CN103153467A - 用于提取、浓缩和检测分子物类的使用表面张力阀的低资源处理器 - Google Patents

用于提取、浓缩和检测分子物类的使用表面张力阀的低资源处理器 Download PDF

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Abstract

本发明描述了使用用于处理样品的低资源装置来隔离、分离和检测分子物类的系统和方法。方法包括根据蛋白质-蛋白质、DNA-DNA和其他化学相互作用来隔离、分离和检测分子物类。

Description

用于提取、浓缩和检测分子物类的使用表面张力阀的低资源处理器
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年7月16日提交的美国临时专利申请序列号61/365,170的优先权，其通过引用整体以并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明一般性地涉及诊断和检测的领域。更特别地，本发明涉及用于评价分子相互作用的低资源处理器(loW resource processor)。具体地，本发明涉及包含被表面张力阀所分隔之多个室的装置用于处理其上连接有筛选试剂之微珠中的用途。所述装置允许测定各种环境和生物学样品的内容物。另外，可评价特异性相互作用，例如DNA-DNA相互作用、DNA-蛋白质相互作用或蛋白质-蛋白质相互作用、离子-蛋白质相互作用、酶-底物相互作用。
2.相关领域讨论
最近的研究集中于开发用于低资源背景的基于核酸的检测(Niemz等，2011)。基于核酸的检测系统(如定量PCR(qPCR))因其灵敏度、特异性和相对快速的回应时间(time-to-answer)而成为特别有吸引力的用于检测病原体的技术。PCR的有效性依赖于核酸模板的质和量(Beuselinck等，2005)以及干扰物质的缺乏(Radstrom等，2004)。例如，临床样品中存在的碳水化合物、蛋白质、脂质或其他未鉴定的干扰物质都已经显示出抑制PCR并产生假阴性(Monteiro等，1997；Wilson，1997；Coiras等，2003)。除了多种干扰物质之外，患者样品还包含核酸酶，其直接减少存在的核酸靶标数目(Wilson，1997)。
为了使假阴性最小化并且使基于核酸之诊断的效率最大化，在测试之前提取核酸并浓缩至不含干扰物质的缓冲液中。一种传统的实验室方法使用苯酚-氯仿混合物(Chomczynski和Sacchi，1987)。该方法高度有效，但是在今天并不常用，因为它耗费时间并且需要使用有毒的有机化学品。几种固相提取试剂盒是可商购的，用以从患者样品中纯化DNA或RNA。这些试剂盒中有许多依赖于在乙醇和离液剂(chaotropic agent)(如硫氰酸胍(GuSCN))存在下核酸选择性结合二氧化硅涂层表面(Avison，2007；Yamada等，1990)。GuSCN还使蛋白质污染物变性，包括可存在于样品中的核酸酶(Chirgwin等，1979；MacDonald等，1987)。这些试剂盒对于低资源用途来说成本效率低，并且经常需要使用专业的实验室设备(例如机器人或离心机)和受过培训的技术人员(在低资源背景中不可得)。另外，许多试剂盒涉及多个步骤，增加了样品和操作者二者污染的机会。
微流体是一种用于低资源的基于核酸之诊断的有前途的方式。最近，将微流体技术扩展以用于样品制备已经受到越来越多的关注(Niemz等，2011；Price等，2009)。这些装置中有许多适用于与下游核酸扩增和检测技术结合(Chen等，2010；Hagan等，2011)。但是，可用于核酸结合之固相的小表面积和可流过通道的有限样品体积限制了回收核酸的总质量(Niemz等，2011)，因此不利地影响了检测限。
例如，尤其是随着基于核酸的技术在低资源背景中变得越来越重要(Huggett等，2009)，用于诊断TB的跨肾(transrenal)DNA分析成为常规诊断方法(例如唾液显微镜法)的具有吸引力的替代方法。患者尿样的PCR分析因上述相同原因中的一些而无效。认为主要原因之一是尿样中所含的盐的高度变化。但是，尿液收集是完全非侵入性的。这在有限资源和技术人员的缺乏可能使得样品收集困难的高疾病负荷背景下特别有利(Umansky和Tomei，2006；Green等，2009)。另外，尿液收集提供了比其他侵入性更大的方法(例如唾液收集)大得多的样品体积。虽然跨肾DNA以相对低的浓度(健康对象中为～6至50ng/mL(Bryzgunova等，2006))存在，但是能够收集和测试大的体积确保了有充足的材料可用于进行精确诊断。最后，经纯化的跨肾DNA的分析可以是多重性的以同时检测多种病原体的存在。例如，TB与HIV的共感染是撒哈拉以南非洲的常见问题(Green等，2009)。设计成诊断TB和HIV二者的多重检测测定对于该背景是理想的。
尤其是随着基于核酸之技术在低资源背景中变得越来越重要，用于诊断结核病的跨肾DNA分析的概念正成为常规诊断方法的具有吸引力的替代方法。因为死亡中的人细胞和微生物被分解，小核酸片段可到达血流中，随后经过肾进入尿液中(Botezatu等，2000)。用于分枝杆菌属(mycobacterial)DNA的跨肾DNA片段的分析已证明它是诊断结核病的有前途的技术并且相对于常规唾液显微镜法提供了多个优点(Aceti等，1999；Cannas等，2008；Gopinath和Singh，2009)。尿液收集是完全非侵入性的。这在有限资源和缺少技术人员可使得样品收集困难的高疾病负荷环境中特别有利(Umansky和Tomei，2006；Green等，2009)。另外，尿液收集提供了比唾液收集大得多的样品体积。虽然跨肾DNA以相对低的浓度(健康对象中为～6至50ng/mL(Bryzgunova等，2006))存在，但是能够收集和测试大体积确保了有充足的材料可用于进行精确诊断。最后，分枝杆菌属特异性DNA序列的分析固有地比显微镜诊断更敏感(Huggett等，2009)。
在没有合适方法的情况下，唾液显微镜法仍然是目前诊断结核病的世界性标准。遗憾的是，唾液样品收集可潜在地产生感染性气溶胶，这在受过训练的人员不可得的低资源背景中特别成问题(Cannas等，2008)。显微镜诊断耗费时间并且具有有限的灵敏度(Green等，2009)。但是，因为在进行任何基于核酸的诊断测试之前，在低资源背景中从尿液中纯化DNA的方法不可用，所以这仍然是优选的方法。
类似的问题涉及测试其他分子物类(species)，包括蛋白质、脂质和碳水化合物。一般而言，“实际”样品中包含的干扰物质的存在使得任何目的分子物类的检测更加困难。因此，期望快速的非侵入性的诊断技术，尤其在低资源背景中。
发明内容
因此，根据本发明，提供了一种处理样品的方法，其包括(a)提供包含多个相继的室的装置，每一个所述室包含流体并且被表面张力阀隔开，其中第一反应室包含在其表面上有反应物的颗粒；(b)将样品引入所述第一反应室中；(c)在足以允许所述反应物与所述样品中的分析物反应的条件下孵育所述第一反应室；(d)将所述颗粒从所述第一反应室中运送到至少第二室中；以及(e)检测所述分析物与所述反应物的相互作用。其他的室包括洗脱室和/或浓缩室。所述装置可包含至少三个室，例如第一反应室、第一处理室和第一检测室，其中所述第一处理室设置在所述第一反应室与所述第一作用室之间。所述方法还可进一步包括反转所述颗粒的运送以将所述颗粒再引入到其已经通过的室中。在一些实施方案中，在最终室中将靶标分子物类与所述珠分离。然后进一步分析这些靶标，例如RT-PCR或PCR反应。
