JP2022544337A - 細胞の標的化および標識化に使用する抗ｃｄ３アプタマー - Google Patents
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Abstract
細胞表面上のＣＤ３タンパク質複合体を認識する高親和性アプタマー配列が提供される。アプタマーは、送達ビヒクルのための標的化部分として、または免疫療法、免疫診断、または対象におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の単離、精製、または特徴付けするための分子成分として使用することができる。
Description
本発明は、ＣＤ３に結合し、Ｔ細胞の標的化、標識化、または選別に使用できるＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーに関する。
関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年７月２６日に出願された米国仮出願第６２／８７９，４０１号および２０１９年７月２６日に出願された米国仮出願第６２／８７９，４１３号、および２０１９年７月２６日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００８９０に対して優先権を主張する。 前述の各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
関連出願の相互参照
この出願は、２０１９年７月２６日に出願された米国仮出願第６２／８７９，４０１号および２０１９年７月２６日に出願された米国仮出願第６２／８７９，４１３号、および２０１９年７月２６日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００８９０に対して優先権を主張する。 前述の各出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
表面抗原群３（ＣＤ３）は、１つのγサブユニット、１つのδサブユニット、および２つのεサブユニットを含有するタンパク質複合体であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と会合し、ＴＣＲがペプチド－ＭＨＣ複合体に結合するとき、細胞内シグナルを伝達するＣＤ３γεおよびＣＤ３δεヘテロダイマーを形成する。ＣＤ３サブユニットは高度に同種であり、それぞれが小さな細胞質ドメインと負に帯電した残基を含有する膜貫通ドメインを持ち、それを介してＴＣＲの膜貫通領域の正に帯電した残基と会合する。ＴＣＲはα、β、ζ、およびηサブユニットを含み、ζζホモ二量体またはζηヘテロ二量体と会合するαβヘテロ二量体として存在する。次に、ＴＣＲはＣＤ３γεおよびＣＤ３δεヘテロ二量体と会合する。
アプタマーは、独特の三次元立体配置を持つ短い一本鎖オリゴヌクレオチドである。抗体のように、アプタマーは高い特異性で標的に結合し、しばしば標的の生物学的活性を調節することができる。アプタマーは、免疫原性の欠如、十分に制御された安価な化学合成、高い安定性、良好な組織浸透など、抗体に比べて多くの利点を提供する。アプタマーはまた、標的化部分として使用するために、ナノ粒子、薬物、造影剤、および他の核酸に結合させることができる。
免疫原性の欠如、十分に制御された安価な化学合成、高い安定性、良好な組織浸透など、抗体に欠如している特性が求められている。
本技術は、ＣＤ３に結合し、Ｔ細胞の標的化、標識化、または選別に使用できるＤＮＡおよびＲＮＡアプタマーを提供する。
したがって、一側面においては、この技術は、ＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δタンパク質複合体に結合するアプタマーを提供する。アプタマーは、本明細書に記載のいくつかの核酸配列のいずれかを有するポリヌクレオチドを含む。
したがって、一側面においては、この技術は、ＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δタンパク質複合体に結合するアプタマーを提供する。アプタマーは、本明細書に記載のいくつかの核酸配列のいずれかを有するポリヌクレオチドを含む。
本発明の別の側面は、ＣＤ３を発現する細胞を標識化、精製、または選別する方法である。細胞は、蛍光標識や放射性同位元素などの標識を持つ抗ＣＤ３アプタマーと培養される。
この技術の別の側面は、上記の抗ＣＤ３アプタマーを含むインビトロまたはインビボ標的化Ｔ細胞のための送達ビヒクルである。
技術のさらに別の側面は、送達ビヒクルを対象のＴ細胞に標的化する方法である。この方法は、送達ビヒクルを対象に投与することを含む。
さらに、この技術は、上記の薬物送達ビヒクルを含む医薬組成物を提供する。
この技術の別の側面は、上記の抗ＣＤ３アプタマーを含むインビトロまたはインビボ標的化Ｔ細胞のための送達ビヒクルである。
技術のさらに別の側面は、送達ビヒクルを対象のＴ細胞に標的化する方法である。この方法は、送達ビヒクルを対象に投与することを含む。
さらに、この技術は、上記の薬物送達ビヒクルを含む医薬組成物を提供する。
本件技術は、以下の特徴のリストにさらに要約することができる。
１．配列ＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＧＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＧＸ１０ＣＴＧＧを含むアプタマーであって、ここで、Ｘ１はＧまたはＡ；Ｘ２およびＸ６はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴまたはＧであり、Ｘ４およびＸ９はＧまたはＣであり、Ｘ５はＣまたはＴであり、Ｘ７はＴ、Ｇ、またはＣであり、Ｘ８およびＸ１０はＣ、Ｔ、またはＡ（配列番号：１０９）またはその変異体であり、前記アプタマーはＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
２．配列ＧＧＧＸ１ＴＴＧＧＣＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＧＧＸ５ＣＴＧＧＣを含むアプタマーであって、Ｘ１およびＸ２はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ４およびＸ５はＡ、Ｔ、またはＣ（配列番号：１１０）またはその変異体であり、前記アプタマーはＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
配列ＧＸ１ＴＴＸ２ＧＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７ＧＧＸ８ＣＴＧＧＸ９Ｇを含むアプタマーであって、Ｘ１はＡまたはＧ、Ｘ２はＴまたはＧ、Ｘ３およびＸ７、Ｘ９はＧまたはＣであり、Ｘ４はＴまたはＣであり、Ｘ５はＡまたはＴであり、Ｘ６はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ８はＡまたはＣ（配列番号：１１１）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
１．配列ＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＧＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＧＸ１０ＣＴＧＧを含むアプタマーであって、ここで、Ｘ１はＧまたはＡ；Ｘ２およびＸ６はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴまたはＧであり、Ｘ４およびＸ９はＧまたはＣであり、Ｘ５はＣまたはＴであり、Ｘ７はＴ、Ｇ、またはＣであり、Ｘ８およびＸ１０はＣ、Ｔ、またはＡ（配列番号：１０９）またはその変異体であり、前記アプタマーはＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
２．配列ＧＧＧＸ１ＴＴＧＧＣＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＧＧＸ５ＣＴＧＧＣを含むアプタマーであって、Ｘ１およびＸ２はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ４およびＸ５はＡ、Ｔ、またはＣ（配列番号：１１０）またはその変異体であり、前記アプタマーはＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
配列ＧＸ１ＴＴＸ２ＧＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７ＧＧＸ８ＣＴＧＧＸ９Ｇを含むアプタマーであって、Ｘ１はＡまたはＧ、Ｘ２はＴまたはＧ、Ｘ３およびＸ７、Ｘ９はＧまたはＣであり、Ｘ４はＴまたはＣであり、Ｘ５はＡまたはＴであり、Ｘ６はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ８はＡまたはＣ（配列番号：１１１）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
４．配列ＧＧＧＴＴＴＧＧＣＡＸ１ＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣを含むアプタマーであって、ここで、Ｘ１はＧ、Ｃ、またはＴ（配列番号：１１２）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
５．配列ＧＣＡＧＣＧＡＵＵＣＵＸ１ＧＵＵＵを含むアプタマーであって、Ｘ１はＵまたは塩基でなく（配列番号：１１３）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
６．前記アプタマーが、約０．２ｐＭ～約２５０ｎＭの解離定数でヒトＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δに結合する、特徴１～５のいずれかに記載に記載のアプタマー。
７．前記アプタマーが、約２０ｎＭ～約８００ｎＭの解離定数で、非ヒト型のＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δに結合する、特徴１～５のいずれかに記載のアプタマー。
５．配列ＧＣＡＧＣＧＡＵＵＣＵＸ１ＧＵＵＵを含むアプタマーであって、Ｘ１はＵまたは塩基でなく（配列番号：１１３）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
６．前記アプタマーが、約０．２ｐＭ～約２５０ｎＭの解離定数でヒトＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δに結合する、特徴１～５のいずれかに記載に記載のアプタマー。
７．前記アプタマーが、約２０ｎＭ～約８００ｎＭの解離定数で、非ヒト型のＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δに結合する、特徴１～５のいずれかに記載のアプタマー。
８．配列番号１～１０８から選択される配列を含む、特徴１～７のいずれかに記載のアプタマー。
９．前記塩基の１つ以上が自然に生成しない塩基で置換されているか、または前記塩基のうちの１つ以上が省略されているか、または対応するヌクレオチドがリンカーで置換されている、前記配列の変異体を含む特徴１～８のいずれかに記載のアプタマー。
１０．前記自然に生成しない塩基の１以上が、メチルイノシン、ジヒドロウリジン、メチルグアノシン、およびチオウリジンからなる群から選択される、特徴９のアプタマー。
１１．ＣＤ３＋Ｔ細胞に結合するがそれらを活性化しない特徴１～１０のいずれかに記載のアプタマー。
９．前記塩基の１つ以上が自然に生成しない塩基で置換されているか、または前記塩基のうちの１つ以上が省略されているか、または対応するヌクレオチドがリンカーで置換されている、前記配列の変異体を含む特徴１～８のいずれかに記載のアプタマー。
１０．前記自然に生成しない塩基の１以上が、メチルイノシン、ジヒドロウリジン、メチルグアノシン、およびチオウリジンからなる群から選択される、特徴９のアプタマー。
１１．ＣＤ３＋Ｔ細胞に結合するがそれらを活性化しない特徴１～１０のいずれかに記載のアプタマー。
１２．薬剤、染料、共有結合のための官能基または生物学的に活性な薬剤をＴ細胞に送達するためのビヒクルであって、前記ビヒクルは、特徴１～１０のいずれかに記載のアプタマーを含む。
１３．高分子ナノ粒子を含む、特徴１１または特徴１２に記載のビヒクル。
１４．高分子ナノ粒子がポリ（ベータアミノエステル）（ＰＢＡＥ）を含む、特徴１３に記載のビヒクル。
１５．アプタマーが前記ポリマーに共有結合している、特徴１３または特徴１４に記載のビヒクル。
１６．薬剤がＴ細胞モジュレーターまたは造影剤である、特徴１３～１５のいずれかに記載のビヒクル。
１３．高分子ナノ粒子を含む、特徴１１または特徴１２に記載のビヒクル。
１４．高分子ナノ粒子がポリ（ベータアミノエステル）（ＰＢＡＥ）を含む、特徴１３に記載のビヒクル。
１５．アプタマーが前記ポリマーに共有結合している、特徴１３または特徴１４に記載のビヒクル。
１６．薬剤がＴ細胞モジュレーターまたは造影剤である、特徴１３～１５のいずれかに記載のビヒクル。
１７．Ｔ細胞モジュレーターが、導入遺伝子を担持するウイルスベクターであり、ウイルスベクターがポリマーでコーティングされ、アプタマーがポリマーに共有結合している、特徴１６に記載のビヒクル。
１８．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、特徴１７に記載のビヒクル。
１９．導入遺伝子がキメラ抗原受容体をコードする、特徴１７または特徴１８に記載のビヒクル。
２０．Ｔ細胞モジュレーターが、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、キナーゼ阻害剤、代謝阻害剤、ＧＳＫ３ ベータ阻害剤、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤、およびＣｄｋ５阻害剤からなる群から選択される、特徴１６に記載のビヒクル。
１８．ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、特徴１７に記載のビヒクル。
１９．導入遺伝子がキメラ抗原受容体をコードする、特徴１７または特徴１８に記載のビヒクル。
２０．Ｔ細胞モジュレーターが、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、キナーゼ阻害剤、代謝阻害剤、ＧＳＫ３ ベータ阻害剤、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤、およびＣｄｋ５阻害剤からなる群から選択される、特徴１６に記載のビヒクル。
２１．対象内のＴ細胞に薬剤を送達する方法であって、特徴１６～２０のいずれかに記載のビヒクルを、対象に投与することを含む、前記方法。
２２．特徴１６～２０のいずれかに記載のビヒクルと、１以上の賦形剤とを含む医薬組成物。
２３．対象からＴ細胞を単離する方法であって、特徴１～１２のいずれかに記載のビヒクルを使用して、対象からＴ細胞を単離することを含む、前記方法。
２２．特徴１６～２０のいずれかに記載のビヒクルと、１以上の賦形剤とを含む医薬組成物。
２３．対象からＴ細胞を単離する方法であって、特徴１～１２のいずれかに記載のビヒクルを使用して、対象からＴ細胞を単離することを含む、前記方法。
詳細な説明
本技術は、抗ＣＤ３アプタマーに関する。ＣＤ３特異的アプタマーを単離するための方法、ならびにＴ細胞に向けられた治療薬のための送達ビヒクルの標的化部分として、および医薬組成物の成分として含む、抗ＣＤ３アプタマーの様々な使用が開示される。
本技術は、抗ＣＤ３アプタマーに関する。ＣＤ３特異的アプタマーを単離するための方法、ならびにＴ細胞に向けられた治療薬のための送達ビヒクルの標的化部分として、および医薬組成物の成分として含む、抗ＣＤ３アプタマーの様々な使用が開示される。
本技術の抗ＣＤ３アプタマーの実施態様は、いくつかのコンセンサス配列を使用して説明することができる。ＤＮＡアプタマーには、以下のコンセンサス配列またはその変異体を含めることができる。
１． ＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＧＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＧＸ１０ＣＴＧＧ、ここでＸ１はＧまたはＡであり、Ｘ２およびＸ６はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴまたはＧであり、Ｘ４とＸ９はＧまたはＣであり、Ｘ５はＣまたはＴであり、Ｘ７はＴ、Ｇ、またはＣであり、Ｘ８およびＸ１０はＣ、Ｔ、またはＡ（配列番号１０９）である。
１． ＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＧＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＧＸ１０ＣＴＧＧ、ここでＸ１はＧまたはＡであり、Ｘ２およびＸ６はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴまたはＧであり、Ｘ４とＸ９はＧまたはＣであり、Ｘ５はＣまたはＴであり、Ｘ７はＴ、Ｇ、またはＣであり、Ｘ８およびＸ１０はＣ、Ｔ、またはＡ（配列番号１０９）である。
