CN103261418A - 介导肿瘤细胞裂解的双特异性适体 - Google Patents

Abstract

公开的是用于癌症治疗的以高特异性与肿瘤特异性抗原（TSA）和效应细胞特异性抗原（ESA）结合的双特异性适体。

Description

介导肿瘤细胞裂解的双特异性适体

适体是可以结合几乎所有种类的分子的单链DNA或RNA寡核苷酸。它们的确定和刚性三级结构允许多种靶的特异性和高亲和分子识别。它们可以从长度15到85个核苷酸不等，导致5-25 kDa的表观分子量。

适体通过对分离的重组蛋白质（“过滤SELEX”）或全细胞（“细胞SELEX”）选择的称为SELEX的过程发现。

几个特征提供适体超过抗体和其他基于蛋白质的形式的特定竞争优势：

- 免疫原性的假定不存在。当以动物和人治疗应用中使用的剂量大1000倍的临床前剂量施用时，适体展示低免疫原性至无免疫原性。许多单克隆抗体的功效可以被针对抗体自身的免疫应答受到严重限制，但非常难以引发针对适体的抗体，最可能是因为适体不能通过MHC由T细胞提呈，并且免疫应答一般未训练为识别细胞外核酸。?

- 通过化学合成以高精确度和再现性的容易和公认的成本有效的生产。预期在不同生产费用之间没有变动。它们通过严格、变性条件纯化，确保极高纯度。?

- 可达到高亲和力和选择性。治疗适体是化学上强壮的。通过热或变性剂变性的适体固有地容易地在数分钟内再生，并且可以作为冻干粉末在室温贮存高达一年的延长时段，从而显示出极高的保存期限。当修饰时，是热和核酸酶抗性的。?

- 良好的可溶性（>150 mg/mL）和相对低的分子量（适体：10-50 kDa相对抗体：150 kDa）。

SELEX?方法

用于生成适体的合适方法是图2概括所述的名称为“通过指数富集的配体系统进化”（“SELEX?”）的过程。SELEX?过程是与靶分子高特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，并且在例如于1990年6月11日提交、现在放弃的美国专利申请序列号07/536,428、名称为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096，和名称为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,270,163（还参见WO 91/19813）中描述。每种SELEX?鉴定的核酸配体即每种适体是给定靶化合物或分子的特异性配体。SELEX?过程基于下述独特理解：核酸具有足够用于形成多种二和三维结构的能力和在其单体内可获得的足够化学多样性，以充当基本上任何化学化合物（无论是单体还是聚合的）的配体（即形成特异性结合对）。任何大小或组成的分子都可以充当靶。

SELEX?依赖包含随机化序列的单链寡核苷酸的大文库或库作为起点。寡核苷酸可以是修饰或未修饰的DNA、RNA或DNA／RNA杂交物。在一些例子中，该库包含100%随机或部分随机的寡核苷酸。在其他例子中，该库包含含有掺入随机化序列内的至少一个固定和／或保守序列的随机或部分随机的寡核苷酸。在其他例子中，该库包含在其5'和／或3'末端含有至少一个固定和／或保守序列的随机或部分随机的寡核苷酸，所述至少一个固定和／或保守序列可以包含由寡核苷酸库的所有分子共享的序列。固定序列是这样的序列，例如PCR引物的杂交位点、RNA聚合酶的启动子序列（例如T3、T4、T7和SP6）、限制位点、或同聚序列例如聚A或聚T束、催化核心、与亲和柱选择性结合的位点、和促进目的寡核苷酸克隆和／或测序的其他序列。保守序列是由与相同靶结合的许多适体共享的除了先前描述的固定序列外的序列。

该库的寡核苷酸优选包括随机化序列部分以及有效扩增所需的固定序列。一般地，起始库的寡核苷酸含有固定的5'和3'末端序列，其侧接30-50个随机核苷酸的内部区域。随机化核苷酸可以以许多方式产生，包括化学合成和来自随机切割的细胞核酸的大小选择。在测试核酸中的序列变动还可以通过在选择／扩增迭代（iterations）前或过程中通过诱变引入或增加。

寡核苷酸的随机序列部分可以具有任何长度，并且可以包含核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸，并且可以包括修饰的或非天然核苷酸或核苷酸类似物。参见例如，美国专利号5,958,691；美国专利号5,660,985；美国专利号5,958,691；美国专利号5,698,687；美国专利号5,817,635；美国专利号5,672,695和PCT公开WO 92/07065。随机寡核苷酸可以由磷酸二酯连接的核苷酸合成，使用本领域众所周知的固相寡核苷酸合成技术。参见例如，Froehler等人，Nucl. Acid Res. 14:5399-5467（1986）和Froehler等人，Tet. Lett. 27:5575-5578（1986）。随机寡核苷酸还可以使用液相方法例如三酯合成法合成。参见例如Sood等人，Nucl. Acid Res. 4:2557（1977）和Hirose等人，Tet. Lett.，28:2449（1978）。在自动化DNA合成设备上执行的一般合成获得1014-1016种个别分子，是对于大多数SELEX?实验足够的数目。在序列设计中足够大区域的随机序列增加每种合成分子可能代表独特序列的可能性。

