CN116083418A - 一种磁珠型核酸提取试剂盒及提取核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种磁珠型核酸提取试剂盒，由裂解液、磁珠液、洗涤液和洗脱液组成。本发明的试剂盒配制方法简单，安全无污染，既可以手工操作进行提取，也可以用于自动化平台，方便快捷，且提取出来的核酸纯度高、得率高，具有较高的推广应用价值。全自动核酸提取时，只需15分钟即可一次实现96个样本的提取，经裂解、洗涤、洗脱后得到高纯度核酸。

Description

一种磁珠型核酸提取试剂盒及提取核酸的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体为一种磁珠型核酸提取试剂盒及提取核酸的方法。
背景技术
核酸提取作为病毒检测的方法，发挥着至关重要的作用，相对于过滤柱式法，磁珠法核酸提取能实现大批量自动化提取，提取速度快、效率高、操作简便、成本低廉，能够满足病毒大批量检测的要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种磁珠型核酸提取试剂盒，由裂解液、磁珠液、洗涤液和洗脱液组成；
所述裂解液由异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、二水乙二胺四乙酸二钠、曲拉通X-100、聚乙二醇6000、氢氧化钠、超纯水和盐酸组成；
所述磁珠液由磁珠、DEPC水组成；
所述洗涤液由三羟甲基氨基甲烷、乙酸钠、超纯水、无水乙醇和盐酸组成；
所述洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、二水乙二胺四乙酸二钠、DEPC水和盐酸组成。
优选的，所述裂解液包括以下质量分数的各组分：
异硫氰酸胍41.36％、三羟甲基氨基甲烷0.6057％、氯化钠1.753％、18.62％、曲拉通X-100 5％、聚乙二醇6000 5％、氢氧化钠5％、余量为超纯水，用盐酸调节pH至8.5。
优选的，所述磁珠液中的磁珠用量为50mg/ml，磁珠为迈德泰克100nm磁珠。
进一步的，所述洗涤液包括以下质量分数的各组分：
三羟甲基氨基甲烷0.12114％、乙酸钠3.533％、无水乙醇80％、余量为超纯水，用盐酸调节pH至7.5。
进一步的，所述洗脱液包括以下质量分数的各组分：
三羟甲基氨基甲烷0.12114％、三羟甲基氨基甲烷18.62％，余量为DEPC水，用盐酸调节pH至8.0。
采用该磁珠型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，包括以下步骤：
S1、向装有样本的离心管中加入裂解液、磁珠液，65℃混匀裂解；
S2、将离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液；
S3、加入洗涤液混匀后，将离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液；
S4、将磁珠晾干后，加入所述洗脱液，75℃温浴洗脱后，收集核酸并保存。
进一步的，所述的样本为拭子、全血、血浆、血清、唾液、组织液、尿液或各种保存液保存的生物样本中的任意一种。
本发明所达到的有益效果是：本发明的试剂盒配制方法简单，安全无污染，既可以手工操作进行提取，也可以用于自动化平台，方便快捷，且提取出来的核酸纯度高、得率高，具有较高的推广应用价值。全自动核酸提取时，只需15分钟即可一次实现96个样本的提取，经裂解、洗涤、洗脱后得到高纯度核酸。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
新型冠状病毒核酸提取
手工法操作步骤如下：
取出试剂盒中的各组分，混匀备用。若裂解液中含有少量结晶，待结晶充分溶解后再使用。
根据提取的样本数，每人份按照400μL“裂解液”+100μL“磁珠液”混匀获得“工作溶液”。
每人份按照500μL“工作溶液”加入200μL待测样本至1.5mL离心管中，震荡混匀5s后置于65℃恒温混匀仪上加热裂解5min。
瞬时离心后，将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，然后将上清液吸除(注：吸除上清液时不要碰到管壁的磁珠)。
加入600μL洗涤液，盖上管盖，震荡混匀30s后瞬时离心，之后将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，然后将上清液吸除(注：吸除上清液时不要碰到管壁的磁珠)。
静置1min后，将管底残余的液体吸除。
加入50-100μL洗脱液，盖上管盖，震荡混匀5s后瞬时离心。
将离心管置于75℃恒温混匀仪上加热洗脱2min。
将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，取上清用于后续实验。核酸样品可以立即使用或用封口膜封闭后保存于2℃-8℃备用。