所述装置可包含连续管和表面张力阀，所述阀将所述管分隔成所述多个室。所述管可由玻璃、聚合物或金属制成。所述管可包含被聚合物包被的内表面。所述颗粒可以是磁性颗粒、顺磁性颗粒或密度与周围流体不同的非磁性颗粒。运送可包括使磁场沿着所述管传递或使所述管经受独特的间歇磁场以实现所述颗粒的运动。运送可代之以包括向所述装置施加离心力使得所述颗粒被运送通过所述多个室。或者，可使用低密度流体中包含的高密度珠(任选磁性的)的重力沉降，或使用由较高密度液体中包含的低密度颗粒产生的浮力来实施处理。
所述分析物可以是蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物、核酸、重金属、有机化合物、细菌、病毒或真菌细胞。蛋白质是抗原、抗体或酶。所述反应物可以是抗体、抗原、螯合剂、脂质、碳水化合物、金属、有机化合物、酶底物或核酸。检测所述分析物与所述反应物的相互作用可包括FRET、比色测定、荧光测定、RT-PCR、光密度变化或折射率变化。引入可包括通过所述第一反应室的壁注射所述样品。为了有助于引入，所述第一反应室的壁可包括有助于注射所述样品的端口(port)。还可通过“毛细”作用加载样品，其意指将流体转移至一束小直径毛细管中。
所述样品可以是生物学样品，例如得自于患者的组织或流体样品。所述样品可以是环境样品，例如土壤样品、水样品或植物样品。所述颗粒的直径可以是0.1至10微米，并且所述管的内直径可以是0.5至104微米。所述表面张力阀可包含非反应性气体或具有低蒸汽压或低表面张力的流体，例如非反应性气体如空气、二氧化碳、氮气、氩气、氦气或六氟化硫，或者流体如矿物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。
另一个实施方案包括这样的装置，其包含多个相继的室，每一个所述室包含流体并且被表面张力阀隔开。所述装置可包含至少三个室，例如第一反应室、第一处理室和第一检测室，其中所述第一处理室设置在所述第一反应室与所述第一作用室之间。其他室包括洗脱室和/或浓缩室。所述装置可包含连续管和表面张力阀，所述表面张力阀将所述管分隔成所述多个室。所述管可由玻璃、聚合物或金属制成，并且所述管的直径可以是0.5至104微米。所述室可包含被聚合物包被的内表面。所述表面张力阀可包含非反应性气体或具有低蒸汽压或低表面张力的流体，例如非反应性气体如空气、二氧化碳、氮气、氩气、氦气或六氟化硫，或者流体如矿物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。所述装置可还包含含有表面反应物的颗粒。所述装置还可包含磁场源。
在又一个实施方案中，提供了一种处理样品的方法，其包括(a)提供包含多个相继的室的装置，每一个所述室包含流体并且被表面张力阀隔开；(b)将包含表面反应物的颗粒引入所述第一反应室中，所述颗粒的表面包含结合至所述反应物的分析物；(c)将所述颗粒从所述第一反应室中运送到至少第二室中；以及(d)检测所述分析物的存在。所述方法还可包括使所述颗粒与样品混合以允许所述分析物结合至所述颗粒上的所述反应物。所述颗粒可以是磁性颗粒、顺磁性颗粒或密度与周围流体不同的非磁性颗粒。运送可包括使磁场沿着所述管传递或使所述管经受独特的间歇磁场以实现所述颗粒的运动。运送可代之以包括向所述装置施加离心力使得所述颗粒被运送通过所述多个室，或者通过密度驱动的运送，例如密度非常高的颗粒降落穿过密度较小的液体或者密度较小的易浮颗粒在密度较大的液体中上升。
所述分析物可以是蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物、核酸、重金属、有机化合物、细菌、病毒或真菌细胞。蛋白质是抗原、抗体或酶。所述反应物可以是抗体、抗原、螯合剂、脂质、碳水化合物、金属、有机化合物、酶底物或核酸。检测所述分析物与所述反应物的相互作用可包括FRET、比色测定、荧光测定、RT-PCR、光密度变化或折射率变化。引入可包括通过所述第一反应室的壁注射所述样品。为了有助于引入，所述第一反应室的壁可包含有助于注射所述样品的端口。
所述样品可以是生物学样品，例如得自于患者的组织或流体样品。所述样品可以是环境样品，例如土壤样品、水样品或植物样品。所述颗粒的直径可以是0.1至10微米，并且所述管的内直径可以是0.5至104微米。所述装置可包含至少三个室，例如第一反应室、第一处理室和第一检测室，其中所述第一处理室设置在所述第一反应室与所述第一作用室之间。
所述表面张力阀可包含非反应性气体或具有低蒸汽压或低表面张力的流体，例如非反应性气体如空气、二氧化碳、氮气、氩气、氦气或六氟化硫，或者流体如矿物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。
还提供了这样的试剂盒，其包含包括管的装置，所述管包含多个相继的室，每一个所述室包含流体并且被表面张力阀隔开。所述试剂盒还可包含设置在所述室的至少一个中的颗粒，或者还可包含设置在不同容器中的颗粒。
在权利要求书和/或说明书中，当没有数量词修饰的名词与术语“包含”或“包括”联合使用时可意指“一个”，但是也意指“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。术语“约”意指所述数目的正负5％。
根据以下详细说明，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。但是，应理解，虽然详细说明和具体实施例指明了本发明的具体实施方案，但是其仅通过举例说明给出，因为根据该详细描述，在本发明精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
当与以下描述和附图一起考虑时，将更好地领会和理解本发明的这些和另一些实施方案。但是，应理解，虽然以下描述指明了本发明的多个实施方案及其许多具体细节，但是其仅通过举例说明给出而并不是限制。在不偏离本发明精神的情况下，可在本发明范围内作出许多替换、修改、添加和/或重排，并且本发明包括所有的这些替换、修改、添加和/或重排。
附图说明
附带并构成本说明书一部分的附图用于描述本发明的某些方面。通过参考附图中阐明的示例性并因此非限制性的实施方案，本发明提供的本发明以及系统组件和操作的更清楚的概念将变得更清楚，在附图中相同的附图标记(如果它们在多于一种视图中出现)指相同元件。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并且与本文描述相结合，可更好地理解本发明。应注意，附图中阐明的特征不一定是按比例绘制。
图1——原型(prototvpe)提取法的设计，其示出固定在玻璃管中并 被填充空气的移液器头隔开的三个处理溶液。RNA吸附到二氧化硅包被的磁珠上，使用外磁体牵引所述磁珠从左至右通过连续的处理室。处理之后，RNA在最后的水室中洗脱。
图2——磁环装置“牵引通过(pull-through)”实施方案。连续管提取盒的设计，其示出被表面张力阀隔开的各个处理溶液。外磁体用于牵引吸附于二氧化硅包被磁珠的RNA通过各处理溶液。处理之后，RNA在最后的水室中洗脱。
图3——基于致密珠沿提取盒向外的离心力运送的低资源处理器。
图4——自动化处理器设计。用于将磁性颗粒从一个处理溶液运送至下一个处理溶液的电磁设计的视图。以线性排列围绕闭合管布置的6个电磁体的系列。打开并关闭电磁体产生瞬时磁场，以牵引磁珠通过分隔连续处理溶液的表面张力界面。
