TW202202524A - 免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用 - Google Patents

免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用 Download PDF

Info

Publication number
TW202202524A
TW202202524A TW110123872A TW110123872A TW202202524A TW 202202524 A TW202202524 A TW 202202524A TW 110123872 A TW110123872 A TW 110123872A TW 110123872 A TW110123872 A TW 110123872A TW 202202524 A TW202202524 A TW 202202524A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
sequence
cdr2
variable region
protein
Prior art date
Application number
TW110123872A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI806087B (zh
Inventor
何云
石磊
吳曉東
鍾琛
黃冰
戎一平
Original Assignee
大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 filed Critical 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司
Publication of TW202202524A publication Critical patent/TW202202524A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI806087B publication Critical patent/TWI806087B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本發明提供了一種結合蛋白及其應用，結合蛋白包括結合標靶細胞上的抗原的標靶域的第一蛋白功能區和所述包括結合免疫效應細胞上的抗原的效應域的第二蛋白功能區；其選自以下結構：所述第一蛋白功能區為Fab結構，所述第二蛋白功能區為VH結構或Fab結構，所述結合蛋白從N末端至C末端依次為第一和第二蛋白功能區。所述結合蛋白可以將免疫效應細胞和特定標靶細胞拉近在一起，高效地有選擇性地活化特定標靶細胞微環境中的免疫效應細胞，進而增強免疫反應，並減少周邊免疫細胞的非特異性活化帶來的毒副作用。所述結合蛋白利用標靶細胞抗原媒介的共刺激分子的交聯以及下游訊息傳遞途徑的活化，進而促進免疫細胞的活化和增殖，提高其毒殺腫瘤的效力。

Description

免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用
本申請要求申請日為2020/6/30的中國專利申請202010630471.6的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及生物製藥領域，尤其涉及具有腫瘤標靶功能和免疫細胞重定向能力的用於免疫細胞銜接器的多特異性的結合蛋白及其製備和應用。
雙特異性抗體(bispecific antibodies)和多特異性抗體(multispecific antibodies)是一類在天然的單株抗體基礎上透過蛋白質工程技術製備出的具有兩種或者多種不同特異性抗原結合位址的人工抗體。天然的單株抗體是單特異性的，即只能辨識和結合一種抗原；雙特異性抗體可以結合兩種不同的抗原或者同一個抗原上的不同表位；而多特異性抗體則可能辨識更多的抗原。
近年來，透過調節免疫反應治療癌症的腫瘤免疫療法顯示出巨大的潛力，使得腫瘤免疫相關的雙特異性抗體吸引了越來越多的注意力、技術和資金支持。免疫細胞銜接器多特異性抗體(multispecificimmune cell engager)分子可以同時辨識腫瘤細胞上的特異性抗原和免疫細胞上的CD3分子或者其他共刺激分子；進而將免疫細胞和腫瘤細胞拉近在一起，高效地有選擇性地活化腫瘤微環境中的免疫細胞，並減少周邊免疫細胞的非特異性活化帶來的毒副作用。基於標靶CD3的雙特異性抗體T細胞銜接器(BsTCE, Bispecific T-cell engager)是一類透過標靶CD3和腫瘤標的的免疫細胞銜接器；在目前全球處於臨床階段或臨床前階段的雙特異性抗體項目中，接近一半的雙特異性抗體是標靶CD3的雙特異性抗體。BsTCE在血液腫瘤疾病領域顯示強勁療效，已經在臨床上得到充分驗證，例如在2014年FDA批准上市用於治療費城染色體陰性B細胞淋巴瘤的Blinatumomab (標靶CD19 × CD3)。但是，BsTCE在實體腫瘤上的效果還沒有得到充分的驗證。
T細胞的活化通常需要TCR-MHC之間的相互作用來觸發；而標靶CD3的免疫細胞銜接器(CD3BsTCE)分子以非MHC限制的方式來活化T細胞，可以克服因腫瘤細胞MHC向下調控或抗原呈現細胞耐受引起的免疫逃脫機制。但是，在沒有共刺激信號的情況下，腫瘤微環境中的T細胞途徑未被完全活化；這可能是CD3BsTCE在實體腫瘤上的效果沒有被完全發揮出來的原因。另一方面，標靶T細胞表面共刺激分子的免疫細胞銜接器分子可引起腫瘤抗原媒介的共刺激分子的交聯以及下游訊息傳遞途徑的活化，為T細胞的完全活化提供了共刺激信號，進而充分活化T細胞並促進增殖，提高毒殺腫瘤的效力。
4-1BB (TNFRSF9，CD137)是一種隸屬於TNF受體超家族的跨膜蛋白。4-1BB是在多種免疫細胞上表現的共刺激分子，為免疫活性的多功能調節劑。其誘導表現於活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞。4-1BB透過其配體4-1BBL媒介的三聚化來活化T細胞，促進細胞增殖和細胞激素釋放。抗4-1BB的促效型抗體具有抑制腫瘤的功能，最早進入臨床試驗的4-1BB抗體是輝瑞的Utomilumab和百時美施貴寶(BMS)公司的Urelumab (BMS-663513)。Urelumab最初的臨床結果發表於2008年，儘管在部分患者上觀察到令人鼓舞的療效，但數據顯示Urelumab導致肝臟毒性，且與標的和劑量有關。Utomilumab安全性更好，劑量可提高至10 mg/kg，但治療效果依然欠佳。4-1BB標靶性藥物開發的核心問題是如何較為合適地透過4-1BB活化免疫細胞，在藥效和安全性之間達到平衡。
OX40 (TNFRSF4，CD134)是TNF受體超家族成員之一，參與增強T細胞受體(TCR)觸發的T細胞反應，是共刺激受體分子。它是一種50 kD的跨膜蛋白。OX40暫態表現在TCR刺激後的人CD4+ 和CD8+ T細胞上。但在腫瘤部位，OX40在CD4+ T細胞上的表現比在CD8+ T細胞更高。因此，CD4+ 和CD8+ T細胞是OX40定向免疫治療癌症的藥物的潛在標的。OX40抗體一些臨床前研究表明抗OX40單抗透過促進MDSC的積累和生成Th2細胞激素而產生有害的免疫抑制副作用。
由於已知的困難和未被滿足的臨床需求，亟需開發新型的抗體分子，可以在腫瘤微環境內中利用標靶細胞來媒介特定免疫細胞的活化，以避免其在周邊系統或者正常組織中被活化所帶來的毒副作用。同時，這些新型的抗體分子需要有較簡單和穩定的分子結構和優秀的藥學性能，以滿足快速開發和降低生產成本的需求。
人的抗體的基本結構為呈現“Y”型的四聚體形式，包含兩個完全相同的重鏈(H鏈)和兩個完全相同的輕鏈(L鏈)，也稱為“H2L2”。在駱駝科及鯊魚科動物血清中還天然存在一種缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chain antibody，HCAb)。來源於駱駝科的重鏈抗體與常規H2L2結構的抗體(如IgG抗體)相比，除了缺少輕鏈外，其重鏈可變區與樞紐區之間沒有重鏈恆定結構域CH1區，只含有一個重鏈可變區(VHH)和兩個重鏈恆定結構域(CH2和CH3，即Fc)；其基本結構為重鏈二聚體。駱駝科動物的重鏈抗體的VHH片段與常規抗體的VH特徵不同，其單獨選殖並表現出來的VHH結構具有與原重鏈抗體相當的結構穩定性以及與抗原的結合活性，分子量只有約13 KDa，因此也被稱作奈米抗體(Nanobody)或單域抗體(single-domain antibody)。重鏈抗體或者其衍生的奈米抗體在分子影像、診斷試劑等方面有獨特優勢，但是其非人源屬性及其潛在的免疫原性風險限制了它的治療性用途，需要經過進一步的抗體工程改造(例如抗體人源化)才能使其滿足用於臨床治療的要求。
由於人的抗體的H2L2結構中，重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的締合保證了抗體的穩定性和可溶性；如果沒有VL的存在，VH上的原本由VL保護住的疏水性基團將暴露於水性溶劑，使得VH易於發生聚集，進而導致抗體可溶性變差，而且也失去了VL貢獻的抗原結合能力。因此無法從天然來源中獲得有用的人源的重鏈抗體。Harbour HCAb基因轉殖小鼠(Harbour Antibodies BV)來源於由Frank Grosveld等人提出的一種利用基因轉殖動物獲得全人源重鏈抗體的技術(專利申請WO2007/096779)。Frank Grosveld等人建構了一種基因轉殖小鼠，其小鼠內源的抗體重鏈基因座和輕鏈基因座都被剔除或者去活化，使其無法產生小鼠的抗體；然後將人源的抗體重鏈基因片段(V，D，J片段)轉入該小鼠，利用該小鼠自身的重排和突變機制產生具有人源抗體基因序列的抗體，而且由於沒有輕鏈，產生的抗體就是人源的重鏈抗體。該基因轉殖小鼠體內可以利用在VDJ重排後引入基因突變和自然選擇的過程，選擇有利於VH的溶解性的VDJ組合和突變，有效地改善VH的溶解性，因此該基因轉殖小鼠體內可以產生天然不存在的人的重鏈二聚體結構。從該基因轉殖小鼠獲得的全人源重鏈抗體及其衍生的全人源單域抗體都有廣闊的應用前景。
重鏈抗體及其衍生的單域抗體在建構雙特異甚至多特異抗體方面有其獨特的優勢。重鏈抗體的抗原結合結構域只有常規抗體的抗原結合片段Fab的四分之一大小；而且沒有輕鏈，避免了輕鏈錯配的問題；也可以透過融合抗體的可結晶片段Fc來提高分子的血清半衰期。所以，利用重鏈抗體及其衍生的單域抗體，可以建構分子量較小的、多肽鏈較少的、結構更簡單的雙特異甚至多特異抗體。而且，全人源重鏈抗體相較於駱駝科動物的奈米抗體，在免疫原性和成藥性方面更有優勢。
本發明所要解決的技術問題是為了克服目前用於免疫細胞銜接器的抗體分子的不足，提供了一種用於免疫細胞銜接器的結合蛋白，本發明的結合蛋白為多價的和多特異性的，能夠結合兩個或更多個抗原、或者兩個或更多個表位。本發明還提供了此類多價的和多特異性的結合蛋白的製備方法及其應用，包括使用此類結合蛋白預防或治療各種疾病、或在體外或體內檢測特異性抗原的方法。本發明的結合蛋白可以增強針對特定標靶細胞(例如腫瘤細胞)的免疫反應(例如T細胞或者NK細胞的活性)，其可以將免疫效應細胞和特定標靶細胞(例如腫瘤細胞)拉近在一起，高效地有選擇性地活化特定標靶細胞(例如腫瘤細胞)微環境中的免疫效應細胞，進而增強免疫反應(例如促進T細胞活化和細胞激素的產生)，並減少周邊免疫細胞的非特異性活化帶來的毒副作用。所述結合蛋白利用標靶細胞抗原媒介的共刺激分子的交聯以及下游訊息傳遞途徑的活化，進而促進免疫細胞的活化和增殖，提高其毒殺腫瘤的效力。本發明的結合蛋白具有優秀的通用性和成藥性，在多個不同標的組合的雙抗分子上都顯示出優秀的生物學活性、分子穩定性和藥學性能。
為了解決上述技術問題，本發明第一方面提供了一種至少含有兩個蛋白功能區的結合蛋白，本發明的結合蛋白通常可以被稱為“免疫細胞銜接多特異性結合蛋白”，其包括第一蛋白功能區和第二蛋白功能區；所述第一蛋白功能區包括結合標靶細胞上的抗原的標靶域(可以結合一個或者多個標靶細胞上的特定的抗原)，所述第二蛋白功能區包括結合免疫效應細胞上的抗原的效應域(可以結合一個或者多個免疫效應細胞上的特定的抗原)； 所述的結合蛋白可以為結構(I)： 所述第一蛋白功能區為Fab結構，所述第二蛋白功能區為VH結構，所述結合蛋白從N末端至C末端為第一蛋白功能區和第二蛋白功能區；所述第一蛋白功能區和第二蛋白功能區直接或間接相連。例如為Fab-VH-Fc (Fab-HCAb)或者Fab-Fc-VH (IgG-VH)結構。 所述的結合蛋白可以為結構(II)： 所述第一蛋白功能區為Fab結構，所述第二蛋白功能區為Fab結構，所述結合蛋白從N末端至C末端為第一蛋白功能區和第二蛋白功能區；所述第一蛋白功能區和第二蛋白功能區直接或間接相連。例如為FIT-Ig結構。
較佳地，所述結合蛋白為(a)單體結構，或(b)由兩個單體組成的二聚體結構。
本發明中，所述的單體指含有單個的所述結構(I)或單個的所述結構(II)，其通常僅含一個第一蛋白功能區。所述的二聚體結構由兩個單體組成，即通常是指含有兩個所述的結構(I)或(II)，其通常含有兩個第一蛋白功能區和至少兩個第二蛋白功能區。
較佳地，所述(a)的單體結構中，所述結合蛋白具有兩個第二蛋白功能區，其中一個第二蛋白功能區連接於所述第一蛋白功能區的Fab結構的重鏈CH1的C末端，另一個第二蛋白功能區連接於所述第一蛋白功能區的Fab結構的輕鏈CL的C末端(例如，圖37 (E)所示)。
較佳地，所述(b)的二聚體結構中，所述結合蛋白通常還包括Fc。所述的Fc可以是位於所述第一蛋白功能區和所述第二蛋白功能區之間(例如如圖1結構(1)和(2)所示，或如圖37 (A)所示)；或者所述Fc還可以是位於所述第二蛋白功能區的C末端(例如，如圖1中的結構(3)、(4)、(8)所示，或如圖37 (B-D)所示)；或者所述Fc還可以位於兩個第二蛋白功能區之間(例如，如圖1的結構(6)所示)。所述Fc的數量通常可以為1個或者更多。本申請中，所述的Fc可以是優選為人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4的重鏈恆定區，其通常還可以包括L234A、L235A和P329G中的一個、兩個或三個突變，例如包含L234A和L235A的突變或包含L234A、L235A和P329G的突變。
更佳地，在每個單體中，所述第一蛋白功能區的數量為1個。
更佳地，在每個單體中，所述第二蛋白功能區的數量為1個或多個例如為1、2或3個。
進一步更佳地，所述的結合蛋白通常還可以進一步包括第三蛋白功能區，其中所述第三蛋白功能區通常位於所述結合蛋白或結合蛋白中Fc的C或N末端。其中，所述第三蛋白功能區的數量為1個或多個，例如其數量可以為1、2或3個。所述的第三蛋白功能區結合其他標靶細胞上的抗原或者結合標靶細胞上的與第一蛋白功能區相同的抗原的不同表位；或者結合其他免疫效應細胞上的抗原或者結合免疫效應細胞上的與第二蛋白功能區相同的抗原的不同表位。所述的第三蛋白功能區優選為一個或多個VH。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B-C’所示，所述的L為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS (例如，圖1的結構1所示)。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_B-C’所示，所述的L1和L2為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS (例如，圖1的結構2所示)。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VH_A-CH1-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-C’所示，所述的L1和L2為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示(例如，圖1的結構3所示)。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-C’所示，所述的L1和L2為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示(例如，圖1的結構4所示)。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VH_A-CH1-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-L3-VH_B-C’所示，所述的L1、L2和L3為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示(例如，圖1的結構5所示)。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-L3-VH_B-C’所示，所述的L1、L2和L3為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示(例如，圖1的結構6所示)。
在某一較佳實施例中，所述結合蛋白包含多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-L-VH_B-CH1-h-CH2-CH3-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-C’所示，所述多肽鏈3如式：N’-VL_B-CL-C’所示，所述的L為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS (例如，圖1的結構8所示)。
其中，上述的VL_B和/或VH_B分別為所述第二蛋白功能區的VL和/或VH，所述的VL_A和/或VH_A分別為所述第一蛋白功能區的VL和/或VH；所述的h為樞紐區或其衍生序列(例如為表2中的人IgG1樞紐、人IgG1樞紐(C220S)、人IgG2樞紐、人IgG4樞紐、人IgG4樞紐(S228P))；所述的CL是輕鏈恆定區結構域；所述的CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域；所述的L或L1或L2或L3為連接胜肽。
本發明人在實驗過程中發現，針對免疫效應細胞的抗原結合片段(效應域，effector moiety)相對於針對標靶細胞(如腫瘤細胞)的抗原結合片段(標靶域，targeting moiety)的位置和距離對於該結合蛋白的功能活性是至關重要的，如圖38所示結構。
在某些實施方案中，當效應域位於標靶域和Fc之間的時候(圖38中的模式二)，特別是如Fab-HCAb四價對稱結構(即圖1所述的結構3或結構4)或FIT-Ig結構(即圖1所述結構8)，該結合蛋白具有活化免疫效應細胞的能力。
在某些實施方案中，當效應域位於Fc的C’端的時候(圖38中的模式一)，特別是如IgG-VH四價對稱結構(即圖1所述的結構1)或IgG-VH (2)六價對稱結構(即圖1所述的結構2)，該結合蛋白具有活化免疫效應細胞的能力。而當效應域位於標靶域的N’端的時候(圖38中的模式三)，特別是如VH-IgG四價對稱結構(即圖1所述結構7)，該結合蛋白儘管可以結合免疫效應細胞但是不具有活化能力。
在某些實施方案中，效應域可以同時位於標靶域和Fc之間以及位於Fc的C’端，以實現多價的結合(可認為是圖38中的模式一和模式二的疊加，如圖37 (C-D)所示)，特別是如Fab-VH-Fc-VH六價對稱結構(即圖1所述的結構5或結構6)，該結合蛋白具有活化免疫效應細胞的能力。
本發明中，所述的抗原結合片段是指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是常規抗體(H2L2)的Fab區，也可以是重鏈抗體(HCAb)的VH區，或者其他抗原結合形式(例如脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞黏附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構)。
較佳地，所述標靶細胞上的(特定的)抗原為腫瘤抗原和/或共抑制分子(coinhibitory)抗原。
其中，所述的腫瘤抗原可以為本領域常規，例如可以是CD19、BCMA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD123、CD44v6、B7H3、B7H4、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PSMA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-beta、SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1 (fucosyl GM1)、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、GD2、FOLR1、FOLR2、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸(polysialic acid)、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、WT1、ETV6-AML、SPA17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、FOSL1、hTERT、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、AR (雄激素受體)、細胞週期蛋白B1 (Cyclin B1)、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD20、CD30、HER2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、gp100Tn、FAP、酪胺酸酶(tyrosinase)、EPCAM、CEA、IGF-1R、EphB2、間皮素(mesothelin)、鈣黏蛋白17 (Cadherin17)、CD32b、EGFRvIII、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、GUCY2C、和/或TACSTD2等等；優選為B7H3、B7H4、PSMA、CLDN18.2、GPC3、HER2、ROR1、CD22、EPCAM、間皮素、EGFRvIII和/或TACSTD2。
其中，所述的共抑制分子抗原可以為本領域常規，例如可以為PD-L1、PD-L2、CTLA4、B7H3、B7H4、VISTA、HHLA2和/或CD155等等，優選為PD-L1、B7H3、B7H4和/或HHLA2。
其中，所述的免疫效應細胞上的(特定的)抗原可以是刺激型(stimulatory)抗原或共刺激分子(costimulatory)抗原，例如可以是TCR/CD3、CD28、4-1BB、OX40、GITR、CD27、ICOS、CD2、CD40、CD226、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D和/或2B4等等，優選為TCR/CD3、CD28、4-1BB、OX40、GITR、CD40、CD226、CD16和/或NKp30。
在某些實施方案中，所述的標靶細胞上的(特定的)抗原可以是CLDN18.2、HER2、B7H4、EPCAM、PSMA和/或PD-L1。
在某些實施方案中，所述的免疫效應細胞上的(特定的)抗原可以是4-1BB和/或OX40。
較佳地，所述第一蛋白功能區為標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、標靶HER2的抗體或其抗原結合片段、標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段、標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段、標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段和/或標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段。
較佳地，所述第二蛋白功能區為標靶OX40的抗體或其抗原結合片段、和/或標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段。
