CN111518876A - 一种牛血红蛋白制品中牛源基因组dna定量检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牛血红蛋白制品中牛源基因组DNA定量检测方法及其应用，具体提供了牛源血红蛋白制品中牛基因组DNA的荧光定量PCR检测方法，其包括：对所述牛源血红蛋白制品中的DNA进行提取，和利用荧光定量PCR方法对提取的DNA进行扩增检测。该方法对从人工聚合的牛血红蛋白中纯化牛源DNA进行特异性扩增和荧光检测，实现了对生化药物制品中牛源成分的快速、准确检测。

Description

一种牛血红蛋白制品中牛源基因组DNA定量检测方法及其 应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种牛血红蛋白制品中牛源基因组DNA定量检测方法及其应用。

背景技术

伴随生物技术发展，诸多经基因克隆的蛋白经原核生物，如大肠杆菌，简单的真核生物，如毕赤酵母，以及哺乳动物细胞如中国仓鼠的卵巢细胞系(CHO)、来自人肾脏的HEK293细胞系、来自非洲绿猴肾细胞的Vero细胞系以及来自鼠的骨髓瘤细胞系NS0。利用这些重组表达系统可以完成细胞因子、多肽类激素、酶及抗体的表达。这些表达系统对于一些氨基酸序列很长、构象特殊、具有复杂高级结构特别是形成天然复合物的蛋白有时难以奏效，特别是这些蛋白具有丰富的天然来源，经过对天然来源的蛋白提取纯化生产的效果和成本都更易控制，这一类以猪、牛、羊等动物的脏器、血液、组织作为原料的生化药物在医药市场上还占据有一定的市场，这类动物来源的生物制品在生产过程中，一方面需要对动物品种、组织特点进行可溯源的分析，防止在生产中其他来源动物材料的掺入以保证生产的药物具有良好的一致性，同时，在产出的产品中还需要对原料动物(宿主)的DNA残留进行控制，以免其进入人体导致不可预测的毒副作用。

TaqMan^TM探针法作为最新发展起来的技术，具有灵敏度高、特异性好、操作简单和定量准确的优点，因此成为该领域的首选方法。以原料来源控制为目的的核酸检测，关注的是非预期来源动物源成分的检出，与食品掺假类似，其选择的基因多来自相关动物的线粒体基因或片段，因为非核基因的线粒体拷贝数高，易于检出，且线粒体终存在诸多高度变异的区域，比如细胞色素B的编码基因cytb，细胞色素C氧化酶I基因CoxI、ATP合成相关的基因atp6、atp8、12S RNA基因以及高度变异的d-loop区等。检测方法主要是传统的染料法、探针法以及各种试纸条法。

对于重组蛋白药物和疫苗制品，中国药典2015年版的3407通则中规定了两种残留DNA检测方法，第一法为DNA探针杂交法，第二法为荧光染色法，但对两种方法原用于具体宿主或物种的探针，其预期检测敏感度分别为100pg/100μl(探针法)和1.25ng/ml(染料法),限于方法和检测原理，其敏感度、精密度和定量准确性对于检测大剂量生物和生化制剂时都有所限制。实际应用中我国目前现有的猪、牛及羊PCR种属鉴别的相关标准均参照中国出入境检验检疫行业标准。实际二者(药典和出入境检验检疫行业标准)从检样至应用目的均有所不同，药典规定检测靶标为宿主的基因组DNA，且需要定量以判断残留情况，而出入境质检以检出为目标，多采用线粒体DNA为目标以提高检测的敏感度，而难以实现和基因组DNA对应的量值关系。为此，中国药典委员会2019年6月公布的2015版药典第四部《通则3407外源性DNA残留量测定法第三法公示稿》中明确规定了针对残留DNA定量检测的第三法，即定量PCR探针法，并对CHO细胞、Vero细胞、NS0、大肠杆菌和毕赤酵母等来源生物制品的探针法定量PCR方法使用的引物和探针序列进行了规定。

TaqMan方法使用一条序列特异，5’和3’端分别经荧光和淬灭剂标记的寡聚核苷酸Taman探针和一对序列特异的引物完成检测。图1为TaqMan方法的工作原理，TaqMan探针法利用Taq DNApolymerase或Tth DNApolymerase等热稳定聚合酶具有的5'-核酸外切酶的活性，探针结合至扩增产物时，将其5’端切除，使荧光基团解除淬灭，报告基团发光而被检测到，产生的荧光信号与样本中扩增产物的量成比例，由扩增的Ct值(阈值循环数)即可推算出反应中模板数量，从而确定其起始浓度。

携氧血红蛋白经分离提取和后续加工纯化制备的携氧血红蛋白作为红细胞代用品具有重要的应用和经济价值。最初采用无任何修饰的人血红蛋白，因不稳定的四聚体解聚能引发多种副作用，此后的研究多以经交联形成的稳定多聚物为开发方向。对于该制品中残留的牛基因组DNA的检测目前尚无可靠的方法。

对于牛来源的生化药物和食品、饲料的来源确定，过去多以进出口检验检疫的行业标准方法为主，此类方法更适宜加工食品和饲料的原料追溯。申请号为CN201310670600.4的发明专利“一种食品及饲料中牛源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用”即公开了一种通过扩增牛线粒体片段进行物种鉴定的检测方法，虽然线粒体DNA拷贝数高，也易于获得，检测方法中使用胶体金试纸条代替电泳，简化了实验。公开号为CN110305973A的发明专利“鲜肉及制品中牛和驴源性同步检测的引物和探针及试剂盒单”中公开了一种可对DNA含量进行定量检测的TaqMan探针方法，类似地，该方法以线粒体DNA为检测基因，此方法目的在于区别牛与驴、鸡肉等食品原料的来源，因为检测线粒体DNA并不能代表基因组DNA的含量，因此还需开发以核基因为目标的定量检测方法。发明专利“一种快速鉴定食品中牛源成分的试剂盒及其应用”(公开号：CN109825609A)以牛基因组DNA的ighmbp2基因为标准基因建立了一种快速检测方法，该方法以试纸条完成定性检测，不能实现对基因组DNA的定量分析，因此不能用于药物蛋白中残留宿主DNA的检测。

对基因组DNA的定量检测，首选对单拷贝基因的检测，且该基因不应有太多的变异，又可与其他物种清晰区别。虽有多种基因可选，但作为常见的内参基因β-Actin和GAPDH的编码基因仍为优选的目的基因，尤其是β-actin基因。Cai等人以牛β-Actin基因为目标，建立了一种基于TaqMan探针法的定量PCR检测方法以区别牛和羊肉来源与其他来源的食品(Yicun Cai等，Meat Science 134(2017)119–123，Interlaboratory validation of areal-time PCR detection method for bovine and ovine-derived material)，该方法具有很好的肉制品来源DNA鉴别能力和敏感度，针对β0actin基因，付理文等也设计了多重PCR的检测方法，实现了三次连续10倍稀释的DNA检测，最低检测限达到了0.048ng/反应(中国生物工程杂志，2017，37(9)48-59.Taqman多重实时荧光PCR同步定量检测6种动物源性成分方法的建立)。Rene′Ko¨ppel等也以动物肉类鉴别为目的，建立了用于区分牛、羊、猪等常见肉类的检测方法(Eur Food Res Technol(2011)232:151–155.Multiplex real-timePCR for the detection and quantification of DNA from beef,pork,horse andsheep)。对于提取自牛血的蛋白制品，对其中残留牛DNA的检测，首先需要具备高度特异性，可以与常见的药物蛋白生产宿主细胞和易因其检测干扰的人源性DNA区别，其次需要足够的敏感度，可以实现对低浓度样本的检测，最后为实现准确的DNA定量，方法需要具有一定的精密度和检测回收率。然而，上述研究论文采用的引物和探针序列以鉴别目的为主，在特异性的设计目标上以食品来源肉中为目标，对回收率和检测的线性范围缺乏足够的考虑，而且上述文献中设计的引物和探针并不能对常见的药物生产细胞进行有效区别。

因此，牛源血红蛋白制品中牛源基因组DNA的定量检测方法还需进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

第一：

对于常规样本中牛基因组DNA的提取制备，如常规血液、细胞或组织样本，例如牛 肉样本，可以利用常规的动物样本基因组DNA制备方法或商品化试剂盒制备，如本发明实施 例1中对牛肉中DNA的提取，柱离心式方法可以获得可满足要求质量的DNA。然而，发明人发 现，同样的方法对于药物蛋白残留DNA的提取并不能奏效。而且，即使改用天根生化科技(北 京)有限公司DP705-1磁珠试剂盒的磁珠纯化方式进行提取，由于对高浓度蛋白样本中残留 成分的去除不净，导致产生了严重的PCR反应抑制，仍然完全无法满足使用要求。

基于上述问题的发现，发明人经过大量的创新试验探索，提供了一种新的提取牛 源血红蛋白制品中的DNA的方法，该方法以天根生化科技(北京)有限公司DP705-1磁珠试剂 盒的提取方法为基础，仅更换了其中的漂洗液，更换后的漂洗液组成为100mmol/L NaCl、 10mmol/LTris-HCl pH7.5，75％-85％乙醇，和0.4％-0.6％Triton X-100。

一方面，发明人发现，原漂洗液配方不可检出0.01pg掺入的质粒，而改良后的漂洗 液配方却可以稳定检测出0.001pg掺入的质粒，消除了样本带入的基质效应，实现了检测样 本敏感度的数量级提升。由此可见，与原漂洗液实验方案相比，仅通过将天根生化科技(北 京)有限公司DP705-1磁珠试剂盒中的漂洗液PWD更换为本申请的漂洗液，却实现了检测敏 感度的显著提升(至少两个数量级)，取得了预料不到的技术效果，对现有技术做出了实质 性贡献。

另一方面，本领域技术人员公知，常规PCR中，在某些情况下，可在缓冲液中加入化 学添加剂或辅助溶剂，通过减少错配来提高扩增特异性，并通过去除二级结构来提高扩增 效率。但是，应当注意，使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、Mg²⁺结合以 及酶活性。同时，它们还会干扰某些下游应用—例如，基因芯片实验中的非离子去污剂的干 扰。因此，为了成功进行PCR扩增和下游实验应用，应慎重考虑缓冲液组成成分及其浓度。对 于本领域技术人员而言，常规化学添加剂或辅助溶剂及其推荐浓度如下表所示。

上表内容可参见文献：Bartlett JMS,Stirling D(2003)PCRProtocols.In: Methodsin molecular biology(2nd ed).Totowa:Humana Press，或者，参见如下网址：

https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/cloning- learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr- reagents-enzymes/pcr-component-considerations.html

由上表可知，在常规PCR中，Tritonx-100的推荐浓度为0.05-0.1％，因为高浓度去 污剂会干扰Taq DNA聚合酶的功能等。因此，按照本领域技术人员的常规理解，如果改良后 的漂洗液配方中含有浓度高于0.05-0.1％的Tritonx-100，极有可能会有部分残留，从而造 成对扩增的干扰，因此，应当尽量避免Tritonx-100的浓度高于0.1％。

然而，本申请发明人突破性地将Triton X-100的浓度调高至0.4-0.6％(如 0.5％)，远远高于Tritonx-100的推荐浓度(0.05-0.1％)，并惊喜地发现，使用本发明改良 的漂洗液进行两次漂洗，每次250μL，不仅没有对扩增造成干扰，反而实现了检测敏感度的 显著提升(至少两个数量级)。由此可见，本发明改良后的提取方法相比于现有技术，不仅具 有非显而易见性，而且取得了预料不到的技术效果，对现有技术做出了突出的实质性贡献。

第二：

荧光定量PCR方法中，发明人设计合成了四组引物探针组合，分别为引物探针组合 1、引物探针组合2、引物探针组合3和引物探针组合1-1。最终，发明人选择引物探针组合1-1 进行PCR扩增(上游引物序列为：5′-TTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGG-3’，下游引物序列为5′- CACCACAAGGGGCAGTCG-3’，探针序列为：5’-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-3’)，原因在于：

其一，发明人发现，Taqman探针法qPCR体系中，引物探针组合1和引物探针组合2的 扩增效率分别为87％和96％，而引物探针组合3的扩增效率仅为77％，可见，引物探针组合1 和2相比于引物探针组合3，扩增效率显著更高。

其二，发明人发现，引物探针组合2在扩增中对于浓度低于0.01ng/μL时扩增效率 下降很快，且对于无模板对照(NTC)在Ct为33之后也会出现扩增信号。可见，引物探针组合2 虽然比引物探针组合1扩增效率略高，但可能形成非特异扩增，在低浓度时干扰结果，检测 敏感度降低，无法满足实际检测需求。

其三，发明人发现，通过对引物探针组合1的序列进行微调(将扩增产物的长度延 长至100bps左右，缩短上游引物3’端与标记探针5’端荧光标记碱基的距离至2个核苷酸，下 游引物的调整至与人基因序列差异更大的位置)获得的引物探针组合1-1，不仅特异性强， 扩增效率高，更重要的是，其Ct值-模板浓度曲线中对于浓度低于0.0001pg/μl的模板可以 有效检出，线性良好，且无模板对照(NTC)始终无扩增信号，最低模板检测浓度低至1×10- ⁷ng/μL，相比于引物探针组合2(敏感度仅为10-²ng/μL)，敏感度至少提高了5个数量级，取得 了预料不到的技术效果，对现有技术做出了实质性贡献。

