JP6978317B2 - ＥｐＣＡＭアプタマー及びそのコンジュゲート - Google Patents

Description

関連出願及び参照による援用
本明細書に引用又は参照されている全ての文献は、本明細書に記載されている若しくは本明細書に参照により援用されている任意の文献に記載されている製造元の指示、説明、製品仕様、及び製品シートとともに、その全体が参照により明細書に援用される。

相互参照
本明細書に引用又は参照されている全ての文献、及び本明細書で引用されている文献中で引用又は参照された全ての文献は、本明細書又は本明細書中で参考して援用されるあらゆる製造元の指示、説明、製品仕様及び製品シートとともに、それらの全体が参照により明細書に援用される。

本出願は、２０１５年２月１１日に出願されたオーストラリア特許出願番号ＡＵ２０１５９００４３７の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に援用される。

配列表への参照
配列表の電子提出の全内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照により援用される。

発明の分野
本開示は、二機能性活性を有するＥｐＣＡＭアプタマー及びＥｐＣＡＭアプタマーコンジュゲート、並びにその使用に関する。アプタマー及びアプタマーコンジュゲートは、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｕｒｓ）及び／又は脳転移（ｂｒａｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）の治療に有用である。

先進国では、主に高齢化が原因で、癌が死亡原因の第１位になっている。癌が身体の別の部位に転移した患者では、生存率が低下し、脳への転移が特に予後不良で、平均生存期間が６ヶ月未満である。脳転移は全ての癌診断の８．５〜９．６％を特徴とし、原発性脳腫瘍の１０倍以上共通するものであり、これらの二次腫瘍の多くは原発性肺、乳房、皮膚（メラノーマ）及び結腸直腸癌及び悪性黒色腫に由来している。

ほとんどの癌と同様に、脳転移の治療には、手術、放射線療法又は化学療法の３つの選択肢が含まれる。これらのアプローチは、患者の生存期間を延長し、生活の質を向上させることができるが、患者の予後は悲観的なままである。外科的切除は、再発率が高く、化学療法及び放射線療法の両方は非特異的であり、安全性プロファイルが不良である。ほとんどの化学療法薬は、循環する薬剤の脳実質へのアクセスが限られているため、さらに複雑である。テモゾロミド（ＴＭＺ）は、脳に入ることができる１つの薬物であるが、有効性の欠如によって依然として制限されている（Ｍｉｎｎｉｔｉ Ｇ ｅｔ ａｌ，（２０１４）Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ １１８（２）：３２９−３４）。このように、最初に脳環境に入ることができるが、癌細胞、特に腫瘍原性亜集団にその毒性を限定することができる標的化薬剤が必要である。

脳腫瘍の治療は、分子の通過を厳密に制御することによって脳微小環境を全身循環から隔離する血液脳関門（ＢＢＢ）の存在によって複雑化されている。このように、化学療法薬は脳に入ることはほとんどないが、身体のどこかでまだ損傷を与え得る。

１ｍｍほどの小さい脳腫瘍は、ＢＢＢの透過性を損ない得る。しかし、この効果はＢＢＢ全体で均質ではなく、十分な量の薬物投与を改善するには効果がほとんどない（Ｈｕｓｅ ＪＴ ｅｔ ａｌ，（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １０（５）：３１９−３１）。ＢＢＢによって提示される問題を回避するために使用される１つの技法である、直接頭蓋注射（ｄｉｒｅｃｔ ｃｒａｎｉａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、非常に侵襲的で有害である（Ｌａｓｓａｌｅｔｔａ Ａ ｅｔ ａｌ，（２００９）９５（１）：６５−９）。このアプローチは効果的であると示されているが、感染やその他の副作用の危険性がある。他の方法は浸透性又は化学的手段によるＢＢＢの透過性を増加させることを含む。これらも、危険な治療選択肢であり、発作及び他の神経学的副作用を誘発する可能性がある。

トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ）は、鉄ホメオスタシスに関与する膜糖タンパク質である。それは、多くの癌細胞株上と同様、ＢＢＢの表面上で強力に発現されており（Ｗｉｌｎｅｒ ＳＥ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｉ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２０１２；１：ｅ２１）、ＢＢＢを通過する薬物コンジュゲートの受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）に対する有効な標的として同定されている。ＴｆＲは、赤血球、肝細胞、腸細胞、マクロファージ及び脳自体のようにそれが発現されるほとんどの細胞型において飽和しているが、その発現がかなり高いＢＢＢでは飽和していない。

癌の増殖は、自己再生特性を有する細胞の特有の亜集団の存在によって引き起こされることが提案されている。これらの癌幹細胞（ＣＳＣ）は比較的静止状態、かつ、薬剤耐性であり、正常幹細胞又はエピジェネティック修飾から生じる他の細胞の脱分化から生じ得ることが示唆される証拠がある。さらに、ＣＳＣと前駆細胞との間で相互変換の可能があるようであり、これは動的平衡として特徴づけられることが示唆されている。

ＣＳＣの存在を指摘する最初の証拠は、免疫不全マウスへの癌細胞の連続希釈の異種移植を含む研究であった。これらは、動物モデルにおいて癌を発症させるのに大量の細胞が必要であることを見出し、いくつかの細胞のみがその能力を有することを示唆している。

ＣＳＣが腫瘍発生において果たす役割を考慮すると、腫瘍に加えて、この細胞集団（従来療法による治療に対して抵抗性であり得る）を特異的に排除することに向けられ得、手術不能な脳腫瘍を含む、脳腫瘍及び脳転移を治療するためにさらにＢＢＢを通過することが可能である、新規な標的化治療剤の必要性がある。

発明の概要
脳腫瘍の治療における抗体の有効性は、それらのサイズによってよって妨げられ、従って、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する能力を犠牲にしている。アプタマーは、抗体と比較してサイズが有意に小さく、抗体療法を損なうことがある非特異的Ｆｃ媒介性の効果がないため、癌治療に対して抗体よりも特に有利である。本開示は、脳転移及び／又は脳腫瘍を効果的に標的とすることができる二機能性アプタマーに関する。

本開示は、ＥｐＣＡＭに結合するＥｐＣＡＭアプタマー、並びに血液脳関門を通過することができる二重の機能性を示し、脳内に位置する腫瘍細胞上に存在するマーカーに結合するＥｐＣＡＭアプタマーコンジュゲートを記載する。アプタマー又はアプタマーコンジュゲートには、腫瘍に送達されて腫瘍細胞死をもたらす化学療法剤を備え得る。アプタマーコンジュゲートは、受容体媒介トランスサイトーシス（ＲＭＴ）を介して脳に入り、脳腫瘍又は脳転移によって発現される癌幹細胞マーカーに結合することができる。特定の例において、アプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭ及びトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合する。アプタマーコンジュゲートは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの組み合わせであり得る。一例では、アプタマーコンジュゲートは、ヒトＥｐＣＡＭに結合する。さらなる例において、アプタマーコンジュゲートは、ヒトＴｆＲに結合する。さらなる例において、アプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭに特異的に結合し、かつ、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）に特異的に結合する。別の例では、アプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭへのその結合とは独立してＴｆＲに結合し、逆もまた同様である。

一例では、アプタマーコンジュゲートは、２つのアプタマー配列（又は本明細書に記載の「結合成分」）の融合体である。別の例では、アプタマーコンジュゲートは、別のアプタマー配列（又は結合成分）に連結された１つのアプタマー配列（又は結合成分）を含む。適切なリンカー配列は当該分野で公知である。

本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、合成的に生成され得る。別の例では、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは単離又は精製される。

一実施形態では、本開示は、（ｉ）配列番号９の塩基５〜１３（ＡＧＧＴＴＧＣＧＴ）、（ｉｉ）配列番号１１の塩基４〜１３（ＡＣＧＴＴＧＴＣＡＴ）又は（ｉｉｉ）配列番号１２の塩基４〜９（ＧＴＴＧＧＣ）のいずれか１つから選択されるループ領域配列及び任意にその１つ又は複数の置換を含む、ＥｐＣＡＭに結合するアプタマーを提供する。

アプタマーは、上記で特定したループ領域配列内に１つ、２つ又は３つの置換を含み得る。

一例では、アプタマーは、配列番号９の塩基５〜１３のループ領域と、３〜１５塩基対を含むステム領域とを含む。さらなる例において、アプタマーは、４〜１０塩基対を含むステム領域を含む。さらなる例において、アプタマーは、１０塩基対を含むステム領域を含む。さらなる例において、アプタマーは、４塩基対を含むステム領域を含む。

一例では、アプタマーは、配列番号９に記載の配列を含むか又はそれからなる。一例では、アプタマーは、配列番号１３に記載の配列を含むか又はそれからなる。

一例では、アプタマーは、配列番号１１の塩基４〜１３のループ領域及び３〜１５塩基対を含むステム領域を含む。一例では、アプタマーは、３〜５塩基対を含む。別の例では、アプタマーは３塩基対を含む。

一例では、アプタマーは、配列番号１１に記載の配列を含むか、又はそれからなる。

一例において、アプタマーは、配列番号１２の塩基４〜９のループ領域及び３〜１５塩基対を含むステム領域を含む。一例では、アプタマーは、３〜５塩基対を含む。一例では、アプタマーは３塩基対のステム領域を含む。

一例において、アプタマーは、配列番号１２に記載の配列を含むか、又はそれからなる。

一例では、アプタマーは、約１ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１ｎＭ〜約４００ｎＭ、約３ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３ｎＭ〜約１５０ｎＭ、約３ｎＭ〜約１００ｎＭ、約５ｎＭ〜約１００ｎＭ、約５ｎＭ〜約８０ｎＭ、約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約８ｎＭ〜約３５ｎＭ、約８ｎＭ〜約１０ｎＭ、１０ｎＭ未満、又は５ｎＭ未満のＥｐＣＡＭに対する結合親和性（Ｋ_D）であり得る。

別の実施形態では、本開示は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）及びＥｐＣＡＭに結合するアプタマーコンジュゲートを提供する。アプタマーコンジュゲートは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの組み合わせであり得る。アプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭへの結合とは独立してＴｆＲに結合し得る。

一例では、本開示は、アプタマーコンジュゲートがＥｐＣＡＭ及びＴｆＲに結合するコンセンサス配列５’−ＧＣＧ ＣＧＧ Ｘ₁Ｘ₂Ｃ ＣＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣ ＧＴＣ ＣＧＴ−３’（配列番号１）を含むアプタマーコンジュゲートを提供する。一例では、Ｘ₁及びＸ₂はＡ、Ｔ、Ｃ又はＧである。一例では、Ｘ₁はＧ又はＣであり、Ｘ₂はＡ又はＴである。

一例において、本開示は、１つ以上の置換基を任意にその中に有する配列５’−ＧＣＧ ＣＧＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣ ＧＴＣ ＣＧＴ−３’（配列番号２）を含むアプタマーコンジュゲートを提供し、ここで、前記アプタマーコンジュゲートはＥｐＣＡＭ及びＴｆＲに結合する。

別の例では、本開示は、１つ以上の置換基を任意にその中に有する配列５’−ＧＣＧ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣ ＧＴＣ ＣＧＴ−３’（配列番号３）を含むアプタマーコンジュゲートを提供し、ここで、前記アプタマーコンジュゲートはＥｐＣＡＭ及びＴｆＲに結合する。

本開示はまた、１つ以上の置換基を任意にその中に有する配列５’−ＧＣ ＧＣＧ ＧＴＡ Ｃ ＣＧ ＣＧＣ ＴＡ ＡＣＧ Ｇ ＡＴ ＴＣＣ ＴＴＴ Ｔ ＣＣ ＧＴ−３’（配列番号１０）を含むアプタマーコンジュゲートを提供し、ここで前記アプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭ及びＴｆＲに結合する。

別の例では、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号１０の配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個のその置換を含む。別の例では、１つ又は複数の置換が、アプタマーコンジュゲートのＴｆＲ結合部分内で生じる。別の例では、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号１０の配列は、アプタマーコンジュゲートのステム領域内に少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個の置換を含む。別の例では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７又は８個の置換が、アプタマーコンジュゲートのＴｆＲ結合部分のステム領域内で起こる。一例では、ステム領域は、アプタマーコンジュゲートの予測された２Ｄ構造の領域である。

一例では、ＴｆＲ結合部分は、トランスフェリン受容体との結合に対し、トランスフェリンと競合しない。

本発明者らは、コンジュゲートアプタマーの結合親和性は損なわれず、結合アフィニティーは、それらが由来する単一アプタマーの結合アフィニティーと比較して強くない場合、典型的には類似していることを見出した。

一例では、本開示のアプタマーコンジュゲートは、ＴｆＲに対して約３００〜３４０ｎＭの結合親和性（Ｋ_D）を有する。別の例において、本開示のアプタマーコンジュゲートは、１５０〜４５０ｎＭ、２００〜４２０ｎＭ、２５０〜３５０ｎＭ、２７０〜３４０ｎＭ、又は３００〜３４０ｎＭのＴｆＲに対する結合親和性を有する。一例では、結合親和性はｂＥｎｄ．３細胞で測定される。

一例において、本開示のアプタマーコンジュゲートは、約２１０〜２２０ｎＭのＥｐＣＡＭに対する結合親和性（Ｋ_D）を有する。別の例において、本開示のアプタマーコンジュゲートは、１３０〜２８０ｎＭ、１５０〜２６０ｎＭ、１７０〜２４０ｎＭ、又は２００〜２２０ｎＭのＥｐＣＡＭに対する結合親和性を有する。一例において、結合親和性はＨＥＹ細胞で測定される。

一例では、アプタマーコンジュゲートは、３３〜１００塩基の配列の長さを含む。別の例において、アプタマーコンジュゲートは、３３〜８０塩基、３３〜７０塩基、３３〜５０塩基、又は３３〜４０塩基の配列を含む。

別の例では、アプタマーコンジュゲートは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号１０の配列を含み、ここで、配列長は３３〜１００塩基である。別の例において、配列の長さは、３３〜８０塩基、３３〜７０塩基、３３〜５０塩基、又は３３〜４０塩基である。

別の例では、アプタマーコンジュゲートは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号１０の配列から本質的になる。

別の例では、アプタマーコンジュゲートは、配列番号２、配列番号３又は配列番号１０の配列からなる。

別の実施形態では、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、（インビトロ又はインビボで）アプタマーの安定性を改善する１つ又は複数の修飾を含む（修飾アプタマー）。適切な修飾は、本明細書の他の箇所で議論される。一例では、ピリミジン塩基は、２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されている。別の例では、アプタマーコンジュゲートの３’末端が、ヌクレアーゼ消化から保護するために修飾される。別の例では、アプタマーコンジュゲートは、５’末端をフルオロフォア（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＴＹＥ６６５）に連結することによって修飾される。別の例では、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、３’末端に、ｉｎｖ−ｄＴ（逆リンケージ）と呼ばれる、逆位デオキシチミジン（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（ｄＴ）を含む。

別の実施形態において、本開示はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２の配列を含むアプタマーと、実質的に同じＥｐＣＡＭへの結合能力を有するアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを提供する。一例において、「実質的に同じ結合能力を有する（ｈａｖｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｔ ｂｉｎｄ）」とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアプタマーと実質的に同じ又は類似の（ｓｉｍｉｌａｒ）結合親和性を有することを意味する。別の例において、「実質的に同じ結合能力を有する」とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２のアプタマーと同じ又は重複するエピトープへの結合を意味する。

一例では、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭ＋細胞（単数又は複数）に特異的に結合する。

別の例では、ＥｐＣＡＭ＋細胞（単数又は複数）は幹細胞（単数又は複数）である。別の例では、幹細胞は、単離された癌幹細胞（単数又は複数）である。別の例では、癌幹細胞（単数又は複数）は、（ｉ）ＥｐＣＡＭを発現し、（ｉｉ）腫瘍形成性（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ）であり、（ｉｉｉ）自己再生することができ、（ｉｖ）分化することができ、及び（ｖ）従来の療法によるアポトーシスに抵抗性である、ものとして特徴付けられる。

癌幹細胞（単数又は複数）は、生物学的サンプルなどの供給源から単離、濃縮、又は精製されたものとして代替的に記載されてもよい。別の例では、癌幹細胞（単数又は複数）は、ＥｐＣＡＭ⁺発現に基づいて濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）細胞集団を表す。別の例では、細胞集団は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が癌幹細胞を含む。

一例では、ＥｐＣＡＭ発現細胞及び／又は癌幹細胞は、インビボで存在する。別の例では、ＥｐＣＡＭ発現細胞及び／又は癌幹細胞は、インビトロで存在する。さらなる例において、ＥｐＣＡＭ発現細胞及び／又は癌幹細胞は、対象から得られた生物学的サンプル中に存在する。さらなる例において、生物学的サンプルは生検サンプルである。

別の例において、本開示のＥｐＣＡＭ発現細胞及び／又は癌幹細胞は、ＣＤ４４、ＡＢＣＧ２、β３−カテニン、ＣＤ１３３、ＡＬＤＨ、ＶＬＡ−２、ＣＤ１６６、ＣＤ２０１、ＩＧＦＲ及びＥＧＦ１Ｒを含む１つ以上のさらなる抗原を発現し得る。

別の例において、本開示による癌幹細胞は、脳癌転移である。さらなる例において、転移は原発性の乳癌、肝臓癌又は結腸癌に由来する。

別の例では、アプタマーコンジュゲートは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合する。別の例では、アプタマーコンジュゲートは、血液脳関門を通過することができる。別の例では、トランスフェリン受容体はトランスフェリン受容体１である。

別の実施形態において、本開示はまた、検出可能な標識にカップリングされた本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含む検出剤を提供する。

別の実施形態では、本開示はまた、検出可能な標識にカップリングした本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含む診断剤を提供する。

当業者であれば、本発明のアプタマーコンジュゲートが、非特異的抗体結合に関連し得る合併症を回避し、それにより、優れたシグナル対ノイズ比を提供することが理解されよう。

