CN114058613B - 一种大体积、高灵敏度核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大体积、高灵敏度核酸提取方法。本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括向无菌离心管中加入样品；向离心管中加入蛋白酶K试剂、磁珠和裂解液；密封离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀；将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀；将离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，将所述磁珠混合液转移至EP管中；将EP管离心，平铺吸磁，弃上清，烘干。本发明的提取方法大大提高了提取的核酸量，有利于提高极低病毒载量样品核酸检测效率，避免漏检。经过验证，本方法检测下限可以达到1IU/ml，大大提高了检测的灵敏度，能够对低病毒载量的标本进行病毒定量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种大体积、高灵敏度核酸提取方法。
背景技术
核酸提取是分子生物学研究的重要基础。一般来说，成功的核酸提取需要四个重要的步骤：有效地破坏细胞或组织、核蛋白复合物的变性、核酸酶的失活和远离污染。提取出的核酸的质量、完整性和数量将直接影响所有后续科研的结果。
目前，国内外采供血机构在用的核酸检测(Nucleic Acid Test,NAT)方法及系统都是从几百微升到1ml中提取病毒核酸进行检测，但对于很多病毒载量低的标本，并不能有效提取出足够量的核酸，直接影响检测结果，影响临床用血安全。已有报道的针对低病毒载量标本的核酸提取方法有PEG富集法和超高速离心法。其中PEG富集法需要4℃过夜，而超高速离心法需要在4℃、250 000g条件下离心3h，这两种方法耗时长、对设备要求高，难以普及应用。
另一方面，目前核酸检测方法的检测下限是影响临床用血安全的关键点。以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)为例，受核酸检测的检测下限限制，目前仍不能完全检出病毒载量极低的HBV献血者，如隐匿性HBV感染(occult hepatits B virus infection，OBI)。OBI是一种特殊形式的HBV感染，OBI患者体内HBV DNA往往处于极低水平，严重威胁着血液安全。Jos Weusten构建了OBI输血残余风险的数学模型显示，约有3.3％的OBI献血者是目前核酸检测无法检测到的，并且20ml该OBI献血者的血液制品即可造成受血者感染；当使用混样核酸检测时，这一比例更是高达8.7％。2016年Ryanne的研究也表明，接受来源于OBI献血者血液制品的受血者HBV感染率约为5％。2018年Daniel报道了3名HBsAg阴性，HBVDNA阴性献血者造成31名受血者中有9人感染的病例，进一步证实了HBV DNA的最小感染病毒载量为3IU，而要达到完全的临床用血安全需要将HBV DNA检测下限提高到0.15IU。这与目前核酸检测4.3IU/mL(盖立复核酸检测系统)和4.1IU/ml(罗氏MP6-NAT核酸检测系统)的检测下限相比，还有较远距离。因此提高NAT检测下限，提高检测灵敏度，对于保证临床用血安全具有重大意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于，提供一种具有能够完全提取大体积标本核酸且灵敏度高等特点的大体积、高灵敏度核酸提取方法。
一种大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括：
S1：向离心管中加入样品；
S2：向所述离心管中加入蛋白酶K试剂、磁珠和裂解液；
S3：密封所述离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀；
S4：将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀；
S5：将步骤S4中混匀后的离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，将所述磁珠混合液转移至EP管中；
S6：将EP管离心，平铺吸磁，弃上清，烘干；
S7：往EP管内加入预热后的洗脱液，反复吹打，充分悬浮磁珠，保温静置，期间混匀多次；
S8：将EP管放入磁力架上，吸磁，取上清，即为核酸溶液。
