JP2023519107A - 制御性t細胞を活性化する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、2020年2月26日に出願された米国仮特許出願第62/981,944号および2020年2月11日に出願された米国仮特許出願第62/975,141号に対する優先権を主張する。
本開示は、バイオテクノロジーおよび免疫学の分野に関し、より具体的には、Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法に関する。
約46kDaの分子量を有する263アミノ酸内在性膜糖タンパク質であり、かつ外因性血液凝固経路のトリガータンパク質である組織因子(TF)は、インビボでの凝固の主要な開始因子である。通常、循環血液と接触していない組織因子は、循環凝固セリンプロテアーゼ因子への曝露時に凝固カスケードを開始する。血管損傷は、組織因子を発現する内皮下細胞を露出させ、既存の血漿因子VIIa(FVIIa)とのカルシウム依存性高親和性複合体の形成をもたらす。セリンプロテアーゼFVIIaの組織因子への結合は、FXからFXaおよびFIXからFIXaへの迅速な切断を促進する。その後、結果として生じたFXaおよび活性膜表面のタンパク質分解活性は、少量のプロトロンビンを非効率的にトロンビンに変換する。FXaによって生成されたトロンビンは、血小板活性化を開始し、微量のプロ補因子である第V因子(FV)および第VIII因子(FVIII)を活性化して、活性補因子である第Va因子(FVa)および第VIIIa因子(FVIIIa)になる。FIXaは、血小板表面でFVIIIaと複合体を形成して、内因性テナーゼ複合体を形成し、これにより、FXaが急速に生成される。FXaは、FVaと複合体を形成して、活性化された血小板表面にプロトロンビナーゼ複合体を形成し、これにより、プロトロンビンがトロンビンに迅速に切断される。
Treg細胞を投与された患者において優れた安全性プロファイルが示されている(Esensten et al.,J Allergy Clin Immunol 142(6):1710-1718,2018)。初期臨床研究では、Treg細胞を使用した急性および慢性移植片対宿主病(Brunstein et al.,Blood 117(3):1061-1070,2011、Di Ianni et al.,Blood 117(14):3921-3928,2011、Martelli et al.,Blood 124(4):638-644,2014、Theil et al.,Cytotherapy 17(4):473-486,2015、Brunstein et al.,Blood 127(8):1044-1051,2016)、自己免疫疾患、および神経変性疾患(Thonhoff et al.,Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm 5(4):e465,2018、Dall’Era et al.,Arthritis Rheumatol 71(3):431-440,2019)の予防および治療において有望な結果が示された。
ンとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、CD3は、ヒトCD3である。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインは、配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインは、配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインは、配列番号5の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、CD28は、ヒトCD28である。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインは、配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインは、配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインは、配列番号6の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号2の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの1つ以上を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号7と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号7と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号7の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号8と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号8と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドは、配列番号8の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約10nM~約1000nMの追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約50nM~約300nMの追加の単鎖キメラポリペプチドを含む。
型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの1つ以上を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、CD3/CD28結合剤は、抗CD3/抗CD28ビーズである。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗CD3/抗CD28ビーズを約1:1~約6:1のビーズ/細胞比で含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、抗CD3/抗CD28ビーズを約3:1~約5:1のビーズ/細胞比で含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、CD3/CD28結合剤は、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインがCD28に結合する。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、IgG1抗体構築物は、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、重鎖可変ドメインは、配列番号72を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号73を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、第1の標的結合ドメインと可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインと第2の標的結合ドメインは、互いに直接隣接している。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、可溶性組織因子ドメインと第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、CD3は、ヒトCD3である。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインは、配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインは、配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインは、配列番号5の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、CD28は、ヒトCD28である。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインは、配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインは、配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインは、配列番号6の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインである。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性ヒト組織因子ドメインは、配列番号2の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、追加の単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちのいずれも含まない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニンのうちの1つ以上を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、血液凝固を開始しない。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号7と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号7と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号7の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号8と少なくとも80%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号8と少なくとも90%同一の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号8の配列を含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約10nM~約1000nMの単鎖キメラポリペプチドを含む。本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、液体培養培地は、約50nM~約300nMの単鎖キメラポリペプチドを含む。
Treg細胞(例えば、本明細書に記載のTreg細胞のうちのいずれか)の増殖を刺激するまたは増加させる方法、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたTreg細胞の集団、それらのTreg細胞の集団のうちのいずれかを含む組成物、およびそれらのTreg細胞の集団または組成物のうちのいずれかを投与することを含む対象を治療する方法が本明細書に提供される。
ヒト組織因子は、以下の3つのドメイン:(1)219アミノ酸N末端細胞外ドメイン(残基1~219)、(2)22アミノ酸膜貫通ドメイン(残基220~242)、および(3)21アミノ酸細胞質C末端尾部(残基242~263)((UniProtKB識別子番号:P13726)を含む263アミノ酸膜貫通タンパク質である。細胞質尾部は、Ser253およびSer258に2つのリン酸化部位を含み、Cys245に1つのS-パルミトイル化部位を含む。細胞質ドメインの欠失または変異が組織因子凝固活性に影響を及ぼすことは見出されなかった。組織因子は、Cys245のタンパク質の細胞内ドメイン内に1つのS-パルミトイル化部位を有する。Cys245は、細胞内ドメインのアミノ酸末端に位置し、膜表面の近くにある。組織因子膜貫通ドメインは、単一膜貫通α-ヘリックスで構成されている。
細胞活性化剤の非限定的な例は、多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドは、(a)(i)第1の標的結合ドメイン、(ii)可溶性組織因子ドメイン、および(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメインを含む、第1のキメラポリペプチドと、(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメインおよび(ii)第2の標的結合ドメインを含む、第2のキメラポリペプチドとを含み、第1のキメラポリペプチドと第2のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第1のドメインと第2のドメインとの結合を介して会合している。
いくつかの実施形態では、可溶性組織因子ドメインは、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠く野生型組織因子ポリペプチドであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、組織因子変異体であり得、野生型組織因子ポリペプチドが、シグナル配列、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを欠き、選択されたアミノ酸でさらに修飾されている。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ヒト組織因子ドメインであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性マウス組織因子ドメインであり得る。いくつかの例では、可溶性組織因子ドメインは、可溶性ラット組織因子ドメインであり得る。可溶性ヒト組織因子ドメイン、可溶性マウス組織因子ドメイン、可溶性ラット組織因子ドメイン、および変異体可溶性組織因子ドメインの非限定的な例が以下に示される。
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ミノ酸~約180アミノ酸、約115アミノ酸~約175アミノ酸、約115アミノ酸~約170アミノ酸、約115アミノ酸~約165アミノ酸、約115アミノ酸~約160アミノ酸、約115アミノ酸~約155アミノ酸、約115アミノ酸~約150アミノ酸、約115アミノ酸~約145アミノ酸、約115アミノ酸~約140アミノ酸、約115アミノ酸~約135アミノ酸、約115アミノ酸~約130アミノ酸、約115アミノ酸~約125アミノ酸、約115アミノ酸~約120アミノ酸、約120アミノ酸~約220アミノ酸、約120アミノ酸~約215アミノ酸、約120アミノ酸~約210アミノ酸、約120アミノ酸~約205アミノ酸、約120アミノ酸~約200アミノ酸、約120アミノ酸~約195アミノ酸、約120アミノ酸~約190アミノ酸、約120アミノ酸~約185アミノ酸、約120アミノ酸~約180アミノ酸、約120アミノ酸~約175アミノ酸、約120アミノ酸~約170アミノ酸、約120アミノ酸~約165アミノ酸、約120アミノ酸~約160アミノ酸、約120アミノ酸~約155アミノ酸、約120アミノ酸~約150アミノ酸、約120アミノ酸~約145アミノ酸、約120アミノ酸~約140アミノ酸、約120アミノ酸~約135アミノ酸、約120アミノ酸~約130アミノ酸、約120アミノ酸~約125アミノ酸、約125アミノ酸~約220アミノ酸、約125アミノ酸~約215アミノ酸、約125アミノ酸~約210アミノ酸、約125アミノ酸~約205アミノ酸、約125アミノ酸~約200アミノ酸、約125アミノ酸~約195アミノ酸、約125アミノ酸~約190アミノ酸、約125アミノ酸~約185アミノ酸、約125アミノ酸~約180アミノ酸、約125アミノ酸~約175アミノ酸、約125アミノ酸~約170アミノ酸、約125アミノ酸~約165アミノ酸、約125アミノ酸~約160アミノ酸、約125アミノ酸~約155アミノ酸、約125アミノ酸~約150アミノ酸、約125アミノ酸~約145アミノ酸、約125アミノ酸~約140アミノ酸、約125アミノ酸~約135アミノ酸、約125アミノ酸~約130アミノ酸、約130アミノ酸~約220アミノ酸、約130アミノ酸~約215アミノ酸、約130アミノ酸~約210アミノ酸、約130アミノ酸~約205アミノ酸、約130アミノ酸~約200アミノ酸、約130アミノ酸~約195アミノ酸、約130アミノ酸~約190アミノ酸、約130アミノ酸~約185アミノ酸、約130アミノ酸~約180アミノ酸、約130アミノ酸~約175アミノ酸、約130アミノ酸~約170アミノ酸、約130アミノ酸~約165アミノ酸、約130アミノ酸~約160アミノ酸、約130アミノ酸~約155アミノ酸、約130アミノ酸~約150アミノ酸、約130アミノ酸~約145アミノ酸、約130アミノ酸~約140アミノ酸、約130アミノ酸~約135アミノ酸、約135アミノ酸~約220アミノ酸、約135アミノ酸~約215アミノ酸、約135アミノ酸~約210アミノ酸、約135アミノ酸~約205アミノ酸、約135アミノ酸~約200アミノ酸、約135アミノ酸~約195アミノ酸、約135アミノ酸~約190アミノ酸、約135アミノ酸~約185アミノ酸、約135アミノ酸~約180アミノ酸、約135アミノ酸~約175アミノ酸、約135アミノ酸~約170アミノ酸、約135アミノ酸~約165アミノ酸、約135アミノ酸~約160アミノ酸、約135アミノ酸~約155アミノ酸、約135アミノ酸~約150アミノ酸、約135アミノ酸~約145アミノ酸、約135アミノ酸~約140アミノ酸、約140アミノ酸~約220アミノ酸、約140アミノ酸~約215アミノ酸、約140アミノ酸~約210アミノ酸、約140アミノ酸~約205アミノ酸、約140アミノ酸~約200アミノ酸、約140アミノ酸~約195アミノ酸、約140アミノ酸~約190アミノ酸、約140アミノ酸~約185アミノ酸、約140アミノ酸~約180アミノ酸、約140アミノ酸~約175アミノ酸、約140アミノ酸~約170アミノ酸、約140アミノ酸~約165アミノ酸、約140アミノ酸~約160アミノ酸、約140アミノ酸~約155アミノ酸、約140アミノ酸~約150アミノ酸、約140アミノ酸~約145アミノ酸、約145アミノ酸~約220アミノ酸、約145アミノ酸~約215アミノ酸、約145アミノ酸~約210アミノ酸、約145アミノ酸~約205アミノ酸、約145アミノ酸~約200アミノ酸、約145アミノ酸~約195アミノ酸、約145アミノ酸~約190アミノ酸、約145アミノ酸~約185アミノ酸、約145アミノ酸~約180アミノ酸、約145アミノ酸~約175アミノ酸、約145アミノ酸~約170アミノ酸、約145アミノ酸~約165アミノ酸、約145アミノ酸~約160アミノ酸、約145アミノ酸~約155アミノ酸、約145アミノ酸~約150アミノ酸、約150アミノ酸~約220アミノ酸、約150アミノ酸~約215アミノ酸、約150アミノ酸~約210アミノ酸、約150アミノ酸~約205アミノ酸、約150アミノ酸~約200アミノ酸、約150アミノ酸~約195アミノ酸、約150アミノ酸~約190アミノ酸、約150アミノ酸~約185アミノ酸、約150アミノ酸~約180アミノ酸、約150アミノ酸~約175アミノ酸、約150アミノ酸~約170アミノ酸、約150アミノ酸~約165アミノ酸、約150アミノ酸~約160アミノ酸、約150アミノ酸~約155アミノ酸、約155アミノ酸~約220アミノ酸、約155アミノ酸~約215アミノ酸、約155アミノ酸~約210アミノ酸、約155アミノ酸~約205アミノ酸、約155アミノ酸~約200アミノ酸、約155アミノ酸~約195アミノ酸、約155アミノ酸~約190アミノ酸、約155アミノ酸~約185アミノ酸、約155アミノ酸~約180アミノ酸、約155アミノ酸~約175アミノ酸、約155アミノ酸~約170アミノ酸、約155アミノ酸~約165アミノ酸、約155アミノ酸~約160アミノ酸、約160アミノ酸~約220アミノ酸、約160アミノ酸~約215アミノ酸、約160アミノ酸~約210アミノ酸、約160アミノ酸~約205アミノ酸、約160アミノ酸~約200アミノ酸、約160アミノ酸~約195アミノ酸、約160アミノ酸~約190アミノ酸、約160アミノ酸~約185アミノ酸、約160アミノ酸~約180アミノ酸、約160アミノ酸~約175アミノ酸、約160アミノ酸~約170アミノ酸、約160アミノ酸~約165アミノ酸、約165アミノ酸~約220アミノ酸、約165アミノ酸~約215アミノ酸、約165アミノ酸~約210アミノ酸、約165アミノ酸~約205アミノ酸、約165アミノ酸~約200アミノ酸、約165アミノ酸~約195アミノ酸、約165アミノ酸~約190アミノ酸、約165アミノ酸~約185アミノ酸、約165アミノ酸~約180アミノ酸、約165アミノ酸~約175アミノ酸、約165アミノ酸~約170アミノ酸、約170アミノ酸~約220アミノ酸、約170アミノ酸~約215アミノ酸、約170アミノ酸~約210アミノ酸、約170アミノ酸~約205アミノ酸、約170アミノ酸~約200アミノ酸、約170アミノ酸~約195アミノ酸、約170アミノ酸~約190アミノ酸、約170アミノ酸~約185アミノ酸、約170アミノ酸~約180アミノ酸、約170アミノ酸~約175アミノ酸、約175アミノ酸~約220アミノ酸、約175アミノ酸~約215アミノ酸、約175アミノ酸~約210アミノ酸、約175アミノ酸~約205アミノ酸、約175アミノ酸~約200アミノ酸、約175アミノ酸~約195アミノ酸、約175アミノ酸~約190アミノ酸、約175アミノ酸~約185アミノ酸、約175アミノ酸~約180アミノ酸、約180アミノ酸~約220アミノ酸、約180アミノ酸~約215アミノ酸、約180アミノ酸~約210アミノ酸、約180アミノ酸~約205アミノ酸、約180アミノ酸~約200アミノ酸、約180アミノ酸~約195アミノ酸、約180アミノ酸~約190アミノ酸、約180アミノ酸~約185アミノ酸、約185アミノ酸~約220アミノ酸、約185アミノ酸~約215アミノ酸、約185アミノ酸~約210アミノ酸、約185アミノ酸~約205アミノ酸、約185アミノ酸~約200アミノ酸、約185アミノ酸~約195アミノ酸、約185アミノ酸~約190アミノ酸、約190アミノ酸~約220アミノ酸、約190アミノ酸~約215アミノ酸、約190アミノ酸~約210アミノ酸、約190アミノ酸~約205アミノ酸、約190アミノ酸~約200アミノ酸、約190アミノ酸~約195アミノ酸、約195アミノ酸~約220アミノ酸、約195アミノ酸~約215アミノ酸、約195アミノ酸~約210アミノ酸、約195アミノ酸~約205アミノ酸、約195アミノ酸~約200アミノ酸、約200アミノ酸~約220アミノ酸、約200アミノ酸~約215アミノ酸、約200アミノ酸~約210アミノ酸、約200アミノ酸~約205アミノ酸、約205アミノ酸~約220アミノ酸、約205アミノ酸~約215アミノ酸、約205アミノ酸~約210アミノ酸、約210アミノ酸~約220アミノ酸、約210アミノ酸~約215アミノ酸、または約215アミノ酸~約220アミノ酸の全長を有し得る。
