起孵育。适配子按先前所述(Shigdar S et al,同上)进行制备。简而言之，将适配子加热至85℃持续5min，然后使其冷却至室温持续10min，然后在37℃下加热15min。37℃下，在包含5mM MgCl2、0.1mg/mL tRNA、1mg/mL BSA、10％硫酸葡聚糖和500μg/mL肝素的PBS溶液中，用100nM浓度的适配子孵育载片15min。然后将载片洗涤3次，每次5min，然后与双苯酰亚胺Hoechst 33342(3μg/mL)一起孵育10min。然后使用VECTASHIELD对载片封片，并盖片，然后使用Fluoview FV10i激光扫描共聚焦显微镜观察。用于直接比较的所有图像均利用相同的暴露参数采集，且不经过任何数字对比度改变或背景去除来呈现。使用抗EpCAM抗体323/A3(ab8601,Abcam)进行抗体染色。根据与先前所述相同的方案洗涤和封闭载片，然后进行抗体染色。以10μg/mL的浓度制备抗体，并在4℃下将载片孵育过夜。然后将载片洗涤3次5min，然后用10μg/mL浓度的山羊抗小鼠IgG AlexaFluor 647缀合物(Invitrogen)孵育2h，然后洗涤，用双苯酰亚胺Hoechst 33342染色，并盖片。通过将一抗替换为PBS来进行阴性对照载片。另外，在吉朗上帝圣约翰病理学实验室(St John of God PathologyLaboratory)，根据其标准方案，用苏木精和伊红以及抗EpCAM抗体BerEP4对载片进行染色。
流式细胞术分析
在细胞80％汇合时用胰蛋白酶消化来收获细胞，然后重悬在洗涤缓冲液(具有5mMMgCl2的DPBS)中，并计数。离心(1000x g，5min)后，将细胞团重悬在分析缓冲液(补充有5mMMgCl2、0.1mg/ml tRNA、0.1mg/ml鲑鱼精DNA、0.2％[w/v]叠氮化钠和5％FCS的DPBS)中，并稀释至1×106/mL。在4℃下进行封闭步骤。在37℃下进行适配子的结合30min，或在4℃下进行1h，其中在所有结合分析中氯化镁的终浓度为2.5mM。
为了确认适配子与靶标蛋白的结合，根据先前描述的方法(Willkomm& Hartmann(2005).Weinheim,Wiley-VCH GmbH & Co.KGaA 1:86-94)，来自迭代循环的RNA在3'端用异硫氰酸荧光素(FITC)标记。在整个过程中都使用了Amber管，以将光致漂白减至最小。简而言之，用过碘酸钠将样品氧化。通过添加10mM乙二醇终止氧化，然后通过乙醇进行沉淀。添加30摩尔过量的FITC，并在4℃下过夜来完成反应。在冰上将1μM的FITC标记的RNA与胰蛋白酶消化的于100μL结合缓冲液(DPBS，补充了5mM MgCl2、0.1mg/ml tRNA、0.1mg/ml鲑鱼精DNA)中的5×105Kato III或U118-MG细胞孵育1h，然后洗涤3次，并重悬在300μL的测定缓冲液中。通过每个样品计数50,000个事件，用FACS Canto II流式细胞仪(Becton Dickinson)测定荧光强度。将来自未选择的文库的FITC标记的RNA用于测定非特异性结合。
根据Ellington和同事描述的方法(Li et al.(2009).J.Proteome Res8:2438-48)，在减去第0轮RNA与靶标细胞的结合以及对阴性对照细胞的结合的平均荧光强度后，计算每轮的结合。通过用于PBS中的2.5μg/ml碘化丙啶和0.5mg/ml RNA酶A染色，对死细胞设门并将其从分析中排除。
共聚焦显微镜
标记之前24小时，以75,000个细胞/cm2的密度将细胞接种在玻璃底的具有8个小室的载玻片(Lab-Tek II,Nunc)中。以与流式细胞术相同的方式制备DY647-Ep23和对照适配子。在去除培养基后，在37℃下将细胞在分析缓冲液中孵育15min，并洗涤两次，然后在37℃下与100nM适配子和2.5mgCl2孵育30min。在最后15min的孵育期间将双苯酰亚胺Hoechst33342(3μg/mL)(Sigma)添加至细胞中。去除适配子溶液，并将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，每次5min，然后使用FluoView FV10i激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)进行观察。
