JP4839051B2 - 核酸プローブを用いる被検物質の検出方法 - Google Patents
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このような事情から、高感度に標的物質を分離精製し、検出定量する方法が望まれている。
抗原−抗体反応を利用したイムノアッセイは、B/F分離を行うヘテロジーニアスなアッセイと、B/F分離を行わないホモジーニアスなアッセイに分類される。
第1複合体から、前記核酸リガンドと前記標識物質と前記被検物質とが結合した第2複合体(「標識被検物質−核酸リガンド複合体」と称することがある)を、鎖置換型DNAポリメラーゼと、dATP、dGTP、dTTP及びdCTPからなる群より選択される少なくとも1種のデオキシヌクレオチドとの存在下で、前記第1核酸プローブを鋳型とする伸長反応により解離させる工程;及び
解離された第2複合体の標識物質に基づいて被検物質を検出する工程を含む。
前記標識被検物質−第1ハイブリッド複合体から、前記核酸リガンドと前記標識物質と前記被検物質とが結合した標識被検物質−核酸リガンド複合体を解離させる工程;
解離された標識被検物質−核酸リガンド複合体を分離採取する工程;並びに
前記標識被検物質−核酸リガンド複合体中の標識物質に基づいて被検物質を検出する工程を含む。
相補塩基配列部の配列は、使用する第1核酸プローブの配列に応じて適宜決められる。具体的には、第1核酸プローブの一本鎖部分とハイブリッドを形成できる相補性を有するものであればよく、一本鎖部分と完全な相補性を有するものに限定されない。特に後の解離工程を引き起こすためには、完全一致の相補性でないことが好ましく、相補塩基配列部における第1核酸プローブの相補部分との相同性は約50%以上であればよい。
先ず、第一固相(反応容器など)において、被検物質と、第1核酸プローブと、核酸リガンドと、標識物質とを結合させ、標識被検物質−第1ハイブリッド複合体を形成させる(標識被検物質−第1ハイブリッド複合体形成工程)。
標識物質と被検物質との結合は、被検物質と第1ハイブリッドとの複合体を形成させる前に行ってもよいし、後に行ってもよい。
解離方法としては、(1)温度上昇を利用する方法、(2)競合反応を利用する方法、(3)鎖置換反応を利用する方法などが挙げられ、使用した第1核酸プローブに応じて適宜選択される。
また、第1核酸プローブがステムループ構造を有している場合は、第1核酸プローブの一本鎖部分が5’末端側であることが好ましい。この場合、第1核酸プローブの3’末端側は二本鎖となっており、これを伸長反応の基点とすることができるため、プライマを用いる必要がない。
図1の実施態様で使用されている第1核酸プローブ21は、1本鎖ヌクレオチドで、ステムループを形成している。2重らせんを形成していない第1核酸プローブの1本鎖部分21aは、ループの3’端から数塩基おいて、核酸リガンドの相補塩基配列部と相補的な配列を有している。ループを構成している塩基の一つは、ビオチンで修飾されている。このような第1核酸プローブとしては、例えば、「5’AGAACAGCGTATAATCATTAGCCCGCCCGGCCAA*AAAGGCCGGGCGGGCTAA3’」(配列ID No.2)の配列を有するものが挙げられる。34番目の「A*」はビオチン修飾アデニンを示している。このような配列のプローブは、例えば、タカラバイオ(株)に合成を依頼して得ることができる。
伸長反応が進行するにつれ、核酸リガンド24の相補塩基配列部24bが剥がされ、鎖置換反応が生じる。第1核酸プローブ21の一本鎖だった部分21aが伸長反応により二本鎖となると、標識被検物質−核酸リガンド複合体25が完全に解離する(図1(e))。
(1)第1核酸プローブの固相化
96穴プレートA(IWAKI製のELISAプレート)の各ウェルに、0.2pmol/μlのストレプトアビジン(chemicon SA101 Lot,21080929)を50μl添加し、37℃で1.7時間保存して、ストレプトアビジンを結合させた(図3(a))。
