KR20240067074A

KR20240067074A - Siglec 수용체 체크 포인트 억제제 및 이를 사용하여 네오플라스틱 세포 성장을 억제하는 방법

Info

Publication number: KR20240067074A
Application number: KR1020247009541A
Authority: KR
Inventors: 프레드 하이드; 마크 잭슨; 헤더 커크패트릭
Original assignee: 어드밴티젠 바이오사이언스, 엘엘씨
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2022-09-29
Publication date: 2024-05-16

Abstract

본 개시 내용은 암세포에서 Siglec-5와 이의 동족 리간드의 상호작용을 억제하기 위한 조성물 및 네오플라스틱(neoplastic) 장애의 치료에서 체크포인트(checkpoint) 억제제로서의 그의 용도를 제공한다. Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 Siglec-5 리간드를 발현하는 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 대상체는 Siglec-5 리간드를 발현하는 암을 갖고 있는 것으로 확인된다. 바람직하게는, 분자는 Siglec-5에 대한 단클론 항체이다.

Description

SIGLEC 수용체 체크 포인트 억제제 및 이를 사용하여 네오플라스틱 세포 성장을 억제하는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 9월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/250,630의 이익을 주장하며, 이의 전체 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.

배경

질병 치료 개선은 기초 연구와 임상 연구 모두에서 오랫동안 지속되어 온 주제였다. 특정 질병 표적과 면역계를 조절하는 표적에 대한 치료법은 매우 오랫동안 연구자와 그러한 연구들의 목표였다. 면역 체크포인트(immune checkpoint)는 자가-내성(self-tolerance)을 유지하고 면역 반응을 돕는 억제 또는 자극 기능을 가진 경로이다. 여기에는 세포, 세포 그룹, 조직, 조직 그룹을 시험관 내(in vitro) 방식으로 면역 조절하는 능력, 및 동물 또는 동물의 면역계에서 생체 내(in vivo) 면역 조절하는 능력이 포함된다. 면역 조절을 위한 새로운 표적은 과거에 잘못 분류되었지만, 현재는 체크포인트 억제제에 의해 표적이 될 수 있는 면역 체크포인트 세포 표면 수용체로 특성화되었다. 표적 치료는 암에 영향을 미칠 수 있으며 고형 종양 암에 대한 CAR-T 치료법의 효과를 높일 수 있다.

면역계를 조절하기 위한 단클론(monoclonal) 항체와 같은 체크포인트 억제제에 대한 미충족 욕구가 당해 기술분야에 존재한다.

발명의 요약

Siglec-5는 본원에서 면역 체크포인트 억제제로 확인된다. 대상체에서의 면역 반응이 조절되도록 Siglec-5와 동족 Siglec-5 리간드(예를 들어, 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드) 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, Siglec-5 리간드는 (당)단백질 리간드이다. 바람직하게는, 분자는 대상체의 면역 반응을 강화, 자극 또는 증가시킨다.

일부 측면에서, 하나 이상의 Siglec-5 리간드를 발현하는 암세포는 Vuchkovska et al., Immunology, 166(2):238-248 (2022)에 기술된 방법에 의해 확인되며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 관련 측면에서, 분자(예를 들어, 항-Siglec-5 항체)에 의한 Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용의 억제는 Vuchkovska et al.에 기술된 방법에 의해 평가된다. 다른 측면에서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자에 의한 항종양 T 세포 반응의 자극은 Vuchkovska et al.에 기술된 방법에 의해 평가된다.

일부 측면에서, Siglec-5와 암세포에 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 Siglec-5 리간드를 발현하는 암의 치료 및/또는 예방 방법이 제공된다. 일부 측면에서, 대상체는 Siglec-5 리간드를 발현하는 암을 가지고 있는 것으로 확인된다.

특정 실시 양태에서, Siglec-5와 암세포 분자에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자(예를 들어, 항-Siglec-5 항체 또는 Siglec-5의 가용성 형태)로 치료되는 암은 고형 종양, 혈액암(예를 들어, 백혈병, 림프종, 골수종, 예를 들어, 다발성 골수종) 및 전이성 병변이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일 실시 양태에서, 암은 고형 종양이다. 고형 종양의 예에는 악성 종양, 예를 들어, 육종 및 암종, 예를 들어, 폐, 유방, 난소, 림프, 위장(예를 들어, 결장), 항문, 생식기 및 비뇨생식관(예를 들어, 신장, 요로상피, 방광 세포, 전립선), 인두, CNS(예를 들어, 뇌, 신경 또는 교세포), 두경부, 피부(예를 들어, 흑색종), 및 췌장에 영향을 미치는 것과 같은 다양한 기관계의 선암종들뿐만 아니라 대장암, 직장암, 신장세포암종, 간암, 비소세포폐암, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암종을 포함한다. 암은 초기, 중기, 말기 또는 전이성 암일 수 있다.

일 실시 양태에서, 암은 폐암(예를 들어, 폐 선암종 또는 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)(NSCLC)(예를 들어, 편평 및/또는 비편평 조직을 갖는 NSCLC, 또는 NSCLC 선암종), 흑색종(예를 들어, 진행성 흑색종), 신장암(예를 들어, 신장 세포 암종), 간암(예를 들어, 간세포 암종), 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 전립선암, 유방암(예를 들어, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중 하나, 둘 또는 전부를 발현하지 않는 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암), 난소암, 결장직장암, 췌장암, 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma)(HNSCC), 항문암, 위식도암(예를 들어, 식도 편평 세포 암종), 중피종, 비인두암, 갑상선암, 자궁경부암, 림프증식성 질환(예를 들어, 이식 후 림프증식성 질환) 또는 혈액암(예를 들어, 미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma), T 세포 림프종, B 세포 림프종 또는 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma)) 또는 백혈병(예를 들어, 골수성 백혈병 또는 림프성 백혈병)으로부터 선택된다.

일부 바람직한 실시 양태에서, 암은 대장암, 식도암, 편평 세포 암종, 간세포 암종, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 중피종, 비소세포 폐암, 신세포 암종, 요로상피암종, 유방암, 자궁경부암, 피부 편평 세포 암종, 자궁내막 암종, 식도 암종, 위 암종, 메르켈(Merkel) 세포 암종, 거대 B 세포 림프종 및 소세포 폐암으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 이들 암 중 하나 이상의 치료 방법은 (i) Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 결합을 억제하는 분자 및 (ii) 바람직하게는 PD-1의 억제제를 포함하는 하나 이상의 추가 면역 체크포인트 억제제를 치료가 필요한 대상체에게 공동 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 대상체는 PD-L1 발현 수준이 상승된 암 미세환경을 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 암 미세환경은 IFNγ 및/또는 CD8 발현을 증가시킬 수 있다.

일부 실시 양태에서, 대상체는 높은 PD-L1 수준 또는 발현 중 하나 이상을 갖는 종양을 갖거나 갖는 것으로 확인되거나, 종양 침윤 림프구(Tumor Infiltrating Lymphocyte)(TIL)+(예를 들어, 증가된 수의 TIL을 갖는 것) 또는 둘 다인 것으로 확인된다. 특정 실시 양태에서, 대상체는 높은 PD-L1 수준 또는 발현을 갖고 TIL+인 종양을 갖거나 갖는 것으로 확인된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 높은 PD-L1 수준 또는 발현 중 하나 이상을 갖는 종양을 갖는 것, TIL+인 것, 또는 둘 다를 갖는 것에 기초하여 대상체를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기재된 방법은 높은 PD-L1 수준 또는 발현을 갖는 종양을 갖고 TIL+인 것에 기초하여 대상체를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, TIL+인 종양은 CD8 및 IFNγ에 대해 양성이다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 PD-L1, CD8 및/또는 IFNγ 중 하나, 두개 이상에 대해 양성인 높은 백분율의 세포를 갖거나 갖는 것으로 확인된다. 특정 실시 양태에서, 대상체는 PD-L1, CD8 및 IFNγ 모두에 대해 양성인 높은 백분율의 세포를 갖거나 갖는 것으로 확인된다.

일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 PD-L1, CD8 및/또는 IFNγ 중 1개, 2개 이상에 대해 양성인 높은 백분율의 세포를 갖는 것에 기초하여 대상체를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 PD-L1, CD8 및 IFNγ 모두에 대해 양성인 높은 백분율의 세포를 갖는 것에 기초하여 대상체를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 양태에서, 대상체는 PD-L1, CD8 및/또는 IFNγ 중 1개, 2개 이상, 및 폐암, 예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종; 두경부암; 편평 세포 자궁경부암; 위암; 식도암; 갑상선암; 흑색종 및/또는 비인두암(nasopharyngeal cancer)(NPC)중 1개 이상을 갖거나 갖는 것으로 확인된다. 특정 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 PD-L1, CD8 및/또는 IFNγ 중 1개, 2개 이상 및 폐암, 예를 들어, 편평 세포 폐암 또는 폐 선암종; 두경부암; 편평 세포 자궁경부암; 위암; 갑상선암; 흑색종 및/또는 비인두암 중 하나 이상을 갖는 것에 기초하여 대상체를 확인하는 것이 추가로 기술된다.

일부 실시 양태에서, 대상체는 높은 PD-1 수준 또는 발현, 높은 TIM-3 수준 또는 발현, 및/또는 높은 수준의 PD-1 종양 내 조절 T 세포의 침윤, 예를 들어, 종양에 존재하는 증가된 Treg의 수 또는 백분율 중 1개, 2개 이상을 갖는 종양을 갖거나 갖는 것으로 확인된다. 특정 실시 양태에서, 대상체는 높은 PD-1 및 TIM-3 수준 또는 발현, 및 높은 수준, 예를 들어, 종양 내 조절 T 세포의 수 또는 조절 T 세포를 갖는 종양을 갖거나 갖는 것으로 확인된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 방법은 PD-1에 대해 양성인 높은 백분율의 세포, TIM-3에 대해 양성인 높은 백분율의 세포, 및/또는 종양 내 조절 T 세포의 높은 수준의 침윤, 예를 들어 종양에 존재하는 증가된 Treg의 수 또는 백분율 중 1개, 2개 이상에 기초하여 대상체를 확인하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 방법은 PD-1에 대해 양성인 높은 백분율의 세포, TIM-3에 대해 양성인 높은 백분율의 세포, 및/또는 종양 내 조절 T 세포의 높은 수준의 침윤, 예를 들어 종양에 존재하는 증가된 Treg의 수 또는 백분율 중 1개, 2개 이상, 및 폐암, 예를 들어 비소세포폐암(NSCLC); 간세포암, 예를 들어 간세포 암종; 또는 난소암, 예를 들어 난소 암종 중 하나 이상에 기초하여 대상체를 확인하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 방법에 따라 치료될 대상체는 상승된 수준의 PD-L1 및/또는 PD-1 발현을 포함하는 종양 미세환경을 갖는 것으로 확인된다.

일부 실시 양태에서, 본 방법에 따라 치료될 대상체는 상승된 수준의 Siglec-5 리간드의 발현을 포함하는 종양 미세환경을 갖는 것으로 확인된다. 관련 실시 양태에서, 본 방법에 따라 치료될 대상체는 상승된 수준의 Siglec-5 리간드 및 PD-1의 발현을 포함하는 종양 미세환경을 갖는 것으로 확인된다.

또한, Siglec-5 리간드 및/또는 PD-1의 존재에 대해 샘플(예를 들어, 암세포를 포함하는 인간 대상체로부터의 샘플)을 테스트하여 Siglec-5 리간드 및/또는 PD-1 값을 확인하고, Siglec-5 리간드 및/또는 PD-1 값을 대조군 값과 비교하고, Siglec-5 리간드 및/또는 PD-1 값이 대조군 값보다 큰 경우, 치료 유효량의 항-Siglec-1 항체(예를 들어, 본원에 기술된 항-Siglec-5 항체)를 대상체에게 선택적으로 하나 이상의 다른 작용제(agent), 예를 들어 항-PD-1 항체 분자와 조합하여 투여함으로써 암을 치료하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법이 제공된다

일부 측면에서, 암세포의 과시알릴화(hypersialylation)는 암세포와 Siglec-5 사이의 상호작용을 조절한다.