内吞作用的抑制
这基本上按针对共聚焦显微镜描述的进行，进行了少量的改动。简而言之，37℃下将细胞用去钾缓冲液(50mM Hepes、140mM NaCl、2.5mM MgCl2和1mM CaCl2)或高渗缓冲液(含有3mM KCl和450mM蔗糖的去钾缓冲液)预处理1hr。这些缓冲液也被用于使用适配子的孵育步骤和所有冲洗步骤。通过定性表征与Alexa Fluor 488(Invitrogen)缀合的人转铁蛋白的内化，验证这些处理在抑制内吞作用中的效力。预处理后，将转铁蛋白(5μg/mL)添加至细胞中，然后在37℃下孵育30min。将细胞在其各自的缓冲液中洗涤3次，并使用FluoViewFV10i共聚焦显微镜进行观察。
适配子与转铁蛋白的共定位。
按先前针对共聚焦显微镜所描述的制备T47D、MCF7、MDA-MB-231、HT29和U118MG细胞。在去除培养基后，37℃下将细胞在包含5％(v/v)血清的封闭缓冲液中孵育15min，在结合缓冲液中洗涤两次，然后于37℃用200nM适配子孵育30min。去除适配子溶液，并将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，每次5min。然后将转铁蛋白添加至细胞中并孵育2小时，然后在最后15min的孵育期间向细胞中添加双苯酰亚胺(Bisbenzimide)Hoechst 33342(3μg/mL)(Sigma)。将细胞在结合缓冲液中洗涤3次，每次5min，然后使用FluoView FV10i激光扫描共聚焦显微镜进行观察。
EpCAM适配子
人EpCAM cDNA购自Invitrogen，并被克隆至哺乳动物表达载体pcDNA 3.1/V5-His-TOPO。在HEK293T中瞬时表达重组6x Histine标记的EpCAM，并按先前所述(Yeong SSet al.(2006)J Biol Chem281(41):30768-81)制备总细胞裂解物。将DELFIA抗小鼠IgG包被的平板(PerkinElmer,Cat.No.#4007-0010)中的每个孔用在结合缓冲液(杜氏磷酸盐缓冲盐(DPBS)，包含5mM MgCl2,0.1mg/mL tRNA和0.1mg/mL鲑鱼精DNA)中的1μg抗His单克隆抗体孵育1h，并在23℃下用SuperBlock(Pierce)封闭1h，然后用结合缓冲液彻底洗涤。将包含重组EpCAM的细胞裂解物添加至孔中，在37℃下孵育1h，然后用结合缓冲液洗涤6次。将EpCAM条于4℃保存在湿润环境中直到使用。
适配子截短
为了产生本公开的截短的适配子，合成了所需序列的正义和反义DNA寡核苷酸。EpDT1(第1截短)源自正义寡核苷酸5’-TAATACGACTCACTATAGGTCCGTAGTTCTGGCTGACTGGTTACCCGGTCGTACAGCTCG-3’，和反应寡核苷酸5’-CGAGCTGTACGACCGGGTAACCAGTCAGCCAGAACTACGGACCTATAGTGAGTCGTATTA-3’；EpDT3(第3截短)源自正义寡核苷酸：5’-TAATACGA CTCACTATAGCGACTGGTTACCCGGTCG-3’和反应寡核苷酸5’-CGACCGGGTAACCAGTCGCTATAGTGAGTCGTATTA-3’；适配子23源自正义寡核苷酸5’-TAATACGACTCACTATAACGTATCCCTTTTCGC GTA-3’和反义寡核苷酸5’-TACGCGAAAAGGGATACGT-3’(T7RNA启动子序列标有下划线)。将每对寡核苷酸以等摩尔比在1×PEI缓冲液(0.1M Tris-HCl pH 8,0.1M MgCl20.5M NaCl和0.1M二硫苏糖醇)中混合，90℃下加热5min并缓慢冷却至室温，然后进行乙醇沉淀。按上述进行体外转录和FITC标记。还用5’-DY647荧光标记和3'-反向脱氧胸苷(Dharmacon)化学合成了该克隆的最终截短物(EpDT3)，其为氟嘧啶形式的5’-GCGACUGGUUCCCGGUCGdT-3'。按本文中所述，使用EpCAM阳性和阴性细胞系以及阴性对照(2-O-甲基-嘧啶)适配子(5'-DY647-mGCmGACUmGmGUUmACCCmGmG UCmGdT-3')，测定了DY647-EpDT3的结合亲和力。