核酸リガンドとして、第1核酸プローブの1本鎖にハイブリダイズ可能な配列を有し、3'端に認識結合部としてビオチンが結合したもの(「5’ATAGCGCGCTGTTCTTACTCAGGGCACTGCAATTGTGGTCCCAATGGGCTGAGTA−biotin 3’」(配列ID No.3))を用いた。第1核酸プローブ(配列ID No.2)の1〜9番目までの塩基と、この核酸リガンド(配列ID No.3)の7〜15番目の塩基が相補的関係にある。
次いで、被検物質(アルカリホスファターゼ(ALP)で標識したストレプトアビジン)を添加し、核酸リガンドのビオチンでこれらを捕捉した(図3(d))。尚、被検物質の捕捉は、アルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン(NORDIC社製、SAv−AP)の2000倍希釈液と核酸リガンドを、1時間反応させることにより行なった。これにより、核酸リガンドのビオチンと被検物質たるストレプトアビジンが結合し、その結果、標識被検物質−第1ハイブリッド複合体が形成された。
鎖置換型DNAポリメラーゼとして、Takara製のReverse TranscriotaqseXL(AMV)を用いた。
下記組成を含む反応液50μlを、各ウェルに1μl添加し、37℃で15時間反応させた。
塩化マグネシウム 6mM
dNTPs 250μl
DTT 2mM
AMV RTaseXL(5U/μl)
第2固相として、オリゴdT20が固定化されたプレートB(ベリタス製のGENE PLATE21GP02−3RNAture)を用いた(図3(g))。
(4)で得られた標識被検物質−核酸リガンド複合体を含むプレートAの各ウェルに収容された溶液を、マイクロピペットを用いて採取し、第2核酸プローブを固定化したプレートBに移した(図3(e))。上澄み液中には、(4)の解離反応で得られた被検物質−核酸リガンド複合体が含有されている。室温で1時間静置することにより、第2核酸プローブの一本鎖と複合体中の相補塩基配列部をハイブリダイズさせて、被検物質−第2ハイブリッド複合体を形成させた(図3(f))。
被検物質−第2ハイブリッド複合体が形成されている容器に、アルカリフォスファターゼ(ALP)の基質であるp−メトキシフェニルフォスフェイト(p−MPP)10mM(希釈液:0.5M、炭酸緩衝液)を10μlずつ添加して、ALP反応を37℃で30分間行った。ALP反応後、停止液(EDTA溶液:pH9)を10μlずつ添加した。
p−MP量はALPの分子数に応じて変化する。従って、p−MP量を測定することによって、核酸リガンド−ストレプトアビジン−ALP複合体の量を測定することができる。
インジェクターに測定試料液(実施例1ではALP反応を終了させた溶液)を入れる。試料液は、インジェクトバルブ(Reodine製77251)を開いて、ODSカラム(YMC−Pack−ODS−AM、AM3C7AM12S05−L502WT No.0270458(W))、ショートカラム(YMCセミミクロガードカートリッジカラム2×10、AM12S05−0102CC)を通って、電気化学検出部へ送液される。このときの溶出液としては、45v/v%又50v/v%メタノールを含む0.1Mのリン酸緩衝液を用いた。ショートカラムは、インジェクトバルブと電極検出部の間に配置されて、測定試料に混入するタンパク成分が電極検出部に到達することで電極表面の汚れを防止する。また、ショートカラムにより緩衝液由来のノイズ電流と検出成分の電流を検出器に到達する時間で分離する。
実施例1の操作(1)〜(3)を同様に行ない、96穴プレートに標識被検物質−第1ハイブリッド複合体を形成させた。この状態で、ALP反応を利用して、標識被検物質−第1ハイブリッド複合体の量を測定した。
図5からわかるように、解離反応を行わなかったアッセイ系(比較例1)では、試料濃度が10−12molまでは、試料濃度と測定値がほぼ相関関係を有するが、それ未満では、ほぼ測定値は変化しなかった。このことは、バックグラウンドノイズが大きいために、10−12mol未満の微量試料を区別して測定できないことを意味する。
(1)第1核酸プローブの固相化