いくつかの実施形態では、リンカー配列は、可動性リンカー配列であり得る。使用され得るリンカー配列の非限定的な例は、Klein et al.,Protein Engineering,Design&Selection Vol.27,No.10,pp.325-330,2014、Priyanka et al.,Protein Sci.,2013 Feb;22(2):153-167に記載されている。いくつかの例では、リンカー配列は、合成リンカー配列である。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメイン、第2の標的結合ドメイン、および/または追加の1つ以上の標的結合ドメインは、抗原結合ドメイン(例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な抗原結合ドメインのうちのいずれか)、可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質(例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性インターロイキンタンパク質または可溶性サイトカインタンパク質のうちのいずれか)、および可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体(例えば、本明細書に記載の例示的な可溶性インターロイキン受容体または可溶性サイトカイン受容体のうちのいずれか)であり得る。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインは、同じ抗原に特異的に結合する。これらの単鎖または多鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインは、同じエピトープに特異的に結合する。これらの単鎖または多鎖キメラポリペプチドのいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインは、同じアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキンタンパク質または可溶性サイトカインタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、可溶性インターロイキンまたは可溶性サイトカインタンパク質は、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、およびFLT3Lの群から選択される。可溶性IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、およびFLT3Lの非限定的な例を以下に提供する。
NWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
AACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
本明細書に記載の単鎖または多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインの一方または両方が、可溶性インターロイキン受容体または可溶性サイトカイン受容体である。いくつかの実施形態では、可溶性受容体は、可溶性TGF-β受容体II(TGF-β RII)である(例えば、Yung et al.,Am.J.Resp.Crit.Care Med.194(9):1140-1151,2016に記載のものを参照のこと)、可溶性TGF-βRIII(例えば、Heng et al.,Placenta 57:320,2017に記載のものを参照のこと)、可溶性NKG2D(例えば、Cosman et al.,Immunity 14(2):123-133,2001、Costa et al.,Front.Immunol.,Vol.9,Article 1150,May 29,2018、doi:10.3389/fimmu.2018.01150を参照のこと)、可溶性NKp30(例えば、Costa et al.,Front.Immunol.,Vol.9,Article 1150,May 29,2018、doi:10.3389/fimmu.2018.01150を参照のこと)、可溶性NKp44(例えば、Costa et al.,Front.Immunol.,Vol.9,Article 1150,May 29,2018、doi:10.3389/fimmu.2018.01150に記載のものを参照のこと)、可溶性NKp46(例えば、Mandelboim et al.,Nature 409:1055-1060,2001、Costa et al.,Front.Immunol.,Vol.9,Article 1150,May 29,2018、doi:10.3389/fimmu.2018.01150を参照のこと)、可溶性DNAM1(例えば、Costa et al.,Front.Immunol.,Vol.9,Article 1150,May 29,2018、doi:10.3389/fimmu.2018.01150に記載のものを参照のこと)、scMHCI(例えば、Washburn et al.,PLoS One 6(3):e18439,2011に記載のものを参照のこと)、scMHCII(例えば、Bishwajit et al.,Cellular Immunol.170(1):25-33,1996に記載のものを参照のこと)、scTCR(例えば、Weber et al.,Nature 356(6372):793-796,1992に記載のものを参照のこと)、可溶性CD155(例えば、Tahara-Hanaoka et al.,Int.Immunol.16(4):533-538,2004に記載のものを参照のこと)、または可溶性CD28(例えば、Hebbar et al.,Clin.Exp.Immunol.136:388-392,2004を参照のこと)。可溶性インターロイキン受容体および可溶性サイトカイン受容体の追加の例は、当該技術分野で既知である。
いくつかの実施形態では、多鎖キメラポリペプチドは、1)一対の親和性ドメインの第1のドメインを含む第1のキメラポリペプチドと、2)一対の親和性ドメインの第2のドメインを含む第2のキメラポリペプチドとを含み、これにより、第1のキメラポリペプチドおよび第2のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第1のドメインおよび第2のドメインの結合を介して会合するようになる。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、ヒトIL-15受容体アルファ鎖(IL15Rα)由来のsushiドメイン、および可溶性IL-15である。sushiドメイン、別名、ショートコンセンサスリピートまたは1型糖タンパク質モチーフは、タンパク質-タンパク質相互作用の一般的なモチーフである。sushiドメインは、補体成分C1r、C1s、H因子、C2m、ならびに非免疫学的分子第XIII因子およびβ2-糖タンパク質を含むいくつかのタンパク質結合分子上で特定されている。典型的なsushiドメインは、およそ60個のアミノ酸残基を有し、4つのシステインを含む(Ranganathan,Pac.Symp Biocomput.2000:155-67)。第1のシステインは第3のシステインとジスルフィド結合を形成することができ、第2のシステインは第4のシステインとジスルフィド架橋を形成することができる。一対の親和性ドメインの一方のメンバーが可溶性IL-15であるいくつかの実施形態では、可溶性IL15は、D8NまたはD8Aアミノ酸置換を有する。一対の親和性ドメインの一方のメンバーがヒトIL-15受容体アルファ鎖(IL15Rα)であるいくつかの実施形態では、ヒトIL15Rαは、成熟全長IL15Rαである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、バルナーゼとバルンスターである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、PKAとAKAPである。いくつかの実施形態では、一対の親和性ドメインは、変異RNase I断片に基づくアダプター/ドッキングタグモジュール(Rossi,Proc Natl Acad Sci USA.103:6841-6846,2006、Sharkey et al.,Cancer Res.68:5282-5290,2008、Rossi et al.,Trends Pharmacol Sci.33:474-481,2012)、またはタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびSNAP25の相互作用に基づくSNAREモジュール(Deyev et al.,Nat Biotechnol.1486-1492,2003)である。
単鎖キメラポリペプチドは、第1の標的結合ドメイン(例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか)、可溶性組織因子ドメイン(例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか)、および第2の標的結合ドメイン(例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の標的結合ドメインのうちのいずれか)を含む。
酸~約950アミノ酸、約340アミノ酸~約900アミノ酸、約340アミノ酸~約850アミノ酸、約340アミノ酸~約800アミノ酸、約340アミノ酸~約750アミノ酸、約340アミノ酸~約700アミノ酸、約340アミノ酸~約650アミノ酸、約340アミノ酸~約600アミノ酸、約340アミノ酸~約550アミノ酸、約340アミノ酸~約500アミノ酸、約340アミノ酸~約480アミノ酸、約340アミノ酸~約460アミノ酸、約340アミノ酸~約440アミノ酸、約340アミノ酸~約420アミノ酸、約340アミノ酸~約400アミノ酸、約340アミノ酸~約380アミノ酸、約340アミノ酸~約360アミノ酸、約360アミノ酸~約3000アミノ酸、約360アミノ酸~約2500アミノ酸、約360アミノ酸~約2000アミノ酸、約360アミノ酸~約1500アミノ酸、約360アミノ酸~約1000アミノ酸、約360アミノ酸~約950アミノ酸、約360アミノ酸~約900アミノ酸、約360アミノ酸~約850アミノ酸、約360アミノ酸~約800アミノ酸、約360アミノ酸~約750アミノ酸、約360アミノ酸~約700アミノ酸、約360アミノ酸~約650アミノ酸、約360アミノ酸~約600アミノ酸、約360アミノ酸~約550アミノ酸、約360アミノ酸~約500アミノ酸、約360アミノ酸~約480アミノ酸、約360アミノ酸~約460アミノ酸、約360アミノ酸~約440アミノ酸、約360アミノ酸~約420アミノ酸、約360アミノ酸~約400アミノ酸、約360アミノ酸~約380アミノ酸、約380アミノ酸~約3000アミノ酸、約380アミノ酸~約2500アミノ酸、約380アミノ酸~約2000アミノ酸、約380アミノ酸~約1500アミノ酸、約380アミノ酸~約1000アミノ酸、約380アミノ酸~約950アミノ酸、約380アミノ酸~約900アミノ酸、約380アミノ酸~約850アミノ酸、約380アミノ酸~約800アミノ酸、約380アミノ酸~約750アミノ酸、約380アミノ酸~約700アミノ酸、約380アミノ酸~約650アミノ酸、約380アミノ酸~約600アミノ酸、約380アミノ酸~約550アミノ酸、約380アミノ酸~約500アミノ酸、約380アミノ酸~約480アミノ酸、約380アミノ酸~約460アミノ酸、約380アミノ酸~約440アミノ酸、約380アミノ酸~約420アミノ酸、約380アミノ酸~約400アミノ酸、約400アミノ酸~約3000アミノ酸、約400アミノ酸~約2500アミノ酸、約400アミノ酸~約2000アミノ酸、約400アミノ酸~約1500アミノ酸、約400アミノ酸~約1000アミノ酸、約400アミノ酸~約950アミノ酸、約400アミノ酸~約900アミノ酸、約400アミノ酸~約850アミノ酸、約400アミノ酸~約800アミノ酸、約400アミノ酸~約750アミノ酸、約400アミノ酸~約700アミノ酸、約400アミノ酸~約650アミノ酸、約400アミノ酸~約600アミノ酸、約400アミノ酸~約550アミノ酸、約400アミノ酸~約500アミノ酸、約400アミノ酸~約480アミノ酸、約400アミノ酸~約460アミノ酸、約400アミノ酸~約440アミノ酸、約400アミノ酸~約420アミノ酸、約420アミノ酸~約3000アミノ酸、約420アミノ酸~約2500アミノ酸、約420アミノ酸~約2000アミノ酸、約420アミノ酸~約1500アミノ酸、約420アミノ酸~約1000アミノ酸、約420アミノ酸~約950アミノ酸、約420アミノ酸~約900アミノ酸、約420アミノ酸~約850アミノ酸、約420アミノ酸~約800アミノ酸、約420アミノ酸~約750アミノ酸、約420アミノ酸~約700アミノ酸、約420アミノ酸~約650アミノ酸、約420アミノ酸~約600アミノ酸、約420アミノ酸~約550アミノ酸、約420アミノ酸~約500アミノ酸、約420アミノ酸~約480アミノ酸、約420アミノ酸~約460アミノ酸、約420アミノ酸~約440アミノ酸、約440アミノ酸~約3000アミノ酸、約440アミノ酸~約2500アミノ酸、約440アミノ酸~約2000アミノ酸、約440アミノ酸~約1500アミノ酸、約440アミノ酸~約1000アミノ酸、約440アミノ酸~約950アミノ酸、約440アミノ酸~約900アミノ酸、約440アミノ酸~約850アミノ酸、約440アミノ酸~約800アミノ酸、約440アミノ酸~約750アミノ酸、約440アミノ酸~約700アミノ酸、約440アミノ酸~約650アミノ酸、約440アミノ酸~約600アミノ酸、約440アミノ酸~約550アミノ酸、約440アミノ酸~約500アミノ酸、約440アミノ酸~約480アミノ酸、約440アミノ酸~約460アミノ酸、約460アミノ酸~約3000アミノ酸、約460アミノ酸~約2500アミノ酸、約460アミノ酸~約2000アミノ酸、約460アミノ酸~約1500アミノ酸、約460アミノ酸~約1000アミノ酸、約460アミノ酸~約950アミノ酸、約460アミノ酸~約900アミノ酸、約460アミノ酸~約850アミノ酸、約460アミノ酸~約800アミノ酸、約460アミノ酸~約750アミノ酸、約460アミノ酸~約700アミノ酸、約460アミノ酸~約650アミノ酸、約460アミノ酸~約600アミノ酸、約460アミノ酸~約550アミノ酸、約460アミノ酸~約500アミノ酸、約460アミノ酸~約480アミノ酸、約480アミノ酸~約3000アミノ酸、約480アミノ酸~約2500アミノ酸、約480アミノ酸~約2000アミノ酸、約480アミノ酸~約1500アミノ酸、約480アミノ酸~約1000アミノ酸、約480アミノ酸~約950アミノ酸、約480アミノ酸~約900アミノ酸、約480アミノ酸~約850アミノ酸、約480アミノ酸~約800アミノ酸、約480アミノ酸~約750アミノ酸、約480アミノ酸~約700アミノ酸、約480アミノ酸~約650アミノ酸、約480アミノ酸~約600アミノ酸、約480アミノ酸~約550アミノ酸、約480アミノ酸~約500アミノ酸、約500アミノ酸~約3000アミノ酸、約500アミノ酸~約2500アミノ酸、約500アミノ酸~約2000アミノ酸、約500アミノ酸~約1500アミノ酸、約500アミノ酸~約1000アミノ酸、約500アミノ酸~約950アミノ酸、約500アミノ酸~約900アミノ酸、約500アミノ酸~約850アミノ酸、約500アミノ酸~約800アミノ酸、約500アミノ酸~約750アミノ酸、約500アミノ酸~約700アミノ酸、約500アミノ酸~約650アミノ酸、約500アミノ酸~約600アミノ酸、約500アミノ酸~約550アミノ酸、約550アミノ酸~約3000アミノ酸、約550アミノ酸~約2500アミノ酸、約550アミノ酸~約2000アミノ酸、約550アミノ酸~約1500アミノ酸、約550アミノ酸~約1000アミノ酸、約550アミノ酸~約950アミノ酸、約550アミノ酸~約900アミノ酸、約550アミノ酸~約850アミノ酸、約550アミノ酸~約800アミノ酸、約550アミノ酸~約750アミノ酸、約550アミノ酸~約700アミノ酸、約550アミノ酸~約650アミノ酸、約550アミノ酸~約600アミノ酸、約600アミノ酸~約3000アミノ酸、約600アミノ酸~約2500アミノ酸、約600アミノ酸~約2000アミノ酸、約600アミノ酸~約1500アミノ酸、約600アミノ酸~約1000アミノ酸、約600アミノ酸~約950アミノ酸、約600アミノ酸~約900アミノ酸、約600アミノ酸~約850アミノ酸、約600アミノ酸~約800アミノ酸、約600アミノ酸~約750アミノ酸、約600アミノ酸~約700アミノ酸、約600アミノ酸~約650アミノ酸、約650アミノ酸~約3000アミノ酸、約650アミノ酸~約2500アミノ酸、約650アミノ酸~約2000アミノ酸、約650アミノ酸~約1500アミノ酸、約650アミノ酸~約1000アミノ酸、約650アミノ酸~約950アミノ酸、約650アミノ酸~約900アミノ酸、約650アミノ酸~約850アミノ酸、約650アミノ酸~約800アミノ酸、約650アミノ酸~約750アミノ酸、約650アミノ酸~約700アミノ酸、約700アミノ酸~約3000アミノ酸、約700アミノ酸~約2500アミノ酸、約700アミノ酸~約2000アミノ酸、約700アミノ酸~約1500アミノ酸、約700アミノ酸~約1000アミノ酸、約700アミノ酸~約950アミノ酸、約700アミノ酸~約900アミノ酸、約700アミノ酸~約850アミノ酸、約700アミノ酸~約800アミノ酸、約700アミノ酸~約750アミノ酸、約750アミノ酸~約3000アミノ酸、約750アミノ酸~約2500アミノ酸、約750アミノ酸~約2000アミノ酸、約750アミノ酸~約1500アミノ酸、約750アミノ酸~約1000アミノ酸、約750アミノ酸~約950アミノ酸、約750アミノ酸~約900アミノ酸、約750アミノ酸~約850アミノ酸、約750アミノ酸~約800アミノ酸、約800アミノ酸~約3000アミノ酸、約800アミノ酸~約2500アミノ酸、約800アミノ酸~約2000アミノ酸、約800アミノ酸~約1500アミノ酸、約800アミノ酸~約1000アミノ酸、約800アミノ酸~約950アミノ酸、約800アミノ酸~約900アミノ酸、約800アミノ酸~約850アミノ酸、約850アミノ酸~約3000アミノ酸、約850アミノ酸~約2500アミノ酸、約850アミノ酸~約2000アミノ酸、約850アミノ酸~約1500アミノ酸、約850アミノ酸~約1000アミノ酸、約850アミノ酸~約950アミノ酸、約850アミノ酸~約900アミノ酸、約900アミノ酸~約3000アミノ酸、約900アミノ酸~約2500アミノ酸、約900アミノ酸~約2000アミノ酸、約900アミノ酸~約1500アミノ酸、約900アミノ酸~約1000アミノ酸、約900アミノ酸~約950アミノ酸、約950アミノ酸~約3000アミノ酸、約950アミノ酸~約2500アミノ酸、約950アミノ酸~約2000アミノ酸、約950アミノ酸~約1500アミノ酸、約950アミノ酸~約1000アミノ酸、約1000アミノ酸~約3000アミノ酸、約1000アミノ酸~約2500アミノ酸、約1000アミノ酸~約2000アミノ酸、約1000アミノ酸~約1500アミノ酸、約1500アミノ酸~約3000アミノ酸、約1500アミノ酸~約2500アミノ酸、約1500アミノ酸~約2000アミノ酸、約2000アミノ酸~約3000アミノ酸、約2000アミノ酸~約2500アミノ酸、または約2500アミノ酸~約3000アミノ酸の全長を有し得る。
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチドは、IL-2受容体活性化剤であり得る。かかる実施形態では、第1の標的結合ドメインおよび/または第2の標的結合ドメインの一方または両方が、IL-2受容体(例えば、ヒトIL-2受容体)に結合する。
単鎖キメラポリペプチドがCD3/CD28結合剤であるいくつかの実施形態では、第1の標的結合ドメインは、CD3(例えば、CD3δ(例えば、ヒトCD3Λ)、CD3Μ(例えば、ヒトCD3Μ)、CD3Κ(例えば、ヒト CD3Κ)、およびCD3Ν(例えば、ヒトCD3Ν)のうちの1つ以上)に特異的に結合し、第2の標的結合ドメインは、CD28(例えば、ヒトCD28)に特異的に結合する。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態は、そのN末端および/またはC末端に1つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)の追加の標的結合ドメイン(例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な標的結合ドメインのうちのいずれか)をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチド、第1のキメラポリペプチド、または第2のキメラポリペプチドは、そのN末端にシグナル配列をさらに含み得る。当業者に理解されるように、シグナル配列は、タンパク質を分泌経路に指向するいくつかの内因的に産生されたタンパク質のN末端に存在するアミノ酸配列である(例えば、タンパク質は、ある特定の細胞内オルガネラに存在するか、細胞膜に存在するか、または細胞から分泌されるように指示される)。シグナル配列は不均一であり、それらの一次アミノ酸配列が大きく異なる。しかしながら、シグナル配列は、典型的には、16~30アミノ酸長であり、親水性の通常は正に帯電したN末端領域、中央の疎水性ドメイン、およびシグナルペプチダーゼの切断部位を含むC末端領域を含む。
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(配列番号34)、
ATGAAGTGGGTCACATTTATCTCTTTACTGTTCCTCTTCTCCAGCGCCTACAGC(配列番号35)、
ATGAAATGGGTGACCTTTATTTCTTTACTGTTCCTCTTTAGCAGCGCCTACTCC(配列番号36)、または
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGC(配列番号101)
によってコードされるシグナル配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第1のキメラポリペプチド、または第2のキメラポリペプチドは、(例えば、単鎖キメラポリペプチド、第1のキメラポリペプチド、または第2のキメラポリペプチドのN末端またはC末端に)ペプチドタグを含み得る。いくつかの実施形態では、単鎖キメラポリペプチド、第1のキメラポリペプチド、または第2のキメラポリペプチドは、2つ以上のペプチドタグを含む。
1つ以上のCD3/CD28結合剤の使用を含む方法が本明細書に提供される。CD3/CD28結合剤は、例えば、単鎖キメラポリペプチド、多鎖キメラポリペプチド、二重特異性抗体、または抗CD3/抗CD28ビーズであり得る。
CD3/CD28結合剤の非限定的な例は、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインがCD28に結合する。CD3/CD28結合剤である単鎖キメラポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
CD3/CD28結合剤の非限定的な例は、多鎖キメラポリペプチドであり、多鎖キメラポリペプチドが、(i)第1の標的結合ドメイン、(ii)可溶性組織因子ドメイン、および(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメインを含む、第1のキメラポリペプチドと、(i)一対の親和性ドメインの第2のドメインおよび(ii)第2の標的結合ドメインを含む、第2のキメラポリペプチドとを含み、第1のキメラポリペプチドと第2のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第1のドメインと第2のドメインとの結合を介して会合し、第1の標的結合ドメインがCD3に結合しかつ第2の標的結合ドメインがCD28に結合するか、または第1の標的結合ドメインがCD28に結合しかつ第2の標的結合ドメインがCD3に結合する。