适配子亲和力的测定
使用流式细胞术，利用EpCAM-阳性和阴性细胞系的流式细胞术以及阴性对照(2-O-甲基-嘧啶)适配子(5'-DY647-mGCmGACUmGmGUUmACCCmGmG UCmGdT-3')测定了成功的2’-氟嘧啶RNA适配子种类对表达于细胞表面上的天然EpCAM的平衡解离常数(K’d)。首先用分析缓冲液孵育Kato III或U118MG细胞(5×105)，然后用结合缓冲液洗涤两次，然后于冰上在100μL分析缓冲液中用系列浓度(高于以及低于表观K’d约10倍)的FITC标记的适配子孵育1h。将细胞洗涤3次，重悬于包含2.5mM MgCl2的150μL分析缓冲液中，并进行流式细胞术分析。将FITC标记的未选择的文库用作另一阴性对照。从适配子-靶标细胞的荧光强度中减去未选择的文库的平均荧光强度(MFI)以生成特性结合的MFI。通过斯卡查德分析，根据以下方程式测定每个适配子的K’d：
[结合的适配子]/[适配子]＝-(1/KD)×[结合的适配子]+([T]tot/KD)
其中[T]tot表示总靶标浓度。
EpCAM适配子-siRNA嵌合体的设计和制备
合成了两条RNA链，并利用2’-氟嘧啶对长链进行化学修饰。在长链中，19nt EpCAM适配子通过两个氨基酸桥联与生存素siRNA(Carvalho A et al.(2003)J Cell Science116:2987-2998)的引导链共价结合，而将生存素siRNA的过客链合成为短链。长链(A)和短链(B)均具有不稳定的二级结构，43nt和21nt的自由能分别为-7.5千卡/摩尔和-0.5千卡/摩尔。相反，理论上讲，在退火后，预期的嵌合体具有稳定得多的结构，64nt的自由能为-42.6千卡/摩尔。这意味着在退火后，这两条单独的链更可能生成预期的适配子-siRNA嵌合体(C)。此外，在退火后将生成2nt(UU)3’突出部分，这将有助于Dicer酶从siRNA的引导链的3’端消化嵌合体，并最终生成预期的21mer siRNA。在短链的5’端添加了荧光分子(DY647)，这不仅有助于图像分析，还有助于嵌合体的结构对称，并在Dicer加工后生成预期的siRNA。
实施例1 使用化学抗体的免疫组织化学
当在硫酸葡聚糖和肝素存在下孵育时，于37℃下以100nM的浓度孵育15min后，抗EpCAM适配子DT3和23显示出高度灵敏的T47D、MCF7和MDA-MB-231人乳腺癌异种移植物染色(图1)。确实，染色特性与乳腺癌细胞表面上可见的EpCAM表达水平密切相关，这可通过MDA-MB-231异种移植物切片的较弱染色得到证明，MDA-MB-231异种移植物切片相比T47D和MCF7表达量低得多的EpCAM。同样，显示染色为高度特异性的，未检测到不表达EpCAM的U118MG异种移植物的染色，或是任何异种移植物切片上的对照适配子的染色。在优化过程中，针对先前成功使用的利用已知能染色石蜡包埋的组织的仅另外一种适配子的那些方法(Zeng Zet al(2010).Mod Pathol 23:1553-1558)以及其他抗原修复方法如酶消化，测试了抗原修复方法。虽然Zeng和同事显示了利用在37℃下进行的抗原修复的成功的适配子染色(ZengZ et al,同上)，本申请的结果与其并不一致。相反，本发明人发现在96-100℃下进行抗原修复20min，对灵敏的和特异性的染色非常有效。
有趣的是，观察到两种EpCAM适配子在HT-29异种移植切片上获得了明显不同的染色(图1)。已通过流式细胞术、针对本研究中使用的所有5种细胞系表征了两种适配子的结合亲和力，并且结果示出在表1中。
表1 EpCAM适配子的结合亲和力
这些细胞系的不同的亲和力表明两种适配子识别EpCAM分子的不同部分。看上去合理的是，反应的差异来源于适配子DT3结合的表位在抗原修复后丢失或仍然不可接近。
实施例2 适配子相比抗体在测定EpCAM方面更为灵敏