本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法，增加了提取核酸标本的体积，大大提高了提取的核酸量，有利于提高核酸检测效率，避免漏检，而且将检测下限提高到1IU/ml，提高检测的灵敏度，能够对低病毒载量的标本进行定量。
进一步优选地，所述裂解液包括按体积分数计的以下组分：柠檬酸钠二水合物0.3％、异硫氰酸胍42.5％、多聚正癸醇5％、DDT 0.9％以及蒸馏水余量。多聚正癸醇的量5％即可达到效果，不需要很多裂解液方案中的12％，节省了成本，同时达到了实验目的。
进一步优选地，步骤S1中离心管的容量为50ml，样品的体积为10ml，步骤S2中蛋白酶K试剂的体积为590-610μl，磁珠的体积为1000-1200μl，裂解液的体积为14-16ml。
进一步优选地，步骤S3中所述密封所述离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀包括：
密封所述离心管，漩涡振荡混匀1-2min，在70℃下温育15-20min，温育期间不时振荡颠倒混匀，温育后再放到混匀器上摇匀5min。
进一步优选地，步骤S4中所述将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀包括：
将所述离心管放到磁力架上，吸磁1min弃上清，将31-35ml磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡30-60s以充分混匀，以达到试剂和样品充分接触的目的，使得样品中的核酸能够提取完全。
进一步优选地，所述大体积、高灵敏度核酸提取方法还包括：
S41：将步骤S4重复3-4遍，充分洗涤，将未结合的物质完全洗涤下来。
进一步优选地，步骤S5中所述将所述磁珠混合液转移至EP管中包括：
留取490-510μl的所述磁珠混合液并转移至2ml的EP管中。
进一步优选地，步骤S6中所述烘干包括：
将EP管放入56℃的烘干机中烘干2h，期间EP管敞口，其上方盖一次性盖子防止其他物质落入EP管内，烘干结束后，盖上EP管的盖子。
进一步优选地，步骤S7所述往EP管内加入预热后的洗脱液，反复吹打，充分悬浮磁珠，保温静置，期间混匀多次包括：
往EP管内加入65℃预热的洗脱液65μl，移液器反复吹打，充分悬浮磁珠，70℃保温静置5-6min，期间混匀多次。
进一步优选地，所述大体积、高灵敏度核酸提取方法还包括：
S9：立即使用所述核酸溶液或将所述核酸溶液置于-20℃环境中保存。
相对于现有技术，本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法，增加了提取核酸标本的体积，大大提高了提取的核酸量，有利于提高核酸检测效率，避免漏检，而且将检测下限提高到1IU/ml，提高了检测的灵敏度，能够对低病毒载量的标本进行定量；裂解液中仅含有5％的多聚正癸醇，在保证能够达到实验目的的情况下，降低了成本；增加烘干步骤可以将10ml样品中提取到的DNA浓缩到洗脱液内，有利于后续试验的进行，提高后续检测效率；本发明中的大体积、高灵敏度核酸提取方法在保证样品中的核酸完全提取的前提下，合理使用试剂，并对试剂用量进行了优化，节省了成本。本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法具有能够完全提取大体积核酸且提高检测下限、灵敏度高等特点。
需要说明的是，在本发明中所使用的蛋白酶K、磁珠、洗脱液EB和磁珠洗涤液均来源于罗氏试剂。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为本发明提取标准品核酸构建的HBV荧光定量标准曲线。
具体实施方式
在本说明书中提到或者可能提到的上、下、左、右、前、后、正面、背面、顶部、底部等方位用语是相对于其构造进行定义的，它们是相对的概念。因此，有可能会根据其所处不同位置、不同使用状态而进行相应地变化。所以，也不应当将这些或者其他的方位用语解释为限制性用语。
以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与本公开的一些方面相一致的实施方式的例子。
在本公开使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本公开。在本公开中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
实施例一
一种大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括：
S1：向50ml无菌离心管中加入10ml样品；
S2：向所述离心管中加入的590μl蛋白酶K试剂、1100μl磁珠和14ml裂解液；
