KR20210041574A - 압타머-기반 car t-세포 스위치 - Google Patents

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bridge
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안나 미오덱
프레데릭 모울란
세실레 부쉐
레나우드 베일란트
필리프 비숍
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아라팅가 바이오 티엔피
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Abstract

키메라 항원 수용체 (CAR)-관련 면역치료요법의 사용 제어를 증진시키는 압타머-기반 스위치 기술이 제공된다. 압타머 기반 스위치는 링커를 통해 CAR-결합 압타머에 결합된 표적-결합 압타머를 함유하는 합성 브릿지 분자를 사용한다. CAR 및 상응하는 압타머 브릿지를 함유하는 시스템은 (i) 브릿지의 표적-결합 압타머를 선택함에 의해 임의의 목적하는 항원에 표적화될 수 있고, (ii) 상기 표적-결합 압타머를 변화시킴에 의해 하나의 표적으로부터 또 다른 표적으로 리다이렉팅될 수 있고; (iii) 시간 경과에 따라 브릿지에 대한 투여 프로토콜을 변경함에 의해 개별 환자의 변화하는 요구에 따라 투여될 수 있고; (iv) 신속하게 또는 점진적으로 가동 또는 중단으로 스위치될 수 있고; (v) 특이적 CAR 치료요법에 대한 동반 진단제로서 사용될 수 있고; (vi) 생체내 또는 생체외 CAR 발현과 통합될 수 있고; (vii) 비면역원성이고; (viii) 낮은 제조 비용을 갖는 면역치료요법 플랫폼을 제공한다.

Description

압타머-기반 CAR T-세포 스위치
키메라 항원 수용체 (CAR)는 단일쇄 가변 도메인 (scFv)을 활용하여 환자의 T-세포에 암 세포를 인지하고 사멸시키는 능력을 부여한다. 그러나, 초기 성공적인 적용에도 불구하고, CAR T-세포의 용도는 생체내 면역 반응을 제어하는데 있어서의 어려움 때문에 복잡해지고, 이는 사이토킨의 해로운 과도한 방출 및 목적하지 않은 독성을 유도할 수 있다. 추가로, 오프-표적 반응이 일어날 수 있고 종양에 의한 항원 회피는 변형된 항원 특이성을 갖는 후속 라운드의 CAR T-세포 치료요법에 대한 필요성을 초래할 수 있다. 따라서, 특이성을 증가시키기 위한 상호작용을 강화하거나, CAR을 새로운 항원으로 리다이렉트 (redirect)하거나, CAR T-세포 치료요법을 억제 또는 종결하기 위해 "오프" 또는 "킬 (kill)" 스위치를 생성하기 위한 전략을 개발할 필요가 있다.
스위치될 수 있는 CAR T-세포 접근법이 개발되어 조정가능한 분자 스위치의 환자로의 적용을 가능하게 하여 이는 CAT-T 세포와 표적 세포 간의 세포작용을 매개한다. 스위치의 부재하에, 어떠한 CAR-매개된 면역 반응이 일어나지 않는다. 예를 들어, 킬 스위치를 사용하여 CAR-T 세포를 제거하고 독성을 예방할 수 있다 (참조: Straathof et al., Di Stasi et al.). 또 다른 접근법은 소분자 스위치의 존재하에 연합된 분열된 키메라 수용체를 사용한다 (참조: Wu et al.). 항체-기반 스위치가 또한 개발되었고 이는 CAR과 표적 간의 상호작용을 매개한다 (참조: Tamada, et al., Urbanska, et al. (2012a), Urbanska et al. 2012b)). 항체 스위치 기술의 변형에서, 표적-특이적 항체는 CAR의 scFv 부분에 결합하는 펩타이드 네오-에피토프 (PNE)와 통합될 수 있다 (참조: Rodgers et al.). PNE는 내인성 에피토프와는 상이하고 모듈러 스위치 접근법을 가능하게 하여, 여기서, 새로운 스위치는 단일 PNE 및 항-PNE CAR과 상이한 표적-특이적 항체를 조합함에 의해 가공될 수 있다. 그러나, 상기 접근법은 여전히 항체 분자의 복합 가공을 요구하고 특히 scFv가 완전히 인간화되지 않은 경우 스위치에 대한 면역 반응의 가능성을 생성한다.
요약
본 발명의 기술은 압타머-기반 스위치 기술을 제공하고 이는 키메라 항원 수용체 (CAR)-관련된 면역치료요법을 수행하는 경우 고도의 제어를 생성한다. 이의 가장 기본적인 수준에서 본 발명의 기술의 압타머-기반 스위치 또는 압타머성 브릿지는 링커를 통해 CAR-결합 압타머에 결합된 표적-결합 압타머를 함유하는 합성 브릿지 분자를 사용한다. CAR 및 상응하는 압타머 브릿지를 함유하는 시스템은 (i) 브릿지의 표적-결합 압타머를 선택함에 의해 임의의 목적하는 항원에 표적화될 수 있고, (ii) 표적-결합 압타머를 변화시킴에 의해 하나의 표적으로부터 또 다른 표적으로 리다이렉팅될 수 있고; (iii) 시간 경과에 따라 브릿지에 대한 투여 프로토콜을 변경함에 의해 개별 환자의 변화하는 요구에 따라 투여될 수 있고; (iv) 신속하게 또는 점진적으로 가동 또는 중단으로 스위치될 수 있고; (v) 특이적 CAR 치료요법에 대한 동반 진단제로서 사용될 수 있고; (vi) 생체내 또는 생체외 CAR 발현과 통합될 수 있고; (vii) 비면역원성이고; (viii) 낮은 제조 비용을 갖는 면역치료요법 플랫폼을 제공한다.
본 발명의 기술은 세포 리다이렉팅 압타머 (예를 들어, 이특이적 또는 다가 압타머)를 제공하고, 이는 세포의 생체내 또는 생체외 유전자 변형을 위해서 뿐만 아니라 압타머-기반 CAR 면역치료요법 시스템에서 압타머 브릿지로서 사용될 수 있다. 본 발명의 기술의 압타머 브릿지, 세포, 키트 및 방법은 암 (예를 들어, 혈액 또는 비혈액, 개별 세포 또는 고형 종양), 자가면역 질환 (예를 들어. 관절염, 중증근무력증, 천포창), 신경염증 질환, 안과 질환, 신경변성 질환 (예를 들어, ALS, 헌팅톤 질환, 알츠하이머 질환), 신경근육 질환 (듀켄 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy), SMA), 감염성 질환 (예를 들어, HIV, HSV, HPV, HBV, 에볼라, 결핵, 크립토코커스), 및 대사 질환 (예를 들어, 1형 진성당뇨병)의 치료를 위한 면역치료요법으로서의 용도를 포함하는 광범위한 용도에 사용될 수 있다. 이들은 또한 이미지화, 세포 트래픽킹의 분석 및 새로운 면역치료요법의 연구 및 개발을 포함하는, 상기 면역치료요법에 사용하기 위한 진단제, 키트 및 방법을 제공하고, 줄기 세포 치료요법 (예를 들어, HSCT)과 조합되는 경우 예방을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "키메라 항원 수용체 세포" 또는 "CAR 세포"는 유전학적으로 변형된 세포 (예를 들어, T-세포, NK-세포, 단핵구, 또는 기타)이고, 이들은 스톡 (stalk) 또는 막관통 도메인을 통해 수용체 (예를 들어, CD3-TCR)의 세포내 도메인에 융합된 단일쇄 가변 도메인 (scFv) 항체를 발현하도록 생체외 또는 생체내 조작되어 상기 세포에게 하나 이상의 특이적 항원을 인지하고 이에 결합하고 세포 면역 반응을 활성화시키는 능력 (예를 들어, 암 세포를 사멸시키거나 바이러스-감염된 세포를 파괴하는)을 부여한다.
본원에 사용된 바와 같은, "항원성 상실" 또는 "항원성 회피"는 종양 항원의 하향조절 또는 억제성 리간드 (예를 들어, PD-L1, TIM3, LAG3)의 상향조절과 같은 면역치료요법에 대한 내성 또는 조정의 임의의 여러 기전을 언급할 수 있고, 이는 CAR-T 세포 부전, CAR 세포의 이의 표적 (예를 들어, 표적 부위)으로의 도달 실패, CAR의 항체 부분에 대한 면역력 (예를 들어, 특히 이것이 완전히 인간화되지 않은 경우 scFv에 대한 T-세포 반응), CAR-T 세포 적합성(즉, 기억 자가-재생을 위한 감소된 잠재력 및 증가된 탈진 경향), 또는 항원 스플라이싱 또는 돌연변이에 기여한다.
후보 압타머는 상이한 서열의 핵산 세트이고, 이로부터 목적하는 압타머가 선택된다. 후보 압타머의 공급원은 천연적으로 존재하는 핵산 또는 이의 단편, 화학적으로 합성된 핵산, 효소적으로 합성된 핵산 또는 이전 기술의 조합에 의해 제조된 핵산일 수 있다.
본 발명의 기술에 사용하기 위한 핵산은 예를 들어, DNA, RNA, 또는 XNA (제노 핵산 (xeno nucleic acid)) 분자일 수 있고, 이는 이의 임의의 화학적 변형을 포함하고 단일 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥 및 이중 가닥의 혼합물일 수 있다.
표적은 통상적으로 압타머에 결합하는 생물학적 실체의 성분인 구조적 유닛이다. 표적은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 폴리사카라이드, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 기질, 대사물, 약물, 영양물, 성장 인자 등과 같은 분자일 수 있다. 표적은 세포의 일부, 또는 T 세포, NK 세포, 단핵구, B-세포, 종양 세포, 또는 병리학적으로 변경된 (예를 들어, 바이러스 또는 다른 미생물에 의해 또는 유전자 재배열로 인해 변경된) 세포와 같은 세포일 수 있다. 표적은 또한 장기 또는 세포 기관일 수 있다.
결합 친화성은 서로 가역적으로 결합하는 리간드와 수용체와 같은 2개 이상의 구조물 간의 상호작용의 강도를 언급한다. 결합 친화성은 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)의 비율의 동력학적 평형의 척도이고, 임의의 공지된 방법에 의해 측정되거나 평가될 수 있고, 상기 방법은 예를 들어, 결합의 농도 의존성으로부터의 해리 상수 (Kd) 또는 결합 상수 (Ka)의 결정 또는 해리의 깁스 자유 에너지 (Gibbs free energy)(ΔGd)의 결정을 포함한다. 증가된 결합 친화성은 상호작용하는 구조물 (예를 들어, 리간드 및 수용체) 간의 보다 강한 분자간의 힘으로부터 생성되고 결합 부위에서 증가된 체류 시간을 초래한다. 보다 높은 친화성을 나타내는 리간드는 보다 높은 "결합" 속도 및/또는 보다 낮은 "해리" 속도를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화성은 완전한 수용체 활성이 보다 낮은 농도의 리간드로 성취되기 때문에 치료학적 제품에서 유리할 수 있다. 결합 친화성은 다가 구조물에서 개별 비-공유 결합 상호작용의 다중 친화성의 총체적 강도에 의해 결정될 수 있다. 다가 리간드의 전체 결합 친화성은 이의 개별 결합 친화성, 리간드와 수용체의 결합가 및 상호작용하는 구조물의 입체 배열에 의존한다. 그러나, 다량체 작제물의 전체 결합 친화성은 단지 개별 압타머의 개별 결합 친화성의 단순한 평균이 아니다. 다량체 구조물의 친화성에 영향을 미치는 인자들은 리간드와 수용체 간의 입체화학적 적합성, 이들 간의 접촉 면적의 크기 및 하전된 그룹과 소수성 그룹들의 분포를 포함한다.
안전성 프로필은 약물, 치료요법 또는 중재와 관련되고 상기 부작용의 가능성과 관련된 총체적 부작용을 언급한다. 보다 양호한 안전성 프로필은 적은 횟수 및/또는 적은 중증 부반응 및/또는 동일한 수준의 치료학적 이득과 관련된 부작용으로부터 비롯될 수 있다. 보다 양호한 안전성 프로필은 개선된 치료학적 지수(TI), 즉. 최소 유효량과 최대 관용성 용량 간의 보다 큰 안전성 윈도우와 관련될 수 있다.
면역 반응은 항원에 대해 특이적인 체액성 및/또는 세포 매개된 반응을 언급한다. 체액성 성분은 항원에 특이적인 항체의 생산을 포함할 수 있고, 세포 매개된 성분은 항원에 대한 지연형 과민성 및 세포독성 이펙터 세포의 생성을 포함할 수 있다. 면역 세포는 항원과의 직접적인 상호작용, 면역계의 다른 세포와의 상호작용, 및 방출 및/또는 사이토킨과의 반응에 의한 것을 포함하는, 다양한 방법을 통해 면역 반응에 관여한다.