图5——自动化处理器设计。线圈式处理器设计的俯视图。装满流体的管包含四个表面张力阀，其将五个处理溶液隔开。线圈在固定的磁体下旋转，并且通过磁场使磁珠移动通过一系列处理溶液。
图6——低资源护理点(point-of-care)提取处理器，其举例说明了 表面张力阀(在这种情况下是液体/空气界面)用于将液体处理步骤分隔 开的用途。将生物学样品注入到左室中(注射器)，然后使用外部环形磁体使二氧化硅包被磁珠从该室移动至第二室中。在该例中，捕获的材料在右边的最终室中释放。
图7——提取盒加载设计。将患者样品引入提取盒一端中的方法。(1)使所述提取盒的端部降低从而进入患者样品中，毛细作用将患者样品吸取进入所述盒的一端，(2)此时所述患者样品与在管内表面上干燥的磁珠相互作用。然后使用外磁体将所述珠运送通过表面张力阀和管上部中包含的处理溶液。
图8——使用低资源牵引通过RNA提取装置的RSV RNA提取(右 侧柱)与可商购试剂盒相当。使用五种方法从储存的7RSV+(黑色柱)和7RSV-(灰色柱)小儿鼻腔冲洗样品中提取RSV RNA的比较。使用磁力驱动的牵引通过设计提取的提取效率与三种可商购试剂盒中的两种类似。平均值±S.D＞，N＝7。
图9——使用连续管提取盒(●)或RNeasv试剂盒(○)从掺入已知 量RSV RNA的HEp-2细胞裂解物中提取之后可通过RT-PCR检测的 RNA检测限(平均值±s.d，n＝3)。当对不包含RNA拷贝的样品进行提取时，用提取盒检测到197±8.5个RNA拷贝而用RNeasy试剂盒检测到202±9.5个拷贝。示出连续管提取盒的检测限(虚线)。通过计算必须添加到RSV阴性细胞裂解物中以在提取后可通过RT-RNA检测的靶标RNA的最小量来确定提取盒检测限。比较该值与关于RNeasy试剂盒计算的检测限。向20μL未感染HEp-2细胞裂解物掺入5μL包含0、5×103、5×104、1×105、5×105、1×106和5×106拷贝RSV N基因RNA标准品的TE缓冲液中的RNA并通过2.6节所述的两种方法提取。提取后，通过RT-PCR对RNA进行定量。检测限定义为针对不含RNA的对照提取获得的平均值之上的3个标准差(3s.d.)。
图10——DNA提取。使用提取盒(左侧柱)和DNeasv试剂盒(右侧柱)从200μL合成尿中回收结核病靶标IS6110DNA的百分比的比较，(平均值±s.d.，n＝3)。
图11——使用空气阀的蛋白质提取。从磷酸盐缓冲盐水和血浆中提取富组氨酸蛋白，平均值+/-s.d.，N＝3。
图12——用商品化离心式柱(spin column)和牵引通过设计提取疟 疾蛋白质的比较。这是在每种方法的理想条件下两种方法的简单比较。商品化试剂盒使用试剂盒中存在的标准试剂进行。％回收指两种方法第一次洗脱中收集的蛋白质的量(对于我们是洗脱室，对于离心式试剂盒是离心下来的第一次洗脱液)(平均值±s.d.，n＝3)。
优选实施方案
如上所讨论的，使用检测分析物的简单快速测定的主要障碍是患者样品中包含的污染物的存在，这阻断了这些方法的有效性。例如，已显示了临床样品中存在的高浓度碳水化合物可抑制PCR的结果。除了包含抑制基于核酸之检测的污染物之外，患者样品还包含DNase和RNase，其使样品中存在的核酸靶标数目随时间减少。可商购多种核酸提取试剂盒用于实验室背景。但是，它们需要实验室设备，例如离心机和移液器。总体目标是开发自足式低资源装置以从样品中提取分子(如核酸或蛋白质)并且在洗脱缓冲液中浓缩靶标，从而可用于多种下游应用而不需要复杂或昂贵的技术。
本发明人开发了适用于在低资源背景中操作的替代性核酸提取盒。这种自足式提取盒预加载有被空气间隔(称为“表面张力阀”)隔开的处理溶液。在RNA提取研究中，使RSV感染细胞裂解，并且在GuSCN和乙醇存在下使病毒RNA选择性吸附至二氧化硅包被磁珠。将各个处理溶液预加载到单个连续长度的Tygon管中，通过表面张力彼此隔开并固定在其位置。通过以下过程实现干扰物质的移除：RNA选择性吸附至二氧化硅包被磁珠，然后使用外部施加的磁场牵引所述磁珠通过每个处理溶液。RNA在最终溶液中从磁珠表面洗脱。该报道描述了该方法的一般特征并且比较了其与基于实验室的商业化试剂盒的性能。
因此，本发明提供了与低成本生物分子隔离(isolation)、分析和检测技术有关的问题的独特解决方案，其中通过将反应物设置在可容易地操作通过仪器或系统的多个“区”的颗粒上使所述反应物“可移动”。不同的区将多个溶液隔开，包括反应区和处理区。本发明的一个重要方面是使用表面张力阀使不同区隔离开，同时允许运送所述颗粒通过每个区。出乎意料地，尽管有相当大的表面张力，所述颗粒也可通过这些空气阀，并且在没有将液体从一个室转移至另一个室的情况下也可如此。因此，本发明可解决目前限制生物分子隔离、分离和检测技术应用的许多问题并且还产生了应用的新领域。以下更详细地描述了本发明的这些和另一些方面。
A.装置
一般而言，装置将具有以下组件。第一，连续管将为产生多个室提供基础。所述室本质上是通过使用表面张力阀维持彼此隔开的液体袋(liquidpocket)，所述表面张力阀是散布在液体袋之间的流体或气体物质。所述装置还可包含预先设置在其中的颗粒以用于检测引入到所述装置中的分析物。最后，所述装置可不设置有液体袋，取而代之地是可在隔开的容器(即，试剂盒)中含有液体和流体/气体组分，以在实施时使用或分布进/定制所述装置。以下将更详细地讨论所述装置的单个元件。
1.管
设计该装置的核心是建立一系列沿管排列的溶液，每个溶液与下一个溶液通过表面张力阀隔开。只有直径足够小的管允许流体和阀的稳定布置。直径大于约4mm的管将不支持稳定阀的形成。因此，该组件的重要物理性质是其直径。
所述管可由多种不同材料(包括玻璃、聚合物或金属)制成。所述管应由在以下进一步讨论的允许表面张力阀形成的聚合物制成，或内部包被所述聚合物。还期望具有低表面能量的管，这意味着其不结合蛋白质并且还是疏水性的。所述管材料的这些性质影响排列溶液的稳定性，并因此影响可使用的管的直径。较低的表面能量一般需要较小直径的管来允许稳定的阀形成。对于玻璃、硅烷化玻璃、聚苯乙烯、特氟龙(Teflon)和一些类型的氟化乙烯聚丙烯Tygon管的典型表面能量值在10-50、10-30、15-30、20-30、5mN/m的范围内，包括10、15、18.5、20、25、30、35、40、45和50mN/m。
一种具体类型的管是Tygon管，这是多种挠性管(flexible tubing)的商标名。Tygon是Saint-Gobain Corporation的注册商标。Tygon管用于多个市场，包括食品和饮料、化学处理、工业、实验室、医疗、药品和半导体处理。有许多透明的挠性Tygon管的配方。不同配方之间的耐化学性和物理性质不同，但是所述管一般对几乎任何的化学侵蚀都有耐性。
Tygon的几种配方是批准的VI类并且可用于手术方法或药品处理。医用形式包括以下：
Tygon医用/手术管S-50-HL——于最新的ISO10993标准和FDA指南表征生物相容性。该材料无毒性、无溶血性并且无热原性。该配方用于微创装置、透析设备，用于旁路(bypass)方法和化疗药物递送。
Tygon医用管S-54-HL在1964年引入用于医学应用。该材料可用于用于静脉或动脉内灌注或其他手术用途的导管。使用热成型和骤燃技术可将Tygon S-54-HL制造成套管或保护套产品。
制药Tygon包括：
Tygon LFL(长弯曲寿命(Long Flex Life))泵管是具有广谱耐化学性的无毒性透明管。其经常用于产物过滤和发酵以及表面活性剂递送。