일부 측면에서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자는 Siglec-5 리간드에 대한 미끼(decoy) 수용체로서 작용할 수 있는 가용성 형태의 Siglec-5를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 가용성 Siglec-5는, 예를 들어, Connolly et al., Br J Haematol., 119(1):221-238 (2002)에 기술된 바와 같이, Siglec-5의 세포외 서열을 갖는 가용성 절단된 단백질을 인코딩하는 Siglec-5 이소형(isoform)을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 가용성 Siglec-5는 리간드-결합 도메인을 포함하는 Siglec-5의 세포외 서열의 일부를 포함한다. 관련된 측면에서, 가용성 Siglec-5는 시알산(sialic acid)을 인식하는 아미노 말단 V-세트 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 가용성 형태의 Siglec-5는 (i) Siglec-5의 세포외 부분 또는 이의 리간드-결합 단편 및 (ii) IgG1의 Fc 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

다른 측면에서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시 양태에서, 항체는 Sigle-5에 특이적으로 결합하고 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 감소시킨다. 바람직한 실시 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 대상체의 암 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 Siglec-5에 결합하고 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 감소시킨다. 다른 실시 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드에 결합하고 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 감소시킨다.

다른 측면에서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자는 간섭 RNA 또는 안티센스(antisense) RNA를 포함한다. 일부 측면에서, 간섭 RNA 또는 안티센스 RNA는 종양 미세환경에서 Siglec-5의 발현을 감소시킨다.

다른 측면에서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자는 소분자(small molecule)를 포함한다. 예를 들어, Rillahan et al., Angew Chem Int Ed Engl., 51(44):11014-11018 (2012)을 참조. 이 내용은 본원에 참고로 포함된다.

또한, (i) Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 억제하는 분자 및 (ii) 제2 암 치료제의 공동 투여를 포함하는 조합 요법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, Siglec-5의 결합을 억제하는 분자는 공동자극 분자의 조절제(예를 들어, 공동자극 분자의 작용제)와 조합하여 대상체에게 투여된다. 다른 실시 양태에서, Siglec-5의 결합을 억제하는 분자는 억제 분자의 조절제(예를 들어, 면역 체크포인트 단백질의 억제제)와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 제2 암 치료제는 면역 체크포인트 억제제, 바람직하게는 항-PD-1, 항-PD-L1 및/또는 항-CTLA-4 항체이다.

또한, Siglec-5에 결합하는 단리된 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시 양태에서, 단리된 항체는 인간 Siglec-5에 결합하는 인간 단클론 항체이다. 또한, 항체를 인코딩하는 핵산 분자, 및 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 본원에 제공된 항-Siglec-5 항체는 다음 특성 중 하나 이상을 나타낸다:

(a) [1 x 10-7 M] 이하의 kD로 인간 Siglec-5에 결합

(b) 시험관 내 및/또는 생체 내 면역 세포(예를 들어, 활성화된 T 세포)에서 발현되는 Siglec-5의 세포 표면 수준을 실질적으로 감소시키지 않음

(c) 혼합 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction)(MLR) 분석에서 T 세포 증식을 증가시킴

(d) MLR 분석에서 IL-2 분비를 증가시킴

(e) T 림프구 증식 분석에서 T 세포 증식 및/또는 IL-2 분비를 증가시킴

(f) 인간 Siglec-5 및 시노몰구스 원숭이 Siglec-5에 결합함

(g) 면역 세포에서 발현된 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5가 결합을 억제함

(h) 생체 내 종양 세포 성장을 억제함

(i) 인간 Siglec-14와 교차반응하지 않음

바람직하게는, 항-Siglec-5 항체는 인간 항체이지만, 대안적인 실시 양태에서, 항체는, 예를 들어, 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 이소형(isotype)의 전장(full-length) 항체일 수 있다. 대안적으로, 항체는 Fab 단편(VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편), F(ab')2 단편(힌지 영역에서 적어도 하나의 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), Fd 단편(VH 및 CH1 도메인으로 구성됨), Fv 단편(항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성됨), dAb 단편(단일 가변 도메인 단편(VH 또는 VL 도메인)으로 구성됨), 함께 융합된 Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH를 포함하며, 일부 실시 양태에서, 단일 단백질 사슬을 만들기 위한 링커를 포함하는 단일 사슬 Fv(scFv)와 같은 항체 단편일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 항체는 인간 Siglec-5에 특이적으로 결합하는 scFv이다.

일부 바람직한 실시 양태에서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 항-Siglec-5 항체가 제공된다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5 리간드를 발현하는 암세포에 대한 재조합 인간 Siglec-5의 결합을 감소시키거나 줄인다. 다른 실시 양태에서, 항-Siglec-5 항체는 시험관 내 및/또는 생체 내 면역 세포(예를 들어, 활성화된 T 세포)에서 발현되는 Siglec-5의 세포 표면 수준을 유의하게 감소시키거나 줄이지 않으면서 암세포에서 발현되는 그의 동족 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 감소시킨다.

본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 시험관 내 분석 또는 세포 기반 배양 분석을 사용하여 포화 항체 농도에서 Siglec-5에 대한 리간드 결합을 적어도 20%만큼 감소시키는 경우, 본원에 사용된 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5와 하나 이상의 Siglec-5 리간드 사이의 상호 작용(예를 들어, 결합)을 억제한다. 일부 측면에서, Siglec-5 리간드를 발현하는 암세포에 대한 Siglec-5의 결합이 20% 이상 감소하도록 유도하는 경우, 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제한다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는, 항-Siglec-5 항체가 없는 경우 Siglec-5의 결합과 비교하여, 하나 이상의 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 적어도 20%, 적어도 21%, 적어도 22%, 적어도 23%, 적어도 24%, 적어도 25%, 적어도 26%, 적어도 27%, 적어도 28%, 적어도 29%, 적어도 30%, 적어도 31%, 적어도 32%, 적어도 33%, 적어도 34%, 적어도 35%, 적어도 36%, 적어도 37%, 적어도 38%, 적어도 39%, 적어도 40%, 적어도 41%, 적어도 42%, 적어도 43%, 적어도 44%, 적어도 45%, 적어도 46%, 적어도 47%, 적어도 48%, 적어도 49%, 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그이상만큼 감소시킨다.

추가로, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 암을 예방하거나, 암의 위험을 감소시키거나, 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 이를 필요로 하는 개인의 종양 미세환경에서 Siglec-5(활성화된 T 세포에서 발현됨)와 그의 동족 리간드(암세포에서 발현됨)의 상호작용에 의해 유발되는 T 세포 불활성화를 예방/역전시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 단클론 항체이다. 따라서, 일부 측면에서, 대상체에서 암 또는 종양 세포의 성장을 감소 또는 억제하는 방법(예를 들어, 암을 치료하는 방법)이 제공되며, 이 방법은 대상체에게 본원에 기술된 항-Siglec-5 항체 분자, 예를 들어, 치료 유효량의 항-Siglec-5 항체 분자를 단독으로 또는 제2 작용제, 예를 들어 면역조절제(예를 들어, 항-PD-1, PD-L1, LAG-3 또는 CEACAM-1 억제제(예를 들어, 항체), 또는 이의 조합)와 조합으로 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 항원(예를 들어, 종양 항원) 자극 시 Siglec-5를 발현하는 활성화된 T 세포에 의해 하나 이상의 전염증성 사이토카인(예를 들어, IFN-g 및 IL-22)의 분비에서의 Siglec-5 리간드-매개 감소 및/또는 하나 이상의 Th2 사이토카인(예를 들어, IL-4, IL-5 및 IL-13)의 분비에서의 Siglec-5 리간드-매개 증가를 예방한다.

일부 측면에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는, 하나 이상의 전염증성 사이토카인(예를 들어, IFN-g, TNF-알파 및/또는 IL-22)의 분비 및/또는 T 세포, 예를 들어, CD4+ 또는 CD8+ T, 예를 들어, IL-12 존재 하에 항-CD3/CD28로 자극된 CD4+ T 세포에서 또는 항-CD3/CD28 자극을 이용한 T 세포-DC 자가 배양 분석에서의 증식을 향상시킨다.

일부 측면에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 예를 들어, 시험관 내(in vitro) 분석에서 표적 암세포에 대한 세포독성 NK(natural killer)(자연 살해) 세포 활성을 향상시킨다. 다른 측면에서, 항-Siglec-5 항체는 T 세포 반응을 자극하는, 예를 들어, 항원 제시 세포(presenting cell)의 IL-12 분비를 증가시키는 대식세포 또는 항원 제시 세포의 능력을 향상시킨다.

다른 측면에서, 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5의 에피토프(epitope), 예를 들어 본원에 기술된 항체 분자에 의해 인식되는 에피토프와 동일하거나 유사한 에피토프에 특이적으로 결합한다.

특정 실시 양태에서, Siglec-5와 하나 이상의 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5에 결합하거나 물리적으로 상호작용하는 항-Siglec-5 항체이다. 항-Siglec-5 항체는 표적 항원(예를 들어, Siglec-5)에 대해 나노몰(nanomolar) 또는 심지어 피코몰(picomolar) 친화성을 가질 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항체의 Kd는 약 10pM 내지 약 100nM이다. 예를 들어, 항체의 Kd는 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 900pM, 약 800pM, 약 790pM, 약 780pM, 약 770pM, 약 760pM, 약 750pM, 약 740pM, 약 730pM, 약 720pM, 약 710pM, 약 700pM, 약 650pM, 약 600pM, 약 590pM pM, 약 580pM, 약 570pM, 약 560pM, 약 550pM, 약 540pM, 약 530pM, 약 520pM, 약 510pM, 약 500pM, 약 450pM, 약 400pM, 약 350pM 300pM, 약 290pM, 약 280pM, 약 270pM, 약 260pM, 약 250pM, 약 240pM, 약 230pM, 약 220pM, 약 210pM, 약 200pM, 약 150pM, 약 100pM , 약 50pM, 약 40pM, 약 30pM, 또는 약 20pM, 또는 약 15pM 내지 약 1pM, 약 2pM, 약 3pM, 약 4pM, 약 5pM, 약 6pM, 약 7pM, 약 8pM, 약 9pM, 약 10pM, 약 11pM, 약 12pM, 약 13pM, 또는 약 14pM 중 어느 하나이다. Siglec-5에 대해 특이적으로 상호작용 및/또는 결합하는 항체의 제조 및 선택 방법이 본원에 기술되어 있다.

일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 인간 Siglec-5에 결합한다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 인간 Siglec-5에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5에 결합하지만 Siglec-14에는 결합하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 인간 Siglec-5에 결합하지만 인간 Siglec-14에는 결합하지 않는다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 인간 Siglec-5에 결합하지만 시노(cyno) Siglec-5에는 결합하지 않는다.

일부 측면에서, 본 개시 내용은, 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 혈액, 혈청, 정액 또는 소변, 또는 조직 생검, 예를 들어, 과다증식성 또는 암성 병변)에서 Siglec-5의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본원의 방법은 평가(예를 들어, 대상체에서 본원에 기술된 장애, 예를 들어, 면역 장애, 암 또는 감염성 질환의 치료 또는 진행을 모니터링, 진단 및/또는 단계화)하는 데 사용될 수 있다. 이 방법에는 (i) 상호작용이 일어나도록 하는 조건 하에서, 본원에 기술된 항-Siglec-5 항체 분자와 샘플(및 선택적으로 참조, 예를 들어, 대조군, 샘플)과 접촉시키거나 피험자에게 투여하는 단계, 및 (ii) 항체 분자와 샘플(및 선택적으로 참조, 예를 들어, 대조군, 샘플) 사이에 복합체가 형성되는지 여부를 검출하는 단계가 포함될 수 있다. 복합체의 형성은 Siglec-5의 존재를 나타내며, 본원에 기술된 치료에 대한 적합성 또는 필요성을 나타낼 수 있다. 이 방법은, 예를 들어, 면역조직화학, 면역세포화학, 유세포분석, 항체 분자 복합 자기 비드, ELISA 분석, PCR 기술(예를 들어, RT-PCR)을 포함할 수 있다.