면역계의 활성화 또는 자극은 면역 이펙터 세포, 예를 들어, 림프구, 대식세포, 수지상 세포, 천연 킬러 세포 (NK 세포) 및 세포독성 T 림프구 (CTL)와 같은 면역 이펙터 세포의 활성화에 의해 매개될 수 있다. 이것은 수지상 세포와 같은 항원 제공 세포의 활성화 및 성숙화에 의해 매개될 수 있다. 이것은 또한 예를 들어, 면역 관문 분자를 억제함에 의해, 억제 경로의 차단에 의해 매개될 수 있다.
도 1은 본 발명의 기술의 압타머 브릿지의 여러 구현예에의 도식을 보여준다.
도 2는 압타머 브릿지에 의해 매개되는 표적화와 함께 CAR 플랫폼의 생체내 발현을 사용한 CAR T-세포 치료요법에 대한 시스템 및 방법의 도식을 보여준다.
도 3은 본 발명의 기술에 따른 표적 리다이렉션 (redirection) 방법의 도식이다.
도 4는 펩타이드 네오항원 및 단량체 압타머의 서열의 목록이다.
도 5는 단량체 압타머의 일부 예측된 2차 구조물을 보여준다.
도 6은 압타머를 연결하기 위한 클릭 화학 반응에 대한 도식을 보여준다.
도 7a 및 7b는 항-PSMA (7a) 및 항-CD3 (7b) 압타머의 각각의 항원을 발현하고 발현하지 않는 세포로의 결합을 보여준다.
도 8a 및 8b는 단량체 및 이량체 (이특이적) 압타머의 아가로스 겔을 보여준다.
도 9는 혈청에서 RNA 압타머의 시간 과정을 보여준다.
도 10a 및 10b는 이특이적 압타머의 PSMA-양성 및 음성 세포로의 결합 친화성을 보여준다.
도 11a 및 11b는 이특이적 압타머의 CD3-양성 및 음성 세포로의 결합 친화성을 보여준다.
도 12는 PSMA- 양성 세포에 대한 이특이적 압타머의 세포독성을 보여준다.
도 13a는 여러 항-PNE RNA 압타머의 서열 정렬을 보여준다. 도 13b는 도 13a로부터 RNA 압타머 2개의 예측된 2차 구조물을 보여준다.
도 14a-14c는 어떠한 수용체, CD19 CAR 또는 PNE CAR을 발현하지 않는 세포 상의 항-CAR PNE 압타머의 결합을 보여준다.
도 15는 혈청에서 항-CAR PNE RNA 압타머의 안정성을 보여준다.
도 16은 CAR-PNE가 형질도입된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로의 항-CAR PNE 압타머의 결합을 보여준다.
본 발명의 기술은 CAR T-세포 치료요법과 같은 면역치료요법에 사용하기 위한 압타머-기반 스위치를 제공한다. 압타머 스위치는 CAR-발현 면역 세포와 표적 세포, 예를 들어, 암 세포 또는 병원체 세포 간의 물리적 브릿지로서 작용한다. 그러나, 압타머 스위치 또는 브릿지는 또한 면역 반응의 특이성 및 강도를 조절하기 위한 민첩하고 신속하게 조정가능한 도구로서 작용한다. 이들의 CAR-결합 및 표적-결합 기능은 둘 다 압타머에 의해 수행되기 때문에, 압타머 브릿지는 항체-기반 접근법으로는 성취될 수 없는 신속한 속도 및 저비용으로 시험관내 환자의 발달 필요성에 따라 신속하게 선택되고 조정될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 기술의 압타머 브릿지는 CAR, 예를 들어, 중합체-코팅된 바이러스 벡터 입자로터의 CAR을 암호화하는 벡터의 직접적인 주사, 및 선택된 면역 세포의 생체내 형질도입 (즉, 면역치료요법의 대상체 신체 내 형질도입) 및 CAR의 발현과 조합되어, 통상적인 생체외 형질도입 및 CAR T-세포의 확장과 비교하여 추가의 시간 및 비용 절감과 함께 진보된 면역치료요법을 성취할 수 있다.
세포 리다이렉팅 압타머 기술 (예를 들어, 이특이적 또는 다가 결합) 및 본 발명의 기술의 압타머 브릿지, 및 이들을 함유하는 시스템 및 키트는 자가성 또는 이종성 암 치료요법 및 면역치료요법을 포함하는, 다양한 응용에 사용될 수 있다. 세포 리다이렉팅 압타머 기술, 압타머 브릿지, 압타머-기반 CAR 면역치료요법 시스템, 키트 및 본 발명의 기술의 방법은 암 (예를 들어, 혈액 또는 비혈액, 개별 세포 또는 고형 종양), 자가면역 질환 (예를 들어. 관절염, 중증근무력증, 천포창), 신경염증 질환, 안과 질환, 신경변성 질환 (예를 들어, ALS, 헌팅톤 질환, 알츠하이머 질환), 신경근육 질환 (듀켄 질환, SMA), 감염성 질환 (예를 들어, HIV, HSV, HPV, HBV, 에볼라, 결핵, 크립토코커스), 및 대사 질환 (예를 들어, 1형 진성당뇨병)의 치료를 포함하는, 광범위한 면역치료요법에 사용될 수 있다. 이들은 또한 이미지화, 세포 트래픽킹의 분석 및 새로운 면역치료요법의 연구 및 개발을 포함하는, 상기 면역치료요법에 사용하기 위한 진단제, 키트 및 방법을 제공하고, 줄기 세포 치료요법 (예를 들어, HSCT)과 조합되는 경우 예방을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
압타머 브릿지는 암 또는 감염에 대해 다이렉팅된 세포-매개된 면역 반응과 같은 면역 반응의 품질 및 강도를 개선시킴에 의해 면역치료요법을 증진시킬 수 있다. 추가로, 압타머 브릿지를 사용하여 범용 CAR을 많은 상이한 표적으로 다이렉트할 수 있고 면역 반응을 상이한 표적으로 리다이렉트할 수 있다. 압타머 브릿지를 또한 사용하여 단순히 상이하게 표적화된 압타머 브릿지를 투여하거나 시간 경과에 따른 압타머 브릿지의 용량 또는 투여 스케줄을 조정함에 의해 면역 반응의 강도를 조정하거나, 반응을 가동시키거나 중단시킬 수 있다. 압타머 브릿지의 추가의 용도는 즉, 압타머 브릿지의 표적-결합 압타머를 억제성 리간드에 결합하는 압타머로 대체함으로써 상기 억제성 리간드를 CAR-결합 리간드로 전환시킴에 의해 PDL-1과 같은 억제성 리간드를 면역 자극 효과로 전환시키는 것이다.
본 발명의 기술에 따른 CAR 치료요법은 전형적으로 CAR-발현 세포를 면역치료요법이 필요한 대상체로 도입하여 개시한다. CAR 세포는 예를 들어, 대상체로부터 제거된 세포에 바이러스 벡터를 형질도입하거나 CAR이 세포 상에 발현되도록 하는, 플라스미드 또는 트랜스포존으로 이들을 형질감염시킴에 이어서 상기 세포를 배양 배지에 확장시키고 확대된 세포를 대상체에 도입, 예를 들어, 정맥내 주사에 의해 생체외 수득될 수 있다. 대안적으로, CAR을 암호화하는 바이러스 벡터, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 예를 들어, 정맥내 주사에 의해 대상체에게 투여될 수 있고, 상기 투여 즉시 CAR은 목적하는 면역 세포 (예를 들어, 자가성 또는 동종이계 T-세포, NK-세포, B-세포, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포)에서 발현된다. 상기 방법 중 어느 하나에서, CAR-발현 세포의 기준선이 대상체의 신체 내에 확립되면, CAR 세포는 표적이 CAR의 scFv 부분으로 결합함에 의해 활성화되는 경우 증식한다.
충분한 수의 CAR 세포를 함유하는 대상체로 적당한 압타머 브릿지의 투여는 브릿지의 CAR-결합 압타머의 CAR로의 결합시 브릿지의 표적-결합 모이어티에 의해 특정된 표적에 대한 면역 반응을 유발한다. 시간 경과에 따라 변화할 수 있는 수득한 면역 반응의 강도는 대상체내 CAR 세포 수, CAR 세포의 표적으로의 접근 및 표적에서 압타머 브릿지의 농도의 함수이다. 면역 반응의 강도는 투여되는 브릿지의 양을 증가시키거나 감소시킴에 의해 또는 투여되는 브릿지의 투여 간의 시간 간격을 감소시키거나 증가시킴에 의해, CAR 세포의 수를 조정하고/하거나 브릿지의 농도를 조정함에 의해 상향 조정되거나 하향 조정될 수 있다.
본 발명의 기술의 치료학적 방법에서, 대상체내 CAR 세포의 총양은 면역치료요법을 개시하기 위한 압타머 브릿지의 투여 전에 평가하고, 투여 프로토콜(예를 들어, 투여량, 투여 횟수, 및/또는 투여 간격)은 면역 반응의 목적하는 강도 및/또는 지속 기간이 생성되도록 디자인 (예를 들어, 알고리즘을 사용하여)된다. 면역 반응의 강도는 공지된 방법을 사용하여 (예를 들어, 환자로부터의 혈액 샘플 중 특정 활성화된 면역 세포의 수 및 유형을 정량하기 위한 형광성 활성화된 세포 분류 (FACS) 분석을 사용하여 또는 상기 샘플 중 특정 사이토킨의 수준을 결정함에 의해) 모니터링될 수 있다. 면역 반응이 너무 강하고 환자에 위험을 제공할 수 있는 경우, 상기 반응은 압타머 브릿지의 투여량 또는 횟수를 감소시킴에 의해, 이를 함께 중단함에 의해 또는 단일 CAR-결합 압타머 (압타머 브릿지의 CAR로의 결합을 붕괴시키는), CAR에 결합하고 압타머 브릿지의 결합을 붕괴시키는 펩타이드 또는 항체, 단일 표적-결합 압타머 (압타머 브릿지의 표적으로의 결합을 붕괴시키는) 또는 CAR 또는 표적 항원으로부터의 가용성 도메인 또는 에피토프를 포함하는 "킬" 스위치를 투여함에 의해 감소될 수 있다.
본 발명의 기술의 압타머 브릿지를 사용하여 CAR 세포를 상이한 표적으로 리다이렉트할 수 있다. 이것은 제1 표적에 의한 또는 제1 표적에 대한 약한 반응에 의한 항원 회피의 이벤트에서 유용할 수 있고, 상이하거나 추가의 표적의 추구를 필요로 한다. 방법의 하나의 구현예에서, 상이한 (예를 들어, 제2 또는 이후) 압타머 브릿지는 대상체에게 투여되고, 이는 동일하거나 유사한 CAR-결합 압타머를 갖지만 제1 브릿지와는 상이한 표적-결합 압타머를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 제1 표적에 직접적으로 (즉, CAR 스위치의 사용 없이) 표적화된 통상적인 CAR은 대상체내 세포 상에 발현되고 압타머 브릿지는 대상체에 투여되어 CAR 반응을 상이한 (제2 또는 그 이상) 표적으로 리다이렉트할 수 있고; 압타머 브릿지는 표적-결합 CAR에 특이적인 CAR-결합 압타머 및 표적-결합 압타머를 포함하고, 상기 2개의 압타머들은 링커에 의해 결합된다. 상기 접근법은 동일한 대상체에서 상이한 표적과 순차적으로 또는 동시에 수회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5회 이상) 사용될 수 있어 면역치료요법을 조정하거나 최적의 표적 또는 표적의 조합을 모색한다. 본 발명의 기술의 압타머 브릿지의 구현예는 대상체내 CAR 세포 또는 표적을 이미지화하거나 정량하는데 사용하기 위한 검출가능한 표지에 결합된다. 예를 들어, 브릿지는 PET 스캐닝과 함께 사용하기 위해, 링커에 또는 CAR-결합 압타머 또는 표적-결합 압타머에 부착된 18F 모이어티를 포함할 수 있다. 동일한 방법은 치료요법을 위한 압타머 브릿지에 사용되는 개별 압타머 (CAR-결합 또는 표적-결합)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 치료요법 개시 전에 또는 치료요법 동안에 CAR 세포를 정량하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 기술의 압타머 브릿지는 링커 모이어티에 의해 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된 2개 이상의 압타머를 함유한다. 2개 이상의 압타머는 이들 각각이 하나 이상의 압타머를 함유하는 CAR-결합 부분 및 표적-결합 부분을 형성한다. CAR-결합 압타머는 면역 세포, 예를 들어, T 세포에 발현되는 CAR에 결합하고 일부 구현예에서 면역 세포를 활성화시키지만 다른 구현예에서 (예를 들어, "킬" 스위치로서 작용하는 경우) 면역 세포를 활성화시키지 않는다. 표적은 면역치료요법의 의도된 표적, 즉, 제거를 위해 의도된 세포이다. 따라서, CAR-발현 세포 및 압타머 브릿지는 면역치료요법, 예를 들어, CAR-T 세포 치료요법에서 시스템으로서 함께 사용하기 위해 의도된다. 압타머 브릿지의 CAR 및 표적으로의 결합은 바람직하게 고친화성 결합이다. 표적은 단백질(예를 들어, 세포-표면 수용체 단백질), 세포, 소분자 또는 핵산일 수 있다. 표적은 바람직하게 표적 세포, 예를 들어, 암 세포의 표면 상에 위치하고 대상체의 다른 세포 (정상 세포) 상에서 발견될 수 있거나 발견되지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 표적은 종양 항원, 예를 들어, CD19, CD20, CD22, CD30, CD123, BCMA, NY-ESO-1, 메소텔린, PSA, PSMA, MART-1, MART-2, Gp100, 티로시나제, p53, ras, Ftt3, NKG2D 리강스(Ligangs), 루이스(Lewis)-Y, MUC1, SAP-1, 수르비빈 (survivin), CEA, Ep-CAM, Her2, Her3, EGFRvIII, BRCA1/2, CD70, CD73, CD16A, CD40, VEGF-a, VEGF, TGF-b, CD32B, CD79B, cMet, PCSK9, IL-4RA, IL-17, IL-23, 4-1BB, LAG-3, CTLA-4, PD-L1, PD-1, OX-40, 또는 돌연변이된 SOD이다. 압타머 브릿지의 성분 압타머는 또한 상기 표적의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 감염성 제제의 항원, 예를 들어, gag, 연전사효소, tat, HIV-1 외피 단백질, 포자소체 (circumsporozoite) 단백질, HCV 비구조적 단백질, 헤마글루티닌이고; 압타머 브릿지는 또한 상기 표적의 조합에 특이적으로 결합할 수 있다.