２． ＧＧＧＸ１ＴＴＧＧＣＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＧＧＸ５ＣＴＧＧＣ、ここでＸ１およびＸ２はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ４およびＸ５は、Ａ、Ｔ、またはＣである（配列番号１１０）。
３． ＧＸ１ＴＴＸ２ＧＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７ＧＧＸ８ＣＴＧＧＸ９Ｇ、ここでＸ１はＡまたはＧであり、Ｘ２はＴまたはＧであり、Ｘ３およびＸ７、Ｘ９はＧまたはＣであり、Ｘ４はＴまたはＣであり、Ｘ５はＡまたはＴであり、Ｘ６はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ８はＡまたはＣである（配列番号１１１）。
４．ＧＧＧＴＴＴＧＧＣＡＸ１ＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣＧ、ここで、Ｘ１は、Ｇ、Ｃ、またはＴである（配列番号１１２）。
５． ＧＣＡＧＣＧＡＵＵＣＵＸ１ＧＵＵＵ、ここでＸ１はＵまたは塩基なしである（配列番号１１３）。
５． ＧＣＡＧＣＧＡＵＵＣＵＸ１ＧＵＵＵ、ここでＸ１はＵまたは塩基なしである（配列番号１１３）。
アプタマーは、標的分子に高い親和性と特異的結合を与える二次および三次構造を持つＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドである。 分子捕捉技術を使用したアプタマーの生成が知られている（A. D. EllingtonおよびJ. W. Szostak．Nature346：818-822，1990；およびC. TuerkおよびL.Gold． Science 249：505-510，1990を参照）。アプタマーは、特定の標的部位に分子剤を送達するための標的化デバイスとして使用することができる。特定の腫瘍は、診断または治療目的での腫瘍標的化を支援するために腫瘍結合アプタマーを設計することができる特定の抗原と会合する。
一般に、アプタマーは、既知の方法を使用して、核酸配列のプールから同定および単離される。核酸配列のプールは、標的分子と培養され、結合したオリゴヌクレオチドを選択し、次のステップで、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。生成物は、標的分子で構成されるアフィニティーカラムを使用してさらに精製される。 アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを含むことができ、塩基は天然および非天然の何れでもよい。天然塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、イノシン（Ｉ）、およびウラシル（Ｕ）である。非天然塩基には、例えば、メチルイノシン、ジヒドロウリジン、メチルグアノシン、チオウリジン、２’－Ｏ－メチルプリン、２’－フルオロピリミジン、および当業者によく知られている他の多くのものが含まれる。ＰＮＡ塩基には、アミド（ペプチド様骨格）に結合した天然または非天然の塩基を含めることができる。核酸配列の骨格は、ＰＮＡなどのアミド、またはＤＮＡまたはＲＮＡにおけるようなホスホジエステル、チオホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチレンホスホロチオエート、またはこれらの化学構造の修飾であり得る。
アプタマーの核酸配列は、定常領域と可変領域の両方、または可変領域のみを含むことができる標的結合配列のみを含むことができる。定常領域配列は、配列の結合、増幅、複製または切断を容易にするために使用することができる。
アプタマーは、様々な目的、例えば、検出、画像化、診断、治療、または予防のために標的または標的部位に送達される薬剤に結合することができる。 薬剤には、細胞、ナノ粒子、ホルモン、ワクチン、ハプテン、毒素、酵素、免疫系モジュレーター、抗酸化剤、ビタミン、造血系の機能剤、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはそれらの変異体などのタンパク質、金属および他の無機物質が含まれる、ウイルス粒子、アミノ酸などの抗原、ペプチド、糖類および多糖類、受容体、常磁性および蛍光標識、医薬化合物、放射性同位元素および放射性核種（９３Ｐ、９５ｍＴｃ、９９Ｔｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１１１Ｉｎ、１４Ｃ、３２Ｐ、３Ｈ、６０Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓ、６５Ｚｎ、１２４Ｉ、２２６ Ｒａなど、および３Ｈｅ、６Ｌｉ、１０Ｂ、１１３Ｃｄ、１３５Ｘｅ、１４９Ｓｍ、１５１Ｅｕ、１５５Ｇｄ、１７４Ｈｆ、１９９Ｈｇ、２３５Ｕ、２４１Ｐｕおよび２４２Ａｍなどの安定同位体）などが含まれる。
アプタマーは、様々な目的、例えば、検出、画像化、診断、治療、または予防のために標的または標的部位に送達される薬剤に結合することができる。 薬剤には、細胞、ナノ粒子、ホルモン、ワクチン、ハプテン、毒素、酵素、免疫系モジュレーター、抗酸化剤、ビタミン、造血系の機能剤、ストレプトアビジンまたはアビジンまたはそれらの変異体などのタンパク質、金属および他の無機物質が含まれる、ウイルス粒子、アミノ酸などの抗原、ペプチド、糖類および多糖類、受容体、常磁性および蛍光標識、医薬化合物、放射性同位元素および放射性核種（９３Ｐ、９５ｍＴｃ、９９Ｔｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１１１Ｉｎ、１４Ｃ、３２Ｐ、３Ｈ、６０Ｃ、１２５Ｉ、３５Ｓ、６５Ｚｎ、１２４Ｉ、２２６ Ｒａなど、および３Ｈｅ、６Ｌｉ、１０Ｂ、１１３Ｃｄ、１３５Ｘｅ、１４９Ｓｍ、１５１Ｅｕ、１５５Ｇｄ、１７４Ｈｆ、１９９Ｈｇ、２３５Ｕ、２４１Ｐｕおよび２４２Ａｍなどの安定同位体）などが含まれる。
アプタマーに結合することができる医薬化合物には、例えば、従来の化学療法剤、抗生物質、コルチコステロイド、変異原性物質（例えば、ニトロ尿素）、代謝拮抗剤、およびホルモン拮抗薬が含まれる。
アプタマーに結合できる高分子には、マイトジェン、サイトカイン、および成長因子が含まれる。潜在的に有用なサイトカインには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（IL-1、IL-2、IL-3など）、インターフェロンタンパク質、ＩＦＮＩＦＮ－α、ＩＮＦ－β、およびＩＦＮ－Ｍ、グルココルチコイドホルモンなどのホルモン類、シトシン アラビノシド、およびアシクロビルやガンシクロビルなどの抗ウイルス剤が含まれる。
アプタマーは、化学的および生物学的技術を含むよく知られた方法を使用して薬剤に結合することができる。共有結合と非共有結合の両方を作成できる（C.-P. D. Tu et al., Gene 10:177-83, 1980; A. S. Boutorine et al., Anal. Biochem. Bioconj. Chem. 1:350-56, 1990; S. L. Commerford Biochem, 10:1993-99, 1971; D. J. Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 36:2306-14, 1995）。 共有結合は、例えば、化学結合反応、キレート剤、またはホスホジエステル結合から形成された結合を使用して形成することができる。非共有結合には、ストレプトアビジンとビオチン間の分子相互作用、水素結合、およびその他の形態のイオン相互作用が含まれる。例示的なキレート剤には、ＤＴＰＡ、ＳＨＮＨ、およびＮ２Ｓ２およびＮ３Ｓ（ＡＲ）などの多座キレート剤が含まれる（A. R. Fritzberg et al., J. Nucl. Med. 23:592-98, 1982）。 アプタマーはまた、細胞表面またはナノ粒子に結合して、細胞またはナノ粒子をインビトロまたはインビボで特定の位置に誘導することができる。
アプタマーは、指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）プロセスによるリガンドの選択的進化と呼ばれるアプローチを使用して選択される（Ellington et al., 1990; Tuerk et al., 1990）。ＳＥＬＥＸは、インビトロの選択と増幅の反復プロセスにより、オリゴヌクレオチドの非常に大きなコ組合せのライブラリーをスクリーニングする方法である。この方法は、同じ一般的な選択テーマを使用して、候補の混合物からの選択と構造改善の段階的反復を含み、結合親和性および選択性の任意の所望の基準を事実上達成する。核酸の混合物から開始し、好ましくはランダム化された配列のセグメントを含み、この方法は、結合に有利な条件下で混合物を標的と接触させ、結合していない核酸を標的分子に結合したそれら核酸から分配する（すなわち、分離する）ステップ、核酸－標的対を解離するステップ、核酸－標的対から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンドに富む混合物を生成し、次に、結合、分配、解離、および増幅のステップを所望する多数のサイクルを通して繰り返すステップを含む。
ＳＥＬＥＸは、多数の可能な配列と構造を含む核酸混合物内に、特定の標的に対して広範囲の結合親和性があるという洞察に基づいている。例えば、２０個のヌクレオチドのランダム化されたセグメントを含む核酸混合物は、４２０の候補の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を持っているものは、結合する可能性が最も高いです。分割、解離、増幅の後、２番目の核酸混合物が生成され、より高い結合親和性の候補に富む。得られる核酸混合物が主に１つまたは２～３個の配列のみで構成されるまで、追加の選択ラウンドが徐々に最良のリガンドの方を好むようになる。次に、これらをクローン化し、配列決定し、純粋なリガンドとしての結合親和性について個別にテストすることができる。
選択と増幅のサイクルは、目的の目標が達成されるまで繰り返される。最も一般的なケースでは、サイクルの繰り返しで結合強度の有意な改善が達成されなくなるまで、選択／増幅が続けられる。反復選択／増幅法は、少なくとも６５，０００の配列変異体を含む混合物中の単一の配列変異体の単離を可能にするのに十分な感度がある。この方法は、１０１４個の配列を含む混合物中の少数の高親和性配列を単離することさえ可能である。この方法は、原則として、約１０１８の異なる核酸種をサンプリングするために使用され得る。 試験混合物の核酸は、好ましくは、ランダム化された配列部分ならびに効率的な増幅に必要な保存された配列を含む。 核酸配列変異体は、ランダム化された核酸配列の合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む多くの方法で生成することができる。 可変配列部分は、完全にまたは部分的にランダムな配列を含み得て、また、ランダム化された配列に組み込まれた保存配列のサブ部分を含む場合もある。試験核酸の配列変異は、選択／増幅の反復前または反復中に突然変異誘発によって導入または増加させることができる。
多くの場合、単一の核酸リガンドが同定されるまで、ＳＥＬＥＸの反復ステップを実行することは必ずしも望ましいことではない。標的特異的核酸リガンド溶液は、いくつかの保存された配列、および標的に対する核酸リガンドの親和性に有意に影響を与えることなく、いくつかの配列を置換または追加することができる核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。 完了する前にＳＥＬＥＸプロセスを終了することにより、核酸リガンド溶液ファミリーのいくつかのメンバーの配列を決定することが可能であり、これにより、核酸リガンド溶液の包括的な記述の決定が可能になる。
核酸リガンドファミリーの記述がＳＥＬＥＸによって解決された後、特定の場合には、ＳＥＬＥＸ実験中に受け取った情報によって調整されたさらなる一連のＳＥＬＥＸを実行することが望ましい場合がある。 例えば、ＳＥＬＥＸの第２のシリーズでは、核酸リガンドファミリーの保存された領域は、リガンド構造内の他のすべての位置がランダム化されている間に固定され得る。代替の実施態様において、核酸リガンドファミリーの最も代表的なメンバーの配列は、核酸配列の元のプールが完全にランダム化されていないが、最もよく知られているリガンドに対するバイアスを含むＳＥＬＥＸプロセスの基礎として使用され得る。これらの方法により、ＳＥＬＥＸプロセスを最適化して、最も好ましい核酸リガンドに到達することが可能である。
本発明のアプタマーは、任意の所望の長さを有することができる。 アプタマーは、少なくとも約１５個のオリゴヌクレオチドを含み得る。好ましくは、アプタマーは、最大約８０個のヌクレオチドを含み得る。
最新の技術により、任意の平衡定数（ＫＤ）を持つアプタマーの同定または生成が可能になる。いくつかの実施態様において、アプタマーは、約１ｐＭから約１０．０μＭまで、約１ｐＭから約１．０μＭまで；約１ｐＭから約１００ｎＭまで；約１００ｐＭから約１０．０μＭまで；約１００ｐＭから約１．０μＭまで；約１００ｐＭから約１００ｎＭまで；または約１．０ｎＭから約１０．０μＭまで；約１．０ｎＭから約１．０μＭまで；約１ｎＭから約２００ｎＭまで；約１．０ｎＭから約１００ｎＭまで；約５００ｎＭから約１０．０μＭまで；または約５００ｎＭから約１．０μＭまでの平衡定数（ＫＤ）を含む。
標的分子は、小分子、タンパク質、または核酸を含み得る。本明細書に記載のアプタマーの場合、標的分子は、ＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δタンパク質である。
本発明のアプタマーは、医薬組成物に使用することができる。
本発明のアプタマーは、医薬組成物に使用することができる。
定義
核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＸＮＡの一本鎖または二本鎖、およびそれらの化学修飾を意味する。
核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＸＮＡの一本鎖または二本鎖、およびそれらの化学修飾を意味する。
アプタマー（またはリガンド）とは、別の分子（標的）に結合する核酸を意味する。候補核酸の集団において、アプタマーは、バルク集団よりも高い親和性で結合するものである。複数の候補アプタマー配列の中に、所与の標的に対して複数のアプタマーが存在し得る。アプタマーは、標的分子に対するそれらの結合親和性において互いに異なる可能性がある。
アプタマー配列などの核酸配列の変異体は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムなどの配列同一性アルゴリズムによって決定される、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含み得る。 変異体はまた、天然に存在しない塩基による１つ以上の塩基の置換、または任意選択でリンカーまたは結合によるヌクレオチドの置換を伴う１つ以上の塩基の除去を含み得る。変異体はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるような修飾された核酸骨格を含み得る。
複数の候補アプタマー配列は、異なる配列の複数の核酸であり、そこから所望のアプタマーを選択する。候補配列の供給源は、天然に存在する核酸またはその断片、化学的に合成された核酸、酵素的に合成された核酸、または前述の技術の組み合わせによって作製された核酸に由来し得る。
標的分子とは、リガンドが望まれる目的の化合物を意味する。標的分子は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝産物、転移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子などであり得る。標的はまた、アプタマーが特異的に結合することを求められた所望のタンパク質を発現する細胞であり得る。細胞を使用したアプタマーの選択は、cell-SELEXと呼ばれ得る（Chen C et al.,npj Precision Oncology (2017) 1-37）。Ｃｅｌｌ－ＳＥＬＥＸは生細胞を標的として使用する。アプタマーは生細胞膜タンパク質と結合します。細胞ＳＥＬＥＸの手順には、正の選択と負の選択を含む。正の選択のために、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーを標的細胞と共にインキュベートし、結合配列を収集する。結合配列は陰性細胞と共にインキュベートされ、非結合配列は増幅、シーケンシング、クローニングに使用するために収集される。アプタマーは、いくつかの交互サイクルの後に得られる。本開示は、標的として生細胞の使用を組み込むことによる抗ＣＤ３アプタマーの選択を含む。ＣＤ３陽性のＪｕｒｋａｔ細胞およびＣＤ３陰性Ｒａｍｏｓ細胞をそれぞれ正および負の選択に使用した。
分離（または分配）とは、標的分子は本明細書中ではアプタマー標的対または配列標的複合体と呼ばれ、それに結合したリガンドが、標的分子に結合していない核酸から分離することができる任意のプロセスを意味する。分離は、当技術分野で知られている様々な方法によって達成することができる。核酸タンパク質対はニトロセルロースフィルターに結合できるが、結合していない核酸は結合できない。シーケンス標的複合体を特に保持する列（または、結合された標的に複合された結合されたアプタマーを特に保持する）を、分配に使用できる。液体－液体の分配は、また、濾過ゲル遅滞、および密度勾配型遠心分離と同様に使用することができる。分離方法の選択は、標的および配列－標的複合体の特性に依存し、当業者に知られている原理および特性に従って行なうことができる。
