IT201900018509A1 - Aptameri e loro usi - Google Patents
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
APTAMERI E LORO USI
SETTORE DELL’INVENZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un aptamero nucleotidico in grado di legare in maniera selettiva il recettore BCMA (B-cell maturation antigen), inibendo il pathway NF-kB attivato a valle, e di internalizzare in maniera recettore-mediata, garantendo il direzionamento specifico di agenti secondari. Pertanto, l’aptamero oggetto della presente invenzione rappresenta un interessante ed innovativo strumento per la terapia mirata del mieloma multiplo (MM). Inoltre, l’aptamero trova applicazioni nell’imaging molecolare, diagnosi, terapia e direzionamento mirato di farmaci anti-tumorali.
TECNICA ANTERIORE
Il melanoma multiplo è un tumore ematologico molto aggressivo, caratterizzato da una proliferazione incontrollata di plasmacellule a livello midollare. Nonostante i numerosi progressi della ricerca abbiano migliorato in maniera significativa la sopravvivenza dei pazienti, in molti casi tale condizione resta incurabile. Infatti, i trattamenti attualmente disponibili, che includono il trapianto autologo o allogenico di cellule staminali, agenti immunomodulatori, anticorpi monoclonali (mAbs) diretti contro i recettori CD38 e SLAMF7, inibitori del proteasoma e vaccini a cellule dendritiche, mostrano efficacia solo in un numero limitato di pazienti (1,2).
Pertanto, lo sviluppo di nuovi ed efficaci approcci terapeutici per tale patologia risulta essere un obiettivo di primaria importanza.
Negli ultimi anni, diversi studi hanno dimostrato che il recettore BCMA (B-cell maturation antigen) è un marcatore importante nel MM ed un interessante bersaglio per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche (3-9). BCMA è un membro della superfamiglia dei recettori TNF, di cui fanno parte anche i recettori TACI (transmembrane activator and calcium-modulating cyclophilin ligand interactor) e BAFF-R (B-cell activating factor receptor) ad esso relati. BCMA è over-espresso sulla superficie delle plasmacellule maligne di pazienti affetti da MM ed il legame dei suoi ligandi specifici, BAFF (B-cell activating factor) e APRIL (a proliferationinducing ligand), induce l’attivazione del pathway di NF-kB, promuovendo la sopravvivenza cellulare (10,11). Il recettore BCMA è over-espresso sulla superficie delle plasmacellule maligne di mieloma multiplo e rappresenta un bersaglio terapeutico molto promettente per la terapia mirata di tale patologia.
Sono stati sviluppati mAbs diretti contro BCMA in grado di inibire l’attivazione del pathway di NF-KB e di attivare la morte immuno-mediata delle cellule neoplastiche (12, 13). Inoltre, sono stati sviluppati mAbs bispecifici BCMA/CD3 e linfociti T ingegnerizzati per esprimere in superficie l’antigene chimerico (CAR-Ts) che attualmente son in fase di valutazione in trials clinici (7, 14-20). Pertanto, il “targeting” di BCMA è un approccio attendibile per il trattamento del MM (12-14, 17, 19, 21-24). Tuttavia, le applicazioni cliniche di anticorpi monoclonali e CAR-T diretti contro BCMA sono state associate ad alcune difficoltà e problematiche legate alla sicurezza (25).
Negli ultimi decenni, gli aptameri sono emersi come efficaci strumenti diagnostici e terapeutici per numerose patologie umane (26). Gli aptameri sono piccoli oligonucleotidi a singolo filamento (ssRNA o ssDNA) in grado di legare in maniera selettiva specifici bersagli molecolari. Essi presentano numerosi vantaggi rispetto agli anticorpi monoclonali, sia per quanto concerne le applicazioni in ambito diagnostico che terapeutico. Gli aptameri sono spesso chiamati “mAbs ad acido nucleico”, data la loro capacità di riconoscere lo specifico bersaglio molecolare ripiegandosi in particolari strutture tridimensionali. Essi mostrano proprietà di riconoscimento ed affinità simili agli anticorpi monoclonali, ma sono caratterizzati da una produzione più rapida ed economica e mostrano una tossicità molto bassa. E’ noto che il sistema immunitario generalmente non produce anticorpi diretti contro gli oligonucleotidi sintetici e che la risposta immunitaria innata, mediata da recettori Toll-like, comunemente attivata da acidi nucleici non-self, non è attivata da aptameri contenenti nucleotidi modificati al 2’ (27, 28). Queste osservazioni suggeriscono un profilo di sicurezza di aptameri che merita ulteriori indagini.
Gli aptameri mostrano quindi numerosi vantaggi rispetto agli mAbs, quali la mancanza di immunogenicità, dimensioni ridotte, elevata versatilità, semplice produzione e modifica chimica che consente un importante incremento della loro stabilità e biodisponibilità. E’ stato ampiamente provato che gli aptameri, in seguito al legame al loro specifico recettore bersaglio, spesso ne inibiscono la funzione e che aptameri diretti contro recettori di superficie possono in molti casi internalizzare nelle cellule in maniera recettore-mediata. Sulla base di tali osservazioni, è evidente che gli aptameri sono uno strumento ideale per la diagnosi e per la terapia mirata di numerose patologie, consentendo tra l’altro il trasporto selettivo di agenti terapeutici (29-31).
Nonostante i numerosi progressi della ricerca, il MM ad oggi resta in molti casi incurabile. Pertanto, esiste la necessità di sviluppare nuove ed efficaci strategie.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Applicando delle modifiche al classico protocollo di cell-SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment), i presenti autori hanno generato un aptamero ad RNA in grado di legare selettivamente il recettore BCMA, di inibire il pathway NF-kB attivato a valle ed internalizzare in maniera recettore-mediata nelle cellule over-esprimenti il recettore, garantendo il direzionamento specifico di agenti secondari e risultando pertanto uno strumento di grande potenzialità ed interesse per la diagnosi e la terapia mirata del MM. Pertanto, l’aptamero rappresenta un interessante ed innovativo strumento per la terapia mirata del MM. L’aptamero oggetto di invenzione è una breve sequenza di RNA (50 mer) contenente 2’Fluoro-Pirimidine (2’F-Py) che ne garantiscono una buona stabilità nel siero umano (emivita stimata di circa 20h in 80% siero). La molecola ben si presta, dunque, all’utilizzo in vivo. L’aptamero può essere utilizzato per imaging molecolare, diagnosi, terapia e direzionamento mirato di farmaci anti-tumorali.
Il presente aptamero, chiamato apt69.T, è il primo aptamero mai descritto in grado di legare in maniera selettiva il recettore BCMA. L’aptamero secondo l’invenzione possiede capacità di legare BCMA con una buona affinità e specificità sulle cellule MM in vitro. Si tratta di un aptamero ad RNA con elevata resistenza alle nucleasi sieriche, grazie alla modifica chimica inserita a livello delle pirimidine della sequenza, che sono state sostituite con 2’F-Py.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Per selezionare l’aptamero è stato adottato un protocollo di cell-SELEX modificato al fine di isolare un aptamero che oltre ad essere in grado di legare in maniera specifica il recettore BCMA fosse anche capace di internalizzare nelle cellule bersaglio in maniera recettore-mediata (32, 33). L’aptamero si è mostrato in grado di inibire in vitro il pathway di NF-kB a valle di BCMA indotto dal ligando APRIL e, vista la sua capacità di internalizzare in cellule overesprimenti BCMA, è stato coniugato al miR-137 ed all’antimiR-222. I risultati ottenuti dimostrano che l’aptamero apt69.T rappresenta un nuovo strumento ideale sia per il targeting diretto che per il direzionamento selettivo di molecole terapeutiche alle cellule di mieloma multiplo over-esprimenti BCMA, essendo in grado di trasportare in modo efficace nelle cellule MM esprimenti BCMA miRNA a doppio filamento e molecole antagoniste di miRNA a singolo filamento. Infatti, esso possiede sia capacità inibitorie che di trasporto.