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGTGGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGCCAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGCTCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAGAACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
MKWVTFISLLFLFSSAYSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSSGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRENWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
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いくつかの実施形態では、CD3/CD28結合剤は、抗CD3/抗CD28ビーズであり得る。抗CD3/抗CD28ビーズは、抗CD3抗体またはその抗原結合断片および抗CD28抗体またはその抗原結合断片を含み得、これらはいずれもビーズに共有結合的にまたは非共有結合的に連結される。いくつかの実施形態では、抗CD3抗体またはその抗原結合断片は、抗CD3 scFv(例えば、本明細書に記載の例示的な抗CD3 scFvのうちの1つ)である。いくつかの実施形態では、抗CD28抗体またはその抗原結合断片は、抗CD28 scFv(例えば、本明細書に記載の任意の抗CD28 scFv)である。ビーズは、当該技術分野で既知の任意の好適な球状ポリマー粒子であり得る。ビーズの平均直径は、約0.5~約20マイクロメートル(例えば、約0.5~約10、約0.8~約8、または約1~約5マイクロメートル)であり得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、ダイナビーズなどであるが、これに限定されない、1つ以上の常磁性材料を含み得る。抗CD3/抗CD28ビーズの非限定的な例には、ThermoFisher Scientific、Gibco、およびInvitrogenによって開発されたものなどの抗CD3/抗CD28ダイナビーズが挙げられる。抗CD3/抗CD28ビーズのさらなる商業的供給源は、当該技術分野で既知である。
1つ以上のIL-2受容体活性化剤の使用を含む方法が本明細書に提供される。IL-2受容体活性化剤の非限定的な例には、単鎖キメラポリペプチド、多鎖キメラポリペプチド、可溶性IL-2(例えば、組換えヒトIL-2)、およびIL-2受容体(例えば、ヒトIL-2受容体)に特異的に結合するアゴニスト抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、IL-2受容体活性化剤は、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインがIL-2受容体に結合する。IL-2受容体活性化剤である単鎖キメラポリペプチドの非限定的な例は、本明細書に記載されている。
いくつかの例では、IL-2受容体活性化剤は、可溶性IL-2(例えば、本明細書に記載の可溶性IL-2タンパク質のうちのいずれか)であり得る。いくつかの実施形態では、可溶性IL-2タンパク質は、配列番号1と少なくとも80%同一、少なくとも82%同一、少なくとも84%同一、少なくとも86%同一、少なくとも88%同一、少なくとも90%同一、少なくとも92%同一、少なくとも94%同一、少なくとも96%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または100%同一の配列を含み得る。
いくつかの例では、IL-2受容体活性化剤は、IL-2受容体(例えば、ヒトIL-2受容体)に特異的に結合するアゴニスト抗体(例えば、Gaulton et al.,Clinical Immunology and Immunopathology 36(1):18-29,1985に記載のもの)またはその抗原結合断片であり得る
IgG1抗体構築物は、IgG1抗体(例えば、可溶性組織因子ドメイン、例えば、本明細書に記載の可溶性組織因子ドメインのうちのいずれかに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナルIgG1抗体)であり得る。いくつかの実施形態では、IgG1抗体構築物は、IgG1 Fc領域(例えば、ヒトIgG1 Fc領域)を含む抗体または抗体断片であり得る。当該技術分野で知られているように、IgG1 Fc領域は、CD16a(FcRガンマIII)(例えば、ヒトCD16a)に結合し、その細胞内シグナル伝達を誘導する。いくつかの実施形態では、IgG1抗体構築物は、Fc領域を含み、かつ可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する単鎖または多鎖ポリペプチドであり得、このFc領域は、CD16a(FcRガンマIII)(例えば、ヒトCD16a)に特異的に結合することができ、ナチュラルキラー細胞(例えば、ヒトナチュラルキラー細胞)にその細胞内シグナル伝達を誘導することができる。いくつかの実施形態では、IgG1抗体構築物は、Fc領域を含み、かつ可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する単鎖または多鎖ポリペプチドであり得、このFc領域は、野生型IgG1 Fcドメイン(例えば、野生型ヒトIgG1 Fcドメイン、例えば、配列番号98)と少なくとも80%同一(例えば、少なくとも82%同一、少なくとも84%同一、少なくとも86%同一、少なくとも88%同一、少なくとも90%同一、少なくとも92%同一、少なくとも94%同一、少なくとも96%同一、少なくとも98%同一、または少なくとも99%同一)の配列を含み、CD16a(FcRガンマIII)(例えば、ヒトCD16a)に特異的に結合することができ、ナチュラルキラー細胞(例えば、ヒトナチュラルキラー細胞)にその細胞内シグナル伝達を誘導することができる。いくつかの実施形態では、IgG1抗体構築物は、可溶性組織因子ドメイン(例えば、本明細書に記載の可溶性組織因子ドメインのうちのいずれか)に特異的に結合し、非ヒトFc領域(例えば、非ヒト抗体由来のFc領域)を含み、この非ヒトFc領域は、非ヒトFc領域がヒトCD16a(ヒトFcRガンマIII)に結合し、かつナチュラルキラー細胞(例えば、ヒトナチュラルキラー細胞)にその細胞内シグナル伝達を誘導することができるように、(例えば、野生型非ヒトFc領域内の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸を置換することにより)改変されている。
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mTOR阻害剤の非限定的な例には、ラパマイシン(別名、シロリムス)、ゾルトレス(別名、エベロリムスおよびRAD001)、トリセル(別名、テムシロリムスおよびCCI-779)、アフィニトール(エベロリムス)、ダクトリシブ(別名、NVP-BEZ235)、GSK2126458、XL765、AZD8055、INK128(別名、MLN0128)、OSI027、およびRapaLinksが挙げられる。
Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Treg細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、CD3/CD28結合剤(例えば、本明細書に記載の例示的なCD3/CD28結合剤のうちのいずれか)と、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、第1の標的結合ドメインおよび第2の標的結合ドメインがIL-2受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの例では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物(例えば、本明細書に記載の例示的なIgG1抗体構築物のうちのいずれか)をさらに含む。いくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号3と少なくとも80%同一(例えば、少なくとも82%同一、少なくとも84%同一、少なくとも86%同一、少なくとも88%同一、少なくとも90%同一、少なくとも92%同一、少なくとも94%同一、少なくとも96%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または100%同一)の配列を含む。いくつかの例では、単鎖キメラポリペプチドは、配列番号4と少なくとも80%同一(例えば、少なくとも82%同一、少なくとも84%同一、少なくとも86%同一、少なくとも88%同一、少なくとも90%同一、少なくとも92%同一、少なくとも94%同一、少なくとも96%同一、少なくとも98%同一、少なくとも99%同一、または100%同一)の配列を含む。
また、Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Treg細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、IL-2受容体活性化剤(例えば、本明細書に記載のIL-2受容体活性化剤のうちのいずれか)と、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、単鎖キメラポリペプチドの第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、単鎖キメラポリペプチドの第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、を含む方法も提供される。いくつかの例では、液体培養培地は、単鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物(例えば、本明細書に記載の例示的なIgG1抗体構築物のうちのいずれか)をさらに含む。
Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、Treg細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、液体培養培地が、CD3/CD28結合剤(例えば、本明細書に記載のCD3/CD28結合剤のうちのいずれか)と、多鎖キメラポリペプチド(例えば、本明細書に記載の多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれか)であって、(a)(i)第1の標的結合ドメイン、(ii)可溶性組織因子ドメイン、および(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメインを含む、第1のキメラポリペプチドと、(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および(ii)第2の標的結合ドメインを含む、第2のキメラポリペプチドとを含み、第1のキメラポリペプチドと第2のキメラポリペプチドが一対の親和性ドメインの第1のドメインと第2のドメインとの結合を介して会合する、多鎖キメラポリペプチドとを含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、液体培養培地は、多鎖キメラポリペプチドの可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物(例えば、本明細書に記載のIgG1抗体構築物のうちのいずれか)をさらに含む。
本明細書に記載のTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法のうちのいずれも、培養する工程の前に、対象から得られた試料からTreg細胞を単離する工程をさらに含む。
本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Treg細胞は、末梢血または臍帯血から単離された、自己Treg細胞、ハプロタイプ一致Treg細胞、または同種異系Treg細胞であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Treg細胞は、CD4+CD25+Foxp3+細胞であり得る。本明細書に記載の方法、組成物、およびキットのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、Treg細胞は、CD4+CD25+CD127dim細胞であり得る。
40%、約160%~約220%、約160%~約200%、約160%~約180%、約180%~約800%、約180%~約750%、約180%~約700%、約180%~約650%、約180%~約600%、約180%~約550%、約180%~約500%、約180%~約450%、約180%~約400%、約180%~約350%、約180%~約300%、約180%~約280%、約180%~約260%、約180%~約240%、約180%~約220%、約180%~約200%、約200%~約800%、約200%~約750%、約200%~約700%、約200%~約650%、約200%~約600%、約200%~約550%、約200%~約500%、約200%~約450%、約200%~約400%、約200%~約350%、約200%~約300%、約200%~約280%、約200%~約260%、約200%~約240%、約200%~約220%、約220%~約800%、約220%~約750%、約220%~約700%、約220%~約650%、約220%~約600%、約220%~約550%、約220%~約500%、約220%~約450%、約220%~約400%、約220%~約350%、約220%~約300%、約220%~約280%、約220%~約260%、約220%~約240%、約240%~約800%、約240%~約750%、約240%~約700%、約240%~約650%、約240%~約600%、約240%~約550%、約240%~約500%、約240%~約450%、約240%~約400%、約240%~約350%、約240%~約300%、約240%~約280%、約240%~約260%、約260%~約800%、約260%~約750%、約260%~約700%、約260%~約650%、約260%~約600%、約260%~約550%、約260%~約500%、約260%~約450%、約260%~約400%、約260%~約350%、約260%~約300%、約260%~約280%、約280%~約800%、約280%~約750%、約280%~約700%、約280%~約650%、約280%~約600%、約280%~約550%、約280%~約500%、約280%~約450%、約280%~約400%、約280%~約350%、約280%~約300%、約300%~約800%、約300%~約750%、約300%~約700%、約300%~約650%、約300%~約600%、約300%~約550%、約300%~約500%、約300%~約450%、約300%~約400%、約300%~約350%、約350%~約800%、約350%~約750%、約350%~約700%、約350%~約650%、約350%~約600%、約350%~約550%、約350%~約500%、約350%~約450%、約350%~約400%、約400%~約800%、約400%~約750%、約400%~約700%、約400%~約650%、約400%~約600%、約400%~約550%、約400%~約500%、約400%~約450%、約450%~約800%、約450%~約750%、約450%~約700%、約450%~約650%、約450%~約600%、約450%~約550%、約450%~約500%、約500%~約800%、約500%~約750%、約500%~約700%、約500%~約650%、約500%~約600%、約500%~約550%、約550%~約800%、約550%~約750%、約550%~約700%、約550%~約650%、約550%~約600%、約600%~約800%、約600%~約750%、約600%~約700%、約600%~約650%、約650%~約800%、約650%~約750%、約650%~約700%、約700%~約800%、約700%~約750%、または約750%~約800%)の増加がもたらされ得る。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されるTreg細胞の集団も本明細書に提供される。本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)を含み得る。本組成物は、治療を必要とする対象(例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか)を治療するために使用することができる。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸も本明細書に提供される。本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかを含むベクターも本明細書に提供される。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかをコードする本明細書に記載の核酸のうちのいずれかを含む細胞(例えば、本明細書に記載のまたは当該技術分野で既知の例示的な細胞のうちのいずれか)も本明細書に提供される。
本明細書に記載の単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドのうちのいずれかを産生する方法であって、単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドの産生をもたらすのに十分な条件下で本明細書に記載の細胞のうちのいずれかを培養培地中で培養する工程と、単鎖キメラポリペプチドまたは多鎖キメラポリペプチドを細胞および/または培養培地から回収する工程とを含む、方法も本明細書に提供される。
治療を必要とする対象(例えば、本明細書に記載の例示的な対象のうちのいずれか)を治療する方法であって、対象に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたTreg細胞の集団、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して生成されたTreg細胞もしくはTreg細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)のうちのいずれかの治療有効量を投与する工程を含む、方法も本明細書に提供される。
老化は、表現型の変化、アポトーシスへの耐性、および損傷を感知するシグナル伝達経路の活性化を伴う不可逆的な成長停止の一形態である。細胞老化は、増殖する能力を失った培養ヒト線維芽細胞で最初に説明され、約50回の集団倍加(ヘイフリック限界と称される)後に永久停止に達した。老化は、酸化的ストレスおよび遺伝毒性ストレス、DNA損傷、テロメア摩滅、発がん性活性化、ミトコンドリア機能障害、または化学療法剤を含む、広範囲の内因性および外因性傷害によって誘導され得るストレス応答とみなされる。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態は、1つ以上の追加の治療薬の治療有効量を対象(例えば、本明細書に記載の対象のうちのいずれか)に投与することをさらに含み得る。1つ以上の追加の治療薬は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって生成されたTreg細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)のうちのいずれかと実質的に同時に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の治療薬は、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)の投与前に対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、1つ以上の追加の治療薬は、対象に、本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞、または本明細書に記載の方法のうちのいずれかを使用して産生されたTreg細胞の集団を含む組成物(例えば、医薬組成物)の投与後に対象に投与することができる。
αCD3scFv/TF/αCD28scFvの核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
(シグナルペプチド)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCC
(αCD3軽鎖可変領域)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGT
(リンカー)
GGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGC
(αCD3重鎖可変領域)
CAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC
(ヒト組織因子219形態)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(αCD28軽鎖可変領域)
GTCCAGCTGCAGCAGAGCGGACCCGAACTCGTGAAACCCGGTGCTTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCCAGCGGATACACCTTCACCTCCTATGTGATCCAGTGGGTCAAACAGAAGCCCGGACAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAACCCTTACAACGACTATACCAAATACAACGAGAAGTTTAAGGGAAAGGCTACTTTAACCTCCGACAAAAGCTCCATCACAGCCTACATGGAGTTCAGCTCTTTAACATCCGAGGACAGCGCTCTGTACTATTGCGCCCGGTGGGGCGACGGCAATTACTGGGGACGGGGCACAACACTGACCGTGAGCAGC
(リンカー)
GGAGGCGGAGGCTCCGGCGGAGGCGGATCTGGCGGTGGCGGCTCC
(αCD28軽鎖可変領域)
GACATCGAGATGACCCAGTCCCCCGCTATCATGTCCGCCTCTTTAGGCGAGCGGGTCACAATGACTTGTACAGCCTCCTCCAGCGTCTCCTCCTCCTACTTCCATTGGTACCAACAGAAACCCGGAAGCTCCCCTAAACTGTGCATCTACAGCACCAGCAATCTCGCCAGCGGCGTGCCCCCTAGGTTTTCCGGAAGCGGAAGCACCAGCTACTCTTTAACCATCTCCTCCATGGAGGCTGAGGATGCCGCCACCTACTTTTGTCACCAGTACCACCGGTCCCCCACCTTCGGAGGCGGCACCAAACTGGAGACAAAGAGG