Tygon2275高纯度管是不含增塑剂的材料，其经常用于无菌填充和分配系统和诊断设备。该配方还被认为具有低吸收/吸附特性，这使流体改变的风险最小。
Tygon2275I.B.高纯度压力管不含增塑剂并且用带子加固以与升高的工作压力使用。
Tygon chemfluor FEP是非蛋白质结合的管，其不包含添加剂或增塑剂。FEP代表氟化乙烯丙烯。
蠕动式应用包括以下：
Tygon R-3603实验室管常用于大学实验室。其经常用于孵箱、通风橱并且作为用于本生灯(Bunsen burner)的橡胶管的替代品。该材料以真空大小生产并且在室温下可禁受住完全真空。
Tygon R-1000超软管用于一般的实验室应用。其是最软的Tygon配方，并且硬度计硬度ShoreA为40(ASTM方法D2240-02)。因为该材料的硬度低，所以其常用于低扭矩蠕动泵。
Tygon LFL(长弯曲寿命)泵管、Tygon3350、Tygon S-50-HL医用/手术管、Tygon2275高纯度管和Tygon2001管也用于蠕动泵应用。
其他类型的管包括以下。硅氧烷管(LPS)是最常用的蠕动泵管。它具有最长的使用寿命和对于水溶剂的良好化学相容性。可使用湿循环对硅氧烷管进行单次的高压灭菌。乙烯管(LPV)是可用蠕动泵管中每英尺成本最低的。它一般只对大多数水性溶剂具有相当的相容性而对有机溶剂不具有良好耐性。它在蠕动泵中仅具有硅酮管使用寿命的约三分之一。乙烯管不应进行高压处理或者暴露于80℃以上的温度。含氟弹性体管(LPF)既是化学惰性最强的也是寿命最短的蠕动泵管。它甚至可在有限的时间内禁受住卤化溶剂。其在蠕动泵中的使用寿命仅是硅氧烷管的约二十分之一。与硅氧烷管一样，可使用湿循环对含氟弹性体管进行单次高压灭菌处理。
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(特氟龙)管(HPT)是我们制造的所有管中惰性最大的。它可禁受住几乎任何用于现代实验室的溶剂，从蒸馏水到二氯甲烷。其优良的热特性允许其重复地进行高压处理。高压处理之后，特氟龙管应直至其冷却才用于流体运送。聚乙烯管(HPP)是特氟龙管的廉价替代品。与特氟龙管一样，聚乙烯可操作的压力显著高于其他挠性管中的任何一种。聚乙烯不具有特氟龙的热稳定性，所以它不应进行高压灭菌处理；但是它可用环氧乙烷进行灭菌处理。
2.室
本发明人设计了装备有气体/流体阀的处理室，所述阀允许颗粒进出所述室而基本上不损失液体，并且保留每个区室的完整性。在一个具体实施方案中，所述处理室被配置成具有低至纳升的容积。反应、处理、杂交和分析步骤可在一系列隔开的室中进行。一般而言，所述室含水性液体，所述液体包含多种化学和生物物类，如盐、染料、标记和其他化学物类。图1至4阐明了所述室布置的实例及其彼此之间的关系。
参照图1，示出使用者沿着与包含空气之塑料移液器头相连的管的区段牵引立方体磁体。立方体磁体的移动将磁性颗粒运送通过溶液/空气界面。在插图中，箭头示出珠进入分隔两种液体溶液的空气。
参照图2，手动使环形磁体沿管移动，从而运送磁性颗粒。在该插图中，箭头示出珠试图通过空气表面张力阀。
参照图3，示出使用者通过手产生的离心力驱使高密度颗粒在管中降落。在插图中，箭头示出珠试图通过空气表面张力阀。
参照图4，沿着管设置一连串的c形夹电磁体。通过使电磁体顺序激活，磁性颗粒被沿着管的长度运送。在插图中，箭头示出珠试图通过水/空气表面张力阀。
反应室。一种类型的室是反应室。在反应室中，分析物与颗粒表面上的反应物相关联。在将颗粒引入装置之前使其与样品混合的一个实施方案中，这种反应室是不必要的。一般而言，反应室将提供颗粒上的反应物与分析物可相互作用的合适条件。所述反应室可任选地包含抑制非特异性相互作用或一旦实现则稳定相互作用的物质。
处理室。多种不同类型的处理室可用于本发明。方便时还可具有一连串的处理室。在颗粒流动可反向的意义上来说，处理室也可重复利用，使得给定的室的使用多于一次。本发明也可利用其中包含不同溶液的多个处理室。
一个示例性处理室是预处理室。经常的情况是，以这种方式“预处理”反应物、样品或颗粒，从而确保接着发生的与靶标的反应具有高保真度，即，使非特异性结合最小。预处理中的经典实例是“阻断”反应。通过用非特异性蛋白质(如BSA)预处理底物来抑制非特异性蛋白质-蛋白质相互作用。类似地，通过将探针与已知与所述探针缺少同源性的“随机”DNA孵育可减少非特异性DNA反应。在这种情况下，预处理室之后将是反应室。
评价生物分子反应时的另一个重要步骤是从反应物中除去非特异性结合分子。虽然实现与预处理相同的目标，但是清洗是发生在将反应物暴露于靶标之后。通常，清洗溶液包含与用于靶标溶液的缓冲液类似的缓冲液，但是缺少靶标自身。偶尔期望改变清洗溶液的化学特性，例如通过改变盐浓度或pH。清洗室将在反应室之后。
可包含另外的室，在最终的提取过程中将目标物类释放到所述室中。该室的功能是提供许多提取过程的洗脱步骤。该室还可有效地作为浓缩室起作用，因为如果其体积与原始样品体积相比足够小，则分子靶标的数目将高于初始样品中，从而有效浓缩该物种。
在一些实施方案中，可期望递归地放大与靶标分析物结合至反应物的信号，或者产生用于反应的更多靶标。实现这个有多种机制。但是，共同特征是在反应室之前或之后需要一个或更多个室，从而实现导致放大的必需步骤。
最后，为了增加过程的效率，可通过提取和再引入或者通过运送机制反转(例如，离心力、密度或磁性)从处理室下游回收颗粒并且返回至上游反应室或处理室。通过重复反应和/或处理步骤可增加信号以及结合和检测的特异性。
因此，图1至4示出线性排列的室的实施方案。管也可以是挠性的并且如图5所示，另一个实施方案可以是扁平的线圈式设计，其示出管排列成线圈，所述线圈缓慢旋转以将磁性颗粒从一个室牵引至下一个。
3.表面张力阀
本发明的一个重要方面是使用表面张力阀将管分隔成离散的室。这些表面张力阀使得处理流体与可移动底物之组成上具有灵活性。
本质上，所述表面张力阀是简单的非反应性气体或液体，其通过与构成多个室的流体产生稳定界面将装置的多个区段隔开。所述气体或液体的重要方面包括低蒸汽压或低表面张力，其被定义为蒸汽压显著小于1kPa并且表面张力在2至100mN/m之间，包括对于空气/水约72，对于水/矿物油约50，对于苄醇/水约3.3(值来自于有机溶剂手册)(Lide，1995)(通过引用并入)。适当气体的实例包括空气、二氧化碳、氮气、氦气、氩气或六氟化硫。液体包括矿物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。另外，添加某些材料可改变表面张力界面，例如可降低表面张力。
如图1至5所阐明的，有多种方法可实现颗粒运送通过表面张力阀。例如，外部永磁体、外部可移动电磁体、通过管绕一端运动而施加的离心力、和密度驱动(即，在重力下重颗粒下降或者在密度较小的流体中易浮颗粒向上运动)。
4.颗粒
用于本发明的颗粒将优先结合一类分子或选择的目的靶标、易受通过外力(例如磁体或密度差)的运送影响与小尺寸的功能性结合起来以增加反应效率。
所述颗粒可以由多种材料(如金属、陶瓷、玻璃或聚合物)合成。特别地，对于采用磁场的实施方案，所述颗粒是磁性或顺磁性颗粒。在采用离心力的实施方案中，所述颗粒的密度应＞1。
可商购颗粒包括由SIGMA-ALDRICH提供的那些并且包括聚苯乙烯、聚苯乙烯单分散体、磁体、三聚氰胺树脂、羧酸酯改性的三聚氰胺树脂、聚甲基丙烯酸酯和二氧化硅(包括包被有以上物质中任何一种的珠)。