为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种牛源血红蛋白制品中牛基因组DNA的荧光定量PCR检测方法，其包括：

对所述牛源血红蛋白制品中的DNA进行提取，和

利用荧光定量PCR方法对提取的DNA进行扩增检测；

其中：

所述提取包括如下步骤：

1)每取250μL所述牛源血红蛋白制品至2ml离心管中，加入20μL Proteinase K溶液和300μL裂解液GHL，振荡混匀，75℃裂解15min，期间颠倒混匀3回，每回5次；

2)向步骤1)获得的产物中加入300μL异丙醇，振荡混匀10sec，加入15μL磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

3)向步骤2)获得的产物中加入900μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

4)向步骤3)获得的产物中加入500μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

5)将所述2ml离心管从磁力架上取下，加入250μL漂洗液，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

6)将所述2ml离心管从磁力架上取下，加入250μL漂洗液，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

7)将所述2ml离心管放置于磁力架上，室温晾干10-15min，之后将所述2ml离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃温度下孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次；

8)将所述2ml离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至一个新离心管中，获得了DNA提取液；

所述牛源血红蛋白制品的体积至少为2mL，

所述漂洗液的组成为：100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.5，75％-85％(优选80％)乙醇，0.4％-0.6％(优选0.5％)Triton X-100，

所述Proteinase K溶液、裂解液GHL、磁珠悬浮液GH、缓冲液GDZ和洗脱缓冲液TB来自天根生化科技(北京)有限公司DP705-1磁珠试剂盒；

所述荧光定量PCR方法中：

扩增使用的上游引物Bos-ACTB-1F2的序列为：5′-TTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGG-3’(SEQ ID NO：11)，下游引物Bos-ACTB-1R2的序列为5′-CACCACAAGGGGCAGTCG-3’(SEQ IDNO：12)，探针Bos-ACTB-P1的序列为：5’-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-3’(SEQ ID NO：3)；

其中：

所述牛源血红蛋白制品是通过下述方法制备的:

1)使用含有抗凝剂的无菌容器收集牛血；

2)所述收集牛血结束后用超滤法洗涤所述牛血；

3)通过离心法或膜过滤法对所述洗涤后的所述牛血进行细胞分离，获得牛血红细胞，裂解所述牛血红细胞，获得血红蛋白溶液；

或者，通过溶出法对所述洗涤后的所述牛血进行血红蛋白溶出处理，获得血红蛋白溶液；

4)对所述血红蛋白溶液进行除氧，获得脱氧血红蛋白溶液，从而稳定所述血红蛋白溶液；

5)纯化所述脱氧血红蛋白溶液，从而减少非特异性血细胞成分，其中所述纯化是通过色谱法实现的；

6)通过30,000Da中空纤维膜超滤所述纯化后的所述脱氧血红蛋白溶液，达到所需的血红蛋白浓度，从而稳定所述纯化后的所述脱氧血红蛋白溶液；

7)将步骤6)获得的脱氧纯化血红蛋白溶液通过30,000Da中空纤维膜超滤，并用储存缓冲液进行渗滤换液，所述储存缓冲液包括2.63g/L十二水合磷酸三钠，7.0g/L七水合磷酸氢二钠和2.0g/L乙酰半胱氨酸；

8)将步骤7)获得的脱氧纯化血红蛋白溶液与戊二醛进行交联聚合；

9)用硼氢化钠还原步骤8)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白；

10)通过对步骤9)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白进行透析滤过，使所述聚合纯化的脱氧血红蛋白稳定下来，获得聚合血红蛋白溶液；

11)过滤步骤10)获得的聚合血红蛋白溶液，获得最终聚合血红蛋白溶液；

12)用柔性袋或西林瓶灌装所述最终聚合血红蛋白溶液，获得所述牛源血红蛋白制品。

需要说明的是，所述漂洗液的组成中，“75％-85％乙醇”指的是每100mL的所述漂洗液中，所述乙醇的体积为75-85mL。“0.4％-0.6％Triton X-100”按照相同的方式进行理解。

在一些实施方案中，所述探针5’端和3’端分别进行了化合物标记，5’端标记的化合物选自异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)、羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro fluorescein，HEX)，3’端标记的化合物选自6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)和广谱荧光淬灭剂BHQ-1(Black HoleQuencher 1)。

在一些实施方案中，所述扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸15秒，扩增40个循环，最后72℃延伸5分钟。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤11)中的过滤为0.5μm深度过滤、0.2μm除菌过滤,和至少一个额外的0.2μm除菌过滤。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，以无菌无氧的方式对所述最终血红蛋白溶液进行柔性袋或西林瓶灌装，以得到可长期保存的产品。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述离心法是在离心力12500xG，温度10℃，时间25min的条件下进行的，或者所述膜过滤法是通过去除白细胞的方式实现所述细胞分离的，或者所述血红蛋白溶出处理是利用20mOsm CSB缓冲液实现的，所述CSB缓冲液包括7.9g/L氯化钠和6.0g/L二水合物柠檬酸钠。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述裂解所述牛血红细胞是通过如下方式进行的：将所述牛血红细胞在100kDa和30kDa膜上进行细胞裂解和顺序渗滤。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤4)中，所述除氧是通过如下方式进行的：以500mL/min的流速将所述血红蛋白溶液泵送通过两个串联排列的液相脱气膜，在75psi下氮气逆流流动，除氧直到溶解氧读数低于0.02mg/mL。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述除氧后进一步包括将所述脱氧血红蛋白溶液经过0.3μm和至少一个0.22μm深度过滤器的步骤。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述色谱系统使用配备有填充有阴离子交换填料的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm I.D.×100cm长)的赛谱SCG层析系统进行，床高为70±5cm。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述色谱系统的缓冲液是使用注射用水制备的，并通过10kDa膜过滤以进一步降低热原含量，所述缓冲液包括：(1)缓冲液A：2.42g/L tris碱，调至pH 9.0±0.1，(2)缓冲液B：6.05g/L Tris碱，调节pH7.0±0.1，(3)缓冲液C：2.42g/L Tris碱，58.38g/L NaCl,调节pH8.9±0.1。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述聚合是在温度为42±2℃下进行的，戊二醛溶液的浓度为6.2g/L，所述戊二醛与所述脱氧纯化血红蛋白的质量比为0.037:1。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述戊二醛通过静态混合器加入，以确保快速均匀地与血红蛋白混合，当所述戊二醛的加入完成时，将反应混合物的温度冷却到25℃以下。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，将所述反应混合物通过30,000Da中空纤维膜进行透析过滤浓缩，使得血红蛋白浓度为60-70g/L。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述硼氢化钠的水溶液包括9.45g/L的硼氢化钠、4.58g/L的十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠，所述硼氢化钠的水溶液经10,000Da膜过滤以降低热原含量。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤9)中，将所述硼氢化钠的水溶液在温度为18-25℃，流速为7ml/min的条件下与步骤8)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白溶液进行混合。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤10)中，将步骤9)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白通过30kd超滤膜浓缩至血红蛋白浓度为100±5g/L。

在一些实施方案中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述洗涤所述牛血是通过如下方式进行的：以200-500mL/min的流速泵送抗凝化的牛血，同时与柠檬酸钠溶液以280-700mL/min的流速混合，并使混合物经过0.6μm和0.4μm深度过滤膜，再将所述深度过滤后的所述混合物以1-2L/min循环通过0.2μm中空纤维,最后以超滤方式并以300-500ml/min速度注入柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液包括7.9g/L氯化钠和6.0g/L二水合物柠檬酸钠。

本发明说明书中所使用的技术术语解释：

引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核普酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3′末端开始。

标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡核苷酸相偶连的方法。

核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。

探针DNA：可以和PCR产物特异结合的单链DNA分子，本发明采用的是TaqMan探针的原理，其5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭集团，无反应状态时淬灭基团使自身荧光淬灭，经与模板结合后，外切酶将带有荧光基团的碱基切下，消除淬灭，发出荧光信号。

Ct值：阈值循环数，一个PCR反应中产生的荧光信号达到设定阈值时的扩增循环数。

有益效果

1、本发明是以TaqMan探针法进行生物制品中宿主残留DNA进行定量分析的检测方法，通过对牛基因组DNA中β-actin基因的定量检测，可以实现对提取自牛的蛋白制品中残留的牛基因组DNA进行准确的定量分析，降低药物使用的风险；

2、快速：本发明检测方法的检测过程在60分钟内完成；

3、灵敏：本发明检测方法的定量限可以达到0.1ng基因组DAN/反应。

4、线性范围宽：本发明检测方法的检测的线性范围可以达到10⁹，可以简化样本制备流程，减少实验环节；

5、低交叉反应：本发明检测方法与常见的易混物种交叉反应很低，与人、CHO(中华仓鼠卵巢细胞)极及小鼠等物种无交叉。

附图说明

图1是TaqMan探针法检测牛基因组DNA的原理；

图2是标准牛基因组DNA的提取和质量控制，其中，M:DNA分子量标记，1kb ladder(TaKaRa)，Bov-DNA：制备的牛基因组DNA脂糖凝胶；

图3是扩增牛β-actin基因片段的序列测定；

图4是不同引物-探针组合扩增的熔解曲线，其中，左：组合1；中：组合2；右：组合3；

图5是引物探针组合2(SEQ ID NO：5,SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)对阳性质粒连续稀释模板的Ct-浓度曲线；

图6是引物探针组合1-1(SEQ ID NO：11,SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：3)对阳性质粒连续稀释模板的Ct-浓度曲线；

图7是阳性质粒连续稀释模板的Ct-浓度曲线；

图8为本发明实施例的牛养殖场实景图；

图9为本发明实施例的采集的牛血实景图；

图10为本发明实施例的洗涤收集的血液的流程示意图；

图11为本发明实施例的膜过滤法现场试验探索示意图；

图12为本发明实施例的膜过滤法流程示意图；

图13为本发明实施例的溶出法现场试验探索示意图；

图14本发明实施例的溶出法流程示意图；

图15为本发明实施例的细胞裂解和渗滤的流程示意图；

图16为本发明实施例的过滤脱氧的流程示意图；

图17为本发明实施例的层析纯化血红蛋白的流程示意图；

图18A为本发明实施例的对纯化的血红蛋白进行脱氧的流程示意图；

图18B为本发明实施例的对纯化的血红蛋白进行脱氧的流程示意图；

图19A为本发明实施例的纯化的血红蛋白与戊二醛进行聚合的流程示意图；

图19B为本发明实施例的用硼氢化钠还原戊二醛-交联血红蛋白的流程示意图；

图20为本发明实施例的无气体残留罐装装置示意图；

图21为本发明实施例的罐装产品示意图；

图22A为本发明实施例的稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含的亚单位α人与牛氨基酸序列同源性示意图；

图22B为本发明实施例的稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含的亚单位β人与牛氨基酸序列同源性示意图；

图23为本发明实施例的洗涤收集的血液的流程示意图；

图24为本发明实施例的细胞裂解的流程示意图；

图25为本发明实施例的过滤脱氧的流程示意图；

图26为本发明实施例的层析纯化血红蛋白的流程示意图；

图27A为本发明实施例的对纯化的血红蛋白进行脱氧的流程示意图；

图27B为本发明实施例的对纯化的血红蛋白进行脱氧的流程示意图；

图28为本发明实施例的纯化的血红蛋白与戊二醛进行聚合的流程示意图；

图29为本发明实施例的用硼氢化钠还原戊二醛-交联血红蛋白的流程示意图；

图30为本发明实施例的无菌过滤过程的示意图；

图31为本发明实施例的用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统结构示意图；

图32为图31的部分结构放大图；

图33为本发明实施例的用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统结构示意图；

图34为本发明实施例的用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统结构示意图；

图35为本发明实施例的红细胞纯化方法使用分离系统图像；

图36为本发明实施例的红细胞纯化方法使用分离系统示意图；

图37为本发明实施例的聚合组件的图像；

图38为本发明实施例的层析现场图像；

图39为本发明实施例的上样前柱效的检测结果图；

图40为本发明实施例的层析1数据的曲线图像；

图41为本发明实施例的层析2数据的曲线图像；

图42为本发明实施例的层析2的收集物SDS-PAGE纯度检测结果图像，其中，1表示C500，2表示AEX穿峰1，3表示AEX穿峰2，4表示AEX冲洗峰，5表示AEX洗脱峰，6表示AEX洗脱峰尾，7表示AEX再生峰，8表示Marker；