Forma pertanto un oggetto della presente invenzione un aptamero nucleotidico o una sua variante, dove detto aptamero comprende o ha essenzialmente la sequenza: 5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUAC -3’ (SEQ ID NO:1) (apt69.T) o
5’-GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCCUAGUCUUGAAUGCACCUCGGGUCAGAAGGG GUUCCAGCUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’(SEQ ID NO:2) (apt 29) o
5’
GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAG AGGGUCUCAUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’ (SEQ ID NO:3) (apt69) o suoi frammenti funzionali.
La sequenza SEQ ID NO:1 è ad esempio un frammento della SEQ ID NO:3.
Preferibilmente la variante dell’aptamero secondo l’invenzione deve essere funzionale.
Una variante dell’aptamero apt69.T può comprendere o avere essenzialmente la sequenza: 5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUACXXX XGUACAUUCUAGAUAGCC-3’ (SEQ ID NO:4) (apt69.T stick) (dove le ogni X rappresenta uno spacer covalente tricarbonioso (CH2)3)
o la sequenza 5’-GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAG AGGGUCUCAUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’ (SEQ ID NO:3) (apt69).
In un aspetto preferito dell’invenzione, l’aptamero o la sua variante legano il recettore BCMA (B-cell maturation antigen) e/o internalizzano nelle cellule bersaglio in maniera recettoremediata.
Nell’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione, preferibilmente i residui di pirimidina sono modificati in 2’-fluoropirimidina.
Nella presente invenzione, i residui di pirimidina possono anche essere modificati come 2’-O-alchil nucleotidi, o con aggiunta di un capping all’estremità 3’ e acidi nucleici locked o come modifiche LNA per aumentare significativamente la stabilità dell’RNA.
Preferibilmente, l’aptamero o la sua variante è coniugata ad almeno un agente ad attività antitumorale, detto agente essendo preferibilmente un agente nucleotidico, quale ad esempio un microRNA e/o un inibitore di microRNA. Esempi di tali agenti sono miRNA oncosoppressori down-regolati nel MM, quali ad esempio miR-125b, Let-7b, miR-34a, miR-202, miR-15a/16, miR-214, miR-126, miR-130b, miR-33b; inibitori di miRNA up-regolati nel MM, quali ad esempio miR-221, cluster miR-17-92, miR-181 a/b, cluster miR-106b-25, miR-32, miR-135b, miR-125a, miR-301a; oligonucleotidi antisenso (ASO) o siRNA, quali ad esempio anti-MALAT 1, anti-Bcl2; non-coding RNA (RNA non codificanti) o inibitori di non-coding RNA dotati di attività antitumorale diretta o indiretta immuno-mediata; altre sequenze aptameriche dirette verso checkpoints immunologici (quali PD1 e/o PD-L1) o verso recettori di effettori della risposta immune (quali linfociti T, cellule NK e/o cellule gamma-delta, etc.). L’aptamero o la sua variante possono essere coniugati ad uno o più degli agenti sopra menzionati, in qualsiasi combinazione.
Preferibilmente, l’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione è coniugato con il miR-137 e/o con l’anti-miR-222.
Preferibilmente, detto miR-137 comprende o ha essenzialmente la sequenza:
5′-GGUGACGGGUAUUCUUGGGUGGAUAAUAGGCUAUCUAGAAUGUAC-3′(SEQ ID NO:5)
o
5′-UGUUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAGUCUU-3′(SEQ ID NO:6) Preferibilmente, detto antimiR-222 comprende o ha essenzialmente la sequenza:
5′ ACCCAGUAGCCAGAUGUAGCUGGCUAUCUAGAAUGUAC 3′;(SEQ ID NO:7) L’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione è preferibilmente per uso medico, più preferibilmente per uso nel trattamento e/o prevenzione o per la diagnosi di mieloma multiplo, leucemia linfocitica cronica o ulteriori tumori solidi o ematologici over-esprimenti il recettore BCMA.
L’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione può essere utilizzato in qualsiasi patologia indotta dal recettore BCMA.
Un altro oggetto dell’invenzione è una composizione farmaceutica comprendente l’aptamero o la sua variante come sopra definiti, detta composizione comprendente preferibilmente ulteriormente un altro agente terapeutico. Esempi di ulteriori agenti terapeutici sono farmaci antiblastci convenzionali (es. bendamustina); farmaci a target molecolare come inibitori del proteasoma (es. carfilzomib, bortezomib); agenti immunomodulanti (es. talidomide, lenalidomide, pomalidomide); polifenoli naturali (es. icaridina, curcumina, quercetina, apigenina, genisteina, fisetina); piccole molecole dotate di attività antitumorale diretta o indiretta immuno-mediata.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione è un metodo per la diagnosi di mieloma multiplo, leucemia linfocitica cronica o ulteriori tumori solidi o ematologici over-esprimenti il recettore BCMA in un paziente da cui è stato ottenuto un campione detto metodo comprendente:
- incubazione del campione con l’aptamero o la sua variante come sopra definito;
- misurazione del legame dell’aptamero con il campione,
preferibilmente detto campione essendo un campione di sangue, siero o saliva, una biopsia, urina o fluido cerebrospinale.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione è un kit per la diagnosi di mieloma multiplo, leucemia linfocitica cronica o altri tumori solidi o ematologici over-esprimenti il recettore BCMA in un paziente da cui è stato ottenuto un campione, comprendente un aptamero nucleotidico o la sua variante come sopra definiti.
Un altro oggetto dell’invenzione è un acido nucleico codificante per l’aptamero o la sua variante come sopra definiti, un vettore comprendente detto acido nucleico e una cellula comprendete detto acido nucleico o detto vettore. L’aptamero secondo l’invenzione è preferibilmente resistente alla nucleasi.
Un ulteriore oggetto dell’invenzione è l’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione per uso come trasportatore di molecole all’interno di cellule over-esprimenti in superficie il recettore BCMA.
Il coniugato secondo l’invenzione può comprendere almeno un aptamero come sopra descritto e almeno un agente ad attività antitumorale come sopra definito. L’agente antitumorale e l’aptamero possono essere collegati da una sequenza nucleotidica “stick”, quale ad esempio la sequenza GUACAUUCUAGAUAGCC (SEQ ID NO:9). Le sequenze stick preferibilmente constano di 2′-F-Py e 2′-O-metil purine. Fra la sequenza dell’aptamero e la sequenza stick, piò essere presente una sequenza spaziatrice covalente ((CH2)3), ripetuta ad esempio quattro volte.