増幅とは、分子または分子のクラスのコピーの量または数を増やすプロセスまたはプロセスステップの組み合わせを意味する。開示例におけるＲＮＡ分子の増幅は、選択したＲＮＡのｃＤＮＡコピーの作成、各ｃＤＮＡのコピー数を増加させるポリメラーゼ連鎖反応の使用、およびｃＤＮＡコピーを転写して、選択したＲＮＡと同じ配列を有するＲＮＡ分子を得るという３つの反応の配列によって行われた。当業者によって認識されるように、直接ＤＮＡ複製、直接ＲＮＡ増幅などを含む、当業者に知られている任意の反応または反応の組み合わせを適切に使用することができる。増幅方法は、最初の混合物における異なる配列の割合を本質的に代表する増幅混合物の割合をもたらすべきである。
ランダム化は、核酸のセグメントを、原則として所定の長さにわたって任意の可能な配列を有する核酸のセグメントを記述するために使用される用語である。ランダム化配列は、所望に応じて、約８～１００個のヌクレオチドの範囲の様々な長さになる。ランダム配列セグメントが作られる化学反応または酵素反応は、存在する可能性のある未知のバイアスまたはヌクレオチド選択により数学的にランダムな配列を生じさせないかもしれない。非理想からのそのような逸脱の可能性を反映するために、「ランダム」の代わりに「ランダム化」という用語が使用されている。現在知られている技術では、例えば逐次化学合成は、大きな偏差が生じることは知られていない。２０個のヌクレオチド以下の短いセグメントでは、存在する可能性のある任意の軽微なバイアスは、極僅かな結果を有するであろう。単一の合成の配列が長いほど、任意のバイアスの効果が大きくなる。
バイアスは、例えば、合成反応の前駆体ヌクレオシド（またはデオキシヌクレオシド）三リン酸のモル比を変化させることによって、ランダム化配列に意図的に導入され得る。たとえば、特定の生物の個々の塩基の比率を概算するため、二次構造に影響を与えるため、または融解ｐＨまたはｐＨ感度に影響を与えるために、意図的なバイアスが望ましい場合があります。配列は、ＣＧ塩基対よりも高い割合のＡＴを含み、したがってそれらの融解ｐＨを減少させるために偏っている可能性がある。
実施例１：抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマー
ライブラリーとプライマー
ＤＮＡアプタマー選択用に設計された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーは、TriLinkBiotechnologiesから購入した。ライブラリーは、２つの定常領域に隣接する４０ヌ個のヌクレオチドのランダム領域（Ｎ４０）で構成されていた：５’－ＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴ－（Ｎ４０）－ＴＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＴＧＡ－３’（配列番号１１４）で、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用された。 ＰＣＲ反応のためのプライマー配列は次のとおりである：５’－ＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴ－３’（配列番号１１５）（フォワードプライマー）および５’ビオチン－ＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１１６）（リバースプライマー）。選択の間に、ライブラリーは、メーカーのプロトコルに従ってAmpliTaqゴールド３６０ポリメラーゼキット（Applied Biosystems）を使用して、Eppendorf Mastercycler Nexus内で増幅された。ポリメラーゼの活性化と９５℃で１０分間初期変性し、９５℃で３０秒間変性し、４５℃で３０秒間アニールし（ＰＣＲサイクルごとに０．２°Ｃ刻み）、７２℃で１．５分間延長、７２°Ｃで７分間最終延長した。５’末端でビオチンを用いたリバースプライマーの改変により、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いた増幅二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）からの選択の各連続ラウンドに対するｓｓＤＮＡライブラリーの生成が可能となった。両方のプライマーは、精製されたＨＰＬＣグレードであり、Eurogentec社から購入した。
ライブラリーとプライマー
ＤＮＡアプタマー選択用に設計された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ライブラリーは、TriLinkBiotechnologiesから購入した。ライブラリーは、２つの定常領域に隣接する４０ヌ個のヌクレオチドのランダム領域（Ｎ４０）で構成されていた：５’－ＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴ－（Ｎ４０）－ＴＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＴＴＧＡ－３’（配列番号１１４）で、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用された。 ＰＣＲ反応のためのプライマー配列は次のとおりである：５’－ＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＴＡＴＡＴ－３’（配列番号１１５）（フォワードプライマー）および５’ビオチン－ＴＣＡＧＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴＣＡＡ－３’（配列番号１１６）（リバースプライマー）。選択の間に、ライブラリーは、メーカーのプロトコルに従ってAmpliTaqゴールド３６０ポリメラーゼキット（Applied Biosystems）を使用して、Eppendorf Mastercycler Nexus内で増幅された。ポリメラーゼの活性化と９５℃で１０分間初期変性し、９５℃で３０秒間変性し、４５℃で３０秒間アニールし（ＰＣＲサイクルごとに０．２°Ｃ刻み）、７２℃で１．５分間延長、７２°Ｃで７分間最終延長した。５’末端でビオチンを用いたリバースプライマーの改変により、ストレプトアビジン結合磁気ビーズを用いた増幅二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）からの選択の各連続ラウンドに対するｓｓＤＮＡライブラリーの生成が可能となった。両方のプライマーは、精製されたＨＰＬＣグレードであり、Eurogentec社から購入した。
ＤＮＡアプタマーの選択
ＳＥＬＥＸプロセスは、６回の選択ラウンドで構成され、ヒト免疫グロブリンＧ１の一定のＦｃドメインを持つＣ末端融合体として購入したＣＤ３イプシロン／ガンマ（CD3ε/γ）およびＣＤ３イプシロン／デルタ（CD3ε/δ）ダイマーからなるCD3タンパク質の組換えε鎖で実行された。その結果、ヒト免疫グロブリンＧ１（IgG1 Fc）のＦｃフラグメントを負の選択に用いた。すべてのタンパク質はAcroBiosystemsから購入した。各選択のラウンドは、カウンター選択、標的とのｓｓＤＮＡライブラリーの培養、標的を認識した配列のＰＣＲ増幅、ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ上のｄｓＤＮＡの分離のステップを含んでいた。各サイクルの前に、ｓｓＤＮＡライブラリー（初期サイクルの場合は２．５ ｎｍｏｌ）を９５°Ｃで５分間変性させ、すぐに選択（ＳＥＬＥＸ）バッファー中で４°Ｃで５分間冷却した（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ2 、および１．５ ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．２、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなしはシグマ・アルドリッチから購入した）。Ｆｃドメイン特異的配列を排除するために、ｓｓＤＮＡライブラリーを、サーモサイクラー（Eppendorf Mastercycler Nexus）で９０分間３７°ＣでIgG1-Fcタンパク質（０．５ｎｍｏｌ、１μＭ）で培養した。反応混合物を、ミリポアから直径２５ｍｍの支持フィルターホルダーに挿入したニトロセルロースアセテート膜（０．４５μｍ ＨＡＷＰ膜、直径２５ｍｍ、ミリポア社製）を通して濾過し、選択緩衝液で洗浄した。 濾過する前に、ＨＡＷＰ膜を少なくとも３０分間選択緩衝液に浸した。濾過後、IgG1-Fc/ssDNA複合体を取り付けた膜と、フィルターに結合した非特異的ssDNA配列とを廃棄した。非結合配列を含む濾液を、10kDa AMICON Ultra-15 MWCOフィルターを用いて濃縮し、続いて陽性標的との培養を行った。
ＳＥＬＥＸプロセスは、６回の選択ラウンドで構成され、ヒト免疫グロブリンＧ１の一定のＦｃドメインを持つＣ末端融合体として購入したＣＤ３イプシロン／ガンマ（CD3ε/γ）およびＣＤ３イプシロン／デルタ（CD3ε/δ）ダイマーからなるCD3タンパク質の組換えε鎖で実行された。その結果、ヒト免疫グロブリンＧ１（IgG1 Fc）のＦｃフラグメントを負の選択に用いた。すべてのタンパク質はAcroBiosystemsから購入した。各選択のラウンドは、カウンター選択、標的とのｓｓＤＮＡライブラリーの培養、標的を認識した配列のＰＣＲ増幅、ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ上のｄｓＤＮＡの分離のステップを含んでいた。各サイクルの前に、ｓｓＤＮＡライブラリー（初期サイクルの場合は２．５ ｎｍｏｌ）を９５°Ｃで５分間変性させ、すぐに選択（ＳＥＬＥＸ）バッファー中で４°Ｃで５分間冷却した（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、５ ｍＭ ＫＣｌ、１ ｍＭ ＭｇＣｌ2 、および１．５ ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ ７．２、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなしはシグマ・アルドリッチから購入した）。Ｆｃドメイン特異的配列を排除するために、ｓｓＤＮＡライブラリーを、サーモサイクラー（Eppendorf Mastercycler Nexus）で９０分間３７°ＣでIgG1-Fcタンパク質（０．５ｎｍｏｌ、１μＭ）で培養した。反応混合物を、ミリポアから直径２５ｍｍの支持フィルターホルダーに挿入したニトロセルロースアセテート膜（０．４５μｍ ＨＡＷＰ膜、直径２５ｍｍ、ミリポア社製）を通して濾過し、選択緩衝液で洗浄した。 濾過する前に、ＨＡＷＰ膜を少なくとも３０分間選択緩衝液に浸した。濾過後、IgG1-Fc/ssDNA複合体を取り付けた膜と、フィルターに結合した非特異的ssDNA配列とを廃棄した。非結合配列を含む濾液を、10kDa AMICON Ultra-15 MWCOフィルターを用いて濃縮し、続いて陽性標的との培養を行った。
第１サイクルでは、組換えＣＤ３ ε/γ（０．１５ ｎｍｏｌ，０．３ μＭ）およびＣＤ３ ε/δ（０．１５ｎｍｏｌ, ０．３ μＭ）ドメインに対して、３７°Ｃで５００μＬの体積で１２０分間、アプタマーが選択された。第２ラウンドから、CD3 ε/γとCD3 ε/δが各サイクルで交互に使用された。 反応混合物を、次いで、ニトロセルロースアセテート膜を通して濾過した。フィルターを8 mLの選択バッファーで洗浄し、タンパク質に結合した低親和性および低特異性配列をすべて除去した。フィルターに保持されたタンパク質に結合したｓｓＤＮＡは、メンブレンを１ｍＬの７Ｍ尿素中で７５℃で５分間、２回培養することで溶出した。回収したｓｓＤＮＡ溶液をＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーの水（Invitrogen）で２回希釈し、１０ｋＤａ ＡＭＩＣＯＮ Ｕｌｔｒａ－４ ＭＷＣＯフィルターを用いて濃縮した。その配列を水で再希釈し、再濃縮した。得られた溶液をマイクロバイオスピンＰ－６カラム（ＳＳＣバッファー、Bio-Rad）で精製し、５μＬの直鎖ポリアクリルアミド(Invitrogen)の存在下でエタノール(ＨＰＬＣグレード、Fisher）および３Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ５．２（ThermoScientific社，ウオルサム、マサチューセッツ州、米国）中で沈殿させた。－２５℃で約１時間インキュベートした後、溶出したｓｓＤＮＡを２１０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を捨て、ｓｓＤＮＡを含むペレットを２００μＬのＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリーの水で希釈し、空気中に２０分間放置してエタノールを蒸発させた。
選択したｓｓＤＮＡ配列は、未修飾のフォワードプライマーとビオチン化リバースプライマーの存在下で、ＰＣＲ反応（AmpliTaq Gold 360，Applied Biosystems）で増幅された。 最適なＰＣＲサイクル数は、選択の各ラウンドに対して個別に選択された。 この目的のために、増幅の進行は、アガロースゲル上の種々の数のＰＣＲサイクルの後に得られたｄｓＤＮＡサンプルの移動を伴った（ＴＢＥバッファー中、SYBR Safeを含む３％，Invitrogen社）。ｄｓＤＮＡに対応するバンドがアガロースゲルに現れた時にＰＣＲ反応を停止した。次いで、増幅したｄｓＤＮＡを有するＰＣＲ混合物を回収し、水で希釈して１５ｍＬの最終体積を得、１０ｋｄａのAMICON Ultra-15 MWCO膜を用いて濃縮した。濃縮サンプルのアリコートは、シーケンシング解析のために－２０℃で保存された。次のサイクルの選択のためにｓｓＤＮＡ鎖を精製して生成するために、残りのサンプルは、増幅されたｄｓＤＮＡ上に存在するビオチンを介してストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ（MyOne Streptavidin Dynabeads）に結合させた。 培養は、メーカーのプロトコルに従って、結合バッファー（1 M NaCl、5 mM Tris、0.5 mM EDTA pH 8.0、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅフリー、Sigma-Aldrich社から購入）中で室温で１８分間行なわせた。 ３ｍｇの磁気ビーズが、２０μｇのｄｓＤＮＡに使用された。 その後、ｄｓＤＮＡを含む磁気ビーズを溶液から分離し、結合バッファー（インキュベーションに使用される二倍体積）で５回洗浄し、非特異的に結合されたライブラリー種およびＰＣＲ反応残基を除去した。ＤＮＡ鎖の分離は、基本的な条件下で変性によって起こり、３分間、５０ｍＭ ＮａＯＨ（Sigma-Aldrich社のBioUltra）溶液中の変性ビーズの培養によって行われた。
その結果、ビオチン化ＤＮＡ鎖は磁気ビーズに付着したままで、目的の未変性鎖が溶液に放出され、回収された。得られたｓｓＤＮＡを、次いで最終的な体積４ｍＬまで水中で希釈し、１０ｋＤａのAMICON Ultra-4 MWCOを使用して濃縮し、ＮａＯＨを除去した。 選択バッファーへの交換は、マイクロバイオスピンカラム（P-6; BioRad社）を使用して行なわれた。 回収されたｓｓＤＮＡライブラリーの品質をアガロースゲル（ＴＢＥバッファー中３％）での移動によって分析し、濃度は２６０ｎｍで吸光度を測定することによりNanoDrop One（ThermoScientific,Waltham, マサチューセッツ州、米国）を使用して計算した。
ＳＥＬＥＸプロセスの連続ラウンド中に、選択のストリンジェンシーが徐々に増加した（表１を参照）。たとえば、標的とｓｓＤＮＡライブラリーの濃度が減少し、タンパク質を用いたインキュベーション時間が短縮され、選択後の膜洗浄用のバッファーの量が増加し、最後の選択ラウンドで非特異的競合物質（yeast total RNA、Sigma-Aldrich社）が追加された。
各ＳＥＬＥＸサイクル後に得られたＰＣＲアリコート、および初期ｓｓＤＮＡライブラリーは、イルミナNextSeq MidOutput（150サイクル）システムを使用して次世代シーケンシングによって解析された。この解析は、ニューヨーク大学ゲノム技術センターで行われた。高スループットシーケンシングのデータを、Galaxyプロジェクトのウェブサイトを使用して分析した。 シーケンシングの結果に基づいて、親和性および特異性テストのためにアプタマー候補が選択された。
これらのアプタマーの核酸配列は、図１、６および７Ａ－７Ｂに示されている。ＰＣＲ増幅に使用される隣接領域の有無にかかわらずＤＮＡアプタマーは、標準的な固相ホスホルアミダイト化学によって合成されたHPLC-RP精製一本鎖オリゴとしてEurogentec Kaneka（リエージュ・ベルギー）から入手した。ビオチンは、アプタマー配列とビオチンフラグの間に１６個の原子の混合極性スペーサーを導入するビオチン－ＴＥＧとしてアプタマーの５’末端に追加された。すべてのアプタマーについて、分子量、純度および完全性は、製造業者によってＨＰＬＣ－ＭＳによって確認された。