在某些實施方案中，所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：22所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：55所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：88所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：142所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶HER2的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：13所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：42所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：77所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：105所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：117所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：134所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：11所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：40所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：75所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：103所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：117所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：132所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：20所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：53所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：86所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：110所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：140所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：21所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：54所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：87所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：111所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：141所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：47所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：81所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：138所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：17所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：48所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：82所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：109所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：122所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：139所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：57所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：90所示的VH CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：12所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：41所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：76所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：104所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：133所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：12所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：44所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：76所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：104所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：133所示的VL CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶OX40的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3。
在某些實施方案中，所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：165所示的VH和序列如SEQ ID NO：179所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶HER2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：152所示的VH和序列如SEQ ID NO：170所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：150所示的VH和序列如SEQ ID NO：168所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH和序列如SEQ ID NO：171所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：163所示的VH和序列如SEQ ID NO：177所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：164所示的VH和序列如SEQ ID NO：178所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：157所示的VH和序列如SEQ ID NO：175所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：158所示的VH和序列如SEQ ID NO：176所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：167所示的VH。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：151所示的VH和序列如SEQ ID NO：169所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：154所示的VH和序列如SEQ ID NO：172所示的VL。
在某些實施方案中，所述的標靶OX40的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH。
在某些實施方案中，所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：196所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：210所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶HER2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：183所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：201所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：181所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：199所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：184所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：202所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：194所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：208所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：195所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：209所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：188所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：206所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：189所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：207所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：190所示的重鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：191所示的重鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：192所示的重鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：198所示的重鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：182所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：200所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：185所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：203所示的輕鏈。
在某些實施方案中，所述的標靶OX40的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：193所示的重鏈。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：105、117和134所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：13、42和77所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：19、51和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：110、118和140所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：20、53和86所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、49和83所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：110、118和140所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：20、53和86所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、50和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：110、118和140所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：20、53和86所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、57和90所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：106、119和135所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、43和78所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、49和83所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：106、119和135所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、43和78所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、50和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：106、119和135所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、43和78所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：19、51和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和138所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、47和81所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、49和83所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和138所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、47和81所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、50和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和138所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、47和81所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：19、51和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：109、122 和 139 所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：17、48和82所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、49和83所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：109、122 和 139 所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：17、48和82所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、50和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：109、122和139所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：17、48和82所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：19、51和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和142所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：22、55和88所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、49和83所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和142所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：22、55和88所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、50和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和142所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：22、55和88所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：19、51和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：106、119和135所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、43和78所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、52和85所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：110、118和140所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：20、53和86所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、52和85所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和138所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：16、47和81所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、52和85所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：109、122和139所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：17、48和82所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、52和85所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：108、121和142所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：22、55和88所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、52和85所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：111、118和141所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：21、54和87所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：18、50和84所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：106、119和135所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：14、43和78所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：104、118和133所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：12、41和76所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：103、117和132所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：11、40和75所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，分別為SEQ ID NOs：104、118和133所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，分別為SEQ ID NOs：12、44和76所示的胺基酸序列。所列CDR的胺基酸序列按照Chothia定義規則所示。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：170所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：152所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：177所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：177所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：177所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：167所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：171所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：171所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：171所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：175所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：157所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：175所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：157所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：175所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：157所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：176所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：176所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：176所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：165所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：159所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：165所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：165所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：161所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：171所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：177所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：163所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：175所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：157所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：176所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：158所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：179所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：165所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：178所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：164所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：160所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：171所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：153所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：169所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：151所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述結合蛋白包含兩種蛋白功能區：第一蛋白功能區和第二蛋白功能區。