Nel contesto della presente invenzione, il termine “variante” si riferisce anche a sequenze polinucleotidiche più lunghe o più corte e/o a polinucleotidi aventi per esempio, una percentuale di identità di almeno il 41%, 50%, 60%, 65%, 70% o 75%, più preferibilmente di almeno l’85%, come esempio di almeno il 90%, e più preferibilmente di almeno il 95% o 100% con le sequenze qui descritte o con la loro sequenza complementare o con la loro sequenza corrispondente di DNA o RNA.
Il termine “variante” e il termine “polinucleotide” comprende anche oligonucleotidi sintetici modificati. Questi oligonucleotidi sintetici modificati sono preferibilmente acidi nucleici bloccati (Locked Nucleic Acid, LNA), oligo fosforo-tiolati, o oligo metilati, morfoline, oligonucleotidi 2'-O-methyl o 2'-O-methoxyethyl e oligonucleotidi modificati 2'-O-methyl colesterolo-coniugati (antagomir).
Il termine “variante” può anche includere analoghi nucleotidici, cioè un ribonucleotide o un deossiribonucleotide naturale sostituito da un nucleotide non-naturale, ed acidi nucleici che possono essere generati mutando uno o più nucleotidi o amminoacidi nelle loro sequenze, o nelle sequenze di precursori o equivalenti. Il termine “variante” comprende anche almeno un frammento funzionale del polinucleotide.
Nel contesto della presente invenzione, per “funzionale” si intende che mantiene le caratteristiche funzionali degli aptameri da cui derivano, ad esempio la capacità di legare il recettore BCMA (B-cell maturation antigen) e/o internalizzare nelle cellule bersaglio in maniera recettore-mediata.
Preferibilmente, l’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione lega selettivamente le cellule over-esprimenti in superficie BCMA con una costante di dissociazione apparente (Kd) di 70-90nM, più preferibilmente di 79,4 nM. Preferibilmente l’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione è capace di discriminare le cellule esprimenti BCMA da quelle che non lo esprimono.
Preferibilmente l’aptamero o la sua variante secondo l’invenzione è un aptamero ad RNA. Come già menzionato, allo scopo di generare aptameri in grado di legare in maniera selettiva il recettore BCMA e di internalizzare nelle cellule over-esprimenti il recettore in superficie, i presenti autori hanno adottato un protocollo modificato di “cell-internalization SELEX”. Brevemente, nei primi 8 cicli di SELEX una libreria di aptameri ad RNA con 2’F-Py pirimidine è stata incubata per 30 minuti con cellule COS-7 parentali non esprimenti il recettore BCMA in superficie (step di contro-selezione); successivamente gli aptameri non legati alle COS-7 parentali sono stati recuperati ed incubati per 30 minuti con le cellule COS-7 transfettate col recettore umano BCMA (step di selezione positiva). Nei successivi ed ultimi 3 cicli di selezione, uno step di lavaggio ad elevata concentrazione salina (3 lavaggi con DPBS NaCl 0.5 M) è stato inserito a valle dello step di selezione positiva per rimuovere gli aptameri legati alla superficie cellulare ma non in grado di internalizzare. Inoltre, durante la procedura di selezione le condizioni sono state modificate in modo da aumentare gradualmente la stringenza. Nello specifico, è stato ridotto numero di cellule usate e sono stati aumentati il numero di lavaggi a valle dello step di selezione positiva, è stato inserito un ulteriore step di contro-selezione dal ciclo 7 al ciclo 11 ed un pretrattamento con un competitore aspecifico (poly inosinic acid) dal ciclo 9 al ciclo 11. Alla fine della procedura i presenti autori hanno identificato un aptamero (apt69) in grado di legare in maniera selettiva e di internalizzare nelle cellule over-esprimenti BCMA. L’aptamero è stato poi accorciato per ottenere una sequenza più vantaggiosa per una traslazione in clinica e la cui lunghezza fosse compatibile con la sintesi chimica. La versione accorciata dell’aptamero (50 mer), chiamata apt69.T, è il primo aptamero descritto in grado di legare il recettore BCMA. L’apt69.T è una sequenza a ssRNA contenente 2’F-Py in tutta la sua lunghezza che lega selettivamente le cellule over-esprimenti in superficie BCMA con una costante di dissociazione apparente (Kd) di 79,4 nM, e capace di discriminare le cellule esprimenti BCMA da quelle che non lo esprimono. L’interazione diretta tra l’aptamero ed il recettore sulla superficie cellulare è stata dimostrata mediante un esperimento di pull-down. La stabilità dell’aptamero è stata valutata in vitro ed è stimata essere di circa 20 ore in 80% di siero umano. Inoltre, è stata dimostrata la capacità dell’aptamero di inibire il pathway a valle di BCMA, determinando una riduzione della fosforilazione di p65 indotta dal ligando APRIL, con una conseguente inibizione dell’attivazione di ERK 1/2, effettori a valle. In aggiunta, l’aptamero si è mostrato in grado di internalizzare rapidamente nelle cellule di MM overesprimenti il recettore BCMA sulla superficie, dimostrando di avere interessanti proprietà di “carrier” selettivo. Infatti, si è rivelato in grado di trasportare in maniera efficiente e selettiva agenti secondari ad RNA (miR e anti-miR) in cellule di MM esprimenti BCMA.
Pertanto, l’aptamero apt69.T può trovare applicazione sia per scopi diagnostici che terapeutici. L’elevata flessibilità della molecola la rende adatta anche ad ulteriori modifiche chimiche volte al miglioramento delle sue proprietà farmacodinamiche e farmacocinetiche, nonché per un suo utilizzo nelle tecniche di imaging molecolare. Le possibili modifiche chimiche sono sostituzioni a livello dello zucchero, del fosfato o delle basi azotate ed includono: biotinilazione, aggiunta di fluorofori, incorporazione di nucleotidi modificati, modifica delle pirimidine in posizione 2’, aggiunta di un capping all’estremità 3’ della sequenza, aggiunta di un linker, coniugazione con radioisotopi, agenti di contrasto, composti chimici, droghe o altri oligonucleotidi terapeutici. Un possibile vantaggio dell’invenzione è l’opportunità di coniugare l’apt69.T a vari farmaci o molecole ed utilizzarlo per il loro direzionamento selettivo nelle cellule di MM over-esprimenti in superficie il recettore BCMA. Nello specifico, i presenti autori hanno già esplorato la capacità dell’aptamero di veicolare in maniera efficace miRNA ed anti-miR con potenziale attività antitumorale nel MM. I miRNA sono piccoli RNA non codificanti, lunghi tra i 19 ed i 22 nucleotidi, espressi sia in cellule normali che tumorali, nonché nei fluidi biologici dove possono essere liberi o incapsulati in vescicole o esosomi. I miRNA e gli inibitori dei miRNA (antimiR) sono stati ampiamente studiati come strumenti terapeutici per la cura di diverse patologie umane, incluso il cancro. Il principale modo con cui ne viene proposto l’utilizzo in terapia è generando dei complessi in cui l’RNA viene incapsulato in liposomi o modificandolo chimicamente in maniera da aumentarne la stabilità. Una questione fondamentale per poter utilizzare miRNA e anti-miR in clinica è quella di trovare degli strumenti che ne consentano un direzionamento selettivo alle cellule malate, in modo da ridurre l’insorgenza di effetti secondari avversi alla terapia. In tale ottica, l’utilizzo di aptameri coniugati ad essi rappresenta una soluzione semplice ed ideale a tale questione. Infatti, l’aptamero lega in maniera selettiva il recettore sulla superficie cellulare ed internalizza in maniera recettore-mediata, trasportando e rilasciando il cargo all’interno della cellula bersaglio. Oltre agli oligonucleotidi come i miRNA e gli anti-miR, possono essere utilizzati come cargoes da coniugare all’aptamero droghe e composti di vario genere in modo da poter sviluppare regimi terapeutici con elevata efficacia antitumorale e ridotti effetti collaterali dovuti all’azione del farmaco sulle cellule sane circostanti.