如图1和表2中所示，使用抗EpCAM抗体323/A3的针对3种不同乳腺癌异种移植物的抗体染色强度比适配子特别是适配子23的强度弱得多。然而，抗体323/A3的确显示对HT-29结肠直肠癌异种移植物的中等至强的染色。为了排除在他们的实验室中使用的荧光染色方案局限性的可能，发明人咨询了临床病理学实验室以确认他们的结果。在该实验室中使用的标准的EpCAM染色为抗EpCAM抗体BerEP4。在进行了该抗体用于病理学诊断实践的常规操作后，发明人获得了与使用323/A3抗体实现的那些类似的所有异种移植肿瘤的染色，这表明本发明适配子相比病理学中使用的标准抗体要灵敏得多。
表2 通过免疫荧光和使用BerEP4抗体的免疫组织化学，利用DT3、23和对照适配子以及323/A3抗体定量细胞系异种移植物的抗EpCAM染色
‘-’无染色；‘+’>10％的细胞的模糊不完全的染色；‘++’中等完全的膜染色；‘+++’强的完全膜染色。
实施例3 低水平表达的EpCAM的检测
在本文研究的所有人癌症细胞系中，MDA-MB-231细胞表达最低量的EpCAM(MBD-MB-231中1.7×103个结合位点/细胞相对于MCF7中222.1×103个结合位点/细胞(Prang Net al(2005).Br J Cancer92:342-349)。有趣的是，两种适配子(DT3和23)均能够成功检测MDA-MB-231的异种移植肿瘤中的EpCAM，而两种抗体均显示该乳腺癌异种移植物的可忽略的染色(图1)。事实上，使用抗体染色，MDA-MB-231细胞先前已被报道具有如此低水平的EpCAM表达，以致在流式细胞术或免疫组织化学研究(Keller PJ et al(2010)BreastCancer Res 12:R87)中均被归类为EpCAM-阴性的(Prang N et al,同上)。相反，本发明人在本文中证明RNA适配子在相当的浓度下，能够可靠地在抗体不能检测的肿瘤中检测到低水平的EpCAM。这些结果表明了这些适配子用于未来诊断应用的有前景的潜力。
实施例4 EpCAM适配子-siRNA嵌合体
在确认生存素siRNA的功效和先前的显示EpCAM适配子的中等结合亲和力的结果后，发明人使用EpCAM适配子和生存素siRNA设计了第一适配子-siRNA嵌合体(图2)。使用“Nupack”(http://www.nupack.org)预测了这两条RNA链的二级结构。
实施例5 退火后生成的适配子-siRNA嵌合体
为了证实长链和短链成功退火从而生成预期的适配子-siRNA嵌合体(95℃,5min)，使用了非变性的高清晰度琼脂糖凝胶(4％)。如从图3可见，观察到了嵌合体的清晰的条带，表明通过退火生成了稳定的嵌合体结构，这证实了先前的结构分析(图2)。
实施例6 EpCAM适配子-siRNA嵌合体在体外结合并内化在EpCAM阳性癌细胞系中
图4表明siRNA与适配子的缀合对适配子的内化能力没有影响。这些结果以及如无EpCAM-阴性细胞系HEK-293T的内化所示的缺少非特异性的结合一起表明该复合物应当用作siRNA至EpCAM-阳性细胞系的有效递送分子。
实施例7 EpCAM适配子-siRNA嵌合体在体内靶向表达EpCAM的肿瘤
如图5中所示，在注射后，EpCAM适配子-siRNA嵌合体能够特异性集中于肿瘤中，并且该结果能够在4小时内连续检测到，峰值出现在约1小时的时间点。当切除肿瘤和器官并在体外测量时，来自适配子-siRNA嵌合体的荧光仍然可从肿瘤中检测到，并比心脏、肝、脾和肺具有更高的强度。肾中的高荧光信号可能是由于相对较大的血流量和嵌合体的较小体积(约4nm并且可通过血管部分扩散)。理论上讲，通过进一步的修饰如PEG化和完全化学修饰，可以实现较好的血浆稳定性和较低的肾和肝累积。
实施例8 嵌合体在内化后能被Dicer酶识别
将EpCAM适配子-生存素siRNA嵌合体(64nt RNA寡核苷酸)抑制生存素蛋白表达的能力与对照生存素siRNA(无过客链的嵌合体的较长链，在图2C中标记为绿色)进行了比较。图6中所示的结果表明嵌合体一旦被递送至胞质即可被Dicer酶成功加工，从而在细胞中产生21-mersiRNA。确实，如图7中所示，在体外Dicer消化分析中，适配子-siRNA嵌合体可被重组Dicer酶成功切割，从而产生适当加工的21-mer siRNA。
实施例9 嵌合体在体外显示基因沉默能力
如从图6中可见，在无转染试剂下与嵌合体一起孵育24h后，20nM和100nM剂量的EpCAM适配子-生存素siRNA嵌合体均显示基因沉默能力(分别为58.4％和79.8％)。这表明该嵌合体不仅能够靶向细胞培养物和动物体中的EpCAM阳性细胞(图4和图5)，还能够引起体外基因沉默，而不需要转染试剂。
