CN110618265B - 一种沙丁胺醇的可视化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沙丁胺醇的可视化检测方法。该方法为在待测样品中加入磁性探针‑二氧化硅‑蛋白复合物进行反应，得到待测样品反应产物，然后加入显色液进行显色反应，根据颜色变化判定待测样品中是否含有沙丁胺醇。该方法的特异性强、操作简便、成本低，肉眼判定结果，检测过程只需要30min，检出限为0.1μmol·L^‑1，在低、中、高三个添加水平下的加标回收率为86.0％～106.0％，RSD控制在15％以内，抗干扰性强，可高效、简便快速的检测中成药和保健品中的沙丁胺醇，极大的满足了可视化检测中成药和保健品中沙丁胺醇的实际需求，具有非常广泛的应用前景。

Description

一种沙丁胺醇的可视化检测方法

技术领域

本发明属于食品药品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种沙丁胺醇的可视化检测方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高以及对西药会产生抗药性的警惕，越来越多的人们会选择服用他们认为相对安全的中成药和保健品以维持自身的健康，殊不知不法商家会向中成药和保健品中非法添加各类化学药物，用以在短时间内快速提高药物的疗效，以牟取最大的非法利益。而人们在长期服用此类含有非法添加化学药物的中成药和保健品会对人体造成巨大的危害。例如，沙丁胺醇是一种常用的止咳平喘药，属于β2受体激动剂。研究表明，长期服用沙丁胺醇会对人的神经系统产生危害。而一些不法商家为了谋取利益，向中成药和保健品中非法添加沙丁胺醇，严重损害了消费者利益。

目前，常见的沙丁胺醇的检测方法包括色谱法、光谱法和免疫检测法。首先，对于色谱法和光谱法来说，虽然这些方法的检测灵敏度很高，但是，非法添加沙丁胺醇的检测无需很高的灵敏度；且以上方法大多依赖贵重仪器、操作繁琐、需要专业人员且无法进行现场检验。另外，对于免疫检测法来说，免疫检测的核心元件抗体存在制备困难、价格昂贵和批间差异大等缺点。因此，如何建立一种高效、简便快速、成本低及可视化检测沙丁胺醇的方法，已成为当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测沙丁胺醇的方法操作繁琐、成本高、检测结果准确度不高，判断结果程序复杂的缺点和不足，提供一种沙丁胺醇的可视化检测方法。

核酸适配体是一种短的单链核苷酸(DNA或RNA)，由于核酸适配体对目标物具有高度的特异性和高度的亲和力，在医疗诊断、治疗手段、新药物的开发、药物输送系统、生物影像、分析试剂、危害检测、食品检验等领域扮演着重要的角色。近年来，核酸适配体以其体外合成、易于修饰以及稳定性高等优点受到越来越多人的关注。

本发明的目的是提供一种沙丁胺醇的可视化检测方法。

本发明另一目的是提供所述方法在检测沙丁胺醇方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先提供了一种沙丁胺醇的可视化检测方法，在待测样品中加入磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物进行反应，得到待测样品反应产物，然后加入显色液进行显色反应，根据颜色变化判定待测样品中是否含有沙丁胺醇。

本发明的检测原理为：通过大比表面积的二氧化硅微球将ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶固定，并达到信号放大，将二氧化硅微球作为信号放大元件，利用沙丁胺醇核酸适配体作为检测元件，将目标物和ssDNA结合蛋白对沙丁胺醇核酸适配体的竞争作用作为“开关”，利用羧基磁性微球作为分离手段，辣根过氧化物酶与其底物的显色反应作为信号输出，建立沙丁胺醇的可视化检测方法。

优选地，所述判定待测样品中是否含有沙丁胺醇的方法为：若颜色发生变化(变为蓝色，甚至变为绿色)，则待测样品中含有沙丁胺醇；若颜色没有改变，则待测样品中不含有沙丁胺醇。