图43为本发明实施例的初级过滤装置图像；

图44为本发明实施例的初级过滤装置示意图；

图45为本发明实施例的用于100KD渗滤处理的组件的图像；

图46为本发明实施例的用于100KD渗滤处理的组件的示意图；

图47为本发明实施例的用于30KD渗滤浓缩处理的组件的图像；

图48为本发明实施例的用于脱气膜脱氧处理的组件的图像；

图49为本发明实施例的用于脱气膜脱氧处理的组件的示意图；

图50为本发明实施例的商业规模生产设计图；

图51为本发明实施例的负一层仓库设计图；

图52为本发明实施例的二层的QC、研发、公用工程室设计图；

图53为本发明实施例的采集牛血的养殖场获得的EDQM证书图像。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非特别指出或从上下文中显而易见，否则本文所用术语“约”应理解为在本领域的正常容限范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以理解为在所述值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％之内。除非上下文中另有说明，本文提供的所有数值都用术语“约”来修改。

短语“异常表达”用于指偏离(即，增加或降低的表达水平)基因的正常参照表达水平的表达水平。

术语“试剂”是指任何小蛋白质或其它化合物，抗体，核酸分子或多肽，或其片段。

“改变”是指稳定技术或反应的分子量分布的改变(增加或减少)，如通过标准的本领域已知的方法如本文所述的那些方法所检测的。如本文所用，改变包括交联水平的至少5％改变，例如交联分子稳定水平的至少5％至95％或100％改变。例如，改变包括蛋白质稳定性的至少5％-10％改变，优选25％改变，更优选80％改变，最优选稳定分子尺寸的590％或更大改变。

“改善”是指减少，抑制，减弱，减少，阻止或稳定疾病的发展或进展。

本文所用术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的生物活性即可。术语“免疫球蛋白”(Ig)在此与“抗体”可互换使用。

“结合”分子是指对该分子具有物理化学亲和力。

“对照”或“参比”是指比较标准。一方面，如本文所用，“与对照相比改变”的样品或受试者被理解为具有统计学上不同于正常，未处理或对照样品的水平。对照样品包括，例如，培养物中的细胞，一种或多种实验室测试动物，或一种或多种人类受试者。选择和测试对照样品的方法在本领域技术人员的能力之内。分析物可以是天然存在的物质，其由细胞或生物体表达或产生(例如抗体，蛋白质)，或由反应物质产生以形成共价键的物质(例如戊二醛)。根据用于检测的方法，变化的量和测量值可以变化。统计显著性的确定在本领域技术人员的能力之内，例如，与构成肯定结果的平均值的标准偏差的数量。

“检测”指鉴定待检测试剂(例如核酸分子，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))的存在，缺乏或量。

“可检测标记”是指这样的组合物，当该组合物与感兴趣的分子连接(例如直接或间接连接)时，使得后者可通过例如光谱，光化学，生物化学，免疫化学或其他化学手段检测到。直接标记可以通过将标记连接到分子上的键或相互作用而发生，而间接标记可以通过使用直接或间接标记的接头或桥接部分而发生。

“检测步骤”可以使用多种已知方法中的任何一种来检测核酸(例如，甲基化DNA)或多肽的存在。其中可使用探针的检测方法的类型包括Western印迹，Southern印迹，斑点或狭缝印迹和Northern印迹。

术语“有效量”和“治疗有效量”的制剂或制剂组分是指足够量的制剂或组分，单独或组合，以提供所需的效果。例如，“有效量F”是指相对于未治疗的患者，改善贫血和/或缺铁状态症状所需的单独或组合的化合物的量。用于实施本发明以治疗性治疗疾病的活性化合物的有效量取决于给药方式，受试者的年龄，体重和一般健康状况。最后，主治医师或兽医将决定合适的量和剂量方案。这种量被称作“有效”量。

术语“片段”是指蛋白质分子的一部分。该部分优选至少包含血红蛋白的分子或原始蛋白构建体的血红素铁部分。例如，片段可以包含天然血红蛋白分子的和bets片段的1，2或4个侧链。然而，本发明还包括上述蛋白质片段，只要它们从全长球形蛋白质结构中显示出所需的生物活性，例如，在本发明的许多实施方案中包括总重量约16000kD，约32000kD(包括所有中间重量)的说明性多氨基酸片段。类似地，如果蛋白片段是铁载体(血红素基团)，则使用几乎任何长度的蛋白片段。

术语“分离的”，“纯化的”或“生物纯的”是指与在其天然环境中发现的通常伴随它的组分在不同程度上无关的材料。“分离”表示与原始来源或环境的分离程度。“纯化”表示高于分离的分离度。

“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分不含其它材料，使得任何杂质不会实质性地影响蛋白质的生物学性质或引起其它不利的后果。也就是说，本发明中的聚合物片段的稳定蛋白质，如果当通过重组DNA技术生产时它基本上不含细胞物质，病毒物质或培养基，或当化学合成时不含化学前体或其它化学物质，以及所有其它基质红细胞或其它血液蛋白或血液组分和细胞碎片，则它被纯化。纯度，均一性和稳定性通常使用分析化学技术测定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。对于可以进行修饰的蛋白质，例如磷酸化，糖基化或聚合，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，其可以被单独纯化。

类似地，“基本上纯的”是指从天然伴随它的组分中分离的蛋白质或多肽。典型地，当蛋白质和多肽至少95％含量，甚至99％含量时，它们基本上是纯的，不含其它蛋白质和与其天然相关的天然存在的有机分子。

“分离的多肽”是指从天然伴随它的组分中分离的本发明的多肽。典型地，当多肽的重量至少为60％时，该多肽被分离，不含蛋白质和天然存在的与之天然相关的有机分子。优选地，制剂是至少75％含量，更优选至少90％含量，最优选至少99％含量的本发明多肽。本发明的分离的多肽级分和/或蛋白可以通过例如从天然来源提取，通过表达编码这种物质的重组核酸而获得；或通过化学合成该蛋白质。纯度可通过任何合适的方法测量，例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶，电泳或HPLC分析。

术语“固定的”或“附着的”是指探针(例如核酸或蛋白质)和固体支持物，其中探针和固体支持物之间的结合足以在结合，洗涤，分析和除去的条件下稳定。结合可以是共价的或非共价的。共价键可以直接在探针和固体载体之间形成，或者可以通过交联剂形成，或者通过在固体载体或探针或两个分子上包含特定的反应基团形成。非共价结合可以是静电，亲水性和疏水性相互作用中的一种或多种。非共价结合包括分子与载体的共价连接和生物素化探针与分子的非共价结合。固定化还可以涉及共价和非共价相互作用的组合。

术语“标志物”是指具有与疾病或病症例如瘤形成相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。

“调节”是指改变(增加或减少)。这些改变是通过标准的本领域已知的方法，例如这里所述的那些方法来检测的。

术语“正常量”是指已知未被诊断为患有癌症或各种代谢和生理疾病状态的个体中复合物的正常量。可以在测试样品中测量分子的量，并将其与“正常对照水平”进行比较，利用诸如参考极限，鉴别极限或风险定义阈值的技术来定义截止点和异常值(例如，用于瘤形成，缺氧，局部缺血)。“正常对照水平”是指通常在已知不患有癌症或生理缺氧状态的受试者中发现的一种或多种蛋白质(或核酸)或组合蛋白质指数(或组合核酸指数)的水平。这样的正常对照水平和截止点可以根据分子是单独使用还是在将其它蛋白质结合成指数的公式中使用而变化。或者，正常对照水平可以是来自先前测试的受试者的蛋白质模式的数据库，所述受试者在临床上相关的时间段内没有转化为癌症。它也可以是以MMHG测量的氧张力降低的状况，以缺氧或局部缺血为特征。另一方面，正常对照水平可以是相对于正常细胞功能和氧化水平的水平。

所确定的电平可以与控制电平或截止电平或阈值电平相同，或者可以相对于控制电平或截止电平或阈值电平增加或减少。在一些方面，对照对象是相同物种的匹配对照，性别，民族，年龄层，吸烟状态，体重指数(BMI)，目前的治疗方案状态，病史或其组合，但是与诊断和评估的对象不同的是，对照不患有所述疾病或没有患病风险或反映缺氧的征兆和症状。

相对于控制电平，所确定的电平可以是增加的电平。本文所用术语“相对于水平(例如表达水平，生物活性水平等)增加”是指比对照水平增加任何％。增加的水平可以是至少或大约5％的增加，至少或大约增加10％，至少或大约增加15％，至少或大约增加20％，至少或大约增加25％，至少或大约增加30％，至少或大约增加35％，至少或大约增加40％，至少或大约增加45％，至少或大约增加50％，至少或大约增加55％，至少或大约增加60％，至少或约65％的增加，相对于对照水平，至少或大约增加70％，至少或大约增加75％，至少或大约增加80％，至少或大约增加85％，至少或大约增加90％，或至少或大约增加95％。

相对于控制水平，所确定的电平可以是降低的水平。本文所用术语“相对于水平(例如表达水平，生物活性水平等)降低”是指低于对照水平的任何％的降低。降低的水平可以是至少或约1％的降低，至少或约减少5％，至少或约减少10％，至少或约减少15％，至少或约减少20％，至少或约减少25％，至少或约减少30％，至少或约减少35％，至少或约减少40％，至少或约减少45％，至少或约减少50％，至少或约减少55％，至少或约减少60％，至少或约减少65％，与对照水平相比，至少或约减少70％，至少或约减少75％，至少或约减少80％，至少或约减少85％，至少或约减少90％，或至少或约减少95％。

可用于本发明方法的蛋白质分子包括编码本发明血红素铁组合物的多肽或其片段的任何核酸分子。这种蛋白质稳定的分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但是通常表现出基本的同一性，例如，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％的同一性。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤严格性也将变化。严格控制的洗涤/和混合条件可由缓冲液浓度，戊二醛反应的分散条件和温度来定义。如上所述，可通过降低盐浓度或通过提高温度来增加受控严格性。这些条件的其它变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。杂交/缀合技术对于本领域技术人员是众所周知的，并且描述于例如Benton和Advis(Science196:180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci。，USA 72:3961，1975)；Ausubel等。(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(导向分子克隆技术，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。

″瘤形成″是指以过度增殖或细胞凋亡减少为特征的疾病或病症。可使用本发明的说明性肿瘤包括，但不限于胰腺癌，白血病(例如，急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性粒细胞白血病，急性成髓细胞白血病，急性早幼粒细胞白血病，急性粒单核细胞白血病，急性单核细胞白血病，急性红细胞白血病，慢性白血病，慢性粒细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤(霍奇金氏病，非霍奇金氏病)，瓦尔德氏巨球蛋白血症，重链病和实体瘤如肉瘤和癌(如恶性淋巴瘤)，纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤，弦瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，Ewing's肿瘤，平滑肌瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，膀胱癌，髓内癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，尼罗导管癌，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎癌，Wilm′s瘤，宫颈癌，子宫癌，睾丸癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，多形性胶质细胞瘤，星形胶质细胞瘤，成髓细胞瘤，颅咽管瘤，附睾瘤，松质瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突胶质瘤，神经胶质瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。

如本文所用，“获得”如“获得代理”中所述，包括合成，购买或以其它方式获得代理。

除非特别指出或从上下文中显而易见，否则本文所用术语“或”应理解为包括在内。除非特别指出或从上下文中显而易见，否则本文所用术语“一个”，“一个”和“该”应理解为单数或复数。

短语“药学上可接受的载体”是本领域公知的，并且包括药学上可接受的材料，组合物或赋形剂，适于给予哺乳动物本发明的化合物。所述载体包括液体或固体填料，稀释剂，赋形剂，溶剂或包封材料，所述液体或固体填料，稀释剂，赋形剂，溶剂或包封材料涉及将所述主体试剂从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分。每种载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且对患者没有伤害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括:糖，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；明胶；赋形剂；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和用于药物制剂中的其它无毒相容性物质。

术语“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指多于两个天然或非天然氨基酸的任何链，不管翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何，如本文所述，组成天然存在或非天然存在的多肽或肽的全部或部分。

“引物组”是指可用于例如PCR的一组寡核苷酸。引物组由至少2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，30，40，50，60，80,100,200,250,300,400,500,600或更多引物组成。

术语“预防”是指对有发展危险的临床无症状个体施用药剂或组合物，易感或易患特定不良状况，病症或疾病，因此涉及预防症状和/或其根本原因的发生。

这里的范围可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当数值被表示为近似值时，通过使用前项“约”，可以理解该特定值形成了另一个方面。还应当理解，每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且独立于另一个端点。还应当理解，在此公开了多个值，并且除了该值本身之外，每个值也在此公开为“大约”该特定值。还应当理解，在整个应用中，以多个不同的格式提供数据，并且该数据表示数据点的任意组合的端点，起点和范围。例如，如果公开了一个特定的数据点“10”和一个特定的数据点“15”，可以理解，大于，大于或等于，小于，小于或等于，以及等于10和15以及10和15之间被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11，12，13和14。

这里提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1-50的范围被理解为包括任何数字，数字的组合，或选自1-50的子范围，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50以及前述整数之间的所有中间小数值，例如1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8和1.9。关于子范围，从该范围的任一端点延伸的“嵌套子范围”是特别考虑的。例如，示例性范围1-50的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1-10，1-20，1-30和1-40，或者在另一个方向上的50-40，50-30，50-20和50-10。

“减少”是指至少10％，25％，50％，75％或100％的负面改变。

“参考序列”是用作序列比较或基因表达比较基础的限定序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸，约50个氨基酸或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约40个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300个或约500个核苷酸或它们之间的任何整数。