其中，所述第一蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：168所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：150所示的胺基酸序列。所述第二蛋白功能區包含輕鏈可變區和重鏈可變區；其輕鏈可變區VL包括如SEQ ID NO：172所示的胺基酸序列；其重鏈可變區VH包括如SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：201所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：214所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：217所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：218所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：219所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：221所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：222所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：223所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：206所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：224所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：206所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：225所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：206所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：226所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：207所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：227所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：207所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：228所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：207所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：229所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：210所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：230所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：210所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：231所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：210所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：232所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：233所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：236所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：206所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：241所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：207所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：242所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：210所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：243所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：220所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：209所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：234所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：212所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：235所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：240所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：238所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含三個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：213所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：212所示的胺基酸序列；多肽鏈3包括如SEQ ID NO：203所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含三個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：216所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：215所示的胺基酸序列；多肽鏈3包括如SEQ ID NO：203所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：266所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：267所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：268所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：269所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：202所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：270所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：212所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：271所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：272所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：208所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：273所示的胺基酸序列。
在某些實施方案中，所述的結合蛋白包含兩個多肽鏈。其中，多肽鏈1包括如SEQ ID NO：237所示的胺基酸序列；多肽鏈2包括如SEQ ID NO：274所示的胺基酸序列。
本申請中，所述的CDR均可包含在所限序列的基礎上進行突變的情形。所述突變為在所述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的胺基酸序列的基礎上分別具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換。本申請中，在類似“具有3、2或1個胺基酸的插入、缺失或替換”中“胺基酸突變”是指相較於原胺基酸序列而言，變體的序列存在胺基酸的突變，包括在原胺基酸序列的基礎上發生胺基酸的插入、缺失或替換。例示性的解釋是對CDR的突變可以包含3個、2個或1個胺基酸的突變，這些CDR之間可以任選地選擇相同或不同數目的胺基酸殘基進行突變，例如可以是對CDR1進行1個胺基酸的突變，對CDR2和CDR3不進行胺基酸突變。
本申請中，所述的VH、VL、或所述的多肽鏈均可包含在所限定的序列的基礎上進行突變的情形。所述突變為所限定的胺基酸序列上發生了一個或多個胺基酸殘基的缺失、取代或添加，且所述突變的胺基酸序列與所限定的胺基酸序列具有至少85%序列相同性，並保持或改善了所述抗體或其抗原結合片段、結合蛋白的結合活性；所述至少85%序列相同性優選為至少90%序列相同性；更優選為至少95%序列相同性；最優選為至少99%序列相同性。
為了解決上述技術問題，本發明第二方面提供了一種分離的核酸，其編碼如本發明第一方面所述的結合蛋白。
為了解決上述技術問題，本發明第三方面提供了一種重組表現載體，其包含如本發明第二方面所述的分離的核酸。
較佳地，所述表現載體包含真核細胞表現載體和/或原核細胞表現載體。
為了解決上述技術問題，本發明第四方面提供了一種轉形株，其包含如本發明第二方面所述的分離的核酸或如本發明第三方面所述的重組表現載體。
較佳地，所述轉形株的宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選E. coli 細胞如TG1、BL21，所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞。
為了解決上述技術問題，本發明第五方面提供了一種結合蛋白的製備方法，其包含培養如本發明第四方面所述的轉形株，從培養物中獲得結合蛋白。
為了解決上述技術問題，本發明第六方面提供了一種藥物組成物，所述藥物組成物包含如本發明第一方面所述的結合蛋白，以及任選地藥學上可接受的載劑。
較佳地，所述藥物組成物還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分。
為了解決上述技術問題，本發明第七方面提供了一種套組，其包括如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物。
較佳地，所述套組還包括(i)施用結合蛋白或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
為了解決上述技術問題，本發明第八方面提供了一種套裝藥盒，所述套裝藥盒包括藥盒一和藥盒二，所述藥盒一包括如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物，所述藥盒二包括其它抗體或藥物組成物。所述的藥盒一和藥盒二可以同時使用，也可以先使用藥盒一再使用藥盒二，還可以先使用藥盒二再使用藥盒一，可以根據具體應用時的實際需求而定。即對應於聯合用藥的情況。
為了解決上述技術問題，本發明第九方面提供了一種給藥裝置，所述給藥裝置包括如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物。
較佳地，所述給藥裝置還包括容納或將所述結合蛋白和/或所述藥物組成物施用於受試者的部件，例如注射器、輸液裝置或植入式給藥裝置。
為了解決上述技術問題，本發明第十方面提供了一種如本發明第一方面所述的結合蛋白、如本發明第六方面所述的藥物組成物、如本發明第七方面所述的套組、如本發明第八方面所述的套裝藥盒和/或如本發明第九方面所述的給藥裝置在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用。
較佳地，所述腫瘤為乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤和/或結直腸癌等等血液瘤或實體瘤。
為了解決上述技術問題，本發明第十一方面提供了一種體外或體內檢測特異性抗原的方法，其包括使用如本發明第一方面所述的結合蛋白和/或如本發明第六方面所述的藥物組成物進行檢測。
為了解決上述技術問題，本發明第十二方面提供了一種診斷、預防和/或治療腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如本發明第一方面所述的結合蛋白、如本發明第六方面所述的藥物組成物、如本發明第七方面所述的套組、如本發明第八方面所述的套裝藥盒和/或如本發明第九方面所述的給藥裝置的步驟。
較佳地，所述腫瘤為乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤和/或結直腸癌等等血液瘤或實體瘤。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：
本發明的結合蛋白可以增強針對特定標靶細胞(例如腫瘤細胞)的免疫反應(例如T細胞或者NK細胞的活性)，其可以將免疫效應細胞和特定標靶細胞(例如腫瘤細胞)拉近在一起，高效地有選擇性地活化特定標靶細胞(例如腫瘤細胞)微環境中的免疫效應細胞，進而增強免疫反應(例如促進T細胞活化和細胞激素的產生)，並減少周邊免疫細胞的非特異性活化帶來的毒副作用。所述結合蛋白利用標靶細胞抗原媒介的共刺激分子的交聯以及下游訊息傳遞途徑的活化，進而促進免疫細胞的活化和增殖，提高其毒殺腫瘤的效力。本發明的結合蛋白具有優秀的通用性和成藥性，在多個不同標的組合的雙抗分子上都顯示出優秀的生物學活性、分子穩定性和藥學性能。
具體實施方式
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所揭示的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
在本申請中，術語“結合蛋白”或者“抗原結合蛋白”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及任選地允許結合抗原的部分採用促進抗原結合蛋白與抗原結合的構象的支架或骨架部分。可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高度變異區，它們散佈在稱為框架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成，它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列：FR-1、CDR1、FR-2、CDR2、FR-3、CDR3和FR-4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。VH的三個CDR分別表示為HCDR1、HCDR2和HCDR3，也可表示為VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3；VL的三個CDR分別表示為LCDR1、LCDR2和LCDR3，也可表示為VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。抗原結合蛋白的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab，Fab’，F(ab)2 ，Fv片段，F(ab’)2 ，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，所述CDR的胺基酸序列均是按照Chothia定義規則所示出的。但是，本領域人員公知，在本領域中可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見J Mol Biol 273：927-48，1997)。在本發明的技術方案中，還可以使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則來確定可變結構域序列中的胺基酸殘基。其中Combined定義規則即是將Kabat定義和Chothia定義的範圍相結合，基於此取了一個更大的範圍，詳見下表。本領域技術人員應當理解的是，除非另有規定，否則術語給定抗體或其區(例如可變區)的“CDR”及“互補決定區”應瞭解為涵蓋如透過本發明描述的上述已知方案中的任何一種界定的互補決定區。雖然本發明中請求保護的範圍是基於Chothia定義規則所示出的序列，但是根據其他CDR的定義規則所對應的胺基酸序列也應當落在本發明的保護範圍中。 表-I 本申請抗體CDR定義方法
  Kabat Chothia Combined
LCDR1 L24--L34 L24--L34 L24-L34
LCDR2 L50--L56 L50--L56 L50-L56
LCDR3 L89--L97 L89--L97 L89-L97
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26-H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50-H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95-H102
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。本領域技術人員應當知曉的是，在用Chothia編碼CDR時，有些位置會有插入位址的情況(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)。
在本申請中，術語“單株抗體”通常是指從一群基本上同質的抗體獲得的抗體，即集群中的個別抗體是相同的，除了可能存在的少量的自然突變。單株抗體通常針對單個抗原位址具有高度特異性。而且，與常規多株抗體製劑(通常具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單株抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點在於它們可以透過融合瘤培養合成，不受其他免疫球蛋白污染。修飾語“單株”表示從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特徵，並且不被解釋為需要透過任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單株抗體可以在融合瘤細胞中製備，或者可以透過重組DNA方法製備。
在本申請中，術語“全人源抗體”通常是指將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表現的抗體。抗體所有部分(包括抗體的可變區和恆定區)均由人類來源的基因所編碼。全人源抗體可以大大減少異源抗體對人體造成的免疫副反應。本領域獲得全人源抗體的方法可以有噬菌體展示技術、基因轉殖小鼠技術等。
在本申請中，術語“特異性結合”通常是指抗體透過其抗原結合域與表位結合，並且該結合需要抗原結合域和表位之間的一些互補性。根據該定義，當抗體相比於其將結合隨機的，不相關的表位而言更容易透過其抗原結合域與表位結合時，抗體被稱為“特異性結合”該抗原。“表位”是指抗原上與抗原結合蛋白(如抗體)結合的特定的原子基團(例如，糖側鏈、磷醯基、磺醯基)或胺基酸。
在本申請中，術語“Fab”通常指常規抗體(例如IgG)中與抗原結合的部分，包括抗體的重鏈可變區VH、輕鏈可變區VL和重鏈恆定區結構域CH1以及輕鏈恆定區CL。在常規抗體中，VH的C端與CH1的N端聯結形成重鏈Fd片段，VL的C端與CL的N端聯結形成輕鏈，CH1的C端又進一步與重鏈的樞紐區和其他恆定區結構域聯結形成重鏈。在一些實施例中，“Fab”也指Fab的變體結構。例如，在某些實施例中，VH的C端與CL的N端聯結形成一個多肽鏈，VL的C端與CH1的N端聯結形成另一個多肽鏈，形成Fab (cross VH/VL)的結構；在某些實施例中，Fab的CH1不與樞紐區聯結，而是CL的C端與重鏈的樞紐區聯結，形成Fab (cross Fd/LC)的結構。
在本申請中，術語“VH”通常指抗體的重鏈可變區VH結構域，即可以是人或者其他動物的常規抗體(H2L2結構)的重鏈可變區VH，也可以是駱駝科等動物的重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VHH，還可以是利用Harbour HCAb基因轉殖小鼠產生的全人源重鏈抗體(HCAb結構)的重鏈可變區VH。
本本申請中，術語“抗原結合片段”通常指任何可以與抗原特異結合的蛋白功能區域，既可以是“Fab”，也可以是“VH”，還可以是其他抗原結合形式[例如脂質運載蛋白(lipocalins)、神經細胞黏附分子(NCAM)、纖維結合蛋白(fibronectin)、錨蛋白重複片段蛋白(DARPins)等衍生蛋白結構]。
在本申請中，術語“腫瘤抗原”(tumor antigen)即可以是腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen，TSA)還可以是腫瘤相關抗原(tumor associated antigen，TAA)。腫瘤特異性抗原是指腫瘤細胞所特有的、不存在於正常細胞或組織上的抗原。腫瘤相關抗原並非腫瘤細胞所特有，也存在於正常細胞或組織，但是腫瘤細胞增殖時高度表現。
在本申請中，術語“標靶細胞”是指需要被清除掉的細胞，主要是腫瘤細胞，也可以是免疫抑制性細胞等。
在本申請中，術語“免疫效應細胞”一般指在免疫反應中參與清除異物抗原和行使效應功能的免疫細胞。如漿細胞、細胞毒性T細胞、NK細胞等等。
在本申請中，術語“共刺激分子”、“共刺激分子抗原”或“刺激性抗原”是指為免疫細胞如T或B細胞完全活化提供共刺激信號的細胞表面分子及其配體，對免疫細胞活化起到正調節作用。例如CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40等等。
在本申請中，術語“共抑制分子”或“共抑制分子抗原”是一類對免疫細胞的功能起到負調節作用的細胞表面分子及其配體。例如CTLA-4、PD-L1、PD-1等等。
在本申請中，術語“效應域”(effector moiety)是指結合免疫效應細胞的抗原結合片段。
在本申請中，術語“標靶域”(targeting moiety)是指結合標靶細胞(如腫瘤細胞)的抗原結合片段。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程式性細胞死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274 (CD274)或B7同源物1 (B7-H1)，並且是由(人類中) CD274基因編碼的蛋白。PD-L1序列是本領域已知的。例如，例示性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到；例示性的全長食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號XP_005581836或Uniprot登錄號G7PSE7下找到。
在本申請中，術語“HER2”通常是指受體酪胺酸激酶erbB-2 (也稱為ERBB2)、其功能變體和/或其功能片段。HER2序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人HER2序列可以在Uniprot登錄號P04626中找到；示例性的全長的食蟹猴HER2序列可以在NCBI登錄號XP_005584091中找到。
在本申請中，術語“B7H4”通常是指含V-Set域T細胞活化抑制因子1 (也稱為VTCN1)、其功能變體和/或其功能片段。B7H4序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人B7H4序列可以在Uniprot登錄號Q7Z7D3中找到；例示性的全長的食蟹猴B7H4序列可以在NCBI登錄號XP_005542249中找到；例示性的全長的小鼠B7H4序列可以在Uniprot登錄號Q7TSP5中找到。
在本申請中，術語“4-1BB”通常是指腫瘤壞死因子受體超家族成員9 (也稱為CD137，4-1BBL受體)、其功能變體和/或其功能片段。4-1BB序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人4-1BB序列可以在Uniprot登錄號Q07011中找到；例示性的全長的食蟹猴4-1BB序列可以在NCBI登錄號XP_005544945中找到。
在本申請中，術語“OX40”通常是指腫瘤壞死因子受體超家族成員4 (也稱為CD134，OX40L受體)、其功能變體和/或其功能片段。OX40序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人OX40序列可以在Uniprot登錄號P43489中找到；例示性的全長的食蟹猴OX40序列可以在NCBI登錄號XP_005545179中找到。