实施例10 EpCAM适配子相比抗EpCAM抗体能在体外更好地渗透肿瘤球体
为了研究EpCAM适配子或抗体渗透肿瘤的能力，发明人使用了3维体外肿瘤球体模型。在干细胞培养基(DMEM/F12，含有20ng/ml EGF和FGF和B27)中培养了表达高水平的EpCAM的人结肠腺癌细胞HT-29和不表达EpCAM的人肾细胞HEK293。当肿瘤球体达到～300-400μm的大小时，将球体与100nM PE标记的抗EpCAM抗体、DY647标记的EpCAM适配子-23或DY647标记的不结合EpCAM的对照适配子孵育。在孵育所示时间后，将球体用PBS洗涤两次，并通过荧光共聚焦显微镜成像。还采集了每个样品的球体的相衬图像。图8显示了甚至在4h后，EpCAM抗体也仅能够渗透肿瘤球体表面上的几层细胞。与之形成强烈对比的是，在30min孵育后，EpCAM适配子-23能够渗透至肿瘤球体的核心或中心；而不结合EpCAM的对照适配子仅显示对肿瘤球体的有限的非特异性结合。进行了滞留研究，其中将肿瘤球体与EpCAM抗体、适配子-23或对照适配子一起孵育4h，在用PBS洗涤两次后，将肿瘤球体用培养基再孵育24h，然后进行共聚焦显微镜检测。如图9中所示，无针对EpCAM抗体的可检测的荧光。对照适配子存在非常弱的信号(接近背景噪声)。相反，对于适配子-23，在整个肿瘤球中存在明显可检测的信号。这表明适配子-23不仅能够渗透入肿瘤球的核心中，还能够被肿瘤细胞保留至少24h，这最可能是由于其有效内化。EpCAM靶向的特异性和选择性通过图10中所示的数据进一步得到证实，其中适配子-23显示与不表达EpCAM的HEK293T球体的最小结合。
第1部分 实施例11-14。EpCAM适配子引导的化疗药物的递送将已知仅杀伤非癌症干细胞的试剂转化为能在体外和体内杀伤癌症干细胞的试剂。
实施例11 适配子23-Dox缀合物而非游离的Dox体外靶向癌症干细胞。
在非粘附和无血清条件下，仅癌症干细胞(CSC)和祖细胞存活并进行自我更新，并且增殖形成肿瘤球体。发明人通过在3μM游离Dox、3μM与适配子缀合的等价Dox、3μM Dox-阴性对照适配子或媒介物对照存在下，将不同细胞剂量的HT29结肠癌细胞的单细胞悬液接种在超低附着的96孔中5天，研究了适配子-Dox靶向癌症干细胞的能力。将肿瘤球体(体积>50μm)计数。与先前的来自Dox仅杀伤非CSC的临床和临床前研究的发现一致，3μM游离Dox对HT29肿瘤球体形成没有影响(表3)。
表3 96孔中的肿瘤球体形成
相比之下，与EpCAM适配子缀合的3μM Dox显著减少了肿瘤球体数目。与对照适配子缀合的Dox对球体形成仅具有轻微影响，这可能是由于被细胞的非特异性摄取。已知靶向CSC23的盐霉素(Sal)，被用作阳性对照来证实我们的分析。此外，发明人证实了适配子-Dox对HT29肿瘤球体形成的抑制不局限于一种特定肿瘤细胞系，因为使用其中EpCAM被表明为肝CSC标志物的肝细胞癌细胞系(PLC/PRF/5)获得了类似的结果(表3，下面)。我们通过采用超低附着6孔形式的检测进一步证实了上述初步结果，所述检测采用了对球体计数的非常不同的系统以及球体连续传代，以更好地评估自我更新能力(数据未显示)。适配子-Dox处理体外靶向CSC的最后指示来源于HT29中确立的CSC标志物(EpCAM高/CD44高/CD24高)的FACS分析。如图11B中所示，在用适配子-Dox处理的HT29球体中，仅存在0.52％EpCAM高/CD44高/CD24高细胞，这与游离Dox组的91％(图11A)或对照适配子-Dox组中的92.1％分别形成了鲜明对比。
实施例12 EpCAM适配子-Dox靶向离体癌症干细胞
因为球体形成是体内致肿瘤性的替代分析，发明人检测了在异种移植后体外处理的细胞是否能够形成肿瘤。用3μM游离Dox或适配子-Dox将HT29细胞处理5天，并将1x104或1x105个处理的细胞(与Matrigel混合)经皮下注射入NOD/SCID小鼠(n＝5)。如图12和表4中所示，游离的Dox处理的细胞在每只研究的小鼠中形成了肿瘤，但在接受适配子-Dox-处理的肿瘤移植物后第50天在小鼠细胞中未检测到肿瘤(表4)。
