KR20150085806A

KR20150085806A - 암 줄기세포 검출을 위한 cd133 앱타머

Info

Publication number: KR20150085806A
Application number: KR1020157005476A
Authority: KR
Inventors: 웨이 두안
Original assignee: 디킨 유니버시티
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2015-07-24
Also published as: SG11201500666TA; AU2013299331B2; US20150299708A1; CN104781417A; BR112015002289A2; WO2014019024A1; EP2880185A1; JP2015526075A; IN2015DN00634A; ZA201501318B; AU2013299331A1; EP2880185B1; NZ704719A; ES2741949T3; JP6279573B2; MX2015001433A; EP2880185A4; US9840712B2; CA2880589A1; CN104781417B

Abstract

최근 암 줄기세포는 종양 조직의 형성 및 성장 그리고 전통적 화학요법들이 처음에는 종양을 축소시킬 수 있지만, 종양 전체를 근절하는 것에는 실패하여, 궁극적으로 재발한다는 결과를 설명하는 자연적 화학요법 내성에 책임 있는 것으로 평가되고 있다. 암 줄기세포 가설에 따르면, CD133 양성 세포는 긴시간 종양 성장을 결정함에 따라서 임상 결과에 영향을 미치는 것으로 의심된다. 최근 CD133 양성 세포의 부분 및 그들의 클러스터(clusters)안에 위상적 조직(topological organisation) 둘다에 종양 등급(grade)의 부정적인 진행-프리 생존(adverse progression-free survival) 및 전체의 독립적 생존, 절제술 범위 또는 환자의 연령이 중요한 예후 인자라는 사실을 발견하였다.
CD133-양성 암 줄기세포의 검출 및 타겟팅을 위한 현재 병리학적 기술들은 종래의 항체 기반 시스템이 사용되지만, CD133 항체의 이용은 크기 및 조직 침투에 그것의 상대적 불능 때문에 민감도가 떨어진다.
따라서, CD133⁺ 세포에 앱타머의 생성은 암의 박멸에 유리할 것이다. 이에 본 발명자는 빠른 내부화 및 우수한 종양 침투를 보이는 CD133에 특이적인 앱타머를 발견하여 현재의 문제점를 해결하고자 하였다.
본 발명은 특이적으로 CD133에 결합하는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다. 일 예에서, CD133은 인간 CD133 이다.
일 예에서, 본 발명의 앱타머는 CD133이 발현된 HT-29 세포에서 82-145 nM 범위의 해리 상수를 가진다. 또 다른 예에서, 본 발명의 앱타머는 CD133이 발현된 Hep3B 세포에서 32-52 nM 범위의 해리 상수를 나타낸다.
일 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 공통적 서열 5'-CCCUCCUACAUAGGG-3'(서열목록 제1서열)을 포함한다.
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 다음으로부터 선택된 서열을 포함한다:
(i) 5’ -GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA
CGA GUU ACU AUA GAG CUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC- 3’(서열목록 제2서
열);
(ii) 5’ -GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA
CGA GUU ACU AUA G-3’(서열목록 제3서열);
(iii) 5’ -GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GU-3’(서열목
록 제4서열);
(iv) 5’ -CC ACC CUC CUA CAU AGG GUG G-3’(서열목록 제5서열); 및
(v) 5’ -CC CUC CUA CAU AGG G-3’(서열목록 제1서열).
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 공통적 서열 5’ -CAGAACGUAUACUAUUCUG- 3’(서열목록 제6서열)을 포함한다.
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 공통적 서열 5’ -AGAACGUAUACUAUU- 3’(서열목록 제7서열)을 포함한다.
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 서열 5’ -GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA GGA AAG CGC UUA UUG UUU GCU AUG UUA GAA CGU AUA CUA UUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC AGG C-3’(서열목록 제8서열)을 포함한다.
특정 예에서, 본 발명은 2'-플루오로-피리미딘 변형 및 CD133에 특이적으로 결합하는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다.
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열을 필수적으로 구성한다.
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열을 구성한다.
또 다른 예에서, 분리된 RNA 앱타머는 15 염기 내지 100 염기 서열 길이의 공통적 서열 CCCUCCUACAUAGGG(서열목록 제1서열), 또는 공통적 서열 CAGAACGUAUACUAUUCUG(서열목록 제6서열), 또는 공통적 서열 AGAACGUAUACUAUU(서열목록 제7서열)을 포함한다. 또 다른 예에서, 15 내지 40 염기 길이. 또 다른 예에서, 19 염기 내지 100염기의 서열 길이. 추가 예에서, 길이는 19 내지 40 염기이다.
서열은 앱타머의 결합 루프을 유지하는 공통적 서열에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함 할 수 있다. 일 예에서 서열은 공통적 서열에 하나 이상을 치환을 포함한다. 일 예에서, 서열은 적어도 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열에 따른 앱타머의 기본 영역 공통적 서열에 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 여섯 개의 치환을 포함한다. 또 다른 예에서, 기본 영역은 앱타머의 예측된 이차원적인 구조이다.
일 예에서, 앱타머는 앱타머의 안정성이 개선된(인 비트로 또는 인 비보) 하나 이상의 변형(변형된 앱타머)를 포함한다. 적합한 변형들은 본 명세서의 다른 곳에서 논의된다. 일 예에서, 피리미딘 염기는 2‘-플루오로(2'-F)로 변형된다. 또 다른 예에서, RNA 앱타머의 3’말단은 뉴클레아제 절단으로부터 보호하기 위해 변형된다. 또 다른 예에서, 앱타머는 5‘ 말단에 형광물질 또는 반전된(inverted) dT 결합에 의해 변형된다.
본 발명은 또한 서열목록 제1서열, 서열목록 제6서열, 또는 서열목록 제7서열의 서열을 포함하는 앱타머의 CD133 결합에 상당히 동일한 능력을 가지는 분리된 RNA 앱타머를 제공한다.
일 예에서, 앱타머는 특이적으로 CD133⁺ 세포에 결합한다. 또 다른 예에서, CD133⁺ 세포(들)은 줄기세포(들)이다. 또 다른 예에서, 줄기세포는 분리된 암 줄기세포(들)이다. 또 다른 예에서, 암 줄기세포(들)은 (i) CD133 발현, (ii) 종양성, (iii) 자가 재생 가능, (iv) 분화 가능 및 (v) 종래 치료에 의한 세포 사멸 저항의 특징을 가지고 있다.
암 줄기세포는 생물학적 시료와 같은 원천으로부터 선택적으로 형성, 분리, 농축 또는 정제되어 질 수 있다. 또 다른 예에서, 암 줄기세포(들)은 CD133⁺ 발현을 기초로 농축된 세포들을 대신한다. 또 다른 예에서, 세포들은 최소 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 의 암 줄기세포를 포함한다.
일 예에서, CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 인 비보 존재한다.
또 다른 예에서, CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 인 비트로 존재한다. 추가된 예에서 CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료내에 존재한다.
또 다른 예에서, 본 발명의 CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포는 CD44, ABCG2, β 카테닌, CD117, ALDH, VLA-2, CD166, CD201, IGFR, EpCAM 및 EGF1R을 포함한 하나 이상의 추가 항원을 발현할 수 있다.
또 다른 예에서, 본 발명에 따른 암 줄기세포는 뇌암 줄기세포, 유방암 줄기세포, 전립선암 줄기세포, 췌장암 줄기세포, 대장암 줄기세포, 간암 줄기세포, 폐암 줄기세포, 난소암 줄기세포, 피부암 줄기세포 또는 흑색종 줄기세포 이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 진단제을 제공한다.
일 예시에서, 상기 RNA 앱타머를 포함하는 진단제는 검출 가능한 표지와 커플링한다.
본 발명의 앱타머는 비 특이적 항체 결합 및 우수한 신호 대 잡음 비율(superior signal to noise ratio)과 관련있는 문제들를 피할 수 있다는 것을 당업자들은 이해할 것이다.
일 예에서, 본 발명의 진단제는 인 비보 또는 인 비트로 CD133 발현 암 줄기세포를 검출하기 위해 사용할 수 있다.
일 예에서, 본 발명의 RNA 앱타머는 대상 또는 종양으로 의심되거나 갖는 또는 종양, 종양을 갖는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 얻은 CD133 발현 세포 및/또는 암 줄기세포, 검출을 위해 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은 검출 가능한 표지에 앱타머를 연결함으로 가능할 수 있다. 검출 표지의 예는 각종 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 전자 밀도 라벨, MRI 용 라벨 및 방사성 물질을 포함한다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 생물학적 시료들을 조직학적 검사에 사용하기 위해 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 진단제를 제공한다. 조직학적 제제를 준비하는 방법은 당업자들에게 익숙할 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 항암제를 제공한다.
일 예에서, 항암제는 모이어티(moiety)에 커플링된 본 발명의 RNA 앱타머를 포함한다.
일 예에서, 본 발명의 항암제는 대상의 암 치료를 위해 사용된다. 일 예에서, 대상은 본 발명의 RNA 앱타머를 가진 치료 이점 중에 하나이다. 또 다른 예에서, 대상은 암으로 진단된 것 중 하나이다. 추가 예에서, 대상은 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 피부암, 흑색종 또는 CD133⁺ 세포가 존재하는 다른 암으로부터 선택된 암 중에 하나이다.
본 발명의 앱타머는 모이어티(moiety)에 커플링할 수 있고, CD133 발현 암 줄기세포(들)을 포함하는 것으로 의심되는 종양 부위에 직접적인 모이어티(moiety)로 사용된다. 모이어티(moiety)의 예로는 독소, 방사성 핵종 또는 암 줄기세포를 죽이는 데 사용 가능한 화학적 제제 또는 CD133 발현 세포를 포함하는 종양 위치 및 크기를 알 수 있는 조영제를 포함한다.
본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제는 추가적으로 하나 이상의 유효 성분을 포함 할 수 있다.
본 발명은 또한 CD133 발현 세포(들) 및/또는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 암 줄기세포(들) 분리, 정제 또는 농축를 위한 방법, 본 발명의 RNA 앱타머와 세포를 접촉시키는 방법 또는 본 발명의 진단제를 제공한다. 일 예에서, 상기 방법은 인 비트로에서 실시된다.
CD133 발현 세포들 분리, 정제, 농축 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서의 다른 곳에 기재된다.
본 발명은 또한 CD133 발현 세포(들) 및/또는 대상 또는 암으로 진단, 의심되어지는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료에 암 줄기세포의 검출 방법, 본 발명의 분리된 RNA 앱타머 또는 본 발명의 진단제와 세포를 접촉시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 RNA 앱타머 또는 본 발명의 항암제 대상으로 제공되어 포함된 대상의 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일 예로서, 암은 CD133 발현 세포 및/ 또는 암 줄기세포가 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 임의의 암이다. 또 다른 예에서, 대상은 암으로 진단된 것 중 하나이다. 추가 예에서, 대상은 CD133⁺ 세포가 존재하는 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 피부암, 흑색종 또는 다른 암으로부터 선택된 암 중에 하나이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 의학적 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상에 암을 치료 또는 예방하기 위해서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상에 암을 치료 또는 예방을 위해서 약제학적 조제에서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 항암제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 siRNA 또는 리보자임에 커플링된 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머를 포함하는 전달체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머, 항암제 또는 전달체의 치료학적 유효량을 포함한 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 종양의 분자 이미지화 용도을 위해서 본 명세서에 기재된 RNA 앱타머 또는 전달체를 제공한다.
본 발명의 RNA 앱타머의 종양 침투 능력은 종양의 분자 이미징을 통해 항체 보다 뚜렷한 장점을 제공한다. 예를 들어, RNA 앱타머는 CD133의 발현 세포 관련 종양의 검출 및 이미징을 촉진하는 제제에 커플링할 수 있다. 적합한 제제의 예로는 본 명세서에 기재된 검출 표지들을 포함한다.
본 명세서에 기재된 RNA 앱타머, 진단제, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물은 단독 또는 다른 치료방법과 혼합하여 사용될 수도 있다. 예를 들어, RNA 앱타머, 진단제, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물은 화학요법 또는 방사선 치료와 혼용하여 사용될 수 있다. 이론상 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 화학요법 또는 방사선 치료 제제는 전형적인 암 줄기세포의 자손 세포로 빠르게 분할하는 세포들을 타겟하여 종양을 축소하는데 사용될 수도 있다는 것을 가정한다. 진단제는 종양에서 암 줄기세포의 유무를 검출함으로써 암 줄기세포를 제거하기 위한 종래 임의의 치료법의 효과를 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제, 전달체, 또는 약제학적 조성물은 암 줄기세포를 특이적으로 감소하기 위해 종양 부위에 투여할 수 있다. 따라서, RNA 앱타머를 포함하는 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물은 화학요법 또는 방사선 요법 치료와 함께 또는 화학요법 또는 방사선 요법 치료 후에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 RNA 앱타머는 암 줄기세포에 존재하는 항원을 타겟으로 하나 이상의 추가 앱타머를 조합할 수 있다는 것이 고려된다.
본 명세서의 각 예는 대상에 암을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 방법으로 필요한 부분만 약간 수정하여 적용 취해져야 한다.
본 명세서의 각 예는 종양의 분자 이미징에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용 취해져야 한다.

Description

암 줄기세포 검출을 위한 CD133 앱타머{CD133 Aptamers for Detection of Cancer Stem Cells}

본 명세서에 있는 모든 인용된 문헌 또는 참조문헌, 그리고 본 명세서에서 인용된 문헌에서 인용되고 참조된 모든 문헌은, 본 명세서에 언급된 또는 본 명세서에 참조로서 삽입된 문헌에 있는 제품에 대한 제조사의 지시사항, 상세한 설명, 제품 명세서 그리고 제품 쉬트는, 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 RNA 앱타머 및 그의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는 CD133에 특이적으로 결합하고 우수한 종양 침투를 나타내는 앱타머에 관한 것이다.

프로미닌-1(Prominin-1)으로 알려진 CD133은 펜타스판(pentaspan)으로서, 혈장 막내의 콜레스테롤과 연관되어 있는 고도로 당화된 막당단백질이다. 이 단백질은 체세포 줄기 및 전구 세포를 포함한 세포의 광범위한 부분을 정의하는 것으로 알려져 있으며, 다양한 발전된 상피 및 분화 세포로 발현되지만 그것의 정확한 기능은 아직 알려져 있지 않다. 그러나 이는 2분열 세포 운명, 장 상피 세포 분화 및 림프구 생성에 중요한 노치(Notch) 신호 전달 경로와 연결되어 있다 (Ulasovetal.2011.MolMed17:103-12). 더욱 흥미로운 것은 최근 몇 년간 이 분자가 수많은 암의 암 줄기세포(CSCs) 마커로 여겨진다는 것이다. 확실한 증거로 다수의 암의 암 줄기세포에서 CD133이 발현되어짐을 보았으며, 면역 결핍 생쥐에서 CD133 음성으로 대응되는 것보다 CD133 양성 세포의 발암 가능성이 높았다(Dittfeldetal.2009.RadiotherOncol92:353-61).