寡核苷酸的起始文库可以通过在DNA合成仪上的自动化化学合成生成。为了合成随机化序列，所有四种核苷酸的混合物在合成过程期间的每个核苷酸添加步骤时加入，允许核苷酸的随机掺入。如上所述，在一个实施方案中，随机寡核苷酸包含完全的随机序列；然而，在其他实施方案中，随机寡核苷酸可以包含非随机或部分随机序列段。部分随机序列可以通过在每个添加步骤时加入不同摩尔比的四种核苷酸产生。

寡核苷酸的起始文库可以是RNA或DNA。在其中RNA文库用作起始文库的那些情况下，它一般通过使用T7 RNA聚合酶或修饰的T7 RNA聚合酶在体外转录DNA文库来生成且纯化。RNA或DNA文库随后在有利于结合的条件下与靶混合，且使用相同一般选择方案实施结合、分隔和扩增的逐步迭代，以达到结合亲和力和选择性的近乎任何所需标准。更具体而言，以含有核酸起始库的混合物开始，SELEX?方法包括步骤：（a）使混合物在有利于结合的条件下与靶接触；（b）使未结合的核酸与已与靶分子特异性结合的那些核酸分隔；（c）解离核酸-靶复合物；（d）扩增从核酸-靶复合物中解离的核酸，以获得配体富集的核酸混合物；和（e）通过和需要的一样多的循环重复结合、分隔、解离和扩增步骤，以获得针对靶分子的高度特异性、高亲和力核酸配体。在其中选择RNA适体的那些情况下，SELEX?方法进一步包括步骤：（i）在步骤（d）中的扩增前，逆转录从核酸-靶复合物中解离的核酸；和（ii）在再起始该过程前，转录来自步骤（d）的扩增核酸。

在含有大量可能序列和结构的核酸混合物内，存在对于给定靶的宽范围的结合亲和力。包含例如20个核苷酸随机化区段的核酸混合物可以具有420种候选物可能性。对于靶具有更高亲和力常数的那些最可能与靶结合。在分隔、解离和扩增后，生成对于更高结合亲和力候选物富集的第二种核酸混合物。附加的轮的选择逐渐有利于最佳配体，直至所得到的核酸混合物占优势地由仅一种或少数序列组成。这些随后可以克隆、测序且作为纯配体或适体个别就结合亲和力测试。

选择和扩增循环重复直至达到所需目的。在最一般的情况下，选择/扩增继续直至在循环重复时未达到结合强度中的显著改善。该方法一般用于取样大约1014个不同核酸种类，但可以用于取样多达约1018个不同核酸种类。一般地，核酸适体分子在5 – 20个循环程序中选择。在一个实施方案中，异质性仅在起始选择阶段中引入并且在重复过程自始至终不发生。

在SELEX?的一个实施方案中，选择过程在分离与所选靶最强结合的那些核酸配体方面是如此有效的，从而使得仅需要一个选择和扩增循环。此类有效选择可以例如在层析型过程中发生，其中核酸与柱上结合的靶缔合的能力以这样的方式操作，从而使得柱充分能够允许分开和分离最高亲和力核酸配体。

在许多情况下，不一定希望执行SELEX?的迭代步骤直至鉴定到单一核酸配体。靶特异性核酸配体溶液可以包括核酸结构或基序家族，所述核酸结构或基序具有许多保守序列和许多可以置换或添加而不显著影响核酸配体与靶的亲和力的序列。通过在完成前终止SELEX?过程，可以测定核酸配体溶液家族的许多成员的序列。

已知存在多种核酸初级、二级和三级结构。已显示最通常涉及非沃森-克里克型相互作用的结构或基序被称为发夹环、对称和不对称凸起、假结及其无数组合。此类基序的几乎所有已知情况都暗示它们可以在不超过30个核苷酸的核酸序列中形成。为此，通常优选具有邻接随机化区段的SELEX?程序以含有约20 – 约50个核苷酸的随机化区段的核酸序列起始，并且在一些实施方案中，以含有约30 – 约40个核苷酸的随机化区段的核酸序列起始。在一个例子中，5'-固定:随机3'-固定序列包含约30 – 约50个核苷酸的随机序列。

核心SELEX?方法已经修饰为达到许多特定目的。例如，美国专利号5,707,796描述了使用与凝胶电泳结合的SELEX?选择具有特定结构特征的核酸分子，例如弯曲DNA。美国专利号5,763,177描述了基于SELEX?的方法用于选择含有光反应性基团的核酸配体，所述光反应性基团能够结合和/或光交联和/或光灭活靶分子。美国专利号5,567,588和美国专利号5,861,254描述了基于SELEX?的方法，其达到在对于靶分子具有高和低亲和力的寡核苷酸之间的高度有效分隔。美国专利号5,496,938描述了用于在已执行SELEX?过程后获得改善的核酸配体的方法。美国专利号5,705,337描述了用于使配体与其靶共价连接的方法。