在本申請中，術語“EPCAM”通常是指上皮細胞黏附分子(也稱為CD326)、其功能變體和/或其功能片段。EPCAM序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人EPCAM序列可以在Uniprot登錄號P16422中找到；例示性的全長的食蟹猴或恆河猴EPCAM序列可以在NCBI登錄號NP_001035118中找到。
在本申請中，術語“PSMA”通常是指前列腺特異膜抗原(也稱為FOLH1，麩胺酸羧肽酶2)、其功能變體和/或其功能片段。PSMA序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人PSMA序列可以在Uniprot登錄號Q04609中找到；例示性的全長的食蟹猴PSMA序列可以在NCBI登錄號XP_005579379中找到。
在本申請中，術語“Claudin-18”或“CLDN18”通常是指是一種在人類中由CLDN18基因編碼的蛋白質，屬於細胞緊密連接蛋白家族，可以控制層細胞之間的分子流動。Claudin-18具有兩個剪接變體，分別為Claudin 18.1和Claudin 18.2，兩者序列之間僅有八個胺基酸的差異。Claudin 18.1和Claudin 18.2的表現分佈有所不同，Claudin 18.1在正常肺的細胞中選擇性表現，Claudin 18.2在正常細胞中表現高度受限，但在多種腫瘤中被活化並高度表現。Claudin-18序列是本領域已知的。例如，例示性的全長的人Claudin-18序列可以在Uniprot登錄號P56856中找到；對應地，剪接變體Claudin 18.1的序列是P56856-1，剪接變體Claudin 18.2的序列是P56856-2。
在本申請中，術語“CLDN18.1”特指“Claudin-18”的剪接變體Claudin 18.1。
在本申請中，術語“CLDN18.2”特指“Claudin-18”的剪接變體Claudin 18.2。實施例
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。實施例不包括對傳統方法的詳細描述，如那些用於建構載體和質體的方法，將編碼蛋白的基因插入到這樣的載體和質體的方法或將質體引入宿主細胞的方法．這樣的方法對於本領域中具有普通技術的人員是眾所周知的，並且在許多出版物中都有所描述。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例 1 基於重鏈抗體的免疫細胞銜接多特異性結合蛋白
本實施例列舉了若干種利用全人源重鏈抗體(HCAb)及其衍生的單域抗體(sdAb)所建構的免疫細胞銜接多特異性結合蛋白的結構。在有些結構中，結構域和結構域之間用連接胜肽進行聯結。在有些結構中，重鏈的Fc區域引入了胺基酸突變以改變其與Fc受體的結合進而改變相關的效應功能或者其他性能。
表1和圖1列出了本申請所涉及的多特異性結合蛋白分子結構，每一個結構會在下文進一步描述。優選結構為結構1、結構2和結構3。表2列出了本申請的結構設計中可能用到的連接胜肽序列。圖37列出了基於重鏈抗體或單域抗體的其他衍生的雙(多)特異性抗體分子結構。 表1 本申請所列舉的多特異性結合蛋白分子結構
結構編號 結構模式名稱 結構類型 結合價數 對稱性 不同的多肽鏈數目
1 IgG_HC-VH IgG-VH 四價 對稱 2
2 IgG_HC-VH-VH IgG-VH(2) 六價 對稱 2
3 Fab(CL)-VH-Fc Fab-HCAb 四價 對稱 2
4 Fab(CH1)-VH-Fc Fab-HCAb 四價 對稱 2
5 Fab(CL)-VH-Fc-VH Fab-VH-Fc-VH 六價 對稱 2
6 Fab(CH1)-VH-Fc-VH Fab-VH-Fc-VH 六價 對稱 2
7 VH-IgG_HC VH-IgG 四價 對稱 2
8 FIT-Ig FIT-Ig 四價 對稱 3
表2 連接胜肽序列
連接胜肽名字 長度   序列 SEQ ID NO
GS_2 2   GS  
GS_4 4   GSGS 244
GS_5 5   GGGGS 245
GS_7 7   GGGGSGS 246
GS_15 15   GGGGSGGGGSGGGGS 247
GS_20 20   GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 248
GS_25 25   GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 249
H1_15 15   EPKSSDKTHTPPPPP 250
LH1 10   DKTHTCPPCP 251
G5-LH 15   GGGGGDKTHTCPPCP 252
H1_15-RT 17   EPKSSDKTHTPPPPPRT 253
L-GS_15-RT 18   LGGGGSGGGGSGGGGSRT 254
L-H1_15-RT 18   LEPKSSDKTHTPPPPPRT 255
KL-H1_15-RT 19   KLEPKSSDKTHTPPPPPRT 256
KL-H1_15-AS 19   KLEPKSSDKTHTPPPPPAS 257
RT-GS_5-KL 9   RTGGGGSKL 258
RT-GS_15-KL 19   RTGGGGSGGGGSGGGGSKL 259
RT-GS_25-KL 29   RTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKL 260
人IgG1樞紐 15   EPKSCDKTHTCPPCP 261
人IgG1樞紐(C220S) 15   EPKSSDKTHTCPPCP 262
人IgG2樞紐 12   ERKCCVECPPCP 263
人IgG4樞紐 12   ESKYGPPCPSCP 264
人IgG4樞紐(S228P) 12   ESKYGPPCPPCP 265
實施例 1.1 含有重鏈抗體 VH 結構域的雙特異性結合蛋白結構
本發明提供了一種使用兩種親代單株抗體建構雙特異性結合蛋白的方法：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的重鏈抗體B。
如圖1中結構(1)至結構(7)所示，Fab端來源於常規抗體A，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH端來源於重鏈抗體B，VH_B為重鏈抗體B的重鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列，L或L1或L2或L3是連接胜肽。實施例 1.1.1 結構 (1) ： IgG_HC-VH
結構(1)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接胜肽L聯結到VH_B；L可以是表2中所列序列。實施例 1.1.2 結構 (2) ： IgG_HC-VH-VH
結構(2)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2-VH_B。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B與第二個VH_B直接融合聯結，即L2的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的第一個VH_B經由連接胜肽L2聯結到第二個VH_B；L2可以是表2中所列序列。實施例 1.1.3 結構 (3) ： Fab(CL)-VH-Fc
結構(3)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。在結構(3)中，抗體A的VL_A和重鏈抗體B的VH_B融合在同一條多肽鏈上，這樣可以避免VL_A和VH_B的締合產生的錯配副產物。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CL與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CL經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表2中所列序列。實施例 1.1.4 結構 (4) ： Fab(CH1)-VH-Fc
結構(4)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH1與VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH1經由連接胜肽L1聯結到VH_B；L1可以是表2中所列序列。實施例 1.1.5 結構 (5) ： Fab(CL)-VH-Fc-VH
結構(5)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-L3-VH_B。在結構(5)中，抗體A的VL_A和重鏈抗體B的VH_B融合在同一條多肽鏈上，這樣可以避免VL_A和VH_B的締合產生的錯配副產物。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CL與第一個VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CL經由連接胜肽L1聯結到第一個VH_B；L1可以是表2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與第二個VH_B直接融合聯結，即L3的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接胜肽L3聯結到第二個VH_B；L3可以是表2中所列序列。實施例 1.1.6 結構 (6) ： Fab(CH1)-VH-Fc-VH
結構(6)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-L3-VH_B。
多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L2聯結到CH2；L2可以是IgG的樞紐區或者樞紐區衍生的連接胜肽序列，或是表2中所列序列，優選為人IgG1樞紐或者人IgG1樞紐(C220S)或者G5-LH的序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH1與第一個VH_B直接融合聯結，即L1的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH1經由連接胜肽L1聯結到第一個VH_B；L1可以是表2中所列序列。
在一個實施方案中，多肽鏈2的CH3與第二個VH_B直接融合聯結，即L3的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的CH3經由連接胜肽L3聯結到第二個VH_B；L3可以是表2中所列序列。實施例 1.1.7 結構 (7) ： VH-IgG_HC
結構(7)的結合蛋白包含兩條多肽鏈：多肽鏈1，也稱短鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL；多肽鏈2，也稱長鏈，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_B-L-VH_A-CH1-h-CH2-CH3。
在一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B與VH_A直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈2的VH_B經由連接胜肽L聯結到VH_A；L可以是表2中所列序列。實施例 1.2   FIT-Ig 雙特異性結合蛋白結構
FIT-Ig結構的設計可以參考專利WO2015/103072A1，結構見圖1的結構(8)所示。FIT-Ig結構的雙抗分子可以建構自：結合第一抗原的常規抗體A和結合第二抗原的常規抗體B。
如圖1的結構(8)所示，VH_A和VL_A分別為抗體A的重鏈可變區和輕鏈可變區。VH_B和VL_B分別為抗體B的重鏈可變區和輕鏈可變區。CL是輕鏈恆定區結構域。CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域。h是IgG抗體的樞紐區或衍生序列，L是連接胜肽。實施例 1.2.1 結構 (8) ： FIT-Ig
結構(8)的結合蛋白包含三條多肽鏈：多肽鏈1，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_A-CL-L-VH_B-CH1-h-CH2-CH3；多肽鏈2，從胺基末端到羧基末端，其包含VH_A-CH1；多肽鏈3，從胺基末端到羧基末端，其包含VL_B-CL。
在一個實施方案中，多肽鏈1的CL與VH_B直接融合聯結，即L的長度為0。在另一個實施方案中，多肽鏈1的CL經由連接胜肽L聯結到VH_B；L可以是表2中所列序列。實施例 2 抗體的序列分析、表現純化、和理化性質特徵分析 實施例 2.1 抗體的表現和純化
本實施例介紹了利用哺乳動物宿主細胞(例如，人胚腎細胞HEK293或中國倉鼠卵巢細胞CHO及其衍生細胞)、暫態轉染表現和親和捕捉分離等技術來製備抗體的一般方法。本方法適用於含有Fc區的目標抗體；目標抗體可以由一條或多條蛋白質多肽鏈組成；可以來源於一個或多個表現質體。
將抗體多肽鏈的胺基酸序列透過密碼子最適化方法轉換成核苷酸序列；合成編碼的核苷酸序列並選殖到與宿主細胞兼容的表現載體上。將編碼抗體多肽鏈的質體按照特定比例同時轉染哺乳動物宿主細胞，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有正確折疊和多肽鏈組裝的重組抗體。具體地，將FreeStyle™ 293-F細胞(Thermo, #R79007)在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, #A1383504)中擴大培養。暫態轉染開始之前，調節細胞濃度至6-8x105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2x106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將編碼抗體多肽鏈的質體按照一定比例混合共計30 µg質體(質體與細胞的比例為1 µg：1 ml)溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, #31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI (Polysciences, #23966-2) 120 µl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培育10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清液；然後將上清液高速離心去除雜質。用PBS pH 7.4緩衝液平衡含有MabSelect™ (GE Healthcare, #71-5020-91)的重力管柱(Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清液樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS緩衝液沖洗柱子，再用pH 3.5的0.1M甘胺酸洗提目標蛋白，隨後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, #UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液或者含有其他成分的緩衝液，得到純化的重組抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo, NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。實施例 2.2 利用 SEC-HPLC 分析蛋白純度和聚合體
本實施例使用分析型分子粒徑篩析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚合體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience，#08541，5 µm，7.8 mm×30 cm)連接到高壓液相層析儀HPLC (Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程式：用PBS緩衝液將樣品以1.0 ml/分鐘的流速流過層析管柱，最長時間為25分鐘。HPLC將生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。實施例 2.3 利用 Uncle 測定蛋白的分子穩定性和分子聚集性
Uncle (Unchained Labs)是一個多功能一站式的蛋白穩定性分析平臺，它透過全螢光，靜態光散射(SLS)和動態光散(DLS)檢測方法來表徵蛋白質的穩定性。同一組樣品可同時得到熔解溫度(Tm)，聚集溫度(Tagg)和粒徑(diameter)等參數。在本實施例中，選擇Uncle的“Tm &Tagg with optional DLS”應用程式進行操作，取9 µL樣品加入Uni管中，設置以0.3℃/分鐘的梯度逐漸從25℃升溫至95℃。進行初始和最終DLS測量四次採集，每次採集5秒。實驗運行結束後，Uncle分析軟體採用重心均值(BCM)公式來計算每個樣品的Tm值；透過SLS在266 nm或473 nm波長下的螢光強度的曲線(聚集曲線)來計算Tagg值；樣品的粒徑和分散度則透過DLS相關的函數來計算。實施例 3 建構標靶共刺激分子的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白
本實施例列舉了數個免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子，其一端可以結合免疫細胞表面的共刺激分子(如4-1BB、OX40等)，其另一端可以結合腫瘤細胞表面的特異性抗原分子(如HER2、PSMA、EPCAM、CLDN18.2、B7H4等)或免疫細胞表面的共抑制分子(如PD-L1等)。
本實施例建構了數個標靶4-1BB和腫瘤抗原(或共抑制分子)的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子，利用腫瘤抗原將4-1BB抗體重定向到腫瘤細胞，特異性活化腫瘤微環境的免疫反應，從而避免肝臟毒性等副作用。另外，4-1BB在CD8+ T細胞和NK細胞表面都有高度表現，4-1BB的活化可以增加細胞毒性T細胞對腫瘤的浸潤也可以增強NK細胞的活性，使“冷腫瘤”轉變為“熱腫瘤”。本實施例利用結合4-1BB的HCAb抗體PR001758、PR001760、PR001836、PR004469的抗原結合片段VH，以及結合腫瘤抗原HER2的IgG抗體Trastuzumab的抗原結合片段Fab，或結合B7H4的IgG抗體PR002408、PR002410的抗原結合片段Fab，或結合EPCAM的IgG抗體PR001081的抗原結合片段Fab，或結合PSMA的IgG抗體PR001331的抗原結合片段Fab，或結合CLDN18.2的IgG抗體PR002726的抗原結合片段Fab，或結合PD-L1的IgG抗體PR000265的抗原結合片段Fab，來建構同時標靶4-1BB和腫瘤抗原(或共抑制分子)的雙特異性結合蛋白分子。
本實施例建構了數個標靶OX40和腫瘤抗原(或共抑制分子)的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子，利用腫瘤抗原將OX40抗體重定向到腫瘤細胞，特異性活化腫瘤微環境的免疫反應。本實施例利用結合OX40的HCAb抗體PR002067的抗原結合片段VH，以及結合腫瘤抗原EPCAM的IgG抗體PR001081的抗原結合片段Fab，或結合PSMA的IgG抗體PR001331的抗原結合片段Fab，或結合CLDN18.2的IgG抗體PR002726的抗原結合片段Fab，或結合B7H4的IgG抗體PR002408的抗原結合片段Fab，或結合PD-L1的IgG抗體PR000265的抗原結合片段Fab，來建構同時標靶OX40和腫瘤抗原(或共抑制分子)的雙特異性結合蛋白分子。
本實施例中，抗4-1BB的HCAb抗體(PR001758, PR001760, PR001836, PR004469)以及抗OX40的HCAb抗體(PR002067)是利用Harbour HCAb基因轉殖小鼠(Harbour Antibodies BV)免疫相關抗原和篩選、最適化而得到的。抗PD-L1的IgG抗體(PR000265)、抗EPCAM的IgG抗體(PR001081)、抗PSMA的IgG抗體(PR001331)、抗CLDN18.2的IgG抗體(PR002726)、抗B7H4的IgG抗體(PR002408, PR002410)、抗4-1BB的IgG抗體(PR000197,PR000448)等是利用Harbour H2L2基因轉殖小鼠(Harbour Antibodies BV)免疫相關抗原和篩選、最適化而得到的。抗HER2的IgG抗體Trastuzumab類似物(抗體編號PR000210)、抗PD-L1的IgG抗體Atezolizumab類似物(抗體編號PR000151)、抗4-1BB的IgG抗體Utomilumab類似物(抗體編號PR000483)和Urelumab類似物(抗體編號PR000628)、抗OX40的IgG抗體Pogalizumab類似物(又名vonlerolizumab，抗體編號PR003475)等的序列來源於現有文獻或公共資料庫。這些抗體作為本實施例建構的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子的親代抗體或者對照抗體分子，列於表3，其對應的胺基酸序列的序列號列於表10。
本實施例中，每一個免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子有兩種特異性的抗原結合片段，分別來自結合標靶細胞(如腫瘤細胞)特異抗原的標靶抗體，即第一抗原結合片段，和結合免疫效應細胞特異抗原的活化抗體，即第二抗原結合片段。表4、表5、表6、和表7以及表8列出了不同結構的雙特異性結合蛋白分子及其對應的抗原結合片段和連接方式，表中的結構編號對應於表1和圖1。表中的突變位址代號是(AAG ：L234A, L235A, P329G；LALA ：L234A, L235A.)。表11列出了雙特異性結合蛋白分子的多肽鏈胺基酸序列的序列編號，表12列出了雙特異性結合蛋白分子的第一和第二抗原結合片段對應的CDR序列的序列編號。
本實施例中，設計多個如實施例1所述結構的雙特異性結合蛋白，並按照實施例2所述方法製備對應蛋白樣品並進行分析，總結於表9。 表3 對照分子和親代單抗
分子編號 抗體
PR000151 抗PD-L1單抗atezolizumab類似物
PR000265 抗PD-L1 91G3H5H3(D54E) , hIgG1(N297A)
PR000210 抗HER2單抗trastuzumab類似物
PR001081 抗EPCAM單抗16A8B3 hIgG1
PR001331 抗PSMA單抗2E8A1B1 hIgG1
PR002408 抗B7H4單抗80C8-2E9 (H:G55A; L:N92Q) hIgG1
PR002410 抗B7H4單抗B-1H11 (L:C87Y) hIgG1
PR002726 抗CLDN18.2單抗13E6F4 hIgG1
PR000628 抗4-1BB單抗urelumab類似物
PR000483 抗4-1BB單抗utomilumab類似物
PR003475 抗OX40單抗vonlerolizumab類似物
PR000197 抗4-1BB單抗79B10G8D4 hIgG4
PR000448 抗4-1BB單抗79B10G8D4 (H:N52Q;L:F2I) hIgG4
PR001758 抗4-1BB重鏈抗體1016P0010B11
PR001760 抗4-1BB重鏈抗體1016P0011G10
PR001836 抗4-1BB重鏈抗體1016P0020G4
PR004469 抗4-1BB重鏈抗體PR001838_G53A
PR002067 抗OX40重鏈抗體R1026P079E12
表4 具有IgG-VH或VH-IgG四價對稱結構的雙抗分子
結構編號 雙抗分子 標靶抗原 標靶抗體 免疫細胞抗原 活化抗體 連接胜肽 Fc類型 (突變)
1 PR002827 HER2 PR000210 4-1BB PR001836 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003334 B7H4 PR002408 4-1BB PR001758 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
1 PR003335 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
1 PR003338 B7H4 PR002408 4-1BB PR004469 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
