CN115380045A - 激活调节性t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法、包含由这些方法产生的Treg细胞群的组合物以及使用这些组合物治疗受试者的方法。

Description

激活调节性T细胞的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月26日提交的美国临时专利申请序列号62/981,944和于2020年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/975,141的优先权，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及生物技术和免疫学领域，并且更具体地，涉及刺激或增加Treg细胞的增殖的方法。
背景技术
组织因子(TF)是263个氨基酸的整体膜糖蛋白，分子量约为46kDa，是外在血液凝固路径的触发蛋白，是体内凝血的主要引发剂。通常不与循环血液接触的组织因子在暴露于循环凝血丝氨酸蛋白酶因子后引发凝血级联反应。血管损伤暴露了表达组织因子的内皮下细胞，从而引起与预先存在的血浆因子VIIa(FVIIa)形成钙依赖性高亲和力复合物。丝氨酸蛋白酶FVIIa结合到组织因子促进了FX快速裂解为FXa和FIX快速裂解为FIXa。所得FXa和活性膜表面的蛋白水解活性于是无法有效地将少量凝血酶原转化为凝血酶。FXa产生的凝血酶引发血小板活化，并且将微量的原辅因子：因子V(FV)和因子VIII(FVIII)活化成为活性辅因子：因子Va(FVa)和因子VIIIa(FVIIIa)。FIXa与FVIIIa在血小板表面上复合，形成内在液化酶(tenase)复合物，从而引起FXa快速产生。FXa与FVa复合，在活化的血小板表面上形成凝血酶原酶复合物，其引起凝血酶原快速裂解为凝血酶。
除了组织因子-FVIIa复合物外，最近的研究表明，组织因子-FVIIa-FXa复合物也能够活化FVIII，从而在初始阶段提供额外水平的FVIIIa。外在路径首要之处在于通过有限量的凝血酶的活化来引发凝血，而内在路径通过显著扩增初始信号来维持凝血。
细胞表面表达的许多组织因子被“加密”，为了完全参与凝血，必须被“解密”。目前，细胞表面组织因子“解密”的机制尚不清楚，但是，阴离子磷脂的暴露在此过程中起着重要作用。健康细胞会主动将阴离子磷脂(例如磷脂酰丝氨酸(PS))隔离到质膜的内部小叶上。在细胞损伤、活化或胞质Ca2+水平增加之后，这种双层不对称性消失，导致外部小叶上PS暴露增加，从而增加了细胞表面组织因子-FVIIa复合物的比活性。已知PS暴露会降低组织因子-FVIIa复合物活化FIX和FX的表观Km，但其它机制可能包含组织因子或组织因子-FVIIa的构象重排以及随后的底物结合位点暴露。
过继免疫疗法或细胞疗法需要体内培养从受试者获得的免疫细胞(和任选地对免疫细胞进行基因操作以表达嵌合抗原受体或T细胞受体)，之后给予回所述受试者体内。需要足够数目的免疫细胞以便在受试者中提供治疗作用。在许多实例中，需要持续三周或三周以上培养从受试者获得的免疫细胞才可获得治疗有效数目的免疫细胞。另外，许多体外培养从受试者获得的免疫细胞的方法需要一层饲养细胞，所述方法需要随后纯化或分离免疫细胞，之后再给予回受试者体内。
发明内容
在接受Treg细胞的患者中已示出出色的安全特性(Esensten等人,《过敏与临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)》142(6):1710-1718,2018)。早期临床研究显示，在使用Treg细胞预防和治疗急性和慢性移植物抗宿主疾病(Brunstein等人,《血液(Blood)》117(3):1061-1070,2011；Di Ianni等人,《血液》117(14):3921-3928,2011；Martelli等人,《血液》124(4):638-644,2014；Theil等人,《细胞疗法(Cytotherapy)》17(4):473-486,2015；Brunstein等人,《血液》127(8):1044-1051,2016)、自身免疫和神经退行性疾病(Thonhoff等人,《神经病学：神经免疫学和神经炎症(Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm)》5(4):e465,2018；Dall'Era等人,《关节炎和风湿病(Arthritis Rheumatol)》71(3):431-440,2019)方面取得了令人鼓舞的结果。
要使用基于T细胞的过继性疗法，包含Treg细胞，GMP制造环境需要离体细胞刺激步骤。抗CD3/抗CD28抗体包被的磁性珠粒(免疫磁珠(Dynabead)，赛默飞世尔公司(ThermoFisher))最常与IL-2组合用于细胞刺激和扩增(Highfill等人,《最新血液恶性肿瘤报告(Curr Hematol Malig Rep)》14(4):269-277,2019)。如果使用此方法，那么必须开发方法以确保T细胞在培养采集时和输注到患者体内之前“无珠粒”。在此研究中，描述了一种采用2t2和3t15*-28s分别有效替代IL-2和抗CD3/抗CD28包被的磁珠的方法，用于T细胞刺激和扩增，而不使用雷帕霉素(rapamycin)。3t15*-28s是可溶性融合蛋白复合物，其可以通过简单的洗涤步骤轻松从培养物中去除，消除了对去除珠粒的需要，从而节省时间和处理成本，并且提高细胞回收率。另外，还证明，在细胞刺激和扩增之前或之后，在Treg细胞的分离或纯化中包含使用抗CD39抗体的分离步骤可以富集CD4+CD25hi CD127lo和CD39hi Treg，使Treg细胞的纯度、一致性和效应功能增加。
人类的老化与全身性炎症升高相关(Ferrucci等人,《血液》105(6):2294-2299,2005；Dinarello,《美国临床营养学杂志(Am J Clin Nutr)》83(2):447S-455S,2006)。将炎症与老化连接起来的过程被称为炎性老化(Franceschi等人,《纽约科学院年鉴(Ann N YAcad Sci)》908:244-254,2000)。老化过程与影响免疫系统的重大变化有关，并导致各种与老化相关的病理学。
免疫系统的功能是检测和应对组织的损伤或病原性微生物的入侵。抵抗感染的第一道防线的先天性免疫细胞表达不同的种系编码模式识别受体(PRR)，所述PRR识别微生物特有的保守病原体相关分子模式(PAMP)(Janeway,冷泉港定量生物学研讨会(Cold SpringHarb Symp Quant Biol)54Pt 1:1-13,1989；Gong等人,《免疫学自然综述(Nat RevImmunol)》20(2):95-112,2020)。由受损或损伤细胞释放的危险信号也被损伤相关分子模式(DAMP)的受体识别(Gong等人,《免疫学自然综述》20(2):95-112,2020)。PAMP和DAMP两者都可以通过激活经典PRR(如Toll样受体(TLR)和多种种系编码受体(如NOD样受体(NLR)、维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLR)、C型凝集素受体(CLR)和细胞内DNA传感器)来引发先天性免疫应答(Cao,《免疫学自然综述》16(1):35-50,2016)。若干种其它受体也可以感测DAMP。这些受体包含晚期糖基化终产物受体(RAGE)(Hudson等人,《医学年评(Annu RevMed)》69:349-364,2018；Teissier等人,《古生物学(Biogerontology)》20(3):279-301,2019)、骨髓细胞上表达的触发受体(TREM)、(Ford等人,《免疫学新见(Curr OpinImmunol)》21(1):38-46,2009)、若干种G蛋白偶联受体(GPCR)(Heng等人,《药理学和毒理学年评(Annu Rev Pharmacol Toxicol)》54:227-249,2014；Weiss等人,《免疫学趋势(TrendsImmunol)》39(10):815-829,2018)和离子通道(Eisenhut等人,《Pflugers Arch》461(4):401-421,2011)。
DAMP引发的炎性应答被称为无菌性炎症，因为其独立于病原体感染(Chen等人,《免疫学自然综述》10(12):826-837,2010)。DAMP可以激活非免疫细胞和先天性免疫细胞两者(Chen等人,《免疫学自然综述》10(12):826-837,2010)。这些细胞的激活导致细胞因子和趋化因子的产生，进而募集炎性细胞并激活适应性免疫应答(Chen等人,《免疫学自然综述》10(12):826-837,2010)。还已知一些DAMP直接激活适应性免疫细胞(Lau等人,《实验医学杂志(J Exp Med)》202(9):1171-1177,2005；Qin等人,《免疫学杂志(J Immunol)》199(1):72-81,2017)。尽管无菌性炎症在组织修复和再生以在损伤性损伤后重建组织止血中起着至关重要的作用，由于反复的组织损伤或对组织中存在过多的先天性免疫触发因素的应答而导致的未解决的慢性炎症对宿主有害，并且可能导致无菌性炎性疾病，包含癌症、代谢紊乱(例如，糖尿病)、神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease))和自身免疫性疾病(例如，多发性硬化症)(Roh等人,《免疫网络(Immune Netw)》18(4):e27,2018)。
炎性小体是大型多聚体蛋白复合物，其包括胞质模式识别受体、含有胱天蛋白酶募集结构域(ASC)的适配体蛋白凋亡相关的斑点样蛋白和胱天蛋白酶-1(Lamkanfi等人,《细胞(Cell》)157(5):1013-1022,2014)。炎性小体在先天性免疫细胞和其它细胞中的组装由各种刺激触发并且最终激活胱天蛋白酶-1，然后所述胱天蛋白酶-1将pro-IL-1β切割成IL-1β(Latz等人,《免疫学自然综述》13(6):397-411,2013；Walsh等人,《神经病学自然综述(Nat Rev Neurosci)》15(2):84-97,2014)。迄今为止，已经发现了多种炎性小体。在鉴定的各种炎性小体中，核苷酸结合寡聚化结构域，富含亮氨酸重复序列的受体(NLR)家族含pyrin结构域3(NLRP3)炎性小体最佳表征(Swanson等人,《免疫学自然综述》19(8):477-489,2019)。NLR被认为是病原体和危险信号的关键传感器。NLRP3炎性小体具有两步骤激活机制：“引发”，这需要诱导Pro-IL-1β和NLRP3以及“激活”，其中在摄取PAMP或DAMP之后组装功能性炎性小体复合物。各种疾病(包含阿尔茨海默氏病(Heneka等人,《自然(Nature)》493(7434):674-678,2013)、帕金森氏病(Heneka等人,，《神经病学自然综述》19(10):610-621,2018)和动脉粥样硬化(Jin等人,《美国心脏学会杂志(J Am Heart Assoc)》8(12):e012219,2019))的病理学与NLRP3炎性小体的超活化有关。
衰老细胞的累积也可能导致无菌性炎症。细胞衰老被定义为不可逆的细胞周期停滞，其响应于细胞压力而发生，并且防止缺陷传递给下一代(Collado等人,《癌症自然评论(Nat Rev Cancer)》10(1):51-57,2010；McHugh等人,《细胞生物学杂志(J Cell Biol)》217(1):65-77,2018)。细胞衰老在发育、组织止血和伤口愈合过程中起着重要的保护作用(Munoz-Espin等人,《细胞》155(5):1104-1118,2013；Storer等人,《细胞》155(5):1119-1130,2013；Demaria等人,《发育细胞(Dev Cell)》31(6):722-733,2014；Yun等人,《E生命(Elife)》4,2015)。细胞衰老伴随着促炎性表型。所述表型被称为衰老相关分泌表型(SASP)(McHugh等人,《细胞生物学杂志》217(1):65-77,2018)。SASP的特征在于释放炎性细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶。这通过自分泌和旁分泌信号传导增强细胞衰老，并且募集和指导免疫细胞清除衰老细胞。因此，细胞衰老和SASP是重要的生理反应，其在细胞水平、组织水平和器官水平上维持体内平衡。然而，在持续性损伤时或在老化期间，衰老细胞的清除受到损害，并且功能失调的细胞累积。来自这些未清除的和累积的衰老细胞的SASP是产生导致多种病理表现的炎性微环境的炎性因子的长期和慢性来源(Munoz-Espin等人,《分子细胞生物学自然综述(Nat Rev Mol Cell Biol)》15(7):482-496,2014；vanDeursen,《自然》509(7501):439-446,2014；McHugh等人,《细胞生物学杂志》217(1):65-77,2018)。另外，一些SASP因子会引发含有炎性小体的细胞，这会增加促进慢性炎性小体激活以诱导无菌性炎症的风险。
调节性T(Treg)细胞是外周耐受性和宿主对自身和非自身抗原的整体免疫调节潜力的重要介质(Sakaguchi等人,《细胞》133(5):775-787,2008；Sakaguchi等人,《免疫学年度评论(Annu Rev Immunol)》38:541-566,2020)。Treg细胞通过多种抑制机制实现这种免疫调节控制。这些抑制机制包含IL-2剥夺、抑制性细胞因子(即，IL-10和TGF-β)的分泌以及通过与CTLA-4的高亲和力结合从抗原呈递细胞中获得共刺激分子(Oberle等人,《免疫学杂志》179(6):3578-3587,2007；Tang等人,《自然免疫学(Nat Immunol)》9(3):239-244,2008；Zheng等人,《免疫学杂志》181(3):1683-1691,2008)。三磷酸腺苷(ATP)-腺苷通路也被调节性Treg用作先天性和适应性免疫的关键调节剂。CD39是在免疫细胞(例如，Treg)、内皮细胞和肿瘤细胞上广泛表达的主要外核苷酸酶，其将ATP和二磷酸腺苷(ADP)水解为一磷酸腺苷(AMP)(Moesta等人,《免疫学自然综述》20(12):739-755,2020)。然后AMP被CD73水解为腺苷。腺苷与免疫细胞上展示的所述腺苷的受体A1、A2A、A2B和A3结合。A2A和A2B受体(A2AR和A2BR)是增加细胞内cAMP和PKA水平的Gs偶联受体，以cAMP依赖性方式在腺苷诱导的免疫抑制中起主要作用。A1和A3受体(A1R和A3R)是减少有利于细胞激活的细胞内cAMP的Gi/o偶联受体，并且因此通常被视为免疫促进腺苷受体。在人类中，A1R、A2AR和A3R对腺苷具有高亲和力，而A2BR的亲和力显著较低。A2A和A2BR在免疫细胞上表达(Feng等人,《癌细胞国际(Cancer Cell Int)》20:110,2020)。最近，已表明人CD39hi调节性T细胞在炎性条件下表现出更强的稳定性、更高的Foxp3表达和抑制能力(Gu等人,《细胞与分子免疫学(Cell MolImmunol)》14(6):521-528,2017)。Treg细胞发育、稳态或功能的变化可以使这些细胞易患多种疾病病状，包含过敏、自身免疫、移植物排斥、癌症和对免疫疗法的应答(Sakaguchi等人,《(Annu Rev Immunol)》38:541-566,2020)。当前的研究聚焦于开发新型疗法，以通过使用细胞因子和小分子量药物来增强体内Treg细胞功能，以支持内源性Treg细胞增殖或激活，在自体过继性细胞疗法(ACT)中体外操纵Treg细胞，以促进自身免疫或抗原特异性Treg细胞(包含嵌合抗原受体Treg(CAR-Treg)细胞)环境中的免疫调节，以增强对过敏性炎症的耐受性(Ferreira等人,《药物发现自然综述(Nat Rev Drug Discov)》18(10):749-769,2019)。本发明是一种使用Treg细胞使炎性小体失活并且然后随后使用由一种或多种免疫治疗剂激活的免疫细胞来减少个体中累积的衰老细胞以治疗炎性老化和/或任何与老化相关的病理学的方法。提供了一种抑制炎性小体相关疾病和抑制衰老相关疾病的方法。Treg细胞可以是体内增强的内源性Treg细胞或在ACT环境中使用的离体操纵的Treg细胞。用于衰老细胞清除的免疫细胞可以通过体内免疫治疗剂激活，或者通过离体刺激和扩增方法产生，以支持ACT施用。本发明基于以下发现：包含可溶性组织因子结构域的单链嵌合多肽或包含可溶性组织因子结构域的多链嵌合多肽与CD3/CD28结合剂或IL-2受体活化剂组合有效刺激或增加Treg细胞的增殖。基于此发现，本文提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，所述方法包含在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包含：CD3/CD28结合剂；以及单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2受体结合。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域包括可溶性IL-2。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性IL-2是人可溶性IL-2。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域各自包括与SEQ IDNO:1至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域各自包括与SEQ ID NO:1至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域各自包括SEQ ID NO:1的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:3至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:3至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:3的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ IDNO:4至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:4至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:4的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括比率为约1:1到约6:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括比率为约3:1到约5:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3是人CD3。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD28是人CD28。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述另外的单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述另外的单链嵌合多肽。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3是人CD3。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，第一嵌合多肽的可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，第一嵌合多肽的可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:102的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:104的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD28是人CD28。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:106的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQID NO:108至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:108的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述多链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述多链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述多链嵌合多肽。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含：在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，进行所述单链嵌合多肽的周期性添加以导致所述液体培养基中的所述单链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，进行所述单链嵌合多肽的周期性添加以导致所述液体培养基中的所述单链嵌合多肽的浓度为约50nM到约150nM。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含：在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述CD3/CD28结合剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述时间段为约7天到约56天。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述权利要求的时间段为约15天到约25天。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
另一方面，本文提供了通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的Treg细胞群。本文提供了包括通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的任何Treg细胞群和药学上可接受的载体的组合物。本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的包括通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的任何Treg细胞群和药学上可接受的载体的任何组合物。在治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。在治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。在治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病(Crohn's disease)、多发性硬化症、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、牛皮癣、格雷夫氏病(Grave'sdisease)、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
另一方面，本文提供了包含以下的试剂盒：(i)CD3/CD28结合剂；(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2的受体结合；以及(iii)mTOR抑制剂。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中：所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
另一方面，本文提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，所述方法包含：在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：IL-2受体活化剂；以及包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域的单链嵌合多肽，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3是人CD3。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域包括与SEQ IDNO:5至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD28是人CD28。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQID NO:7至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IL-2受体活化剂是可溶性IL-2。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性IL-2是人可溶性IL-2。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述人可溶性IL-2包括与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述人可溶性IL-2包括与SEQ IDNO:1至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述人可溶性IL-2包括SEQ ID NO:1的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约100IU/mL到约800IU/mL的所述人可溶性IL-2。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约400IU/mL到约600IU/mL的所述人可溶性IL-2。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含：在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述IL-2受体活化剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，进行所述IL-2受体活化剂的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述IL-2受体活化剂的浓度为约10nM到约1000nM。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，进行所述IL-2受体活化剂的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述IL-2受体活化剂的浓度为约50nM到约150nM。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含：在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述时间段为约7天到约56天。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述权利要求的时间段为约15天到约25天。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
本文提供了通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的Treg细胞群。本文提供了包括通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的任何Treg细胞群和药学上可接受的载体的组合物。本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的包括通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的任何Treg细胞群和药学上可接受的载体的任何组合物。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
另一方面，本文提供了包含以下的试剂盒：(i)白细胞介素-2受体活化剂；(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合；以及(iii)mTOR抑制剂。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
另一方面，本文提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，所述方法包含：在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：CD3/CD28结合剂；以及多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一嵌合多肽中的所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域和所述一对亲和结构域中的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域与所述一对亲和结构域中的所述第一结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述一对亲和结构域中的所述第二结构域和所述第二靶标结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包括介于所述第二嵌合多肽中的所述一对亲和结构域中的所述第二结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与相同的抗原特异性结合。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与不同的抗原特异性结合。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者是抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者与选自由以下组成的组的靶标特异性结合：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘蛋白、CEACAM5、UL16-结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体以及CD28的受体。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者是可溶性白细胞介素或细胞因子蛋白。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性白细胞介素、细胞因子或配体蛋白选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者是可溶性白细胞介素或细胞因子受体。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽进一步包括一个或多个另外的靶标结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第二嵌合多肽进一步包括一个或多个另外的靶标结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述一对亲和结构域是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述一对亲和结构域选自由以下组成的组：芽胞杆菌RNA酶和芽胞杆菌RNA酶抑制剂、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和SNAP25的相互作用的SNARE模块。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述多链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括比率为约1:1到约6:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括比率为约3:1到约5:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3是人CD3。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD28是人CD28。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ IDNO:6至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括SEQID NO:7的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述单链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述单链嵌合多肽。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是另外的多链嵌合多肽，所述另外的多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述另外的多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD3是人CD3。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，另外的多链嵌合多肽的第一嵌合多肽的可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，另外的多链嵌合多肽的第一嵌合多肽的可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:102的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:104的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述CD28是人CD28。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ IDNO:6至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:106的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少80％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少90％相同的序列。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:108的序列。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述另外的多链嵌合多肽不引发血液凝固。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述另外的多链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述另外的多链嵌合多肽。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含：在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述多链嵌合多肽。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，进行所述多链嵌合多肽的周期性添加以导致所述液体培养基中的所述多链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，进行所述多链嵌合多肽的周期性添加以导致所述液体培养基中的所述多链嵌合多肽的浓度为约50nM到约150nM。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包含：在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述CD3/CD28结合剂。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述时间段为约7天到约56天。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述权利要求的时间段为约15天到约25天。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
本文提供了通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的Treg细胞群。本文还提供了包括通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的任何Treg细胞群和药学上可接受的载体的组合物。本文提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的包括通过本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法产生的任何Treg细胞群和药学上可接受的载体的任何组合物。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
另一方面，本文提供了包含以下的试剂盒：CD3/CD28结合剂；多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；以及mTOR抑制剂。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述试剂盒进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述CD3/CD28结合剂是另外的多链嵌合多肽，所述另外的多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
在本文所描述的任何试剂盒的一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
另一方面，本文提供了从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的方法，其中所述方法包括基于所述Treg细胞的CD39表达从样品中分离所述Treg细胞，由此分离所述Treg细胞。
在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述方法包括：在允许抗体或配体与表达CD39的Treg细胞结合的条件下，将样品与能够结合CD39的抗体或配体混合；将与抗体或配体结合的Treg细胞与样品中的其它组分分离，由此分离Treg细胞。
在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述抗体是小鼠、人源化或人抗体或其抗原结合片段；和/或所述抗体或配体用生物素、亲和素、链霉亲和素或荧光染料中的至少一种标记，或者与颗粒、珠粒、树脂或固体支持物结合。在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，分离包括使用流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、离心或基于柱、板、颗粒或珠粒的方法。
在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述方法进一步包括：在允许所述抗体或所述配体与所述Treg细胞结合的条件下，将所述样品与能够结合CD39的生物素化抗体或配体混合；使用链霉亲和素包被的磁性颗粒捕获与所述生物素化抗体或配体结合的所述Treg细胞；使用磁铁分离所述结合磁性颗粒的Treg细胞；洗涤所述结合磁铁颗粒的Treg细胞，以去除所述样品中的其它组分；以及将所述结合磁性颗粒的Treg细胞从所述磁铁中释放到溶液中，由此分离所述Treg细胞。
在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，Treg细胞是从包括新鲜或冷冻的外周血、脐带血、外周血单核细胞、淋巴细胞、CD4+ T细胞或Treg细胞的样品中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。在本文所描述的分离Treg细胞的任何方法的一些实施例中，所述Treg细胞在体外和在体内是免疫抑制性的。
另一方面，本文提供了通过本文所描述的任一种方法产生的分离的Treg细胞群。在本文所描述的任何分离的Treg细胞群的一些实施例中，所述分离的Treg细胞群大于70％CD39+细胞。还提供了扩增本文所描述的分离的Treg细胞群的任何方法，所述方法包含在允许分离的Treg细胞的增殖的条件下培养分离的Treg细胞群。
本文还提供了包括本文所描述的任何分离的Treg细胞群和药学上可接受的载体的组合物。
本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的任何组合物。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。在本文所描述的治疗有需要的受试者的任何方法的一些实施例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
如本文所使用的，术语“嵌合”是指多肽包含最初来源于两个不同来源(例如，两种天然存在的不同蛋白质，例如来自相同或不同物种)的氨基酸序列(例如，结构域)。举例而言，嵌合多肽可以包含来自至少两种天然存在的不同人蛋白质的结构域。在一些实例中，嵌合多肽可以包含作为合成序列(例如scFv)的结构域和来源于天然存在的蛋白质(例如天然存在的人蛋白质)的结构域。在一些实施例中，嵌合多肽可以包含至少两个不同的作为合成序列(例如两个不同scFv)的结构域。
“抗原结合结构域”是能够特异性结合到一种或多种不同抗原的一个或多个蛋白质结构域(例如，由来自单个多肽的氨基酸形成或由来自两个或多于两个多肽(例如，相同或不同的多肽)的氨基酸形成)。在一些实例中，抗原结合结构域可能以与天然存在的抗体相似的特异性和亲和力结合到抗原或表位。在一些实施例中，抗原结合结构域可以是抗体或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域可以包含替代支架。本文描述抗原结合结构域的非限制性实例。抗原结合结构域的另外的实例是本领域已知的。
“可溶性组织因子结构域”是指与缺少跨膜结构域和细胞内结构域的野生型哺乳动物组织因子蛋白(例如，野生型人组织因子蛋白)的段具有至少70％同一性(例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少99％同一性或100％相同)的多肽。本文描述可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且包含某些类型的免疫球蛋白分子，所述免疫球蛋白分子包含一个或多个特异性结合到抗原或表位的抗原结合结构域。抗体具体包含例如完整抗体(例如，完整免疫球蛋白)、抗体片段和多特异性抗体。抗原结合结构域的一个实例是由VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。本文描述抗体的另外的实例。抗体的另外的实例是本领域已知的。
“亲和力”是指抗原结合位点与其结合配偶体(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外说明，否则如本文所用，“亲和力”是指固有结合亲和力，其反映抗原结合结构域与抗原或表位的成员之间的1:1相互作用。分子X与其配偶体Y的亲和力可以通过解离平衡常数(KD)表示。在下文中更详细地描述贡献于解离平衡常数的动力学组分。亲和力可以通过本领域已知的常见方法来测量，包含本文描述的方法。亲和力可以例如使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如，
Figure BDA0003872613750000351
)或生物层干涉测量术(例如，
Figure BDA0003872613750000352
)来确定。确定对抗原结合结构域和其对应抗原或表位的亲和力的另外的方法是本领域已知的。
如本文所使用的“单链多肽”是指单个蛋白质链。
如本文所用，“多链多肽”是指包括两个或更多个(例如，三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)蛋白链(例如，至少第一嵌合多肽和第二多肽)的多肽，其中两个或更多个蛋白链通过非共价键缔合形成四级结构。
术语“表位”是指特异性结合到抗原结合结构域的抗原的一部分。表位可以例如由表面可接近的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合而非与后者的结合可能会丢失。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。鉴定与抗原结合结构域结合的表位的方法是本领域已知的。
术语“治疗”是指改善病症的至少一种症状。在一些实例中，所治疗的病症是癌症，并且改善癌症的至少一种症状包含减少异常增殖、基因表达、信号传导、翻译和/或因子的分泌。一般来说，治疗方法包含将治疗有效量的组合物给予需要或已确定为需要这种治疗的受试者，所述组合物减少病症的至少一种症状。
术语“CD3/CD28结合剂”意指与哺乳动物细胞(例如，T细胞，如Treg细胞)的表面上的CD3和CD28两者特异性结合并且在所述哺乳动物细胞中诱导下游信号传导的试剂。本文描述了CD3/CD28结合剂的非限制性实例。
术语“IL-2受体活化剂”意指与哺乳动物细胞(例如，T细胞，如Treg细胞)的表面上存在的IL-2受体特异性结合并且在所述哺乳动物细胞中诱导下游信号传导的试剂。本文描述了IL-2受体活化剂的非限制性实例。
术语“IgG1抗体构建体”意指包含与可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)结合的至少一个抗原结合结构域以及至少一个IgG1 Fc结构域的单链多肽或多链多肽。本文描述了IgG1抗体构建体的非限制性实例。
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；还可以使用其它在本领域已知的合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其它参考文献通过全文引用的方式并入。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。
本发明的其它特征和优点将通过以下详细描述和附图以及通过权利要求书变得显而易见。
附图说明
图1是示出使用(1)2t2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素或(2)重组人IL-2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素的Foxp3+ Treg细胞的扩增的图。
图2A-2I是示出使用(1)2t2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素或(2)重组人IL-2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素刺激Treg细胞之后Helios+、CTLA-4+、CD39+、CD62L+、CD25+、CD103+、CD69+、PD1+和CD49b+标志物增加的图。
图3A-3D是示出使用(1)2t2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素或(2)重组人IL-2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素激活人Treg细胞后的葡萄糖代谢水平的图。图3A示出了Treg细胞的糖酵解水平。图3B示出了Treg细胞的糖酵解能力水平。图3C示出了Treg细胞的糖酵解储备水平。图3D示出了Treg细胞的非糖酵解酸化水平。
图4是示出先前使用(1)2t2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素或(2)重组人IL-2、CD3/CD28珠粒和雷帕霉素刺激的Treg细胞抑制自体T应答细胞的图。
图5是示出T应答细胞抑制测定中Treg细胞分泌IL-10水平的图，其中Treg细胞先前使用(1)2t2和CD3/CD28珠粒(在存在或不存在雷帕霉素的情况下)或(2)重组人IL-2和CD3/CD28珠粒(在存在或不存在雷帕霉素的情况下)刺激。
图6A-6B示出了产生的融合蛋白的示例性图，包含抗CD3scFv/TF/IL15D8N突变体(3t15*)和抗CD28scFv/IL15RαSu(28s)融合蛋白。
图7是示出通过免疫亲和色谱法从抗-TF抗体亲和柱的3t15*-28s纯化洗脱的图。
图8示出了3t15*-28s的尺寸排阻色谱法分析。
图9示出了从抗TF抗体亲和色谱法纯化的3t15*-28s的SDS凝胶。泳道1：3t15*-28s；泳道2：SeeBlue Plus 2预染标准物(左侧的数字指示分子量，单位为千道尔顿)。
图10A是示出3t15*-28s与CD28之间的相互作用的图。
图10B是示出3t15*-28s与CD3之间的相互作用的图。
图11是示出Foxp3+调节性T细胞在含有2t2和3t15*-28s的培养基中的扩增的图。
图12是示出在含有2t2和3t15*-28s的含有或不含抗TF抗体的培养基中温育后增殖的人免疫细胞水平的图。
图13A示出了指示用不同纯化方案分离的CD39+调节性T细胞的纯度的流式细胞术直方图。
图13B示出了指示使用抗CD39 Ab试剂分离的CD39+调节性T细胞的纯度的流式细胞术直方图。
图14示出了描绘用使用不同方法分离的调节性T细胞温育后的T应答细胞增殖水平的柱状图。
图15示出了用使用不同方法分离的T调节性细胞温育后的T应答细胞增殖(如通过IL-10水平评估)的图表。
具体实施方式
本文提供了刺激或增加Treg细胞(例如，本文所描述的任何Treg细胞)的增殖的方法、使用本文所描述的任何方法产生的Treg细胞群、包含这些Treg细胞群中的任何细胞群的组合物以及包含施用这些Treg细胞群中的任何细胞群或组合物的治疗受试者的方法。
组织因子
人组织因子是263个氨基酸的跨膜蛋白，其含有三个结构域：(1)219个氨基酸的N端胞外结构域(残基1-219)；(2)22个氨基酸的跨膜结构域(残基220-242)；和(3)21个氨基酸的胞质C端尾(残基242-263)((UniProtKB标识符编号：P13726)。胞质尾在Ser253和Ser258处含有两个磷酸化位点，在Cys245处含有一个S-棕榈酰化位点。没有发现胞质结构域的缺失或突变影响组织因子凝血活性。组织因子在蛋白质胞内结构域中Cys245处具有一个S-棕榈酰化位点。Cys245位于胞内结构域的氨基酸端，并且靠近膜表面。组织因子跨膜结构域由单跨度的α-螺旋构成。
由两个纤连蛋白III型结构域构成的组织因子的细胞外结构域通过六氨基酸接头与跨膜结构域连接。这一接头提供构象灵活性，以使组织因子细胞外结构域与其跨膜结构域和胞质结构域解偶联。每个组织因子纤连蛋白III型模块均由两个重叠的β折叠构成，其中顶层折叠结构域含有三个反平行的β链，而底层折叠含有四个β链。链βA与βB、βC与βD以及βE与βF之间通过β环连接β链，所有这些链在两个模块中均具有保守的构象。有三个短的α螺旋段连接β链。组织因子的独特特征是链β10与链β11之间的17个氨基酸的β发夹，这不是纤连蛋白超家族的共同成分。N端结构域还在β6F与β7G之间包含一个12个氨基酸的环，所述环不存在于C端结构域，并且是组织因子特有的。这种纤连蛋白III型结构域结构是免疫球蛋白样家族蛋白质折叠的特征，并且在广泛多种细胞外蛋白中是保守的。
一旦酶原FVII与组织结合形成活性组织因子-FVIIa复合物，就可通过有限的蛋白水解将其迅速转化成FVIIa。FVIIa以大约0.1nM(血浆FVII的1％)的浓度作为酶循环，也可以直接结合到组织因子。组织因子与FVIIa在组织因子-FVIIa复合物上的变构相互作用极大地提高了FVIIa的酶促活性：小的发色肽基底物的水解速率提高约20到100倍，并且天然大分子底物FIX和FX的激活速率提高接近一百万倍。与结合到组织因子时FVIIa活性位点的变构激活相一致，磷脂双层上组织因子-FVIIa复合物的形成(即，当磷脂酰基-L-丝氨酸暴露在膜表面时)以Ca2+依赖性方式将FIX或FX激活速率再提高1,000倍。相对于游离FVIIa，组织因子-FVIIa-磷脂复合物对FX激活的大约百万倍总体增加是凝血级联反应的关键调节点。
FVII是约50kDa的单链多肽，由406个氨基酸残基组成，具有N端富含γ-羧基谷氨酸(GLA)的结构域、两个表皮生长因子样结构域(EGF1和EFG2)和C端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII通过在EGF2与蛋白酶结构域之间的短接头区中Ile-154-Arg152键的特异性蛋白水解裂解而被激活为FVIIa。这种裂解引起轻链和重链通过Cys135和Cys262的单个二硫键固定在一起。FVIIa通过其N端GLA结构域以Ca2+依赖性方式结合磷脂膜。GLA结构域的C端紧邻芳香族堆叠和两个EGF结构域。芳香族堆叠将GLA连接到结合单个Ca2+离子的EGF1结构域。占用这一Ca2+结合位点会增加FVIIa酰胺分解活性和组织因子缔合。催化三联体由His193、Asp242和Ser344组成，并且FVIIa蛋白酶结构域内单个Ca2+离子的结合对其催化活性至关重要。FVII对FVIIa的蛋白水解激活释放了Ile153处新形成的氨基端，使其向后折叠并且插入激活袋中，与Asp343的羧酸盐形成盐桥，以生成氧阴离子孔。这一盐桥的形成对于FVIIa活性至关重要。但是，在蛋白水解激活后，游离的FVIIa中不会发生氧阴离子孔的形成。结果，FVIIa以酶原样状态循环，血浆蛋白酶抑制剂不能很好识别所述状态，使其以大约90分钟的半衰期循环。
FVIIa活性位点在膜表面上方的组织因子介导的定位对于FVIIa朝向同源底物很重要。游离FVIIa在结合到膜上时采用稳定扩展结构，其活性位点定位在膜表面上方约
Figure BDA0003872613750000391
FVIIa与组织因子结合后，FVa活性位点将重新定位为更靠近膜约
Figure BDA0003872613750000392
这种调节可帮助FVIIa催化三联体与靶标底物裂解位点适当对齐。使用无GLA结构域的FVIIa，已显示活性位点仍位于膜上方相似的距离，证明即使在没有FVIIa-膜相互作用的情况下，组织因子也能够完全支持FVIIa活性位点定位。另外的数据显示，只要组织因子细胞外结构域以某种方式系栓到膜表面，组织因子就支持完全FVIIa蛋白水解活性。但是，将FVIIa的活性位点提高到膜表面上方大于
Figure BDA0003872613750000393
会大大降低组织因子-FVIIa复合物激活FX的能力，但不会降低组织因子-FVIIa的酰胺分解活性。
丙氨酸扫描诱变已用于评定组织因子细胞外结构域中特定氨基酸侧链对与FVIIa相互作用的作用(Gibbs等人,《生物化学(Biochemistry)》33(47):14003-14010,1994；Schullek等人,《生物化学杂志(J Biol Chem)》269(30):19399-19403,1994)。丙氨酸取代鉴别出有限数量的残基位置，在这些位置处，丙氨酸置换引起对FVIIa结合的亲和力降低5到10倍。发现这些残基侧链中的大多数在晶体结构中充分暴露于溶剂，与大分子配体相互作用一致。FVIIa配体结合位点位于两个模块之间边界处的宽广区上。在C模块中，位于突出的B-C环上的残基Arg135和Phe140提供与FVIIa的独立接触。Leu133位于手指状结构的基底部，并且挤入两个模块之间的裂缝中。这提供由Lys20、Thr60、Asp58和Ile22组成的重要结合残基的主要簇的连续性。Thr60仅部分暴露于溶剂，并且可能起局部结构作用，而不是与配体显著接触。结合位点延伸到模块间角的凹面，其涉及Glu24和Gln110，并且可能涉及更远的残基Val207。结合区从Asp58延伸到由Lys48、Lys46、Gln37、Asp44和Trp45形成的凸表面区。Trp45和Asp44不会独立地与FVIIa相互作用，这表明Trp45位置处的突变效应可能反映这一侧链对邻近Asp44和Gln37侧链的局部堆积的结构重要性。相互作用区进一步包含两个表面暴露的芳香族残基Phe76和Tyr78，其在N模块中形成疏水簇的一部分。
组织因子-FVIIa的已知生理底物是FVII、FIX和FX以及某些蛋白酶激活受体。突变分析已鉴别出许多残基，当突变时，所述残基支持对小肽基底物的完全FVIIa酰胺分解活性，但缺少支持大分子底物(即，FVII、FIX和FX)激活的能力(Ruf等人,《生物化学杂志》267(31):22206-22210,1992；Ruf等人,《生物化学杂志》267(9):6375-6381,1992；Huang等人,《生物化学杂志》271(36):21752-21757,1996；Kirchhofer等人,《生物化学》39(25):7380-7387,2000)。已显示在残基159-165处的组织因子环区和在这一柔性环中或附近的残基对于组织因子-FVIIa复合物的蛋白水解活性至关重要。这定义了提出的组织因子的底物结合位点外区，所述区与FVIIa活性位点相距甚远。甘氨酸残基被稍大的残基丙氨酸取代会大大损害组织因子-FVIIa的蛋白水解活性。这表明甘氨酸提供的柔性对于用于组织因子大分子底物识别的残基159-165的环至关重要。
还证明了残基Lys165和Lys166对于底物识别和结合很重要。这些残基中的任何一个突变为丙氨酸均会引起组织因子辅助因子功能的显著降低。在大多数组织因子-FVIIa结构中，Lys165和Lys166彼此背对，Lys165指向FVIIa，而Lys166指向晶体结构中的底物结合位点外区。FVIIa的Lys165和Gla35之间的推定盐桥形成将支持组织因子与FVIIa的GLA结构域相互作用调节底物识别的观点。这些结果表明，组织因子胞外结构域的C端部分直接与FIX和FX的GLA结构域、可能的邻近EGF1结构域相互作用，并且FVIIa GLA结构域的存在可以直接或间接调节这些相互作用。
多链嵌合多肽
细胞活化剂的非限制性实例是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包含：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合。
在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的第一靶标结合结构域中的任一种)和可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在第一嵌合多肽中的第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的示例性第一靶标结合结构域中的任一种)与可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)在第一嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在第一嵌合多肽中的可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述的示例性第二靶标结合结构域中的任一种)在第二嵌合多肽中彼此直接邻接。在本文描述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，
第二嵌合多肽进一步包括在一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文描述的任一对示例性亲和结构域中的任一个示例性第二结构域)与第二嵌合多肽中的第二靶标结合结构域(例如，本文描述的任一个示例性第二靶标结合结构域)之间的接头序列(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性接头序列)。
在本文所述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的一者或两者特异性地结合到选自由以下组成的群组的靶标：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘素、CEACAM5、UL16结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体和CD28的受体。
在本文所描述的任何多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所描述的或所属领域中已知的任何示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所描述的或所属领域中已知的任何示例性示例性靶标结合结构域)中的一者或两者是可溶性白细胞介素或细胞因子蛋白。可溶性白细胞介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的非限制性实例包含：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD和SCF。
在本文所述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一者或两者(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)是可溶性白细胞介素或细胞因子受体。可溶性白细胞介素受体和可溶性细胞因子受体的非限制性实例包含：可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、可溶性CD122、可溶性CD3或可溶性CD28。
在本文所述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一者或两者是可溶性白细胞介素受体或细胞因子受体。在本文所述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、TNFα的可溶性受体、IL-4的可溶性受体，或IL-10的可溶性受体。
可溶性组织因子结构域
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域的野生型组织因子多肽。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是组织因子突变体，其中野生型组织因子多肽缺少信号序列、跨膜结构域和细胞内结构域，并且已在所选氨基酸处经过进一步修饰。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性人组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实例中，可溶性组织因子结构域可为大鼠可溶性组织因子结构域。下文显示可溶性人组织因子结构域、小鼠可溶性组织因子结构域、大鼠可溶性组织因子结构域和突变可溶性组织因子结构域的非限制性实例。
示例性可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:2)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
编码可溶性人组织因子结构域的示例性核酸(SEQ ID NO:13)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
示例性可溶性小鼠组织因子结构域(SEQ ID NO:14)
agipekafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwknkcfsttdtecdltdeivkdvtwayeakvlsvprrnsvhgdgdqlvihgeeppftnapkflpyrdtnlgqpviqqfeqdgrklnvvvkdsltlvrkngtfltlrqvfgkdlgyiityrkgsstgkktnitntnefsidveegvsycffvqamifsrktnqnspgsstvcteqwksflge
示例性可溶性大鼠组织因子结构域(SEQ ID NO:15)
Agtppgkafnltwistdfktilewqpkptnytytvqisdrsrnwkykctgttdtecdltdeivkdvnwtyearvlsvpwrnsthgketlfgthgeeppftnarkflpyrdtkigqpviqkyeqggtklkvtvkdsftlvrkngtfltlrqvfgndlgyiltyrkdsstgrktntthtneflidvekgvsycffaqavifsrktnhkspesitkcteqwksvlge
示例性突变体可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:16)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
示例性突变体可溶性人组织因子结构域(SEQ ID NO:17)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFATALEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDAKSKCFYTTDTECALTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLAENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVARNNTALSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以包含与SEQ ID NO:2、14、15、16或17至少70％相同、至少72％相同、至少74％相同、至少76％相同、至少78％相同、至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以包含SEQ ID NO:2、14、15、16或17的序列，其中从其N末端去除了一到二十个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸)和/或从其C端去除了一到二十个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸)。