同じ合成アプローチが、コア配列CELTIC_coreに変異を導入するために続き、図１７．５および図１８に示した。非塩基部位は、固相合成の間にＣ３スペーサーアームを組み込むことによって、コア配列に沿って様々な位置に作成された。必要に応じて、立体障害を最小限に抑えるために、さらにヘキサエチレングリコール（HEG）リンカーを５’末端修飾官能基と５’位におけるアプタマーの最初のヌクレオチドの間に挿入した。コア配列変異体のさらなる修飾は、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を高める戦略として３’－３’デオキシ・チミジンの添加を含んだ。
最後に、アプタマーの５’末端は、末端リン酸塩に加えられたＣ６アミノ変性剤を介して一次アミンで機能化された。テトラジン官能基を標準ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を介してテトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステルとして添加し、アプタマー配列とテトラジンフラグの間に１６個の原子混合極性スペーサーを導入した。
実施例２：抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマー
ライブラリーとプライマー
初期ＲＮＡライブラリー・テンプレートとプライマーは、ＩＤＴ（Coralville、アイオワ州、米国）によってssDNAとして合成された。５'－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ－（N20）－ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＴＴＴ－（N10）－ＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧ－３’，（配列番号１１７）、 ５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ－３’，（配列番号１１８）（順方向プライマー），５’－ＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣ－３‘（逆方向プライマー）（配列番号１１９）。二次構造に対するプライマーの影響を最小限に抑えるために、５’－および３’－固定プライマー領域に相補的な２つの短い“ブロッキング”配列（ＩＤＴから購入）を合成した。５’－ＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＧＧ－３’、（配列番号:１２０）（順方向ブロッキング配列）、５’－ＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣ－３’、（配列番号:１２１）（逆方向ブロッキング配列）。ライブラリーの固定中心領域に相補的な追加のビオチン化された“キャプチャ”配列もＩＤＴによって合成された：５’－ビオチン－ＧＴＣ－ＰＥＧ－６スペーサー－ＣＡＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧ－３’（配列番号１２２）。すべての材料は２５０ｎｍｏｌスケールで注文され、脱塩精製を受けた。
ライブラリーとプライマー
初期ＲＮＡライブラリー・テンプレートとプライマーは、ＩＤＴ（Coralville、アイオワ州、米国）によってssDNAとして合成された。５'－ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ－（N20）－ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＡＴＴＣＴＴＧＴＴＴ－（N10）－ＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧＧＡＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧ－３’，（配列番号１１７）、 ５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴ－３’，（配列番号１１８）（順方向プライマー），５’－ＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣ－３‘（逆方向プライマー）（配列番号１１９）。二次構造に対するプライマーの影響を最小限に抑えるために、５’－および３’－固定プライマー領域に相補的な２つの短い“ブロッキング”配列（ＩＤＴから購入）を合成した。５’－ＡＴＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧＡＧＧ－３’、（配列番号:１２０）（順方向ブロッキング配列）、５’－ＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣ－３’、（配列番号:１２１）（逆方向ブロッキング配列）。ライブラリーの固定中心領域に相補的な追加のビオチン化された“キャプチャ”配列もＩＤＴによって合成された：５’－ビオチン－ＧＴＣ－ＰＥＧ－６スペーサー－ＣＡＡＧＡＡＴＣＧＣＴＧＣＡＧ－３’（配列番号１２２）。すべての材料は２５０ｎｍｏｌスケールで注文され、脱塩精製を受けた。
ＲＮＡアプタマー選択用のＲＮＡライブラリーを、２’フロロ－（２’Ｆ－）ピリミジンで修飾し、最終適用において安定性を高められた。Ｔ７プライマーは、チタンＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Clontech；マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）とプライマー拡張のためのライブラリー・テンプレート配列と組み合わされた。プライマー拡張材料は、Durascribe(R)T7 Transcription Kit（転写キット）（Epicentre；マディソン、ウィスコンシン州、米国）を使用して、８Ｍ尿素（Sequel NE試薬、パートＡおよびパートＢ）で変性ポリアクリルアミド上で精製され、American Bioanalytical（Natick,マサチューセッツ州、米国）から購入した。 選択中に、ライブラリーは、スーパースクリプトＩＶ逆転写酵素（Invitrogen；カールスバッド、カリフォルニア州、米国）を使用してメーカーのプロトコルに従って逆転写し、クロンテックからチタンＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅した。選択中、ライブラリーは次のＰＣＲプロトコル（９５℃で１０秒、６０℃で３０秒、９５℃で６０秒の最初のＨｏｔＳｔａｒｔ活性化を伴なう）を使用して増幅した。次いで、ＲＮＡライブラリーをDurascribe(R)Ｔ７転写キットを用いて転写し、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）上で精製した。 ４℃にて一晩の後精製用ゲル溶出バッファー・ライブラリー・リカバリーは、０．５Ｍ ＮＨ４ＯＡｃ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ（いずれもTeknovaから購入）、０．２％ ＳＤＳ（Amrescoから購入）ｐＨ７．４に調製した。
ＲＮＡアプタマーの選択
ＲＮＡライブラリースクリーニングは、融解アプローチを使用して９ラウンドの選択で行われた。選択のラウンド１～６は、標的としてＣＤ３タンパク質の組換えε鎖に対して、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを対抗標的として、ＤＮＡアプタマー選択と同様の物質を使用して行った。 第７ラウンドから、ＣＤ３タンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ細胞白血病ヒト細胞株-ATCC TIB-152）上でＲａｍｏｓ細胞（バーキットリンパ腫ヒト細胞株-ATCC CRL-1596）で負の選択工程（細胞－ＳＥＬＥＸ）のスクリーニングを行った。細胞株は、アメリカンタイプ細胞コレクションから得られ、RPMI-1640培地（Gibco Invitrogen）で培養し、10%FBS（Gibco Invitrogen）および１％ペニシリン／ステプトマイシン（Gibco Invitrogen）で補完した。すべての選択は１０％の血清マトリックスを補充した１Ｘ ＲＰＭＩ培地で行われ、ＳＥＬＥＸラウンドのそれぞれには、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ上のＲＮＡライブラリーの固定化、カウンター選択、標的とのインキュベーション、標的を認識した配列の逆転転写、ＰＣＲ増幅、ＲＮＡへの転写の各ステップが含まれていた。
ＲＮＡライブラリースクリーニングは、融解アプローチを使用して９ラウンドの選択で行われた。選択のラウンド１～６は、標的としてＣＤ３タンパク質の組換えε鎖に対して、ＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントを対抗標的として、ＤＮＡアプタマー選択と同様の物質を使用して行った。 第７ラウンドから、ＣＤ３タンパク質を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ細胞白血病ヒト細胞株-ATCC TIB-152）上でＲａｍｏｓ細胞（バーキットリンパ腫ヒト細胞株-ATCC CRL-1596）で負の選択工程（細胞－ＳＥＬＥＸ）のスクリーニングを行った。細胞株は、アメリカンタイプ細胞コレクションから得られ、RPMI-1640培地（Gibco Invitrogen）で培養し、10%FBS（Gibco Invitrogen）および１％ペニシリン／ステプトマイシン（Gibco Invitrogen）で補完した。すべての選択は１０％の血清マトリックスを補充した１Ｘ ＲＰＭＩ培地で行われ、ＳＥＬＥＸラウンドのそれぞれには、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ上のＲＮＡライブラリーの固定化、カウンター選択、標的とのインキュベーション、標的を認識した配列の逆転転写、ＰＣＲ増幅、ＲＮＡへの転写の各ステップが含まれていた。
各ラウンドの前に、ストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズのアリコート（MyOneストレプトアビジンＴ１ダイナビーズＴＭ、通常１ｐｍｏｌのビオチン化された材料が、ダイナビーズＴＭ ２０μｇ毎に使用され、必要なストリンジェンシーに応じて量が変化する）を２００μＬのＰＢＳ－Ｔ（最終濃度０．０１％Ｔｗｅｅｎ２００、ｐＨ７．４）で３回前洗浄した。ＲＮＡライブラリーは、１Ｘ ＲＰＭＩ培地中に血清なしで、プライマーブロッキング配列と捕捉配列の両方のライブラリーモルの２倍量、リフォールデイング（９０℃で１分間変性、６０°Ｃで５分間、次に２３℃で５分間アニーリング）された。これは、アプタマーの二次構造に対する一定のプライマー領域の影響を最小限に抑え、エキソヌクレアーゼからアプタマーの端を保護するために、ストレプトアビジン－ビオチン結合相互作用を通して磁気ビーズによってライブラリーを捕捉するのを可能にした。リフォールデイングが完了した後、ライブラリーを室温で１５分間インキュベーションして磁気ビーズ上に捕捉した。その後、磁気ビーズを溶液から分離し、３７℃で２００μＬの選択バッファーで３回洗浄し、残りのＰＢＳ－Ｔおよび非特異的に結合されたライブラリー種を除去した。固定化されたＲＮＡライブラリーを備えた磁気ビーズは、３７℃で３０分間のカウンター標的調製物の２００μＬ中でカウンター選択インキュベーションを行い、磁気ビーズから非特異的配列の放出をもたらした。
次に、非特異的なライブラリーメンバーを廃棄し、磁気ビーズを２００μＬの選択バッファーで７分間６回洗浄した。 正の選択は、磁気ビーズＲＮＡライブラリーを２００ μＬのポジティブ調製物と３７℃で３０分間培養することで構成された。 最初のサイクルでは、組換えCD3ε/γおよびCD3ε/δドメイン（それぞれ0.1 μM）に対してアプタマーを選択し、２番目のラウンドからCD3ε/γとCD3ε/δを交互に使用した。第６ラウンドでは、細胞に対する選択の前に、ライブラリーを２つの正の条件（それぞれCD3ε/γまたはCD3ε/δに対して）に分割し、両方の組み換えタンパク質に対する応答を観察できることを確認した。その後、第６ラウンドのポジティブライブラリーは、回復中に一緒にプールされ、その後セル選択が続いた。細胞ＳＥＬＥＸのラウンドの場合、標的細胞および対標的細胞を解凍し、5,000ｘｇで遠心分離してペレット化し、選択バッファーで２回洗浄した後、選択バッファーの２００ μＬに懸濁させた。インキュベーションに使用されるセルの数は、カウンター選択で15x106、正の選択では1x106～15x106であった。 正の選択が完了すると、標的を認識する配列を含む上清を磁気ビーズから分離して回収した。上清は、磁気ビーズが完全に除去されたことを確かにするために、第２の磁気分離を受けた。細胞ＳＥＬＥＸラウンドに対して、標的となったＪｕｒｋａｔ細胞は、第２の磁気分離後に５，０００ｘｇの遠心分離によってペレット化された。ペレット化された細胞を、選択バッファーの２００μＬで１回洗浄し、低親和性および低特異性アプタマー種を除去した。ライブラリーは７０℃で熱変性により細胞から回収された。全ラウンドにおいて回収されたライブラリーは、ＭＰＣ試薬（Lucigen Corp，Middleton、ウィスコンシン州、米国）、エタノール沈殿、および試料の濃度でタンパク質沈殿を受け、８Ｍ尿素で１０％変性ＰＡＧＥによって精製された。
その後、ライブラリーは、メーカーの指示に従ってSuperScript IV逆転写酵素を使用して逆転写され、Titanium(R) Taq DNAポリメラーゼを使用して増幅され、メーカーの指示に従ってDurascribe(R) T7転写キットを使用して転写された。転写生成物は次に、８Ｍ尿素で１０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製された。ゲルスライスを切除し、ゲル溶出バッファー中４℃で一晩溶出し、ＲＮＡライブラリーの濃度をNanoDrop-1000上で２６０ｎｍにて吸光度を測定して算出した。
ＳＥＬＥＸプロセスの連続ラウンド中に、ＲＮＡライブラリーの濃度は徐々に減少した。追加の並列評価および"クロスオーバーフィットネステスト"を実施し、選択後のバイオインフォマティクス分析中に良好なアプタマー候補の同定を容易にした。
アプタマー候補は、MiniSeq Mid出力(150 cycle)システム(Iluumina)を使用した次世代配列によって選ばれた。さらに試験のためにいくつかのアプタマーが選ばれた。この目的のために、２’－デオキシ－２’－フルオロ・チミジン修飾ＲＮＡアプタマーを、統合ＤＮＡ技術（IDT，Coralville，米国）から購入された。ビオチンは、アプタマー配列とビオチンフラグの間に１６個の原子の混合極性スペーサーを導入するビオチン－ＴＥＧとしてアプタマーの５’末端に添加された。分子量、純度および完全性はＨＰＬＣ－ＭＳにより検証された。これらのアプタマーの核酸配列は、図２７に示される。
実施例３細胞上に発現したＣＤ３タンパク質に対する抗ＣＤ３ＤＮＡアプタマーの親和性と特異性の決定
実施例３細胞上に発現したＣＤ３タンパク質に対する抗ＣＤ３ＤＮＡアプタマーの親和性と特異性の決定
細胞上に発現したCD3タンパク質に対するDNAアプタマー候補の親和性と特異性は、フローサイトメトリーで評価された。これらの研究は、CD3陽性のＪｕｒｋａｔ（急性Ｔ細胞白血病ヒト細胞株－ATCC TIB-152)、ＥＬ４(リンパ腫マウス細胞株－ATCC CRL-2638)およびＣＤ３陰性Ｒａｍｏｓ（バーキットリンパ腫ヒト細胞株 - ATCC CRL-1596）細胞上で、選択（ＳＥＬＥＸ）バッファービオチン化候補アプタマーを用いて培養し、５％ＦＢＳで補完することによって行われた。細胞は、使用前に１０％ＦＢＳ（Gibco Invitrogen）および１％ペニシリン／ステプトマイシン（Gibco Invitrogen）を補充してＲＰＭＩ－１６４０培地（Gibco Invitrogen）で培養した。実験の前に、Ｊｕｒｋａｔ、ＥＬ４、およびＲａｍｏｓ細胞（２．５ｘ１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を捨て、ペレット化した細胞を３７℃に予熱した２００μＬのＳＥＬＥＸ５％ＦＢＳ緩衝液で２回洗浄した。各洗浄工程に続いて、２５００ｒｐｍで２分間遠心分離を行った。候補アプタマーを９５℃で５分間変性し、そして直ちに４℃の氷塊の上に５分間置いた。試験サンプルは、その後、２つの異なる濃度範囲：３、１０、３０ｎＭおよび１、２．５、５、７．５、１０ｎＭで希釈した、続いて１００ｎＭのフィコエリトリンで標識したストレプトアビジン（ストレプトアビジン－ＰＥ，eBioscience）を各溶液に添加した。ＥＬ４細胞を用いたインキュベーションの場合、アプタマーを１００および３００ｎＭに追加して希釈した。ユルカット、ＥＬ４、Ｒａｍｏｓ細胞をＤＮＡ希釈液（１００μＬ／ウェル）で再懸濁し、３７℃で３０分間、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で培養した。対照として、細胞をＣＤ３モノクローナル抗体（ＰＥ標識、ＯＫＴ３ヒト抗ＣＤ３、Invitrogen）、ＰＥ－ストレプトアビジンまたは各緩衝液を用いて追加試薬なしで培養した。インキュベーション後、細胞を２５００ｒｐｍで２分間遠心し、非結合配列を有する上清を廃棄した。ペレット化された細胞をＳＥＬＥＸ-５％ＦＢＳ緩衝液（200μL／ウェル）で洗浄し、全ての弱くおよび非特異的に付着した配列を除去するために２回遠心分離した。次に、細胞を１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ溶液（100μL／ウェル）で３７℃にて、５％ＣＯ２加湿雰囲気で洗浄した。３０分後、サケ精子溶液を２５００ｒｐｍで２分間遠心分離して除去し、細胞をＳＥＬＥＸ－５％緩衝液（200μL／ウェル）で更に２回洗浄し、続いて遠心分離を行った。 次いで、結合したＤＮＡ配列を用いてＪｕｒｋａｔ、ＥＬ４およびＲａｍｏｓ細胞を固定し（BD CellFIX溶液#340181）、蛍光陽性細胞をフローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen Inc.）によってＹＬ－１チャネルに対してカウントした。