优选地，所述磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物的制备方法包括以下步骤：

S1.将氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体加入活化的羧基磁性微球中进行偶联，乙醇胺封闭羧基磁性微球上残余的羧基，磁性分离，得到磁性探针；

S2.将羧基二氧化硅微球活化后，加入ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶进行偶联，乙醇胺封闭二氧化硅微球上残余的羧基，离心，得到二氧化硅-蛋白复合物；

S3.将步骤S1得到的磁性探针和步骤S2得到的二氧化硅-蛋白复合物混合后，进行连接反应，磁性分离，洗涤，即可得到所述磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物。

优选地，步骤S1所述氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体的序列为：

5’-NH₂-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTTGTAAAACTTAATCAGCGATTCTCTATGTCTGCAATTACCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

优选地，步骤S1所述氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体和羧基磁性微球的体积比为50：1～4。

更优选地，步骤S1所述氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体和羧基磁性微球的体积比为20：1。

优选地，步骤S2所述羧基二氧化硅微球、ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶的体积比为100：2～8：5～15。

更优选地，步骤S2所述羧基二氧化硅微球、ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶的体积比为20：1：2。

优选地，步骤S3所述混合的体积比为1：0.5～2。

更优选地，步骤S3所述混合的体积比为1：1。

优选地，步骤S3所述连接反应的时间为12～18min。

更优选地，步骤S3所述连接反应的时间为15min。

优选地，所述显色液为TMB显色液。

优选地，所述沙丁胺醇为中成药和保健品中的沙丁胺醇。

更优选地，所述中成药和保健品为具有止咳平喘作用的中成药和保健品。

另外，所述方法检测沙丁胺醇方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种沙丁胺醇的可视化检测方法。本发明基于核酸适配体技术建立的沙丁胺醇的可视化检测方法，可高效、简便快速的检测沙丁胺醇，检测过程只需要30min，反应产物的吸光度与沙丁胺醇的浓度之间具有良好的线性关系，线性相关系数为0.9959，检出限为0.1μmol·L^-1。

本发明采用蛋白与二氧化硅偶联的方式将其负载与扩大，比传统纳米金与蛋白的静电结合方式更加牢固，重复性更高；另外，该方法检测沙丁胺醇的特异性强、操作简便、成本低，肉眼即可判定结果，实现了可视化检测，在低、中、高三个添加水平下的加标回收率为86.0％～106.0％，RSD控制在15％以内，抗干扰性强，极大的满足了可视化检测中成药和保健品中沙丁胺醇的实际需求，在检测实际样品中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

附图说明

图1是本实施例中沙丁胺醇的可视化检测方法建立的原理图；其中，MB代表羧基磁性微球；SiO₂代表二氧化硅微球；HRP代表辣根过氧化物酶；SSB代表ssDNA结合蛋白；SAL代表沙丁胺醇；SAL-Aptamer代表沙丁胺醇核酸适配体；Supernatant代表上清液；TMB代表3,3',5,5',-四甲基联苯胺。

图2是本发明制备得到的SiO₂@SSB@HRP复合物的表征图。

图3是本发明显色反应时间的优化结果图。

图4是不同浓度的沙丁胺醇检测反应产物的紫外可见光谱图。

图5是检测信号拟合曲线结果图。

图6是不同浓度的沙丁胺醇的可视化检测结果图；其中，1、2、3、4、5、6分别代表加入浓度为10μmol·L^-1、5μmol·L^-1、1μmol·L^-1、0.5μmol·L^-1、0.1μmol·L^-1、0μmol·L^-1的沙丁胺醇。

图7是检测沙丁胺醇的可视化检测方法的特异性验证结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用的材料和仪器如下：