表4 离体肿瘤形成的评估
实施例13 EpCAM适配子-Dox在体内靶向结肠CSC。
本发明人通过使用原位IVIS Lumina II成像站的活体动物成像，首次研究了适配子-Dox缀合物是否能够在体内有效靶向肿瘤。如图13中所示，Dy647标记的适配子-Dox在静脉注射后5min累积于HT-29异种移植肿瘤(s.c.约5mm大小)中，并且肿瘤中的信号持续了约2h。使用金标准极限稀释/异种移植分析(ELDA)在体内进一步测试了适配子-Dox靶向CSC的能力。为此，发明人将1x106个HT29细胞经皮下注射至NOD/SCID小鼠中。当肿瘤达到3mm的大小时，将小鼠随机分组，并经尾静脉注射5mg/Kg日剂量的游离Dox、EpCAM适配子-Dox或对照适配子-Dox，连续处理3天。在最后处理后1周处死小鼠。如图14中所示，在仅3次注射后，相比接受游离Dox或与对照适配子缀合的Dox的小鼠，来自适配子-Dox处理组的肿瘤在统计学上明显更小/更轻。重复试验并从处理的肿瘤制备了单细胞悬液(如14中所示的)，并进行了ELDA(极限稀释分析)以评估对CSC频数的影响。如表5中所示，如接种后9周时所测得的，EpCAM适配子-Dox缀合物能够显著降低体内致肿瘤性。
表5 HT29细胞群的致肿瘤性
实施例14 将20kDa-PEG缀合至EpCAM适配子的5’端改善了其生物分布和肿瘤靶向
经静脉内将PEG-适配子-Dox(5mg Dox/kg)注射至携带肿瘤的小鼠中。经由适配子ELISA测定的通过给定组织/器官的重量(g)标准化的PEG-适配子的百分比(％)ID描绘在图15中所示的条形图中。
总之，来自实施例11-14的数据表明EpCAM-23引导的RNA适配子-阿霉素缀合物能够在体外和体内靶向癌症干细胞。
第2部分 实施例15-17。EpCAM适配子引导的siRNA递送通过体内有效靶向癌症干细胞克服了化疗抗性。
实施例15 EpCAM适配子介导的siRNA递送在体外靶向癌症干细胞
阿霉素(Dox)其自身并不杀伤癌症干细胞。发明人假定生存素siRNA靶向CSC的递送将使得CSC对Dox敏感。确实，在用20nM嵌合体+300nM Dox处理(无转染试剂)72h后，在第一和第二轮的肿瘤球体测定中乳腺球体的数目减少了～80％(未显示)，这表明大部分的癌症干细胞已被清除。通过将处理的细胞异种移植入NOD/SCID小鼠的第4腹股沟乳腺脂肪垫中以及评估CSC频数(在移植后第40天)的极限稀释分析(表6)，发明人还证实了嵌合体+Dox对癌症干细胞的致肿瘤性的影响。最后，如图16中所示，相比仅用游离的Dox处理，在体外用嵌合体+300nM Dox处理肿瘤球体引起了乳腺癌CSC(EpCAM+/CD44+/CD24-)的显著减少(图16)，而对于以媒介物对照或阴性对照嵌合体+Dox处理的细胞，EpCAM+/CD44+/CD24-群体分别保持在～22.5％和21.7％。这些结果确立了EpCAM适配子-生存素siRNA嵌合体能在体外靶向MCF7/ADR乳腺癌耐药模型中的癌症干细胞。
表6 离体致肿瘤性
实施例16 EpCAM适配子在体内递送siRNA至异种移植物肿瘤并靶向癌症干细胞
通过在NOD-SCID小鼠中每部位移植3x106MCF7/ADR细胞(与Matrigel混合)来建立原位乳腺癌模型。当肿瘤达到～200mm3的体积时，我们开始通过尾静脉注射进行处理。在第1、3、5天，以静脉内(快速浓注)注射1纳摩尔EpCAM适配子-siRNA嵌合体来处理小鼠(n＝5)；且在第2、4、6天，以静脉内(快速浓注)注射5mg/kg阿霉素处理。在第10天将动物安乐死，收获肿瘤，然后进行异种移植和体内极限稀释分析。如图17中所示，嵌合体(无PEG)的体内功效显示为其将生存素mRNA和蛋白敲低～60％的能力。重要的是，生存素siRNA靶向EpCAM的递送结合Dox处理在体内消除了MCF7/ADR肿瘤中大部分的癌症干细胞，这从异种移植-极限稀释分析得到证实，所述分析评估了肿瘤的癌症干细胞的独特特征、自我更新和致肿瘤性(在移植后第50天)(表7)。
表7 异种移植-LDA
实施例17 EpCAM-siRNA嵌合体的药代动力学的改善进一步增强了治疗功效