면역 요법은 최근 몇 년 동안 암 치료에 큰 영향을 미쳤다. 그러나, 항체의 사용은, 인간화 항체일지라도 치명적일 수 있는 부작용을 초래할 수 있었다(Hanseletal.2010.NatRevDrugDiscov9:325-38). 이에 ‘더 크고 더 나은’추가적인 것을 찾기 위한 검색이 이어져 왔다. 치료제로서 핵산을 이용하기위한 몇 번의 시도는 비록 실망스러운 결과들 이었지만, 적어도 세포에 들어가는 핵산의 실패 때문만은 아니었다(Shigdaretal.2011.BrJHaematol155:3-13).

앱타머로 불리는 화학적 항체는 지난 20 년 동안 임상 응용 프로그램에 점점 더 사용되어졌다. 실제로, 하나의 앱타머, pegaptanib (항 VEGF 앱타머)는 FDA의 승인 및 여러 임상 시험이 있었다. 앱타머의 치료 용도에 대한 관심의 증가는 면역성이 나타나지 않고, 작은 배치별 변화로 화학적 합성이 가능하며 종래의 항체보다 안정하다는 사실 등 여러 가지 이유 때문이다. 또한 이것의 작은 사이즈는 우수한 종양 침투를 보여주기 때문이다. 그러나 가장 중요한 기능은 기능을 손실 없이 나노 입자, 약물, 조영제 또는 다른 핵산 치료제에 이 앱타머가 부착되는 능력이다(Mengetal.2012.PLoSOne7:e33434). 이 기능은 현재의 치료 방법들보다 더 적은 부작용으로 새로운 더 많은 타켓된 치료들를 선도하고 있다(Mengetal. 2012 supra). 주로 수동적인 종래의 치료 방법과 비교했을 때, 타켓 전달 시스템은 훨씬 더 효율적이다. 앱타머는 효율적인 약물 전달체로서 단시간 내에 내부화 될 수 있고, 세포 표면의 타겟에 결합할 수 있다.

일반적 기재들 및 선택된 정의들

용어 "및 / 또는", 즉, "X 및 / 또는 Y"는 "X 와 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 양쪽의 의미 또는 또 다른 하나의 의미는 설명에 대한 보충을 제공하기 위함으로 취해져야 한다.

본 명세서에 포함된 문서, 행위, 재료, 장치, 논문 등에 관련된 논의는 이러한 문제의 일부 또는 전부가 종래 기재적 기초의 일부를 형성하거나 본원의 각 청구항의 우선일 이전에 존재한 당업계의 일반 지식과 공통되어져서는 안된다.

본 명세서의 전반에 걸쳐, 특별히 달리 언급된 또는 달리 해석된 문맥, 한 단계의 예, 물질의 조성, 단계의 그룹 또는 물질의 조성물에 그룹 또는 단계, 물질의 조성물들은 물질의 조성물에 단계 또는 그룹의 이들의 하나 및 복수(즉, 하나 이상)를 포함하여 취해져야 한다.

본 명세서의 각 예는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 본 명세서에 각각의 예 및 모든 다른 일예에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용되어진다.

본 명세서에 기재된 발명은 당업계의 지식을 가진 자라면 구체적으로 설명되지 않은 변이 및 변형된 부분을 쉽게 이해할 것이다. 이 명세서는 이러한 모든 변이 및 변성을 포함하는 것들을 이해해야만 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별 및 조합하여 그리고 임의의 모든 조합 및 임의의 2개 이상을 포함하는 단계 또는 기능들이 언급 또는 설명된, 모든 단계, 특징, 조성물과 화합물을 포함한다.

본 명세서는 본원에 기재된 구체적인 예에 의한 범위에 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 본 명세서에 개시된 범위 내에 속하는 것임을 명백히 한다.

본 발명은 분자 생물학, 재조합 DNA 기재, 세포 생물학 및 면역학의 통상적인 실험에 나타내지 않는 과도한 실험없이 실시되었다. 이와 같은 과정은 문헌 Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning에 예를 들어 설명되어져 있다.: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III; DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text; Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed, 1984) IRL Press, Oxford, whole of text, and particularly the papers therein by Gait, ppl-22; Atkinson etal,pp35-81; Sproatetal, pp83-115;and Wuetal,pp135-151;4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.,1985) IRLPress, Oxford, whole of text; Immobilized Cell sand Enzymes: A Practical Approach(1986) IRLPress, Oxford, whole of text; Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S.ColowickandN.Kaplan,eds.,AcademicPress,Inc.), whole of series, Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E.LandFenichel, R.L.(1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73336-342; Merrifield, R.B.(1963). J.Am.Chem.Soc. 85, 2149-2154; Barany, G. and Merrifield, R.B.(1979) in The Peptides (Gross,E.andMeienhofer,J.eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, NewYork. 12. W,E., ed.(1974) Synthese von Peptide nin Houben - Weyls Metod ender Organischen Chemie (M,E.,ed.), vol.15,4 the dn., Parts1and 2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky,M. (1984) Principlesof Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M.&Bodanszky, A.(1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky,M. (1985) Int. J.Peptide Protein Res. 25,449-474; Handbook of Experimental Immunology, VoIs. I-IV (D.M.WeirandC.C.Blackwell,eds. ,1986, Blackwell Scientific Publications); and Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (JohnR.W.Masters,ed.,2000), ISBN0199637970, whole of text.

본 명세서에 전반에 걸쳐, 문맥에 따라 달리 해석되지 않는 한, 단어“포함하다”, 또는 “포함하다”또는“포함하는”과 같은 차이는 명시된 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 것이지만, 다른 단계 또는 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하지 않는다.

용어 "구성되다" 또는 "구성되는"은 참조 물질의 방법, 과정 또는 조성물이 인용된 단계들 및 / 또는 구성 요소 및 추가 단계 또는 구성 요소를 가지고 있다는 의미로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 중량, 시간, 투여량 등으로 측정값을 참조할 때 사용된 용어 “약”은 개시된 방법을 적절하게 실시하였을 때 ± 20% 또는 ± 10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 매우 바람직하게는 ± 1%, 더욱 더 바람직하게는 ± 0.1%의 편차를 포함하는 것을 의미한다.

단일 뉴클레오티드 서열 또는 올리고뉴클레오티드 혼합물 중 하나로 본 명세서에서 일반적으로 사용된 용어“앱타머”는 특이적으로 CD133에 결합하는 특성을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 “앱타머”는 단일 핵산 가닥을 치칭한다. 구조적으로, 본 발명의 앱타머는 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합한다.

본 명세서에 사용된 용어 “올리고뉴클레오티드”는 폴리디옥시리보뉴클레어티드(2‘-디옥시-D-리보스 또는 변이된 형태) 즉 DNA, 폴리리보뉴클레어티드(D 리보스가 포함된 또는 그것의 변이의 형태) 즉 RNA 그리고 퓨린 또는 피리미딘 염, 또는 변이된 퓨린 또는 피리미딘 염 또는 염기 abasic 뉴클레오티드의 N-글리코사이드 또는 C-글리코사이드 폴리뉴클레오티드의 다른 형태를 총칭한다. 본 발명에 따르면, 용어“올리고뉴클레오타이드”는 종래의 염기, 당 잔기 및 결합된 인터뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 세 모이어티(moieties)의 일부 또는 전부가 변형된 것을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “RNA 앱타머”는 리보뉴클레오시드 단위를 포함하는 앱타머이다. RNA 앱타머는 본 명세서에서 정의된 RNA 유사체를 포함한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “결합 친화성” 및 “ 결합 활성”은 결합 또는 비 결합된 타겟에 리간드 분자 / 앱타머의 경향 또는 리간드 분자 / 앱타머의 결합 강도 측정 또는 타켓에 결합된 리간드 분자 / 앱타머의 친화성을 말하는 것이다. “결합 활성” 및 “결합 친화성”에 중요한 상호 작용을 일컫는 에너지론은 상호 작용하는 파트너의 필요한 농도, 이러한 피트너가 결합할 수 있는 비율, 그리고 용액 안에 프리 분자 및 결합하는 바운드(bound)의 농도와 관련된 의미를 말한다. 에너지론은 다른 방법들, 해리 상수의 결정, Kd를 통해 본 것이 특징이다. 당업계에 공지 된 바와 같이 낮은 해리 상수는 서로 다른 분자의 강한 결합 및 친화성을 나타낸다. 일 예에서, 해리 상수는 최소 10^-6 M 이고, 다른 예에서 최소 해리 상수는 10^-8 M 및 10^-9 M 이다.

본 명세서에서 사용된 용어 “생물학적 시료”는 세포 또는 세포의 부분 또는 대상의 조직 또는 유체의 양을 의미한다. 대부분의 경우, 시료는 대상과 동떨어져 있지만, 용어 “생물학적 시료”는 대상과 동떨어져 있지 않고, 인 비보에서 분석된 세포 또는 조직이라 할 수 있다. 종종, “생물학적 시료”는 대상에서 세포까지 포함되지만, 용어는 유전자 발현 측정이 가능한 혈액, 타액, 소변의 비 세포의 분획과 같은 비 세포의 생물학 재료라 할 수 있다. 생물학적 시료들은 조직 생검, 천자 생검, 촬과상(예 협측 부스러기), 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 골수, 소변, 타액, 객담, 세포 배양, 흉수, 심낭 유체, 복수 또는 뇌척수액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료는 조직 생검 및 세포 배양을 포함한다. 생물학적 시료 또는 조직 시료는 개별적으로, 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 조직 생검, 소변, 대변, 객담, 뇌척수액, 늑막액, 유듀 흡입물, 림프액, 피부, 호흡기, 장, 및 비뇨 생식기액, 눈물, 타액, 모유, 세포(혈구를 포함하지만 한정하지 않음), 종양, 기관, 및 인 비트로 세포 배양 시료가 포함 분리된 구성 조직 또는 유체의 시료라 할 수 있며 이제 한정하지 않는다. 일부 실시 예에서, 시료는 절제, 기관지 생검 또는 프라이머리(primary) 또는 전이성 종양, 또는 흉수의 세포 블록의 생검 또는 미세 천자 생검이다. 또한 세침 흡인 시료를 사용할 수도 있다. 시료는 파라핀 또는 냉동 조직일 수도 있다. 대상으로부터 세포의 시료를 수득될 수 있을 뿐만 아니라, 분리된 세포들(예를 들어 다른 사용자에 의해 분리된)을 사용하거나 또는 본 발명의 인 비보 실험 방법에 의해서 실시할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “커플링된”은 RNA 앱타머가 본 명세서에 기재된 검출 제제, 성분, siRNA 또는 리보자임에 커플링된, 부착된 또는 접합된 것을 포함하도록 의도되어 있다. 커플링하는 효과를 위한 방법은 당업계의 기재에 공지되어 있지만, 펩타이드 링커 또는 전체 체인 RNA 및 제제(예를 들어 siRNA, 리보자임)의 직접적인 화학적 합성의 접합, 연결에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 “분리하다”는 RNA 앱타머 또는 줄기 세포(예: 암 줄기세포)를 다른 구성 요소로부터 분리 또는 정제한 것을 의미한다. 분리된 세포는 자연적으로 발생할 수 있는 환경에서의 세포를 의미한다. 분리된 세포는 자연적으로 획득할 수 있는 상태를 기준으로 정제된 것일 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “리간드”는 타겟에 결합하는 능력을 가진 분자 또는 다른 화학적 물질을 지징한다. 리간드는 펩타이드, 올리고머, 핵산(예, 앱타머), 작은 분자(예, 화학 화합물), 이들의 항체 또는 그 단편, 핵산 - 단백질 융합 및 / 또는 기타 친화성 제제를 포함 할 수 있다. 따라서, 이하에 개시된 리간드는 앱타머 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 당업계에서 정의된 기술를 포함하는 다른 라이브러리와 같이 특이적으로 조합된 라이브러리, 임의의 것을 포함하는 라이브러리, 임의의 소스로부터 올 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “ 변형된 RNA 앱타머”는 이것의 단위로서 리보뉴클레오시드르 포함한 중합체 분자를 의미한다. 또한, 다음 중 적어도 최소 하나를 포함한다: 2‘-데옥시, 2’-할로(2‘-플루오로 포함), 2’-아미노(바람직하게는 치환되지 않은 또는 모노- 또는 디- 로 친환된), 2‘-모노, 디- 또는 트리-할로메틸, 2’-O-할로-치환된 알킬, 2‘-알킬, 아지도, 포스포오틸에이트, 설피드릴, 메틸포스포네이트, 플루오레세인, 로다민, 피렌, 비오틴, 산틴, 하이포크산틴, 2,6-디아미노 퓨린, 2-히드록실-6-메켑토퓨린 및 황을 가지는 6 위치 또는 할로를 가지는 5 위치가 치환된 피리미딘 염기 또는 C¹⁵ 알킬그룹, abasic 링커, 3'- 디옥시아데노신 뿐만아니라 “말단 체인”또는 “비-확장가능한”안알로그(RNA의 3 '말단) 또는 ³²P, ³³P 와 같은 라벨들 및 유사체. 이들 모두는 본 명세서에 개시된 표준 합성 기재를 이용하여 RNA에 통합될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “치료학적 유효량”은 암 줄기세포 및 / 또는 하나 또는 그 이상의 암 발생자에서 발현된 CD133의 수를 현재의 수준보다 줄이거나 억제하는 RNA 앱타머, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물의 유효량을 의미한다. 사용자들은 예를 들어, 특정 대상 및 / 또는 유형 또는 질병의 심각한 정도에 따라 양이 달라질 수 있음이 인식될 것이다. 이 용어는 본 발명의 RNA 앱타머의 특정 양을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에서 사용된 용어 “치료하다” 또는 “치료”또는“치료하는”은 임상 조건이 나타나는 또는 암에 의해 야기된 최소 하나의 증상을 줄이거나 억제하는 RNA 앱타머, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것으로 의미를 이해하여야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “예방하다” 또는 “예방하는” 또는 “예방”은 암의 최소 하나의 증상의 중지, 방해 또는 지연시키기 위한 RNA 앱타머, 항암제, 전달체 또는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여하는 것으로 의미를 해석해야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “특이적 결합들”은 다른 세포나 물질에서보다 특이적인 세포 또는 물질에서 RNA 앱타머가 더 자주, 더 빨리, 더 긴 지속 기간 및 / 또는 더 큰 친화력으로 반응 또는 결합하는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정한 타겟 단백질에 결합하는 RNA 앱타머는 관련 없는 단백질 및 / 또는 에피토프 또는 그것의 면역원성 단편의 결합보다 타겟 단백질 및 / 또는 에피토프 또는 그것의 면역원성 단편에서 더 높은 친화력, 더 쉽게, 더 긴 지속기간 결합한다. 또한, 예를 들어, RNA 앱타머는 첫 번째 타겟에 특이적으로 결합되어지고 또한 두 번째 타겟에 특이적으로 결합되지 않을 수도 있다는 것으로 정의하여 이해된다. 따라서 “특이적 결합”은 “선택적 결합”이라는 용어에 포함된 정확한 결합 또는 다른 분자의 비검출 결합이 반드시 동반되지는 않는다. 일반적으로, 반드시는 아님, 본 명세서의 결합은 특이적인 결합을 의미한다. 결합의 특이성은 타겟 앱타머의 해리 상수(Kd)와 일반적인 환경 또는 무관한 분자에 앱타머 및 기타 물질의 해리 상수를 비교한 것으로 정의된다. 일반적으로 타겟의 반응하는 앱타머의 Kd는 무관한 물질 또는 환경에서 수반되는 물질의 Kd보다 2배, 5배 또는 10배 이하 일 것이다. 보다 더 바람직하게는, Kd가 50배, 100배, 200배 이하 일 것이다.