可以以多种方法实现将颗粒/样品引入盒中。图6阐明了通过Tygon管的壁注射样品。可在注射前使颗粒与样品混合，或者颗粒可已经存在于悬液中或干燥于管的第一区段中。图7阐明了通过毛细作用加载颗粒/样品的第二实施方案。在该实施方案中，小直径管中存在的毛细力导致样品被吸入盒的第一区段中。可在颗粒沿第一区段管吸取或干燥之前使颗粒与样品混合，在这种情况下，当所述颗粒与超前流体相接触时释放。如上所述在接下来的室之间进行颗粒的运送。
5.试剂盒
根据本发明，提供了包括上述装置的试剂盒。一般而言，试剂盒包括用于多种试剂(如颗粒、反应物和检测试剂)——作为液体或冻干固体的单独的小瓶或容器。在后一种情况下，可包括的合适溶剂例如水、乙醇、多种缓冲溶液等。所述试剂也可以在装置中以即用形式(即，与在装置中已经建立的室和表面张力阀一起)提供。所述装置、颗粒、反应物和/或试剂可设置在固定于吹模或注模塑料中的小瓶或容器中或者设置在扁平循环盒内的线圈式管中。
B.反应物和靶标
本发明的另一个重要方面是设置在颗粒表面上的反应物和这些反应物与之相互作用的靶标。对于反应物，材料以任何具体类型的方式相互作用不是必要的。相反地，预想了允许反应物与靶标分析物结合的任何物理相互作用，例如共价、非共价、静电、水静力(hydrostatic)或离子。例如，通过用二氧化硅包被颗粒，可将核酸(DNA和RNA，取决于溶液)吸附至颗粒以排除掉其他生物分子。还预想了与金属(尤其是重金属)配位的分子作为反应物。尤其考虑了镍和钴。简单地基于化合物与反应物的相对相互作用，也可使用非特异性结合将更一般类别的化合物分开。
如上所述，所述反应物可以是多种生物分子中的任何一种，包括核酸(DNA、RNA)、蛋白质。另一些反应物包括氨基酸和有机小分子。对于两个核酸，结合相互作用一般通过杂交表征，通过同源碱基配对实现。对于一个或更多个蛋白质分子，相互作用一般是形成蛋白质-配体复合物，这依赖于组分分子的互补结构和电荷，例如抗体-抗原相互作用和酶-底物相互作用。以下描述了适用于本发明的多种类型的分子。
1.核酸
术语“核酸”为本领域所公知。本文使用的“核酸”一般指DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子，包括合成分子。核酸还定义为包含一连串天然嘌呤或嘧啶碱基的分子。术语“核酸”涵盖了术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，其各自是术语“核酸”的亚类。术语“寡核苷酸”指长度在约3与约100个核碱基之间的分子。术语“多核苷酸”指长度大于约100个核碱基的至少一个分子。
这些定义一般指单链和双链分子两者，后者彼此之间基本上或完全互补。核酸甚至可涵盖三链分子。本文使用的单链核酸可由前缀“ss”指示，双链核酸由前缀“ds”指示，而三链核酸由前缀“ts”表示。
(b)DNA
DNA定义为包含腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”的核酸。单链和双链两种DNA分子可用于本发明。DNA可包含编码序列或非编码序列、和基因组序列或cDNA、与目的靶标同源的合成链。DNA“阵列”——表示一组选择的探针的DNA集合。
(c)RNA
RNA定义为含A、G、尿嘧啶“U”或C的核酸。单链和双链两种RNA分子可用于本发明。因为其不稳定的性质，必须采取另外的步骤以维持包含RNA之样品的完整性。尤其是，RNAse的普遍存在需要使用RNAse抑制剂，如DEPC。
2.蛋白质
在另一个实施方案中，所述探针可以是蛋白质化合物。虽然有各种各样的蛋白质-蛋白质相互作用；但是，蛋白质也结合核酸、金属和其他非蛋白质化合物(例如，脂质、激素、递质)。以下列出了可用作靶标或探针的蛋白质的一些实例。
(a)抗体
抗体可用作用于未知分子的探针，或者它们可以是用于与已知探针反应的靶标。所述抗体的来源可以是多克隆或单克隆的。用于制备抗体的方法为本领域技术人员所公知，在此不需讨论。使用标准技术可将抗体固定于丝状支持物。
明显地，鉴定与某些靶标分子结合的抗体是可通过本发明实现的重要目的。但是，本发明还允许筛选样品中抗体的存在。例如，颗粒可包含多种细菌和病毒抗原，其可通过鉴定受影响对象中的相关抗体有助于诊断传染病。
(b)酶
酶是有助于修饰各种各样的化合物的蛋白质，所述化合物包括核酸、其他蛋白质、脂质、糖、类固醇和许多其他的化合物。考虑的具体测定类型包括鉴定酶抑制剂，所述抑制剂结合所述酶但并不被所述酶处理。或者，鉴定通过酶结合的化合物可有助于设计通过酶处理的前药。
(c)受体
受体是通过结合其同源配体部分而有助于信号转导过程的分子。一旦结合，受体就会进行另一些功能(酶促、细胞内转位、细胞渗透)，从而影响信号传导。使用本发明可实现对阻断受体功能或模拟天然配体的分子的鉴定。
(d)DNA结合蛋白
另一类重要的蛋白质是DNA结合蛋白。这些蛋白质包括聚合酶、解旋酶、连接酶和转录因子。可评价具有不同DNA序列特异性程度的蛋白质结合不同DNA序列的能力。相反地，一旦可鉴定出对DNA序列具有特异性的未知结合蛋白，就提供所述序列作为探针。
3.小分子和其他靶标
可检查各种各样的“小分子”与给定反应物相互作用的能力。这些文库包含非蛋白质和非核酸分子。或者，可围绕特定“药物核心(pharmacore)”来构建文库，所述药物核心被认为提供特定药物发挥功能所必需的基本结构特征。
另外，使用本发明装置和方法可测定化合物，例如脂质、碳水化合物、金属和毒素。
4.标记
在多个实施方案中，可期望标记颗粒、反应物或靶标分子。标记的实例包括顺磁性离子、放射性同位素、化学发光化合物、荧光团、生色团、NMR可检测物质和X射线成像化合物。
顺磁性离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)，并且特别优选钆。用于其他环境(例如X射线成像)的离子包括但不限于镧(III)、金(III)、铅(II)，以及尤其是铋(III)。
放射性同位素包括砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m和/或钇90。在某些实施方案中常优选125I，并且因为其低能量和长范围检测的适用性，经常也优选锝99m和/或铟111。
考虑使用的荧光标记中包括Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY630/650、BODIPY650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5，6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或德克萨斯红。
也可使用在与生色底物接触后将产生有色产物的酶(酶标签)。合适的酶的实例包括脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶。优选的二级结合配体是生物素和/或亲和素和链霉亲和素化合物。这些标记的使用为本领域所公知并且例如在美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中有所描述，其各自通过引用并入本文。
C.定义
本文使用的未经数量词修饰时定义为一个或多于一个。
本文使用的术语多个定义为两个或多于两个。
本文使用的术语另一个定义为至少第二个或更多个。
本文使用的术语包括和/或具有定义为包含(即，开放式语言)。