La presente invenzione verrà illustrata con l'ausilio di esempi non limitativi facendo riferimento alle seguenti figure.
Figura 1. Cell-internalizing SELEX. (a) Schema del protocollo di cell-internalizing SELEX usato. Abbiamo eseguito 8 cicli in cui una libreria di aptameri ad RNA modificata con 2’F-Py è stata: incubata con le cellule COS-7 parentali (contro-selezione); gli aptameri non legati sono stati recuperati ed incubati con la stessa linea cellulare trasfettata con BCMA (COS7-BCMA) (step di selezione positiva); gli aptameri legati sono stati recuperati mediante estrazione dell’RNA ed RT-PCR. In 3 cicli addizionali, a valle dello step di selezione positive sono stati eseguiti 3 lavaggi con elevata concentrazione salina per rimuovere gli aptameri legati alla superficie cellulare ma non internalizzanti. Gli aptameri internalizzati sono stati recuperati mediante estrazione dell’RNA ed RT-PCR. (b) Analisi mediante western blot dei livelli di espressione BCMA in cellule COS-7 parentali e trasfettate in transiente con il plasmide esprimente la proteina BCMA umana.
Figura 2: Saggio di legame degli aptameri. (a, b) Il legame degli 11 aptameri isolati mediante SELEX è stato valutato mediante RT-qPCR. Gli aptameri (100 nM) sono stati incubati con le cellule COS-7 parentali o con le cellule COS-7 trasfettate con BCMA (COS7-BCMA) per 30 min a 37°C. Il potere di legame è stato calcolato e rappresentato nel grafico come fold (COS7-BCMA/ COS-7).
Figura 3: Saggio di legame ed internalizzazione dell’aptamero apt69. (a) L’aptamero apt69 è stato incubato alle concentrazioni indicate con le cellule COS-7 parentali o con le cellule COS-7 trasfettate con BCMA (COS7-BCMA) per 30 min a 37°C. Il legame (μM) dell’aptamero alle cellule è stato misurato mediante RT-qPCR. (b) Le cellule COS7-BCMA sono state incubate per 1 h con l’aptamero apt69 (200nM) e poi analizzate direttamente (quantità totale di aptamero) o prima sottoposte a lavaggi ad elevata concentrazione salina (quantità di aptamero internalizzato). Le quantità di aptamero totale ed internalizzato sono state valutate mediante RT-qPCR. Le barre di errore indicano la media ± SEM.
Figura 4: Specificità dell’aptamero apt69.T. (a) Strutture secondarie dell’aptamero lungo apt69 (sinistra) e della versione accorciata apt69.T (destra) predette mediante RNAstructure Fold. (b) Saggio di legame dell’aptamero apt69.T sulle cellule COS-7 parentali e COS7-BCMA. Le cellule sono state incubate con l’aptamero (200 nM) per 30 min a 37°C. I valori di legame (μM) sono stati calcolati mediante RT-qPCR. Le barre di errore indicano la media ± SEM. (c) Determinazione della costante di dissociazione apparente (Kd) dell’aptamero apt69.T sulle cellule COS7-BCMA. Le cellule COS-7 parentali e COS7-BCMA sono state incubate a 37°C con concentrazioni crescenti di aptamero e sottoposte a RT-qPCR. I valori di legame ottenuti utilizzando un aptamero non relato, utilizzato come controllo, sono stati sottratti e la Kd è stata calcolata mediante analisi l’analisi Lineweaver-Burk. Le barre di errore indicano la media ± SEM. (d) Livelli di espressione di BCMA mediante western blot nelle linee U266, NCI-H929 e CCRF-CEM (sinistra). L’aptamero apt69.T (400 nM) è stato incubato per 15 min con le cellule U266 (BCMA+), NCI-H929 (BCMA+) e CCRF-CEM (BCMA-). I valori di legame (μM) sono stati calcolati mediante by RT-qPCR. Le barre di errore indicano la media ± SEM. Per l’analisi statistica è stato eseguito il test Student’s t, *p < 0.05 (destra) (e) Pull-down aptamero-mediato. Le cellule U266 sono state incubate con l’aptamero apt69.T o con un aptamero di controllo (scraCL4) alle concentrazioni indicate. I lisati cellulari sono stati purificati su biglie coniugate con streptavidina e poi immunoblottate con l’anticorpo anti-BCMA. 5 μg di estratto proteico totale (Input) è stato caricato come riferimento.
Figura 5: Attività dell’aptamero in vitro. (a) La stabilità in siero dell’aptamero apt69.T è stata calcolata incubando l’aptamero (4 μM) in 80% di siero umano per i tempi indicati. Ad ogni tempo, i campioni di RNA in siero sono stati raccolti e sottoposti a corsa elettroforetica su gel al 15% di poliacrilammide in condizioni denaturanti (urea 7M). Il gel è stato colorato con etidio bromuro e visualizzato agli UV mediante Gel Doc EZ Imager (pannello a sinistra); le bande sono state quantizzate utilizzando il programma Image J e l’intensità dei pixel ad ogni tempo è riportata nel grafico (pannello a destra). (b) Per valutare la capacità dell’aptamero apt69.T di inibire il pathway canonico di NF-kB indotto dal ligando APRIL, le cellule NCI-H929 sono state fatte crescere per 24 h in RPMI supplementato con 0.25% FBS. Le cellule sono state trattate con l’aptamero apt69.T (400 nM) per 30 min a 37 °C and poi stimulate con il ligando umano ricombinante APRIL (400 ng/ml) per i tempi indicati in presenza o meno dell’aptamero. I lisati cellulari totali (4 μg) sono stati immunoblottati con i seguenti anticorpi: anti-phosphop44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204), anti-phospho-NFkB-P65 (Ser536), anti-ERK 1, anti-NFkB-P65 e anti-vinculina.
Figura 6: Internalizzazione dell’aptamero apt69.T e trasporto aptamero-mediato di miRNA/antimiR in vitro. (a) Internalizzazione dell’aptamero apt69.T sulle cellule U266 (sinistra) ed H929 (destra) BCMA+. L’aptamero apt69.T (200 nM) è stato incubato per 15 minuti con le cellule e poi le cellule sono state recuperate dopo 3 lavaggi con DPBS (quantità di aptamero totale) o con DPBS 0,5M NaCl (quantità di aptamero internalizzato) allo scopo di rimuovere l’aptamero legato alla superficie cellulare. Le quantità di aptamero totale ed internalizzato sono state calcolate mediante RT-qPCR. Le barre di errore indicano la media ± SEM (b). Rappresentazione schematica del coniugato apt69.T-miR-137 (in alto) e del coniugato apt69.T-antimiR-222 (in basso). (c) Le cellule U266 (BCMA+) o CCRF-CEM (BCMA-) sono state trattate (400 nM) con le molecole indicate. I livelli del miR-137, relativi a quelli misurati in cellule trattate con un aptamero di controllo (ScraCL4), sono stati valutati mediante RT-qPCR dopo 48 h di trattamento. Le barre di errore indicano la media ± SD. (d) Le cellule U266 (BCMA+) e CCRF-CEM (BCMA-) sono state trattate (400 nM) con le molecole indicate. Dopo 72 ore di trattamento la vitalità cellulare è stata misurata mediante saggio MTT. Le barre di errore indicano la media ± SD. (e) Le cellule NCI-H929 (BCMA+) o CCRF-CEM (BCMA-) sono state trattate (400 nM) con le molecole indicate. I livelli del miR-222, relativi a quelli misurati in cellule trattate con un coniugato di controllo (SCRA-222), sono stati valutati mediante RT-qPCR dopo 72 h di trattamento. Le barre di errore indicano ± SD values.