본 명세서에서 사용될 수 있고 사용된 용어 “CD133⁺" 또는 “세포에 발현된 CD133"은 교대로 사용할 수 있다. 이 용어는 임의의 적합한 수단으로 결정될 수 있는 CD133 항원의 세포 표면 발현의 의미를 포함한다. 일 예에서, 소정의 마커에 양성을 나타내는 세포는 형광 강도와 관련된, 마커가 세포 표면에 존재하는 정도에 따라 그 마커의 낮은(IO 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 발현자(expresser)임을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “대상”은 인간 또는 비 인간을 포함하는 임의의 대상을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 비 인간 대상은 인간이 아닌 영장류, 유제류, 소과, 개, 고양이, 토끼목(토끼, 토끼와 새앙토끼), 설치류 (마우스, 쥐, 기니피그, 햄스터 및 모래쥐), 조류, 물고기를 포함 할 수 있다. 일 예에서, 상기 대상은 인간이다.

앱타머들

앱타머의 몇가지 독특한 특성은 분자 생물학의 다양한 애플리케이션 및 잠재적인 약제학적 제제의 다양한 사용을 위한 매력적인 툴(tools)을 만든다. 첫째, 대부분의 앱타머는 피코(pico) 에서 나노(nano) 분자 범위에 전형적인 해리 상수를 보여주는 높은 친화력으로 타겟에 결합한다. 앱타머에 대한 결합 부위는 타켓 분자의 약제학적 제제로 현재 이용가능한 것과 매우 유사한 길항 활동의 결과에 의한 쪼개짐 및 홈들을 포함한다. 둘째, 앱타머들은 온도 및 보관 조건에 넓은 범위에 걸쳐 구조적으로 안정하다. 셋째, 앱타머들은 단일 클론 항체들을 생산하는데 필요한 비용 및 작업에 민감한 생물학적 시스템과 대조적으로 화학적으로 합성 할 수 있다.

이론상 단계에 제한이 없이, RNA 앱타머는 일반적으로 변이되지 않은 RNA 보다 변형된 RNA의 플라즈마 안정성이 더 높을 뿐만 아니라 그것의 타켓 단백질들을 위한 RNA 앱타머에 대해 이론적 높은 친화력으로 많은 그룹들에 의해 선호되었다.

본 명세서에 개시된 것은 siRNA　또는 리보자임, 화학요법 약물, 방사성 동위 원소, 독소 및 / 또는 항원을 갖는 다른 제제의 효율적인 세포 내 전달을 위해 사용될 수 있는 CD133 항원에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 분자이다.

앱타머는 단백질 또는 소분자와 같은 특정 타겟 분자에 결합하는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체이다. 따라서, 앱타머는 항체에 올리고뉴클레오티드와 유사하다. 일반적으로 앱타머는 약 15~100 뉴클레오티드를 포함하고 바람직하게는 15~40 뉴클레오티드, 더 바람직하게는 20~40 뉴클레오티드로 이러한 길이의 올리고뉴클레오티드는 통상적 기재에 의해 제조 될 수 있다. 옵션으로 앱타머는 특이적인 결합에 효율을 위해 최소 약 6 뉴클레오티드, 바람직하게는 10, 더 바람직하게는 14 또는 15 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 10 보다 더 작은(예를 들어 6-mers) 서열을 포함하는 결합 영역의 앱타머는 적절한 상호작용이 타겟이 처한 환경의 맥락(context)에서 얻어진다면 가능하다. 따라서, 이것은 다른 재료들, 덜 특이적인 및 결합이 덜 강한 힘에 의한 작은 간섭이 있을 경우 요구 될 수 있다.

앱타머 결합은 앱타머 올리고뉴클레오티드의 이차구조 형성에 크게 좌우된다. RNA 및 단일 가닥 DNA(또는 유사체) 앱타머 둘 다 알려져 있다. 예를 들면, Burke et al (1996). J. Mol. Biol. 264:650-666; Ellington and Szostak (1990). Nature 346:818-22; Hirao et al (1998). Mol Divers. 4:75-89; Jaeger et al (1998). EMBO Journal 17:4535; Kensch et al (2000). J. Biol. Chem 275:18271-8; Schneider et al (1995). Biochemistry 34:9599-9610; and US 5773598; US6028186; US 6110900; US6127119; and US 6171795.

특정한 타겟에 대한 앱타머의 선택

사실상 임의의 특정 타겟에 결합하는 앱타머는 SELEX^TM(Systemic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)이라는 반복적 과정을 사용하여 선택할 수 있다. 그 과정은 예를 들어, US 5270163 및 US 5475096 에 기재되어 있다. SELEX^TM과정은 핵산이 2차원 및 3차원 구조의 다양한 형태를 위한 충분한 용량 및 단량체 또는 중합체인 거의 모든 화학적 화합물을 가지는 리간드(즉, 특이적인 결합 쌍 형성) 역할로 그들의 단량체로 이용 가능한 풍부한 화학적 다양성을 가지는 독특한 이해을 기초로 한다. 임의의 크기 또는 성분의 분자는 타겟으로서 역할 할 수 있다.

SELEX^TM과정, 시작점으로, 임의의 서열을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 큰 라이브러리 또는 전체(pool)에 의존한다. 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 변형되지 않은 DNA, RNA, 또는 DNA / RNA 하이브리드들이 될 수 있다. 어떤 실시예에서, 전체(pool)는 100% 무작위 또는 부분적으로 무작위 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에서 전체(pool)은 무작위 서열에 포함된 적어도 하나의 고정된 서열 및 / 또는 보존된 서열을 포함한 무작위 또는 부분적으로 무작위 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에서, 전체(pool)는 올리고뉴클레오티드 전체의 모든 분자에 의해 공유된 서열을 포함할 수 있고, 5 ' 및 / 또는 3' 말단에 적어도 하나의 고정된 서열 및 / 또는 보존된 서열을 포함한 무작위 또는 부분적으로 무작위 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 고정된 서열은 CpG 모티프(motifs), PCR 프라이머에 대한 하이브리드 부위, RNA 중합 효소(예를 들어, T3, T4, T7 및 SP6)에 대한 프로모터 서열, 제한 부위, 또는 폴리 또는 폴리 T 트랙(tracts)과 같은 호모 폴리머 서열, 친화성 컬럼에 선택적 결합을 위한 부위, 및 관심있는 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및 / 또는 시퀀싱을 용이하게 하는 다른 서열들과 같은 기존에 선택된 목적을 위해 통합된 풀의 올리고뉴클레오티드에 공통적 서열이다. 보존된 서열은 동일 타겟에 결합하는 앱타머의 수에 의해 공유되어지고 사전에 기재된, 고정된 서열 이외의 서열이다.

전체(pool)의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 효율적 증폭에 필요한 고정된 서열 뿐만 아니라 임의의 서열 부위를 포함한다. 전형적으로, 기존 전체(pool)의 뉴클레오티드는 30-50의 무작위 뉴클레오티드의 내부 영역의 측면에 고정된 5’및 3’말단 서열을 포함한다. 임의의 뉴클레오티드는 무작위로 절단된 세포의 핵산으로부터 화학적 합성 및 크기 선택을 포함한 방법으로 제조 할 수 있다. 핵산 시험에 서열 변이는 선택 / 증폭을 반복하기 전 또는 동안에 돌연변이에 의해 도입 또는 증가할 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 무작위 서열은 임의의 길이 및 리보 및 / 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함 할 수 있고 변형된 또는 비-천연의(natural) 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함 할 수 있다(예를 들면 US 5958691, US 5660985 및 WO 92/07065). 무작위 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드로부터 당업계에 공지된 올리고뉴클레오티드 합성 기재를 사용하여 합성 할 수 있다. 예를 들면, Froehler et al., (1986). Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 and Froehler et al (1986) Tet. Lett. 27:5575-5578. 무작위 올리고뉴클레오티드는 또한 트리에스테르 합성 방법과 같은 용액 상 방법을 사용하여 합성 할 수 있다. 예를 들면, Sood et al (1977). Nucl. Acid Res. 4:2557 and Hirose et al (1978). Tet. Lett., 28:2449. 일반적 합성은 대부분의 SELEX™ 실험에 대한 충분한 수를 10¹⁴~10¹⁶ 개별 분자 수율, 자동화된 DNA 합성 장비로 실시하였다.

올리고뉴클레오티드의 개시 라이브러리는 DNA 합성기에 자동화된 화학 합성에 의해 생성 될 수 있다. 부분적 무작위 서열은 각각의 부가 단계에서 상이한 몰비에 4 개의 뉴클레오티드를 첨가함으로써 생성 할 수 있다.

올리고뉴클레오티드의 개시 라이브러리는 RNA 또는 DNA 중 하나 일 수 있다. 예를 들어 RNA 라이브러리는 일반적인 T7 RNA 중합 효소 또는 변형된 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 인 비트로 DNA 라이브러리 전사에 의해 생성 및 정제된 개시 라이브러리로서 사용된다. RNA 또는 DNA 라이브러리는 결합에 유리한 조건 하에서 타겟과 혼합, 결합하는 단계적 반복, 분할 및 증폭, 동일한 일반 선택 방식을 사용, 결합의 친화성 및 선택을 원하는 기준으로 실시한다. 보다 구체적으로, 핵산의 개시 전체(pool)를 포함하는 혼합물에 대한 개시는 SELEX™ 방법에 단계들을 포함한다: (a) 결합에 유리한 조건 하에서 타겟과 혼합물을 접촉시키는 단계; (b) 타겟 분자에 특이적으로 결합하는 핵산으로부터 결합되지 않은 핵산 구획; (c) 핵산 - 타겟 복합체 해리; (d) 핵산의 리간드-농축 혼합물 수득을 위한 핵산-타겟 복합체로부터 해리된 핵산 증폭; 및 (e) 타겟 분자에 매우 특이적, 큰 친화성을 갖는 핵산 리간드를 원하는 만큼 수득하기 위한 결합, 분할, 해리 및 증폭의 단계 반복. 이러한 경우 RNA 앱타머 선택은 SELEX™ 방법에 다음 단계를 포함한다: (i) 증폭 단계 전에 핵산 - 타겟 복합체로부터 해리된 역전사하는 핵산 (d); 및 (ⅱ) 과정을 재진행하기 전에 (d)단계로부터 증폭된 핵산 전사.

선택 및 증폭의 사이클(cycle)은 원하는 목표를 얻을 때까지 반복한다. 일반적으로, 결합 강도에 현저한 개선이 달성되지 않으면 사이클을 반복적으로 실시한다. 일반적으로, 핵산 앱타머 분자는 5-20 사이클 방법에서 선택된다. 핵산의 1차, 2차 및 3차 구조의 다양성이 존재하는 것으로 알려져 있다. 구조 또는 모티프(motifs)는 헤어핀 루프(hairpin loops), 대칭 및 비대칭 벌지(bulges), 슈도노트(pseudoknots) 및 이와 같은 것의 무수한 조합으로 지칭된 비-왓슨-크릭 형 상호작용이 가장 일반적으로 포함된 것으로 보인다. 이와 같은 모티프(motifs)의 공지된 모든 사례들은 30 뉴클레오티드 이하의 핵산 서열로 형성될 수 있음을 시사한다. 이 때문에, 약 20~50 사이의 무작위 분절을 포함하는 핵산 서열을 함유한 연속된 임의의 부분에 대한 SELEX™ 방법를 자주 선호한다.

핵심(core) SELEX™ 방법은 특정 목표들을 달성하기 위해 변화하였다. 예를 들면, US 5707796는 bent DNA와 같은 특이적인 구조적 특징을 가진 핵산 분자를 선택하기위해 겔 전기 영동과 결합한 SELEX™의 사용 방법을 기재한다. US 5763177은 결합할 수 있는 광반응 그룹 및 / 또는 광-가교 및 / 또는 광-불활성된 타겟 분자를 포함한 핵산 리간드 선택을 위한 SELEX™을 기반으로 한 방법을 기재한다. US 5567588 및 US 5861254는 타겟 분자에 대한 높고 낮은 친화성을 갖는 올리고뉴클레오티드 사이의 매우 효율적인 분할을 실시하기 위한 SELEX™을 기반으로 한 방법을 기재한다. US 5496938은 SELEX™ 처리가 실행된 후에 개선된 핵산 리간드를 얻는 방법을 기재한다. US 5705337은 타겟에 리간드를 공유 결합하는 방법을 기재한다.

카운터(counter)-SELEX™는 하나 이상의 비-타겟 분자에 교차-반응에 대한 핵산 리간드 서열을 제거함으로써 타겟 분자에 대한 핵산 리간드의 특이성을 개선하는 방법이다. 카운터 SELEX™는 다음의 단계들을 포함한다: (a) 핵산의 후보 혼합물을 준비하는 단계; (b) 후보 혼합물의 나머지 부분으로부터 분할 할 수 있는 후보 혼합물과 관련 있는 타겟에 증가된 친화성을 가지는 핵산인 타겟과 후보 혼합물을 접촉시키는 단계; (c) 후보 혼합물의 나머지 부분으로부터 친화성이 증가된 핵산 분할; (d) 타겟으로부터 친화성이 증가된 핵산 해리; (e) 비- 타겟 분자를 위한 특이적 친화성을 가진 핵산 리간드와 같은 하나 이상의 비 - 타겟 분자와 친화성이 증가된 핵산를 접촉시키는 단계; (f) 타겟 분자에 결합하는 비교적 높은 친화성 및 특이성을 갖는 핵산 서열에 대해 농축된 핵산의 혼합물을 수득하는 특이적 친화성을 가진 핵산 증폭. SELEX™에 대해 기재한 바와 같이, 선택 및 증폭의 사이클은 원하는 목표가 실시 될 때까지 필요한 만큼 반복한다.

대표적인 예로, RNA 앱타머는 Beaucage et al. (1981) Tetrahedr. Letters 22:1859-1862 and Sinha et al., (1984) Nucleosides and Nucleotides 3:157-171. 에 기재된 종래의 기술를 사용하여, 고체 지지체 컬럼 상에서 합성된다. 최종 DMT-그룹은 얻어진 RNA 앱타머로부터 제거되었다. 선택적으로, 광범위한 합성에 사용할 경우, RNA 앱타머는 고체 지지체 방법의 스케일 업에 의해 제조 될 수 있으며 또는 특히 RNA 앱타머는 원하는 최종 산물이 상대적으로 짧은 올리고 뉴클레오티드 일 경우 용액상 기법을 사용하여 제조 될 수 있다. 합성 과정에 대한 개시 물질은 바람직하게 염기를 보호하고, 고체 지지체에 결합하는 5'-non -tritylated RNA -올리고리보뉴클레오티드 또는 원하는 개시 구조의 유사체 일 수 있다. 종래에 사용된 보호 그룹을 사용할 수 있다. 일반적으로 N6 -벤조일은 아데닌, N4 -벤조일은 시토신, N2 -이소는 구아닌, N2 -벤조일은 퓨린에 대해 사용된다. 다른 유용한 보호 그룹에는 페녹(PAC) 및 t-butoxyacetyl(TAC)이 포함된다. 편리하게, 더 많은 염기 불안정성 보호 그룹은 RNA 앱타머의 합성을 위해 사용되어져야 한다; 당업자들은 이러한 그룹을 알고 있다. 이러한 그룹은 일부 가수 분해의 대상이 될 수 있지만 일반적으로 염기성 조건 하에서 매우 안정적인 트리(tri)- 또는 디(di)- 포스페이트 생성의 가수분해를 방지하는데 도움이 될 수 있다. 다른 가시적인 변형은 US 6011020 특허에 개시되어 있고, 공유 결합을 통한 PEG 또는 콜레스테롤과 같은 생체 이용률 향상 분자의 결합에 한정되지 않는다.

