KR20190023197A - 암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법 - Google Patents

암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 In vitro 혹은 In vivo 연구시 암줄기 세포 추적 및 분포를 확인하기 위하여 CD133 결합 녹색 형광 단백질 발현 세포를 이용한 추적 방안에 관한 것으로서 본 발명에 따른 형질전환 세포주는 리포터 시스템(reporter system)으로 CD133이 결합된 녹색형광단백질 유전자를 동시에 발현하므로 In Vitro 혹은 In vivo 연구에서 주입된 암 줄기세포로부터 개시된 종양 형성에 따라 암 줄기세포의 추적을 가능하게 한다.

Description

암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법{recombinant expression vector for detection of cancer stem cells and transfected cell line and manufacturing method thereof}
본 발명은 암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 CD133 유전자가 녹색 형광 단백질과 결합되어 In vitro 혹은 In vivo 연구시 암 줄기세포 추적 및 분포를 확인할 수 있는 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법에 관한 것이다.
암 줄기세포(CSC) 모델의 최근 발전은 암 치료 및 약물 개발에 대한 연구 방향을 바꾸어 놓았다. CSCs는 종양 형성, 전이 및 국소 재발을 일으키는 것으로 알려져 있으며 prominin-1로 알려진 CD133은 원발성 고형 종양에서 유래된 CSCs의 마커로 사용되어왔다.
CD133은 또한 백혈병, 뇌종양, 망막 아세포종, 췌장암, 신장 종양, 대장 암종 및 전립선 암에서의 재발 및 악성 진행의 예후 인자로서 보고되어왔다. 최근보고에 따르면 CD133 발현은 암 환자의 생존율과 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
녹색 형광 단백질(GFP, 발광 해파리 Aequorea victoria에서 유래한 것) 에 연결된 단백질 또는 펩타이드를 발현하기 위한 플라스미드의 사용은 원하는 단백질의 검출을 위한 강력한 도구이다. 이 해파리 단백질을 발현하기 위한 원래 플라스미드를 수정하면 야생형 단백질에 비해 형광이 약 35배 향상된다. 다양한 단백질을 암호화하는 GFP 플라스미드의 발현은 in vitro 및 in vivo에서 세포 분열 세포 이동 및 세포 분포와 같은 살아있는 세포에서 발현되는 단백질의 변화에 대한 연구를 용이하게 하였다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0085806호: 암 줄기세포 검출을 위한 CD133 앱타머
본 발명의 목적은 CD133 유전자와 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP) 유전자를 동시에 발현하는 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법을 제공하여 빠르고 정확하게 암 줄기세포를 탐색할 수 있는 기술을 제시하는 데 있다.
본 발명의 일 양태로서, 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터는 CD133 유전자가 녹색 형광 단백질과 연결되어 발현되도록 CD133 유전자 및 녹색 형광 단백질 유전자를 포함한다.
그리고 상기 재조합 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 형질전환 세포주는 상기의 재조합 발현벡터로 형질전환된다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 형질전환 세포주의 제조방법은 CD133 유전자와 녹색 형광 단백질 유전자를 동시에 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 제1단계와; 상기 재조합 발현벡터로 세포주를 형질전환시키는 제 2단계;를 포함한다.
그리고 상기 제1단계는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 pcDNA 3.1 vector로부터 CD133 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터를 제조한다.
또한, 상기 제2단계는 상기 세포주가 PC3, DU145 그리고 LnCap 중에서 어느 하나이다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 및 형질전환 세포주는 리포터 시스템으로 CD133과 녹색 형광 단백질 유전자를 동시에 발현하므로 녹색 형광 단백질 스캐너를 사용하여 빠르고 정확하게 주입된 암 줄기세포를 탐색하는데 이용할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 및 형질전환 세포주는 암 줄기세포 타겟 항암제를 검색하기 위한 바이오센서로서 암 줄기세포 타겟 항암제를 스크리닝하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도1 CD133이 삽입된 pcDNA3.1/NT-GFP-TOPO®vector의 개열지도,
도 2는 PC3vec와 DU145vec 세포 클론(대조군) 및 PC3CD133 + 및 DU145CD133+(CD133-GFP- 과발현) 세포 클론에서 CD133의 웨스턴 블랏팅(293T 세포를 pcDNA3.1 / NT-GFP 또는 pcDNA3.1 / NT-CD133-GFP로 일시적으로 형질 감염시켜 293Tvec 또는 293TCD133 + 세포를 각각 생성시켜 양성 대조군으로 사용하였다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용됨).