1 PR003549 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001758 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003550 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003551 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001836 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003552 EPCAM PR001081 4-1BB PR001758 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003553 EPCAM PR001081 4-1BB PR001760 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003554 EPCAM PR001081 4-1BB PR001836 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003555 PSMA PR001331 4-1BB PR001758 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003556 PSMA PR001331 4-1BB PR001760 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003557 PSMA PR001331 4-1BB PR001836 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003562 CLDN18.2 PR002726 4-1BB PR001758 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003563 CLDN18.2 PR002726 4-1BB PR001760 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003564 CLDN18.2 PR002726 4-1BB PR001836 H1_15-RT 人IgG1 (AAG)
1 PR003789 PD-L1 PR000265 OX40 PR002067 H1_15 人IgG1 (AAG)
1 PR004276 B7H4 PR002408 OX40 PR002067 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
1 PR004283 EPCAM PR001081 OX40 PR002067 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
1 PR004284 PSMA PR001331 OX40 PR002067 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
1 PR004285 CLDN18.2 PR002726 OX40 PR002067 H1_15-RT 人IgG1 (LALA)
7 PR004278 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 GS_15 人IgG1 (LALA)
表5 具有IgG-VH(2)六價對稱結構的雙抗分子
結構編號 雙抗分子 標靶抗原 標靶抗體 免疫細胞抗原 活化抗體 第一連接胜肽 第二連接胜肽 Fc類型 (突變)
2 PR003487 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 H1_15-RT 無 人IgG1 (LALA)
2 PR004158 B7H4 PR002410 4-1BB PR001760 H1_15-RT GS_5 人IgG1 (LALA)
表6 具有Fab-HCAb四價對稱結構的雙抗分子
結構編號 雙抗分子 標靶抗原 標靶抗體 免疫細胞抗原 活化抗體 第一連接胜肽 第二連接胜肽 Fc類型 (突變)
3 PR004270 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 H1_15 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
3 PR004279 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 H1_15 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
3 PR004277 B7H4 PR002408 OX40 PR002067 H1_15 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
3 PR005189 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 無 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
3 PR005649 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 H1_15 人IgG2樞紐 人IgG1 (LALA)
4 PR007163 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 無 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
3 PR007164 PD-L1 PR000265 4-1BB PR001760 無 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
4 PR007165 B7H4 PR002408 4-1BB PR001760 無 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
4 PR007166 B7H4 PR002408 OX40 PR002067 無 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
3 PR007167 B7H4 PR002408 OX40 PR002067 無 人IgG1樞紐(C220S) 人IgG1 (LALA)
表7 具有Fab-VH-Fc-VH六價對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子
結構編號 雙抗分子 B7H4抗體 4-1BB抗體 第一連接胜肽 第二連接胜肽 第三連接胜肽 Fc類型 (突變)
5 PR005650 PR002408 PR001760 無 人IgG1樞紐(C220S) 無 人IgG1 (LALA)
5 PR005651 PR002408 PR004469 無 人IgG1樞紐(C220S) 無 人IgG1 (LALA)
表8 具有FIT-Ig對稱結構的雙抗分子
結構編號 雙抗分子 標靶抗原 標靶抗體 免疫細胞抗原 活化抗體 結構說明 Fc 類型 (突變)
8 PR000701 PD-L1 PR000265 4-1BB PR000197 4-1BB Fab靠近Fc；無連接胜肽 人 IgG4 (S228P)
8 PR003052 PD-L1 PR000151 4-1BB PR000448 4-1BB Fab靠近Fc；無連接胜肽 人 IgG4 (S228P)
表9 雙抗分子蛋白的表現
結構編號 雙抗分子 表現系統和體積 第一步純化後產量(mg/L) SEC-HPLC純度(%)
1 PR002827 Expi293F (10ml) 29.5 73.75
1 PR003334 ExpiCHO (200ml) 38.2 97.98
1 PR003335 ExpiCHO (200ml) 68.9 99.29
1 PR003338 HEK293-F (10ml) 74.6 98.02
2 PR003487 HEK293-F (30ml) 19 84
1 PR003549 HEK293-F (30ml) 24.5 98.31
1 PR003550 HEK293-F (30ml) 42.2 95.41
1 PR003551 HEK293-F (30ml) 2.3 99.39
1 PR003552 HEK293-6E (40ml) 44 89.71
1 PR003553 HEK293-6E (40ml) 44.8 88.77
1 PR003554 HEK293-6E (40ml) 6.5 79.47
1 PR003555 HEK293-6E (40ml) 52.8 98.73
1 PR003556 HEK293-6E (40ml) 67.8 98.42
1 PR003557 HEK293-6E (40ml) 9 97.73
1 PR003562 HEK293-F (30ml) 173 97.87
1 PR003563 HEK293-F (30ml) 142.7 95.63
1 PR003564 HEK293-F (30ml) 20 93.72
1 PR003789 HEK293-6E (40ml) 3.3 96.08
1 PR004276 HEK293-6E (40ml) 17.7 95.46
1 PR004283 HEK293-6E (40ml) 27.5 95.42
1 PR004284 HEK293-6E (40ml) 21 99.43
1 PR004285 HEK293-6E (40ml) 60.8 98.15
2 PR004158 HEK293-F (30ml) 31.9 63.09
3 PR004270 HEK293-6E (40ml) 77.5 92.33
3 PR004279 HEK293-F (30ml) 11.4 79.18
3 PR004279 CHO (100ml) 3.6 95.46
3 PR004277 CHO (100ml) 48 93.03
5 PR005650 HEK293 (100ml) 21.5 97.48
5 PR005651 HEK293 (100ml) 18.2 98.13
7 PR004278 HEK293-6E (40ml) 11.5 98.08
8 PR003052 HEK293-6E (40ml) 47.5 87.76
表10 對照分子和親代單抗的序列和CDR序列的序列編號表
分子編號 輕鏈 重鏈 VL VH LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR000151 199 181 168 150 103 117 132 11 40 75
PR000265 202 184 171 153 106 119 135 14 43 78
PR000210 201 183 170 152 105 117 134 13 42 77
PR001081 206 188 175 157 108 121 138 16 47 81
PR001331 207 189 176 158 109 122 139 17 48 82
PR002408 208 194 177 163 110 118 140 20 53 86
PR002410 209 195 178 164 111 118 141 21 54 87
PR002726 210 196 179 165 108 121 142 22 55 88
PR000628 205 187 174 156 108 121 137 12 46 80
PR000483 204 186 173 155 107 120 136 15 45 79
PR003475 211 197 180 166 112 123 143 23 56 89
PR000197 200 182 169 151 104 118 133 12 41 76
PR000448 203 185 172 154 104 118 133 12 44 76
PR001758 190 159 16 49 83
PR001760 191 160 18 50 84
PR001836 192 161 19 51 84
PR004469 198 167 18 57 90
PR002067 193 162 14 52 85
表11 本實施例建構的雙抗分子的多肽鏈的序列編號表
結構編號 分子編號 多肽鏈1 多肽鏈2 多肽鏈3
1 PR002827 201 214
1 PR003334 208 217
1 PR003335 208 218
1 PR003338 208 219
2 PR003487 208 220
1 PR003549 202 221
1 PR003550 202 222
1 PR003551 202 223
1 PR003552 206 224
1 PR003553 206 225
1 PR003554 206 226
1 PR003555 207 227
1 PR003556 207 228
1 PR003557 207 229
1 PR003562 210 230
1 PR003563 210 231
1 PR003564 210 232
1 PR003789 202 233
2 PR004158 209 234
3 PR004270 212 235
1 PR004276 208 236
3 PR004277 237 238
7 PR004278 208 239
3 PR004279 237 240
1 PR004283 206 241
1 PR004284 207 242
1 PR004285 210 243
8 PR000701 213 212 203
8 PR003052 216 215 203
3 PR005189 237 266  
3 PR005649 237 267  
5 PR005650 237 268  
5 PR005651 237 269  
4 PR007163 202 270  
3 PR007164 212 271  
4 PR007165 208 272  
4 PR007166 208 273  
3 PR007167 237 274  
表12 雙抗分子的抗原結合片段的CDR的序列編號表
分子編號 抗原結合域序號 LCDR1 LCDR2 LCDR3 HCDR1 HCDR2 HCDR3
PR002827 #1(HER2) 105 117 134 13 42 77
#2(4-1BB) 19 51 84
PR003334 #1(B7H4) 110 118 140 20 53 86
#2(4-1BB) 16 49 83
PR003335, PR004278, PR003487, PR004279, PR005189, PR005649, PR005650, PR007165 #1(B7H4) 110 118 140 20 53 86
#2(4-1BB) 18 50 84
PR003338, PR005651 #1(B7H4) 110 118 140 20 53 86
#2(4-1BB) 18 57 90
PR003549 #1(PD-L1) 106 119 135 14 43 78
#2(4-1BB) 16 49 83
PR003550, PR004270, PR007163, PR007164 #1(PD-L1) 106 119 135 14 43 78
#2(4-1BB) 18 50 84
PR003551 #1(PD-L1) 106 119 135 14 43 78
#2(4-1BB) 19 51 84
PR003552 #1(EPCAM) 108 121 138 16 47 81
#2(4-1BB) 16 49 83
PR003553 #1(EPCAM) 108 121 138 16 47 81
#2(4-1BB) 18 50 84
PR003554 #1(EPCAM) 108 121 138 16 47 81
#2(4-1BB) 19 51 84
PR003555 #1(PSMA) 109 122 139 17 48 82
#2(4-1BB) 16 49 83
PR003556 #1(PSMA) 109 122 139 17 48 82
#2(4-1BB) 18 50 84
PR003557 #1(PSMA) 109 122 139 17 48 82
#2(4-1BB) 19 51 84
PR003562 #1(CLDN18.2) 108 121 142 22 55 88
#2(4-1BB) 16 49 83
PR003563 #1(CLDN18.2) 108 121 142 22 55 88
#2(4-1BB) 18 50 84
PR003564 #1(CLDN18.2) 108 121 142 22 55 88
#2(4-1BB) 19 51 84
PR003789 #1(PD-L1) 106 119 135 14 43 78
#2(OX40) 14 52 85
PR004276, PR004277, PR007166, PR007167 #1(B7H4) 110 118 140 20 53 86
#2(OX40) 14 52 85
PR004283 #1(EPCAM) 108 121 138 16 47 81
#2(OX40) 14 52 85
PR004284 #1(PSMA) 109 122 139 17 48 82
#2(OX40) 14 52 85
PR004285 #1(CLDN18.2) 108 121 142 22 55 88
#2(OX40) 14 52 85
PR004158 #1(B7H4) 111 118 141 21 54 87
#2(4-1BB) 18 50 84
PR000701 #1(PD-L1) 106 119 135 14 43 78
#2(4-1BB) 104 118 133 12 41 76
PR003052 #1(PD-L1) 103 117 132 11 40 75
#2(4-1BB) 104 118 133 12 44 76
實施例 4 結合 4-1BB
本實施例是為了研究標靶4-1BB的抗體和免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白結合4-1BB的活性。
利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現人4-1BB的CHO-K1細胞株CHO-K1/hu 4-1BB (南京金斯瑞，M00538)和高度表現食蟹猴4-1BB的CHO-K1細胞株CHO-K1/cyno 4-1BB (南京金斯瑞，M00569)等細胞的結合能力。具體地，消化酶處理細胞並用完全培養基重新懸浮；將細胞密度調整為2x106 細胞/mL。接著將細胞以100 µL/孔(2x105 細胞/孔)接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，4℃下離心5分鐘，棄上清液。隨後將梯度稀釋的結合蛋白以100 µL/孔加入96孔盤並混合均勻，結合蛋白可以從最高終濃度為200 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共12個濃度；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。然後，加入100 µL/孔預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)洗滌細胞兩次，4℃下500 g離心5分鐘，棄上清液。接著，再加入100 µL/孔螢光二抗(Goat human lgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjunction, Thermo, #A11013, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃，避光培育1小時。隨後以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清液。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
本實施例中，陽性對照分子為抗4-1BB的單抗Urelumab或Utomilumab。實施例 4.1 結合高度表現人 4-1BB 的 CHO-K1/hu 4-1BB 實施例 4.1.1 PD-L1 × 4-1BB 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
圖2中所示，所有PD-L1×4-1BB雙抗分子都可以結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB。
圖2的(A)中所示，IgG-VH四價對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)結合人4-1BB的能力優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR000701, PR003052)，而且在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab。
圖2的(B)中所示，Fab-HCAb對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR004270)結合人4-1BB的能力在MFI最大值上優於陽性對照Urelumab和Utomilumab。
圖2的(C)中所示，Fab-HCAb對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子，無論是如實施例1.1.3所述的結構(3)的分子(PR007164)還是如實施例1.1.4所述的結構(4)的分子(PR007163)，都有幾乎相同的4-1BB結合活性，且與親代單抗PR001760的相當。實施例 4.1.2 B7H4 × 4-1BB 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
圖3中所示，所有B7H4×4-1BB雙抗分子都可以結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB。
圖3的(A)中所示，IgG-VH四價對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子(PR003334, PR003335, PR003338)都可以結合CHO-K1/hu 4-1BB，且在MFI最大值上優於Urelumab。
圖3的(B-C)中所示，IgG-VH(2)六價對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子(PR003487, PR004158)都可以結合CHO-K1/hu 4-1BB。
圖3的(D)中所示，Fab-HCAb對稱結構的B7H4×4-1BB (PR004279)和VH-IgG結構分子(PR004278)的4-1BB結合活性略優於IgG-VH結構(PR003335)。
圖3的(E)中所示，Fab-HCAb對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子，無論是如實施例1.1.3所述的結構(3)的分子(PR005189)還是如實施例1.1.4所述的結構(4)的分子(PR007165)，都有相似的4-1BB結合活性，且與親代單抗PR001760的相當。
圖3的(F)中所示，Fab-HCAb四價對稱結構(PR005649)和Fab-VH-Fc-VH六價對稱結構(PR005650, PR005651)都可以結合CHO-K1/hu 4-1BB，但是Fab-HCAb結構有更高的MFI值。實施例 4.1.3 HER2 × 4-1BB 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
圖4中所示，HER2×4-1BB雙抗分子(PR002827)可以結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB。實施例 4.1.4 EPCAM × 4-1BB 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
圖5中所示，所有EPCAM×4-1BB雙抗分子(PR003552, PR003553, PR003554)都可以結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB。實施例 4.1.5 PSMA × 4-1BB 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
圖6中所示，所有PSMA×4-1BB雙抗分子(PR003555, PR003556, PR003557)都可以結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB。實施例 4.1.6 CLDN18.2 × 4-1BB 結合 CHO-K1/hu 4-1BB
圖7中所示，所有CLDN18.2×4-1BB雙抗分子(PR003562, PR003563, PR003564)都可以結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB。實施例 4.2 結合高度表現食蟹猴 4-1BB 的 CHO-K1/cyno 4-1BB
圖8中所示，抗4-1BB的HCAb抗體(PR001758, PR001760)和B7H4×4-1BB雙抗分子(PR003334, PR003335, PR003338)都可以結合食蟹猴4-1BB細胞CHO-K1/cyno 4-1BB。而Urelumab不能結合食蟹猴4-1BB。實施例 5 結合 OX40
本實施例是為了研究標靶OX40的抗體和免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白結合OX40的活性。實施例 5.1 結合食蟹猴 OX40 蛋白
利用酵素連結免疫吸附分析法ELISA測試結合蛋白結合食蟹猴OX40重組蛋白的能力。具體地，首先將2 µg/mL的食蟹猴OX40-His蛋白(NovoProtein, #CB17)以100 µL/孔塗覆96孔盤，於4℃過夜。然後用PBST緩衝液(含有0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌3次，接著加入封阻液(含有5%脫脂奶粉的PBS緩衝液)置於37℃培育1小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL/孔加入3倍濃度梯度稀釋的結合蛋白，共8個濃度，混合均勻，置於37℃培育1小時；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL/孔加入HRP標記的山羊抗人IgG (H+L)二抗(Invitrogen, A18805, 1 : 4000稀釋)，置於37℃培育0.5小時。然後用PBST緩衝液洗滌3次。隨後以100 µL/孔加入TMB顯色液反應15分鐘。最後加入終止液中止反應。用Enspire™多功能讀取儀(Perkin Elmer, Inc.)於450 nM讀取光吸收值(OD值)。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖9中所示，抗OX40的HCAb抗體PR002067可以結合食蟹猴OX40，與陽性對照Pogalizumab有相似的結合能力。實施例 5.2 結合高度表現人 OX40 的 CHO-K1/hu OX40