結合研究の結果を図２Ａ～２Ｅに示した。５つのアプタマー、CELTIC_1、CELTIC_1s、CELTIC_2、CELTIC_3、およびCELTIC_21が分析された。 CELTIC_1sは、特定の隣接領域ヌクレオチドを欠いているという点でCELTIC_1とは異なる。比較のために、ＣＤ３陰性Ｒａｍｏｓ細胞（バーキットリンパ腫ヒト細胞株-ATCC CRL-1596）へのアプタマーの結合も測定された。すべてのアプタマーは、ＣＤ３陽性細胞への優先結合を示す。CELTIC_3は１０ｎＭにて飽和結合を示した。 より大きな特異性を有する３ｎＭにて有意な結合を示した。これらの結果に基づいて、Ｊｕｒｋａｔ細胞へのCELTIC_3の結合の見かけのＫＤは、３ｎＭと１０ｎＭの間である。
これらのアプタマーは、Ｊｕｒｋａｔ細胞への結合についても低濃度でテストされ、Ｊｕｒｋａｔ細胞への優先的な結合が確認された。図３Ａ～３Ｅを参照されたい。 別の細胞結合アッセイでは、アプタマーCELTIC_2、CELTIC_3、およびCELTIC_21の細胞への結合を、それらの短いバージョンのCELTIC_2s、CELTIC_3s、および細胞へのCELTIC_21sと結合と比較した。アプタマーの特異性の改善は、隣接領域を除去した際に観察された。図５Ａ～５Ｆを参照されたい。さらに別の細胞結合アッセイでは、アプタマーCELTIC_4s、CELTIC_5s、CELTIC_6s、CELTIC_9s、CELTIC_11s、CELTIC_19s、およびCELTIC_21sの細胞への結合を測定し、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｍｏｓ細胞に対する高い特異性を示した。この結合は、アプタマー濃度３ｎＭ、１０ｎＭ、および３０ｎＭにて試験された。図８Ａ～８Ｇを参照されたい。３ｎＭおよび１０ｎＭの濃度でのＪｕｒｋａｔおよびＲａｍｏｓ細胞と全アプタマーとの結合結果をそれぞれ図９Ａ及び９Ｂに示す。さらなる細胞結合アッセイでは、アプタマーCELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s、およびCELTIC_19sのマウスＥＬ４細胞への結合を評価した。結合研究の結果を図１３Ａ～１３Ｄに示す。このアッセイで得られた細胞の用量依存的な染色は、これらのアプタマーが交差特異的であり、ヒトとマウスの両方のＣＤ３タンパク質を認識することを示唆している。
同じ実験的セットアップを用いて、ＳＥＬＥＸ中に分離された上位４５個の配列ファミリーの中で見つかった計算された保存モチーフに対応するアプタマーCELTIC_coreの結合親和性および特異性を評価した（図７Ｃ）。図１７．４に示すように、厳密に保存された２１個のヌクレオチドまでのアプタマーの短縮により、ＣＤ３受容体の認識特異性の大幅な向上をもたらした。試験濃度ごとに、ＣＤ３陰性のＲａｍｏｓ細胞上で無視できる場合にＣＤ３陽性のＪｕｒｋａｔ細胞のシグナルを測定した。この特異性の利得は、この実験で観察された見かけのＫＤが、CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s、およびCELTIC_19sなどの親配列が１０ｎＭ以上のシグナルの飽和に達したときに５０ｎＭを超えていたので、親和性を犠牲にして達成された。
この保存されたモチーフは、いわゆる”G-quadruplex”組織を定義するGGG/Cの繰り返しを示すため、予測されるコンフォメーションにおけるＧ残基の重要性を最終的に確認し、結合特異性と親和性に関与する重要な位置を特定し、アプタマーの特性を改善する変異を導入する、変異体のセットを設計した。CELTIC_core_1のCELTIC_core_13（図１７．５）へのいくつかの配列変異体を、前述のように５０および１００ｎＭの濃度でＪｕｒｋａｔ細胞およびＲａｍｏｓ細胞上で合成し、試験した。比較として、これらの分析には、未変性のコア配列CELTIC_core（５０および１００ｎＭ）および省略なしのCD3_CELTIC_1s（１０および５０ｎＭ）が含まれていた。図１７．６．Ａ～１７．６．Ｎに開示された結果は、各変性がアプタマーの生物学的活性に有意かつ予測不能な影響を及ぼしたことを示している。すなわち、保存モチーフ（CELTIC_core_1またはCELTIC_core_4）の３‘末端にＧＣまたはＧを添加すると特異性が失われた。いくつかの突然変異は、ＣＤ３受容体（CELTIC_core_2、CELTIC_core_5、CELTIC_core_6およびCELTIC_core_13）との相互作用を破壊した。結合の喪失は、一部の位置のＧ／Ｃヌクレオチドが非塩基部位（CELTIC_core_7からCELTIC_core_11）に置き換えられた場合にも発生したが、位置１６に非塩基部位を作成すると、親和性は高くなるが特異性が低下したアプタマーが得られた。
５’末端（CELTIC_core_T）でＴＴＴトリプレットを添加しても、立体障害を伴わずにビオチンラベルとアプタマーの間にいくらかの空間を導入することが可能であることを示すコア配列の結合特性に影響を及ぼさなかった。この観察により、より長いＣ１８スペーサーを導入する５’末端でＨＥＧリンカーを運ぶすべてのさらなる配列変異体を評価するよう促された。配列変異体CELTIC_core_14からCELTIC_core_44を合成し（図１８）、前述のように５０および１００ｎＭの濃度でＪｕｒｋａｔおよびＲａｍｏｓ細胞に対してテストした（図１９Ａ～Ｄ）。比較として、これらの分析には、未変性のコア配列CELTIC_core（５０および１００ｎＭ）および省略なしのCD3_CELTIC_1sおよびCD3_CELTIC_19s（１０および５０ｎＭ）が含まれていた。
ほとんどの位置について、非塩基部位または塩基置換は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の表面を発現したＣＤ３受容体への結合を破壊した。位置１０および１２でのヌクレオシドの除去は親和性（CELTIC_core_23およびCELTIC_core_25）を減少させたが、”G-quadruplex”アーキテクチャを定義するＧＧＧ／Ｃトリプレットの一部ではない位置１１（CELTIC_core_24）または１６（CELTIC_core_29）での同じ変性は、それぞれ同等または改善された親和性および特異性を有するアプタマーを生成した。予想外に、位置１６での元のＣをＧで置換すると、Ａが影響を及ぼさず(CELTIC_core_38)、Ｔが親和性と特異性の向上（CELTIC_core_40）に翻訳された場合に、アプタマー（CELTIC_core_39）の親和性を低下させた。位置１１と１６の同時変性は、親和性と特異性(CELTIC_core_42)の利得または親和性損失(CELTIC_core_44)の増加を引き起こした。これら一緒に立体配座－関数研究の結果を図２０にまとめ、コアシーケンスの改良版は、”G-quadruplex”構造を形成するＧＧＧ／Ｃトリプレットの外にある位置に非塩基部位を置き換えて導入することによって、経験的に設計できることを示唆している。
実施例４
細胞上に発現したＣＤ３タンパク質に対する抗ＣＤ３・ＲＮＡアプタマーの親和性と特異性の決定
抗CD3 RNAアプタマーは、ユルカットおよびＥＬ４細胞への結合について評価し、それらの結合の見かけのＫＤを決定した。この結合は、ＳＥＬＥＸ緩衝液ＤＰＢＳの代わりに使用された以外は、一般に実施例３に記載されているように行った。アプタマーは、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭの３濃度で使用した。ＥＬ４細胞を用いたインキュベーションについても、アプタマーは３ｎＭおよび１０ｎＭに希釈された。結合研究の結果を図３０Ａ～Ｅに示した。 ５つのアプタマー、ARACD3-3700006、ARACD3-0010209、ARACD3-3130001、ARACD3-2980001、およびARACD3-0270039を分析した。ＣＤ３陰性Ｒａｍｏｓ細胞へのアプタマーの結合（対照）も、アプタマーの特異性を評価するために測定した。さらに別の細胞結合アッセイでは、アプタマーARACD3-3700006およびARACD3-0010209のマウスＥＬ４細胞への結合を評価しました。結合研究の結果を図３４Ａ～Ｂに示した。このアッセイで得られた細胞の用量依存的な染色は、これらのアプタマーが交差特異的であり、ヒトとマウスの両方のＣＤ３タンパク質を認識することを示唆している。
細胞上に発現したＣＤ３タンパク質に対する抗ＣＤ３・ＲＮＡアプタマーの親和性と特異性の決定
抗CD3 RNAアプタマーは、ユルカットおよびＥＬ４細胞への結合について評価し、それらの結合の見かけのＫＤを決定した。この結合は、ＳＥＬＥＸ緩衝液ＤＰＢＳの代わりに使用された以外は、一般に実施例３に記載されているように行った。アプタマーは、３０ｎＭ、１００ｎＭ、および３００ｎＭの３濃度で使用した。ＥＬ４細胞を用いたインキュベーションについても、アプタマーは３ｎＭおよび１０ｎＭに希釈された。結合研究の結果を図３０Ａ～Ｅに示した。 ５つのアプタマー、ARACD3-3700006、ARACD3-0010209、ARACD3-3130001、ARACD3-2980001、およびARACD3-0270039を分析した。ＣＤ３陰性Ｒａｍｏｓ細胞へのアプタマーの結合（対照）も、アプタマーの特異性を評価するために測定した。さらに別の細胞結合アッセイでは、アプタマーARACD3-3700006およびARACD3-0010209のマウスＥＬ４細胞への結合を評価しました。結合研究の結果を図３４Ａ～Ｂに示した。このアッセイで得られた細胞の用量依存的な染色は、これらのアプタマーが交差特異的であり、ヒトとマウスの両方のＣＤ３タンパク質を認識することを示唆している。
実施例５
表面プラズモン共鳴により測定した抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマーの結合
結合親和性の測定は、BIAcore T200機器（GE Healthcare社）を使用して実行された。 アプタマーとＣＤ３タンパク質間の相互作用を分析するために、１０００レゾナンスユニットのビオチン化アプタマーを、メーカーの取扱説明書（GE Healthcare社）に従ってシリーズＳセンサーチップＳＡ（GE Healthcare社）に固定した。 ＳＥＬＥＸ緩衝液が実行緩衝液として使用された。 相互作用は、”単一動力学サイクル”モードで３０μＬ／分の流速で、さまざまな濃度のヒトCD3ε/γ、CD3ε/δ、IgG1 Fc、およびマウスCD3ε/δを注入することによって測定された（Sino Biological社）。使用した最高タンパク質濃度は１００ｎＭであった。その他の濃度は３倍希釈により得られた。相互作用のすべての速度論的データは、BIAcoreT200評価ソフトウェアを使用して評価された。これらの測定から得られた結合プロファイルの例を図４Ａ～４Ｃに示す。以下の表３は、表面プラズモン共鳴測定から得られたＫＤ値の要約を示している。
表面プラズモン共鳴により測定した抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマーの結合
結合親和性の測定は、BIAcore T200機器（GE Healthcare社）を使用して実行された。 アプタマーとＣＤ３タンパク質間の相互作用を分析するために、１０００レゾナンスユニットのビオチン化アプタマーを、メーカーの取扱説明書（GE Healthcare社）に従ってシリーズＳセンサーチップＳＡ（GE Healthcare社）に固定した。 ＳＥＬＥＸ緩衝液が実行緩衝液として使用された。 相互作用は、”単一動力学サイクル”モードで３０μＬ／分の流速で、さまざまな濃度のヒトCD3ε/γ、CD3ε/δ、IgG1 Fc、およびマウスCD3ε/δを注入することによって測定された（Sino Biological社）。使用した最高タンパク質濃度は１００ｎＭであった。その他の濃度は３倍希釈により得られた。相互作用のすべての速度論的データは、BIAcoreT200評価ソフトウェアを使用して評価された。これらの測定から得られた結合プロファイルの例を図４Ａ～４Ｃに示す。以下の表３は、表面プラズモン共鳴測定から得られたＫＤ値の要約を示している。
ヒトとマウスCD3 ε/δに結合するためのＫＤ値を比較すると、アプタマーがマウスCD3 ε/δにも結合するが、親和性が低いということを示している。さらに、アプタマーCELTIC_1（表１のCD3-1）と比較して、CELTIC_1s（CD3-1s）はＣＤ３タンパク質により強く結合することが観察された。以下の表４は、別のセットの表面プラズモン共鳴測定から得られたＫＤ値の要約を示している。これは、隣接領域の有無にかかわらず、最初の５つのアプタマーのＫＤ値を含む。
以下の表５および６に、さらに数個のアプタマーのＫＤ値の要約を示す。表４および５に記載されたＫＤ値は定常状態解析モードで測定を行って得られたが、表３および６の値は、動態解析モードで行われた測定によって得られた。
実施例６表面プラズモン共鳴により測定した抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマーの結合
抗CD3 RNAアプタマーの各精製組換えヒトCD3 ε/γおよびCD3 ε/δタンパク質への結合を、表面プラズモン共鳴を使用して測定した。 結合試験は、ＳＥＬＥＸバッファーがＤＰＢＳで置換されたことを除いて、一般に実施例５に記載されているように行われた。使用した最高タンパク質濃度は３００ｎＭであった。 その他の濃度は３倍希釈により得られた。hIgG1Fcへの結合を対照として使用した。マウスCD3 ε/δ(mCD3 ε/δ)への結合も測定した。 これらの研究の結果は、以下の表7に示されている。
抗CD3 RNAアプタマーの各精製組換えヒトCD3 ε/γおよびCD3 ε/δタンパク質への結合を、表面プラズモン共鳴を使用して測定した。 結合試験は、ＳＥＬＥＸバッファーがＤＰＢＳで置換されたことを除いて、一般に実施例５に記載されているように行われた。使用した最高タンパク質濃度は３００ｎＭであった。 その他の濃度は３倍希釈により得られた。hIgG1Fcへの結合を対照として使用した。マウスCD3 ε/δ(mCD3 ε/δ)への結合も測定した。 これらの研究の結果は、以下の表7に示されている。
実施例７抗CD3 DNAアプタマーによるＴ細胞活性化
抗CD3 DNAアプタマーによるＴ細胞活性化を測定するために、アプタマーをＴ細胞のＣＤ２８共刺激と共に１μＭの濃度で使用した。 活性化に応答して細胞によって分泌されたサイトカインは、ＥＬＩＳＡおよびヒトＴｈ１／Ｔｈ２細胞数測定ビードアレイ(CBA)によって測定された。 Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現は、フローサイトメトリーにより測定した。得られた結果は、それぞれ図１４Ａ～１４Ｌ、１５Ａ～１５Ｃおよび１６Ａ～１６Ｃに示される。
抗CD3 DNAアプタマーによるＴ細胞活性化を測定するために、アプタマーをＴ細胞のＣＤ２８共刺激と共に１μＭの濃度で使用した。 活性化に応答して細胞によって分泌されたサイトカインは、ＥＬＩＳＡおよびヒトＴｈ１／Ｔｈ２細胞数測定ビードアレイ(CBA)によって測定された。 Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現は、フローサイトメトリーにより測定した。得られた結果は、それぞれ図１４Ａ～１４Ｌ、１５Ａ～１５Ｃおよび１６Ａ～１６Ｃに示される。
Ｔ細胞活性化アッセイは末梢血単核細胞（PBMC）上で実施された。 新たに調製されたＰＢＭＣは、健康なドナー（Etablissement Francais du Sang，Division Rhones-Alpes）から入手したバフィーコートから分離された。血液をＤＰＢＳで希釈した後、ＰＢＭＣをＦＩＣＯＬＬ密度勾配（FICOLL-PAQUE PREMIUM 1.084 GE Healthcare社）で分離し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、再懸濁して目的の細胞密度を得て、１０％ＦＢＳ（Gibco Invitrogen）および１％Penicillin/Steptomycin（Gibco Invitrogen）を３７℃、５％CO2で補充して、RPMI-1640培地（Gibco Invitrogen）中で培養した。
Ｔ細胞活性化特性を評価する前に、ヒトＰＢＭＣへの抗CD3 DNAアプタマーの結合は、ＳＥＬＥＸバッファーが１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン/ステプトマイシンを補充したRPMI-1640培地に置き換えられたことを除いて、実施例3に記載されているようにフローサイトメトリーによって先ず検証された。４つのアプタマー、CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s、およびCELTIC_19sを３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、および３００ｎＭの濃度で使用した。結合研究の結果が図１２に示された。