도 3은 형질전환된 PC3, DU145 또는 293T 세포에서 CD133-GFP 발현을 나타내는 공 촛점 현미경 이미지(4Δ, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 핵을 염색 하였다. 패널 : GFP, CD133-GFP 융합 단백질; DAPI, 핵; DIC (미분 간섭 대비), 이미지 병합. 이미지는 630배에서 획득됨. 스케일 바 = 20 μm).
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터와 이로부터 형질전환된 세포주 그리고 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 CD133 유전자와 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP) 유전자를 둘 다 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현벡터는 분자생물학적인 방법을 통하여 in vivo에서 pcDNA3.1 벡터의 insert 유전자 부분에 CD133을 클로닝 한 결과물로서, 바람직하게는 도 1의 개열지도를 가지는 발현벡터이다.
또한, 본 발명은 CD133 유전자와 녹색 형광 단백질 유전자를 동시에 발현하는 형질전환 세포주를 제공한다. 상기 CD133 유전자와 녹색 형광 단백질 유전자를 동시에 발현하는 형질전환 세포주는 암줄기세포에 의한 발암 동물 모델 구축시 최초 암세포로부터 발생되는 발암 과정을 조직 검사를 통해 녹색 형광 단백질의 분포를 확인하여 빠르게 검사할 수 있는 수단을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 CD133 유전자와 녹색 형광 단백질 유전자를 동시에 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 제1단계와, 상기 재조합 발현벡터로 세포주를 형질전환시키는 제 2단계를 포함하는 형질전환 세포주의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 제1단계는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 CD133 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자를 pcDNA3.1 발현벡터에 클로닝하여 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터를 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 제2단계의 세포주는 PC3, DU145 그리고 LnCaP 중 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시예에서는, CD133, GFP 유전자 및 항생제 저항성 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고, PC3, DU145 그리고 LnCaP세포 내에서 영구적으로 발현하도록 하기 위한 트랜스펙션을 수행한 다음, 트랜스펙션 이후 계속적인 계대배양(subculture)를 통하여 네오마이신에 대해 저항성이 있는 세포를 선별하고, 추가적으로 일주일 동안 더 계대배양한 후에 안정적인 형질전환 세포주를 확인할 수 있었다. 상기 확인 방법으로는 트랜스펙션 전후에 GFP 발현을 비교하는 방법, 세포에서 게노믹 DNA, mRNA를 분리하여 PCR 및 RT-PCR을 각각 사용하여 트랜스펙션 전후의 CD133 유전자의 존재를 확인하는 방법 등이 존재한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1 > CD133과 녹색 형광 단백질의 융합단백질을 생성하는 암줄기세포 유사 PC3, DU145, LnCaP 영구 세포주 제작
1. 세포 제조
1.1 10% 열불활성화 태아소혈청(FBS)과 1% 항생제 - 항균 솔루션이 보충 된 로스웰 파크 기념 연구소(RPMI) 1640 배지 10mL가 있는 9cm 배양 플레이트에서 1 x 106 PC3, DU145 및 HT29 세포에 씨앗을 뿌린다. 그리고 가습된 챔버에서 37℃에서 5% CO2로 인큐베이션한다.
1.2 배지를 3일마다 신선한 배지로 교체하면서 세포가 ~70%의 합류에 도달하도록 허용한다.
1.3 세포가 70% 합류(3-5 일)에 도달하면, 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세 번 씻는다.
1.4 37℃에서 3분간 trypsin-ethylenediamine tetra-acetic acid(EDTA) 용액(0.05 % 트립신과 0.53mM EDTA 4Na)을 사용하여 세포를 분리한다. 15ML 원뿔 튜브에 세포를 옮긴다. 5분 250g에서 세포를 원심 분리기.
1.5 RPMI 1640 배지(10mL)로 9㎝ 배양 플레이트에서 상등액을 제거하고 1 x 106 세포를 각 실험마다 37℃에서 재조정(즉, 계대 배양)한다.
1.6 조절된 조명 조건하에서 5주 된 수컷 흉선 누드 마우스(BALB / c-Nu)를 수납하고 자유롭게 먹인다.