바람직한 구현예에서, CAR-결합 압타머 또는 압타머들은 펩타이드 네오-에피토프 (PNE), 즉, 항-PNE CAR에 대해 친화성을 갖는 CAR의 세포외 도메인으로의 특이적 결합을 위해 선택된다. PNE는 대상체의 신체 내에 존재하지 않는 에피토프이기 때문에, 항-PNE CAR을 발현하는 면역 세포는 내인성 생분자에 의해 활성화되지 않지만, 면역 세포에 대한 "가동" 스위치로서 작용하고 목적하는 항원(들) 또는 상기 항원(들)을 보유하는 세포 유형(들)을 향해 CAR-발현 세포를 표적화하는 압타머 브릿지의 대상체로의 투여를 대기한다. CAR 발현 면역 세포의 면역 활성화 및 생체내 확장은 PNE를 함유하는 펩타이드 또는 단량체 형태의 브릿지의 CAR-결합 압타머 또는 표적-결합 압타머 - 이중 어느 하나는 표적에 의한 CAR-발현 면역 세포의 활성화를 종결시킨다 - 의 대상체로의 투여에 의해 중단될 수 있다.
PNE는 숙주의 프로테옴에서 발견되지 않는 (예를 들어, 인간 프로테옴에서 발견되지 않는) 임의의 펩타이드 에피토프일 수 있고, 이에 대한 항-PNE CAR이 수득될 수 있다. 바람직한 PNE의 예는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)로부터의 GCN4 전사 인자의 펩타이드 단편 (NYHLENEVARLKKL, 서열번호 1)이다. 고친화성 (Kd = 5.2 pM)을 갖고 52SR4 단일쇄 항체를 포함하는 CAR 결합 GCN4는 로저스 (Rodgers) 등에 의해 기재된다. 추가로, CAR 및 상응하는 압타머 브릿지와 함께 사용하기에 적합한 PNE는 다음을 포함한다: (i) 이에 결합하고 문헌 (참조: Clin. Vaccine Immunol. 17(11): 1708-1717)에 기재된 항체와 쌍을 형성하는, 스타필로코커스 장독소 B의 N-말단 15-량체 펩타이드 ESQPDPKPDELHKSS (서열번호 2); (ii) 이에 결합하고 문헌 (참조: Protein Expr. Purif. 35(1): 84-92)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 이. 콜리 마이코톡신인 데옥시니발레놀; (iii) 문헌 (참조: Biomed. Res. Int. 2018; 2018: 5809028)에 기재된, 이에 대한 항체와 쌍을 형성하는, HPV-16 단백질 E5; (iv) 이에 결합하고 문헌 (참조: Protein Expression and Purification 86 (2012) 75-81)에 기재된 랍비 바이러스 단백질 및 scFv; (v) 이에 결합하고 문헌 (참조: Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1134-1141)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 인플루엔자 A 매트릭스 단백질; (vi) 이에 결합하고 문헌 (참조: Viral Immunol. 2018 May 30)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, HBV의 전구-S2 단백질의 아미노산 134-145 (PRVRGLYFPAGG, 서열번호 3); (vii) 문헌 (참조: J. of Virological Methods 257 (2018) 73-78)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 오리 간염 바이러스 1형의 VP3 펩타이드; (viii) 문헌 (참조: Appl Microbiol Biotechnol. 2017 Dec;101(23-24):8331-8344)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 소 헤르페스 1의 당단백질 D로부터의 펩타이드 (MEESKGYEPP, 서열번호 4); (ix) 이에 결합하고 문헌 (참조: Virus Research 167 (2012) 370-379)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 사우쓰 아프리칸 테리토리스 2 (SAT2) 구제역 바이러스의 VP1 단백질의 아미노산 159를 포함하는 펩타이드; (x) 이에 결합하고 문헌 (참조: Veterinary Microbiology 147 (2011) 162-169)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로부터의 OmpD의 펩타이드 (DRTNNQVKA, 서열번호 5); (xi) 이에 결합하고 문헌 (참조: Journal of Biotechnology 102 (2003) 177/189)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, 이. 콜리 기원의 이소페리틴의 펩타이드; (xii) 이에 결합하고 문헌 (참조: Arch. Virol. (2008) 153:1075-1084)에 기재된 scFv 와 쌍을 형성하는, 그라페빈 리프롤(grapevine leafroll)-연관된 바이러스 3 코트 단백질의 N 말단에 위치한 펩타이드 (AQEPPRQ, 서열번호 6); (xiii) 이에 결합하고 문헌 (참조: Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2004, 36(8): 541-547)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, SARS-CoV의 N 단백질의 펩타이드 (PTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQ, 서열번호 7); (xiv) 이에 결합하고 문헌 (참조: J. Virol. 2004 Apr; 78(7): 3792-3796)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, HIV Tat 단백질의 아미노산 1 내지 15를 함유하는 펩타이드; 및 (xv) 이에 결합하고 문헌 (참조: J. Hepatology 37 (2002) 660-668, J Virol 1994;68:4829-4836, and Arch Virol 1997;142:601-610)에 기재된 scFv와 쌍을 형성하는, HCV NS3의 헬리카제 도메인의 아미노산 1363 내지 1454로부터의 펩타이드.
본 발명의 기술의 압타머 브릿지와 쌍을 형성할 수 있는 범용 CAR의 다른 예는 문헌 (참조: J. Autoimmun. 2013 May. 42 :105-16; Blood Cancer J. 2016 Aug, 6(8): e458; Oncotarget. 2017 Dec 12, 8(65): 108584-108603; Oncotarget 2017 May 9, 8(19): 31368-31385; Oncotarget 2018 Jan 26, 9(7): 7487-7500; 및 WO2016030414)에 기재되어 있다.
압타머 브릿지의 연결 모이어티는 단순히 개별 압타머 간의 하나 이상의 공유 결합일 수 있거나 합성 또는 천연적으로 존재하는 중합체, 예를 들어, 탄화수소, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 핵산, 펩타이드, 탄수화물, 또는 지질일 수 있다. 특정 구현예에서, 연결 모이어티는 펩타이드가 아니다. 특정 구현예에서, 압타머 브릿지는 펩타이드가 부재이고 폴리펩타이드 및 단백질이 부재이다. 연결 모이어티는 또한 나노스케일 구조 (예를 들어, 중합체, 단백질, 나노입자, 나노튜브, 나노결정, 나노와이어, 나노리본, 나노결정, 마이셀, 또는 리포좀), 또는 마이크로스케일 구조(예를 들어, 마이크로비드 또는 세포), 또는 보다 큰 구조 (예를 들어, 고체 지지체)의 형태를 취할 수 있다. 바람직하게, 연결 모이어티는 생분해될 수 있는 중합체이다. 연결 모이어티는 선형, 분기된, 사이클릭 또는 이들 구조의 조합인 중합체일 수 있다. 연결 모이어티는 또한 덴드리머 구조, 또는 허브 또는 성상형 구조 (예를 들어, 2개 이상의 압타머가 결합된 코어 구조)를 위한 골격으로서 작용할 수 있다. 비-공유 연합을 위해, 2개 이상의 개별 압타머는 압타머 간에 직접적으로 또는 연결 모이어티와의 상호작용을 통한 비-공유 상호작용을 통해 결합될 수 있다. 비-공유 상호작용은 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합, 이온 결합, 소수성 결합, 반데르 발스 상호작용 또는 이들의 조합일 수 있다. 고친화성 결합 쌍, 예를 들어, 스트렙타비딘-비오틴을 사용하여 압타머 브릿지에서 압타머를 비공유적으로 연결할 수 있다.
링커 또는 연결 모이어티는 공유적으로 또는 비공유적으로 단량체성 압타머 유닛을 함께 연결하는 임의의 화학적 모이어티일 수 있다. 링커는 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 탄수화물을 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있다. 링커는 세포 수용체, 리간드 또는 지질을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 링커는 치환된 또는 비치환된 알킬쇄 또는 환 구조와 같은 탄화수소 쇄 또는 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 또는 변형되거나 비변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나 이들로 이루어질 수 있다. 링커는 단일 공유 결합일 수 있거나 하나 이상의 이온 결합, 수소 결합, 소수성 결합 또는 반데르 발스 상호작용을 포함할 수 있다. 링커는 디설파이드-브릿지, 헤파린 또는 헤파란 설페이트-유래된 올리고사카라이드 (글리코소아미노글리칸), 화학 가교-링커, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르 또는 트리아졸을 포함할 수 있다. 링커는 효소에 의해 절단될 수 있어 개별 압타머의 방출 및/또는 압타머 브릿지에 의한 CAR-표적 상호작용의 종결을 가능하게 한다. 상기 링커는 순 양성, 음성 또는 중성 전하를 가질 수 있다. 링커는 다량체 작제물에서 개별 단량체 압타머 유닛의 기능성 성질의 보존을 보장하고 CAR 및 표적으로의 결합을 촉진시키거나 이들의 상호작용을 촉진시키기 위해 요구되는 바와 같이 가요성이거나 강성일 수 있다. 링커는 5 내지 20개 글라이신 및/또는 세린 잔기의 중합체와 같은 가요성 부분을 포함할 수 있다. 링커는 또한 글루타메이트, 알라닌, 라이신 및/또는 류신의 중합체와 같은 강성의 한정된 구조를 함유할 수 있다. 링커는 힌지 부분 또는 스페이서 부분을 포함할 수 있다. 링커는 치환된 또는 비치환된 C2-C50 쇄 또는 환 구조, 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (예를 들어, 헥사에틸렌글리콜), 또는 변형되거나 비변형된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 링커는 헤파린 또는 헤파란 설페이트-유래된 올리고사카라이드 (글리코소아미노글리칸), 화학적 가교-링커, 펩타이드, 폴리펩타이드, 하이드라존, 티오에테르 또는 에스테르를 포함할 수 있다.
C2-C50 링커는 하나 이상의 에틸렌 글리콜 유닛 -O-(CH2CH2O)-; 하나 이상의 1,3-프로판 디올 유닛; 아민, 아미드; 또는 티오에테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 임의로 에테르 연결 (예를 들어, 하나 이상의 알킬렌 글리콜 유닛)을 함유하는 2 내지 50개 탄소 원자 (포화되거나 불포화된, 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭), 0 내지 10개 아릴 그룹, 0 내지 10개 헤테로아릴 그룹 및 0 내지 10개 헤테로사이클릭 그룹의 골격을 포함할 수 있다. 각각의 골격 탄소 원자는 독립적으로 비치환될 수 있거나 (즉, 단지 -H 치환체를 포함하는) C1 내지 C3 알킬, -OH, -NH2, -SH, -O-(C1 내지 C6 알킬), -S-(C1 내지 C6 알킬), 할로겐, -OC(O)(C1 to C6 알킬), 및 -NH-(C1 내지 C6 알킬)로부터 선택되는 하나 이상의 그룹으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 C2-C20 링커, C2-C10 링커, C2-C8 링커, C2-C6 링커, C2-C5 링커, C2-C4 링커, 또는 C3 링커이고, 여기서, 각각의 탄소는 상기된 바와 같이 독립적으로 치환될 수 있다.
특정 구현예에서, 개별 압타머를 연결하는 임의의 중재 연결 모이어티 없이, 예를 들어, 이온 결합, 수소 결합, 소수성 결합, 반 데르 발스 상호작용 또는 이의 혼합을 통해 매개되는 압타먼 간에 비-공유 결합이 있다. 단일 다량체 압타머 작제물은 또한 특정 압타머를 연결하는 중재 링커 모이어티를 통한 공유 결합, 및 압타머 간에 다른 결합 부위에서 중재 링커 모이어티가 없는 비-공유 결합의 혼합을 사용할 수 있다.