ＰＢＭＣ活性化アッセイは、共刺激剤としての抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（Invitrogen社）の有無にかかわらず、４つのアプタマー、CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、およびCELTIC_19sで実行されました。試薬の濃度を一定に保つために、３時間、１９時間、および２７時間後に抗ＣＤ２８ｍＡｂの存在下で新鮮なアプタマー溶液を添加する３番目の条件が含まれていた。実験の前に、ＰＢＭＣを２４ウェルプレートにウェルあたり２．５ｘ１０５細胞の密度で、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む４００μＬのＲＰＭＩ培地に播種し、３７℃にて５％ＣＯ２下で４時間培養した。 候補アプタマーを９５℃で５分間変性し、直ちに４℃の氷塊の上に５分間置いた。１００μＬの上澄み（サイトカイン基底レベル条件）をサンプリングした後、ウェルに１μＭのＤＮＡアプタマーを含む刺激溶液の１００μＬとＲＰＭＩで希釈された０．５μｇ／ｍＬのＣＤ２８ｍＡｂを添加した。 細胞を３７℃にて、５％ＣＯ２下で１６、２４または４８時間培養した。
また、ＰＢＭＣを２μｇ／ｍＬ ＣＤ３ ｍＡｂおよび５μｇ／ｍＬ ＣＤ２８ ｍＡｂ（Invitrogen社）を含む混合物１００ μＬ、試薬を含まない２μｇ／ｍＬ ＣＤ３ ｍＡｂまたはＲＰＭＩ培地を含む溶液（陰性対照）を使用して培養した。その後、サンプルを３２０ｇで５分間遠心分離し、上澄みを回収した。ＰＢＭＣの活性化は、異なる間隔で収集された培養上澄み中の分泌されたインターロイキン２（IL-2）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-a）、およびインターフェロン・ガンマ（IFN-g）のレベルを測定することによって評価された。サンドイッチエリザ（DUOSET ELISA R&D Systems）を測定に使用した。捕捉抗体で予め一晩コーティングした各ウェルに、１００μＬの未希釈サンプルまたはサイトカイン標準液を添加した。 IL-2、TNF-a、またはIFN-gサイトカイン結合は、ストレプトアビジン－ＨＲＰ複合体とＴＭＢ基質で明らかになったビオチン化検出抗体で検出された。停止溶液の添加に続いて、ＥＬＩＳＡプレートをVARIOSCAN LUXプレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取り、サイトカインのレベルを参照標準曲線に対して決定した。得られた結果は、図１４Ａ－１４Ｌに示されている。４８時間後に収集した培養上澄み中の分泌されたインターロイキン２（IL-2）、インターロイキン4（IL-4）、インターロイキン５（IL-5）、インターロイキン１０（IL-10）、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-a）およびインターフェロンガンマ（IFN- g）のレベルを、Human Th1/Th2 Cytometric Bead Array（CBA）（Becton Dickinson Biosciences社）を使用して、メーカーの取扱説明書に従って測定した。得られた結果を、図１６Ａ－１６Ｃに示す。
最後に、ＰＢＭＣの活性化は、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の表面でのＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現を分析することによって評価された。ＥＬＩＳＡおよびＣＢＡ分析のための異なる試験条件および培養上澄みの収集物の存在下で４８時間のインキュベーションの後、ＰＢＭＣは９６ウェルプレートに移され、２５００ ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、ペレット化した細胞を２００μＬのＤＰＢＳ－０．２％ＢＳＡで２回洗浄した。各洗浄ステップの後に、２５００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。次に、細胞を、ＤＰＢＳ－０．２％ＢＳＡ（１μｌ／テスト）中で希釈した抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２５、および抗ＣＤ６９モノクローナル抗体（Miltenyi社）とともに培養した。４℃で１０分間インキュベーションした後、細胞を２５００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ＤＰＢＳ－０．２％ＢＳＡ（200μL/ウェル）で２回洗浄した。細胞をＣｅｌｌＦｉｘ溶液（BD Biosciences）で固定し、蛍光陽性細胞をフローサイトメトリー（AttuneNXT; Invitrogen, Inc.）で、ＢＬ３（抗CD4-PerCP-Vio700）、ＹＬ１（CD69-PE）、ＹＬ２（CD8-PE-Vio-615）およびＹＬ４（CD25-PE-Vio770）チャネル上で数えた。得られた結果を図１５Ａ－１５Ｃに示す。
抗ＣＤ２８モノクロ―なる抗体の有無にかかわらず抗ＣＤ３モノクローナル抗体で処理された細胞は、ＩＬ－５および、ＣＤ２５およびCD69活性化マーカーの表面発現のアップレギュレーションを除くすべての測定されたサイトカインの分泌の増加を示した。試験されたアプタマーはいずれも、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と組み合わせても、表面マーカー発現のサイトカイン分泌を活性化できなかった。血清中の分解を補うために新鮮な溶液を繰り返し添加することによってアプタマー濃度を一定に保つことは、より持続的な活性化プロファイルをもたらさなかった。
実施例８：抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマーによるＴ細胞の活性化
抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマーによるＴ細胞活性化は、実施例７に記載の手順を用いてＣＤ２８共刺激と共に１μＭ濃度でアプタマーを有する細胞をインキュベートすることによって測定した。活性化に応答して細胞によって分泌されたサイトカインは、ＥＬＩＳＡおよびヒトＴｈ１／Ｔｈ２細胞数測定ビードアレイによって測定された。Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現は、フローサイトメトリーにより測定した。 得られた結果は、それぞれ図３５Ａ－Ｆ、３７Ａ－Ｃおよび３６Ａ－Ｃに示される。
抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマーによるＴ細胞活性化は、実施例７に記載の手順を用いてＣＤ２８共刺激と共に１μＭ濃度でアプタマーを有する細胞をインキュベートすることによって測定した。活性化に応答して細胞によって分泌されたサイトカインは、ＥＬＩＳＡおよびヒトＴｈ１／Ｔｈ２細胞数測定ビードアレイによって測定された。Ｔ細胞の表面におけるＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの発現は、フローサイトメトリーにより測定した。 得られた結果は、それぞれ図３５Ａ－Ｆ、３７Ａ－Ｃおよび３６Ａ－Ｃに示される。
実施例７で既に観察されているように、抗ＣＤ２８モノクロ―なる抗体の有無にかかわらず抗ＣＤ３モノクローナル抗体で処理された細胞は、ＩＬ－５および、ＣＤ２５およびＣＤ６９活性化マーカーの表面発現のアップレギュレーションを除くすべての測定されたサイトカインの分泌の増加を示した。試験されたアプタマーはいずれも、共刺激性抗ＣＤ２８抗体と組み合わせても、表面マーカー発現のサイトカイン分泌を活性化できなかった。血清中の分解を補うために新鮮な溶液を繰り返し添加することによってアプタマー濃度を一定に保つことは、より持続的な活性化プロファイルをもたらさなかった。
実施例９：抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマーの機能安定性
抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマー（CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s、CELTIC_11s、CELTIC_19sおよびCELTIC_22s）の安定性を、５％ＦＢＳまたはＦＢＳ単独で含有するＳＥＬＥＸ緩衝液で測定した。 ビオチン化アプタマーを９５℃で５分間変性させた後、すぐにアイスブロック上で４℃で５分間冷却した。次に、配列を、５％ＦＢＳを補充したＳＥＬＥＸバッファーまたは純粋なＦＢＳで最終濃度２μＭに希釈した。サンプルを３７℃で１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間または２４時間インキュベートした。対照サンプルには、３７℃でインキュベートせずに作りたてのアプタマーが含まれていた。１００ｎＭストレプトアビジン－ＰＥを各溶液に添加し、アプタマーを前に述べたように陽性のＣＤ３ Ｊｕｒｋａｔ細胞でインキュベートした。次に、５％ＦＢＳまたは純粋なＦＢＳを含むＳＥＬＥＸバッファーにおけるアプタマーの半減期を、３７℃でのインキュベーション時間の関数としての蛍光陽性細胞数の変動に基づいて、ＹＬ－１チャネルでフローサイトメトリーを使用して決定した。 測定結果は図１１Ａおよび１１Ｂに示す。５％血清を含むＳＥＬＥＸバッファー中でインキュベーとされたすべてのアプタマーは、２４時間インキュベートした場合でも安定であった。純粋なＦＢＳにおけるＤＮＡアプタマーの希釈は、３７℃でのインキュベーションの２時間から配列の徐々の分解を示す。
抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマー（CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_9s、CELTIC_11s、CELTIC_19sおよびCELTIC_22s）の安定性を、５％ＦＢＳまたはＦＢＳ単独で含有するＳＥＬＥＸ緩衝液で測定した。 ビオチン化アプタマーを９５℃で５分間変性させた後、すぐにアイスブロック上で４℃で５分間冷却した。次に、配列を、５％ＦＢＳを補充したＳＥＬＥＸバッファーまたは純粋なＦＢＳで最終濃度２μＭに希釈した。サンプルを３７℃で１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間または２４時間インキュベートした。対照サンプルには、３７℃でインキュベートせずに作りたてのアプタマーが含まれていた。１００ｎＭストレプトアビジン－ＰＥを各溶液に添加し、アプタマーを前に述べたように陽性のＣＤ３ Ｊｕｒｋａｔ細胞でインキュベートした。次に、５％ＦＢＳまたは純粋なＦＢＳを含むＳＥＬＥＸバッファーにおけるアプタマーの半減期を、３７℃でのインキュベーション時間の関数としての蛍光陽性細胞数の変動に基づいて、ＹＬ－１チャネルでフローサイトメトリーを使用して決定した。 測定結果は図１１Ａおよび１１Ｂに示す。５％血清を含むＳＥＬＥＸバッファー中でインキュベーとされたすべてのアプタマーは、２４時間インキュベートした場合でも安定であった。純粋なＦＢＳにおけるＤＮＡアプタマーの希釈は、３７℃でのインキュベーションの２時間から配列の徐々の分解を示す。
実施例１０：抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマーの機能安定性
アプタマーARACD3-3700006およびARACD3-0010209の安定性は、５％ＦＢＳまたはＦＢＳのみを含むDulbecco社のリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で測定された。 実施例９に記載の手順を、変性が８５℃で行われたことを除いて使用した。測定結果は図３２－Ａに示す。 ５％血清を含むＤＰＢＳ中でインキュベーとされた何れのアプタマーも、２４時間インキュベートした場合でも安定であった。純粋な血清中でインキュベートした場合、結合活性の半分は３０分後に失われた。
アプタマーARACD3-3700006およびARACD3-0010209の安定性は、５％ＦＢＳまたはＦＢＳのみを含むDulbecco社のリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で測定された。 実施例９に記載の手順を、変性が８５℃で行われたことを除いて使用した。測定結果は図３２－Ａに示す。 ５％血清を含むＤＰＢＳ中でインキュベーとされた何れのアプタマーも、２４時間インキュベートした場合でも安定であった。純粋な血清中でインキュベートした場合、結合活性の半分は３０分後に失われた。
実施例１１：ゲル電気泳動法を用いた抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマーの血清安定性
抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマー（CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s）の安定性が、５％胎児ウシ血清（FBS）、１０％ＦＢＳまたは純粋ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地を含有する選択（SELEX）バッファーにおいて検討された。アプタマーを９５℃で５分間変性させた後、すぐに氷ブロックで４℃で５分間冷却した。次に、配列を、５％ＦＢＳを補充したＳＥＬＥＸバッファー、１０％ＦＢＳまたは純のＦＢＳ血清で補充し、最終濃度２μＭに希釈した。サンプルを３７℃で１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間または２４時間インキュベートした。対照サンプルには、３７℃でインキュベートせずに作りたてのアプタマーを含んでいた。その後、それぞれの緩衝液中のアプタマーの半減期は、次のように、異なるインキュベーション時間からのアプタマーサンプルを負荷緩衝液（ThermoScientific社、Waltham、マサチューセッツ州、米国）と混合し、各サンプルの１５μＬを、SYBRsafe(Invitrogen)をＤＮＡ染色剤として含有する新たに調製した３％アガロースゲル上に配置した。アガロースゲル上でのＤＮＡアプタマーの移動は、1X TBEバッファー（Invitrogen）で、１００Ｖを２０分間印加することによって実行された。ゲルはBio-Rad画像化システムを使用して視覚化され、結果は図１０Ａ～１０Ｄに示す。試験したすべてのアプタマーは、ＳＥＬＥＸ－５％ＦＢＳバッファーで少なくとも２４時間安定であった。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中のインキュベーションは、３７℃で２４時間後にCELTIC_4sおよびCELTIC_11sの分解を引き起こした。しかしながら、純粋な血清中のＤＮＡアプタマーの希釈は、１時間のインキュベーション後の強度の低下をもたらした。これらの結果は、実施例９でフローサイトメトリーで報告された安定性と完全に一致している。
抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマー（CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s）の安定性が、５％胎児ウシ血清（FBS）、１０％ＦＢＳまたは純粋ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地を含有する選択（SELEX）バッファーにおいて検討された。アプタマーを９５℃で５分間変性させた後、すぐに氷ブロックで４℃で５分間冷却した。次に、配列を、５％ＦＢＳを補充したＳＥＬＥＸバッファー、１０％ＦＢＳまたは純のＦＢＳ血清で補充し、最終濃度２μＭに希釈した。サンプルを３７℃で１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間または２４時間インキュベートした。対照サンプルには、３７℃でインキュベートせずに作りたてのアプタマーを含んでいた。その後、それぞれの緩衝液中のアプタマーの半減期は、次のように、異なるインキュベーション時間からのアプタマーサンプルを負荷緩衝液（ThermoScientific社、Waltham、マサチューセッツ州、米国）と混合し、各サンプルの１５μＬを、SYBRsafe(Invitrogen)をＤＮＡ染色剤として含有する新たに調製した３％アガロースゲル上に配置した。アガロースゲル上でのＤＮＡアプタマーの移動は、1X TBEバッファー（Invitrogen）で、１００Ｖを２０分間印加することによって実行された。ゲルはBio-Rad画像化システムを使用して視覚化され、結果は図１０Ａ～１０Ｄに示す。試験したすべてのアプタマーは、ＳＥＬＥＸ－５％ＦＢＳバッファーで少なくとも２４時間安定であった。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中のインキュベーションは、３７℃で２４時間後にCELTIC_4sおよびCELTIC_11sの分解を引き起こした。しかしながら、純粋な血清中のＤＮＡアプタマーの希釈は、１時間のインキュベーション後の強度の低下をもたらした。これらの結果は、実施例９でフローサイトメトリーで報告された安定性と完全に一致している。