SELEX?还可以用于获得与靶分子上的超过一个位点结合的核酸配体，和用于获得包括与靶上的特异性位点结合的非核酸种类的核酸配体。SELEX?提供了用于分离且鉴定与任何可设想的靶结合的核酸配体，所述靶包括大和小生物分子例如核酸结合蛋白和未知结合核酸作为其生物功能的部分的蛋白质以及辅因子和其他小分子。例如，美国专利号5,580,737公开了通过SELEX?鉴定的核酸序列，其能够以高亲和力与咖啡因和紧密相关的类似物茶碱结合。

反SELEX?是通过消除与一种或多种非靶分子具有交叉反应性的核酸配体序列，用于改善核酸配体对于靶分子的特异性的方法。反SELEX?包含步骤：（a）制备核酸的候选物混合物；（b）使候选物混合物与靶接触，其中相对于候选物混合物对于靶具有增加的亲和力的核酸可以与候选物混合物的其余部分分隔；（c）使增加亲和力的核酸与候选物混合物的其余部分分隔；（d）使增加亲和力的核酸与靶解离；e）使增加亲和力的核酸与一种或多种非靶分子接触，从而去除对于非靶分子具有特定亲和力的核酸配体；和f）扩增仅对靶分子具有特定亲和力的核酸，以获得对于与靶分子的结合具有相对更高的亲和力和特异性的核酸序列富集的核酸混合物。如上文对于SELEX?所述的，根据需要重复选择和扩增循环直至达到所需目的。

在核酸用作治疗学和疫苗中遇到的一个潜在性问题是以其磷酸二酯形式的寡核苷酸可以在表现所需效应前被细胞内和细胞外酶例如内切核酸酶和外切核酸酶在体液中快速降解。SELEX?方法因此包含高亲和力核酸配体的鉴定，所述核酸配体含有对配体赋予改善的特征例如改善的体内稳定性或改善的递送特征的修饰核苷酸。此类修饰的例子包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置上的化学置换。含有修饰核苷酸的SELEX?鉴定的核酸配体例如在下述专利中描述：描述了含有在核糖的2'位、嘧啶的5位和嘌呤的8位上化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸的美国专利号5,660,985，描述了含有多种2'修饰的嘧啶的寡核苷酸的美国专利号5,756,703，和描述了含有由2'-氨基（2′-NH2）、2'-氟（2′-F）和/或2′-OMe（2′-OMe）取代基修饰的一种或多种核苷酸的高特异性核酸配体的美国专利号5,580,737。

在本发明中考虑的核酸配体的修饰包括但不限于提供其他化学基团的那些，所述化学基团对核酸配体碱基或作为整体的核酸配体掺入另外的电荷、可极化性、疏水性、氢键合、静电相互作用和流变性（fluxionality）。生成对核酸酶抗性的寡核苷酸群体的修饰还可以包括一个或多个替代核苷酸间键合、改变的糖、改变的碱基或其组合。此类修饰包括但不限于2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、在环外胺上的修饰、4-硫尿苷的置换、5-溴或5-碘-尿嘧啶的置换；主链修饰、硫代磷酸酯或磷酸烷基酯修饰、甲基化、和稀有碱基配对组合例如异碱基异胞苷和异鸟嘌呤。修饰还可以包括3'和5'修饰例如加帽。

对于适体选择和鉴定有用的进一步方法在通过引用并入本文的US 7,803,931中详细描述。

本发明的适体可以由DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA或rRnY组合物组成，其中R = 嘌呤；Y = 嘧啶；H = A,C,U；D = A,G,U；d = 2’脱氧；r = 2’羟基；m = 2’甲氧基；f = 2’氟；n = 2’胺。

通过增强召募效应细胞群体往肿瘤以利用完整但通常受阻碍的自身免疫系统的治疗方法应用于几种肿瘤相关抗原（TRA）以及效应物特异性抗原（ESA）。在其中的一种有效的ESA是在天然杀伤（NK）细胞和巨噬细胞上的CD16（FcγRIII）。经报道的大多数双特异性方法靶向在细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）上的CD3ε或在天然杀伤细胞上的CD16α。NK细胞经由双特异性结合物（binder）召募到肿瘤靶的概念由针对CD19和CD16的双特异性单链Fv抗体得到证明。

源于在抗体的Fc区内的特异性结合位点与Fcγ受体（FcγR）的相互作用的抗体依赖性细胞毒性（ADCC）在多种肿瘤的治疗中起关键作用。在位置158上的特定多态性增强FcγRIIIa对于IgG1的亲和力，并且与改善的ADCC和因此在淋巴瘤患者中改善的临床结果相关。