2. RNA 분리, 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR), 및 인간 CD133의 클로닝
2.1 CD133 mRNA의 전장 서열을 얻기 위해서는 HT29 세포에서 전체 RNA를 추출하다.
2.1.1 10ML의 RPMI 1640 배지와 9cm 배양 플레이트에 HT29 세포를 뿌리고, 세포가 70% 합류에 도달하면 매체를 제거한다.
2.1.2 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 한 번 씻는다. RNA 추출 시약 1mL를 넣고 세포 스크레이퍼로 긁어 낸다. 그런 다음 세포를 모으고 새 튜브로 옮긴다.
2.1.3 클로로포름 0.2mL를 넣고 15초 동안 격렬히 교반한다.
2.1.4 시료를 실온에서 3분 동안 배양하고 12,000 ×g 및 4℃에서 15분간 원심 분리한다. 원심 분리 후 상층 액을 새 튜브로 옮긴다. 이소프로판올 0.5 mL를 넣고 잘 섞는다.
2.1.5 4℃에서 10분간 배양하고 12,000 ×g, 4℃에서 10분간 원심 분리한다. 상등액을 완전히 제거하고 75% 에탄올 1mL를 RNA pellet에 넣고 vortexing하여 혼합한다.
2.1.6 시료를 7,500 ×g 및 4℃에서 5분간 원심 분리한다. 원심 분리 후 남은 에탄올을 모두 제거하고 RNA pellet을 diethylpyrocarbonate(DEPC) 처리 수에 녹인다. RNA 측정 키트를 사용하여 RNA 농도를 정량한다.
2.1.7 RT-PCR premix kit의 반응 혼합물에 RNA(1μg)와 DEPC 물 (20μL)을 첨가한다.
2.1.8 42℃에서 60분간, 95℃에서 5분간 배양하여 cDNA를 역전사시킨다.
2.2 cDNA로부터 CD133을 증폭시키기 위해서, PCR 프라이머로서 5'-ATGGCCCTCGTACTCGGCTCCCTGTT-3'(Tm = 69.6℃) 및 역방향 프라이머 5'-TCAATGTTGTGATGGGCTTGTCATAACAG-3'(Tm = 64.5℃) 15.
2.3 PCR 산물의 3' 말단에 poly-A tail을 추가하기 위해서는 72℃에서 15 분 동안 2 주 - 데 옥시 아데노신 5 주 - 트리 포스페이트(dATP, 100 mM)와 함께 비정제 앰플 리콘을 배양한다.
2.4 1X Tris-acetate-EDTA(TAE) 완충액에서 1.0 % 아가 로스 겔에서 전기 영동을 수행하여 증폭 산물의 분리를 수행한다.
2.5 겔 추출 키트를 사용하여 생성된 앰플 리콘을 정제한다.
2.6 CD133 - GFP 발현 플라스미드를 구성하려면, GFP 발현 플라스미드 및 ligase와 실온에서 5분 동안 CD133 PCR 제품의 2μL를 품는다.
2.7 대장균을 라이게이션 제품으로 형질 전환시키고 9cm 배양 접시에 50 μg/mL의 카나마이신을 함유한 Luria-Bertani(LB) 브로쓰 한천에 형질전환된 박테리아를 플레이트한다.
2.7.1 CD133 결합 혼합물 2μL를 화학적으로 유능한 대장균 세포가 담긴 바이알에 넣고 부드럽게 혼합한다. pipetting up과 down으로 혼합하지 않는다.
2.7.2 얼음으로 30분 동안 배양한다.
2.7.3 Catabolite 억제(SOC, 2 % trypton, 0.5 % 효모 추출물, 0.05 % NaCl, 20mM 포도당) 배지가 있는 상온 Super Optimal broth 250μL를 첨가한다.
2.7.4 튜브를 단단히 덮고 37℃에서 1시간 동안 튜브를 수평으로 흔들어 준다(200 rpm).
2.7.5 미리 보온 된 선택 플레이트(50ug / ml 카나마이신 LB 한천 플레이트)에 각 변형 반응에서 25-200μL을 퍼내고 37℃에서 밤새 품어 둔다. 분석을 위해 ~ 10 콜로니를 선택한다.