S3：密封所述离心管，漩涡振荡1min充分混匀，70℃温育17min，温育期间不时振荡颠倒混匀，温育后再放到混匀器上摇匀5min；
S4：将所述离心管放到磁力架上，吸磁1min弃上清，将31ml磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡30-60s以充分混匀；
S41：将步骤S4重复3遍；
S5：将步骤S4中混匀后的离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，留取490μl所述磁珠混合液并转移至2ml EP管中；
S6：将EP管离心，平铺吸磁，用移液器吸取上清，弃去，EP管敞开盖，使用烘干机在56℃温度下烘干2h，烘干机上面用盖子盖住，防污染；
S7：往EP管内加入65℃预热的洗脱液(EB)65μl，移液器反复吹打，充分悬浮磁珠，盖紧EP管盖，70℃保温静置5min，期间混匀多次使核酸从磁珠上洗脱下来；
S8：将EP管放入磁力架上，吸磁，取上清，即为核酸溶液；
S9：将核酸溶液立即使用或保存于-20℃的容器中。
实施例二
一种大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括：
S1：向50ml无菌离心管中加入10ml样品；
S2：向所述离心管中加入的600μl蛋白酶K试剂、1000μl磁珠和15ml裂解液；
S3：密封所述离心管，漩涡振荡1min充分混匀，70℃温育15min，温育期间不时振荡颠倒混匀，温育后再放到混匀器上摇匀5min；
S4：将所述离心管放到磁力架上，吸磁1min弃上清，将33ml磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡30-60s以充分混匀；
S41：将步骤S4重复3遍；
S5：将步骤S4中混匀后的离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，留取500μl所述磁珠混合液并转移至2ml EP管中；
S6：将EP管离心，平铺吸磁，用移液器吸取上清，弃去，EP管敞开盖，使用烘干机在56℃温度下烘干2h，烘干机上面用盖子盖住，防污染；
S7：往EP管内加入65℃预热的洗脱液(EB)65μl，移液器反复吹打，充分悬浮磁珠，盖紧EP管盖，70℃保温静置5min40s，期间混匀多次使核酸从磁珠上洗脱下来；
S8：将EP管放入磁力架上，吸磁，取上清，即为核酸溶液；
S9：将核酸溶液立即使用或保存于-20℃的容器中。
实施例三
一种大体积、高灵敏度核酸提取方法，包括：
S1：向50ml无菌离心管中加入10ml样品；
S2：向所述离心管中加入的610μl蛋白酶K试剂、1200μl磁珠和16ml裂解液；
S3：密封所述离心管，漩涡振荡1min充分混匀，70℃温育20min，温育期间不时振荡颠倒混匀，温育后再放到混匀器上摇匀5min；
S4：将所述离心管放到磁力架上，吸磁1min弃上清，将35ml磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡30-60s以充分混匀。
S41：将步骤S4重复4遍；
S5：将步骤S4中混匀后的离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，留取510μl所述磁珠混合液并转移至2ml EP管中；
S6：将EP管离心，平铺吸磁，用移液器吸取上清，弃去，EP管敞开盖，使用烘干机在56℃温度下烘干2h，烘干机上面用盖子盖住，防污染；
S7：往EP管内加入65℃预热的洗脱液(EB)65μl，移液器反复吹打，充分悬浮磁珠，盖紧EP管盖，70℃保温静置6min，期间混匀多次使核酸从磁珠上洗脱下来；
S8：将EP管放入磁力架上，吸磁，取上清，即为核酸溶液；
S9：将核酸溶液立即使用或保存于-20℃的容器中。
相对于现有技术，本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法，增加了提取核酸标本的体积，大大提高了提取的核酸量，有利于提高核酸检测效率，避免漏检，而且将检测下限提高到1IU/ml，提高了检测的灵敏度，能够对低病毒载量的标本进行定量；裂解液中仅含有5％的多聚正癸醇，在保证能够达到实验目的的情况下，降低了成本；增加烘干步骤可以将10ml样品中提取到的DNA浓缩到洗脱液内，有利于后续试验的进行，提高后续检测效率；本发明中的大体积、高灵敏度核酸提取方法在保证样品中的DNA完全提取的前提下，合理使用试剂，并对试剂用量进行了优化，节省了成本。本发明的大体积、高灵敏度核酸提取方法具有能够提取大体积核酸且提高检测下限、灵敏度高等特点。