採用高度表現人OX40的CHO-K1細胞株CHO-K1/hu OX40 (南京金斯瑞，#M00561)進行細胞位準上的抗體結合實驗。簡言之，消化酶處理細胞CHO-K1/hu OX40細胞，並用F12K完全培養基重新懸浮，將細胞密度分別調整為1×106 細胞/ml。以100 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)，隨後加入100 µl/孔，2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。將細胞放置於4℃，避光培育1小時。之後，加入100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。再加入100 µl/孔螢光二抗(Alexa Fluor 488-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, #109-545-06, 1 : 1000稀釋)，4℃，避光培育30分鐘。用100 µl/孔預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清液。最後，200 µl/孔預冷PBS重新懸浮細胞。使用BD FACS CANTOII流式細胞儀或ACEA NovoCyte流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。
圖10中所示，所有標靶OX40的雙抗分子都能結合人OX40。而且，Fab-HCAb結構的B7H4×OX40雙抗分子(PR007166, PR007167)結合OX40的能力與其親代單抗PR002067的相當。實施例 6 結合腫瘤抗原
本實施例是為了研究免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白與腫瘤抗原的結合活性。在本實施例中，腫瘤抗原分子可以是HER2、PSMA、EPCAM、CLDN18.2、B7H4等，或是免疫細胞表面的共抑制分子如PD-L1等。
本實施例利用流式細胞術FACS測試結合蛋白與高度表現特定腫瘤抗原的細胞的結合能力。簡言之，收集細胞懸浮液，將細胞密度調整為2x106 細胞/mL；接著以50 µL細胞/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)。隨後以50 µL/孔加入2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的結合蛋白共8個濃度，混合均勻；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)作為同型對照。將細胞放置於4℃，避光培育2小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清液。之後，以100 µL/孔加入螢光二抗(Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ Fragment Specific, Jackson ImmunoResearch, #109-605-098, 1 : 1000稀釋)，放置於4℃避光培育1小時。隨後以100 µL/孔加入預冷的PBS緩衝液洗滌細胞兩次，然後於4℃下500 g離心5分鐘，棄上清液。最後，以200 µL/孔加入預冷的FACS緩衝液(含有0.5% BSA的PBS緩衝液)重新懸浮細胞。使用ACEA NovoCyte流式細胞儀或者BD FACS CANTOII 流式細胞儀讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到抗體對標靶細胞的結合曲線及EC50值等參數。實施例 6.1 結合 CLDN18.2
本實施例測試標靶CLDN18.2的抗體與高度表現人CLDN18.2的NUGC-4細胞(JCRB, JCRB0834)的結合能力。本實施例中，陽性對照分子為抗CLDN18.2的IgG單抗PR002726，亦為CLDN18.2×4-1BB雙抗分子和CLDN18.2×OX40雙抗分子的CLDN18.2端的親代單抗。
圖20中所示，CLDN18.2×OX40雙抗分子(PR004285)可以結合NUGC-4細胞，且結合EC50和最大螢光訊號和親代單抗非常接近。實施例 6.2 結合 HER2
本實施例測試標靶HER2的抗體與高度表現人HER2的細胞SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)的結合能力。本實施例中，陽性對照分子為抗HER2的IgG單抗trastuzumab，亦為HER2×4-1BB雙抗分子的HER2端的親代單抗。
圖13中所示，HER2×4-1BB雙抗分子(PR002827)可以結合SK-BR-3細胞，且結合能力甚至略優於親代單抗。實施例 6.3 結合 B7H4
本實施例測試標靶B7H4的抗體與高度表現人B7H4的細胞SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)的結合能力。B7H4×4-1BB雙抗分子和B7H4×OX40雙抗分子的B7H4端的親代單抗是抗B7H4的IgG單抗PR002408或PR002410。
圖12中所示，B7H4×4-1BB雙抗分子都可以結合SK-BR-3細胞。
圖12的(A)中所示，IgG-VH四價對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子(PR003334, PR003335, PR003338)都可以結合SK-BR-3，且結合能力相當。
圖12的(B-C)中所示，IgG-VH(2)六價對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子(PR003487, PR004158)都可以結合SK-BR-3。
圖12的(D)中所示，Fab-HCAb對稱結構的B7H4×4-1BB (PR004279)的結合能力略優於VH-IgG_HC結構(PR004278)。
圖12的(E)中所示，Fab-HCAb對稱結構的B7H4×4-1BB雙抗分子，無論是如實施例1.1.3所述的結構(3)的分子(PR005189)還是如實施例1.1.4所述的結構(4)的分子(PR007165)，都有幾乎相同的結合活性；說明將Fab的CL融合到VH_B所在的重鏈上不影響Fab端的結合活性。
圖12的(F)中所示，Fab-HCAb結構的第一連接胜肽和第二連接胜肽不會影響Fab端的結合活性，例如PR005649使用H1_15序列作為第一連接胜肽和人IgG2樞紐序列作為第二連接胜肽，而PR005650的第一連接胜肽長度為0且第二連接胜肽為人IgG1樞紐(C220S)的序列。
圖12的(F)中所示，Fab-VH-Fc-VH六價對稱結構的雙抗分子(PR005650, PR005651)都可以結合SK-BR-3。
圖17中所示，無論何種結構的B7H4×OX40雙抗分子，如結構(1)的分子(PR004276)、結構(3)的分子(PR004277, PR007167)和結構(4)的分子(PR007166)，其結合B7H4的能力都與親代單抗PR002408的相當。實施例 6.4 結合 PD-L1
本實施例測試標靶PD-L1的抗體與高度表現人PD-L1的CHO-K1細胞株CHO-K1/hPD-L1 (南京金斯瑞，M00543)的結合能力。本實施例中，陽性對照分子為抗PD-L1的IgG單抗PR000265，亦為PD-L1×4-1BB雙抗分子和PD-L1×OX40雙抗分子的PD-L1端的親代單抗。
圖11中所示，PD-L1×4-1BB雙抗分子都可以結合CHO-K1/hPD-L1細胞。
圖11的(A)中所示，IgG-VH四價對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)結合PD-L1的能力與親代單抗PR000265的相似，而且其結合PD-L1的EC50值和MFI最大值略優於FIT-Ig結構的雙抗分子(PR000701, PR003052)。
圖11的(B)中所示，Fab-HCAb對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR004270)結合PD-L1的能力與親代單抗相似，結合的MFI最大值比親代單抗更高。
圖11的(C)中所示，Fab-HCAb對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子，無論是如實施例1.1.3所述的結構(3)的分子(PR007164)還是如實施例1.1.4所述的結構(4)的分子(PR007163)，都有幾乎相同的PD-L1結合活性；說明將Fab的CL融合到VH_B所在的重鏈上不影響Fab端的結合活性。
圖16中所示，PD-L1×OX40雙抗分子(PR003789)可以結合CHO-K1/hPD-L1細胞，且結合EC50和最大螢光訊號和親代單抗的幾乎相同。實施例 6.5 結合 EPCAM
本實施例測試標靶EPCAM的抗體與高度表現人EPCAM的細胞Capan-2 (ATCC, HTB-80)的結合能力。本實施例中，陽性對照分子為抗EPCAM的IgG單抗PR001081，亦為EPCAM×4-1BB雙抗分子和EPCAM×OX40雙抗分子的EPCAM端的親代單抗。
圖14中所示，EPCAM×4-1BB雙抗分子(PR003552, PR003553, PR003554)都可以結合Capan-2細胞，且結合EC50和最大螢光訊號和親代單抗的幾乎一致。
圖18中所示，EPCAM×OX40雙抗分子(PR004283)可以結合Capan-2細胞，且結合EC50和最大螢光訊號和親代單抗非常接近。實施例 6.6 結合 PSMA
本實施例測試標靶PSMA的抗體與高度表現人PSMA的細胞LNCaP (南京科佰生物，CBP60364)的結合能力。本實施例中，陽性對照分子為抗PSMA的IgG單抗PR001331，亦為PSMA×4-1BB雙抗分子和PSMA×OX40雙抗分子的PSMA端的親代單抗。
圖15中所示，PSMA×4-1BB雙抗分子(PR003555, PR003556, PR003557)都可以結合LNCaP細胞，且結合EC50和最大螢光訊號和親代單抗的幾乎一致。
圖19中所示，PSMA×OX40雙抗分子(PR004284)可以結合LNCaP細胞，且結合EC50和最大螢光訊號和親代單抗非常接近。實施例 7 標靶細胞媒介的 T 細胞的特異性活化
本實施例是為了研究標靶T細胞表面共刺激分子的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白在標靶細胞的存下，透過結合共刺激分子來活化T細胞的活性。
本實施例中，免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白可以是標靶4-1BB的雙抗分子，也可以是標靶OX40的雙抗分子。標靶細胞是表現特定抗原(例如腫瘤抗原)的細胞，例如高度表現人PD-L1的CHO-K1/hPD-L1 (南京金斯瑞，M00543)，或者高度表現人PD-L1的MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26)，或者高度表現人B7H4的SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)，或者高度表現人B7H4的CHO-K1/hB7H4 (和鉑醫藥自製)，或者高度表現人HER2的SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)，或者高度表現人PSMA的LNCaP (南京科佰生物，CBP60364)，或者高度表現人PSMA的HEK293/hPSMA (和鉑醫藥自製)，或者高度表現人EPCAM的Capan-2 (ATCC, HTB-80)，或者高度表現人CLDN18.2的NUGC4 (JCRB, JCRB0834)。效應細胞可以是分離的人PBMC或者T細胞。
具體的，首先以100 µL/孔將0.3 µg/mL抗CD3抗體OKT3 (Thermo, #16-0037-81)塗覆於96孔盤(Corning, #3599)。接著，將人T細胞(從人PBMC中用T細胞分選套組(Miltenyi, #130-096-535)分離得到)的密度調整為2x106 細胞/mL，將標靶細胞的密度調整為3x105 細胞/mL，隨後把兩種細胞懸浮液各以50 µL/孔接種於96孔盤。然後，以100 µL/孔加入不同濃度的結合蛋白，兩個複孔加樣；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)和hIgG4 iso (CrownBio, #C0045)作為對照。將96孔盤置於37℃，5% CO2 培養箱中培育3天。分別收集培養48小時後和72小時後的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測48小時後的上清液中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測72小時後的上清液中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。
應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析。實施例 7.1   CLDN18.2 標靶媒介的 T 細胞活化
圖21中所示，在高度表現CLDN18.2的NUGC-4細胞存在時，CLDN18.2×4-1BB雙抗分子(PR003562, PR003563, PR003564)可以活化T細胞和促進細胞激素IL-2的產生，並呈現抗體濃度梯度依賴。
圖22中所示，在NUGC-4細胞存在時，抗OX40的HCAb單抗PR002067和抗CLDN18.2的IgG單抗PR002726都不能活化T細胞。CLDN18.2×OX40雙抗分子PR004285可以活化T細胞和促進細胞激素IL-2的產生。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。實施例 7.2   PSMA 標靶媒介的 T 細胞活化
圖23中所示，在高度表現PSMA的LNCaP細胞存在時，PSMA×4-1BB雙抗分子(PR003555, PR003556, PR003557)比Urelumab有更強T細胞活化能力，能更好地促進IL-2的產生。
圖24中所示，在高度表現PSMA的HEK293/hPSMA細胞存在時，抗OX40的HCAb單抗PR002067和抗PSMA的IgG單抗PR001331都不能活化T細胞。PSMA×OX40雙抗分子PR004284可以活化T細胞和促進細胞激素IL-2的產生。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。實施例 7.3   EPCAM 標靶媒介的 T 細胞活化
圖25中所示，在高度表現EPCAM的Capan-2細胞存在時，EPCAM×4-1BB雙抗分子(PR003552, PR003553, PR003554)比Urelumab有更強T細胞活化能力，能更好地促進IL-2的產生。
圖26中所示，在Capan-2細胞存在時，抗OX40的HCAb單抗PR002067和抗EPCAM的IgG單抗PR001081都不能活化T細胞。EPCAM×OX40雙抗分子PR004283可以活化T細胞和促進細胞激素IL-2的產生。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。實施例 7.4   PD-L1 標靶媒介的 T 細胞活化
圖27中所示，在高度表現PD-L1的細胞CHO-K1/hPD-L1和T細胞混合的系統中，不依賴於交聯的抗4-1BB單抗Urelumab可以活化T細胞釋放IFN-γ，而依賴於交聯的抗4-1BB單抗(PR000448, PR001758, PR001760, PR001836)則幾乎不能活化T細胞。FIT-Ig結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR003052, PR000701)和IgG-VH四價對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)和Fab-HCAb結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR004270)都能夠活化T細胞並釋放細胞激素。這說明PD-L1×4-1BB對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的特異性的活化。而且IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力，且優於Urelumab。
圖28中所示，在高度表現PD-L1的標靶細胞MDA-MB-231存在時，IgG-VH四價對稱結構的PD-L1×4-1BB雙抗分子(PR003549)比Urelumab有更強T細胞活化能力，能更好地促進細胞激素IL-2的產生，並呈現抗體濃度梯度依賴。
圖29中所示，在高度表現PD-L1的標靶細胞MDA-MB-231存在時，抗OX40的HCAb單抗PR002067和抗PD-L1的IgG單抗PR000265都不能活化T細胞。PD-L1×OX40雙抗分子PR003789可以活化T細胞和促進細胞激素IL-2的產生。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。實施例 7.5   HER2 標靶媒介的 T 細胞活化
圖30中所示，在高度表現HER2的SK-BR-3細胞存在時，HER2×4-1BB雙抗分子(PR002827)可以活化T細胞和促進細胞激素IFN-γ的產生，並呈現抗體濃度梯度依賴。實施例 7.6   B7H4 標靶媒介的 T 細胞活化
本實施例是為了研究標靶B7H4的B7H4×4-1BB或B7H4×OX40雙抗分子在標靶細胞的存在時活化T細胞的能力。標靶細胞可以是不同程度表現B7H4的細胞，例如高度表現B7H4的SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)，或者高度表現B7H4的CHO-K1/hB7H4 (和鉑醫藥自製)，或者不表現B7H4的JIMT-1 (DSMZ, ACC 589)。
圖31中所示，在高度表現B7H4的CHO-K1/hB7H4細胞存在時，抗OX40的HCAb單抗PR002067和抗B7H4的IgG單抗PR002408都不能活化T細胞；B7H4×OX40雙抗分子PR004276 (IgG-VH結構)和PR004277 (Fab-HCAb結構)可以活化T細胞和促進細胞激素IL-2的產生。這說明雙抗分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。
圖32中所示，在高度表現B7H4的SK-BR-3細胞存在時，B7H4×4-1BB雙抗分子比Urelumab有更強T細胞活化能力，能更好地促進IL-2的產生。
圖32的(A-B)中所示，IgG-VH四價對稱結構的雙抗(PR003334, PR003335, PR003338)活化T細胞的能力比Urelumab略強。
圖32的(C-D)中所示，IgG-VH(2)六價對稱結構的雙抗(PR003487, PR004158)活化T細胞的能力明顯強於IgG-VH四價的雙抗和Urelumab。
圖32的(E)中所示，Fab-HCAb對稱結構的雙抗分子PR004279活化T細胞的能力比Urelumab略強；當4-1BB結合結構域VH在IgG重鏈的C端時，IgG-VH結構的雙抗分子PR003335可以活化T細胞；而當4-1BB結合結構域VH在IgG重鏈的N端時，VH-IgG結構的雙抗分子PR004278幾乎不能活化T細胞，儘管其可以結合4-1BB(圖3 (D))。
圖32的(F)中所示，Fab-VH-Fc-VH六價對稱結構的雙抗(PR005650, PR005651)可以活化T細胞。
這說明了，標靶4-1BB的結合結構域處於Fab和Fc之間的時候(如Fab-HCAb結構，特別是實施例1.1.3和圖1(3)所述結構)，或者處於Fc的C端的時候(如IgG-VH結構，特別是實施例1.1.1 和圖1 (1)所述結構)，其雙抗分子具有交聯4-1BB並進一步活化T細胞的能力；而當4-1BB的結合結構域處於Fab的N端的時候(如VH-IgG結構，特別是實施例1.1.7和圖1 (7)所述結構)，雙抗分子儘管可以結合4-1BB但是不能活化T細胞。
另一方面，圖33顯示了B7H4×4-1BB對T細胞活化是特異性依賴B7H4的表現。圖33 (A)中所示，在高度表現B7H4的細胞SK-BR-3存在時，雙抗分子PR003334可以活化T細胞；圖33 (B)中所示，在不表現B7H4的細胞JIMT-1存在時，PR003334不能活化T細胞。然而，Urelumab則沒有標的特異性，即使沒有B7H4的表現，也可以活化T細胞。實施例 8 混合淋巴細胞反應 (MLR)
本實施例是利用混合淋巴細胞反應(MLR)來研究PD-L1×4-1BB雙抗分子對T細胞的活化作用。
第一步，利用CD14磁珠(Meltenyi, #130-050-201)從第一供體PBMC細胞(妙通生物)中分離單核細胞(monocytes)；具體操作參照相關套組說明書。然後加入50 ng/mL重組人源IL-4 (PeproTech, #200-02-A) 和100 ng/mL重組人源GM-CSF (PeproTech, #300-03-A)，於37℃誘導7天後，獲得未成熟的樹突狀細胞(iDC細胞)。繼續加入1 μg/ml的脂多糖Lipopolysaccharide (LPS, Sigma, #L6529)，誘導24小時後，獲得成熟的樹突狀細胞(mDC細胞)。第二步，利用T細胞分離套組(Meltenyi, #130-096-535)從第二供體PBMC細胞(妙通生物)中分離得到T淋巴細胞。第三步，將獲得的T細胞和mDC細胞按5：1比例接種至96孔盤(1×105 /孔的T細胞和2×104 /孔的mDC細胞)。隨後以50 µL/孔加入不同濃度的結合蛋白，抗體終濃度可以是(10 nM, 1 nM)，或者是從最高終濃度為50 nM按照3倍濃度梯度稀釋的共8個濃度，兩個複孔加載樣品；hIgG1 iso (CrownBio, #C0001)或者空白孔作為對照。於37℃，5% CO2 培養箱培育5天。第四步，分別收集第3天和第5天的上清液，用IL-2 ELISA套組(Thermo, #88-7025-88)檢測第3天的上清液中IL-2濃度，用IFN-γ ELISA套組(Thermo, #88-7316-77)檢測第5天的上清液中IFN-γ濃度。ELISA檢測方法參照相關套組操作說明。
圖34顯示了採用不同的供體PBMC的兩次獨立的MLR實驗。在這兩次MLR實驗中，抗4-1BB單抗Urelumab對T細胞的活化作用有限，產生細胞激素的能力很弱；抗PD-L1單抗PR000265有較明顯的活化作用；而PD-L1×4-1BB雙抗分子可以進一步提高T細胞的功能。
在第一個MLR實驗中(圖34，A-B)，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550, PR003551)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力；而且雙抗分子優於PD-L1單抗。
在第二個MLR實驗中(圖34，C-D)，IgG-VH四價對稱結構的雙抗分子(PR003549, PR003550)和Fab-HCAb結構的雙抗分子(PR004270)比FIT-Ig結構的雙抗分子(PR003052, PR000701)能夠引起更高的細胞激素釋放位準，顯示出更強的T細胞活化能力；而且雙抗分子優於PD-L1單抗。實施例 9 藥代動力學研究
本實施例研究了具有不同結構的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子在小鼠體內的藥代動力學性能。
給藥和採血：對於每一個測試結合蛋白分子，選取體重18~22克的雌性BALB/c或者C57BL/6小鼠6隻，按5 mg/kg的劑量透過靜脈注射給與測試結合蛋白分子。一組3隻於給藥前以及給藥後15分鐘、24小時(1天)、第4天、和第10天採集全血，另一組3隻於只於給藥前以及給藥後5小時、第2天、第7天、和第14天採集全血。將全血靜置30分鐘使其凝固，隨後離心並將分離的血清樣品在-80℃下凍存直至分析。
分析方法：採用兩種ELISA方法來定量測定小鼠血清中的藥物濃度。ELISA方法一，即Fc端檢測方法，透過塗覆於96孔盤的山羊抗人Fc多株抗體來捕捉小鼠血清中的含有人Fc的抗體，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。ELISA方法二，即功能結構域檢測方法，透過塗覆於96孔盤的抗原蛋白來捕捉小鼠血清中的特異辨識抗原的抗體，然後加入HRP標記的山羊抗人Fc第二抗體來檢測。例如，在本實施例中，使用人PD-L1蛋白來捕捉雙抗分子PR004270；或使用人4-1BB蛋白來捕捉雙抗分子PR003334和PR003335。使用Phoenix WinNonlin軟體8.2版，選用非房室模型(NCA)分析藥代動力學參數。
圖35和表13中所示，Fab-HCAb結構的雙抗分子PR004270有與常規IgG抗體相似的血清半衰期t1/2 值，PD-L1端檢測方法顯示其t1/2 值超過10天。IgG-VH結構的雙抗分子PR003334和PR003335有與常規IgG抗體相似的藥代動力學：在Fc端檢測方法下，PR003334和PR003335在小鼠體內的血清半衰期t1/2 值分別約為8天和14天；在4-1BB端檢測方法下，PR003334和PR003335在小鼠體內的血清半衰期t1/2 值分別約為9天和12天。 表 13 雙抗分子在小鼠體內的藥代動力學參數
雙抗分子 PR003334 PR003335 PR004270
動物(數量) C57BL/6小鼠(n=6) C57BL/6小鼠(n=6) BALB/c小鼠(n=6)
抗體劑量 5 mg/kg, I.V. 5 mg/kg, I.V. 5 mg/kg, I.V.