링커는 임의로 하나 이상의 관능기를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 온도 및/또는 pH에 민감성이고, 이는 상기 링커가 형태를 변화시키거나 온도 및/또는 pH의 예비-디자인된 범위에서 절단됨을 의미한다.
압타머 브릿지의 CAR-결합 부분 및 표적-결합 부분의 각각은 단일 압타머를 포함할 수 있거나 2개 이상의 동일하거나 동일하지 않은 압타머 유닛을 포함할 수 있다. 2개 이상의 동일한 압타머 또는 동일하지 않지만 동일한 표적에 결합하는 압타머의 사용은 특히, 소정의 표적 분자의 다중 카피물을 소유한, 세포와 같은 표적에 대해 상이하게 제공되는 동일한 표적의 결합의 협력 또는 결합을 통해 결합 친화성을 크게 증진시킬 수 있다. 동일한 단량체 압타머는 완전히 동일한 뉴클레오타이드 서열 (100% 동일한)을 가질 수 있거나, 이들은 약 99% 동일한, 약 98% 동일한, 약 97% 동일한, 약 96% 동일한, 약 95% 동일한, 약 94% 동일한, 약 93% 동일한, 약 92% 동일한, 약 91% 동일한, 또는 약 90% 동일한, 또는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 가질 수 있다.
압타머 브릿지의 CAR-결합 부분 및 표적-결합 부분 각각은 동일하지 않거나 동일하거나 상이한 표적에 결합하는 2개 이상의 개별 압타머를 포함할 수 있다. 동일하지 않은 압타머는 구조, 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 결합 특이성 또는 결합 친화성에서 상이할 수 있다. 상기 브릿지는 표적 상에 2개 이상의 상이한 부위, 예를 들어, 단백질의 상이한 에피토프 또는 표적 세포의 상이한 표면 단백질 또는 상이한 CAR과 같은 표적 상의 2개 이상의 상이한 부위에 특이적으로 결합하여 표적에 대한 친화성 및/또는 특이성을 증가시키거나 상이한 표적 세포 및/또는 상이한 CAR-발현 세포에 결합할 수 있다. 상이한 표적 또는 상이한 CARS는 상이한 표적 세포 및/또는 상이한 CAR-발현 세포를 포함하는 작용의 조합을 통해, 목적하는 치료학적 효과를 최대화하기 위해 선택될 수 있다.
CAR 세포의 기능은 이들을 표적 세포 상의 2개 이상의 항원, 예를 들어, 소정의 종양 세포 상에 2개 이상의 항원, 예를 들어, CD19 및 CD22, CD19 및 CD123, 또는 CD19 및 BCMA에 다이렉팅함에 의해 개선될 수 있다. 상기 접근법은 종양 항원 상실을 극복하고 반응의 개선된 지속성을 성취하는 것을 도와줄 수 있다. 압타머 브릿지는 표적-결합 부분에서 2개 이상의 압타머를 함께 연결함에 의해 동일한 표적 세포 상에 CAR 및 2개 이상의 항원을 인지하도록 가공될 수 있다. 상기 접근법은 동시에 2개의 종양 관련 항원 수용체를 발현하도록 T 세포를 가공하지만 항체의 이중 표적 제한 초과로 연장하고 항체-기반 CAR 스위치 보다 저렴한 비용 및 보다 큰 가요성을 제공하는 것과 유사하다.
본 발명의 기술의 압타머 브릿지 작제물은 면역치료학적 조성물에 사용될 수 있다. 상기 조성물의 구현예는 압타머 브릿지 및 부형제를 포함한다. 압타머 브릿지는 다른 분자와 연합될 수 있거나 리포좀, 마이크로- 또는 나노입자, 수용체- 또는 세포-표적화된 분자와 같은 구조, 또는 취득, 분포 및/또는 흡수를 원조하는 경구, 국소 또는 다른 제형과 연합될 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머 브릿지는 캡슐화되거나, 접합되거나 치료학적 제제 전달 비히클과 연합된다. 일부 구현예에서, 치료학적 제제 전달 비히클은 유전자 전달 비히클, 예를 들어, 바이러스 벡터이거나, 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 임의의 유형의 적합한 벡터, 예를 들어, 발현 벡터 또는 플라스미드일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 바람직한 구현예에서, CAR-암호화 벡터는 먼저 CAR 발현의 제1 및 초기 기준선으로서 대상체에 투여되고, 일부 구현예에서, CAR 세포 확장은 표적에 대한 면역 반응을 활성화시키기 위해 대상체에게 압타머 브릿지를 투여하기 전에 대상체에서 확립된다. CAR 발현 및 임의로 CAR-발현 세포의 확장은 예를 들어, 표지된 형태로 CAR-결합 압타머 (예를 들어, 압타머 브릿지의 CAR-결합 부분과 같은)를 투여함에 이어서 말초 혈액 세포에서 결합된 표지를 결정하거나 신체내 표지의 분포를 결정함에 의해 대상체에서 검출되고/되거나 정량될 수 있다.
압타머 브릿지의 성분 압타머는 압타머 구조 또는 서열에 대한 임의의 목적하는 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 후보물 압타머의 하나 이상의 리보스 또는 데옥시리보스 모이어티에 도입된 치환을 포함할 수 있다. 상기 변형은 후보 서열의 하나 이상의 포스페이트 모이어티에서의 치환을 포함할 수 있다. 상기 변형은 후보 압타머의 하나 이상의 퓨린 또는 피리미딘 모이어티에서의 치환 또는 후보 압타머의 천연 뉴클레오타이드의 비천연 또는 희귀 천연 뉴클레오타이드로의 치환을 포함할 수 있다. 화학적 변형은 뉴클레오타이드간 포스페이트의 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트로의 대체, 비오틴, 아지드 또는 알킨 그룹의 첨가와 같이, 뉴클레오타이드 간 포스페이트 결합에 도입될 수 있다. 화학적 변형은 불소, LNA (고정된 핵산) 유닛, 또는 2'-O-알킬 변형과 같은 리보스 환의 C2' 위치에서 도입될 수 있다. 압타머의 하나 이상의 뉴클레오시드는 2'-위치 당 변형 (예를 들어, 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로 (2'-F), 또는 2'-0-메틸 (2'-OMe))으로부터 선택된 변형, 사이토신 엑소사이클릭 아민에서의 변형, 뉴클레오타이드간 연결 변형 또는 5-메틸-사이토신을 포함할 수 있다. 압타머는 3' 말단에서 3' 캡, 5' 캡, 및/또는 역위 데옥시티미딘을 포함할 수 있다. 2-티오우리딘 (s2U), 슈도우리딘 (Ψ), 및 디하이드로우리딘 (D)과 같은 희귀 뉴클레오타이드, 또는 펩타이드 핵산 (PNA), 모르폴리노, 고정된 핵산 (LNA), 글리콜 핵산 (GNA), 또는 트레오스 핵산 (TNA)과 같은 비천연 뉴클레오타이드는 통상적으로 존재하는 뉴클레오타이드를 치환할 수 있다. 비천연 핵산 (제노 핵산 (XNA))이 또한 포함될 수 있다.
표적에 대한 압타머를 제조하거나 선택하기 위한 임의의 적합한 방법을 사용하여 압타머 브릿지의 성분 압타머를 수득할 수 있다. 예를 들어, 압타머는 대수적 농축에 의한 리간드의 시스템적 전개 (SELEX)에 의해 동정될 수 있다. SELEX는 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제5,270,163호에 기재되어 있다. 간략하게, SELEX는 표적과 접촉된 다양한 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 다수의 핵산 (즉, 후보 압타머 서열)으로 개시한다. 미결합된 핵산은 압타머-표적 복합체를 형성하는 것들로부터 분리된다. 압타머-표적 복합체는 이어서 해리되고, 핵산은 증폭되고, 결합, 분리, 해리 및 증폭 단계는 목적하는 바와 같은 많은 사이클을 통해 반복하여 표적에 대해 점진적으로 보다 높은 친화성의 압타머 집단을 수득하였다. 선택 및 증폭 사이클은 결합 친화성에서 어떠한 유의적 개선이 사이클의 추가의 반복에 대해 성취되지 않을 때까지 반복될 수 있다.
분리 및 증폭 사이클은 단일 압타머가 동정되기 전에 중단될 수 있다. 상기 경우에, 압타머 집단은 동정되고, 이는 서열, 구조 또는 압타머와 표적의 결합을 가능하게 하는 모티프에 관한 유의적 정보를 제공할 수 있다. 상기 후보 압타머의 집단은 또한 압타머의 어느 부분이 표적 결합을 위해 중요하지 않음을 알려줄 수 있다. 상기 정보는 이어서 동일한 표적으로의 다른 압타머의 생성을 가이드할 수 있다. 따라서, 생성된 압타머는 새로운 라운드의 SELEX에 대한 인풋 (input)으로서 사용되어, 잠재적으로 보다 양호한 결합 친화성 또는 관심 대상의 다른 특징을 갖는 압타머를 수득할 수 있다.
일부 구현예에서, 후보 압타머 브릿지와 같은 다량체 압타머 작제물을 함유하는 후보 압타머 서열이 생성되고, 이는 이어서 다량체 작제물로서 추가 라운드의 선택에 적용된다. 다량체 후보 압타머 작제물은 연결 모이어티와 함께 개별 후보 압타머 모이어티를 연결하고 임의로 하나 이상의 라운드의 SELEX에 대한 인풋으로서 상기 작제물을 사용함에 의해 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 개별 압타머는 독립적으로 하나 이상의 라운드의 SELEX를 통해 선택되고 최종적으로 연결 모이어티와 함께 연결된다. 따라서, 다량체 압타머 작제물 뿐만 아니라 단량체 압타머의 다량체화는 SELEX 과정들 전, 과정들 동안에 또는 과정들 후 수행될 수 있다.
압타머 브릿지의 성분 압타머를 선택하기 위해, 선택은 표적 세포 상의 표적에 결합하는 압타머와 비교하여 CAR과 결합하는 압타머에 대해 상이하게 수행될 수 있다. 표적 세포에 결합하는 압타머의 선택은 후보 압타머를 온전한 표적 세포, 재조합 세포, 병원체 세포, 바이러스-유사 입자, 또는 정제된 표적 단백질 또는 펩타이드 에피토프와 연합함에 의해 또는 표적 세포 또는 항원 표면 단백질을 함유하는 재조합 세포로부터의 막 제제와 연합함에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 항-PNE CAR에 결합하는 압타머의 선택은 PNE의 존재 및 부재하에 세포 상에서 발현되는 항-PNE CAR과 후보 압타머를 접촉시킴에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 상기 방법에 따라, 항-PNE CAR에 대해 목적하는 결합 친화성을 갖는 압타머는 PNE의 부재하에 CAR로의 결합이 PNE를 함유하는 펩타이드를 첨가함에 의해 대체될 수 있는 것들이다. 그러나, 압타머는 또한 PNE 결합 부위와 상이한, 예들 들어, 이에 인접한 CAR의 영역으로부터의 펩타이드를 사용하여 선택될 수 있고 상기 방식으로 선택된 압타머는 PNE에 의해 대체될 수 없지만 항-PNE CAR에 대해 높은 친화성 결합을 제공할 수 있다. 추가로, 성공적인 면역치료요법을 촉진시키기 위해, CAR을 발현하는 T 세포와 같은 CAR-발현 세포의 활성화는 압타머 선택 공정 동안에 모니터링되어야만 한다. 상기 목적을 위해, 후보 CAR-결합 압타머의 선택은 후보 표적 결합 압타머와 함께 압타머 스위치에 설치된 후보 CAR-결합 압타머를 사용하여 수행될 수 있다.
압타머 브릿지의 성분 압타머는 임의의 목하는 길이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 성분 압타머는 적어도 약 15개 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 압타머는 최대 약 100개 뉴클레오타이드를 포함한다. 압타머 브릿지의 길이는 브릿지를 통해 상호작용하는 세포 간의 거리를 결정할 수 있다. 이와 같이, 브릿지의 길이는 바람직하게 약 70 내지 약 200 옴스트롱, 또는 약 70 내지 약 150 옴스트롱, 또는 약 100 내지 약 170 옴스트롱, 또는 약 120 내지 약 150 옴스트롱 범위이다.