第1固相となる96穴プレートC(CORNING社、DNA-BIND plate)の各ウェルに、50mM Na2PO4、1mM EDTA、100pmol アミノ化オリゴDNA(第1核酸プローブ:5’AGAACAGCGTATAATCATTAGCCCGCCCGGCCAA(NH2−A)AAGGCCGGGCGGGCTAA 3’(配列ID No.4、株式会社ベックス)を含む溶液(pH8.5)を100μl添加し、37℃で1時間静置して、第1核酸プローブ41の35番目のアデニンに付加したアミノ基がプレートCに結合し、第1核酸プローブ41が固定された(図7(a))。
標識被検物質−第1ハイブリッド複合体を形成する際のハイブリダイゼーション用バッファーとして、5×SSC(20×SSC(ニッポンジーン社)を希釈して調製)、0.05% SDS(10%SDS(ニッポンジーン社)を希釈して調製)及び0.005% BSAを超純水に溶解した溶液を用いた。
以下の組成を含む反応液100μlを各ウェルに添加し、37℃1時間反応させた。
1×Thermopol バッファ(New England Labs社)
1mM dATPs(インビトロジェン社)
1mM dGTPs(インビトロジェン社)
1mM dTTPs(インビトロジェン社)
1mM dCTPs(インビトロジェン社)
2.4U/ml BstDNAポリメラーゼ(New England Labs社)
なお、BstDNAポリメラーゼは、鎖置換型DNAポリメラーゼである。
この反応によって、標識被検物質−第1ハイブリッド複合体からHRPで標識された被検物質−核酸リガンド複合体を解離させ、反応液中に遊離させた。
第2固相となる96穴プレートD(CORNING社、DNA-BIND plate)の各ウェルに50mM Na2PO4、1mM EDTA、100pmol 3’末端アミノ化オリゴDNA(第2核酸プローブ:5’ AGAGCAGCGTATGGTCATTTTTT3’:配列ID No.7、シグマジェノシス社)を含む溶液(pH8.5)を100μl添加し、37℃で1時間静置して、第2核酸プローブ51を結合させた。その後、プレートDに固定化されなかった第2核酸プローブを200μlのPBSで3回洗浄することにより除去した。
(3)で得られたプレートCの反応液の全量をプレートDの各ウェルに移動した。移動後、37℃で1時間静置することにより、反応液中のHRPで標識した被検物質−核酸リガンド複合体を第2核酸プローブ51とハイブリダイズさせ、標識被検物質−第2ハイブリッド複合体を形成させた(図10)。標識被検物質−第2ハイブリッド複合体の形成後、各ウェルを200μlのPBSで3回洗浄した。
(5)の工程を終了した後、各ウェルの洗浄用のPBSを除去した。次に、各ウェルにHRPの基質であるTMB(3,3',5,5'Tetramethylbensidine )を含む基質溶液100μlを添加し、37℃で反応させ、HRPの作用で基質であるTMBを分解し、発色させた。1時間後、各ウェルに100μlの1N HCl(和光純薬社)を加えて反応を停止させた。各ウェルの450nmにおける吸光度を、プレートリーダ(TECAN社、Safire2)を用いて測定した。
実施例2と同様にして(1)〜(2)の工程を実施した。その後、(3)〜(5)の工程を行わず、(6)と同様にしてHRPによる発色反応を行い、吸光度を測定した。また、測定の際のバックグラウンド値を測定するため、被検物質を含まない試料(0 fmol)を用いて実施例2の(1)〜(2)を実施し、さらに(6)と同様にしてHRPによる発色反応を行い、吸光度測定を行った。測定結果を表1に示す。
また、試料に含まれる特定物質について、質量分析、電気泳動、分子間相補作用測定を行なうに際して、高純度の測定試料を得るための前処理として利用できる。
22 被検物質
23 二次抗体(第2認識結合物質)
24 核酸リガンド
24a 認識結合部
24b 相補塩基配列部
25 標識被検物質−核酸リガンド複合体
26 鎖置換型ポリメラーゼ
31 第2核酸プローブ
41 第1核酸プローブ
43a 第1物質
43b 第2物質
44 核酸リガンド
51 第2核酸プローブ
Claims (12)
- 試料中の被検物質を検出する方法であって、
第1固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第1核酸プローブと、該第1核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドと、前記被検物質と、該被検物質に結合可能な標識物質と、からなる第1複合体を形成させる工程;