本文所用术语“样品”是指为了体外评价而获得的生物样品。本文所述方法的示例性组织样品包括来自瘤形成或循环外体的组织样品。关于本文公开的方法，样品或患者样品优选可以包括任何体液或组织。在一些实施方案中，体液包括但不限于从受试者获得的血液，血浆，血清，淋巴，母乳，唾液，粘液，精液，阴道分泌物，细胞提取物，炎性液体，脑脊液，粪便，玻璃体液或尿液。在一些方面，样品是血液样品，血浆样品，血清样品和尿液样品中的至少两种的复合板。在示例性方面，样品包括血液或其级分(例如，血浆，血清，通过白细胞分离获得的级分)。优选的样品是全血，血清，血浆或尿液。样品也可以是组织或体液的部分纯化的级分。

参比样品可以是“正常”样品，来自不具有所述疾病或病症流体的供体，或来自具有所述疾病或病症的受试者的正常组织。参比样品也可以来自未用活性剂处理的未处理的供体或细胞培养物(例如，仅不处理或施用载体)。在将细胞或受试者与待测试的试剂或治疗干预接触之前或在预期研究开始时，还可以在“零时间点”采集参比样品。

“固体载体”描述了条带，聚合物，珠粒或纳米颗粒。所述条带可以是核酸探针(或蛋白质)包被的多孔或非多孔固体载体条带，所述条带包括将核酸探针连接至载体以制备缀合物和将所述缀合物固定在多孔固体载体上。众所周知的载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，淀粉酶，天然和改性纤维素，聚丙烯酰胺，Gabbros和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以在一定程度上是可溶的或不可溶的。只要偶联的分子能够与结合剂(例如抗体或核酸分子)结合，载体材料实际上可以具有任何可能的结构构型。因此，支撑结构可以是球形，如珠状，或圆柱形，如试管的内表面，或杆的外表面。或者，表面可以是平坦的，例如片材，或测试条等。例如，载体包括聚苯乙烯珠粒。本领域技术人员将知道结合抗体或抗原的许多其它合适的载体，或者能够通过常规实验来确定这些载体。在其它方面，固体载体包含聚合物，试剂化学结合，固定，分散或缔合到该聚合物上。聚合物载体可以是聚合物网络，并且可以珠粒形式(例如通过悬浮聚合)制备。引入聚合物载体的活性位点的位置取决于聚合物载体的类型。例如，在溶胀凝胶珠粒聚合物载体中，活性位点均匀分布在整个珠粒中，而在大孔珠粒聚合物载体中，它们主要在大孔的内表面上。所述固体载体，例如装置，包含单独的或与至少一种，两种，三种或更多种其它分子的结合剂一起的结合剂。

术语“特异性结合”是指识别和结合本发明多肽的化合物或抗体，但是其基本上不识别和结合样品中的其它分子，例如生物样品，其天然包括本发明的多肽/缀合纯化蛋白。

“基本上相同”是指与参考氨基酸序列具有至少80％同一性的多肽/蛋白质或核酸分子(例如，本文所述氨基酸序列中的任何一个)或核酸序列(例如本文所述核酸序列中的任何一个)。优选地，这样的序列在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或至少99％相同。

本文所用术语“受试者”包括易于患有所述病症的动物家族的所有成员。在一些方面，所述受试者是哺乳动物，而在一些方面，所述受试者是人。该方法也适用于伴侣动物如狗和猫以及家畜如奶牛，马，绵羊，山羊，猪和其它驯化和野生动物。

“患有或怀疑患有”特定疾病的受试者，病症或综合征具有足够数量的危险因素，或者表现出足够数量的疾病，病症或综合征的征兆或症状，或者这些征兆或症状的组合，使得有能力的个体将诊断或怀疑该受试者患有该疾病，病症或综合征。用于鉴定患有或怀疑患有与癌症相关的病症的受试者的方法在本领域技术人员的能力之内。患有和怀疑患有特定疾病，病症或综合征的受试者不一定是两个不同的组。

如本文所用，“易患”或“处于发展特定疾病或病症的风险”是指基于遗传，环境，健康和/或其它风险因素的个体比一般人群更可能发展疾病或病症。发展成疾病的可能性的增加可以是大约10％，20％，50％，100％，150％，200％或更多的增加。

本文所用术语“治疗”是指对患有不良病症的临床症状个体施用药剂或制剂，从而降低症状的严重程度和/或频率，消除症状和/或其根本原因，和/或促进损伤的改善或修复。应该认识到，尽管不排除治疗疾病或病症，但不需要完全消除与之相关的疾病，病症或症状。

在一些情况下，本发明的组合物口服或全身给药。其它给药方式包括局部，眼内，口腔，植入物内/植入物上或胃肠外途径。术语“胃肠外”包括皮下，鞘内，静脉内，肌肉内，腹膜内或输液。静脉内或肌肉内途径不特别适用于长期治疗和预防。然而，在紧急情况下，它们可能是优选的。包含本发明组合物的组合物可加入到生理流体如血液中。由于患者的便利性以及给药计划，口服给药对于预防性治疗可能是优选的。胃肠外给药方式(皮下或静脉内)对于更急性的疾病是优选的，或者对于由于胃肠不耐受，肠梗阻或其它伴随的危重疾病而不能耐受肠内给药的患者的治疗是优选的。

药物组合物可组装成试剂盒或药物系统，用于快速分裂细胞，例如癌细胞的细胞周期的辅助治疗。根据本发明这个方面的试剂盒或药物系统包括一个载体装置，例如盒子，纸箱，管子，在其中具有一个或多个容器装置，例如小瓶，管子，安瓿，瓶子，注射器或袋子，所述容器装置被紧密地限制在其中。本发明的试剂盒或药物系统还可以包括使用试剂盒的相关说明。

本文提供的任何组合物或方法可与本文提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种组合。

与“包括”，“包含”或“特征在于”同义的过渡术语“包括”是包括性的或开放式的，并且不排除附加的未列举的元素或方法步骤。相反，过渡短语“基本上由将权利要求的范围限制到指定的元素或成分组成”包括排除权利要求中未指定的任何元素，步骤或成分。过渡短语“基本上由将权利要求的范围限制到指定的材料或步骤组成”和那些实质上不影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤组成。

将携氧血红蛋白作为红细胞代用品具有重要的应用和经济价值。最初采用无任何修饰的人血红蛋白，因不稳定的四聚体解聚能引发多种副作用，此后的研究多以经交联形成的稳定多聚物为开发方向。将携氧牛血红蛋白制品应用于生物治疗时必需对其残留的宿主DNA进行严格测试，以保证其安全可靠，本发明即提供了一种可快速定量检测牛血红蛋白制品中残留牛DNA的有效方法，属于分子生物学领域。

本发明公开了在牛携氧血红蛋白制品中定量检测牛(Bos taurus)来源DNA含量的核酸检测试剂盒的制备方法及其应用方法，属于分子生物学领域。牛血红蛋白本发明利用核酸制备中的磁珠富集核酸技术和探针法实时荧光定量聚合酶反应(Realtimequantitative PCR)技术结合，通过设计适宜的引物和探针序列，对从人工聚合的牛血红蛋白中纯化牛源DNA进行特异性扩增和荧光检测，从而实现对该生化药物制品主要饲料中牛源成分快速、准确的检测。

本发明通过设计针对牛基因组中单拷贝且变异很少的β-actin基因的特异性引物和独特的探针序列，在PCR反应中加入待测样本和不同浓度的牛基因组DNA标准样本，通过读取反应产生的荧光信号，绘制DNA浓度和Ct值的标准曲线，即可计算出样本中牛基因组DNA的准确含量，从而判定其是否符合要求。

因此，本发明提供了一种用携氧牛血红蛋白中基因组DNA的制备方法，可以最大程度的消除DNA制品中杂质对检测的干扰，保证很高的提取效率。另一方面，本发明设计了一组用于扩增牛基因组DNA的引物和探针组合，具体地，引物序列为Bos-ACTB-1F2：5′-TTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGG(SEQ ID NO：11)，下游引物Bos-ACTB-1R2的序列为5′-CACCACAAGGGGCAGTCG-3’(SEQ ID NO：12)，探针Bos-ACTB-P1序列为：5’-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-3’(SEQ ID NO：3)。

本发明还提供了使用这个试剂盒和引物组合进行样本检测的能力验证结果，包括检测的线性范围、敏感度、特异性以及回收率等。

具体地，本发明提供了一种牛源血红蛋白制品中牛基因组DNA的荧光定量PCR检测方法。

在一些实施方案中，其由对牛血红蛋白制品中的DNA提取过程和利用荧光定量PCR方法对提取的DNA进行扩增检测两个过程组成。

在一些实施方案中，残留DNA的磁珠提取过程中包含有特定的DNA漂洗过程，其漂洗试剂组成为100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.5，其中乙醇的浓度为75％，80％或85％，Triton X-100的浓度为0.4％，0.5％或0.6％，优选地，乙醇浓度为80％，Triton X-100的浓度0.5％。

在一些实施方案中，PCR反应由耐热的DNA聚合酶、独特设计的扩增引物和探针、dNTP混合物、PCR反应缓冲液、牛基因组标准品组成的。

在一些实施方案中，PCR反应以牛的β-actin编码基因作为扩增的目的基因，扩增产物具有如序列SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

CCGAGGTTGCTGCCAGGCGGCCTCGGAGTGTGTATTCAGTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGGGCCCCGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGCACTCTTCTGCATGTGCCCAGTCTGGCCCGACTGCCCCTTGTGGTGTCCCAGTATGACGCGGCCCATCTCTTCCTACAGATCATGTTCGAGACCTTCAACACCCCTGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGCCGCACCACCGGCATCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCACCCACACGGTGCCCATCTATGAGGGGTACGCCCTTCCCCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCTGACGGACTACCTCATGAAGATCCTCACGGAGCGTGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTCTGCTACGTGGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGCCACCGCGGCCTCCAGCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTACGAGCTTCCTGACGGGCAGGTCATCACCATCGGCAATGAGCGGTTCCGCTGCCCTGAGGCTCTCTTCCAGCCTTCCTTCCTGGGTGAGTGAGAAGGCCCGCCCTGCCTGCCCCACACGAAGGTCACCCTGTGGCCACACTGGAGGCTAAGTCTGCCTTCTCTCTCTCCCCAGGCATGGAATCCTGCGGCATTCACGAAACTACCTTCAATTCCATCATGAAGTGTGACGTCGACATCCGCAAGGACCTCTACGCCAACACGGTGCTGTCCGGCGGGACCACCATGTACCCCGGCATCGCGGACAGGATGCAGAAAGAGATCACTGCCCTGGCACCCAGCACAATGAAGATCAAGGTGAGCGCCCAGCCGTAGCCGGACGGTGCAGATAGGCGTGGTGGCTGTCAAGGCGGCTGCCTTGCTCGGGTCCCATGGGTACCGGGGAGATGACGCCAGGGCCCTCACTGCCCCCTTCTCTCTCTCTCCAGATCATCGCGCCCCCTGAGCGCAAGTACTCCGTGTGGATTGGCGGCTCCATCCTGGCCTCGCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTACGATGAGTCCGGCCCCTCCATCGTCCACCGCAAATGCTT(SEQ ID NO：1，牛β-actin片段，物种：Bostaurus)。

在一些实施方案中，扩增使用的上游引物为Bos-ACTB-1F2的序列为：5′-TTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGG(SEQ ID NO：11)，下游引物Bos-ACTB-1R2的序列为5′-CACCACAAGGGGCAGTCG-3’(SEQ ID NO：12)，探针Bos-ACTB-P1序列为：5’-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-3’(SEQ ID NO：3)。

在一些实施方案中，DNA探针5’端和3’端分别进行了化合物标记，其中5’端标记化合物选自异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)、羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro fluorescein，HEX)，3’端标记的化合物基团选自6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)和广谱荧光淬灭剂BHQ-1(Black HoleQuencher 1)。

在一些实施方案中，扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸15秒，扩增40个循环，最后72℃延伸5分钟。

在一些实施方案中，所述检测方法的用途为检测提取的牛血红蛋白α亚基、牛血红蛋白β亚基组分及经聚合反应制得的牛血红蛋白聚合物中残留的牛基因组DNA含量。

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的解释说明。

实施例1 对照用牛基因组DNA的提取

称取2g牛肉，切割小块后，进行液氮研磨后，粉末称量约1g左右。向样品加入裂解液(10mM Tris-Cl,0.1M EDTA,0.5％SDS,pH8.0)，蛋白酶K终浓度100μg/mL，水浴50℃裂解3h，期间轻轻摇动。加入等体积抽提液(苯酚：氯仿1:1)轻轻混匀，12000rpm，4℃，15min。轻轻转移上层水相至新50mL离心管。如抽提效果不好，可视情况重复抽提。向转移水相中加入1/10体积3M NaAc，等体积异丙醇，轻轻混匀后-20℃沉淀30min以上，12000rpm，4℃，离心10min，弃上清。向沉淀中加入20mL70％乙醇轻轻混合，洗涤。12000rpm，4℃，10min，弃上清。重复洗涤1-2次。风干离心管中的乙醇，适量无菌水溶解风干的DNA，电泳检测，并测定其浓度，电泳检测结果见表1和附图2。