ESEMPI
Materiali e metodi
Colture cellulari e trasfezione
Le linee cellulari sono state acquistate dall’ATCC (LG Standards, Milan, Italy). Le cellule COS-7 sono state cresciute in Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM), mentre le cellule U266, NCI-H929 and CCRF-CEM sono state cresciute in mezzo di crescita Roswell Park Memorial Institute (RPMI). I mezzi di crescita sono stati supplementati con 10% di siero fetale bovino (FBS) inattivato al calore e con 100 U/ml di penicillina/streptomicina. Tutti i reagenti per le colture cellulari sono stati acquistati dalla Sigma (St Louis, MO).
Il giorno precedente alla trasfezione cellulare, le cellule sono state piastrate in mezzo di crescita con 10% FBS. Tutte le trasfezioni sono state eseguite in Opti-MEM privo di siero con Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo il protocollo consigliato dal produttore. Il plasmide contenente il gene BCMA umano è stato acquistato presso l’OriGene Technologies Inc. (9620 Medical Center Drive, Suite 200 | Rockville, MD 20850).
Protocollo di cell-SELEX
La libreria di partenza utilizzata per la SELEX è composta da sequenze di RNA modificate con 2′ F-Py (TriLinkBioTechnologies, San Diego, CA, USA), contenenti una regione centrale randomizzata di 40 nucleotidi e due regioni fisse di 23 nucleotidi per l’amplificazione mediante reverse transcription PCR (RT-PCR). Il primer utilizzati sono: Forward Selection Primer (FSP) 5'-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-3' (SEQ ID NO:17); Reverse Selection Primer (RSP) 5'-TCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA-3 (SEQ ID NO:14). Nello step di controselezione sono state utilizzate cellule COS-7 parentali (BCMA-), mentre in quello di selezione positiva la stessa linea cellulare trasfettata in transiente con il gene BCMA umano (COS-7-BCMA). La libreria di RNA è stata prima incubata con le cellule COS-7 (contro-selezione) e poi gli aptameri non legati sono stati incubati con le cellule COS-7 trasfettate con BCMA (selezione positiva). Gli aptameri legati sono stati recuperati e sottoposti ad RT-PCR e trascrizione in vitro. Dopo 8 cicli di selezione positiva e contro-selezione, sono stati eseguiti 3 cicli addizionali nei quali è stato introdotto uno step di lavaggio ad elevata concentrazione salina con Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) 0.5 M NaCl a valle dello step di selezione positiva, allo scopo di rimuovere gli aptameri legati alla superficie cellulare ma non in grado di internalizzare. L’arricchimento della libreria con sequenze aspecifiche è stato evitato incrementando le condizioni di stringenza durante la procedura di cell-SELEX, per esempio utilizzando durante l’incubazione un competitore aspecifico (poliinosinic acid), riducendo il numero delle cellule bersaglio utilizzate nello step di selezione positiva, aumentando il numero di contro-selezioni ed il numero di lavaggi a valle della selezione. Dopo un totale di 11 cicli di SELEX, la libreria ottenuta è stata clonata e ~100 cloni sono stati sottoposti a sequenziamento.
Analisi bioinformatica
Le sequenze aptameriche ottenute sono state analizzate utilizzando programmi per l’allineamento multiplo di sequenze (ClustalW2), allo scopo di individuare le similarità di sequenza.
Le strutture secondarie degli aptameri sono state predette utilizzando l’algoritmo RNAstructure Fold.
Sequenze
Incluse nella presente invenzione sono anche sequenze di acido nucleico derivate dalle sequenze nucleotidiche mostrate sotto, per es. frammenti, mutanti, derivati, analoghi e sequenze con una % di identità di almeno il 70% con le sequenze sottostanti, funzionali. Sono anche incluse le sequenze complementari.
apt29:
5’-GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCCUAGUCUUGAAUGCACCUCGGGUCAGAAGGG GUUCCAGCUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’(SEQ ID NO:2)
apt69:
5’-GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAG AGGGUCUCAUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’(SEQ ID NO:3)
apt69.T:
5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUAC-3’(SEQ ID NO:1)
apt69.T (biotin):
5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUAC{Bio BB}-3’
ScraCL4:
5’-UUCGUACCGGGUAGGUUGGCUUGCACAUAGAACGUGUCA-3’(SEQ ID NO:8) ScraCL4 (biotin):
5’-UUCGUACCGGGUAGGUUGGCUUGCACAUAGAACGUGUCA{BioBB}--3’ apt69.T stick:
5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUACXXX XGUACAUUCUAGAUAGCC-3’(SEQ ID NO:4)
SCRA stick (indicated as SCRA):
5’-GGCGCUAGAACCUUCUAAGCGAAUACAUUACCGCXXXXGUACAUUCUAGAUAG CC-3’(SEQ ID NO:11)
miR-137 Passenger stick:
5′-GGUGACGGGUAUUCUUGGGUGGAUAAUAGGCUAUCUAGAAUGUAC-3′(SEQ ID NO:5)
miR-137 guide:
5′-UGUUAUUGCUUAAGAAUACGCGUAGUCUU-3′(SEQ ID NO:6)
antimiR-222 stick:
5′ ACCCAGUAGCCAGAUGUAGCUGGCUAUCUAGAAUGUAC 3′;(SEQ ID NO:7) Scrambled stick aptamer (indicated as aptScra):
5’-GCUCAACGUUGACAACAAAUGACGAXXXXGUACAUUCUAGAUAGCC-3'(SEQ ID NO:12)
Tutte le sequenze contengono 2′ F-Py. Gli aptameri lunghi (apt29 e apt69) sono stati prodotti mediante trascrizione in vitro utilizzando la sequenza di DNA corrispondente come stampo ed in presenza di 2’F-Py (Tebu-bio Srl, Magenta, Milan, Italy). L’ aptamero corto apt69.T, apt69.T stick, miR-137 Passenger stick e miR-137 guide sono stati sintetizzati da TriLinkBio Technologies (San Diego, CA, USA) o da “Synthetic and Biopolymer Chemistry Core” presso il “Beckman Research Institute” di City of Hope (Duarte, CA, USA). Le sequenze stick (sottolineate) constano di 2′-F-Py e 2′-O-metil purine. La X indica la presenza di una sequenza spaziatrice covalente ((CH2)3).
Prima di trattare le cellule, gli aptameri sono sottoposti ad un ciclo di denaturazione– rinaturazione mediante incubazione per 5 minuti a 85°C, 5 minuti in ghiaccio e 10 minuti a 37°C.