第1複合体から、前記核酸リガンドと前記標識物質と前記被検物質とが結合した第2複合体を、鎖置換型DNAポリメラーゼと、dATP、dGTP、dTTP及びdCTPからなる群より選択される少なくとも1種のデオキシヌクレオチドとの存在下で、前記第1核酸プローブを鋳型とする伸長反応により解離させる工程;及び
解離された第2複合体の標識物質に基づいて被検物質を検出する工程
を含む核酸プローブを用いる被検物質の検出方法。 - 検出工程が、解離された第2複合体と、第2固相に固定され且つ前記核酸リガンドの相補塩基配列部にハイブリダイズ可能な一本鎖を有する第2核酸プローブとからなる第3複合体を形成し、第3複合体の標識物質に基づいて被検物質を検出する、請求項1に記載の検出方法。
- 前記第1複合体形成工程は、
第1核酸プローブと核酸リガンドを接触させ、第1核酸プローブ−核酸リガンド複合体を形成させた後に、第1核酸プローブ−核酸リガンド複合体に、被検物質及び標識物質を結合させることにより行なわれる請求項1又は2に記載の検出方法。 - 前記第1複合体形成工程は、
核酸リガンドと、被検物質と、標識物質を接触させ、第2複合体を形成させた後に、前記第1核酸プローブに、第2複合体を結合させることにより行なわれる請求項1又は2に記載の検出方法。 - 前記認識結合部は、被検物質と結合できるアプタマー、抗体、及び受容体からなる群より選ばれる1種である請求項1〜4のいずれかに記載の測定方法。
- 前記相補塩基配列部はDNA又はRNAで構成され、
前記認識結合部は、前記相補塩基配列部の3’末端に結合している請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 前記標識物質は、
前記被検物質に結合可能な第2認識結合部と、
放射性同位元素、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群より選択される少なくとも1種とを有する請求項1〜6のいずれかに記載の検出方法。 - 前記標識物質は、
前記被検物質に結合可能な第1物質と、
前記第1物質に結合可能であり、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群より選択される少なくとも1種を有する第2物質とからなる請求項1〜7のいずれかに記載の検出方法。 - 試料から被検物質を採取する方法であって、
固相に固定され且つ一本鎖部分を有する第1核酸プローブと、該第1核酸プローブの該一本鎖部分にハイブリダイズ可能な塩基配列の相補塩基配列部及び被検物質を特異的に捕捉できる認識結合部を含む核酸リガンドと、前記被検物質とを結合させて、被検物質−核酸リガンド−第1核酸プローブ複合体を形成させる工程;
前記被検物質−核酸リガンド−第1核酸プローブ複合体から、被検物質−核酸リガンド複合体を、鎖置換型DNAポリメラーゼと、dATP、dGTP、dTTP及びdCTPからなる群より選択される少なくとも1種のデオキシヌクレオチドとの存在下で、前記第1核酸プローブを鋳型とする伸長反応により解離させる工程;及び
解離された被検物質−核酸リガンド複合体を採取する工程;
を含む被検物質の採取方法。
- 試料中の被検物質を検出するために用いられる試薬キットであって、
一本鎖部分を有する第1核酸プローブを固定化した第1固相;
前記第1核酸プローブの一本鎖部分にハイブリダイズ可能な相補塩基配列部と、前記被検物質に結合可能な認識結合部とを有する核酸リガンド;
前記被検物質に結合可能な標識物質;
鎖置換型DNAポリメラーゼ;及び
dATP、dGTP、dTTP及びdCTPからなる群より選択される少なくとも1種のデオキシヌクレオチド;
を含む被検物質検出用試薬キット。 - さらに、前記第1固相を洗浄するための洗浄液を含む請求項10に記載の試薬キット。
- 前記核酸リガンドの認識結合部にハイブリダイズ可能な一本鎖部分を有する第2核酸プローブを固定化した第2固相を、さらに含む請求項10又は11に記載の試薬キット。
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