表1 牛基因组DNA浓度测定

样品	浓度(ng/μL)	OD260/280	体积(μL)
				牛基因组DNA	935	1.8	100

实施例2 阳性对照质粒的制备

根据文献资料显示，常用的检测靶基因有ACTB,GAPDH等保守的单拷贝基因，经过序列分析和文献调研，选择ACTB基因片段为检测对象，设计了一对引物对序列分析后可能用作检测片段的部分涵盖在扩增产物之内，扩增使用的引物为Bov-ACTB-F(5’-CCGAGGTTGCTGCCAGGCGG-3’)和Bov-ACTB-R(5’-AAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’)，以提取的牛基因组DNA为模板，进行PCR，扩增产物为1166bps，扩增后的产物连入pUC19质粒载体(购自北京华大蛋白质研发中心有限公司)，对该质粒测序分析，结果见图3，序列中目标扩增序列之外的个别位点存在多态性，对实验无影响，该质粒可用做后续实验的阳性对照，该β-actin基因片段序列为SEQ ID NO：1。

实施例3 引物和探针的设计和优化

1、引物和探针设计

根据牛基因组序列，选取ACTB基因作为检测靶基因，对牛ACTB基因序列进行设计(表2)，以供Taqman探针qPCR检测样品DNA残留使用。最初设计了基因片段的三个位置和对应的引物和探针进行检测(SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：10)，所有引物设计完成后通过引物设计软件Primer premier 6计算引物和探针的退火温度，确保无明显的引物二聚体和复杂二级结构。之后通过在线分析工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行与模板序列的特异性确认。

表2 Taqman探针qPCR引物及探针序列

2、染料法qPCR体系及反应条件优化

以染料法进行扩增效率和特异性的初步测定，以便确定后期Taqman探针qPCR检测的实验条件。反应体系见表3,EvaGreen荧光染料购自上海开放生物科技有限公司(货号:31000)，其他酶和dNTPs等购自宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa Bio)。各PCR反应的条件为95℃预变性5min，之后95℃30sec，55℃-61℃退火30sec，72℃延伸15sec，进行40个循环后，最后延伸10min。

表3 荧光染料qPCR体系

组分	体积(μL)
		20×EvaGreen	1
dNTP(2.5mM)	1.6
		10×Buffer	2
正向引物F(10μM)	1
		反向引物R(10μM)	1
HS TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.1
		DNA模板(适当稀释)	1
ddH<sub>2</sub>O	12.3

通过利用梯度稀释的阳性质粒作为模板，制作标准曲线，计算每对引物，在相应Tm温度下的扩增效率，筛选出最佳引物及反应最佳条件，实验结果如下表4和附图4。

经扩增后计算出三对引物组合的扩增效率分别为105％，104％和91％，第三组效率略低。

表4 荧光染料qPCR法引物及反应条件

组合	最佳Tm温度(℃)	扩增效率	引物特异性
				1	55	105％	良好(图4左)
2	58.8	104％	良好(图4中)
				3	57.4	91％	良好(图4右)

3、Taqman探针法qPCR体系及反应条件优化

在荧光染料方法建立的反应体系及最佳反应条件基础上对Taqman探针法qPCR反应进行调整，以提高Taqman探针法qPCR的扩增效率，进而提高样品检测的灵敏度。实验使用Taqman探针法qPCR反应体系，除，扩增使用的TaqMan^TM Genotyping Master Mix购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司Thermo公司，货号4371353，其余引物、探针、DNA模板等为本单位自制，反应体系见表5。各PCR反应的条件为95℃预变性5min，之后95℃30sec，55℃-61℃退火30sec，72℃延伸15sec，进行42个循环后，最后延伸10min。

表5 Taqman探针法qPCR反应体系

利用梯度稀释的阳性质粒作为模板，制作标准曲线，计算每对引物及探针，在相应Tm温度下的扩增效率，筛选出最佳引物及探针反应最佳条件。

经扩增后计算出三对引物组合(组合1、组合2、组合3)探针法扩增效率依次为87％，96％和77％。可知，第三组引物和探针扩增效率较低，不能满足使用要求，淘汰该组引物对，选取组合1和组合2继续优化检测，退火温度Tm55-58.8℃。

4、引物探针组合1和2的特异性测试

为了确定引物及探针的物种特异性，我们以人(Homo sapiens)基因组，小鼠(Musmusculus)基因组和牛(Bos taurus)基因组作为模板扩增，人和鼠基因组DNA的制备由北京华大蛋白质研发中心有限公司提供的人HEK293细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)，参照其说明书进行细胞基因组DNA制备。对1号和2号引物探针组合(1号引物探针组为SEQ ID NO：2,SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4；2号引物探针组为SEQ ID NO：5,SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)的物种特异性进行测试，扩增效率见表6，这两对引物对于人和小鼠的都没有扩增信号，表明引物具有良好的特异性，结果见表6。引物组合1的扩增效率为93％，引物探针组合2的扩增效率为107％，引物探针组合2效率高一些，后续实验需考察其扩增中的非特异干扰。引物探针组合1效率略低，但特异性良好，后续实验可以在保留探针序列基础上，对引物序列进行调整，并进行进一步测试。

表6 两组引物及探针的物种特异性结果

物种	引物探针组合1	引物探针组合2
			牛(Bos taurus)	93％	107％
人(Homo sapiens)	-	-
			鼠(Mus musculus)	-	-

备注：-表示没有扩增信号。

4.1、引物探针组合2的最低检测限

在以阳性质粒为模板的检测限和本底干扰实验中，将阳性质粒按照100ng/μl开始10倍连续稀释到0.001pg/μl，反应条件见表7。扩增结果的Ct值-模板浓度曲线见图5。

可见，引物探针组合2在扩增中对于浓度低于0.01ng/μL时扩增效率下降很快，且对于无模板对照(NTC)在Ct为33之后也会出现扩增信号，表明2号引物对虽然扩增效率略高，但可能形成非特异扩增，在低浓度时干扰结果，降低检测敏感度，因此淘汰引物探针组合2。

表7 Taqman探针法qPCR反应体系

组分	体积(μL)
		Taqman genotyping master mix	10
各组正向引物F(10μM)	1
		各组反向引物R(10μM)	1
对应探针(10μM)	1
		DNA模板(适当稀释)	1
ddH<sub>2</sub>O	6

4.2、引物探针组合1-1的最低检测限

如前所述，虽引物探针组合1的效率相比引物探针组合2略低，但特异性良好，因此，对引物序列进行微调(如下表8所示)，将扩增产物的长度延长至100bps左右，尝试缩短上游引物3’端与标记探针5’端荧光标记碱基的距离至2个核苷酸，下游引物的调整至与人基因序列差异更大的位置，目的是在提高扩增产物物种特异性的基础上，保持探针固有的高度结合特性，利用增强的探针5’端酶切效率增加检测信号强度，最终提高检测的敏感度。为与原引物探针组合1区别，新引物命名为Bov-ACTB-1F2和Bov-ACTB-1R2，探针未变，得到引物探针组合1-1。

表8 调整后的引物探针组合1-1的Taqman探针qPCR引物及探针序列

同上，在以阳性质粒为模板的检测限和本底干扰实验中，将阳性质粒按照100ng/μl开始10倍连续稀释到0.001pg/μl，反应条件同上表7。扩增结果的Ct值-模板浓度曲线见图6。

对修订的引物探针组合1-1(SEQ ID NO：11,SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：3)的测试表明，其Ct值-模板浓度曲线(图6)中对于浓度低于0.0001pg/μl的模板可以有效检出，线性良好，且无模板对照(NTC)始终无扩增信号，表明特异性、敏感度和线性都符合要求，至此，通过特异性、扩增效率和扩增敏感度的测试，筛选确定了本方法使用的引物和探针组合，即为引物探针组合1-1。

综上可知，利用本发明的引物探针组合1-1进行测试，阳性质粒线性范围最低可达10^-7ng/μL(0.0001pg/μL)，即最低检测为1×10^-7ng/μL，相当于牛基因组DNA最低限为0.1ng/μL。由于阳性质粒大小(约3kb)与牛基因组大小(2.98Gb)，相差百万倍，按照摩尔浓度推算，阳性质粒10^-6ng/μL(0.001pg/μL)等摩尔浓度的基因组牛DNA浓度为1ng/μL。

实施例4 样品DNA制备方法和优化

对于牛基因组DNA的制备，常规血液、细胞或组织样本，例如牛肉样本，可以利用常规的动物样本基因组DNA制备方法或商品化试剂盒制备，如实施例1中对牛肉中DNA的提取，柱离心式方法可以获得可满足要求质量的DNA，但对于药物蛋白残留DNA的提取并不能奏效，以同样方法提取牛血红蛋白制品(实施例6制备的牛血红蛋白制品)中的DNA因对高浓度蛋白样本中残留成分去除不净，产生了严重的PCR反应抑制。表9结果说明了该方法提取物中的抑制效应，采用引物探针组合1-1，按照表5的组成进行扩增，在不加入该法DNA提取物的100ng含量牛基因组模板扩增时，Ct值为25.77，加入制备的DNA产物后没有扩增出现，且将此制备物稀释十倍后有扩增出现，表明制备物中存在严重的PCR抑制物质。

表9 柱离心纯化法样本提取的扩增结果

备注：Sample指的样本命名，Sample-A指的是用柱离心法提取的样品。

鉴于常规手工提取和使用天根柱离心式基因组DNA提取方法制备样本中残留DNA带来的杂质对PCR反应的抑制和提取效率不足，改用磁珠纯化方式提取样本DNA，起始方法依照产品说明书方法进行。

具体为，天根生化科技(北京)有限公司DP705-1磁珠试剂盒进行，取250μL血液样品至2ml离心管中，加入20μL Proteinase K溶液和300μL裂解液GHL，振荡混匀，75℃裂解15min，期间颠倒混匀3回，每回5次；加入300μL异丙醇，振荡混匀10sec，加入15μL磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min(注意：为了确保磁珠彻底重悬，请在使用前振荡混匀)；将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体；之后加入900μL缓冲液GDZ(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀2min。将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。加入500μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min。将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。将离心管从磁力架上取下，加入900μL漂洗液PWD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，振荡混匀2min。将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心吸去液体。将离心管从磁力架上取下，加入300μL漂洗液PWD，振荡混匀2min。将离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，小心地吸去液体。将离心管于磁力架上，室温晾干10-15min(乙醇残留会抑制后续的酶反应，所以晾干时要确保乙醇挥发干净。但也不要干燥太长时间，以免难以洗脱DNA)将离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次。将离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心将DNA溶液转移至一个新离心管中，并于适当条件保存。

以上为试剂盒说明。估测样本中DNA含量极低，以2ml样本起始制备，裂解消化富集过程溶液按比例增加，漂洗过程按照试剂盒说明进行，加入洗脱体积为30μL，以此方法制备的基因组核酸样本命名为Sample-B。样本检测的结果见表10，结果表明核酸样本对PCR仍有抑制，难以检出0.01pg的质粒DNA样本，此时对应基因组DNA为10ng，不能满足使用要求。

表10 第一次样本制备优化的检测结果

因对扩增造成的污染主要因样本残留不明物质引起，按照蛋白样本制备流程和原料成分推测，这些残留物质可能是蛋白、血色素、金属离子或其复合物。为此，发明人为改善牛血红蛋白制品中特定杂质对扩增反应的干扰，尝试了不同的漂洗液，增加洗涤的强度，去除色素和参与蛋白的干扰。在改进的提取过程中，对NaCl浓度为代表的总盐浓度和非离子型去污剂Triton X-100进行了浓度实验。

常规PCR中，在某些情况下，可在缓冲液中加入化学添加剂或辅助溶剂，通过减少错配来提高扩增特异性，并通过去除二级结构来提高扩增效率。但是，应注意，使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、Mg²⁺结合以及酶活性。同时，它们还会干扰某些下游应用——例如，基因芯片实验中的非离子去污剂的干扰。因此，为了成功进行PCR扩增和下游实验应用，应慎重考虑缓冲液组成成分及其浓度。常规化学添加剂或辅助溶剂及其推荐浓度如下表11所示。

参见文献：Bartlett JMS,Stirling D(2003)PCR Protocols.In:Methods in molecular biology(2nd ed).Totowa：Humana Press，

或者，参见如下网址：

https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/cloning/cloning- learning-center/invit rogen-school-of-molecular-biology/pcr-education/pcr- reagents-enzymes/pcr-component-consider ations.html

表11 用作PCR增强剂的常见添加剂或辅助溶剂，以及其建议终浓度。

由上述内容可知，在常规PCR中，Tritonx-100的推荐浓度为0.05-0.1％，因为高浓度去污剂会干扰Taq DNA聚合酶的功能等。因此，按照常规理解，如果用于漂洗样本的溶液中含有浓度高于0.05-0.1％的Tritonx-100，必定会有部分残留，进而可能造成对扩增的干扰。