(シグナルペプチド)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD3軽鎖可変領域)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(リンカー)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重鎖可変領域)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
(ヒト組織因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(αCD28軽鎖可変領域)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(リンカー)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重鎖可変領域)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
IL-2/TF/IL-2の核酸配列およびアミノ酸配列を以下に示す。
(シグナルペプチド)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCCTGCTGTTCCTGTTCTCCAGCGCCTACTCC
(第1のIL-2断片)
GCCCCCACCTCCTCCTCCACCAAGAAGACCCAGCTGCAGCTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTAAACGGCATCAACAACTACAAGAACCCCAAGCTGACTCGTATGCTGACCTTCAAGTTCTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAGCTGAAGCATTTACAGTGTTTAGAGGAGGAGCTGAAGCCCCTCGAGGAGGTGCTGAATTTAGCCCAGTCCAAGAATTTCCATTTAAGGCCCCGGGATTTAATCAGCAACATCAACGTGATCGTTTTAGAGCTGAAGGGCTCCGAGACCACCTTCATGTGCGAGTACGCCGACGAGACCGCCACCATCGTGGAGTTTTTAAATCGTTGGATCACCTTCTGCCAGTCCATCATCTCCACTTTAACC
(ヒト組織因子219形態)
AGCGGCACAACCAACACAGTCGCTGCCTATAACCTCACTTGGAAGAGCACCAACTTCAAAACCATCCTCGAATGGGAACCCAAACCCGTTAACCAAGTTTACACCGTGCAGATCAGCACCAAGTCCGGCGACTGGAAGTCCAAATGTTTCTATACCACCGACACCGAGTGCGATCTCACCGATGAGATCGTGAAAGATGTGAAACAGACCTACCTCGCCCGGGTGTTTAGCTACCCCGCCGGCAATGTGGAGAGCACTGGTTCCGCTGGCGAGCCTTTATACGAGAACAGCCCCGAATTTACCCCTTACCTCGAGACCAATTTAGGACAGCCCACCATCCAAAGCTTTGAGCAAGTTGGCACAAAGGTGAATGTGACAGTGGAGGACGAGCGGACTTTAGTGCGGCGGAACAACACCTTTCTCAGCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGATTTAATCTACACACTGTATTACTGGAAGTCCTCTTCCTCCGGCAAGAAGACAGCTAAAACCAACACAAACGAGTTTTTAATCGACGTGGATAAAGGCGAAAACTACTGTTTCAGCGTGCAAGCTGTGATCCCCTCCCGGACCGTGAATAGGAAAAGCACCGATAGCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(第2のIL-2断片)
GCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTAACT
(シグナルペプチド)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(ヒトIL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
(ヒト組織因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(ヒトIL-2)
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT
新鮮なヒト白血球(3名のドナー)を血液バンクから入手し、CD4+CD25+CD127dimTreg細胞をCD4+CD25+CD127dim制御性T細胞分離キットII試薬(Miltenyi Biotec)で単離した。Foxp3+Treg細胞の純度は35%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の48ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を、(1)hIL-2サイトカイン(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで刺激し、37℃、5%CO2で21日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、1日おきに(1)hIL-2サイトカイン(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで再刺激した。7日おきに、細胞を抗CD3/抗CD28ビーズ(1:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)で再刺激した。細胞を、1日おきに(1)hIL-2サイトカイン(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)を含む新鮮な完全培地で21日間にわたって1×106/mLの濃度で維持した。7日目、14日目、および21日目に、細胞を、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(Foxp3染色キットを使用した細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)で染色して、Foxp3+Treg細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Foxp3+Treg細胞の増大倍率を、トリパンブルー(0.4%、Invitrogen)生存率アッセイでカウントすることによって測定した。図1は、hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)で刺激した際の100倍増加と比較した、100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)で刺激したFoxp3+Treg細胞の145倍増加を示す。
新鮮なヒト白血球(3名のドナー)を血液バンクから入手し、CD4+CD25+CD127dimTreg細胞をCD4+CD25+CD127dim制御性T細胞分離キットII試薬(Miltenyi Biotec)で単離した。Foxp3+Treg細胞の純度は35%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の48ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を、(1)hIL-2サイトカイン(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで刺激し、その後、37℃、5%CO2で21日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、1日おきに(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれか再刺激した。7日おきに、細胞を抗CD3/抗CD28ビーズ(1:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)で再刺激した。細胞を、1日おきに(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)を含む新鮮な完全培地で21日間にわたって1×106/mLの濃度で維持した。細胞を、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(Foxp3染色キットを使用した細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)で染色して、Foxp3+Treg細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Foxp3+Treg細胞の増大倍率を、トリパンブルー(0.4%、Invitrogen)生存率アッセイでカウントすることによって測定した。21日目に細胞を回収し、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(Foxp3染色キットを使用した細胞内染色、Invitrogen)、CD127-Alex Fluro 700、Helios PE-Cy7、CTLA-4 Brilliant Violet 605、CD39 APC、CD62L PECy7、CD25 PE、CD103 PerCP.Cy5.5、CD69 APC Fire 750、PD1 Alexa Fluro 750、およびCD49b APCで表面染色し、Foxp3-Pacific Blue(BioLegend)(細胞内染色キット、Invitrogen)を使用して細胞内染色した。表面染色の場合、細胞を、FACS緩衝液(0.5%BSA(EMD Millipore)および0.001%アジ化ナトリウム(Sigma)を含む1×PBS(Hyclone))中で洗浄した(1500RPM、室温で5分間)。2回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー(Celesta-BD Bioscience)によって分析した。細胞内染色の場合、細胞を固定緩衝液(Invitrogen)で、室温で20分間固定した。固定した後、細胞を1×透過処理緩衝液(eBioscience)で洗浄し(1500RPM、室温で5分間)、Foxp3-Pacific Blue (Biolegend)を使用して室温で30分間染色した。細胞を1x透過処理緩衝液で再度洗浄し、その後、FACS緩衝液で洗浄した。細胞ペレットをフローサイトメトリー(Celesta-BD Bioscience)による分析のために300μLのFACS緩衝液中に再懸濁した。(細胞をCD4+CD25+Foxp3+細胞でゲーティングし、表面マーカー%データをプロットした(3名の健常ドナー))。図2A~2Iは、(1)100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで21日間刺激したFoxp3+Treg細胞上の同等の表面マーカーを示す。
新鮮なヒト白血球(3名のドナー)を血液バンクから入手し、CD4+CD25+CD127dimTreg細胞を、CD4+CD25+CD127dimTreg細胞分離キットII(Miltenyi Biotec)を使用して単離した。Foxp3+Treg細胞の純度は35%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の24ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を、(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで刺激し、その後、37℃、5%CO2で一晩インキュベートした。翌日、細胞を回収し、カウントし、96ウェルプレート中に4×106/mLで再懸濁し、50μL/ウェルを、2mMのL-グルタミンを補充したSeahorse XF RPMI培地(pH7.4)中のCell-TakコーティングSeahorse Bioanalyzer XFe96培養プレート中に播種した。細胞を37℃で30分間かけてプレートに付着させた。追加の130μLのアッセイ培地をプレートの各ウェルに(バックグラウンドウェルにも)添加した。プレートを37℃の非CO2インキュベーター内で1時間インキュベートした。キャリブレーションプレートの場合、グルコース/オリゴマイシン/2-デオキシグルコースの10倍溶液をSeahorseアッセイ培地中で調製した。20μL体積のオリゴマイシン/2-デオキシグルコースを、一晩キャリブレーションした細胞外フラックスプレートのポートA、B、およびCに添加した。細胞外酸性化速度(ECAR)を、XFe96 Extracellular Flux Analyzerを使用して測定した。完全なECAR分析は、非解糖酸性化(薬物なし)、解糖(10mMグルコース)、解糖能(2μMオリゴマイシン)、および解糖予備能(100mM 2-デオキシグルコース)の4つの段階からなり、これらをSeahorse Xfe96 software Waveを使用して計算した。結果(図3A~3D)は、活性化ヒトTreg細胞が高レベルのグルコース代謝を呈したことを示した。
新鮮なヒト白血球(3名のドナー)を血液バンクから入手し、CD4+CD25+CD127dim-Treg細胞をCD4+CD25+CD127dim-制御性T細胞分離キットII試薬(Miltenyi Biotec)で単離した。Foxp3+Treg細胞の純度は35%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の24ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を、(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで刺激し、その後、37℃、5%CO2で21日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、1日おきに(1)hIL-2サイトカイン(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで再刺激した。7日おきに、細胞を抗CD3/抗CD28ビーズ(1:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)で再刺激した。細胞を、1日おきに(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)を含む新鮮な完全培地で21日間にわたって1×106/mLの濃度で維持した。Foxp3+Treg細胞の増大倍率を、トリパンブルー(0.4%、Invitrogen)生存率アッセイでカウントすることによって測定した。21日目に、凍結させた自己レスポンダーT(Tresp)細胞を解凍し、Cell Trace Violet(Invitrogen)で標識した。増大したTreg細胞を回収し、カウントした。Treg細胞をレスポンダーT細胞と様々な比率(5:1、2:1、1:1、0.5:1のTreg細胞:レスポンダーT細胞)で培養した。細胞を、(1)抗CD3/抗CD28ビーズ(1:70のビーズ:細胞)および2t2(25nM)、または(2)抗CD3/抗CD28ビーズ(1:70のビーズ:細胞)およびIL2(50IU/mL)のいずれかで再刺激し、5日間培養した。細胞を回収し、FACS緩衝液(0.5%BSA(EMD Millipore)および0.001%アジ化ナトリウム(Sigma)を含む1×PBS(Hyclone))中で洗浄した(1500RPM、室温で5分間)。2回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー(Celesta-BD Bioscience)によって分析した。(CFSE+増殖細胞%増加をプロットした)。図4は、hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)で刺激した細胞と比較した、100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)で刺激したFoxp3+Treg細胞の抑制能を示す。
新鮮なヒト白血球(3名のドナー)を血液バンクから入手し、CD4+CD25+CD127dimTreg細胞をCD4+CD25+CD127dim制御性T細胞分離キットII試薬(Miltenyi Biotec)で単離した。Foxp3+Treg細胞の純度は35%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-APC、CD3 APC-Cy7、Foxp3-PE(細胞内染色、Invitrogen)、およびCD127-Alex Fluro 700(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の24ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を、(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2、抗CD3/抗CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)、およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで刺激し、その後、37℃および5%CO2で21日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、1日おきに(1)hIL-2サイトカイン(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)、または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)のいずれかで再刺激した。7日おきに、細胞を抗CD3/抗CD28ビーズ(1:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)で再刺激した。細胞を、1日おきに(1)hIL-2(500IU/mL)(Proleukin)およびラパマイシン(100nM)(Sigma)または(2)100nMの2t2およびラパマイシン(100nM)(Sigma)を含む新鮮な完全培地で21日間にわたって1×106/mLの濃度で維持した。Foxp3+Treg細胞の増大倍率を、トリパンブルー(0.4%、Invitrogen)生存率アッセイでカウントすることによって測定した。21日目に、凍結させた自己レスポンダーT(Tresp)細胞を解凍し、Cell Trace Violet(Invitrogen)で標識した。増大したTreg細胞を回収し、カウントした。Treg細胞をレスポンダーT細胞と様々な比率(5:1、1:1のTreg細胞:レスポンダーT細胞)で培養した。細胞を、(1)抗CD3/抗CD28ビーズ(1:70のビーズ:細胞)および2t2(25nM)、または(2)抗CD3/抗CD28ビーズ(1:70のビーズ:細胞)およびIL2(50IU/mL)で再刺激し、5日間培養した。無細胞液体培養培地を収集し、LEGENDplexマルチアナライトフローアッセイキット(Biolegend)によって製造業者の指示に従って分析した。図5は、抑制アッセイにおける無細胞液体培養培地中のIL-10を示し、IL-10分泌がIL-2増大Treg細胞と比較して2t2増大Treg細胞で有意に高い(いずれもラパマイシンの存在下または不在下である)。
3t15*-28sの構築および産生
抗CD3scFv/TF/IL15D8N変異体および抗CD28scFv/IL15RαSu融合タンパク質を含む融合タンパク質を生成した。抗CD3抗体(αCD3)可変領域、ヒト組織因子、IL15D8N変異体、抗CD28抗体(αCD28)可変領域、およびIL15RαSuの配列をUniProtウェブサイトから入手し、これらの配列のDNAをGenewizによって合成した。具体的には、この構築物を、αCD3軽鎖可変領域配列を(G4S)3リンカーによりαCD3重鎖可変領域配列に連結してαCD3scFvを形成することによって作製した。αCD3scFvを組織因子219のN末端コード領域に連結し、その後、IL15D8N変異体のN末端コード領域に連結した(図6A~6B)。構築物の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。
(シグナルペプチド)
ATGAAGTGGGTGACCTTCATCAGCTTATTATTTTTATTCAGCTCCGCCTATTCC
(αCD3軽鎖可変領域)
CAGATCGTGCTGACCCAAAGCCCCGCCATCATGAGCGCTAGCCCCGGTGAGAAGGTGACCATGACATGCTCCGCTTCCAGCTCCGTGTCCTACATGAACTGGTATCAGCAGAAAAGCGGAACCAGCCCCAAAAGGTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCTCCGGAGTGCCCGCTCATTTCCGGGGCTCTGGATCCGGCACCAGCTACTCTTTAACCATTTCCGGCATGGAAGCTGAAGACGCTGCCACCTACTATTGCCAGCAATGGAGCAGCAACCCCTTCACATTCGGATCTGGCACCAAGCTCGAAATCAATCGT
(リンカー)
GGAGGAGGTGGCAGCGGCGGCGGTGGATCCGGCGGAGGAGGAAGC
(αCD3重鎖可変領域)
CAAGTTCAACTCCAGCAGAGCGGCGCTGAACTGGCCCGGCCCGGCGCCTCCGTCAAGATGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACATTTACTCGTTACACAATGCATTGGGTCAAGCAGAGGCCCGGTCAAGGTTTAGAGTGGATCGGATATATCAACCCTTCCCGGGGCTACACCAACTATAACCAAAAGTTCAAGGATAAAGCCACTTTAACCACTGACAAGAGCTCCTCCACCGCCTACATGCAGCTGTCCTCTTTAACCAGCGAGGACTCCGCTGTTTACTACTGCGCTAGGTATTACGACGACCACTACTGTTTAGACTATTGGGGACAAGGTACCACTTTAACCGTCAGCAGC
(ヒト組織因子219形態)
TCCGGCACCACCAATACCGTGGCCGCTTATAACCTCACATGGAAGAGCACCAACTTCAAGACAATTCTGGAATGGGAACCCAAGCCCGTCAATCAAGTTTACACCGTGCAGATCTCCACCAAATCCGGAGACTGGAAGAGCAAGTGCTTCTACACAACAGACACCGAGTGTGATTTAACCGACGAAATCGTCAAGGACGTCAAGCAAACCTATCTGGCTCGGGTCTTTTCCTACCCCGCTGGCAATGTCGAGTCCACCGGCTCCGCTGGCGAGCCTCTCTACGAGAATTCCCCCGAATTCACCCCTTATTTAGAGACCAATTTAGGCCAGCCTACCATCCAGAGCTTCGAGCAAGTTGGCACCAAGGTGAACGTCACCGTCGAGGATGAAAGGACTTTAGTGCGGCGGAATAACACATTTTTATCCCTCCGGGATGTGTTCGGCAAAGACCTCATCTACACACTGTACTATTGGAAGTCCAGCTCCTCCGGCAAAAAGACCGCTAAGACCAACACCAACGAGTTTTTAATTGACGTGGACAAAGGCGAGAACTACTGCTTCAGCGTGCAAGCCGTGATCCCTTCTCGTACCGTCAACCGGAAGAGCACAGATTCCCCCGTTGAGTGCATGGGCCAAGAAAAGGGCGAGTTCCGGGAG