一例では、本明細書に記載の検出又は診断剤は、インビボ又はインビトロでＥｐＣＡＭ発現細胞を検出するために使用される。

一例では、本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、対象又は腫瘍を有するか若しくは腫瘍を有すると疑われる対象から得られる生物学的サンプル中のＥｐＣＡＭ発現細胞及び／又は癌幹細胞の存在を検出するために使用され得る。

さらなる例において、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、対象又は腫瘍を有するか若しくは腫瘍を有すると疑われる対象から得られる生物学的サンプル中の脳腫瘍又は脳転移の存在を診断するために使用され得る。

特定の例において、検出又は診断は、ＥｐＣＡＭ発現細胞の検出に基づく。

検出は、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートを検出可能な標識にカップリングすることによって促進され得る。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐｓ）、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、電子密度標識（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｅ ｌａｂｅｌｓ）、ＭＲＩ用標識及び放射性物質が含まれる。

本開示はまた、生物学的サンプルの組織学的検査において使用するための、本明細書に記載のアプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート又は本明細書に記載の検出剤を提供する。組織学的調製物を調製するための方法は、当業者によく知られているであろう。

本開示はまた、成分（ｍｏｉｅｔｙ）にカップリングした本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含む抗癌剤（ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔ）を提供する。一例において、本明細書に記載の抗癌剤は、対象における脳腫瘍若しくは癌及び／又は脳転移を治療するために使用される。本開示の当業者は、本開示の抗癌剤が、脳内で新たに生じたか、又は脳の外に起因する原発性腫瘍若しくは癌の転移から発生した癌又は腫瘍を治療するために使用され得ることを認識するであろう。一例では、対象は、本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートによる治療の恩恵を受ける対象である。別の例では、対象は、脳癌（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）又は脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｕｒ）と診断された対象である。典型的には、癌は、悪性であり、二次増殖（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｇｒｏｗｔｈｓ）を生じさせることができる制御不能な増殖として認識される。腫瘍は、悪性又は良性であってもよい。良性腫瘍は、身体のある成分に限定された成長として特徴付けられる。別の例では、対象は、固形腫瘍を有する対象である。腫瘍の処置におけるそれらの有用性に関して、当業者は、本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートが、腫瘍サイズ及び／又は腫瘍内で増殖するその能力を低下させ、そ脳機能及び／又は完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を損なう（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）腫瘍の能力を予防又は軽減する、そのような腫瘍に成分を送達するために使用され得ることを認識するであろう。

本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、成分にカップリングされ得、アプタマーは、ＥｐＣＡＭ発現細胞（例えば、ＥｐＣＡＭを発現する癌幹細胞）を含むか又はそれを含むと疑われる腫瘍の部位に成分を導くために使用される。成分の例は、ＥｐＣＡＭ発現細胞を死滅させるために使用され得る毒素、放射性核種又は化学療法剤、又はＥｐＣＡＭ発現細胞を含む腫瘍の位置及びサイズ決定に使用され得る造影剤（ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）を含む。さらなる例において、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、ドキソルビシン（ｄｏｘ）とカップリングされる。ドキソルビシンは、好ましくは、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートのステム領域に挿入又はインターカレートされる（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）。

本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含む抗癌剤は、１つ以上の有効成分をさらに含み得る。有効成分は、１つ以上のさらなる抗癌剤を含み得る。

本開示はまた、対象から得られた生物学的サンプルからＥｐＣＡＭ発現細胞(単数又は複数）及び／又は癌幹細胞（単数又は複数）を単離、精製又は濃縮する方法を提供し、該方法は、細胞を、本開示のアプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート又は本開示の検出剤と接触させることを含む。一例では、この方法はインビトロで実施される。

ＥｐＣＡＭ発現細胞を単離、精製又は濃縮する方法は、当業者に公知であり、本明細書の他の箇所にも記載されている。

本開示はまた、対象、又は脳癌若しくは脳腫瘍及び／若しくは脳転移を有するか又は有すると疑われる対象から得られた生物学的サンプル中の、ＥｐＣＡＭ発現細胞（単数又は複数）及び／又は癌幹細胞（単数又は複数）を同定又は検出するための方法を提供するものであり、細胞又はサンプルを、本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲート、又は本開示の検出剤と接触させることを含む。

本開示はまた、脳腫瘍又は脳腫瘍及び／又は脳転移を診断する方法を提供するものであり、対象又は対象から得られた生物学的サンプル中のＥｐＣＡＭ発現細胞（単数又は複数）及び／又は癌幹細胞（単数又は複数）を、本開示のアプタマーコンジュゲート又は本開示の診断剤と接触させることを含む。

本開示はまた、対象における脳腫瘍又は腫瘍及び／又は脳転移を、治療又は予防する方法を提供するものであり、対象に、本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲート、又は本明細書に記載の抗癌剤を提供することを含む。一例では、癌は、ＥｐＣＡＭ発現細胞及び／又は癌幹細胞が存在するか又は疑われる任意の癌である。脳転移は、身体のどこかに位置し、原発癌の治療後数ヶ月又は数年後に脳に現れる原発癌に由来するものであってもよい。

ＥｐＣＡＭ発現細胞は、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、感覚神経芽腫（ｅｓｔｈｅｓｉｏｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経線維腫（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａ）、原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）を含む、脳腫瘍において見出され得るが、これらに限定されない。さらに、ＥｐＣＡＭ発現細胞は、皮膚腫瘍（例えば、基底細胞腫、メラノーマ、メルケル細胞癌）、胸腺腫、線維肉腫、乳腺／乳房腫瘍（例えば、アポクリン腺癌（ａｐｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺管癌（ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜腫瘍（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｔｕｍｏｕｒｓ）、卵巣腫瘍（ｏｖａｒｉａｎ ｔｕｍｏｕｒｓ）（例えば、エンドメトリオド癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、類内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、漿液癌（ｓｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））、前立腺癌、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍、結腸及び直腸腫瘍（例えば、結腸腺腫（ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｍａ）、結腸腺癌（ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、食道腫瘍、肝臓腫瘍、膵腫瘍、胃腫瘍、及び神経内分泌腫瘍（例えば、カルチノイド腫瘍、副甲状腺腺腫、甲状腺腺腫、甲状腺濾胞癌、甲状腺乳頭癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ））を含むが、これらに限定されない。

本開示の方法は、全身療法（ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ）を対象に送達するために使用され得ることが理解されるであろう。例えば、投与経路に応じて、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートを、ＥｐＣＡＭ発現細胞を含有する脳腫瘍／癌又は転移並びに身体の他の部位に位置する腫瘍を標的にするために使用され得る。このようにして、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、治療に対する全身療法アプローチを提供し得る。

別の例では、対象は、脳癌又は脳腫瘍及び／又は脳転移を有すると診断された対象である。別の例では、対象は固形腫瘍を有する対象である。

別の実施形態では、本開示はまた、医療（ｍｅｄｉｃｉｎｅ）において、本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲート又は抗癌剤の使用に関する。

本開示はまた、対象における脳癌、脳腫瘍及び／又は脳転移を治療又は予防するための、本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲート又は抗癌剤の使用に関する。

本開示は、対象における脳癌、脳腫瘍及び／又は脳転移を治療又は予防するのに使用するための、本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲート又は抗癌剤にも関する。

本開示はまた、対象における脳癌、脳腫瘍及び／又は脳転移を治療又は予防するための医薬品の製造における、本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲート又は抗癌剤の使用に関する。

別の実施形態では、本開示は、ｓｉＲＮＡ、リボザイム又はＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）にカップリングした本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含む送達剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）を提供する。

別の実施形態では、本開示は、医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤とともに、治療有効量の本明細書に記載のアプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート、抗癌剤又は送達剤を含む組成物を提供する。一例では、アプタマーはリポソーム製剤として送達される。

別の実施形態では、本開示は、脳癌、脳腫瘍又は脳転移の分子イメージングにおける使用のための、本明細書に記載のアプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート又は本明細書に記載の診断剤を提供する。

本発明のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートの腫瘍浸透能力は、腫瘍の分子イメージングのための抗体よりも顕著な利点を提供する。例えば、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、ＥｐＣＡＭ発現細胞を有する癌又は腫瘍の検出及びイメージングを促進する剤にカップリングされ得る。適切な剤の例には、本明細書に記載の検出標識が含まれる。

本明細書に記載のアプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート、診断剤、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は、単独で、又は他の治療様式（ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）と組み合わせて使用されてもよい。例えば、アプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート、診断剤、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は、化学療法及び／又は放射線療法と組み合わせて使用され得る。理論に縛られることを望むものではないが、化学療法剤又は放射線療法剤は、主に癌幹細胞の子孫細胞である急速に分裂する細胞を主に標的にして腫瘍を縮小させるために使用できると想定される。診断剤は、腫瘍中の癌幹細胞の存在又は非存在を検出することによって、癌幹細胞を排除するための任意の先の治療様式の有効性を決定するために使用することができる。次いで、本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含有する抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は、ＥｐＣＡＭ発現細胞を特異的に枯渇させるために、対象に投与され得る。従って、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートを含有する抗癌剤、送達剤又は医薬組成物は、化学療法又は放射線療法と共に、又は化学療法若しくは放射線療法治療の後に使用され得る。本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、癌幹細胞上に存在する抗原を標的とする１つ又は複数のさらなるアプタマーと組み合わせられ得ることも考えられる。

本開示の各実施例は、対象において癌を治療、予防、又は改善するための方法について準用するものとする。

本開示の各実施例は、癌又は腫瘍の分子イメージングに準用するものとする。

図面の説明

図１は、本明細書で使用される血液脳関門のインビトロモデルの模式図を示す。 図２は、元の抗トランスフェリン受容体アプタマーの切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を説明する概略図を示す。元のアプタマー（Ａ）は、６回のＳＥＬＥＸ後に選択された。これは、より短いアプタマー５０塩基対へ切断された（Ｂ）。これは、本発明者によって、ＴｆＲ１（Ｃ）を産生するために１４ヌクレオチド長にさらに切断された。 図３は、ＴｆＲ陽性（ｂＥｎｄ．３）及び陰性（ＭＯＬＴ４）細胞を用いた抗ＴｆＲアプタマーのＫ_Dの決定を示す。それぞれのケースにおける上の曲線は、ｂＥｎｄ．３細胞に対応し、下の曲線はＭＯＬＴ４細胞に対応した。結合曲線は、０、２０、４０、６０、８０、１００、２００及び４００ｎＭの濃度を用いて得た。使用された構築物（ｃｏｎｓｔｒａｃｔ）を図に示す。（Ａ）ＴｆＲ１；（Ｂ）ＴｆＲ２；（Ｃ）ＴｆＲ３；（Ｄ）ＴｆＲ４。データは平均蛍光強度±平均の標準誤差（ｎ＝３）として提示した。 図４は、全長ＤＮＡ ＥｐＣＡＭアプタマー（配列番号１５）及びトランケート型Ｅｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９アプタマー構造を示す。 図５Ａ−１及びＡ−２は、ＥｐＣＡＭ陽性細胞株、ＨＴ２９及びＨＥＹに対するトランケート型ループの相互作用の平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。代表的な結合曲線は、５×１０⁵細胞／ｍＬの細胞密度を用いて、様々な濃度のＥｐＣＡＭ ＤＮＡアプタマー（２０〜２００ｎＭ）で測定した。データは中央値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。 図５Ａ−１及びＡ−２は、ＥｐＣＡＭ陽性細胞株、ＨＴ２９及びＨＥＹに対するトランケート型ループの相互作用の平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。代表的な結合曲線は、５×１０⁵細胞／ｍＬの細胞密度を用いて、様々な濃度のＥｐＣＡＭ ＤＮＡアプタマー（２０〜２００ｎＭ）で測定した。データは中央値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。 図５Ｂは、ＥｐＣＡＭ陽性卵巣癌細胞株、ＨＥＹに対する、伸長Ｅｘ Ｅｐ及びスクランブルＥｘ Ｅｐ７の相互作用の平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。蛍光ヒストグラムを、５×１０⁵細胞／ｍＬの細胞密度を用いて、０及び１００ｎＭのＥｐＣＡＭ ＤＮＡアプタマーで決定した。 図６Ａ及びＢは、ＥｐＣＡＭ陰性細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２に対するトランケート型ループの相互作用の平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。代表的な蛍光オーバーレイは、５×１０⁵細胞／ｍＬの細胞密度を用いて、０ｎＭ（自己（Ａｕｔｏ））及び１００ｎＭのＥｐＣＡＭ ＤＮＡアプタマーで示される。 図６Ａ及びＢは、ＥｐＣＡＭ陰性細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２に対するトランケート型ループの相互作用の平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。代表的な蛍光オーバーレイは、５×１０⁵細胞／ｍＬの細胞密度を用いて、０ｎＭ（自己（Ａｕｔｏ））及び１００ｎＭのＥｐＣＡＭ ＤＮＡアプタマーで示される。 図７は、ＴＹＥ６６５標識アプタマー、Ｅｐ全長、Ｅｐ７、Ｅｐ８及びＥｐＬ９アプタマー並びにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した、培養ＨＴ２９及びＨＥＹ細胞の共焦点画像を示す。スケールバー＝１０μｍ。 図８は、ＴＹＥ６６５標識アプタマー、Ｅｘ Ｅｐ７及びＳｃｒ Ｅｘ Ｅｐ７アプタマー並びにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した、培養ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ２９及びＨＥＹ細胞の共焦点画像を示す。スケールバー＝１０μｍ。 図９−１及び図９−２は、ＴｆＲ陽性（ｂＥｎｄ．３）、ＥｐＣＡＭ陽性（ＨＥＹ）及び−陰性（ＭＯＬＴ４）細胞を用いて、コンジュゲートアプタマーのＫ_Dの決定を示す。それぞれの場合の上の曲線はＨＥＹ細胞に対応し、下の曲線はｂＥｎｄ．３細胞に対応する。（Ａ）アプタマーコンジュゲート（Ｂｉ１）；（Ｂ）アプタマーコンジュゲート（Ｂｉ２）；（Ｃ）アプタマーコンジュゲート（Ｂｉ３）。（Ｄ−Ｆ）蛍光ヒストグラムは、ＭＯＬＴ４細胞で０及び１００ｎＭの濃度を用いて得た。（Ｄ）Ｂｉ１；（Ｅ）Ｂｉ２；（Ｆ）Ｂｉ３。データは中央値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。 図９−１及び図９−２は、ＴｆＲ陽性（ｂＥｎｄ．３）、ＥｐＣＡＭ陽性（ＨＥＹ）及び−陰性（ＭＯＬＴ４）細胞を用いて、コンジュゲートアプタマーのＫ_Dの決定を示す。それぞれの場合の上の曲線はＨＥＹ細胞に対応し、下の曲線はｂＥｎｄ．３細胞に対応する。（Ａ）アプタマーコンジュゲート（Ｂｉ１）；（Ｂ）アプタマーコンジュゲート（Ｂｉ２）；（Ｃ）アプタマーコンジュゲート（Ｂｉ３）。（Ｄ−Ｆ）蛍光ヒストグラムは、ＭＯＬＴ４細胞で０及び１００ｎＭの濃度を用いて得た。（Ｄ）Ｂｉ１；（Ｅ）Ｂｉ２；（Ｆ）Ｂｉ３。データは中央値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として示した。 図１０は、ＴｆＲアプタマーとＥｐＣＡＭ陽性細胞株（ＨＥＹ）とのインキュベーションを示す。アプタマーＴｆＲ３をＨＥＹ細胞と共にインキュベートし、（Ａ）フローサイトメトリー（濃度０、２０、４０、６０、８０、１００、２００及び４００ｎＭを用いて得られた結合曲線。データは中央値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として提示された）を用いて分析した。結果は、明確な、非特異的結合であることを示す。 図１１は、２ナノモルのアプタマーＢｉ１又はアプタマー６（Ｂｉ３及びＢｉ１のコンジュゲート）を尾静脈に注射したマウスの全身蛍光画像（Ａ）及び脳及び肝臓の蛍光画像（Ｂ）を示す。アプタマー６を注射したマウスの脳（ＢＡ）、アプタマー６を注射したマウスの肝臓（ＢＣ）及びアプタマー１を注射したマウスの脳（ＢＢ）。 図１２−１及び１２−２は、二機能性アプタマーのインビボイメージングを示す。マウスに、尾静脈注射により２ナノモルのアプタマーを注射した。（Ａ）投与後３０分間のインキュベーション期間中に捕捉された全身の蛍光画像。ｉ）ネガティブコントロールアプタマーＢｉ１（ＴＥＮＮ）、ｉｉ）ポジティブコントロールアプタマーＢｉ３（ＴＥＰＰ）、（Ｂ）投与３０分後にマウスを屠殺し、脳を抽出した。ｉ）Ｎｅｇ、ｉｉ）Ｐｏｓ（Ｎ＝２）。 図１２−１及び１２−２は、二機能性アプタマーのインビボイメージングを示す。マウスに、尾静脈注射により２ナノモルのアプタマーを注射した。（Ａ）投与後３０分間のインキュベーション期間中に捕捉された全身の蛍光画像。ｉ）ネガティブコントロールアプタマーＢｉ１（ＴＥＮＮ）、ｉｉ）ポジティブコントロールアプタマーＢｉ３（ＴＥＰＰ）、（Ｂ）投与３０分後にマウスを屠殺し、脳を抽出した。ｉ）Ｎｅｇ、ｉｉ）Ｐｏｓ（Ｎ＝２）。 図１３は、脳におけるトランスフェリン／ＥｐＣＡＭアプタマーの生体内分布を示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、４つの様々な形態（ＴＥＰＰ：Ｂｉ３トランスフェリン⁺／ＥｐＣＡＭ⁺； ＴＥＰＮ：トランスフェリン⁺／ＥｐＣＡＭ^-； ＴＥＮＰ：トランスフェリン^-／ＥｐＣＡＭ⁺； ＴＥＮＮ：Ｂｉ１トランスフェリン^-／ＥｐＣＡＭ^-）を有するトランスフェリン／ＥｐＣＡＭアプタマー、４０ｎｍｏｌ／Ｋｇの単一のｉ．ｖ．を受けた。示された組織における、組織１ｍｇ当たりの注射された用量（ＩＤ）の％として表されるアプタマーの濃度を、ＥＬＩＳＡを用いて、剤投与の３０分後及び６０分後に決定した。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）である。