然而，本申请发明人为提高DNA得率，降低样本中残留物干扰，并稳定PCR反应，将漂洗液中NaCl的浓度调整为100mM，同时突破性地将Triton X-100的浓度调高至0.5％，使用本发明提供的漂洗液(组成为100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.5，乙醇的浓度为80％，Triton X-100的浓度为0.5％)进行两次漂洗，每次250μL，制备出基因组DNA样本Sample-C，以染料法进行预实验扩增，结果见表12。

由表12可知，此时样品原液可测出Ct值为39.51，稀释12.5倍和25倍后Ct值依次为39.87和39.84，表明此时数值为系统本底所致，Ct值高于36，判定为不可检出，此稀释度下的对0.01pg和0.001pg质粒加标回收测定值影响甚微，可以确定样本制备方法已对检测结果没有干扰，与原漂洗液实验方案相比，原漂洗液配方不可检出0.01pg掺入的质粒，改良漂洗液可以稳定检测出0.001pg掺入的质粒，消除了样本带入的基质效应，实现了检测样本敏感度的明显提升。

另外，本发明提供的漂洗液中的Triton X-100的浓度为0.4％或0.6时，可以实现与Triton X-100的浓度为0.5％时同样的检测敏感度。

表12 第二次样本制备优化的检测结果

实施例5 引物和探针的性能检测

按照实施例3优化后的方法制备一批新的牛血红蛋白样本DNA，起始样本量为2ml，同时分别将10ng、100ng和1000ng阳性质粒加入2ml纯水中作为回收率检测样本，用最终优化的样本制备方法分别对阳性质粒样本进行DNA提取。对于提取的牛血红蛋白样本中DNA命名为Sample-C。将Sample-C和回收样本分别取2μl作为模板扩增，对于回收的阳性质粒样本增加一个稀释10倍后加2μl的扩增反应以观察其线性，计算回收率。此次阳性质粒扩增的标准曲线(Ct-浓度曲线)见图7，各样本扩增的Ct值和计算的浓度见表13。

表13 样本检测结果

由各浓度加标回收实验结果知，在曲线中部靠后(低浓度条件下)回收率从74％-136％，属于较理想范围，样本稀释10倍检测的线性范围也符合预期，靠近高浓度样本时，测定受Ct值影响而增加，超出标曲范围时，回收率测定数值仅供参考。制备的牛血红蛋白样本中DNA样本测定的Ct值为38.95，落于标曲之外，浓度远低于0.0001pg/μl，可以定为不可检出(在推测的情况下，其计算浓度为0.0000127pg质粒DNA/ml样本，折合基因组DNA浓度为12.7pg gDNA/ml，按照每剂量残留不超过100pg gDNA的要求，容许的最大样本量为8ml)。

实施例6 用于小批量戊二醛聚合牛血红蛋白的制造工艺和工艺控制

血红蛋白序列

在一些实施例中，由本稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含亚单位α(α)，其中亚单位α包含以下氨基酸序列：

1 MVLSPADKTN VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL ERMFLSFPTT KTYFPHFDLS HGSAQVKGHG

61 KKVADALTNA VAHVDDMPNA LSALSDLHAH KLRVDPVNFK LLSHCLLVTL AAHLPAEFTP

121 AVHASLDKFL ASVSTVLTSK YR

(SEQ ID NO:13).

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，该亚单位α包含氨基酸序列，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:13的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，该亚单位α包含与SEQ ID NO:13的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由以下核酸序列编码：

(SEQ ID NO:14).

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:14序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位α，其中亚单位α由与SEQ IDNO:14的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β(β)，其中亚单位β包含以下氨基酸序列：

1 MVHLTPEEKS AVTALWGKVN VDEVGGEALG RLLVVYPWTQ RFFESFGDLS TPDAVMGNPK

61 VKAHGKKVLG AFSDGLAHLD NLKGTFATLS ELHCDKLHVD PENFRLLGNV LVCVLAHHFG

121 KEFTPPVQAA YQKVVAGVAN ALAHKYH

(SEQ ID NO:15).

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，该亚单位β包含氨基酸序列β，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:15的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，该亚单位β包含与SEQ ID NO:15的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由以下核酸序列编码：

(SEQ ID NO:16).

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位α由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:16序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由与SEQ IDNO:16的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ(γ)，其中亚单位β包含以下氨基酸序列：

1 MGHFTEEDKA TITSLWGKVN VEDAGGETLG RLLVVYPWTQ RFFDSFGNLS SASAIMGNPK

61 VKAHGKKVLT SLGDAIKHLD DLKGTFAQLS ELHCDKLHVD PENFKLLGNV LVTVLAIHFG

121 KEFTPEVQAS WQKMVTGVAS ALSSRYH

(SEQ ID NO:17).

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，该亚单位γ包含氨基酸序列γ，该氨基酸序列与序SEQ ID NO:17的序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，该亚单位γ包含与SEQ ID NO:17的序列具有至少90％的同源性的氨基酸序列。

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位β由以下核酸序列编码：

(SEQ ID NO:18).

在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位γ，其中亚单位γ由具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％与SEQ ID NO:18序列相同性的核酸序列编码。在一些实施例中，血红蛋白包含亚单位β，其中亚单位β由与SEQ IDNO:18的序列具有至少90％相同性的核酸序列编码。

采血

牛血得自青岛润伟牛业有限公司的养殖场(图8为养殖场实景图)。通过其记载的健康计划连续观察动物。通过颈静脉进行牛血采集，首先确认内部识别耳标和动物卫生疾病防疫中心配备的防疫耳标是否齐全，同时符合牛只健康标准，达到要求后方可进行后续采血。按要求，每头成牛每次最多可以采集3L血液。采血前要清理牛舍粪便、尿液，保持圈舍、牛体干净卫生，以免污染采血部位和血样。接着将牛赶进保定栏，助手保定好牛头部，使头部稍前伸上仰并稍偏向对侧，颈部稍有弯曲，颈静脉暴露出来，局部剪毛，用碘伏棉球沿颈静脉向牛身方向擦拭消毒，操作人穿戴好防护用品，稍弯腰蹲于颈静脉暴露的一侧，用左手拇指或食指与中指在颈静脉沟稍下方(近心端)压迫静脉管，促使颈静脉怒张，部分牛由于膘肥看不清，此时就要用左手食指和中指点击颈静脉沟，有跳动，再按压，用右手食指和中指探摸跳动的部位，有波动和弹性的管状物为颈外静脉。右手拇指、食指、中指夹住16#针头，对准颈外静脉，依靠腕力把针头朝静脉方向快速地垂直刺入，当刺入静脉内立见回血，打开采血袋上流速夹，使血液流入采血袋。若针头偏离静脉(未见回血)，可将针头稍稍退出或拔至皮下，在认清静脉走向后重新刺入。若血液滴出量较少或速度较慢，可用手指按压颈静脉中下端片刻即可。采血过程中，要把血袋放在摇床上以充分混匀血液和抗凝剂。采血完毕，先松左手，后迅速拔出针头，用碘酊棉球按压针孔片刻止血。血袋装满后(图9采集的牛血实景图)，压紧流速夹，稍冷后放入冷藏箱保存。

细胞洗涤

按照图10所示的方法洗涤收集的血液。在24小时内，使用蠕动泵把收集的3-5升(L)血液转移到单个Mobius 5L柔性袋(T100)中。在无菌混合罐中制备50L柠檬酸钠溶液(7.9g/L氯化钠和6.0g/L柠檬酸钠二水合物)，并通过10kDa膜过滤器进入50L柔性袋(T101)中进行除热原。以200mL/min的流速将柑桔化的血液泵入静态在线混合器，同时与柠檬酸钠溶液以280mL/min的流速混合，将该混合物导入连续的0.6μm和0.4μm深度过滤膜并进入20L柔性袋(T102)。当袋T102包含5L过滤的血液时，洗涤过程通过以1L/min的速率通过0.2μm中空纤维膜的再循环而开始将跨膜压力调节到15psi，允许平均渗透液流速为300mL/min。通过渗滤，将柠檬酸钠溶液以300mL/min的流速泵入袋T102中来启动细胞洗涤并连续进行，直到用7倍体积洗涤细胞。将渗滤渗透物导入50L柔性废物袋(T103)中。渗滤连续进行，直到收集相当于7个血容量的渗出液。用于细胞洗涤过程的部件的例子列于下表14中。

表14

该方法的一个替代方案是使用较大规模的设备进行该步骤，或者安装离心机并在25L下进行C500步骤从而使袋能够适合于在25L下进行。电流设置被设计成将罐(袋的尺寸)限制在50L以适合一个可移动的支架。

细胞分离

方法1：离心法

在百级环境下将洗涤的牛血转移至碱液去内毒素及高压灭菌的离心瓶，配平离心瓶，拧紧瓶盖，放入离心机(C098)中开始离心。离心条件为：离心力12500xG，温度10℃，时间25min。注意离心结束后让离心机自然降速。离心瓶下层是红细胞，上层为血浆，中间一薄层较致密的白膜为白细胞。使用蠕动泵(P098)和灭菌L/S 24管将上清液从每个瓶中泵入废液瓶中；用CSB(7.9g/l氯化钠和6.0g/l二水合物柠檬酸钠)重悬红细胞以获得最终浓度为12-16g/dL的血红蛋白。将重悬的细胞转移到20L柔性袋(T098)中。用于离心法细胞分离的部分实例列于下表15。

表15

方法2：膜过滤法

用无菌的CSB(7.9g/l氯化钠和6.0g/l二水合物柠檬酸钠)通过蠕动泵(P096)充分润洗白细胞过滤膜(L099)使电导与pH与CSB保持一致。组装碱液去热原的胶管并高压湿热灭菌，连接白细胞过滤膜，现场试验探索见实图11，取洗涤牛血连接到过滤膜进液口，用蠕动泵(P099)控制进液压力，使过滤压力不超过20Kpa，同时检测滤过端白细胞含量的变化，当白细胞去除率低于98％时，停止过滤并更换新的滤膜，滤过液收集到20L软性袋(T099)中，如图12所示。尝试的几种不同型号的白细胞去除膜的效果见表16，在初始过滤时，白细胞去除率都在99％以上。用于膜过滤法细胞分离的部分实例列于下表17。

表16

表17

WBC:白细胞，RBC：红细胞，HGB：血红蛋白，PLT：血小板

方法3：溶出法

用无菌的20mOsm CSB缓冲液经过蠕动泵或离心泵充分润洗截留红细胞等大颗粒的0.65μm或100KD滤膜(L100)使电导与pH与CSB保持一致，现场试验探索见图13。取洗涤的牛血(T100)连接到滤膜(L100)进液口，用蠕动泵或离心泵(P094)控制进液压力，使过滤压力不超过20Kpa。通过蠕动泵或离心泵(P095)向洗涤的牛血加入无菌的20mOsm CSB并持续搅拌以溶出血红蛋白，同时监测红细胞保持完整的状态，开启蠕动泵或离心泵经过滤膜循环透过溶出的血红蛋白，收集到20L软性袋(T100)直至收率大于95％，通过蠕动泵(P093)用30KD的滤膜(L097)浓缩血红蛋白溶液至10-14g/dl，如图14所示。用于溶出法细胞分离的部分实例列于下表18.

表18

细胞裂解

当细胞由于渗透压的迅速降低而溶解时，血红蛋白从牛红细胞中释放出来。在100kDa和30kDa膜上进行细胞裂解和顺序渗滤，如图15所示。以250mL/min的流速将抗凝化的全血泵入静态混合器同时以250mL/min的流速加入注射用水，装入10L柔性袋(T105)中。当用2.0-2.5L稀释的全血填充T105时，以1000mL/min的流速通过100kDa的中空纤维膜盒(F103)开始再循环将渗透物导入5L柔性袋(T106)。当1.0-1.5L渗透液在T106中积聚时，以1000mL/min的流速开始通过30kDa膜(F104)的再循环F104，渗透物为废物。当全血体积(T102)小于250mL时，停止泵104和105。然后通过以例如250mL/min的流速将WFI直接泵入T105来开始渗滤并持续直到100kDa渗透液中的血红蛋白浓度小于0.2mg/mL相应于大约25-30L的渗滤体积。用于细胞裂解过程的部分实例列于下表19。

表19

血红蛋白溶液的脱氧

通过除去氧来稳定血红蛋白溶液，并使用图16所示的方法过滤脱氧以作为中间体储存。最初，以500mL/min的流速将血红蛋白溶液泵送通过两个串联排列的液相脱气膜在75psi下氮气逆流流动。继续脱氧直到溶解氧读数低于0.02mg/mL。当实现充分脱氧时，通过泵送0.3μM和两个0.22μM深度的过滤器将血红蛋白溶液过滤到5L柔性袋中。过滤后的血红蛋白在进一步加工前可保存多达2周。用于血红蛋白过滤-脱氧工艺的部件的实例列于下表20。

表20

层析

层析用于进一步纯化血红蛋白溶液和减少非特异性血细胞组分(图17所示的方法)。这使用配备有填充有快流速Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare)的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm I.D.×100cm长)的赛谱SCG层析系统进行，床高为70±5cm。使用注射用水制备缓冲液，并通过10kDa膜过滤以进一步降低热原含量。缓冲液为:(1)缓冲液A；2.42g/L Tris碱，调节至pH9.0±0.1，(2)缓冲液B；6.05g/LTris碱，调节至pH7.0±0.1(3)缓冲液C；2.42g/L Tris碱，调节至pH8.9±0.1。