더욱이, 2'- 데옥시, 2'- 할로, 2'- 아미노( 모노 또는 디로 치환되지 않음)와 같은 뉴클레오시드 유사체, 2'- 모노, 디- 또는 트리 할로 메틸, 2'- O- 알킬, 2'- O- 할로- 치환된 알킬, 2'- 알킬, 아지도(azido), 포스포로시오에이트(phosphorothioate), 설피드릴(sulfhydryl), 메틸포스포네이트, 플루오레세인, 로다민, 피렌, 비오틴, 크산틴, 하이포크산틴, 2,6- 디아미노퓨린, 2-하이드록시- 6- 머캅토 및 황에 6 위치 또는 할로의 5 위치가 치환된 피리미딘 염기 또는 C_1-5 알킬 그룹, abasic 링커, 3'- 데옥시아데노신 뿐만 아니라 다른 이용 가능한“체인(chain) 말단”또는“비-확장가능한”유사체(RNA의 3‘-말단) 및 이와 같은 것이 RNA 합성 중에 혼입 할 수 있다. 더욱, ³²P 또는 ³³P와 같은 다양한 라벨은 같은 방식으로 제조된 새로운 RNA 유사체 결과로 합성 과정에서 혼입할 수 있다. 다르게 설계된 변형은 US 6011020 특허에 기재되어 있고, 반전된(inverted)-DT 캡(cap) 또는 반전된(inverted) abasic 캡, 또는 이들의 조합이 가능하며, 이와 같은 3 '캡의 결합에 한정되지 않는다.

앱타머의 결합 친화성

결합 친화성은 각각 다른 분자의 결합 강도 또는 친화성의 측정으로 설명한다. 타겟 및 다른 분자에 대해 본 발명의 앱타머 결합 친화성은 Kd를 이용하여 정의된다. 해리 상수는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 방법에 의해 이와 같은 복잡한 혼합물에 대해서도 계산할 수 있다. 예를 들면, set forth in Caceci, M., et al., Byte (1984) 9:340-362. 해리 상수 측정의 예는 US 7602495 특허에, 표면 플라스몬 공명 분석은 US 6562627, US 6562627 및 US 2012/00445849 특허에 기재되어있다. 또 다른 예에서, Kd는 Wong and Lohman, (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432.에 기재된 이중 필터 니트로셀룰로오스 필터를 이용하여 확립되었다.

몇몇의 작은 올리고 뉴클레오티드, Kd의 직접적 판단이 어렵고, 오해의 소지가 있는 높은 결과를 가져올 수 있음이 관찰되었다. 이러한 상황에서,타겟 분자 또는 다른 후보 물질에 대한 경쟁적 결합 분석법은 타겟 또는 후보에 결합하는 것으로 알려진 물질에 대하여 실시될 수 있다. 50% 억제가 발생하는 농도값(Ki) 동일한 Kd는 이상적인 조건이다. 그러나 어떠한 경우에도 Ki는 Kd 값보다 작다. 따라서, Ki의 결정은, 다른 방법으로, Kd 값을 최대값으로 설정한다. 기술적 어려움으로 Kd의 정확한 측정이 어려울 경우, Ki의 측정은 Kd에 대한 상한을 제공하기 위해 쉽게 치환시킬 수 있다. Ki 값은 존재하는 타겟에 결합된 앱타머를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

앱타머 안정성 개선

포스포디에스테르(phosphodiester) 형태의 올리고뉴클레오티드에 치료제로서 핵산 사용 시 발생 가능한 잠재적 문제는 원하는 효과가 명백해지기 전에 엔도뉴클레아제(endonucleases) 및 엑소뉴클레아제(exonucleases)와 같은 세포내 및 세포외 효소에 의해 유체에서 빠르게 저하될 수 있다는 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 및 / 또는 뉴클레아제 절단으로부터 보호하는 것과 같은 RNA 앱타머의 하나 이상의 특징을 개선하기 위해 추가 변형 설계된 RNA 유사체를 포함한다.

본 명세서에 포함된 올리고뉴클레오티드는 변형을 포함하지만, 핵산 리간드 염기 또는 핵산 리간드 전체에 추가적으로 전하 분극, 소수성, 수소 결합, 정전기적 상호 작용, 및 유동(fluxionality) 등의 다른 화학적 그룹들을 제공하며, 이것에 한정하지 않는다.

뉴클레아제 내성이 있는 올리고뉴클레오티드를 생성을 위한 변형은 또한 하나 이상의 치환 인터뉴클레아제 링커들, 변형된 당, 변형된 염기, 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 변형은 2'- 위치 당 변형, 5- 위치 피리미딘 변형, 8- 위치 퓨린 변형, 외향 고리 아민의 변형, 4- thiouridine 치환, 치환 5- 브로모 또는 5- 요오도 우라실, 백본 변형, 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 알킬포스페이트, 메틸레이션(methylations), 특이한 염기쌍의 조합; 캡핑과 같은 3' 및 5' 변형; 고 분자량 결합, 비 면역원성 결합 화합물; 친유성 화합물 결합; 인산염 백본 변형을 포함한다.

일 예에서, 비면역원성, 본 발명의 앱타머에 결합된 고분자 화합물은 폴리 알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol)이며, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 이다. 일 예에서, 백본 변형은 포스페이트 백본에 하나 이상의 포스포로티오에이트의 혼입을 포함한다. 또 다른 예에서, 본 발명의 앱타머는 포스페이트 백본안에 10 개 미만, 6 개 미만, 또는 3 개 미만의 포스포로티오에이트(phosphorothioates)를 포함한다.

앱타머의 유용성

본 발명의 RNA 앱타머 분자는 타겟 분자(예 암 줄기세포 내 CD133) 분리 및 정제를 위한 친화성 리간드, 추적, 모니터, 타겟 분자 검출 및 정량(예 암 줄기세포 내 CD133), 또는 치료 효과를 달성하기 위한 생리학적 관련 블록, 허용, 활성 또는 촉매 반응 프로브로 사용될 수 있다.

본 발명의 RNA 앱타머 분자는 인 비보 과정에서 사용될 수 있다. 예를 들어 타겟 분자를 정제하기 위한 친화성 정제 혼합물(예 암 줄기세포 내 CD133). 앱타머에는 세포 배양 또는 세포 추출물로부터 오염 물질을 정제하는 타겟 분자(예 암 줄기세포 내 CD133) 크로마토그래피 분리가 적합하다.

일 예에서, 본 발명의 RNA 앱타머 분자는 타겟 결합 또는 고정화를 위한 포획제를 사용할 수 있다. 고체 지지체는 필터, 웨이퍼, 웨이퍼 칩, 막 및 박막과 관련된 구조 및 조성을 갖는 물질로 구성될 수 있다. 그러나, 고체 지지체가 물질을 포함 할 수 있음이 고려되지만, 레진, 친화성 레진, 마그네틱 또는 폴리머 비드 또는 다른 진단제 시약, 진단, 검출 또는 정량 연구를 위해 캡쳐 또는 고정한 시약을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 고체 지지체는, 원하는 용도의 어떤 재료를 포함 할 수 있고, 포함된 임의의 물질은 유리, 금속 표면 및 스틸(steel), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), 폴리아미드(polyamide), 및 폴리비닐리덴플루오라이드(polyvinylidenefluoride) 등 또는 이들의 조합과 같은 세라믹 또는 중합체 물질과 같은 재료를 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

CD133 항원

AC133으로 알려진, CD133은 당단백질(Prominin-1으로 알려진) 이다. 그것은 특히 세포의 돌출부에 특이적으로 위치한 펜타스판(pentaspan) 막당단백질의 구성원이다. CD133은 조혈 줄기 세포, 혈관 내피 전구 세포, 신경교모세포종, 신경원 및 신경교 줄기세포, 우식 소아 뇌종양, 뿐만 아니라 성인 신장, 젖샘, 기관지, 침샘, 태반, 소화관, 고환 및 다른 세포 유형에서 발현된다.

CD133 발현 암 줄기세포의 분리 및 정제

줄기 세포의 분화에 의해 성인 세포 재생으로 가장 잘 알려진 예는 조혈 시스템이다. 조혈 줄기 세포 및 전구 세포와 같은 발전적 미성숙 전구체는 다양한 혈액 및 림프 세포 유형으로부터 점차 분자 신호에 반응한다. 줄기 세포는 상피 조직과 간엽 조직을 포함하는 다른 조직에서 발견된다. 암 줄기세포는 예를 들어, 정상적인 줄기세포 또는 유전자 손상의 줄기세포 및 / 또는 분화세포의 증식 조절 이상의 결과에 대한 세포 유형에서 발생할 수 있다.

암 줄기세포는 종양 줄기세포를 포함하는 모든 암으로부터 유도 될 수 있다. 즉 이 세포는 광범위하게 무한정 증식 능력을 구비하고, 대부분의 암 세포를 발생시킨다. 확립된 종양 내, 대부분의 세포는 광범위한 증식 능력 및 새로운 종양 형성, 및 암 줄기세포의 작은 서브세트(subset)가 잠재적인 종양유전자 결핍 종양세포를 야기할 뿐만 아니라 암 줄기세포 재생을 위한 증식을 상실한다. 암 줄기세포들은 비대칭 및 대칭적으로 나눌 수 있으며, 증식의 변수 비율을 표시 할 수 있다. 암 줄기세포는 재획득된 줄기세포의 특성을 가지는 증폭세포 또는 전구세포를 포함할 수 있다.

줄기세포로 분리될 수 있는 대표적인 암에는 섬유종, 점액종, 지방종, 연골종, 골종, 척삭종, 혈관종, 육종, 림프종, 활막종, 림프육종, 중피종, Ewing’s 종양, 평활근종, 횡문근종, 대장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암, 낭선 암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막 암종, 정상 피종, 배아 암종, Wilm’s 종양, 자궁 경부암, 고환 종양, 폐암종, 소세포 폐암종, 방광암종, 상피성 암종, 신경아교종, 별아교세포종, 수아세포종, 두개 인두종, 뇌실막 세포종, 송과체종, 혈관 모세포종, 청신경, 희돌기 교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막 모세포종을 포함한 고형 암종으로 특징 지어진 암들을 포함한다.

본 발명에 줄기세포로 분리되거나 농축될 수 있는 대표적인 추가 암은 저급 (low grade) / 여포성 비- Hodgkin’s 림프종(NHL), 소 림프구(SL)NHL, 중급(intermediate grade) / 여포 NHL, 중급 확산 NHL, 상급(high grade) 면역아세포 NHL, 고급 작은 비분열 세포 NHL, 부피가 큰 질병 NHL 및 Waldenstrom’s 마크로글로불린혈증, 만성 백혈구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 림프 구성 백혈병, 림프 구성 백혈병, 단핵구 백혈병, 골수성 백혈병 및 골수성 백혈병을 포함한 B 세포 림프종 및 백혈병과 같은 조혈 악성 종양을 포함한다.

암 줄기세포 내 CD133은 본 명세서에 기재된 앱타머 분자를 사용하여 선택할 수 있다. 예를 들어, 형광 염료가 결합된 앱타머는 암 줄기세포의 양성 선별을 위해 사용될 수 있다. CD133은 또한 일부 정상 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 그러나, CD133 발현 암 줄기세포에서 상향 조절되는 것으로 생각된다. 암 줄기세포 마커는 일반적으로 적어도 동일한 기원 또는 비-종양 세포에서 분화된 세포보다 최소 5배 이상 발현되며, 예를 들어, 최소 약 10배, 또는 최소 약 15배, 또는 최소 약 20배, 또는 최소 약 50배 또는 최소 약 100배 더 크다. 또한 선택 과정은 암 줄기세포가 아닌 암 세포의 제거를 위해 사용할 수 있는 음성 선택 마커를 포함할 수 있다.

본 발명을 실시하는데, 세포 내 CD133의 분리는 다수의 다른 방법에 의해 실시 될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 RNA 앱타머는 투박한 분리가 가능하도록 고체 지지체에 부착할 수 있다. 다른 효능의 다양한 기술는 정교한 장비 및 / 또는 기술 스킬의 성능과 필요성의 분리 효율, 세포 독성, 편의성 및 속도에 의존하여 이용할 수 있다. 분리 또는 정제를 위한 방법는 자성 비드가 코팅된 앱타머를 사용한 자성 분리, 친화성 크로마토그래피 및 고체 매트릭스에 부착된 앱타머 “패닝”을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 정확한 분리 또는 정제를 제공하는 기술은 FACS를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. FACS 제조하기위한 방법은 당업자는 알 수 있을 것이다.

암 줄기세포에 발현된 CD133의 농축

일 예에서, 본 발명의 RNA 앱타머 분자는 대상로부터 얻은 생물학적 시료에서 농축된다. 일반적으로 대상은 암 줄기세포를 포함하는 종양을 갖는 또는 종양을 갖는 것으로 의심되는 것 중에 하나 일 것이다. 용어 “농축된” 또는 “농축”또는 이들의 변형은 하나의 특정 세포 유형의 부분(즉, 암 줄기세포)이 세포의 비 처리된 부분(예를 들면 세포 시료)에 비해 증가된 세포 부분을 기재하기 위해 사용된다.

일 예에서, 암 줄기세포에 대해 농축된 부분은 적어도 약 0.1%, 0.5% 또는 1%, 2%, 5% 이상 또는 10% 또는 15% 또는 20% 또는 25% 또는 30% 또는 50% 또는 75% 암 줄기세포 관련 CD133을 포함한다. 이와 관련된, 용어 "암 줄기세포를 포함하는 농축된 세포 부분"은 본 명세서에 기재된 X% 백분율인 X% 암 줄기세포를 포함하는 세포의 부분에 대한 명백한 지원을 제공하기 위해 실시될 것이다.