本文使用的术语偶联定义为连接，但并不一定是直接连接。
本文使用的术语约定义为至少接近给定值(例如，优选在给定值的10％内，更优选1％内，最优选0.1％内)。
本文使用的术语基本上定义为至少接近给定的状态(例如，优选在给定状态的10％内，更优选1％内，最优选0.1％内)。
本文使用的短语“其中可衍生的任何整数”定义为本说明书中列举的相应数字之间的整数，并且短语其中可衍生的任何范围定义为这些相应数字内的任何范围。
D.实施例
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术是由本发明人发现的在本发明实践中运行良好的技术，并因此可被认为构成了其优选实施方式。但是，本领域技术人员应理解，根据本公开内容，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可对公开的具体实施方案作出许多改变并仍然获得相同或类似的结果。
实施例1RSV RNA提取
图6示出该想法的一个实施方案，其阐明了用于从小儿鼻腔洗出样品中提取病毒RNA的一种设计。通过Tygon管将经溶解的鼻腔洗出样品注射到左侧的第一室中并在该室中存在的胍盐缓冲液中与二氧化硅包被磁珠混合。样品RNA结合至二氧化硅表面。预加载的处理溶液通过阀的表面张力固定在其位置。外磁体拖动磁珠并牵引其通过每一个处理溶液。出乎意料地，当珠到达液体-空气界面时，它们通过所述界面而不带走溶液。类似地进入下一个溶液直至整个颗粒群通过所有的处理步骤。处理除去样品污染物，并且RNA浓缩在最终室中的50μl水中并用于下游RT-PCR处理，以检测呼吸道合胞体病毒(RSV)的存在。图8示出使用磁力牵引通过(magnetic pull-through)的设计和几种商业化试剂盒进行RSV RNA提取的比较。
使用连续管提取盒从TE缓冲液和HEp-2细胞裂解物中进行RNA提取。图1的初始原型设计被进一步简化为图2所示的连续管设计。在该设计中，在～61cm长的Tygon管(1.6mm内径)内预加载8个处理溶液。这些溶液是促离液清洗缓冲液(300μL的4M盐酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0)、含RNA沉淀缓冲液的两个区段(300μL的80％乙醇，5mM磷酸钾，pH8.5)、含水清洗液的三个区段(100μL分子级水)和RNA洗脱液(50μL分子级水)。选择50μL洗脱液体积使得RT-PCR输入与其他提取方法(如RNeasy试剂盒)相当。每个溶液通过～2mm长的空气间隙与彼此隔开。制备了三种类型的提取测试样品：5μL的TE缓冲液中RSV N基因标准RNA(浓度为1×106拷贝/μL)、掺入5μL RNA标准物的20μL HEp-2细胞裂解物(2×103个细胞/μL)或20μL经RSV感染的HEp-2细胞裂解物。通过使其5次通过25号针来使得细胞裂解物样品均匀。在提取之前，将样品添加到230μL RNA-二氧化硅结合缓冲液(230μL2M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0，50％乙醇)和20μL直径1μm的二氧化硅包被磁珠(3×106颗粒/μL)(Bioneer Inc.，Alameda，CA)中，并且在室温下在旋转混合器上放置5分钟。混合之后，将每种样品加载到管内，并盖上管盖。通过外磁体在第一室中收集颗粒并使用直径～5cm的钕环磁体(Emovendo LLC，Petersburg，WV)以～4mm/秒牵引所述颗粒通过表面张力阀和每个相继的室，如图2所述。在再收集之前，通过来回快速移动磁体使颗粒分散在促离液清洗液和RNA沉淀溶液中。在水清洗溶液中，颗粒可以以～8mm/秒移动以使清洗期间通过洗脱的RNA损失最小。最后，颗粒分散于最终的洗脱室中并在室温下孵育5分钟后除去。虽然其在原型设计中使用，但是在该最终设计中不进行65℃的RNA洗脱，这是因为它在大多数低资源背景下不能实行。收集最终室的内容物用于RT-PCR分析。每步RNA提取都在～15分钟内完成。
图9举例说明了该设计操作特征的实例。使用连续管提取盒(●)或RNeasy试剂盒(○)，在掺入已知量RSV RNA的HEp-2细胞裂解物中提取之后，可通过RT-PCR检测的RNA的检测限(平均值±s.d，n＝3)。当提取不含RNA拷贝的样品时，用提取盒检测到197±8.5个RNA拷贝，用RNeasy试剂盒检测到202±9.5个拷贝。示出了连续管提取盒的检测限(虚线)。通过计算必须添加到RSV阴性细胞裂解物中以在提取后可通过RT-RNA检测的靶标RNA的最小量来确定提取盒检测限。将该值与关于RNeasy试剂盒所计算的检测限进行比较。向20μL未感染HEp-2细胞裂解物中掺入包含0、5×103、5×104、1×105、5×105、1×106和5×106拷贝RSVN基因RNA标准物的TE缓冲液中的5μL RNA并通过两种方法提取。提取后，通过RT-PCR对RNA进行定量。检测限定义为对于不含RNA的对照提取中获得的平均值之上的三个标准差(3s.d.)。
实施例2——跨肾DNA提取
在该实施例中，在内径为1.6mm的～45cm长的Tygon管内预加载四个处理溶液。这些溶液是促离液清洗缓冲液(300μL的4M盐酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0)、含DNA沉淀缓冲液的两个区段(300μL的80％乙醇，5mM磷酸钾，pH8.5)和DNA洗脱液(50μL分子级水)。这些溶液可被～2mm长的空气间隙彼此隔开。
通过整合DNA技术(Coralville，Iowa)合成来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)IS6110序列的140碱基DNA序列，并且将5×107个拷贝掺入200μL合成尿中，所述合成尿由0.65二水氯化钙、0.65氯化镁、4.6氯化钠、2.3硫酸钠、0.65二水柠檬酸钠、2.8磷酸氢二钾、1.6氯化钾、1.0氯化铵、25尿素和1.1肌酸肝(单位为g/L)构成(Miro-Casas等，2001)。将掺入DNA的合成尿样品与200μL DNA-二氧化硅结合缓冲液(4M盐酸胍，25mM柠檬酸钠，pH7.0)和20μL(0.8mg)Invitrogen Dynabeads MYONE硅烷珠(Carlsbad，California)混合并在室温下涡旋混合5分钟。混合后，将样品加载到管内，并盖上管盖。通过外磁体在第一室中收集颗粒并使用直径～5cm的钕环磁体(Emovendo LLC，Petersburg，WV)以～4mm/秒牵引所述颗粒通过空气阀和每个相继的室。在再收集之前，通过来回快速移动磁体使颗粒分散在促离液清洗液和DNA沉淀溶液中。最后，颗粒完全分散于DNA洗脱室中并被除去，收集最终室的内容物用于PCR分析。每步DNA提取都在～9分钟内完成。比较其提取效率与根据制造商说明书使用Qiagen DNeasy试剂盒提取的DNA。
使用正向引物5’-ACCAGCACCTAACCGGCTGTGG-3’(SEQ ID NO：1)和反向引物5’-CATCGTGGAAGCGACCCGCCAG-3’(SEQ ID NO：2)扩增IS6110序列的129碱基片段(Cannas等，2008)。根据制造商说明书，在使用5μLDNA模板和Qiagen Quantitect SYBR green PCR试剂盒中以25μL的体积进行反应。使用Rotor-Gene Q热循环仪(Qiagen，Germantown，MD)，热循环由以下组成：94℃15分钟以活化DNA聚合酶；40周期的94℃15s；62℃30秒和72℃30秒。使用熔解曲线分析确定产物特异性。收集数据，通过Rotor-Gene Q软件(Qiagen，Germantown，MD)记录Ct值，并使用标准曲线转化为DNA拷贝数/μL。