为验证此方法的有效性，进行了标准品标准曲线的构建，曲线构建良好，证明了该种方法核酸提取完全且有效。
具体操作步骤如下：
将HBV定量试剂盒(广州达安基因股份有限公司)中的HBV标准品分别配置成10000IU/ml、1000IU/ml、100IU/ml、10IU/ml和1IU/ml浓度的标准品，从10ml相应浓度的标准品中提取核酸，用大体积、高灵敏度核酸提取方法(实施例二)，每个浓度梯度行双次检测，以两次检测CT值的平均值为Y轴，病毒浓度的对数为X轴，构建荧光定量标准曲线(如图1所示)和回归方程，图1为实时荧光定量PCR仪ABI 7500合成的荧光定量标准曲线。
结果：HBV病毒荧光定量标准曲线回归方程为：
y＝-3.485x+41.07(R2＝0.999)。
方程中y为CT平均值，x为模板量的对数。
标准曲线回归方程R2大于0.99，说明各浓度CT平均值与模板量的对数之间均具有良好的线性关系。
表1：不同浓度标准品对应平均CT值
| 10000IU/ml | 1000IU/ml | 100IU/ml | 10IU/ml | 1IU/ml | |
| CT平均 | 27.04 | 30.64 | 34.24 | 37.62 | 40.89 |
由上述检测结果可知，本方法可以将检测下限提高到1IU/ml，提高检测的灵敏度，能够对低病毒载量的标本进行定量。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：包括：
S1：向50ml离心管中加入10ml样品；
S2：向所述离心管中加入590-610μl蛋白酶K试剂、1000-1200μl磁珠和14-16ml裂解液，所述裂解液包括按体积分数计的以下组分：柠檬酸钠二水合物0.3％、异硫氰酸胍42.5％、多聚正癸醇5％、DDT 0.9％以及蒸馏水余量；
S3：密封所述离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀；
S4：将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀；
S5：将步骤S4中混匀后的离心管放置到磁力架上，吸磁弃上清，得到磁珠混合液，将所述磁珠混合液转移至EP管中；
S6：将EP管离心，平铺吸磁，弃上清，将EP管放入56℃的烘干机中烘干2h；
S7：往EP管内加入预热后的洗脱液，反复吹打，充分悬浮磁珠，保温静置，期间混匀多次；
S8：将EP管放入磁力架上，吸磁，取上清，即为核酸溶液。
2.根据权利要求1所述的大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：步骤S4中所述将所述离心管放到磁力架上，吸磁弃上清，将磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡以充分混匀包括：
将所述离心管放到磁力架上，吸磁1min弃上清，将31-35ml磁珠洗涤液加入所述离心管，漩涡振荡30-60s以充分混匀。
3.根据权利要求2所述的大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：步骤S5中所述将所述磁珠混合液转移至EP管中包括：
留取490-510μl的所述磁珠混合液并转移至2ml的EP管中。
4.根据权利要求3所述的大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：步骤S7所述往EP管内加入预热后的洗脱液，反复吹打，充分悬浮磁珠，保温静置，期间混匀多次包括：
往EP管内加入65℃预热的洗脱液65μl，移液器反复吹打，充分悬浮磁珠，70℃保温静置5-6min，期间混匀多次。
5.根据权利要求1-4任一项所述的大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：所述大体积、高灵敏度核酸提取方法还包括：
S41：将步骤S4重复3-4遍。
6.根据权利要求1-4任一项所述的大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：步骤S3中所述密封所述离心管，漩涡振荡混匀，温育，期间不时振荡混匀包括：
密封所述离心管，漩涡振荡混匀1-2min，在70℃下温育15-20min，温育期间不时振荡颠倒混匀，温育后再放到混匀器上摇匀5min。
7.根据权利要求1-4任一项所述的大体积、高灵敏度核酸提取方法，其特征在于：所述大体积、高灵敏度核酸提取方法还包括：
S9：立即使用所述核酸溶液或将所述核酸溶液置于-20℃环境中保存。
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