如本领域中可了解，本领域技术人员将理解，在不同哺乳动物物种之间保守的氨基酸的突变更可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性，而在不同哺乳动物物种之间不具保守性的氨基酸的突变不太可能降低蛋白质的活性和/或结构稳定性。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域不能结合到因子VIIa。在一些实例中，可溶性组织因子结构域不将非活性因子X转化成因子Xa。在一些实施例中，本文所描述的任何单链嵌合多肽或多链嵌合多肽不刺激哺乳动物的血液凝固。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性小鼠组织因子结构域。在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以是可溶性大鼠组织因子结构域。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的一者或多者(例如，两者、三者、四者、五者、六者或七者)：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域包含以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在一些实施例中，突变体可溶性组织因子具有SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在一些实例中，可溶性组织因子结构域可以由包含与SEQ ID NO:13至少70％相同、至少72％相同、至少74％相同、至少76％相同、至少78％相同、至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域的总长度可以为约20个氨基酸到约220个氨基酸、约20个氨基酸到约215个氨基酸、约20个氨基酸到约210个氨基酸、约20个氨基酸到约205个氨基酸、约20个氨基酸到约200个氨基酸、约20个氨基酸到约195个氨基酸、约20个氨基酸到约190个氨基酸、约20个氨基酸到约185个氨基酸、约20个氨基酸到约180个氨基酸、约20个氨基酸到约175个氨基酸、约20个氨基酸到约170个氨基酸、约20个氨基酸到约165个氨基酸、约20个氨基酸到约160个氨基酸、约20个氨基酸到约155个氨基酸、约20个氨基酸到约150个氨基酸、约20个氨基酸到约145个氨基酸、约20个氨基酸到约140个氨基酸、约20个氨基酸到约135个氨基酸、约20个氨基酸到约130个氨基酸、约20个氨基酸到约125个氨基酸、约20个氨基酸到约120个氨基酸、约20个氨基酸到约115个氨基酸、约20个氨基酸到约110个氨基酸、约20个氨基酸到约105个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约95个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约85个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约75个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约220个氨基酸、约30个氨基酸到约215个氨基酸、约30个氨基酸到约210个氨基酸、约30个氨基酸到约205个氨基酸、约30个氨基酸到约200个氨基酸、约30个氨基酸到约195个氨基酸、约30个氨基酸到约190个氨基酸、约30个氨基酸到约185个氨基酸、约30个氨基酸到约180个氨基酸、约30个氨基酸到约175个氨基酸、约30个氨基酸到约170个氨基酸、约30个氨基酸到约165个氨基酸、约30个氨基酸到约160个氨基酸、约30个氨基酸到约155个氨基酸、约30个氨基酸到约150个氨基酸、约30个氨基酸到约145个氨基酸、约30个氨基酸到约140个氨基酸、约30个氨基酸到约135个氨基酸、约30个氨基酸到约130个氨基酸、约30个氨基酸到约125个氨基酸、约30个氨基酸到约120个氨基酸、约30个氨基酸到约115个氨基酸、约30个氨基酸到约110个氨基酸、约30个氨基酸到约105个氨基酸、约30个氨基酸到约100个氨基酸、约30个氨基酸到约95个氨基酸、约30个氨基酸到约90个氨基酸、约30个氨基酸到约85个氨基酸、约30个氨基酸到约80个氨基酸、约30个氨基酸到约75个氨基酸、约30个氨基酸到约70个氨基酸、约30个氨基酸到约60个氨基酸、约30个氨基酸到约50个氨基酸、约30个氨基酸到约40个氨基酸、约40个氨基酸到约220个氨基酸、约40个氨基酸到约215个氨基酸、约40个氨基酸到约210个氨基酸、约40个氨基酸到约205个氨基酸、约40个氨基酸到约200个氨基酸、约40个氨基酸到约195个氨基酸、约40个氨基酸到约190个氨基酸、约40个氨基酸到约185个氨基酸、约40个氨基酸到约180个氨基酸、约40个氨基酸到约175个氨基酸、约40个氨基酸到约170个氨基酸、约40个氨基酸到约165个氨基酸、约40个氨基酸到约160个氨基酸、约40个氨基酸到约155个氨基酸、约40个氨基酸到约150个氨基酸、约40个氨基酸到约145个氨基酸、约40个氨基酸到约140个氨基酸、约40个氨基酸到约135个氨基酸、约40个氨基酸到约130个氨基酸、约40个氨基酸到约125个氨基酸、约40个氨基酸到约120个氨基酸、约40个氨基酸到约115个氨基酸、约40个氨基酸到约110个氨基酸、约40个氨基酸到约105个氨基酸、约40个氨基酸到约100个氨基酸、约40个氨基酸到约95个氨基酸、约40个氨基酸到约90个氨基酸、约40个氨基酸到约85个氨基酸、约40个氨基酸到约80个氨基酸、约40个氨基酸到约75个氨基酸、约40个氨基酸到约70个氨基酸、约40个氨基酸到约60个氨基酸、约40个氨基酸到约50个氨基酸、约50个氨基酸到约220个氨基酸、约50个氨基酸到约215个氨基酸、约50个氨基酸到约210个氨基酸、约50个氨基酸到约205个氨基酸、约50个氨基酸到约200个氨基酸、约50个氨基酸到约195个氨基酸、约50个氨基酸到约190个氨基酸、约50个氨基酸到约185个氨基酸、约50个氨基酸到约180个氨基酸、约50个氨基酸到约175个氨基酸、约50个氨基酸到约170个氨基酸、约50个氨基酸到约165个氨基酸、约50个氨基酸到约160个氨基酸、约50个氨基酸到约155个氨基酸、约50个氨基酸到约150个氨基酸、约50个氨基酸到约145个氨基酸、约50个氨基酸到约140个氨基酸、约50个氨基酸到约135个氨基酸、约50个氨基酸到约130个氨基酸、约50个氨基酸到约125个氨基酸、约50个氨基酸到约120个氨基酸、约50个氨基酸到约115个氨基酸、约50个氨基酸到约110个氨基酸、约50个氨基酸到约105个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约50个氨基酸到约95个氨基酸、约50个氨基酸到约90个氨基酸、约50个氨基酸到约85个氨基酸、约50个氨基酸到约80个氨基酸、约50个氨基酸到约75个氨基酸、约50个氨基酸到约70个氨基酸、约50个氨基酸到约60个氨基酸、约60个氨基酸到约220个氨基酸、约60个氨基酸到约215个氨基酸、约60个氨基酸到约210个氨基酸、约60个氨基酸到约205个氨基酸、约60个氨基酸到约200个氨基酸、约60个氨基酸到约195个氨基酸、约60个氨基酸到约190个氨基酸、约60个氨基酸到约185个氨基酸、约60个氨基酸到约180个氨基酸、约60个氨基酸到约175个氨基酸、约60个氨基酸到约170个氨基酸、约60个氨基酸到约165个氨基酸、约60个氨基酸到约160个氨基酸、约60个氨基酸到约155个氨基酸、约60个氨基酸到约150个氨基酸、约60个氨基酸到约145个氨基酸、约60个氨基酸到约140个氨基酸、约60个氨基酸到约135个氨基酸、约60个氨基酸到约130个氨基酸、约60个氨基酸到约125个氨基酸、约60个氨基酸到约120个氨基酸、约60个氨基酸到约115个氨基酸、约60个氨基酸到约110个氨基酸、约60个氨基酸到约105个氨基酸、约60个氨基酸到约100个氨基酸、约60个氨基酸到约95个氨基酸、约60个氨基酸到约90个氨基酸、约60个氨基酸到约85个氨基酸、约60个氨基酸到约80个氨基酸、约60个氨基酸到约75个氨基酸、约60个氨基酸到约70个氨基酸、约70个氨基酸到约220个氨基酸、约70个氨基酸到约215个氨基酸、约70个氨基酸到约210个氨基酸、约70个氨基酸到约205个氨基酸、约70个氨基酸到约200个氨基酸、约70个氨基酸到约195个氨基酸、约70个氨基酸到约190个氨基酸、约70个氨基酸到约185个氨基酸、约70个氨基酸到约180个氨基酸、70个氨基酸到约175个氨基酸、约70个氨基酸到约170个氨基酸、约70个氨基酸到约165个氨基酸、约70个氨基酸到约160个氨基酸、约70个氨基酸到约155个氨基酸、约70个氨基酸到约150个氨基酸、约70个氨基酸到约145个氨基酸、约70个氨基酸到约140个氨基酸、约70个氨基酸到约135个氨基酸、约70个氨基酸到约130个氨基酸、约70个氨基酸到约125个氨基酸、约70个氨基酸到约120个氨基酸、约70个氨基酸到约115个氨基酸、约70个氨基酸到约110个氨基酸、约70个氨基酸到约105个氨基酸、约70个氨基酸到约100个氨基酸、约70个氨基酸到约95个氨基酸、约70个氨基酸到约90个氨基酸、约70个氨基酸到约85个氨基酸、约70个氨基酸到约80个氨基酸、约80个氨基酸到约220个氨基酸、约80个氨基酸到约215个氨基酸、约80个氨基酸到约210个氨基酸、约80个氨基酸到约205个氨基酸、约80个氨基酸到约200个氨基酸、约80个氨基酸到约195个氨基酸、约80个氨基酸到约190个氨基酸、约80个氨基酸到约185个氨基酸、约80个氨基酸到约180个氨基酸、约80个氨基酸到约175个氨基酸、约80个氨基酸到约170个氨基酸、约80个氨基酸到约165个氨基酸、约80个氨基酸到约160个氨基酸、约80个氨基酸到约155个氨基酸、约80个氨基酸到约150个氨基酸、约80个氨基酸到约145个氨基酸、约80个氨基酸到约140个氨基酸、约80个氨基酸到约135个氨基酸、约80个氨基酸到约130个氨基酸、约80个氨基酸到约125个氨基酸、约80个氨基酸到约120个氨基酸、约80个氨基酸到约115个氨基酸、约80个氨基酸到约110个氨基酸、约80个氨基酸到约105个氨基酸、约80个氨基酸到约100个氨基酸、约80个氨基酸到约95个氨基酸、约80个氨基酸到约90个氨基酸、约90个氨基酸到约220个氨基酸、约90个氨基酸到约215个氨基酸、约90个氨基酸到约210个氨基酸、约90个氨基酸到约205个氨基酸、约90个氨基酸到约200个氨基酸、约90个氨基酸到约195个氨基酸、约90个氨基酸到约190个氨基酸、约90个氨基酸到约185个氨基酸、约90个氨基酸到约180个氨基酸、约90个氨基酸到约175个氨基酸、约90个氨基酸到约170个氨基酸、约90个氨基酸到约165个氨基酸、约90个氨基酸到约160个氨基酸、约90个氨基酸到约155个氨基酸、约90个氨基酸到约150个氨基酸、约90个氨基酸到约145个氨基酸、约90个氨基酸到约140个氨基酸、约90个氨基酸到约135个氨基酸、约90个氨基酸到约130个氨基酸、约90个氨基酸到约125个氨基酸、约90个氨基酸到约120个氨基酸、约90个氨基酸到约115个氨基酸、约90个氨基酸到约110个氨基酸、约90个氨基酸到约105个氨基酸、约90个氨基酸到约100个氨基酸、约100个氨基酸到约220个氨基酸、约100个氨基酸到约215个氨基酸、约100个氨基酸到约210个氨基酸、约100个氨基酸到约205个氨基酸、约100个氨基酸到约200个氨基酸、约100个氨基酸到约195个氨基酸、约100个氨基酸到约190个氨基酸、约100个氨基酸到约185个氨基酸、约100个氨基酸到约180个氨基酸、约100个氨基酸到约175个氨基酸、约100个氨基酸到约170个氨基酸、约100个氨基酸到约165个氨基酸、约100个氨基酸到约160个氨基酸、约100个氨基酸到约155个氨基酸、约100个氨基酸到约150个氨基酸、约100个氨基酸到约145个氨基酸、约100个氨基酸到约140个氨基酸、约100个氨基酸到约135个氨基酸、约100个氨基酸到约130个氨基酸、约100个氨基酸到约125个氨基酸、约100个氨基酸到约120个氨基酸、约100个氨基酸到约115个氨基酸、约100个氨基酸到约110个氨基酸、约110个氨基酸到约220个氨基酸、约110个氨基酸到约215个氨基酸、约110个氨基酸到约210个氨基酸、约110个氨基酸到约205个氨基酸、约110个氨基酸到约200个氨基酸、约110个氨基酸到约195个氨基酸、约110个氨基酸到约190个氨基酸、约110个氨基酸到约185个氨基酸、约110个氨基酸到约180个氨基酸、约110个氨基酸到约175个氨基酸、约110个氨基酸到约170个氨基酸、约110个氨基酸到约165个氨基酸、约110个氨基酸到约160个氨基酸、约110个氨基酸到约155个氨基酸、约110个氨基酸到约150个氨基酸、约110个氨基酸到约145个氨基酸、约110个氨基酸到约140个氨基酸、约110个氨基酸到约135个氨基酸、约110个氨基酸到约130个氨基酸、约110个氨基酸到约125个氨基酸、约110个氨基酸到约120个氨基酸、约110个氨基酸到约115个氨基酸、约115个氨基酸到约220个氨基酸、约115个氨基酸到约215个氨基酸、约115个氨基酸到约210个氨基酸、约115个氨基酸到约205个氨基酸、约115个氨基酸到约200个氨基酸、约115个氨基酸到约195个氨基酸、约115个氨基酸到约190个氨基酸、约115个氨基酸到约185个氨基酸、约115个氨基酸到约180个氨基酸、约115个氨基酸到约175个氨基酸、约115个氨基酸到约170个氨基酸、约115个氨基酸到约165个氨基酸、约115个氨基酸到约160个氨基酸、约115个氨基酸到约155个氨基酸、约115个氨基酸到约150个氨基酸、约115个氨基酸到约145个氨基酸、约115个氨基酸到约140个氨基酸、约115个氨基酸到约135个氨基酸、约115个氨基酸到约130个氨基酸、约115个氨基酸到约125个氨基酸、约115个氨基酸到约120个氨基酸、约120个氨基酸到约220个氨基酸、约120个氨基酸到约215个氨基酸、约120个氨基酸到约210个氨基酸、约120个氨基酸到约205个氨基酸、约120个氨基酸到约200个氨基酸、约120个氨基酸到约195个氨基酸、约120个氨基酸到约190个氨基酸、约120个氨基酸到约185个氨基酸、约120个氨基酸到约180个氨基酸、约120个氨基酸到约175个氨基酸、约120个氨基酸到约170个氨基酸、约120个氨基酸到约165个氨基酸、约120个氨基酸到约160个氨基酸、约120个氨基酸到约155个氨基酸、约120个氨基酸到约150个氨基酸、约120个氨基酸到约145个氨基酸、约120个氨基酸到约140个氨基酸、约120个氨基酸到约135个氨基酸、约120个氨基酸到约130个氨基酸、约120个氨基酸到约125个氨基酸、约125个氨基酸到约220个氨基酸、约125个氨基酸到约215个氨基酸、约125个氨基酸到约210个氨基酸、约125个氨基酸到约205个氨基酸、约125个氨基酸到约200个氨基酸、约125个氨基酸到约195个氨基酸、约125个氨基酸到约190个氨基酸、约125个氨基酸到约185个氨基酸、约125个氨基酸到约180个氨基酸、约125个氨基酸到约175个氨基酸、约125个氨基酸到约170个氨基酸、约125个氨基酸到约165个氨基酸、约125个氨基酸到约160个氨基酸、约125个氨基酸到约155个氨基酸、约125个氨基酸到约150个氨基酸、约125个氨基酸到约145个氨基酸、约125个氨基酸到约140个氨基酸、约125个氨基酸到约135个氨基酸、约125个氨基酸到约130个氨基酸、约130个氨基酸到约220个氨基酸、约130个氨基酸到约215个氨基酸、约130个氨基酸到约210个氨基酸、约130个氨基酸到约205个氨基酸、约130个氨基酸到约200个氨基酸、约130个氨基酸到约195个氨基酸、约130个氨基酸到约190个氨基酸、约130个氨基酸到约185个氨基酸、约130个氨基酸到约180个氨基酸、约130个氨基酸到约175个氨基酸、约130个氨基酸到约170个氨基酸、约130个氨基酸到约165个氨基酸、约130个氨基酸到约160个氨基酸、约130个氨基酸到约155个氨基酸、约130个氨基酸到约150个氨基酸、约130个氨基酸到约145个氨基酸、约130个氨基酸到约140个氨基酸、约130个氨基酸到约135个氨基酸、约135个氨基酸到约220个氨基酸、约135个氨基酸到约215个氨基酸、约135个氨基酸到约210个氨基酸、约135个氨基酸到约205个氨基酸、约135个氨基酸到约200个氨基酸、约135个氨基酸到约195个氨基酸、约135个氨基酸到约190个氨基酸、约135个氨基酸到约185个氨基酸、约135个氨基酸到约180个氨基酸、约135个氨基酸到约175个氨基酸、约135个氨基酸到约170个氨基酸、约135个氨基酸到约165个氨基酸、约135个氨基酸到约160个氨基酸、约135个氨基酸到约155个氨基酸、约135个氨基酸到约150个氨基酸、约135个氨基酸到约145个氨基酸、约135个氨基酸到约140个氨基酸、约140个氨基酸到约220个氨基酸、约140个氨基酸到约215个氨基酸、约140个氨基酸到约210个氨基酸、约140个氨基酸到约205个氨基酸、约140个氨基酸到约200个氨基酸、约140个氨基酸到约195个氨基酸、约140个氨基酸到约190个氨基酸、约140个氨基酸到约185个氨基酸、约140个氨基酸到约180个氨基酸、约140个氨基酸到约175个氨基酸、约140个氨基酸到约170个氨基酸、约140个氨基酸到约165个氨基酸、约140个氨基酸到约160个氨基酸、约140个氨基酸到约155个氨基酸、约140个氨基酸到约150个氨基酸、约140个氨基酸到约145个氨基酸、约145个氨基酸到约220个氨基酸、约145个氨基酸到约215个氨基酸、约145个氨基酸到约210个氨基酸、约145个氨基酸到约205个氨基酸、约145个氨基酸到约200个氨基酸、约145个氨基酸到约195个氨基酸、约145个氨基酸到约190个氨基酸、约145个氨基酸到约185个氨基酸、约145个氨基酸到约180个氨基酸、约145个氨基酸到约175个氨基酸、约145个氨基酸到约170个氨基酸、约145个氨基酸到约165个氨基酸、约145个氨基酸到约160个氨基酸、约145个氨基酸到约155个氨基酸、约145个氨基酸到约150个氨基酸、约150个氨基酸到约220个氨基酸、约150个氨基酸到约215个氨基酸、约150个氨基酸到约210个氨基酸、约150个氨基酸到约205个氨基酸、约150个氨基酸到约200个氨基酸、约150个氨基酸到约195个氨基酸、约150个氨基酸到约190个氨基酸、约150个氨基酸到约185个氨基酸、约150个氨基酸到约180个氨基酸、约150个氨基酸到约175个氨基酸、约150个氨基酸到约170个氨基酸、约150个氨基酸到约165个氨基酸、约150个氨基酸到约160个氨基酸、约150个氨基酸到约155个氨基酸、约155个氨基酸到约220个氨基酸、约155个氨基酸到约215个氨基酸、约155个氨基酸到约210个氨基酸、约155个氨基酸到约205个氨基酸、约155个氨基酸到约200个氨基酸、约155个氨基酸到约195个氨基酸、约155个氨基酸到约190个氨基酸、约155个氨基酸到约185个氨基酸、约155个氨基酸到约180个氨基酸、约155个氨基酸到约175个氨基酸、约155个氨基酸到约170个氨基酸、约155个氨基酸到约165个氨基酸、约155个氨基酸到约160个氨基酸、约160个氨基酸到约220个氨基酸、约160个氨基酸到约215个氨基酸、约160个氨基酸到约210个氨基酸、约160个氨基酸到约205个氨基酸、约160个氨基酸到约200个氨基酸、约160个氨基酸到约195个氨基酸、约160个氨基酸到约190个氨基酸、约160个氨基酸到约185个氨基酸、约160个氨基酸到约180个氨基酸、约160个氨基酸到约175个氨基酸、约160个氨基酸到约170个氨基酸、约160个氨基酸到约165个氨基酸、约165个氨基酸到约220个氨基酸、约165个氨基酸到约215个氨基酸、约165个氨基酸到约210个氨基酸、约165个氨基酸到约205个氨基酸、约165个氨基酸到约200个氨基酸、约165个氨基酸到约195个氨基酸、约165个氨基酸到约190个氨基酸、约165个氨基酸到约185个氨基酸、约165个氨基酸到约180个氨基酸、约165个氨基酸到约175个氨基酸、约165个氨基酸到约170个氨基酸、约170个氨基酸到约220个氨基酸、约170个氨基酸到约215个氨基酸、约170个氨基酸到约210个氨基酸、约170个氨基酸到约205个氨基酸、约170个氨基酸到约200个氨基酸、约170个氨基酸到约195个氨基酸、约170个氨基酸到约190个氨基酸、约170个氨基酸到约185个氨基酸、约170个氨基酸到约180个氨基酸、约170个氨基酸到约175个氨基酸、约175个氨基酸到约220个氨基酸、约175个氨基酸到约215个氨基酸、约175个氨基酸到约210个氨基酸、约175个氨基酸到约205个氨基酸、约175个氨基酸到约200个氨基酸、约175个氨基酸到约195个氨基酸、约175个氨基酸到约190个氨基酸、约175个氨基酸到约185个氨基酸、约175个氨基酸到约180个氨基酸、约180个氨基酸到约220个氨基酸、约180个氨基酸到约215个氨基酸、约180个氨基酸到约210个氨基酸、约180个氨基酸到约205个氨基酸、约180个氨基酸到约200个氨基酸、约180个氨基酸到约195个氨基酸、约180个氨基酸到约190个氨基酸、约180个氨基酸到约185个氨基酸、约185个氨基酸到约220个氨基酸、约185个氨基酸到约215个氨基酸、约185个氨基酸到约210个氨基酸、约185个氨基酸到约205个氨基酸、约185个氨基酸到约200个氨基酸、约185个氨基酸到约195个氨基酸、约185个氨基酸到约190个氨基酸、约190个氨基酸到约220个氨基酸、约190个氨基酸到约215个氨基酸、约190个氨基酸到约210个氨基酸、约190个氨基酸到约205个氨基酸、约190个氨基酸到约200个氨基酸、约190个氨基酸到约195个氨基酸、约195个氨基酸到约220个氨基酸、约195个氨基酸到约215个氨基酸、约195个氨基酸到约210个氨基酸、约195个氨基酸到约205个氨基酸、约195个氨基酸到约200个氨基酸、约200个氨基酸到约220个氨基酸、约200个氨基酸到约215个氨基酸、约200个氨基酸到约210个氨基酸、约200个氨基酸到约205个氨基酸、约205个氨基酸到约220个氨基酸、约205个氨基酸到约215个氨基酸、约205个氨基酸到约210个氨基酸、约210个氨基酸到约220个氨基酸、约210个氨基酸到约215个氨基酸或约215个氨基酸到约220个氨基酸。
在一些实施例中，可溶性组织因子结构域可以包括或由人可溶性野生型组织因子(或其任何序列)组成。
接头序列
在一些实施例中，接头序列可以是柔性接头序列。可以使用的接头序列的非限制性实例描述于Klein等人，《蛋白质工程、设计和选择(Protein Engineering,Design&Selection)》第27卷，第10期，第325-330页，2014；Priyanka等人，《蛋白质科学(ProteinSci.)》，2013年2月；22(2):153-167。在一些实例中，接头序列是合成接头序列。
在一些实施例中，本文所述的任一种单链嵌合多肽可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在一些实施例中，本文所述的任一种单链嵌合多肽可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如相同或不同的接头序列，例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文所描述的任何第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的一些实施例中可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，相同或不同的接头序列，例如，本文所描述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。在本文所描述的任何第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的一些实施例中可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个接头序列(例如，相同或不同的接头序列，例如，本文所描述的或本领域已知的任何示例性接头序列)。
在一些实施例中，接头序列的总长度可以为1个氨基酸到约100个氨基酸、1个氨基酸到约90个氨基酸、1个氨基酸到约80个氨基酸、1个氨基酸到约70个氨基酸、1个氨基酸到约60个氨基酸、1个氨基酸到约50个氨基酸、1个氨基酸到约45个氨基酸、1个氨基酸到约40个氨基酸、1个氨基酸到约35个氨基酸、1个氨基酸到约30个氨基酸、1个氨基酸到约25个氨基酸、1个氨基酸到约24个氨基酸、1个氨基酸到约22个氨基酸、1个氨基酸到约20个氨基酸、1个氨基酸到约18个氨基酸、1个氨基酸到约16个氨基酸、1个氨基酸到约14个氨基酸、1个氨基酸到约12个氨基酸、1个氨基酸到约10个氨基酸、1个氨基酸到约8个氨基酸、1个氨基酸到约6个氨基酸、1个氨基酸到约4个氨基酸、约2个氨基酸到约100个氨基酸、约2个氨基酸到约90个氨基酸、约2个氨基酸到约80个氨基酸、约2个氨基酸到约70个氨基酸、约2个氨基酸到约60个氨基酸、约2个氨基酸到约50个氨基酸、约2个氨基酸到约45个氨基酸、约2个氨基酸到约40个氨基酸、约2个氨基酸到约35个氨基酸、约2个氨基酸到约30个氨基酸、约2个氨基酸到约25个氨基酸、约2个氨基酸到约24个氨基酸、约2个氨基酸到约22个氨基酸、约2个氨基酸到约20个氨基酸、约2个氨基酸到约18个氨基酸、约2个氨基酸到约16个氨基酸、约2个氨基酸到约14个氨基酸、约2个氨基酸到约12个氨基酸、约2个氨基酸到约10个氨基酸、约2个氨基酸到约8个氨基酸、约2个氨基酸到约6个氨基酸、约2个氨基酸到约4个氨基酸、约4个氨基酸到约100个氨基酸、约4个氨基酸到约90个氨基酸、约4个氨基酸到约80个氨基酸、约4个氨基酸到约70个氨基酸、约4个氨基酸到约60个氨基酸、约4个氨基酸到约50个氨基酸、约4个氨基酸到约45个氨基酸、约4个氨基酸到约40个氨基酸、约4个氨基酸到约35个氨基酸、约4个氨基酸到约30个氨基酸、约4个氨基酸到约25个氨基酸、约4个氨基酸到约24个氨基酸、约4个氨基酸到约22个氨基酸、约4个氨基酸到约20个氨基酸、约4个氨基酸到约18个氨基酸、约4个氨基酸到约16个氨基酸、约4个氨基酸到约14个氨基酸、约4个氨基酸到约12个氨基酸、约4个氨基酸到约10个氨基酸、约4个氨基酸到约8个氨基酸、约4个氨基酸到约6个氨基酸、约6个氨基酸到约100个氨基酸、约6个氨基酸到约90个氨基酸、约6个氨基酸到约80个氨基酸、约6个氨基酸到约70个氨基酸、约6个氨基酸到约60个氨基酸、约6个氨基酸到约50个氨基酸、约6个氨基酸到约45个氨基酸、约6个氨基酸到约40个氨基酸、约6个氨基酸到约35个氨基酸、约6个氨基酸到约30个氨基酸、约6个氨基酸到约25个氨基酸、约6个氨基酸到约24个氨基酸、约6个氨基酸到约22个氨基酸、约6个氨基酸到约20个氨基酸、约6个氨基酸到约18个氨基酸、约6个氨基酸到约16个氨基酸、约6个氨基酸到约14个氨基酸、约6个氨基酸到约12个氨基酸、约6个氨基酸到约10个氨基酸、约6个氨基酸到约8个氨基酸、约8个氨基酸到约100个氨基酸、约8个氨基酸到约90个氨基酸、约8个氨基酸到约80个氨基酸、约8个氨基酸到约70个氨基酸、约8个氨基酸到约60个氨基酸、约8个氨基酸到约50个氨基酸、约8个氨基酸到约45个氨基酸、约8个氨基酸到约40个氨基酸、约8个氨基酸到约35个氨基酸、约8个氨基酸到约30个氨基酸、约8个氨基酸到约25个氨基酸、约8个氨基酸到约24个氨基酸、约8个氨基酸到约22个氨基酸、约8个氨基酸到约20个氨基酸、约8个氨基酸到约18个氨基酸、约8个氨基酸到约16个氨基酸、约8个氨基酸到约14个氨基酸、约8个氨基酸到约12个氨基酸、约8个氨基酸到约10个氨基酸、约10个氨基酸到约100个氨基酸、约10个氨基酸到约90个氨基酸、约10个氨基酸到约80个氨基酸、约10个氨基酸到约70个氨基酸、约10个氨基酸到约60个氨基酸、约10个氨基酸到约50个氨基酸、约10个氨基酸到约45个氨基酸、约10个氨基酸到约40个氨基酸、约10个氨基酸到约35个氨基酸、约10个氨基酸到约30个氨基酸、约10个氨基酸到约25个氨基酸、约10个氨基酸到约24个氨基酸、约10个氨基酸到约22个氨基酸、约10个氨基酸到约20个氨基酸、约10个氨基酸到约18个氨基酸、约10个氨基酸到约16个氨基酸、约10个氨基酸到约14个氨基酸、约10个氨基酸到约12个氨基酸、约12个氨基酸到约100个氨基酸、约12个氨基酸到约90个氨基酸、约12个氨基酸到约80个氨基酸、约12个氨基酸到约70个氨基酸、约12个氨基酸到约60个氨基酸、约12个氨基酸到约50个氨基酸、约12个氨基酸到约45个氨基酸、约12个氨基酸到约40个氨基酸、约12个氨基酸到约35个氨基酸、约12个氨基酸到约30个氨基酸、约12个氨基酸到约25个氨基酸、约12个氨基酸到约24个氨基酸、约12个氨基酸到约22个氨基酸、约12个氨基酸到约20个氨基酸、约12个氨基酸到约18个氨基酸、约12个氨基酸到约16个氨基酸、约12个氨基酸到约14个氨基酸、约14个氨基酸到约100个氨基酸、约14个氨基酸到约90个氨基酸、约14个氨基酸到约80个氨基酸、约14个氨基酸到约70个氨基酸、约14个氨基酸到约60个氨基酸、约14个氨基酸到约50个氨基酸、约14个氨基酸到约45个氨基酸、约14个氨基酸到约40个氨基酸、约14个氨基酸到约35个氨基酸、约14个氨基酸到约30个氨基酸、约14个氨基酸到约25个氨基酸、约14个氨基酸到约24个氨基酸、约14个氨基酸到约22个氨基酸、约14个氨基酸到约20个氨基酸、约14个氨基酸到约18个氨基酸、约14个氨基酸到约16个氨基酸、约16个氨基酸到约100个氨基酸、约16个氨基酸到约90个氨基酸、约16个氨基酸到约80个氨基酸、约16个氨基酸到约70个氨基酸、约16个氨基酸到约60个氨基酸、约16个氨基酸到约50个氨基酸、约16个氨基酸到约45个氨基酸、约16个氨基酸到约40个氨基酸、约16个氨基酸到约35个氨基酸、约16个氨基酸到约30个氨基酸、约16个氨基酸到约25个氨基酸、约16个氨基酸到约24个氨基酸、约16个氨基酸到约22个氨基酸、约16个氨基酸到约20个氨基酸、约16个氨基酸到约18个氨基酸、约18个氨基酸到约100个氨基酸、约18个氨基酸到约90个氨基酸、约18个氨基酸到约80个氨基酸、约18个氨基酸到约70个氨基酸、约18个氨基酸到约60个氨基酸、约18个氨基酸到约50个氨基酸、约18个氨基酸到约45个氨基酸、约18个氨基酸到约40个氨基酸、约18个氨基酸到约35个氨基酸、约18个氨基酸到约30个氨基酸、约18个氨基酸到约25个氨基酸、约18个氨基酸到约24个氨基酸、约18个氨基酸到约22个氨基酸、约18个氨基酸到约20个氨基酸、约20个氨基酸到约100个氨基酸、约20个氨基酸到约90个氨基酸、约20个氨基酸到约80个氨基酸、约20个氨基酸到约70个氨基酸、约20个氨基酸到约60个氨基酸、约20个氨基酸到约50个氨基酸、约20个氨基酸到约45个氨基酸、约20个氨基酸到约40个氨基酸、约20个氨基酸到约35个氨基酸、约20个氨基酸到约30个氨基酸、约20个氨基酸到约25个氨基酸、约20个氨基酸到约24个氨基酸、约20个氨基酸到约22个氨基酸、约22个氨基酸到约100个氨基酸、约22个氨基酸到约90个氨基酸、约22个氨基酸到约80个氨基酸、约22个氨基酸到约70个氨基酸、约22个氨基酸到约60个氨基酸、约22个氨基酸到约50个氨基酸、约22个氨基酸到约45个氨基酸、约22个氨基酸到约40个氨基酸、约22个氨基酸到约35个氨基酸、约22个氨基酸到约30个氨基酸、约22个氨基酸到约25个氨基酸、约22个氨基酸到约24个氨基酸、约25个氨基酸到约100个氨基酸、约25个氨基酸到约90个氨基酸、约25个氨基酸到约80个氨基酸、约25个氨基酸到约70个氨基酸、约25个氨基酸到约60个氨基酸、约25个氨基酸到约50个氨基酸、约25个氨基酸到约45个氨基酸、约25个氨基酸到约40个氨基酸、约25个氨基酸到约35个氨基酸、约25个氨基酸到约30个氨基酸、约30个氨基酸到约100个氨基酸、约30个氨基酸到约90个氨基酸、约30个氨基酸到约80个氨基酸、约30个氨基酸到约70个氨基酸、约30个氨基酸到约60个氨基酸、约30个氨基酸到约50个氨基酸、约30个氨基酸到约45个氨基酸、约30个氨基酸到约40个氨基酸、约30个氨基酸到约35个氨基酸、约35个氨基酸到约100个氨基酸、约35个氨基酸到约90个氨基酸、约35个氨基酸到约80个氨基酸、约35个氨基酸到约70个氨基酸、约35个氨基酸到约60个氨基酸、约35个氨基酸到约50个氨基酸、约35个氨基酸到约45个氨基酸、约35个氨基酸到约40个氨基酸、约40个氨基酸到约100个氨基酸、约40个氨基酸到约90个氨基酸、约40个氨基酸到约80个氨基酸、约40个氨基酸到约70个氨基酸、约40个氨基酸到约60个氨基酸、约40个氨基酸到约50个氨基酸、约40个氨基酸到约45个氨基酸、约45个氨基酸到约100个氨基酸、约45个氨基酸到约90个氨基酸、约45个氨基酸到约80个氨基酸、约45个氨基酸到约70个氨基酸、约45个氨基酸到约60个氨基酸、约45个氨基酸到约50个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约50个氨基酸到约90个氨基酸、约50个氨基酸到约80个氨基酸、约50个氨基酸到约70个氨基酸、约50个氨基酸到约60个氨基酸、约60个氨基酸到约100个氨基酸、约60个氨基酸到约90个氨基酸、约60个氨基酸到约80个氨基酸、约60个氨基酸到约70个氨基酸、约70个氨基酸到约100个氨基酸、约70个氨基酸到约90个氨基酸、约70个氨基酸到约80个氨基酸、约80个氨基酸到约100个氨基酸、约80个氨基酸到约90个氨基酸或约90个氨基酸到约100个氨基酸。
在一些实施例中，接头富含甘氨酸(Gly或G)残基。在一些实施例中，接头富含丝氨酸(Ser或S)残基。在一些实施例中，接头富含甘氨酸和丝氨酸残基。在一些实施例中，接头具有一个或多个甘氨酸-丝氨酸残基对(GS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GS对。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGS序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGGGS序列。在一些实施例中，接头具有一个或多个Gly-Gly-Ser-Gly(GGSG)序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个GGSG序列。
在一些实施例中，接头序列可以包括GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18)或由其组成。在一些实施例中，接头序列可以由包括以下或由以下组成的核酸编码：GGCGGTGGAGGATCCGGAGGAGGTGGCTCCGGCGGCGGAGGATCT(SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，接头序列可以包括GGGSGGGS(SEQ ID NO:20)或由其组成。
靶标结合结构域
在本文所描述的单链嵌合多肽或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和/或另外的一个或多个靶标结合结构域可以是抗原结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性抗原结合结构域中的任一种)、可溶性白细胞介素或细胞因子蛋白(例如，本文所描述的示例性可溶性白细胞介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白中的任一种)和可溶性白细胞介素或细胞因子受体(例如，本文所描述的示例性可溶性白细胞介素受体或可溶性细胞因子受体中的任一种)。
在本文所描述的单链或多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和/或一个或多个另外的靶标结合结构域可以各自独立地具有约5个氨基酸到约1000个氨基酸、约5个氨基酸到约950个氨基酸、约5个氨基酸到约900个氨基酸、约5个氨基酸到约850个氨基酸、约5个氨基酸到约800个氨基酸、约5个氨基酸到约750个氨基酸、约5个氨基酸到约700个氨基酸、约5个氨基酸到约650个氨基酸、约5个氨基酸到约600个氨基酸、约5个氨基酸到约550个氨基酸、约5个氨基酸到约500个氨基酸、约5个氨基酸到约450个氨基酸、约5个氨基酸到约400个氨基酸、约5个氨基酸到约350个氨基酸、约5个氨基酸到约300个氨基酸、约5个氨基酸到约280个氨基酸、约5个氨基酸到约260个氨基酸、约5个氨基酸到约240个氨基酸、约5个氨基酸到约220个氨基酸、约5个氨基酸到约200个氨基酸、约5个氨基酸到约195个氨基酸、约5个氨基酸到约190个氨基酸、约5个氨基酸到约185个氨基酸、约5个氨基酸到约180个氨基酸、约5个氨基酸到约175个氨基酸、约5个氨基酸到约170个氨基酸、约5个氨基酸到约165个氨基酸、约5个氨基酸到约160个氨基酸、约5个氨基酸到约155个氨基酸、约5个氨基酸到约150个氨基酸、约5个氨基酸到约145个氨基酸、约5个氨基酸到约140个氨基酸、约5个氨基酸到约135个氨基酸、约5个氨基酸到约130个氨基酸、约5个氨基酸到约125个氨基酸、约5个氨基酸到约120个氨基酸、约5个氨基酸到约115个氨基酸、约5个氨基酸到约110个氨基酸、约5个氨基酸到约105个氨基酸、约5个氨基酸到约100个氨基酸、约5个氨基酸到约95个氨基酸、约5个氨基酸到约90个氨基酸、约5个氨基酸到约85个氨基酸、约5个氨基酸到约80个氨基酸、约5个氨基酸到约75个氨基酸、约5个氨基酸到约70个氨基酸、约5个氨基酸到约65个氨基酸、约5个氨基酸到约60个氨基酸、约5个氨基酸到约55个氨基酸、约5个氨基酸到约50个氨基酸、约5个氨基酸到约45个氨基酸、约5个氨基酸到约40个氨基酸、约5个氨基酸到约35个氨基酸、约5个氨基酸到约30个氨基酸、约5个氨基酸到约25个氨基酸、约5个氨基酸到约20个氨基酸、约5个氨基酸到约15个氨基酸、约5个氨基酸到约10个氨基酸的氨基酸总数。
本文所描述的任何靶标结合结构域可以以小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10- 9M、小于1x10-10M、小于1x10-11M、小于1x10-12M或小于1x10-13M的解离平衡常数(KD)与其靶标结合。在一些实施例中，本文提供的抗原结合蛋白构建体可以以约1x10-3M到约1x10-5M、约1x10-4M到约1x10-6M、约1x10-5M到约1x10-7M、约1x10-6M到约1x10-8M、约1x10-7M到约1x10-9M、约1x10-8M到约1x10-10M或约1x10-9M到约1x10-11M(含端值)的KD与识别抗原结合。
本文所描述的任何靶标结合结构域可以以约1pM到约30nM之间(例如，约1pM到约25nM、约1pM到约20nM、约1pM到约15nM、约1pM到约10nM、约1pM到约5nM、约1pM到约2nM、约1pM到约1nM、约1pM到约950pM、约1pM到约900pM、约1pM到约850pM、约1pM到约800pM、约1pM到约750pM、约1pM到约700pM、约1pM到约650pM、约1pM到约600pM、约1pM到约550pM、约1pM到约500pM、约1pM到约450pM、约1pM到约400pM、约1pM到约350pM、约1pM到约300pM、约1pM到约250pM、约1pM到约200pM、约1pM到约150pM、约1pM到约100pM、约1pM到约90pM、约1pM到约80pM、约1pM到约70pM、约1pM到约60pM、约1pM到约50pM、约1pM到约40pM、约1pM到约30pM、约1pM到约20pM、约1pM到约10pM、约1pM到约5pM、约1pM到约4pM、约1pM到约3pM、约1pM到约2pM)的KD与其靶标结合。
本文所描述的任何靶标结合结构域可以约1nM到约10nM之间(例如，约1nM到约9nM、约1nM到约8nM、约1nM到约7nM、约1nM到约6nM、约1nM到约5nM、约1nM到约4nM、约1nM到约3nM、约1nM到约2nM、约2nM到约10nM、约2nM到约9nM、约2nM到约8nM、约2nM到约7nM、约2nM到约6nM、约2nM到约5nM、约2nM到约4nM、约2nM到约3nM、约3nM到约10nM、约3nM到约9nM、约3nM到约8nM、约3nM到约7nM、约3nM到约6nM、约3nM到约5nM、约3nM到约4nM、约4nM到约10nM、约4nM到约9nM、约4nM到约8nM、约4nM到约7nM、约4nM到约6nM、约4nM到约5nM、约5nM到约10nM、约5nM到约9nM、约5nM到约8nM、约5nM到约7nM、约5nM到约6nM、约6nM到约10nM、约6nM到约9nM、约6nM到约8nM、约6nM到约7nM、约7nM到约10nM、约7nM到约9nM、约7nM到约8nM、约8nM到约10nM、约8nM到约9nM和约9nM到约10nM)的KD与其靶标结合。
可以使用本领域已知的多种不同方法来确定本文所述的任何抗原结合蛋白构建体的KD值(例如，电泳迁移率变化测定法、过滤器结合测定法、表面等离子体共振和生物分子结合动力学测定法等)。
抗原结合结构域
在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的抗原。在这些单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到相同的表位。在这些单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域包含相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。
在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一者或两者是抗原结合结构域。在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域各自是抗原结合结构域。在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，抗原结合结构域包含或是scFv或单结构域抗体(例如，VaHH或VNAR结构域)。
在一些实例中，抗原结合结构域(例如，本文所描述的抗原结合结构域中的任一种)可以与以下中的任一种特异性结合：CD16a(参见例如，美国专利第9,035,026号中所描述的那些)、CD28(参见例如，美国专利第7,723,482号中所描述的那些)、CD3(参见例如，美国专利第9,226,962号中所描述的那些)、CD33(参见例如，美国专利第8,759,494号中所描述的那些)、CD20(参见例如，WO 2014/026054中所描述的那些)、CD19(参见例如，美国专利第9,701,758号中所描述的那些)、CD22(参见例如，WO 2003/104425中所描述的那些)、CD123(参见例如，WO 2014/130635中所描述的那些)、IL-1R(参见例如，美国专利第8,741,604号中所描述的那些)、IL-1(参见例如，WO 2014/095808中所描述的那些)、VEGF(参见例如，美国专利第9,090,684号中所描述的那些)、IL-6R(参见例如，美国专利第7,482,436号中所描述的那些)、IL-4(参见例如，美国专利申请公开第2012/0171197号中所描述的那些)、IL-10(参见例如，美国专利申请公开第2016/0340413号中所描述的那些)、PDL-1(参见例如，Drees等人,《蛋白质表达和纯化(Protein Express.Purif.)》94:60-66,2014中所描述的那些)、TIGIT(参见例如，美国专利申请公开第2017/0198042号中所描述的那些)、PD-1(参见例如，美国专利第7,488,802号中所描述的那些)、TIM3(参见例如，美国专利第8,552,156号中所描述的那些)、CTLA4(参见例如，WO 2012/120125中所描述的那些)、MICA(参见例如，WO 2016/154585中所描述的那些)、MICB(参见例如，美国专利第8,753,640号中所描述的那些)、IL-6(参见例如，Gejima等人,《人抗体(Human Antibodies)》11(4):121-129,2002中所描述的那些)、IL-8(参见例如，美国专利第6,117,980号中所描述的那些)、TNFα(参见例如，Geng等人,《免疫学研究(Immunol.Res.)》62(3):377-385,2015中所描述的那些)、CD26(参见例如，WO 2017/189526中所描述的那些)、CD36(参见例如，美国专利申请公开第2015/0259429号中所描述的那些)、ULBP2(参见例如，美国专利第9,273,136号中所描述的那些)、CD30(参见例如，Homach等人,《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)》48(5):497-501,1998中所描述的那些)、CD200(参见例如，美国专利第9,085,623号中所描述的那些)、IGF-1R(参见例如，美国专利申请公开第2017/0051063号中所描述的那些)、MUC4AC(参见例如，WO 2012/170470中所描述的那些)、MUC5AC(参见例如，美国专利第9,238,084号中所描述的那些)、Trop-2(参见例如，WO 2013/068946中所描述的那些)、CMET(参见例如，Edwardraja等人,《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》106(3):367-375,2010中所描述的那些)、EGFR(参见例如，Akbari等人,《蛋白质表达和纯化(ProteinExpr.Purif.)》127:8-15,2016中所描述的那些)、HER1(参见例如，美国专利申请公开第2013/0274446号中所描述的那些)、HER2(参见例如，Cao等人,《生物技术快报(Biotechnol.Lett.)》37(7):1347-1354,2015中所描述的那些)、HER3(参见例如，美国专利第9,505,843号中所描述的那些)、PSMA(参见例如，Parker等人,《蛋白质表达和纯化》89(2):136-145,2013中所描述的那些)、CEA(参见例如，WO 1995/015341中所描述的那些)、B7H3(参见例如，美国专利第9,371,395号中所描述的那些)、EPCAM(参见例如，WO 2014/159531中描述的那些)、BCMA(参见例如，Smith等人,《分子疗法(Mol.Ther.)》26(6):1447-1456,2018中所描述的那些)、P-钙粘蛋白(参见例如，美国专利第7,452,537号中所描述的那些)、CEACAM5(参见例如，美国专利第9,617,345号中所描述的那些)、UL16结合蛋白(参见例如，WO 2017/083612中所描述的那些)、HLA-DR(参见例如，Pistillo等人,《实验和临床免疫遗传学(Exp.Clin.Immunogenet.)》14(2):123-130,1997中所描述的那些)、DLL4(参见例如，WO 2014/007513中所描述的那些)、TYRO3(参见例如，WO 2016/166348中所描述的那些)、AXL(参见例如，WO 2012/175692中所描述的那些)、MER(参见例如，WO 2016/106221中所描述的那些)、CD122(参见例如，美国专利申请公开第2016/0367664号中所描述的那些)、CD155(参见例如，WO 2017/149538中所描述的那些)或PDGF-DD(参见例如，美国专利第9,441,034号中所描述的那些)。
存在于本文所描述的单链嵌合多肽或多链嵌合多肽中的任一种中的抗原结合结构域各自独立地选自由以下组成的组：VHH结构域、VNAR结构域和scFv。在一些实施例中，本文描述的任一个抗原结合结构域是BiTe、(scFv)2、纳米抗体(nanobody)、纳米抗体-HAS、DART、TandAb、单链双功能抗体(scDiabody)、单链双功能抗体-CH3、scFv-CH-CL-scFv、HSAbody、单链双功能抗体-HAS或串联scFv。可以用于任一种单链或多链嵌合多肽中的抗原结合结构域的另外实例是本领域已知的。
VHH结构域是可在骆驼科动物中发现的单个单体可变抗体结构域。VNAR结构域是可在软骨鱼中发现的单个单体抗体可变结构域。VHH结构域和VNAR结构域的非限制性方面描述于例如Cromie等人,《医药化学当前话题(Curr.Top.Med.Chem.)》15:2543-2557,2016；DeGenst等人,《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》30:187-198,2006；De Meyer等人,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》32:263-270,2014；Kijanka等人,《纳米医学(Nanomedicine)》10:161-174,2015；Kovaleva等人,《生物疗法专家观点(Expert.Opin.Biol.Ther.)》14:1527-1539,2014；Krah等人,《免疫药理学和免疫毒理学(Immunopharmacol.Immunotoxicol.)》38:21-28,2016；Mujic-Delic等人,《药理科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.)》35:247-255,2014；Muyldermans,《生物技术杂志(J.Biotechnol.)》74:277-302,2001；Muyldermans等人,《生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.)》26:230-235,2001；Muyldermans,《生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.)》82:775-797,2013；Rahbarizadeh等人,《免疫学研究(Immunol.Invest.)》40:299-338,2011；Van Audenhove等人,《E生物医学(EBioMedicine)》8:40-48,2016；Van Bockstaele等人,《研究药物当前观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)》10:1212-1224,2009；Vincke等人,《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》911:15-26,2012；和Wesolowski等人,《医学微生物学和免疫学(Med.Microbiol.Immunol.)》198:157-174,2009。
在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是VHH结构域，或至少一个抗原结合结构域是VHH结构域。在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是VNAR结构域，或至少一个抗原结合结构域是VNAR结构域。在一些实施例中，本文所述的单链或多链嵌合多肽中的每个抗原结合结构域都是scFv结构域，或至少一个抗原结合结构域是scFv结构域。
在一些实施例中，存在于单链或多链嵌合多肽中的两个或更多个多肽可以组装(例如，非共价组装)以形成本文所描述的抗原结合结构域中的任一种，例如，抗体的抗原结合片段(例如，本文所描述的抗体的任何抗原结合片段)、VHH-scAb、VHH-Fab、双scFab、F(ab')2、双链抗体、crossMab、DAF(二合一)、DAF(四合一)、DutaMab、DT-IgG、杵臼(knobs-in-holes)的共同轻链、杵臼组合件、电荷对、Fab臂交换、SEEDbody、LUZ-Y、Fcab、κλ体、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG、双链抗体-CH3、三链抗体、微抗体、微体、TriBi微体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、F(ab')2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、双链抗体-Fc、串联scFv-Fc、胞内抗体(Intrabody)、对接锁定抗体、ImmTAC、IgG-IgG缀合物、Cov-X-Body和scFv1-PEG-scFv2。参见例如Spiess等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》67:95-106,2015，其在此全文并入，以便描述这些元件。抗体的抗原结合片段的非限制性实例包含Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段和Fab'片段。抗体的抗原结合片段的另外实例是IgG的抗原结合片段(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗原结合片段)(例如，人或人源化IgG，例如人或人源化IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的抗原结合片段)；IgA的抗原结合片段(例如，IgA1或IgA2的抗原结合片段)(例如，人或人源化IgA，例如人或人源化IgA1或IgA2的抗原结合片段)；IgD的抗原结合片段(例如，人或人源化IgD的抗原结合片段)；IgE的抗原结合片段(例如，人或人源化IgE的抗原结合片段)；或IgM的抗原结合片段(例如，人或人源化IgM的抗原结合片段)。
“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
“Fab”片段包含除Fv片段的重链和轻链可变结构域外，轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。
“F(ab')2”片段包含在铰链区附近通过二硫键接合的两个Fab片段。
“双可变结构域免疫球蛋白”或“DVD-Ig”是指多价且多特异性结合蛋白，如例如DiGiammarino等人,《分子生物学方法》899:145-156,2012；Jakob等人,《单抗(MABs)》5:358-363,2013；和美国专利第7,612,181号；第8,258,268号；第8,586,714号；第8,716,450号；第8,722,855号；第8,735,546号；和第8,822,645号中所描述，其中的每一个均通过引用整体并入。
DART描述于例如Garber,《自然综述：药物发现(Nature Reviews DrugDiscovery)》13:799-801,2014中。
在一些实施例中，本文所述的任一种抗原结合结构域能够结合到选自以下组成的群组的抗原：蛋白质、碳水化合物、脂质和其组合。
抗原结合结构域的另外实例和方面是本领域已知的。
可溶性白细胞介素或细胞因子蛋白
在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一者或两者可以是可溶性白细胞介素蛋白或可溶性细胞因子蛋白。在一些实施例中，可溶性白细胞介素或可溶性细胞因子蛋白选自由以下组成的组：IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。可溶性IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L的非限制性实例在下文提供。
人可溶性IL-2(SEQ ID NO:75)
Figure BDA0003872613750000631
人可溶性IL-3(SEQ ID NO:76)
Figure BDA0003872613750000632
Figure BDA0003872613750000641
人可溶性IL-7(SEQ ID NO:77)
Figure BDA0003872613750000642
人可溶性IL-8(SEQ ID NO:78)
Figure BDA0003872613750000643
人可溶性IL-10(SEQ ID NO:79)
Figure BDA0003872613750000644
人可溶性IL-15(SEQ ID NO:80)
Figure BDA0003872613750000645
人可溶性IL-15D8N突变体(SEQ ID NO:99)
NWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
人可溶性IL-15D8N突变体(SEQ ID NO:100)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
人可溶性IL-17(SEQ ID NO:81)
Figure BDA0003872613750000646
人可溶性IL-18(SEQ ID NO:82)
Figure BDA0003872613750000647
Figure BDA0003872613750000651
人可溶性PDGF-DD(SEQ ID NO:83)
Figure BDA0003872613750000652
人可溶性SCF(SEQ ID NO:84)
Figure BDA0003872613750000653
人可溶性FLT3L(SEQ ID NO:85)
Figure BDA0003872613750000654
下文提供了可溶性MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ULBP4、ULBP5和ULBP6的非限制性实例。
人可溶性MICA(SEQ ID NO:86)
Figure BDA0003872613750000655
人可溶性MICB(SEQ ID NO:87)
Figure BDA0003872613750000656
Figure BDA0003872613750000661
人可溶性ULBP1(SEQ ID NO:88)
Figure BDA0003872613750000662
人可溶性ULBP2(SEQ ID NO:89)
Figure BDA0003872613750000663
人可溶性ULBP3(SEQ ID NO:90)
Figure BDA0003872613750000664
人可溶性ULBP4(SEQ ID NO:91)
Figure BDA0003872613750000665
人可溶性ULBP5(SEQ ID NO:92)
Figure BDA0003872613750000666
人可溶性ULBP6(SEQ ID NO:93)
Figure BDA0003872613750000667
可溶性白细胞介素蛋白和可溶性细胞因子蛋白的另外实例是本领域已知的。
可溶性受体
在本文所述的任一种单链或多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一者或两者是可溶性白细胞介素受体或可溶性细胞因子受体。在一些实施例中，可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)(参见例如，Yung等人,《美国呼吸与重症医学杂志(Am.J.Resp.Crit.Care Med.)》194(9):1140-1151,2016中所描述的那些)、可溶性TGF-βRIII(参见例如，Heng等人,《胎盘(Placenta)》57:320,2017中所描述的那些)、可溶性NKG2D(参见例如，Cosman等人,《免疫(Immunity)》14(2):123-133,2001；Costa等人,《免疫学前沿(Front.Immunol.)》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性NKp30(参见例如，Costa等人,《免疫学前沿》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性NKp44(参见例如，Costa等人,《免疫学前沿》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所描述的那些)、可溶性NKp46(参见例如，Mandelboim等人,《自然(Nature)》409:1055-1060，2001；Costa等人,《免疫学前沿》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150)、可溶性DNAM1(参见例如，Costa等人，《免疫学前沿》,第9卷,第1150条,2018年5月29日；doi:10.3389/fimmu.2018.01150中所描述的那些)、scMHCI(参见例如，Washburn等人,《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》6(3):e18439，2011中所描述的那些)、scMHCII(参见例如，Bishwajit等人,《细胞免疫学(CellularImmunol.)》170(1):25-33,1996中所描述的那些)、scTCR(参见例如，Weber等人，《自然》356(6372):793-796,1992中所描述的那些)、可溶性CD155(参见例如，Tahara-Hanaoka等人,《国际免疫学(Int.Immunol.)》16(4):533-538,2004中所描述的那些)或可溶性CD28(参见例如，Hebbar等人,《临床与实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)》136:388-392,2004)。可溶性白细胞介素受体和可溶性细胞因子受体的其它实例是本领域已知的。
亲和结构域对
在一些实施例中，多链嵌合多肽包含：1)包含一对亲和结构域中的第一结构域的第一嵌合多肽，和2)包含一对亲和结构域中的第二结构域的第二嵌合多肽，使得第一嵌合多肽和第二嵌合多肽通过一对亲和结构域中的第一结构域和第二结构域的结合而缔合。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域和可溶性IL-15。寿司结构域，也称为短共有重复序列或1型糖蛋白基序，是蛋白质-蛋白质相互作用中的常见基序。已在许多蛋白质结合分子，包含补体组分C1r、C1s、因子H和C2m以及非免疫分子因子XIII和β2-糖蛋白上鉴别了寿司结构域。典型的寿司结构域具有大约60个氨基酸残基，并且包含四个半胱氨酸(Ranganathan,《太平洋生物计算专题讨论会(Pac.SympBiocomput.)》2000:155-67)。第一半胱氨酸可与第三半胱氨酸形成二硫键，并且第二半胱氨酸可与第四半胱氨酸形成二硫桥键。在其中一对亲和结构域中的一个成员是可溶性IL-15的一些实施例中，可溶性IL15具有D8N或D8A氨基酸取代。在其中一对亲和结构域中的一个成员是人IL-15受体的α链(IL15Rα)的一些实施例中，人IL15Rα是成熟全长IL15Rα。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是芽胞杆菌RNA酶和芽胞杆菌RNA酶抑制剂。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是PKA和AKAP。在一些实施例中，所述一对亲和结构域是基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块(Rossi,《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad Sci USA.)》103:6841-6846,2006；Sharkey等人,《癌症研究(Cancer Res.)》68:5282-5290,2008；Rossi等人,《药物科学趋势(Trends Pharmacol Sci.)》33:474-481,2012)或基于蛋白质突触蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和SNAP25相互作用的SNARE模块(Deyev等人,《自然·生物技术(Nat Biotechnol.)》1486-1492,2003)。
在一些实施例中，多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包含一对亲和结构域中的第一结构域，并且多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包含一对亲和结构域中的第二结构域，其中所述一对亲和结构域种的第一结构域和所述一对亲和结构域中的第二结构域以小于1x10-7M、小于1x10-8M、小于1x10-9M、小于1x10-10M、小于1x10-11M、小于1x10-12M或小于1x10-13M的解离平衡常数(KD)彼此结合。在一些实施例中，所述一对亲和结构域中的第一结构域和所述一对亲和结构域中的第二结构域以约1x10-4M到约1x10-6M、约1x10-5M到约1x10-7M、约1x10-6M到约1x10-8M、约1x10-7M到约1x10-9M、约1x10-8M到约1x10-10M、约1x10-9M到约1x10-11M、约1x10-10M到约1x10-12M、约1x10-11M到约1x10-13M、约1x10-4M到约1x10-5M、约1x10-5M到约1x10-6M、约1x10-6M到约1x10-7M、约1x10-7M到约1x10-8M、约1x10-8M到约1x10-9M、约1x10-9M到约1x10-10M、约1x10-10M到约1x10-11M、约1x10-11M到约1x10-12M或约1x10-12M到约1x10-13M的KD彼此结合。本领域已知的多种不同方法中的任一种均可以用于确定一对亲和结构域中的第一结构域与一对亲和结构域中的第二结构域的结合的KD值(例如，电泳迁移变动测定、滤膜结合测定、表面等离子体共振和生物分子结合动力学测定等)。
在一些实施例中，多链嵌合多肽的第一嵌合多肽包含一对亲和结构域中的第一结构域，并且多链嵌合多肽的第二嵌合多肽包含一对亲和结构域中的第二结构域，其中所述一对亲和结构域中的第一结构域、所述一对亲和结构域中的第二结构域或两者的长度为约10到100个氨基酸。例如，一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，一对亲和结构域中的第一结构域、一对亲和结构域中的第二结构域或两者的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的一对亲和结构域中的第一和/或第二结构域中的任一个可以在其N端和/或C端包含一个或多个另外的氨基酸(例如1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要一对亲和结构域中第一和/或第二结构域的功能保留完整即可。例如，来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域可以在N端和/或C端包含一个或多个另外的氨基酸，同时仍保留与可溶性IL-15结合的能力。另外地或可替代地，可溶性IL-15可以在N端和/或C端包含一个或多个另外的氨基酸，同时仍保留与来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的寿司结构域结合的能力。
来自IL-15受体α(IL15Rα)的α链的sushi结构域的非限制性实例可以包含与ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR(SEQ ID NO:94)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，来自IL15Rα的α链的sushi结构域可以由包含
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG(SEQ ID NO:95)的核酸编码。
在一些实施例中，可溶性IL-15可以包含与
NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:96)至少70％相同、至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同的序列。在一些实施例中，可溶性IL-15可以由包含序列
AACTGGGTGAACGTCATCAGCGATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC(SEQ ID NO:97)的核酸编码。
单链嵌合多肽
单链嵌合多肽包含：第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)；可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)；以及第二靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性第一靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性示例性靶标结合结构域)彼此直接邻接。在本文描述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括在第一靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性靶标结合结构域)与第二靶标结合结构域(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性靶标结合结构域)之间的接头序列(例如，本文描述或本领域已知的任一个示例性接头序列)。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，
第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)彼此直接邻接。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括介于第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)与可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间的接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)。