전형적으로, 생체 내 및 시험관 내 진단 방법에 사용되는 항-Siglec-5 항체 분자는 결합되거나 결합되지 않은 결합제의 검출을 용이하게 하기 위해 검출 가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 적합한 검출 가능한 물질에는 다양한 생물학적 활성 효소, 보결분자단(prosthetic group), 형광 물질, 발광 물질, 상자성(예를 들어, 핵자기공명 활성) 물질 및 방사성 물질이 포함된다.

일부 측면에서, 본 개시 내용은 본원에 기술된 항-Siglec-5 항체 분자 및 사용 지침을 포함하는 진단 또는 치료 키트를 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시 내용은 본원에 기술된 치료 방법에 유용한 Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직한 실시 양태에서, 스크리닝 방법은 Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 소분자(small molecule)를 확인한다.

일부 바람직한 실시 양태에서, 이러한 스크리닝 분석에서, Siglec-5와 본 발명의 항체를 조합함으로써 제1 결합 혼합물이 형성되고; 제1 결합 혼합물(M₀)에서의 결합량을 측정한다. 또한, Siglec-5, 항체, 및 스크리닝할 화합물 또는 작용제를 조합하여 제2 결합 혼합물을 형성하고, 제2 결합 혼합물(M₁)에서의 결합량을 측정한다. 테스트할 화합물은 또 다른 항-Siglec-5 항체 또는 소분자일 수 있다. 이어서, 예를 들어 M₁/M₀ 비율을 계산함으로써 제1 결합 혼합물과 제2 결합 혼합물의 결합 양을 비교한다. 화합물 또는 작용제는, 제1 결합 혼합물과 비교하여 제2 결합 혼합물의 결합 감소가 관찰되는 경우, 면역 반응의 Siglec-5 관련 하향조절을 조절할 수 있는 것으로 간주된다. 결합 혼합물의 제제화 및 최적화는 당업자의 수준 내에 있으며, 이러한 결합 혼합물은 또한 결합을 향상시키거나 최적화하는 데 필요한 완충제 및 염을 함유할 수 있으며, 추가적인 대조 분석이 본 발명의 스크리닝 분석에 포함될 수 있다. Siglec-5-항체 결합을 적어도 약 10%(즉, M₁/M₀<0.9), 바람직하게는 약 30% 이상 감소시키는 것으로 확인된 화합물을 확인할 수 있으며, 따라서 원하는 경우 다른 분석이나 질병의 관련 동물 모델에서의 장애를 개선하는 능력에 대해 이차적으로 스크리닝할 수 있다. Siglec-5와 항체 사이의 결합 강도는, 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석(enzyme-linked immunoadsorption assay)(ELISA), 방사선 면역 분석(radio-immunoassay)(RIA), 표면 플라스몬 공명 기반 기술(surface plasmon resonance-based technology)(예를 들어, Biacore) 등을 사용하여 측정할 수 있으며, 이들 모두는 당업계에 잘 알려진 기술이다.

관련 실시 양태에서, 예를 들어, Rillahan et al., Angew Chem Int Ed Engl., 51(44):11014-11018 (2012)의 방법에 따라 인간 Siglec-5에 대한 히트(hit)를 확인하기 위해 마이크로어레이 기술과 결합된 클릭 화학(click chemistry)을 사용하여 시알로시드 유사체 라이브러리의 고처리량 합성을 사용하여 Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 능력에 대해 소분자 후보가 생성되고 스크리닝될 수 있다. 이어서, 이러한 화합물은 MLR 또는 기타 시험관 내 분석 또는 질병(예를 들어, 암)의 관련 동물 모델에서 T 세포를 자극하는 능력에 대해 이차적으로 스크리닝될 수 있다.

또 다른 실시 양태에서, 대상체에서 T 세포 반응을 감소시키는 항-Siglec-5 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응을 하향조절하는 방법이 제공된다. 면역 반응을 하향조절하는 데 유용한 항-Siglec-5 항체는 Siglec-5 작용제로서 작용할 수 있으며 Siglec-5 매개된 면역 반응의 약화를 향상시키는 특성을 가질 수 있다. 이러한 항체는 하나 이상의 전염증성 사이토카인(예를 들어, IFNγ, IL-2, IL-1a, IL-1b, TNF-α, IL-8)의 면역 세포(예를 들어, T 세포) 분비를 감소 및/또는 하나 이상의 Th2 사이토카인(예를 들어, IL-4 및/또는 IL-10)에 대한 분비 증가 및/또는 T 세포의 증식 감소시키는 효과로 확인될 수 있으며, 자가면역 질환(예를 들어, 류마티스 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 크론병(Crohnl's disease), 전신 홍반성 루푸스 및 천식), 과다증식성 면역 장애, 조직, 피부 및 장기 이식 거부 및 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)(GVHD) 치료 및/또는 예방에 유용하다.

도 1은 활성화된 인간 T 세포의 표면에서 발현되는 Siglec-5에 대한 항-Siglec-5 단클론 항체(monoclonal antibodies)(mAbs)의 결합을 예시한다.
도 2는 mAb의 존재 하에 PBMC 자극 4일 후 활성화된 T 세포 집단에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. 데이터는 단일 기증자(기증자 1)의 두 번의 기술 반복의 평균이다. PD-1 및 BL은 각각 PD-1 또는 Siglec-5 수용체에 결합하는 Biolegend(BL)의 mAb이다. IgG는 IgG만 첨가한 음성 대조군이다. 세포 수는 IgG 샘플 대조군에 대해 정규화되었다.
도 3은 mAb의 존재 하에 자극 4일 후 IL-17A에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. IgG는 음성 대조군으로 역할했다. 뮤린 항-PD-1 항체는 양성 대조군으로 역할했다. 상업용 항-Siglec-5 항체("BL")도 연구에 포함되었다(Biolegend). 데이터는 단일 기증자(기증자 1)의 두 번의 기술 반복의 평균이다.
도 4는 mAb의 존재 하에 PBMC 자극 4일 후 IL-2에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. IgG는 음성 대조군으로 역할했다. 뮤린 항-PD-1 항체는 양성 대조군으로 역할했다. 상업용 항-Siglec-5 항체("BL")도 연구에 포함되었다. 데이터는 단일 기증자(기증자 1)의 두 번의 기술 반복의 평균이다.
도 5는 mAb의 존재 하에 PBMC 자극 4일 후 IL-6에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. IgG는 음성 대조군으로 역할했다. 뮤린 항-PD-1 항체는 양성 대조군으로 역할했다. 데이터는 단일 기증자(기증자 1)의 두 번의 기술 반복의 평균이다.
도 6은 흑색종 MEL624 유래 항원과 함께 흑색종 항원 티로시나제에 특이적인 TCR(1383i)로 형질도입된 조작된 인간 T 세포의 자극 후 IFN-γ 생산에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. 뮤린 항-PD-1 면역 체크포인트 억제제 항체와 가용성 Siglec-5 융합 단백질(Siglec-5 Fc)이 양성 대조군으로 역할했다. IgG는 음성 대조군으로 역할했다. 데이터는 단일 기증자(기증자 2)의 두 번의 기술 반복의 평균이다.
도 7은 흑색종 MEL624 유래 항원과 함께 흑색종 항원 티로시나제에 특이적인 TCR(1383i)로 형질도입된 조작된 인간 T 세포의 자극 후 IL-5 생산에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. 뮤린 항-PD-1 면역 체크포인트 억제제 항체와 가용성 Siglec-5 융합 단백질(Siglec-5 Fc)이 양성 대조군으로 역할했다. IgG는 음성 대조군으로 역할했다. 데이터는 단일 기증자(기증자 2)의 두 번의 기술 반복의 평균이다.
도 8은 흑색종 MEL624 유래 항원과 함께 흑색종 항원 티로시나제에 특이적인 TCR(1383i)로 형질도입된 조작된 인간 T 세포의 자극 후 IL-13 생산에 대한 항-Siglec-5 항체의 효과를 예시한다. 뮤린 항-PD-1 면역 체크포인트 억제제 항체와 가용성 Siglec-5 융합 단백질(Siglec-5 Fc)이 양성 대조군으로 역할했다. IgG는 음성 대조군으로 역할했다. 데이터는 단일 기증자(기증자 2)의 두 번의 기술 반복의 평균이다.

정의

본원에서 언급되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합 부분") 또는 단일 사슬을 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중(heavy)(H)쇄 및 2개의 경(Light)(L)쇄를 포함하는 당단백질, 또는 이의 항원 결합 부분을 의미한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 V_H로 약칭함)과 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 C_H1, C_H2 및 C_H3의 세 가지 도메인으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 V_L로 약칭함)과 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 C_L이라는 하나의 도메인으로 구성된다. V_H 및 V_L 영역은 상보성 결정 영역(complementarity determining region)(CDR)으로 불리는 초가변성 영역, 프레임워크 영역(framework region)(FR)으로 불리는 더욱 보존된 영역이 산재된 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역에는 항원과 상호작용하는 결합 도메인이 포함되어 있다. 항체의 불변 영역은 면역계(immune system)의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포(effector cell)) 및 고전적 보체계(complement system)의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.

본원에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 부분")은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편(예를 들어 Siglec-5)을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장(full-length) 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) V_L, V_H, C_L 및 C_H1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) V_H 및 C_H1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 V_L 및 V_H 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) V_H 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 더욱이 Fv 단편의 두 도메인인 V_L과 V_H는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하면, V_L 및 V_H 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)로 만들 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어 내에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻고, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.

본원에 사용된 "단리된(isolated) 항체"는 다른 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것으로 의도된다(예를 들어, Siglec-5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체에는 Siglec-5 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 Siglec-5에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종의 Siglec-5 분자와 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없을 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단클론(monoclonal) 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 의미한다. 단클론 항체 조성물은 특정 에피토프(epitope)에 대한 단일 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다 인간 생식계열(germline) 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체 내 체세포(somatic) 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된(grafted) 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.

"인간 단클론 항체"라는 용어는 프레임워크 영역과 CDR 영역이 모두 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 의미한다. 일 실시 양태에서, 인간 단클론 항체는 불멸화 세포에 융합된 인간 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어 형질전환 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대한 형질전환 또는 염색체전환(transchromosomal) 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(아래에 추가로 설명됨), (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들어 형질감염종으로부터 단리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱(splicing)하는 것을 포함하는 기타 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는다. 그러나 특정 실시 양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 형질전환 동물이 사용되는 경우 생체 내 체세포 돌연변이 유발)에 적용될 수 있으며, 따라서 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계역 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이와 관련되어 있지만 생체 내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에 사용된 "이소형(isotype)"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 부류(예를 들어, Ig 또는 IgG1)를 의미한다.

"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"라는 문구는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 상호교환적으로 사용된다.

용어 "인간화 항체"는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 지칭하도록 의도된다. 추가적인 프레임워크 영역 변형은 인간 프레임워크 서열 내에서 이루어질 수 있다.

용어 "키메라(chimeric) 항체"는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 가변 영역 서열이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 의미하도록 의도된다.

본원에서 "인간 Siglec-5에 특이적으로 결합하는" 항체는 인간 Siglec-5에 1×10^-7M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10^-8M 이하, 보다 바람직하게는 1×10^-8M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10^-9M 이하 KD로 결합하는 항체를 의미하도록 의도된다.

본원에 사용된 용어 "K_assoc" 또는 "K_a"는 특정 항체-항원 상호작용의 회합율(association rate)을 의미하는 것으로 의도되는 반면, 본원에 사용된 용어 "K_dis" 또는 "K_d"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리율(dissociation rate)를 의미하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "K_D"는 K_d 대 K_a의 비(즉, K_d/K_a)로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 의미하는 것으로 의도된다. 항체에 대한 K_D 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 측정하기 위한 바람직한 방법은 표면 플라즈몬(plasmon) 공명을 사용하는 것, 바람직하게는 Biacore® 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하는 것이다.