(ヒトIL15D8N変異体)
AACTGGGTGAACGTCATCAGCAATTTAAAGAAGATCGAAGATTTAATTCAGTCCATGCATATCGACGCCACTTTATACACAGAATCCGACGTGCACCCCTCTTGTAAGGTGACCGCCATGAAATGTTTTTTACTGGAGCTGCAAGTTATCTCTTTAGAGAGCGGAGACGCTAGCATCCACGACACCGTGGAGAATTTAATCATTTTAGCCAATAACTCTTTATCCAGCAACGGCAACGTGACAGAGTCCGGCTGCAAGGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAGAACATCAAGGAGTTTCTGCAATCCTTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATCAATACCTCC
(シグナルペプチド)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD3軽鎖可変領域)
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR
(リンカー)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD3重鎖可変領域)
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
(ヒト組織因子219)
SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTYLARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLETNLGQPTIQSFEQVGTKVNVTVEDERTLVRRNNTFLSLRDVFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKTAKTNTNEFLIDVDKGENYCFSVQAVIPSRTVNRKSTDSPVECMGQEKGEFRE
(ヒトIL15D8N変異体)
NWVNVISNLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
(シグナルペプチド)
ATGAAATGGGTCACCTTCATCTCTTTACTGTTTTTATTTAGCAGCGCCTACAGC
(αCD28軽鎖可変領域)
GTGCAGCTGCAGCAGTCCGGACCCGAACTGGTCAAGCCCGGTGCCTCCGTGAAAATGTCTTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCTCCTACGTCATCCAATGGGTGAAGCAGAAGCCCGGTCAAGGTCTCGAGTGGATCGGCAGCATCAATCCCTACAACGATTACACCAAGTATAACGAAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACTCTGACAAGCGACAAGAGCTCCATTACCGCCTACATGGAGTTTTCCTCTTTAACTTCTGAGGACTCCGCTTTATACTATTGCGCTCGTTGGGGCGATGGCAATTATTGGGGCCGGGGAACTACTTTAACAGTGAGCTCC
(リンカー)
GGCGGCGGCGGAAGCGGAGGTGGAGGATCTGGCGGTGGAGGCAGC
(αCD28重鎖可変領域)
GACATCGAGATGACACAGTCCCCCGCTATCATGAGCGCCTCTTTAGGAGAACGTGTGACCATGACTTGTACAGCTTCCTCCAGCGTGAGCAGCTCCTATTTCCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCTCCTCCCCTAAACTGTGTATCTACTCCACAAGCAATTTAGCTAGCGGCGTGCCTCCTCGTTTTAGCGGCTCCGGCAGCACCTCTTACTCTTTAACCATTAGCTCTATGGAGGCCGAAGATGCCGCCACATACTTTTGCCATCAGTACCACCGGTCCCCTACCTTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGACCAAGCGG
(ヒト IL15RαSu)
ATTACATGCCCCCCTCCCATGAGCGTGGAGCACGCCGACATCTGGGTGAAGAGCTATAGCCTCTACAGCCGGGAGAGGTATATCTGTAACAGCGGCTTCAAGAGGAAGGCCGGCACCAGCAGCCTCACCGAGTGCGTGCTGAATAAGGCTACCAACGTGGCTCACTGGACAACACCCTCTTTAAAGTGCATCCGG
(シグナルペプチド)
MKWVTFISLLFLFSSAYS
(αCD28軽鎖可変領域)
VQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVIQWVKQKPGQGLEWIGSINPYNDYTKYNEKFKGKATLTSDKSSITAYMEFSSLTSEDSALYYCARWGDGNYWGRGTTLTVSS
(リンカー)
GGGGSGGGGSGGGGS
(αCD28重鎖可変領域)
DIEMTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYFHWYQQKPGSSPKLCIYSTSNLASGVPPRFSGSGSTSYSLTISSMEAEDAATYFCHQYHRSPTFGGGTKLETKR
(ヒトIL-15Rαのsushiドメイン)
ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
抗TF抗体アフィニティーカラムを、GE Healthcare AKTA Avantシステムに接続した。流速は、2mL/分の溶出ステップを除くすべてのステップで4mL/分であった。
Superdex 200 Increase 10/300 GLゲル濾過カラム(GE Healthcare製)をAKTA Avantシステム(GE Healthcare製)に接続した。カラムを2カラム体積のPBSで平衡化した。流速は0.8mL/分であった。キャピラリーループを使用して、3t15*-28s(1mg/mL)の試料200μLをカラムに注入した。その後、注入を1.25カラム体積のPBSで追跡した。SECクロマトグラフを図8に示した。結果は、3t15*-28sの単量体形態および二量体形態、または他の異なる形態を表す可能性が高い4つのタンパク質ピークが存在することを示した。
純度およびタンパク質分子量を決定するために、抗TF抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した3t15*-28sタンパク質試料を、還元条件下で標準ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル(4~12%NuPageビス-トリスゲル)電気泳動(SDS-PAGE)法によって分析した。ゲルをInstantBlueで約30分間染色し、その後、精製水で一晩脱染した。図9は、抗TF抗体アフィニティークロマトグラフィーで精製した3t15*-28sのSDSゲルを示す。結果は、精製した3t15*-28sが、還元SDS PAGE中で予想された分子量(72kDa)のタンパク質バンドを含むことを示した。
ELISAベースの方法により、3t15*-28s融合タンパク質複合体の形成を確認した。3t15*-28sがCD28およびCD3と相互作用するかを評価するために(図10A~10B)、50mM炭酸緩衝液pH9.4(100μl/ウェル)中10μg/mLのヒトCD28-Fc(カタログ番号CD8-H525a、Acro Biosystems)または10μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロ二量体-ラマFc/ラマFc(カタログ番号CDD-H5258、Acro Biosystems)をELISAプレート(カタログ番号80040LE 0910、ThermoFisher)に塗布し、4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをELISA洗浄緩衝液(0.05%Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水)で3回洗浄し、ブロッキング緩衝液(1%BSA-PBS)で1時間ブロックした。減少濃度(ブロッキング緩衝液中3~0.00243μg/mL)の3t15*-28sまたは陰性対照融合タンパク質(同じTFドメインを含むHCW9218)をプレートに添加し、プレートを25℃で1時間インキュベートした。プレートをELISA洗浄緩衝液で3回洗浄した。0.1μg/mLの検出抗体であるビオチン化抗TF抗体(カタログ番号 BAF2339、R&D Systems)をプレートに添加し、25℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄し、0.25μg/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼ-ストレプトアビジン(コード番号016-030-084、Jackson ImmunoResearch)をプレートに添加し、25℃で30分間インキュベートした。プレートを洗浄し、HRPの基質であるABTS(カタログ番号ABTS-1000-01、Surmodics)をプレートに添加し、25℃で20分間インキュベートした。プレートを、マイクロプレートリーダー(Multiscan Sky、Thermo Scientific)を用いてOD405nmで読み取った。図10A~10Bに示されるように、3t15*-28sはCD28およびCD3と相互作用したが、対照融合タンパク質HCW9218は相互作用しなかった。3t15*-28s融合タンパク質複合体のαCD3scFvドメインおよびαCD28scFvドメインは、CD3およびCD28に結合することができた。それぞれ、CD28および抗TF抗体へのαCD28scFvドメインおよびTFドメインの結合(図10A)により、精製タンパク質が3t15*-28sヘテロ二量体複合体で構成されたことが確認された。
新鮮なヒト白血球(3名のドナー)を血液バンクから入手し、CD4+CD25+CD127low制御性T細胞をEasySepヒトCD4+CD25+CD127low制御性T細胞単離キット(StemCell Technology)で単離した。Foxp3+制御性T細胞の純度は35%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、およびFoxp3-PacBlue抗体(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の24ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を2t2(100nM)および3t15*-28s(200nM)で刺激し、37℃、5%CO2で11日間インキュベートした。増大期間中、細胞を、1日おきに2t2(100nM)および3t28(200nM)を含む新鮮な完全培地で11日間にわたって1×106/mLの濃度で維持した。その後、細胞を、CD4-Alexa Fluro 488、CD25-PE、CD3 APC-Cy7、およびFoxp3-PacBlue抗体(BioLegend)で染色して、Foxp3+制御性T細胞の増大をフローサイトメトリーによって評価した。Foxp3+制御性T細胞の増大倍数を、トリパンブルー(0.4%、Invitrogen)排除法を使用してカウントすることによって測定した。図11は、11日目にFoxp3+制御性T細胞が2.5倍増加したことを示す。
新鮮なヒト白血球(2名のドナー)を血液バンクから入手し、PBMC(末梢血単核細胞)をFicoll分離法で単離した。細胞をカウントし、PBS中に1×107細胞/mLの密度で再懸濁した。2μMの最終濃度のCell-Trace Violet Dye(Life Technologies)を細胞に添加し、5%CO2雰囲気下37°Cで20分間インキュベートした。細胞を、2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、抗生物質(ペニシリン:10,000単位/mL、ストレプトマイシン:10,000μg/mL、Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充した新鮮な予温したRPMI1640培地(Gibco)中に室温で5分間にわたって10倍体積で再懸濁した。細胞を1200rpmで10分間2回洗浄し、カウントし、2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、抗生物質(ペニシリン:10,000単位/mL、ストレプトマイシン:10,000μg/mL、Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640培地(Gibco)中に2×106細胞/mLの密度で再懸濁した。細胞(0.1mL)を96ウェル平底プレートに移し、抗組織因子抗体(抗TF抗体、0.01~100nM)の存在下または不在下で2t2(100nM)および3t15*-28s(0.01~1000nM)とインキュベートした。刺激の15分前に、3t15*-28sと抗組織因子抗体の複合体を2:1の比率で作製した。培地の半分を除去し、抗組織因子抗体の存在下または不在下で新鮮な2t2(100nM)および3t15*-28sと48~72時間おきに交換した。細胞を、CD4-Alexa Fluro 488、CD3-PE、CD8-PerCP Cy5.5抗体(BioLegend)で染色して、フローサイトメトリーによってCell Trace Violetの希釈を評価した。
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。白血球の半分を使用して、CD4+CD25+CD127low制御性T細胞をEasySepヒトCD4+CD25+CD127low制御性T細胞分離キット(StemCell Technology)で精製した。Foxp3+制御性T細胞の純度は60%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue(BioLegend)での染色により確認した。白血球の残りの半分を使用して、CD39+Foxp3+制御性T細胞を二段階プロセスで精製した。第1のCD4+T細胞を、RosetteSepヒトCD4+細胞分離キット(StemCell Technology)で分離した。CD4+T細胞を濃縮した後、CD39+CD4+細胞を、新規ビオチン化抗CD39抗体試薬(HCW Biologic)および磁性粒子(EasySepヒトビオチンポジティブセレクションキット、StemCell Technology)を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue抗体(BioLegend)で染色して、CD39+Foxp3+制御性T細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した(細胞をCD3+CD4+Foxp3+でゲーティングした)。フローサイトメーターによる精製後純度分析により、EasySepヒトCD4+CD25+CD127low制御性T細胞単離キット(StemCell Technology)で単離した細胞の62%と比較して、ビオチン化抗CD39抗体を使用して精製した細胞では84.8%のCD39+であったことが示された。このデータは、高度に純粋で表現型的に活性な制御性T細胞を単離するための新規戦略を実証する(図13A)。これらの細胞を、上記の方法により、hIL-2、抗CD3/抗CD28ビーズ、ラパマイシン、2t2、3t15*、および/または3t15*-28s:抗TF抗体複合体を含む培地中で増大させることができる。
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。白血球の半分を使用して、CD4+CD25+CD127low制御性T細胞をEasySepヒトCD4+CD25+CD127low制御性T細胞分離キット(StemCell Technology)で精製した。Foxp3+制御性T細胞の純度は60%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue(BioLegend)での染色により確認した。白血球の残りの半分を使用して、CD39+Foxp3+制御性T細胞を二段階プロセスで精製した。第1のCD4+T細胞を、RosetteSepヒトCD4+細胞分離キット(StemCell Technology)で分離した。CD4+T細胞を濃縮した後、CD39+CD4+細胞を、新規ビオチン化抗CD39抗体試薬(HCW Biologics)および磁性粒子(EasySepヒトビオチンポジティブセレクションキット、StemCell Technology)を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞を、CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue抗体(BioLegend)で染色して、CD39+Foxp3+制御性T細胞の純度をフローサイトメトリーによって評価した(細胞をCD3+CD4+Foxp3+でゲーティングした)。自己レスポンダーT(Tresp)細胞をCell Trace Violet(Invitrogen)で標識した。精製したFoxp3+T細胞をレスポンダーT細胞と培養した(1:1の制御性T細胞:レスポンダーT細胞)。細胞を2t2(10nM)で再刺激し、5日間培養した。細胞を回収し、FACS緩衝液(0.5%BSA(EMD Millipore)および0.001%アジ化ナトリウム(Sigma)を含む1×PBS(Hyclone))中で洗浄した(1500RPM、室温で5分間)。2回洗浄した後、細胞をフローサイトメトリー(Celesta-BD Bioscience)によって分析し、分裂レスポンダーT細胞%をCell Trace Violet希釈に基づいて決定した。図14は、精製したCD39+Foxp3+制御性T細胞が、CD4+CD25+CD127low制御性T細胞に基づいて単離された細胞と比較して、レスポンダーT細胞の増殖の抑制により効果的であったことを示す。
新鮮なヒト白血球を血液バンクから入手した。EasySepヒトCD4+CD25+CD127low制御性T細胞分離キット(StemCell Technology)でのCD4+CD25+CD127low制御性T細胞。Foxp3+制御性T細胞の純度は60%超であり、CD4-Alexa Fluro 488、CD39-APC、CD3 PE、Foxp3-PacBlue(BioLegend)での染色により確認した。細胞をカウントし、完全培地(2mM L-グルタミン(Thermo Life Technologies)、ペニシリン(Thermo Life Technologies)、ストレプトマイシン(Thermo Life Technologies)、および10%FBS(Hyclone)を補充したRPMI1640(Gibco))中の24ウェル平底プレート中に1×106/mLで再懸濁した。細胞を100nMの2t2およびCD3/CD28ビーズ(4:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)で刺激し、37℃、5%CO2で21日間インキュベートした。増大期間中、細胞を1日おきに100nMの2t2で再刺激し、細胞を7日おきにCD3/CD28ビーズ(1:1のビーズ:細胞)(Dynabeads、Life Technologies)で再刺激した。細胞を、1日おきに100nMの2t2を含む新鮮な完全培地で最大21日間にわたって1×106/mLの濃度で維持した。
本発明が発明を実施するための形態と併せて記載されているが、前述の記載が例証することを意図しており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (367)
- Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、
Treg細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、前記液体培養培地が、
CD3/CD28結合剤と、
第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインがIL-2受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドと
を含む、方法。 - 前記液体培養培地が、前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが、前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが同じアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが可溶性IL-2を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性IL-2がヒト可溶性IL-2である、請求項11に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが各々、配列番号1と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが各々、配列番号1と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが各々、配列番号1の配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項1~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号3と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号3と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項25に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号3の配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号4と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項27に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号4と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号4の配列を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約500nMの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約150nMの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記CD3/CD28結合剤が抗CD3/抗CD28ビーズである、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が前記抗CD3/抗CD28ビーズを約1:1~約6:1のビーズ/細胞比で含む、請求項33に記載の方法。