기술은 임의의 목적하는 결합 친화성을 갖는 압타머를 동정하거나 생성하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 선택된 압타머는 고친화성 (특이적) 결합에 대해 약 1 pM 내지 약 10 nM, 또는 저친화성 결합에 대해 약 100 nM 내지 약 10 μM의 표적 결합에 대한 Kd를 갖는다. 일부 구현예에서, 압타머는 약 1 pM 내지 약 10 μM; 약 1 pM 내지 약 1 μM; 약 1 pM 내지 약 100 nM; 약 100 pM 내지 약 10 μM; 약 100 pM 내지 약 1 μM; 약 100 pM 내지 약 100 nM; 또는 약 1 nM 내지 약 10 μM; 약 1 nM 내지 약 1 μM; 약 1 nM 내지 약 200 nM; 약 1 nM 내지 약 100 nM; 약 500 nM 내지 약 10 μM; 또는 약 500 nM 내지 약 1 μM의 Kd를 갖는다. 일부 구현예에서, 압타머 브릿지 내 성분 압타머의 결합 친화성은 단량체 후보 압타머의 친화성 보다 4 내지 50배 높다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적에 대한 압타머 브릿지의 성분 압타머의 친화성은 브릿지, 브릿지에 포함되는 성분 압타머 또는 링커 내 다량체와 정도를 변경함에 의해 미세 조정될 수 있다. 특정 구현예에서, 브릿지의 CAR-결합 부분 및/또는 표적-결합 부분은 다가이고, 이는 이것이 CAR 또는 표적 상에 동일하거나 상이한 부위에 결합하는 2개 이상의 개별 압타머를 함유함을 의미한다. 다가 압타머 작제물은 CAR 또는 표적에 대해 보다 큰 결합 특이성 및/또는 보다 높은 결합 친화성의 이점을 제공한다. 다량체 압타머의 결합 친화성은 다량체 복합체의 결합이 개별 결합 부위 중에 양성 협력 또는 양성 알로스테리즘을 나타낼 수 있기 때문에 단일 압타머에 대한 것보다 훨씬 높을 수 있다. 다량체 압타머 브릿지 부분에서 결합 부위를 주의깊게 선택하고 조합하는 능력은 해롭거나 독성 효과를 제한하고 효과적인 치료 효과를 증진시킴에 의해 안전성 프로필을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 압타머 브릿지의 압타머는 또 다른 화합물, 예를 들어, 비오틴-아비딘 또는 폴리에틸렌 글리콜와 같은 또 다른 화합물과 복합체화함에 의해 안정화되고/되거나 다량체화된다. 일부 구현예에서, 압타머는 고체 지지체를 사용하여 합성된다.
본원에 기재된 압타머 브릿지는 증식 또는 감염 질환을 예방하거나 치료하기 위해 유용하다. 본 발명의 하나의 양상은 압타머 브릿지 또는 압타머 브릿지를 포함하는 면역치료학적 제형 또는 치료학적 제제 전달 비히클을 투여함에 의해 암 또는 감염을 예방하거나 치료하는 방법이다.
본 발명은 또한 압타머 브릿지 또는 압타머 브릿지를 포함하는 면역치료학적 제형 또는 치료학적 제제 전달 비히클을 투여함에 의해 대상체에서 암 또는 감염 질환에 대한 면역 반응을 유도하거나 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 CAR을 발현하는 면역 세포를 이에 대한 면역 반응 또는 증진된 면역 반응이 요구되는 표적 세포와 특이적으로 연합하는 방법을 제공한다. 표적 세포 상에 CAR 및 분자 표적 둘 다에 대한 결합 특이성을 갖는 압타머 브릿지의 투여는 CAR-발현 면역 세포의 활성화 및 표적 세포에 대한 면역 반응의 개시 또는 증진을 유도한다.
실시예
실시예 1. PSMA 및 CD3에 특이적인 이특이적 압타머의 제조.
A10 RNA 압타머 (서열번호 8)는 인간 전립선-특이적 막 항원 (PSMA)에 대해 선택되고 siRNA에 대한 전립선 특이적 전달 제제로서 사용되는 39 뉴클레오타이드-길이의 서열이다 (참조: McNamara et al. 2006 - Dassie et al. 2009).
CELTIC_1s, CELTIC_19s 및 CELTIC_코어는 DNA 압타이머(서열번호 9, 10 및 11)이고, ARACD3-3700006 및 ARACD3-0010209는 모두 인간 CD3에 대해 선택된 RNA 압타이머 (서열번호 12 및 13)이다. 이들 DNA 또는 2'-데옥시-2'-플루오로-티미딘-변형된 RNA (2'F-RNA) 압타머는 표준 고체 상 포스포라미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 단일 가닥 올리고스로서 베이스클릭 (baseclick) (Neuried, Germany)으로부터 구입하였다. 항-CD3 압타머는 동시자극 항-CD28 항체와 조합되는 경우에도 및 항-CD3 모노클로날 항체와 같지 않게 사이토킨 분비 또는 표면 마커 발현을 활성화시키지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
A10 압타머는 후속 트리아졸 뉴클레오타이드 간 이량체화를 위해 이의 3'-말단에서 아지드 그룹으로 변형시켰다. 비오틴은 압타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합된 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 A10 압타머의 5'-말단에 첨가하였다. Cy5-표지된 버젼의 A10은 또한 합성하였다. CELTIC_1s, CELTIC_19s, CELTIC_코어, ARACD3-3700006 및 ARACD3- 0010209는 후속적 트리아졸 뉴클레오타이드간 이량체화를 위한 이들의 5' 말단에서 알킨 그룹으로 변형시켰다. 분자량, 순도 및 통합성은 HPLC-MS로 입증하였다. A10 항-PSMA RNA 압타머의 친화성 및 특이성은 PSMA 양성 및 PSMA 음성 세포에 대해 평가하였다 (도 7a).
항-PSMA A10 및 항-CD3 압타머는 제조업자의 지침에 따라 올리고2-클릭 키트 엘 (Oligo2-Click kit L) (baseclick, Neuried, Germany)을 사용하여 45℃에서 60분 동안 수행된 구리-촉매된 클릭 반응에 의해 이종이량체화하였다. 반응 생성물은 30분 동안에 100 V에서 1 X TBE 완충액 (Invitrogen)에서 이동된 3% 아가로스 겔 상에서 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔은 바이오-래드(Bio-Rad) 이미지화 시스템을 사용하여 가시화하였고 상기 결과는 도 8a 및 8b에 나타낸다. 이량체 압타머에 상응하는 겔 슬라이스는 겔로부터 절단 제거하고 핵산은 25 mM NaCl-TE 완충액에서 수동 용출에 의해 8℃에서 72시간 동안 추출하였다. 이특이적 압타머 이량체는 표준 나트륨 아세테이트 침전에 의해 회수하고, 멸균수에 재현탁하고 사용때까지 -20 ℃에서 저장하였다.
실시예 2. PSMA에 특이적인 압타머 A10의 기능적 안정성.
A10 RNA 압타머의 안정성은 5% FBS 또는 FBS 단독을 함유하는 듈베코 포스페이트-완충 식염수 (DPBS)에서 측정하였다. 비오티닐화된 압타머는 5분 동안 85℃에서 변성시키고 이어서 즉시 빙 블록 상에서 5분 동안 4℃로 냉각시켰다. 이어서 압타머는 5%의 FBS가 보충된 DPBS에서 또는 순수 FBS에서 2 μM의 최종 농도로 희석하였다. 샘플은 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 37℃에서 항온처리하고; 대조군 샘플은 37℃에서 항온처리 없이 새롭게 제조된 압타머를 함유하였다. 이어서 100 nM 스트렙타비딘-PE는 각각의 용액에 첨가하고 압타머는 PSMA-양성 LNCaP 세포 (인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1740)로 항온처리하였다. 5% FBS를 함유하는 DPBS 완충액에서 또는 순수 FBS에서 압타머 A10의 반감기는 이어서 37℃에서 항온처리 시간의 함수로서 형광성-양성 세포수의 변화를 기준으로, YL-1 채널 상에서 유동 세포측정을 사용하여 결정하였다. 이들 측정 결과는 도 9에 나타낸다. 5% 혈청을 함유하는 DPBS 완충액에서 항온처리된 압타머 A10은 24시간 동안 안정하였다. 순수 혈청에서 시험되는 경우, 결합 활성의 절반은 항온처리 처음 2시간 이내에 상실되었다.
실시예 3. 항-PSMA x 항-CD3 이특이적 압타머의 세포 상에 발현된 표적에 대한 친화성 및 특이성의 결정.
항-PSMA x 항-CD3 이특이적 압타머의 세포 상에 발현된 표적 단백질에 대한 친화성 및 특이성은 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 이들 연구는 SELEX 완충액에서 비오티닐화된 RNA/DNA 압타머 또는 5%의 FBS가 보충된 DPBS 완충액에서 RNA/RNA 압타머로 항온처리함에 의해 CD3-양성 Jurkat (급성 T 세포 백혈병 인간 세포주 - ATCC TIB-152), CD3-음성 Ramos (버킷 (Burkitt) 림프종 인간 세포주 - ATCC CRL-1596), PSMA-양성 LNCaP (인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1740) 및 PSMA-음성 PC-3 (인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1435) 세포에 대해 수행하였다. 세포는 사용전에 10% FBS (Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지 (Gibco Invitrogen)에서 배양하였다. 실험 전에, Jurkat, Ramos, LNCaP 및 PC-3 세포 (2.5×105 세포/웰)는 96웰 플레이트에 씨딩하고 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 버리고 펠렛화된 세포는 37℃에서 예비 가열된 200 μL의 SELEX 또는 DPBS-5% FBS 완충액으로 2회 세척하였다. 각각의 세척 단계에 이어서 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였다. 압타머는 5분 동안 85℃에서 변성시키고 즉시 5분 동안 4℃의 빙 블록 상에 위치시켰다. 시험 샘플은 후속적으로 2개의 상이한 농도 범위: 3, 10, 30,100 및 300 nM (CD3 결합 검정) 및 30, 100 및 300 nM (PSMA 결합 검정)에서 희석시킴에 이어서 각각의 용액에 100 nM 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘 (스트렙타비딘-PE, eBioscience)을 각각의 용액에 첨가하였다. Jurkat, Ramos, LNCaP 및 PC-3 세포는 압타머 희석물 (100 μL/웰) 중에 재현탁시키고 5% CO2 습화된 대기에서 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 대조군으로서, 세포는 CD3 모노클로날 항체 (PE-표지된, OKT3 인간 항-CD3, Invitrogen), PSMA 모노클로날 항체 (Alexa Fluor 488-표지된, GCP-05 인간 항-PSMA, Invitrogen), PE-스트렙타비딘 또는 추가의 시약이 없는 각각의 완충액으로 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포는 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하고 미결합된 서열을 갖는 상등액을 버렸다. 펠렛화된 세포는 SELEX 또는 DPBS-5% FBS 완충액 (200 μL/웰)으로 세척하고 2회 원심분리하여 모두 약하게 및 비-특이적으로 부착된 서열을 제거하였다. 세포는 이어서 5% CO2 습화된 대기에서 37℃에서 1 mg/mL 연어 정자 DNA 용액 (100 μL/웰)으로 세척하였다. 30분 후, 연어 정자 용액은 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하여 제거하고 세포는 추가로 SELEX 또는 DPBS-5% 완충액 (200 μL/웰)으로 2회 세척함에 이어서 원심분리하였다. 부착된 DNA 또는 RNA 서열을 갖는 Jurkat, Ramos, LNCaP 및 PC-3 세포는 이어서 고정화 (BD CellFIX 용액 #340181)시키고 형광성-양성 세포는 YL-1 채널 상에서 유동 세포측정 (AttuneNXT; Invitrogen, Inc.)에 의해 계수하였다.
PSMA 양성 세포에 대한 결합 연구의 결과는 도 10a 및 10b에 나타낸다. 3개의 RNA/DNA 압타머 (A10 x CELTIC_1s, A10 x CELTIC_19s, A10 x CELTIC_코어) 및 2개의 RNA/RNA 압타머 (A10 x ARACD3-3700006 및 A10 x ARACD3-0010209)는 A10 단량체 압타머를 사용하여 분석하였다. 비교를 위해, 시험된 시약의 PSMA-음성 PC-3 세포로의 결합을 또한 측정하였다. PSMA-양성 LNCaP 세포의 용량-의존성 결합은 최고 시험된 농도에서 신호의 포화에 도달하는 것 없이 A10으로 관찰하였다. 신호의 강도는 항체 대조군에 대한 것만큼 강하였다. A10 단량체의 PC-3 세포로의 잔여 결합은 단지 최고 시험된 농도에서 관찰되었다. 모든 이특이적 PSMA x CD3 압타머는 A10 단량체에 대해 유사한 결합 성질을 나타냈지만 PSMA 음성 세포에 대한 잔여 결합이 감소됨으로써 표적-양성 세포에 대해 개선된 특이성을 갖는다. 각각의 시험된 농도에 대해, 이특이적 압타머의 신호 강도는 A10 단량체에 대해 측정된 것 보다 우수하였고, 이는 이종이량체화가 친화성을 개선시킴을 시사한다.
또 다른 실험에서, 동일한 압타머의 CD3-양성 Jurkat 및 CD-3 음성 Ramos 세포로의 결합을 조사하였다. 도 11a 및 11b를 참조한다. 예상된 바와 같이, A10 압타머는 이들 2개의 세포주에 결합하지 않았다. 항-CD3 단량체의 Ramos 세포로의 잔여 결합은 단지 최고 시험된 농도에서 관찰되었다. 모든 이특이적 PSMA x CD3 압타머는 유사한 용량-의존성 결합을 나타냈지만 CD3-음성 세포로의 잔여 결합이 강하게 감소됨으로 표적-양성 세포에 대해 보다 우수한 특이성을 가졌다. 각각의 시험된 농도에 대해, 이특이적 압타머의 신호 강도는 항- CD3 단량체에 대해 측정된 것 보다 우수하였고, 이는 이종이량체화가 친화성을 저하시킴을 시사한다.