본원에 사용된 용어 IgG 항체에 대한 "고친화도(high affinity)"는 표적 항원에 대해 KD가 10^-8 M 이하, 더욱 바람직하게는 10^-9 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 10^-10 M 이하인 항체를 의미한다. 그러나 "고친화성" 결합은 다른 항체 이소형에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 KD가 10^-7 M 이하, 더 바람직하게는 10^-8 M 이하, 훨씬 더 바람직하게는 10^-9 M 이하인 항체를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "간섭 RNA" 및 "간섭 RNA 분자"는 RISC와 상호작용할 수 있고 유전자 발현에서 RISC 매개 변화에 참여할 수 있는, 바람직하게는 Siglec-5 mRNA와 같은 특정 메신저(messenger) RNA(mRNA)의 번역을 감소(즉, 녹다운(knock-down))시킬 수 있는 모든 RNA 또는 RNA 유사 분자를 의미한다. RISC와 상호작용할 수 있는 간섭 RNA 분자의 예로는 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA), 단일 스트랜드(single-stranded) siRNA, 마이크로(micro)RNA(miRNA), 피코(pico)RNA(piRNA) 및 다이서-기질 27-머(dicer-substrate 27-mer) 이중체가 포함된다. RISC와 상호작용할 수 있는 "RNA 유사" 분자의 예에는 하나 이상의 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드, 하나 이상의 비뉴클레오타이드, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide), 및/또는 하나 이상의 비-포스포디에스테르(non-phosphodiester) 연결을 함유하는 siRNA, 단일 스트랜드 siRNA, miRNA, piRNA, 비대칭 siRNA 및 shRNA 분자가 포함된다. 따라서 siRNA, 단일 스트랜드 siRNA, shRNA, miRNA, piRNA, 비대칭 siRNA 및 다이서-기질 27-머 이중체는 "간섭 RNA" 또는 "간섭 RNA 분자"의 하위 집합(sebset)이다.

본원에 사용된 용어 "siRNA"는 특별한 언급이 없는 한 이중 스트랜드 간섭 RNA를 의미한다. 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 siRNA는 2개의 뉴클레오타이드 스트랜드를 포함하는 이중 스트랜드 핵산 분자이고, 각 스트랜드는 약 19 내지 약 28개의 뉴클레오타이드(즉, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 뉴클레오타이드)를 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 간섭 RNA는 약 19 내지 49개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 이중 스트랜드 간섭 RNA를 언급할 때 "19 내지 49개 뉴클레오타이드의 길이"라는 문구는 안티센스(antisense) 및 센스(sense) 스트랜드가 링커(linker) 분자에 의해 연결되는 간섭 RNA 분자를 포하는 독립적으로 센스 및 안티센스 스트랜드가 약 19 내지 약 49개 뉴클레오타이드 길이를 갖는다는 것을 의미한다.

"치료" 또는 "요법"이라는 용어는, 병태(condition)(예를 들어, 질병), 병태의 증상을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 해결, 호전, 개선 또는 영향을 미치거나, 또는 질병의 증상, 합병증, 생화학적 징후의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 또는 달리 통계적으로 유의미한 방식으로 질병, 병태 또는 장애의 추가 발병을 저지하거나 억제시킬 목적을 가지고 활성제를 투여하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, 두 아미노산 서열 사이의 상동성 백분율은 두 서열 사이의 동일성 백분율과 동일하다. 두 서열 간의 동일성 백분율은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는, 갭 수와 각 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치 수의 함수이다(즉, 상동성 % = 동일한 위치 수/위치 총 수 × 100). 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율 결정은 하기 비제한적 실시예에 기술된 바와 같이 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.

두 아미노산 서열 사이의 동일성 백분율은, PAM120 중량 잔류 테이블, 갭 길이 페널티 12 및 갭 페널티 4를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 E. Meyers and W. Miller의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)). 또한, 두 아미노산 서열 간의 동일성(%)은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4와 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 사용하는, GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용 가능)의 GAP 프로그램에 통합된 Needleman and Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열은, 예를 들어, 관련 서열을 확인하기 위해 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질의 서열(query sequence)"로서 추가로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul, et al. (1990)J.Mol. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어 길이=3으로 수행되어 본 발명의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적으로 갭이 있는 정렬을 얻기위해, Gapped BLAST는 Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기술된 바와 같이 활용될 수 있다. BLAST and Gapped BLAST 프로그램을 활용하는 경우, 해당 프로그램(예를 들어, XBLAST and NBLAST)의 기본 매개변수가 사용될 수 있다.(www.ncbi.nlm.nih.gov 참조).

Siglec-5는 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 유형 1 막횡단(transmembrane) 단백질이다. Siglec-5의 단일 막횡단 도메인은 4개의 세포외 IG 유사 도메인을 2개의 티로신 기반 보존 모티프가 있는 89개의 아미노산 긴 세포질 꼬리에 연결한다. 인간 Siglec-5의 아미노산 서열은 아래에 제공된다:

Met Leu Pro Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Gly Gly Ser Leu Gln

1 5 10 15

Glu Lys Pro Val Tyr Glu Leu Gln Val Gln Lys Ser Val Thr Val Gln

20 25 30

Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Trp Arg

35 40 45

Ser Trp Tyr Ser Ser Pro Pro Leu Tyr Val Tyr Trp Phe Arg Asp Gly

50 55 60

Glu Ile Pro Tyr Tyr Ala Glu Val Val Ala Thr Asn Asn Pro Asp Arg

65 70 75 80

Arg Val Lys Pro Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Val

85 90 95

Gln Lys Lys Asn Cys Ser Leu Ser Ile Gly Asp Ala Arg Met Glu Asp

100 105 110

Thr Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Arg Asp Val Lys Tyr

115 120 125

Ser Tyr Gln Gln Asn Lys Leu Asn Leu Glu Val Thr Ala Leu Ile Glu

130 135 140

Lys Pro Asp Ile His Phe Leu Glu Pro Leu Glu Ser Gly Arg Pro Thr

145 150 155 160

Arg Leu Ser Cys Ser Leu Pro Gly Ser Cys Glu Ala Gly Pro Pro Leu

165 170 175

Thr Phe Ser Trp Thr Gly Asn Ala Leu Ser Pro Leu Asp Pro Glu Thr

180 185 190

Thr Arg Ser Ser Glu Leu Thr Leu Thr Pro Arg Pro Glu Asp His Gly

195 200 205

Thr Asn Leu Thr Cys Gln Met Lys Arg Gln Gly Ala Gln Val Thr Thr

210 215 220

Glu Arg Thr Val Gln Leu Asn Val Ser Tyr Ala Pro Gln Thr Ile Thr

225 230 235 240

Ile Phe Arg Asn Gly Ile Ala Leu Glu Ile Leu Gln Asn Thr Ser Tyr

245 250 255

Leu Pro Val Leu Glu Gly Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Asp Ala Pro

260 265 270

Ser Asn Pro Pro Ala His Leu Ser Trp Phe Gln Gly Ser Pro Ala Leu

275 280 285

Asn Ala Thr Pro Ile Ser Asn Thr Gly Ile Leu Glu Leu Arg Arg Val

290 295 300

Arg Ser Ala Glu Glu Gly Gly Phe Thr Cys Arg Ala Gln His Pro Leu

305 310 315 320

Gly Phe Leu Gln Ile Phe Leu Asn Leu Ser Val Tyr Ser Leu Pro Gln

325 330 335

Leu Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Arg

340 345 350

Cys Ser Phe Arg Ala Arg Pro Ala Pro Ser Leu Cys Trp Arg Leu Glu

355 360 365

Glu Lys Pro Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Gly Ser Phe Lys Val Asn

370 375 380

Ser Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ile Leu His Gly

385 390 395 400

Gly Leu Ser Ser Asp Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Trp Asn Ile Tyr

405 410 415

Gly Ser Gln Ser Gly Ser Val Leu Leu Leu Gln Gly Arg Ser Asn Leu

420 425 430

Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Ala Leu Gly Gly Ala Gly Val Met Ala

435 440 445

Leu Leu Cys Ile Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Leu Ile Val Lys Ala

450 455 460

Arg Arg Lys Gln Ala Ala Gly Arg Pro Glu Lys Met Asp Asp Glu Asp

465 470 475 480

Pro Ile Met Gly Thr Ile Thr Ser Gly Ser Arg Lys Lys Pro Trp Pro

485 490 495

Asp Ser Pro Gly Asp Gln Ala Ser Pro Pro Gly Asp Ala Pro Pro Leu

500 505 510

Glu Glu Gln Lys Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Ser Phe Ser Glu Met

515 520 525

Lys Ser Arg Glu Pro Lys Asp Gln Glu Ala Pro Ser Thr Thr Glu Tyr

530 535 540

Ser Glu Ile Lys Thr Ser Lys (서열 식별 번호 1)

545 550

인간 Siglec-5와 같은 Siglec-5 단백질은 서열 식별 번호 1의 아미노산 잔기 1-16에 위치한 신호 서열, 서열 식별 번호 1의 아미노산 잔기 19-136에 위치한 세포외 면역글로불린 유사 가변형(immunoglobulin-like variable-type)(IgV) 도메인, 서열 식별 번호 1의 아미노산 잔기 146-229 및 236-330에 위치한 2개의 Ig-유사 C2형 도메인, 서열 식별 번호 1의 아미노산 잔기 442-462에 위치하는 막횡단 도메인, 서열 식별 번호 1의 아미노산 잔기 518-523에 위치한 ITIM 모티프(motif) 1, 및 서열 식별 번호 1의 아미노산 잔기 542-547에 위치한 SLAM-유사 모티프을 포함하되, 이에 국한되지 않는 여러 도메인을 함유한다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 본 개시 내용의 도메인의 시작(beginning) 및 종료(ending) 잔기는 사용된 컴퓨터 모델링 프로그램 또는 도메인을 결정하기 위해 사용된 방법에 따라 달라질 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 본 개시 내용의 "Siglec-5" 단백질은 제한 없이 포유동물 Siglec-5 단백질, 인간 Siglec-5 단백질 및 영장류 Siglec-5 단백질을 포함한다. 추가로, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 포유동물 Siglec-5 단백질, 인간 Siglec-5 단백질 및 영장류 Siglec-5 중 하나 이상 내의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 본 개시 내용의 항-Siglec-5 항체는 인간 Siglec-5 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 항-Siglec-5 항체는 인간 Siglec-5 단백질의 아미노산 잔기 19-136 내, 146-229 내 또는 236-330 내 에피토프에 결합한다.

Siglec-5는 α2,3- 및 α2,6 연결된 시알산 둘 다에 결합하고, 그보다 적은 정도는 α2,8 연결된 시알산에도 결합한다. b-단백질(그룹 B 연쇄상구균에서 발현됨), HSP70 및 PSLG-1을 포함하여, Siglec-5의 여러 단백질 리간드가 확인되었다. 여기서 Siglec-5는 T 세포 특이적 항종양 반응을 억제하는 종양 세포에서 Siglec-5가 그의 동족 리간드와 결합하여, 활성화된 T 세포에서 억제 수용체로 확인된다. 따라서, 본 출원은 Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 차단함으로써 T 세포 고갈을 역전시키는 방법을 제공한다.

본 출원은 Siglec-5가 상당한 면역 체크포인트 특성(quality)을 갖는 것으로 확인한다. 다른 Siglec 계열 구성원도 면역 체크포인트 특성을 가질 수 있다. 따라서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 항-Siglec-5 항체와 체크포인트 억제제로서의 이들 항체의 치료적 용도가 제공된다. 일부 측면에서, 항체는 T 세포 고갈을 역전시키고 CAR-T 치료법의 효과를 증가시키기 위해 투여된다. 다른 측면에서, 항체는 키트루다(Keytruda) 및 PD-1/PDL-1 경로를 표적으로 하는 다른 치료법과 같은 하나 이상의 다른 체크포인트 억제제와 공동 투여된다. 일부 측면에서, 항-Siglec-5 항체와 하나 이상의 다른 체크포인트 억제제의 공동 투여는 시너지적인(synergistic) 항종양 효과를 나타낸다. 일부 바람직한 실시 양태에서, 본원에 기술된 항-Siglec-5 항체는 (i) 니볼루맙(nivolumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 세미플리맙(cemiplimab)과 같으나 이에 국한되지 않는 프로그램화된 세포사멸 수용체-1(programmed cell death receptor-1)(PD-1)을 표적으로 하는 체크포인트 억제제; (ii) 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 더발루맙(durvalumab)와 같으나 이에 국한되지 않는 프로그램화된 세포사멸 리간드-1(PD-L1)을 표적으로 하는 체크포인트 억제제; (iii) 이필리무맙(Ipilimumab)과 같으나 이에 국한되지 않는 세포독성 T 림프구 관련 분자-4(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule-4)(CTLA-4)를 표적으로 하는 체크포인트 억제제; (iv) 림프구 활성화 유전자-3(Lymphocyte activation gene-3)(CD223으로도 알려진 LAG-3)을 표적으로 하는 체크포인트 억제제; (v) TIM-3을 표적으로 하는 체크포인트 억제제, (vi) B7-H3 또는 B7-H4를 표적으로 하는 체크포인트 억제제 및/또는 (vii) A2aR, CD73, NKG2A 및/또는 PVRIGPVRL2를 표적으로 하는 체크포인트 억제제; 및/또는 예를 들어, CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, FAK, CCL2/CCR2, LIF, CD47SIRPα, CSF-1(M-CSF), IL-1, IL-1R3(IL-1RAP), IL-8, 세마포린(Semaphorins)SEMA4D, Ang2,EVER-1, Axl 및/또는 포스파티딜세린(Phosphatidylserine)과 같으나 이에 국한되지 않는 다른 억제 면역 메커니즘에 작용하는 경로와 조합하여 투여된다.