图10举例说明了使用该实施方案的结果。从掺入DNA的合成尿中提取的DNA的回收效率为27.15±1.10％。这相当于DNA洗脱浓度为271,500±11,020拷贝/μL。使用DNeasy试剂盒提取的DNA的回收效率为68.6±3.48％。这相当于DNA洗脱浓度为686,000±34,780拷贝/μL。回收效率通过所提取拷贝的总数目除以样品中存在拷贝的初始数目并乘以100％来计算。
实施例3——使用空气/液体界面的蛋白质隔离
将一条
Figure BDA00002930029100201
管切成9.5”长并且水平放置在实验台上之后，使用凝胶上样移液器头将10μL缓冲液B(50mM磷酸钠pH8.0，300mM NaCl，500mM咪唑，0.05％吐温20)插入管的右端并用MelTemp毛细管的圆头端封闭该端(仅将1/8”玻璃插入
Figure BDA00002930029100202
管中)。用缓冲液A(50mM磷酸钠pH8.0，300mM NaCl，500mM咪唑，0.05％吐温20)填充1mL注射器。小心地从注射器圆筒和针中除去所有的空气气泡并分配缓冲液直至黑色的注射器帽静止在1mL刻度线处。将注射器针从洗脱室左侧的1/8”插入管的壁中并分配0.1mL缓冲液A。将注射器从以上清洗室左侧的1/8”再次插入管的壁中并分配0.1mL缓冲液A。重复第三次以产生3个清洗室。将PCR管(已在圆头切割以具有小圆孔)的切割端插入管的右手侧，确保
Figure BDA00002930029100211
管在管底部完全密封并且在PCR管中没有褶皱或折痕。使用注射器针，在管盖中刺出小孔以充当释放阀。
将提取管保持竖直，将100μL样品吸入到PCR管中，然后吸入100μL缓冲液C。确保样品适当混合以完全溶解所有的细胞。为了得到包含溶解样品的加载室，将10μL100×稀释的
Figure BDA00002930029100212
添加至PCR管中。封闭盖并用小片胶带密封孔。将管放于烤架(如果需要使用胶带贴到烤架上)并使管旋转10分钟以适当地混合样品。10分钟后，从烤架下移下管。使用环状磁体在PCR管切割端将珠收集成团块。牵引珠通过第一空气阀并进入第一清洗室中。沿着室长度使用“来回”运动使珠分散1分钟。在第一清洗室的末端收集珠的小球，然后牵引小球通过空气阀进入第二清洗室。以类似方式牵引珠通过第二和第三清洗室，以确保珠在整个室中足够分散。在第三清洗室中收集珠的小球，牵引小球进入洗脱室并使用“来回”运动使珠分散10分钟。10分钟后，牵引珠回到洗脱室左侧的空气室中。使用移液器从样品加载室中移出200μL样品并放入新的管中。用刀片将珠团块与洗脱室之间洗脱室左侧的的空气阀切开。用向上的MelTemp毛细管将提取管的切割端放进
Figure BDA00002930029100214
管中。移除MelTemp管并将90μL缓冲液B移入至含洗脱室的
Figure BDA00002930029100215
管中，以使得所述室被冲入新的
Figure BDA00002930029100216
管中。储存样品用于稍后的分析。
图11举例说明了该实施例的提取百分比。从磷酸盐缓冲盐水和血浆中提取疟疾蛋白质靶标(富组氨酸蛋白)的效率分别为约55％和25％。
实施例4——使用矿物油/水表面张力阀的蛋白质隔离
根据本发明的装置用于隔离与疟疾相关的替代靶标(标记有荧光化合物TAMRA的HRP-II)。使用BS3作为交联剂使胺末端磁珠(硅烷化氧化铁，12μmol胺/mL，p＝2.5g/mL，直径1-4μm，25-35EMU/g)与经赖氨酸修饰的NTA交联。交联后，颗粒使用NiCl2而带有Ni(II)。
对于该装置，每个室含100μL溶剂。每个室之间是～25至50μL轻质矿物油作为阀。使用1/16(直径)的Tygon管。室内容物和反应如下：
室1(样品)：样品与Ni(II)NTA磁珠反应
室2(清洗1)：0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)，300mM NaCl，0.25％吐温20
室3(清洗2)：0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)，300mM NaCl，0.25％吐温20
室4(洗脱)：0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)，300mM NaCl，0.25％吐温20，200mM咪唑
室5(洗脱后)：0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)，300mM NaCl，0.25％吐温20，200mM咪唑
该装置预先加载有被轻质矿物油隔开的室2至5。尽可能多地避免空气袋。将靶标(TAMRA HRP-II，10μM结合位点)和BSA(荧光素BSA，100μg/mL)二者与Ni(NTA)磁珠(100μM Ni(II)NTA)孵育10分钟(100μL总体积)。孵育后，将混合物注射到第一室中。然后使用环状磁体使磁珠转移通过管。当珠到达室中时，通过来回快速移动磁体使所述珠扩散至整个室。然后，缓慢移动磁体穿过室，垂直于管振荡以确保有效混合。该过程花费～1分钟。然后通过磁体收集珠并转移至后续的室。当提取完成时，收集室并使用荧光进行分析。牵引通过方法(BNT-II)
相同方法施加于初始室包含BNT-II(1μM)、BSA(40mg/mL)、100μM Ni(II)NTA磁珠的装置。
图12示出采用该实施例所述装置和方法得到的代表性结果。
在本公开内容的教导下，不需过度实验即可进行并使用本文公开的本发明的所有公开实施方案。本发明不受本文所述的理论声明限制。虽然公开了本发明人考虑的实施本发明的最佳模式，但是本发明的实践不限于此。因此，本领域技术人员将理解，除本文具体描述的之外，也可实践本发明。
另外，单个组件不一定形成所公开的形状或组合成所公开的配置，而是可以以几乎任何形状提供和/或组合成几乎任何配置。此外，单个组件不一定由所公开的材料制造，而是可由几乎任何合适的材料制造。
另外，可对构成本文所述方法的步骤或步骤顺序做出改变。明显的是，在不偏离基于本发明概念的精神和/或范围的情况下可对本发明的特征做出多种替换、修改、添加和/或重排。认为由所附权利要求及其等同项限定的基于本发明概念的精神和/或范围包括所有的这些替换、修改、添加和/或重排。
除非在给定权利要求中使用短语“用于......的方法”和/或“用于......的步骤”明确列出方法加功能(means-plus-function)的限定，否则所附权利要求不应解释为包括这种限定。本发明的亚类实施方案由所附独立权利要求及其等同项描述。本发明的具体实施方案由所附独立权利要求及其等同项来区分。
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在某种程度上以下参考文献提供了示例性方法和补充本文所述那些的其他细节，其具体通过引用并入本文。
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Claims (62)

1.一种处理样品的方法，其包括：