일 예에서, 세포 부분은 선택 가능한 형태 CD133⁺ 세포를 포함하는 세포 제제로부터 농축된다. 이와 관련하여, 용어 "선택 가능한 형태"는 CD133 내포 세포의 선택을 허용하는 세포 발현 마커(예: 세포 표면 마커)를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

앱타머 분자를 사용한 암의 진단

본 발명의 RNA 앱타머 분자는 악성 조직에서 암 줄기세포의 존재를 결정하기 위한 진단 목적으로 인 비트로에서 사용할 수 있다. 방법은 CD133⁺ 암 줄기세포의 존재에 대한 생물학적 시료 검사를 포함한다. 예를 들어, 생물학적 시료는 본 발명의 표지된 RNA 앱타머 및 시료로 결정된 세포에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 능력과 연관될 수 있다. 결합은 암 줄기세포 내 CD133의 존재를 나타낸다. 본 발명의 RNA 앱타머 본 발명의 분리된 RNA 앱타머를 대상에 투여함으로써 인 비보 종양을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 결합 앱타머는 유동 세포 계측법, 현미경, 외부 신티그래피(scintigraphy), 방출 단층 촬영, 광학 영상 또는 방사핵(radionuclear) 주사를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 방법은 질병 정도 및 치료 반응 모니터닝 변화와 암 단계 결정에 사용할 수 있다.

암 줄기세포의 검출은 검출 가능한 표지로 RNA 앱타머를 결합함으로써 용이하게 할 수 있다. 검출 라벨의 예는 각종 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 전자 밀도 라벨, MRI 용 라벨 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 예에는 호르세라디쉬 페로시디제(horseradish peroxidise), 알칼린 포스파티제(alkaline phosphatise), β-갈락토시다제(galactosidase), 또는 아세틸콜린에스타아제(acetylcholinesterase)를 포함한다. 적합한 프로스데틱(prosthetic) 그룹 복합체의 예로는 스트렙타비딘(streptavidin) / 바이오(biotin) 및 아비딘(avidin) / 바이오틴을 포함한다. 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리폰(umbellifone), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민, 디스클로트리아지닐아민 플루오레세인(dischlorotriazinylamine fluorescein) , 단실 클로라이드(dansyl chloride) 또는 피코에리트린(phycoerythrin)을 포함한다. 발광 물질의 예는 루미놀을 포함한다. 생물 발광 재료의 예에는 루시페라제, 루시페린, 및 애큐오린(aequorin) 및 적합한 방사성 물질의 예에는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ^94mTc, ¹²⁴I, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁶⁸Ga, ⁸⁶Y, ⁸²Rb 또는 ³H을 포함한다.

앱타머의 3' 말단 표지는 예를 들어 Klenow 폴리머라제를 사용하여 주형 확장, T4-RNA 라이게즈- 매개 결합 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제 (deoxynucleotidyl transferase)에 사용하여 실시될 수 있다. 5' 말단에 표지는 바이오틴을 부착하는데 사용될 수 있는 과량의 GTP-β-S, 티올 및 인 비트로 전사 혼합물의 첨가제에 의해 실시될 수 있다. 더욱이, 5'- 또는 3'- 말단 중 하나에 적합한 그룹의 직접적인 화학 결합은 앱타머 라벨에 사용할 수 있다.

본 발명의 항암제

본 발명의 RNA 앱타머 분자는 CD133⁺ 세포에 바람직하게는, 암 줄기세포에 직접적인 모이어티(moiety)로 사용되고 그 모이어티(moiety)에 결합할 수 있다. 모이어티(moieties)의 예로는 암 줄기세포를 죽이는 데 사용할 수 있는 독성 물질, 방사성 핵종, 또는 화학 요법제를 포함한다.

RNA 앱타머는 모이어티(moiety)에 융합될 수 있다. 예를 들어. 독성, 모이어티(moiety)의 힘 및 화학적으로 합성 또는 결합, 예를 들어. 비- 펩티드 공유 결합, 비- 아미드 결합된 앱타머는 부분적으로 생성된 RNA 앱타머와 모이어티를 결합하는데 사용된다. 대안으로, RNA 앱타머 및 모이어티는 적합한 링커 펩타이드로 인해 결합할 수도 있다.

유용한 독소 분자는 세포 내 존재 시 중요한 세포 독소인 펩티드 독소를 포함한다. 독소의 예에는 효소 활성을 방해 및 이로 인해 암 줄기세포를 죽이는 세포 독소, 대사성 교란(억제제 및 활성제) 및 이펙터 부분으로 정의된 반경 내의 모든 세포를 죽이는 방사성 분자를 포함한다. 대사성 교란자는 예를 들어, 정상 기능이 바뀌는 세포의 대사를 바꾸는 효소 또는 사이토카인(cytokine) 분자이다. 대체로, 용어 독소는 종양 세포 사멸을 일으키는 작용기를 포함한다.

많은 펩티드 독소는 일반적인 진핵 수용체 결합 도메인을 가지고 있다; 이러한 경우의 독소는 CD133과 관련되지 않은 살해 세포를 차단하도록 변형되어야한다 (예를 들어 CD133과 관련되지 않은 살해 세포를 차단하기 위해서는 변형되지 않은 독소에 대한 수용체를 가지지 않음). 이러한 변형은 분자의 세포 독성 기능을 유지하는 방식으로 이루어져 있음이 틀림없다. 잠재적으로 유용한 독소 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 리신, 0- 시가(Shiga)- 와 같은 독소(SLT-I, SLT-II, SLT-II_V), LT 독소, C3 독소, 시가 독소, 백일해 독소, 파상풍, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin), 알로린(alorin), 사포닌(saponin), 및 모데신(modeccin) 및 젤라닌(gelanin)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 독소에는 종양 괴사 액터(actor) 알파(TNF-α) 및 림프 독소(LT)를 포함한다. 항 종양 활성을 갖는 또 다른 독소는 칼리키아마이신 감마 1(calicheamicin gamma 1), 종양에 대한 상당한 힘을 가진 항종양 항생제를 포함한 diyne-ene를 가진다(Zein N et al (1988). Science 240:1198-201).

예를 들어, 디프테리아 독소(서열이 공지되어 있음)는 본 발명의 RNA 앱타머 분자에 결합될 수 있다. 천연 디프테리아 독소 분자는 아미노 말단 단부에서 시작하고, 효소적 활성 단편(AA 1-193) 및 전위 도메인 및 일반화된 세포 결합 도메인(AA 475-535)를 포함하는 프래그먼트 B(AA 194-535)를 특징으로 하는 여러 가지 기능성 도메인과 관련된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)에 의해 분비된다.

RNA 앱타머 및 독소 성분은 당업계에 공지되어 있는 여러 가지 방법 중 어느 하나에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 독소 겔로닌에 RNA 앱타머를 결합하는 방법은 Chu TC et al. (2006) Cancer Res 6(12)5989-5992.에 기재되어 있다.

모이어티(moiety)는 또한 하나가 활성화 또는 영역 레벨에 신체의 면역 체계를 활성 또는 억제하는 면역계의 모형이라 할 수 있다. 예를 들어, 사이토카인, 종양에 전달된 IL-2 와 같은 림포카인은 종양 주변에 세포 독성 T 림프구 및 자연 살해 세포의 증식을 유발할 수 있다.

모이어티(moiety) 또는 수용체 그룹은 또한 방사성 분자 일 수 있다. 예를 들어 방사성 뉴클레오티드, 또는 so-colled sensitizer, 예를 들어 특정 조건하에서 방사되는 전구성 분자, 예를 들어 Barth et al. (1990). Scientific American Oct 1990:100-107.에 기재된 "붕소 중성자 포착 요법"(BNCT)으로 불리는 저 에너지 중성자 bean 노출 붕소일 수 있다. 방사성 효과기 모이어티(moiety)을 갖는 화합물은 종양의 암 종양 줄기 세포의 증식을 억제 및 이미지 형성을 위한 암 줄기세포에 표지로 사용할 수 있다.

방사성뉴클레오티드(Ridionucleotides)는 단일 원자 방사성 분자로 α, β, 또는 γ 입자를 방출 할 수 있다. α 입자 방출이 짧은 거리를 거쳐 높은 에너지 물질을 방출하지 않고 정상조직을 의미있게 관통 또는 해치지 않는 효율성 때문에 β, 또는 γ 입자 방출을 선호한다. 적합한 α 입자 방출 핵종은 ²¹¹At, ²¹²Pb, 및 ²¹²Bi을 포함한다.

방사성 분자는 앱타머와 직접적으로 또는 비기능성 킬레이트(chelate)에 의해 단단하게 연결되어야만 한다. 킬레이트(chelate)는 인 비보 방사성 활성 분자의 조기성숙(premature) 방출과 같은 용출을 허용되지 않는다Waldmann, Science, 252:1657-62 (1991). 예를 들어, 본 발명에 적응된 BNCT, 붕소의 안정화된 동위체, 예를 들면, 붕소 10은 화합물의 항종양 모이어티 또는 이펙터(effector) 부분으로 선택 될 수 있다. 붕소는 암 줄기세포에 결합하는 앱타머의 특이적인 결합에 의해 종양세포에 전달 및 집중될 것이다. 붕소의 충분한 양이 축척되는 수 시간 후, 종양을 이미지화, 저에너지의 중성자 빔을 조사, 약 0.025 eV의 에너지를 가질 수 있다. 이 중성자 방출은, 그 자체로, 종양 또는 종양 자체를 둘러싼 건강한 조직 중 하나에 작은 손상을 야기할 수 있고, 붕소 10(예를 들면, 종양세포의 표면상에)은 불안정한 동위 원소, 붕소 11을 형성하는 중성자를 포획할 것이다. 붕소 11은 즉시 리튬 7 핵 및 에너지 α 입자, 약 2.79 백만 Ev 수율로 분열한다. 이 무거운 입자는 약 하나의 세포 직경(10 microns)의 경로 길이를 갖기 때문에 방사선의 형성이 매우 국부적이지만 매우 치명적인 형태이다.

본 발명의 전달체

본 발명에 기재된 RNA 앱타머 분자는 siRNA 또는 리보자임을 세포내 전달을 위해 사용할 수 있다. 적합한 siRNA 또는 리보자임의 예는 상황에 따라 달라질 것이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 siRNA를 또는 리보자임의 예에는 타겟 ATP 결합 카세트(cassette) 막 전달자, stemness 유전자(Bmi-1, Notch 1, Sox 2, Oct-4, Nanog, β-catenin, Smo, nestin, ABCG2, Wnt2 및 SCF, 등), GAPDH(글리세르알데히드 -3- 포스페이트 탈수소효소), 및 서바이빈(survivin) 을 포함한다.

예를 들어, 안티-PSMA 앱타머를 이용한 종래 기술이 증명되어 있다. 이는 PSMA가 엔도솜(endosome)에 클라트린 피복 소공(clathrin-coated pit)를 통해 내부화 된다는 지식을 바탕으로, 안티-PSMA 앱타머가 PSMA가 발현된 세포에 부착된 siRNA를 이동시킬거라는 가정 하에, PSMA 단백질에 결합하는 앱타머-siRNA는 내부화를 통해 세포에 접촉할 것이다. 다음으로, siRNA 일부는 Dicer 복합체에 의해 처리되어지고, RNA- Induced Silencing Complex(RISC)- 매개된 유전자 침묵 과정안에 공급된다. 세 그룹은 이러한 목표를 달성하기 위해 서로 다른 전략을 사용했다. Chu et al (2006) Nucleic Acids Res 34, e73.에서는 PSMA 앱타머와 siRNA의 조립을 위해 바이오틴-스트렙타비딘 브릿지 매개 접합 방법(biotin-streptavidin bridge mediated conjugation method)을 설명하였다. McNamara et al. (2006) Nat Biotechnol 24, 1005-1015.에서는“RNA 전용" 앱타머-siRNA의 키메라를 앱타머와 siRNA의 결합 방식을 사용하였다. Wullner et al (2008). Curr. Cancer Drug Targets 8:554-565. 발명자에 의한 후속 연구에서, 저자들은 PSMA-양성 전립선암에 진핵 신장 인자 2(EEF2)의 siRNA를 전달하기 위해 안티-PSMA 앱타머를 사용, 이가의 PSMA 앱타머를 이러한 목적으로 사용하였다. 저자들은 모노밸런트(monovlaent) 안티-PSMA-siRNA 키메라에 비해, 이가의 앱타머-구성체가 유전자 녹-다운(knock-down)에 효력이 더 우수함을 입증하였다.

본 발명의 RNA 앱타머 분자는 고형 종양의 다양한 CD133⁺ 암 줄기세포안에 카고(cargo)를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 겔로닌(Gelonin)은 단백질 합성 과정을 억제하며 세포 독성을 지닌 리보솜 독소이다. 그것은 막을 투과할 수 있지만, 세포 이입을 위해 안내자를 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 RNA 앱타머 분자는 암 줄기세포에 독성 페이로드(payload)가 막을 투과할 수 있도록 전달하기 위해 이용될 수 있다.

세포 독성 화학 요법제에 대한 종양의 내성은 불충분한 전달 및 흡수, 더 바람직하게는 암세포에 의한 유출에 부분적으로 기인하는 것으로 여겨진다. (poly D,L-lactic-co-glycolic acid)PLGA 유래 생분해성 폴리 나노입자(NP)는 이러한 문제를 해결하기 위해 사용되었다Dhar et al (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:17356-17361. 간략하게, 시스플라틴(cisplatin)은 두 개의 알킬 체인(chain)을 도입하여 약물의 전구(pro-drug), Pt(V), 화합물로 변환하였다. 이것은 화합물의 소수성을 증가시키고 NP의 소수성 중심부(core)내에 그것의 패킹(packaging) 과정을 완화하였다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 PEG-PLGA 나노 입자를 합성하기 위한 나노프리시피테이션(nanoprecipitation) 단계 동안에 코폴리머(copolymer)로 사용하였다. PLGA-PEG-NP 표면은 PSMA(전립선 특이 막 항원) 앱타머로 구성하였다. LNCaP 세포와 함께 배양할 때 세포내 이입이 실시된 NP, 알킬화된 전구 약물은 세포질 환원 과정에 의해 시스플라틴으로 변환하였다.

본 발명은 또한 약물 전달과 동시에 이미징제제로서의 RNA 앱타머 분자의 사용을 확장한다. 이것은 형광 양자점(QD) 표면에 앱타머 결합에 의해 달성될 수 있다. 이어서, QD-앱타머 접합체는 QD-앱타머 독스(Dox)-나노 입자를 형성하기 위해 독스와 함께 배양하였다. Dox 및 QD는 모두 형광 분자이다. 그러나, QD-앱타머-Dox 나노 입자의 근접성 때문에, 그들은 양방향 형광(bi-fluorescence) 공명 에너지 전달(FRET) 메카니즘에 의해 서로의 형광을 억제한다. 따라서, QD-앱타머-Dox 나노 입자는 비 형광이다. 그러나, 전립선암 세포에 PSMA-매개 세포내 이입을 거친 QD-앱타머-Dox 나노 입자는 Dox 및 QD 에 의한 형광 복구의 결과로 QD-앱타머-Dox 나노 입자로부터 Dox의 방출을 야기한다.

약제학적 조성물

본 발명의 일 예인 RNA 앱타머, 본 발명에 따른 항암제 또는 약물 전달체는 약제학적으로 허용가능한 담체 및 / 또는 부형제를 포함하는 조성물의 형태로 투여된다. 조성물의 부형제 또는 다른 요소들의 선택은 투여를 위해 사용되는 경로 및 장치에 따라 적용될 수 있다.