CD16是在NK细胞上表达的唯一Fcγ受体。存在两个同种型：CD16α和CD16β。CD16α是多价免疫复合的IgG1和IgG3但非IgG2和IgG4的中等（intermediate）亲和力受体。它涉及吞噬作用、酶和炎症介质的分泌、抗体依赖性细胞毒性和免疫复合物的清除。在人中，它是由NK细胞、δγ-T细胞、单核细胞和巨噬细胞表达的50 - 70 kDa I型跨膜激活受体。CD16α以在位置158上不同的两个同种异型出现。V158同种异型对抗体的Fc区显示更高的亲和力。

FcγRIIIβ（CD16β）与CD16α高度相关，在细胞外结构域（ECD）内与CD16α共享97%氨基酸序列同一性，但它是在人嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达的糖基-磷脂酰-肌醇（GPI）连接的受体。

CD16α和β两者的ECD都可以是蛋白酶解切割的并且可溶形式保留结合活性。普遍的可溶性同种型是嗜中性粒细胞衍生的sCD16β。一定量的sCD16α可以在健康人中。

肝细胞生长因子受体（HGFR）或c-Met是对于胚胎发育和伤口愈合必需的膜受体酪氨酸激酶。它正常由上皮起源的细胞表达。它目前被识别为TRA。主要单链前体蛋白质翻译后切割，以产生二硫键合形成成熟受体的α和β亚基。在通过其配体肝细胞生长因子（HGF）刺激后，c-Met诱导共同引起称为侵袭性生长的程序的几个生物应答。

在癌症中的异常c-Met激活和过表达与预后不良关联，而异常活跃的c-Met MET [c-met？]触发肿瘤生长、新血管形成（血管生成）和癌症扩散至其他器官（转移）。c-Met在许多类型的人恶性肿瘤包括肾、肝、胃、乳腺和脑癌中是失调的。

在癌症中的进一步c-Met验证包括：

- 相对于周围组织在许多肿瘤类型中受体和配体两者的过表达

- 在多重适应症（multiple indications）中观察到的基因扩增

- c-Met引入细胞系内赋予致肿瘤性和转移倾向

- 受体/配体功能的抑制逆转癌症表型（机动性（motility）、侵袭、增殖和体内肿瘤生长）

许多不同类型癌症不存在可靠疗法。此类癌症的一个例子是c-Met过表达癌症。

因此，本发明的优选目的是提供用于治疗此类癌症优选过表达c-Met的癌症的新疗法。

本发明人惊讶地发现针对TRA和ESA的双特异性适体分子提供用于癌症治疗的有力手段。

此类分子的例子是对于CD16α和c-Met双特异性的适体。另一个例子是针对CD16α和EGFR的适体。

在本发明中有用的肿瘤抗原类型可以是肿瘤特异性抗原（TSA）或肿瘤相关抗原（TAA）。TSA是肿瘤细胞特有的，并且在体内的其他细胞上不出现。TAA相关抗原不是肿瘤细胞特有的，并且相反在未能诱导对抗原的免疫耐受性状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在致使免疫系统响应抗原的条件下发生。TAAs可以是在胎儿发育过程中在正常细胞上表达的抗原，其时免疫系统不成熟且不能响应，或它们可以是正常以极低水平存在于正常细胞上但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。TSAs和TAAs可以统称为TRA或肿瘤相关抗原。

关于TRAs的例子是：MUC-1、PSMA、EGFR、核仁蛋白、Sialyl Lewis X、PDGFR、VEGF和VEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、黑素瘤蛋白聚糖、p糖蛋白、内皮糖蛋白、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、LewisY。

关于ESAs的例子是CD32a/b（FcγRIIa/b），CD64（FcγRI），在NK细胞上的CD16α，在细胞毒性T淋巴细胞上的CD3ε和CD28，在嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上的CD89（FcαRI），在树突细胞上的DEC-250和用于补体激活的C1q。

优选的TRA是c-Met。进一步优选的TRA是EGFR。

优选的ESA是CD16α。

本发明的非常优选方面因此提供了选自SEQ ID NOs：64-87中所述的适体的适体，其中SEQ ID NO：82和/或87是特别优选的。

迄今为止，本领域未提供针对CD16α或c-Met的DNA适体。

本发明的进一步目的是提供针对TRAs的单特异性适体。针对TRA的此类单特异性适体的一个优选用途是作为本发明的双特异性适体中的构件块的用途。

针对TRAs的此类单特异性适体例如针对（即以高特异性以皮摩尔更优选纳摩尔范围的Kd结合）：MUC-1、PSMA、EGFR、核仁蛋白、Sialyl Lewis X、PDGFR、VEGF和VEGFR、CD40、CD19、CD20、CD22、CD33、CD52、FAP、TR、CEA、GD2、Wue、黑素瘤蛋白聚糖、p糖蛋白、内皮糖蛋白、HMW-MAA、ErbB1、HER1、HER2/neu、ErbB2、EpCAM、LewisY。