配列表への鍵
配列番号１：本開示のアプタマーコンジュゲートのコンセンサスＤＮＡ配列
配列番号２：アプタマーコンジュゲートＢｉ２のＤＮＡ配列
配列番号３：アプタマーコンジュゲートＢｉ３のＤＮＡ配列
配列番号４：アプタマーＴｆＲ１のＤＮＡ配列
配列番号５：アプタマーＴｆＲ２のＤＮＡ配列
配列番号６：アプタマーＴｆＲ３のＤＮＡ配列
配列番号７：アプタマーＴｆＲ４のＤＮＡ配列
配列番号８：アプタマーコンジュゲートＢｉ１のＤＮＡ配列
配列番号９：アプタマーＥｐ７のＤＮＡ配列
配列番号１０：アプタマーコンジュゲート（アプタマー６）のＤＮＡ配列
配列番号１１：アプタマーＥｐ８のＤＮＡ配列
配列番号１２：アプタマーＥｐ９のＤＮＡ配列
配列番号１３：伸長Ｅｐ７アプタマーのＤＮＡ配列（Ｅｘ Ｅｐ７）
配列番号１４：スクランブル伸長Ｅｐ７アプタマー（ｓｃｒ ｅｘ ｅｐ７）のＤＮＡ配列
配列番号１５：全長６４ｍｅｒ ＴｆＲアプタマーのＤＮＡ配列
配列番号１６：全長４８ｍｅｒ ＥｐＣＡＭアプタマーのＤＮＡ配列
配列番号１７：ＴｆＲアプタマーのＤＮＡ配列
配列番号１８：ＴｆＲアプタマーのＤＮＡ配列
配列番号１９：ＴｆＲアプタマーのＤＮＡ配列

用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」を意味すると理解され、両方の意味又はいずれかの意味を明示的に支持するために用いられる。

本明細書を通して、別段の記載がない限り、又は文脈上他の意味を必要としない限り、単一の工程（ｓｔｅｐ）、物質の組成物、工程の群（ｇｒｏｕｐ）又は物質の組成物の群は、それらの工程、物質の組成物、工程の群又は物質の組成物の群の１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含するものとする。

本明細書に記載される各例示は、他に特に断らない限り、本開示の各例及び他の全ての例に準用して適用される。

当業者であれば、本開示は具体的に記載されたもの以外の変形及び修正を受けやすいことを理解するであろう。本開示は、そのような全ての変形及び修正を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書において言及又は指示される工程（ｓｔｅｐｓ）、特徴（ｆｅａｔｕｒｅｓ）又は組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）の全てを個別に又は集合的に、及び前記工程又は特徴のいずれか及び全ての組合せ又は任意の２つ以上、を含んでいる。

本開示は、例示のみを目的とする本明細書に記載の特定の例によって範囲が限定されるものではない。機能的に同等な製品、組成物及び方法は、本開示の範囲内にあることは明らかである。

本開示は、特に明記しない限り、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、細胞生物学及び免疫学の従来技術を使用して、過度の実験をすることなく実施される。このような手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｏｎｄ ＥｄｉｔｉｏＮ（１９８９），Ｖｏｌｓ Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩの全て；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｓ．Ｉ及びＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，１９８５），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全テキスト；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ，１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全テキスト、及び、特にその中のＧａｉｔ、ｐｐｌ−２２の論文；Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，ｐｐ３５−８１；Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ，ｐｐ８３−１１５；及び、Ｗｕ ｅｔ ａｌ，ｐｐ１３５−１５１；４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｆｌａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全テキスト；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９８６）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，全テキスト；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），全シリーズ，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｄ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎ，Ｊ．，Ｌｉｅｎ，Ｅ．Ｌａｎｄ Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，Ｒ．Ｌ．（１９７６）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．７３ ３３６−３４２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９６３）．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４；Ｂａｒａｎｙ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．（１９７９）ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．ｅｄｓ．），ｖｏｌ．２，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１２．Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ．，ｅｄ．（１９７４）Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｖｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅn ｉn Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ Ｍｅｔｏｄｅn ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅn Ｃｈｅｍｉｅ（Ｗｉｅｒ，Ｅ．，ｅｄ．），ｖｏｌ．１５，４ｔｈ ｅｄｎ．，Ｐａｒｔｓ １ ａｎｄ ２，Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．＆ Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．（１９８４）Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９８５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉn Ｒｅｓ．２５，４４９−４７４；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；及び、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｒ．Ｗ．Ｍａｓｔｅｒｓ，ｅｄ．，２０００），ＩＳＢＮ０１９９６３７９７０、全テキスト、に記載されている。

文脈が他を必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明示された工程（ｓｔｅｐ）又は要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）又は整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）、又は工程若しくは要素の群を含むことを意味すると理解されるが、他の工程又は要素又は整数又は要素若しくは整数の群を排除するものではない。

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、事項（ｍａｔｔｅｒ）の方法（ｍｅｔｈｏｄ）、プロセス（ｐｒｏｃｅｓｓ）又は組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）が、列挙された工程及び／又は構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）を有し、追加の工程又は構成要素を有さないことを意味すると理解されるべきである。

重量、時間、用量などのような測定可能な値を指すときに本明細書で使用する「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、変動が開示される方法の実施に適切であるように、特定された量の±２０％、又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、いっそう好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。

本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、ループ状の一本鎖領域を含み、ここで、該一本鎖領域の両端に隣接する領域は、それぞれ、好ましくは二本鎖領域を形成する。アプタマーは、このように、多くの場合、いわゆる「ステム−ループ構造」を含むことが知られ、主に一本鎖ループ構造領域を介して標的物質に特異的に結合することも知られている。一本鎖領域の両端に隣接し、それぞれでもって二本鎖領域を形成する領域の大きさは特に限定されないが、好ましくは２ｂｐ〜１５ｂｐである。アプタマーの二次構造は、コンピュータを用いた常法により容易に決定することができる。アプタマーの二次構造を分析するためのソフトウェアとして、例えば、周知のＭｆｏｌｄを利用することができ、そのソフトウェアはＭｆｏｌｄウェブサーバーで自由に利用可能である。

二本鎖ステム領域は塩基対を含む。例えば、一塩基対は、Ａ−Ｔ塩基対又はＣ−Ｇ塩基対のいずれかであり得る。

本明細書で用いられる「アプタマーコンジュゲート（ａｐｔａｍｅｒ ｃｏｎｆｕｃａｔｅ）」という用語は、二機能性活性を有する構築物を指す。特に、少なくとも１つの「ＥｐＣＡＭ結合部分（ＥｐＣＡＭ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」及び少なくとも１つの「ＴｆＲ結合部分（ＴｆＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｒｔｉｏｎ）」を含む構築物を指す。特定の例において、アプタマー構築物は、１つのＥｐＣＡＭ結合部分及び１つのＴｆＲ結合部分を含む。一例では、ＥｐＣＡＭ結合部分はアプタマーであり、ＴｆＲ結合部分はアプタマーである。ＥｐＣＡＭ結合部分（アプタマー）及びＴｆＲ結合部分（アプタマー）は隣接していてもよい。あるいは、ＥｐＣＡＭ結合部分（アプタマー）及びＴｆＲ結合部分（アプタマー）は、リンカーを介して結合され得る。適切なリンカーの例には、アプタマーコンジュゲートに柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）を与えるリンカーが含まれる。一例では、アプタマーコンジュゲートはＤＮＡアプタマーである。用語「アプタマーコンジュゲート」は多量体も包含する。

「ＴｆＲ結合部分」とは、ＴｆＲに結合することができ、ステム領域及び結合ループ領域を構成するアプタマーコンジュゲートの一部（ｐａｒｔ）を意味する。一例では、ＴｆＲ結合部分はアプタマーである。ＴｆＲ結合部分は、ＴｆＲに結合するか、又は特異的に結合することができる。

「ＥｐＣＡＭ結合部分」とは、ＥｐＣＡＭに結合することができ、ステム領域及び結合ループ領域を構成するアプタマーコンジュゲートの一部を意味する。一例では、ＥｐＣＡＭ結合部分はアプタマーである。ＥｐＣＡＭ結合部分は、ＥｐＣＡＭに結合するか、又は特異的に結合することができる。

「ＥｐＣＡＭアプタマー」とは、ＥｐＣＡＭに結合することができ、ステム領域及び結合ループ領域を構成するアプタマーを意味する。

本明細書で使用する「結合親和性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）」及び「結合活性（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、標的に結合する又は結合しないアプタマー又はアプタマーコンジュゲート（及び／又はそれぞれそれらのＥｐＣＡＭ及びＴｆＲ結合部分）の傾向を指し、アプタマー又はアプタマーコンジュゲート及び／又はそのＥｐＣＡＭ及びＴｆＲ結合部分の、標的と結合する結合又は親和性の強さの程度（ｍｅａｓｕｒｅ）を記述する。前記相互作用のエネルギー論（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）は、相互作用するパートナーの必要な濃度、これらのパートナーが結合することができる速度、及び溶液中の結合分子及び遊離分子の相対濃度を定義するので、「結合活性」及び「結合親和性」において重要である。エネルギー論は、本明細書では、他の方法を通して、他の方法の中で、解離定数Ｋ_Dの決定を特徴とする。当該技術分野で知られているように、低解離定数は、分子同士のより強い結合及び親和性を示す。ＥｐＣＡ１つの例において、解離定数は少なくとも１０^-6Ｍである。別の例では、解離定数は少なくとも１０^-8及び１０^-9Ｍである。結合親和性はまた、アプタマー会合速度（Ｋ_on）に対するアプタマー解離速度（Ｋ_off）の比を表す、平衡解離定数（Ｋ_D）の点から表現される。Ｋ_D値が小さいほど、その標的に対するアプタマーの親和性が大きくなる。Ｋ_D値は、例えば偏光変調された斜入射反射率差（ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｏｂｌｉｑｕｅ−ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＯＩ−ＲＤ）又はＢｉａｃｏｒｅのいずれかを用いて測定することができる。

本明細書中で使用される場合、用語「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」は、細胞又は細胞集団又は対象由来の組織若しくは液体の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）をいう。ほとんどの場合、サンプルは対象から除去されているが、用語「生物学的サンプル」は、インビボで分析された細胞又は組織、すなわち対象から除去されない組織又は組織をも指し得る。本開示の文脈における「生物学的サンプル」は、対象由来の腫瘍細胞を含むであろう。生物学的サンプルとしては、限定されないが、組織生検（ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ）、又は脳腫瘍から得られた針生検（ｎｅｅｄｌｅ ｂｉｏｐｓｉｅｓ）が挙げられる。サンプルは、パラフィン包埋された又は凍結した組織であってもよい。サンプルは、対象から細胞のサンプルを除去することによって得ることができるが、以前に単離された細胞（例えば、別の人によって単離された細胞）を使用することによって、又はインビボで本発明の方法を実施することによっても達成することができる。

本明細書中で使用される「カップリングされた（ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ）」という用語は、本明細書に記載されるように、アプタマーコンジュゲートが、検出剤、成分（ｍｏｉｅｔｙ）、ｓｉＲＮＡ、リボザイム又はＤＮＡザイムに連結（ｌｉｎｋｅｄ）、付着（ａｔｔａｃｈｅｄ）、インターカレート又は接合（ｊｏｉｎｅｄ）された任意の構築物を包含することを意図する。カップリング効果をもたらすための方法は、当業者に知られており、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、ペプチド若しくはＤＮＡリンカーによる連結（ｌｉｎｋｉｎｇ）、又は全部の鎖（ｗｈｏｌｅ ｃｈａｉｎ）としてのＤＮＡ及び剤の直接化学合成（例えばＤＮＡザイム）によるものが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用する「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、他の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）から単離可能又は精製された幹細胞（例えば、癌幹細胞）を意味することを意図する。単離された細胞とは、それが自然に生じる可能性のある環境由来の細胞をいう。単離された細胞は、その自然に得られる状態と比較して任意の程度まで精製され得る。

本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、好ましくは、当該分野で公知の方法を用いて化学的に合成される。アプタマーコンジュゲートの文脈における「単離された」という用語への言及は、アプタマーの合成中（例えば、ＳＥＬＥＸ法）に存在し得る他の成分から精製されるアプタマーを指す。

「治療上有効な量」という用語は、ＥｐＣＡＭ発現癌幹細胞の数及び／又は１つ以上の癌の症状を減少させるか、又は阻害するために、本開示によるアプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物の十分な量を意味する。当業者は、そのような量が、例えば、特定の対象及び／又は疾患のタイプ若しくは重症度若しくはレベルに依存して、変化することを認識するであろう。この用語は、本開示を特定量のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートに限定するものと解釈されない。

本明細書中で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、本明細書に開示されるアプタマー、アプタマーコンジュゲート、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物の治療有効量を投与し、そして癌に関連するか、又は癌によって引き起こされる臨床症状の少なくとも１つの症状を減少させる、又は阻害することを意味すると理解される。

本明細書中で使用される場合、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」又は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、本開示のアプタマー、アプタマーコンジュゲート、抗癌剤、送達剤又は医薬組成物の治療有効量を投与して、そして癌の少なくとも１つの症状の発症又は進行を停止させるか、又は妨げるか、又は遅延させることを意味するものとみなされる。

本明細書中で使用される場合、「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」という用語は、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートが、代替細胞（マーカー）よりも、特定の細胞（細胞上に存在するマーカー）へ、より頻繁に、より迅速に、より長い期間及び／又はより高い親和性で反応するか、又は会合することを意味するものとみなされる。例えば、標的タンパク質に特異的に結合するアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、そのタンパク質又はエピトープ又はその免疫原性フラグメントに、非関連タンパク質及び／若しくはエピトープ又はその免疫原性フラグメントに結合するよりも、より高い親和性で、結合活性で、より容易に、及び／又は、より長い持続時間、結合する。一般的に、必ずしも必要ではないが、結合すること（ｂｉｎｄｉｎｇ）への言及は特異的結合を意味する。結合の特異性は、アプタマー若しくはアプタマーコンジュゲート及び環境中若しくは一般に無関係な分子中の他の物質に対する解離定数又は平衡解離定数と比較した場合の、標的に対するアプタマーコンジュゲートの比較解離定数（Ｋ_D）又は平衡解離定数（Ｋ_D）に関して定義される。典型的には、標的に対するアプタマーのＫｄ又はＫ_Dは、標的及び環境中の無関係な物質又は付随する物質に対する、Ｋｄ又はＫ_Dの２倍、５倍又は１０倍低い。さらにより好ましくは、Ｋｄ又はＫ_Dは、５０倍、１００倍又は２００倍低いであろう。

本明細書で使用される「ＥｐＣＡＭ＋」又は「ＥｐＣＡＭ発現細胞（単数又は複数）」という用語は、互換的に使用することができる。この用語は、任意の適切な手段によって検出することができるＥｐＣＡＭ抗原の細胞表面発現を包含する。所与のマーカーに対して陽性である細胞への言及は、マーカーが細胞表面上に存在する程度に応じて、そのマーカーの低（ｌｏ又は薄暗い（ｄｉｍ））又は高（明るい（ｂｒｉｇｈｔ）、ｂｒｉ）発現体のいずれかであり得ることを意味し、これらの用語は蛍光強度に関する。

本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト又は非ヒト対象を含む任意の対象を意味すると解釈されるものとする。一例では、対象はヒトである。

アプタマー

アプタマーは、特定の標的に結合することができる小さなオリゴヌクレオチドである。それらは、相補的な塩基対形成によってではなく、抗体と同様の様式で、標的との３Ｄ構造の相互作用により、相補的なリガンドに結合する。アプタマーは２つのユニークなドメインを有する：非結合ステム領域及び結合ループ；及び、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかであり得る。ＤＮＡアプタマーはＲＮＡアプタマーよりも安定で安価であるが、ＲＮＡアプタマーはより多様な機能を有する（Ｓｈｉｇｄａｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １５５（１）：３−１３）。アプタマーは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）として知られているプロセスによって産生される。

アプタマーは、それらを治療用途のための抗体より優れた多くの特徴を有する。第一に、それらは、抗体タンパク質カウンターパート（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）よりも小さく（５〜２５ｋＤａ対１２５ｋＤａ）、従って、組織の深部まで、さらには腫瘍の核（ｃｏｒｅ）までさえ浸透することができる（Ｓｈｉｇｄａｒ Ｓ． ｅｔ ａｌ.（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３０（１）：８４−９５）。また、抗体とは異なり、アプタマーは免疫応答を生成することが実証されていない。アプタマーの産生は、ＳＥＬＥＸが、動物の免疫系を用いて産生される抗体とは対照的に、インビトロプロセスであるため、より単純なプロセスでもある。これにより、広い範囲のエピトープに対してアプタマーを製造することができ、バッチ間のばらつきが限定され、両方の観点が、アプタマーが抗体よりも優れたものにすることを確実にする。

しかしながら、アプタマーには多くの制限がある。アプタマーは、２つの要因により低下した循環半減期を有する。第一に、オリゴヌクレオチドであるため、それらはヌクレアーゼ分解を受けやすい。さらに、アプタマーのサイズが小さいほど、糸球体濾過を受けやすくなり、容易に尿中に流出する。アプタマーへの任意のＳＥＬＥＸ後修飾は、結合親和性を変化させる可能性を有する。アプタマーはまた、部分的に、負に荷電した細胞膜による核酸の反発のために、送達の問題を有する。