일부 실시 양태에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 하나 이상의 추가 면역 체크포인트 억제제와 병행하여(concurrently), 동시에(simultaneously) 또는 순차적으로(sequentially) 투여된다. 병행 투여(concurrent administration)는 2개의 개별 치료제의 투여 요법이 적어도 하루 이상 겹치는 것을 의미한다.

관련 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 MBG453, Sym023 및/또는 TSR-022를 포함하나 이에 국한되지 않는 항-TIM-3 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, 항-Siglec-5 분자는 항-Tim-3 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 조합하여 투여된다.

바람직한 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 항-PD-1 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, 항PD-1 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 이의 대표적인 예로는 세미플리맙(Cemiplimab), 니볼루맙(Nivolumab) 및 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)이 포함된다.

또 다른 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 항-PD-L1 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, 항PD-L1 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 이의 대표적인 예로는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 두르발루맙(Durvalumab)이 포함된다.

또 다른 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 항-CTLA-4 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, 항-CTLA-4 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 이의 대표적인 예로는 이필리무맙(Ipilimumab)이다.

또 다른 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 LAG525(IMP701), REGN3767(R3767), BI 754,091, IMP321 또는 FS118과 같은 항-LAG-3 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, 항-Lag3 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 이의 대표적인 예로는 테보텔리맙(tebotelimab)이다.

또 다른 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 MGC018 또는 FPA150와 같은 항-B7-H3 또는 항-B7-H4 제제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, 항-B7-H3 또는 항-B7-H4 제제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.

다른 실시 양태에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 공동자극 분자의 조절제, 예를 들어, 작용제와 조합하여 투여된다. 일 실시 양태에서, 공동자극 분자의 작용제는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160 또는 CD83 리간드의 작용제(예를 들어, 작용제 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 가용성 융합)로부터 선택된다.

바람직한 측면에서, 항-Siglec-5 항체 분자는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 OX40 작용제와 조합하여 투여된다. 일부 실시 양태에서, OX40 작용제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 이의 대표적인 예로는 티슬레즐리움맙(tislezliumab), HFB301001, YH002, 이부솔리맙(ivuxolimab)(PF-04518600) 및 INBRX-106이 포함된다.

이러한 약물의 조합 또는 칵테일은 암의 치료 및/또는 예방에 부가적으로 또는 시너지적으로 작용할 수 있다.

Siglec-5 및 기타 Siglec-5 계열 구성원(Siglec 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15)은 여기서 체크포인트 단백질(들)로 확인된다. 따라서, Siglec-5와 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 항체 또는 기타 화합물은 이러한 표적의 체크포인트 억제제 역할을 한다. 이러한 체크포인트 억제제(들)는 대상체(예를 들어, 포유류)의 액체(림프종) 및 고형 종양 모두에서 종양 크기를 줄이기 위해 단독으로 투여되거나 다른 체크포인트 억제제(들)(및 기타 치료법)(항체 치료제[Keytruda])와 함께 투여될 수 있다. 이들 체크포인트 억제제(들)은 액체(림프종) 또는 고형 종양의 치료에서 T세포 고갈을 줄이고 역전시키기 위해 단독으로 투여하거나 다른 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 또한, 이러한 체크포인트 억제제(들)은 CAR-T 치료법에서 T 세포 소진을 감소키고 역전시키기 위해 단독으로 투여되거나 다른 체크포인트 억제제 및 치료법과 함께 투여될 수 있다. 체크포인트 억제제(들)는 종양 미세환경에서 면역계 고갈을 역전시키는 역할을 한다.

임의의 상기 기술된 실시 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 약 7.5 x 10⁵1/M·s 이상의 kassoc로 인간 SIGLEC5에 결합할 수 있다. 일 실시 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 약 1×10⁶1/M·s 이상의 kassoc로 인간 SIGLEC5에 결합할 수 있다.

임의의 상기 기술된 실시 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 약 2 x 10^-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 SIGLEC5에 결합할 수 있다. 일 실시 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 약 2.7 x 10^-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 SIGLEC5에 결합할 수 있다. 일 실시 양태에서, 항체 또는 항체 단편은 약 3×10^-5 1/s 이하의 kdissoc로 인간 SIGLEC5에 결합할 수 있다.

KD, kassoc 및 kdissoc 값은 사용 가능한 모든 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 해리 상수는 생체광 간섭계(bio-light interferometry)(예를 들어, ForteBio Octet 방법)를 사용하여 측정된다. 다른 바람직한 실시 양태에서, 해리 상수는 표면 플라스몬 공명(예를 들어, Biacore) 또는 Kinexa를 사용하여 측정될 수 있다.

또한, 임의의 상기 기술된 실시 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 약 1nM 이하의 IC50으로 인간 PSGL1과 인간 SIGLEC5의 결합을 차단할 수 있다. 리간드 결합의 차단은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 본원 실시예에 기술된 FACS 또는 FMAT 방법을 사용하여 측정하고 IC50을 계산할 수 있다.

또한, 본 발명은 인간 SIGLEC5의 결합 에피토프에 대해 위에서 기술된 임의의 항체와 경쟁하고, 약 1nM 이하의 IC50으로 인간 PSGL1 또는 인간 SIGLEC5에 대한 결합을 차단하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 키메라 항체 또는 키메라 항체의 단편이다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 인간 항체의 단편이다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 인간화 항체 또는 인간화 항체의 단편이다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, scFv 또는 F(ab')2 항체 단편이다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 항체 단편은 디아바디(diabodies)이다.

또한, 본 발명은 인간 SIGLEC5에 결합하는 상기 기술된 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나를 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다.

일부 실시 양태에서, 본 발명의 단리된 항-SIGLEC5 항체 및 항체 단편은 당업자에게 공지된 전형적인 수단에 의해 측정된 바와 같이 T 세포 활성화를 증가시킨다(제한 없이 면역 세포 증식 증가, 사이토카인 분비 증가 또는 CD25 및/또는 CD69와 같은 활성화 마커의 발현 증가를 포함함).

임의의 상기 기술된 실시 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 생체 외(ex vivo) 또는 생체 내 포도상구균 장독소 B(Staphylococcus Enterotoxin B) 또는 파상풍 톡소이드(Tetanus Toxoid)로 자극한 후 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 증가된 면역 활성화는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 증식 또는 면역 세포에 의한 사이토카인 생산(예를 들어, T 세포에 의한 IFNγ 또는 IL-2 생산)을 정량화하여 결정할 수 있다.

또한, 본 발명은 면역 세포를 본 발명의 항체 또는 항체 단편 중 어느 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역 세포의 활성을 증가시키거나 하향조절을 감소시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 암이나 감염성 질환(예를 들어, 만성 바이러스 감염)을 치료하는 데 사용될 수 있거나 예방적 또는 치료적 백신의 어주번트(adjuvant)로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 항원에 대한 면역 반응이 증가되거나 향상되도록 면역 세포를 항원 및 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 방법을 포함한다. 이 방법은 생체 내(대상체 내) 또는 생체 외에서 수행될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 제2 치료제 또는 치료 양식(modality)과 조합될 수 있다. 일 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 재조합 사이토카인 또는 분비된 면역 인자의 적용을 포함하는 암 치료와 조합될 수 있다. 조합의 비제한적인 예에는 흑색종 또는 신장 세포 암종의 치료를 위해 항-SIGLEC5 항체를 재조합 IL-2 또는 재조합 IFNα2와 조합하는 것이 포함된다. 재조합 IL-2는 암 환자의 T 세포 성장을 향상시킨다. 재조합 IFNα2는 암세포 성장을 억제할 뿐만 아니라 치료받은 환자의 암세포, 항원 제시 세포 및 기타 체세포에서 SIGLEC5에 대한 억제 리간드의 발현을 증가시킨다. 항-SIGLEC5는 암 또는감염성 질환의 치료에 유용한 것으로 간주될 수 있는 다른 사이토카인과 조합될 수 있다.

일부 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 암 또는 감염성 질환을 예방하거나 치료하기 위해 백신과 조합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 항-SIGLEC5는 치료할 암 또는 감염과 관련된 하나 이상의 항원을 함유하는 단백질, 펩타이드 또는 DNA 백신, 또는 이러한 항원으로 펄스된(pulsed) 수지상 세포로 구성된 백신과 조합될 수 있다. 또 다른 실시 양태는 (약화된) 암세포 또는 전체 바이러스 백신과 함께 항-SIGLEC5의 사용을 포함한다. 일 실시 양태는 GM-CSF를 분비하도록 조작된 전체 세포 암 백신과 항-SIGLEC5 요법의 조합을 포함한다.

일부 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 암 또는 감염성 질환의 표준 치료로 간주되는 치료와 조합될 수 있다. 이러한 조합의 이론적 근거는 항-SIGLEC5에 의한 병행 증가된 면역 활성화가 표준 치료 치료에 대한 초기 임상 반응을 유도하거나 촉진하고, 지속적인 임상 반응 및 질병의 장기적인 면역 조절을 유도한다는 것이다.

일 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편을 사용한 치료는 화학요법과 조합될 수 있다. 세포독성제를 사용하는 화학요법은 암세포 사멸을 초래하여 종양 항원의 방출을 증가시킨다. 이러한 종양 항원의 증가된 가용성은 항-SIGLEC5 치료와 시너지 효과를 초래할 수 있다. 비제한적인 예는 흑색종 치료를 위한 데카르바진(decarbazine) 또는 테모졸로미드(temozolomide) 및 췌장암 치료를 위한 젬시타빈(gemcitabine)의 사용에 의해 제공된다.

일 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편을 사용한 치료는 방사선요법과 조합될 수 있다. 방사선 요법은 암세포 사멸을 유도하고 면역 세포의 제시(presentation) 및 활성화를 위한 종양 항원의 가용성을 증가시킨다.

다른 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편을 사용한 치료는 대상체로부터 암세포를 제거하기 위해 수술과 조합될 수 있다.

다른 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 호르몬 결핍 또는 혈관신생 억제에 사용되는 표적화제, 또는 종양 세포에서 활성인 단백질을 표적화하는 것을 포함하는 SIGLEC5 차단과 시너지 효과를 초래할 수 있는 치료법과 조합될 수 있으며, 이는 모두 향상된 종양 세포 사멸 및 향상된 면역 자극 종양 항원의 가용성을 초래한다. 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편과 조합으로, 증가된 T 세포 활성화는 암에 대한 지속적인 면역 조절을 초래할 수 있다.

일부 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 암 또는 감염성 질환의 치료에 유용한 또 다른 치료 항체와 조합될 수 있다. 비제한적인 예는 Her2/neu를 표적으로 하거나 EGF 수용체를 표적으로 하는 항체와 항-SIGLEC5의 조합에 의해 제공된다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 VEGF 또는 그 수용체를 표적으로 하는 치료와 조합된다. 다른 실시 양태에서, 항-SIGLEC5 항체 또는 항체 단편은 항-CTLA-4와 조합된다. 또 다른 비제한적인 예에서, 항-SIGLEC5는 RSV를 표적으로 하는 항체와 조합된다.