実施例１２ゲル電気泳動を用いた抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマーの血清安定性
抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマー（ARACD3-3700006およびARACD3-0010209）の安定性を、５％ＦＢＳ、１０％ＦＢＳまたは純粋ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地を含有するＤＰＢＳバッファーで検討された。アプタマーを８５℃で５分間変性させた後、すぐに氷ブロックで４℃で５分間冷却した。次に、配列を、５％ＦＢＳを補充したＤＰＢＳバッファー、１０％ＦＢＳまたは純のＦＢＳ血清で補充したＲＰＭＩ培地中、最終濃度２μＭに希釈した。サンプルを３７℃で１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間または２４時間インキュベートした。対照サンプルには、３７℃でインキュベートせずに作りたてのアプタマーを含んでいた。それぞれのバッファー内のアプタマーの半減期は、次のように変性電気泳動法を用いてアガロースゲル上の移動によって決定した：異なるインキュベーション時間からのアプタマー試料をホルムアミド含有負荷バッファー（ThermoScientific, ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）と混合し、および８５℃で５分間変性した後、各サンプルの１５μＬを、ＲＮＡ染色マーカーとしてSYBRsafe（Invitrogen）を含む作成仕立ての３％アガロースゲルに配置した。アガロースゲル上のＲＮＡアプタマーの移動は、２０分間に１００Ｖを印加することにより1X TBE緩衝液（Invitrogen）で行った。ゲルをバイオ・ラッド画像化システムを用いて可視化し、その結果を図３２Ｂ－Ｃに示した。両方のアプタマーは、DPBS-5%FBSおよびRPMI-10%FBSにおいて少なくとも４時間安定であった。純粋な血清中のＲＮＡアプタマーのインキュベーシウォルサム０分後に強度の減少をもたらした。これらの結果は、実施例１０でフローサイトメトリーで報告された安定性と完全に一致している。
抗ＣＤ３ ＲＮＡアプタマー（ARACD3-3700006およびARACD3-0010209）の安定性を、５％ＦＢＳ、１０％ＦＢＳまたは純粋ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地を含有するＤＰＢＳバッファーで検討された。アプタマーを８５℃で５分間変性させた後、すぐに氷ブロックで４℃で５分間冷却した。次に、配列を、５％ＦＢＳを補充したＤＰＢＳバッファー、１０％ＦＢＳまたは純のＦＢＳ血清で補充したＲＰＭＩ培地中、最終濃度２μＭに希釈した。サンプルを３７℃で１０分間、３０分間、１時間、２時間、４時間または２４時間インキュベートした。対照サンプルには、３７℃でインキュベートせずに作りたてのアプタマーを含んでいた。それぞれのバッファー内のアプタマーの半減期は、次のように変性電気泳動法を用いてアガロースゲル上の移動によって決定した：異なるインキュベーション時間からのアプタマー試料をホルムアミド含有負荷バッファー（ThermoScientific, ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）と混合し、および８５℃で５分間変性した後、各サンプルの１５μＬを、ＲＮＡ染色マーカーとしてSYBRsafe（Invitrogen）を含む作成仕立ての３％アガロースゲルに配置した。アガロースゲル上のＲＮＡアプタマーの移動は、２０分間に１００Ｖを印加することにより1X TBE緩衝液（Invitrogen）で行った。ゲルをバイオ・ラッド画像化システムを用いて可視化し、その結果を図３２Ｂ－Ｃに示した。両方のアプタマーは、DPBS-5%FBSおよびRPMI-10%FBSにおいて少なくとも４時間安定であった。純粋な血清中のＲＮＡアプタマーのインキュベーシウォルサム０分後に強度の減少をもたらした。これらの結果は、実施例１０でフローサイトメトリーで報告された安定性と完全に一致している。
実施例１３：抗ＣＤ３モノクローナル抗体による競合結合アッセイによる抗ＣＤ３ ＤＮＡアプタマーのエピトープマッピング
CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19sアプタマーによって認識される領域に関する詳細情報を収集するために、参照モノクローナル抗体を使用した競合結合アッセイを、基本的に実施例３ですでに説明したように、ただし以下の変更を加えて陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して行った。
CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19sアプタマーによって認識される領域に関する詳細情報を収集するために、参照モノクローナル抗体を使用した競合結合アッセイを、基本的に実施例３ですでに説明したように、ただし以下の変更を加えて陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して行った。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＰＥ標識モノクローナル抗体（OKT3-PE-0.1 nM; UCHT1-PE-1nMまたはHIT3a-PE-0.1nM-すべてThermoScientific、Waltham、マサチューセッツ州、米国から購入）と３７℃で３０分間、過剰なさまざまの競合他社の存在下（標識なしOKT3-32nM；標識なしUCHT1-10nM；標識なしHIT3a-32nM-すべてThermoScientific、Waltham、マサチューセッツ州、米国から購入およびアプタマー-300 nM）でインキュベートした。次に、細胞への標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体の結合をフローサイトメトリーによって評価した。
逆実験の設定では、Ｊｕｒｋａｔ細胞は、CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19s ＤＮＡアプタマー（300nMの濃度に固定）を用いて、非標識モノクローナル抗体（OKT3-32 nM;UCHT1 - 10 nM;ラベルなし HIT3a - 32 nM）の飽和濃度を有するか、または有しないでインキュベートされた。次に細胞上のビオチン化アプタマーの結合を、ストレプトアビジン－ＰＥで検出した後のフローサイトメトリーにより評価した。
競合他社の飽和濃度の有無にかかわらずＰＥ標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体の結合結果は、図１７．１Ａ、１７．２Ａおよび１７．３Ａに示されている。それぞれの試験抗体について、その標識されていない形態の過剰を使用して、実験条件を検証したそのＰＥ標識バージョンの結合を阻害または完全に廃止した。最大シグナルは、試験された候補が３つの基準抗体の結合を妨げなかったことを示唆する競合他社としてアプタマーが使用されたときに測定された。
モノクローナル抗体の飽和濃度の有無にかかわらず抗CD3アプタマーの結合結果を、図１７．１．Ｂ、１７．２．Ｂおよび１７．３．Ｂに示す。同様のシグナルは、アプタマーが競合者の有無にかかわらずインキュベートされたときに測定され、抗体が試験配列の結合を妨げなかったことを示唆する。
抗ＣＤ３アプタマーとテストされた参照モノクローナル抗体の間に見られる競合の欠如は、アプタマーが標的とするヒトCD3受容体の領域がOKT3、HIT3a、およびUCHT1 エピトープとは異なることを示唆している。OKT3およびUCHT1抗体は、結合するとＴリンパ球を活性化することが報告されています。CELTIC_1s、CELTIC_4s、CELTIC_11s、CELTIC_19sによる代替ＣＤ３エピトープの認識は、実施例７においてヒトＰＢＭＣ上で観察された活性化特性の欠如と一致している。
実施例１４：抗ＣＤ３モノクローナル抗体による競合結合アッセイによる抗ＣＤ３・ＲＮＡアプタマーのエピトープマッピング
ARACD3-3700006およびARACD3-0010209アプタマーにより認識される領域に関する詳細情報を収集するために、参照モノクローナル抗体を有する競合結合アッセイは、ＤＰＢＳ－５％ＦＣＳがＳＥＬＥＸバッファー－５％ＦＣＳの代わりに使用されたことを除いて、実質的に実施例１３で既に説明したようにＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞上で行われた。
競合他社の飽和濃度の有無にかかわらずＰＥ標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体の結合結果を、図３８－Ａ、３８－Ｃおよび３８－Ｅに示す。
それぞれの試験抗体について、その標識されていない形態の過剰を使用して、実験条件を検証したそのＰＥ標識バージョンの結合を阻害または完全に廃止した。最大シグナルは、試験された候補が３つの基準抗体の結合を妨げなかったことを示唆する競合他社としてアプタマーが使用されたときに測定された。
モノクローナル抗体の飽和濃度の有無にかかわらず抗ＣＤ３アプタマーの結合結果を、図３８．Ｂ、３８－Ｄおよび３８－Ｆに示す。同様のシグナルは、アプタマーが競合者の有無にかかわらずインキュベートされたときに測定され、抗体が試験配列の結合を妨げなかったことを示唆する。
抗ＣＤ３アプタマーとテストされた参照モノクローナル抗体の間に見られる競合の欠如は、アプタマーが標的とするヒトCD3受容体の領域がOKT3、HIT3a、およびUCHT1 エピトープとは異なることを示唆している。OKT3およびUCHT1抗体は、結合するとＴリンパ球を活性化することが報告されています。ARACD3-3700006およびARACD3-0010209による代替ＣＤ３エピトープの認識は、実施例８におけるヒトＰＢＭＣ上で観察された活性化特性の欠如と一致している。
ARACD3-3700006およびARACD3-0010209アプタマーにより認識される領域に関する詳細情報を収集するために、参照モノクローナル抗体を有する競合結合アッセイは、ＤＰＢＳ－５％ＦＣＳがＳＥＬＥＸバッファー－５％ＦＣＳの代わりに使用されたことを除いて、実質的に実施例１３で既に説明したようにＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞上で行われた。
競合他社の飽和濃度の有無にかかわらずＰＥ標識抗ＣＤ３モノクローナル抗体の結合結果を、図３８－Ａ、３８－Ｃおよび３８－Ｅに示す。
それぞれの試験抗体について、その標識されていない形態の過剰を使用して、実験条件を検証したそのＰＥ標識バージョンの結合を阻害または完全に廃止した。最大シグナルは、試験された候補が３つの基準抗体の結合を妨げなかったことを示唆する競合他社としてアプタマーが使用されたときに測定された。
モノクローナル抗体の飽和濃度の有無にかかわらず抗ＣＤ３アプタマーの結合結果を、図３８．Ｂ、３８－Ｄおよび３８－Ｆに示す。同様のシグナルは、アプタマーが競合者の有無にかかわらずインキュベートされたときに測定され、抗体が試験配列の結合を妨げなかったことを示唆する。
抗ＣＤ３アプタマーとテストされた参照モノクローナル抗体の間に見られる競合の欠如は、アプタマーが標的とするヒトCD3受容体の領域がOKT3、HIT3a、およびUCHT1 エピトープとは異なることを示唆している。OKT3およびUCHT1抗体は、結合するとＴリンパ球を活性化することが報告されています。ARACD3-3700006およびARACD3-0010209による代替ＣＤ３エピトープの認識は、実施例８におけるヒトＰＢＭＣ上で観察された活性化特性の欠如と一致している。
実施例１５：コア配列に由来する安定性が向上した抗ＣＤ３・ＤＮＡアプタマーのエンジニアリング
ＣＤ３陽性およびＣＤ３陰性細胞で実施され、実施例３で説明されている結合研究で得られた結果に基づいて、コア配列に由来し、見かけの親和性および標的特異性が改善された、配列最適化抗ＣＤ３アプタマーの短いリストが、血清中のそれらの安定性をさらに調査するために選択された。これらの分析は、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＦＢＳまたは純粋なＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を含む選択（SELEX）バッファーでインキュベートされた、アプタマー CELTIC_core、CELTIC_core_12およびCELTIC_core_12および5'end HEG修飾CELTIC_core_24、CELTIC_core_29、CELTIC_core_40およびCELTIC_core_42を使用して実行された。種々のインキュベーション時間後、未分解アプタマーの分画は、それぞれ実施例１１および１３に説明されているようにフローサイトメトリーおよびアガロースゲル電気泳動法によって定量した。
ＣＤ３陽性およびＣＤ３陰性細胞で実施され、実施例３で説明されている結合研究で得られた結果に基づいて、コア配列に由来し、見かけの親和性および標的特異性が改善された、配列最適化抗ＣＤ３アプタマーの短いリストが、血清中のそれらの安定性をさらに調査するために選択された。これらの分析は、５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０％ＦＢＳまたは純粋なＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地を含む選択（SELEX）バッファーでインキュベートされた、アプタマー CELTIC_core、CELTIC_core_12およびCELTIC_core_12および5'end HEG修飾CELTIC_core_24、CELTIC_core_29、CELTIC_core_40およびCELTIC_core_42を使用して実行された。種々のインキュベーション時間後、未分解アプタマーの分画は、それぞれ実施例１１および１３に説明されているようにフローサイトメトリーおよびアガロースゲル電気泳動法によって定量した。
図２２Ａ－Ｆおよび２３Ａ－Ｃに示すように、アプタマーCELTIC_core、CELTIC_core_24およびCELTIC_core_29は、SELEX-5% FBSで４時間または純粋な血清中で３０分インキュベーションした後に残された統合／機能性アプタマーを有しない試験された血清状態のそれぞれにおいて非常に不安定に見えた。実施例１１および１３で既に観察されたように、両方の方法により得られた結果において完全な一貫性があった。比較として、親のノーカットのCELTIC_1sおよびCELTIC_19s配列は、SELEX-5％FBS中で２４時間、純粋な血清で少なくとも１時間安定していた。一方、CELTIC_core_12、CELTIC_core_40、CELTIC_core_42は、両方の安定性の読み出しではるかに優れたパフォーマンスを発揮しました。CELTIC_core_12は、SELEX-５％FBSおよび10％FBSを含むRPMI培地で24時間培養した後、完全に分解されていない最も安定したアプタマーであった。純粋な血清では、その分解は４時間後でのみ起こり始めた。CELTIC_core_40およびCELTIC_core_42は、未修飾のCELTIC_core配列よりも安定している中間ケースであったが、４時間のインキュベーション後に純粋な血清で完全に分解されました。CELTIC_core_12、CELTIC_core_29、およびCELTIC_core_42は、位置１１で１個のヌクレオチドだけ異なるが、まったく異なる安定性を示すことは注目に値する。また、位置１６においてCELTIC_core_29内の第２の非塩基部位を導入し、その結果CELTIC_core_42が配列を安定化させる戦略のように見えた。
ＨＥＧ修飾CELTIC_core_40およびCELTIC_core_42の安定性を向上させるもう一つの試みとして、３‘－３’デオキシ－チミジンを添加する利点が検討された。このタイプの変性は、３‘末端でヌクレアーゼ分解に対するヌクレオチド配列の抵抗性を高めることが報告されている。図３２．１ Ａ～Ｄおよび３２．２ Ａ～Ｂに示されるように、CELTIC_core_40およびCELTIC_core_42と比較して、3'-3'デオキシ-チミジンを３‘末端で有するアプタマーは、安定性を著しく改善した。CELTIC_coreを上回るものではないが、これらの変異体はSELEX-5%FBSで２４時間、純粋な血清中で少なくとも２時間安定であった。ヌクレアーゼ感受性部位と一般的に考えられている２つの非塩基部位の存在にもかかわらず、CELTIC_core_42はCELTIC_core_40よりも安定していたことは言及する価値がある。
実施例１６：最も安定した、配列最適化された抗CD3コアDNA配列誘導体は、クロス特異的を維持する
コア配列に由来する最も興味深い抗ＣＤ３アプタマーを用いた結合親和性測定は、実施例４で既に説明したように、BIAcore T200機器（GE Healthcare）を使用して行なわれた。アプタマーとＣＤ３タンパク質間の相互作用を分析するために、ビオチン化アプタマーを、メーカー（GE Healthcare社）の取扱説明書に従ってシリーズＳセンサーチップＳＡ（GE Healthcare社）に固定した。カニクイザルＣＤ３ε/δはAcroBiosystems社から購入した。ヒトタンパク質の場合、マウスおよびカニクイザル抗原に対して使用された最高濃度は１００ｎＭ、１μＭであった。その他の濃度は３倍希釈により得られた。