特别优选的方面包含针对c-Met或EGFR优选c-Met的单特异性适体。

因此，本发明在非常优选的方面涉及选自SEQ ID NOs：50-63中公开的适体的一种或多种适体，其中SEQ ID NO：53和/或54是特别优选的。

本发明的同样重要的方面是提供针对ESAs的单特异性适体。针对ESA的此类单特异性适体的一个优选用途是作为本发明的双特异性适体中的构件块的用途。

针对TRAs的此类单特异性适体例如针对（即以高特异性以皮摩尔更优选纳摩尔范围的Kd结合）：CD32a/b（FcγRIIa/b），CD64（FcγRI），在NK细胞上的CD16α，在细胞毒性T淋巴细胞上的CD3ε和CD28，在嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞上的CD89（FcαRI），在树突细胞上的DEC-250和用于补体激活的C1q。

特别优选的方面包含针对CD16α的单特异性适体。

因此，本发明在非常优选的方面涉及选自SEQ ID NOs：1-49中公开的适体的一种或多种适体，其中SEQ ID NO：4、6和/或24是特别优选的。

图显示下述：

图1：适体的序列最佳化：A，CLN0004的完全侧翼序列的去除导致在斑点印迹实验中结合的完全丧失（?），而仅G61的添加（▲）恢复与原始克隆（●）几乎相似的亲和力。B，如在斑点印迹中测定的，CLN0020中C20的去除改变低纳摩尔亲和力（?）至几乎没有任何结合（▲）。C，CLN0003的最小化一般导致亲和力的减少，然而，仍保留在低纳摩尔范围中。D，CLN0004的序列变体和3’平截显示出更低的亲和力，而5’侧翼序列不是c-Met结合必需的。E，CD16α适体CLN0020最小化至34聚体核心序列，同时保留高亲和力。F，截短的CLN0123构建体一如预期地微弱地结合但以相似或改善的亲和力结合CD16α。间歇的结合曲线由于温度和蛋白质分批变异而改变；因此，只有与原始适体的直接定性比较是可行的（在D中表示为~11 nM）。

图2：双特异性适体的斑点印迹结合曲线 A和C，分别为双特异性适体bsA17和bsA31的斑点印迹结合曲线。对于CD16的亲和力是相当的（19和24 nM）并且与亲本-19ntCLN0020-31nt（47 nM）一致。相比之下，CLN0003衍生的bsA17显示出皮摩尔c-Met亲和力（A），而CLN0004衍生的bsA31以92 nM Kd与c-Met结合（C），反映亲本适体CLN0003和CLN0004的不同亲和力（分别为91 pM和57 nM）。B，斑点印迹衍生的所有双特异性适体（除了未产生的bsA14外）对于CD16α和c-Met的亲和力。一般地，当使用5'时，CLN0020保留原始亲和力，而融合至3'末端的c-Met适体表现最佳（bsA3，5，7 17 – 22）。连接的全长适体获得类似于亲本单一适体的亲和力（分别地，CLN0003：bsA9-11、17、21、22的皮摩尔Kd；CLN0004：bsA12、13的18 nM；CLN0123：bsA15和16的174 nM和178 nM）。不含接头的bsA1和bsA2显示出c-Met亲和力减少。Kd值显示为独立斑点印迹实验的平均值和标准差。

图3：电泳迁移率变动分析（EMSA）以证明两种蛋白质的同时结合（当与两种靶蛋白质结合时，在TBE凝胶上适体的带移）。A – C，CLN0003衍生的bsA17、bsA22和bsA11都显示出与CD16α-6His（泳道2中的另外条带）或c-Met-Fc融合蛋白（泳道3中的另外条带）的结合。这种c-Met-Fc结合的适体条带在CD16α-6His（泳道4）添加后再次改变。D，相比之下，阴性对照亲本单一适体CLN0003未显示这种迁移变动。E和F，bsA31和原始单一c-Met特异性适体CLN0004显示出相同模式，而如预期的，非结合的阴性对照适体CLNC不与任何蛋白质结合。梯度凝胶的应用和在CD16α-6His与c-Met-Fc融合蛋白之间的大小差异导致不同延伸的迁移（泳道2和3），和在两种靶蛋白质（从泳道3到4）添加后预期的较小但明确存在的迁移变动。箭头指示特定适体条带的最低迁移前沿。在A、B、C中的泳道1和2以及在D中的所有泳道中的弱的另外条带可以是由于非特异性聚集。

图4：重要的单一适体（CLN0004、CLN0020）和双特异性构建体（bsA3和bsA17）的胎牛血清稳定性。A和B，分别为在不同时间点在胎牛血清中温育后的CLN0020或bsA17的PAGE。在0小时样品的迁移水平的条带代表完整适体，而在更低位置的增加的信号描述了分解产物。C，bsA17经过整个时间过程在PBS中是稳定的，因为即使在48小时后也不能观察到碎片。D，如在A – C中，从凝胶中提取强度值，计算完整适体百分比，和与所得到的时间过程拟合曲线。半衰期测定为6.4小时 – 20.3小时。放大符号指示每种适体的半衰期拟合。