본 발명의 단클론 항체(mAb)는 통상적인 단클론 항체 방법론, 예를 들어, Kohler and Milstein(1975) Nature 256: 495의 표준 체세포 혼성화(hybridization) 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 선호되지만, 원칙적으로 단클론 항체를 생산하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 발암성 형질전환이 사용될 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물계는 뮤린계이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차도 알려져 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 상기 기술된 바와 같이 제조된 뮤린 단클론 항체의 서열을 기초로 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 DNA는 관심 있는 뮤린 하이브리도마로부터 얻을 수 있고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린(예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결할 수 있다(예를 들어, Cabilly 외의 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 CDR 영역을 인간 프레임워크에 삽입할 수 있다(예를 들어, Winter의 미국 특허 번호 5,225,539 및 Queen 외의 미국 특허 번호 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 및 6,180,370 참조).

일부 바람직한 실시 양태에서, 항-Siglec-5 항체는 미국 특허 번호 7731969에 기술된 방법에 따라 생성되며, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 특히 바람직한 실시 양태에서, 항체는 a) 인간 Siglec-5 항원으로 동물을 면역화하고 동물로부터 비장세포를 단리하는 단계; b) CD138-양성 세포의 단리된 비장세포를 고갈시켜 고갈된 면역화된 세포를 얻는 단계; c) 고갈된 면역화된 세포를 활성화제와 접촉시켜 활성화된 항원 특이적 B-림프구를 얻는 단계; d) 활성화된 항원 특이적 B-림프구를 불멸화시켜 불멸화된 인간 Siglec-5 특이적 혈장 세포를 생성하는 단계; 및 e) 불멸화된 Siglec-5 특이적 형질 세포를 성장시켜 Siglec-5에 특이적으로 결합하는 항체를 얻는 단계를 포함하는 방법에 따라 생성된다.

일부 실시 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항-Siglec-5 항체를 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산은 전체 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 알려진 다른 것 등의 표준 기술을 사용하여 다른 세포 성분이나 기타 오염 물질, 예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때 핵산은 "단리된" 또는 "실질적으로 순수하게 된"다. F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York 참조. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있으며 인트론(intronic) 서열을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다. 바람직한 실시 양태에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본 발명의 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 아래에 추가로 기술되는 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술을 통해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들어, 파지(phage) 디스플레이 기술 사용)에서 얻은 항체의 경우, 항체를 인코딩하는 핵산을 라이브러리에서 회수할 수 있다.

본 발명의 일부 양태는 다음 항목 1에서 부터 예시되어 있다:

1. 암세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

2. 시험관 내 면역 세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

3. 유기체의 생체 내 면역 세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

4. T-세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

5. T 세포 또는 NK(자연 살해) 세포 또는 기타 면역 세포 유형에서 발현되는 CAR-T 세포(키메라 항원 수용체)로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역 조절하는 방법.

6. 시험관 내 암세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

7. 시험관 내 암세포에 영향을 주어 사멸시키기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

8. 유기체의 생체 내 암세포에 영향을 미치기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

9. 유기체의 생체 내 암세포에 영향을 주어 사멸시키기 위해 Siglec을 사용하여 면역조절하는 방법.

10. Siglec 계열 구성원(수용체) 및 이들의 리간드를 모두 사용하여 면역조절하는 방법.

11. Siglec 계열 수용체의 개별 수용체 및 이의 리간드를 조절할 수 있는 물질의 조성물로서, Siglec 계열의 구성원에 결합하는 항체를 포함하는 조성물.

12. Siglec 계열 수용체의 개별 수용체 및 이의 리간드를 조절할 수 있는 물질의 조성물로서, Siglec-5 및 Siglec-14 중 적어도 하나에 결합하는 항체를 포함하는 조성물.

13. 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

14. 면역계 질환을 치료하기 위해 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

15. 암을 치료하기 위해 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

16. 조성물을 적어도 하나의 다른 약물과 조합함으로써 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

17. 항목 16에 있어서, 하나 이상의 다른 약물이 적어도 하나의 체크포인트 억제제인 방법.

18. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 프로그램화된 세포사멸 수용체-1(PD-1)을 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

19. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 니볼루맙, 펨브롤리주맙 및 세미플리맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.

20. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 체크포인트 억제제 프로그램화된 세포사멸 리간드-1(PD-L1)인 방법.

21. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 더발루맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.

22. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 세포독성 T 림프구 관련 분자-4(CTLA-4)를 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

23. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 이필리무맙인 방법.

24. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 림프구 활성화 유전자-3(LAG-3, CD223으로도 알려짐)을 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

25. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 TIM3을 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

26. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 B7-H3를 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

27. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 B7-H4를 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

28. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 A2aR을 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

29. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 CD73을 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

30. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 NKG2A를 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

31. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 PVRIGPVRL2를 표적으로 하는 체크포인트 억제제인 방법.

32. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 다른 억제성 면역 메커니즘에 작용하는 체크포인트 억제제 표적화 경로인 방법.

33. 항목 17에 있어서, 적어도 하나의 체크포인트 억제제가 CEACAM1, CEACAM5, CEACAM6, FAK, CCL2/CCR2, LIF, CD47SIRPα, CSF-1(M-CSF), IL-1, IL-1R3(IL-1RAP), IL-8, 세마포린SEMA4D, Ang2,EVER-1, Axl 및 포스파티딜세린로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.

34. CAR-T와 조합하여 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

35. CAR-T 및 적어도 하나의 체크포인트 억제제와 조합하여 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

36. 고형 종양에서 CAR-T 치료와 조합하여 전술한 조성물 중 임의의 것을 사용하여 개체를 치료하는 방법.

실시예

실시예 1 - 항-Siglec-5 항체의 생성

면역화

예시적인 면역화 프로토콜이 하기에 예시되어 있다:

인간 Siglec-5에 대한 항체는 미국 특허 번호 제7731969호에 기술된 방법에 따라 생성되었으며, 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.

30~50일령 암컷 BALB/c 마우스 5마리에게 0일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 43일 및 44일에 인간 Siglec-5 항원(Cat # SI5-H5250 ACROBiosystems Inc.) 또는 내부적으로 생성된 가용성 Siglec-5을 복강내 주사하고, 항원을 알럼(alum) 어주번트(adjuvant)에 마우스당 100마이크로그램의 단백질 항원으로 혼합했다(마우스당 총 부피는 100마이크로그램/마이크로리터). 모든 쥐에게 43일, 44일 및 45일에 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 최종 추가 투여(final boost)를 했다. 대안적으로 쥐를 쉬게 하고 57일, 58일, 59일에 최종 추가 투여를 받을 수도 있다. 각각 46일 또는 60일에, 융합을 위해 마우스를 안락사시켰다. 비장을 수확하고 비장에서 림프구를 단리했다.

일반적으로, 재조합 Siglec-5 단백질은 1차 마우스 면역화를 위한 표준 항원으로 사용될 수 있으며, 각 위치에 50%의 단백질을 주사하여 복강 내 및 피하 주사를 통해 마우스를 Siglec-5로 면역화할 수 있다. 프로인드(Freund)나 알럼(Alum)과 같은 어주번트가 사용된다. Alum은 Siglec-5로 면역화할 때 독점적으로 사용되었다.

비장 회수 및 단일 세포 현탁

면역화된 마우스의 비장을 3회 최종 추가 투여 후 하루 만에 수확했다. 비장당 20mL의 배지로 비장을 관류하여 단일 세포 현탁액을 만들었다. 적혈구 용해 완충액(Red Blood Cell Lysing Buffer)(Sigma, St. Louis, MO)을 사용하여 적혈구를 용해시킨 후 적절한 세포 배지에 재현탁시켰다.

세포 계수

비장세포 단리, 세포 분류, 성장(development) 후 세포 회수 및 생존력을 자동화된 ViCe11.TM.XR Cell Viability Analyzer system(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA)을 사용하여 평가했다.

융합

단일 세포 현탁액으로서 5마리 마우스의 비장으로부터 림프구를 단리한 후, 폴리에틸렌 글리콜(50% PEG(Sigma, #P-7181)) 존재 하에 뮤린 SP2/0 골수종 세포와 융합시켰다. 융합된 세포는 Azaserine(Sigma, #A1164-0.5MG) 배지 선택을 사용하여 배양되었다. 모든 배양 웰에는 50,000개의 피더 세포(feeder cell)가 함유되어 있다. 피더 세포는 미경험(naive) 마우스의 비장에서 단일 세포 현탁액을 만들어 생산되었다. 융합 후 14일, 1920개 웰을 항원 특이적 반응에 대해 테스트했다.

하이브리도마 용액(Hybridoma Solution):

하이브리도마 용액은 95-100% 에탄올, 70% 에탄올 스프레이 버틀(Ethanol Spray Bottle), 50% PEG(Sigma, #P-7181), 마스터 OPI-HT 하이브리도마 성장 배지, HBSS(1X), [Sterile 1X PBS를 대용으로 사용 가능] 아자세린(50%)(Azaserine(50X)) [Sigma, #A1164-0.5MG 또는 Fisher ICN15480510]을 포함했다.

OPI-HT 하이브리도마 성장 배지

OPI-HT 하이브리도마 성장 배지는 DMEM 600ml, 하이 글루코오스(High Glucose)(4500mg/L); 50X HT 보충제 20ml; 100X OPI 보충제 10ml; L. 글루타민 10ml; 200ml(표준 = 특성화, 정의 = 마스터) 열 불활성화(heat inactived) FBS; SP2/0 조절 배지(Conditioned Media) 200ml; 페니실린/스트렙토마이신(100X) 10ml; 암포테리신B(Amphotericin B) 1ml(250ug/ml 스톡); 5ul의 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol)(흄후드(fume hood) 내 순수 98%); 1L 병을 멸균하는 0.2μm 버틀-탑(bottle-top) 필터를 갖는 멸균 필터 전체 배지(Sterile Filter entire medium)를 포함한다.

실시예 2 - 항-Siglec-5 항체의 특성화

Siglec-5(실시예 1에서 생성됨)에 대한 단클론 항체(mAbs)를 테스트하여 이들이 세포 표면 인간 Siglec-5를 인식하는지 그리고 T 세포 항원 반응을 조절하는지 여부를 결정했다.

1차 ELISA

1920개 하이브리도마로부터의 조직 배양 상층액을 Siglec-5(Cat # SI5-H5250 ACROBiosystems Inc.)에 대해 ELISA로 스크리닝하고 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체로 탐침했다. TMB(T5569-100ml)를 반응에 사용하여 양성을 시각화했다. 반응을 멈추기 위해 H2SO4 또는 황산을 사용했다. 이 분석에서 양성 하이브리도마 클론 >0.3 OD는 다음 수준의 성장을 계속하여 서브클로닝되었다.

양성 하이브리도마의 24-웰 플레이트 배양

양성 세포주는 원래의 96웰 융합 플레이트로부터 옮겨진 후 24웰 배양 플레이트에서 배양을 유지하였다. 24웰 플레이트를 2주 동안 성장시킨 후 하이브리도마의 서브클로닝이 발생했다. 24웰 형식으로 앞으로 이동되는 융합 생성물을 함유하는 각 웰로부터 1개의 세포 튜브를 동결시켰다. "니켈 웰(nickel well)" 성장 기간 동안 두 개의 추가 세포 튜브를 동결시켰다. 서브클로닝 후, 2개의 튜브 중 하나의 안정화 및 검증은 마스터 뱅크 튜브를 서브클로닝 후 이루어지고 마스터 뱅크 튜브 중 하나에서 10개 이상의 하이브리도마 작업 뱅크 튜브가 동결된다. 일반적으로 초기 단계의 하이브리도마를 생산 배지에서 안정적인 형식으로 얻으려면 3회의 서브클로닝이 필요했다.