- 前記液体培養培地が前記抗CD3/抗CD28ビーズを約3:1~約5:1のビーズ/細胞比で含む、請求項34に記載の方法。
- 前記CD3/CD28結合剤が、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。 - 前記液体培養培地が、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項36に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項36~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが、前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項36~40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項36~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項36~42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3がヒトCD3である、請求項36~44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5の配列を含む、請求項47に記載の方法。
- 前記CD28がヒトCD28である、請求項36~48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6の配列を含む、請求項51に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項36~52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項55に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項36~52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項36~52のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項36~52のいずれか一項に記載の方法。 - 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項36~59のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項36~60のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号7と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号7と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項62に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号7の配列を含む、請求項63に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号8と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号8と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドが配列番号8の配列を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約1000nMの前記追加の単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項36~67のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約300nMの前記追加の単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項68に記載の方法。
- 前記CD3/CD28結合剤が多鎖キメラポリペプチドであり、
前記多鎖キメラポリペプチドが、
(a)(i)第1の標的結合ドメイン、
(ii)可溶性組織因子ドメイン、および
(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメイン
を含む、第1のキメラポリペプチド、ならびに
(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および
(ii)第2の標的結合ドメイン
を含む、第2のキメラポリペプチド
を含み、
前記第1のキメラポリペプチドと前記第2のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインと前記第2のドメインとの結合を介して会合し、
前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合するか、または前記第1の標的結合ドメインがCD28に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD3に結合する、
請求項1~32のいずれか一項に記載の方法。 - 前記液体培養培地が、前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項70に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項72に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項73に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項70~74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが、前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項70~74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項70~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項70~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3がヒトCD3である、請求項70~78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項79に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項80に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5の配列を含む、請求項81に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項70~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項83に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項84に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項85に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項70~82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項70~82のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項70~82のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項70~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが配列番号102と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが配列番号102と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項91に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが配列番号102の配列を含む、請求項92に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが配列番号104と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが配列番号104と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項94に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが配列番号104の配列を含む、請求項95に記載の方法。
- 前記CD28がヒトCD28である、請求項70~96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項97に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項98に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6の配列を含む、請求項99に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが配列番号106と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが配列番号106と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項101に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが配列番号106の配列を含む、請求項102に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが配列番号108と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項70に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが配列番号108と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項104に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが配列番号108の配列を含む、請求項105に記載の方法。
- 前記多鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項70~106のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約1000nMの前記多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項70~107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約300nMの前記多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項108に記載の方法。
- 前記液体培養培地がmTOR阻害剤をさらに含む、請求項1~109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記mTOR阻害剤がラパマイシンである、請求項110に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約500nMの前記mTOR阻害剤を含む、請求項110または111に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約150nMの前記mTOR阻害剤を含む、請求項112に記載の方法。
- 前記液体培養培地がmTOR阻害剤を含まない、請求項1~109のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間の開始後36時間~約60時間毎に前記液体培養培地に前記単鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む、請求項1~114のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約10nM~約500nMの濃度の前記単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項115に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約50nM~約150nMの濃度の前記単鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項116に記載の方法。
- 前記期間の開始後約6日~約8日毎に前記液体培養培地に前記CD3/CD28結合剤を定期的に添加することをさらに含む、請求項1~117のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が約7日間~約56日間である、請求項1~118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が約15日間~約25日間である、請求項119に記載の方法。
- 前記培養する工程の前に、対象から得られた試料から前記Treg細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1~120のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養する工程の後に、対象から得られた試料から前記Treg細胞を単離する工程をさらに含む、請求項1~120のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離する工程が蛍光支援細胞選別の使用を含む、請求項121または122に記載の方法。
- 前記Treg細胞が、末梢血または臍帯血から単離された、自己Treg細胞、ハプロタイプ一致Treg細胞、または同種異系Treg細胞である、請求項1~123のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+Foxp3+細胞である、請求項1~124のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+CD127dim細胞である、請求項1~124のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項1~126のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~127のいずれか一項に記載の方法によって生成されたTreg細胞の集団。
- 請求項128に記載のTreg細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
- 治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項129に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項130に記載の方法。
- 前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、2型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、COPD、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、NAFLD、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項131に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、CNS損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項131に記載の方法。
- (i)CD3/CD28結合剤と、
(ii)第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインがIL-2受容体に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、
(iii)mTOR阻害剤と
を含む、キット。 - 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項134に記載のキット。
- 前記CD3/CD28結合剤が抗CD3/抗CD28ビーズである、請求項134または135に記載のキット。
- 前記CD3/CD28結合剤が、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む追加の単鎖キメラポリペプチドであり、
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、請求項134または135に記載のキット。 - 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項137に記載のキット。
- 前記CD3/CD28結合剤が多鎖キメラポリペプチドであり、
前記多鎖キメラポリペプチドが、
(a)(i)第1の標的結合ドメイン、
(ii)可溶性組織因子ドメイン、および
(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメイン
を含む、第1のキメラポリペプチド、ならびに
(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および
(ii)第2の標的結合ドメイン
を含む、第2のキメラポリペプチド
を含み、
前記第1のキメラポリペプチドと前記第2のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインと前記第2のドメインとの結合を介して会合し、
前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合するか、または前記第1の標的結合ドメインがCD28に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD3に結合する、
請求項134または135に記載のキット。 - 前記液体培養培地が、前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項139に記載の方法。
- Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、
Treg細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、前記液体培養培地が、
IL-2受容体活性化剤と、
第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドと
を含み、
前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、方法。 - 前記液体培養培地が、前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項141に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項142に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項143に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項144に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項141~145のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが、前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項141~145のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項141~147のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項141~147のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3がヒトCD3である、請求項141~149のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項150に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項151に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインが配列番号5の配列を含む、請求項152に記載の方法。
- 前記CD28がヒトCD28である、請求項141~153のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項154に記載の方法。
- 前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項155に記載の方法。
- 前記第2の標的結合ドメインが配列番号6の配列を含む、請求項156に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項141~157のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項158に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項159に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項160に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項141~157のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項141~157のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項141~157のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項141~164のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項141~165のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号7と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項141に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号7と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項167に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号7の配列を含む、請求項168に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号8と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項169に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号8と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項170に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号8の配列を含む、請求項171に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約1000nMの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項141~172のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約300nMの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項173に記載の方法。