图5：使用bsA17（SEQ ID NO：82）的ADCC测定 A，在与作为阳性对照的西妥昔单抗相似的量值通过双特异性适体bsA17介导的特异性GTL-16细胞裂解。适体滴定导致非结合的阴性对照适体CLNC的裂解减少至本底水平并且以仅具有培养基为参考。B，PBMC：靶细胞比降低减少bsA17和西妥昔单抗两者在50 nM的特异性GTL-16细胞裂解。应当指出当应用80:1 PBMC：靶细胞时，实际效应物：靶细胞比是约8:1。C，bsA17介导的浓度依赖性特异性EBC-1细胞裂解同样类似于GTL-16靶细胞（A）。D，由于bsA17与CD16α结合的抑制，抗体3G8的20倍摩尔过量的添加导致bsA17介导的GTL-16裂解的显著减少。E，352 pM（bsA17）与5 nM（bsA20）的亲和力差异显示对GTL-16细胞裂解的有效性无影响，而更长的接头序列（大约bsA17以49 ?，bsA22以105 ?和bsA11以217 ?）导致bsA介导的GTL-16细胞裂解的减少（F）。由于供体和CD16α同种异型依赖性，最大限度裂解在个别实验之间变化。ADCC测定以n = 4执行5次（A），以n = 3执行3次（B），以n = 4执行4次（C），以n = 9执行3次（D），以n = 9执行1次（E），以n = 9执行3次（F），并且代表性测量显示为计算的平均值，误差条指出标准差。

图6：使用bsA22（SEQ ID NO：87）的ADCC测定 A，双特异性适体bsA22（SEQ ID NO：87）以浓度依赖性方式诱导特异性肿瘤细胞裂解。bsA22几乎与西妥昔单抗一样有效，具有比非结合的适体对照CLNC或培养基参考显著更高的裂解。B，在50 nM固定浓度，bsA22和西妥昔单抗介导的裂解通过PBMC：靶细胞比的降低而减少。C，更少的c-Met亲和的bsA31在更高浓度诱导更弱但显著的裂解。D，由作为更低亲和力CD16α结合实体的CLN0123组成的bsA15同样介导弱的但显著的细胞毒性。在所有测量中应用人胃腺癌GTL-16细胞。显示了平均值与标准差。测定一式三份地执行（B）或n = 4 – 5（A、C、D）4次（A）、1次（B）、2次（C）和1次（D），并且显示了代表性测量。

为了举例说明本发明，包括下述实施例。然而，应当理解这些实施例不限制本发明，并且仅意欲暗示实践本发明的方法。此外，当前的实施例不应解释为限制本发明，并且当可应用于操作本发明的双特异性适体用于癌症治疗时，这些实施例的技术教导可以与本申请的说明书中的任何技术教导组合。

实施例：

实施例1：过滤SELEX

过滤SELEX基于在适体与靶蛋白质在溶液中温育后，将靶蛋白质固定至硝酸纤维素膜，致使能够分离和洗涤靶结合的适体。选择在Dulbecco’s PBS（DPBS）中以100 μl的总体积执行，所述DPBS具有递增浓度的非特异性竞争物tRNA和洗涤体积以及递减量的靶蛋白质，以从头到尾地增强选择过程的严格性。对于第1轮，使用起始库的1 x 1014分子（具有1.66 μM的终浓度），和在后续轮中，将来自先前轮的输出库调整至1 μM。滤器用KOH预处理以减少DNA库与滤器的非特异性结合。

对于在阴性预选择中结合滤器的适体的去除（在第1轮中省略），将50 μl库/ DPBS溶液加入预处理的滤器，并且以2000 rpm离心1分钟。收集流通物用于在后续阳性/阴性选择步骤中使用。

如果希望去除针对未靶向的组分（例如应用的重组靶蛋白质的His标签或Fc融合部分；在第1轮中省略）的适体，那么通过将蛋白质和DPBS加入阴性选择的流通物至在90 μl总体积中1 μM蛋白质的终浓度，应用反选择。在37℃温育1小时后，将库/ DPBS溶液加入预处理的滤器中，以2000 rpm离心1分钟，并且收集流通物用于在阳性选择步骤中使用。

在先前反选择的情况下，通过加入靶蛋白质和竞争物量至90 μl库/ DPBS流通物以获得在100 μl总体积中的1 μM蛋白质，执行阳性选择。将阳性选择混合物在37℃温育1小时，随后加入预处理的Centrex柱，并且以2000 rpm离心1分钟，弃去流通物。滤器从而捕获所需蛋白质:库复合物。这些用预温的1000 μl DPBS（在第1轮中500 μl）洗涤两次，和如前离心弃去流通物，并且通过如上温育1分钟和离心用200 μl 90℃预加热的洗脱缓冲液洗脱两次，组合两种流通物洗脱级分（总共400 μl）。在这个步骤过程中，热和尿素变性的靶蛋白质丧失其正确折叠，释放在流通物中收集的构象表位结合适体。经由异丙醇沉淀将这些适体纯化用于后续PCR，并且重悬浮于10 μl dH2O中。