裂解液包括：异硫氰酸胍41.36％、三羟甲基氨基甲烷0.6057％、氯化钠1.753％、18.62％、曲拉通X-100 5％、聚乙二醇6000 5％、氢氧化钠5％、余量为超纯水，用盐酸调节pH至8.5。
磁珠液包括磁珠(100nm购自迈德泰克，50mg/ml)、DEPC水；
洗涤液包括以下质量分数的各组分：三羟甲基氨基甲烷0.12114％、乙酸钠3.533％、无水乙醇80％、余量为超纯水，用盐酸调节pH至7.5。
洗脱液包括以下质量分数的各组分：
三羟甲基氨基甲烷0.12114％、三羟甲基氨基甲烷18.62％，余量为DEPC水，用盐酸调节pH至8.0。
本发明也可配合全自动核酸提取仪，程序如下表1所示：
表1核酸提取运行程序1
其中，样本采用广东和信健康科技有限公司的《新型冠状病毒核酸室内质控品》(L1弱阳，浓度约为1000Copies/ml)。
对照提取试剂选用硕世生物科技股份有限公司的《核酸快速提取试剂盒(磁珠法)》(货号：SDKF60101)。
对上述提取得到的核酸使用硕世生物科技股份有限公司的《新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)》进行PCR扩增，利用QuantStudio5荧光定量PCR仪进行扩增检测，扩增体系见表2，扩增程序见表3。
表2核酸扩增体系
表3核酸扩增程序
结果如下表4。
表4实施例1结果
由以上结果分析可得，本发明的提取效率已具备同类产品的水平，满足后续试验的要求。
实施例2人血液DNA提取
本实施例试剂盒组分与实施例1基本相同，区别在于样本需先加蛋白酶K消化，以及多两步洗涤。
手工法操作步骤如下：
取出试剂盒中的各组分，混匀备用。若裂解液中含有少量结晶，待结晶充分溶解后再使用。
根据提取的样本数，每人份按照400μL“裂解液”+10μL“蛋白酶K”混匀获得“工作溶液”。
每人份按照400μL“工作溶液”加入200μL待测样本至1.5mL离心管中，震荡混匀5s后置于65℃恒温混匀仪上加热裂解15min。
加入100μL“磁珠液”，震荡混匀1min，共静置9min，其中每3min震荡混匀1min。
注：磁珠液在使用前充分混匀。
瞬时离心后，将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，待磁珠完全吸附后将上清液吸除。注：可适当延长吸磁时间，吸除上清液时不要碰到管壁的磁珠，下同。
加入600μL洗涤液1，盖上管盖，震荡混匀30s后瞬时离心，之后将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，待磁珠完全吸附后将上清液吸除。
加入600μL洗涤液2，盖上管盖，震荡混匀30s后瞬时离心，之后将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，待磁珠完全吸附后将上清液吸除。
重复上一步骤。
将离心管开盖继续置于磁力架上室温晾干5min，再将管底残余的液体吸除。
注：乙醇残留会抑制后续的酶反应，故要尽量使乙醇挥发干净，但也不要过于干燥，以免难以洗脱DNA。
将离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱液，盖上管盖，震荡混匀5s后瞬时离心。
将离心管置于75℃恒温混匀仪上加热洗脱10min。
将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，取上清用于后续实验。DNA样品可以立即使用或用封口膜封闭后保存于2℃-8℃备用。
试剂盒的配置同实施例1。
本发明也可配合全自动核酸提取仪，程序如下表5所示：
表5核酸提取运行程序2
其中，样本采用某医院病人新鲜全血，对照提取试剂选用北京天根生化科技有限公司的《磁珠法通用型基因组DNA提取试剂盒》(货号：DP705)。
对上述提取到的核酸用NanoDrop2000进行浓度与纯度的测定，结果如下表6。
表6实施例2结果
由以上结果分析可得，本发明的提取效率已接近同类产品的水平，满足后续试验的要求。
实施例3人宫颈脱落细胞HPV-DNA提取
本实施例试剂盒组分与实施例2基本相同，区别在于样本需先加核酸保护剂消化，而非蛋白酶K。
手工法操作步骤如下：
取出试剂盒中的各组分，混匀备用。若“裂解液”中含有少量结晶，待结晶充分溶解后再使用。
先按每1mL液基细胞保存液加入5μL核酸保护剂，混匀后室温放置10分钟，每人份按照400μL“裂解液”加入200μL待测样本至1.5mL离心管中，震荡混匀5s后置于65℃恒温混匀仪上加热裂解15min。
加入100μL“磁珠液”，震荡混匀1min，共静置9min，其中每3min震荡混匀1min。
注：磁珠液在使用前充分混匀。
瞬时离心后，将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，待磁珠完全吸附后将上清液吸除。注：可适当延长吸磁时间，吸除上清液时不要碰到管壁的磁珠，下同。