종합해보면 이들 결과는 이종이량체화 후, 상이한 표적에 대해 선택된 압타머의 결합 성질이 별도로 평가되는 경우 입체 장애로 인해 파괴되지 않음을 시사한다. 선택된 파트너에 의존하여, 각각의 표적에 대한 특이성 및 친화성은 심지어 이량체화시 개선될 수 있다.
실시예 4. 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시 PSMA 및 CD3을 표적화하는 이특이적 압타머의 결합.
결합 친화성 측정은 BIAcore T200 장비 (GE Healthcare)를 사용하여 수행하였다. 압타머와 CD3 및 PSMA 단백질 간의 상호작용을 분석하기 위해, 비오티닐화된 압타머의 300 공명 유닛은 제조업자의 지침 (GE Healthcare)에 따라 시리즈 S 센서 칩 상에 고정화시켰다. DPBS 완충액은 전개 완충액으로서 사용하였다. 상호작용은 30 μl/min의 유속에서 "단일 동력학 사이클" 방식으로 및 상이한 농도의 인간 CD3 ε/γ, CD3 ε/δ, IgG1 Fc 및 PSMA (Acro Biosystems)를 주사함에 의해 측정하였다. 사용된 최고 압타머 농도는 300 nM이었다. 다른 농도는 3배 희석에 의해 수득하였다. 상호작용의 모든 동력학 데이터는 BIAcore T200 평가 소프트웨어를 사용하여 평가하였다.
단량체 및 이특이적 압타머에 대한 KD 값의 비교는 이량체화가 이의 특정 표적에 대해 각각의 서브유닛의 결합 성질을 붕괴시키지 않음을 보여준다. PSMA 및 CD3 ε/γ의 동시 결합은 또한 10 μl/min의 유속에서 수동 주사 방식으로 및 포화 농도에서 제1 표적의 용액에 이어서 포화 농도에서 제2 표적의 용액을 주사함에 의해 기록할 수 있다. 역위 서열을 갖는 제2 주사가 수행된다. 서열 둘 다에서, 동일한 강도의 반응을 유도하는 각각의 주사는 이특이적 압타머의 아암 둘 다가 제2 표적에 결합할 수 있고 제1 항원에 대한 결합 부위가 점유됨을 지적한다. 표적 용액의 주사 둘 다에 응답하는데 실패한 단량체는 이특이적 압타머가 동시에 표적 둘 다에 결합할 수 있음을 지적한다.
실시예 5. PSMA 및 CD3에 특이적인 이특이적 압타머의 생활성.
세포독성 검정은 자극되지 않은 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 상에서 수행하였다. 새롭게 제조된 PBMC는 건강한 공여자로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다 (Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes). 혈액을 DPBS로 희석시킨 후, PBMC는 FICOLL 밀도 구배 (FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.077 GE Healthcare)로 분리하고, DPBS로 2회 세척하였고, RPMI-1640 배지 (Gibco Invitrogen)에 재현탁시켜 5x106 세포/ml의 세포 밀도를 수득하였다. 이들 PBMC는 이펙터 세포로서 사용하였다.
LNCaP 표적 세포는 세포 배양 배지에서 37℃에서 30분 동안 2 μM 칼세인 AM (Trevigen Inc, Gaithersburg, MD, USA)으로 표지시켰다. 칼세인 AM 플루오로크롬은 생존 LNCaP 세포 내부에 포집되고 리다이렉팅된 용해시에만 방출되는 염료이다. 세포 배양 배지에서 2회 세척 후, 5x105 세포/ml의 세포 밀도는 RPMI-1640 배지에서 조정하고 50,000 세포의 100 μl 분취액을 검정 반응 당 사용하였다. 37℃/5% CO2에서 표준 반응은 4시간 동안 지속하였고 200 μl의 총 용적에서 5x104 세포 칼세인 AM-표지된 표적 세포, 5x105 PBMC (1:10의 E/T 비율) 및 1 μM에서 20 μl의 이특이적 압타머 용액을 사용하였다. 세포독성 반응 후, 항온처리 배지에서 방출된 염료는 형광성 판독기 (VarioSkan Lux, ThermoFisher, Waltham, MA, USA)로 정량하였고 세포독성 화합물이 부재인 대조군 반응 및 형광성 신호가 전체 용해된 세포에 대해 결정된 반응 (여기서, 압타머는 제조원(Chemometec, Allerod, Denmark)으로부터 구입된 A100 시약으로 대체되었다)으로부터의 형광 신호와 비교하였다. 이들 판독을 기준으로, 특이적 세포독성은 하기의 수학식에 따라 계산하였다: [형광성 (샘플) - 형광성 (대조군)]/[형광성(총 용해) - 형광성 (대조군)] x 100.
10:1의 단일 E:T 비율로 압타머 100 nM의 존재하에 4시간 항온처리 후 수득된 세포독성 검정의 결과는 도 12에 나타낸다. 부재 내지 약한 특이적 세포 사멸 활성 (<10%)은 PSMAxCD3 이특이적 RNA/DNA 압타머로 관찰되었다. 보다 우수한 특이적 세포독성은 LNCaP 세포의 40-50%의 사멸을 유도한 RNA/RNA 압타머 A10 x ARACD3-3700006 및 A10 x ARACD3-0010209로 측정하였다. CD3 결합 모이어티가 없는 대조군 단량체 A10은 임의의 세포독성을 유도하지 않았다.
이들 결과는 가공된 압타머 스위치가 이들의 세포용해 기구를 리다이렉트하고 특정 세포 집단을 제거하도록 이펙터 T 림프구를 표적 세포로 동원할 수 있음을 시사한다.
실시예 6. 항-CAR PNE 압타머.
라이브러리 및 프라이머
초기 RNA 라이브러리 주형 및 프라이머는 단일 가닥 DNA로서 IDT (Coralville, IA, USA)에 의해 합성하였다: 5'-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-(N20)-TTTCTGCAGCGATTCTTGTTT-(N10)-GGAGAATGAGGAACCCAGTGCAG-3', 5'-TAATACGACTCACTATAGGGCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3' (정배향 프라이머), 5'-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3' (역배향 프라이머). 5'- 및 3'-불변 프라이머 영역에 상보적인 2개의 짧은 "차단" 서열 (IDT로부터 구입함)을 합성하여 2차 구조에 대한 프라이머의 효과를 최소화하였다: 5'-ATCACCGACTGCCCATAGAGAGG-3' (정배향 차단 서열), 5'-CTGCACTGGGTTCCTCATTCTCC-3' (역배향 차단 서열). 라이브러리의 불변 중심 영역에 상보적인, 추가의 비오티닐화된 "포획" 서열은 또한 IDT에 의해 합성하였다: 5'-비오틴-GTC-PEG-6 스페이서-CAAGAATCGCTGCAG-3'. 모든 재료는 250 nmole 스케일로 주문되었고 탈염 정제를 거쳤다.
RNA 압타머 선택을 위한 RNA 라이브러리는 최종 적용에서 보다 큰 안정성을 위해 2'플루오로- (2'F-) 피리미딘으로 변형시켰다. T7 프라이머는 티타늄 (Titanium) Taq DNA 폴리머라제 (Clontech; Mountain View, CA, USA)를 사용한 프라이머 확장을 위해 라이브러리 주형 서열과 조합하였다. 프라이머-연장된 재료는 이어서 Durascribe® T7 전사 키트 (Epicentre; Madison, WI, USA)를 사용하여 전사하고, 8M 우레아와 함께 변성 폴리아크릴아미드 (Sequel NE 시약, 파트 A 및 파트 B) 상에서 정제하였고, 이는 제조원 (American Bioanalytical (Natick, MA, USA))으로부터 구입하였다. 선택 동안에 라이브러리는 제조업자의 프로토콜에 따라 SuperScript IV 역전사 효소 (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 역전사시키고 제조사 (Clontech)로부터 티타늄 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시켰다. 선택 동안에, 라이브러리는 하기의 PCR 프로토콜 (95℃에서 60초의 초기 HotStart 활성화와 함께 95℃에서 10초, 60℃에서 30초)을 사용하여 증폭시켰다. RNA 라이브러리는 이어서 Durascribe® T7 전사 키트를 사용하여 전사하였고 폴리아크릴아미드 겔 (PAGE) 상에서 정제하였다. 4℃에서 밤새 동안 정제 라이브러리 회수 후 겔 용출 완충액은 0.5 M NH4OAc, 1 mM EDTA (둘 다 제조사(Teknova)로부터 구입함), 0.2% SDS (제조사 (Amresco)로부터 구입함), pH 7.4로 제조하였다.
RNA 압타머 선택
RNA 라이브러리 스크리닝은 용융-오프 접근법을 사용한 6라운드의 선택으로 수행하였다. 선택의 라운드 1-6은 세포 표면 상에서 펩타이드 네오-에피토프 (PNE)에 대해 다이렉팅된 GCN4(S25R14) CAR (키메라 항원 수용체)을 발현하는 안정한 HEK293T 세포주 (인간 배아 신장 - ATCC CRL-1573) 상에서 그리고 음성 선택 단계 (세포-SELEX)를 위해 항-CD19 CAR을 함유하는 안정하게 형질도입된 HEK293T 세포를 사용하여 수행하였다. HEK293T 세포주는 아메리칸 타입 세포 콜렉션 (American Type Cell Collection)으로부터 수득하였고 10% FBS (Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco Invitrogen)이 보충된 DMEM 배지 (Gibco Invitrogen) 중에서 배양하였다. 모든 선택은 10% 혈청 매트릭스가 보충된 DMEM 배지에서 수행하고 SELEX 라운드 각각은 하기의 단계를 포함하였다: 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 상에 RNA 라이브러리의 고정화, 역 선택, 표적을 사용한 항온처리, 표적을 인지한 서열의 역전사, PCR 증폭, 및 RNA로의 전사. 각각의 라운드 전, 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드의 분취액 (MyOne 스트렙타비딘 T1 Dynabeads™, 전형적으로 1 pmole의 비오티닐화된 재료는 모든 20 μg의 Dynabead™와 함께 사용하였고, 양은 요구되는 엄중도에 따라 다양함)을 200 μL의 PBS-T (0.01% Tween 20의 최종 농도, pH 7.4) 세척 완충액으로 3회 사전에 세척하였다. 추가로, 표적 및 역 표적 세포는 트립신 처리로 수거하였고, 5,000 x g에서 원심분리하여 펠렛화하고, 200 μL의 DPBS 완충액 중에 재현탁시키기 전 DPBS 완충액으로 2회 세척하고; 라운드 당 사용되는 세포의 수는 표 1에 나타낸다. RNA 라이브러리는 혈청 없이, 프라이머-차단 서열 및 포획 서열 둘 다의 라이브러리 몰량 2회와 함께 DMEM 배지에서 재폴딩하였다 (90℃에서 1-분 변성, 60℃에서 5분 어닐링, 이어서 23℃에서 5분). 이것을 수행하여 압타머의 2차 구조에 대한 불변 프라이머 영역의 효과를 최소화하고, 라이브러리가 스트렙타비딘-비오틴 결합 상호작용을 통한 자기 비드에 의해 포획되도록 하고 압타머의 말단을 엑소뉴클레아제로부터 보호하였다.
재폴딩 및 프라이머 차단 후, 라이브러리는 실온에서 15분 동안 항온처리함에 의해 자기 비드 상에 포획하였다. 자기 비드는 이어서 용액으로부터 분리하고 37℃에서 200 μL의 선택 완충액으로 3회 세척하여 임의의 잔류하는 PBS-T 및 비특이적으로 결합된 라이브러리 종을 제거하였다. 이어서 고정화된 RNA 라이브러리를 갖는 자기 비드를 30분 동안 37℃에서 200 μL의 106 역-세포 제제에서 역 선택 항온처리를 거쳐 자기 비드로부터 비-특이적 서열을 방출시켰다. 이어서 비-특이적 라이브러리 구성원을 버리고 자기 비드는 시간 과정 (37℃에서 DPBS에서 7분, 자기 분리를 위해 3분, 상등액을 버리고 상기 공정을 반복) 과정 동안 200 μL의 선택 완충액으로 7분 동안 6회 세척하여 비특이적 라이브러리 구성원이 잔류하여 양성 선택 단계 동안에 응답할 수 있는 가능성을 감소시켰다. 양성 선택은 라운드 1 내지 4 동안에 60분, 라운드 5-6 동안 30분 동안 37℃에서 200 μL의 양성 세포 제제와 자기 비드 RNA 라이브러리의 항온처리 및 병행 평가 (표 1에서 세포 계수)로 이루어졌다. 양성 선택이 완료되면, 표적을 인지하는 서열을 함유하는 상등액은 자기 비드로부터 분리하고 회수하였다. 이어서 상등액은 제2 자기 분리를 거쳐 자기 비드가 완전히 제거되었음을 확실히한다. 표적화된 HEK293T CAR PNE 세포는 5,000 x g에서 원심분리하여 펠렛화하고 200 μL의 DPBS 완충액으로 1회 세척하여 약하게 연합된 압타머 종을 제거하였다. 라이브러리는 70 ℃에서 열 변성에 의해 세포로부터 회수하였다. 모든 라운드에서 회수된 라이브러리는 MPC 시약 (Lucigen Corp, Middleton, WI, USA), 에탄올 침전, 및 샘플의 농축과 함께 단백질 침전을 거치고 8M 우레아와 함께 10% 변성 PAGE로 정제하였다. 이어서 라이브러리는 제조업자의 지침에 따라 SuperScript IV 역전사 효소를 사용하여 역전사시키고, Titanium® Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 증폭시키고, 제조업자의 지침에 따라 Durascribe® T7 전사 키트를 사용하여 전사하였다. 전사 생성물은 이어서 8M 우레아와 함께 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 정제하였다. 겔 슬라이스를 절개하고, 겔 용출 완충액 중에서 4℃에서 밤새 용출시키고, RNA 라이브러리의 농도는 NanoDrop-1000 상에서 260 nM에서 흡광도를 측정함에 의해 계산하였다. SELEX 공정의 연속 라운드 동안에, RNA 라이브러리의 농도 및 표적 세포 수는 점진적으로 감소하였다. 추가의 병행 평가 및 "크로스 오버 적합성 시험"을 수행하여 선택 후 생물정보 분석 동안에 양호한 압타머 후보의 동정을 촉진시켰다.