在层析操作之前，通过新鲜填充的Q琼脂糖柱进行5个完整的缓冲循环。以125mL/min的流速进行层析。血红蛋白溶液，1L含130±10mg/mL血红蛋白，首先将血红蛋白加载到柱上，然后通过加入等体积的缓冲液A和缓冲液B形成pH梯度，通过280nm处的UV吸光度测量从柱上洗脱的蛋白质。当洗脱液的吸光度低于0.05Au时，通过用100％缓冲液B洗脱来增加柱pH。当吸光度达到0.43Au时，血红蛋白级分被收集到20L柔性袋(T111)中，当吸光度降到0.05Au以下时，血红蛋白级分终止。在洗脱血红蛋白之后，3L缓冲液C被泵送通过柱以洗脱紧密结合的组分。

在每次色谱操作之间用0.2N磷酸，随后用两个完全缓冲循环清洗柱子。如果在24小时内不启动另一次操作，则将柱子储存在0.2N磷酸中。用于色谱方法的部件的实例列于下表21中。

表21

脱氧

对纯化的血红蛋白进行脱氧以增加稳定性，如图18A、图18B所示。将来自阴离子交换层析步骤的纯化级分浓缩至10±1mg/mL通过30kDa的中空纤维膜(F110)超滤。当达到所需的血红蛋白浓度时，纯化的血红蛋白通过以500mL/min的流速通过两个串联排列的脱气膜(F108，F109)进行在75psi下氮气逆流流动下脱氧。连续脱氧直到溶解氧读数低于0.02mg/mL。

随后通过泵送通过30kDa的中空纤维膜(F110)，将脱氧的纯化血红蛋白渗滤达到6体积的储存缓冲液中。所述储存缓冲液的组成为2.63g/L十二水合磷酸三钠，7.0g/L七水合磷酸氢二钠和2.0g/L乙酰半胱氨酸。当缓冲液交换完成时，通过泵送通过0.5μM和两个0.22μM深度过滤器将溶液过滤到5L柔性袋(T113)中。纯化的血红蛋白可在室温(17-23℃)下在氮气手套箱中储存达60天，然后进一步处理。用于脱氧工艺的部件的实例列于下表22中。

表22

聚合

纯化的血红蛋白通过使用图19A所示的方法与戊二醛交联而聚合。在氮气压力下，将纯化的血红蛋白(4-5L，110g/L)从储罐(T113)转移到20L温控波动袋(T603)中。将注射用水通过纯化的血红蛋白转移管线泵入T603中，以将血红蛋白浓度降低到20g/L。然后将稀释的血红蛋白溶液的温度升高到42±2℃。在温控波动包(T602)中制备浓度为6.2g/L的戊二醛溶液，并加热至42±2℃。戊二醛溶液在50min时间泵入T603中，直到戊二醛与血红蛋白的比率约为0.037:1。戊二醛通过再循环回路中的静态混合器(M601)加入，以确保与血红蛋白溶液的快速和均匀混合。当戊二醛的加入完成时，将反应混合物的温度冷却至25℃以下，并通过30kDa中空纤维膜(F601)渗滤将溶液浓缩至60-70g/L的血红蛋白浓度。

戊二醛-交联血红蛋白键通过用硼氢化钠还原来稳定，如图19B所示。硼氢化钠在中性pH的水溶液中分解形成氢和硼酸钠。进行聚合血红蛋白与硼酸钠缓冲液的渗滤，以稳定硼氢化钠并限制氢气的形成。硼酸盐缓冲液由4.58g/l十水合硼酸钠和0.91g/l氢氧化钠组成。

通过10kDa膜过滤缓冲液以降低热原含量，并储存在20L柔性袋(T605)中。硼酸盐缓冲液首先以1000mL/min的流速通过再循环回路泵入T603。同时，通过以250mL/min的流速泵送通过30kDa中空纤维膜渗滤聚合的血红蛋白溶液。硼酸盐添加流速被调节到等于渗滤渗透速率的流速，约250mL/min。继续用硼酸盐缓冲液渗滤，直到加入相当于聚合血红蛋白溶液体积的3倍。

硼氢化钠溶液由9.45g/l硼氢化钠，4.58g/l十水合硼酸钠和0.91g/l氢氧化钠组成。通过10kDa膜过滤该溶液以降低热原含量，并储存在2L柔性袋(T606)中。首先硼氢化钠溶液(0.6L)以7mL/min的流速通过再循环回路泵入T603，T603的温度控制在25℃以下。

稳定的聚合血红蛋白溶液在30kD超滤膜(F601)上浓缩血红蛋白至100±5g/L。通过用透析过滤溶液A(6.67g/l氯化钠，0.30g/l氯化钾，0.20g/l二水合氯化钙，0.445g/l氢氧化钠，2.02g/l N-乙酰-L-半胱氨酸，3.07g/l乳酸钠，pH＝4.9-5.1)通过30kD超滤膜(F601)对聚合血红蛋白进行透析过滤，除去含硼组分(硼酸钠/硼氢化钠)并将pH降至8.0-8.4。用于聚合方法的部件的实例列于下表23。

表23

无菌过滤

将最终聚合的血红蛋白溶液通过0.5μM过滤器，消毒级0.2μM过滤器和第二消毒级0.2μm过滤器过滤到20升软性袋中。散装保存袋在氮气下保存直到使用。

终产品软性袋灌装

结合图20所示，本实施例的无气体残留灌装装置，包括罐体1、惰性气源2、真空泵3、T形管道4和灌装袋5。其中，T形管道4由罐体段41、气源段42和真空段43组成，并且T形管道4的三个自由端分别与罐体1、惰性气源2和真空泵3连接，同时在三个自由端的端口位置还分别设有第一截止开关61、第二截止开关62和第三截止开关63。罐体1内存储有灌装液，灌装袋5与真空段43连通。

结合图20所示，采用本实施例的无气体残留灌装装置进行无基质血红蛋白产品灌装操作的具体步骤为：步骤S1，关闭第一截止开关61和第三截止开关63，开启第二截止开关62，通过气源段42将惰性气体引入T形管道4和灌装袋5中，使惰性气体充满T形管道4和灌装袋5；步骤S2，关闭第二截止开关62，开启第三截止开关63和真空泵3，利用真空泵3将T形管道4和灌装袋5内的惰性气体全部排空，并依次重复步骤S1和步骤S2的操作三次后，将T形管道4和灌装袋5内抽至0.1Mpa以上的真空状态；步骤S3，开启第一截止开关61，关闭第二截止开关62和第三截止开关63，使罐体1中的无基质血红蛋白产品经过罐体段41和真空段43流至灌装袋5内，完成对无基质血红蛋白产品的无气体残留灌装操作，灌装产品见图21。

实施例7 制备过程的描述和批量制备戊二醛交联牛血红蛋白的过程控制

戊二醛交联牛血红蛋白原料药的制备过程包括以下主要步骤：

血红蛋白序列同源性

在一些实施例中，由本稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含亚单位α(α)，其中亚单位α人与牛氨基酸序列同源性为88％(参见图22A)：

其中：

Human alpha的氨基酸序列如下：

VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGK

KVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPA

VHASLDKFLASVSTVLTSKYR

(SEQ ID NO：19)。

Bovine alpha的氨基酸序列如下：

VLSAADKGNVKAAWGKVGGHAAEYGAEALERMFLSFPTTKTYFPHFDLSHGSAQVKGHGA

KVAAALTKAVEHLDDLPGALSELSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHSLLVTLASHLPSDFTPA

VHASLDKFLANVSTVLTSKYR

(SEQ ID NO：20)。

在一些实施例中，由本稳定血红蛋白溶液组成的血红蛋白包含亚单位β(β)，其中亚单位β人与牛氨基酸序列同源性为85％(参见图22B)：

其中：

Human beta的氨基酸序列如下：

LTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKA

HGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEF

TPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH

(SEQ ID NO：21)。

Bovine beta的氨基酸序列如下：

LTAEEKAAVTAFWGKVKVDEVGGEALGRLLVVYPWTQRFFESFGDLSTADAVMNNPKVKA

HGKKVLDSFSNGMKHLDDLKGTFAALSELHCDKLHVDPENFKLLGNVLVVVLARNFGKEF

TPVLQADFQKVVAGVANALAHRYH

(SEQ ID NO：22)。

表24氨基酸位点修饰

采血

牛血得自润伟青岛牛业有限公司的养殖场。通过其记载的健康计划连续观察动物。通过颈静脉进行牛血采集，首先确认内部识别耳标和动物卫生疾病防疫中心配备的防疫耳标是否齐全，同时符合牛只健康标准，达到要求后方可进行后续采血。按要求，每头成牛每次最多可以采集3L血液。采血前要清理牛舍粪便、尿液，保持圈舍、牛体干净卫生，以免污染采血部位和血样。接着将牛赶进保定栏，助手保定好牛头部，使头部稍前伸上仰并稍偏向对侧，颈部稍有弯曲，颈静脉暴露出来，局部剪毛，用碘伏棉球沿颈静脉向牛身方向擦拭消毒，操作人穿戴好防护用品，稍弯腰蹲于颈静脉暴露的一侧，用左手拇指或食指与中指在颈静脉沟稍下方(近心端)压迫静脉管，促使颈静脉怒张，部分牛由于膘肥看不清，此时就要用左手食指和中指点击颈静脉沟，有跳动，再按压，用右手食指和中指探摸跳动的部位，有波动和弹性的管状物为颈外静脉。右手拇指、食指、中指夹住16#针头，对准颈外静脉，依靠腕力把针头朝静脉方向快速地垂直刺入，当刺入静脉内立见回血，打开采血袋上流速夹，使血液流入采血袋。若针头偏离静脉(未见回血)，可将针头稍稍退出或拔至皮下，在认清静脉走向后重新刺入。若血液滴出量较少或速度较慢，可用手指按压颈静脉中下端片刻即可。采血过程中，要把血袋放在摇床上以充分混匀血液和抗凝剂。采血完毕，先松左手，后迅速拔出针头，用碘酊棉球按压针孔片刻止血。血袋装满后(图9采集的牛血实景图)，压紧流速夹，稍冷后放入冷藏箱保存。

细胞洗涤

按照图23所示的方法洗涤收集的血液。使用蠕动泵将在24小时内收集的15-20L血液转移到一个20L备用回路柔性袋(T100)中。在无菌混合罐中制备200L柠檬酸钠溶液(7.9g/l氯化钠和6.0g/l二水合物柠檬酸钠)，并通过10kDa膜过滤器进入200L超低密度聚乙烯(ULDP)一次性使用袋(T101)中进行除热原。以500mL/min的流速将抗凝化的血液泵入静态在线混合器，同时加入流速为700mL/min的柠檬酸钠溶液，将该混合物顺序通过0.6μM和0.4μM过滤膜并导入50L ULDP一次性使用袋(T102)中。当袋T102包含10L过滤的血液时，洗涤过程通过以2L/min的速率通过0.2μM中空纤维膜再循环，开始将跨膜压力调节到15psi，允许平均渗透液流速为500mL/min。通过渗滤作用，以500mL/min的流速将柠檬酸钠溶液泵入袋T102中来启动细胞洗涤，并继续进行，直到用7倍渗滤体积洗涤细胞。将渗滤渗透物导入200L ULDP一次性使用袋(T103)中。渗滤继续进行，直到收集相当于7个血容量的渗出液。

用于细胞洗涤过程的部件的实例列于下表25中，用于细胞洗涤过程中测试的部件的实例列于下表26中。

表25

表26

细胞分离

方法1：离心法

在百级环境下将洗涤的牛血转移至碱液去内毒素及高压灭菌的离心瓶，配平离心瓶，拧紧瓶盖，放入离心机(C098)中开始离心。离心条件为：离心力12500xG，温度10℃，时间25min。注意离心结束后让离心机自然降速。离心瓶下层是红细胞，上层为血浆，中间一薄层较致密的白膜为白细胞。使用蠕动泵(P098)和灭菌L/S 24管将上清液从每个瓶中泵入废液瓶中；用CSB(7.9g/l氯化钠和6.0g/l二水合物柠檬酸钠)重悬红细胞以获得最终浓度为12-16g/dL的血红蛋白。将重悬的细胞转移到20L柔性袋(T098)中。采集细胞样本并检测总Hb、免疫球蛋白G(IgG)浓度、白细胞含量和血小板含量，用于离心分离细胞过程中测试的部件的实例列于下表27中。

表27

方法2：膜分离法

用无菌的CSB(7.9g/l氯化钠和6.0g/l二水合物柠檬酸钠)通过蠕动泵(P096)充分润洗白细胞过滤膜(L099)使电导与pH与CSB保持一致。组装碱液去热原的胶管并高压湿热灭菌，连接白细胞过滤膜，取洗涤牛血连接过滤膜进液口，用蠕动泵(P099)控制进液压力，使过滤压力不超过20Kpa，同时检测滤过端白细胞含量的变化，当白细胞去除率低于98％时，停止过滤并更换新的滤膜，滤过液收集到20L软性袋(T099)中。尝试的几种不同型号的白细胞去除膜的效果无明显差别，在初始过滤时，白细胞去除率都在99％以上。用于膜分离细胞过程中测试的部件的实例列于下表28中。