- 前記IL-2受容体活性化剤が可溶性IL-2である、請求項141~174のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性IL-2がヒト可溶性IL-2である、請求項175に記載の方法。
- 前記ヒト可溶性IL-2が配列番号1と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項176に記載の方法。
- 前記ヒト可溶性IL-2が配列番号1と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項177に記載の方法。
- 前記ヒト可溶性IL-2が配列番号1の配列を含む、請求項178に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約100IU/mL~約800IU/mLの前記ヒト可溶性IL-2を含む、請求項176~179のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約400IU/mL~約600IU/mLの前記ヒト可溶性IL-2を含む、請求項180に記載の方法。
- 前記液体培養培地がmTOR阻害剤をさらに含む、請求項141~181のいずれか一項に記載の方法。
- 前記mTOR阻害剤がラパマイシンである、請求項182に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約500nMの前記mTOR阻害剤を含む、請求項182または183に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約150nMの前記mTOR阻害剤を含む、請求項184に記載の方法。
- 前記液体培養培地がmTOR阻害剤を含まない、請求項141~181のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間の開始後36時間~約60時間毎に前記液体培養培地に前記IL-2受容体活性化剤を定期的に添加することをさらに含む、請求項141~186のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地中に約10nM~約1000nMの濃度の前記IL-2受容体活性化剤をもたらすように前記IL-2受容体活性化剤の前記定期的な添加が行われる、請求項187に記載の方法。
- 前記液体培養培地中に約50nM~約150nMの濃度の前記IL-2受容体活性化剤をもたらすように前記IL-2受容体活性化剤の前記定期的な添加が行われる、請求項188に記載の方法。
- 前記期間の開始後約6日~約8日毎に前記液体培養培地に前記単鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む、請求項141~189のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が約7日間~約56日間である、請求項141~190のいずれか一項に記載の方法。
- 前記請求項の期間が約15日間~約25日間である、請求項191に記載の方法。
- 前記培養する工程の前に、対象から得られた試料から前記Treg細胞を単離する工程をさらに含む、請求項141~192のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養する工程の後に、対象から得られた試料から前記Treg細胞を単離する工程をさらに含む、請求項141~192のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離する工程が蛍光支援細胞選別の使用を含む、請求項193または194に記載の方法。
- 前記Treg細胞が、末梢血または臍帯血から単離された、自己Treg細胞、ハプロタイプ一致Treg細胞、または同種異系Treg細胞である、請求項141~195のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+Foxp3+細胞である、請求項141~196のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+CD127dim細胞である、請求項141~196のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項141~198のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項141~199のいずれか一項に記載の方法によって生成されたTreg細胞の集団。
- 請求項200に記載のTreg細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
- 治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項201に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項202に記載の方法。
- 前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、2型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、COPD、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、NAFLD、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項203に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、CNS損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項203に記載の方法。
- (i)インターロイキン-2受容体活性化剤と、
(ii)第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであって、前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、単鎖キメラポリペプチドと、
(iii)mTOR阻害剤と
を含む、キット。 - 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項206に記載のキット。
- Treg細胞の増殖を刺激するまたは増加させる方法であって、
Treg細胞をある期間にわたって液体培養培地中で培養する工程を含み、前記期間の初めに、前記液体培養培地が、
CD3/CD28結合剤と、
多鎖キメラポリペプチドであって、
(a)(i)第1の標的結合ドメイン、
(ii)可溶性組織因子ドメイン、および
(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメイン
を含む、第1のキメラポリペプチド、ならびに
(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および
(ii)第2の標的結合ドメイン
を含む、第2のキメラポリペプチド
を含み、
前記第1のキメラポリペプチドと前記第2のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインと前記第2のドメインとの結合を介して会合する、
多鎖キメラポリペプチドと
を含む、方法。 - 前記液体培養培地が、前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項208に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項209に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項210に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項211に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが、前記第1のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している、請求項208~212のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが、前記第1のキメラポリペプチド内の前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項208~212のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインと前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインとが、前記第1のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している、請求項208~214のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが、前記第1のキメラポリペプチド内の前記可溶性組織因子ドメインと前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項208~214のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一対の親和性ドメインの前記第2のドメインと前記第2の標的結合ドメインとが、前記第2のキメラポリペプチド内で互いに直接隣接している、請求項208~216のいずれか一項に記載の方法。
- 第2のキメラポリペプチドが、前記第2のキメラポリペプチド内の前記一対の親和性ドメインの前記第2のドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項208~216のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが同じ抗原に特異的に結合する、請求項208~218のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインが異なる抗原に特異的に結合する、請求項208~218のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインの一方または両方が抗原結合ドメインである、請求項208~220のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインの一方または両方が、CD16a、CD28、CD3、CD33、CD20、CD19、CD22、CD123、IL-1R、IL-1、VEGF、IL-6R、IL-4、IL-10、PDL-1、TIGIT、PD-1、TIM3、CTLA4、MICA、MICB、IL-6、IL-8、TNFα、CD26、CD36、ULBP2、CD30、CD200、IGF-1R、MUC4AC、MUC5AC、Trop-2、CMET、EGFR、HER1、HER2、HER3、PSMA、CEA、B7H3、EPCAM、BCMA、P-カドヘリン、CEACAM5、UL16結合タンパク質、HLA-DR、DLL4、TYRO3、AXL、MER、CD122、CD155、PDGF-DD、TGF-β受容体II(TGF-βRII)リガンド、TGF-βRIIIリガンド、DNAM-1リガンド、NKp46リガンド、NKp44リガンド、NKG2Dリガンド、NKp30リガンド、scMHCIリガンド、scMHCIIリガンド、scTCRリガンド、IL-1受容体、IL-2受容体、IL-3受容体、IL-7受容体、IL-8受容体、IL-10受容体、IL-12受容体、IL-15受容体、IL-17受容体、IL-18受容体、IL-21受容体、PDGF-DD受容体、幹細胞因子(SCF)受容体、幹細胞様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3L)受容体、MICA受容体、MICB受容体、ULP16結合タンパク質受容体、CD155受容体、CD122受容体、およびCD28受容体からなる群より選択される標的に特異的に結合する、請求項208~221のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインの一方または両方が可溶性インターロイキンまたはサイトカインタンパク質である、請求項208~220のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性インターロイキン、サイトカイン、またはリガンドタンパク質が、IL-1、IL-2、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、PDGF-DD、SCF、およびFLT3Lからなる群より選択される、請求項223に記載の方法。
- 前記第1の標的結合ドメインおよび前記第2の標的結合ドメインの一方または両方が可溶性インターロイキンまたはサイトカイン受容体である、請求項208~220のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性受容体が、可溶性TGF-β受容体II(TGF-βRII)、可溶性TGF-βRIII、可溶性NKG2D、可溶性NKp30、可溶性NKp44、可溶性NKp46、可溶性DNAM-1、scMHCI、scMHCII、scTCR、可溶性CD155、または可溶性CD28である、請求項225に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドが1つ以上の追加の標的結合ドメインをさらに含む、請求項208~226のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のキメラポリペプチドが1つ以上の追加の標的結合ドメインをさらに含む、請求項208~227のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一対の親和性ドメインが、ヒトIL-15受容体アルファ鎖(IL15Rα)由来のsushiドメイン、および可溶性IL-15である、請求項208~228のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性IL-15がD8NまたはD8Aアミノ酸置換を有する、請求項229に記載の方法。
- 前記一対の親和性ドメインが、バルナーゼとバルンスター(barnstar)、PKAとAKAP、変異RNase I断片に基づくアダプター/ドッキングタグモジュール、ならびにタンパク質シンタキシン、シナプトタグミン、シナプトブレビン、およびSNAP25の相互作用に基づくSNAREモジュールからなる群より選択される、請求項208~228のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項208~231のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項232に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項233に記載の方法。
- 前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項234に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項208~231のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項208~231のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項208~231のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項208~238のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項208~239のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3/CD28結合剤が抗CD3/抗CD28ビーズである、請求項208~240のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が前記抗CD3/抗CD28ビーズを約1:1~約6:1のビーズ/細胞比で含む、請求項241に記載の方法。
- 前記液体培養培地が前記抗CD3/抗CD28ビーズを約3:1~約5:1のビーズ/細胞比で含む、請求項242に記載の方法。
- 前記CD3/CD28結合剤が、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、
前記単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、前記単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、請求項208~240のいずれか一項に記載の方法。 - 前記液体培養培地が、前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項244に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項245に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項246に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項247に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項244~248のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが、前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項244~248のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項244~250のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項244~250のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3がヒトCD3である、請求項244~252のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項253に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項254に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5の配列を含む、請求項255に記載の方法。
- 前記CD28がヒトCD28である、請求項244~256のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項257に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項258に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6の配列を含む、請求項259に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項244~260のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項261に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項262に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項263に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項244~260のいずれか一項に記載の方法。
- 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項244~260のいずれか一項に記載の方法。 - 前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項244~260のいずれか一項に記載の方法。 - 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項244~267のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項244~268に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号7と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項244に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号7と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項270に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号7の配列を含む、請求項271に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号8と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項272に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号8と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項273に記載の方法。
- 前記単鎖キメラポリペプチドが配列番号8の配列を含む、請求項274に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約1000nMの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項244~275のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約300nMの前記単鎖キメラポリペプチドを含む、請求項276に記載の方法。