Figure pct00001
압타머 후보물은 MiniSeq Mid 아웃풋 (150 사이클) 시스템 (Illumina)을 사용한 차세대 서열 분석에 의해 선택하였다. 여러 압타머는 추가의 시험을 위해 선택하였다. 상기 목적을 위해, 2'-데옥시-2'-플루오로-티미딘-변형된-RNA 압타머는 표준 고체 상 포스포라미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 단일 가닥 올리고스로서 제조사 (Eurogentec-Kaneka (Liege, Belgium))로부터 구입하였다. 비오틴은 압타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합된 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 압타머의 5'-말단에 첨가하였다. 분자량, 순도 및 통합성은 HPLC-MS로 입증하였다. 이들 압타머의 핵산 서열은 도 13a에 나타낸다.
실시예 7. 인간 세포 상에 발현된 표적에 대한 항-CAR PNE 압타머의 친화성 및 특이성의 결정.
세포 상에 발현된 표적 단백질에 대한 ARAA-00100001, ARAA-05200001, ARAA-0060095, ARAA-01300011 및 ARAA-01700001 압타머의 친화성 및 특이성은 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 이들 연구는 5%의 FBS가 보충된, DPBS 완충액에서 비오티닐화된 압타머로 항온처리함에 의해 HEK293T, HEK293T-CAR CD19 (CD19 항원에 대해 다이렉팅된 CAR를 암호화하는 렌티바이러스 벡터가 형질도입된 HEK293T 세포주) 및 HEK293T-CAR PNE (PNE 펩타이드에 대해 다이렉팅된 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 HEK293T 세포주) 세포에 대해 수행하였다. 세포는 사용전에 10% FBS (Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco Invitrogen)이 보충된 DMEM 배지 (Gibco Invitrogen)에서 배양하였다. 실험 전에, 세포(2.5×105 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 씨딩하고 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 버리고 펠렛화된 세포는 37℃에서 예비 가열된 200 μL의 DPBS-5% FBS 완충액으로 2회 세척하였다. 각각의 세척 단계에 이어서 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였다. 압타머는 5분 동안 85℃에서 변성시키고 즉시 5분 동안 4℃의 빙 블록 상에 위치시켰다. 서열은 후속적으로 2개의 상이한 농도 범위: 30,100 및 300 nM (5개 압타머 후보물의 1차 시험) 및 30, 50, 75 및 100 nM (ARAA-00100001 및 ARAA-01700001을 사용한 염색 반복)로 희석시키고 이어서 100 nM의 피코에리트린-표지된 스트렙타비딘 (스트렙타비딘-PE, eBioscience)을 각각의 용액에 첨가하였다. 세포는 압타머 희석물 (100 μL/웰) 중에 재현탁시키고 5% CO2 습화된 대기에서 30분 동안 37℃에서 항온처리하였다. 대조군으로서, 세포는 PNE 펩타이드 (Alexa Fluor 488-표지된, Provepharm, Marseille, France), 스트렙타비딘-PE (eBioscience) 또는 추가의 시약이 없는 각각의 완충제로 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포는 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하고 미결합된 서열을 갖는 상등액을 버렸다. 펠렛화된 세포는 DPBS-5% FBS 완충액 (200 μL/웰)으로 세척하고 2회 원심분리하여 모두 약하게 및 비-특이적으로 부착된 서열을 제거하였다. 세포는 이어서 5% CO2 습화된 대기에서 37℃에서 1 mg/mL 연어 정자 DNA 용액 (100 μL/웰)으로 세척하였다. 30분 후, 연어 정자 용액은 2분 동안 2500 rpm에서 원심분리하여 제거하고 세포는 추가로 DPBS-5% 완충액 (200 μL/웰)으로 2회 세척함에 이어서 원심분리하였다. 부착된 DNA 서열을 갖는 세포는 이어서 고정화 (BD CellFIX 용액 #340181)시키고 형광성-양성 세포는 YL-1 채널 상에서 유동 세포측정 (AttuneNXT; Invitrogen, Inc.)에 의해 계수하였다.
HEK293T, HEK293T-CAR CD19 및 HEK293T-CAR PNE에 대한 결합 연구의 결과는 도 14a에 나타낸다. CAR PNE-양성 HEK293T 세포로의 용량-의존성 결합은 최고 시험된 농도에서 신호의 포화에 도달하는 것 없이 ARAA-00100001 및 ARAA-01700001로 관찰하였다. 신호의 강도는 PNE 펩타이드 대조군 보다 강하였다. CAR PNE-음성 세포로의 압타머 둘 다의 잔여 결합은 50 nM 초과의 농도에서 관찰되었다. ARAA-05200001, ARAA-0060095 및 ARAA-01300011은 3개의 HEK293T 세포주 간에 임의의 차등적 염색을 나타내지 않았고, 이들 3개의 압타머는 CAR PNE에 특이적이지 않음을 지적한다. 압타머 ARAA-00100001 및 ARAA-01700001을 사용한 결합 연구는 1차 실험의 결과를 확인하는 광범위한 농도 범위 상에서 반복하였다 (도 14b 및 14c).
또 다른 실험에서, CAR PNE를 발현하는 인간 PBMC로의 동일한 압타머의 결합을 조사하였다. PBMC는 실시예 5에 이미 기재된 바와 같이 혈액 공여자로부터 단리하였고, 37℃, 5% CO2에서, 10% FBS (Gibco Invitrogen) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640 배지 (Gibco Invitrogen)에서 배양하였다. PNE 펩타이드에 대해 다이렉팅된 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터를 사용한 2시간 형질도입 후, 세포는 결합 연구를 상기된 방법 후 수행하기 전에 추가로 72시간 동안 계속 배양하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 용량-의존성 신호는 300 nM 초과의 농도에서 정체기에 도달한 압타머 둘 다로 측정하였다. 신호의 강도는 PNE 펩타이드 대조군 보다 강하였다.
실험 세트 둘 다는 PNE 펩타이드를 인지하는 CAR에 대해 선택된 ARAA-00100001 및 ARAA-01700001 압타머가 상기 특정 키메라 항원 수용체를 발현하도록 가공된, 인간 세포 상에 발현된 이들의 표적을 특이적으로 인지할 수 있음을 보여준다.
실시예 8. CAR-PNE에 특이적인 압타머의 혈청 안정성.
항-CAR PNE RNA 압타머 (ARAA-00100001 및 ARAA-01700001)의 안정성은 5% 태아 송아지 혈청 (FBS)을 함유하는 DPBS 완충액, 10% FBS 또는 순수 FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 연구하였다. 압타머는 5분 동안 85℃에서 변성시키고 이어서 즉시 빙 블록 상에서 5분 동안 4℃로 냉각시켰다. 이어서 상기 서열은 5%의 FBS가 보충된 DPBS에서, 10% FBS가 보강된 RPMI 배지에서 또는 순수 FBS 혈청에서 2 μM의 최종 농도로 희석하였다. 샘플은 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 또는 24시간 동안 37℃에서 항온처리하고; 대조군 샘플은 37℃에서 항온처리 없이 새롭게 제조된 압타머를 함유하였다. 이어서 이들 각각의 완충액 중에서 압타머의 반감기는 하기와 같은 변성 전기영동 방법을 사용한 아가로스 겔 상에서의 이동에 의해 측정하였다: 상이한 항온처리 시간으로부터의 압타머 샘플은 포름아미드-함유 부하 완충액 (ThermoScientific, Waltham, MA, USA)과 혼합하고 5분 동안 85℃에서 변성시킨 후, 15 μL의 각각의 샘플을 RNA 염색 마커로서 SYBRsafe (Invitrogen)를 함유하는 새롭게 제조된 3% 아가로스 겔 상에 위치시켰다. 아가로스 겔 상에서 RNA 압타머의 이동은 20분 동안 100V를 적용함에 의해 1 X TBE 완충액 (Invitrogen)에서 수행하였다. 겔은 바이오-래드 (Bio-Rad) 이미지화 시스템을 사용하여 가시화하였고 상기 결과는 도 15에 나타낸다. 압타머 둘 다는 RNA 신호의 강도가 4시간 후 감소하기 시작함으로써 상이한 항온처리 조건에서 적어도 2시간 동안 안정하였다.
실시예 9. PSMA 및 CAR-PNE에 특이적인 이특이적 압타머의 제조.
ARAA-00100001 및 ARAA-01700001 압타머는 표준 고체 상 포스포라미디트 화학을 통해 합성된 HPLC-RP 정제된 2'-F RNA 올리고스로서 제조사 (baseclick) (Neuried, Germany)로부터 구입하였다.
A10 2'F-RNA 압타머는 후속 트리아졸 뉴클레오타이드 간 이량체화를 위해 이의 3'-말단에서 아지드 그룹으로 변형시켰다. 비오틴은 압타머 서열과 비오틴 플래그 사이에 16-원자 혼합된 극성 스페이서를 도입하는 비오틴-TEG로서 A10 압타머의 5'-말단에 첨가하였다. ARAA-00100001 및 ARAA-01700001은 후속 트리아졸 뉴클레오타이드 간 이량체화를 위해 이들의 5' 말단에 알킨 그룹으로 변형시켰다. 분자량, 순도 및 통합성은 HPLC-MS로 입증하였다.
실시예 1에 기재된 과정을 사용하여 이특이적 항-PSMA A10 및 항-CAR PNE 압타머를 제조하였다. 클릭 반응의 결과는 도 8a에 나타낸다.
실시예 10. 항-PSMA x 항-CAR PNE 이특이적 압타머의 세포 상에 발현된 표적에 대한 친화성 및 특이성의 결정.
항-PSMA x 항-CAR PNE 압타머의 세포 상에 발현된 표적 단백질에 대한 친화성 및 특이성은 유동 세포측정에 의해 평가하였다. 이들 연구는 실시예 3에 기재된 바와 같이 5% FBS를 함유하는 DPBS 완충액에서 PSMA-양성 LNCaP (인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1740) 및 PSMA-음성 PC-3 (인간 전립선 암종 - ATCC CRL-1435)에 대해 수행하였다. 압타머는 단일 농도 범위: 30, 100 및 300 nM 내에서 시험하였다.
PSMA-양성 세포에 대한 결합 연구의 결과는 도 10a에 나타낸다. 2개의 RNA/RNA 압타머인, A10 x ARAA-00100001 및 A10 x ARAA-01700001은 A10 단량체 압타머와 함께 분석하였다. 비교를 위해, 시험된 시약의 PSMA-음성 PC-3 세포로의 결합을 또한 측정하였다.
PSMA-양성 LNCaP 세포의 용량-의존성 결합은 최고 시험된 농도에서 신호의 포화에 도달하는 것 없이 A10으로 관찰하였다. 신호의 강도는 항체 대조군에 대한 것 만큼 강하였다. A10 단량체의 PC-3 세포로의 잔여 결합은 단지 최고 시험된 농도에서 관찰하였다. 이특이적 PSMA x CAR PNE 압타머 둘 다는 A10 단량체로의 유사한 결합 성질을 나타냈지만 PSMA 음성 세포에 대한 잔여 결합이 감소됨으로써 표적-양성 세포에 대해 개선된 특이성을 갖는다. 각각의 시험된 농도에 대해, 이특이적 압타머의 신호 강도는 A10 단량체에 대해 측정된 것 보다 우수하였고, 이는 이종이량체화가 친화성을 개선시킴을 시사한다.
실시예 9 및 10으로부터의 결과를 종합해 보면 상이한 표적에 대해 선택된 압타머의 이종이량체화가 별도로 평가되는 경우 각각의 모이어티의 결합 성질에 유의적으로 영향을 미치지 않음을 시사한다.
실시예 11. CAR-PNE 및 PSMA에 특이적인 이특이적 압타머의 생활성.