适体库的扩增在两步PCR设置中达到。执行最初小规模PCRs（ssPCR），以调整DNA浓度至10 ng/μl的标准浓度，同时通过PCR循环监控间接地调查所选适体的量。富集的适体越多，达到所需浓度所需要的PCR循环越少。在接下来的步骤中，随后为大规模PCRs（lsPCR），以获得用于后续选择轮的足够适体材料。lsPCR溶液用乙醇沉淀，并且将团块干燥且重悬浮于30 μl TE缓冲液pH 8.0中，且转移至1.5 ml管。

单链适体必须经由双链PCR产物的链分离来获得。3’核糖修饰的反向引物的使用致使反义链的碱诱导的链断裂成为可能，导致通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的一个较大的有义链适体和两个较小的反义片段。被动凝胶洗脱、DNA沉淀和重悬浮于40 μl DPBS中通过浓度测定完成，以获得准备用于下一轮SELEX的富集适体库。

我们选择结合NK细胞上的CD16α（V158）和CD16α（F158）两者而不是CD16?的CD16α适体，其具有高特异性（不与其他细胞或蛋白质结合）和高亲和力（二数位纳摩尔范围或更低的Kd）。

对于CD16α适体，一些重要的说明在下面表1中给出：

表1：CD16 DNA SELEX的说明

靶蛋白质是CD16<-6His，同时将CD16β-10His应用于反选择，tRNA充当非特异性竞争物。监控且突出显示再扩增特定量的适体所需的PCR循环。MTP，微量滴定板。

我们选择以高特异性和亲和力与c-Met阳性细胞上的c-Met结合的c-Met适体（如上）。如果可应用其他肿瘤特异性抗原（TSAs），例如EGFR，那么还可以选择适体且应用于双特异性适体的构建。

适体可以由DNA、dRmY、rGmH、rRfY、dCmD、mRfY、MNA或rRnY组合物组成，其中R = 嘌呤；Y = 嘧啶；H = A,C,U；D = A,G,U；d = 2’脱氧；r = 2’羟基；m = 2’甲氧基；f = 2’氟；n = 2’胺。

实施例2：获得的数据– CD16a适体：

经由过滤和细胞SELEX（DNA过滤SELEX：CLN0015-31，细胞SELEX：CLN0118-128，rRfY过滤SELEX：CLN0047-63）选择针对CD16α的DNA和rRfY适体。

与CD16特异性结合的所有适体的序列是：

A）DNA适体

B）rRfY CD16特异性适体

C）mRfY CD16特异性适体（spezifische Aptamere）

仅DNA CD16α适体进一步表征，导致仅3个候选物：

CLN0020（SEQ ID NO:6）：

生物化学结合和亲和力：针对CD16a-6His 45 ± 28 nM（n = 10），V158和F158同种异型结合，完全无CD16β结合，无His标签结合，通过斑点印迹的数据。通过FACS证实对下述的细胞结合：1）重组CD16α（V158）阳性Jurkat细胞系，2）重组CD16α（F158）阳性Jurkat细胞系，3）新鲜分离的CD16α阳性PBMCs（包括NK细胞），4）新鲜分离的NK细胞。在CD16α阴性细胞系Jurkat E6.1、CD16α阴性PBMCs、GTL-16上不可见非特异性结合。经由竞争斑点印迹针对西妥昔单抗（Bou-Assaly和Mukherji（2010）AJNR Am J Neuroradiol 31（4）:626-7）和CD16α特异性mAb 3G8的表位作图显示CLN0020在Fc结合结构域（类似于抗体，仅具有~10X更高的亲和力）中或附近结合。结构预测驱动的最小化导致显示出与FL适体相似的性质的缩短形式（命名为“MS1”的41聚体，而非84聚体，和命名为“MS3”的34聚体，参见下文）。在FBS中的血清稳定性显示~ 10小时的半衰期。

（SEQ ID NO:24）：

生物化学结合和亲和力：针对CD16α-6His 231 nM，仅V158同种异型结合，完全无CD16β结合，无His标签结合，通过斑点印迹的数据。针对CLN0020的竞争斑点印迹揭示CLN0123与不同表位结合，因此不在Fc结合位点中，从而不与血清IgG竞争。通过FACS证实对下述的细胞结合：1）重组CD16α（V158）阳性Jurkat细胞系，2）重组CD16α（F158）阳性Jurkat细胞系，3）新鲜分离的PBMCs（包括NK细胞），4）新鲜分离的NK细胞。在CD16α阴性细胞系Jurkat E6.1、CD16-阴性PBMCs上不可见非特异性结合。