アプタマーは、抗体と同様に多くの目的に使用される可能性がある。アプタマーは、黄斑変性の治療において、臨床使用のためにＦＤＡによって既に承認されており（Ｒｉｎａｌｄｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７４（６）：９４０−６）、現在、いくつかの用途に対し、治験が進行中である。インビトロ及びインビボでの前臨床試験では、糖尿病からＨＩＶ及びプリオン病への状態を治療する際のアプタマーの治療的適用が示されている。時折知られているような、これらの化学抗体は、癌細胞の表面上の特定のマーカーを標的にして細胞毒性効果を誘導するように設計されたペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を送達するために使用され得ることがあるため、癌研究の分野において特に有望である。このアプローチは、癌の部位に向けて薬剤を集中させることによって、化学療法レジメンの全身毒性を制限させる可能性を有する。このような技術を臨床的に適用することができれば、患者の副作用を制限し、より高い薬物用量の使用を可能にするであろう。さらに、標的化治療は腫瘍形成ＣＳＣに向けられ得、これは患者の予後（ｏｕｔｃｏｍｅｓ）を改善する。

ＥｐＣＡＭ

癌細胞は、正常細胞とは異なる抗原発現プロファイルを示し、この異なるパターンは、抗癌治療プログラムの焦点となり得る。多くの細胞表面マーカーが癌細胞上でより高いレベルで発現され、従って、これらの癌細胞に結合するアプタマーが生成され得る。上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、正常な上皮細胞と比較して、その高レベルの発現（１０００倍）のために、固形腫瘍及びＣＳＣのマーカーとして同定されている膜糖タンパク質である（８８−９１）。興味深いことに、二次腫瘍の１０８サンプルの免疫組織化学的分析により、ＥｐＣＡＭ発現が４％のみ欠けていることが判明した。さらに、ＥｐＣＡＭは、細胞増殖及び転移に関連しているため、予期しない、哀れな患者予後（ｐｏｏｒ ｐａｔｉｅｎｔ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）と関連している（９３−９５）。

ＥｐＣＡＭは、正常細胞では上皮膜の側底側（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ ｓｉｄｅ）に発現するのに対して、癌細胞ではＥｐＣＡＭが頂端膜側（ａｐｉｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）に強く発現するため、理想的な治療標的である。抗体に基づく治療法（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）は、正常な細胞のＥｐＣＡＭがそれほど顕著でなく露出が少なく、健康な細胞が抗体結合に対して感受性でないことを意味するので、ＥｐＣＡＭ発現のこの特徴を利用（ｅｘｐｌｏｉｔ）することができた。従って、副作用は限られており、薬物作用は問題の細胞に向けられている。

癌治療のための抗ＥｐＣＡＭ治療抗体を含む臨床研究では、患者における急性膵炎の発症が観察されている。しかしながら、この副作用は、高い親和性を有する抗体においてのみ見られた。これは、ＥｐＣＡＭのアプタマーに基づく標的化が、副作用を制限するために中程度の結合親和性を有するアプタマーを使用すべきであることを示唆する。正常な脳組織がＥｐＣＡＭに対して陰性であるため、ＥｐＣＡＭはアプタマーに基づく癌治療、特に脳腫瘍のための有用な標的である（Ａｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６８（１）：１４３−５１）。従って、ＢＢＢをバイパスすることができれば、ＥｐＣＡＭは脳転移及び／又は脳腫瘍の治療のための理想的な標的となるだろう。

アプタマー−ドキソルビシンコンジュゲート

癌細胞を殺すために、アプタマーは、細胞傷害性効果を引き起こすであろう何かにコンジュゲートしなければならない。１つの選択肢は、アプタマーを化学療法薬と結合させて、癌細胞を直接殺すことである。ドキソルビシン（ｄｏｘ）は、アプタマーとコンジュゲートされた薬物である。ｄｏｘのアントラサイクリン構造（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のために、アプタマーのステム領域に、グアニン−シトシン（ＧＣ）対の間に、結合親和性の変化は最小限で、容易に挿入することができる（１０秒以内に平衡に達する）。これは、細胞のＤＮＡにインターカレートし、アポトーシスを誘導するので、ｄｏｘ毒性のメカニズムを反映している。アプタマーは、高ＧＣ含量の伸長したステム領域を有するように設計することができ、ｄｏｘのインターカレーションを増加させることができる。アプタマー−ｄｏｘコンジュゲートは、ＲＭＥを介して細胞にインターナライズされ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓｅｄ）、遊離ｄｏｘに匹敵する細胞傷害性効果を不法（ｉｌｌｉｃｉｔ）にし、正常細胞よりも癌細胞に対して６倍高い毒性を示す。このシステムの利点は、ｐＨ媒介薬物放出である。これらのコンジュゲートは、血漿（７．４）及び脳（６．６−７．２）ｐＨでは安定であるが、インターナライズに際し、エンドソームのより酸性の環境に解離する。

所与の標的に対するアプタマーの選択

実質的に任意の特定の標的に結合するアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（商標）（指数関数的濃縮によるリガンドの系統進化（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））と呼ばれる反復プロセスを用いて選択することができる。このプロセスは、例えば米国特許第５２７０１６３号明細書及び米国特許第５４７５０９６号明細書に記載されている。ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスは、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）であろうと多量体（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ）であろうと、核酸が、様々な２次元及び３次元構造を形成するのに十分な能力を有し、実質的に任意の化合物とリガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）ために、それらの単量体中に利用可能な十分な化学的多様性を有するというユニークな洞察に基づいている。任意のサイズ又は組成の分子が標的として働くことができる。

ＳＥＬＥＸ（商標）は、出発点として、無作為配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドの大きなライブラリー又はプールに依存する。オリゴヌクレオチドは、修飾された、又は修飾されていないＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。いくつかの例では、プールは、１００％ランダム又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、ランダム化配列内に組み込まれた少なくとも１つの固定配列及び／又は保存配列を含むランダム又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。他の例では、プールは、オリゴヌクレオチドプールの全ての分子によって共有される配列を含み得る、その５’及び／又は３’末端に少なくとも１つの固定配列及び／又は保存配列を含むランダム又は部分的にランダムなオリゴヌクレオチドを含む。固定配列は、予め選択された目的のために組み込まれたプール中のオリゴヌクレオチドと共通の配列であり、例えば、ＣｐＧモチーフ、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡ／ＤＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７及びＳＰ６）、制限酵素部位、又はホモポリマー配列（例えばポリＡ又はポリＴトラクト（tracts)）、触媒性コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、及び目的のオリゴヌクレオチドのクローニング及び／又は配列決定を容易にするための他の配列などである。保存された配列は、同じ標的に結合する多数のアプタマーによって共有される、以前記載された固定配列以外の配列である。

プールのオリゴヌクレオチドは、好ましくは、効率的な増幅に必要なランダム配列部分並びに固定配列を含む。典型的には、出発プールのオリゴヌクレオチドは、３０〜５０個のランダムなヌクレオチドの内部領域に隣接する固定された５’及び３’末端配列を含む。ランダムなヌクレオチドは、化学合成及びランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む多くの方法で産生され得る。試験核酸中の配列変異は、選択／増幅反復の前又は最中に突然変異誘発によって導入又は増加させることもできる。

オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、任意の長さとすることができ、リボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドを含むことができ、修飾又は非天然のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むことができる（例えば、米国特許第５９５８６９１号明細書、米国特許第５６６０９８５号明細書及び国際公開第９２／０７０６５号を参照のこと）。ランダムオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いてホスホジエステル連結ヌクレオチドから合成することができる。例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７、及び、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８を参照のこと。ランダムオリゴヌクレオチドはまた、例えば、トリエステル合成法などの溶液相方法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いて合成することができる。例えば、Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９７７）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７、及び、Ｈｉｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．（１９７８）．Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９を参照されたい。自動化されたＤＮＡ合成装置で実施される典型的な合成は、１０¹⁴〜１０¹⁶個の個々の分子をもたらし、ほとんどのＳＥＬＥＸ（商標）実験に十分な数である。

オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＤＮＡシンセサイザーでの自動化された化学合成によって生成され得る。部分的にランダムな配列は、各添加段階で、異なるモル比の４つのヌクレオチドを加えることによって作製することができる。

オリゴヌクレオチドの出発ライブラリーは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る。ＲＮＡライブラリーを出発ライブラリーとして使用する場合、典型的には、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は修飾Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＤＮＡライブラリーを転写し、精製することによって生成される。次いで、ＲＮＡ又はＤＮＡライブラリーは、結合に好ましい条件下で標的と混合され、実質的に任意の所望の結合親和性及び選択性基準を達成するために、同じ一般的選択スキームを用いて結合、分離（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）及び増幅の段階的反復に供される。より具体的には、核酸の出発プールを含有する混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、以下：（ａ）結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程；（ｂ）標的分子に特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分離する（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）工程；（ｃ）核酸−標的複合体を解離させる工程；（ｄ）核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド濃縮混合物を得る工程；（ｅ）標的分子に対して高度に特異的で高親和性の核酸リガンドを得るために、所望のサイクル数で結合、分離、解離及び増幅の工程を反復する工程、を含む。ＲＮＡアプタマーが選択されている場合、ＳＥＬＥＸ（商標）法は、さらに、以下：（ｉ）工程（ｄ）において増幅前に、核酸−標的複合体から解離した核酸を逆転写する工程；及び（ｉｉ）工程を再開する前に、工程（ｄ）から増幅された核酸を転写する工程、を含む。

選択及び増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。一般に、これは、サイクルの繰り返しで結合強度の有意な改善が達成されなくなるまでである。典型的には、核酸アプタマー分子は、５〜２０サイクルの手順で選択される。様々な核酸の一次、二次及び三次構造が存在することが知られている。非ワトソン−クリック型相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造又はモチーフは、ヘアピンループ、対称及び非対称バルジ、シュードノット（ｐｓｅｕｄｏｋｎｏｔｓ）及びそれらの無数の組み合わせとして言及される。このようなモチーフのほとんど全ての既知の事例は、それらが３０ヌクレオチド以下の核酸配列において形成され得ることを示唆している。この理由のため、連続ランダム化セグメントを有するＳＥＬＥＸ（商標）手順は、約２０〜約５０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸配列で開始されることがしばしば好ましい。

コアのＳＥＬＥＸ（商標）法は、多くの特定の目的を達成するために変更されている。例えば、米国特許第５７０７７９６号明細書は、例えば、曲げられたＤＮＡ（ｂｅｎｔ ＤＮＡ）などの、特定の構造的特徴を有する核酸分子を選択するためにゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ（商標）の使用を記載している。米国特許第５７６３１７７号明細書は、標的分子に結合及び／又は光架橋する（ｐｈｏｔｏ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）及び／又は光不活性化する（ｐｈｏｔｏｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ことができる光反応基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。米国特許第５５６７５８８号明細書及び米国特許第５８６１２５４号明細書は、標的分子に対する高親和性及び低親和性を有するオリゴヌクレオチド間の効率的な分離を達成するＳＥＬＥＸ（商標）に基づく方法を記載している。米国特許第５４９６９３８号明細書は、ＳＥＬＥＸ（商標）プロセスが実施された後に改良された核酸リガンドを得るための方法を記載する。米国特許第５７０５３３７号明細書は、リガンドをその標的に共有結合する方法を記載している。

Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（商標）は、１つ以上の非標的分子に対して交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を向上させる方法である。Ｃｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ（商標）は、以下：（ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；（ｂ）候補混合物を標的と接触させる工程であって、候補混合物と比較して、標的に対する増加した親和性を有する核酸が、候補混合物の残りの成分から分離され得る工程；（ｃ）増加した親和性核酸を候補混合物の残りから分離する工程；（ｄ）増加した親和性核酸を標的から解離させる工程；（ｅ）非標的分子（単数又は複数）に対する特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように、増加した親和性核酸を１つ以上の非標的分子と接触させる工程；及び（ｆ）標的分子のみへの特異的親和性を有する核酸を増幅して、標的分子への結合に対して比較的高い親和性及び特異性を有する核酸配列が濃縮された核酸の混合物を得る工程、を含む。ＳＥＬＥＸ（商標）について上述したように、選択及び増幅のサイクルは、所望の目的が達成されるまで必要に応じて繰り返される。

代表的な例において、アプタマーは、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−１８６２、及びＳｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ３：１５７−３０ １７１によって記載されているような従来技術を用いて、固体支持体カラム上で合成される。あるいは、大規模な合成が使用される場合、アプタマーは、固体支持体法のスケールアップによって作製することができ、又は、アプタマーは、特に、所望の最終産物が比較的短いオリゴヌクレオチドであれば、液相技術（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって作製することができる。合成プロセスのための出発物質は、好ましくは保護された塩基を有することができ、好ましくは固体支持体に結合される、所望の一次構造の５’−非トリチル化ＲＮＡオリゴリボヌクレオチド又は類似体であり得る。任意の従来使用されている保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）を使用することができる。典型的には、Ｎ６−ベンゾイルがアデニン、シトシンについてはＮ４−ベンゾイル、グアニンについてはＮ２−イソブチリル、２−アミノプリンについてはＮ２−ベンゾイルが使用される。他の有用な保護基には、フェノキシアセチル（ＰＡＣ）及びｔ−ブトキシアセチル（ＴＡＣ）が含まれる。好都合には、アプタマーの合成のために、より塩基に不安定な（ｌａｂｉｌｅ）保護基を使用すべきであり、当業者はこれらの基（ｇｒｏｕｐ）を知っている。このような基は、生成された三リン酸又は二リン酸の加水分解を防止するのに役立ち得、これは一般に塩基性条件下では非常に安定であるが、いくらかの加水分解に供される可能性がある。他の想定される変更は、米国特許第６，０１１，０２０号明細書に記載されており、限定されるものではないが、共有結合を介してＰＥＧ又はコレステロールのようなバイオアベイラビリティー増強分子の取り込みを含む。

さらに、ヌクレオシド類似体（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ）、例えば、２’−デオキシ、２’−ハロ、２’−アミノ（非置換又は一置換又は二置換）、２’−モノ、ジ−若しくはトリハロメチル、２’−０−アルキル、２’−０−ハロ−置換アルキル、２’−アルキル、アジド、ホスホロチオエート、スルフヒドリル、メチルホスホン酸、フルオレセイン、ローダミン、ピレン、ビオチン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミノプリン、６位（６−ｐｏｓｉｔｉｏｎ）が硫黄又は５位（５−ｐｏｓｉｔｉｏｎ）がハロ若しくはＣ１〜５アルキル基で置換された２−ヒドロキシ−６−メルカプトプリン及びピリミジン塩基、無塩基リンカー、３’−デオキシ−アデノシン並びに他の利用可能な「鎖終結剤（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）」又は「非伸長性」類似体（アプタマーの３’末端において）などが、合成中に組み込まれ得る。さらに、例えば、³²Ｐ又は³³Ｐなどの様々な標識が、同様に合成の間に組み込むことができ、このプロセスによって製造された新規類似体が得られる。他の想定される変更は、米国特許第６，０１１，０２０号明細書に記載されており、限定されるものではないが、３’キャップ、例えば逆ＤＴキャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ＤＴ ｃａｐ）、又は逆向き脱塩基キャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ａｂａｓｉｃ ｃａｐ）、又はそれらの組み合わせの組み込みが含まれる。

アプタマーの結合親和性

結合親和性は、分子同士の結合又は親和性の強さの尺度を表す。標的及び他の分子に関する本明細書中のアプタマーの結合親和性は、解離定数（Ｋｄ）又は平衡解離定数（Ｋ_D）に関して定義される。解離定数は、当該分野で公知の方法によって決定することができ、例えば、Ｃａｃｅｃｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｙｔｅ（１９８４）９：３４０−３６２に記載されるものなどの方法により、複合体混合物に対して算出され得る。

解離定数の測定の例は、例えば表面プラズモン共鳴分析を記載する米国特許第７６０２４９５号明細書、米国特許第６５６２６２７号明細書、米国特許第６５６２６２７号明細書及び米国特許出願公開第２０１２／００４４５８４９号明細書に記載されている。別の例において、解離定数は、Ｗｏｎｇ ａｎｄ Ｌｏｈｍａｎ，（１９９３）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５４２８−５４３２によって開示されたような二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを用いて確立される。

しかし、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドでは、解離定数の直接的決定が困難であり、誤って高い結果をもたらし得ることが観察されている。これらの状況下で、標的分子又は他の候補物質に対する競合的結合アッセイを、標的又は候補に結合することが知られている物質に関して行うことができる。５０％阻害が生じる濃度の値（Ｋ）は、理想的な条件下ではＫ_Dに等しい。Ｋ値はまた、本発明のアプタマーが標的に結合することを確認するために使用され得る。

アプタマーの安定性の改善

それらのホスホジエステル形態のオリゴヌクレオチドが所望の効果が現れる前に、細胞内及び細胞外酵素、例えばエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによって体液中で迅速に分解され得る点における、治療剤として核酸を使用する際に遭遇する１つの潜在的な問題が、顕在化している。本開示はまた、本明細書に記載の類似体及び／又はヌクレアーゼ消化からの保護などのアプタマーの１つ又は複数の特性を改善するように設計されたさらなる修飾も含む。

本開示で企図されるオリゴヌクレオチド修飾には、限定されないが、核酸リガンド塩基又は全体としての核酸リガンドへの追加の電荷、分極率（ｐｏｌａｒｉｚａｂｉｌｉｔｙ）、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）、水素結合、静電相互作用、及び可動性率（ｆｌｕｏｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を組み込む他の化学基を提供するものが含まれる。