加入600μL洗涤液1，盖上管盖，震荡混匀30s后瞬时离心，之后将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，待磁珠完全吸附后将上清液吸除。
加入600μL洗涤液2，盖上管盖，震荡混匀30s后瞬时离心，之后将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，待磁珠完全吸附后将上清液吸除。
重复上一步骤。
将离心管开盖继续置于磁力架上室温晾干5min，再将管底残余的液体吸除。
注：乙醇残留会抑制后续的酶反应，故要尽量使乙醇挥发干净，但也不要过于干燥，以免难以洗脱DNA。
将离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱液，盖上管盖，震荡混匀5s后瞬时离心。
将离心管置于75℃恒温混匀仪上加热洗脱10min。
将离心管置于磁性分离器上吸磁1min，取上清用于后续实验。DNA样品可以立即使用或用封口膜封闭后保存于2℃-8℃备用。
试剂盒的配置同实施例1。
本发明也可配合全自动核酸提取仪，程序与实施例2相同，见表5。
其中，样本采用某医院病人新鲜宫颈脱落细胞，对照提取方法为热裂解法。
对上述提取到的核酸用Qubit3.0进行浓度的测定，结果如下表7。
表7实施例3结果
由以上结果分析可得，本发明的提取效率已满足同类方法的水平，满足后续试验的要求。
综上所述，本发明提供的核酸提取试剂盒及核酸提取方法，可广泛使用于多种样本的核酸提取，亦适用于多种自动化核酸提取仪，最快仅需13min即可完成提取，快速高效，且试剂中不含有氯仿等有毒试剂，对人友好，且提取的核酸浓度高、纯度好，具有较高的推广应用价值。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种磁珠型核酸提取试剂盒，其特征在于，由裂解液、磁珠液、洗涤液和洗脱液组成；
所述裂解液由异硫氰酸胍、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、二水乙二胺四乙酸二钠、曲拉通X-100、聚乙二醇6000、氢氧化钠、超纯水和盐酸组成；
所述磁珠液由磁珠、DEPC水组成；
所述洗涤液由三羟甲基氨基甲烷、乙酸钠、超纯水、无水乙醇和盐酸组成；
所述洗脱液由三羟甲基氨基甲烷、二水乙二胺四乙酸二钠、DEPC水和盐酸组成。
2.如权利要求1所述的磁珠型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括以下质量分数的各组分：
异硫氰酸胍41.36％、三羟甲基氨基甲烷0.6057％、氯化钠1.753％、18.62％、曲拉通X-100 5％、聚乙二醇6000 5％、氢氧化钠5％、余量为超纯水，用盐酸调节pH至8.5。
3.如权利要求1所述的磁珠型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠液中的磁珠用量为50mg/ml，磁珠为迈德泰克100nm磁珠。
4.如权利要求1所述的磁珠型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括以下质量分数的各组分：
三羟甲基氨基甲烷0.12114％、乙酸钠3.533％、无水乙醇80％、余量为超纯水，用盐酸调节pH至7.5。
5.如权利要求1所述的磁珠型核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括以下质量分数的各组分：
三羟甲基氨基甲烷0.12114％、三羟甲基氨基甲烷18.62％，余量为DEPC水，用盐酸调节pH至8.0。
6.权利要求1-5任一项的磁珠型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、向装有样本的离心管中加入裂解液、磁珠液，65℃混匀裂解；
S2、将离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液；
S3、加入洗涤液混匀后，将离心管置于磁力架，待磁珠完全被吸附后，弃掉上清液；
S4、将磁珠晾干后，加入所述洗脱液，75℃温浴洗脱后，收集核酸并保存。
7.权利要求6任一项的磁珠型核酸提取试剂盒提取核酸的方法，其特征在于，所述的样本为拭子、全血、血浆、血清、唾液、组织液、尿液或各种保存液保存的生物样本中的任意一种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114934041A (zh) * 2022-04-27 2022-08-23 北京金豪制药股份有限公司 一种核酸提取的试剂和方法
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