在本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实例中，单链嵌合多肽的总长度可以为约50个氨基酸到约3000个氨基酸、约50个氨基酸到约2500个氨基酸、约50个氨基酸到约2000个氨基酸、约50个氨基酸到约1500个氨基酸、约50个氨基酸到约1000个氨基酸、约50个氨基酸到约950个氨基酸、约50个氨基酸到约900个氨基酸、约50个氨基酸到约850个氨基酸、约50个氨基酸到约800个氨基酸、约50个氨基酸到约750个氨基酸、约50个氨基酸到约700个氨基酸、约50个氨基酸到约650个氨基酸、约50个氨基酸到约600个氨基酸、约50个氨基酸到约550个氨基酸、约50个氨基酸到约500个氨基酸、约50个氨基酸到约480个氨基酸、约50个氨基酸到约460个氨基酸、约50个氨基酸到约440个氨基酸、约50个氨基酸到约420个氨基酸、约50个氨基酸到约400个氨基酸、约50个氨基酸到约380个氨基酸、约50个氨基酸到约360个氨基酸、约50个氨基酸到约340个氨基酸、约50个氨基酸到约320个氨基酸、约50个氨基酸到约300个氨基酸、约50个氨基酸到约280个氨基酸、约50个氨基酸到约260个氨基酸、约50个氨基酸到约240个氨基酸、约50个氨基酸到约220个氨基酸、约50个氨基酸到约200个氨基酸、约50个氨基酸到约150个氨基酸、约50个氨基酸到约100个氨基酸、约100个氨基酸到约3000个氨基酸、约100个氨基酸到约2500个氨基酸、约100个氨基酸到约2000个氨基酸、约100个氨基酸到约1500个氨基酸、约100个氨基酸到约1000个氨基酸、约100个氨基酸到约950个氨基酸、约100个氨基酸到约900个氨基酸、约100个氨基酸到约850个氨基酸、约100个氨基酸到约800个氨基酸、约100个氨基酸到约750个氨基酸、约100个氨基酸到约700个氨基酸、约100个氨基酸到约650个氨基酸、约100个氨基酸到约600个氨基酸、约100个氨基酸到约550个氨基酸、约100个氨基酸到约500个氨基酸、约100个氨基酸到约480个氨基酸、约100个氨基酸到约460个氨基酸、约100个氨基酸到约440个氨基酸、约100个氨基酸到约420个氨基酸、约100个氨基酸到约400个氨基酸、约100个氨基酸到约380个氨基酸、约100个氨基酸到约360个氨基酸、约100个氨基酸到约340个氨基酸、约100个氨基酸到约320个氨基酸、约100个氨基酸到约300个氨基酸、约100个氨基酸到约280个氨基酸、约100个氨基酸到约260个氨基酸、约100个氨基酸到约240个氨基酸、约100个氨基酸到约220个氨基酸、约100个氨基酸到约200个氨基酸、约100个氨基酸到约150个氨基酸、约150个氨基酸到约3000个氨基酸、约150个氨基酸到约2500个氨基酸、约150个氨基酸到约2000个氨基酸、约150个氨基酸到约1500个氨基酸、约150个氨基酸到约1000个氨基酸、约150个氨基酸到约950个氨基酸、约150个氨基酸到约900个氨基酸、约150个氨基酸到约850个氨基酸、约150个氨基酸到约800个氨基酸、约150个氨基酸到约750个氨基酸、约150个氨基酸到约700个氨基酸、约150个氨基酸到约650个氨基酸、约150个氨基酸到约600个氨基酸、约150个氨基酸到约550个氨基酸、约150个氨基酸到约500个氨基酸、约150个氨基酸到约480个氨基酸、约150个氨基酸到约460个氨基酸、约150个氨基酸到约440个氨基酸、约150个氨基酸到约420个氨基酸、约150个氨基酸到约400个氨基酸、约150个氨基酸到约380个氨基酸、约150个氨基酸到约360个氨基酸、约150个氨基酸到约340个氨基酸、约150个氨基酸到约320个氨基酸、约150个氨基酸到约300个氨基酸、约150个氨基酸到约280个氨基酸、约150个氨基酸到约260个氨基酸、约150个氨基酸到约240个氨基酸、约150个氨基酸到约220个氨基酸、约150个氨基酸到约200个氨基酸、约200个氨基酸到约3000个氨基酸、约200个氨基酸到约2500个氨基酸、约200个氨基酸到约2000个氨基酸、约200个氨基酸到约1500个氨基酸、约200个氨基酸到约1000个氨基酸、约200个氨基酸到约950个氨基酸、约200个氨基酸到约900个氨基酸、约200个氨基酸到约850个氨基酸、约200个氨基酸到约800个氨基酸、约200个氨基酸到约750个氨基酸、约200个氨基酸到约700个氨基酸、约200个氨基酸到约650个氨基酸、约200个氨基酸到约600个氨基酸、约200个氨基酸到约550个氨基酸、约200个氨基酸到约500个氨基酸、约200个氨基酸到约480个氨基酸、约200个氨基酸到约460个氨基酸、约200个氨基酸到约440个氨基酸、约200个氨基酸到约420个氨基酸、约200个氨基酸到约400个氨基酸、约200个氨基酸到约380个氨基酸、约200个氨基酸到约360个氨基酸、约200个氨基酸到约340个氨基酸、约200个氨基酸到约320个氨基酸、约200个氨基酸到约300个氨基酸、约200个氨基酸到约280个氨基酸、约200个氨基酸到约260个氨基酸、约200个氨基酸到约240个氨基酸、约200个氨基酸到约220个氨基酸、约220个氨基酸到约3000个氨基酸、约220个氨基酸到约2500个氨基酸、约220个氨基酸到约2000个氨基酸、约220个氨基酸到约1500个氨基酸、约220个氨基酸到约1000个氨基酸、约220个氨基酸到约950个氨基酸、约220个氨基酸到约900个氨基酸、约220个氨基酸到约850个氨基酸、约220个氨基酸到约800个氨基酸、约220个氨基酸到约750个氨基酸、约220个氨基酸到约700个氨基酸、约220个氨基酸到约650个氨基酸、约220个氨基酸到约600个氨基酸、约220个氨基酸到约550个氨基酸、约220个氨基酸到约500个氨基酸、约220个氨基酸到约480个氨基酸、约220个氨基酸到约460个氨基酸、约220个氨基酸到约440个氨基酸、约220个氨基酸到约420个氨基酸、约220个氨基酸到约400个氨基酸、约220个氨基酸到约380个氨基酸、约220个氨基酸到约360个氨基酸、约220个氨基酸到约340个氨基酸、约220个氨基酸到约320个氨基酸、约220个氨基酸到约300个氨基酸、约220个氨基酸到约280个氨基酸、约220个氨基酸到约260个氨基酸、约220个氨基酸到约240个氨基酸、约240个氨基酸到约3000个氨基酸、约240个氨基酸到约2500个氨基酸、约240个氨基酸到约2000个氨基酸、约240个氨基酸到约1500个氨基酸、约240个氨基酸到约1000个氨基酸、约240个氨基酸到约950个氨基酸、约240个氨基酸到约900个氨基酸、约240个氨基酸到约850个氨基酸、约240个氨基酸到约800个氨基酸、约240个氨基酸到约750个氨基酸、约240个氨基酸到约700个氨基酸、约240个氨基酸到约650个氨基酸、约240个氨基酸到约600个氨基酸、约240个氨基酸到约550个氨基酸、约240个氨基酸到约500个氨基酸、约240个氨基酸到约480个氨基酸、约240个氨基酸到约460个氨基酸、约240个氨基酸到约440个氨基酸、约240个氨基酸到约420个氨基酸、约240个氨基酸到约400个氨基酸、约240个氨基酸到约380个氨基酸、约240个氨基酸到约360个氨基酸、约240个氨基酸到约340个氨基酸、约240个氨基酸到约320个氨基酸、约240个氨基酸到约300个氨基酸、约240个氨基酸到约280个氨基酸、约240个氨基酸到约260个氨基酸、约260个氨基酸到约3000个氨基酸、约260个氨基酸到约2500个氨基酸、约260个氨基酸到约2000个氨基酸、约260个氨基酸到约1500个氨基酸、约260个氨基酸到约1000个氨基酸、约260个氨基酸到约950个氨基酸、约260个氨基酸到约900个氨基酸、约260个氨基酸到约850个氨基酸、约260个氨基酸到约800个氨基酸、约260个氨基酸到约750个氨基酸、约260个氨基酸到约700个氨基酸、约260个氨基酸到约650个氨基酸、约260个氨基酸到约600个氨基酸、约260个氨基酸到约550个氨基酸、约260个氨基酸到约500个氨基酸、约260个氨基酸到约480个氨基酸、约260个氨基酸到约460个氨基酸、约260个氨基酸到约440个氨基酸、约260个氨基酸到约420个氨基酸、约260个氨基酸到约400个氨基酸、约260个氨基酸到约380个氨基酸、约260个氨基酸到约360个氨基酸、约260个氨基酸到约340个氨基酸、约260个氨基酸到约320个氨基酸、约260个氨基酸到约300个氨基酸、约260个氨基酸到约280个氨基酸、约280个氨基酸到约3000个氨基酸、约280个氨基酸到约2500个氨基酸、约280个氨基酸到约2000个氨基酸、约280个氨基酸到约1500个氨基酸、约280个氨基酸到约1000个氨基酸、约280个氨基酸到约950个氨基酸、约280个氨基酸到约900个氨基酸、约280个氨基酸到约850个氨基酸、约280个氨基酸到约800个氨基酸、约280个氨基酸到约750个氨基酸、约280个氨基酸到约700个氨基酸、约280个氨基酸到约650个氨基酸、约280个氨基酸到约600个氨基酸、约280个氨基酸到约550个氨基酸、约280个氨基酸到约500个氨基酸、约280个氨基酸到约480个氨基酸、约280个氨基酸到约460个氨基酸、约280个氨基酸到约440个氨基酸、约280个氨基酸到约420个氨基酸、约280个氨基酸到约400个氨基酸、约280个氨基酸到约380个氨基酸、约280个氨基酸到约360个氨基酸、约280个氨基酸到约340个氨基酸、约280个氨基酸到约320个氨基酸、约280个氨基酸到约300个氨基酸、约300个氨基酸到约3000个氨基酸、约300个氨基酸到约2500个氨基酸、约300个氨基酸到约2000个氨基酸、约300个氨基酸到约1500个氨基酸、约300个氨基酸到约1000个氨基酸、约300个氨基酸到约950个氨基酸、约300个氨基酸到约900个氨基酸、约300个氨基酸到约850个氨基酸、约300个氨基酸到约800个氨基酸、约300个氨基酸到约750个氨基酸、约300个氨基酸到约700个氨基酸、约300个氨基酸到约650个氨基酸、约300个氨基酸到约600个氨基酸、约300个氨基酸到约550个氨基酸、约300个氨基酸到约500个氨基酸、约300个氨基酸到约480个氨基酸、约300个氨基酸到约460个氨基酸、约300个氨基酸到约440个氨基酸、约300个氨基酸到约420个氨基酸、约300个氨基酸到约400个氨基酸、约300个氨基酸到约380个氨基酸、约300个氨基酸到约360个氨基酸、约300个氨基酸到约340个氨基酸、约300个氨基酸到约320个氨基酸、约320个氨基酸到约3000个氨基酸、约320个氨基酸到约2500个氨基酸、约320个氨基酸到约2000个氨基酸、约320个氨基酸到约1500个氨基酸、约320个氨基酸到约1000个氨基酸、约320个氨基酸到约950个氨基酸、约320个氨基酸到约900个氨基酸、约320个氨基酸到约850个氨基酸、约320个氨基酸到约800个氨基酸、约320个氨基酸到约750个氨基酸、约320个氨基酸到约700个氨基酸、约320个氨基酸到约650个氨基酸、约320个氨基酸到约600个氨基酸、约320个氨基酸到约550个氨基酸、约320个氨基酸到约500个氨基酸、约320个氨基酸到约480个氨基酸、约320个氨基酸到约460个氨基酸、约320个氨基酸到约440个氨基酸、约320个氨基酸到约420个氨基酸、约320个氨基酸到约400个氨基酸、约320个氨基酸到约380个氨基酸、约320个氨基酸到约360个氨基酸、约320个氨基酸到约340个氨基酸、约340个氨基酸到约3000个氨基酸、约340个氨基酸到约2500个氨基酸、约340个氨基酸到约2000个氨基酸、约340个氨基酸到约1500个氨基酸、约340个氨基酸到约1000个氨基酸、约340个氨基酸到约950个氨基酸、约340个氨基酸到约900个氨基酸、约340个氨基酸到约850个氨基酸、约340个氨基酸到约800个氨基酸、约340个氨基酸到约750个氨基酸、约340个氨基酸到约700个氨基酸、约340个氨基酸到约650个氨基酸、约340个氨基酸到约600个氨基酸、约340个氨基酸到约550个氨基酸、约340个氨基酸到约500个氨基酸、约340个氨基酸到约480个氨基酸、约340个氨基酸到约460个氨基酸、约340个氨基酸到约440个氨基酸、约340个氨基酸到约420个氨基酸、约340个氨基酸到约400个氨基酸、约340个氨基酸到约380个氨基酸、约340个氨基酸到约360个氨基酸、约360个氨基酸到约3000个氨基酸、约360个氨基酸到约2500个氨基酸、约360个氨基酸到约2000个氨基酸、约360个氨基酸到约1500个氨基酸、约360个氨基酸到约1000个氨基酸、约360个氨基酸到约950个氨基酸、约360个氨基酸到约900个氨基酸、约360个氨基酸到约850个氨基酸、约360个氨基酸到约800个氨基酸、约360个氨基酸到约750个氨基酸、约360个氨基酸到约700个氨基酸、约360个氨基酸到约650个氨基酸、约360个氨基酸到约600个氨基酸、约360个氨基酸到约550个氨基酸、约360个氨基酸到约500个氨基酸、约360个氨基酸到约480个氨基酸、约360个氨基酸到约460个氨基酸、约360个氨基酸到约440个氨基酸、约360个氨基酸到约420个氨基酸、约360个氨基酸到约400个氨基酸、约360个氨基酸到约380个氨基酸、约380个氨基酸到约3000个氨基酸、约380个氨基酸到约2500个氨基酸、约380个氨基酸到约2000个氨基酸、约380个氨基酸到约1500个氨基酸、约380个氨基酸到约1000个氨基酸、约380个氨基酸到约950个氨基酸、约380个氨基酸到约900个氨基酸、约380个氨基酸到约850个氨基酸、约380个氨基酸到约800个氨基酸、约380个氨基酸到约750个氨基酸、约380个氨基酸到约700个氨基酸、约380个氨基酸到约650个氨基酸、约380个氨基酸到约600个氨基酸、约380个氨基酸到约550个氨基酸、约380个氨基酸到约500个氨基酸、约380个氨基酸到约480个氨基酸、约380个氨基酸到约460个氨基酸、约380个氨基酸到约440个氨基酸、约380个氨基酸到约420个氨基酸、约380个氨基酸到约400个氨基酸、约400个氨基酸到约3000个氨基酸、约400个氨基酸到约2500个氨基酸、约400个氨基酸到约2000个氨基酸、约400个氨基酸到约1500个氨基酸、约400个氨基酸到约1000个氨基酸、约400个氨基酸到约950个氨基酸、约400个氨基酸到约900个氨基酸、约400个氨基酸到约850个氨基酸、约400个氨基酸到约800个氨基酸、约400个氨基酸到约750个氨基酸、约400个氨基酸到约700个氨基酸、约400个氨基酸到约650个氨基酸、约400个氨基酸到约600个氨基酸、约400个氨基酸到约550个氨基酸、约400个氨基酸到约500个氨基酸、约400个氨基酸到约480个氨基酸、约400个氨基酸到约460个氨基酸、约400个氨基酸到约440个氨基酸、约400个氨基酸到约420个氨基酸、约420个氨基酸到约3000个氨基酸、约420个氨基酸到约2500个氨基酸、约420个氨基酸到约2000个氨基酸、约420个氨基酸到约1500个氨基酸、约420个氨基酸到约1000个氨基酸、约420个氨基酸到约950个氨基酸、约420个氨基酸到约900个氨基酸、约420个氨基酸到约850个氨基酸、约420个氨基酸到约800个氨基酸、约420个氨基酸到约750个氨基酸、约420个氨基酸到约700个氨基酸、约420个氨基酸到约650个氨基酸、约420个氨基酸到约600个氨基酸、约420个氨基酸到约550个氨基酸、约420个氨基酸到约500个氨基酸、约420个氨基酸到约480个氨基酸、约420个氨基酸到约460个氨基酸、约420个氨基酸到约440个氨基酸、约440个氨基酸到约3000个氨基酸、约440个氨基酸到约2500个氨基酸、约440个氨基酸到约2000个氨基酸、约440个氨基酸到约1500个氨基酸、约440个氨基酸到约1000个氨基酸、约440个氨基酸到约950个氨基酸、约440个氨基酸到约900个氨基酸、约440个氨基酸到约850个氨基酸、约440个氨基酸到约800个氨基酸、约440个氨基酸到约750个氨基酸、约440个氨基酸到约700个氨基酸、约440个氨基酸到约650个氨基酸、约440个氨基酸到约600个氨基酸、约440个氨基酸到约550个氨基酸、约440个氨基酸到约500个氨基酸、约440个氨基酸到约480个氨基酸、约440个氨基酸到约460个氨基酸、约460个氨基酸到约3000个氨基酸、约460个氨基酸到约2500个氨基酸、约460个氨基酸到约2000个氨基酸、约460个氨基酸到约1500个氨基酸、约460个氨基酸到约1000个氨基酸、约460个氨基酸到约950个氨基酸、约460个氨基酸到约900个氨基酸、约460个氨基酸到约850个氨基酸、约460个氨基酸到约800个氨基酸、约460个氨基酸到约750个氨基酸、约460个氨基酸到约700个氨基酸、约460个氨基酸到约650个氨基酸、约460个氨基酸到约600个氨基酸、约460个氨基酸到约550个氨基酸、约460个氨基酸到约500个氨基酸、约460个氨基酸到约480个氨基酸、约480个氨基酸到约3000个氨基酸、约480个氨基酸到约2500个氨基酸、约480个氨基酸到约2000个氨基酸、约480个氨基酸到约1500个氨基酸、约480个氨基酸到约1000个氨基酸、约480个氨基酸到约950个氨基酸、约480个氨基酸到约900个氨基酸、约480个氨基酸到约850个氨基酸、约480个氨基酸到约800个氨基酸、约480个氨基酸到约750个氨基酸、约480个氨基酸到约700个氨基酸、约480个氨基酸到约650个氨基酸、约480个氨基酸到约600个氨基酸、约480个氨基酸到约550个氨基酸、约480个氨基酸到约500个氨基酸、约500个氨基酸到约3000个氨基酸、约500个氨基酸到约2500个氨基酸、约500个氨基酸到约2000个氨基酸、约500个氨基酸到约1500个氨基酸、约500个氨基酸到约1000个氨基酸、约500个氨基酸到约950个氨基酸、约500个氨基酸到约900个氨基酸、约500个氨基酸到约850个氨基酸、约500个氨基酸到约800个氨基酸、约500个氨基酸到约750个氨基酸、约500个氨基酸到约700个氨基酸、约500个氨基酸到约650个氨基酸、约500个氨基酸到约600个氨基酸、约500个氨基酸到约550个氨基酸、约550个氨基酸到约3000个氨基酸、约550个氨基酸到约2500个氨基酸、约550个氨基酸到约2000个氨基酸、约550个氨基酸到约1500个氨基酸、约550个氨基酸到约1000个氨基酸、约550个氨基酸到约950个氨基酸、约550个氨基酸到约900个氨基酸、约550个氨基酸到约850个氨基酸、约550个氨基酸到约800个氨基酸、约550个氨基酸到约750个氨基酸、约550个氨基酸到约700个氨基酸、约550个氨基酸到约650个氨基酸、约550个氨基酸到约600个氨基酸、约600个氨基酸到约3000个氨基酸、约600个氨基酸到约2500个氨基酸、约600个氨基酸到约2000个氨基酸、约600个氨基酸到约1500个氨基酸、约600个氨基酸到约1000个氨基酸、约600个氨基酸到约950个氨基酸、约600个氨基酸到约900个氨基酸、约600个氨基酸到约850个氨基酸、约600个氨基酸到约800个氨基酸、约600个氨基酸到约750个氨基酸、约600个氨基酸到约700个氨基酸、约600个氨基酸到约650个氨基酸、约650个氨基酸到约3000个氨基酸、约650个氨基酸到约2500个氨基酸、约650个氨基酸到约2000个氨基酸、约650个氨基酸到约1500个氨基酸、约650个氨基酸到约1000个氨基酸、约650个氨基酸到约950个氨基酸、约650个氨基酸到约900个氨基酸、约650个氨基酸到约850个氨基酸、约650个氨基酸到约800个氨基酸、约650个氨基酸到约750个氨基酸、约650个氨基酸到约700个氨基酸、约700个氨基酸到约3000个氨基酸、约700个氨基酸到约2500个氨基酸、约700个氨基酸到约2000个氨基酸、约700个氨基酸到约1500个氨基酸、约700个氨基酸到约1000个氨基酸、约700个氨基酸到约950个氨基酸、约700个氨基酸到约900个氨基酸、约700个氨基酸到约850个氨基酸、约700个氨基酸到约800个氨基酸、约700个氨基酸到约750个氨基酸、约750个氨基酸到约3000个氨基酸、约750个氨基酸到约2500个氨基酸、约750个氨基酸到约2000个氨基酸、约750个氨基酸到约1500个氨基酸、约750个氨基酸到约1000个氨基酸、约750个氨基酸到约950个氨基酸、约750个氨基酸到约900个氨基酸、约750个氨基酸到约850个氨基酸、约750个氨基酸到约800个氨基酸、约800个氨基酸到约3000个氨基酸、约800个氨基酸到约2500个氨基酸、约800个氨基酸到约2000个氨基酸、约800个氨基酸到约1500个氨基酸、约800个氨基酸到约1000个氨基酸、约800个氨基酸到约950个氨基酸、约800个氨基酸到约900个氨基酸、约800个氨基酸到约850个氨基酸、约850个氨基酸到约3000个氨基酸、约850个氨基酸到约2500个氨基酸、约850个氨基酸到约2000个氨基酸、约850个氨基酸到约1500个氨基酸、约850个氨基酸到约1000个氨基酸、约850个氨基酸到约950个氨基酸、约850个氨基酸到约900个氨基酸、约900个氨基酸到约3000个氨基酸、约900个氨基酸到约2500个氨基酸、约900个氨基酸到约2000个氨基酸、约900个氨基酸到约1500个氨基酸、约900个氨基酸到约1000个氨基酸、约900个氨基酸到约950个氨基酸、约950个氨基酸到约3000个氨基酸、约950个氨基酸到约2500个氨基酸、约950个氨基酸到约2000个氨基酸、约950个氨基酸到约1500个氨基酸、约950个氨基酸到约1000个氨基酸、约1000个氨基酸到约3000个氨基酸、约1000个氨基酸到约2500个氨基酸、约1000个氨基酸到约2000个氨基酸、约1000个氨基酸到约1500个氨基酸、约1500个氨基酸到约3000个氨基酸、约1500个氨基酸到约2500个氨基酸、约1500个氨基酸到约2000个氨基酸、约2000个氨基酸到约3000个氨基酸、约2000个氨基酸到约2500个氨基酸或约2500个氨基酸到约3000个氨基酸。
为单链嵌合多肽的示例性IL-2受体活化剂
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以是IL-2受体活化剂。在此类实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域中的一者或两者与IL-2受体(例如，人IL-2受体)结合。
在作为IL-2受体活化剂的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和/或第二靶标结合结构域可以是与IL-2受体(例如，人IL-2受体)特异性结合的激动性抗原结合结构域(参见例如，Gaulton等人,《临床免疫学与免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)》36(1):18-29,1985中描述的那些)。
在本文所描述的为IL-2受体活化剂单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域中的一者或两者可以是可溶性白细胞介素2(IL-2)蛋白。下文提供了可溶性IL-2的示例性序列。
人可溶性IL-2(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0003872613750000791
在这些单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域和第二靶标结合结构域是可溶性人IL-2蛋白。与IL-2受体特异性结合的IL-2蛋白的非限制性实例可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。
在一些实施例中，可溶性人IL-2蛋白可以由与以下序列至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列编码：
GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT(SEQ ID NO:31)。
在一些实施例中，可溶性人IL-2蛋白可以由与以下序列至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列编码：
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACC(SEQ ID NO:32)。
在一些实施例中，为IL-2受体活化剂的单链嵌合多肽可以包含与以下序列至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，为IL-2受体活化剂的单链嵌合多肽由与以下序列至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列编码：
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACCAGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT(SEQ ID NO:11)。
在一些实施例中，为IL-2受体活化剂的单链嵌合多肽可以包含与以下序列至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
MKWVTFISLLFLFSSAYSAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，为IL-2受体活化剂的单链嵌合多肽由与以下序列至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列编码：
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCCGCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACCAGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT(SEQID NO:12)。
为单链嵌合多肽的示例性CD3/CD38结合剂
在单链嵌合多肽是CD3/CD28结合剂的一些实施例中，第一靶标结合结构域与CD3(例如，CD3δ(例如，人CD3δ)、CD3ε(例如，人CD3ε)、CD3γ(例如，人CD3γ)和CD3ζ(例如，人CD3ζ)中的一者或多者)特异性结合，并且第二靶标结合结构域与CD28(例如，人CD28)特异性结合。
在一些实施例中，与CD3(例如，CD3δ(例如，人CD3δ)、CD3ε(例如，人CD3ε)、CD3γ(例如，人CD3γ)和CD3ζ(例如，人CD3ζ)中的一者或多者)特异性结合的第一靶标结合结构域是抗原结合结构域(例如，本文所描述的示例性抗原结合结构域中的任一种，例如，抗CD3scFv)。
在一些实施例中，第一靶标结合结构域可以是抗CD3 scFv。在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:21)和/或轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，scFv(例如本文描述的任一个scFv)可以包含在重链可变结构域与轻链可变结构域之间的接头序列(例如本文描述或本领域已知的任一个示例性接头序列)。
在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包含由核酸编码的重链可变结构域，所述核酸包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
CAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC(SEQ ID NO:23)和/或由核酸编码的轻链可变结构域，所述核酸包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGT(SEQ ID NO:24)。
在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包含SEQ IDNO:5中存在的六种CDR。
在一些实施例中，抗CD3 scFv可以包含由核酸序列编码的序列，所述序列与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)：
CAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCTATTATGAGCGCTAGCCCCGGTGAAAAGGTGACTATGACATGCAGCGCCAGCTCTTCCGTGAGCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAGTCCGGCACCAGCCCTAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTCCCCGCTCACTTTCGGGGCTCCGGCTCCGGAACAAGCTACTCTCTGACCATCAGCGGCATGGAAGCCGAGGATGCCGCTACCTATTACTGTCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCTTCACCTTTGGATCCGGCACCAAGCTCGAGATTAATCGTGGAGGCGGAGGTAGCGGAGGAGGCGGATCCGGCGGTGGAGGTAGCCAAGTTCAGCTCCAGCAAAGCGGCGCCGAACTCGCTCGGCCCGGCGCTTCCGTGAAGATGTCTTGTAAGGCCTCCGGCTATACCTTCACCCGGTACACAATGCACTGGGTCAAGCAACGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATTGGCTATATCAACCCCTCCCGGGGCTATACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAAGCCACCCTCACCACCGACAAGTCCAGCAGCACCGCTTACATGCAGCTGAGCTCTTTAACATCCGAGGATTCCGCCGTGTACTACTGCGCTCGGTACTACGACGATCATTACTGCCTCGATTACTGGGGCCAAGGTACCACCTTAACAGTCTCCTCC(SEQ ID NO:25)。
在一些实施例中，与CD28(例如，人CD28)特异性结合的第二靶标结合结构域是抗原结合结构域(例如，本文所描述的示例性抗原结合结构域中的任一种，例如，抗CD28scFv)。
在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:26)和/或轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS(SEQ ID NO:27)。
在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包含由核酸编码的重链可变结构域，所述核酸包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：GACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG(SEQ IDNO:28)和/或由核酸编码的轻链可变结构域，所述核酸包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO:29)。
在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:6)。在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包含SEQ ID NO:6中存在的六种CDR。
在一些实施例中，抗CD28 scFv可以包含由核酸序列编码的序列，所述序列与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)：
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGCGACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG(SEQ ID NO:30)。
在一些实施例中，为CD3/CD28结合剂的单链嵌合多肽可以包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:7)。
在一些实施例中，为CD3/CD28结合剂的单链嵌合多肽由核酸编码，所述核酸包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:9)。
在一些实施例中，为CD3/CD28结合剂的单链嵌合多肽可以包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
MKWVTFISLLFLFSSAYSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFREVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR(SEQ ID NO:8)。
在一些实施例中，为CD3/CD28结合剂的单链嵌合多肽由核酸编码，所述核酸包含与以下序列至少70％相同(例如，至少75％相同、至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同、至少95％相同、至少99％相同或100％相同)的序列：
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCCCAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGGTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGCGGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCCGACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG(SEQ ID NO:10)。
另外的抗原结合结构域
本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例可以进一步包含一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端和/或C端的其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽可以包含一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端的其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽N端的一个或多个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一可以直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽N端的至少一个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽包含一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其C端的其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽C端的一个或多个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包括接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于单链嵌合多肽C端的至少一个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，单链嵌合多肽包括一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)位于其N端和其C端的其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)。在一些实施例中，位于单链嵌合多肽N端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于N端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。在一些实施例中，位于C端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一直接邻接第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)，或可溶性组织因子结构域(例如任一种示例性可溶性组织因子结构域)。在一些实施例中，单链嵌合多肽进一步包含接头序列(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性接头序列)，所述接头序列介于C端的一个或多个其它抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)之一与第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)或可溶性组织因子结构域(例如本文所述的任一种示例性可溶性组织因子结构域)之间。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)中的两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)包含相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)各自特异性地结合到相同抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)各自特异性地结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合结构域各自包括相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)、第二靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)和一个或多个(例如二、三、四、五、六、七、八、九或十个)其它靶标结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性靶标结合结构域)特异性地结合到不同抗原。
在任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个是抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合结构域)。在本文所述的任一种单链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个其它靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如本文所述或所属领域中已知的任一种示例性抗原结合结构域)。在一些实施例中，抗原结合结构域可以包含scFv或单结构域抗体。
在本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，以下中的一者或多者(例如，二、三、四、五、六、七、八、九或十者)与CD28、CD3或IL-2受体特异性结合：第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)；第二靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)；以及一个或多个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。
在本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，以下中的一者或多者是可溶性IL-2：第一靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)；第二靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)；以及一个或多个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)
在多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)，其中一个或多个另外的抗原结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，第一嵌合多肽可以进一步包含在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，和/或一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的本文所接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第一嵌合多肽在第一嵌合多肽的N端和/或C端进一步包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接亲和结构域对中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的本文所描述的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，在第一嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)安置于第一嵌合多肽的N和/或C端，并且一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)定位在可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述或本领域已知的任何示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于N端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第一嵌合多肽中，安置于C端的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包含第一嵌合多肽中安置于至少一个另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第一靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)或一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的第一结构域中的任一种或本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种)之间的一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接可溶性组织因子结构域和/或一对亲和结构域中的第一结构域。在一些实施例中，第一嵌合多肽进一步包括接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)，所述接头序列安置于(i)可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子中的任一种)与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的示例性可溶性组织因子中的任一种)与一对亲和结构域中的第一结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第一结构域中的任一种)之间，和/或(ii)一对亲和结构域中的第一结构域与一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个之间，所述一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个位于可溶性组织因子结构域与一对亲和结构域中的第一结构域之间。
在本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种的一些实施例中，第二嵌合多肽在第二嵌合多肽的N端和/或C端进一步包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)另外的靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接所述一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包含第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与一对亲和结构域中的第二结构域(例如，本文所描述的示例性亲和结构域对中的任一种的示例性第二结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。在一些实施例中，在第二嵌合多肽中，一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)直接邻接第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的靶标结合结构域中的任一种)。在一些实施例中，第二嵌合多肽进一步包含第二嵌合多肽中在一个或多个另外的靶标结合结构域中的至少一个(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)与第二靶标结合结构域(例如，本文所描述或本领域已知的示例性靶标结合结构域中的任一种)之间的接头序列(例如，本文所描述或本领域已知的示例性接头序列中的任一种)。
在本文描述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域中的两个或更多个(例如，三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)包含相同的氨基酸序列。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的抗原。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自特异性结合到相同的表位。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自包含相同的氨基酸序列。
在本文所述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个其它靶标结合结构域特异性结合到不同的抗原。在本文所述的任一种多链嵌合多肽的一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个靶标结合结构域中的一个或多个(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或十个或更多个)是抗原结合结构域。在一些实施例中，第一靶标结合结构域、第二靶标结合结构域和一个或多个另外的靶标结合结构域各自是抗原结合结构域(例如，scFv或单结构域抗体)。
信号序列
在一些实施例中，本文所描述的单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以进一步在其N末端包含信号序列。如本领域普通技术人员将理解，信号序列是存在于许多内源产生的蛋白质的N端的氨基酸序列，其将蛋白质引导到分泌路径(例如，蛋白质被引导以存在于某些细胞内细胞器中、存在于细胞膜中或从细胞中分泌)。信号序列是异质的，并且其一级氨基酸序列差异很大。但是，信号序列的长度典型地为16至30个氨基酸，并且包含亲水、通常带正电荷的N端区、中央疏水结合结构域和含有信号肽酶的裂解位点的C端区。
在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:33)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含由以下核酸序列编码的信号序列：
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:34)；ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC(SEQ ID NO:35)；
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(SEQ ID NO:36)；或
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGC(SEQ ID NO:101)。
在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含具有氨基酸序列MKCLLYLAFLFLGVNC(SEQ ID NO:37)的信号序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含具有以下氨基酸序列的信号序列：MGQIVTMFEALPHIIDEVINIVIIVLIIITSIKAVYNFATCGILALVSFLFLAGRSCG(SEQ ID NO:38)。在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含具有以下氨基酸序列的信号序列：MPNHQSGSPTGSSDLLLSGKKQRPHLALRRKRRREMRKINRKVRRMNLAPIKEKTAWQHLQALISEAEEVLKTSQTPQNSLTLFLALLSVLGPPVTG(SEQ ID NO:39)。在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含具有氨基酸序列MDSKGSSQKGSRLLLLLVVSNLLLCQGVVS(SEQ ID NO:40)的信号序列。本领域普通技术人员将知道其它适当的用于单链嵌合多肽的信号序列。
在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含长度为约10到100个氨基酸的信号序列。例如，信号序列的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，信号序列的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的任一个信号序列可以在其N端和/或C端包含一个或多个另外的氨基酸(例如，1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要信号序列的功能保留完整即可。例如，具有氨基酸序列MKWVTFISLLFLFSSAYS(SEQ ID NO:33)的信号序列可以在N末端或C末端包含一个或多个另外的氨基酸，同时仍然保留将单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽引导到分泌路径的能力。
在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含将所述单链嵌合多肽、所述第一嵌合多肽或所述第二嵌合多肽引导到细胞外空间中的信号序列。此类实施例可用于产生相对容易分离和/或纯化的单链嵌合多肽、第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。
肽标签
在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含肽标签(例如，在所述单链嵌合多肽、所述第一嵌合多肽或所述第二嵌合多肽的N末端或C末端)。在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽包含两个或更多个肽标签。
可以包含在单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽中的示例性肽标签包含但不限于：AviTag(GLNDIFEAQKIEWHE；SEQ ID NO:41)；钙调素标签(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL；SEQ ID NO:42)；聚谷氨酸标签(EEEEEE；SEQ ID NO:43)；E标签(GAPVPYPDPLEPR；SEQ ID NO:44)；FLAG标签(DYKDDDDK；SEQ ID NO:45)；HA标签；来自血凝素的肽(YPYDVPDYA；SEQ ID NO:46)；his标签(HHHHH(SEQ ID NO:47)；HHHHHH(SEQ IDNO:48)；HHHHHHH(SEQ ID NO:49)；HHHHHHHH(SEQ ID NO:50)；HHHHHHHHH(SEQ ID NO:51)；或HHHHHHHHHH(SEQ ID NO:52))；myc标签(EQKLISEEDL；SEQ ID NO:53)；NE标签(TKENPRSNQEESYDDNES；SEQ ID NO:54)；S标签(KETAAAKFERQHMDS；SEQ ID NO:55)；SBP标签(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP；SEQ ID NO:56)；Softag 1(SLAELLNAGLGGS；SEQ ID NO:57)；Softag 3(TQDPSRVG；SEQ ID NO:58)；Spot标签(PDRVRAVSHWSS；SEQ IDNO:59)；Strep标签(WSHPQFEK；SEQ ID NO:60)；TC标签(CCPGCC；SEQ ID NO:61)；Ty标签(EVHTNQDPLD；SEQ ID NO:62)；V5标签(GKPIPNPLLGLDST；SEQ ID NO:63)；VSV标签(YTDIEMNRLGK；SEQ ID NO:64)；和Xpress标签(DLYDDDDK；SEQ ID NO:65)。在一些实施例中，组织因子蛋白是肽标签。
可以包含在单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽中的肽标签可以用于与单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽相关的多种应用中的任一种。例如，肽标签可以用于纯化单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽。作为一个非限制性实例，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含myc标签；并且可以使用识别所述myc标签的抗体进行纯化。识别myc标签的抗体的一个非限制性实例是9E10，其可以从非商业发展研究杂交瘤库(Developmental Studies Hybridoma Bank)获得。作为另一个非限制性实例，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含组氨酸标签，并且可以使用镍或钴螯合物进行纯化。本领域普通技术人员将了解其它合适的标签和与那些标签结合的用于纯化单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽的试剂。在一些实施例中，在纯化后从单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽去除肽标签。在一些实施例中，在纯化后不从单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽去除肽标签。
可以包含在单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽中的肽标签可以用于例如，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽的免疫沉淀，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽的成像(例如，通过蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术和/或免疫细胞化学)和/或单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽的溶解。
在一些实施例中，单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽可以包含长度为约10到100个氨基酸的肽标签。例如，肽标签的长度可以为约10到100个氨基酸、长度可以为约15到100个氨基酸、长度可以为约20到100个氨基酸、长度可以为约25到100个氨基酸、长度可以为约30到100个氨基酸、长度可以为约35到100个氨基酸、长度可以为约40到100个氨基酸、长度可以为约45到100个氨基酸、长度可以为约50到100个氨基酸、长度可以为约55到100个氨基酸、长度可以为约60到100个氨基酸、长度可以为约65到100个氨基酸、长度可以为约70到100个氨基酸、长度可以为约75到100个氨基酸、长度可以为约80到100个氨基酸、长度可以为约85到100个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约95到100个氨基酸、长度可以为约10到95个氨基酸、长度可以为约10到90个氨基酸、长度可以为约10到85个氨基酸、长度可以为约10到80个氨基酸、长度可以为约10到75个氨基酸、长度可以为约10到70个氨基酸、长度可以为约10到65个氨基酸、长度可以为约10到60个氨基酸、长度可以为约10到55个氨基酸、长度可以为约10到50个氨基酸、长度可以为约10到45个氨基酸、长度可以为约10到40个氨基酸、长度可以为约10到35个氨基酸、长度可以为约10到30个氨基酸、长度可以为约10到25个氨基酸、长度可以为约10到20个氨基酸、长度可以为约10到15个氨基酸、长度可以为约20到30个氨基酸、长度可以为约30到40个氨基酸、长度可以为约40到50个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸、长度可以为约60到70个氨基酸、长度可以为约70到80个氨基酸、长度可以为约80到90个氨基酸、长度可以为约90到100个氨基酸、长度可以为约20到90个氨基酸、长度可以为约30到80个氨基酸、长度可以为约40到70个氨基酸、长度可以为约50到60个氨基酸或之间的任何范围。在一些实施例中，肽标签的长度为约10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个氨基酸。
包含在单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽中的肽标签可以具有任何合适的长度。例如，肽标签的长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸。在单链嵌合多肽、第一嵌合多肽或第二嵌合多肽包含两个或更多个肽标签的实施例中，所述两个或更多个肽标签的长度可以相同或不同。在一些实施例中，本文公开的任一个肽标签可以在N端和/或C端包含一个或多个另外的氨基酸(例如，1、2、3、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸)，只要肽标签的功能保留完整即可。例如，具有氨基酸序列EQKLISEEDL(SEQ ID NO:53)的myc标签可以包含一个或多个另外的氨基酸(例如，在肽标签的N末端和/或C末端)，同时仍然保留被抗体(例如，9E10)结合的能力。
CD3/CD28结合剂
本文提供了包含使用一种或多种CD3/CD28结合剂的方法。CD3/CD28结合剂可以是例如单链嵌合多肽、多链嵌合多肽、双特异性抗体或抗CD3/抗CD28珠粒。
单链嵌合多肽
CD3/CD28结合剂的非限制性实例是单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述单链嵌合多肽的第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述单链嵌合多肽的第二靶标结合结构域与CD28结合。本文描述了为CD3/CD28结合剂的单链嵌合多肽的非限制性实例。
多链嵌合多肽
CD3/CD28结合剂的非限制性实例是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包含第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中：所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
在一些实施例中，所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在一些实施例中，所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。在一些实施例中，所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。在一些实施例中，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。在一些实施例中，所述第二嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
在一些实施例中，CD3是人CD3。在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。
在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不包含以下中的任一项：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在一些实施例中，所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包含以下中的一者或多者：在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
在一些实施例中，第一嵌合多肽的可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。在一些实施例中，第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施例中，第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。
在一些实施例中，CD28是人CD28。在一些实施例中，第二嵌合多肽的第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施例中，第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施例中，第二嵌合多肽包括与SEQID NO:108至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施例中，多链嵌合多肽不引发血液凝固。
在一些实施例中，液体培养基包括约10nM到约1000nM(或本文所描述的此范围的任何子范围)的多链嵌合多肽。在一些实施例中，液体培养基包括约50nM到约300nM(或本文所描述的此范围的任何子范围)的多链嵌合多肽。
示例性成熟第一嵌合多肽(SEQ ID NO:102)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
示例性DNA编码成熟第一嵌合多肽(SEQ ID NO:103)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGAACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
示例性前体第一嵌合多肽(SEQ ID NO:104)
MKWVTFISLLFLFSSAYSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
示例性DNA编码前体第一嵌合多肽(SEQ ID NO:105)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCCCAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGAACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
示例性成熟第二嵌合多肽(SEQ ID NO:106)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKRITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
示例性DNA编码成熟第二嵌合多肽(SEQ ID NO:107)
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGCGACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGGATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
示例性前体第二嵌合多肽(SEQ ID NO:108)
MKWVTFISLLFLFSSAYSVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKRITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
示例性DNA编码前体第二嵌合多肽(SEQ ID NO:109)
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGCGTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGCGACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGGATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
抗CD3/抗CD28珠粒
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂可以是抗CD3/抗CD28珠粒。抗CD3/抗CD28珠粒可以包含抗CD3抗体或其抗原结合片段以及抗CD28抗体或其抗原结合片段，两者与珠粒共价或非共价连接。在一些实施例中，抗CD3抗体或其抗原结合片段是抗CD3 scFv(例如，本文所描述的示例性抗CD3 scFv之一)。在一些实施例中，抗CD28抗体或其抗原结合片段是抗CD28 scFv(例如，本文所描述的任何抗CD28 scFv)。珠粒可以是本领域已知的任何合适的球形聚合物颗粒。珠粒的平均直径可以为约0.5到约20微米(例如，约0.5到约10、约0.8到约8或约1到约5微米)。在一些实施例中，珠粒可以包含一种或多种顺磁性材料，如但不限于免疫磁珠。抗CD3/抗CD28珠粒的非限制性实例包含抗CD3/抗CD28免疫磁珠，如由赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)、吉博科公司(Gibco)和英杰公司(Invitrogen)开发的那些。其它商业来源的抗CD3/抗CD28珠粒是本领域已知的。
IL-2受体活化剂
本文提供了包含使用一种或多种IL-2受体活化剂的方法。IL-2受体活化剂的非限制性实例包含单链嵌合多肽、多链嵌合多肽、可溶性IL-2(例如，重组人IL-2)和与IL-2受体特异性结合的激动性抗体(例如，人IL-2受体)。
单链嵌合多肽
在一些实施例中，IL-2受体活化剂是包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域的单链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2的受体结合。本文描述了为IL-2受体活化剂的单链嵌合多肽的非限制性实例。
可溶性IL-2
在一些实例中，IL-2受体活化剂可以是可溶性IL-2(例如，本文所描述的可溶性IL-2蛋白中的任一种)。在一些实施例中，可溶性IL-2蛋白可以包含与SEQ ID NO:1至少80％相同、至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的序列。
激动性抗体
在一些实例中，IL-2受体活化剂可以是与IL-2受体(例如，人IL-2受体)(参见例如，Gaulton等人,《临床免疫学和免疫病理学(Clinical Immunology andImmunopathology)》36(1):18-29,1985中所描述的那些)特异性结合的激动性抗体或其抗原结合片段。
IgG1抗体构建体
IgG1抗体构建体可以是IgG1抗体(例如，与可溶性组织因子结构域，例如，本文所描述的可溶性组织因子结构域中的任一种特异性结合的单克隆或多克隆IgG1抗体)。在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是包含IgG1 Fc区(例如，人IgG1 Fc区)的抗体或抗体片段。如本领域已知，IgG1 Fc区结合到CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)并且诱导其细胞内信号传导。在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是单链或多链多肽，其包含能够与CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)特异性结合并且能够诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导的Fc区，并且与可溶性组织因子结构域特异性结合。在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以是包含Fc区的单链或多链多肽，并且与可溶性组织因子结构域特异性结合，所述Fc区包含与野生型IgG1 Fc结构域(例如，野生型人IgG1 Fc结构域，例如，SEQ ID NO:98)至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同或至少99％相同)的序列并且能够与CD16a(FcRγIII)(例如，人CD16a)特异性结合，并且能够诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导。在一些实施例中，IgG1抗体构建体与可溶性组织因子结构域(例如，本文所描述的可溶性组织因子结构域中的任一种)特异性结合，并且包含非人Fc区(例如，来自非人抗体的Fc区)，所述非人Fc区已经过改变(例如，通过取代野生型非人Fc区中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸)，使得非人Fc区能够与人CD16a(人FcRγIII)结合并诱导其在自然杀伤细胞(例如，人自然杀伤细胞)中的细胞内信号传导。
野生型人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:98)
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
在一些实例中，IgG1抗体构建体是人源化的或完全的人抗组织因子抗体(参见例如，美国专利第7,968,094号和美国专利第8,007,795号中所描述的抗组织因子抗体)。
在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下一组CDR序列：包含DYNVY(SEQ ID NO:66)的CDR1；包含YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQID NO:67)的CDR2；以及包含DVTTALDF(SEQ ID NO:68)的CDR3。
在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下一组CDR序列：包含DYNVY(SEQ ID NO:66)的CDR1；包含YIDPYNGITIYDQNLKG(SEQID NO:74)的CDR2；以及包含DVTTALDF(SEQ ID NO:68)的CDR3。
示例性重链可变结构域(SEQ ID NO:72)
QIQLVQSGGEVKKPGASVRVSCKASGYSFTDYNVYWVRQSPGKGLEWIGYIDPYNGITIYDQNFKGKATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARDVTTALDFWGQGTTVTVSS
在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:72至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下一组CDR序列：包含LASQTIDTWLA(SEQ ID NO:69)的CDR1；包含AATNLAD(SEQIDNO:70)的CDR2；以及包含QQVYSSPFT(SEQ ID NO:71)的CDR3。
示例性轻链可变结构域(SEQ ID NO:73)
DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCLASQTIDTWLAWYLQKPGKSPQLLIYAATNLADGVPSRFSGSGSGTDFSFTISSLQPEDFATYYCQQVYSSPFTFGQGTKLEIK