하이브리도마 세포 동결

특정 클론의 손실을 제한하기 위해 하이브리도마를 초기 단계 또는 "벌크(Bulk)" 단계에서 세포 동결 배지(Cell Freezing Media)(20% DMSO)에서 동결시켰다. 이 절차는 초기 단계 "벌크" 및 24웰 플레이트에서 초기에 확장된 중간 단계의 '모노(Mono)' 하이브리도마에서 하이브리도마 세포주를 동결시킨다. 이 동결 기술에는 세포 계수가 필요하지 않다.

하이브리도마의 서브클로닝

단클론성을 보장하기 위해 최상위 하이브리도마 세포주(클론)를 서브클로닝했다. 서브클로닝은 당사의 서브클로닝 방법을 사용하여 모(parental) 클론을 다시 플레이팅하여 수행되었다. 이 방법은 96웰 플레이트에 웰당 50,000개의 피더 세포가 필요하다. 피더 세포는 마우스 비장세포의 단일 세포 현탁액이었다. 특정 클론으로부터의 세포를 96웰 플레이트의 맨 왼쪽에 있는 8웰에 한 방울씩 배치했다. 왼쪽의 8개 웰에서 상단 웰은 6~8개로 가장 많은 수의 방울을 받았고 마지막 웰은 관심 클론으로부터의 세포 한 방울을 받았다. 클론이 대략 6~10일 동안 성장함에 따라 96웰 플레이트의 왼쪽 상단에는 벌크 영역이, 플레이트의 맨 오른쪽 하단에는 단클론 영역이 형성되었다. ELISA로 스크리닝한 후 플레이트의 단클론 영역에서 최소 2개의 서브클론을 선택했다. 상위 2개 클론 모두 배양에서 확장되었다.

항원(Siglec-5) 특이적 ELISA

Ag-특이적 ELISA를 위해, 500ng/well 항원(Siglec-5:Cat# SI5-H5250 ACROBiosystems Inc.)을 96웰 플레이트에 코팅하였다. 96개 웰 각각의 배지 25ul를 코팅된 플레이트에 배양한 후, PBS(PBSST) 중 0.05% Tween-20으로 세척했다. 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)(HRP)에 접합된 2차 염소 항-마우스 "2차 항체"를 Siglec-5 검출에 사용했다. 세척 후, TMB(테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine))을 사용하여 신호를 검출하고, 1N H2SO4 정지 용액(stop solusion)을 첨가하여 반응을 중단하고 Molecular Devices(Sunnyvale, CA)의 ELISA 플레이트 판독기에서 450nm에서 판독했다.

활성화된 T 세포에 존재하는 Siglec-5 - 유세포 분석

세포의 분취량을 사용하여 표면 Siglec 5 염색을 평가했다(도 1). 이 분석을 위해 세포를 항-Siglec 5 Ab(1μg/ml로 사용)로 30분간 염색하고 세척한 다음 염소 항-마우스 IgG-FITC Ab로 다시 염색했다. 마우스 IgG 염색을 음성 대조군으로 사용했다. 양성 대조군으로는 Biolegend monoclonal Ab가 사용되었다(BL로 표시). Biolegend 항체를 대조군으로 사용하면 항체가 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포 집단 모두에 직접 결합하는 것을 볼 수 있다. 도 1에는 두 개의 대표적인 클론(클론 5 및 20)만 표시되어 있다. 다른 모든 클론은 유사한 수준에서 이러한 세포를 염색했다.

항-Siglec-5 항체 존재 하의 활성화된 T 세포 성장

활성화된 T 세포 집단을 제조하기 위해, 인간 말초 혈액(건강한 성인 기증자로부터) 유래 단핵구 세포(peripheral blood (from a healthy adult donor) derived mononucleated cells))(PBMC)를 피콜(Ficoll) 구배로 정제했다. 이 제조에는 T 세포, B 세포 및 골수 세포(주로 단핵구)가 포함된다. 세포(ml당 5x10⁶개 세포)를 인간 IL-2(10ng/ml)를 함유하는 배지에서 항-인간 CD3 및 항-인간 CD28(50g/ml)로 코팅된 폴리스티렌 비드와 혼합했다. 3일 동안 배양한 후, 세포를 수확했다.

그 다음, 활성화된 세포를 기능 분석을 위해 2차 배양에 넣었다. 여기서 세포는 가용성 항-CD28(IL-2가 첨가되지 않음)과 함께 플레이트 코팅된 항-CD3 및 항-Siglec 5 mAb(단클론 항체)로 재자극되었다. 다중 사이토카인 분석을 위해 배양 1일 및 4일 후에 이 분석의 배양 상등액을 수확했다. 배양 4일 후, 세포를 수확하고 각 mAb 처리 샘플에 대해 총 살아있는 세포 수를 측정했다. 여기에서는 BioLegend의 항-Siglec-5 및 항-PD1 mAb를 단독으로 또는 조합하여 기준점으로 사용했고, 마우스 IgG를 Siglec-5 mAb에 대한 음성 대조군으로 사용했다.

표면 염색과 대조적으로, 세포 성장 분석에서는 이들 클론들 간에 차이가 있는 것으로 나타났다(도 2). 인간 Siglec-5에 대한 결합에 대해 양성인 항체를 활성화된 T 세포에 결합하는 능력과 활성화된 T 세포 집단을 확장 또는 성장시키거나 활성화된 T 세포 집단의 성장을 수축 또는 감소시키는 능력에 대해 테스트했다. 도 2의 데이터는 마우스 IgG 대조군과 비교하여 항-Siglec 5 Ab 존재 하에서 자극 4일 후 살아있는 세포 수의 백분율 차이를 보여준다. 2개의 클론은 IgG 대조군에 비해 살아있는 세포 수가 10% 이상 증가한 것으로 나타났다. 다른 세 클론에서는 약간의 증가가 나타났다. 5개의 클론은 세포 수가 10% 이상 감소한 것으로 나타났다. 20개의 단클론 항체 클론의 첫 번째 세트에서 2개의 클론(클론 #5, #6)은 CD4 및 CD8 양성 활성화 T 세포 모두에 존재하는 Siglec-5에 작용하여 활성화된 T 세포 성장을 촉진했다. (도 2).

데이터는 모든 클론이 표면 발현된 인간 Siglec 5를 인식할 수 있음을 보여준다. 또한, 데이터는 활성화된 T 세포에서 발현된 Siglec-5에 결합하는 항체가 T 세포 반응을 조절하는 능력을 스크리닝함으로써 Siglec-5 작용제(예를 들어, 자가면역 질환 치료에 유용함) 또는 면역 체크포인트 억제제(예를 들어, 암 치료에 유용함)로 확인될 수 있음을 입증한다.

실시예 3 - 유세포분석 - Siglec-5 사이토카인 프로파일 및 T 세포 활성화

PBMC로부터의 활성화된 인간 T 세포 집단을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다. 활성화 후, 세포를 기능 분석을 위해 2차 배양에 넣었다. 여기서 세포는 가용성 항-CD28(IL-2가 첨가되지 않음)과 함께 플레이트 코팅된 항-CD3 및 항-Siglec 5 mAb(단클론 항체)로 재자극되었다. 다중 사이토카인 분석을 위해 배양 4일 후에 이 분석으로부터의 배양 상청액을 수확했다. 배양 4일 후, 세포를 수확하고 각 mAb 치료 샘플에 대해 배양 상층액의 사이토카인 프로파일을 결정했다. IL-17-A, IL-2 및 IL-6 사이토카인 프로파일은 도 3-5에 나와 있다. 여기서, 각각 단일 또는 혼합물로서 BioLegend의 항-Siglec-5 및 항-PD1 mAbs를 기준점으로 사용했고, 마우스 IgG를 Siglec5 mAbs(단클론 항체)에 대한 음성 대조군으로 사용했다.

배양 상층액으로부터 T 세포 활성화 동안 분석된 사이토카인 프로파일은 IL-2, IL-17A 및 IL-6 생산의 강력한 억제를 보여주었다(도 3-5, 클론 8, 11 및 16). 대조적으로, 2개의 클론(클론 1 및 18)은 IL-2 및 IL-17a 생산을 실질적으로 향상시켰다(도 3 및 4). 항-PD1 mAb(단클론성 뮤린 면역 체크포인트 억제제 항체)는 IL-2 및 IL-17A를 향상시켰으며, 그 효과는 클론 1과 항-PD1 항체 간에 비슷했다. 분석에 사용된 mAb 클론에 따라 T 세포 활성화의 감소와 T 세포 활성화의 증가가 모두 관찰되었으며, 이는 항-Siglec-5 항체가 T 세포 반응을 조절할 수 있음을 나타낸다.

실시예 4 - 인간 1383i TCR T 세포의 항원 특이적 활성화

활성화된 인간 1383i TCR+ T 세포(흑색종 항원 티로시나제에 특이적인 TCR(1383i)로 형질도입된 조작된 인간 T 세포)에서의 Siglec-5 및 흑색종 세포(MEL624 세포)에서 발현된 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 차단함으로써 면역 체크포인트 억제제로 작용하는 항-Siglec-5 mAb의 능력을 평가했다.

인간 1383i TCR+T 세포는 Nishimura MI, et al., Cancer Res 1999;59:6230-8에 기술된 대로 생성되었다. 1383i TCR+T 세포를 자극하기 위해, T 세포를 흑색종 세포주 MEL624와 10:1(1383i T 세포:MEL624)의 비율로 공동 배양했다. 이 배양물에 정제된 항-siglec-5 mAb(이전 실시예에 설명됨)를 0일부터 첨가했다(5μg/ml). 항-Siglec-5 mAb를 첨가한 지 60시간 후에 배양 상청액을 수집하고 유세포 분석 기반 사이토카인 분석(Biolegend의 LEGENDplex)으로 분석했다.

흑색종 자극된 1383i TCR T 세포의 상층액 분석 결과, 여러 mAb 클론(클론 8과 4는 특히 강한 반응을 매개했다)으로 치료된 T 세포에 의한 IFN 감마(도 6), IL-5(도 7) 및 IL-13(도 8) 발현의 항-Siglec-5 mAb 매개 증가가 나타났다. 흥미롭게도, 양성 대조군(Biolegend 뮤린 항-PD-1 면역 체크포인트 억제제 항체(PD-1 리간드 결합을 차단하는 능력이 입증된 카탈로그 번호 329902) 및 Fc 단편에 융합된 siglec-5의 가용성 부분을 포함하는 가용성 siglec-5은 이 분석에서 약간의 T 세포 반응만을 초래했다(도 6-8, "PD1 C+" 및 "Siglec5 Fc C+"). 특히, 이 분석에서 MEL624는 테스트된 검출 가능한 수준의 사이토카인을 생성하지 않는다. 본원에 기술된 항-Siglec-5 mAb와는 완전히 대조적으로, Biolegend 항-Siglec-5 mAb는 T 세포 자극에 대해 관찰 가능한 유의미한 효과를 나타내지 않았다(도 6-8).

데이터는 몇몇의 항-Siglec-5 mAb가 흑색종 세포 표면의 이의 리간드에 의한 Siglec-5 체크포인트 단백질의 결합으로 인한 T 세포 고갈을 역전시킨다는 것을 입증한다. 흥미롭게도, 이러한 항-Siglec-5 mAb는 뮤린 항-인간 PD-1 면역 체크포인트 억제제(양성 대조군) 및 가용성 Siglec-5(양성 대조군)보다 훨씬 더 강한 T 세포 반응을 생성했다. 자극 시간이 더 긴 항-Siglec-5 mAb에 의해 훨씬 더 큰 T 세포 반응이 예상된다.

실시예 5 - Siglec-5 발현 침묵(silencing)에 있어서 작은 간섭 리보핵산 분자의 사용

길이가 약 15-25개 뉴클레오타이드이고 인간 Siglec-5 mRNA의 영역에 상보적인 짧은 간섭 RNAs(short interfering RNAs)(shRNAs)의 어레이가 설계되었다. shRNA는 Siglec-5 mRNA에 결합하고 다이서(Dicer) 효소(이중 스트랜드 리보뉴클레아제)가 있는 경우 mRNA를 절단하고 번역할 수 없게 만드는 "RISC 복합체"(RNA 간섭 침묵 복합체(RNA Interfering Silencing Complex))를 형성하여 유전자의 발현을 침묵시킨다.

shRNA는 인간 Siglec-5를 발현하는 하나 이상의 표적 세포(들)에 도입되고, Siglec-5의 발현을 감소(또는 녹다운)시키는 shRNA의 능력은 항체 기반 검출 분석((효소 결합, 면역흡착 분석(Enzyme-linked, immunosorbent assay)[ELISA]) 등을 사용하여 평가된다. 바람직하게는, shRNA는 shRNA의 연속적인 시험관 내 발현을 위해 프로모터(예를 들어, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터)의 제어 하에 있도록 플라스미드 내에 함유된다. 대안적으로, shRNA는 전기천공법 또는 바이러스 매개 바이러스 형질도입에 의해 표적 세포 내로 도입된다.