将20-kDa PEG连接至siRNA-适配子-嵌合体的5’-端，以延长其系统循环时间。然后，发明人通过每部位移植3x106MCF7/ADR细胞(与Matrigel混合)使用了相同的原位乳腺癌模型。当肿瘤达到～200mm3的体积时，我们开始处理。在第1、3、5天，用静脉内(快速浓注)注射1纳摩尔的EpCAM适配子-siRNA嵌合体处理小鼠(n＝8)；且在第2、4、6天，用静脉内(快速浓注)注射5mg/kg阿霉素处理。在最后(第3次)处理后第2天，去除肿瘤，测定其重量，并通过流式细胞术研究处理组和各种对照组中的乳腺癌干细胞标志物(EpCAM+/CD44+/CD24-)阳性细胞的百分比。如图18中所示，相比任何其他处理组，包括以游离阿霉素处理的组，来自用EpCAM-23适配子-生存素siRNA嵌合体+阿霉素处理的小鼠的肿瘤具有明显减少的肿瘤总肿瘤质量(重量)。此外，从乳腺癌干细胞标志物-阳性细胞的比例来评判，通过EpCAM-23适配子-生存素siRNA嵌合体+阿霉素处理极大地减少了乳腺癌干细胞池(表8)。
总之，通过防止发生化疗抗性，在体内EpCAM-23适配子引导的siRNA至癌症干细胞的递送增强了治疗功效。
表8 不同处理组中的CSC标志物状态
在一周中用1纳摩尔PEG-嵌合体+5mg/kg阿霉素处理MCF-7/ADR肿瘤(0.2mm3)3次。制备了单细胞悬液用于流式细胞术分析(n＝8)。
评论
用于检测组织病理学切片中的癌症生物标记蛋白表达的灵敏和可靠的方法为基于病灶的分子信息的个体化用药所必需。EpCAM是癌症生物标志物，其在原发性和转移性乳腺癌中过表达均有记载。这类患者的不利临床结果与增加的EpCAM表达有关，尤其是在转移中。另外，胆囊癌、卵巢癌和胰腺癌的较差的预后也与EpCAM的过表达有关。实际上，已表明三重阴性乳腺癌中的EpCAM表达可以是用于免疫治疗的合适的靶标，考虑到它对现有的靶向治疗如内分泌治疗和曲妥单抗的耐受性。在使用完全的人源化的单克隆抗EpCAM抗体、阿德木单抗(adecatumumab)(MT201)的研究中，患有转移性乳腺癌的患者显示剂量依赖性的和靶标依赖性的临床反应，具有降低的新转移率。
根据免疫组织化学研究和来自几项EpCAM免疫治疗临床试验的结果，表明测试了癌症患者中的EpCAM表达的水平，考虑到增加的免疫治疗的使用和使用抗EpCAM抗体治疗表达高水平的EpCAM的肿瘤。实际上，甚至已表明抗EpCAM免疫治疗的一些临床试验的失败可能与缺乏待治疗的肿瘤中的EpCAM表达的现有知识有关。在本文中，本发明人证明适配子特别适合于(并且优于抗体)组织学诊断。虽然在尝试使用这些适配子作为化学抗体时需要大量优化，这些探针为核酸并因此可能需要两种常规抗体染色的组合方法以及用于原位杂交的类似方法的认识，证明是高度成功的。已表明硫酸葡聚糖的使用能够加速核酸杂交速率，因此能减少适配子孵育所需的时间，同时已表明肝素能减低杂交程序中的背景结合。当从杂交缓冲液中省略了这两种试剂中的一种时，未实现阳性染色，甚至在增加孵育时间时亦如此。实际上，该方法对于针对EpCAM染色测试的所有适配子均成功。我们预计该改善的方案将证明在石蜡包埋的组织的染色中对其他适配子的应用高度有效。
在本研究中，现有适配子DT3未显示对HT-29异种移植物切片的任何染色，而另一种测试的适配子——适配子23，显示了强阳性染色。一种可能是DT3结合的EpCAM分子上的特定表位可能缺失或由于细胞表面上的其他抗原掩蔽了该特定肿瘤的这一表位而使其仍不能被接近。然而，考虑到3种乳腺癌异种移植物中观察到的阳性反应，不可能是表位缺失的原因。可选地，该特定表位在抗原修复后仍在该异种移植肿瘤上被掩蔽。同样，适配子DT3具有的针对该细胞系的较低的亲和力可能也起着作用，并且可能是这两种因素的组合导致了免疫染色的缺失。
本发明适配子能够检测石蜡包埋的组织中的低水平的抗原和测试的常规抗体不能染色相同的肿瘤之间的鲜明对比是有趣的。适配子比抗体小10-20倍(6kDa vs 150kDa)，并因此可能的是相比抗体，更多数目的适配子能结合给定的靶标分子。另外，适配子的较小体积可以促进其更有效地渗透组织病理学载片中的细胞层。这可能是为何本发明发明人能够通过石蜡包埋的组织的适配子染色检测MDA-MB-231细胞表面上的EpCAM表达的一个原因，该细胞系通常被认为是EpCAM阴性的，这是由于抗体不能检测其表达。可以想象，在使用常规抗体染色进行诊断期间，低水平的EpCAM表达可能被错过。