在一些实施例中，IgG1抗体构建体可以包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:73至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
IgG1抗体构建体的非限制性实例可以包含：重链可变结构域，所述重链可变结构域包含与SEQ ID NO:72至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:73至少70％相同(例如，至少72％、至少74％、至少75％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少85％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同)的序列。
mTOR抑制剂
mTOR抑制剂的非限制性实例包含雷帕霉素(也被称为西罗莫司(sirolimus))、Zortress(也被称为依维莫司(everolimus)和RAD001)、驮瑞塞尔(Torisel)(也被称为替西罗莫司(temsirolimus)和CCI-779)、飞尼妥(Afinitor)(依维莫司)、达托尼西(dactolisib)(也被称为NVP-BEZ235)、GSK2126458、XL765、AZD8055、INK128(也被称为MLN0128)、OSI027和RapaLinks。
刺激或增加Treg细胞的增殖的示例性方法
本文提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，所述方法包含在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包含：CD3/CD28结合剂(例如，本文所描述的示例性CD3/CD28结合剂中的任一种)；以及单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2受体结合。在一些实例中，液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在一些实例中，单链嵌合多肽包含与SEQ ID NO:3至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实例中，单链嵌合多肽包含与SEQ ID NO:4至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。
在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约500nM(例如，约10nM到约450nM、约10nM到约400nM、约10nM到约350nM、约10nM到约300nM、约10nM到约250nM、约10nM到约200nM、约10nM到约150nM、约10nM到约100nM、约10nM到约50nM、约50nM到约500nM、约50nM到约450nM、约50nM到约400nM、约50nM到约350nM、约50nM到约300nM、约50nM到约250nM、约50nM到约200nM、约50nM到约150nM、约50nM到约100nM、约100nM到约500nM、约100nM到约450nM、约100nM到约400nM、约100nM到约350nM、约100nM到约300nM、约100nM到约250nM、约100nM到约200nM、约100nM到约150nM、约150nM到约500nM、约150nM到约450nM、约150nM到约400nM、约150nM到约350nM、约150nM到约300nM、约150nM到约250nM、约150nM到约200nM、约200nM到约500nM、约200nM到约450nM、约200nM到约400nM、约200nM到约350nM、约200nM到约300nM、约200nM到约250nM、约250nM到约500nM、约250nM到约450nM、约250nM到约400nM、约250nM到约350nM、约250nM到约300nM、约300nM到约500nM、约300nM到约450nM、约300nM到约400nM、约300nM到约350nM、约350nM到约500nM、约350nM到约450nM、约350nM到约400nM、约400nM到约500nM、约400nM到约450nM或约450nM到约500nM)的单链嵌合多肽。
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性抗CD3/抗CD28珠粒中的任一种)。在一些实施例中，液体培养基以约1:1到约6:1珠粒/细胞(例如，约1:1到约5:1、约1:1到约4:1、约1:1到约3:1、约1:1到约2:1、约2:1到约6:1、约2:1到约5:1、约2:1到约4:1、约2:1到约3:1、约3:1到约6:1、约3:1到约5:1、约3:1到约4:1、约4:1到约6:1、约4:1到约5:1、约5:1到约6:1珠粒/细胞)的比率包含抗CD3/抗CD28珠粒。
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包含第一抗原结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3特异性结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28特异性结合。在一些实施例中，液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与另外的单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在一些实施例中，另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约1000nM(例如，约10nM到约950nM、约10nM到约900nM、约10nM到约850nM、约10nM到约800nM、约10nM到约750nM、约10nM到约700nM、约10nM到约650nM、约10nM到约600nM、约10nM到约550nM、约10nM到约500nM、约10nM到约450nM、约10nM到约400nM、约10nM到约350nM、约10nM到约300nM、约10nM到约250nM、约10nM到约200nM、约10nM到约150nM、约10nM到约100nM、约10nM到约50nM、约25nM到约1000nM、约25nM到约950nM、约25nM到约900nM、约25nM到约850nM、约25nM到约800nM、约25nM到约750nM、约25nM到约700nM、约25nM到约650nM、约25nM到约600nM、约25nM到约550nM、约25nM到约500nM、约25nM到约450nM、约25nM到约400nM、约25nM到约350nM、约25nM到约300nM、约25nM到约250nM、约25nM到约200nM、约25nM到约150nM、约25nM到约100nM、约25nM到约50nM、约50nM到约1000nM、约50nM到约950nM、约50nM到约900nM、约50nM到约850nM、约50nM到约800nM、约50nM到约750nM、约50nM到约700nM、约50nM到约650nM、约50nM到约600nM、约50nM到约550nM、约50nM到约500nM、约50nM到约450nM、约50nM到约400nM、约50nM到约350nM、约50nM到约300nM、约50nM到约250nM、约50nM到约200nM、约50nM到约150nM、约50nM到约100nM、约100nM到约1000nM、约100nM到约950nM、约100nM到约900nM、约100nM到约850nM、约100nM到约800nM、约100nM到约750nM、约100nM到约700nM、约100nM到约650nM、约100nM到约600nM、约100nM到约550nM、约100nM到约500nM、约100nM到约450nM、约100nM到约400nM、约100nM到约350nM、约100nM到约300nM、约100nM到约250nM、约100nM到约200nM、约100nM到约150nM、约150nM到约1000nM、约150nM到约950nM、约150nM到约900nM、约150nM到约850nM、约150nM到约800nM、约150nM到约750nM、约150nM到约700nM、约150nM到约650nM、约150nM到约600nM、约150nM到约550nM、约150nM到约500nM、约150nM到约450nM、约150nM到约400nM、约150nM到约350nM、约150nM到约300nM、约150nM到约250nM、约150nM到约200nM、约200nM到约1000nM、约200nM到约950nM、约200nM到约900nM、约200nM到约850nM、约200nM到约800nM、约200nM到约750nM、约200nM到约700nM、约200nM到约650nM、约200nM到约600nM、约200nM到约550nM、约200nM到约500nM、约200nM到约450nM、约200nM到约400nM、约200nM到约350nM、约200nM到约300nM、约200nM到约250nM、约250nM到约1000nM、约250nM到约950nM、约250nM到约900nM、约250nM到约850nM、约250nM到约800nM、约250nM到约750nM、约250nM到约700nM、约250nM到约650nM、约250nM到约600nM、约250nM到约550nM、约250nM到约500nM、约250nM到约450nM、约250nM到约400nM、约250nM到约350nM、约250nM到约300nM、约300nM到约1000nM、约300nM到约950nM、约300nM到约900nM、约300nM到约850nM、约300nM到约800nM、约300nM到约750nM、约300nM到约700nM、约300nM到约650nM、约300nM到约600nM、约300nM到约550nM、约300nM到约500nM、约300nM到约450nM、约300nM到约400nM、约300nM到约350nM、约350nM到约1000nM、约350nM到约950nM、约350nM到约900nM、约350nM到约850nM、约350nM到约800nM、约350nM到约750nM、约350nM到约700nM、约350nM到约650nM、约350nM到约600nM、约350nM到约550nM、约350nM到约500nM、约350nM到约450nM、约350nM到约400nM、约400nM到约1000nM、约400nM到约950nM、约400nM到约900nM、约400nM到约850nM、约400nM到约800nM、约400nM到约750nM、约400nM到约700nM、约400nM到约650nM、约400nM到约600nM、约400nM到约550nM、约400nM到约500nM、约400nM到约450nM、约450nM到约1000nM、约450nM到约950nM、约450nM到约900nM、约450nM到约850nM、约450nM到约800nM、约450nM到约750nM、约450nM到约700nM、约450nM到约650nM、约450nM到约600nM、约450nM到约550nM、约450nM到约500nM、约500nM到约1000nM、约500nM到约950nM、约500nM到约900nM、约500nM到约850nM、约500nM到约800nM、约500nM到约750nM、约500nM到约700nM、约500nM到约650nM、约500nM到约600nM、约500nM到约550nM、约550nM到约1000nM、约550nM到约950nM、约550nM到约900nM、约550nM到约850nM、约550nM到约800nM、约550nM到约750nM、约550nM到约700nM、约550nM到约650nM、约550nM到约600nM、约600nM到约1000nM、约600nM到约950nM、约600nM到约900nM、约600nM到约850nM、约600nM到约800nM、约600nM到约750nM、约600nM到约700nM、约600nM到约650nM、约650nM到约1000nM、约650nM到约950nM、约650nM到约900nM、约650nM到约850nM、约650nM到约800nM、约650nM到约750nM、约650nM到约700nM、约700nM到约1000nM、约700nM到约950nM、约700nM到约900nM、约700nM到约850nM、约700nM到约800nM、约700nM到约750nM、约750nM到约1000nM、约750nM到约950nM、约750nM到约900nM、约750nM到约850nM、约750nM到约800nM、约800nM到约1000nM、约800nM到约950nM、约800nM到约900nM、约800nM到约850nM、约850nM到约1000nM、约850nM到约950nM、约850nM到约900nM、约900nM到约1000nM、约900nM到约950nM或约950nM到约1000nM)的另外的单链嵌合多肽。
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包含第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中：所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。在一些实施例中，液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与多链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在一些实施例中，第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，第二嵌合多肽包括与SEQ IDNO:108至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约1000nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的多链嵌合多肽。在一些实施例中，液体培养基进一步包括mTOR抑制剂(例如，本文所描述的mTOR抑制剂中的任一种，例如，雷帕霉素)。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约500nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的mTOR抑制剂。在一些实施例中，液体培养基不包含mTOR抑制剂。
一些实施例进一步包含在时间段开始之后每36小时到约60小时(例如，约36到约56小时、约36到约52小时、约36到约48小时、约36到约44小时、约36到约40小时、约40到约60小时、约40到约56小时、约40到约52小时、约40到约48小时、约40到约44小时、约44到约60小时、约44到约56小时、约44到约52小时、约44到约48小时、约48到约60小时、约48到约56小时、约48到约52小时、约52到约60小时、约52到约56小时或约56到约60小时)之后，周期性地向液体培养基中添加单链嵌合多肽(例如，本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种)。在一些实施例中，进行单链嵌合多肽的周期性添加以导致液体培养基中的单链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)。
一些实施例进一步包含在时间段开始之后每约4天到约10天之后(例如，每约4天到约9天之后、每约4天到约8天之后、每约4天到约7天之后、每约4天到约6天之后、每约4天到约5天之后、每约5天到约10天之后、每约5天到约9天之后、每约5天到约8天之后、每约5天到约7天之后、每约5天到约6天之后、每约6天到约10天之后、每约6天到约9天之后、每约6天到约8天之后、每约6天到约7天之后、每约7天到约10天之后、每约7天到约9天之后、每约7天到约8天之后、每约8天到约10天之后、每约8天到约9天之后或每约9天到约10天之后)，周期性地向液体培养基中添加所述CD3/CD28结合剂。
在本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法的一些实施例中，液体培养基可以进一步包含mTOR抑制剂(例如，本文所描述的mTOR抑制剂中的任一种)。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约500nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的mTOR抑制剂(例如，本文描述的mTOR抑制剂中的任一种)。
在这些方法的一些实例中，液体培养基是无血清液体培养基。在本文描述的任一种方法的一些实施例中，液体培养基是化学成分确定的液体培养基。
在一些实施例中，时间段为约7天到约56天(例如，约7天到约56天、约7天到约54天、约7天到约46天、约7天到约38天、约7天到约32天、约7天到约28天、约7天到约25天、约7天到约23天、约7天到约21天、约7天到约19天、约7天到约17天、约7天到约15天、约7天到约13天、约7天到约11天、约7天到约9天、约9天到约56天、约9天到约54天、约9天到约46天、约9天到约38天、约9天到约32天、约9天到约28天、约9天到约25天、约9天到约23天、约9天到约21天、约9天到约19天、约9天到约17天、约9天到约15天、约9天到约13天、约9天到约11天、约11天到约56天、约11天到约54天、约11天到约46天、约11天到约38天、约11天到约32天、约11天到约28天、约11天到约25天、约11天到约23天、约11天到约21天、约11天到约19天、约11天到约17天、约11天到约15天、约11天到约13天、约13天到约56天、约13天到约54天、约13天到约46天、约13天到约38天、约13天到约32天、约13天到约28天、约13天到约25天、约13天到约23天、约13天到约21天、约13天到约19天、约13天到约17天、约13天到约15天、约15天到约56天、约15天到约54天、约15天到约46天、约15天到约38天、约15天到约32天、约15天到约28天、约15天到约25天、约15天到约23天、约15天到约21天、约15天到约19天、约15天到约17天、约17天到约56天、约17天到约54天、约17天到约46天、约17天到约38天、约17天到约32天、约17天到约28天、约17天到约25天、约17天到约23天、约17天到约21天、约17天到约19天、约19天到约56天、约19天到约54天、约19天到约46天、约19天到约38天、约19天到约32天、约19天到约28天、约19天到约25天、约19天到约23天、约19天到约21天、约21天到约56天、约21天到约54天、约21天到约46天、约21天到约38天、约21天到约32天、约21天到约28天、约21天到约25天、约21天到约23天、约23天到约56天、约23天到约54天、约23天到约46天、约23天到约38天、约23天到约32天、约23天到约28天、约23天到约25天、约25天到约56天、约25天到约54天、约25天到约46天、约25天到约38天、约25天到约32天、约25天到约28天、约28天到约56天、约28天到约54天、约28天到约50天、约28天到约46天、约28天到约38天、约28天到约32天、约32天到约56天、约32天到约54天、约32天到约46天、约32天到约38天、约38天到约56天、约38天到约54天、约38天到约46天、约46天到约56天、约46天到约54天、约54天到约56天)。
一些实施例进一步包含在培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的步骤(例如，使用本文所描述的分离方法中的任一种)。
刺激或增加Treg细胞的增殖的示例性方法
还提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，所述方法包含：在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包含：IL-2受体活化剂(例如，本文所描述的IL-2受体活化剂中的任一种)；以及包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域的单链嵌合多肽，其中：所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。在一些实例中，液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包括与单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在一些实施例中，单链嵌合多肽包含与SEQ ID NO:7至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包含与SEQ ID NO:8至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。
在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约1000nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的单链嵌合多肽(例如，本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种)。
在一些实施例中，IL-2受体活化剂是可溶性IL-2。在一些实施例中，人可溶性IL-2包含与SEQ ID NO:1至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，液体培养基包含约100IU/mL到约800IU/mL(例如，约100IU/mL到约800IU/mL、约100IU/mL到约700IU/mL、约100IU/mL到约600IU/mL、约100IU/mL到约500IU/mL、约100IU/mL到约400IU/mL、约100IU/mL到约300IU/mL、约100IU/mL到约200IU/mL、约200IU/mL到约800IU/mL、约200IU/mL到约700IU/mL、约200IU/mL到约600IU/mL、约200IU/mL到约500IU/mL、约200IU/mL到约400IU/mL、约200IU/mL到约300IU/mL、约300IU/mL到约800IU/mL、约300IU/mL到约700IU/mL、约300IU/mL到约600IU/mL、约300IU/mL到约500IU/mL、约300IU/mL到约400IU/mL、约400IU/mL到约800IU/mL、约400IU/mL到约700IU/mL、约400IU/mL到约600IU/mL、约400IU/mL到约500IU/mL、约500IU/mL到约800IU/mL、约500IU/mL到约700IU/mL、约500IU/mL到约600IU/mL、约600IU/mL到约800IU/mL、约600IU/mL到约700IU/mL或约700IU/mL到约800IU/mL)的人可溶性IL-2。
在一些实施例中，液体培养基进一步包含mTOR抑制剂(例如，本文所描述的示例性mTOR抑制剂中的任一种，例如，雷帕霉素)。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约500nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的mTOR抑制剂。
这些方法的一些实施例进一步包含在时间段开始之后每36小时到约60小时(例如，约36到约56小时、约36到约52小时、约36到约48小时、约36到约44小时、约36到约40小时、约40到约60小时、约40到约56小时、约40到约52小时、约40到约48小时、约40到约44小时、约44到约60小时、约44到约56小时、约44到约52小时、约44到约48小时、约48到约60小时、约48到约56小时、约48到约52小时、约52到约60小时、约52到约56小时或约56到约60小时)之后，周期性地向液体培养基中添加IL-2受体活化剂(例如，本文所描述的IL-2受体活化剂中的任一种)。在一些实施例中，进行IL-2受体活化剂的周期性添加以导致液体培养基中的IL-2受体活化剂的浓度为约10nM到约1000nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)。
这些方法的一些实施例进一步包含在时间段开始之后每约4天到约10天之后(例如，每约4天到约9天之后、每约4天到约8天之后、每约4天到约7天之后、每约4天到约6天之后、每约4天到约5天之后、每约5天到约10天之后、每约5天到约9天之后、每约5天到约8天之后、每约5天到约7天之后、每约5天到约6天之后、每约6天到约10天之后、每约6天到约9天之后、每约6天到约8天之后、每约6天到约7天之后、每约7天到约10天之后、每约7天到约9天之后、每约7天到约8天之后、每约8天到约10天之后、每约8天到约9天之后或每约9天到约10天之后)，周期性地向液体培养基中添加单链嵌合多肽(例如，本文所描述的示例性单链嵌合多肽中的任一种)。
在这些方法中的任何方法的一些实施例中，时间段为约7到约56天(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)。
一些实施例进一步包含在培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的步骤(例如，使用本文所描述的分离方法中的任一种)。
刺激或增加Treg细胞的增殖的示例性方法
还提供了刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，所述方法包含：在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包含：CD3/CD28结合剂(例如，本文所描述的CD3/CD28结合剂中的任一种)；以及多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包含：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包含：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合(例如，本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种)。在一些实施例中，液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包括与多链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒(例如，本文所描述的抗CD3/抗CD28珠粒中的任一种)。在本文所描述的任一种方法的一些实施例中，液体培养基以约1:1到约6:1珠粒/细胞(例如，约1:1到约5:1、约1:1到约4:1、约1:1到约3:1、约1:1到约2:1、约2:1到约6:1、约2:1到约5:1、约2:1到约4:1、约2:1到约3:1、约3:1到约6:1、约3:1到约5:1、约3:1到约4:1、约4:1到约6:1、约4:1到约5:1、约5:1到约6:1珠粒/细胞)的比率包含抗CD3/抗CD28珠粒。
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述单链嵌合多肽的第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述单链嵌合多肽的第二靶标结合结构域与CD28结合(例如，本文所描述的示例性单链嵌合多肽中的任一种)。在一些实施例中，单链嵌合多肽包含与SEQ ID NO:7至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，单链嵌合多肽包含与SEQ ID NO:8至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约1000nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的单链嵌合多肽。
在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包含第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包含(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中：所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。在一些实施例中，液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与多链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
在一些实施例中，第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，第二嵌合多肽包括与SEQ IDNO:108至少80％相同(例如，至少82％相同、至少84％相同、至少86％相同、至少88％相同、至少90％相同、至少92％相同、至少94％相同、至少96％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同)的序列。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约1000nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)的多链嵌合多肽。
在一些实施例中，液体培养基进一步包含mTOR抑制剂(例如，本文所描述的mTOR抑制剂中的任一种，例如，雷帕霉素)。在一些实施例中，液体培养基包含约10nM到约500nM的mTOR抑制剂(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)。在一些实施例中，液体培养基不包含mTOR抑制剂。
这些方法的一些实施例进一步包含在时间段开始之后每36小时到约60小时(例如，约36到约56小时、约36到约52小时、约36到约48小时、约36到约44小时、约36到约40小时、约40到约60小时、约40到约56小时、约40到约52小时、约40到约48小时、约40到约44小时、约44到约60小时、约44到约56小时、约44到约52小时、约44到约48小时、约48到约60小时、约48到约56小时、约48到约52小时、约52到约60小时、约52到约56小时或约56到约60小时)之后，周期性地向液体培养基中添加多链嵌合多肽(例如，本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种)。在一些实施例中，进行多链嵌合多肽的周期性添加以导致液体培养基中的多链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)。
这些方法的一些实施例进一步包含在时间段开始之后每约4天到约10天之后(例如，每约4天到约9天之后、每约4天到约8天之后、每约4天到约7天之后、每约4天到约6天之后、每约4天到约5天之后、每约5天到约10天之后、每约5天到约9天之后、每约5天到约8天之后、每约5天到约7天之后、每约5天到约6天之后、每约6天到约10天之后、每约6天到约9天之后、每约6天到约8天之后、每约6天到约7天之后、每约7天到约10天之后、每约7天到约9天之后、每约7天到约8天之后、每约8天到约10天之后、每约8天到约9天之后或每约9天到约10天之后)，周期性地向液体培养基中添加CD3/CD28结合剂(例如，本文所描述的示例性CD3/CD28结合剂中的任一种)。
在这些方法中的任何方法的一些实施例中，时间段为约7到约56天(例如，或本文所描述的此范围的任何子范围)。
一些实施例进一步包含在培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的步骤(例如，使用本文所描述的分离方法中的任一种)。
从样品中分离Treg细胞的方法
如本文所描述的刺激或增加Treg细胞的增殖的任何方法可以进一步包含在培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的步骤。
样品可以是血液样品(例如，外周血样品或脐带血样品)、淋巴组织或胸腺样品(例如，小儿胸腺样品)。本文所描述的任何方法的一些实施例进一步包含从受试者获得样品。
从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的方法是本领域熟知的。例如，磁激活的细胞分选(MACS)和/或荧光激活的细胞分选(FACS)可以用于基于标志物表达分离Treg细胞。FACS仪器的非限制性实例包含FACSAria(贝迪医疗(Becton Dickinson))、FX500应用流体学细胞分选仪(索尼(Sony))和MACSQuant Tyto细胞分选仪(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))。用于从样品中分离Treg细胞的示例性细胞表面蛋白包含CD4、CD25和CD127。Treg细胞的细胞内标志物是Foxp3。例如，CD4和CD25的表达水平可以用于从样品(例如，脐带血样品)中分离Treg细胞。CD127的表达水平可以用作从样品(例如，外周血样品)中分离Treg细胞的另外的标志物。在一些情况下，从样品中分离Treg细胞包含分选为CD4+CD25+Foxp3+和/或为CD4+CD25+CD127dim的Treg细胞。用于分离Treg细胞的试剂盒包含CD4+CD25+CD127dim调节性T细胞分离试剂盒II试剂(美天旎生物技术公司)。用于分离Treg细胞的另外的试剂盒可从干细胞技术公司(StemCell Technologies)(EasySepTM人CD4+CD127low、CD25+调节性T细胞分离试剂盒)、美天旎生物技术公司(人CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒)和研发系统公司(R&D Systems)(MagCellect人CD4+CD25+调节性T细胞分离试剂盒)商购获得。
本文还提供了从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的方法，所述方法包含基于Treg细胞的CD39表达从样品中分离Treg细胞，由此分离Treg细胞。这些方法的一些实施例包含在允许抗体或配体与表达CD39的Treg细胞结合的条件下，将样品与能够结合CD39的抗体或配体混合；以及将与抗体或配体结合的Treg细胞与样品中的其它组分分离，由此分离Treg细胞。在这些方法的一些实施例中，所述抗体是小鼠、人源化或人抗体或其抗原结合片段；和/或所述抗体或配体用生物素、亲和素、链霉亲和素或荧光染料中的至少一种标记，或者与颗粒、珠粒、树脂或固体支持物结合。在这些方法的一些实施例中，分离包括使用流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、离心或基于柱、板、颗粒或珠粒的方法。这些方法的一些实施例进一步包含：在允许所述抗体或所述配体与所述Treg细胞结合的条件下，将所述样品与能够结合CD39的生物素化抗体或配体混合；
使用链霉亲和素包被的磁性颗粒捕获与生物素化抗体或配体结合的Treg细胞；使用磁铁分离结合磁性颗粒的Treg细胞；洗涤结合磁铁颗粒的Treg细胞，以去除样品中的其它组分；以及将结合磁性颗粒的Treg细胞从磁铁中释放到溶液中，由此分离Treg细胞。
在一些实例中，Treg细胞是从包括新鲜或冷冻的外周血、脐带血、外周血单核细胞、淋巴细胞、CD4+ T细胞或Treg细胞的样品中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。在一些实例中，Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。在一些实例中，Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。在一些实例中，Treg细胞包括嵌合抗原受体。在一些实例中，Treg细胞在体外和在体内是免疫抑制性的。
本文还提供了使用本文所描述的任何方法产生和/或分离的分离的Treg细胞群。在一些实例中，分离的Treg细胞群大于70％(例如，大于75％、大于80％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％或大于99％)CD39+细胞。在一些实例中，本文提供的分离的Treg细胞或分离的Treg细胞群在体外进一步扩增。还提供了扩增本文所描述的分离的Treg细胞群的任何方法，所述方法包含在允许分离的Treg细胞的增殖的条件下培养分离的Treg细胞群。
本文还提供了包括本文所描述的任何分离的Treg细胞群和药学上可接受的载体的组合物。本文还提供了治疗有需要的受试者的方法，所述方法包含向所述受试者施用治疗有效量的本文所描述的任何组合物。在一些实例中，所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。在一些实例中，所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。在一些实例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
Treg细胞
在本文所描述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，Treg细胞可以是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。在本文所描述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，Treg细胞可以是CD4+CD25+Foxp3+细胞。在本文所描述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，Treg细胞可以是CD4+CD25+CD127dim细胞。
在本文所描述的任何方法、组合物和试剂盒的一些实施例中，Treg细胞可以包含嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实例中，Treg细胞先前已被基因修饰以表达嵌合抗原受体或重组T细胞受体。在一些实例中，Treg细胞先前已被基因修饰以表达识别靶标组织中的所关注肽或共刺激分子(例如，ICOS)的重组T细胞受体。
这些方法的一些实施例可以进一步包含在培养步骤之后，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入到Treg细胞中。这些方法的一些实施例可以进一步包含在培养步骤之后，将编码共刺激分子(例如，ICOS)的核酸引入到Treg细胞中。
这些方法的一些实施例可以进一步包含在培养步骤之前，将编码嵌合抗原受体或重组T细胞受体的核酸引入所述Treg细胞中。这些方法的一些实施例可以进一步包含在培养步骤之前，将编码共刺激分子(例如，ICOS)的核酸引入到Treg细胞中。
Treg细胞的增殖的检测可以使用本领域已知的方法进行，例如，细胞术(例如，荧光辅助流式细胞术)、显微镜检查和免疫荧光显微镜检查。例如，Treg细胞的增殖可以通过用染料(例如，台盼蓝)染色和对活细胞的数量进行计数来测定。在一些实例中，Treg细胞的增殖和/或激活可以通过检测Treg细胞上的表面标志物的水平来测定，所述表面标志物如但不限于：Helios、CTLA-4、CD39、CD62L、CD25、CD103、CD69、PD1和CD49b。这些表面标志物的检测可以使用FACS进行。Treg细胞的激活也可以通过检测Treg细胞中的葡萄糖代谢水平来测定。在一些实例中，葡萄糖代谢可以通过测量细胞外酸化比率(ECAR)来测定，其涉及以下阶段：非糖酵解酸化(不含药物)、糖酵解(添加葡萄糖)、糖酵解能力(添加寡霉素)和糖酵解储备(添加2-脱氧葡萄糖)。细胞外通量分析仪(安捷伦(Agilent))可以用于测量ECAR。
在一些实例中，Treg细胞的增殖和/或激活可以通过检测IL-10分泌水平的增加来测定。例如，本文所提供的方法可以导致由Treg细胞分泌的IL-10水平增加约1％到约800％(例如，约1％到约750％、约1％到约700％、约1％到约650％、约1％到约600％、约1％到约550％、约1％到约500％、约1％到约450％、约1％到约400％、约1％到约350％、约1％到约300％、约1％到约280％、约1％到约260％、约1％到约240％、约1％到约220％、约1％到约200％、约1％到约180％、约1％到约160％、约1％到约140％、约1％到约120％、约1％到约100％、约1％到约90％、约1％到约80％、约1％到约70％、约1％到约60％、约1％到约50％、约1％到约45％、约1％到约40％、约1％到约35％、约1％到约30％、约1％到约25％、约1％到约20％、约1％到约15％、约1％到约10％、约1％到约5％、约5％到约800％、约5％到约750％、约5％到约700％、约5％到约650％、约5％到约600％、约5％到约550％、约5％到约500％、约5％到约450％、约5％到约400％、约5％到约350％、约5％到约300％、约5％到约280％、约5％到约260％、约5％到约240％、约5％到约220％、约5％到约200％、约5％到约180％、约5％到约160％、约5％到约140％、约5％到约120％、约5％到约100％、约5％到约90％、约5％到约80％、约5％到约70％、约5％到约60％、约5％到约50％、约5％到约45％、约5％到约40％、约5％到约35％、约5％到约30％、约5％到约25％、约5％到约20％、约5％到约15％、约5％到约10％、约10％到约800％、约10％到约750％、约10％到约700％、约10％到约650％、约10％到约600％、约10％到约550％、约10％到约500％、约10％到约450％、约10％到约400％、约10％到约350％、约10％到约300％、约10％到约280％、约10％到约260％、约10％到约240％、约10％到约220％、约10％到约200％、约10％到约180％、约10％到约160％、约10％到约140％、约10％到约120％、约10％到约100％、约10％到约90％、约10％到约80％、约10％到约70％、约10％到约60％、约10％到约50％、约10％到约45％、约10％到约40％、约10％到约35％、约10％到约30％、约10％到约25％、约10％到约20％、约10％到约15％、约15％到约800％、约15％到约750％、约15％到约700％、约15％到约650％、约15％到约600％、约15％到约550％、约15％到约500％、约15％到约450％、约15％到约400％、约15％到约350％、约15％到约300％、约15％到约280％、约15％到约260％、约15％到约240％、约15％到约220％、约15％到约200％、约15％到约180％、约15％到约160％、约15％到约140％、约15％到约120％、约15％到约100％、约15％到约90％、约15％到约80％、约15％到约70％、约15％到约60％、约15％到约50％、约15％到约45％、约15％到约40％、约15％到约35％、约15％到约30％、约15％到约25％、约15％到约20％、约20％到约800％、约20％到约750％、约20％到约700％、约20％到约650％、约20％到约600％、约20％到约550％、约20％到约500％、约20％到约450％、约20％到约400％、约20％到约350％、约20％到约300％、约20％到约280％、约20％到约260％、约20％到约240％、约20％到约220％、约20％到约200％、约20％到约180％、约20％到约160％、约20％到约140％、约20％到约120％、约20％到约100％、约20％到约90％、约20％到约80％、约20％到约70％、约20％到约60％、约20％到约50％、约20％到约45％、约20％到约40％、约20％到约35％、约20％到约30％、约20％到约25％、约25％到约800％、约25％到约750％、约25％到约700％、约25％到约650％、约25％到约600％、约25％到约550％、约25％到约500％、约25％到约450％、约25％到约400％、约25％到约350％、约25％到约300％、约25％到约280％、约25％到约260％、约25％到约240％、约25％到约220％、约25％到约200％、约25％到约180％、约25％到约160％、约25％到约140％、约25％到约120％、约25％到约100％、约25％到约90％、约25％到约80％、约25％到约70％、约25％到约60％、约25％到约50％、约25％到约45％、约25％到约40％、约25％到约35％、约35％到约800％、约35％到约750％、约35％到约700％、约35％到约650％、约35％到约600％、约35％到约550％、约35％到约500％、约35％到约450％、约35％到约400％、约35％到约350％、约35％到约300％、约35％到约280％、约35％到约260％、约35％到约240％、约35％到约220％、约35％到约200％、约35％到约180％、约35％到约160％、约35％到约140％、约35％到约120％、约35％到约100％、约35％到约90％、约35％到约80％、约35％到约70％、约35％到约60％、约35％到约50％、约35％到约45％、约35％到约40％、约40％到约800％、约40％到约750％、约40％到约700％、约40％到约650％、约40％到约600％、约40％到约550％、约40％到约500％、约40％到约450％、约40％到约400％、约40％到约350％、约40％到约300％、约40％到约280％、约40％到约260％、约40％到约240％、约40％到约220％、约40％到约200％、约40％到约180％、约40％到约160％、约40％到约140％、约40％到约120％、约40％到约100％、约40％到约90％、约40％到约80％、约40％到约70％、约40％到约60％、约40％到约50％、约40％到约45％、约45％到约800％、约45％到约750％、约45％到约700％、约45％到约650％、约45％到约600％、约45％到约550％、约45％到约500％、约45％到约450％、约45％到约400％、约45％到约350％、约45％到约300％、约45％到约280％、约45％到约260％、约45％到约240％、约45％到约220％、约45％到约200％、约45％到约180％、约45％到约160％、约45％到约140％、约45％到约120％、约45％到约100％、约45％到约90％、约45％到约80％、约45％到约70％、约45％到约60％、约45％到约50％、约50％到约800％、约50％到约750％、约50％到约700％、约50％到约650％、约50％到约600％、约50％到约550％、约50％到约500％、约50％到约450％、约50％到约400％、约50％到约350％、约50％到约300％、约50％到约280％、约50％到约260％、约50％到约240％、约50％到约220％、约50％到约200％、约50％到约180％、约50％到约160％、约50％到约140％、约50％到约120％、约50％到约100％、约50％到约90％、约50％到约80％、约50％到约70％、约50％到约60％、约60％到约800％、约60％到约750％、约60％到约700％、约60％到约650％、约60％到约600％、约60％到约550％、约60％到约500％、约60％到约450％、约60％到约400％、约60％到约350％、约60％到约300％、约60％到约280％、约60％到约260％、约60％到约240％、约60％到约220％、约60％到约200％、约60％到约180％、约60％到约160％、约60％到约140％、约60％到约120％、约60％到约100％、约60％到约90％、约60％到约80％、约60％到约70％、约70％到约800％、约70％到约750％、约70％到约700％、约70％到约650％、约70％到约600％、约70％到约550％、约70％到约500％、约70％到约450％、约70％到约400％、约70％到约350％、约70％到约300％、约70％到约280％、约70％到约260％、约70％到约240％、约70％到约220％、约70％到约200％、约70％到约180％、约70％到约160％、约70％到约140％、约70％到约120％、约70％到约100％、约70％到约90％、约70％到约80％、约80％到约800％、约80％到约750％、约80％到约700％、约80％到约650％、约80％到约600％、约80％到约550％、约80％到约500％、约80％到约450％、约80％到约400％、约80％到约350％、约80％到约300％、约80％到约280％、约80％到约260％、约80％到约240％、约80％到约220％、约80％到约200％、约80％到约180％、约80％到约160％、约80％到约140％、约80％到约120％、约80％到约100％、约80％到约90％、约90％到约800％、约90％到约750％、约90％到约700％、约90％到约650％、约90％到约600％、约90％到约550％、约90％到约500％、约90％到约450％、约90％到约400％、约90％到约350％、约90％到约300％、约90％到约280％、约90％到约260％、约90％到约240％、约90％到约220％、约90％到约200％、约90％到约180％、约90％到约160％、约90％到约140％、约90％到约120％、约90％到约100％、约100％到约800％、约100％到约750％、约100％到约700％、约100％到约650％、约100％到约600％、约100％到约550％、约100％到约500％、约100％到约450％、约100％到约400％、约100％到约350％、约100％到约300％、约100％到约280％、约100％到约260％、约100％到约240％、约100％到约220％、约100％到约200％、约100％到约180％、约100％到约160％、约100％到约140％、约100％到约120％、约120％到约800％、约120％到约750％、约120％到约700％、约120％到约650％、约120％到约600％、约120％到约550％、约120％到约500％、约120％到约450％、约120％到约400％、约120％到约350％、约120％到约300％、约120％到约280％、约120％到约260％、约120％到约240％、约120％到约220％、约120％到约200％、约120％到约180％、约120％到约160％、约120％到约140％、约140％到约800％、约140％到约750％、约140％到约700％、约140％到约650％、约140％到约600％、约140％到约550％、约140％到约500％、约140％到约450％、约140％到约400％、约140％到约350％、约140％到约300％、约140％到约280％、约140％到约260％、约140％到约240％、约140％到约220％、约140％到约200％、约140％到约180％、约140％到约160％、约160％到约800％、约160％到约750％、约160％到约700％、约160％到约650％、约160％到约600％、约160％到约550％、约160％到约500％、约160％到约450％、约160％到约400％、约160％到约350％、约160％到约300％、约160％到约280％、约160％到约260％、约160％到约240％、约160％到约220％、约160％到约200％、约160％到约180％、约180％到约800％、约180％到约750％、约180％到约700％、约180％到约650％、约180％到约600％、约180％到约550％、约180％到约500％、约180％到约450％、约180％到约400％、约180％到约350％、约180％到约300％、约180％到约280％、约180％到约260％、约180％到约240％、约180％到约220％、约180％到约200％、约200％到约800％、约200％到约750％、约200％到约700％、约200％到约650％、约200％到约600％、约200％到约550％、约200％到约500％、约200％到约450％、约200％到约400％、约200％到约350％、约200％到约300％、约200％到约280％、约200％到约260％、约200％到约240％、约200％到约220％、约220％到约800％、约220％到约750％、约220％到约700％、约220％到约650％、约220％到约600％、约220％到约550％、约220％到约500％、约220％到约450％、约220％到约400％、约220％到约350％、约220％到约300％、约220％到约280％、约220％到约260％、约220％到约240％、约240％到约800％、约240％到约750％、约240％到约700％、约240％到约650％、约240％到约600％、约240％到约550％、约240％到约500％、约240％到约450％、约240％到约400％、约240％到约350％、约240％到约300％、约240％到约280％、约240％到约260％、约260％到约800％、约260％到约750％、约260％到约700％、约260％到约650％、约260％到约600％、约260％到约550％、约260％到约500％、约260％到约450％、约260％到约400％、约260％到约350％、约260％到约300％、约260％到约280％、约280％到约800％、约280％到约750％、约280％到约700％、约280％到约650％、约280％到约600％、约280％到约550％、约280％到约500％、约280％到约450％、约280％到约400％、约280％到约350％、约280％到约300％、约300％到约800％、约300％到约750％、约300％到约700％、约300％到约650％、约300％到约600％、约300％到约550％、约300％到约500％、约300％到约450％、约300％到约400％、约300％到约350％、约350％到约800％、约350％到约750％、约350％到约700％、约350％到约650％、约350％到约600％、约350％到约550％、约350％到约500％、约350％到约450％、约350％到约400％、约400％到约800％、约400％到约750％、约400％到约700％、约400％到约650％、约400％到约600％、约400％到约550％、约400％到约500％、约400％到约450％、约450％到约800％、约450％到约750％、约450％到约700％、约450％到约650％、约450％到约600％、约450％到约550％、约450％到约500％、约500％到约800％、约500％到约750％、约500％到约700％、约500％到约650％、约500％到约600％、约500％到约550％、约550％到约800％、约550％到约750％、约550％到约700％、约550％到约650％、约550％到约600％、约600％到约800％、约600％到约750％、约600％到约700％、约600％到约650％、约650％到约800％、约650％到约750％、约650％到约700％、约700％到约800％、约700％到约750％或约750％到约800％)(例如，与时间段开始相比，在时间段结束时)。
本文提供的方法可导致Treg细胞的浓度或数量增加(例如，约1％到约800％增加，或本文所描述的此范围的任何子范围)(例如，在时间段结束时，与时间段的开始相比)。
在一些实施例中，本文所提供的方法可以导致Treg细胞的浓度或数量增加(例如，约0.1倍增加到约100倍增加、约0.1倍增加到约90倍增加、约0.1倍增加到约80倍增加、约0.1倍增加到约70倍增加、约0.1倍增加到约60倍增加、约0.1倍增加到约50倍增加、约0.1倍增加到约45倍增加、约0.1倍增加到约40倍增加、约0.1倍增加到约35倍增加、约0.1倍增加到约30倍增加、约0.1倍增加到约25倍增加、约0.1倍增加到约20倍增加、约0.1倍增加到约15倍增加、约0.1倍增加到约10倍增加、约0.1倍增加到约8倍增加、约0.1倍增加到约6倍增加、约0.1倍增加到约4倍增加、约0.1倍增加到约2倍增加、约0.1倍增加到约1.5倍增加、约0.1倍增加到约1倍增加、约0.1倍增加到约0.5倍增加、约0.5倍增加到约100倍增加、约0.5倍增加到约90倍增加、约0.5倍增加到约80倍增加、约0.5倍增加到约70倍增加、约0.5倍增加到约60倍增加、约0.5倍增加到约50倍增加、约0.5倍增加到约45倍增加、约0.5倍增加到约40倍增加、约0.5倍增加到约35倍增加、约0.5倍增加到约30倍增加、约0.5倍增加到约25倍增加、约0.5倍增加到约20倍增加、约0.5倍增加到约15倍增加、约0.5倍增加到约10倍增加、约0.5倍增加到约8倍增加、约0.5倍增加到约6倍增加、约0.5倍增加到约4倍增加、约0.5倍增加到约2倍增加、约0.5倍增加到约1.5倍增加、约0.5倍增加到约1倍增加、约1倍增加到约100倍增加、约1倍增加到约90倍增加、约1倍增加到约80倍增加、约1倍增加到约70倍增加、约1倍增加到约60倍增加、约1倍增加到约50倍增加、约1倍增加到约45倍增加、约1倍增加到约40倍增加、约1倍增加到约35倍增加、约1倍增加到约30倍增加、约1倍增加到约25倍增加、约1倍增加到约20倍增加、约1倍增加到约15倍增加、约1倍增加到约10倍增加、约1倍增加到约8倍增加、约1倍增加到约6倍增加、约1倍增加到约4倍增加、约1倍增加到约2倍增加、约1倍增加到约1.5倍增加、约1.5倍增加到约100倍增加、约1.5倍增加到约90倍增加、约1.5倍增加到约80倍增加、约1.5倍增加到约70倍增加、约1.5倍增加到约60倍增加、约1.5倍增加到约50倍增加、约1.5倍增加到约45倍增加、约1.5倍增加到约40倍增加、约1.5倍增加到约35倍增加、约1.5倍增加到约30倍增加、约1.5倍增加到约25倍增加、约1.5倍增加到约20倍增加、约1.5倍增加到约15倍增加、约1.5倍增加到约10倍增加、约1.5倍增加到约8倍增加、约1.5倍增加到约6倍增加、约1.5倍增加到约4倍增加、约1.5倍增加到约2倍增加、约2倍增加到约100倍增加、约2倍增加到约90倍增加、约2倍增加到约80倍增加、约2倍增加到约70倍增加、约2倍增加到约60倍增加、约2倍增加到约50倍增加、约2倍增加到约45倍增加、约2倍增加到约40倍增加、约2倍增加到约35倍增加、约2倍增加到约30倍增加、约2倍增加到约25倍增加、约2倍增加到约20倍增加、约2倍增加到约15倍增加、约2倍增加到约10倍增加、约2倍增加到约8倍增加、约2倍增加到约6倍增加、约2倍增加到约4倍增加、约4倍增加到约100倍增加、约4倍增加到约90倍增加、约4倍增加到约80倍增加、约4倍增加到约70倍增加、约4倍增加到约60倍增加、约4倍增加到约50倍增加、约4倍增加到约45倍增加、约4倍增加到约40倍增加、约4倍增加到约35倍增加、约4倍增加到约30倍增加、约4倍增加到约25倍增加、约4倍增加到约20倍增加、约4倍增加到约15倍增加、约4倍增加到约10倍增加、约4倍增加到约8倍增加、约4倍增加到约6倍增加、约6倍增加到约100倍增加、约6倍增加到约90倍增加、约6倍增加到约80倍增加、约6倍增加到约70倍增加、约6倍增加到约60倍增加、约6倍增加到约50倍增加、约6倍增加到约45倍增加、约6倍增加到约40倍增加、约6倍增加到约35倍增加、约6倍增加到约30倍增加、约6倍增加到约25倍增加、约6倍增加到约20倍增加、约6倍增加到约15倍增加、约6倍增加到约10倍增加、约6倍增加到约8倍增加、约8倍增加到约100倍增加、约8倍增加到约90倍增加、约8倍增加到约80倍增加、约8倍增加到约70倍增加、约8倍增加到约60倍增加、约8倍增加到约50倍增加、约8倍增加到约45倍增加、约8倍增加到约40倍增加、约8倍增加到约35倍增加、约8倍增加到约30倍增加、约8倍增加到约25倍增加、约8倍增加到约20倍增加、约8倍增加到约15倍增加、约8倍增加到约10倍增加、约10倍增加到约100倍增加、约10倍增加到约90倍增加、约10倍增加到约80倍增加、约10倍增加到约70倍增加、约10倍增加到约60倍增加、约10倍增加到约50倍增加、约10倍增加到约45倍增加、约10倍增加到约40倍增加、约10倍增加到约35倍增加、约10倍增加到约30倍增加、约10倍增加到约25倍增加、约10倍增加到约20倍增加、约10倍增加到约15倍增加、约15倍增加到约100倍增加、约15倍增加到约90倍增加、约15倍增加到约80倍增加、约15倍增加到约70倍增加、约15倍增加到约60倍增加、约15倍增加到约50倍增加、约15倍增加到约45倍增加、约15倍增加到约40倍增加、约15倍增加到约35倍增加、约15倍增加到约30倍增加、约15倍增加到约25倍增加、约15倍增加到约20倍增加、约20倍增加到约100倍增加、约20倍增加到约90倍增加、约20倍增加到约80倍增加、约20倍增加到约70倍增加、约20倍增加到约60倍增加、约20倍增加到约50倍增加、约20倍增加到约45倍增加、约20倍增加到约40倍增加、约20倍增加到约35倍增加、约20倍增加到约30倍增加、约20倍增加到约25倍增加、约25倍增加到约100倍增加、约25倍增加到约90倍增加、约25倍增加到约80倍增加、约25倍增加到约70倍增加、约25倍增加到约60倍增加、约25倍增加到约50倍增加、约25倍增加到约45倍增加、约25倍增加到约40倍增加、约25倍增加到约35倍增加、约25倍增加到约30倍增加、约30倍增加到约100倍增加、约30倍增加到约90倍增加、约30倍增加到约80倍增加、约30倍增加到约70倍增加、约30倍增加到约60倍增加、约30倍增加到约50倍增加、约30倍增加到约45倍增加、约30倍增加到约40倍增加、约30倍增加到约35倍增加、约35倍增加到约100倍增加、约35倍增加到约90倍增加、约35倍增加到约80倍增加、约35倍增加到约70倍增加、约35倍增加到约60倍增加、约35倍增加到约50倍增加、约35倍增加到约45倍增加、约35倍增加到约40倍增加、约40倍增加到约100倍增加、约40倍增加到约90倍增加、约40倍增加到约80倍增加、约40倍增加到约70倍增加、约40倍增加到约60倍增加、约40倍增加到约50倍增加、约40倍增加到约45倍增加、约45倍增加到约100倍增加、约45倍增加到约90倍增加、约45倍增加到约80倍增加、约45倍增加到约70倍增加、约45倍增加到约60倍增加、约45倍增加到约50倍增加、约50倍增加到约100倍增加、约50倍增加到约90倍增加、约50倍增加到约80倍增加、约50倍增加到约70倍增加、约50倍增加到约60倍增加、约60倍增加到约100倍增加、约60倍增加到约90倍增加、约60倍增加到约80倍增加、约60倍增加到约70倍增加、约70倍增加到约100倍增加、约70倍增加到约90倍增加、约70倍增加到约80倍增加、约80倍增加到约100倍增加、约80倍增加到约90倍增加或约90倍增加到约100倍增加)(例如，与时间段开始相比，在时间段结束时)。
组合物和试剂盒
本文还提供了使用本文所描述的任何方法产生的Treg细胞群。本文还提供了包含使用本文所描述的任何方法产生的Treg细胞或使用本文所描述的任何方法产生的Treg细胞群的组合物(例如，药物组合物)。在一些实施例中，药物组合物可以包含药学上可接受的载体(例如，磷酸盐缓冲盐水)。所述组合物可以用于治疗有需要的受试者(例如，本文所描述的任何示例性受试者)。
可将药物组合物的单次或多次给药给予有需要的受试者，其取决于例如：受试者所需和耐受的剂量和频率。调配物应提供足够量的Treg细胞以有效治疗、预防或改善受试者的病状、疾病或症状。
本文还提供了包含以下的试剂盒：(i)CD3/CD28结合剂(例如，本文所描述的CD3/CD28结合剂中的任一种)；(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2的受体结合(例如，本文所描述的此类单链嵌合多肽中的任一种)；以及(iii)mTOR抑制剂(例如，本文所描述的任何mTOR抑制剂)。这些试剂盒的一些实施例可以进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在这些试剂盒的一些实施例中，CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒(例如，本文所描述的示例性抗CD3/抗CD28珠粒中的任一种)。在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽(例如，本文所描述的此类单链嵌合多肽的实例中的任一种)，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的第二靶标结合结构域与CD28结合。在一些实施例中，试剂盒可以进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与另外的单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
本文还提供了包含以下的试剂盒：(i)白细胞介素-2受体活化剂(例如，本文所描述的白细胞介素-2受体活化剂中的任一种)；(ii)单链嵌合多肽(例如，本文所描述的此类单链嵌合多肽中的任一种)，所述单链嵌合多肽包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合；或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合；以及(iii)mTOR抑制剂(例如，本文所描述的任何mTOR抑制剂)。在一些实施例中，试剂盒可以进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包含与单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
本文还提供了包含以下的试剂盒：CD3/CD28结合剂(例如，本文所描述的CD3/CD28结合剂中的任一种)；多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：(i)第一靶标结合结构域；(ii)可溶性组织因子结构域；以及(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及(ii)第二靶标结合结构域，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合(例如，本文所描述的示例性多链嵌合多肽中的任一种)；以及mTOR抑制剂(例如，本文所描述的示例性mTOR抑制剂中的任一种)。这些试剂盒的一些实施例进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包括与多链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒(例如，本文所描述的抗CD3/抗CD28珠粒中的任一种)。在一些实施例中，CD3/CD28结合剂是单链嵌合多肽(例如，本文所描述的此类单链嵌合多肽的实例中的任一种)，所述单链嵌合多肽包含第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述另外的单链嵌合多肽的第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的第二靶标结合结构域与CD28结合。在一些实施例中，试剂盒进一步包含IgG1抗体构建体(例如，本文所描述的示例性IgG1抗体构建体中的任一种)，所述IgG1抗体构建体包括与单链嵌合多肽的可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
核酸/载体
本文还提供了编码本文所描述的单链嵌合多肽或多链嵌合多肽中的任一种的核酸。本文还提供了包含编码本文所描述的单链嵌合多肽或多链嵌合多肽中的任一种的核酸中的任一种的载体。
本文描述的任一种载体可以是表达载体。例如，表达载体可以包含与编码单链嵌合多肽的序列可操作地连接的启动子序列。
载体的非限制性实例包含质粒、转座子、粘粒和病毒载体(例如任何腺病毒载体(例如pSV或pCMV载体)、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体和逆转录病毒载体)，以及任何
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载体。载体可以例如包含足够的用于表达的顺式作用元件；其它表达元件可以由宿主哺乳动物细胞或在体外表达系统中供应。熟练从业人员将能够选择合适的载体和哺乳动物细胞以制备本文描述的任一种单链嵌合多肽或多链嵌合多肽。
细胞
本文还提供了包括本文所描述的核酸中的任一种的细胞(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性细胞中的任一种)，所述核酸编码本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种或多链嵌合多肽中的任一种。
本文还提供了包含本文所描述的载体中的任一种的细胞(例如，本文所描述的或本领域已知的示例性细胞中的任一种)，所述载体编码本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种或多链嵌合多肽中的任一种。
在本文描述的任一种方法的一些实施例中，细胞可以是真核细胞。如本文所用，术语“真核细胞”是指具有明显的膜结合核的细胞。这类细胞可以包含例如哺乳动物(例如，啮齿动物、非人灵长类动物或人)、昆虫、真菌或植物细胞。在一些实施例中，真核细胞是酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。在一些实施例中，真核细胞是高级真核生物，如哺乳动物、禽类、植物或昆虫细胞。哺乳动物细胞的非限制性实例包含中国仓鼠卵巢细胞和人胚胎肾细胞(例如HEK293细胞)。
将核酸和表达载体引入细胞(例如真核细胞)的方法是本领域已知的。可用于将核酸引入到细胞中的方法的非限制性实例包含脂质转染、转染、电穿孔、显微注射、磷酸钙转染、基于树状大分子的转染、阳离子聚合物转染、细胞挤压、声致穿孔、光学转染、刺穿感染、流体动力学递送、磁转染、病毒转导(例如，腺病毒和慢病毒转导)和纳米颗粒转染。
产生单链或多链嵌合多肽的方法
本文还提供了产生本文所描述的单链嵌合多肽或多链嵌合多肽中的任一种的方法，所述方法包含在足以导致产生单链嵌合多肽或多链嵌合多肽的条件下，在培养基中培养本文所描述的细胞中的任一种细胞；以及从细胞和/或培养基中回收单链嵌合多肽或多链嵌合多肽。