Saggi di legame mediante RT-qPCR
24h dopo la trasfezione delle cellule COS-7 con BCMA umano, le COS-7 parentali e trasfettate sono state piastrate in piastre multipozzetto 6 well plates (1.6 × 10<5 >cellule/pozzetto). Il giorno dopo, le cellule sono state trattate con gli aptameri (concentrazioni indicate) per 30 minuti a 37 °C in mezzo di crescita privo di siero.
Per il saggio di legame sulle cellule U266, NCI-H929 e CCRF-CEM, 4 × 10<5 >cellule/pozzetto sono state pretrattate per 30 minuti a 37 °C con tRNA (0.4 mg/ml) come competitore aspecifico e poi trattate con gli aptamer (200 nM) per 15 minuti a 37 °C in mezzo di crescita privo di siero. Gli aptameri non legati sono stati rimossi mediante 3 lavaggi con DPBS freddo. Gli aptameri legati sono stati recuperati mediante estrazione con TRIzol contenente 0.5 pmol/ml dell’aptamero CL4 (CL4: 5′ -GCCUUAGUAACGUGCUUUGAUGUCGAUUCGACAGGAGGC-3′(SEQ ID NO:13)) usato come normalizzatore interno. La quantità di RNA recuperato è stata determinata mediante RT-qPCR con un protocollo a 2 step. Nel primo step, l’RNA recuperato è retrotrascritto (RT) con MMuLV e primer specifici. I primer usati per lo step di RT sono: RSP (for both apt29 and apt69) 5'-TCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA-3'(SEQ ID NO:14); primer apt69.T Rv 5’-GTACTAGTCAATGAGACCCT-3’(SEQ ID NO:15); primer CL4 Rv 5′-GCCTCCTGTCGAATCG-3′(SEQ ID NO:16).
Il protocollo di RT usato è il seguente: denaturazione 5 minuti a 65 °C, 5 minuti a 22 °C per consentire l’annealing dei primer, 30 minuti a 42 °C e 30 minuti a 48 °C per l’estensione, 5 minuti a 95 °C per l’inattivazione dell’enzima. Nel secondo step, I prodotti di RT sono amplificati mediante qPCR con iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Il protocollo di qPCR usato è il seguente: denaturazione 2 minuti a 95 °C, e a seguire 40 cicli di riscaldamento a 95 °C per 30 secondi, annealing a 55 °C per 30 secondi, estensione a 60 °C per 30 secondi. Viene poi eseguita una curva di melting riscaldando a 60 °C – 95 °C. I primer usati per la qPCR sono: FSP Seq 5'-TAGGGAAGAGAAGGACATATGAT-3'(SEQ ID NO:17); RSP 5'-TCAAGTGGTCATGTACTAGTCAA-3'(SEQ ID NO:14); primer apt69.T Fw 5’-AGTGCAAGACGTTCGCAGA-3’(SEQ ID NO:18); primer apt69.T Rv 5’-GTACTAGTCAATGAGACCCT-3’(SEQ ID NO:15); primer CL4 Fw 5′-GCCTTAGTAACGTGCTTT-3′(SEQ ID NO:10) primer CL4 Rv 5′-GCCTCCTGTCGAATCG-3′(SEQ ID NO:16).
I risultati ottenuti sono stati normalizzati usando I valori dell’aptamero CL4 utilizzato come controllo e per il numero di cellule.
Per valutare l’affinità di legame, le COS-7 parentali e trasfettate con BCMA sono state incubate con l’apt69.T per 30 minuti a 37 °C in mezzo privo di siero alle concentrazioni indicate. Per calcolare la costante di dissociazione apparente (Kd) è stata eseguita l’analisi Lineweaver-Burk.
Saggi di internalizzazione mediante RT-qPCR
Le cellule BCMA+ (COS-7-BCMA, U266 or H929) sono state incubate per I tempi indicate con gli aptameri (200 nM) in mezzo privo di siero. Dopo il trattamento, le cellule sono state lavate con DPBS o con DPBS 0.5 M NaCl al fine di rimuovere gli aptameri non internalizzati. Le quantità di aptameri recuperate sono state valutate mediante RT-qPCR in maniera simile a quanto fatto per I saggi di legame ed è stata calcolata la percentuale di aptameri internalizzati rispetto al totale legato.
Stabilità dell’aptamero in siero umano
L’aptamero apt69.T è stato incubato ad una concentrazione di 4 μM in 80% di siero umano (Type AB Human Serum fornito da Euroclone) per diversi tempi (1 h - 72 h). Ad ogni tempo 4 μl di RNA (16 pmol) è stato raccolto ed incubato per 1 ora a 37 °C con 5 μl di proteinasi K (600 mAU/ml) al fine di rimuovere le proteine sieriche che interferiscono con la migrazione elettroforetica dell’RNA. Dopo il trattamento con proteinasi K, ai campioni sono stati aggiunti 18 μl di buffer denaturante per RNA (Invitrogen, Waltham, MA, USA) e sono poi stati conservati a −80 °C. Tutti i campioni sono poi stati sottoposti a corsa elettroforetica su gel di acrilammide 7M urea al 15%. Il gel è stato poi colorato co etidio bromuro e visualizzato per esposizione agli UV.
Western blot
Per valutare la capacità dell’aptamero di inibire il pathway di NF-kB indotto dal ligando APRIL, le cellule NCI-H929 (3 × 10<5 >cellule/pozzetto) sono state piastrate in piastre multipozzetto (6 well plates) e fatte crescere per 24 ore in RPMI con FBS 0,25%. Le cellule sono state trattate con l’aptamero apt69.T (400 nM) per 30 minuti a 37 °C e poi stimolate con il ligando APRIL (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) per 5 minuti ad una concentrazione di 400 ng/ml in presenza o meno dell’aptamero apt69.T. Le cellule sono state poi lisate in buffer JS (50 mM Hepes (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% glycerol, 1% Triton X-100, 1.5mMMgCl2, 5mMEGTA, 1mMNa3VO4, protease inhibitors) per estrarne le proteine totali. I campioni proteici sono stati poi bolliti in sodio dodecil solfato/ β-mercaptoetanolo e separate mediante elettroforesi e trasferite su membrana di nitrocellulosa (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA). Dopo il blocking in albumina di siero bovino (BSA) al 5% in Tris-buffered saline (TBS) con 0.1% Tween-20, le membrane sono state incubate a 4 °C per tutta la notte con i seguenti anticorpi primari: anti-phospho-p44/42 MAP Kinase (Thr202/Tyr204), antivinculina (Cell Signalling Technology, Inc., Danvers, MA, USA); anti-phospho-NFkB-P65 (Ser536), anti-NFkB-P65 (Elabscience Biotechnology Inc., Houston, Texas, USA); anti-ERK 1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Stockton, CA, USA).
Pull-down aptamero-mediato
Le cellule U266 (1 x 10<6>) sono state incubate in mezzo senza siero a 37°C per 30 min con 400 nM di apt69.T biotinilato all’estremità 3’ o con una sequenza di controllo scraCL4 anch’essa biotinilata alla stessa maniera. Dopo tre lavaggi con DPBS, le cellule sono state lisate con 10 mmol/l Tris-HCl pH 7.5 contenente 200 mmol/l NaCl, 5 mmol/l ethylendiaminetetraacetate (EDTA), 0.1% Triton X-100 e inibitori di proteasi.