PK參數 Fc端檢測 4-1BB端檢測 Fc端檢測 4-1BB端檢測 Fc端檢測 PD-L1端檢測
T1/2 (hour) 193 218 336 295 465.6 256.5
Vd (mL/kg) 76 89 81 81 75.7 83.9
AUC (µg*hour/mL) 12,680 11,471 14,813 14,286 17,536 13,126
Cl (mL/hour/kg) 0.28 0.28 0.17 0.19 0.11 0.23
C0 (µg/mL) 111 114 123 124 119.7 81.7
實施例 10 雙抗分子的抗腫瘤藥效
本實施例研究了B7H4×4-1BB雙抗分子PR003334在BALB/c-hCD137/CT26-hB7H4小鼠腫瘤模型中的抗腫瘤藥效。
實施方法如下：選用6-8周雌性BALB/c-hCD137小鼠(將BALB/c小鼠引入外源人4-1BB基因轉殖，集萃藥康生物科技)，然後將處於對數生長期的CT26-hB7H4腫瘤細胞(將小鼠結腸癌細胞CT26引入外源人B7H4基因轉殖，和鉑醫藥)以5×105 細胞/鼠的劑量接種於實驗小鼠腋右側背部皮下。當平均腫瘤體積達到80 mm3 時對小鼠進行隨機分組，每組6隻小鼠。分組當天，將特定濃度經PBS稀釋的藥物以腹腔注射(i.p.)、每週給藥2次總共給藥6次(BIW*3)的方式進行給藥，以PBS為空白對照組。在初次給藥當天及之後第4、7、11、14和18天對腫瘤體積和小鼠體重進行測量。腫瘤大小計算公式：腫瘤體積(mm3 )=0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑2 )。實驗結束後將荷瘤小鼠安樂死並剝瘤稱重。計算各組小鼠的腫瘤體積、小鼠體重等實驗結果以平均值±標準誤差(Mean±SEM)表示。多組比較採用單因子變異數分析(one way ANOVA)檢驗方法比較不同治療組與對照組相比有無顯著性差異。
本實施例中，抗4-1BB的單抗Urelumab為陽性對照分子。雙抗分子PR003334的6 mpk (mg/kg)劑量與Urelumab的5 mpk劑量為同莫耳濃度(根據分子量換算)的對等劑量；雙抗分子PR003334的18 mpk劑量與Urelumab的15 mpk劑量為同莫耳濃度的對等劑量。10 mpk的抗小鼠PD-1抗體(Bio X Cell, clone RMP1-14, #BE0146)也作為對照分子。PBS為空白對照組。
圖36中所示，雙抗分子PR003334和Urelumab在各劑量組都有抑制腫瘤生長的藥效且優於PD-1抗體(A)。受試各組小鼠體重變化均在正常範圍內(B)。實施例 11 利用 UNcle 測試雙抗分子的穩定性和理化特性
本實施例利用實施例2.3所述方法測試B7H4×4-1BB雙抗分子(PR003334, PR003335, PR003338)的分子穩定性等理化特徵。如表14中所示，這些雙抗分子有良好的穩定性。 表14 雙抗分子在UNcle中的測試參數
PR003334 PR003335 PR003338
Tm (℃) 60.32 65.59 62.17
Tagg (℃) at 266 nm 52.00 50.39 54.14
Tagg (℃) at 473 nm / / /
Initial SLS at 266 nm (counts x104 ) 0.26 0.22 0.20
Max SLS at 266 nm (counts x104 ) 1.00 0.40 0.34
Initial SLS at 473 nm (counts) ＜ 0 ＜ 0 ＜ 0
Max SLS at 473 nm (counts) ＜ 0 ＜ 0 ＜ 0
Initial diameter (nm) (25℃) 16.22 16.38 11.74
Final diameter (nm) (95℃) 23.85 17.51 16.52
Initial PDI 0.267 0.229 0.043
Final PDI 0.089 0.194 0.185
實施例 12 總結
本申請建構了數個免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子，其一端可以結合免疫細胞表面的共刺激分子(如4-1BB、OX40等)，其另一端可以結合腫瘤細胞表面的特異性抗原分子(如HER2、PSMA、EPCAM、CLDN18.2、B7H4等)或免疫細胞表面的共抑制分子(如PD-L1等)。這些雙抗分子可以將免疫細胞和腫瘤細胞拉近在一起，高效地有選擇性地活化腫瘤微環境中的免疫細胞，並減少周邊免疫細胞的非特異性活化帶來的毒副作用。雙抗分子利用標靶細胞抗原媒介的共刺激分子的交聯以及下游訊息傳遞途徑的活化，進而促進免疫細胞的活化和增殖，提高其毒殺腫瘤的效力。
本申請建構了數個不同結構的免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子。其中IgG-VH對稱結構(特別是實施例1.1.1和圖1 (1)所述結構)和Fab-HCAb對稱結構(特別是實施例1.1.3和圖1 (3)所述結構)體現出優秀的通用性和成藥性，在多個不同標的組合的雙抗分子上，都顯示出優秀的生物學活性、分子穩定性和藥學性能。
在一些實施例顯示了，免疫細胞銜接器雙特異性結合蛋白分子對T細胞的活化是依賴於標靶細胞的。如在實施例7.6和圖33中所體現的，在高度表現B7H4的細胞SK-BR-3存在時，B7H4×4-1BB雙抗分子可以特異地活化T細胞釋放IL-2；但是，在不表現B7H4的細胞JIMT-1存在時，B7H4×4-1BB雙抗分子不能活化T細胞。Urelumab則沒有標的特異性，即使沒有B7H4的表現，也可以活化T細胞。這可以說明B7H4×4-1BB雙抗分子比Urelumab有更好的安全性。
在一些實施例顯示了，增加標靶免疫細胞共刺激分子(例如4-1BB)的抗原結合片段(效應域)的數目可以顯著地提高雙抗分子的活化免疫細胞的能力，如IgG-VH(2)對稱結構(特別是實施例1.1.2和圖1 (2)所述結構)的雙抗分子在實施例7.6和圖32 (C-D)中所體現的強力的T細胞活化能力。
在一些實施例顯示了，標靶免疫細胞共刺激分子(例如4-1BB)的抗原結合片段(效應域)相對於標靶腫瘤細胞的抗原結合片段(標靶域)的位置和距離對雙抗分子的功能活性是至關重要的。如在實施例7.6和圖32 (E)中所體現的，當標靶4-1BB的結合結構域處於Fab和Fc之間的時候(如Fab-HCAb結構，特別是實施例1.1.3和圖1 (3)所述結構)，或者處於Fc的C端的時候(如IgG-VH結構，特別是實施例1.1.1和圖1 (1)所述結構)，其雙抗分子具有交聯4-1BB並進一步活化T細胞的能力；而當4-1BB的結合結構域處於Fab的N端的時候(如VH-IgG結構，特別是實施例1.1.7和圖1 (7)所述結構)，雙抗分子儘管可以結合4-1BB但是不能活化T細胞。
基於前面所述的發現，一方面可以在IgG-VH結構或者Fab-HCAb結構基礎上增加標靶免疫細胞共刺激分子的抗原結合片段VH (如圖37中黑色結構域所示)的數量來提高活化免疫細胞的能力；另一方面可以去掉Fc區來使分子更小(如圖37 (E)中VH結構域分別連在Fab的CH1的C’端和Fab的CL的C’端)。圖37列出了基於重鏈抗體或單域抗體的其他衍生的雙(多)特異性結合蛋白結構。
圖1為分子結構示意圖。 圖2顯示了PD-L1×4-1BB結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的結合活性。 圖3顯示了B7H4×4-1BB結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的結合活性。 圖4顯示了HER2×4-1BB結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的結合活性。 圖5顯示了EPCAM×4-1BB結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的結合活性。 圖6顯示了PSMA×4-1BB結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的結合活性。 圖7顯示了CLDN18.2×4-1BB結合人4-1BB細胞CHO-K1/hu 4-1BB的結合活性。 圖8顯示了抗體分子結合食蟹猴4-1BB細胞CHO-K1/cyno 4-1BB的結合活性。 圖9顯示了抗體分子結合食蟹猴OX40蛋白的結合活性。 圖10顯示了抗體分子結合人OX40細胞CHO-K1/hu OX40的結合活性。 圖11顯示了PD-L1×4-1BB結合人PD-L1細胞CHO-K1/hPD-L1的結合活性。 圖12顯示了B7H4×4-1BB結合腫瘤細胞SK-BR-3的結合活性。 圖13顯示了HER2×4-1BB結合腫瘤細胞SK-BR-3的結合活性。 圖14顯示了EPCAM×4-1BB結合腫瘤細胞Capan-2的結合活性。 圖15顯示了PSMA×4-1BB結合腫瘤細胞LNCaP的結合活性。 圖16顯示了PD-L1×OX40結合人PD-L1細胞CHO-K1/hPD-L1的結合活性。 圖17顯示了B7H4×OX40結合腫瘤細胞SK-BR-3的結合活性。 圖18顯示了EPCAM×OX40結合腫瘤細胞Capan-2的結合活性。 圖19顯示了PSMA×OX40結合腫瘤細胞LNCaP的結合活性。 圖20顯示了CLDN18.2×OX40結合腫瘤細胞NUGC-4的結合活性。 圖21顯示了CLDN18.2×4-1BB透過NUGC-4細胞媒介T細胞特異性活化。 圖22顯示了CLDN18.2×OX40透過NUGC-4細胞媒介T細胞特異性活化。 圖23顯示了PSMA×4-1BB透過LNCaP細胞媒介T細胞特異性活化。 圖24顯示了PSMA×OX40透過HEK293/hPSMA細胞媒介T細胞特異性活化。 圖25顯示了EPCAM×4-1BB透過Capan-2細胞媒介T細胞特異性活化。 圖26顯示了EPCAM×OX40透過Capan-2細胞媒介T細胞特異性活化。 圖27顯示了PD-L1×4-1BB透過CHO-K1/hPD-L1細胞媒介T細胞特異性活化。 圖28顯示了PD-L1×4-1BB透過MDA-MB-231細胞媒介T細胞特異性活化。 圖29顯示了PD-L1×OX40透過MDA-MB-231細胞媒介T細胞特異性活化。 圖30顯示了HER2×4-1BB透過SK-BR-3細胞媒介T細胞特異性活化。 圖31顯示了B7H4×OX40透過CHO-K1/hB7H4細胞媒介T細胞特異性活化。 圖32顯示了B7H4×4-1BB透過SK-BR-3細胞媒介T細胞特異性活化。 圖33顯示了B7H4×4-1BB對T細胞活化特異性依賴B7H4的表現：(A)在高度表現B7H4的細胞SK-BR-3存在時，B7H4×4-1BB可以活化T細胞；(B)在不表現B7H4的細胞JIMT-1存在時，B7H4×4-1BB不能活化T細胞。 圖34顯示了PD-L1×4-1BB在混合淋巴細胞反應(MLR)實驗中活化T細胞：第一個MLR實驗中測定的第5天的IFNγ位準(A)和第3天的IL-2位準(B)；第二個MLR實驗中測定的第5天的IFNγ位準(C)和第3天的IL-2位準(D)。 圖35顯示了雙抗分子在小鼠體內的藥代動力學。 圖36顯示了B7H4×4-1BB在BALB/c hCD137-KI CT26-hB7H4腫瘤小鼠模型中的抗腫瘤效果。 圖37為其他分子結構示意圖。 圖38為標靶域和效應域的組合示意圖。

Claims (17)

  1. 一種至少含有兩個蛋白功能區的結合蛋白，其包括第一蛋白功能區和第二蛋白功能區；所述第一蛋白功能區包括結合標靶細胞上的抗原的標靶域，所述第二蛋白功能區包括結合免疫效應細胞上的抗原的效應域； 所述的結合蛋白選自以下結構： (I)所述第一蛋白功能區為Fab結構，所述第二蛋白功能區為VH結構，所述結合蛋白從N末端至C末端為第一蛋白功能區和第二蛋白功能區； (II)所述第一蛋白功能區為Fab結構，所述第二蛋白功能區為Fab結構，所述結合蛋白從N末端至C末端為第一蛋白功能區和第二蛋白功能區； 較佳地，所述結合蛋白為(a)單體結構，或(b)由兩個單體組成的二聚體結構。
  2. 如請求項1所述的結合蛋白，其中， 所述(a)的單體結構中，所述結合蛋白具有兩個第二蛋白功能區，其中一個第二蛋白功能區連接於所述第一蛋白功能區的Fab結構的重鏈CH1的C末端，另一個第二蛋白功能區連接於所述第一蛋白功能區的Fab結構的輕鏈CL的C末端； 所述(b)的二聚體結構中，所述結合蛋白還包括Fc； 較佳地，所述Fc位於所述第一蛋白功能區和所述第二蛋白功能區之間；或，所述Fc位於所述第二蛋白功能區的C末端；或，所述Fc位於兩個所述第二蛋白功能區之間； 更佳地，每個單體中，所述第一蛋白功能區的數量為1個，所述Fc的數量為1個，所述第二蛋白功能區的數量為1個或多個例如為1、2或3個； 進一步更佳地，所述結合蛋白還包括第三蛋白功能區，其中所述第三蛋白功能區位於所述結合蛋白C或N末端，或者結合蛋白中Fc結構的C或N末端； 進一步更佳地，所述第三蛋白功能區的數量為1個或多個，例如為1、2或3個。
  3. 如請求項1或2所述的結合蛋白，其特徵在於， 所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L-VH_B-C’所示，所述的L為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS； 或，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-h-CH2-CH3-L1-VH_B-L2- VH_B -C’所示，所述的L1和L2為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS； 或，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VH_A-CH1-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-C’所示，所述的L1和L2為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示； 或，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-C’所示，所述的L1和L2為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示； 或，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VH_A-CH1-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VL_A-CL-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-L3-VH_B-C’所示，所述的L1、L2和L3為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示； 或，所述結合蛋白包含多肽鏈1和多肽鏈2，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-L1-VH_B-L2-CH2-CH3-L3-VH_B -C’所示，所述的L1、L2和L3為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NOs：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS，所述L2的胺基酸序列進一步優選如SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：263所示； 或，所述結合蛋白包含多肽鏈1、多肽鏈2和多肽鏈3，所述多肽鏈1如式：N’-VL_A-CL-L-VH_B-CH1-h-CH2-CH3-C’所示，所述多肽鏈2如式：N’-VH_A-CH1-C’所示，所述多肽鏈3如式：N’-VL_B-CL-C’所示，所述的L為連接胜肽，其長度優選為0或其胺基酸序列優選如SEQ ID NO：244-265任一所示、或其胺基酸序列為GS； 其中，所述的VL_B和/或VH_B分別為所述第二蛋白功能區的VL和/或VH，所述的VL_A和/或VH_A分別為所述第一蛋白功能區的VL和/或VH；所述的h為樞紐區；所述的CL是輕鏈恆定區結構域；所述的CH1、CH2和CH3分別是重鏈恆定區的第一、第二和第三結構域；所述的L或L1或L2或L3為連接胜肽。
  4. 如請求項1-3任一項所述的結合蛋白，其特徵在於，所述標靶細胞上的抗原為腫瘤抗原和/或共抑制分子抗原； 其中，所述腫瘤抗原為CD19、BCMA、TSHR、CD171、CS-1、CLL-1、GD3、Tn Ag、FLT3、CD38、CD123、CD44v6、B7H3、B7H4、KIT、IL-13Ra2、IL-11Ra、PSCA、PSMA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-beta、SSEA-4、MUC1、EGFR、NCAM、CAIX、LMP2、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、GD2、FOLR1、FOLR2、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TAARP、WT1、ETV6-AML、SPA17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、FOSL1、hTERT、ML-IAP、ERG、NA17、PAX3、AR、細胞週期蛋白B1、MYCN、RhoC、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD20、CD30、HER2、ROR1、FLT3、TAAG72、CD22、CD33、GD2、gp100Tn、FAP、酪胺酸酶、EPCAM、CEA、IGF-1R、EphB2、間皮素、鈣黏蛋白17、CD32b、EGFRvIII、GPNMB、GPR64、HER3、LRP6、LYPD8、NKG2D、SLC34A2、SLC39A6、SLITRK6、GUCY2C或TACSTD2；優選為B7H3、B7H4、PSMA、CLDN18.2、GPC3、HER2、ROR1、CD22、EPCAM、間皮素、EGFRvIII或TACSTD2； 和/或，所述共抑制分子抗原為PD-L1、PD-L2、CTLA4、B7H3、B7H4、VISTA、HHLA2或CD155，優選為PD-L1、B7H3、B7H4或HHLA2； 和/或，所述免疫效應細胞上的抗原為刺激型抗原或共刺激分子抗原，例如為TCR/CD3、CD28、4-1BB、OX40、GITR、CD27、ICOS、CD2、CD40、CD226、CD16、NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D或2B4，優選為TCR/CD3、CD28、4-1BB、OX40、GITR、CD40、CD226、CD16或NKp30； 較佳地： 所述標靶細胞上的抗原為CLDN18.2、HER2、B7H4、EPCAM、PSMA或PD-L1；和/或，所述免疫效應細胞上的抗原為4-1BB或OX40。
  5. 如請求項1-4任一項所述的結合蛋白，其特徵在於，所述第一蛋白功能區為標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段、標靶HER2的抗體或其抗原結合片段、標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段、標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段、標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段、和/或標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段； 所述第二蛋白功能區為標靶OX40的抗體或其抗原結合片段、或標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段； 較佳地： 所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：22所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：55所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：88所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：142所示的VL CDR3； 所述的標靶HER2的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：13所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：42所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：77所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：105所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：117所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：134所示的VL CDR3； 所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：11所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：40所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：75所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：103所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：117所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：132所示的VL CDR3；或者，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3； 所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：20所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：53所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：86所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：110所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：140所示的VL CDR3；或者，所述VH含有序列如SEQ ID NO：21所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：54所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：87所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：111所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：141所示的VL CDR3； 所述的標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：47所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：81所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：138所示的VL CDR3； 所述的標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：17所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：48所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：82所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：109所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：122所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：139所示的VL CDR3； 所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3；或者，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3；或者，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3；或者，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：57所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：90所示的VH CDR3； 或者，所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：12所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：41所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：76所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：104所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：133所示的VL CDR3；或者，含有序列如SEQ ID NO：12所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：44所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：76所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：104所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：133所示的VL CDR3； 所述的標靶OX40的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3； 更佳地： 所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：165所示的VH和序列如SEQ ID NO：179所示的VL； 所述的標靶HER2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：152所示的VH和序列如SEQ ID NO：170所示的VL； 所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：150所示的VH和序列如SEQ ID NO：168所示的VL；或者含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH和序列如SEQ ID NO：171所示的VL； 所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：163所示的VH和序列如SEQ ID NO：177所示的VL；或者含有序列如SEQ ID NO：164所示的VH和序列如SEQ ID NO：178所示的VL； 所述的標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：157所示的VH和序列如SEQ ID NO：175所示的VL； 所述的標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：158所示的VH和序列如SEQ ID NO：176所示的VL； 所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH；或者，含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH；或者，含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH；或者，含有序列如SEQ ID NO：167所示的VH；或者，含有序列如SEQ ID NO：151所示的VH和序列如SEQ ID NO：169所示的VL；或者，含有序列如SEQ ID NO：154所示的VH和序列如SEQ ID NO：172所示的VL； 所述的標靶OX40的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH； 進一步更佳地： 所述的標靶CLDN18.2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：196所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：210所示的輕鏈； 所述的標靶HER2的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：183所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：201所示的輕鏈； 所述的標靶PD-L1的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：181所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：199所示的輕鏈；或者含有序列如SEQ ID NO：184所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：202所示的輕鏈； 所述的標靶B7H4的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：194所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：208所示的輕鏈；或者含有序列如SEQ ID NO：195所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：209所示的輕鏈； 所述的標靶EPCAM的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：188所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：206所示的輕鏈； 所述的標靶PSMA的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：189所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：207所示的輕鏈； 所述的標靶4-1BB的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：190所示的重鏈；或者，含有序列如SEQ ID NO：191所示的重鏈；或者，含有序列如SEQ ID NO：192所示的重鏈；或者，含有序列如SEQ ID NO：198所示的重鏈；或者，含有序列如SEQ ID NO：182所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：200所示的輕鏈；或者，含有序列如SEQ ID NO：185所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：203所示的輕鏈； 所述的標靶OX40的抗體或其抗原結合片段含有序列如SEQ ID NO：193所示的重鏈。