可以使用本领域众所周知的技术(例如，硫酸铵沉淀、聚乙二醇沉淀、离子交换色谱法(阴离子或阳离子)、基于疏水相互作用的色谱法、金属亲和色谱法、配体亲和色谱法和尺寸排阻色谱法)从培养基或细胞(例如，真核细胞)回收单链嵌合多肽或多链嵌合多肽。
培养细胞的方法是本领域众所周知的。细胞可以在体外维持在有利于增殖、分化和生长的条件下。简单来说，可以通过使细胞(例如，任何细胞)与细胞培养基接触来培养细胞，所述细胞培养基包含必需的生长因子和补充剂以支持细胞活力和生长。
本文还提供了通过本文所描述的方法中的任一种产生的单链嵌合多肽(例如，本文所描述的单链嵌合多肽中的任一种)或多链嵌合多肽(例如，本文所描述的多链嵌合多肽中的任一种)。
治疗方法
本文还提供了治疗有需要的受试者(例如，本文所描述的任何示例性受试者)的方法，所述方法包含向受试者施用治疗有效量的使用本文所描述的方法中的任一种产生的Treg细胞群或包括使用本文所描述的方法中的任一种产生的Treg细胞或Treg细胞群的组合物(例如，药物组合物)中的任一种。
在这些方法的一些实施例中，受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。在一些实施例中，所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。
在一些实施例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
在一些实施例中，这些方法可以引起受试者的癌症的一种或多种症状的数目、严重程度或频率降低(例如，与治疗前受试者的与老化相关的疾病或炎性疾病的一种或多种症状的数目、严重程度或频率相比)。
在一些实例中，例如，与治疗前受试者中衰老细胞的数量相比，所述方法可以导致受试者的衰老细胞数量的减少(例如，约1％减少到约99％减少、约1％减少到约95％减少、约1％减少到约90％减少、约1％减少到约85％减少、约1％减少到约80％减少、约1％减少到约75％减少、约1％到约70％减少、约1％减少到约65％减少、约1％减少到约60％减少、约1％减少到约55％减少、约1％减少到约50％减少、约1％减少到约45％减少、约1％减少到约40％减少、约1％减少到约35％减少、约1％减少到约30％减少、约1％减少到约25％减少、约1％减少到约20％减少、约1％减少到约15％减少、约1％减少到约10％减少、约1％减少到约5％减少、约5％减少到约99％减少、约5％减少到约95％减少、约5％减少到约90％减少、约5％减少到约85％减少、约5％减少到约80％减少、约5％减少到约75％减少、约5％到约70％减少、约5％减少到约65％减少、约5％减少到约60％减少、约5％减少到约55％减少、约5％减少到约50％减少、约5％减少到约45％减少、约5％减少到约40％减少、约5％减少到约35％减少、约5％减少到约30％减少、约5％减少到约25％减少、约5％减少到约20％减少、约5％减少到约15％减少、约5％减少到约10％减少、约10％减少到约99％减少、约10％减少到约95％减少、约10％减少到约90％减少、约10％减少到约85％减少、约10％减少到约80％减少、约10％减少到约75％减少、约10％到约70％减少、约10％减少到约65％减少、约10％减少到约60％减少、约10％减少到约55％减少、约10％减少到约50％减少、约10％减少到约45％减少、约10％减少到约40％减少、约10％减少到约35％减少、约10％减少到约30％减少、约10％减少到约25％减少、约10％减少到约20％减少、约10％减少到约15％减少、约15％减少到约99％减少、约15％减少到约95％减少、约15％减少到约90％减少、约15％减少到约85％减少、约15％减少到约80％减少、约15％减少到约75％减少、约15％到约70％减少、约15％减少到约65％减少、约15％减少到约60％减少、约15％减少到约55％减少、约15％减少到约50％减少、约15％减少到约45％减少、约15％减少到约40％减少、约15％减少到约35％减少、约15％减少到约30％减少、约15％减少到约25％减少、约15％减少到约20％减少、约20％减少到约99％减少、约20％减少到约95％减少、约20％减少到约90％减少、约20％减少到约85％减少、约20％减少到约80％减少、约20％减少到约75％减少、约20％到约70％减少、约20％减少到约65％减少、约20％减少到约60％减少、约20％减少到约55％减少、约20％减少到约50％减少、约20％减少到约45％减少、约20％减少到约40％减少、约20％减少到约35％减少、约20％减少到约30％减少、约20％减少到约25％减少、约25％减少到约99％减少、约25％减少到约95％减少、约25％减少到约90％减少、约25％减少到约85％减少、约25％减少到约80％减少、约25％减少到约75％减少、约25％到约70％减少、约25％减少到约65％减少、约25％减少到约60％减少、约25％减少到约55％减少、约25％减少到约50％减少、约25％减少到约45％减少、约25％减少到约40％减少、约25％减少到约35％减少、约25％减少到约30％减少、约30％减少到约99％减少、约30％减少到约95％减少、约30％减少到约90％减少、约30％减少到约85％减少、约30％减少到约80％减少、约30％减少到约75％减少、约30％到约70％减少、约30％减少到约65％减少、约30％减少到约60％减少、约30％减少到约55％减少、约30％减少到约50％减少、约30％减少到约45％减少、约30％减少到约40％减少、约30％减少到约35％减少、约35％减少到约99％减少、约35％减少到约95％减少、约35％减少到约90％减少、约35％减少到约85％减少、约35％减少到约80％减少、约35％减少到约75％减少、约35％到约70％减少、约35％减少到约65％减少、约35％减少到约60％减少、约35％减少到约55％减少、约35％减少到约50％减少、约35％减少到约45％减少、约35％减少到约40％减少、约40％减少到约99％减少、约40％减少到约95％减少、约40％减少到约90％减少、约40％减少到约85％减少、约40％减少到约80％减少、约40％减少到约75％减少、约40％到约70％减少、约40％减少到约65％减少、约40％减少到约60％减少、约40％减少到约55％减少、约40％减少到约50％减少、约40％减少到约45％减少、约45％减少到约99％减少、约45％减少到约95％减少、约45％减少到约90％减少、约45％减少到约85％减少、约45％减少到约80％减少、约45％减少到约75％减少、约45％到约70％减少、约45％减少到约65％减少、约45％减少到约60％减少、约45％减少到约55％减少、约45％减少到约50％减少、约50％减少到约99％减少、约50％减少到约95％减少、约50％减少到约90％减少、约50％减少到约85％减少、约50％减少到约80％减少、约50％减少到约75％减少、约50％到约70％减少、约50％减少到约65％减少、约50％减少到约60％减少、约50％减少到约55％减少、约55％减少到约99％减少、约55％减少到约95％减少、约55％减少到约90％减少、约55％减少到约85％减少、约55％减少到约80％减少、约55％减少到约75％减少、约55％到约70％减少、约55％减少到约65％减少、约55％减少到约60％减少、约60％减少到约99％减少、约60％减少到约95％减少、约60％减少到约90％减少、约60％减少到约85％减少、约60％减少到约80％减少、约60％减少到约75％减少、约60％到约70％减少、约60％减少到约65％减少、约65％减少到约99％减少、约65％减少到约95％减少、约65％减少到约90％减少、约65％减少到约85％减少、约65％减少到约80％减少、约65％减少到约75％减少、约65％到约70％减少、约70％减少到约99％减少、约70％减少到约95％减少、约70％减少到约90％减少、约70％减少到约85％减少、约70％减少到约80％减少、约70％减少到约75％减少、约75％减少到约99％减少、约75％减少到约95％减少、约75％减少到约90％减少、约75％减少到约85％减少、约75％减少到约80％减少、约80％减少到约99％减少、约80％减少到约95％减少、约80％减少到约90％减少、约80％减少到约85％减少、约85％减少到约99％减少、约85％减少到约95％减少、约85％减少到约90％减少、约90％减少到约99％减少、约90％减少到约95％减少或约95％减少到约99％减少)(例如，受试者的与老化相关的疾病或炎性疾病中涉及和/或牵连的一种或多种特定组织中衰老细胞的数量减少)。
术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施例中，受试者或“需要治疗的受试者”可以是犬科动物(例如，狗)、猫科动物(例如，猫)、马科动物(例如，马)、绵羊、牛、猪、山羊、灵长类动物，例如猿猴(例如，猴(例如狨猴、狒狒)或猿(例如，大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿)或人；或啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)。在一些实施例中，受试者或“需要治疗的受试者”可以是非人哺乳动物，尤其可以采用常规用作证明在人中的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，鼠、兔、猪、犬或灵长类动物)。
衰老细胞
衰老是不可逆的生长停滞的一种形式，伴随着表型变化、对细胞凋亡的抗性和损伤感知信号传导路径的激活。细胞衰老最初是在经培养的人类成纤维细胞中描述的，这些细胞失去了其增殖能力，在约50次种群倍增后达到永久停滞(被称为海弗利克极限(Hayflick limit))。衰老被认为是可由广泛范围的内在和外在伤害，包含氧化和遗传毒性应激、DNA损伤、端粒损耗、致癌激活、线粒体功能障碍或化疗剂诱导的应激反应。
衰老细胞保留代谢活性，并且可以通过其分泌表型影响组织止血、疾病和老化。衰老被认为是生理过程，并且对促进伤口愈合、组织稳态、再生和纤维化调节很重要。例如，在伤口愈合过程中观察到衰老细胞的瞬时诱导，并且其有助于伤口愈合。衰老的最重要作用之一可能是其在肿瘤抑制中的作用。但是，衰老细胞的积累也驱动老化和与老化相关的疾病和病状。衰老表型还可触发慢性炎性反应，并且因此增强慢性炎性病状以促进肿瘤生长。衰老与老化之间的联系最初是基于衰老细胞在老化组织中积累的观察结果。转基因模型的使用已使得能够在许多年龄相关的病理中系统地检测衰老细胞。选择性消除衰老细胞的策略展现衰老细胞确实可在老化和相关病理中起因果作用。
衰老细胞显示重要且独特的特性，包含形态、染色质组织、基因表达和代谢的变化。存在与细胞衰老相关的几种生化和功能特性，如(i)细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制剂p16和p21的表达增加，(ii)存在衰老相关的β-半乳糖苷酶，即溶酶体活性的标志物，(iii)出现衰老相关的异染色质灶和核纤层蛋白B1水平下调，(iv)对由抗凋亡BCL家族蛋白表达增加引起的细胞凋亡的抗性，和(v)CD26(DPP4)、CD36(清道夫(Scavenger)受体)、叉头框4(FOXO4)和分泌性载体膜蛋白4(SCAMP4)上调。衰老细胞还表达炎性特征，即所谓的衰老相关分泌表型(SASP)。通过SASP，衰老细胞产生广泛范围的炎性细胞因子(IL-6、IL-8)、生长因子(TGF-β)、趋化因子(CCL-2)和基质金属蛋白酶(MMP-3、MMP-9)，其以细胞自主方式运作以增强衰老(自分泌效应)，并且与微环境通信并调节微环境(旁分泌效应)。SASP因子可以通过触发衰老监视，即免疫介导的衰老细胞清除来促进肿瘤抑制。但是，慢性炎症也是肿瘤发生的已知驱动因素，并且越来越多的证据表明，慢性SASP也可以促进癌症和与老化相关的疾病。
衰老细胞的分泌概况取决于环境。例如，人成纤维细胞中不同的线粒体功能障碍诱导的线粒体功能障碍相关衰老(MiDAS)引起缺乏IL-1依赖性炎性因子的SASP出现。NAD+/NADH比率的降低激活AMPK信号传导，其通过激活p53诱导MiDAS。结果，p53抑制NF-κB信号传导，其为促炎性SASP的关键诱导因素。相反，由人细胞中持续性DNA损伤引起的细胞衰老诱导炎性SASP，其依赖于共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶的激活，而不依赖于p53的激活。特别地，IL-6和IL-8的表达和分泌水平提高。还展现了由异位表达p16INK4a和p21CIP1引起的细胞衰老诱导人成纤维细胞的衰老表型，且不存在炎性SASP，表明生长停滞本身并不刺激SASP。
衰老的最主要特征之一是稳定生长停滞。这是通过两个重要路径，即p16/Rb和p53/p21实现的，这两个路径都是肿瘤抑制的关键。DNA损伤引起：(1)染色质中γH2Ax(组蛋白编码基因)和53BP1(DNA损伤反应中涉及)的高沉积：这引起激酶级联反应的激活，最终引起p53激活，和(2)p16INK4a和ARF(均由CDKN2A编码)和P15INK4b(由CDKN2B编码)的激活：p53诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(p21)的转录，并且与p16INK4a和p15INK4b两者一起阻断细胞周期进展的基因(CDK4和CDK6)。这最终引起成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化不足，并且使细胞周期停滞在G1期。
在正常老化的情况下，选择性杀死衰老细胞已显示可显著改善小鼠的健康寿命，并且改善与年龄相关的疾病或癌症疗法的结果(Ovadya,《临床研究杂志(J ClinInvest.)》128(4):1247-1254,2018)。在自然界中，衰老细胞通常被先天免疫细胞去除。衰老的诱导不仅阻止了受损/改变的细胞的潜在增殖和转化，而且还通过产生SASP因子(主要充当自然杀手(NK)细胞的化学引诱物(如IL-15和CCL2)和巨噬细胞的化学引诱物(如CFS-1和CCL2))促进组织修复。这些先天免疫细胞介导消除应激细胞的免疫监视机制。衰老细胞通常上调NK细胞活化受体NKG2D和DNAM1配体，其属于应激诱导性配体家族：防御感染性疾病和恶性肿瘤的一线免疫的重要组分。受体激活后，NK细胞可以接着通过其溶细胞机构特异性诱导衰老细胞的死亡。已在肝纤维化(Sagiv,《致癌基因(Oncogene)》32(15):1971-1977,2013)、肝细胞癌(Iannello,《实验医学杂志(J Exp Med)》210(10):2057-2069,2013)、多发性骨髓瘤(Soriani,《血液(Blood)》113(15):3503-3511,2009)和由甲羟戊酸路径功能异常应激的神经胶质瘤细胞(Ciaglia,《国际癌症杂志(Int J Cancer)》142(1):176-190,2018)中指出了NK细胞在衰老细胞的免疫监视中的作用。子宫内膜细胞经历急性细胞衰老，并且不会分化成蜕膜细胞。分化的蜕膜细胞分泌IL-15，并且从而募集子宫NK细胞以靶向并消除未分化的衰老细胞，因此有助于重塑和年轻化子宫内膜(Brighton，《E生命(Elife)》6：e31274，2017)。以类似的机制，在肝纤维化过程中，表达p53的衰老肝卫星细胞使驻留库普弗(Kupfer)巨噬细胞和新浸润的巨噬细胞的极化偏向促炎性M1表型，其显示衰老活性。已显示F4/80+巨噬细胞在清除小鼠子宫衰老细胞以维持产后子宫功能中起关键作用。
衰老细胞主要通过上调NKG2D(在NK细胞上表达)的配体、趋化因子和其它SASP因子来募集NK细胞。肝纤维化的体内模型已显示激活的NK细胞有效清除衰老细胞(Krizhanovsky,《细胞(Cell)》134(4):657-667,2008)。研究已描述多种模型来研究衰老，包含肝纤维化(Krizhanovsky，《细胞》134(4)：657-667，2008)、骨关节炎(Xu，《老年学杂志：A系列，生物科学与医学(J Gerontol A Biol Sci Med Sci)》72(6)：780-785，2017)和帕金森氏病(Chinta，《细胞报告(Cell Rep)》22(4)：930-940，2018)。用于研究衰老细胞的动物模型描述于：Krizhanovsky，《细胞》134(4)：657-667，2008；Baker,《自然》479(7372)：232-236，2011；Farr，《自然·医学(Nat Med)》23(9)：1072-1079，2017；Bourgeois，《欧洲生物化学学会联合会快报(FEBS Lett)》592(12)：2083-2097，2018；Xu，《自然·医学》24(8)：1246-1256，2018)。
另外的治疗剂
本文描述的任一种方法的一些实施例可以进一步包含将治疗有效量的一种或多种其它治疗剂给予受试者(例如，本文描述的任一个受试者)。可以与通过本文所描述的方法中的任一种产生的Treg细胞或包括使用本文所描述的方法中的任一种产生的Treg细胞群的组合物(例如，药物组合物)中的任一种基本上同时向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施例中，可以在施用Treg细胞或包括使用本文所描述的方法中的任一种产生的Treg细胞群的组合物(例如，药物组合物)之前向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施例中，可以在向受试者施用Treg细胞或包括使用本文所描述的方法中的任一种产生的Treg细胞群的组合物(例如，药物组合物)之后向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
其它治疗剂的非限制性实例包含：抗癌药物、激活受体激动剂、免疫检查点抑制剂、用于阻断HLA特异性抑制受体的试剂、糖原合酶激酶(GSK)3抑制剂和抗体。
抗癌药物的非限制性实例包含抗代谢药物(例如，5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基尿素、甲胺喋呤、6-硫鸟嘌呤、克拉屈滨(cladribine)、奈拉滨(nelarabine)、喷司他汀(pentostatin)或培美曲塞(pemetrexed))、植物碱(例如，长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、喜树碱(camptothecin)、9-甲氧基喜树碱、冠狗牙花定碱(coronaridine)、紫杉醇、乌檀根碱(naucleaoral)、二异戊二烯基化吲哚生物碱(diprenylated indole alkaloid)、山矢车菊碱(montamine)、希什金矢车菊碱(schischkiniin)、原小蘖碱(protoberberine)、小蘖碱(berberine)、血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、白屈菜碱(chelidonine)、鹅掌楸碱(liriodenine)、山岗蠹吾碱(clivorine)、β-咔啉、脱甲氧基娃儿藤碱(antofine)、娃儿藤碱(tylophorine)、白叶藤碱(cryptolepine)、新白叶藤碱(neocryptolepine)、紫堇诺灵碱(corynoline)、依兰碱(sampangine)、咔唑、文珠兰碱(crinamine)、高山网球花碱(montanine)、玫瑰树碱(ellipticine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenisopide)、伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)或吖啶酮生物碱)、蛋白酶体抑制剂(例如，乳胞素(lactacystin)、双硫仑(disulfiram)、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、马里佐米(marizomib)(盐孢菌素(salinosporamide)A)、奥普佐米(oprozomib)(ONX-0912)、地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)、环氧霉素(epoxomicin)、MG132、β-羟基β-甲基丁酸盐、硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)或埃沙佐米(ixazomib))、抗肿瘤抗生素(例如，阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊达比星(idarubicin)、放线菌素(actinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)或博来霉素(bleomycin))、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat)、帕比诺他(panobinostat)、贝林司他(belinostat)、吉韦诺他(givinostat)、阿贝辛他(abexinostat)、缩肽(depsipeptide)、恩替诺特(entinostat)、苯基丁酸盐、丙戊酸、曲古抑菌素(trichostatin)A、达西司他(dacinostat)、莫西司他(mocetinostat)、普瑞司他(pracinostat)、烟酰胺(nicotinamide)、坎比诺尔(cambinol)、替诺文(tenovin)1、替诺文6、斯汀诺(sirtinol)、利可司他(ricolinostat)、替非司他(tefinostat)、凯维林(kevetrin)、奎西司他(quisinostat)、雷米诺他(resminostat)、泰克地那林(tacedinaline)、西达本胺(chidamide)或赛利司他(selisistat))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，阿昔替尼(axitinib)、达沙替尼(dasatinib)、恩可非尼(encorafinib)、厄洛替尼(erlotinib)、伊马替尼(imatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕唑帕尼(pazopanib)和舒尼替尼(sunitinib))和化疗剂(例如，全反式维甲酸、阿扎胞苷(azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、去氧氟尿苷、埃博霉素(epothilone)、羟脲、伊马替尼、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、戊柔比星(valrubicin)、维罗非尼(vemurafenib)和来那度胺(lenalidomide))。化疗剂的其它实例包含烷化剂，例如二氯甲二乙胺、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、噻替派(thiotepa)、六甲三聚氰胺(hexamethylmelamine)、白消安(busulfan)、六甲蜜胺(altretamine)、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、卡莫司汀(carmustine)、罗莫司汀(lumustine)、链脲霉素(streptozocin)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。
实例
在以下实例中进一步描述本发明，所述实例不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。
实例1.αCD3scFv/TF/αCD28scFv的产生
下文示出了αCD3scFv/TF/αCD28scFv的核酸和氨基酸序列。
编码αCD3scFv/TF/αCD28scFv的核酸(SEQ ID NO:10)
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCC
(αCD3轻链可变区)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGT
(接头)
GGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGC
(αCD3重链可变区)
CAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC
(人组织因子219形式)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(αCD28轻链可变区)
GTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGC
(接头)
GGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCC
(αCD28轻链可变区)
GACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG
αCD3scFv/TF/αCD28scFv(SEQ ID NO:8)
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD3轻链可变区)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重链可变区)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(αCD28轻链可变区)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重链可变区)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
如先前所描述的，将编码αCD3scFv/TF/αCD28scFv的核酸克隆到经修饰的逆转录病毒表达载体中(Hughes等人,《人类基因疗法(Hum Gene Ther)》16:457–72,2005)。将编码αCD3scFv/TF/αCD28scFv的表达载体转染到CHO-K1细胞中。表达载体在CHO-K1细胞中的表达允许分泌可溶性αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽(称为3t28)，其可以通过抗TF抗体亲和与其它色谱法方法来纯化。
抗组织因子抗体亲和柱用于纯化αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽。抗组织因子抗体亲和柱连接到GE Healthcare AKTA Avant系统。除洗脱步骤外，所有步骤都使用4毫升/分钟的流速，洗脱步骤的流速为2毫升/分钟。
使用1M Tris碱将包含αCD3scFv/TF/αCD28scFv单链嵌合多肽的细胞培养收集物调节到pH 7.4并且负载到经5个柱体积的PBS平衡的抗TF抗体亲和柱(上文所述)上。加载样品后，用5个柱体积的PBS洗涤柱，接着用6个柱体积的0.1M乙酸(pH 2.9)洗脱。收集A280洗脱峰，然后通过添加1M Tris碱中和到pH 7.5-8.0。然后使用具有30kDa分子量截断值的Amicon离心过滤器将中和的样品缓冲液交换到PBS中。
每次洗脱之后，使用6个柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)剥离抗组织因子抗体亲和柱。然后使用10个柱体积的PBS、0.05％NaN3中和所述柱，并且存储在2-8℃下。
实例2.IL-2/TF/IL-2的产生
下文示出了IL-2/TF/IL-2的核酸和氨基酸序列。
编码IL-2/TF/IL-2的核酸(SEQ ID NO:12)
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(第一IL-2片段)
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACC
(人组织因子219形式)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(第二IL-2片段)
GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT
IL-2/TF/IL-2(SEQ ID NO:4)
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人IL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
如先前所描述的，将编码IL-2/TF/IL-2的核酸克隆到经修饰的逆转录病毒表达载体中(Hughes等人,《人类基因疗法》16:457–72,2005)。将编码IL-2/TF/IL-2的表达载体转染到CHO-K1细胞中。表达载体在CHO-K1细胞中的表达允许分泌可以通过抗TF抗体亲和色谱法和其它色谱法方法纯化的可溶性IL-2/TF/IL-2单链嵌合多肽(被称为2t2)。
实例3：与商业重组人IL-2相比通过2t2和抗CD3/抗CD28珠粒以及雷帕霉素刺激Foxp3+ Treg细胞
从血库获得新鲜的人白细胞(3个供体)，并且用CD4+CD25+CD127dim调节性T细胞分离试剂盒II试剂(美天旎生物技术公司)分离CD4+CD25+CD127dim Treg细胞。Foxp3+ Treg细胞的纯度>35％并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(细胞内染色，英杰公司)和CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司(BioLegend))进行染色来确认。对细胞进行计数并在48孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司(Thermo Life Technologies))、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司(Hyclone))的RPMI 1640(吉博科公司))中。用(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净(Proleukin))、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司(Life Technologies))和雷帕霉素(100nM)(西格玛(Sigma))或(2)100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激细胞，并且在37℃、5％CO2下温育21天。在扩增期间，每隔一天用(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)对细胞进行再刺激。每7天用抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:1)(免疫磁珠，生命技术公司)对细胞进行再刺激。每隔一天用含有(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)的新鲜完全培养基将细胞以1x106/mL浓度维持21天。在第7天、第14天和第21天，将细胞用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(使用英杰公司的Foxp3染色试剂盒进行细胞内染色)和CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司)染色，以通过流式细胞术评估Foxp3+ Treg细胞的扩增。通过在台盼蓝(0.4％，英杰公司)活力测定中进行计数来测量Foxp3+ Treg细胞的扩增倍数。图1示出了与用hIL-2(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激增加100倍相比，用100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激的Foxp3+ Treg细胞增加145倍。
实例4：Helios、CTLA-4、CD39、CD62L、CD25、CD103、CD69、PD1和CD49b标志物的检测
从血库获得新鲜的人白细胞(3个供体)，并且用CD4+CD25+CD127dim调节性T细胞分离试剂盒II试剂(美天旎生物技术公司)分离CD4+CD25+CD127dim Treg细胞。Foxp3+ Treg细胞的纯度>35％并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(细胞内染色，英杰公司)和CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司)进行染色来确认。对细胞进行计数并在48孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中。用(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激细胞，然后在37℃、5％CO2下温育21天。在扩增期间，每隔一天用(1)hIL-2(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)对细胞进行再刺激。每7天用抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:1)(免疫磁珠，生命技术公司)对细胞进行再刺激。每隔一天用含有(1)hIL-2(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)的新鲜完全培养基将细胞以1x106/mL浓度维持21天。将细胞用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(使用英杰公司的Foxp3染色试剂盒进行细胞内染色)和CD127-Alex Fluro700(百进生物公司)染色，以通过流式细胞术评估Foxp3+ Treg细胞的扩增。通过在台盼蓝(0.4％，英杰公司)活力测定中进行计数来测量Foxp3+ Treg细胞的扩增倍数。在第21天，采集细胞并且对CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(使用英杰公司的Foxp3染色试剂盒进行细胞内染色)、CD127-Alex Fluro 700、Helios PE-Cy7、CTLA-4Brilliant Violet 605、CD39 APC、CD62L PECy7、CD25 PE、CD103 PerCP.Cy5.5、CD69 APCFire 750、PD1 Alexa Fluro 750和CD49b APC进行染色，并且使用Foxp3-太平洋蓝(百进生物公司)(细胞内染色试剂盒，英杰公司)进行细胞内染色。对于表面染色，将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD密理博公司(EMD Millipore))和0.001％叠氮化钠(西格玛)的1xPBS(海克隆公司))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)。两次洗涤之后，通过流式细胞术(Celesta-BD生物科学公司(BD Bioscience))分析细胞。对于细胞内细胞染色，在室温下将细胞固定在固定缓冲液(英杰公司)中持续20分钟。固定步骤之后，将细胞在1x透化缓冲液(e生物科学公司(eBiosciences))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)，并且在室温下用Foxp3-太平洋蓝(百进生物公司)染色，持续30分钟。将细胞再次用1x透化缓冲液洗涤，并且然后用FACS缓冲液洗涤。将细胞沉淀物重悬于300μL的FACS缓冲液中，用于通过流式细胞术(Celesta-BD生物科学公司)进行分析。(在CD4+CD25+Foxp3+细胞上对细胞进行门控，并且绘制表面标志物的数据％+，3个健康供体)。图2A-2I示出了用(1)100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)hIL-2(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激21天的Foxp3+ Treg细胞上的可比较表面标志物。
实例5：人调节性T细胞的激活显示出高水平的葡萄糖代谢。
从血库获得新鲜的人白细胞(3个供体)，并且使用CD4+CD25+CD127dim Treg细胞分离试剂盒II(美天旎生物技术公司)分离CD4+CD25+CD127dim Treg细胞。Foxp3+ Treg细胞的纯度>35％并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(细胞内染色，英杰公司)和CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司)进行染色来确认。对细胞进行计数并在24孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中。用(1)hIL-2(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激细胞，然后在37℃下在5％CO2下温育过夜。第二天，采集细胞、对细胞进行计数并且以4x106/mL重悬于96孔板中，并且50μL/孔接种在Cell-Tak包被的Seahorse BioanalyzerXFe96培养板中，所述培养板在Seahorse XF RPMI培养基中，pH 7.4，补充有2mM L-谷氨酰胺。使细胞在37℃下附着在板上，持续30分钟。将另外的130μL测定培养基添加到板的每个孔中(也是背景孔)。将板在37℃的非CO2温育箱中温育1小时。对于校准板：在Seahorse测定培养基中制备葡萄糖/寡霉素/2-脱氧葡萄糖的10x溶液。将20μL体积的葡萄糖/寡霉素/2-脱氧葡萄糖添加到经过整夜校准的细胞外通量板的端口A、B和C。使用XFe96细胞外通量分析仪测量细胞外酸化率(ECAR)。完整的ECAR分析由四个阶段组成：非糖酵解酸化(不含药物)、糖酵解(10mM葡萄糖)、糖酵解能力(2μM寡霉素)和糖酵解储备(100mM 2-脱氧葡萄糖)，使用Seahorse Xfe96软件、波计算。结果(图3A-3D)示出，激活的人Treg细胞显示出高水平的葡萄糖代谢。
实例6：通过经扩增的调节性T细胞测量自体T应答细胞的抑制
从血库获得新鲜的人白细胞(3个供体)，并且用CD4+CD25+CD127dim-调节性T细胞分离试剂盒II试剂(美天旎生物技术公司)分离CD4+CD25+CD127dim-Treg细胞。Foxp3+ Treg细胞的纯度>35％并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(细胞内染色，英杰公司)和CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司)进行染色来确认。对细胞进行计数并在24孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中。用(1)hIL-2(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激细胞，并且然后在37℃、5％CO2下温育21天。在扩增期间，每隔一天用(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)对细胞进行再刺激。每7天用抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:1)(免疫磁珠，生命技术公司)对细胞进行再刺激。每隔一天用含有(1)hIL-2(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)的新鲜完全培养基将细胞以1x106/mL浓度维持21天。通过在台盼蓝(0.4％，英杰公司)活力测定中进行计数来测量Foxp3+ Treg细胞的扩增倍数。在第21天，将冷冻的自体T应答(Tresp)细胞解冻并且用Cell Trace Violet(英杰公司)标记。采集经扩增的Treg细胞并且进行计数。将Treg细胞与T应答细胞以各种比率(Treg细胞:T应答细胞为5:1、2:1、1:1、0.5:1)一起培养。用(1)抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:70)和2t2(25nM)或(2)抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:70)和IL2(50IU/mL)对细胞进行再刺激，并且培养5天。采集细胞，并且将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD密理博公司)和0.001％叠氮化钠(西格玛)的1x PBS(海克隆公司))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)。两次洗涤之后，通过流式细胞术(Celesta-BD生物科学公司)分析细胞。(绘制了CFSE+增殖细胞的％+)。图4示出了与用hIL-2(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激的细胞相比，用100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)刺激的Foxp3+ Treg细胞的抑制能力。
实例7：根据抑制测定测量IL-10
从血库获得新鲜的人白细胞(3个供体)，并且用CD4+CD25+CD127dim调节性T细胞分离试剂盒II试剂(美天旎生物技术公司)分离CD4+CD25+CD127dim Treg细胞。Foxp3+ Treg细胞的纯度>35％并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(细胞内染色，英杰公司)和CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司)进行染色来确认。对细胞进行计数并在24孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中。用(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净)、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2、抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)刺激细胞，然后在37℃下和5％CO2下温育21天。在扩增期间，每隔一天用(1)hIL-2细胞因子(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)对细胞进行再刺激。每7天用抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:1)(免疫磁珠，生命技术公司)对细胞进行再刺激。每隔一天用含有(1)hIL-2(500IU/mL)(普留净)和雷帕霉素(100nM)(西格玛)或(2)100nM的2t2和雷帕霉素(100nM)(西格玛)的新鲜完全培养基将细胞以1x106/mL浓度维持21天。通过在台盼蓝(0.4％，英杰公司)活力测定中进行计数来测量Foxp3+ Treg细胞的扩增倍数。在第21天，将冷冻的自体T应答(Tresp)细胞解冻并且用Cell Trace Violet(英杰公司)标记。采集经扩增的Treg细胞并且进行计数。将Treg细胞与T应答细胞以各种比率(Treg细胞:T应答细胞为5:1、1:1)一起培养。用(1)抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:70)和2t2(25nM)或(2)抗CD3/抗CD28珠粒(珠粒:细胞为1:70)和IL2(50IU/mL)对细胞进行再刺激，并且培养5天。根据制造商的说明，通过LEGENDplex多分析物流式测定试剂盒(百进生物公司)采集和分析无细胞液体培养基。图5示出来自抑制测定的无细胞液体培养基中的IL-10，其中在存在或不存在雷帕霉素两者的情况下，与经IL-2扩增的Treg细胞相比，经2t2扩增的Treg细胞中的IL-10分泌显著更高。
实例8. 3t15*-28s融合蛋白复合物的产生和表征
3t15*-28s的构建和产生
产生包括抗CD3scFv/TF/IL15D8N突变体和抗CD28scFv/IL15RαSu融合蛋白的融合蛋白。抗CD3抗体(αCD3)可变区、人组织因子、IL15D8N突变体、抗CD28抗体(αCD28)可变区以及IL15RαSu序列从UniProt网站获得，并且这些序列的DNA由金唯智(Genewiz)合成。具体地，构建体是通过(G4S)3接头将αCD3轻链可变区序列与αCD3重链可变区序列连接以形成αCD3scFv来制备的。αCD3scFv与组织因子219的N末端编码区连接，然后与IL15D8N突变体的N末端编码区连接(图6A-6B)。下文示出了构建体的核酸和蛋白质序列。
αCD3scFv/TF/IL15D8N构建体的核酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:105)：
(信号肽)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCC
(αCD3轻链可变区)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGT
(接头)
GGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGC
(αCD3重链可变区)
CAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC
(人组织因子219形式)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(人IL15D8N突变体)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
αCD3scFv/TF/IL15D8N构建体的氨基酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:104)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD3轻链可变区)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重链可变区)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
(人组织因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(人IL15D8N突变体)
NWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
另一个构建体是通过将通过(G4S)3接头将αCD28轻链可变区序列与αCD28重链可变区序列连接而构建的αCD28scFv与IL15RαSu的N末端编码区连接来制备的。最终构建体αCD28scFv/IL15RαSu融合蛋白序列由金唯智合成。下文示出了构建体的核酸和蛋白质序列。
αCD28scFv/IL15RαSu构建体的核酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:109)：
(信号肽)
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGC
(αCD28轻链可变区)
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCC
(接头)
GGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGC
(αCD28重链可变区)
GACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG
(人IL15RαSu)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
αCD28scFv/IL15RαSu构建体的氨基酸序列(包含信号肽序列)如下(SEQ ID NO:108)：
(信号肽)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD28轻链可变区)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(接头)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重链可变区)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
(人IL-15Rαsushi结构域)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
在一些情况下，将前导肽从完整多肽上切割下来，以产生可能可溶或可分泌的成熟形式。
如先前所描述的，将αCD3scFv/TF/IL15D8N和αCD28scFv/IL15RαSu构建体克隆到具有不同抗生素选择标志物的经修饰的逆转录病毒表达载体中(Hughes等人,《人类基因疗法》16:457–72,2005)，并且将表达载体共转染到CHO-K1细胞中。构建体在CHO-K1细胞中的表达允许分泌可以用抗TF抗体亲和色谱法和其它色谱法方法纯化的可溶性αCD3scFv/TF/IL15D8N:αCD28scFv/IL15RαSu融合蛋白(被称为3t15*-28s)。
通过免疫亲和色谱法纯化3t15*-28s
抗TF抗体亲和柱连接到通用电气医疗集团(GE Healthcare)AKTA Avant系统。除洗脱步骤外，所有步骤的流速均为4毫升/分钟，洗脱步骤的流速为2毫升/分钟。
用1M Tris碱将3t15*-28s的细胞培养物采集调节到pH 7.4，并且装载到用5个柱体积的PBS平衡的(上文描述的)抗TF抗体亲和柱上。装载样品后，用5个柱体积的PBS洗涤柱，然后用6个柱体积的0.1M乙酸(pH 2.9)洗脱。采集A280洗脱峰，并且然后通过添加1MTris碱中和到pH 7.5-8.0。然后使用具有30KDa分子量截断值的Amicon离心过滤器将中和的样品缓冲液交换到PBS中。如图7中示出的，显而易见，抗TF抗体亲和柱可以结合含有TF的3t15*-28s作为3t15*-28s的融合伴侣。将缓冲液交换的蛋白质样品储存在2℃-8℃下，以用于进一步生化分析和生物活性测试。
每次洗脱之后，接着使用6个柱体积的0.1M甘氨酸(pH 2.5)剥离抗TF抗体亲和柱。然后使用10个柱体积的PBS、0.05％NaN3中和所述柱，并且储存在2℃-8℃下。
3t15*-28s的分析型尺寸排阻色谱法(SEC)分析
将Superdex 200Increase 10/300GL凝胶过滤柱(来自通用电气医疗集团)连接到AKTA Avant系统(来自通用电气医疗集团)。用2个柱体积的PBS平衡所述柱。流速为0.8毫升/分钟。使用毛细管环将200μL的3t15*-28s(1mg/mL)样品注射到柱上。然后用1.25个柱体积的PBS追赶注射液。图8中示出了SEC色谱图。结果指示存在4个蛋白质峰，可能表示单体和二聚体或其它不同形式的3t15*-28s。
3t15*-28s的SDS PAGE分析
为了测定纯度和蛋白质分子量，在还原条件下，通过标准十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(4％-12％NuPage Bis-Tris凝胶)电泳(SDS-PAGE)方法分析来自抗TF抗体亲和色谱法的纯化的3t15*-28s蛋白样品。用InstantBlue对凝胶进行染色，持续约30分钟，然后使用纯化水脱色过夜。图9示出了从抗TF抗体亲和色谱法纯化的3t15*-28s的SDS凝胶。结果指示在还原的SDS PAGE中，纯化的3t15*-28s包含具有预期分子量(72kDa)的蛋白质条带。
3t15*-28s融合蛋白复合物活性的体外表征
基于ELISA的方法确认了3t15*-28s融合蛋白复合物的形成。为了评估3t15*-28s是否与CD28和CD3相互作用(图10A-10B)，将含10μg/mL的人CD28-Fc(目录号CD8-H525a，百普赛斯(Acro Biosystems))或10μg/mL的人CD3E/CD3D异二聚体-Llama Fc/Llama Fc(目录号CDD-H5258，百普赛斯)的50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.4)(100μl/孔)施加到ELISA板(目录号80040LE 0910，赛默飞世尔公司)，并且在4℃下温育过夜。第二天，用ELISA洗涤缓冲液(含0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲盐水)洗涤所述板3次，并且用阻断缓冲液(1％BSA-PBS)阻断1小时。将浓度递减的(阻断缓冲液中3g/mL到0.00243μg/mL)3t15*-28s或阴性对照融合蛋白(包含相同TF结构域的HCW9218)的添加到板中，并且将所述板在25℃下温育1小时。将所述板用ELISA洗涤缓冲液洗涤3次。将0.1μg/mL的检测抗体、生物素化抗TF抗体(目录号BAF2339，R&D系统公司(R&D Systems))添加到板中，并且在25℃下温育1小时。洗涤板，并且将0.25μg/mL的辣根过氧化物酶-链霉亲和素(代码号016-030-084，杰克逊免疫研究实验室(Jackson ImmunoResearch))添加到板中并且在25℃下温育30分钟。洗涤板，并且将HRP的底物ABTS(目录号ABTS-1000-01，Surmodics公司(Surmodics))添加到板中并且在25℃下温育20分钟。用酶标仪(Multiscan Sky，赛默飞世尔科技公司)以OD405 nm读取板。如图10A-10B中示出的，3t15*-28s与CD28和CD3相互作用，而对照融合蛋白HCW9218没有与CD28和CD3相互作用。3t15*-28s融合蛋白复合物的αCD3scFv和αCD28scFv结构域能够结合CD3和CD28。αCD28scFv和TF结构域分别与CD28和抗TF抗体的结合(图10A)确认了纯化的蛋白质包含3t15*-28s异二聚体复合物。
实例9.使用2t2和3t15*-28s扩增Foxp3+调节性T细胞
从血库获得新鲜的人白细胞(3个供体)，并且用EasySep人CD4+CD25+CD127low T调节性细胞分离试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technology))分离CD4+CD25+CD127low T调节性细胞。Foxp3+调节性T细胞的纯度>35％，并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7和Foxp3-PacBlue抗体(Abs)(百进生物公司)染色确认。对细胞进行计数并在24孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中。用2t2(100nM)和3t15*-28s(200nM)对细胞进行刺激，并且在37℃、5％CO2下温育11天。在扩增期间，每隔一天用含有2t2(100nM)和3t28(200nM)的新鲜完全培养基将细胞以1x106/mL浓度维持11天。然后用CD4-Alexa Fluro488、CD25-PE、CD3APC-Cy7和Foxp3-PacBlue Abs(百进生物公司)对细胞进行染色，以通过流式细胞术评估Foxp3+调节性T细胞的扩增。通过使用台盼蓝(0.4％，英杰公司)排除进行计数来测量Foxp3+调节性T细胞的扩增倍数。图11示出Foxp3+调节性T细胞在第11天增加2.5倍。
实例10.使用2t2和3t15*-28s Plus抗组织因子抗体扩增人免疫细胞
从血库获得新鲜的人白细胞(2个供体)，并且用菲柯尔分离(Ficoll separation)分离PBMC(外周血单核细胞)。对细胞进行计数并以1x107个细胞/mL的密度重悬于PBS中。将2μM最终浓度的Cell-Trace Violet染料(Cell-Trace Violet Dye)(生命技术公司)添加到细胞中，并且在37℃下在5％CO2的气氛下温育20分钟。在室温下将细胞以10倍体积重悬于新鲜预热的RPMI 1640培养基(吉博科公司)中，所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、抗生素(青霉素，10,000单位/mL；链霉素，10,000μg/mL；赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)，持续5分钟。将细胞在计数时以1200rpm洗涤2次，持续10分钟，并且以2x106个细胞/mL的密度重悬于RPMI 1640培养基(吉博科公司)中，所述培养基补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、抗生素(青霉素，10,000单位/mL；链霉素，10,000μg/mL；赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)。将细胞(0.1mL)转移到96孔平底板中，并且在含有或不含抗组织因子抗体(αTF Ab，0.01-100nM)的情况下与2t2(100nM)和3t15*-28s(0.01-1000nM)一起温育。在刺激前15分钟以2:1的比例制备3t15*-28s和抗组织因子抗体的复合物。在含有或不含抗组织因子抗体的情况下，每48到72小时去除一半培养基并且替换为新鲜的2t2(100nM)和3t15*-28s。用CD4-Alexa Fluro 488、CD3-PE、CD8-PerCPCy5.5 Abs(百进生物公司)对细胞进行染色，以通过流式细胞术评估Cell Trace Violet的稀释度。
图12示出了在不同培养条件下经历六次或更多次细胞分裂的CD4+ T细胞的百分比。用3t15*-28s:αTF Ab复合物加2t2温育能够在比用3t15*-28s加2t2(不含αTF Ab)时观察到的3t15*-28s浓度更低的3t15*-28s浓度下支持细胞增殖。此结果表明，使用抗组织因子抗体和3t28的复合物可以最佳地刺激来源于PBMC的免疫细胞增殖。
实例11.使用抗CD39 IgG1k试剂纯化CD39+Foxp3+调节性T细胞
从血库中获得新鲜的人白细胞。将一半的白细胞用于使用EasySep人CD4+CD25+CD127low调节性T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)纯化CD4+CD25+CD127low T调节性细胞。Foxp3+调节性T细胞的纯度>60％，并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE，Foxp3-PacBlue(百进生物公司)染色确认。将另一半白细胞用于通过两步骤过程纯化CD39+Foxp3+调节性T细胞。首先用RosetteSep人CD4+细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)分离CD4+T细胞。富集CD4+ T细胞之后，按照制造商的说明书(EasySep人生物素阳性选择试剂盒，干细胞技术公司)，使用新型生物素化抗CD39抗体试剂(HCW生物制剂公司(HCW Biologic))和磁性颗粒分离CD39+CD4+细胞。用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlueAbs(百进生物公司)对细胞进行染色，以通过流式细胞术评估CD39+Foxp3+调节性T细胞的纯度(在CD3+CD4+Foxp3+上对细胞进行门控)。通过流式细胞仪进行的纯化后纯度分析表明，与使用EasySep人CD4+CD25+CD127low调节性T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)分离的细胞的62％相比，使用生物素化抗CD39 Ab纯化的细胞的CD39+为84.8％。此数据展示了分离高纯度和表型活性调节性T细胞的新策略(图13A)。这些细胞可以通过上文所描述的方法在含有hIL-2、抗CD3/抗CD28珠粒、雷帕霉素、2t2、3t15*和或3t15*-28s:αTF Ab复合物的培养基中扩增。
在第二项研究中，首先用来自纯化的CD4+CD25+CD127low T调节细胞的2t2扩增Foxp3+调节性T细胞，并且然后冷冻。对细胞进行解冻并且以2x106/mL维持在含有含2t2(100nM)的完全培养基(补充有2mM L谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))的T25烧瓶中。按照制造商的说明书(EasySep人生物素阳性选择试剂盒，干细胞技术公司)，使用新型生物素化抗CD39 Ab试剂(HCW生物制剂公司)和磁性颗粒分离CD39+CD4+细胞。用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue Abs(百进生物公司)对细胞进行染色，以通过流式细胞术评估CD39+Foxp3+调节性T细胞的纯度(在CD3+CD4+Foxp3+上对细胞进行门控)。通过流式细胞仪进行的纯化后纯度分析表明，使用生物素化抗CD39抗体纯化的细胞产生了99.9％富集高度抑制性CD39+亚群的Foxp3+调节性T细胞(图13B)。这些细胞可以通过上文所描述的方法在含有hIL-2、抗CD3/抗CD28珠粒、雷帕霉素、2t2、3t15*和或3t15*-28s:αTF Ab复合物的培养基中扩增。
实例12.通过纯化的CD39+调节性T细胞抑制自体T应答细胞
从血库中获得新鲜的人白细胞。将一半的白细胞用于使用EasySep人CD4+CD25+CD127low调节性T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)纯化CD4+CD25+CD127low T调节性细胞。Foxp3+调节性T细胞的纯度>60％，并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE，Foxp3-PacBlue(百进生物公司)染色确认。将另一半白细胞用于通过两步骤过程纯化CD39+Foxp3+调节性T细胞。首先用RosetteSep人CD4+细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)分离CD4+T细胞。富集CD4+ T细胞之后，按照制造商的说明书(EasySep人生物素阳性选择试剂盒，干细胞技术公司)，使用新型生物素化抗CD39抗体试剂(HCW生物制剂公司(HCW Biologics))和磁性颗粒分离CD39+CD4+细胞。用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue Abs(百进生物公司)对细胞进行染色，以通过流式细胞术评估CD39+Foxp3+调节性T细胞的纯度(在CD3+CD4+Foxp3+上对细胞进行门控)。将自体T应答(Tresp)细胞用CellTrace Violet(英杰公司)标记。将纯化的Foxp3+ T细胞与T应答细胞一起培养(调节性T细胞:T应答细胞为1:1)。用2t2(10nM)对细胞进行再刺激并且培养5天。采集细胞，将细胞在FACS缓冲液(含0.5％BSA(EMD密理博公司)和0.001％叠氮化钠(西格玛)的1x PBS(海克隆公司))中洗涤(室温下，1500RPM，持续5分钟)。洗涤两次之后，通过流式细胞术(Celesta-BD生物科学公司)分析细胞，并且基于Cell Trace Violet稀释度测定分裂的Tresp细胞的％。图14示出与基于CD4+CD25+CD127low T调节性细胞分离的细胞相比，纯化的CD39+Foxp3+调节性T细胞在抑制T应答细胞增殖方面更有效。
实例13.通过扩增的和CD39+纯化的T调节性细胞抑制THP-1单核细胞
从血库中获得新鲜的人白细胞。CD4+CD25+CD127low T调节性细胞和EasySep人CD4+CD25+CD127low调节性T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)。Foxp3+调节性T细胞的纯度>60％，并且通过用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE，Foxp3-PacBlue(百进生物公司)染色确认。对细胞进行计数并在24孔平底板中以1x106/mL重悬于完全培养基(补充有2mM L谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中。用100nM的2t2和CD3/CD28珠粒(珠粒:细胞为4:1)(免疫磁珠，生命技术公司)对细胞进行刺激，并且在37°、5％CO2下温育21天。在扩增期间，每隔一天用100nM的2t2对细胞进行再刺激，并且每7天用CD3/CD28珠粒(珠粒:细胞为1:1)(免疫磁珠，生命技术公司)对细胞进行再刺激。每隔一天用含有100nM的2t2的新鲜完全培养基将细胞以1x106/mL浓度维持至多21天。
在第21天，将细胞用CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(使用英杰公司的Foxp3染色试剂盒进行细胞内染色)、CD127-Alex Fluro 700(百进生物公司)染色，以通过流式细胞术评估Foxp3+调节性T细胞的扩增，并且以20x106/mL冷冻。对先前扩增的细胞进行解冻并且以2x106/mL维持在T25烧瓶中的完全培养基(补充有2mM L谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司))中，持续一小时，并且在分离CD39+CD4+T细胞之前洗涤。使用新型生物素化抗CD39 Ab试剂(HCW生物制剂公司；EasySep人生物素阳性选择试剂盒，干细胞技术公司)分离CD39+CD4+细胞。用CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue Abs(百进生物公司)对细胞进行染色，以通过流式细胞术评估CD39+Foxp3+调节性T细胞的纯度(在CD3+CD4+Foxp3+上对细胞进行门控)。通过流式细胞仪进行的纯化后纯度分析表明，使用生物素化抗CD39抗体纯化的细胞产生了99.9％富集高度抑制性CD39+亚群的Foxp3+调节性T细胞。使用THP-1(人单核细胞)和纯化的CD39+Foxp3+ T Reg细胞或CD39-Foxp3+ T Reg细胞或总CD4+ T Reg细胞(比率为1:1)设置抑制测定。将细胞在补充有2mM L-谷氨酰胺(赛默生命技术公司)、青霉素(赛默生命技术公司)、链霉素(赛默生命技术公司)和补充有50ng/mL LPS的10％FBS(海克隆公司)的RPMI 1640(吉博科公司)中培养3天。在第3天采集细胞上清液，以通过ELISA(R&D系统公司)分析IL-10。
图15示出，与CD39-Foxp3+ T Reg细胞或总CD4+ T Reg细胞相比，纯化的CD39+Foxp3+调节性T细胞分泌显著更多的IL-10。此数据表明，与CD39-Foxp3+ T Reg细胞或总CD4+ T Reg细胞相比，CD39+Foxp3+ T Reg具有更多的抑制能力。
其它实施例
应理解，虽然已经结合其具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都处于以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> HCW生物制品公司（HCW BIOLOGICS, INC.）
<120> 激活调节性T细胞的方法
<130> 47039-0019WO1
<140> PCT/US2021/017620
<141> 2021-02-11
<150> 62/981,944
<151> 2020-02-26
<150> 62/975,141
<151> 2020-02-11
<160> 123
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 1
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 2
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 2
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 3
<211> 485
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
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180 185 190
Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val
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Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn
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Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr
260 265 270
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275 280 285
Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn
290 295 300
Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe
305 310 315 320
Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr
325 330 335
Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
340 345 350
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
355 360 365