Gli estratti cellulari (800 μg in 0.8 ml di buffer di lisi) sono stati purificati mediante incubazione con 480 μl di biglie coniugate con streptavidina (Thermo Fischer Scientific) per 2 h in agitazione. Dopo l’incubazione, le biglie sono state lavate 3 volte con DBPS e le proteine legate sono state recuperate aggiungendo il buffer Laemmli e poi analizzate mediante immunoblotting con anticorpi anti-BCMA (Novus Biologicals, CO, USA).
Produzione dei coniugati aptamero-miRNA/antimiR
Per preparare i coniugati aptamero-miRNA, il filamento passenger ed il filamento guide del miR-137 sono stati annilati mediante incubazione in un buffer specifico (20 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethane sulfonic acid (HEPES) pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2) per 10 min a 95 °C,10 min a 55 °C e 20 min a 37 °C. L’aptamero stick è stato sottoposto a ciclo di denaturazione/rinaturazione (5 min a 85 °C, 5 min in ghiaccio, 10 min a 37 °C) e poi pari quantità di aptamero stick e filamenti passenger e guide annilati sono stati incubate a 37 °C per 30 min per consentire la coniugazione mediante le sequenze stick complementari. Per preparare i coniugati aptamero-antimiR, l’aptamero stick è stato sottoposto a ciclo di denaturazione/rinaturazione come indicato sopra e la sequenza antimiR stick [antimiR-222] è stata incubata a 95 °C per 10 min in buffer di annealing. Dopo, pari quantità di aptamero stick e di antimiR stick sono state annilate mediante incubazione a 37 °C per 30 min.
L’efficienza di annealing è stata poi valutata mediante corsa elettroforetica su gel di acrilammide non denaturante al 12%.
Saggi per valutare il trasporto nelle cellule bersaglio dei miRNA e degli antimiR
Le cellule (1,4 x 10<5>) sono state piastrate in piastre multipozzetto da 6 (6 well plates) e trattate con 400 nM di apt69.T-137 (coniugato apt69.T-miR-137), apt69.T-222 (coniugato apt69.T-antimiR-222), chimera di controllo (SCRA-222) o aptamero di controllo (ScraCL4) per 48 o 72 h. Le cellule sono state poi lavate con DPBS freddo e l’RNA totale è stato estratto con Total RNA Purification Plus Kit (NorgenBiotekCorp.,ON, Canada). 500 ng di RNA totale è stato retrotrascritto con miScript Reverse Transcription kit (Qiagen, Milan, Italy), secondo le indicazione del produttore. L’amplificazione per valutare il livello di espressione dei miRNAè stata eseguita usando il miScript-SYBR Green PCR Kit e miScript Primer Assay (Qiagen, Milan, Italy). Il gene housekeeping U6 è stato utilizzato come normalizzatore.
Vitalità cellulare
Le cellule (7 x 10<3>) sono state piastrate in piastre multipozzetto da 96 (well plates) e trattate con 400 nM di scraCL4, apt69.T, aptScra-137 (aptamer scrambled stick coniugato con il miR-137) o apt69.T-137. La vitalità cellulare è stata misurata mediante saggio MTT (Cat. no. M 5655, Sigma, St Louis, MO), secondo le istruzioni del produttore.
RISULTATI
Allo scopo di selezionare aptameri in grado di legare in maniera specifica il recettore BCMA e di internalizzare in maniera recettore-mediata, abbiamo utilizzato una variante della classica procedura di cell-SELEX (Tabella 1), introducendo negli ultimi 3 cicli di selezione uno step di lavaggi ad elevata concentrazione salina a valle della selezione positiva, al fine di ottenere un arricchimento in aptameri in grado di internalizzare rapidamente e selettivamente nelle cellule bersaglio over-esprimenti il recettore BCMA.
Tabella 1 Protocollo di cell-internalizing SELEX
Come mostrato in Figura 1a, nello step di contro-selezione, una libreria randomizzata di aptameri ad RNA modificati con 2’F-Py è stata incubata con cellule COS-7 parentali non esprimenti BCMA e poi gli aptameri non legati sono stati recuperati ed incubati (step di selezione positiva) con la stessa linea cellulare trasfettata in transiente col recettore BCMA umano (COS-7-BCMA). L’over-espressione di BCMA nelle COS-7 in seguito alla trasfezione è stata valutata mediante western blot (Figura 1b). Alla fine degli 11 cicli di cell-SELEX, la libreria di aptameri ottenuta è stata clonata e sequenziata ed 11 diverse sequenze, presenti in due o tre copie, sono state validate per il legame a cellule over-esprimenti BCMA. Tra gli 11 aptameri screenati, le sequenze apt69 ed apt29 sono risultate in grado di discriminare in maniera efficace le cellule COS-7 trasfettate con BCMA dalle COS-7 parentali (BCMA -) (Figura 2 a e b). Analisi successive hanno dimostrato che l’aptamero apt69 ha maggiore capacità di legare cellule over-esprimenti BCMA e miglior potere discriminante (Figura 3 a). Inoltre, l’aptamero si è dimostrato in grado di internalizzare nelle cellule over-esprimenti il recettore BCMA, raggiungendo ~ il 16,8 % di internalizzazione dopo un’ora (Figura 3 b). La sequenza apt69 è stata accorciata al fine di ottenere un aptamero di una lunghezza compatibile con la sintesi chimica. La versione accorciata dell’aptamero è stata disegnata basandosi sulle predizioni di struttura secondaria (RNAstructure, https://rna.urmc.rochester.edu, and RNAfold, http://rna.tbi.univie.ac.at). I due stem-loop centrali sono stati conservati, mentre l’intera estremità 5’ e parte dell’estremità 3’ (regioni costanti) sono state rimosse (Figura 4 a) in modo da ottenere un aptamero di 50 mer, chiamato apt69.T. L’aptamero apt69.T si è dimostrato in grado di legare in maniera efficace BCMA e di discriminare le cellule COS-7 over-esprimenti BCMA dalle cellule COS-7 parentali (Figura 4 b), con una costante di dissociazione apparente (Kd) di 79,4 nM (Figura 4 c). Successivamente, l’apt69.T è stato validato per il legame a cellule umane di mieloma. Come mostrato, l’aptamero lega in maniera preferenziale le cellule U266 e NCI-H929, over-esprimenti BCMA, rispetto alle cellule CCRF-CEM che non esprimono livelli detectabili di BCMA (Figura 4 d pannello sinistro e destro). Inoltre, le cellule CCRF-CEM esprimono il recettore TACI (34), ma non BCMA o BAFF-R (35), mentre le cellule U266 (BCMA+) esprimono TACI ma non BAFF-R (36) e le cellule NCI-H929 (BCMA+) non esprimono TACI e mostrano una moderata espressione di BAFF-R (37). I risultati ottenuti indicano il legame dell’aptamero apt69.T al recettore BCMA espresso sulla superficie di cellule di MM, e nessun o solo un debole legame ai recettori relati TACI e BAFF-R. Il legame dell’aptamero al recettore BCMA sulla superficie cellulare è stato confermato anche mediante un saggio di pull-down aptamero-mediato. A tale scopo le cellule di MM U266 (BCMA+) sono state trattate con l’aptamero apt69.T biotinilato e l’estratto proteico cellulare è stato purificato su biglie legate a streptavidina e poi sottoposto ad immunoblot con un anticorpo anti-BCMA. Come mostrato in Figura 4 e, l’aptamero apt69.T interagisce con BCMA, mentre nessuna interazione è rilevata quando si utilizza un aptamero non relato