- 前記CD3/CD28結合剤が追加の多鎖キメラポリペプチドであり、
前記追加の多鎖キメラポリペプチドが、
(a)(i)第1の標的結合ドメイン、
(ii)可溶性組織因子ドメイン、および
(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメイン
を含む、第1のキメラポリペプチド、ならびに
(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および
(ii)第2の標的結合ドメイン
を含む、第2のキメラポリペプチド
を含み、
前記第1のキメラポリペプチドと前記第2のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインと前記第2のドメインとの結合を介して会合し、
前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合するか、または前記第1の標的結合ドメインがCD28に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD3に結合する、
請求項208~240のいずれか一項に記載の方法。 - 前記液体培養培地が、前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項278に記載の方法。
- 前記IgG1抗体構築物が、配列番号66、67または74、および68のCDRを含む重鎖可変ドメインと、配列番号69、70、および71のCDRを含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項279に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72と少なくとも90%同一の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項280に記載の方法。
- 前記重鎖可変ドメインが配列番号72を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号73を含む、請求項281に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインと前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインとが互いに直接隣接している、請求項278~282のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが、前記第1の標的結合ドメインと前記可溶性組織因子ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項278~282のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとが互いに直接隣接している、請求項278~284のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが、前記可溶性組織因子ドメインと前記第2の標的結合ドメインとの間にリンカー配列をさらに含む、請求項278~284のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3がヒトCD3である、請求項278~286のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のキメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項287に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項288に記載の方法。
- 前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインが配列番号5の配列を含む、請求項289に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが可溶性ヒト組織因子ドメインである、請求項278~290のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項291に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項292に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性ヒト組織因子ドメインが配列番号2の配列を含む、請求項293に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、野生型可溶性ヒト組織因子由来の配列を含むか、またはそれからなる、請求項278~290のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちのいずれも含まない、請求項278~290のいずれか一項に記載の方法。 - 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸20位に対応するアミノ酸位置におけるリジン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸22位に対応するアミノ酸位置におけるイソロイシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸45位に対応するアミノ酸位置におけるトリプトファン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸58位に対応するアミノ酸位置におけるアスパラギン酸、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸94位に対応するアミノ酸位置におけるチロシン、
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸135位に対応するアミノ酸位置におけるアルギニン、および
成熟野生型ヒト組織因子タンパク質のアミノ酸140位に対応するアミノ酸位置におけるフェニルアラニン
のうちの1つ以上を含む、請求項278~290のいずれか一項に記載の方法。 - 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインが血液凝固を開始しない、請求項278~297のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが配列番号102と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項278に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが配列番号102と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項299に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが配列番号102の配列を含む、請求項300に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが配列番号104と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項278に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが配列番号104と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項302に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第1のキメラポリペプチドが配列番号104の配列を含む、請求項303に記載の方法。
- 前記CD28がヒトCD28である、請求項278~304のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項305に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項306に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインが配列番号6の配列を含む、請求項307に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが配列番号106と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項278に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが配列番号106と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項309に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが配列番号106の配列を含む、請求項310に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが配列番号108と少なくとも80%同一の配列を含む、請求項311に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが配列番号108と少なくとも90%同一の配列を含む、請求項312に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記第2のキメラポリペプチドが配列番号108の配列を含む、請求項313に記載の方法。
- 前記追加の多鎖キメラポリペプチドが血液凝固を開始しない、請求項278~314に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約1000nMの前記追加の多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項278~315のいずれか一項に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約300nMの前記追加の多鎖キメラポリペプチドを含む、請求項316に記載の方法。
- 前記液体培養培地がmTOR阻害剤をさらに含む、請求項208~317のいずれか一項に記載の方法。
- 前記mTOR阻害剤がラパマイシンである、請求項318に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約10nM~約500nMの前記mTOR阻害剤を含む、請求項318または319に記載の方法。
- 前記液体培養培地が約50nM~約150nMの前記mTOR阻害剤を含む、請求項320に記載の方法。
- 前記液体培養培地がmTOR阻害剤を含まない、請求項208~317のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間の開始後36時間~約60時間毎に前記液体培養培地に前記多鎖キメラポリペプチドを定期的に添加することをさらに含む、請求項208~322のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約10nM~約500nMの濃度の前記多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項323に記載の方法。
- 前記多鎖キメラポリペプチドの前記定期的な添加が、前記液体培養培地中に約50nM~約150nMの濃度の前記多鎖キメラポリペプチドをもたらすように行われる、請求項324に記載の方法。
- 前記期間の開始後約6日~約8日毎に前記液体培養培地に前記CD3/CD28結合剤を定期的に添加することをさらに含む、請求項208~325のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が約7日間~約56日間である、請求項208~326のいずれか一項に記載の方法。
- 前記請求項の期間が約15日間~約25日間である、請求項327に記載の方法。
- 前記培養する工程の前に、対象から得られた試料から前記Treg細胞を単離する工程をさらに含む、請求項208~328のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養する工程の後に、対象から得られた試料から前記Treg細胞を単離する工程をさらに含む、請求項208~328のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離する工程が蛍光支援細胞選別の使用を含む、請求項329または330に記載の方法。
- 前記Treg細胞が、末梢血または臍帯血から単離された、自己Treg細胞、ハプロタイプ一致Treg細胞、または同種異系Treg細胞である、請求項208~331のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+Foxp3+細胞である、請求項208~332のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+CD127dim細胞である、請求項208~332のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項208~334のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項208~335のいずれか一項に記載の方法によって生成されたTreg細胞の集団。
- 請求項336に記載のTreg細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
- 治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項337に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項338に記載の方法。
- 前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、2型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、COPD、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、NAFLD、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項339に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、CNS損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項339に記載の方法。
- CD3/CD28結合剤と、
多鎖キメラポリペプチドであって、
(a)(i)第1の標的結合ドメイン、
(ii)可溶性組織因子ドメイン、および
(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメイン
を含む、第1のキメラポリペプチド、ならびに
(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および
(ii)第2の標的結合ドメイン
を含む、第2のキメラポリペプチド
を含み、
前記第1のキメラポリペプチドと前記第2のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインと前記第2のドメインとの結合を介して会合する、
多鎖キメラポリペプチドと、
mTOR阻害剤と
を含む、キット。 - 前記多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項342に記載のキット。
- 前記CD3/CD28結合剤が抗CD3/抗CD28ビーズである、請求項342または343に記載のキット。
- 前記CD3/CD28結合剤が、第1の標的結合ドメイン、可溶性組織因子ドメイン、および第2の標的結合ドメインを含む単鎖キメラポリペプチドであり、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合し、前記追加の単鎖キメラポリペプチドの前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合する、請求項342または343に記載のキット。
- 前記単鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項345に記載のキット。
- 前記CD3/CD28結合剤が追加の多鎖キメラポリペプチドであり、
前記追加の多鎖キメラポリペプチドが、
(a)(i)第1の標的結合ドメイン、
(ii)可溶性組織因子ドメイン、および
(iii)一対の親和性ドメインの第1のドメイン
を含む、第1のキメラポリペプチド、ならびに
(b)(i)一対の親和性ドメインの第2のドメイン、および
(ii)第2の標的結合ドメイン
を含む、第2のキメラポリペプチド
を含み、
前記第1のキメラポリペプチドと前記第2のキメラポリペプチドが、前記一対の親和性ドメインの前記第1のドメインと前記第2のドメインとの結合を介して会合し、
前記第1の標的結合ドメインがCD3に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD28に結合するか、または前記第1の標的結合ドメインがCD28に結合しかつ前記第2の標的結合ドメインがCD3に結合する、
請求項342または343に記載のキット。 - 前記液体培養培地が、前記追加の多鎖キメラポリペプチドの前記可溶性組織因子ドメインに特異的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含むIgG1抗体構築物をさらに含む、請求項347に記載の方法。
- 対象から得られた試料からTreg細胞を単離する方法であって、そのCD39発現に基づいて前記試料から前記Treg細胞を分離し、それにより、前記Treg細胞を単離することを含む、方法。
- 前記Treg細胞を単離する前に前記試料を液体培養培地中で培養することによってTreg細胞の増殖を刺激するまたは増加させることを含む、請求項349に記載の方法。
- 前記試料と、CD39に結合することができる抗体またはリガンドとを、CD39を発現するTreg細胞への前記抗体またはリガンドの結合を可能にする条件下で混合することと、
前記抗体またはリガンドに結合した前記Treg細胞を前記試料中の他の成分から分離し、それにより、前記Treg細胞を単離することと
を含む、請求項349または350に記載の方法。 - 前記抗体が、マウス、ヒト化、もしくはヒト抗体もしくはその抗原結合断片であり、かつ/または
前記抗体または前記リガンドが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、もしくは蛍光色素のうちの少なくとも1つで標識されているか、または粒子、ビーズ、樹脂、もしくは固体支持体に結合している、
請求項351に記載の方法。 - 前記分離が、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別(FACS)、遠心分離、またはカラム、プレート、粒子、もしくはビーズベース方法の使用を含む、請求項351に記載の方法。
- 前記試料と、CD39に結合することができるビオチン化抗体またはリガンドとを、前記Treg細胞への前記抗体または前記リガンドの結合を可能にする条件下で混合することと、
ストレプトアビジン被覆磁性粒子を使用して、前記ビオチン化抗体またはリガンドに結合した前記Treg細胞を捕捉することと、
磁石を使用して前記磁性粒子に結合したTreg細胞を分離することと、
前記磁石粒子に結合したTreg細胞を洗浄して、前記試料中の他の成分を除去することと、
前記磁性粒子に結合したTreg細胞を前記磁石から溶液中に放出し、それにより、前記Treg細胞を単離することと
をさらに含む、請求項349に記載の方法。 - 前記Treg細胞が、新鮮または凍結された末梢血、臍帯血、末梢血単核細胞、リンパ球、CD4+T細胞、またはTreg細胞を含む試料から単離された、自己Treg細胞、ハプロタイプ一致Treg細胞、または同種異系Treg細胞である、請求項349~354のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+Foxp3+細胞である、請求項349~355のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がCD4+CD25+CD127dim細胞である、請求項349~356のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がキメラ抗原受容体を含む、請求項349~357のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Treg細胞がインビトロおよびインビボで免疫抑制性である、請求項349~358のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項349~359のいずれか一項に記載の方法によって生成された単離されたTreg細胞の集団。
- 請求項360に記載の単離されたTreg細胞の集団を増大させる方法であって、前記単離されたTreg細胞の増殖を可能にする条件下で、前記単離されたTreg細胞の集団を培養する工程を含む、方法。
- 前記単離されたTreg細胞の集団は、70%超がCD39+細胞である、請求項360に記載の単離されたTreg細胞の集団。
- 請求項360または362に記載の単離されたTreg細胞の集団と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
- 治療を必要とする対象を治療する方法であって、治療有効量の請求項363に記載の組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。
- 前記対象が加齢性疾患または炎症性疾患を有すると特定または診断されている、請求項364に記載の方法。
- 前記加齢性疾患が、アルツハイマー病、動脈瘤、嚢胞性線維症、膵炎における線維症、緑内障、高血圧症、特発性肺線維症、炎症性腸疾患、椎間板変性、黄斑変性、骨関節炎、2型真性糖尿病、脂肪萎縮、リポジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、白内障、COPD、特発性肺線維症、腎移植不全、肝線維症、骨量喪失、心筋梗塞、サルコペニア、創傷治癒、脱毛症、心筋細胞肥大、骨関節炎、パーキンソン病、加齢性肺組織弾性喪失、黄斑変性、悪液質、糸球体硬化症、肝硬変、NAFLD、骨粗しょう症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、多発性硬化症、神経変性、発作、認知症、血管疾患、易感染性、慢性炎症、および腎機能障害からなる群より選択される、請求項365に記載の方法。
- 前記炎症性疾患が、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、エリテマトーデス、ループス腎炎、糖尿病性腎症、CNS損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、クローン病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、乾癬、グレーブス病、潰瘍性大腸炎、非アルコール性脂肪性肝炎、および気分障害からなる群より選択される、請求項365に記載の方法。
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