ヌクレアーゼに耐性のオリゴヌクレオチドを生成するための改変はまた、１つ以上の、置換ヌクレオチド間結合、改変された糖、改変された塩基、又はそれらの組み合わせを含み得る。このような修飾には、２’−位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ若しくは５−ヨード−ウラシルの置換、骨格修飾、ホスホロチオエート若しくはアルキルホスフェート修飾、メチル化修飾、イソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅｓ） イソシチジン及びイソグアノシンのような珍しい塩基対合の組み合わせ；キャッピングなどの３’及び５’修飾；高分子量の非免疫原性化合物へのコンジュゲーション；親油性化合物へのコンジュゲーション；及びリン酸骨格修飾、を含み得る。好ましくは、アプタマーは、３’逆位チミジン（３’ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を含む。

一例では、本開示のアプタマーにコンジュゲートした非免疫原性の高分子量化合物は、ポリアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。一例では、骨格修飾は、リン酸骨格への１つ以上のホスホロチオエートの組み込みを含む。別の例において、本開示のアプタマーは、リン酸骨格に１０未満、６未満、又は３未満のホスホロチオエートの取り込みを含む。

血液脳関門

脳癌又は腫瘍の治療は、分子の通過を厳密に制御することによって脳微小環境を全身循環から隔離する血液脳関門（ＢＢＢ）の存在によって複雑である。このような化学療法薬は脳に入ることはほとんどできないが、体内の他の場所ではまだ損傷を与え得る。ＢＢＢは、脳微小血管に並ぶ脳血管内皮細胞の単層からなる。これらは、クローディン（ｃｌａｕｄｉｎｓ）のような膜と細胞質の両方に関連する様々な細胞−細胞接着分子によって密に詰め込まれている。オクルディン帯（ｚｏｎａ ｏｃｃｕｌｄｅｎｓ）を含む後者のタイプは、隣接する細胞の細胞骨格を互いに結合させる働きをする。他の細胞型もまた、星状細胞及びペリサイトを含む、ＢＢＢの特性の調節に関与する。しかしながら、最も重要な成分は内皮単層（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）であり、タイトジャンクションを介して物理的障壁を形成する。ＢＢＢは、物質の脳実質内外への通過を調節する分子トランスポーター及び特殊酵素（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｔ ｅｎｚｙｍｅｓ）のユニークな発現を特徴としている。

転移

腫瘍は毎日何百万個もの細胞が放たれるが、体内の他の部位の種腫瘍（ｓｅｅｄ ｔｕｍｏｕｒｓ）にはほとんど行かない。この失敗率の理由は、２つの要因によるものである；放たれた細胞のほとんどが死んでいるという事実、及び細胞が循環中に遭遇する過酷な環境。転移の成功には、腫瘍塊からの細胞の放出及び循環系又はリンパ系への血管内遊走（ｉｎｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）と、血液からの血管外遊走（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）及び別の組織内のコロニー形成の、２つの別々のプロセスが関与する。これらは両方とも、細胞が最初に遊走し、次いで他の組織に定着することを可能にする表現型のスイッチによって起こると考えられている。この形態学的変化は、上皮性及び間葉性形質間の相互変換（ｉｎｔｅｒ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）を含む。

抗癌薬のように、転移性細胞は、ＢＢＢの存在により脳実質に入るのに苦労する。従って、脳への血管外遊走は、他の臓器に比べて測定可能なほど長いことは驚くことではない。脳転移の正確なメカニズムには多くの不確実性が残っているが、癌細胞は、内皮のタイトジャンクションを分解し、内皮細胞間をナビゲートすることによって、傍細胞経路（ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｏｕｔｅ）を介してＢＢＢを通過するようである。

Ｋｉｅｎａｓｔ ａｎｄ ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１）：１１６−２２による研究は、癌細胞が脳に入る過程を解明するうえで重要であった。多光子レーザー走査顕微鏡を用いて、彼らは４つの異なる段階を確認した。第１に、癌細胞は脳毛細血管に捕捉され、潜在的な日数の間そのまま残る。重要なことは、これは、細胞の接着特性よりも微小血管直径の制限のために起こることである。この静的状態にある間、細胞は形態学的変化を受け、ＢＢＢに機械的圧力を加える。第２のステップは、脳組織への血管外遊出であり、それは、天然のＢＢＢ防御を克服し、内皮タイトジャンクションを破壊するマトリックスメタロプロテアーゼなどの酵素が関与する。次に、癌細胞が、ペリサイトと同様にＢＢＢの反管腔側（ａｂｌｕｍｉｎａｌ ｓｉｄｅ）に接着することが重要である。ここから、細胞は、既存の脈管構造を利用することによって、又は血管新生を介して新生血管の形成を促進することによって増殖する。

アプタマーの有用性

本開示のアプタマー及びアプタマーコンジュゲートは、標的分子（例えば、ＥｐＣＡＭを有する細胞）を分離及び精製するための親和性リガンドとして、標的分子（例えば、ＥｐＣＡＭを有する細胞）を追跡、モニタリング、検出及び定量するためのプローブとして、又は、治療効果を達成するために生理学的に関連する反応を阻害する、可能にする、活性化する、又は触媒するために、使用され得る。それらは、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）として作用し、特定の標的に結合し、特定の分子を所望の部位に向けることができる。

本開示のアプタマー及びアプタマーコンジュゲートは、インビトロプロセス、例えば、標的分子（例えば、ＥｐＣＡＭを有する細胞）を精製するためのアフィニティー精製混合物において使用され得る。アプタマーは、標的分子（例えば、ＥｐＣＡＭを有する細胞）を汚染物質からのクロマトグラフィー分離に、及び細胞培養物若しくは細胞抽出物から標的分子を精製するために、理想的である。

一例では、本開示のアプタマー及びアプタマーコンジュゲートは、標的（例えば、ＥｐＣＡＭを有する細胞）を固体支持体に結合又は固定するための捕捉剤（ｃａｐｔｕｒｅ ａｇｅｎｔｓ）として使用することができる。固体支持体は、フィルター、ウェハー、ウェハーチップ、膜及び薄膜に一般的に関連する構造及び組成を有する基材から構成することができる。

しかし、固体支持体は、診断、検出又は定量研究のための試薬を捕捉又は固定化するために、樹脂、親和性樹脂、磁性若しくはポリマービーズ、又は任意の診断用検出試薬を含むがこれらに限定されない基質から構成され得ることが企図される。

固体支持体は、所望の用途に応じた任意の材料を含んでもよく、限定されないが、ガラス、及び、鋼（ｓｔｅｅｌ）、セラミック又はポリマー材料（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、及びポリフッ化ビニリデンなど、又はその組み合わせ）などの金属表面及び材料を含む。

ＥｐＣＡＭ発現癌幹細胞の単離と精製

癌幹細胞は、腫瘍原性幹細胞、すなわち、広範に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）又は無期限に（ｉｎｄｅｆｉｎｉｔｅｌｙ）増殖する能力を有する細胞、を含む任意の細胞から由来し得るものであり、そしてそれは大多数の癌細胞を生じる。確立された腫瘍内では、ほとんどの細胞が広範に増殖して新たな腫瘍を形成する能力を消失しており、小さなサブセットの癌幹細胞が増殖して癌幹細胞を再生し、腫瘍形成能を欠く腫瘍細胞も生じる。癌幹細胞は、非対称的及び対称的に分裂し、増殖速度の変化を示しうる。癌幹細胞は、幹細胞の性質を再獲得した遷移増幅細胞（ｔｒａｎｓｉｔ ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）又は前駆細胞を含み得る。

ＥｐＣＡＭを発現する癌幹細胞が単離され得る代表的な癌には、原発癌由来の脳腫瘍又は脳転移が含まれ、限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、滑膜腫、リンパ内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、中皮腫、骨髄原発性肉腫（Ｅｗｉｎｇ’ｓ ｔｕｍｏｕｒ）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫（ｈｅｐａｔｏｍａ）、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ（ｓｅｍｉｎｏｍａ）、胎児性癌（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、星状細胞腫、髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、頭蓋咽頭腫、上衣腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｅｕｒｏｍａ）、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫及び網膜芽腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）を含む。

さらに、脳転移は、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｇｒａｄｅ ｄｉｆｆｕｓｅ）ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度小非切断細胞（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｃｌｅａｖｅｄ ｃｅｌｌ）ＮＨＬ、巨大腫瘤病変ＮＨＬ及びワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、慢性白血球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｅｕｋｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ球性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、単球性白血病、骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む、Ｂ細胞リンパ腫および白血病などの造血器悪性腫瘍（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ）から選択される原発腫瘍又は癌に由来し得る。

ＥｐＣＡＭを有する癌幹細胞は、本明細書に記載のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートを用いて選択されてもよい。例えば、蛍光色素にカップリングされたアプタマーは、癌幹細胞の陽性選択のために使用され得る。ＥｐＣＡＭは、いくつかの正常細胞でも発現することが知られている。しかしながら、ＥｐＣＡＭ発現は、癌幹細胞においてアップレギュレートされていると考えられている。癌幹細胞マーカーは、典型的には、同じ起源の分化細胞又は非腫瘍原性細胞より、少なくとも約５倍高いレベルで発現され、例えば、少なくとも約１０倍高い、又は少なくとも約１５倍高い、又は少なくとも約２０倍高い、又は少なくとも約５０倍高い、又は少なくとも約１００倍高い。選択プロセスはまた、癌幹細胞ではない集団におけるこれらの癌細胞の排除に用いることができる陰性選択マーカーを含んでもよい。

本開示を実施する際に、ＥｐＣＡＭを有する細胞の分離は、多数の異なる方法によって達成され得ることが理解されるであろう。例えば、本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、粗製分離を可能にするために固体支持体に結合されてもよい。洗練された装置及び／又は技術的技量に対する分離効率、関連する細胞傷害性、性能の容易さ及び速度、及び必要性に応じて、異なる有効性の様々な技術を使用することができる。単離又は精製のための手順は、アプタマー被覆磁気ビーズを用いる磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、及び固体マトリックスに結合したアプタマーによる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」を含むが、これに限定されない。正確な単離又は精製を提供する技術には、ＦＡＣＳが含まれるが、これに限定されない。ＦＡＣＳを調製するための方法は、当業者には明らかであろう。

ＥｐＣＡＭ発現細胞の濃縮

一例において、ＥｐＣＡＭ発現細胞は、対象から得られた生物学的サンプルから濃縮される（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）。典型的には、対象は、脳腫瘍を有するか、又は癌幹細胞を含む脳腫瘍又は脳転移を有する疑いがある。本明細書では、「濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」又は「濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」という用語又はその変形は、１つの特定の細胞型（すなわち、癌幹細胞）の割合が、未処理の細胞集団（例えば、サンプル中の細胞）と比較した場合、増加された細胞集団を述べるために本明細書中で使用される。

１つの例において、癌幹細胞を濃縮した集団は、少なくとも約０．１％、又は０．５％又は１％又は２％又は５％又は１０％又は１５％又は２０％又は２５％又は３０％又は５０％又は７５％のＥｐＣＡＭを有する癌幹細胞を含む。これに関して、用語「癌幹細胞を含む濃縮された細胞集団」は、「Ｘ％の癌幹細胞を含む細胞集団」という用語を明示的に支持するために用いられ、ここでＸ％は本明細書中に記載される百分率である。一例において、細胞集団は、選択可能な形態のＥｐＣＡＭ＋細胞を含む細胞調製物から濃縮される。これに関して、用語「選択可能な形態（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｆｏｒｍ）」は、細胞が、ＥｐＣＡＭを有する細胞の選択を可能にするマーカー（例えば、細胞表面マーカー）を発現することを意味すると理解される。

アプタマーコンジュゲートを用いた癌の診断

本開示のアプタマー及びアプタマーコンジュゲートは、悪性組織（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ）における癌幹細胞の存在を決定するための診断目的のためにインビトロで使用され得る。この方法は、ＥｐＣＡＭ＋癌幹細胞の存在について生物学的サンプルを試験することを含む。例えば、生物学的サンプルを本開示の標識アプタマーと接触させることができ、アプタマーがサンプル中の細胞に特異的に結合する能力が決定される。アプタマーによる結合は、ＥｐＣＡＭを有する細胞の存在を示す。一例では、ＥｐＣＡＭを有する細胞は癌幹細胞である。

本開示のアプタマーコンジュゲートはまた、検出可能なシグナルを与えるレポーター基（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｒｏｕｐ）で標識された本開示の単離されたアプタマーを対象に投与することによって、インビボでＥｐＣＡＭ＋腫瘍を局在化するために使用され得る。結合したアプタマーは、その後、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、外部シンチグラフィー（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ）、エミッショントモグラフィ、光学イメージング又は放射性核種スキャニング（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅａｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ）を用いて検出することができる。該方法は、疾患の程度に関して対象の癌をステージ分類し（ｓｔａｇｅ）、治療に対する応答の変化をモニターするために使用され得る。

癌幹細胞の検出は、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートを検出可能な標識にカップリングすることによって促進することができる。検出可能な標識の例には、種々の酵素、補欠分子族（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、電子密度標識（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｎｓｅ ｌａｂｅｌｓ）、ＭＲＩ用標識、及び放射性物質が含まれる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれる。適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフォン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンを含む。発光物質の例としては、ルミノールが含まれる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性物質の例としては、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、³⁵Ｓ、¹⁸Ｆ、⁶⁴Ｃｕ、^94mＴｃ、¹²⁴Ｉ、¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｏ、⁶⁸Ｇａ、⁸⁶Ｙ、⁸²Ｒｂ又は³Ｈが含まれる。

アプタマーの３’末端での標識は、例えばＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いた鋳型伸長、Ｔ４ ＲＮＡ／ＤＮＡリガーゼ媒介ライゲーション、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって達成することができる。５’末端での標識は、インビトロ転写混合物を過剰のＧＴＰ−１３−Ｓで補うことによって達成することができ、そのチオールはビオチンを付着させるために使用することができる。さらに、適切な基（単数又は複数）の５’又は３’末端への直接的な化学的コンジュゲーションは、アプタマーを標識するために使用され得る。

本開示の抗癌剤

本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、成分（ｍｏｉｅｔｙ）にさらにコンジュゲートされ、この成分をＥｐＣＡＭ＋細胞、好ましくは癌幹細胞に導くために使用され得る。成分の例には、癌幹細胞を死滅させるために使用できる毒素（ｔｏｘｉｎ）、放射性核種、又は化学療法剤が含まれる。

アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、化学的に合成される成分及びアプタマーによって、又は別々に産生されたアプタマーとその成分を結合させるために使用されるコンジュゲーション(例えば、非ペプチド共有結合、例えば、非アミド結合）の手段のいずれかによって、成分、例えば毒素に融合され得る。あるいは、アプタマー及び成分は、適切なリンカーペプチドによって結合されてもよい。

有用な毒素分子としては、ペプチド毒素が挙げられ、これは細胞内に存在する場合に著しく細胞傷害性である。毒素の例には、細胞毒素（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）、酵素活性を破壊し、それによって癌幹細胞を死滅させる代謝崩壊剤（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓ）（阻害剤及び活性化剤）、及びエフェクター部分（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｏｒｔｉｏｎ）の規定された半径内の全ての細胞を殺す放射性分子が含まれる。代謝崩壊剤は、分子、例えば、正常な機能を変化させるように細胞の代謝を変化させる酵素又はサイトカイン、である。概して、毒素という用語は、腫瘍細胞に死を引き起こす任意のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を含む。

多くのペプチド毒素は、一般化された真核生物受容体結合ドメインを有し、これらの場合、毒素は、ＥｐＣＡＭを保有していない細胞を死滅させないように（例えば、ＥｐＣＡＭを保有していないが、改変されていない毒素の受容体を有する死細胞を防ぐために）改変されなければならない。そのような改変は、分子の細胞傷害性機能を保存する様式で行われなければならない。潜在的に有用な毒素には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシン、０−志賀様毒素（Ｏ−Ｓｈｉｇａ−ｌｉｋｅ ｔｏｘｉｎ）（ＳＬＴ−１、ＳＬＴ−ＩＩ、ＳＬＴ−１Ｉｖ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素百日咳毒素（Ｓｈｉｇａ ｔｏｘｉｎ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｉｎ）、破傷風毒素（ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｉｎ）、シュードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、アロリン、サポニン、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）及びゼラニンが挙げられるが、これらに限定されない。他の毒素には、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）及びリンホトキシン（ＬＴ）が含まれる。抗腫瘍活性を有する別の毒素は、腫瘍に対して顕著な効力を有する抗腫瘍抗生物質を含む、カリチアマイシンγ１（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｇａｍｍａ １）、ジン−エンである（ｄｉｙｎｅ−ｅｎｅ）（Ｚｅｉｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１１９８−２０１）。

一例として、ジフテリア毒素（この配列は公知である）を本開示のアプタマーコンジュゲートに結合させることができる。天然のジフテリア毒素分子は、トランスロケーションドメイン（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）及び一般化された細胞結合ドメイン（ＡＡ ４７５−５３５）を含む、酵素活性フラグメントＡ（ＡＡ１−１９３）及びフラグメントＢ（ＡＡ１９４−５３５）として、分子のアミノ末端で始まることで特徴づけることができるいくつかの機能的ドメインからなるコリネバクテリウムジペプテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌される。

アプタマー及び毒素成分は、当業者に知られているいくつかの方法のいずれかで連結することができる。例えば、アプタマーを毒素（ゲロニン）に結合させる方法は、Ｃｈｕ ＴＣ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６（１２）５９８９−５９９２に記載されている。成分はまた、局所レベルで身体の免疫系を活性化又は阻害する免疫系のモジュレーターであり得る。例えば、サイトカイン、例えば、腫瘍に送達されるＩＬ−２のようなリンホカインは、腫瘍の近傍で細胞傷害性Ｔリンパ球又はナチュラルキラー細胞の増殖を引き起こし得る。