3μm羧基磁性微球(MB)购自上海英芮诚生化科技有限公司；100nm羧基化二氧化硅微球购自中科雷鸣(北京)科技有限公司；ssDNA结合蛋白(SSB)购于自哈尔滨新海基因检测有限公司；乙醇胺购自上海麦克林生化科技有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)、3,3',5,5',-四甲基联苯胺(TMB)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和沙丁胺醇核酸适配体均购于上海生工生物科技股份有限公司；水均为18.25MΩ·cm^-1的超纯水，由实验室Milli-Q水系统生成。磁力搅拌器，德国伊卡(IKA)公司；超微量紫外可见分光光度计，德国(IMPLEN)公司；离心机，美国贝克曼库尔特(BeckmanCoulter)公司。

以下实施例中所用的缓冲液的配制：

偶联缓冲液(0.02mol·L^-1MES，pH 5.0)；适配体结合缓冲液(BB，50mmol·L^{- 1}Tris-HCl，5mmol·L^-1KCl，100mmol·L^-1NaCl，1mmol·L^-1MgCl₂，pH 7.4)；TMB缓冲液(0.1mol·L^-1Na₃C₆H₅O₇，0.2mol·L^-1NaHPO₄，pH 5.2)；显色液(30％H₂O₂，1mg·mL^-1TMB乙醇溶液，TMB缓冲液体积比1：100：900混合，现配现用)；0.1mol·L^-1PBS缓冲液。

实施例1沙丁胺醇的可视化检测方法的建立

本实施例中沙丁胺醇的可视化检测方法建立的原理图如图1所示，由于70个碱基的ssDNA结合蛋白的作用力(K_d＝1.1μmol·L^-1)小于沙丁胺醇核酸适配体与目标物的亲和作用(K_d＝53.60nmol·L^-1)；因此，当待测样本中有沙丁胺醇时，固定于羧基磁性微球上的沙丁胺醇核酸适配体与目标物结合，而与ssDNA结合蛋白断开，捕获完成并磁性分离，利用二氧化硅-蛋白复合物与显色液进行显色反应，根据颜色变化即可判定是否含有沙丁胺醇。

具体的检测原理为：通过大比表面积的二氧化硅微球将ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶固定，并达到信号放大，将二氧化硅微球作为信号放大元件，利用沙丁胺醇核酸适配体作为检测元件，将目标物和ssDNA结合蛋白对沙丁胺醇核酸适配体的竞争作用作为“开关”，利用羧基磁性微球作为分离手段，辣根过氧化物酶与其底物的显色反应作为信号输出，建立沙丁胺醇的可视化检测方法。

一、磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物的制备

1、实验方法

本实施例磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物的制备方法包括以下步骤：

S1.磁性探针的制备

取100μL 10mg·mL^-1MB分散于400μL偶联缓冲液中，向其中加入偶联剂EDC/NHS(4：1)至10mg·mL^-1，室温活化1h，洗去多余偶联剂。吸取5μL 100μmol·L^-1沙丁胺醇核酸适配体，95℃水浴5min，立即置入冰浴中延展10min，然后将其加入到活化的MB中，室温偶联1h。最后加入乙醇胺5μL，室温反应1h，以封闭MB上残余的羧基。终产物磁性分离，BB洗涤3次，即可得到磁性探针(MB-aptamer)，将其悬于200μL BB中，备用。

S2.二氧化硅-蛋白复合物的制备

将100μL 50mg·mL^-1羧基二氧化硅微球分散于900μL偶联缓冲液中，加入偶联剂EDC/NHS(4：1)至10mg·mL^-1，室温下活化1h，5000r·min^-1离心5min，洗涤3次之后重悬于400μL偶联缓冲液中。向其中加入5μL 2μg·μL^-1SSB、10μL 10mg·mL^-1HRP，室温偶联2h。最后加入乙醇胺5μL，室温反应2h，以封闭二氧化硅微球上残余的羧基。终产物5000r·min^-1离心5min，去离子水洗涤3次，即可得到二氧化硅-蛋白复合物(SiO₂@SSB@HRP复合物)，将其悬于200μL离子水中，备用。