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
385 390 395 400
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
405 410 415
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
420 425 430
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
435 440 445
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
450 455 460
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
465 470 475 480
Ile Ser Thr Leu Thr
485
<210> 4
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu
20 25 30
Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
35 40 45
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met
50 55 60
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu
65 70 75 80
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe
85 90 95
His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu
100 105 110
Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu
115 120 125
Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln
130 135 140
Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala
145 150 155 160
Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp
165 170 175
Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys
180 185 190
Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys
195 200 205
Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala
210 215 220
Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala
225 230 235 240
Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu
245 250 255
Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr
260 265 270
Lys Val Asn Val Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn
275 280 285
Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr
290 295 300
Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys
305 310 315 320
Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr
325 330 335
Cys Phe Ser Val Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys
340 345 350
Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe
355 360 365
Arg Glu Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu
370 375 380
Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met
405 410 415
Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu
420 425 430
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe
435 440 445
His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu
450 455 460
Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu
465 470 475 480
Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln
485 490 495
Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
500
<210> 5
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
165 170 175
Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp
210 215 220
His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser
<210> 6
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val
20 25 30
Ile Gln Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ser Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu
130 135 140
Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu
165 170 175
Cys Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
195 200 205
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
210 215 220
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg
225 230 235
<210> 7
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
165 170 175
Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp
210 215 220
His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys
245 250 255
Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn
260 265 270
Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser
275 280 285
Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile
290 295 300
Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu
325 330 335
Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro
340 345 350
Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val
355 360 365
Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu
370 375 380
Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys
385 390 395 400
Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe
405 410 415
Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala
420 425 430
Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val
435 440 445
Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Val Gln Leu Gln
450 455 460
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser
465 470 475 480
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile Gln Trp Val
485 490 495
Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Asn Pro
500 505 510
Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr
515 520 525
Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr Met Glu Phe Ser Ser
530 535 540
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Asp
545 550 555 560
Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly
565 570 575
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu
580 585 590
Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val
595 600 605
Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe His
610 615 620
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Cys Ile Tyr Ser
625 630 635 640
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly
645 650 655
Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala
660 665 670
Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Thr Phe Gly Gly
675 680 685
Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg
690 695
<210> 8
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
35 40 45
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp
50 55 60
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu
85 90 95
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
100 105 110
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp
165 170 175
Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
180 185 190
Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr
225 230 235 240
Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr
260 265 270
Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro
275 280 285
Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp
290 295 300
Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp
305 310 315 320
Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser
325 330 335
Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu
340 345 350
Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly
355 360 365
Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val
370 375 380
Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr
405 410 415
Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn
420 425 430
Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val
435 440 445
Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser
450 455 460
Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Val Gln
465 470 475 480
Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
485 490 495
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Ile Gln
500 505 510
Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile
515 520 525
Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys
530 535 540
Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr Met Glu Phe
545 550 555 560
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp
565 570 575
Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
580 585 590
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
595 600 605
Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu
610 615 620
Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr
625 630 635 640
Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Cys Ile
645 650 655
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
660 665 670
Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
675 680 685
Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Thr Phe
690 695 700
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg
705 710
<210> 9
<211> 2088
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
cagatcgtgc tgacccaaag ccccgccatc atgagcgcta gccccggtga gaaggtgacc 60
atgacatgct ccgcttccag ctccgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaaaagcgga 120
accagcccca aaaggtggat ctacgacacc agcaagctgg cctccggagt gcccgctcat 180
ttccggggct ctggatccgg caccagctac tctttaacca tttccggcat ggaagctgaa 240
gacgctgcca cctactattg ccagcaatgg agcagcaacc ccttcacatt cggatctggc 300
accaagctcg aaatcaatcg tggaggaggt ggcagcggcg gcggtggatc cggcggagga 360
ggaagccaag ttcaactcca gcagagcggc gctgaactgg cccggcccgg cgcctccgtc 420
aagatgagct gcaaggcttc cggctataca tttactcgtt acacaatgca ttgggtcaag 480
cagaggcccg gtcaaggttt agagtggatc ggatatatca acccttcccg gggctacacc 540
aactataacc aaaagttcaa ggataaagcc actttaacca ctgacaagag ctcctccacc 600
gcctacatgc agctgtcctc tttaaccagc gaggactccg ctgtttacta ctgcgctagg 660
tattacgacg accactactg tttagactat tggggacaag gtaccacttt aaccgtcagc 720
agctccggca ccaccaatac cgtggccgct tataacctca catggaagag caccaacttc 780
aagacaattc tggaatggga acccaagccc gtcaatcaag tttacaccgt gcagatctcc 840
accaaatccg gagactggaa gagcaagtgc ttctacacaa cagacaccga gtgtgattta 900
accgacgaaa tcgtcaagga cgtcaagcaa acctatctgg ctcgggtctt ttcctacccc 960
gctggcaatg tcgagtccac cggctccgct ggcgagcctc tctacgagaa ttcccccgaa 1020
ttcacccctt atttagagac caatttaggc cagcctacca tccagagctt cgagcaagtt 1080
ggcaccaagg tgaacgtcac cgtcgaggat gaaaggactt tagtgcggcg gaataacaca 1140
tttttatccc tccgggatgt gttcggcaaa gacctcatct acacactgta ctattggaag 1200
tccagctcct ccggcaaaaa gaccgctaag accaacacca acgagttttt aattgacgtg 1260
gacaaaggcg agaactactg cttcagcgtg caagccgtga tcccttctcg taccgtcaac 1320
cggaagagca cagattcccc cgttgagtgc atgggccaag aaaagggcga gttccgggag 1380
gtccagctgc agcagagcgg acccgaactc gtgaaacccg gtgcttccgt gaaaatgtct 1440
tgtaaggcca gcggatacac cttcacctcc tatgtgatcc agtgggtcaa acagaagccc 1500
ggacaaggtc tcgagtggat cggcagcatc aacccttaca acgactatac caaatacaac 1560
gagaagttta agggaaaggc tactttaacc tccgacaaaa gctccatcac agcctacatg 1620
gagttcagct ctttaacatc cgaggacagc gctctgtact attgcgcccg gtggggcgac 1680
ggcaattact ggggacgggg cacaacactg accgtgagca gcggaggcgg aggctccggc 1740
ggaggcggat ctggcggtgg cggctccgac atcgagatga cccagtcccc cgctatcatg 1800
tccgcctctt taggcgagcg ggtcacaatg acttgtacag cctcctccag cgtctcctcc 1860
tcctacttcc attggtacca acagaaaccc ggaagctccc ctaaactgtg catctacagc 1920
accagcaatc tcgccagcgg cgtgccccct aggttttccg gaagcggaag caccagctac 1980
tctttaacca tctcctccat ggaggctgag gatgccgcca cctacttttg tcaccagtac 2040
caccggtccc ccaccttcgg aggcggcacc aaactggaga caaagagg 2088
<210> 10
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
atgaagtggg tgaccttcat cagcttatta tttttattca gctccgccta ttcccagatc 60
gtgctgaccc aaagccccgc catcatgagc gctagccccg gtgagaaggt gaccatgaca 120
tgctccgctt ccagctccgt gtcctacatg aactggtatc agcagaaaag cggaaccagc 180
cccaaaaggt ggatctacga caccagcaag ctggcctccg gagtgcccgc tcatttccgg 240
ggctctggat ccggcaccag ctactcttta accatttccg gcatggaagc tgaagacgct 300
gccacctact attgccagca atggagcagc aaccccttca cattcggatc tggcaccaag 360
ctcgaaatca atcgtggagg aggtggcagc ggcggcggtg gatccggcgg aggaggaagc 420
caagttcaac tccagcagag cggcgctgaa ctggcccggc ccggcgcctc cgtcaagatg 480
agctgcaagg cttccggcta tacatttact cgttacacaa tgcattgggt caagcagagg 540
cccggtcaag gtttagagtg gatcggatat atcaaccctt cccggggcta caccaactat 600
aaccaaaagt tcaaggataa agccacttta accactgaca agagctcctc caccgcctac 660
atgcagctgt cctctttaac cagcgaggac tccgctgttt actactgcgc taggtattac 720
gacgaccact actgtttaga ctattgggga caaggtacca ctttaaccgt cagcagctcc 780
ggcaccacca ataccgtggc cgcttataac ctcacatgga agagcaccaa cttcaagaca 840
attctggaat gggaacccaa gcccgtcaat caagtttaca ccgtgcagat ctccaccaaa 900
tccggagact ggaagagcaa gtgcttctac acaacagaca ccgagtgtga tttaaccgac 960
gaaatcgtca aggacgtcaa gcaaacctat ctggctcggg tcttttccta ccccgctggc 1020
aatgtcgagt ccaccggctc cgctggcgag cctctctacg agaattcccc cgaattcacc 1080
ccttatttag agaccaattt aggccagcct accatccaga gcttcgagca agttggcacc 1140
aaggtgaacg tcaccgtcga ggatgaaagg actttagtgc ggcggaataa cacattttta 1200
tccctccggg atgtgttcgg caaagacctc atctacacac tgtactattg gaagtccagc 1260
tcctccggca aaaagaccgc taagaccaac accaacgagt ttttaattga cgtggacaaa 1320
ggcgagaact actgcttcag cgtgcaagcc gtgatccctt ctcgtaccgt caaccggaag 1380
agcacagatt cccccgttga gtgcatgggc caagaaaagg gcgagttccg ggaggtccag 1440
ctgcagcaga gcggacccga actcgtgaaa cccggtgctt ccgtgaaaat gtcttgtaag 1500
gccagcggat acaccttcac ctcctatgtg atccagtggg tcaaacagaa gcccggacaa 1560
ggtctcgagt ggatcggcag catcaaccct tacaacgact ataccaaata caacgagaag 1620
tttaagggaa aggctacttt aacctccgac aaaagctcca tcacagccta catggagttc 1680
agctctttaa catccgagga cagcgctctg tactattgcg cccggtgggg cgacggcaat 1740
tactggggac ggggcacaac actgaccgtg agcagcggag gcggaggctc cggcggaggc 1800
ggatctggcg gtggcggctc cgacatcgag atgacccagt cccccgctat catgtccgcc 1860
tctttaggcg agcgggtcac aatgacttgt acagcctcct ccagcgtctc ctcctcctac 1920
ttccattggt accaacagaa acccggaagc tcccctaaac tgtgcatcta cagcaccagc 1980
aatctcgcca gcggcgtgcc ccctaggttt tccggaagcg gaagcaccag ctactcttta 2040
accatctcct ccatggaggc tgaggatgcc gccacctact tttgtcacca gtaccaccgg 2100
tcccccacct tcggaggcgg caccaaactg gagacaaaga gg 2142
<210> 11
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
gcccccacct cctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac tcgtatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga agcatttaca gtgtttagag 180
gaggagctga agcccctcga ggaggtgctg aatttagccc agtccaagaa tttccattta 240
aggccccggg atttaatcag caacatcaac gtgatcgttt tagagctgaa gggctccgag 300
accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 360
tggatcacct tctgccagtc catcatctcc actttaacca gcggcacaac caacacagtc 420
gctgcctata acctcacttg gaagagcacc aacttcaaaa ccatcctcga atgggaaccc 480
aaacccgtta accaagttta caccgtgcag atcagcacca agtccggcga ctggaagtcc 540
aaatgtttct ataccaccga caccgagtgc gatctcaccg atgagatcgt gaaagatgtg 600
aaacagacct acctcgcccg ggtgtttagc taccccgccg gcaatgtgga gagcactggt 660
tccgctggcg agcctttata cgagaacagc cccgaattta ccccttacct cgagaccaat 720
ttaggacagc ccaccatcca aagctttgag caagttggca caaaggtgaa tgtgacagtg 780
gaggacgagc ggactttagt gcggcggaac aacacctttc tcagcctccg ggatgtgttc 840
ggcaaagatt taatctacac actgtattac tggaagtcct cttcctccgg caagaagaca 900
gctaaaacca acacaaacga gtttttaatc gacgtggata aaggcgaaaa ctactgtttc 960
agcgtgcaag ctgtgatccc ctcccggacc gtgaatagga aaagcaccga tagccccgtt 1020
gagtgcatgg gccaagaaaa gggcgagttc cgggaggcac ctacttcaag ttctacaaag 1080
aaaacacagc tacaactgga gcatttactg ctggatttac agatgatttt gaatggaatt 1140
aataattaca agaatcccaa actcaccagg atgctcacat ttaagtttta catgcccaag 1200
aaggccacag aactgaaaca tcttcagtgt ctagaagaag aactcaaacc tctggaggaa 1260
gtgctaaatt tagctcaaag caaaaacttt cacttaagac ccagggactt aatcagcaat 1320
atcaacgtaa tagttctgga actaaaggga tctgaaacaa cattcatgtg tgaatatgct 1380
gatgagacag caaccattgt agaatttctg aacagatgga ttaccttttg tcaaagcatc 1440
atctcaacac taact 1455
<210> 12
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgttct ccagcgccta ctccgccccc 60
acctcctcct ccaccaagaa gacccagctg cagctggagc atttactgct ggatttacag 120
atgattttaa acggcatcaa caactacaag aaccccaagc tgactcgtat gctgaccttc 180
aagttctaca tgcccaagaa ggccaccgag ctgaagcatt tacagtgttt agaggaggag 240
ctgaagcccc tcgaggaggt gctgaattta gcccagtcca agaatttcca tttaaggccc 300
cgggatttaa tcagcaacat caacgtgatc gttttagagc tgaagggctc cgagaccacc 360
ttcatgtgcg agtacgccga cgagaccgcc accatcgtgg agtttttaaa tcgttggatc 420
accttctgcc agtccatcat ctccacttta accagcggca caaccaacac agtcgctgcc 480
tataacctca cttggaagag caccaacttc aaaaccatcc tcgaatggga acccaaaccc 540
gttaaccaag tttacaccgt gcagatcagc accaagtccg gcgactggaa gtccaaatgt 600
ttctatacca ccgacaccga gtgcgatctc accgatgaga tcgtgaaaga tgtgaaacag 660
acctacctcg cccgggtgtt tagctacccc gccggcaatg tggagagcac tggttccgct 720
ggcgagcctt tatacgagaa cagccccgaa tttacccctt acctcgagac caatttagga 780
cagcccacca tccaaagctt tgagcaagtt ggcacaaagg tgaatgtgac agtggaggac 840
gagcggactt tagtgcggcg gaacaacacc tttctcagcc tccgggatgt gttcggcaaa 900
gatttaatct acacactgta ttactggaag tcctcttcct ccggcaagaa gacagctaaa 960
accaacacaa acgagttttt aatcgacgtg gataaaggcg aaaactactg tttcagcgtg 1020
caagctgtga tcccctcccg gaccgtgaat aggaaaagca ccgatagccc cgttgagtgc 1080
atgggccaag aaaagggcga gttccgggag gcacctactt caagttctac aaagaaaaca 1140
cagctacaac tggagcattt actgctggat ttacagatga ttttgaatgg aattaataat 1200
tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc 1260
acagaactga aacatcttca gtgtctagaa gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta 1320
aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta agacccaggg acttaatcag caatatcaac 1380
gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag 1440
acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca 1500
acactaact 1509
<210> 13
<211> 657
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 13
agcggcacaa ccaacacagt cgctgcctat aacctcactt ggaagagcac caacttcaaa 60
accatcctcg aatgggaacc caaacccgtt aaccaagttt acaccgtgca gatcagcacc 120
aagtccggcg actggaagtc caaatgtttc tataccaccg acaccgagtg cgatctcacc 180
gatgagatcg tgaaagatgt gaaacagacc tacctcgccc gggtgtttag ctaccccgcc 240
ggcaatgtgg agagcactgg ttccgctggc gagcctttat acgagaacag ccccgaattt 300
accccttacc tcgagaccaa tttaggacag cccaccatcc aaagctttga gcaagttggc 360
acaaaggtga atgtgacagt ggaggacgag cggactttag tgcggcggaa caacaccttt 420
ctcagcctcc gggatgtgtt cggcaaagat ttaatctaca cactgtatta ctggaagtcc 480
tcttcctccg gcaagaagac agctaaaacc aacacaaacg agtttttaat cgacgtggat 540
aaaggcgaaa actactgttt cagcgtgcaa gctgtgatcc cctcccggac cgtgaatagg 600
aaaagcaccg atagccccgt tgagtgcatg ggccaagaaa agggcgagtt ccgggag 657
<210> 14
<211> 223
<212> PRT
<213> 小鼠（mus musculus）
<400> 14
Ala Gly Ile Pro Glu Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr Asp
1 5 10 15
Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr Tyr
20 25 30
Thr Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Asn Lys Cys Phe
35 40 45
Ser Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys Asp
50 55 60
Val Thr Trp Ala Tyr Glu Ala Lys Val Leu Ser Val Pro Arg Arg Asn
65 70 75 80
Ser Val His Gly Asp Gly Asp Gln Leu Val Ile His Gly Glu Glu Pro
85 90 95
Pro Phe Thr Asn Ala Pro Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Asn Leu
100 105 110
Gly Gln Pro Val Ile Gln Gln Phe Glu Gln Asp Gly Arg Lys Leu Asn
115 120 125
Val Val Val Lys Asp Ser Leu Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr Phe
130 135 140
Leu Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Lys Asp Leu Gly Tyr Ile Ile Thr
145 150 155 160
Tyr Arg Lys Gly Ser Ser Thr Gly Lys Lys Thr Asn Ile Thr Asn Thr
165 170 175
Asn Glu Phe Ser Ile Asp Val Glu Glu Gly Val Ser Tyr Cys Phe Phe
180 185 190
Val Gln Ala Met Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn Gln Asn Ser Pro Gly
195 200 205
Ser Ser Thr Val Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Phe Leu Gly Glu
210 215 220
<210> 15
<211> 224
<212> PRT
<213> 大鼠（rattus rattus）
<400> 15
Ala Gly Thr Pro Pro Gly Lys Ala Phe Asn Leu Thr Trp Ile Ser Thr
1 5 10 15
Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Gln Pro Lys Pro Thr Asn Tyr Thr
20 25 30
Tyr Thr Val Gln Ile Ser Asp Arg Ser Arg Asn Trp Lys Tyr Lys Cys
35 40 45
Thr Gly Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val Lys
50 55 60
Asp Val Asn Trp Thr Tyr Glu Ala Arg Val Leu Ser Val Pro Trp Arg
65 70 75 80
Asn Ser Thr His Gly Lys Glu Thr Leu Phe Gly Thr His Gly Glu Glu
85 90 95
Pro Pro Phe Thr Asn Ala Arg Lys Phe Leu Pro Tyr Arg Asp Thr Lys
100 105 110
Ile Gly Gln Pro Val Ile Gln Lys Tyr Glu Gln Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Lys Val Thr Val Lys Asp Ser Phe Thr Leu Val Arg Lys Asn Gly Thr
130 135 140
Phe Leu Thr Leu Arg Gln Val Phe Gly Asn Asp Leu Gly Tyr Ile Leu
145 150 155 160
Thr Tyr Arg Lys Asp Ser Ser Thr Gly Arg Lys Thr Asn Thr Thr His
165 170 175
Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val Glu Lys Gly Val Ser Tyr Cys Phe
180 185 190
Phe Ala Gln Ala Val Ile Phe Ser Arg Lys Thr Asn His Lys Ser Pro
195 200 205
Glu Ser Ile Thr Lys Cys Thr Glu Gln Trp Lys Ser Val Leu Gly Glu
210 215 220
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Ala Thr Ala Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Ala Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Ala Arg Asn Asn Thr Ala Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 17
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
1 5 10 15
Thr Asn Phe Ala Thr Ala Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Ala Lys Ser Lys
35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Ala Leu Thr Asp Glu Ile Val
50 55 60
Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Ala Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
100 105 110
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Ala Arg Asn Asn Thr Ala Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
180 185 190
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
ggcggtggag gatccggagg aggtggctcc ggcggcggag gatct 45
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
100 105
<210> 23
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
caagttcagc tccagcaaag cggcgccgaa ctcgctcggc ccggcgcttc cgtgaagatg 60
tcttgtaagg cctccggcta taccttcacc cggtacacaa tgcactgggt caagcaacgg 120
cccggtcaag gtttagagtg gattggctat atcaacccct cccggggcta taccaactac 180
aaccagaagt tcaaggacaa agccaccctc accaccgaca agtccagcag caccgcttac 240
atgcagctga gctctttaac atccgaggat tccgccgtgt actactgcgc tcggtactac 300
gacgatcatt actgcctcga ttactggggc caaggtacca ccttaacagt ctcctcc 357
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
cagatcgtgc tgacccagtc ccccgctatt atgagcgcta gccccggtga aaaggtgact 60
atgacatgca gcgccagctc ttccgtgagc tacatgaact ggtatcagca gaagtccggc 120
accagcccta aaaggtggat ctacgacacc agcaagctgg ccagcggcgt ccccgctcac 180
tttcggggct ccggctccgg aacaagctac tctctgacca tcagcggcat ggaagccgag 240
gatgccgcta cctattactg tcagcagtgg agctccaacc ccttcacctt tggatccggc 300
accaagctcg agattaatcg t 321
<210> 25
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
cagatcgtgc tgacccagtc ccccgctatt atgagcgcta gccccggtga aaaggtgact 60
atgacatgca gcgccagctc ttccgtgagc tacatgaact ggtatcagca gaagtccggc 120
accagcccta aaaggtggat ctacgacacc agcaagctgg ccagcggcgt ccccgctcac 180
tttcggggct ccggctccgg aacaagctac tctctgacca tcagcggcat ggaagccgag 240
gatgccgcta cctattactg tcagcagtgg agctccaacc ccttcacctt tggatccggc 300
accaagctcg agattaatcg tggaggcgga ggtagcggag gaggcggatc cggcggtgga 360
ggtagccaag ttcagctcca gcaaagcggc gccgaactcg ctcggcccgg cgcttccgtg 420
aagatgtctt gtaaggcctc cggctatacc ttcacccggt acacaatgca ctgggtcaag 480
caacggcccg gtcaaggttt agagtggatt ggctatatca acccctcccg gggctatacc 540
aactacaacc agaagttcaa ggacaaagcc accctcacca ccgacaagtc cagcagcacc 600
gcttacatgc agctgagctc tttaacatcc gaggattccg ccgtgtacta ctgcgctcgg 660
tactacgacg atcattactg cctcgattac tggggccaag gtaccacctt aacagtctcc 720
tcc 723
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 26
Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Cys
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg
100 105
<210> 27
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 27
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val
20 25 30
Ile Gln Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ser Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
gacatcgaga tgacacagtc ccccgctatc atgagcgcct ctttaggaga acgtgtgacc 60
atgacttgta cagcttcctc cagcgtgagc agctcctatt tccactggta ccagcagaaa 120
cccggctcct cccctaaact gtgtatctac tccacaagca atttagctag cggcgtgcct 180
cctcgtttta gcggctccgg cagcacctct tactctttaa ccattagctc tatggaggcc 240
gaagatgccg ccacatactt ttgccatcag taccaccggt cccctacctt tggcggaggc 300
acaaagctgg agaccaagcg g 321
<210> 29
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 29
gtgcagctgc agcagtccgg acccgaactg gtcaagcccg gtgcctccgt gaaaatgtct 60
tgtaaggctt ctggctacac ctttacctcc tacgtcatcc aatgggtgaa gcagaagccc 120
ggtcaaggtc tcgagtggat cggcagcatc aatccctaca acgattacac caagtataac 180
gaaaagttta agggcaaggc cactctgaca agcgacaaga gctccattac cgcctacatg 240
gagttttcct ctttaacttc tgaggactcc gctttatact attgcgctcg ttggggcgat 300
ggcaattatt ggggccgggg aactacttta acagtgagct cc 342
<210> 30
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 30
gtgcagctgc agcagtccgg acccgaactg gtcaagcccg gtgcctccgt gaaaatgtct 60
tgtaaggctt ctggctacac ctttacctcc tacgtcatcc aatgggtgaa gcagaagccc 120
ggtcaaggtc tcgagtggat cggcagcatc aatccctaca acgattacac caagtataac 180
gaaaagttta agggcaaggc cactctgaca agcgacaaga gctccattac cgcctacatg 240
gagttttcct ctttaacttc tgaggactcc gctttatact attgcgctcg ttggggcgat 300
ggcaattatt ggggccgggg aactacttta acagtgagct ccggcggcgg cggaagcgga 360
ggtggaggat ctggcggtgg aggcagcgac atcgagatga cacagtcccc cgctatcatg 420
agcgcctctt taggagaacg tgtgaccatg acttgtacag cttcctccag cgtgagcagc 480
tcctatttcc actggtacca gcagaaaccc ggctcctccc ctaaactgtg tatctactcc 540
acaagcaatt tagctagcgg cgtgcctcct cgttttagcg gctccggcag cacctcttac 600
tctttaacca ttagctctat ggaggccgaa gatgccgcca catacttttg ccatcagtac 660
caccggtccc ctacctttgg cggaggcaca aagctggaga ccaagcgg 708
<210> 31
<211> 399
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 31
gcacctactt caagttctac aaagaaaaca cagctacaac tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttgaatgg aattaataat tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc 120
acatttaagt tttacatgcc caagaaggcc acagaactga aacatcttca gtgtctagaa 180
gaagaactca aacctctgga ggaagtgcta aatttagctc aaagcaaaaa ctttcactta 240
agacccaggg acttaatcag caatatcaac gtaatagttc tggaactaaa gggatctgaa 300
acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga 360
tggattacct tttgtcaaag catcatctca acactaact 399
<210> 32
<211> 399
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 32
gcccccacct cctcctccac caagaagacc cagctgcagc tggagcattt actgctggat 60
ttacagatga ttttaaacgg catcaacaac tacaagaacc ccaagctgac tcgtatgctg 120
accttcaagt tctacatgcc caagaaggcc accgagctga agcatttaca gtgtttagag 180
gaggagctga agcccctcga ggaggtgctg aatttagccc agtccaagaa tttccattta 240
aggccccggg atttaatcag caacatcaac gtgatcgttt tagagctgaa gggctccgag 300
accaccttca tgtgcgagta cgccgacgag accgccacca tcgtggagtt tttaaatcgt 360
tggatcacct tctgccagtc catcatctcc actttaacc 399
<210> 33
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 33
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 34
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
atgaaatggg tgacctttat ttctttactg ttcctcttta gcagcgccta ctcc 54
<210> 35
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
atgaagtggg tcacatttat ctctttactg ttcctcttct ccagcgccta cagc 54
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
atgaaatggg tgacctttat ttctttactg ttcctcttta gcagcgccta ctcc 54
<210> 37
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 37
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Leu Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
<210> 38
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Met Gly Gln Ile Val Thr Met Phe Glu Ala Leu Pro His Ile Ile Asp
1 5 10 15
Glu Val Ile Asn Ile Val Ile Ile Val Leu Ile Ile Ile Thr Ser Ile
20 25 30
Lys Ala Val Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Ile Leu Ala Leu Val Ser
35 40 45
Phe Leu Phe Leu Ala Gly Arg Ser Cys Gly
50 55
<210> 39
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Met Pro Asn His Gln Ser Gly Ser Pro Thr Gly Ser Ser Asp Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Gly Lys Lys Gln Arg Pro His Leu Ala Leu Arg Arg Lys Arg
20 25 30
Arg Arg Glu Met Arg Lys Ile Asn Arg Lys Val Arg Arg Met Asn Leu
35 40 45
Ala Pro Ile Lys Glu Lys Thr Ala Trp Gln His Leu Gln Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Glu Ala Glu Glu Val Leu Lys Thr Ser Gln Thr Pro Gln Asn Ser
65 70 75 80
Leu Thr Leu Phe Leu Ala Leu Leu Ser Val Leu Gly Pro Pro Val Thr
85 90 95
Gly
<210> 40
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser
20 25 30
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 41
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 42
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 42
Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg
1 5 10 15
Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu
20 25
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 43
Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1 5
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 44
Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg
1 5 10
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 45
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 46
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 47
His His His His His
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 48
His His His His His His
1 5
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 49
His His His His His His His
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 50
His His His His His His His His
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 51
His His His His His His His His His
1 5
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 52
His His His His His His His His His His
1 5 10
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 53
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 54
Thr Lys Glu Asn Pro Arg Ser Asn Gln Glu Glu Ser Tyr Asp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Ser
<210> 55
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 55
Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 56
Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly
1 5 10 15
Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro
20 25 30
Gln Gly Gln Arg Glu Pro
35
<210> 57
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 57
Ser Leu Ala Glu Leu Leu Asn Ala Gly Leu Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Thr Gln Asp Pro Ser Arg Val Gly
1 5
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Cys Cys Pro Gly Cys Cys
1 5
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro Leu Asp
1 5 10
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Asp Tyr Asn Val Tyr
1 5
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe
1 5
<210> 69
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 71
Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr
1 5
<210> 72
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 72
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 75
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 76
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 76
Ala Pro Met Thr Gln Thr Thr Pro Leu Lys Thr Ser Trp Val Asn Cys
1 5 10 15
Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gln Pro Pro Leu
20 25 30
Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gln Asp Ile Leu
35 40 45
Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe Asn Arg Ala
50 55 60
Val Lys Ser Leu Gln Asn Ala Ser Ala Ile Glu Ser Ile Leu Lys Asn
65 70 75 80
Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr Arg His Pro
85 90 95
Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg Lys Leu Thr
100 105 110
Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gln Ala Gln Gln Thr Thr Leu
115 120 125
Ser Leu Ala Ile Phe
130
<210> 77
<211> 152
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 77
Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu
1 5 10 15
Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp
35 40 45
Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg
50 55 60
Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu Leu
65 70 75 80
Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln Val
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser
100 105 110
Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu
115 120 125
Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys
130 135 140
Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His
145 150
<210> 78
<211> 79
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 78
Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys
1 5 10 15
Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu
20 25 30
Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile Val
35 40 45
Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp
50 55 60
Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser
65 70 75
<210> 79
<211> 160
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 79
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 80
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 80
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 81
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 81
Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys
1 5 10 15
Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn Leu Asn Ile His Asn Arg Asn
20 25 30
Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr
35 40 45
Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser
50 55 60
Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp
65 70 75 80
Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile
85 90 95
Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu
100 105 110
Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Ile Val
115 120 125
His His Val Ala
130
<210> 82
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 82
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 83
<211> 352
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 83
Arg Asp Thr Ser Ala Thr Pro Gln Ser Ala Ser Ile Lys Ala Leu Arg
1 5 10 15
Asn Ala Asn Leu Arg Arg Asp Glu Ser Asn His Leu Thr Asp Leu Tyr
20 25 30
Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr Trp Arg
50 55 60
Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp Asn Gln
65 70 75 80
Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp Phe Val
85 90 95
Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly Arg Trp
100 105 110
Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr Asn Gln
115 120 125
Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys Pro Gly
130 135 140
Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala Ala Ala
145 150 155 160
Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly Val Ser
165 170 175
Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp Ala Leu
180 185 190
Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu Lys Tyr
195 200 205
Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr Leu Asp
210 215 220
Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser Lys Val
225 230 235 240
Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr Pro
245 250 255
Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn Val
260 265 270
Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn Cys
275 280 285
Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly Lys
290 295 300
Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly His Ile
305 310 315 320
Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu
325 330 335
Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 84
<211> 248
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 84
Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr
1 5 10 15
Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr
20 25 30
Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met
35 40 45
Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser
50 55 60
Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val
65 70 75 80
Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys
85 90 95
Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr Pro
100 105 110
Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp
115 120 125
Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu
130 135 140
Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu
145 150 155 160
Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn
165 170 175
Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala
180 185 190
Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly
195 200 205
Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu
210 215 220
Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu
225 230 235 240
Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu Val
245
<210> 85
<211> 209
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 85
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1 5 10 15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
20 25 30
Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp
35 40 45
Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala
50 55 60
Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His
65 70 75 80
Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe
85 90 95
Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu
100 105 110
Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu
115 120 125
Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser
130 135 140
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Leu
145 150 155 160
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Val Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala
165 170 175
Trp Cys Leu His Trp Gln Arg Thr Arg Arg Arg Thr Pro Arg Pro Gly
180 185 190
Glu Gln Val Pro Pro Val Pro Ser Pro Gln Asp Leu Leu Leu Val Glu
195 200 205
His
<210> 86
<211> 360
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 86
Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp Asp Gly
1 5 10 15
Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Thr Glu Val His Leu Asp Gly Gln Pro
20 25 30
Phe Leu Arg Cys Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln Gly Gln
35 40 45
Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu Thr Arg
50 55 60
Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala His Ile
65 70 75 80
Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val Cys
85 90 95
Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe Tyr Tyr
100 105 110
Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Lys Glu Trp Thr
115 120 125
Met Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Arg Asn
130 135 140
Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His Ala Met
145 150 155 160
His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Ser Gly Val
165 170 175
Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg Ser Glu
180 185 190
Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gly Phe Tyr
195 200 205
Pro Trp Asn Ile Thr Leu Ser Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu Ser
210 215 220
His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly Thr
225 230 235 240
Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Gln Gly Glu Glu Gln Arg
245 250 255
Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His Pro Val
260 265 270
Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp Gln Thr Phe His
275 280 285
Val Ser Ala Val Ala Ala Ala Ala Ile Phe Val Ile Ile Ile Phe Tyr
290 295 300
Val Arg Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu Leu
305 310 315 320
Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Ser Asp His
325 330 335
Arg Asp Ala Thr Gln Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Asp Leu Gly
340 345 350
Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
355 360
<210> 87
<211> 361
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 87
Ala Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Met Val Leu Ser Gln Asp
1 5 10 15
Glu Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Gly His Leu Asp Gly Gln
20 25 30
Pro Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Arg Arg Ala Lys Pro Gln Gly
35 40 45
Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Ala Lys Thr Trp Asp Thr Glu Thr
50 55 60
Glu Asp Leu Thr Glu Asn Gly Gln Asp Leu Arg Arg Thr Leu Thr His
65 70 75 80
Ile Lys Asp Gln Lys Gly Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg Val
85 90 95
Cys Glu Ile His Glu Asp Ser Ser Thr Arg Gly Ser Arg His Phe Tyr
100 105 110
Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Gln Glu Ser
115 120 125
Thr Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val Thr
130 135 140
Asn Phe Trp Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr Arg Ala
145 150 155 160
Met Gln Ala Asp Cys Leu Gln Lys Leu Gln Arg Tyr Leu Lys Ser Gly
165 170 175
Val Ala Ile Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Cys Ser
180 185 190
Glu Val Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Ser Phe
195 200 205
Tyr Pro Arg Asn Ile Thr Leu Thr Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser Leu
210 215 220
Ser His Asn Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn Gly
225 230 235 240
Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Arg Gln Gly Glu Glu Gln
245 250 255
Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Gly Thr His Pro
260 265 270
Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser Gln Arg Thr Asp Phe
275 280 285
Pro Tyr Val Ser Ala Ala Met Pro Cys Phe Val Ile Ile Ile Ile Leu
290 295 300
Cys Val Pro Cys Cys Lys Lys Lys Thr Ser Ala Ala Glu Gly Pro Glu
305 310 315 320
Leu Val Ser Leu Gln Val Leu Asp Gln His Pro Val Gly Thr Gly Asp
325 330 335
His Arg Asp Ala Ala Gln Leu Gly Phe Gln Pro Leu Met Ser Ala Thr
340 345 350
Gly Ser Thr Gly Ser Thr Glu Gly Ala
355 360
<210> 88
<211> 190
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 88
Trp Val Asp Thr His Cys Leu Cys Tyr Asp Phe Ile Ile Thr Pro Lys
1 5 10 15
Ser Arg Pro Glu Pro Gln Trp Cys Glu Val Gln Gly Leu Val Asp Glu
20 25 30
Arg Pro Phe Leu His Tyr Asp Cys Val Asn His Lys Ala Lys Ala Phe
35 40 45
Ala Ser Leu Gly Lys Lys Val Asn Val Thr Lys Thr Trp Glu Glu Gln
50 55 60
Thr Glu Thr Leu Arg Asp Val Val Asp Phe Leu Lys Gly Gln Leu Leu
65 70 75 80
Asp Ile Gln Val Glu Asn Leu Ile Pro Ile Glu Pro Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ala Arg Met Ser Cys Glu His Glu Ala His Gly His Gly Arg Gly Ser
100 105 110
Trp Gln Phe Leu Phe Asn Gly Gln Lys Phe Leu Leu Phe Asp Ser Asn
115 120 125
Asn Arg Lys Trp Thr Ala Leu His Pro Gly Ala Lys Lys Met Thr Glu
130 135 140
Lys Trp Glu Lys Asn Arg Asp Val Thr Met Phe Phe Gln Lys Ile Ser
145 150 155 160
Leu Gly Asp Cys Lys Met Trp Leu Glu Glu Phe Leu Met Tyr Trp Glu
165 170 175
Gln Met Leu Asp Pro Thr Lys Pro Pro Ser Leu Ala Pro Gly
180 185 190
<210> 89
<211> 191
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 89
Gly Arg Ala Asp Pro His Ser Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro
1 5 10 15
Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp
20 25 30
Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro
35 40 45
Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala
50 55 60
Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu
65 70 75 80
Arg Asp Ile Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu
85 90 95
Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly
100 105 110
Ser Trp Gln Phe Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser
115 120 125
Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys
130 135 140
Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys Val Val Ala Met Ser Phe His Tyr Phe
145 150 155 160
Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser
180 185 190
<210> 90
<211> 188
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 90
Asp Ala His Ser Leu Trp Tyr Asn Phe Thr Ile Ile His Leu Pro Arg
1 5 10 15
His Gly Gln Gln Trp Cys Glu Val Gln Ser Gln Val Asp Gln Lys Asn
20 25 30
Phe Leu Ser Tyr Asp Cys Gly Ser Asp Lys Val Leu Ser Met Gly His
35 40 45
Leu Glu Glu Gln Leu Tyr Ala Thr Asp Ala Trp Gly Lys Gln Leu Glu
50 55 60
Met Leu Arg Glu Val Gly Gln Arg Leu Arg Leu Glu Leu Ala Asp Thr
65 70 75 80
Glu Leu Glu Asp Phe Thr Pro Ser Gly Pro Leu Thr Leu Gln Val Arg
85 90 95
Met Ser Cys Glu Cys Glu Ala Asp Gly Tyr Ile Arg Gly Ser Trp Gln
100 105 110
Phe Ser Phe Asp Gly Arg Lys Phe Leu Leu Phe Asp Ser Asn Asn Arg
115 120 125
Lys Trp Thr Val Val His Ala Gly Ala Arg Arg Met Lys Glu Lys Trp
130 135 140
Glu Lys Asp Ser Gly Leu Thr Thr Phe Phe Lys Met Val Ser Met Arg
145 150 155 160
Asp Cys Lys Ser Trp Leu Arg Asp Phe Leu Met His Arg Lys Lys Arg
165 170 175
Leu Glu Pro Thr Ala Pro Pro Thr Met Ala Pro Gly
180 185
<210> 91
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 91
His Ser Leu Cys Phe Asn Phe Thr Ile Lys Ser Leu Ser Arg Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Trp Cys Glu Ala Gln Val Phe Leu Asn Lys Asn Leu Phe Leu
20 25 30
Gln Tyr Asn Ser Asp Asn Asn Met Val Lys Pro Leu Gly Leu Leu Gly
35 40 45
Lys Lys Val Tyr Ala Thr Ser Thr Trp Gly Glu Leu Thr Gln Thr Leu
50 55 60
Gly Glu Val Gly Arg Asp Leu Arg Met Leu Leu Cys Asp Ile Lys Pro
65 70 75 80
Gln Ile Lys Thr Ser Asp Pro Ser Thr Leu Gln Val Glu Met Phe Cys
85 90 95
Gln Arg Glu Ala Glu Arg Cys Thr Gly Ala Ser Trp Gln Phe Ala Thr
100 105 110
Asn Gly Glu Lys Ser Leu Leu Phe Asp Ala Met Asn Met Thr Trp Thr
115 120 125
Val Ile Asn His Glu Ala Ser Lys Ile Lys Glu Thr Trp Lys Lys Asp
130 135 140
Arg Gly Leu Glu Lys Tyr Phe Arg Lys Leu Ser Lys Gly Asp Cys Asp
145 150 155 160
His Trp Leu Arg Glu Phe Leu Gly His Trp Glu Ala Met Pro Glu Pro
165 170 175
Thr Val Ser Pro Val Asn Ala Ser Asp Ile His Trp Ser Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Pro Asp Arg Trp Ile Ile Leu Gly Ala Phe Ile Leu Leu Val Leu
195 200 205
Met Gly Ile Val Leu Ile Cys Val Trp Trp Gln Asn Gly Glu Trp Gln
210 215 220
Ala Gly Leu Trp Pro Leu Arg Thr Ser
225 230
<210> 92
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 92
Gly Leu Ala Asp Pro His Ser Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro
1 5 10 15
Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp
20 25 30
Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Ser Lys Thr Val Thr Pro
35 40 45
Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Thr Ala Trp Lys Ala
50 55 60
Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Gln Leu Glu Asn Tyr Ile Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu
85 90 95
Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Trp Gln Leu Ser Phe Asp Gly Gln Ile Phe Leu Leu Phe Asp Ser
115 120 125
Glu Asn Arg Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys
130 135 140
Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys Asp Met Thr Met Ser Phe His Tyr Ile
145 150 155 160
Ser Met Gly Asp Cys Thr Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Gly Ala Pro Pro Thr Met Ser Ser
180 185 190
Gly
<210> 93
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 93
Arg Arg Asp Asp Pro His Ser Leu Cys Tyr Asp Ile Thr Val Ile Pro
1 5 10 15
Lys Phe Arg Pro Gly Pro Arg Trp Cys Ala Val Gln Gly Gln Val Asp
20 25 30
Glu Lys Thr Phe Leu His Tyr Asp Cys Gly Asn Lys Thr Val Thr Pro
35 40 45
Val Ser Pro Leu Gly Lys Lys Leu Asn Val Thr Met Ala Trp Lys Ala
50 55 60
Gln Asn Pro Val Leu Arg Glu Val Val Asp Ile Leu Thr Glu Gln Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Gln Leu Glu Asn Tyr Thr Pro Lys Glu Pro Leu Thr Leu
85 90 95
Gln Ala Arg Met Ser Cys Glu Gln Lys Ala Glu Gly His Ser Ser Gly
100 105 110
Ser Trp Gln Phe Ser Ile Asp Gly Gln Thr Phe Leu Leu Phe Asp Ser
115 120 125
Glu Lys Arg Met Trp Thr Thr Val His Pro Gly Ala Arg Lys Met Lys
130 135 140
Glu Lys Trp Glu Asn Asp Lys Asp Val Ala Met Ser Phe His Tyr Ile
145 150 155 160
Ser Met Gly Asp Cys Ile Gly Trp Leu Glu Asp Phe Leu Met Gly Met
165 170 175
Asp Ser Thr Leu Glu Pro Ser Ala Gly Ala Pro Leu Ala Met Ser Ser
180 185 190
Gly
<210> 94
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 94
Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val
1 5 10 15
Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly
20 25 30
Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn
35 40 45
Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile
50 55 60
Arg
65
<210> 95
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 95
attacatgcc cccctcccat gagcgtggag cacgccgaca tctgggtgaa gagctatagc 60
ctctacagcc gggagaggta tatctgtaac agcggcttca agaggaaggc cggcaccagc 120
agcctcaccg agtgcgtgct gaataaggct accaacgtgg ctcactggac aacaccctct 180
ttaaagtgca tccgg 195
<210> 96
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 96
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 97
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 97
aactgggtga acgtcatcag cgatttaaag aagatcgaag atttaattca gtccatgcat 60
atcgacgcca ctttatacac agaatccgac gtgcacccct cttgtaaggt gaccgccatg 120
aaatgttttt tactggagct gcaagttatc tctttagaga gcggagacgc tagcatccac 180
gacaccgtgg agaatttaat cattttagcc aataactctt tatccagcaa cggcaacgtg 240
acagagtccg gctgcaagga gtgcgaagag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
caatcctttg tgcacattgt ccagatgttc atcaatacct cc 342
<210> 98
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 98
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 99
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 99
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asn Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
1 5 10 15
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
20 25 30
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
35 40 45
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
50 55 60
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
65 70 75 80
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
85 90 95
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
100 105 110
Thr Ser
<210> 100
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 100
aactgggtga acgtcatcag caatttaaag aagatcgaag atttaattca gtccatgcat 60
atcgacgcca ctttatacac agaatccgac gtgcacccct cttgtaaggt gaccgccatg 120
aaatgttttt tactggagct gcaagttatc tctttagaga gcggagacgc tagcatccac 180
gacaccgtgg agaatttaat cattttagcc aataactctt tatccagcaa cggcaacgtg 240
acagagtccg gctgcaagga gtgcgaagag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 300
caatcctttg tgcacattgt ccagatgttc atcaatacct cc 342
<210> 101
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 101
atgaaatggg tcaccttcat ctctttactg tttttattta gcagcgccta cagc 54
<210> 102
<211> 574
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 102
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
130 135 140
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys
145 150 155 160
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser
165 170 175
Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu
180 185 190
Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu
195 200 205
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp
210 215 220
His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys
245 250 255
Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn
260 265 270
Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser
275 280 285
Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile
290 295 300
Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu
325 330 335
Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro
340 345 350
Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val
355 360 365
Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu
370 375 380
Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys
385 390 395 400
Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe
405 410 415
Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala
420 425 430
Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val
435 440 445
Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asn Trp Val Asn
450 455 460
Val Ile Ser Asn Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His
465 470 475 480
Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys
485 490 495
Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu
500 505 510
Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile
515 520 525
Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly
530 535 540
Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu
545 550 555 560
Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
565 570
<210> 103
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 103
cagatcgtgc tgacccaaag ccccgccatc atgagcgcta gccccggtga gaaggtgacc 60
atgacatgct ccgcttccag ctccgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaaaagcgga 120
accagcccca aaaggtggat ctacgacacc agcaagctgg cctccggagt gcccgctcat 180
ttccggggct ctggatccgg caccagctac tctttaacca tttccggcat ggaagctgaa 240
gacgctgcca cctactattg ccagcaatgg agcagcaacc ccttcacatt cggatctggc 300
accaagctcg aaatcaatcg tggaggaggt ggcagcggcg gcggtggatc cggcggagga 360
ggaagccaag ttcaactcca gcagagcggc gctgaactgg cccggcccgg cgcctccgtc 420
aagatgagct gcaaggcttc cggctataca tttactcgtt acacaatgca ttgggtcaag 480
cagaggcccg gtcaaggttt agagtggatc ggatatatca acccttcccg gggctacacc 540
aactataacc aaaagttcaa ggataaagcc actttaacca ctgacaagag ctcctccacc 600
gcctacatgc agctgtcctc tttaaccagc gaggactccg ctgtttacta ctgcgctagg 660
tattacgacg accactactg tttagactat tggggacaag gtaccacttt aaccgtcagc 720
agctccggca ccaccaatac cgtggccgct tataacctca catggaagag caccaacttc 780
aagacaattc tggaatggga acccaagccc gtcaatcaag tttacaccgt gcagatctcc 840
accaaatccg gagactggaa gagcaagtgc ttctacacaa cagacaccga gtgtgattta 900
accgacgaaa tcgtcaagga cgtcaagcaa acctatctgg ctcgggtctt ttcctacccc 960
gctggcaatg tcgagtccac cggctccgct ggcgagcctc tctacgagaa ttcccccgaa 1020
ttcacccctt atttagagac caatttaggc cagcctacca tccagagctt cgagcaagtt 1080
ggcaccaagg tgaacgtcac cgtcgaggat gaaaggactt tagtgcggcg gaataacaca 1140
tttttatccc tccgggatgt gttcggcaaa gacctcatct acacactgta ctattggaag 1200
tccagctcct ccggcaaaaa gaccgctaag accaacacca acgagttttt aattgacgtg 1260
gacaaaggcg agaactactg cttcagcgtg caagccgtga tcccttctcg taccgtcaac 1320
cggaagagca cagattcccc cgttgagtgc atgggccaag aaaagggcga gttccgggag 1380
aactgggtga acgtcatcag caatttaaag aagatcgaag atttaattca gtccatgcat 1440
atcgacgcca ctttatacac agaatccgac gtgcacccct cttgtaaggt gaccgccatg 1500
aaatgttttt tactggagct gcaagttatc tctttagaga gcggagacgc tagcatccac 1560
gacaccgtgg agaatttaat cattttagcc aataactctt tatccagcaa cggcaacgtg 1620
acagagtccg gctgcaagga gtgcgaagag ctggaggaga agaacatcaa ggagtttctg 1680
caatcctttg tgcacattgt ccagatgttc atcaatacct cc 1722
<210> 104
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser
20 25 30
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
35 40 45
Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp
50 55 60
Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu
85 90 95
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
100 105 110
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu
130 135 140
Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met
145 150 155 160
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp
165 170 175
Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn
180 185 190
Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser
210 215 220
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr
225 230 235 240
Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr
245 250 255
Val Ser Ser Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr
260 265 270
Trp Lys Ser Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro
275 280 285
Val Asn Gln Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp
290 295 300
Lys Ser Lys Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp
305 310 315 320
Glu Ile Val Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser
325 330 335
Tyr Pro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu
340 345 350
Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly
355 360 365
Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val
370 375 380
Thr Val Glu Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu
385 390 395 400
Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr
405 410 415
Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn
420 425 430
Glu Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val
435 440 445
Gln Ala Val Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser
450 455 460
Pro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Asn Trp
465 470 475 480
Val Asn Val Ile Ser Asn Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser
485 490 495
Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser
500 505 510
Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile
515 520 525
Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu
530 535 540
Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu
545 550 555 560
Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu
565 570 575
Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
580 585 590
<210> 105
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 105
atgaagtggg tgaccttcat cagcttatta tttttattca gctccgccta ttcccagatc 60
gtgctgaccc aaagccccgc catcatgagc gctagccccg gtgagaaggt gaccatgaca 120
tgctccgctt ccagctccgt gtcctacatg aactggtatc agcagaaaag cggaaccagc 180
cccaaaaggt ggatctacga caccagcaag ctggcctccg gagtgcccgc tcatttccgg 240
ggctctggat ccggcaccag ctactcttta accatttccg gcatggaagc tgaagacgct 300
gccacctact attgccagca atggagcagc aaccccttca cattcggatc tggcaccaag 360
ctcgaaatca atcgtggagg aggtggcagc ggcggcggtg gatccggcgg aggaggaagc 420
caagttcaac tccagcagag cggcgctgaa ctggcccggc ccggcgcctc cgtcaagatg 480
agctgcaagg cttccggcta tacatttact cgttacacaa tgcattgggt caagcagagg 540
cccggtcaag gtttagagtg gatcggatat atcaaccctt cccggggcta caccaactat 600
aaccaaaagt tcaaggataa agccacttta accactgaca agagctcctc caccgcctac 660
atgcagctgt cctctttaac cagcgaggac tccgctgttt actactgcgc taggtattac 720
gacgaccact actgtttaga ctattgggga caaggtacca ctttaaccgt cagcagctcc 780
ggcaccacca ataccgtggc cgcttataac ctcacatgga agagcaccaa cttcaagaca 840
attctggaat gggaacccaa gcccgtcaat caagtttaca ccgtgcagat ctccaccaaa 900
tccggagact ggaagagcaa gtgcttctac acaacagaca ccgagtgtga tttaaccgac 960
gaaatcgtca aggacgtcaa gcaaacctat ctggctcggg tcttttccta ccccgctggc 1020
aatgtcgagt ccaccggctc cgctggcgag cctctctacg agaattcccc cgaattcacc 1080
ccttatttag agaccaattt aggccagcct accatccaga gcttcgagca agttggcacc 1140
aaggtgaacg tcaccgtcga ggatgaaagg actttagtgc ggcggaataa cacattttta 1200
tccctccggg atgtgttcgg caaagacctc atctacacac tgtactattg gaagtccagc 1260
tcctccggca aaaagaccgc taagaccaac accaacgagt ttttaattga cgtggacaaa 1320
ggcgagaact actgcttcag cgtgcaagcc gtgatccctt ctcgtaccgt caaccggaag 1380
agcacagatt cccccgttga gtgcatgggc caagaaaagg gcgagttccg ggagaactgg 1440
gtgaacgtca tcagcaattt aaagaagatc gaagatttaa ttcagtccat gcatatcgac 1500
gccactttat acacagaatc cgacgtgcac ccctcttgta aggtgaccgc catgaaatgt 1560
tttttactgg agctgcaagt tatctcttta gagagcggag acgctagcat ccacgacacc 1620
gtggagaatt taatcatttt agccaataac tctttatcca gcaacggcaa cgtgacagag 1680
tccggctgca aggagtgcga agagctggag gagaagaaca tcaaggagtt tctgcaatcc 1740
tttgtgcaca ttgtccagat gttcatcaat acctcc 1776
<210> 106
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val
20 25 30
Ile Gln Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Ser Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
50 55 60
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu
130 135 140
Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser
145 150 155 160
Ser Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu
165 170 175
Cys Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
195 200 205
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
210 215 220
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg Ile Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser
245 250 255
Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys
260 265 270
Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn
275 280 285
Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
290 295 300
<210> 107
<211> 903
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 107
gtgcagctgc agcagtccgg acccgaactg gtcaagcccg gtgcctccgt gaaaatgtct 60
tgtaaggctt ctggctacac ctttacctcc tacgtcatcc aatgggtgaa gcagaagccc 120
ggtcaaggtc tcgagtggat cggcagcatc aatccctaca acgattacac caagtataac 180
gaaaagttta agggcaaggc cactctgaca agcgacaaga gctccattac cgcctacatg 240
gagttttcct ctttaacttc tgaggactcc gctttatact attgcgctcg ttggggcgat 300
ggcaattatt ggggccgggg aactacttta acagtgagct ccggcggcgg cggaagcgga 360
ggtggaggat ctggcggtgg aggcagcgac atcgagatga cacagtcccc cgctatcatg 420
agcgcctctt taggagaacg tgtgaccatg acttgtacag cttcctccag cgtgagcagc 480
tcctatttcc actggtacca gcagaaaccc ggctcctccc ctaaactgtg tatctactcc 540
acaagcaatt tagctagcgg cgtgcctcct cgttttagcg gctccggcag cacctcttac 600
tctttaacca ttagctctat ggaggccgaa gatgccgcca catacttttg ccatcagtac 660
caccggtccc ctacctttgg cggaggcaca aagctggaga ccaagcggat tacatgcccc 720
cctcccatga gcgtggagca cgccgacatc tgggtgaaga gctatagcct ctacagccgg 780
gagaggtata tctgtaacag cggcttcaag aggaaggccg gcaccagcag cctcaccgag 840
tgcgtgctga ataaggctac caacgtggct cactggacaa caccctcttt aaagtgcatc 900
cgg 903
<210> 108
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多肽
<400> 108
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
20 25 30
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser
35 40 45
Tyr Val Ile Gln Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
50 55 60
Ile Gly Ser Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys
65 70 75 80
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ile Thr Ala
85 90 95
Tyr Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr
100 105 110
Cys Ala Arg Trp Gly Asp Gly Asn Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Thr Leu
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala
145 150 155 160
Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val
165 170 175
Ser Ser Ser Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro
180 185 190
Lys Leu Cys Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro
195 200 205
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser
210 215 220
Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Tyr His Arg
225 230 235 240
Ser Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Thr Lys Arg Ile Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser
260 265 270
Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys
275 280 285
Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala
290 295 300
Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg
305 310 315
<210> 109
<211> 957
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 109
atgaaatggg tcaccttcat ctctttactg tttttattta gcagcgccta cagcgtgcag 60
ctgcagcagt ccggacccga actggtcaag cccggtgcct ccgtgaaaat gtcttgtaag 120
gcttctggct acacctttac ctcctacgtc atccaatggg tgaagcagaa gcccggtcaa 180
ggtctcgagt ggatcggcag catcaatccc tacaacgatt acaccaagta taacgaaaag 240
tttaagggca aggccactct gacaagcgac aagagctcca ttaccgccta catggagttt 300
tcctctttaa cttctgagga ctccgcttta tactattgcg ctcgttgggg cgatggcaat 360
tattggggcc ggggaactac tttaacagtg agctccggcg gcggcggaag cggaggtgga 420
ggatctggcg gtggaggcag cgacatcgag atgacacagt cccccgctat catgagcgcc 480
tctttaggag aacgtgtgac catgacttgt acagcttcct ccagcgtgag cagctcctat 540
ttccactggt accagcagaa acccggctcc tcccctaaac tgtgtatcta ctccacaagc 600
aatttagcta gcggcgtgcc tcctcgtttt agcggctccg gcagcacctc ttactcttta 660
accattagct ctatggaggc cgaagatgcc gccacatact tttgccatca gtaccaccgg 720
tcccctacct ttggcggagg cacaaagctg gagaccaagc ggattacatg cccccctccc 780
atgagcgtgg agcacgccga catctgggtg aagagctata gcctctacag ccgggagagg 840
tatatctgta acagcggctt caagaggaag gccggcacca gcagcctcac cgagtgcgtg 900
ctgaataagg ctaccaacgt ggctcactgg acaacaccct ctttaaagtg catccgg 957
<210> 110
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 110
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 111
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 112
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 接头
<400> 112