(a)提供包含通过管相连接的多个相继的室的装置，每个所述相继的室包含流体并且被基于气体的表面张力阀隔开，其中第一反应室包含在其表面上具有反应物的颗粒；
(b)将样品引入所述第一反应室中；
(c)在足以允许所述反应物与所述样品中的分析物反应的条件下孵育所述第一反应室；
(d)将所述颗粒从所述第一反应室通过设置于其间的管运送到至少第二室中；以及
(e)检测所述分析物与所述反应物的相互作用。
2.权利要求1的方法，其中所述装置包含至少三个室。
3.权利要求2的方法，其中所述装置包含所述第一反应室、第一处理室和第一检测室，其中所述第一处理室设置在所述第一反应室与所述第一作用室之间。
4.权利要求2的方法，其还包括反转所述颗粒的运送以将所述颗粒再引入其已经通过的室中。
5.权利要求1的方法，其中所述装置包括连续管和表面张力阀，所述表面张力阀将所述管分隔成所述多个室。
6.权利要求5的方法，其中所述管由玻璃、聚合物或金属制成。
7.权利要求5的方法，其中所述管包含被聚合物包被的内表面。
8.权利要求1的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒、顺磁性颗粒或密度＞1或＜1的非磁性颗粒。
9.权利要求8的方法，其中运送包括使磁场沿着所述管传递或使所述管经受独特的间歇磁场以实现所述颗粒的运动。
10.权利要求1的方法，其中运送包括向所述装置施加离心力或重力使得所述颗粒被运送通过所述多个室。
11.权利要求8的方法，其中通过密度驱动的运送来运送密度＞1的所述非磁性颗粒。
12.权利要求1的方法，其中所述分析物是蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物、核酸、重金属、有机化合物、细菌、病毒或真菌细胞。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白质是抗原、抗体或酶。
14.权利要求1的方法，其中所述反应物是抗体、抗原、螯合剂、脂质、碳水化合物、金属、有机化合物、酶底物或核酸。
15.权利要求1的方法，其中检测所述分析物与所述反应物的相互作用包括FRET、比色测定、荧光测定、RT-PCR、光密度变化或折射率变化。
16.权利要求1的方法，其中引入包括通过所述第一反应室的壁注射所述样品。
17.权利要求1的方法，其中引入包括通过毛细作用使所述样品移动到所述第一反应室中。
18.权利要求1的方法，其中所述样品是生物学样品。
19.权利要求17的方法，其中所述生物学样品是得自于患者的组织或流体样品。
20.权利要求1的方法，其中所述样品是环境样品。
21.权利要求20的方法，其中所述环境样品是土壤样品、水样品或植物样品。
22.权利要求1的方法，其中所述颗粒的直径为0.1至10微米。
23.权利要求1的方法，其中所述管的直径是0.5至104微米。
24.权利要求1的方法，其中所述基于气体的表面张力阀包括具有低蒸汽压和/或低表面张力的非反应性气体。
25.权利要求24的方法，其中所述非反应性气体是空气、二氧化碳、氮气、氩气、氦气或六氟化硫。
26.权利要求25的方法，其中所述非反应性气体是空气。
27.包含通过管相连接的多个相继的室的装置，每个所述室包含流体并且被基于气体的表面张力阀隔开。
28.权利要求27的装置，其中所述装置包含三个室，所述三个室包括所述第一反应室、第一处理室和第一检测室，其中所述第一处理室设置在所述第一反应室与所述第一作用室之间。
29.权利要求27的装置，其中所述装置包含连续管和表面张力阀，所述表面张力阀将所述管分隔成所述多个室。
30.权利要求29的装置，其中所述管由玻璃、金属或聚合物制成。
31.权利要求29的装置，其中所述管包含被聚合物包被的内表面。
32.权利要求30的装置，其中所述第一反应室的壁包含有助于注射所述样品或颗粒的端口。
33.权利要求29的装置，其中所述管的直径是0.5至104微米。
34.权利要求27的装置，其中所述基于气体的表面张力阀包括具有低蒸汽压和/或低表面张力的非反应性气体。
35.权利要求34的装置，其中所述非反应性气体是空气、二氧化碳、氮气、氩气、氦气或六氟化硫。
36.权利要求35的装置，其中所述非反应性气体是空气。
37.权利要求27的装置，其还包含含有表面反应物的颗粒。
38.权利要求27的装置，其还包含磁场源。
39.处理样品的方法，其包括：
(a)提供包含通过管相连接的多个相继的室的装置，每个所述相继的室包含流体并且被基于气体的表面张力阀隔开；
(b)将包含表面反应物的颗粒引入所述第一反应室中，所述颗粒表面包含结合至所述反应物的分析物；
(c)将所述颗粒从所述第一反应室通过设置于其间的管运送到至少第二室中；以及
(d)检测所述分析物的存在。
40.权利要求39的方法，其还包括使所述颗粒与样品混合以允许所述分析物与所述颗粒上的所述反应物结合。
41.权利要求39的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒、顺磁性颗粒或密度＞1或＜1的非磁性颗粒。
42.权利要求41的方法，其中运送包括使磁场沿着所述管传递或使所述管经受独特的间歇磁场以实现所述颗粒的运动。
43.权利要求41的方法，其中通过密度驱动的运送来运送密度＞1的所述非磁性颗粒。
44.权利要求39的方法，其中运送包括向所述装置施加离心力使得所述颗粒被运送通过所述多个室。
45.权利要求39的方法，其中所述分析物是蛋白质、多肽、脂质、碳水化合物、核酸、重金属、有机化合物、细菌、病毒或真菌细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述蛋白质是抗原、抗体或酶。
47.权利要求39的方法，其中所述反应物是抗体、抗原、螯合剂、脂质、碳水化合物、金属、有机化合物、酶底物或核酸。
48.权利要求39的方法，其中检测所述分析物与所述反应物的相互作用包括FRET、比色测定、荧光测定、RT-PCR、光密度变化或折射率变化。
49.权利要求39的方法，其中引入包括通过所述第一反应室的壁注射所述颗粒。
50.权利要求49的方法，其中引入包括通过毛细作用使所述样品移动到所述第一反应室中。
51.权利要求40的方法，其中所述样品是生物学样品或环境样品。
52.权利要求51的方法，其中所述生物学样品是得自于患者的组织或流体样品。
53.权利要求40的方法，其中所述样品是环境样品。
54.权利要求53的方法，其中所述环境样品是土壤样品、水样品或植物样品。
55.权利要求39的方法，其中所述装置包含至少三个室。
56.权利要求55的方法，其中所述装置包含所述第一反应室、第一处理室和第一检测室，其中所述第一处理室设置在所述第一反应室与所述第一作用室之间。
57.权利要求55的方法，其还包括反转所述颗粒的运送以将所述颗粒再引入其已经通过的室中。
58.权利要求39的方法，其中所述基于气体的表面张力阀包括具有低蒸汽压和/或低表面张力的非反应性气体。
59.权利要求58的方法，其中所述非反应性气体是空气、二氧化碳、氮气、氩气、氦气或六氟化硫。
60.权利要求59的方法，其中所述非反应性气体是空气。
61.试剂盒，其包括包含管的装置，所述管包含多个相继的室，每一个所述室包含流体并且被基于气体的表面张力阀隔开。
62.权利要求61的试剂盒，其还包括设置在所述室至少之一中的颗粒，或者还包括设置在不同容器中的颗粒。
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