S3.磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物的制备

将上述步骤S1得到的MB-aptamer与步骤S2得到的SiO₂@SSB@HRP复合物混合，37℃连接反应3h。磁性分离吸弃上清液，BB洗涤3次，复悬后再次于室温下反应1h，磁性分离吸弃上清液，BB洗涤3次。即可得到磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物(MB-aptamer-SiO₂@SSB@HRP复合物)，将其分散于300μL BB中，4℃保存备用。

S4.沙丁胺醇的可视化检测方法的建立

在待测样品中加入步骤S3得到的MB-aptamer-SiO₂@SSB@HRP复合物进行反应，得到待测样品反应产物，然后加入显色液进行显色反应，根据颜色变化判定待测样品中是否含有沙丁胺醇；

若颜色发生变化(变为蓝色，甚至转变为绿色)，则待测样品中含有沙丁胺醇；若颜色没有改变，则待测样品中不含有沙丁胺醇。

2、实验结果

本发明制备得到的SiO₂@SSB@HRP复合物的表征图如图2所示，可以看出，SiO₂@SSB@HRP复合物在波长270nm和403nm附近均有吸收峰(曲线c)。而SSB在波长270nm处有吸收峰(曲线a)，HRP在波长403nm处有吸收峰(曲线b)，因此，以上结果证明SiO₂、SSB和HRP偶联成功，成功制备得到了SiO₂@SSB@HRP复合物。

二、显色反应时间的优化

1、实验方法

为确定沙丁胺醇的可视化检测方法中显色反应结果判定的最佳时间，分别设定反应时间为0min、1min、5min、8min、10min、15min、17min、20min，对一系列反应时间的吸光度进行测定。

2、实验结果

本发明显色反应时间的优化结果图如图3所示，可以看出，当显色液与上清液反应时间达到15min时，吸光度达到最大值；因此，选择15min作为显色反应时间进而进行结果判定。

三、沙丁胺醇加标

1、实验方法

取6份以上得到的MB-aptamer-SiO₂@SSB@HRP复合物，每份50μL，分别加入不同浓度(0μmol·L^-1、0.1μmol·L^-1、0.5μmol·L^-1、1μmol·L^-1、5μmol·L^-1、10μmol·L^-1)的沙丁胺醇和BB，使得最终体积均为100μL，进行显色反应15min。之后将得到的6份反应产物磁性分离，小心吸取上清液70μL，加入100μL TMB-H₂O₂显色液，15min后肉眼观察颜色变化，并用紫外-可见分光光度计测定反应产物在650nm处的吸光度。

2、实验结果

不同浓度的沙丁胺醇反应产物的紫外可见光谱如图4所示，可以看出，随着沙丁胺醇浓度的增加，反应产物在650nm处的吸光度逐渐增加。检测信号拟合曲线结果如图5所示，可以看出，650nm处的吸光度与在0.1～10μmol·L^-1范围内沙丁胺醇的浓度具有良好的线性关系，拟合曲线方程为：y＝0.3433x+0.3122(R²＝0.9959)。不同浓度的沙丁胺醇的可视化检测结果如图6所示，可以看出，反应产物的颜色随沙丁胺醇浓度呈现梯度变化。以上结果表明：本发明建立的沙丁胺醇的可视化检测方法的检出限为0.1μmol·L^-1，可以满足检测沙丁胺醇的实际需求。

实施例2沙丁胺醇的可视化检测方法的特异性验证

1、实验方法

由于克伦特罗(Clenbuterol，CLB)、莱克多巴胺(Ractopamine，RAP)与沙丁胺醇的分子结构相似，都属于β受体激动剂。因此，应用本发明建立的沙丁胺醇的可视化检测方法分别检测10μmol·L^-1的沙丁胺醇、1mmol·L^-1的克伦特罗和1mmol·L^-1莱克多巴胺，同时设置空白阴性对照，并用紫外-可见分光光度计测定反应产物在650nm处的吸光度，以验证本发明建立的沙丁胺醇的可视化检测方法的特异性。