세포독성 검정은 비자극된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에 대해 수행한다. 새롭게 제조된 PBMC는 건강한 공여자로부터 수득된 버피 코트로부터 단리하였다 (Etablissement Francais du Sang, Division Rhones-Alpes). 혈액을 DPBS로 희석시킨 후, PBMC는 FICOLL 밀도 구배 (FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.077 GE Healthcare)로 분리하고, DPBS로 2회 세척하였고, RPMI-1640 배지 (Gibco Invitrogen)에 재현탁시켜 5x106 세포/ml의 세포 밀도를 수득하였다. 이들 PBMC에 CAR-PNE 수용체를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 형질도입하였다. 이들 PBMC-CAR-PNE는이펙터 세포로서 사용한다.
LNCaP 표적 세포는 세포 배양 배지에서 37℃에서 30분 동안 2 μM 칼세인 AM (Trevigen Inc, Gaithersburg, MD, USA)으로 표지시켰다. 칼세인 AM 플루오로크롬은 생존 LNCaP 세포 내부에 포집되고 리다이렉팅된 용해시에만 방출되는 염료이다. 세포 배양 배지에서 2회 세척 후, 5x105 세포/ml의 세포 밀도는 RPMI-1640 배지에서 조정하고 50,000 세포의 100 μl 분취액을 검정 반응 당 사용하였다. 37℃/5% CO2에서 표준 반응은 4시간 동안 지속하였고 200 μl의 총 용적에서 5x104 세포 칼세인 AM-표지된 표적 세포, 5x105-PBMC-CAR- PNE PBMC (1:10의 E/T 비율) 및 1 μM에서 20 μl의 이특이적 압타머 용액을 사용하였다. 세포독성 반응 후, 항온처리 배지에서 방출된 염료는 형광성 판독기 (VarioSkan Lux, ThermoFisher, Waltham, MA, USA)에서 정량하였고 세포독성 화합물이 부재인 대조군 반응 및 형광성 신호가 전체 용해된 세포에 대해 결정된 반응 (여기서, 압타머는 제조원 (Chemometec, Allerod, Denmark)으로부터 구입된 A100 시약으로 대체되었다)으로부터의 형광 신호와 비교하였다. 이들 판독을 기준으로, 특이적 세포독성은 하기의 수학식에 따라 계산하였다: [형광성 (샘플) - 형광성 (대조군)]/[형광성(총 용해) - 형광성 (대조군)] x 100.
10:1의 단일 E:T 비율로 압타머 100 nM의 존재하에 4시간 항온처리 후 수득된 세포독성 검정의 결과를 결정하였다. 특이적 세포독성은 30% 초과의 LNCaP 세포의 사멸을 유도하는 RNA/RNA 압타머 A10 x PNE로 측정한다. PNE 결합 모이어티가 부재인 대조군 단량체 A10은 임의의 세포독성을 유도하지 않는다.
이들 결과는 가공된 압타머 스위치가 이들의 세포용해 기구를 리다이렉트하고 특정 세포 집단을 제거하도록 이펙터 T 림프구를 표적 세포로 동원할 수 있음을 보여주기 위해 사용될 수 있다.
실시예 12. 항-CD3 x 항-PSMA 압타머를 사용한 임상전 모델에서 암의 치료.
마우스에서 단량체 압타머와 비교하여 상이한 다량체 압타머 작제물의 생체내 효능 및 독성을 평가한다. PSMA 양성 종양을 함유하는 성체 마우스에 마우스의 상이한 그룹에서 CD3 및 PSMA에 특이적으로 결합하는 압타머를 투여하였고 상기 압타머는 단량체 형태 또는 다량체 형태로 존재한다. 효능은 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 종양 크기, 종양 성장 및 속도, 및 생존률을 측정함에 의해 평가한다. 독성은 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 역반응의 발생률에 의해 평가한다.
실시예 13. CAR-T 압타머 스위치를 갖는 임상전 모델에서 암의 치료.
마우스에서 단량체 압타머와 비교하여 스위치 압타머 작제물의 생체내 효능 및 독성을 평가한다. 다량체 압타머는 CAR-T 세포 기반 치료제의 활성을 가동시키는 스위치로서 제조한다. 종양을 함유하는 성체 마우스에 먼저 CAR PNE로 형질도입된 T 세포를 주사하고 PSMA, 또는 HER2, 또는 CD19, 또는 CD20 또는 CD22 종양 관련 표적에 융합된 항-CAR PNE 압타머로 구성된 다량체 압타머를 주입한다. 효능은 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 종양 크기, 종양 성장 및 속도, 및 생존률을 측정함에 의해 평가한다. 독성은 대조군에 비해 치료받은 그룹에서 역반응의 발생률에 의해 평가한다.
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참고문헌
Figure pct00002
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Claims (48)

  1. 표적에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 결합시키기 위한 압타머 브릿지로서, 상기 브릿지가 하나 이상의 CAR-결합 압타머 및 하나 이상의 표적-결합 압타머를 포함하고, 여기서, 상기 하나 이상의 CAR-결합 압타머가 하나 이상의 링커에 의해 표적-결합 압타머에 연결되고 상기 하나 이상의 CAR-결합 압타머 중 적어도 하나가 CAR의 세포외 도메인에 결합하는, 압타머 브릿지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CAR 세포외 도메인이 펩타이드 네오-에피토프 (PNE)에 특이적으로 결합할 수 있는, 압타머 브릿지.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 브릿지의 CAR-결합 압타머의 면역 세포 상에 발현된 CAR로의 결합이 상기 면역 세포를 활성화시키는, 압타머 브릿지.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 브릿지의 CAR-결합 압타머의 면역 세포 상에 발현된 CAR로의 결합이 상기 면역 세포를 활성화시키지 않는, 압타머 브릿지.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 면역 세포가 T-세포, NK-세포 또는 대식세포이고, 상기 결합이 상기 압타머 브릿지의 표적-결합 압타머에 결합된 표적 세포의 파괴를 유도하는, 압타머 브릿지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 공유 결합, 단일-가닥의 핵산, 이중-가닥 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 합성 중합체, 하이드라존, 티오에테르, 에스테르, 트리아졸, 나노입자, 마이셀, 리포좀, 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 링커 모이어티를 포함하거나 이들로 이루어진, 압타머 브릿지.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 펩타이드 또는 이의 단편을 함유하지 않는, 압타머 브릿지.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 함유하지 않는, 압타머 브릿지.
  9. 제6항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 DNA, RNA 및 XNA로 부터 선택되는 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산을 포함하는, 압타머 브릿지.
  10. 제6항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 이의 단편인, 압타머 브릿지.
  11. 제6항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 글루칸, 덱스트란, 글리코겐, 전분 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리사카라이드인, 압타머 브릿지.
  12. 제6항에 있어서, 상기 링커 모이어티가 폴리(아미도아민) (PAMAM) 및 폴리(베타 아미노 에스테르) (PBAE)로부터 선택되는 합성 중합체인, 압타머 브릿지.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR 세포외 도메인이 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는, 압타머 브릿지.
  14. 제10항에 있어서, 상기 면역글로불린 폴리펩타이드가 단일쇄 Fv인, 압타머 브릿지.
  15. 제2항에 있어서, 상기 PNE가 인간 프로테옴에서 발견되지 않는 아미노산 서열을 갖는, 압타머 브릿지.
  16. 제2항에 있어서, 상기 PNE가 서열번호 1 내지 7로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 압타머 브릿지.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적-결합 압타머 중 적어도 하나가 CD19, CD20, CD22, CD123, BCMA, NY-ESO-1, 메소텔린, PSA, PSMA, MART-1, MART-2, Gp100, 티로시나제, p53, ras, MUC1, SAP-1, 수르비빈, CEA, Ep-CAM, Her2, EGFRvIII, BRCA1/2, CD70, CD73, 및 돌연변이된 SOD로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 표적에 결합하는, 압타머 브릿지.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 동일하거나 동일하지 않은 CAR-결합 압타머를 포함하는, 압타머 브릿지.
  19. 제18항에 있어서, 2개 이상의 동일하거나 동일하지 않은 표적-결합 압타머를 포함하는, 압타머 브릿지.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 환형, 성상형, 덴드리머, 선형, 분기형 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 분자 형태를 포함하는, 압타머 브릿지.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 CAR-결합 압타머와 하나 이상의 표적-결합 압타머 간의 거리가 약 70 내지 약 200 옴스트롱의 범위인, 압타머 브릿지.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포에서 발현되는 경우, 상기 CAR에 결합하는, 압타머 브릿지.
  23. 제22항에 있어서, 상기 CAR에 결합 시 상기 T 세포, NK 세포, B 세포 또는 대식세포를 활성화시키는, 압타머 브릿지.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 CAR-결합 압타머 및 하나 이상의 표적-결합 압타머 각각이 10 nM 미만, 바람직하게 1 nM 미만, 및 보다 바람직하게 100 pM 미만 또는 10 pM 미만의 결합 친화성을 갖는, 압타머 브릿지.
  25. 면역치료요법을 위한 시스템으로서, 상기 시스템이 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 압타머 브릿지 및 상기 CAR을 발현하는 면역 세포를 포함하는 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역 세포가 상기 압타머 브릿지의 CAR-결합 압타머로의 결합 시 활성화되는, 시스템.
  27. 암, 병원체 또는 염증 세포 또는 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키기 위한 제25항 또는 제26항의 시스템의 용도.
  28. 대상체에 면역치료요법을 제공하기 위한 키트로서, 상기 키트가 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 압타머 브릿지 및 상기 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터를 포함하는 키트.
  29. 제28항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 키트.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, CAR-결합 압타머 또는 이의 부분의 것과 상보적 서열을 갖는 압타머를 추가로 포함하는, 키트.
  31. 면역치료요법을 대상체에게 제공하기 위한 키트로서, 상기 키트가 (i) 생체내 또는 생체외에서 면역 세포에서의 발현을 위해 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터 및 (ii) 고친화성으로 상기 CAR에 결합할 수 있는 압타머를 포함하는, 키트.
  32. 제31항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터인, 키트.
  33. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 압타머 브릿지, 및 상기 브릿지의 CAR-결합 압타머와 동일한 CAR에 결합하지만 상기 브릿지에 의해 결합된 표적에 결합하지 않는 표지되고/되거나 표지되지 않은 CAR-결합 압타머를 포함하는, 키트.
  34. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 압타머 브릿지, 및 상기 브릿지의 표적-결합 압타머와 동일한 표적에 결합하지만 상기 브릿지에 의해 결합된 CAR에 결합하지 않는 표지되고/되거나 표지되지 않은 표적-결합 압타머를 포함하는 키트.
  35. 이를 필요로 하는 대상체에서 면역치료요법을 수행하는 방법으로서, 상기 방법이
    (a) CAR을 발현하는 세포 집단을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 CAR이 펩타이드 네오-에피토프 (PNE)에 특이적으로 결합할 수 있는 세포외 도메인을 포함하는 단계; 및
    (b) 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 압타머 브릿지를 상기 대상체에게 투여하는 단계
    를 포함하고, 이로써 상기 압타머 브릿지가 상기 대상체에서 CAR-발현 세포에 결합하고 상기 CAR-발현 세포와 상기 표적 간의 상호작용을 유도하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (a1) 상기 CAR에 결합하는 표지된 단일특이적 압타머를 상기 대상체에게 투여하고 상기 대상체에 존재하는 CAR 또는 CAR-발현 세포의 양을 결정하는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 단계 (b)가 CAR 또는 CAR-발현 세포의 양이 상기 면역치료요법이 성공적이기 위해 요구되는 것으로 평가된 미리 결정된 양에 도달하거나 이를 초과하는 경우에만 수행되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, CAR 또는 CAR-발현 세포의 상기 양이 상기 미리 결정된 양 미만에 속하고, 단계 (a1)가 일정 기간 후 반복되는, 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적이 표적 세포 상에 있고, 상기 상호작용이 표적 세포의 사멸을 초래하는, 방법.
  40. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상호작용이 상기 대상체에서 증진된 면역 반응을 초래하는, 방법.
  41. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상호작용이 대상체에서 면역 관용성을 초래하는, 방법.
  42. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상호작용이 상기 대상체에서 감소되거나 종결된 면역 반응을 초래하는, 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 증진된 면역 반응이 암, 병원체 또는 염증성 세포 또는 단백질에 대한 것인, 방법.
  44. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 강도 또는 지속 기간이 단계 (b)에서 압타머 브릿지의 투여의 용량 또는 지속 기간에 의해 조절되는, 방법.
  45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응의 강도 또는 지속 기간이 하기의 추가의 단계에 의해 제한되는, 방법:
    (c) 상기 CAR-결합 압타머 또는 이의 부분의 것과 상보적인 서열을 갖는 압타머를 대상체에게 투여하는 단계.
  46. 제35항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는, 방법:
    (a0) 상기 대상체 기원의 세포에, 세포 내 CAR을 발현하는 바이러스 벡터를 형질도입하는 단계.
  47. 제46항에 있어서, 상기 형질도입이 시험관내 (생체외) 수행되는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 형질도입이 상기 대상체에서 (생체내) 수행되는, 방법.
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