용어 "담체" 및 "부형제"는 종래의 분야에서 사용된 저장제, 관리 및 / 또는 활성 조성물에 생물학적 활성 물질의 조성물을 의미한다(see, e.g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980). 담체는 활성 화합물의 바람직하지 않은 부작용을 감소시킬 수 있다. 적합한 담체는, 예를 들면, 안정된, 예를 들어 담체에 다른 요소와 반응 할 수 없다. 일 예에서, 담체 약물은 특별한 부분 또는 치료에 사용되는 투여량 및 농도로 수여자에 전신성 부작용을 생성하지 않는다.

종래에 사용되는 것을 포함한 본 발명의 적합한 담체의 예로서, 물, 식염수, 수성 덱스트로스(aqueous dextrose), 락토스(lactose), 완충 용액 Ringer's 용액, 히알루로난(hyaluronan) 및 글리콜은 특히 용액을 위한(등장성 일 때), 기본적 액체 담체들이다. 적합한 약제학적 담체 및 부형제로는 전분, 셀룰로스, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아(malt), 쌀, 밀가루, 백악(chalk), 실리카 겔, 마그네슘 스테아레이트(stearate), 나트륨 스테아레이트(stearate), 글리세롤 모노 스테아레이트(stearate), 염화나트륨, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 및 이와 같은 것들을 포함한다.

항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 다른 일반적인 첨가제들을 첨가할 수 있다. 주사액, 환제, 캡슐제, 과립제 또는 정제, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제를 준비하여 별도로 첨가할 수 있다.

본 발명의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제 또는 약물 전달체는 비 경구 투여 (예, 정맥 내, 피하, 국부적 또는 복막의 주사)를 할 수 있다. 항암제의 유효 투여량은 질환의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설 및 증상에 따라 결정될 수 있다. 일 예에서, 항암제 또는 약물 전달체는 10-95 중량(weight)%로 RNA 앱타머를 포함한다. 또 다른 예에서, 항암제 또는 약물 전달체는 25-75 중량(weight)%로 RNA 앱타머를 포함한다.

투여 빈도는 하루에 여러 번이 될 수 있다.

일 예에서, RNA 앱타머의 효과적인 세포내 함량은 대략 1 nM 내지 1000 nM이다. 또 다른 예에서, RNA 앱타머의 효과적인 세포 내 함량은 500 nM 내지 100 nM인 것이 바람직하다. 그러나, 앱타머의 투여량은 상기 범위보다 이하 또는 이상 일 수 있다.

앱타머의 조합

본 발명의 분리된 RNA 앱타머 분자들은 단독 또는 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 따라 하나 이상의 추가 RNA 앱타머와 조합하여 사용할 수 있다. 일 예에서, 본 발명의 RNA 앱타머 분자(들)은 암 줄기세포의 검출, 농축 또는 정제를 용이하게 하는 RNA 앱타머와 조합 할 수 있다. 일 예에서, 추가적인 RNA 앱타머는 Shigdar S et al (2011) Cancer Sci 102(5):991-998.에 기재된 바와 같이 앱타머의 서열 EpDT3 5 '-GCGACUGGUUACCCGGUCG- 3'을 포함한다. 다른 예에서, 추가적인 RNA 앱타머는 서열 5 '-ACGUAUCCCUUUUCGCGUA- 3'를 포함한다.

키트(들)

본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 방법을 실시하기 위한 진단 키트를 제공한다. 일 예에서, 진단 키트는 RNA 앱타머 또는 CD133 발현 세포(들)(예, 암 줄기세포(들))을 검출하기 위해 본 명세서에 기재된 진단제를 포함한다.

키트는 또한 완충제 및 안정제와 같은 보조제를 포함한다. 진단 키트는 더욱 백그라운드(background) 간섭 제어 반응을 줄이기 위한 시약 및 테스트(test)를 실행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 진단 키트를 사용하는 방법에 대한 지침은 일반적으로 포함된다.

본 명세서의 개시 사항의 넓고 일반적인 범위를 벗어나지 않는 한에서, 다수의 변형 및/또는 변경이 상술한 구현예에 대하여 만들어질 수 있음은, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의해 이해 될 것이다. 따라서, 본 구현예들은 모든 점에서 예시로서 고려되어야 하며 제한적으로 고려되여서는 아니 된다.

도 1. RNA 앱타머의 서열; 15mer CD133 RNA 앱타머로 설계된 CD133-1-2-2(서열목록 제1서열) 및 19mer CD133 RNA 앱타머로 설계된 CD133-2-1(서열목록 제6서열). 염기 변형, 2‘-F-피리미딘 RNA, 시티딘(C), 및 우리딘(U)는 2’-F로 변형됨(도 1에 밑줄 참조). 뉴클레아제 절단으로부터 보호하기 위한 IDT-3'. RNA HPLC 급별(grade) 정제, 합성 후: 2'-탈보호/탈염.
도 2. 지수 농축(SELEX)에 의한 리간드의 전체적인 evolution을 사용한 CD133 앱타머의 분리.
(A) CD133-형질된(transfected) HEK293T 세포에서 SELEX의 반복된 단계로부터 FITC-표지된 앱타머의 유동 세포 결합 분석. 각 단계의 플루오레신-표지된 RNA는 유동 세포 분석 후, 37℃에서 30분간 타겟세포와 반응하였다. (B) 각 단계의 결합은 음성 대조군 세포에 대한 세포 결합 뿐만 아니라, 타겟 세포에서 선택되지 않은 라이브러리 RNA의 결합 형광 강도를 뺀 후에 계산하였다. R, SELEX 주기(cycle) 단계; R, 선택되지 않은 임의의(random) 라이브러리.
도 3. CD133 앱타머의 절단된 클론의 상호 작용을 위한 평균 해리 상수(Kd)의 결정.
5 × 10⁵ 세포/mL의 세포 밀도에 CD133 앱타머(1-200 nM)의 다양한 농도에 따른 주 결합 곡선. (A) HT-29 세포; (B) Hep3B 세포; (C) T98G 세포; (D) HEK293T 세포(들).
도 4. CD133 앱타머의 잘림(truncation).
(A) CD133-1은 총 4번 연속적으로 잘림 (i): CD133-1; (ii): CD133-1-1, (iii): CD133-1-2, (iv): CD133-1-2-1, (v): CD133-1-2-2); (B) (i) CD133-2는 한번 잘림 (ii) CD133-2-1.
도 5. CD133 앱타머는 CD133 양성 세포에 결합한 다음 세포내로 이입되지만, CD133 음성 세포는 아님.
DY647-표지된 CD133 앱타머들을 37℃에서 30분간 기재된 암세포와 반응한 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 이미지화함. 패널의 각 쌍에 대한 광학(위상) 이미지는 위에, 형광 이미지는 아래에 있음. HT-29 및 Hep3B는 인간 클론 및 간암 세포이며, 각각 CD133을 발현함. T98G는 인간 신경 교종세포이며 CD133을 발현하지 않음. HEK293T는 인간 비종양 세포주이며 CD133 발현하지 않음. 기준선(Scale line) - 20 μm.
도 6. CD133 앱타머는 CD133 양성 세포에 결합한 다음 세포내로 이입되지만, CD133 음성 세포는 아님.
세포내 이입 정지, 처리(칼슘 고갈) 후, 앱타머들이 세포내에 더 이상 이입되지 않고, 대신 세포 표면에 머뭄(입자 패턴보다는 링구조 형성). 트랜스페린(transferrin)은 트랜스페린 엔도사이토시스(endocytosis) 중지 처리의 효과를 보여주기 위해 양성 대조군으로 사용됨. HT-29: 결장암 세포주, Hep3B: 인간 간암 세포주. DY647-표지된 CD133 앱타머는 37℃에서 30분간 상기 기재한 암세포와 배양한 다음 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 이미지화. 패널의 각 쌍은 광학(위상) 이미지는 위에, 형광 이미지는 아래에 있음. 기준선(Scale line) - 20 μm.
도 7. CD133 RNA 앱타머는 CD133 항체 (AC133)보다 많은 종양 덩어리(mass)에 침투.
CD133⁺ 인간 대장암 세포(HT-29) 및 CD133^- 인간 신장 상피 세포(HEK293T)를 섬유 아세포 성장 인자(10 ng/㎖) 및 표피 성장 인자(10 ng/㎖), 인슐린(50 ㎍/㎖) 및 B27(100 units/㎖)이 첨가된 무혈청 DMEM / F12 배지(10 ng/㎖)에서 배양하여 종양구(tumoursphere) 형성. 종양구가 300 ㎛의 크기가 되었을 때, 종양구를 100 nM Dy647-표지된 CD133 RNA 앱타머 또는 대조군 앱타머와 배양할 뿐만 아니라 PE-CD133 항체(AC133)의 동일 농도로 각각 4시간 동안 배양. PBS로 3번 세척 후 종양구를 공초점 형광 현미경을 사용하여 이미지화. 두 중심(중간) 부분에 나타냄.
표기된 서열 순서
서열목록 제1서열 : CD133-2-2 앱타머 서열 (15 mer)
서열목록 제2서열 : CD133-1 앱타머 서열 (81 mer)
서열목록 제3서열: CD133-1-1 앱타머 서열 (58 mer)
서열목록 제4서열 : CD133-1-2 앱타머 서열 (35 mer)
서열목록 제5서열 : CD133-1-2-1 앱타머 서열 (21 mer)
서열목록 제6서열 : CD133-2-1 앱타머 서열 (19 mer)
서열목록 제7서열 : 공통적 CD133 앱타머 서열 (15 mer)
서열목록 제8서열 : CD133-2 앱타머 서열 (85 mer)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

세포주 및 세포 배양.

본 연구에 사용된 인간 기원의 세포주는 American type Culture Collection으로부터 구입하였다. 그것들은 인간의 대장암 HT-29; 인간의 간세포 암종 Hep3B; 인간의 다형성 교모세포종 T98G; 인간 배아 신장 세포 HEK293T 이다. 세포는 10% 소 태아 혈청이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)(Invitrogen, Victoria, Australia)(HEK293T, HT-29), 또는 10% 소 태아 혈청이 첨가된 Minimum Essenitial Medium(MEM)(Invitrogen)(Hep3B, T98G)에서 배양 상태를 유지 및 성장하였다. 세포는 5% CO₂조건하에 37℃를 유지하였다.

단백질 발현 및 세포 SELEX.

인간 CD133 cDNA를 Invitrogen으로부터 구입하여, 포유 동물 발현 벡터 pcDNA 3.1 / V5-His-TOPO에 클로닝 하였다. 재조합 6 × Histidine-태깅된 CD133을 일시적으로 HEK293T 세포에서 발현시켰다. 간략하게, 24시간 동안 배양 한, HEK293T 세포를 100 mm 또는 60 mm 디쉬에 70% 컨플런시(confluency)가 되도록 접종하고, 제조사의 명세서에 따라 항생제가 처리되지 않은 배양액에서 Lipofecctamine 2000(Invitrogen Life Technologies)을 사용하여 총 각각 24 또는 8 ㎍을 트랜스팩션(transfection) 하였다. 72 시간 배양 후, 형질 전환된 세포는 세포 SELEX 대한 타겟으로서 사용하였다.

SELEX 선택.

중심(central) 40-nt 무작위 서열을 포함하는 DNA 라이브러리 (밑줄 치 T7 RNA 중합 효소 프로모터 서열을 포함하는 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC AAG AAT AAA CGC TCA A-N40- TTC GAC AGG AGG CTC ACA ACA GGC)(GeneWorks, Australia)을 합성하였다. 이중 가닥 DNA 전체(pool)는 무작위 서열 측면 프라이머 5'-TAA TAC GAC TCA CTA의 TAG GGA GAC AAG AAT AAA CGC TCA 및 5'-GCC TGT TGT GAG CCT CCT의 GTC GAA -3 '을 사용한 광범위한(large-scale) PCR를 통해 오리지날 합성 라이브러리로부터 생성되었다. 광범위한(large-scale) PCR 제품들의 일부(~ 10¹⁴ 서열)은 DurascribeT7 transcription kit(EPICENTREBiotechnologies, USA)를 사용하여 개시 2'- 플루오로피리미딘(fluoropyrimidine)이 변형된 RNA 전체(pool)를 생성하기 위해 인 비트로 전사에 대한 주형으로 사용하였다. SELEX을 위한, RNA, 개시 선택된 5 μM 또는 각 반복된 라운드(rounds)에 1 μM 농도로, 100 μL 결합 완충액(2.5 mM의 MgCl_2,0.1 ㎎/㎖ tRNA 및 0.1 ㎎/㎖ Salmon sperm이 첨가된Dulbecco's phosphate befferd saline)으로 희석하였고, 85℃에서 5분간 변성, 실온에서 10분간 냉각, 37℃에서 15분 동안 어닐이드(anealed), HEK293T 세포안에 타겟 단백질을 발현시키기 전에 4℃ 에서 1시간 동안 반응하였다. 반응 및 광대한(extensive) 세척에 이어, 바운드(bound) RNA는 PCR 증폭 및 인 비트로 전사 및 SELEX의 다음 라운드(round)에 사용한 다음, SuperScript III 역전사 효소(Invitrogen)를 사용하여 역전사 시켰다. 카운터(counter)-선택 단계는 라운드(round) 4, HEK293T 세포에서 발현된 His-태깅된 무관한 단백질 사용, His-태그에 특이적으로 알게된 종의 농축 감소, HEK293T 세포들 또는 조직 배양 플레이트에 포함하였다. PCR 증폭 사이클 수는 또한 비특이적으로 “파라사이트(parasite)”PCR 산물의 과다 증폭을 방지하기 위해 최적화하였다. 더욱이, 선택 과정에 엄격하게 앱타머 농도, 배양 시간 및 세척 수에 대한 조절을 통해 높은 친화력의 앱타머 선택을 촉진하도록 개선하였다. 매우 특이적인 앱타머을 획득하기 위해 세포의 수는 점차 줄이고, 라운드(round) 4에 포함된 네가티브 선택을 가지는 SELEX의 진행과정에서의 세척 과정은 엄격하게 증가시켰다. 농축은 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 및 살아있는 세포를 사용한 유동 세포 계측법을 사용하여 모니터링 하였다.

RFLP 분석.

선택하는 동안 앱타머 후보들의 농축은 제한 단별 길이 다형성(RFLP)에 의해 결정하였다. 간략하게, RFLP는 작은(minor) 변형과 기존에 기재된 바와 같이 실시하였다(Dasetal. 2009; Missailidis & Hardy 2009). 반복적인 사이클로부터 cDNA의 약 5 ng은 PCR 8 사이클에 의해 증폭되었다. 증폭된 DNA를 37℃에서 하룻밤동안 제조사(Takara)에 의해 제공되는 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민이 첨가된 완충액 T에서 4개의 뉴클레오티드를 인식하는(빈번한 절단기(frequent cutters)) 4개 제한 효소, Afa I, Alu I, Hha I 및 Xsp I으로 절단하였다. 하룻밤동안 절단한 다음, DNA를 65℃로 가열하고, 얼음에서 냉각시킨 다음, TBE 버퍼안에 기본 20% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동하여 분리하였다. 겔은 GelStar로 염색하고 나서 표준 겔 이미징 시스템을 사용하여 가시화하였다.

유동 세포 계측 분석법.