  6. 如請求項1-5任一項所述的結合蛋白，其特徵在於， 所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：13所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：42所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：77所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：105所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：117所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：134所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：20所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：53所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：86所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：110所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：140所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO: 20所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：53所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：86所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：110所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：140所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：20所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：53所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：86所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：110所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：140所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：57所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：90所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：47所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：81所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：138所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：47所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：81所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：138所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：47所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：81所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：138所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：17所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：48所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：82所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：109所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：122所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：139所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：17所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：48所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：82所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：109所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：122所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：139所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：17所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：48所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：82所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：109所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：122所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：139所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：22所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：55所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：88所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：142所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：49所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：83所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：22所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：55所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：88所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：142所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：22所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：55所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：88所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：142所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：19所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：51所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：20所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：53所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：86所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：110所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：140所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：16所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：47所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：81所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：138所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：17所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：48所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：82所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：109所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：122所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：139所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：22所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：55所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：88所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：108所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：121所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：142所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：52所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：85所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：21所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：54所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：87所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：111所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：141所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：18所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：50所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：84所示的VH CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：14所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：43所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：78所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：106所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：119所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：135所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：12所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：41所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：76所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：104所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：133所示的VL CDR3； 或，所述第一蛋白功能區包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：11所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：40所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：75所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：103所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：117所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：132所示的VL CDR3；所述第二蛋白功能區含有序列包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，所述VH含有序列如SEQ ID NO：12所示的VH CDR1、序列如SEQ ID NO：44所示的VH CDR2和序列如SEQ ID NO：76所示的VH CDR3，所述VL含有如SEQ ID NO：104所示的VL CDR1、序列如SEQ ID NO：118所示的VL CDR2和序列如SEQ ID NO：133所示的VL CDR3； 較佳地： 所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：152所示的VH以及如SEQ ID NO：170所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：163所示的VH以及如SEQ ID NO：177所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：163所示的VH以及如SEQ ID NO：177所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：163所示的VH以及如SEQ ID NO：177所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：167所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH以及如SEQ ID NO：171所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH以及如SEQ ID NO：171所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH以及如SEQ ID NO：171所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：157所示的VH以及如SEQ ID NO：175所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：157所示的VH以及如SEQ ID NO：175所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：157所示的VH以及如SEQ ID NO：175所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：158所示的VH以及如SEQ ID NO：176所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：158所示的VH以及如SEQ ID NO：176所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：158所示的VH以及如SEQ ID NO：176所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：165所示的VH以及如SEQ ID NO：179所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：159所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：165所示的VH以及如SEQ ID NO：179所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：165所示的VH以及如SEQ ID NO：179所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：161所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH以及如SEQ ID NO：171所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：163所示的VH以及如SEQ ID NO：177所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：157所示的VH以及如SEQ ID NO：175所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：158所示的VH以及如SEQ ID NO：176所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：165所示的VH以及如SEQ ID NO：179所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：162所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：164所示的VH以及如SEQ ID NO：178所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：160所示的VH； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：153所示的VH以及如SEQ ID NO：171所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：151所示的VH以及如SEQ ID NO：169所示的VL； 或，所述第一蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：150所示的VH以及如SEQ ID NO：168所示的VL；所述第二蛋白功能區含有序列如SEQ ID NO：154所示的VH以及如SEQ ID NO：172所示的VL； 更佳地，所述的結合蛋白包括以下多肽鏈： 序列如SEQ ID NO：201所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：214所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：217所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：218所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：219所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：202所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：221所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：202所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：222所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：202所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：223所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：206所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：224所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：206所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：225所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：206所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：226所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：207所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：227所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：207所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：228所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：207所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：229所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：210所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：230所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：210所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：231所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：210所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：232所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：202所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：233所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：236所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：206所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：241所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：207所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：242所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：210所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：243所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：220所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：209所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：234所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：212所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：235所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：240所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：238所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：213所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：212所示的多肽鏈2，以及序列如SEQ ID NO：203所示的多肽鏈3； 或，序列如SEQ ID NO：216所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：215所示的多肽鏈2，以及序列如SEQ ID NO：203所示的多肽鏈3； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：266所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：267所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：268所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：269所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：202所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：270所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：212所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：271所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：272所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：208所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：273所示的多肽鏈2； 或，序列如SEQ ID NO：237所示的多肽鏈1，序列如SEQ ID NO：274所示的多肽鏈2。
  7. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-6任一項所述的結合蛋白。
  8. 一種重組表現載體，其包含如請求項7所述的分離的核酸； 較佳地，所述表現載體包含真核細胞表現載體和/或原核細胞表現載體。
  9. 一種轉形株，包含如請求項7所述的分離的核酸或如請求項8所述的重組表現載體； 較佳地，所述轉形株的宿主細胞為原核細胞和/或真核細胞，所述原核細胞優選E. coli 細胞如TG1、BL21，所述真核細胞優選HEK293細胞或CHO細胞。
  10. 一種結合蛋白的製備方法，其包含培養如請求項9中所述的轉形株，從培養物中獲得結合蛋白。
  11. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含如請求項1-6中任一項所述的結合蛋白，以及任選地藥學上可接受的載劑； 較佳地，所述藥物組成物還包括其他抗腫瘤抗體作為活性成分。
  12. 一種套組，其包括如請求項1-6任一項所述的結合蛋白和/或如請求項11所述的藥物組成物； 較佳地，所述套組還包括(i)施用結合蛋白或藥物組成物的裝置；和/或(ii)使用說明。
  13. 一種套裝藥盒，其特徵在於，所述套裝藥盒包括藥盒一和藥盒二，所述藥盒一包括如請求項1-6任一項所述的結合蛋白和/或如請求項11所述的藥物組成物，所述藥盒二包括其它抗體或藥物組成物。
  14. 一種給藥裝置，其特徵在於，所述給藥裝置包括如請求項1-6任一項所述的結合蛋白和/或如請求項11所述的藥物組成物； 較佳地，所述給藥裝置還包括容納或將所述結合蛋白和/或所述藥物組成物施用於受試者的部件，例如注射器、輸液裝置或植入式給藥裝置。
  15. 一種如請求項1-6任一項所述的結合蛋白、如請求項11所述的藥物組成物、如請求項12所述的套組、如請求項13所述的套裝藥盒和/或如請求項14所述的給藥裝置在製備診斷、預防和/或治療腫瘤的藥物中的應用； 較佳地，所述腫瘤為乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤和/或結直腸癌。
  16. 一種體外或體內檢測特異性抗原的方法，其包括使用如請求項1-6任一項所述的結合蛋白進行檢測。
  17. 預防和/或治療腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如請求項1-6任一項所述的結合蛋白、如請求項11所述的藥物組成物、如請求項12所述的套組、如請求項13所述的套裝藥盒和/或如請求項14所述的給藥裝置的步驟； 較佳地，所述的腫瘤選自乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、腎癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、食道癌、子宮頸癌、頭頸部腫瘤、膽管癌、膽囊癌、膀胱癌、肉瘤、結直腸癌、淋巴瘤和多發性骨髓瘤中的一種或多種。
TW110123872A 2020-06-30 2021-06-29 免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用 TWI806087B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010630471.6 2020-06-30
CN202010630471 2020-06-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202202524A true TW202202524A (zh) 2022-01-16
TWI806087B TWI806087B (zh) 2023-06-21

Family

ID=79317489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110123872A TWI806087B (zh) 2020-06-30 2021-06-29 免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230303698A1 (zh)
EP (1) EP4174092A4 (zh)
CN (1) CN115698088A (zh)
TW (1) TWI806087B (zh)
WO (1) WO2022002038A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI833244B (zh) * 2021-06-18 2024-02-21 大陸商和鉑醫藥（上海）有限責任公司 一種雙抗組合及其應用
WO2023174521A1 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2638117A1 (en) 2006-01-25 2007-08-30 Erasmus University Medical Center Rotterdam Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
WO2010035012A1 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
KR102056963B1 (ko) 2013-12-30 2019-12-17 에피맙 바이오테라퓨틱스 인코포레이티드 Fabs-인-탠덤 면역글로불린 및 이의 용도
MA44381A (fr) * 2015-06-15 2019-01-23 Numab Innovation Ag Format d'anticorps hétérodimères multispécifiques
WO2019184909A1 (zh) * 2018-03-27 2019-10-03 信达生物制药(苏州)有限公司 新型抗体分子、其制备方法及其用途
CN111902428B (zh) * 2018-07-03 2023-11-10 上海健信生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其用途
KR20210087472A (ko) * 2018-11-01 2021-07-12 산동 뉴 타임 파마슈티칼 코., 리미티드. 이중 특이성 항체 및 그 용도
CN112646031B (zh) * 2019-10-10 2021-12-07 天境生物科技(上海)有限公司 抗4-1bb纳米抗体及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP4174092A1 (en) 2023-05-03
TWI806087B (zh) 2023-06-21
US20230303698A1 (en) 2023-09-28
WO2022002038A1 (zh) 2022-01-06
EP4174092A4 (en) 2024-03-20
CN115698088A (zh) 2023-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11643465B2 (en) Anti-PD-1 antibodies
EP4039707A1 (en) Cd3-targeting antibody, bispecific antibody and use thereof
CN117964759A (zh) 调节由细胞表达的生物活性的抗体
CN110856446A (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
CN111995685B (zh) 一种靶向her2和pd-1的双特异性抗体及其应用
CN111094348A (zh) 双特异性抗pd1-抗tim3抗体
TWI806087B (zh) 免疫細胞銜接多特異性結合蛋白及其製備和應用
CN112574308A (zh) 靶向bcma的抗体、双特异性抗体及其用途
TW202132351A (zh) 抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用
WO2023155845A1 (zh) 人源化抗cd28抗体及其与抗cd40的双特异性抗体
TWI806088B (zh) 具有H2L2與HCAb結構的結合蛋白
TWI818276B (zh) Fab-HCAb結構的結合蛋白
WO2023186113A9 (zh) 靶向pd-l1和cd40的抗原结合蛋白及其制备和应用
TWI833227B (zh) 靶向pd-l1和cd73的特異性結合蛋白及其應用
US20230134183A1 (en) Cldn18.2-targeting antibody, bispecific antibody and use thereof
WO2022267926A1 (zh) 一种抗tnfr2抗体及其制备方法和应用
WO2023011338A1 (zh) 抗CD79b×CD3双特异性抗体及其用途
WO2022184155A1 (zh) 抗ctla-4抗体及其应用