成分又はレポーター基はまた、放射性分子、例えば、放射性ヌクレオチド、又はいわゆる増感剤、例えば、例えば特定の条件下で放射性になる前駆体分子、例えば、Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９０）．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｃｔ １９９０：１００−１０７に記載されているように、いわゆる「ホウ素中性子捕獲療法（ｂｏｒｏｎ ｎｅｕｔｒｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｔｈｅｒａｐｙ）」（ＢＮＣＴ）においてわずかな低エネルギー中性子にさらされたときのホウ素であってもよい。そのような放射性エフェクター成分を有する化合物は、腫瘍における癌幹細胞の増殖を阻害するため、及び画像化目的のために癌幹細胞を標識するための両方に用いることができる。

放射性核種は、α、β、又はγ粒子のいずれかを放出することができる単一原子放射性分子である。α粒子エミッタ（ｅｍｉｔｔｅｒｓ）は、β又はγ粒子エミッタよりも好ましい。何故ならば、これらのエミッタは短い距離ではるかに高いエネルギーを放出し、従って正常組織に著しく浸透し、損傷することなく効率的であるからである。適切な粒子放出放射性核種には、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、及び²¹²Ｂｉが含まれる。

放射性分子は、直接又は二官能性キレートによってアプタマーに強く結合しなければならない。このキレートは溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）を許容せず、従ってインビボでの放射性分子の早すぎる放出を許容してはならない。Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７−６２（１９９１）。一例として、ＢＮＣＴを本発明に適合させるために、ホウ素の安定同位体、例えばホウ素１０を、化合物の抗腫瘍成分又はエフェクター成分として選択することができる。ホウ素は、アプタマーが癌幹細胞に特異的に結合することによって、腫瘍細胞に送達され、腫瘍細胞内又は腫瘍細胞上に濃縮される。充分な量のホウ素を蓄積させる時間が経過した後、約０．０２５ｅＶのエネルギーを有する低エネルギー中性子ビームで腫瘍を撮像及び照射することができる。この中性子照射は、それ自体、腫瘍を取り囲む健康な組織又は腫瘍そのものにほとんど損傷を与えないが、ホウ素１０（例えば、腫瘍細胞の表面上）は中性子を捕捉し、それによって不安定な同位体、ホウ素１１を形成する。ホウ素１１は即時に分裂してリチウム７核及び約２７９万電子ボルトのエネルギーを有するエネルギー性の粒子を生成する。これらの重粒子は、非常に致命的であるが、粒子がわずか約１セル直径（１０ミクロン）の経路長を有するため、非常に局在する放射線の形態である。

本開示の送達剤（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）

本開示のアプタマーコンジュゲートは、細胞へ送達するｓｉＲＮＡ、リボザイム、又はＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）のために使用され得る。適切なｓｉＲＮＡ、リボザイム又はＤＮＡザイムの例は、状況に依存する。本開示に従って使用するのに適したｓｉＲＮＡ、リボザイム、又はＤＮＡザイムの例は、ＡＴＰ結合カセット膜輸送体（ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ）、幹性遺伝子（Ｂｍｉ−１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、β−カテニン（ｃａｔｅｎｉｎ）、Ｓｍｏ、ネスチン（ｎｅｓｔｉｎ）、ＡＢＣＧ２、Ｗｎｔ２及びＳＣＦなど）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、及びサバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）を標的とするものが含まれる。

例として、これは、抗ＰＳＭＡアプタマーを用いた先行技術において実証されている。ＰＳＭＡはエンドソームにクラスリン被覆ピット（ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔｓ）を介してインターナライズされるという知見に基づいて、抗ＰＳＭＡアプタマーは、結合させたｓｉＲＮＡを、ＰＳＭＡを発現する細胞へと運搬し、ＰＳＭＡタンパク質に結合したアプタマー−ｓｉＲＮＡは、インターナリゼーションを介して細胞へのアクセスすることになるであろうと仮定された。次に、ｓｉＲＮＡ成分（ｓｉＲＮＡ ｐｏｒｔｉｏｎ）はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）複合体によるプロセシングを受け、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介遺伝子サイレンシング経路に供給される。３つのグループがこれを達成するために異なる戦略を利用している。Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４，ｅ７３は、抗ＰＳＭＡアプタマー及びｓｉＲＮＡを組み立てるためのビオチン−ストレプトアビジン架橋媒介接合方法を記載している。ＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４，１００５−１０１５は、アプタマーとｓｉＲＮＡを連結するための「ＲＮＡのみ」のアプタマー−ｓｉＲＮＡキメラアプローチを使用した。その後のＷｕｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ.（２００８）．Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ８：５５４−５６５の研究では、著者が、ＰＳＭＡ陽性前立腺癌細胞に真核伸長因子２（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ２）（ＥＥＦ２）ｓｉＲＮＡを送達するために抗ＰＳＭＡアプタマーを使用し、二価ＰＳＭＡアプタマーは、この目的のために使用された。この著者らは、一価抗ＰＳＭＡ−ｓｉＲＮＡキメラと比較して、二価アプタマー構築物の遺伝子ノックダウンの力価が優れていることを実証した。本開示のアプタマーコンジュゲートはまた、様々な固形腫瘍においてＥｐＣＡＭ＋癌幹細胞に積荷（ｃａｒｇｏ）を送達するために使用され得る。ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）は、タンパク質合成のプロセスを阻害し、細胞傷害性であるリボソーム毒素である。しかしながら、それは膜不浸透性であり、その細胞侵入のための先導役（ｕｓｈｅｒ）を必要とする。従って、本開示のアプタマーコンジュゲートは、癌幹細胞に膜不透過性毒性ペイロードを送達するために利用され得る。細胞傷害性化学療法剤に対する腫瘍耐性は、部分的には、癌細胞への不十分な送達及び取り込み、そしてより重要なことには、癌細胞による排出が原因である。ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−グリコール酸）ＰＬＧＡ由来の生分解性ナノ粒子（ＮＰ）は、Ｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１７３５６−１７３６１に記載されるように、この課題に取り組むために使用された。簡潔に述べると、シスプラチンは、２つのアルキル鎖を導入することによってそのプロドラッグのＰｔ（ＩＶ）化合物に変換された。これは、化合物の疎水性を増加させ、ＮＰの疎水性コア内でのそのパッケージングのプロセスを容易にした。ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子を合成するためのナノ沈殿工程（ｎａｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）の間に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をコポリマーとして使用した。ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＮＰ表面は、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）アプタマーで修飾された。ＮＰは、ＬＮＣａＰ細胞と共にインキュベートしたときにエンドサイトーシスを受け、アルキル化プロドラッグは、細胞質ゾル（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）還元プロセスによってシスプラチンに変換された。

本開示はまた、脳腫瘍又は脳転移のための同時薬物送達及び画像化剤としてのアプタマー又はアプタマーコンジュゲートの使用にも及ぶ。これは、アプタマーを蛍光量子ドット（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）（ＱＤ）の表面に結合させることによって達成することができる。次に、ＱＤ−アプタマーコンジュゲートをＤｏｘと共にインキュベートして、ＱＤ−アプタマー−Ｄｏｘナノ粒子を形成する。Ｄｏｘ及びＱＤは共に蛍光分子である。しかし、それらはＱＤ−アプタマー−Ｄｏｘナノ粒子中に近接しているため、二重蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）機構によって互いの蛍光を消光する。従って、ＱＤ−アプタマー−Ｄｏｘナノ粒子は非蛍光性である。しかしながら、癌細胞におけるＰＳＭＡ媒介エンドサイトーシスを介したＱＤ−アプタマー−Ｄｏｘナノ粒子のインターナリゼーションは、Ｄｏｘ及びＱＤの両方による蛍光の回復をもたらす、ＱＤ−アプタマー−Ｄｏｘナノ粒子からのＤｏｘの放出を引き起こす。

医薬組成物

本開示の一例では、本開示によるアプタマー、アプタマーコンジュゲート、抗癌剤又は薬物送達剤（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｙ ａｇｅｎｔ）は、医薬的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む組成物の形態で投与される。賦形剤又は組成物の他の要素の選択は、投与に使用される経路及びデバイスに従って適合させることができる。

「担体」及び「賦形剤」という用語は、活性化合物／アプタマーの貯蔵、投与及び／又は生物学的活性を促進するために当該技術分野で従来使用されている物質の組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）を参照のこと）。担体はまた、活性化合物／アプタマーの望ましくない副作用を低減し得る。担体は、例えば、安定であり、例えば、担体中の他の成分と反応することができないものである。一例として、担体は、治療に使用される用量及び濃度で、レシピエントにおいて有意な局所的又は全身的有害作用を引き起こさない。

本開示のための適切な担体には、従来使用されているものを含み、例えば、水、生理食塩水、水溶性デキストロース、ラクトース、リンゲル液 緩衝溶液、ヒアルロナン及びグリコールは、特に溶液の場合（等張性の場合）の典型的な液体担体である。適切な医薬的担体及び賦形剤は、澱粉、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク（ｃｈａｌｋ）、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。

抗酸化剤、緩衝液、静菌剤（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）などの他の一般的な添加剤を添加することができる。注射可能な溶液を調製するために、丸剤（ｐｉｌｌｓ）、カプセル剤、顆粒剤又は錠剤（ｔａｂｌｅｔｓ）、希釈剤、分散剤、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、結合剤（ｂｉｎｄｅｒｓ）及び滑沢剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ）をさらに添加することができる。

本開示のアプタマーを含む抗癌剤又は薬物送達剤は、当該分野で公知の方法に従って、脳への送達のために対象に投与することができる。投与は、非経口的手段（例えば、静脈内、皮下、局所又は腹腔内注射）によって行うことができる。あるいは、投与は、鼻腔内であり得る。いくつかの実施形態では、アプタマー又はアプタマーコンジュゲートは、ナノ粒子又はリポソームの形態で提供される。例えば、ナノ粒子は、薬物の標的送達のための本開示のアプタマー又はアプタマーコンジュゲートで機能化することができる。

抗癌剤の有効投与量は、体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与頻度、投与方法、排泄及び疾患の重篤度に応じて決定することができる。一例では、抗癌剤又は薬物送達剤は、アプタマーコンジュゲートを１０〜９５重量％含む。別の例において、抗癌剤又は薬物送達剤は、アプタマーコンジュゲートを２５〜７５重量％含む。

投与頻度は、１日に１〜数回でよい。一例では、アプタマーの有効細胞内含量は、約１ｎＭ〜１０００ｎＭである。別の例では、アプタマーの有効細胞内含量は、好ましくは１００ｎＭ〜５００ｎＭである。しかし、アプタマーの投与量は、上記の範囲未満又はそれ以上であり得る。

トランスフェリン受容体

トランスフェリン受容体（ＴｆＲ；ＣＤ７１）は、２つの９０ｋＤａサブユニットからなる膜貫通糖タンパク質である。ジスルフィド架橋はこれらのサブユニットを連結し、各サブユニットは１つのトランスフェリン（Ｔｆ）分子に結合することができる。ＴｆＲは、主に肝細胞、赤血球、腸細胞、単球上、並びに血液脳関門（ＢＢＢ）の内皮細胞上で発現する。さらに、脳においてＴｆＲは、脈絡叢（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ）上皮細胞及びニューロン上で発現される。ＴｆＲは、受容体媒介エンドサイトーシスによる鉄飽和（ｉｒｏｎ−ｓａｔｕｒａｔｅｄ）トランスフェリンのインターナリゼーションを媒介する。研究は、その受容体に対するトランスフェリンの親和性がｐＨ及び鉄負荷（ｉｒｏｎ ｌｏａｄｉｎｇ）に依存することを示した。

トランスフェリンリガンドが受容体に結合すると、受容体−リガンド複合体はクラスリン被覆小胞（ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｃｏａｔｅｄ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を介してエンドサイトーシスされる。

アプタマーの組み合わせ

本開示の単離されたアプタマー分子（単数又は複数）は、本明細書中に開示される任意の方法に従って、単独で、又は１つ以上のさらなるアプタマーと組み合わせて使用され得る。一例では、本開示のアプタマーコンジュゲート（単数又は複数）は、癌幹細胞の検出、精製、又は濃縮を促進するアプタマーと組み合わせることができる。

キット

本開示はまた、本明細書中に開示される方法を実施するための診断キットを提供する。一例では、診断キットは、ＥｐＣＡＭ発現細胞（例えば、癌幹細胞）を検出するための本明細書に記載の診断剤を含む。

キットはまた、緩衝剤及び安定化剤などの補助剤を含み得る。診断キットは、バックグラウンド干渉を低減するための薬剤、対照試薬、及び試験を行うための装置をさらに含み得る。診断キットの使用方法についての説明も一般的に含まれている。

当業者であれば、本開示の広範な一般的な範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に多くの変形及び／又は修正を行うことができることが理解されよう。従って、本実施形態は、全ての点で例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。

方法
細胞培養
細胞培養細胞株（表１）をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気中で維持した。細胞株は、ｂＥｎｄ．３マウス大脳内皮細胞（ＴｆＲ陽性）、ＨＥＹ卵巣癌細胞（ＥｐＣＡＭ陽性）及びＭＯＬＴ４白血病細胞（ＴｆＲ陰性、ＥｐＣＡＭ陰性）であった。アッセイに必要とされる場合、又は細胞数を維持するのに適切な場合、細胞を継代した（付着細胞については１ｘトリプシンを使用）。

アプタマー
アプタマーを表２に記載する。全てのアプタマーを、３’ｉｎｖ ｄＴ及び５’末端（ＴＹＥ ６６５）上のフルオロフォアでタグ付けした。これらは全て商業的に合成された（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。アプタマーの２つの異なる群を使用した。マウスＴｆＲに対する４つのアプタマーを最初に試験した。これに続き、これらの抗ＴｆＲアプタマーのいくつかと、Ｓｏｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８５（８）：４１４１−９に記載されている、より大きいＥｐＣＡＭアプタマー由来の抗ＥｐＣＡＭアプタマー（Ｅｐ７）を組み込んだ、３つのコンジュゲートアプタマーが生成された。Ｓｏｎｇらのアプタマーは以下の配列からなる：

５’ＣＡＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＣＣ ＡＣＧ ＴＴＧ ＴＣＡ ＴＧＧ ＧＧＧ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ３’（配列番号１６）

２つの追加のＥｐＣＡＭアプタマーもまた、Ｅｐ８及びＥｐ９を設計して作製され、それらもまた、Ｓｏｎｇらに記載されている、より大きなＥｐＣＡＭアプタマーから誘導されたものである。

アプタマーの特徴付け
ｉ）アプタマーの結合親和性の決定

アプタマーの結合親和性（平衡解離定数Ｋ_D）を決定するために、結合アッセイを行って、細胞表面上に発現された天然のＥｐＣＡＭタンパク質への結合を測定した。アプタマーを、０ｎＭ〜４００ｎＭの範囲の濃度で細胞とともにインキュベートした。その後、これらをフローサイトメトリーによって分析した。アプタマーは、使用前に保存温度（−２０℃）から解凍した。次いで、これらを所望の濃度を達成するために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で連続希釈して希釈した。ＰＢＳに、アプタマーに適切なＭｇＣｌ₂濃度を補充した（抗ＴｆＲアプタマーについては１ｍＭ；コンジュゲートアプタマーについては５ｍＭ）。次いで、アプタマーは、サーモサイクラーを用いて３Ｄ構造に折り畳んだ（８５℃で５分間、１０分間かけて２２℃へゆっくりと冷却、そして３７℃で１５分間）。

同時に、継代培養した細胞をブロッキング緩衝液（１０％ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含むＰＢＳ）中で３０分間インキュベートした。遠心分離後、ブロッキング緩衝液を除去し、細胞を結合緩衝液（１０％ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡを含むＰＢＳ）に再懸濁した。次いで、細胞（５０μＬ）をアプタマー（５０μＬ）と共に３７℃で３０分間、濃度範囲（０ｎＭ、２０ｎＭ、４０ｎＭ、６０ｎＭ、８０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ）でインキュベートした。この後、フローサイトメトリーのための最終再懸濁の前に、細胞を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した。

アプタマーを、選択された細胞株（ｂＥｎｄ．３細胞、ＴｆＲ陽性マウス細胞；ＨＥＹ細胞、ＥｐＣＡＭ陽性ヒト卵巣癌細胞株；及びＴｆＲ及びＥｐＣＡＭ陰性ＭＯＬＴ４ヒト細胞）と一定の濃度でインキュベートした。アプタマーに結合した細胞を、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析し、アプタマーの結合親和性を測定するために各サンプルについて１０，０００イベントを数えた。蛍光を示す生存細胞が観察され、中央蛍光強度が記録された。バックグラウンド蛍光を説明するために、自己蛍光０ｎＭ濃度の値を他の数字から差し引いた（Ｌｉ Ｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８（５）：２４３８−４８）。得られた値を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３ソフトウェアを介して解離定数（Ｋ_D）を決定した。

ｉｉ）細胞へのアプタマーインターナリゼーションの測定

細胞へのアプタマーインターナリゼーションを視覚化する手段として共焦点顕微鏡法を用いた。アプタマー及び細胞は、混合して、３７℃でインキュベートする前に上記と同じ方法で調製した。アプタマーを２００ｎＭの濃度で使用し、６０分間インキュベートした。コンジュゲート（二官能性）アプタマーの濃度は４００ｎＭであり、これらを細胞とともに１２０分間インキュベートした。インキュベーション終了の１０分前に、２μＬのＨｏｅｃｈｓｔ核染色液（１０ｍｇ／ｍＬ）を細胞に添加した。次いで、細胞を上記のように１００μＬのＰＢＳで３回洗浄し、視覚化のために８チャンバースライド（８−ｃｈａｍｂｅｒｅｄ ｓｌｉｄｅ）（Ｌａｂ−Ｔｅｋ ＩＩ、Ｎｕｎｃ）に２０μＬ（８×１０⁵細胞／ウェル）で再懸濁した。細胞をブロッキング緩衝液中で６０分間インキュベートし、続いてアプタマーを含む結合緩衝液に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。最後の１０分間のインキュベーションの間、細胞にビスベンズイミダゾール（Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（３ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した。アプタマー溶液を除去し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて可視化する前に、細胞をＰＢＳ中でそれぞれ５分間３回洗浄した。