コア配列に由来する最も興味深い抗ＣＤ３アプタマーを用いた結合親和性測定は、実施例４で既に説明したように、BIAcore T200機器（GE Healthcare）を使用して行なわれた。アプタマーとＣＤ３タンパク質間の相互作用を分析するために、ビオチン化アプタマーを、メーカー（GE Healthcare社）の取扱説明書に従ってシリーズＳセンサーチップＳＡ（GE Healthcare社）に固定した。カニクイザルＣＤ３ε/δはAcroBiosystems社から購入した。ヒトタンパク質の場合、マウスおよびカニクイザル抗原に対して使用された最高濃度は１００ｎＭ、１μＭであった。その他の濃度は３倍希釈により得られた。
以下の表８は、表面プラズモン共鳴測定から得られたＫＤ値の要約を示している。これらの結果は、親の配列CELTIC_CD3_1sおよびCELTIC_CD3_19sと比較して、コア配列を有する細胞結合アッセイにおいて観察される親和性低下を確認する。細胞結合アッセイで同定されたコア配列の変異体（CELTIC_core_12、CELTIC_core_24、CELTIC_core_29、CELTIC_core_40およびCELTIC_core_42）は、いずれもヒトCD3 e/γを有する未修飾アプタマーよりも良好な親和性を有することが確認された。実施例４ですでに観察されたように、親和性は、一般に、CD3 ε/δでわずかに低かったが、これは、CD3 ε/δイソ型で多くのラウンドを含むＳＥＬＥＸ戦略の結果である。これらの配列はいずれもヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合しなかった。CELTIC_core_24、CELTIC_core_40、およびCELTIC_core_42の３‘末端に３‘－３’デオキシチミジンを付加しても、ＫＤ値は大幅に変化しなかった。
以下の表９は、ヒトCD3 e/γおよびマウスとカニクイザルCD3 e/δで実行された表面プラズモン共鳴測定から得られたＫＤ値の要約を示している。この新しい実験のセットアップでは、配列変異体CELTIC_core_12、CELTIC_core_24、CELTIC_core_29、CELTIC_core_40、およびCELTIC_core_42が改善された親和性を示した場合、CELTIC_coreは親配列CELTIC_core_1sおよびCELTIC_core_19sと比較してヒトCD3 e/γに対して再び低い親和性を示した。これらの条件では、最新の４つのアプタマーの３’－３’デオキシチミジン修飾バージョンが同等に良好に機能した。これらの配列最適化されたアプタマーはすべて、実施例３および５で既に観察されているCD3アプタマーの交差特異性を確認するマウスとカニクイザルCD3 e/δイソ型を結合することができた。CELTIC_core、CELTIC_1s、またはCELTIC_19sとは対照的に、マウスおよびカニクイザルCD3 e/δイソ型との相互作用について報告されたＫＤ値は、ヒトCD3タンパク質と同じ範囲にあったことを示唆し、測定された相互作用が実際であることを示唆した。 これらの結果に基づいて、抗ＣＤ３配列最適化アプタマーは、マウスに対して交差特異的なままであり、これらはヒト受容体に対して選択されたが、マウスとカニクイザルに結合する。
実施例１７：最も安定した、配列最適化された抗ＣＤ３コアＤＮＡ配列誘導体は、依然として参照抗体とは異なるエピトープを認識する
CELTIC_core_12、CELTIC_core_40tおよびCELTIC_42tアプタマーによって認識される領域に関するより詳細情報を収集するために、参照モノクローナル抗体を有する競合結合アッセイは、実質的に実施例１３に既に説明されているようにＣＤ３陽性のＪｕｒｋａｔ細胞に対して行われた。比較として、これらの分析にはノーカットのCD3_CELTIC_1sが含まれていた。
競合他社の飽和濃度の有無にかかわらず、ＰＥ標識抗CD3 OKT3、UCHT1、およびHIT3aモノクローナル抗体の結合結果を、図２１－Ａ、２１－Ｃ、および２１－Ｅに示す。それぞれの試験抗体について、その標識されていない形態の過剰を使用して、実験条件を検証したそのＰＥ標識バージョンの結合を阻害または完全に廃止した。最大シグナルは、試験された候補が３つの基準抗体の結合を妨げなかったことを示唆する競合他社としてアプタマーが使用されたときに測定された。
モノクローナル抗体の有無にかかわらず、抗ＣＤ３アプタマーの結合結果を、図２１－Ｂ、２１－Ｄ、および２１－Ｅに示す。同様のシグナルは、アプタマーが競合者の有無にかかわらずインキュベートされたときに測定され、抗体が試験配列の結合を妨げなかったことを示唆する。
抗ＣＤ３アプタマーとテストされた参照モノクローナル抗体の間に見られる競合の欠如は、アプタマーが標的とするヒトCD3受容体の領域がOKT3、HIT3a、およびUCHT1 エピトープとは異なることを示唆している。これらの結果を総合すると、配列最適化CELTIC_core_12、CELTIC_core_40t、およびCELTIC_42tアプタマーは、ヌクレオチド組成物や5 'および3'末端の化学修飾における変異体にもかかわらず、エピトープ特異性の点で親配列と異ならないことが示唆される。結合時にＴリンパ球を活性化することが知られているOKT3およびUCHT1エピトープに代わるＣＤ３領域への結合は、CELTIC_core_12、CELTIC_core_40tおよびCELTIC_42tアプタマーが活性化特性を示さない可能性があることを示唆している。
CELTIC_core_12、CELTIC_core_40tおよびCELTIC_42tアプタマーによって認識される領域に関するより詳細情報を収集するために、参照モノクローナル抗体を有する競合結合アッセイは、実質的に実施例１３に既に説明されているようにＣＤ３陽性のＪｕｒｋａｔ細胞に対して行われた。比較として、これらの分析にはノーカットのCD3_CELTIC_1sが含まれていた。
競合他社の飽和濃度の有無にかかわらず、ＰＥ標識抗CD3 OKT3、UCHT1、およびHIT3aモノクローナル抗体の結合結果を、図２１－Ａ、２１－Ｃ、および２１－Ｅに示す。それぞれの試験抗体について、その標識されていない形態の過剰を使用して、実験条件を検証したそのＰＥ標識バージョンの結合を阻害または完全に廃止した。最大シグナルは、試験された候補が３つの基準抗体の結合を妨げなかったことを示唆する競合他社としてアプタマーが使用されたときに測定された。
モノクローナル抗体の有無にかかわらず、抗ＣＤ３アプタマーの結合結果を、図２１－Ｂ、２１－Ｄ、および２１－Ｅに示す。同様のシグナルは、アプタマーが競合者の有無にかかわらずインキュベートされたときに測定され、抗体が試験配列の結合を妨げなかったことを示唆する。
抗ＣＤ３アプタマーとテストされた参照モノクローナル抗体の間に見られる競合の欠如は、アプタマーが標的とするヒトCD3受容体の領域がOKT3、HIT3a、およびUCHT1 エピトープとは異なることを示唆している。これらの結果を総合すると、配列最適化CELTIC_core_12、CELTIC_core_40t、およびCELTIC_42tアプタマーは、ヌクレオチド組成物や5 'および3'末端の化学修飾における変異体にもかかわらず、エピトープ特異性の点で親配列と異ならないことが示唆される。結合時にＴリンパ球を活性化することが知られているOKT3およびUCHT1エピトープに代わるＣＤ３領域への結合は、CELTIC_core_12、CELTIC_core_40tおよびCELTIC_42tアプタマーが活性化特性を示さない可能性があることを示唆している。
実施例１８：共有化学によるその後のグラフトのための配列最適化抗ＣＤ３コアＤＮＡ配列誘導体の機能化は、生物学的特性を改変しない
我々は、最後に、特定の抗CD3アプタマーの生物学的特性に対する３‘および５‘末端の修飾の影響を評価することに着手した。この問題は、機能化されたアプタマーを担体、ポリマーまたは表面に共有結合することを考慮する際に特に関連性があります。これを行うために、５’－または３’－末端でＴＥＧ－ビオチンと結合したHEG修飾CELTIC_core_42を選択し、実施例１で既に説明したように固相合成によってテトラジン－ＰＥＧ５群をCELTIC_core_42の５‘末端で導入した。このような官能基はそれぞれ、親和性相互作用（１０１５ＭのＫＤと、これまでに報告された最強の相互作用）またはクリックケミストリーによるノルボルネン／アルケン／アルキン修飾パートナーへの共有結合（逆電子要求ディールスアルダー）を介したアプタマーのビオチンへの結合を可能にする。
同一アプタマーとＪｕｒｋａｔ細胞上で発現したＣＤ３受容体とのこれら３つのバージョンの相互作用を、実施例３に既に説明したように調査した。ＣＤ３陰性のＲａｍｏｓ細胞は、導入された化学修飾によって媒介される非特異的相互作用を監視する陰性対照として含まれていた。図３３に要約した結果は、特定のアプタマーの両端が、見かけの親和性（ＫＤ＜５０ ｎＭ）および特異性に影響を与えることなくビオチンで修飾できることを示している。５‘末端でテトラジン機能を導入した結果、ＣＤ３標的に対する特異性を失うことなく、わずかに親和性（見かけのＫＤ＜２５ ｎＭ）が改善された。
我々は、最後に、特定の抗CD3アプタマーの生物学的特性に対する３‘および５‘末端の修飾の影響を評価することに着手した。この問題は、機能化されたアプタマーを担体、ポリマーまたは表面に共有結合することを考慮する際に特に関連性があります。これを行うために、５’－または３’－末端でＴＥＧ－ビオチンと結合したHEG修飾CELTIC_core_42を選択し、実施例１で既に説明したように固相合成によってテトラジン－ＰＥＧ５群をCELTIC_core_42の５‘末端で導入した。このような官能基はそれぞれ、親和性相互作用（１０１５ＭのＫＤと、これまでに報告された最強の相互作用）またはクリックケミストリーによるノルボルネン／アルケン／アルキン修飾パートナーへの共有結合（逆電子要求ディールスアルダー）を介したアプタマーのビオチンへの結合を可能にする。
同一アプタマーとＪｕｒｋａｔ細胞上で発現したＣＤ３受容体とのこれら３つのバージョンの相互作用を、実施例３に既に説明したように調査した。ＣＤ３陰性のＲａｍｏｓ細胞は、導入された化学修飾によって媒介される非特異的相互作用を監視する陰性対照として含まれていた。図３３に要約した結果は、特定のアプタマーの両端が、見かけの親和性（ＫＤ＜５０ ｎＭ）および特異性に影響を与えることなくビオチンで修飾できることを示している。５‘末端でテトラジン機能を導入した結果、ＣＤ３標的に対する特異性を失うことなく、わずかに親和性（見かけのＫＤ＜２５ ｎＭ）が改善された。
これらの結果をまとめて、その後のカップリングに対する抗ＣＤ３アプタマーの機能化は、それらの生物学的特性を有意に阻害することなく行うことができることを示唆している。
クラスター1～45の場合、5'-および3'-末端に存在する隣接領域（それぞれTAGGGAAGAGAAGGAAGGATATとTTGAGaCTAGATGACCACTTGA）および、配列番号１１４に記載されているが、示されていない。
本明細書で使用される場合、「本質的にからなる」とは、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップを含めることを可能にする。本明細書の「含む」という用語の任意の記述は、特に組成物の成分の説明において、または装置の要素の説明において、「本質的にからなる」または「からなる」と交換することができる。
本発明は特定の好ましい実施態様と併せて説明されてきたが、通常の技術の１つは、前述の明細書を読んだ後、本明細書に記載の組成物および方法に様々な変更、同等物の置換、および他の変更を行うことができる。
本発明は特定の好ましい実施態様と併せて説明されてきたが、通常の技術の１つは、前述の明細書を読んだ後、本明細書に記載の組成物および方法に様々な変更、同等物の置換、および他の変更を行うことができる。
Claims (23)
- 配列ＧＸ１Ｘ２ＴＸ３ＧＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＧＸ１０ＣＴＧＧを含むアプタマーであって、ここで、Ｘ１はＧまたはＡ；Ｘ２およびＸ６はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴまたはＧであり、Ｘ４およびＸ９はＧまたはＣであり、Ｘ５はＣまたはＴであり、Ｘ７はＴ、Ｇ、またはＣであり、Ｘ８およびＸ１０はＣ、Ｔ、またはＡ（配列番号１０９）またはその変異体であり、前記アプタマーはＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
- 配列ＧＧＧＸ１ＴＴＧＧＣＸ２Ｘ３Ｘ４ＧＧＧＸ５ＣＴＧＧＣを含むアプタマーであって、Ｘ１およびＸ２はＡ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ３はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ４およびＸ５はＡ、Ｔ、またはＣ（配列番号１１０）またはその変異体であり、前記アプタマーはＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
- 配列ＧＸ１ＴＴＸ２ＧＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７ＧＧＸ８ＣＴＧＧＸ９Ｇを含むアプタマーであって、Ｘ１はＡまたはＧであり、Ｘ２はＴまたはＧであり、Ｘ３およびＸ７、Ｘ９はＧまたはＣであり、Ｘ４はＴまたはＣであり、Ｘ５はＡまたはＴであり、Ｘ６はＴ、Ｃ、またはＧであり、Ｘ８はＡまたはＣ（配列番号１１１）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
- 配列ＧＧＧＴＴＴＧＧＣＡＸ１ＣＧＧＧＣＣＴＧＧＣを含むアプタマーであって、ここで、Ｘ１はＧ、Ｃ、またはＴ（配列番号：１１２）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
- 配列ＧＣＡＧＣＧＡＵＵＣＵＸ１ＧＵＵＵを含むアプタマーであって、Ｘ１はＵまたは塩基なく（配列番号：１１３）またはその変異体であり、前記アプタマーがＣＤ３ε/γまたはＣＤ３ε/δに結合する。
- 前記アプタマーが、約０．２ｐＭ～約２５０ｎＭの解離定数でヒトＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δに結合する、請求項１～５のいずれかに記載のアプタマー。
- 前記アプタマーが、約２０ｎＭ～約８００ｎＭの解離定数で、非ヒト型のＣＤ３ε/γおよび／またはＣＤ３ε/δに結合する、請求項１～５のいずれかに記載のアプタマー。
- 配列番号１～１０８から選択される配列を含む、請求項１～７のいずれかに記載のアプタマー
- 前記配列の変異体を含む、請求項１～８のいずれかに記載のアプタマーであって、前記塩基のうちの１つ以上が非天然に存在する塩基で置換されているか、または前記塩基のうちの１つ以上が省略されているか、または対応するヌクレオチドがリンカーで置換されている、前記アプタマー。
- 前記非天然に存在する１以上の塩基が、メチルイノシン、ジヒドロウリジン、メチルグアノシン、およびチオウリジンからなる群から選択される、請求項９に記載のアプタマー。
- ＣＤ３＋Ｔ細胞に結合するが活性化しない、請求項１～１０のいずれかに記載のアプタマー。
- 薬剤、染料、共有結合のための官能基または生物学的に活性な薬剤をＴ細胞に送達するためのビヒクルであって、前記ビヒクルは、請求項１～１１のいずれかに記載のアプタマーを含む。
- 高分子ナノ粒子を含む、請求項１１または請求項１２に記載のビヒクル。
- 前記高分子ナノ粒子がポリ（ベータアミノエステル）（ＰＢＡＥ）を含む、請求項１３のビヒクル。
- 前記アプタマーが前記ポリマーに共有結合している、請求項１３または請求項１４に記載のビヒクル。
- 前記薬剤がＴ細胞モジュレーターまたは造影剤である、請求項１３～１５のいずれかに記載のビヒクル。
- 前記Ｔ細胞モジュレーターが、導入遺伝子を担持するウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターが前記ポリマーでコーティングされ、前記アプタマーが前記ポリマーに共有結合している、請求項１６に記載のビヒクル。
- 前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１７に記載のビヒクル。
- 前記導入遺伝子がキメラ抗原受容体をコードする、請求項１７または請求項１８に記載のビヒクル。
- 前記Ｔ細胞モジュレーターが、ダサチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＨＤ ＡＣ阻害剤、キナーゼ阻害剤、代謝阻害剤、ＧＳＫ３ ベータ阻害剤、ＭＡＯ－Ｂ阻害剤、およびＣｄｋ５阻害剤からなる群から選択される、請求項１６に記載のビヒクル。
- 対象内のＴ細胞に薬剤を送達する方法であって、請求項１６～２０のいずれかに記載のビヒクルを、対象に投与することを含む、前記方法。
- 請求項１６～２０のいずれかに記載のビヒクルと、１以上の賦形剤とを含む医薬組成物。
- 対象からＴ細胞を単離する方法であって、前記方法が請求項１～１２のいずれかに記載のビヒクルを使用し、対象からＴ細胞を単離することを含む、前記方法。
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