2、实验结果

检测沙丁胺醇的可视化检测方法的特异性验证结果如图7所示，可以看出，克伦特罗和莱克多巴胺在650nm处的吸光度与空白阴性对照无显著差异，可忽略不计；而与空白阴性对照、克伦特罗和莱克多巴胺相比，沙丁胺醇在650nm处的吸光度显著升高，高达克伦特罗和莱克多巴胺的10倍以上。另外，沙丁胺醇反应产物的颜色变为蓝色，而克伦特罗和莱克多巴胺的反应产物始终无颜色变化。以上结果表明：本发明建立的沙丁胺醇的可视化检测方法对沙丁胺醇的特异性良好。

实施例3中成药和保健品中沙丁胺醇的检测

为了验证本发明建立的沙丁胺醇的可视化检测方法的可行性，采用标准加入法检测中成药和保健品中沙丁胺醇的回收率，具体实验方法和实验结果如下：

1、实验方法

取1片某品牌已验证沙丁胺醇为阴性的喘息定片，研成粉末，充分溶解后离心，向上清液中加入低、中、高三个不同浓度(0.1μg·mL^-1、0.5μg·mL^-1、2.0μg·mL^-1)的沙丁胺醇，制成典型模拟样品，应用本发明建立的检测中成药和保健品中沙丁胺醇的可视化检测方法进行检测，计算其加标回收率。

2、实验结果

中成药和保健品中沙丁胺醇的检测结果如表1所示，可以看出，加标回收率为86.0％～106.0％，相对标准偏差(RSD)控制在15％以内，可以满足检测中成药和保健品中沙丁胺醇的实际需求，说明本发明建立的沙丁胺醇的可视化检测方法在检测试实际样品(中成药和保健品)中具有广泛的应用前景。

表1中成药和保健品中沙丁胺醇的检测结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种沙丁胺醇的可视化检测方法，其特征在于，在待测样品中加入磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物进行反应，得到待测样品反应产物，然后加入显色液进行显色反应，根据颜色变化判定待测样品中是否含有沙丁胺醇；

所述磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物的制备方法包括以下步骤：

S1.将氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体加入活化的羧基磁性微球中进行偶联，乙醇胺封闭羧基磁性微球上残余的羧基，磁性分离，得到磁性探针；

S2.将羧基二氧化硅微球活化后，加入ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶进行偶联，乙醇胺封闭二氧化硅微球上残余的羧基，离心，得到二氧化硅-蛋白复合物；

S3.将步骤S1得到的磁性探针和步骤S2得到的二氧化硅-蛋白复合物混合后，进行连接反应，磁性分离，洗涤，即可得到所述磁性探针-二氧化硅-蛋白复合物；

其中，步骤S1所述氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体的序列为：

5’-NH2-AGCAGCACAGAGGTCAGATGTTGTAAAACTTAATCAGCGATTCTCTATGTCTGCAATTACCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述判定待测样品中是否含有沙丁胺醇的方法为：若颜色发生变化，则待测样品中含有沙丁胺醇；若颜色没有改变，则待测样品中不含有沙丁胺醇。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1所述氨基修饰的沙丁胺醇核酸适配体和羧基磁性微球的体积比为50：1～4。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2所述羧基二氧化硅微球、ssDNA结合蛋白和辣根过氧化物酶的体积比为100：2～8：5～15。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述混合的体积比为1：0.5～2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3所述连接反应的时间为12～18min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沙丁胺醇为中成药和保健品中的沙丁胺醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述中成药和保健品为具有止咳平喘作用的中成药和保健品。

9.权利要求1～8任一所述方法在检测沙丁胺醇方面的应用。

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