細胞取り込みの機序を評価するために、フィコエチリン標識ラット抗マウスＴｆＲモノクローナル抗体（Ｒ１７２１７；Ａｂｃａｍ）のインターナリゼーションを、１μｇ／ｍＬのアプタマーと３０分間、共インキュベートすることにより、共焦点顕微鏡法によっても可視化した。

インビトロ血液脳関門モデル

アプタマーを含むＴｆＲがレセプター媒介輸送（ＲＭＴ）を介して内皮細胞単層を通過する能力を評価するために、図１に模式的に示すように、ＢＢＢのインビトロモデルを作製した。２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のトランスウェルインサート（直径０．４μｍの細孔を有するポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））を１００μＬの５０％コラーゲンＩＶと共に３７℃で２時間インキュベートした。ｂＥｎｄ．３細胞のフラスコをトリプシン処理して単一細胞懸濁液を生成し、十分な割合の細胞が生存していることを確実にするために血球計及びトリパンブルーを用いて計数した。次いで、これらを遠心分離し、培地に再懸濁した。ウェルに８００μＬの無血清培地を充填し、トランスウェルインサートを上に置いた。次いで、細胞を１×１０⁶細胞／ｃｍ²の密度で９０μＬの無血清培地に播種し、３７℃でインキュベートした。細胞を６時間静置させ、次いで増強培地（ＤＭＥＭ低グルコース：Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２（１：１）、（両方無血清）５５０ｎＭヒドロコルチゾン、３２μＭのｃＡＭＰ、１７．５μＭのアミノフィリン、１μＭのレチノイン酸、５μｇ／ｍＬのインスリン、２．７５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、２．５ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウム、１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（表皮成長因子））（Ｗｕｅｓｔ ＤＭ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１２（２）：２１１−２１）をトランスウェルに添加した。単層の成長を補うために、両方の区画の培地を翌日に増強培地に交換した。

（ｉ）経皮電気抵抗測定（Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）

膜の完全性を評価するために、トランスウェルの経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。ＥＶＯＭ２上皮電圧計（ＥＶＯＭ２ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｖｏｌｔｏｈｍｍｅｔｅｒ）（Ｗｏｒｌｄ ＰｒｅｃｉｓｉｏＮＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の電極をＢＢＢモデルの両チャンバーに挿入し、抵抗をオーム単位で記録した。次いで、この値にトランスウェルの面積を掛けた。ブランクのトランスウェルインサートを使用して同じことを行い、ＴＥＥＲをΩｃｍ２で得るために、前に記録した値から差し引いた。

（ｉｉ）トランスウェル膜の可視化

トランスウェルは培地を吸引してから、ＰＢＳで穏やかにすすいだ。次にメタノールをトランスウェルに５分間添加して細胞を固定した。これを除去し、ヘマトキシリンを５分間加えた。その後、トランスウェルをＰＢＳですすぎ、次に酸性化したアルコールを加えた。ＰＢＳでさらにすすいだ後、エオシンをトランスウェルに３０秒間加えた。トランスウェルは、ヘマトキシリン染色及びエオシン染色の前及び後に、光学顕微鏡下（オリンパス）で視覚化した。

（ｉｉｉ）ＨＥＹ−ｂＥｎｄ．３共培養及びアプタマー血液脳関門透過性

ＨＥＹ細胞を継代培養し、生存細胞のパーセンテージを評価するために、血球計及びトリパンブルーを用いて計数した。続いて、それらをＤＭＥＭ培地中で８７，５００細胞／ｍＬの濃度で希釈した。インビトロＢＢＢモデルの底部コンパートメントから培地を除去し、ＨＥＹ細胞溶液８００μＬと交換し、ウェル当たり７０，０００細胞を播種した。これらを一晩インキュベートした。次に、培地をトランスウェルの上部コンパートメントから取り出し、濃度２μＭのアプタマー１００μＬをトランスウェル膜の上部にピペットで加えた。３７℃で３時間インキュベートした後、底部コンパートメントの培地を除去し、遠心分離した。次いで、細胞を１００μＬのＰＢＳに再懸濁し、２μＬのＨｏｅｃｈｓｔ核染色液（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、１０分間インキュベートした。次いで、細胞を１００μＬのＰＢＳで３回洗浄した後、共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）下で観察した。

データ分析

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ３を用いてデータ及び結果を分析し、特に明記しない限り、平均及び平均の標準誤差（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として報告した。

実施例１ 抗トランスフェリン受容体アプタマーの特徴付け
（ｉ）ＴｆＲアプタマーの生成

本明細書において生成されたトランスフェリンアプタマーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ １０５（４１）：１５９０８−１３に以前記載され、そして図３Ａ及びＢに示されるように、マウストランスフェリン受容体（ｔｆＲ）に対するアプタマーに由来するものであった。ＢＢＢを介したアプタマーのトランスサイトーシスの概念実証（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ）として、この元のアプタマーデザインを使用した。本発明者らは、さらに、Ｃｈｅｎらの元のＴｆＲアプタマーであって、配列：５’ＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＴＧＴＧＣＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＡＧＴＴＡＧＴＡＴＣＧＣＴＡＣＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴＡＧＴＣＣＧＴＴＣＧＧＧＡＴ ３’（配列番号１５）
アプタマーを有するものをさらに切断し、ＴｆＲアプタマーを生成した（図２Ｃ及び配列番号４）。次いで、これを結合ループの配列のスクランブリングにより改変して、表２に示すように３つの代替バージョン（ＴｆＲ２、ＴｆＲ３及びＴｆＲ４と命名）を作製した。抗ＴｆＲアプタマーの２Ｄ構造は、結合ループ中の配列の変化に続いて変化していないことを確実にするために、ＶＩＥＮＮＡソフトウェア（Ｇｒｕｂｅｒ ＡＲ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６（Ｗｅｂサーバー発行）：Ｗ７０−Ｗ４）を用いて予測した。

（ｉｉ）抗トランスフェリン受容体アプタマー結合親和性の決定

アプタマーの標的受容体への結合親和性は、治療剤としてのその使用に重大な影響を及ぼす分子の重要な特徴である。より高い親和性は、細胞へのより大きな取り込みを可能にするが、腫瘍全体にわたる薬物の最適な治療分布を防止し、オフターゲット効果の危険にさらす可能性もある。さらに、一部のアプタマーは、それらが意図された機能を実行するための一時的な結合のみを必要とする。これは、本明細書で設計されている抗ＴｆＲアプタマーの場合である。これらはＢＢＢを介してトランスサイトーシスするように設計されており、単に内皮細胞にインターナリゼーションするのではなく、より低い結合親和性が必要である。

アプタマーＴｆＲ１、ＴｆＲ２、ＴｆＲ３及びＴｆＲ４の結合親和性を、フローサイトメトリーを介して、ＴｆＲ陽性細胞株としてｂＥｎｄ．３マウス大脳内皮細胞、及びネガティブコントロールとしてヒトＴｆＲを発現するが、マウスＴｆＲは発現しない、ＭＯＬＴ４急性リンパ芽球性白血病細胞（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）ＰＮＡＳ ７８（７）：４５１５−９）を用いて、半定量的に決定した。３つの独立した結合アッセイを各細胞株に対する各アプタマーについて実施した。

結合アッセイの結果は、アプタマー結合ループでなされた変化が、結合アフィニティーに様々な影響を及ぼしたが、任意のアプタマーが完全に特異性を失う程度のものではないを示している。驚くべきことに、結合親和性が最も低いアプタマーは、最も密接な結合を示すアプタマーであるＴｆＲ３（図３Ｃ；ＫＤ＝３６５．６±８３．２８ｎＭ）とは対照的に、元のトランケーションであるＴｆＲ１（図３Ａ；ＫＤ＝５７６４±７１１７ｎＭ）であった。

アプタマーの結合親和性は、ネガティブコントロールとしてのヒト細胞株（ＭＯＬＴ４）に対しても測定した。ＭＯＬＴ４はＴｆＲを発現するが、ヒトＴｆＲとマウスＴｆＲとの間のアミノ酸配列相同性はわずか７７％であるため（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、特異的な結合は期待されなかった。アプタマーはＭＯＬＴ４細胞への非特異的結合を示し、ｂＥｎｄ．３細胞に対して観察された結合が実際に特異的であるという確信を確立した。

（ｉｉｉ）細胞への抗トランスフェリン受容体アプタマーインターナリゼーションの定量分析

これらのアプタマーの細胞内への取り込みは、治療薬としての使用の可能性を決定する重要な因子である。本明細書で生成される抗トランスフェリン受容体アプタマーは、活性トランスサイトーシス経路を介してＢＢＢを通過するように設計される。従って、アプタマーが単に細胞表面に結合するのではなく、細胞内にインターナリゼーションされることを確実にすることが重要である。これは、共焦点顕微鏡を用いて、１時間のインキュベーションの間にｂＥｎｄ．３及びＭＯＬＴ４細胞に２００ｎＭの濃度でアプタマーのインターナリゼーションを視覚化することによって行った。

４つの抗ＴｆＲアプタマー全てをＴｆＲ陽性のマウス大脳内皮細胞に取り込んだ。ＴｆＲ陰性細胞は、明確なアプタマー取り込みを示さず、インターナリゼーションプロセスの特異性に対する信頼を確立した。さらに、インターナリゼーションされたアプタマーは点状の染色パターンを有し、エンドソーム局在の可能性を強調し、これは細胞取り込み活性があることを示す。

（ｉｖ）抗トランスフェリン受容体アプタマー取り込みの特異性の決定

アプタマーは、診断及び治療の分野における比較的新しい分子ツールである。従って、タンパク質ベースの結合分子（表１参照）よりも多くの利点があるにもかかわらず、抗体は特異的な表面抗原を介して細胞を標的化するためのよりよく受け入れられたアプローチである。対応する抗体を用いたアプタマーの性能を、ｂＥｎｄ．３細胞における取り込みを調べることによって比較した。これは、最も高い親和性アプタマー、ＴｆＲ３、及び抗ＴｆＲ抗体をｂＥｎｄ．３細胞と共にインキュベートし、共焦点顕微鏡でそれらを観察することによって行った。

ｂＥｎｄ．３細胞中に、ＴｆＲ３アプタマーと抗ＴｆＲ抗体との共局在が顕微鏡で観察された。アプタマー及び抗体にて非常に類似した分布パターンが細胞全体にて観察され、両方の分子が同じ経路を介して細胞に入ったことを示している。

（Ｖ）細胞への抗トランスフェリン受容体アプタマーインターナリゼーションの定性的時間経過分析

本明細書において生成される抗ＴｆＲアプタマーは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる薬物送達剤として使用されることが意図される。インビボ又は臨床の場面では、これらは、反対側で脳実質へと出る前に、血流からＢＢＢ内皮単層へと通過する必要がある。これを考えると、これらは能動輸送過程を経て細胞に入ることができるだけでなく、再び細胞外に排出され得ることが重要である。従って、アプタマーが細胞内に保持されているのか、又は細胞外液に戻っているのかを確認するために、時間経過インターナリゼーション実験を行った。トランスフェリン受容体に対する最良の結合剤であるＴｆＲ３を、６つの異なる時点（０．５、１、２、４、６、８時間）にわたってｂＥｎｄ．３細胞とともにインキュベートした。次いで細胞を共焦点顕微鏡で観察した。

前の結果と一致して、両方の実験セットは均一な分布及び斑点状の外観を示すという、同様のパターンのインターナリゼーションが各時点にわたって観察された。図３は、この分配パターンがインキュベーションの８時間を通して維持され、アプタマーが細胞から除去されなかったことを示している。

実施例２ ＥｐＣＡＭアプタマーの特徴付け

ＳＹＬ３Ｃ（全長又はＦＬ）４８ｍｅｒアプタマーは、もともとＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８５：４１４１−４１４９によって生成されたものである。ＲＮＡｆｏｌｄを用いて２Ｄ構造を予測した。表２及び図４に示すように、それぞれ、Ｅｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９と名付けられたこのアプタマーのトランケート型バージョン（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を生成した。伸長Ｅｐ７及びスクランブル伸長Ｅｐ７アプタマーの配列を表２に示す。延長Ｅｐ７はＥｐ７と同じ結合ループを有し、スクランブル伸長Ｅｐ７は、結合ループにおいてランダムに選択された塩基対を有する。２Ｄ構造は、ＲＮＡｆｏｌｄを用いて予測された（Ｇｒｕｂｅｒ ＡＲ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔｈｅ Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡ ｗｅｂｓｕｉｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６：Ｗ７０−Ｗ４）。

トランケート型Ｅｐ７、Ｅｐ８、Ｅｐ９、伸長（Ｅｘ）ＥｘＥｐ７及びスクランブル（Ｓｃｒ）ＳｃｒＥｘ Ｅｐ７を含む全てのアプタマーは、５’末端にＴＹＥ６６５色素、３’末端に逆向きチミジンを有し、商業的に合成された（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

ｉ）結合親和性の決定

各ＤＮＡ ＥｐＣＡＭアプタマー（Ｅｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９）の平衡解離定数（Ｋ_D）は、フローサイトメトリーを用いて細胞表面上に発現された天然ＥｐＣＡＭタンパク質へのその結合を測定することによって決定した。ＨＴ２９、ＨＥＹ及びＨＥＫ２９３Ｔ（５×１０⁵）細胞をブロッキング緩衝液（１０％ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳ）で３０分間インキュベートした後、結合緩衝液（１０％ＦＣＳ、１ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含むＰＢＳ）で一回洗浄した後、結合緩衝液中のそれぞれの連続希釈した濃度のＴＹＥ６６５標識アプタマー（０〜２００ｎＭ）で３７℃にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリー分析の前にＰＢＳに再懸濁した。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて蛍光強度を測定し、各サンプルについて１０，０００イベントを測定した。各濃度の平均蛍光強度を自己蛍光コントロールの平均蛍光強度から差し引き、各アプタマーのＫ_Dを蛍光強度の正規化した値から計算した。

図５Ａは、全長のＳｏｎｇらのアプタマー（配列番号１６）と比較した、ＥｐＣＡＭ陽性細胞株、ＨＴ２９及びＨＥＹに対するＥｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９の相互作用についての平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。

図５Ｂは、ＥｐＣＡＭ陽性卵巣癌細胞株、ＨＥＹに対するＥＸ Ｅｐ７及びＳｃｒ Ｅｘ Ｅｐ７アプタマーの相互作用についての平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。

各アプタマーについてのＫ_D値を中央値±ＳＥＭ（ｎ＝３）として以下の表３に示す。

結果は、トランケート型アプタマーがＥｐＣＡＭに対する特異性及び感受性を維持したことを示す。

図６Ａは、ＥｐＣＡＭ陰性細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２に対するＥｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９の相互作用についての平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。図６Ｂは、ＥｐＣＡＭ陽性卵巣癌細胞株、ＨＥＹに対する、伸長Ｅｘ Ｅｐ７及びスクランブルＥｘ Ｅｐ７の相互作用についての平衡解離定数（Ｋ_D）の決定を示す。

これらの結果は、アプタマーＥｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９がＥｐＣＡＭ陰性細胞株に結合しなかったことを示す。

ｉｉ）インターナリゼーションアッセイ

各ＤＮＡ ＥｐＣＡＭアプタマーがインターナリゼーションされる能力は、共焦点顕微鏡によって確立された。ＨＴ２９、ＨＥＹ、Ｋ６５２及びＨＥＫ２９３Ｔを、共焦点マイクロアレイの調製のために、２４時間、８チャンバースライドで８×１０⁵細胞／ウェルで播種した。細胞をブロッキング緩衝液と共に６０分間インキュベートし、続いて結合緩衝液、及び２００ｎＭのＥｐＣＡＭアプタマー又はネガティブコントロールアプタマーを含有する結合緩衝液中に再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの最後の１０分間、細胞にビスベンズイミダゾール（Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（３ｍｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ）を添加した。アプタマー溶液を除去し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ ＦＶ１０ｉレーザー走査共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて可視化する前に、細胞をＰＢＳ中でそれぞれ５分間３回洗浄した。

図７は、ＴＹＥ６６５標識アプタマー（Ｅｐ７、Ｅｐ８及びＥｐ９）で染色した培養ＨＴ２９及びＨＥＹ細胞の共焦点画像の結果を示す。スケールバー＝１０μｍ。結果は、トランケート型アプタマーがＥｐＣＡＭ陽性細胞によってインターナリゼーションされたことを示す。

図８は、ＴＹＥ６６５標識アプタマー（Ｅｘ Ｅｐ７及びＳｃｒ Ｅｘ Ｅｐ７）で染色した培養ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ２９及びＨＥＹ細胞の共焦点画像を示す。結果は、伸長ＥＸＥｐ７はインターナリゼーションされたが、スクランブルされたＥｘ Ｅｐ７アプタマーはインターナリゼーションされなかったことを示す。

ｉｉｉ）ドキソルビシン負荷効率（ｌｏａｄｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の決定

ＤＯＸを含む、アントラサイクリンクラスの薬物は、ＤＮＡにインターカレーションした後、消失する蛍光特性を有する（Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５） ｌｌ Ｆａｒｍａｃｏ ｅｄｉｚｉｏｎｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ ４０（６）：３７７−９０）。ドキソルビシンの自然蛍光と、ＤＮＡ ＥｐＣＡＭアプタマーとインターカレートしたあとのその後の消失を、蛍光分光法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を介するドキソルビシンコンジュゲーションの程度の測定に使用した。コンジュゲーションプロセスは、異なるアプタマードキソルビシンモル比（０、０．０１、０．０４、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５及び０．６）を用いて検討し、蛍光プレートリーダーを用いて、遊離ドキソルビシンの標準曲線に基づいて分析した。