2.8 PCR을 사용하여(CD133 프라이머의 GFP 정방향 프라이머 % 3 '끝) 올바른 플라스미드 삽입 크기 및 방향에 대한 형질 전환 플레이트상의 박테리아 콜로니를 스크리닝한다.
2.9 플라스미드의 증폭을 위해 LB 성장 배지(100μg / mL 암피실린 보충)에 양성 클론을 접종한다.
2.10 서열 검증을 위해 플라스미드 정화 키트를 사용하여 양성 클론의 세균 배양으로부터 플라스미드를 분리하고 시판 시퀀싱 서비스를 사용하여 시퀀싱 반응을 수행한다(참고 : 여기에서 서열은 인간 프로 미니민 -1에 대한 국립 생명 공학 정보 센터 BC_023089의 서열과 동일하다는 것이 밝혀졌다).
3. 안정적으로 형질 감염된 PC3-GFP 또는 DU145-GFP 대조 세포 및 PC3-GFPCD133 또는 DU145-GFPCD133 융합 단백질 세포의 확립
3.1 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지(0.5 mL)에 well 당 5104 세포에서 24-well plate에 PC3 또는 DU145 세포를 seed한다.
3.2 다음날 24-well plate에서 배지를 제거하고 항생제가 없는 10% FBS가 첨가된 RPMI 1640을 첨가한다.
3.3 혈청이 없는 RPMI 1640 (100μL)에서 DNA (2μg)를 희석한다. 그런 다음 DNA diluent에 6μL의 transfection reagent를 넣고 잘 섞는다.
3.4 실온에서 5-15 분 동안 품어 낸다.
3.5 transfect 시약 : DNA(3μl transfection reagent : 1μg DNA ratio) 혼합물을 10-50μL 씩 첨가하여 세포의 각 well에 넣고 부드럽게 혼합한다. 인큐베이터에 세포를 반환하고 48시간 동안 품는다.
3.6 transfection 2일 후, 10% FBS가 보충된 RPMI 1640(0.5 mL) mL당 G418 sulfate 400μg과 함께 세포를 배양함으로써 CD133-GFP 또는 GFP를 안정적으로 발현하는 세포를 선별하기 시작한다.
3.7 3일마다 G418 sulfate와 FBS가 들어있는 배지를 교체한다.
3.8 3~4주 후, 형광 현미경(배율 x630, 여기 480nm, 방출 517nm) 16에 의해 CD133-GFP 또는 GFP의 다른 수준을 표현하는 살아남은 세포를 검사한다.
3.9 융합 단백질의 발현을 확인하기 위해, 293T 세포를 양성 대조군으로 사용한다. 293T 세포를 60mm 배양 접시에서 거의 합류로 배양하고 20㎍의 CD133-GFP- 또는 GFP- 발현 플라스미드를 일시적으로 형질 감염시킨다. Dulbecco 수정된 이글 매체(DMEM, 2ML)에서 0.6μL의 형질 전환 시약에 대한 플라스미드 0.2μg의 비율을 사용한다.
3.10 48시간 후, 부드럽게 얼음으로 차가운 PBS로 세포를 씻어서 제조사의 프로토콜에 따라 1x 프로테아제 억제제를 포함하는 세포 용해 완충액으로 용해시킨다.
3.11 형질 전환 여부를 확인하기 위해 CD133 항체로 Western blotting을한다.
이상, 본 발명은 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims (6)

  1. CD133 유전자가 녹색 형광 단백질과 연결되어 발현되도록 CD133 유전자 및 녹색 형광 단백질 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 것을 특징으로 하는 암 줄기세포 검출을 위한 재조합 발현벡터.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주.
  4. CD133 유전자와 녹색 형광 단백질 유전자를 동시에 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 제1단계와;
    상기 재조합 발현벡터로 세포주를 형질전환시키는 제 2단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주의 제조방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제1단계는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 pcDNA 3.1 vector로부터 CD133 유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터를 제조하는 것을 특징으로 형질전환 세포주의 제조방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 제2단계는 상기 세포주가 PC3, DU145 그리고 LnCap 중에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 형질전환 세포주의 제조방법.
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