本研究使用了异种移植肿瘤将本发明的EpCAM适配子表征为组织学试剂。关于这方面的一个原因是由于难以获得合适的人体组织。然而，至少在其他人研究的肿瘤中，已提出异种移植肿瘤在很大程度上忠实地体现了体内肿瘤的组织学。用于本研究的异种移植肿瘤的组织病理学已得到病理学家确认。来自该原理循证研究的结果表明适配子不仅能够用作化学抗体，而且相比常规抗体更为灵敏(至少相比测试的EpCAM抗体)。考虑到适配子能被容易地化学合成，本研究为在未来的组织病理学诊断中使用这些化学抗体作好了准备。
本申请的结果表明适配子能够提供稳健和经济有效的工具以将来自生物标志物和癌症干细胞研究中的发现转化为病理学诊断实践，从而使得能够更好地将患者分级进行个体化用药。

Claims (21)

1.特异性结合EpCAM的RNA适配子，所述适配子由序列5’-ACGUAUCCCUUUUCGCGUA-3’组成。
2.如权利要求1所述的适配子，其包含一个或多个增加适配子稳定性的修饰。
3.如权利要求2所述的适配子，其中所述适配子序列的嘧啶碱基经2’-氟代(2’-F)修饰。
4.如权利要求2所述的适配子，其还包含反向的dT。
5.如权利要求4所述的适配子，其中所述适配子特异性结合EpCAM+癌症干细胞。
6.如权利要求3所述的适配子，其中所述适配子特异性结合EpCAM+癌症干细胞。
7.如权利要求5所述的适配子，其中所述细胞存在于获自个体的生物样品中。
8.如权利要求5所述的适配子，其中所述细胞选自乳腺癌干细胞、前列腺癌干细胞、胰腺癌干细胞、结肠癌干细胞、肝癌干细胞、肺癌干细胞、卵巢癌干细胞和头颈癌干细胞。
9.诊断剂，其包含与可检测标记结合的权利要求1-8任一项所述的适配子。
10.如权利要求9所述的诊断剂，其中所述可检测标记选自：酶、辅基、发光物质、电子致密标记、MRI标记和放射性物质。
11.如权利要求10所述的诊断剂，其中所述发光物质为荧光物质或生物发光物质。
12.抗癌剂，其包含与部分结合的权利要求1-8中任一项所述的适配子，所述部分选自毒素、放射性核素和化疗剂，以及以上物质的组合。
13.如权利要求12所述的抗癌剂，其中所述化疗剂是阿霉素。
14.从获自个体的生物样品分离、纯化或富集表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-8中任一项所述的RNA适配子或者权利要求9-11任一项所述的诊断剂。
15.鉴定个体中的或获自个体的生物样品中的表达EpCAM的细胞和/或癌症干细胞的试剂盒，所述个体患有或疑似患有癌症，所述试剂盒包含权利要求1-8中任一项所述的RNA适配子或者权利要求9-11任一项所述的诊断剂。
16.如权利要求14或15所述的试剂盒，其中所述个体为患有选自如下的癌症的个体：乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、头颈癌、或其中存在EpCAM+细胞的任何其他癌症。
17.如权利要求1-8中任一项所述的适配子，或者权利要求12或13所述的抗癌剂在制备用于治疗或预防个体中存在EpCAM+细胞的癌症的药物中的用途。
18.递送剂，其包含能够与siRNA或核酶结合的权利要求1-8中任一项所述的适配子。
19.如权利要求18所述的递送剂，其包含适配子-siRNA嵌合体，其中所述嵌合体具有由序列5’-ACGUAUCCCUUUUCGCGUAAAAUGUAGAGAUGCGGUGGUCCUU-3’组成的适配子、连接子和生存素siRNA的引导链以及由序列3’UUACAUCUCUACGCCACCAGG 5’组成的生存素siRNA的过客链。
20.如权利要求18或19所述的递送剂，其还包含一个或多个增加适配子稳定性的修饰。
21.组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-8中任一项所述的适配子、权利要求12或13所述的抗癌剂、或者权利要求18-20任一项所述的递送剂，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
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