コンジュゲーションの前に、アプタマーを前述のように適用のために調製した。ＤＯＸは、その後、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．０５ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含む結合緩衝液中のアプタマーと組み合わせ、攪拌しながら（７５ｒ．ｐ．ｍ）１時間、オービタルミキサー／インキュベータ（Ｏｒｂｉｔａｌ ｍｉｘｅｒ／ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）（ＲＡＴＥＫ）で３７℃にてインキュベートした。次いで、コンジュゲートをＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−１０メディウムカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に通して、アプタマー：ドキソルビシンコンジュゲートを遊離ＤＯＸから分離した。ＤＯＸは、二本鎖ＤＮＡにインターカレートした後、消失する天然の蛍光を有するので、ＤＯＸのこの特性は、コンジュゲートアプタマーの二本鎖ステム領域中に挿入されたＤＯＸの量を決定するために利用された。カラム分離後、１５０μＬのアセトニトリルを添加することによりコンジュゲート産物からＤＯＸを抽出した。次いで、この溶液を２１，０００ｇで５分間遠心分離した。８０マイクロリットルの上清を除去し、蛍光強度を蛍光プレートリーダーで定量した。較正標準曲線を、既知の濃度のＤＯＸを用いて同じ条件下で調製した。

Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ３を用いてデータを分析し、特に断らない限り、データは平均値及び平均値の標準誤差（平均±ＳＥＭ）として報告した。

各アプタマー対ドキソルビシンのモル比を決定し、下記の表４に示す。

全長及びトランケート型アプタマーは、ドキソルビシンをインターカレートすることができた。

実施例３ コンジュゲートアプタマーの特徴付け
（ｉ）コンジュゲートアプタマー

ＥｐＣＡＭに対するアプタマーは、以前ＳｏｎｇＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８５：４１４１−４１４９によって生成されていた。本発明者の研究室で以前に特徴付けられたこれのトランケート型（Ｅｐ７と表記される、表２）は、特徴付けのために、３つの二重特異性アプタマーを産生するために抗ＴｆＲアプタマーとコンジュゲートするために使用された。二機能性アプタマーの配列を表２に示す。ＴｆＲ及びＥｐ７のそれぞれの結合ループをスクランブルした。Ｂｉ１はＴｆＲ１及びＥｐ７に基づき、Ｂｉ２はＴｆＲ２及びＥｐ７に基づき、Ｂｉ３はＴｆＲ３及びＥｐ７に基づいていた。

アプタマーとドキソルビシンとのインターカレーションを見越して、ＧＣ対の数を増加させるために、ステム領域においてわずかな変更がなされた。２つの元のアプタマーの形状がコンジュゲート中に保持されているかどうかを確認するために、ＶＩＥＮＮＡソフトウェアを用いて、二重特異性アプタマーの２Ｄ構造を再度決定した。

（ｉｉ）コンジュゲートアプタマー結合親和性の決定

文献に十分に記載されており、抗ＴｆＲアプタマーを用いたこの研究ですでに観察されているように、アプタマーの構成のわずかな変化でさえ、結合特性を変える可能性がある。コンジュゲートを生成するために元のアプタマーに成された、より実質的な変化が与えられた場合、ＴｆＲ及びＥｐＣＡＭ発現細胞の両方に対する結合親和性が逸脱した程度を決定することが重要であった。

アプタマーＢｉ１、Ｂｉ２及びＢｉ３の結合親和性を、ＴｆＲとの反応性を評価するためにｂＥｎｄ．３細胞を、ＥｐＣＡＭ特異性を決定するためにＨＥＹ細胞を、ネガティブコントロールとしてのＭＯＬＴ４細胞を用いて、フローサイトメトリーにより半定量的に決定した。３つの独立した結合アッセイを、３つの細胞株（ｂＥｎｄ．３、ＨＥＹ及びＭＯＬＴ４）全てに対し、これらのアプタマーについて実施した。

コンジュゲートアプタマーの結合曲線は、陽性細胞株の両方に対する特異的結合を明らかにした（図９Ａ〜Ｃ）。実際、コンジュゲートアプタマーの結合親和性は、より強くない場合、設計された単一アプタマーの結合親和性と類似していた（表５）。ｂＥｎｄ．３細胞に対する親和性を考慮すると、Ｂｉ２（図９Ｂ；ＫＤ＝３０５．５±１５２．６ｎＭ）は、それが基礎とした単一のアプタマーであるＴｆＲ２よりも有意にしっかりと結合していた（表５；ＫＤ＝５２４．７±１６１．３ｎＭ）。さらに、他の２つのコンジュゲートアプタマーは、同一のそれぞれの結合ループを共有する２つの抗ＴｆＲアプタマーの範囲内で結合親和性を示した。ＥｐＣＡＭ発現ＨＥＹ細胞に対して、Ｅｐ７アプタマーと同じ結合ループを含むコンジュゲートアプタマーは、以前記録されたものと類似の結合親和性を有していた（ＫＤ＝２４８．３±８２．１６ｎＭ）。対照的に、スクランブルされたＥｐＣＡＭ結合ループを有するＢｉ１は、はるかに弱い結合親和性を有していた（図９Ａ；ＫＤ＝９２１．２±２６９．７ｎＭ）。

コンジュゲートアプタマーの結合は、ＭＯＬＴ４陰性細胞株に対して観察されなかった。これは、これらの細胞に対する抗ＴｆＲアプタマーの以前の結果とは対照的であり、非特異的な結合を示した（図３）。これは、０ｎＭと１００ｎＭのアプタマー濃度の間に集団蛍光のシフトが観察されなかった点を明確にする（図９Ｄ〜Ｆ）。

（ｉｉｉ）細胞へコンジュゲートアプタマーインターナリゼーションの定量分析

抗ＴｆＲ単一アプタマーと同様に、観察された結合が表面付着ではなく細胞インターナリゼーションに起因することを確実にすることが必要であった。これは以前と同様の方法で行われた。４００ｎＭの濃度にて、ｂＥｎｄ．３、ＨＥＹ及びＭＯＬＴ４細胞へのコンジュゲートアプタマーのインターナリゼーションを、共焦点顕微鏡を用いて２時間のインキュベーションの経過時間にわたって可視化した。

共焦点顕微鏡により観察されるように、３つのコンジュゲートアプタマーは全て、ＥｐＣＡＭ陽性ＨＥＹ細胞株にインターナリゼーションすることが観察された。対照的に、アプタマーＢｉ２及びＢｉ３のみが、ＴｆＲ発現ｂＥｎｄ．３細胞に取り込まれた。また、アプタマーを取り込んだ細胞の内部には、点状の染色の分布が存在した。ＭＯＬＴ４ネガティブコントロールではインターナリゼーションは観察されなかった。

（ｉｖ）ＨＥＹ細胞株に対するコンジュゲートアプタマーのＥｐＣＡＭ特異性の決定

コンジュゲートアプタマーが２つの異なる標的に結合することが観察されたことを考慮すると、結合アッセイ又は共焦点顕微鏡法のいずれかからＨＥＹ細胞株に対して得られた結果が、ＥｐＣＡＭ結合によるものか、又はこれらの細胞株の任意のＴｆＲの存在によりよるものであるか、不明であった。実際、ＴｆＲの発現は、ヒト組織に広範囲に分布する（Ｈａｒｅｌ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（９）：ｅ２４２０２）。従って、マウス抗ＴｆＲアプタマーは、ＨＥＹ細胞と交差反応しないことを確実にすることも重要であった。これは、コンジュゲートアプタマーがＨＥＹ細胞株に対して示す特異的結合（図１０）及びインターナリゼーションが、アプタマーのＥｐＣＡＭ結合部分に起因し得ることを確認するであろう。これは、最もしっかりと結合する抗ＴｆＲアプタマー、ＴｆＲ３を用いる２つの方法によって行われた。フローサイトメトリーを介して結合曲線を作成し、細胞を共焦点顕微鏡で可視化した。

ＨＥＹ細胞株に対するＴｆＲ３の結合アッセイの結果は、明確に非特異的結合を示した（図１０）。この知見と一致して、アプタマーのインターナリゼーションは、これらの同じ細胞では検出されなかった。これらの２つの証拠は、コンジュゲートアプタマーのＥｐＣＡＭ結合特性における信頼性を提供する。

実施例４ インビトロ血液脳関門モデル
（ｉ）インビトロＢＢＢモデルの特徴付け

ＴｆＲの標的化のためのアプタマーを設計する目的は、それがＢＢＢ内皮単層を通過することを可能にすることであった。ＢＢＢを横切る物質の透過性を評価するための認識された方法は、このシステムのインビトロモデルを作製することである（Ｗｕｅｓｔ ＤＭ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２１２（２）：２１１−２１）。このように、内皮細胞の密着した単層を成長させる目的で、無血清培地中で、ｂＥｎｄ．３細胞を継代し、トランスウェルインサート上に播種した。このバリアの完全性は、記載されているように（Ｗｉｌｈｅｌｍ Ｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ ７１（１）：１１３−２８）、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによって評価した。トランスウェルインサートをヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡で画像化した。トランスウェルの画像は、低ＴＥＥＲ示度と一致して、細胞のパッチ状の被覆を示した。しかしながら、これにもかかわらず、膜を横切る細胞の被覆範囲は広範囲であった。

（ｉｉ）インビトロ血液脳関門モデルを通るコンジュゲートアプタマー透過性の決定

コンジュゲートアプタマーが脳転移の標的化に使用されるために必要とされる重要な特徴は、ＢＢＢを通過する能力である。インビトロ環境でこれを行う最良の方法は、これらのアプタマーがこの生理学的システムのモデルを通過できるかどうかを決定することである。従って、ＨＥＹ細胞をインビトロＢＢＢモデルの底部コンパートメントで共培養し、一晩増殖させた後、コンジュゲートアプタマー２μＭを上部コンパートメントで３時間インキュベートした。その後、ＨＥＹ細胞を共焦点顕微鏡により可視化した。

コンジュゲートアプタマーの２つ、Ｂｉ２及びＢｉ３がＨＥＹ細胞にインターナリゼーションすることが観察された（示さず）。これらは、ｂＥｎｄ．３細胞株への特異的結合を証明した同一の２つのアプタマーである。対照的に、ｂＥｎｄ．３内皮単層の他方側でインキュベートした後、ＨＥＹ細胞内でＢｉ１は観察されなかった。このアプタマーは、以前はＨＥＹ細胞にインターナリゼーションすることが観察されていたが、ｂＥｎｄ．３細胞はインターナリゼーションしていなかったことを考慮すると、興味深い観察である。これは、Ｂｉ１アプタマーがインビトロモデルを通過しなかった可能性を提供するものであり、従って、他の２つのアプタマーがＲＭＴを介して膜を横断したという示唆を支持する。

実施例５ インビボでの血液脳関門を通過するコンジュゲートアプタマー透過性の決定

蛍光標識したアプタマーＢｉ１（ネガティブコントロール）、及びＢｉ１のＥｐＣＡＭ結合部分に結合したアプタマーＢｉ３のＴｆＲ結合部分の組み合わせであって、３’末端に逆向きのｄＴと、５’末端にフルオロフォアを有する、配列５’−ＧＣ ＧＣＧ ＧＴＡ Ｃ ＣＧ ＣＧＣ ＴＡ ＡＣＧ Ｇ ＡＴ ＴＣＣ ＴＴＴ Ｔ ＣＣ ＧＴ−３’（配列番号１０）アプタマー６を、マウスに注射した。２ｎｍｏｌのアプタマー６を健常マウスの尾静脈に注射した場合、図１１Ａに示すように、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ ＩＩイメージングシステムを用いて、１０分間で、頭部領域においてシグナルが識別できた。ネガティブのアプタマーＢｉ１の蛍光シグナル強度は、ＥｐＣＡＭアプタマー６については６．８２×１０⁹及び１．２５×１０¹⁰であった。

マウスを３０分で安楽死させ、解剖した脳を画像化すると、ネガティブコントロールアプタマーＢｉ１を注射したマウスで観察されなかったシグナルとは対照的に、脳の周辺にはっきりとしたシグナルが見られた。これらの結果は、アプタマーが血液脳関門トランスサイトーシス剤として効果的に使用できることを示している。肝臓における高レベルのＴｆＲ発現は、鉄の捕捉及び貯蔵におけるこの受容体の特定の役割を示唆している。肝臓はトランスフェリン受容体を発現することが知られている。

実施例６ 脳におけるトランスフェリン／ＥｐＣＡＭアプタマーの取り込み

脳取り込みにおける、陰性トランスフェリン修飾カウンターパートに対する陽性トランスフェリン修飾アプタマーの利点を評価するために、４つの様々な構造（トランスフェリン＋／ＥｐＣＡＭ＋、トランスフェリン＋／ＥｐＣＡＭ−、トランスフェリン−／ＥｐＣＡＭ＋、トランスフェリン−／ＥｐＣＡＭ−）を有するアプタマーの生体内分布は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへ４０ｎｍｏｌ／Ｋｇの投与量で、これらの薬剤を単一の静脈注射の３０分後及び６０分後に調べた。

種々のアプタマーを以下のように設計した：

ＴＥＰＰ：トランスフェリン陽性、ＥｐＣＡＭ陽性アプタマーＢｉ３（配列番号３）
ＴＥＮＮ：トランスフェリン陰性、ＥｐＣＡＭ陰性アプタマーＢｉ１（配列番号１）
ＴＥＰＮ：トランスフェリン陽性、ＥｐＣＡＭ陰性アプタマー５’ＧＣ ＧＣＧ ＧＴＡ Ｃ ＣＧ ＣＧＣ ＴＡ ＡＣＧ Ｇ ＡＴ ＴＣＣ ＴＴＴ Ｔ ＣＣ ＧＴ３’
ＴＥＮＰ：トランスフェリン陰性、ＥｐＣＡＭ陽性アプタマー５’ＧＣ ＧＣＧ ＴＧＣ Ａ ＣＧ ＣＧＣ ＴＡ ＡＣＧ Ｇ ＡＧ ＧＴＴ ＧＣＧ ＴＣＣ ＧＴ３’

脳における蓄積に関して、トランスフェリン＋／ＥｐＣＡＭ＋の量は、３０分及び６０分において、カンターパートのトランスフェリン−／ＥｐＣＡＭ−（又はトランスフェリン−／ＥｐＣＡＭ＋）より、１２．２倍（又は３．１倍）及び１０．８倍（又は２．５倍）、それぞれ、統計的に有意に高かった（図１２及び図１３）。さらに、投与３０分後の脳におけるトランスフェリン＋／ＥｐＣＡＭ−取り込みのレベルが、トランスフェリン−／ＥｐＣＡＭ−の取り込みよりも有意に高かったが、グロス差異（ｇｒｏｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）は、注射１時間後のこれらの２つのグループ間に大きな差は見られなかった。これらのデータは、インビボでのライブイメージングによる、注入後１時間の、トランスフェリン−／ＥｐＣＡＭ−に対するトランスフェリン＋／ＥｐＣＡＭ＋アプタマーの脳内での持続的な保持と一致しており、トランスフェリン＋修飾アプタマーが少なくとも１時間、インビボに高濃度で脳内に保持され得ることを示している。まとめると、トランスフェリン＋修飾アプタマーは、脳における陰性トランスフェリン修飾アプタマーと比較して、良好な蓄積及び保持プロフィールを示し、このアプタマーが脳−血液障壁を克服するための有効な様式として開発され、脳へ標的とされた薬物送達のために新たな窓を開いた。

Claims (14)

1. ステム領域及びループ領域を構成し、トランスフェリンレセプター（ＴｆＲ）およびＥｐＣＡＭに結合する、二機能性アプタマーコンジュゲートであって、
   配列５’−ＧＣＧ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣＧＴＣ ＣＧＴ−３’（配列番号３）を含み、
   前記アプタマーコンジュゲートは３３〜１００塩基の配列長を有し、
   前記アプタマーコンジュゲートは、そのステム領域内に０、１、２、３、４または５個の置換を有する、アプタマーコンジュゲート。
2. ＥｐＣＡＭへの結合とは独立してＴｆＲに結合する、請求項１に記載のアプタマーコンジュゲート。
3. 配列５’−ＧＣＧ ＣＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＧＣＴ ＡＡＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＴＧＣＧＴＣ ＣＧＴ−３’（配列番号３）からなる、請求項１または２に記載のアプタマーコンジュゲート。
4. インビトロまたはインビボでアプタマー安定性を改善する１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲート。
5. 化学療法剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲート。
6. 前記化学療法剤がドキソルビシンであり、前記ドキソルビシンがアプタマーコンジュゲートの一方又は両方のステム領域にインターカレートされている、請求項５に記載のアプタマーコンジュゲート。
7. 前記アプタマーコンジュゲートが、約３００〜３４０ｎＭのＴｆＲに対する結合親和性（ＫＤ）および約２１０〜２２０ｎＭのＥｐＣＡＭに対する結合親和性（ＫＤ）を有する、請求項４〜６のいずれか１項に記載のアプタマーコンジュゲート。
8. ＥｐＣＡＭ発現細胞および／または癌幹細胞に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲート。
9. 前記ＥｐＣＡＭ発現細胞および／または癌幹細胞が、脳腫瘍細胞、または脳の外に起因する原発性腫瘍もしくは癌の脳腫瘍転移である、請求項８に記載のアプタマーコンジュゲート。
10. 毒素、放射性核種、化学療法剤もしくは造影剤から選択される成分または検出可能な標識に結合された請求項１〜８のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲートを含む抗癌剤または診断剤。
11. 対象における脳がん、脳腫瘍または脳の外に起因する原発性腫瘍の脳転移を治療または予防するのに使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲート、または請求項１０に記載の抗癌剤。
12. 治療上有効量の請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲート、または請求項１０に記載の抗癌剤を、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と共に含む組成物。
13. 脳がん、脳腫瘍または脳転移の分子イメージングに使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲート、または検出可能な標識に結合された請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲートを含む診断剤。
14. ｓｉＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムにカップリングされた、請求項１〜９いずれか一項に記載のアプタマーコンジュゲートを含む、送達剤。

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