세포를 트립신 처리 및 세척 완충액(2.5 mM의 MgCl2를 가진 DPBS)에 재현탁시키는 과정을 실시하여 80% 컨플루언스를 수거하였다. 원심 분리(5 분동안 1,000 × g)에 이어, 세포 펠릿(pellet)을 결합 완충액(5 mM MgCl₂, 0.1 ㎎/㎖ tRNA, 0.1 ㎎/㎖ salmon sperm이 첨가된 DPBS)에 재현탁시키고 1 X 10⁶/㎖으로 희석하였다. 타겟 단백질에 결합하는 앱타머를 확인하기 위해, 되풀이되는 라운드(rounds)로부터 RNA를 앞서 기재한 방법(Willkomm & Hartmann (2005). Weinheim, Wiley-VCH GmbH & Co. KGaA 1:86-94)에 따라 형광 이소티오시아네이(isothiocyanate)(FITC)를 3'- 말단에 표지하였다. 앰버(amber) 튜브를 사진 표백(photo-bleaching)을 최소화하기위해 전반에 걸쳐 사용하였다. 간략하게, 시표를 요드화 나트륨으로 산화시켰다. 산화는 에탄올 침전에 이어서 10 mM 에틸렌 글리콜을 첨가하여 종결시켰다. FITC는 30-molar 초과량을 첨가하여, 4 ℃에서 하루밤동안 반응하였다. FITC가 표지된 RNA 중 1 μM을 CD133 단백질이 형질 전환된 5 X 10⁵HEK293T 세포 비형질 전환된 HEK293T와 함께 300 μL 결합 완충액으로 세 번 세척 및 재현탁한 다음 100 μL 결합 완충액으로 얼음에서 1 시간동안 반응시켰다. 형광 강도는 각 시료당 50,000 건을 계산하여 FACS 캔토(Canto) II 유동 세포 계측기(벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson))로 측정하였다. 선택되지 않은 라이브러리로부터 FITC-표지된 RNA는 비특이적인 결합을 측정하기 위해 사용하였다.

각 라운드(round)에 대한 결합은 Ellington and colleagues(Lietal. (2009). J. Proteome Res 8:2438-48)에 의해 기재된 방법에 따라, 음성 대조군 세포에 결합할 뿐만 아니라 그와 같은 타겟 세포의 라운드 제로 RNA 단계의 결합하는 평균 형광 강도를 뺀 값을 측정하였다.

선택된 앱타머의 클로닝, 시퀀싱 및 구조 분석.

반복된 라운드들(rounds)의 RFLP 및 유동 세포 계측 분석 다음에, 라운드(round) 6은 선택적으로 타겟 단백질을 인식하는 RNA 서열의 충분한 농축을 보여주었다. 이 농축된 전체(pool)는 PCR 10 사이클 동안 증폭시켰고, PCR 결과물 플라스미드 pCR4-TOPO (Invitrogen)에 클로닝 하였다. 개별 클론으로부터 플라스미드 DNA를 제조하고, 그것을 서열 자동화 DNA 서열 분석 방법를 사용하여 측정하였다. 앱타머 서열은 ClustalX2를 사용하여 분석하였다(Larkinetal.(2007)Bioinformatics23:2947-8). 이차 구조는 프로그램 RNAfold를 사용하여 예측하였다(Hofacker (2003) Nucleic Acids Res 31:3429-31).

앱타머 친화성의 결정.

세포 표면에 발현된 본래(native) CD133에 성공적인 2'- 플루오로 피리미딘 RNA 앱타머 종류들(species)의 해리 상수(Kd)를 유동 세포 분석기를 사용하여 측정하였다. CD133 단백질로 형질된 HEK293T 세포, 또는 비-형질된 HEK293T 세포 (5 × 10⁵)를 첫째 차단 완충액(blocking buffer)(0.2% (w/v) 소듐 아자이드(sodium azide)가 포함된 결합 완충액(binding buffer)에 반응시킨 다음 얼음에서 1 시간동안 100 μL 결합 완충액으로 FITC-표지된 앱타머의 순차적(serial) 농도(약 10 배 이상 및 이하 Kd)로 반응하기 전에 결합 완충액으로 두 번 세척하였다. 세포(들)을 결합 완충액으로 3 회 세척하고, 150 μL 결합 완충액에 재현탁하여 유동 세포 분석기에 유동하였다. FITC-표지된 비선택 라이브러리는 음성 대조군으로 사용하였다. 선택되지 않은 라이브러리의 평균 형광 강도(MFI)는 특이적 결합의 MFI를 생성하는 앱타머-타겟 세포로부터 감산하였다. 각 앱타머에 대한 Kd는 식에 따라 표준(Scatchard) 분석에 의해 측정하였다 :

[(바운드)Bound 앱타머]/[앱타머]= -(1/K_d) × [(바운드)Bound 앱타머] + ([T]_tot/K_d)

여기서 [T]_tot는 총 타겟 농도를 대표한다.

앱타머 잘림(truncation) 및 특이성의 결정

절단된 앱타머를 생성하기 위해, 원하는 서열의 센스 및 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. CD133-1-1(1st 잘림)은 센스 올리고뉴클레오티드, 5’- TAA TAC GAC TCA CTA TAG AGA CAA GAA TAA ACG CTC AAC CCA CCC TCC TAC ATA GGG AGG AAC GAG TTA CTA TAG -3’, 및 안티 센스 올리고뉴클레어티드, 5’- CTA TAG TAA CTC GTT CCT CCC TAT GTA GGA GGG TGG GTT GAG CGT TTA TTC TTG TCT C -3’로부터 파생되었다; CD133-1-2 (2nd 잘림)는 센스 올리고뉴클레어티드, 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG CTC AAC CCA CCC TCC TAC ATA GGG AGG AAC GAG T-3’ 및 안티센스 올리고뉴클레어티드, 5’- ACT CGT TCC TCC CTA TGT AGG AGG GTG GGT TGA GC -3’로부터 파생되었다; CD133-1-2-1 (3rd 잘림)은 센스 올리고뉴클레오티드, 5’- TAA TAC GAC TCA CTA TAC CAC CCT CCT ACA TAG GGT GG-3’ 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 5’-CCA CCC TAT GTA GGA GGG TGG-3’로부터 파생되었다; 및CD133-1-2-2 (4th 잘림)는 센스 올리고뉴클레오티드, 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAC CCT CCT ACA TAG GG-3’ 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 5’-CCC TAT GTA GGA GGG-3’으로부터 파생되었다. CD133-2-1 (1st 잘림)은 센스 올리고뉴클레오티드, 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAC AGA ACG TAT ACT ATT CTG-3’ 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, 5’-CAG AAT AGT ATA CGT TCT G-3’ (T7 RNA 프로모터 서열은 밑줄짐). 올리고뉴클레오티드의 적절한 쌍은 1 × PEI 완충액(0.1 M Tris-HCl, pH 8, 0.1 M MgCl_2, 0.5 M, NaCl 및 0.1 M dithiothreitol)에 동등한 몰비로 혼합하고, 90 ℃ 에서 5 분동안 가열, 에탄올 침전을 위해 실온에서 천천히 냉각시켰다. 인 비트로 전사 및 FITC-표지는 앞서 기재된 바와 같이 실시하였다. 이러한 클론의 마지막 잘림(CD133-1-4 및 CD133-2-1), 5'-DY647-CCC TCC TAC ATA GGGdT-3' 및 5'-DY647- CAG AAC GTA TAC TAT TCT GDT-3',은 또한 5'- DY647 형광 태그 및 3'-반전된(inverted) 데옥시티미딘(Dharmacon)으로 화학적 합성을 하였다. 이러한 두 앱타머의 결합 친화성 및 음성 대조군 앱타머는 CD133 양성(HT-29로 Hep3B) 및 CD133 음성(T98G 및 HEK293T) 세포주를 사용하여 측정하였다. 차단(blocking) 단계는 5% (v/v)의 소 태아 혈청이 포함된 차단 완충액을 사용하여 4℃에서 실시하였다. 앱타머의 결합은 37℃에서 30 분동안 실시하였다.

공초점 현미경.

표지하기 24 시간 전, 세포를 유리-바틈(bottom) 8- 챔버 슬라이드(Lab-Tak II, Nunc)에 cm² 당 75,000 세포 밀도로 접종하였다. DY647-CD133-1-2-2, DY647-CD133-2-1 및 조절(control) 앱타머는 유동 세포 계측법과 동일한 방법으로 제조하였다. 배양액을 제거한 다음, 세포를 37℃에서 15 분동안 혈청이 포함된 차단 완충액에 배양하고, 200 nM 앱타머를 37℃에서 30분 동안 배양하기 전에 결합 완충액으로 두 번 세척하였다. Bisbenzimide Hoechst 33342(3 ㎍/㎖)(Sigma)는 반응의 마지막 15 분동안 세포에 첨가하였다. 앱타머 용액 제거 및 세포를 FluoView FV10i 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus)를 사용하여 가시화하기 전에 결합 완충액으로 5 분씩 3 번 세척하였다.

엔도시토시스(endocytosis)의 억제.

작은(minor) 변형은 공초점 현미경에 기재한 바와 같이 필수적으로 실시하였다. 간략하게, 세포를 칼륨이 고갈된(50 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2.5 mM MgCl₂, 및 1 mM CaCl₂) 또는 고장 완충액(3 mM KCl 및 450 mM 자당(sucrose)이 포함된 칼륨 고갈된 완충액)에 37 ℃에서 1 시간 동안 전처리 하였다. 이 완충액들은 또한 앱타머의 반응 단계 및 모든 세척 단계에 사용하였다. 억제 엔도시토시스(endocytosis)에 이러한 처리 효과는 Alexa Fluor 488(Invitrogen)에 결합된 인간 트랜스페린(transferrin)의 내부화(internalisation)에 질적인 특징을 입증한다. 트랜스페린(transferrin)(5 ㎍/㎖)을 37℃에서 30 분 동안 전처리 후 세포에 첨가하였다. 세포는 각각의 완충액으로 3 번 세척하고 FluoView FV10i 공초점 현미경을 사용하여 가시화하였다.

트랜스페린(transferrin)과 앱타머의 colocalisation.

HT-29, Hep3B, T98G 및 293T 세포를 기존에 기재된 바와 같이 준비하였다. 배양액 제거 후, 세포를 5% (v/v) 혈청이 포함된 차단 완충액으로 37℃ 에서 30 분 동안 배양하였고, 200 nM 앱타머를 37℃에서 15 분동안 배양하기 전에 결합 완충액으로 두 번 세척 하였다. 앱타머 용액을 제거하고 세포를 결합 완충액으로 5 분마다 3 번 세척하였다. 트랜스페린을 세포에 첨가하고, 반응의 마지막 15 분 동안 Bisbenzimide Hoechst 33342(3 /㎖)(Sigma)를 세포에 첨가하기 전 2 시간동안 반응시켰다. 세포를 FluoView FV10i 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 가시화하기 전에 결합 완충액으로 5 분마다 3번 세척하였다.

앱타머(들) 및 항체에 종양구 준비 및 배양.

HT29 및 HEK293T 세포 1~ 2000개를 표피 성장 인자, 염기성 섬유 아세포 성장 인자, 인슐린, B27이 포함된 DMEM/F12 배양액(Invitrogen Life Technologies)에 접종하고 7일 동안 구(spheres)를 형성시켰다. 7일에, 구(spheres)를 (300~ 400㎛의 크기) MgCl₂가 포함된 PBS에 3 번 세척하고, 결합 완충액을 사용하여 20 분동안 차단하였다. 구(sphere)는 100 nM 앱타머 또는 AC133 항체와 함께 30 분, 60 분, 120 분, 240 분 또는 24 시간동안 반응하였다. 각 시점에 따라, 구(sphere)는 FluoView FV10i 공초점 현미경을 사용하여 가시화하기 전에 PBS로 3 번 세척하였다.

실시예 1: 세포 SELEX는 복잡한 단백질 타겟에 대한 앱타머의 선별을 용이하게 한다.

CD133은 두 개의 세포외 루프(loops)를 포함하는 복잡한 펜타스판(pentaspan) 단백질이다. 단백질의 세포외 일부에 대한 앱타머만을 효율적으로 선별하기 위해, 본 발명자는 구조적 본래(native) 형태에 CD133을 발현하기 위한 방법를 고안할 필요가 있었다. 이를 위해, 본 발명자들은 일시적으로 HEK293T 세포에 표면 단백질을 발현하기 위해 노력하였다. 리포펙타민(lipofectamin) 2000을 사용하여, CD133을 HEK293T 세포내로 형질하고, AC133 항체 염색에 의한 확인을 위해 SELEX 실험 전 72 시간 동안 발현시켰다. 기존의 SELEX 실험과 유사하게, 모든 피리미딘에 2'-fluoro 변형 리보오스를 포함하는 약 1 × 10¹⁴ 종의 임의의 RNA 라이브러리를 HEK293T 세포 표면에 발현된 CD133과 함께 반응시켰다. 언바운드(unbound) RNA는 RT-PCR 전에 여러 세척 단계를 거쳐 제거하였고, 이 과정을 총 12번 반복하였다. 비특이적 결합은 HEK293T 세포내에 형질된 관련없는 His-태그된 단백질을 사용한 음성 선별을 통해 박멸하였다. 비방사성 RFLP는 반복 단계 및 농축 확인 시 종의 변화를 확인하기 위해 실시하였고, 형질 및 비형질된 HEK293T 세포를 사용한 유동 세포 계측 분석법을 사용하여 측정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 라운드(round) 6은 비형질된 HEK293T 세포 및 비선별된 라이브러리에 비해, CD133 형질된 HEK293T 세포에서 결합이 2.5 배 증가되는 것을 보여준다.

실시예 2: 설계된 Psot-SELEX은 가장 작은 종양-특이적 앱타머를 생성하였다.

라운드 6을 복제 및 서열화 하였고, 클론들(clones)을 (인-하우스)in-house 방법을 사용하여 FITC로 형광 표지하였다. 각 클론의 결합 특이성은 형질 및 비형질된 HEK293T 세포를 사용하여 측정하였고, 가장 바람직한 결과로 CD133-1 및 CD133-2 두 앱타머를 볼 수 있다. 이 두 클론들은 Kd를 낮춰서 결합 친화성을 증가 할 뿐만 아니라 앱타머의 결합 영역의 구조를 유지하기 위한 필수적인 염기들의 최소한의 수를 위해 연속적으로 절단하였다(표 1).

CD133 앱타머(들)의 서열 및 그들의 잘림(truncations).

	서열	길이 (뉴클레오티드의 수)
CD133-1	GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GUU ACU AUA GAG CUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC	81
CD133-1-1	GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CTC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GUU ACU AUA G	58
CD133-1-2	GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GU	35

CD133-1-2-1	CC ACC CUC CUA CAU AGG GUG G	21

CD133-1-2-2	CC CUC CUA CAU AGG G	15

CD133-2	GAGACAAGAAUAAACGCUCAAGGAAAGCGCUUAUUGUUUGCUAUGUUAGAACGUAUACUAUUUCGACAGGAGGCUCACAACAGGC	85
CD133-2-1	CAGAACGUAUACUAUUCUG	19

클론 CD133-1은 앱타머의 결합 영역을 확인하기 위해 총 4번을 잘랐다(truncated). 이 클론은 15 뉴클레오티드, 종양-특이적 항원에 대해 기재된 가장 작은 앱타머이며, 트롬빈에 대해 기재된 가장 작은 크기 DNA 앱타머로 성공적으로 잘려졌다. 두 번째 클론, CD133-2 또한 높은 친화력과 특이성으로 CD133에 결합할 가능성이 관찰되었다. 잘린 앱타머가 Kd를 낮춰서 결합 친화성을 증가시킨 결과이다 (표 2).