Siglec-5 발현을 감소시켜 하나 이상의 암세포에서 Siglec-5와 이의 리간드의 상호작용을 방지하는 shRNA가 확인되었다. 이들 shRNA는 하나 이상의 암세포에서의 시험관 내 및/또는 생체 내(하나 이상의 적합한 동물 암 모델에서)의 항암 활성에 대해 평가된다. 바람직하게는 shRNA는 인간 Siglec-5의 녹다운을 향상시키는 스캐폴드(scaffold)(예를 들어, mir-30 백본) 내에 함유된다.

세포 RNA 전사 기구에 의해 인식되는 발현 프로모터와 함께 shRNA 서열을 함유하는 복제 플라스미드는 표적 세포 내에서 장기간에 걸쳐 siRNA를 생성하는 데 사용된다; 표적 세포/조직에 의한 Siglec-5 발현의 모니터링은 위에서 설명한 것과 동일한 ELISA 분석으로 모니터링된다. 대안적으로, Siglec-5 발현의 녹다운은 shRNA에 대해 설명된 것과 동일한 메커니즘을 따르는 긴 이중 스트랜드 RNA(long double stranded RNA)(long dsRNA)를 사용하여 수행된다.

실시예 6 - PD-1 및 Siglec-5 차단의 협력적인 항종양 효과.

Siglec-5는 활성화된 T 세포에서 PD-1과 동시에 공동 발현된다(데이터는 표시되지 않음). 활성화된 T 세포에서의 Siglec-5와 암세포에서의 이의 동족 수용체의 상호작용을 억제하는 화합물과 PD-1 억제제의 공동 투여는 다중 신호 전달 경로를 억제함으로써 시너지적인 항종양 효과를 제공한다.

본원에 기재된 항-Siglec-5 항체와 항-PD-1 ICI 항체의 조합물을 암 마우스 모델에 투여하여 항-Siglec-5 항체 또는 항-PD-1 항체를 단독으로 투여한 동일한 암 모델의 동일한 연령의 마우스에서 관찰된 항종양 효과와 조합으로 관찰된 항종양 효과를 비교함으로써 암에 대한 시너지 효과가 입증되었다. 시너지(즉, 추가 보다 더 큰) 효과가 입증되었다.

Claims

Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자와 면역 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 상기 분자는 Siglec-5에 대한 단클론 항체인 Siglec-5를 발현하는 면역 세포와 Siglec-5 리간드를 발현하는 암세포 사이의 상호작용을 억제하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 시험관 내(in vitro)에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 생체 내(in vivo)에서 수행되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
Siglec-5를 발현하는 면역 세포는 활성화된 T 세포이고/이거나 단클론 항체는 a) 인간 Siglec-5 항원으로 동물을 면역화하고 동물로부터 비장세포를 단리하는 단계; b) CD138-양성 세포의 분리된 비장세포를 고갈시켜 고갈된 면역화된 세포를 얻는 단계; c) 고갈된 면역화된 세포를 활성화제와 접촉시켜 활성화된 항원 특이적 B-림프구를 얻는 단계; d) 활성화된 항원 특이적 B-림프구를 불멸화시켜 불멸화된 인간 Siglec-5 특이적 혈장 세포를 생성하는 단계; e) 불멸화된 Siglec-5 특이적 형질 세포를 성장시켜 Siglec-5에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 획득되는 방법
제4항에 있어서,
T 세포가 키메라 항원 수용체를 발현하는 방법.
활성화된 T 세포에서 발현되는 Siglec-5와 암세포(들)에서 발현되는 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 상호작용을 억제하는 분자는 Siglec-5의 세포외 도메인 또는 Siglec-5에 대한 단클론 항체를 포함하는 융합 단백질인 암치료 방법.
제6항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자가 (i) Siglec-5의 세포외 도메인 또는 이의 리간드-결합 부분 및 임의로 (ii) Fc 부분을 포함하는 융합 단백질인 방법.
제6항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자가 항체 또는 이의 리간드-결합 부분이며, 바람직하게는 항체 또는 이의 리간드-결합 부분은 (i) TCR(1383i)로 형질도입된 조작된 인간 T 세포 및 (ii) 항체 또는 이의 리간드-결합 부분의 부재에 대한 MEL624 세포의 공동 배양에서 적어도 하나의 전염증성 사이토카인의 생성을 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배 또는 적어도 3배 증가시며, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 전염증성 사이토카인이 IFNγ를 포함하는 방법.
제8항에 있어서,
항체가 단클론 항체인 방법.
제9항에 있어서,
항체가 마우스 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체인 방법.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
항체가 인간 Siglec-5에 결합하는 것인 방법.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체가 Siglec-5 리간드를 발현하는 암을 갖고 있는 것으로 확인되는 방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
암이 고형 종양, 혈액암 및/또는 전이성 병변인 방법.
제13항에 있어서,
암은 유방암(예를 들어, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 또는 Her2/neu 중 하나, 둘 또는 전부를 발현하지 않는 유방암, 예를 들어, 삼중 음성 유방암), 위장관/비뇨생식기(자궁경부암, 난소암, 결장암, 대장암, 직장암, 신장암, 요로상피암, 방광암, 전립선암, 췌장암, 장암, 항문암), 두경부암(예를 들어, 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma)(HNSCC)), 인두암, 위식도암(예를 들어, 식도 편평 세포 암종), 식도암, 비인두암, 갑상선암, 혈액 악성 종양[예를 들어, 골수종(예를 들어, 다발성 골수종), 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(예를 들어, 여포성, 몰트(malt), 변연부, 대세포/미만성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma)을 포함하되 이에 국한되지 않는 무통성 및 비무통성 B 세포 림프종)], T 세포 림프종, 백혈병(예를 들어, T 및 B 세포 백혈병, 골수성 백혈병 또는 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia)(ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia)(AML), 급성 전골수성 백혈병(acute promyelocytic leukemia)(APML), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)(CLL), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia)(CML), 골수성 백혈병, 모세포 백혈병(Hairy cell leukemia), 전골수성 백혈병(promyelocytic leukemia)(PML)), 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome)(MDS), 림프증식성 질환(예를 들어, 이식 후 림프증식성 질환), 폐암(예를 들어, 비소형 세포폐암(non-small cell lung cancer)), 간암(예를 들어, 간세포암종), 중추신경계암, 피부암(예: 흑색종), 중피종으로부터 선택되는 방법.
제13항에 있어서,
암이 혈액암, 백혈병, 흑색종, 간암 및 유방암으로부터 선택되는 방법.
제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자가 하나 이상의 추가 면역 체크포인트 단백질 억제제와 함께 대상체에게 공동 투여되는 방법.
제16항에 있어서,
하나 이상의 추가적인 면역 체크포인트 단백질 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, B7-H3 및 B7-H4로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질의 억제제를 포함하고, 선택적으로 PD-1 억제제는 세미플리맙(Cemiplimab), 니볼루맙(Nivolumab), 및 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)으로부터 선택되는 항체이고; PD-L1 억제제는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 및 더발루맙(Durvalumab)에서 선택되는 항체이고; CTLA-4 억제제는 이필리무맙(Ipilimumab)이고; TIM-3 억제제는 MBG453, Sym023 및 TSR-022로부터 선택되며; LAG-3 억제제는 LAG525(IMP701), REGN3767(R3767), BI754,091, IMP321, FS118 및 테보텔리맙(tebotelimab)으로부터 선택되고; B7-H3 및/또는 B7-H4 억제제는 MGC018 및 FPA150으로부터 선택되는 방법.
제17항에 있어서,
하나 이상의 추가적인 면역 체크포인트 단백질 억제제가 PD-1의 억제제를 포함하고, 바람직하게는 PD-1 억제제는 항체이고, 더욱 바람직하게는 PD-1 억제제는 세미플리맙, 니볼루맙, 또는 펨브롤리주맙인 방법.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자와 하나 이상의 추가적인 면역 체크포인트 단백질 억제제가 순차적으로, 동시에 또는 병행하여(concurrently) 투여되고, 바람직하게는 병행하여 투여되는 방법.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
대상체가 인간인 방법.
제20항에 있어서,
대상체의 종양 미세환경이 대조군에 비해 Siglec-5 리간드 및/또는 PD-1의 상승된 발현을 포함하는 방법.
제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자는 하나 이상의 공동자극 분자와 함께 대상체에게 공동 투여되고, 바람직하게는 하나 이상의 공동자극 분자는 OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278), 4-1BB(CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160 또는 CD83 리간드의 작용제를 포함하는 방법.
제22항에 있어서,
하나 이상의 공동자극 분자가 OX40 작용제를 포함하고, 바람직하게는 OX40 작용제가 항체이며, 더욱 바람직하게는 OX40 작용제가 티슬레즐리움맙(tislezliumab), HFB301001, YH002, 이부솔리맙(ivuxolimab)(PF-04518600) 및 INBRX-106으로부터 선택되는 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자와 하나 이상의 보조자극 분자가 순차적으로, 동시에 또는 병행하여 투여되는 방법.
Siglec-5에 결합하여 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 감소시키고, 바람직하게는 암세포에서 발현되는 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5의 결합을 감소시키는 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
제25항에 있어서,
항체 또는 이의 항원 결합 부분이 인간 Siglec-5에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
제25항 또는 제26항에 있어서,
(j) [1 x 10-7 M] 이하의 kD로 인간 Siglec-5에 결합
(k) 시험관 내 및/또는 생체 내 면역 세포(예를 들어, 활성화된 T 세포)에서 발현되는 Siglec-5의 세포 표면 수준을 실질적으로 감소시키지 않음
(l) 혼합 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction)(MLR) 분석에서 T 세포 증식을 증가시킴
(m) MLR 분석에서 IL-2 분비를 증가시킴
(n) T 세포 증식 분석에서 T 세포 증식 및/또는 IL-2 분비를 증가시킴
(o) 인간 Siglec-5 및 시노몰구스 원숭이 Siglec-5에 결합함
(p) 면역 세포에서 발현된 Siglec-5 리간드에 대한 Siglec-5가 결합을 억제함
(q) 생체 내 종양 세포 성장을 억제함
(r) 인간 Siglec-14와 교차반응하지 않음
중 하나 이상의 특성을 나타내는 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
다클론, 단클론, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
Fab, F(ab)₂ 또는 scFv 단편인 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 바람직하게는 암 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 항체와 면역 체크포인트 단백질의 억제제를 포함하는 약학적 조합물.
제31항에 있어서,
면역 체크포인트 단백질의 억제제가 PD-1, PD-L1 CTLA-4, TIM-3, LAG-3, B7-H3 및 B7-H4로부터 선택된 면역 체크포인트 단백질을 억제하는 약학적 조성물.
제32항에 있어서,
면역 체크포인트 단백질의 억제제가 PD-1을 억제하는 약학적 조성물.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
면역 체크포인트 단백질의 억제제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 약학적 조성물.
암 및/또는 종양 미세환경에서 Siglec-5 리간드의 발현 수준을 평가하는 것을 포함하며, 암에 대한 Siglec-5 리간드의 발현 수준이 소정의 표준 수준을 초과하면 대상체가 항-Siglec-5 치료 요법에 대한 후보임을 확인하는 항-Siglec-5 치료 요법의 후보로서 암에 걸린 대상체를 확인하는 방법,
제35항에 있어서,
Siglec-5와 Siglec-5 리간드 사이의 상호작용을 억제하는 분자를 항-Siglec-5 치료 요법의 후보로 확인된 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.