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 113
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码信号肽的核酸
<400> 113
atgaagtggg tgaccttcat cagcttatta tttttattca gctccgccta ttcc 54
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码抗CD3轻链可变区的核酸
<400> 114
cagatcgtgc tgacccaaag ccccgccatc atgagcgcta gccccggtga gaaggtgacc 60
atgacatgct ccgcttccag ctccgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaaaagcgga 120
accagcccca aaaggtggat ctacgacacc agcaagctgg cctccggagt gcccgctcat 180
ttccggggct ctggatccgg caccagctac tctttaacca tttccggcat ggaagctgaa 240
gacgctgcca cctactattg ccagcaatgg agcagcaacc ccttcacatt cggatctggc 300
accaagctcg aaatcaatcg t 321
<210> 115
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码接头的核酸
<400> 115
ggaggaggtg gcagcggcgg cggtggatcc ggcggaggag gaagc 45
<210> 116
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码抗CD3重链可变区的核酸
<400> 116
caagttcaac tccagcagag cggcgctgaa ctggcccggc ccggcgcctc cgtcaagatg 60
agctgcaagg cttccggcta tacatttact cgttacacaa tgcattgggt caagcagagg 120
cccggtcaag gtttagagtg gatcggatat atcaaccctt cccggggcta caccaactat 180
aaccaaaagt tcaaggataa agccacttta accactgaca agagctcctc caccgcctac 240
atgcagctgt cctctttaac cagcgaggac tccgctgttt actactgcgc taggtattac 300
gacgaccact actgtttaga ctattgggga caaggtacca ctttaaccgt cagcagc 357
<210> 117
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码人组织因子219形式的核酸
<400> 117
tccggcacca ccaataccgt ggccgcttat aacctcacat ggaagagcac caacttcaag 60
acaattctgg aatgggaacc caagcccgtc aatcaagttt acaccgtgca gatctccacc 120
aaatccggag actggaagag caagtgcttc tacacaacag acaccgagtg tgatttaacc 180
gacgaaatcg tcaaggacgt caagcaaacc tatctggctc gggtcttttc ctaccccgct 240
ggcaatgtcg agtccaccgg ctccgctggc gagcctctct acgagaattc ccccgaattc 300
accccttatt tagagaccaa tttaggccag cctaccatcc agagcttcga gcaagttggc 360
accaaggtga acgtcaccgt cgaggatgaa aggactttag tgcggcggaa taacacattt 420
ttatccctcc gggatgtgtt cggcaaagac ctcatctaca cactgtacta ttggaagtcc 480
agctcctccg gcaaaaagac cgctaagacc aacaccaacg agtttttaat tgacgtggac 540
aaaggcgaga actactgctt cagcgtgcaa gccgtgatcc cttctcgtac cgtcaaccgg 600
aagagcacag attcccccgt tgagtgcatg ggccaagaaa agggcgagtt ccgggag 657
<210> 118
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码抗CD28轻链可变区的核酸
<400> 118
gtccagctgc agcagagcgg acccgaactc gtgaaacccg gtgcttccgt gaaaatgtct 60
tgtaaggcca gcggatacac cttcacctcc tatgtgatcc agtgggtcaa acagaagccc 120
ggacaaggtc tcgagtggat cggcagcatc aacccttaca acgactatac caaatacaac 180
gagaagttta agggaaaggc tactttaacc tccgacaaaa gctccatcac agcctacatg 240
gagttcagct ctttaacatc cgaggacagc gctctgtact attgcgcccg gtggggcgac 300
ggcaattact ggggacgggg cacaacactg accgtgagca gc 342
<210> 119
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码接头的核酸
<400> 119
ggaggcggag gctccggcgg aggcggatct ggcggtggcg gctcc 45
<210> 120
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码抗CD28重链可变区的核酸
<400> 120
gacatcgaga tgacccagtc ccccgctatc atgtccgcct ctttaggcga gcgggtcaca 60
atgacttgta cagcctcctc cagcgtctcc tcctcctact tccattggta ccaacagaaa 120
cccggaagct cccctaaact gtgcatctac agcaccagca atctcgccag cggcgtgccc 180
cctaggtttt ccggaagcgg aagcaccagc tactctttaa ccatctcctc catggaggct 240
gaggatgccg ccacctactt ttgtcaccag taccaccggt cccccacctt cggaggcggc 300
accaaactgg agacaaagag g 321
<210> 121
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码信号序列的核酸
<400> 121
atgaagtggg tgaccttcat cagcctgctg ttcctgttct ccagcgccta ctcc 54
<210> 122
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 122
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 123
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（artificial sequence）
<220>
<223> 编码接头的核酸
<400> 123
ggcggcggcg gaagcggagg tggaggatct ggcggtggag gcagc 45

Claims (367)

1.一种刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，其中所述方法包括：
在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：
CD3/CD28结合剂；以及
单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2的受体结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
7.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
9.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域包括相同的氨基酸序列。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域包括可溶性IL-2。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可溶性IL-2是人可溶性IL-2。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域各自包括与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域各自包括与SEQ ID NO:1至少90％相同的序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域各自包括SEQ ID NO:1的序列。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少80％相同的序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少90％相同的序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。
20.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
21.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
22.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
24.根据权利要求1到23所述的方法，其中所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:3至少80％相同的序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:3至少90％相同的序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:3的序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:4至少80％相同的序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:4至少90％相同的序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:4的序列。
31.根据权利要求1到30中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述单链嵌合多肽。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述单链嵌合多肽。
33.根据权利要求1到32中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述液体培养基包括比率为约1:1到约6:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述液体培养基包括比率为约3:1到约5:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。
36.根据权利要求1到32中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
41.根据权利要求36到40中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
42.根据权利要求36到40中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
43.根据权利要求36到42中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
44.根据权利要求36到42中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
45.根据权利要求36到44中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
49.根据权利要求36到48中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。
53.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。
57.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
58.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
59.根据权利要求36到52中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
60.根据权利要求36到59中任一项所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
61.根据权利要求36到60所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽不引发血液凝固。
62.根据权利要求36所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。
68.根据权利要求36到67中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述另外的单链嵌合多肽。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述另外的单链嵌合多肽。
70.根据权利要求1到32中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：
(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；以及
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及
(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及
(ii)第二靶标结合结构域，
其中：
所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且
其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
75.根据权利要求70到74中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
76.根据权利要求70到74中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
77.根据权利要求70到76中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
78.根据权利要求70到76中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
79.根据权利要求70到78中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
83.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。
87.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
88.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
89.根据权利要求70到82中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
90.根据权利要求70到89中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
91.根据权利要求70所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同的序列。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少90％相同的序列。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:102的序列。
94.根据权利要求70所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同的序列。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少90％相同的序列。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:104的序列。
97.根据权利要求70到96中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。
101.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同的序列。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少90％相同的序列。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:106的序列。
104.根据权利要求70所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少80％相同的序列。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少90％相同的序列。
106.根据权利要求105所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:108的序列。
107.根据权利要求70到106所述的方法，其中所述多链嵌合多肽不引发血液凝固。
108.根据权利要求70到107中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述多链嵌合多肽。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述多链嵌合多肽。
110.根据权利要求1到109中任一项所述的方法，其中所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素(rapamycin)。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。
114.根据权利要求1到109中任一项所述的方法，其中所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。
115.根据权利要求1到114中任一项所述的方法，其进一步包括：
在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述单链嵌合多肽。
116.根据权利要求115所述的方法，其中进行所述单链嵌合多肽的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述单链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM。
117.根据权利要求116所述的方法，其中进行所述单链嵌合多肽的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述单链嵌合多肽的浓度为约50nM到约150nM。
118.根据权利要求1到117中任一项所述的方法，其进一步包括：
在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述CD3/CD28结合剂。
119.根据权利要求1到118中任一项所述的方法，其中所述时间段为约7天到约56天。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述时间段为约15天到约25天。
121.根据权利要求1到120中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
122.根据权利要求1到120中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。
124.根据权利要求1到123中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。
125.根据权利要求1到124中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。
126.根据权利要求1到124中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。
127.根据权利要求1到126中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
128.一种Treg细胞群，其通过根据权利要求1到127中任一项所述的方法产生。
129.一种组合物，其包括根据权利要求128所述的Treg细胞群以及药学上可接受的载体。
130.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求129所述的组合物。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病(Parkinson's disease)、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。
133.根据权利要求131所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病(Crohn's disease)、多发性硬化症、格林巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、牛皮癣、格雷夫氏病(Grave's disease)、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
134.一种试剂盒，其包括：
(i)CD3/CD28结合剂；
(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与IL-2的受体结合；以及
(iii)mTOR抑制剂。
135.根据权利要求134所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
136.根据权利要求134或135所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。
137.根据权利要求134或135所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是另外的单链嵌合多肽，所述另外的单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：
所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。
138.根据权利要求137所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
139.根据权利要求134或135所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：
(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；以及
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及
(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及
(ii)第二靶标结合结构域，
其中：
所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且
其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
141.一种刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，其中所述方法包括：
在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：
IL-2受体活化剂；以及
单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
146.根据权利要求141到145中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
147.根据权利要求141到145中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
148.根据权利要求141到147中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
149.根据权利要求141到147中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
150.根据权利要求141到149中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
154.根据权利要求141到153中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。
156.根据权利要求155所述的方法，其中所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。
158.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
159.根据权利要求158所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少80％相同的序列。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少90％相同的序列。
161.根据权利要求160所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:2的序列。
162.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
163.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
164.根据权利要求141到157中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
165.根据权利要求141到164中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
166.根据权利要求141到165所述的方法，其中所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。
167.根据权利要求141所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。
171.根据权利要求170所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。
173.根据权利要求141到172中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述单链嵌合多肽。
174.根据权利要求173所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述单链嵌合多肽。
175.根据权利要求141到174中任一项所述的方法，其中所述IL-2受体活化剂是可溶性IL-2。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述可溶性IL-2是人可溶性IL-2。
177.根据权利要求176所述的方法，其中所述人可溶性IL-2包括与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述人可溶性IL-2包括与SEQ ID NO:1至少90％相同的序列。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述人可溶性IL-2包括SEQ ID NO:1的序列。
180.根据权利要求176到179所述的方法，其中所述液体培养基包括约100IU/mL到约800IU/mL的所述人可溶性IL-2。
181.根据权利要求180所述的方法，其中所述液体培养基包括约400IU/mL到约600IU/mL的所述人可溶性IL-2。
182.根据权利要求141到181中任一项所述的方法，其中所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。
184.根据权利要求182或183所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。
185.根据权利要求184所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。
186.根据权利要求141到181中任一项所述的方法，其中所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。
187.根据权利要求141到186中任一项所述的方法，其进一步包括：
在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述IL-2受体活化剂。
188.根据权利要求187所述的方法，其中进行所述IL-2受体活化剂的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述IL-2受体活化剂的浓度为约10nM到约1000nM。
189.根据权利要求188所述的方法，其中进行所述IL-2受体活化剂的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述IL-2受体活化剂的浓度为约50nM到约150nM。
190.根据权利要求141到189中任一项所述的方法，其进一步包括
在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述单链嵌合多肽。
191.根据权利要求141到190中任一项所述的方法，其中所述时间段为约7天到约56天。
192.根据权利要求191所述的方法，其中所述权利要求的时间段为约15天到约25天。
193.根据权利要求141到192中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
194.根据权利要求141到192中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
195.根据权利要求193或194所述的方法，其中所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。
196.根据权利要求141到195中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。
197.根据权利要求141到196中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。
198.根据权利要求141到196中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。
199.根据权利要求141到198中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
200.一种Treg细胞群，其通过根据权利要求141到199中任一项所述的方法产生。
201.一种组合物，其包括根据权利要求200所述的Treg细胞群以及药学上可接受的载体。
202.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求201所述的组合物。
203.根据权利要求202所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。
204.根据权利要求203所述的方法，其中所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。
205.根据权利要求203所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
206.一种试剂盒，其包括：
(i)白细胞介素-2受体活化剂；
(ii)单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：
所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合；以及
(iii)mTOR抑制剂。
207.根据权利要求206所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
208.一种刺激或增加Treg细胞的增殖的方法，其中所述方法包括：
在一定时间段内在液体培养基中培养Treg细胞，其中在所述时间段开始时，所述液体培养基包括：
CD3/CD28结合剂；以及
多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：
(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；以及
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及
(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及
(ii)第二靶标结合结构域，
其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合。
209.根据权利要求208所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
210.根据权利要求209所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
211.根据权利要求210所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
212.根据权利要求211所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
213.根据权利要求208到212中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
214.根据权利要求208到212中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一嵌合多肽中的所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
215.根据权利要求208到214中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域和所述一对亲和结构域中的所述第一结构域在所述第一嵌合多肽中彼此直接邻接。
216.根据权利要求208到214中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一嵌合多肽中的所述可溶性组织因子结构域与所述一对亲和结构域中的所述第一结构域之间的接头序列。
217.根据权利要求208到216中任一项所述的方法，其中所述一对亲和结构域中的所述第二结构域和所述第二靶标结合结构域在所述第二嵌合多肽中彼此直接邻接。
218.根据权利要求208到216中任一项所述的方法，其中第二嵌合多肽进一步包括介于所述第二嵌合多肽中的所述一对亲和结构域中的所述第二结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
219.根据权利要求208到218中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与相同的抗原特异性结合。
220.根据权利要求208到218中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域与不同的抗原特异性结合。
221.根据权利要求208到220中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者是抗原结合结构域。
222.根据权利要求208到221中任一项所述的多链嵌合多肽，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者与选自由以下组成的组的靶标特异性结合：CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-钙粘蛋白、CEACAM5、UL16-结合蛋白、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受体II(TGF-βRII)的配体、TGF-βRIII的配体、DNAM-1的配体、NKp46的配体、NKp44的配体、NKG2D的配体、NKp30的配体、scMHCI的配体、scMHCII的配体、scTCR的配体、IL-1的受体、IL-2的受体、IL-3的受体、IL-7的受体、IL-8的受体、IL-10的受体、IL-12的受体、IL-15的受体、IL-17的受体、IL-18的受体、IL-21的受体、PDGF-DD的受体、干细胞因子(SCF)的受体、干细胞样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)的受体、MICA的受体、MICB的受体、ULP16结合蛋白的受体、CD155的受体、CD122的受体以及CD28的受体。
223.根据权利要求208到220中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者是可溶性白细胞介素或细胞因子蛋白。
224.根据权利要求223所述的方法，其中所述可溶性白细胞介素、细胞因子或配体蛋白选自由以下组成的组：IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF和FLT3L。
225.根据权利要求208到220中任一项所述的方法，其中所述第一靶标结合结构域和所述第二靶标结合结构域中的一者或两者是可溶性白细胞介素或细胞因子受体。
226.根据权利要求225所述的方法，其中所述可溶性受体是可溶性TGF-β受体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155或可溶性CD28。
227.根据权利要求208到226中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽进一步包括一个或多个另外的靶标结合结构域。
228.根据权利要求208到227中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽进一步包括一个或多个另外的靶标结合结构域。
229.根据权利要求208到228中任一项所述的方法，其中所述一对亲和结构域是来自人IL-15受体的α链(IL15Rα)的sushi结构域和可溶性IL-15。
230.根据权利要求229所述的方法，其中所述可溶性IL-15具有D8N或D8A氨基酸取代。
231.根据权利要求208到228中任一项所述的方法，其中所述一对亲和结构域选自由以下组成的组：芽胞杆菌RNA酶和芽胞杆菌RNA酶抑制剂、PKA和AKAP、基于突变核糖核酸酶I片段的衔接子/对接标签模块以及基于蛋白质突触融合蛋白、突触结合蛋白、突触泡蛋白和SNAP25的相互作用的SNARE模块。
232.根据权利要求208到231中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
233.根据权利要求232所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少80％相同的序列。
234.根据权利要求233所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ IDNO:2至少90％相同的序列。
235.根据权利要求234所述的方法，其中所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ IDNO:2的序列。
236.根据权利要求208到231中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
237.根据权利要求208到231中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
238.根据权利要求208到231中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
239.根据权利要求208到238中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
240.根据权利要求208到239所述的方法，其中所述多链嵌合多肽不引发血液凝固。
241.根据权利要求208到240中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。
242.根据权利要求241所述的方法，其中所述液体培养基包括比率为约1:1到约6:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。
243.根据权利要求242所述的方法，其中所述液体培养基包括比率为约3:1到约5:1珠粒/细胞的所述抗CD3/抗CD28珠粒。
244.根据权利要求208到240中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中：
所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。
245.根据权利要求244所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
246.根据权利要求245所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
247.根据权利要求246所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
248.根据权利要求247所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
249.根据权利要求244到248中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
250.根据权利要求244到248中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
251.根据权利要求244到250中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
252.根据权利要求244到250中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
253.根据权利要求244到252中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。
254.根据权利要求253所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。
255.根据权利要求254所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。
256.根据权利要求255所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
257.根据权利要求244到256中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。
258.根据权利要求257所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。
259.根据权利要求258所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。
260.根据权利要求259所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。
261.根据权利要求244到260中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
262.根据权利要求261所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。
263.根据权利要求262所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。
264.根据权利要求263所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。
265.根据权利要求244到260中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
266.根据权利要求244到260中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
267.根据权利要求244到260中任一项所述的方法，其中所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
268.根据权利要求244到267中任一项所述的方法，其中所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
269.根据权利要求244到268所述的方法，其中所述单链嵌合多肽不引发血液凝固。
270.根据权利要求244所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少80％相同的序列。
271.根据权利要求270所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:7至少90％相同的序列。
272.根据权利要求271所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:7的序列。
273.根据权利要求272所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少80％相同的序列。
274.根据权利要求273所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括与SEQ ID NO:8至少90％相同的序列。
275.根据权利要求274所述的方法，其中所述单链嵌合多肽包括SEQ ID NO:8的序列。
276.根据权利要求244到275中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述单链嵌合多肽。
277.根据权利要求276所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述单链嵌合多肽。
278.根据权利要求208到240中任一项所述的方法，其中所述CD3/CD28结合剂是另外的多链嵌合多肽，所述另外的多链嵌合多肽包括：
(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；以及
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及
(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及
(ii)第二靶标结合结构域，
其中：
所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且
其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
279.根据权利要求278所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
280.根据权利要求279所述的方法，其中所述IgG1抗体构建体包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:66、67或74和68的CDR，所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:69、70和71的CDR。
281.根据权利要求280所述的方法，其中所述重链可变结构域包括与SEQ ID NO:72至少90％相同的序列，并且所述轻链可变结构域包括与SEQ ID NO:73至少90％相同的序列。
282.根据权利要求281所述的方法，其中所述重链可变结构域包括SEQ ID NO:72，并且所述轻链可变结构域包括SEQ ID NO:73。
283.根据权利要求278到282中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域和所述另外的多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域彼此直接邻接。
284.根据权利要求278到282中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽进一步包括介于所述第一靶标结合结构域与所述可溶性组织因子结构域之间的接头序列。
285.根据权利要求278到284中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域和所述第二靶标结合结构域彼此直接邻接。
286.根据权利要求278到284中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽进一步包括介于所述可溶性组织因子结构域与所述第二靶标结合结构域之间的接头序列。
287.根据权利要求278到286中任一项所述的方法，其中所述CD3是人CD3。
288.根据权利要求287所述的方法，其中所述第一嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少80％相同的序列。
289.根据权利要求288所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:5至少90％相同的序列。
290.根据权利要求289所述的方法，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域包括SEQ ID NO:5的序列。
291.根据权利要求278到290中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域是可溶性人组织因子结构域。
292.根据权利要求291所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少80％相同的序列。
293.根据权利要求292所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括与SEQ ID NO:2至少90％相同的序列。
294.根据权利要求293所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性人组织因子结构域包括SEQ ID NO:2的序列。
295.根据权利要求278到290中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括来自野生型可溶性人组织因子的序列或由来自野生型可溶性人组织因子的序列组成。
296.根据权利要求278到290中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不包括以下中的任一项：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
297.根据权利要求278到290中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域包括以下中的一者或多者：
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置20的氨基酸位置处的赖氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置22的氨基酸位置处的异亮氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置45的氨基酸位置处的色氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置58的氨基酸位置处的天冬氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置94的氨基酸位置处的酪氨酸；
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置135的氨基酸位置处的精氨酸；以及
在对应于成熟野生型人组织因子蛋白的氨基酸位置140的氨基酸位置处的苯丙氨酸。
298.根据权利要求278到297中任一项所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域不引发血液凝固。
299.根据权利要求278所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少80％相同的序列。
300.根据权利要求299所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:102至少90％相同的序列。
301.根据权利要求300所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:102的序列。
302.根据权利要求278所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少80％相同的序列。
303.根据权利要求302所述的方法，其中所述另外的多嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括与SEQ ID NO:104至少90％相同的序列。
304.根据权利要求303所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第一嵌合多肽包括SEQ ID NO:104的序列。
305.根据权利要求278到304中任一项所述的方法，其中所述CD28是人CD28。
306.根据权利要求305所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少80％相同的序列。
307.根据权利要求306所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括与SEQ ID NO:6至少90％相同的序列。
308.根据权利要求307所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域包括SEQ ID NO:6的序列。
309.根据权利要求278所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少80％相同的序列。
310.根据权利要求309所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:106至少90％相同的序列。
311.根据权利要求310所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:106的序列。
312.根据权利要求311所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少80％相同的序列。
313.根据权利要求312所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括与SEQ ID NO:108至少90％相同的序列。
314.根据权利要求313所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽的所述第二嵌合多肽包括SEQ ID NO:108的序列。
315.根据权利要求278到314所述的方法，其中所述另外的多链嵌合多肽不引发血液凝固。
316.根据权利要求278到315中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约1000nM的所述另外的多链嵌合多肽。
317.根据权利要求316所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约300nM的所述另外的多链嵌合多肽。
318.根据权利要求208到317中任一项所述的方法，其中所述液体培养基进一步包括mTOR抑制剂。
319.根据权利要求318所述的方法，其中所述mTOR抑制剂是雷帕霉素。
320.根据权利要求318或319所述的方法，其中所述液体培养基包括约10nM到约500nM的所述mTOR抑制剂。
321.根据权利要求320所述的方法，其中所述液体培养基包括约50nM到约150nM的所述mTOR抑制剂。
322.根据权利要求208到317中任一项所述的方法，其中所述液体培养基不包括mTOR抑制剂。
323.根据权利要求208到322中任一项所述的方法，其进一步包括：
在所述时间段开始之后每36小时到约60小时之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述多链嵌合多肽。
324.根据权利要求323所述的方法，其中进行所述多链嵌合多肽的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述多链嵌合多肽的浓度为约10nM到约500nM。
325.根据权利要求324所述的方法，其中进行所述多链嵌合多肽的所述周期性添加以导致所述液体培养基中的所述多链嵌合多肽的浓度为约50nM到约150nM。
326.根据权利要求208到325中任一项所述的方法，其进一步包括：
在所述时间段开始之后每约6天到约8天之后，周期性地向所述液体培养基中添加所述CD3/CD28结合剂。
327.根据权利要求208到326中任一项所述的方法，其中所述时间段为约7天到约56天。
328.根据权利要求327所述的方法，其中所述权利要求的时间段为约15天到约25天。
329.根据权利要求208到328中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之前从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
330.根据权利要求208到328中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述培养步骤之后从获得自受试者的样品中分离所述Treg细胞的步骤。
331.根据权利要求329或330所述的方法，其中所述分离包括使用荧光分类的细胞分选。
332.根据权利要求208到331中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是从外周血或脐带血中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞。
333.根据权利要求208到332中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。
334.根据权利要求208到332中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。
335.根据权利要求208到334中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
336.一种Treg细胞群，其通过根据权利要求208到335中任一项所述的方法产生。
337.一种组合物，其包括根据权利要求336所述的Treg细胞群以及药学上可接受的载体。
338.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求337所述的组合物。
339.根据权利要求338所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。
340.根据权利要求339所述的方法，其中所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。
341.根据权利要求339所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
342.一种试剂盒，其包括：
CD3/CD28结合剂；
多链嵌合多肽，所述多链嵌合多肽包括：
(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；以及
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；
(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及
(ii)第二靶标结合结构域，
其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；以及
mTOR抑制剂。
343.根据权利要求342所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
344.根据权利要求342或343所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是抗CD3/抗CD28珠粒。
345.根据权利要求342或343所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是单链嵌合多肽，所述单链嵌合多肽包括第一靶标结合结构域、可溶性组织因子结构域和第二靶标结合结构域，其中所述另外的单链嵌合多肽的所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述另外的单链嵌合多肽的所述第二靶标结合结构域与CD28结合。
346.根据权利要求345所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述单链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
347.根据权利要求342或343所述的试剂盒，其中所述CD3/CD28结合剂是另外的多链嵌合多肽，所述另外的多链嵌合多肽包括：
(a)第一嵌合多肽，所述第一嵌合多肽包括：
(i)第一靶标结合结构域；
(ii)可溶性组织因子结构域；以及
(iii)一对亲和结构域中的第一结构域；以及
(b)第二嵌合多肽，所述第二嵌合多肽包括：
(i)一对亲和结构域中的第二结构域；以及
(ii)第二靶标结合结构域，
其中：
所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽通过所述一对亲和结构域中的所述第一结构域和所述第二结构域的结合而缔合；并且
其中所述第一靶标结合结构域与CD3结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD28结合，或者所述第一靶标结合结构域与CD28结合，并且所述第二靶标结合结构域与CD3结合。
348.根据权利要求347所述的方法，其中所述液体培养基进一步包含IgG1抗体构建体，所述IgG1抗体构建体包括与所述另外的多链嵌合多肽的所述可溶性组织因子结构域特异性结合的至少一个抗原结合结构域。
349.一种从获得自受试者的样品中分离Treg细胞的方法，其中所述方法包括基于所述Treg细胞的CD39表达将所述Treg细胞从所述样品中分离，由此分离所述Treg细胞。
350.根据权利要求349所述的方法，其中所述方法包括：
通过在分离Treg细胞之前在液体培养基中培养所述样品来刺激或增加所述Treg细胞的增殖。
351.根据权利要求349或350所述的方法，其中所述方法包括：
在允许抗体或配体与表达CD39的Treg细胞结合的条件下，将所述样品与能够结合CD39的所述抗体或配体混合；
将与所述抗体或配体结合的所述Treg细胞与所述样品中的其它组分分离，由此分离所述Treg细胞。
352.根据权利要求351所述的方法，其中：
所述抗体是小鼠、人源化或人抗体或其抗原结合片段；和/或
所述抗体或配体用生物素、亲和素、链霉亲和素或荧光染料中的至少一种标记，或者与颗粒、珠粒、树脂或固体支持物结合。
353.根据权利要求351所述的方法，其中分离包括使用流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、离心或基于柱、板、颗粒或珠粒的方法。
354.根据权利要求349所述的方法，其中所述方法进一步包括：
在允许所述抗体或所述配体与所述Treg细胞结合的条件下，将所述样品与能够结合CD39的生物素化抗体或配体混合；
使用链霉亲和素包被的磁性颗粒捕获与所述生物素化抗体或配体结合的所述Treg细胞；
使用磁铁分离所述结合磁性颗粒的Treg细胞；
洗涤所述结合磁铁颗粒的Treg细胞，以去除所述样品中的其它组分；以及
将所述结合磁性颗粒的Treg细胞从所述磁铁中释放到溶液中，由此分离所述Treg细胞。
355.根据权利要求349到354中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是从样品中分离的自体Treg细胞、单倍同一性Treg细胞或同种异体Treg细胞，所述样品包括新鲜或冷冻的外周血、脐带血、外周血单核细胞、淋巴细胞、CD4+T细胞或Treg细胞。
356.根据权利要求349到355中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+Foxp3+细胞。
357.根据权利要求349到356中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞是CD4+CD25+CD127dim细胞。
358.根据权利要求349到357中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞包括嵌合抗原受体。
359.根据权利要求349到358中任一项所述的方法，其中所述Treg细胞在体外和在体内是免疫抑制性的。
360.一种分离的Treg细胞群，其通过根据权利要求349到359中任一项所述的方法产生。
361.一种扩增根据权利要求360所述的分离的Treg细胞群的方法，所述方法包括在允许所述分离的Treg细胞的增殖的条件下，培养所述分离的Treg细胞群。
362.根据权利要求360所述的分离的Treg细胞群，其中所述分离的Treg细胞群大于70％CD39+细胞。
363.一种组合物，其包括根据权利要求360或362所述的分离的Treg细胞群以及药学上可接受的载体。
364.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求363所述的组合物。
365.根据权利要求364所述的方法，其中所述受试者已被鉴定或诊断为患有与老化相关的疾病或炎性疾病。
366.根据权利要求365所述的方法，其中所述与老化相关的疾病选自由以下组成的组：阿尔茨海默氏病、动脉瘤、囊性纤维化、胰腺炎纤维化、青光眼、高血压、特发性肺纤维化、炎性肠病、椎间盘退变、黄斑变性、骨关节炎、2型糖尿病、脂肪萎缩、脂肪营养不良、动脉粥样硬化、白内障、COPD、特发性肺纤维化、肾移植失败、肝纤维化、骨量损失、心肌梗死、肌肉减少症、伤口愈合、脱发、心肌细胞肥大、骨关节炎、帕金森氏病、与年龄相关的肺组织弹性丧失、黄斑变性、恶病质、肾小球硬化症、肝硬化、NAFLD、骨质疏松症、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风、痴呆症、血管疾病、感染易感性、慢性炎症和肾功能障碍。
367.根据权利要求365所述的方法，其中所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、炎性肠病、红斑狼疮、狼疮性肾炎、糖尿病肾病、CNS损伤、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、克罗恩氏病、多发性硬化症、格林巴利综合征、牛皮癣、格雷夫氏病、溃疡性结肠炎、非酒精性脂肪性肝炎和情绪障碍。
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