CD133-양성(HT-29 & Hep3B) 및 CD133-음성(T98G & HEK293T) 세포에 대한 CD133 해리 결합 상수

세포 주	CD133-1-2-2 (Kd, nM)	CD133-2-1 (Kd, nM)
HT-29	82	145
Hep3B	32	52
HEK293T	1.20E+05	1.74E+06
T98G	2.75E+05	4763

이 두 앱타머의 민감성 및 특이성 확인은 CD133 양성(HT-29로 Hep3B) 및 CD133 음성(T98G 및 HEK293T) 세포주를 사용하여 결정하였다(표 2). Kd는 종류들(species)을 DyLight 형광으로 상업적 합성 및 표지하였을 때 약간 증가하였다.

실시예 3: CD133 특이적 앱타머는 수용체-매개된 엔도사이토시스(endocytosis)를 거쳐 내부화되었다(internalised).

우리가 종래에 보고했던 것처럼, 앱타머가 효과적인 암 테라그노스틱(theragnostic)으로 분류되기 위해서는, 그것이 효율적으로 타겟에 결합한 후 내부화 되어야 한다. CD133 양성 및 CD133 음성 세포를 37 ℃에서 30 분간 배양한 후, 내부화(internalisation)를 공초점 현미경을 사용하여 정량하였다. 내부화는 CD133-음성 세포주에서 부족한 형광 신호를 보인다는 것을 특정한 것으로 간주하였다. 수용체-매개된 엔도사토시스(endocytosis)에 의한 내부화는 칼륨 고갈 및 고장성 처리와 같은, 엔도사토시스 봉쇄로 확인하였다. 이러한 처리 효과는 기존에 트랜스페린을 사용하여 확인하였다(Shigdar et al. (2011a) Cancer Sci1 02:991-8).

실시예 4: CD133 특이적 앱타머는 CD133 항체보다 종양 구의 우수한 침투를 보여준다.

암 테라그노스틱(theranostics)으로서 발명자의 앱타머 효과를 입증하기 위한 시도로, 본 발명자들은 인 비보 타겟하기 위한 모델로 인 비트로 종양구를 사용하여 종양 덩어리에 침투하기 위한 그것의 앱타머 전위를 관찰하였다. 본 발명자는 HT-29(CD133⁺) 및 HEK293T(CD133^-) 세포주의 종양구 모델을 생성 및 공초점 현미경으로 확인한 다음 CD133-1, CD133-2 및 AC133 항체와 구(spheroid)를 4 시간동안 반응하였다(도 7).

실시예 5: CD133 앱타머-독소루비신(doxorubicin) 결합은 인 비트로 상에서 대장암 줄기세포를 제거할 수 있다.

독소루비신과 같은, 화학 요법 약물들, 몇 가지를 제외한 예들은, 암 줄기세포를 죽이지 않았다. 본 발명자 가설은 화학 요법 약물들이 CD133 앱타머에 의해 암 줄기세포로 전달되고, 약물이 자유롭게 세포 안에서 무작위적으로 확산하는 대신에 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 세포내로 들어가고, 그들은 효율적 암 줄기세포 킬러로 종래의 화학 요법 약물을 전달할 수 있다는 것이다. 인 비트로 대장암 줄기세포의 제거에 CD133 앱타머-독소루비신의 능력을 시험하기 위해, 본 발명자들은 인 비트로 종양구 분석을 실시하였다.

CD133-2-1 앱타머를 독소루비신과 결합시켰다. 대장암 세포(HT29)의 세 가지 다른 세포 약물을 종양구 형성을 촉진하는 세포 배양액(인슐린, FGF, EGF, 및 B27가 첨가된 무혈청 DMEM 배양액)과 96 울트라-로우(ultra-low) 부착 플레이트에 접종하였다. 세포에 완충액(PBS) 대조군(control), 1 μM DOX-앱타머 복합체, 또는 1 μM 독소루비신을 처리하였다. 처리 후 각 웰(well)의 종양구 형성을 관찰하였다(표 3).

100 세포들/웰(well)의 세포 약물, CD133-2-1 앱타머-독스 결합 및 프리(free) 독소루비신는 둘다 종양구 형성의 억제 효과를 보이지 않았다. 그러나, 웰(well)당 50 세포들의 세포 약물은, 앱타머-Dox에서 빈도(frequency)에 약간의 감소가 관찰되었다. 중요하게, 10 세포들/웰(well)의 조건 하에서, 1 μM DOX-앱타머 복합체 처리는 종양구들를 형성할 수 있는 대장암 줄기-유사 세포를 완전하게 제거하였다. 따라서, CD133 앱타머를 통한 독소루비신의 암 줄기세포-타겟된 전달은 기존의 항-암 치료 저항성의 암 줄기세포의 능력을 기반으로 알려져있는 항저항성 메카니즘을 우회할 수 있다.

처리 후 종양구 형성

	Control (PBS)	독소루비신 (Dox)	앱타머-독소루비신 결합
100 cells/well	5/5	5/5	5/5
50 cells/well	5/5	5/5	3/5
10 cells/well	4/5	5/5	0/5

리마커(Remarks)

암 줄기세포(CSCs)는 암 및 암재발의 원인으로 간주된다. 이러한 모델은 방사선-화학 요법 저항성을 설명하고(Visvader & Lindeman (2012) Cell Stem Cell 10:717-28), 종양 내 세포 일부에 특이적으로 타겟하기 위한 다양한 시도를 가능하게 한다. 이는 모든 암 줄기세포를 한정하는 하나의 특이적인 마커는 아니지만, CD133, CD44, ALDH, EpCAM 및 ABCG2을 포함하는 많은 마커들은,(Hu & Fu (2012) Cancer Res 2:340-56; Visvader & Lindeman 2012 supra), 고형 종양에 암 줄기세포 부분을 정의하기 위해 유용함이 입증되었다. CD133은 뇌, 전립선, 췌장, 흑색종, 대장, 간, 폐 및 난소암에 암 줄기세포 부분의 마커로 알려져 있다. CD133의 기능이 아직 밝혀지지 않았지만, 이 마커는 저산소 조건에서 증가하며 트리플(triple) 음성 유방암 및 전립선암에서 혈관형성 모방(mimicry)과 관련되어 있으므로 (Liu et al. (2012a) Cancer Biol Ther May 1 13(7); Liu et al. (2012b) Oncogene Apr 2), 종양 성장 및 전이에 CD133의 중요성을 나타낸다. CD133⁺ 세포가 중요하게 종양 발생, 유지 및 계속적인 확산을 할 수 있다는 것을 가정하여, 우리는 CD133에 대한 RNA 앱타머를 분리할 수 있었다.

발명자들은 다른 CSC 마커를 타겟팅하는 앱타머를 분리하기 위한 성공적인 SELEX 방법를 종래에 기재하였다. CD133 타겟팅 앱타머의 분리는 이 단백질의 펜타스판(pentaspan) 특성 및 앱타머 선택을 위한 그들의 구조적 형상에 사용하는 단백질에 필수성 때문에 종래 프로토콜의 변형을 요구한다. 선택한 프로토콜의 성공은 유동 세포 결합 분석 및 RFLP 분석을 사용하여 확인하였다. 성공적인 진전은 6 SELEX 사이클 후 보여졌고, 몇 개의 앱타머가 복제되었다. 두 앱타머는 CD133-양성 및 CD133-음성 세포주 둘 다에서 사용하는 추가적인 특성을 위해 선택하였다. 이 앱타머들은 또한 결합 친화성을 유지하기 위해 필요한 최소 크기를 결정하여 절단하였다. 이 앱타머들 중 하나인, CD133-1은 15 염기들의 크기로 절단 할 수 있었다. 이 절단은 트롬빈을 타겟팅하는 DNA 앱타머에 동등한 크기 및 기재된 가장 작은 RNA 앱타머를 만든다. 이 앱타머들 둘다 민감성 및 특이성을 보이며, 더욱 중요하게는 그들의 타겟에 결합한 후 수용체-매개된 엔도사이토시스에 의해 빠르게 내부화되었다. 마지막 앱타머의 특성은 테라그노스틱(theragnostic) 제제로서 이 앱타머들이 변형되기 위한 사항이 필수적이다.

앱타머들은 종양 덩어리의 처리 및 이미징 둘 다를 위한 이상적인 호위 양상들을(escort modalities) 가지는 많은 장점을 갖추고 있다. 작은 크기는 그들이 종래의 면역 요법보다 더 효율적으로 종양에 침투할 수 있으며, 이 핵산은 또한 면역성이 없고, 훨씬 더 작은 부작용이 있음을 의미한다. 나노입자에 직접적인 결합 또는 약물 캡슐화의 추가적인 기능화을 통해 앱타머를 매우 효과적인 약물 안내(escots)로 기능할 수 있게 한다. 앱타머에 타겟팅하는 독소루비신, siRNA 또는 리보자임과 같은 화학요법 약물에 직접적인 결합 및 그들의 표면에 앱타머 부착을 통한 나노입자의 기능화에 대한 몇 개의 보고들이 있다. 일부 앱터머들은 단독으로 그들의 타겟에 결합하는 것이 효율적일 수 있지만, 대다수의 앱타머들은 독성 물질를 안내함으로 더 많이 성공적이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기재하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기재는 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Deakin University <120> CD133 Aptamers for Detection of Cancer Stem Cells <130> PI150004 <150> AU 2012/903332 <151> 2012-08-02 <150> PCT/AU 2013/000850 <151> 2013-08-02 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 1 cccuccuaca uaggg 15 <210> 2 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 2 gagacaagaa uaaacgcuca acccacccuc cuacauaggg aggaacgagu uacuauagag 60 cuucgacagg aggcucacaa c 81 <210> 3 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 3 gagacaagaa uaaacgcuca acccacccuc cuacauaggg aggaacgagu uacuauag 58 <210> 4 <211> 35 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 4 gcucaaccca cccuccuaca uagggaggaa cgagu 35 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 5 ccacccuccu acauagggug g 21 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 6 cagaacguau acuauucug 19 <210> 7 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 7 agaacguaua cuauu 15 <210> 8 <211> 85 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 8 gagacaagaa uaaacgcuca aggaaagcgc uuauuguuug cuauguuaga acguauacua 60 uuucgacagg aggcucacaa caggc 85

Claims

CD133에 특이적으로 결합하는 분리된 RNA 앱타머.
제 1 항에 있어서, 상기 앱타머는 약 150 nM 또는 그 이하의 해리상수를 갖는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 공통적 서열(consensus sequence) 5’ -CCCUCCUACAUAGGG-3’(서열목록 제1서열)을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 3 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 상기 공통적 서열 내에 하나 이상의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
상기 어떤 청구항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 하기 서열들로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머:
(i) GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA
GUU ACU AUA GAG CUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC(서열목록 제2서열);
(ii) GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA
GUU ACU AUA G(서열목록 제3서열);
(iii) GCU CAA CCC ACC CUC CUA CAU AGG GAG GAA CGA GU(서열목록 제4서
열);
(iv) CC ACC CUC CUA CAU AGG GUG G(서열 목록 제5서열); 및
(v) CC CUC CUA CAU AGG G(서열목록 제1서열).
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 공통적 서열 5’ CAGAACGUAUACUAUUCUG- 3’(서열목록 제6서열)을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 공통적 서열 5’ - AGAACGUAUACUAUU- 3’(서열목록 제7서열)을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 공통적 서열에 하나 이상의 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 7 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 GAG ACA AGA AUA AAC GCU CAA GGA AAG CGC UUA UUG UUU GCU AUG UUA GAA CGU AUA CUA UUU CGA CAG GAG GCU CAC AAC AGG C (서열목록 제8서열)의 서열을 포함하는 것을 서열을 특징으로 하는 앱타머.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열로 필수적으로 구성된 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제6서열로 필수적으로 구성된 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 피리미딘 염기들이 2‘-플루오로로 변형된 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
상기 어떤 청구항에 있어서, 상기 앱타머는 앱타머 안정성을 증가시키는 하나 이상의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
상기 어떤 청구항에 있어서, 상기 앱타머는 CD133⁺ 세포(들)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
상기 어떤 청구항에 있어서, 상기 CD133⁺ 세포(들)이 암 줄기세포인 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 상기 세포는 인 비보 또는 인 비트로 세포인 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 14 항 또는 제 16 항에 있어서, 상기 세포는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료에 존재하는 것을 특징으로 하는 앱타머.
제 14 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 암 줄기세포는 뇌암 줄기 세포, 유방암 줄기 세포, 전립선암 줄기 세포, 췌장암 줄기 세포, 대장암 줄기 세포, 간암 줄기 세포, 폐암 줄기 세포, 난소암 줄기 세포, 피부암 셀 또는 흑색종 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 앱타머.
검출가능한 표지가 커플링된 상기 어떤 청구항의 RNA 앱타머를 포함하는 진단제.
제 19 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 효소, 보결기, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 전자 밀도 표지, MRI용 표지 및 방사성 물질 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단제.
생물학적 시료의 조직학적 검사에 이용되는 상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 분리된 RNA 앱타머, 또는 제 19 항 또는 제 20 항의 진단제.
모이어티(moiety)에 커플링된 상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 RNA 앱타머를 포함하는 항암제.
제 22 항에 있어서, 상기 모이어티는 독소, 방사성 핵종 및 화학요법제 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제.
대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 CD133 발현 세포(들) 및/ 또는 암 줄기세포를 분리, 정제 또는 농축하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머 또는 상기 제 19 항 또는 제 20 항의 상기 진단제를 상기 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
대상 또는 암을 갖는 또는 갖는 것으로 의심되는 대상으로부터 얻어진 생물학적 시료로부터 CD133 발현 세포(들) 및/또는 암 줄기 세포(들)을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 제 1 항 내지 제 18 항에 중 어느 한 항의 상기 분리된 앱타머 또는 제 19 항 또는 제 20 항의 상기 진단제를 상기 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 상기 대상은 뇌암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 간암, 폐암, 난소암, 피부암, 흑색종 또는 CD133⁺ 세포가 존재하는 다른 암에서 선택되는 암을 갖는 대상인 것을 특징으로 하는 방법.
상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머 또는 상기 제 22 항 또는 제 23 항의 항암제의 의약으로서의 용도.
상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머 또는 상기 제 22 항 또는 제 23 항의 항암제의 대상에서의 암 치료 또는 예방하는 용도.
상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머 또는 상기 제 22 항 또는 제 23 항의 항암제의 대상에서의 암 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하기 위한 용도.]
siRNA 또는 리보자임과 커플링된 상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머를 포함하는 전달체.
상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머, 상기 제 22 항 또는 제 23 항의 항암제 또는 상기 제30 항의 전달체의 치료학적 유효량, 그리고 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 조성물.
상기 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 상기 RNA 앱타머, 또는 상기 제 19 항 또는 제 20 항의 상기 진단제의 종양의 분자 이미징 용도.