（SEQ ID NO:4）：

生物化学结合和亲和力：针对CD16α-6His 38 ± 26 nM（n = 4），仅V158同种异型结合，完全无CD16β结合，无His标签结合，通过斑点印迹的数据。经由FACS的细胞结合分析显示广泛非特异性结合。

实施例3：DNA c-Met适体：

通过过滤SELEX在重组Fc-c-Met上选择c-Met DNA适体。

与c-met特异性结合的所有适体的序列是：

仅2个适体符合低纳摩尔结合的标准并且进一步表征（由于与CLN0004的高序列相似性排除CLN0008）：

CLN0003（SEQ ID NO53）:

生物化学结合和亲和力：针对Fc-His-c-Met 91 ± 40 pM（n = 3），无Fc结合，无His标签结合，通过斑点印迹的数据。通过FACS证实对c-Met阳性细胞系GTL-16、MNK-45、EBC-1的细胞结合；不可见对Jurkat细胞的非特异性结合。应用最小化，但未成功（参见下文）。

（SEQ ID NO54）：

生物化学结合和亲和力：针对Fc-His-c-Met  11 ± 6 nM（n = 6），无Fc结合，无His标签结合，通过斑点印迹的数据。通过FACS证实对c-Met阳性细胞系GTL-16、MNK-45、EBC-1的细胞结合；不可见对Jurkat细胞的非特异性结合。最小化导致显示出与FL适体相似的性质的缩短形式（41聚体而非84聚体，命名为“MS2”，参见下文）。在FBS中的血清稳定性显示~ 10小时的半衰期。

实施例4：双特异性适体

双特异性适体

TRA实体经由接头与ESA实体的连接：

已采用下述不同类型的接头：

- PEG（3）、PEG（6）、PEG（24）

- 核苷酸：15dA

- 核苷酸 “侧翼序列的接头序列” 长7-24 nt）

连接已以构成适体实体两者之间的距离的方式完成，所述距离关联抗体中的CDRs与Fc结合结构域的距离（~ 7.5 nm）。

通过不同策略偶联两种适体的建立

1. 掺入几个序列和长度的核苷酸或碳/PEG接头的直接完全合成（参见下文）。?

2. 下述的偶联

5’胺官能化适体以C7碳间隔物至NHS激活的PEG（24）

和

3’硫醇官能化适体以C3碳间隔物至结合到PEG（24）的另一个末端的马来酰亚胺

导致最终构建体：适体1-C7-NH-CO-PEG（24）-马来酰亚胺-S-C3-适体2

已构建下述双特异性适体：

CD16 c-Met双特异性DNA适体

SEQ ID NO:79 bsA14；GGAGGGAAAAGTTATCAGGCTGGATGGTAGCTCGGTCGGGGTGGGTGGGTTGGCAAGTCTGATTAGTTTTGGAGTACTCGCTCC-C7-NH2和GTTATCAGGCCACTGCGGGGGTCTATACGTGAGGAAGAAGTGGGCAGGTC-C3-SH与通过PEG（24）连接的官能残基NH2和SH，以获得适体1-C7-NH-CO-PEG（24）-马来酰亚胺-S-C3-适体2

下表2显示了本发明的双特异性适体的细节。

 实施例5：关于双特异性适体的细节

对于双特异性适体，执行下述实验：

 - 斑点印迹，以确定各自的适体实体的未改变的结合性质（Kds参见下文）

- 在图2中概括了各自的数据。?

- 在图3中显示了电泳迁移率变动分析（EMSA），以证明两种蛋白质的同时结合（当与两种靶蛋白质结合时，在TBE凝胶上适体的带移）。

实施例6：所选适体的血清稳定性

重要的单一适体（CLN0004、CLN0020）和双特异性构建体（bsA3和bsA17）的胎牛血清稳定性经测定具有6.4 – 20.3小时的血清半衰期。所获得的结果在图4中阐述。

实施例7： - 评价肿瘤细胞裂解的ADCC测定

使用下述细胞系：

GTL-16      人胃腺癌（Paolo Porporato Novara，Merck KGaA）

EBC-1   人肺鳞状细胞癌（Health Sc. Res. Resources Bank，JCRB0920，031496）

所有ADCC测定都使用GTL-16细胞（参见van der Horst 2009 c-Met抗体ADCC测定）执行，除了还使用EBC-1（参见图5，部分C）评价bsA17外。由图5容易理解本发明的双特异性适体介导类似于西妥昔单抗的ADCC活性。图6显示了对于bsA22获得的结果。

Claims (5)

1.用于癌症治疗的双特异性适体，其与TRA和ESA结合。

2.根据权利要求1的双特异性适体，其与c-Met和CD16α结合。

3.根据权利要求2的双特异性适体，其包含选自SEQ ID NO 82和SEQ ID NO 87的核酸序列。

4.前述权利要求之一的双特异性适体，其用于药物中。

5.根据权利要求4的双特异性适体，其用于癌症药物中。

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