come sequenza di controllo. Un ostacolo importante per lo sviluppo di piccoli RNA a scopo terapeutico è rappresentato dalla loro rapida clearance renale e dalla scarsa stabilità nel circolo sanguigno. Pertanto, abbiamo testato la stabilità in siero dell’aptamero apt69.T contenente tutte le pirimidine modificate con 2’ fluoro che incrementano la resistenza alle nucleasi sieriche (38). L’apt69.T è stato incubato a 37°C con siero umano all’80% per diversi tempi, fino a 72h. L’integrità dell’aptamero è stata valutata mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in condizioni denaturanti (Figura 5 a, pannello sinistro). Come mostrato, l’aptamero rimane stabile fino a circa 8 ore per poi essere degradato gradualmente. L’intensità delle bande è stata misurata (Image J) (Figura 5 a, pannello destro) e l’emivita dell’aptamero in siero è stata calcolata essere di ~ 20 ore. Successivamente, allo scopo di valutare se l’aptamero apt69.T fosse in grado di inibire l’attività del recettore BCMA indotta dal ligando APRIL, è stata analizzata l’attivazione del pathway NF-kB in seguito al trattamento con l’aptamero in cellule NCI-H929. Le cellule, dopo deprivazione di siero, sono state trattate per 30 min con l’apt69.T 400 nM e poi stimolate col ligando APRIL per 5 o 10 min in presenza o meno dell’aptamero. La Figura 5 b mostra la capacità dell’aptamero di ridurre la fosforilazione di p65 indotta da APRIL e la conseguente inibizione della fosforilazione di ERK 1⁄2, effettori a valle. Dunque, l’aptamero apt69.T sembra essere in grado di legare BCMA ed inibire il pathway attivato a valle del recettore. La capacità dell’aptamero apt69.T di internalizzare in cellule bersaglio, over-esprimenti il recettore BCMA, è stata valutata mediante specifici saggi di internalizzazione in vitro. Come mostrato in Figura 6 a (pannello sinistro e destro) l’aptamero internalizza rapidamente in cellule U266 e NCI-H929, entrambe esprimenti BCMA, con una percentuale di internalizzazione a 15 minuti di ~ 35%. Pertanto, l’aptamero apt69.T è stato utilizzato come carrier molecolare per il trasporto di RNA terapeutici. Utilizzando un approccio tipo “stick-end” (39,40) sono stati disegnati due diversi coniugati in cui l’aptamero apt69.T è stato coniugato al miR-137 o all’antimiR-222 (Figura 6 b), per i quali è stata riportata una funzione antitumorale in MM (41-43). Una consistente over-espressione del miR-137 può essere osservata in seguito al trattamento delle cellule U266 (BCMA+) con il coniugato apt69.T-miR-137 (apt69.T-137). Si osserva una leggera over-espressione del miRNA anche nelle cellule CCRF-CEM (BCMA -), probabilmente dovuta ad un lieve ingresso aspecifico. Comunque, i livelli di over-espressione del miRNA nelle CCRF-CEM sono di ~ 170 volte inferiore rispetto a quelli osservati nelle U266 (Figura 6 c). Inoltre, andando ad esplorare l’effetto funzionale del coniugato apt69.T-137, si osserva una chiara riduzione della vitalità cellulare (~ 40%) nelle cellule U266 overesprimenti il recettore (Figura 6 d).
Le cellule NCI-H929 (BCMA ) sono state trattate con il coniugato 69.T-anti-miR-222 (apt69.T-222) e si è osservata una evidente riduzione (~ 80%) dei livelli di espressione del miR-222, con effetti non detectabili sulle cellule CCRF-CEM (BCMA -) (Figura 6 e).
I dati ottenuti indicano che l’aptamero apt69.T può essere utilizzato per il trasporto selettivo di molecole secondarie a cellule over-esprimenti in superficie il recettore BCMA.
Claims (12)
- RIVENDICAZIONI 1. Un aptamero nucleotidico o una sua variante, dove detto aptamero comprende o ha essenzialmente la sequenza: 5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUAC -3’ (SEQ ID NO:1) o 5’-GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCCUAGUCUUGAAUGCACCUCGGGUCAGAAGGG GUUCCAGCUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’ (SEQ ID NO: 2) o 5’-GGGAAGAGAAGGACAUAUGAUCAGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAG AGGGUCUCAUUGACUAGUACAUGACCACUUGA-3’ (SEQ ID NO:3) o suoi frammenti funzionali.
- 2. La variante dell’aptamero secondo la rivendicazione 1 dove detta variante comprende o ha essenzialmente la sequenza: 5’-AGUGCAAGACGUUCGCAGAUUAGCGAAAAGAGGGUCUCAUUGACUAGUACXXX XGUACAUUCUAGAUAGCC-3’ (SEQ ID NO:4) (apt69.T stick) (dove ogni X rappresenta uno spacer covalente tricarbonioso (CH2)3).
- 3. L’aptamero o la sua variante secondo la rivendicazione 1 o 2 dove detto aptamero o variante lega il recettore BCMA (B-cell maturation antigen) e internalizza nelle cellule bersaglio in maniera recettore-mediata.
- 4. L’aptamero o la sua variante secondo una delle rivendicazioni precedenti, in cui i residui di pirimidina sono modificati in 2’-fluoropirimidina.
- 5. L’aptamero o la sua variante secondo una delle rivendicazioni precedenti, dove detto aptamero o variante è coniugata ad almeno un agente ad attività antitumorale, detto agente essendo preferibilmente un agente nucleotidico, quale ad esempio un microRNA e/o un inibitore di microRNA.
- 6. L’aptamero o la sua variante secondo una delle rivendicazioni precedenti, dove detto aptamero o variante è coniugata con il miR-137 e/o con l’anti-miR-222.
- 7. L’aptamero o la sua variante secondo una delle rivendicazioni precedenti per uso medico.
- 8. L’aptamero o la sua variante secondo una delle rivendicazioni precedenti per uso nel trattamento e/o prevenzione o per la diagnosi di mieloma multiplo, leucemia linfocitica cronica o ulteriori tumori solidi o ematologici over-esprimenti il recettore BCMA.
- 9. Una composizione farmaceutica comprendente l’aptamero o la sua variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, detta composizione comprendente preferibilmente ulteriormente un altro agente terapeutico.
- 10. Un metodo per la diagnosi di mieloma multiplo, leucemia linfocitica cronica o ulteriori tumori solidi o ematologici over-esprimenti il recettore BCMA in un paziente da cui è stato ottenuto un campione comprendente: - incubazione del campione con l’aptamero o la sua variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8; - misurazione del legame dell’aptamero con il campione, preferibilmente detto campione essendo un campione di sangue, siero o saliva, una biopsia, urina o fluido cerebrospinale.
- 11. Un kit per la diagnosi di mieloma multiplo, leucemia linfocitica cronica o ulteriori tumori solidi o ematologici over-esprimenti il recettore BCMA in un paziente da cui è stato ottenuto un campione comprendente un aptamero nucleotidico o la sua variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
- 12. Acido nucleico codificante per l’aptamero o la sua variante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8.
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2019
- 2019-10-10 IT IT102019000018509A patent/IT201900018509A1/it unknown
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