表28

方法3：溶出法

用无菌的20mOsm CSB缓冲液经过蠕动泵或离心泵充分润洗截留红细胞等大颗粒的0.65μm或100KD滤膜(L100)使电导与pH与CSB保持一致，现场试验探索见图13。取洗涤的牛血(T100)连接到滤膜(L100)进液口，用蠕动泵或离心泵(P094)控制进液压力，使过滤压力不超过20Kpa。通过蠕动泵或离心泵(P095)向洗涤的牛血加入无菌的20mOsm CSB并持续搅拌以溶出血红蛋白，同时监测红细胞保持完整的状态，开启蠕动泵或离心泵经过滤膜循环透过溶出的血红蛋白，收集到20L软性袋(T100)直至收率大于95％，通过蠕动泵(P093)用30KD的滤膜(L097)浓缩血红蛋白溶液至10-14g/dl。用于溶出法过程中测试的部件的实例列于下表29中。

表29

细胞裂解

红细胞通过离心从白细胞和血小板中分离出来，当细胞由于渗透压的迅速降低而溶解时，血红蛋白从红细胞中释放出来，如图24所示。将洗涤过的血细胞泵入在13，500×g离心力下操作的管式碗离心机(C201)中。包含在重相中的红细胞被引导通过静态混合器(M202)，在那里它们被注射用水稀释2倍，并进入20L GE Ready回路柔性袋(T202)。当用至少10L稀释的全血填充T202时，以1000mL/min的流速通过100kDa的中空纤维膜(F201)开始再循环。该渗透物被引导至20L GE Ready回路柔性袋(T203)。当15L渗透液在T203中积聚时，以1000mL/min的流速开始通过30kDa膜(F202)进行再循环。F202渗透物是废液。通过100kDa(F201)的渗滤继续进行，直到渗透物中的血红蛋白浓度低于0.2mg/mL，表明大部分释放的血红蛋白已经被提取。这对应于大约15-20渗滤体积。通过100kDa的过滤从细胞碎片中分离出的血红蛋白通过对30kDa的膜过滤而浓缩。100kDa和30kDa的步骤在连续方法中进行。当血红蛋白浓度在90-10g/L范围内时，停止30kDa的过滤。

用于细胞裂解过程的部分的实施例列于下表30，用于细胞裂解过程中测试部分的实施例列于下表31。

表30

表31

血红蛋白溶液的脱氧

通过除去氧来稳定血红蛋白溶液，并使用图25所示的方法过滤以作为中间体储存。最初，以500mL/min的流速将血红蛋白溶液泵送通过两个串联排列的液相脱气膜在75psi下氮气逆流流动。继续脱氧直到溶解氧读数低于0.02mg/mL。当实现充分脱氧时，通过泵送通过0.3μM和两个0.22μM过滤器，将血红蛋白溶液过滤到20L GE Ready CircuitFlexible Bag(T301)中。过滤后的血红蛋白在进一步加工前可保存多达2周。

用于血红蛋白过滤-脱氧过程的部件的实例列于下表32中，用于血红蛋白过滤-脱氧过程中测试的部件的实例列于下表33中。

表32

表33

层析

层析用于进一步纯化血红蛋白溶液和减少非特异性血细胞组分(图26所示的方法)。这使用配备有填充有快流速Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare)的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm I.D.×100cm长)的赛谱SCG层析系统进行，床高为70±5cm。使用注射用水制备缓冲液，并通过10kDa膜过滤以进一步降低热原含量。缓冲液为:(1)缓冲液A；2.42g/L Tris碱，调节至pH9.0±0.1，(2)缓冲液B；6.05g/LTris碱，调节至pH7.0±0.1(3)缓冲液C；2.42g/L Tris碱，调节至pH8.9±0.1。

在层析操作之前，通过新鲜填充的Q琼脂糖柱进行5个完整的缓冲循环。以125mL/min的流速进行层析。血红蛋白溶液，1L含130±10mg/mL血红蛋白，首先将血红蛋白加载到柱上，然后通过加入等体积的缓冲液A和缓冲液B形成pH梯度，通过280nm处的UV吸光度测量从柱上洗脱的蛋白质。当洗脱液的吸光度低于0.05Au时，通过用100％缓冲液B洗脱来增加柱pH。当吸光度达到0.43Au时，血红蛋白级分被收集到20L柔性袋(T405)中，当吸光度降到0.05Au以下时，血红蛋白级分终止。在洗脱血红蛋白之后，3L缓冲液C被泵送通过柱以洗脱紧密结合的组分。

在每次色谱操作之间用0.2N磷酸，随后用两个完全缓冲循环清洗柱子。如果在24小时内不启动另一次操作，则将柱子储存在0.2N磷酸中。用于层析过程的部件的实例列于下表34中，用于层析过程中测试的部件的实例列于下表35中。

表34

表35

脱氧

对纯化的血红蛋白进行脱氧以增加稳定性，如图27A和图27B所示。通过30kDa的中空纤维膜(F503)过滤将来自阴离子交换层析步骤的纯化级分浓缩至11±1mg/mL。当达到所需的血红蛋白浓度时，纯化的血红蛋白通过以500mL/min的流速通过两个串联排列的脱气膜(F501，F502)，以75psi的氮气逆流进行脱氧。继续脱氧直到溶解氧读数低于0.02mg/mL。

随后通过泵送通过30kDa的中空纤维膜(F503)，将脱氧的纯化血红蛋白用6倍体积的储存缓冲液进行渗滤换液。所述储存缓冲液的组成为2.63g/L十二水合磷酸三钠，7.0g/L七水合磷酸氢二钠和2.0g/L乙酰半胱氨酸。当缓冲液交换完成时，通过泵送通过0.5μM的过滤器和两个0.22μM的过滤器将溶液过滤到20L GE Ready Circuit一次性袋子(T501)中。纯化的血红蛋白可在室温(17-23℃)下氮气手套箱中储存达60天，然后进一步处理。

用于脱氧过程的部件的实例列于下表36中，用于脱氧过程中测试的部件的实例列于下表37中。

表36

表37

聚合

纯化的血红蛋白通过使用图28所示的方法与戊二醛交联而聚合。在氮气压力下，将纯化的血红蛋白(4-5L，110g/L)从储罐T501)转移到20L温控波动袋(T603)中。将注射用水通过纯化的血红蛋白转移管线泵入T603中，以将血红蛋白浓度降低到20g/L。然后将稀释的血红蛋白溶液的温度升高到42±2℃。在温控波动包(T602)中制备浓度为6.2g/L的戊二醛溶液，并加热至42±2℃。戊二醛溶液50min时间泵入T603中，直到戊二醛与血红蛋白的比率约为0.037:1。戊二醛通过再循环回路中的静态混合器(M601)加入，以确保与血红蛋白溶液的快速和均匀混合。当戊二醛的加入完成时，将反应混合物的温度冷却至25℃以下，并通过30kDa中空纤维膜(F601)渗滤将溶液浓缩至60-70g/L的血红蛋白浓度。

戊二醛-交联血红蛋白化学键通过用硼氢化钠还原来稳定，如图29所示。硼氢化钠在中性pH的水溶液中分解形成氢和硼酸钠。进行聚合血红蛋白与硼酸钠缓冲液的渗滤，以稳定硼氢化钠并限制氢气的形成。硼酸盐缓冲液由4.58g/L十水合硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠组成。上述缓冲液通过10kDa膜过滤缓冲液以降低热原含量，并储存在20L柔性袋(T605)中。硼酸盐缓冲液首先以250mL/min的流速通过再循环回路泵入T603。同时，通过以1000mL/min的流速泵送通过30kDa中空纤维膜渗滤聚合的血红蛋白溶液。硼酸盐添加流速被调节到等于渗滤渗透速率的流速，约250mL/min。继续用硼酸盐缓冲液渗滤，直到加入相当于聚合血红蛋白溶液体积的3倍。

硼氢化钠溶液由9.45g/l硼氢化钠，4.58g/l十水合硼酸钠和0.91g/l氢氧化钠组成。通过10kDa膜过滤该溶液以降低热原含量，并储存在2L柔性袋(T606)中。首先硼氢化钠溶液(0.6L)以7mL/min的流速通过再循环回路泵入T603，T603的温度控制在20±2℃。在加入所有溶液后，硼氢化物反应继续循环60分钟。

稳定的聚合血红蛋白溶液在30kD超滤膜(F601)上浓缩血红蛋白至100±5g/L。通过用透析过滤溶液A(6.67g/l氯化钠，0.30g/l氯化钾，0.20g/l二水合氯化钙，0.445g/l氢氧化钠，2.02g/l N-乙酰-L-半胱氨酸，3.07g/l乳酸钠，pH＝4.9-5.1)通过30kD超滤膜(F601)对聚合血红蛋白进行透析过滤，除去含硼组分(硼酸钠/硼氢化钠)并将pH降至8.0-8.4。用于聚合方法的部件的实例列于下表38中，用于聚合过程中测试的部件的实例列于下表39中。

表38

表39

无菌过滤

将最终聚合的血红蛋白溶液过滤通过0.5μM过滤器(F701)，0.2μM消毒级膜过滤器(F702)和第二个消毒级0.2μM膜过滤器(F703)，放入20L GE Ready Circuit软袋(T701)中。散装保存袋在氮气下保存直到使用。无菌过滤过程的示意图如图30所示。用于无菌过滤方法的部件的实例列于下表40。

表40

终产品的西林瓶灌装

结合图31和图32所示，本实施例是用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统，包括灌装舱体1、脱内包舱体2和气体置换单元3。

灌装舱体1内设有灌装设备101，用于引入并完成血红蛋白的灌装操作。脱内包舱体2位于灌装舱体1的上游位置，并且两者之间保持密闭连通状态。其中，脱内包舱体2用于对西林瓶进行脱包装和脱氧置换操作，灌装舱体1用于进行西林瓶的血红蛋白灌装操作，气体置换单元3位于脱内包舱体中，用于对灌装前的西林瓶进行负压状态下的置换脱氧操作。

在本实施例中，气体置换单元3，包括负压盒31、排气管32和输气管33。其中，负压盒31采用可反复开启的密闭结构，并且位于脱内包舱体2的内部，用于盛放待脱氧的西林瓶。排气管32的一端与负压盒31连接，另一端延伸至脱内包舱体2的外部与真空机连接。输气管33的一端与负压盒31连接，另一端延伸至脱内包舱体2的外部与惰性气源进行连接，例如氮气源。

采用本实施例中无菌无氧灌装系统进行西林瓶灌装血红蛋白的操作过程为：首先，对灌装舱体1和脱内包舱体2进行脱氧处理，使灌装舱体1和脱内包舱体2的内部形成无氧环境；接着，将脱包装的西林瓶依次摆放至负压盒31中，并且将负压盒31移至脱内包舱体2中，完成排气管32和输气管33的连接；然后，关闭输气管33，开启真空泵通过排气管32将负压盒31进行抽真空处理，待达到设定真空度后，关闭真空泵和排气管32；再接下来，开启输气管33，在真空的负压作用下，将惰性气体引入至负压盒31中，从而完成对西林瓶的置换气体操作，实现对西林瓶的脱氧处理；最后，将完成脱氧处理的西林瓶移至灌装舱体1中进行血红蛋白灌装操作。

结合图33所示，本实施例用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统，还包括层流罩4和脱氧单元5。

层流罩4位于灌装舱体1内，在本实施例中，层流罩选用百级层流罩，使灌装舱体1的内部环境达到A级洁净状态并维持在稳定的无菌状态。在层流罩4与灌装舱体1之间设有气体循环通道6，利用气体循环通道6对层流罩4的底部区域和顶部区域进行连通，从而可以将位于层流罩4的底部气体引流至层流罩4的顶部位置重新进行释放，形成层流罩内的气体内循环。脱氧单元5位于气体循环通道6上，用于对所有流经气流循环通道的气体进行脱氧处理。

此时，将用于血红蛋白灌装的设备和层流罩置于灌装舱体内，利用百级层流罩使灌装舱体的内部形成A级洁净状态，将灌装舱体维持在无菌环境，进而使用于血红蛋白灌装的设备处于无菌环境中。

结合图31所示，在本实施例中，通过在灌装舱体1和脱内包舱体2上还分别设有一个进气口7和一个排气口8。其中，进气口的一端与惰性气源连接，另一端延伸至层流罩内，用于将惰性气体引入至层流罩内；排气口的一端位于层流罩内，另一端与外界大气环境连通，用于将层流罩内的气体外排至大气环境，从而形成层流罩内的气体外循环。

此时，利用灌装舱体中进气口与惰性气源的连接，例如氮气源，将惰性气体引入至层流罩内，同时利用灌装舱体的出气口将层流罩内的空气排出至外界的大气环境中，从而形成层流罩内的气体外循环，完成对层流罩内的气体置换，使层流罩内形成充满惰性气体的无氧环境。在此过程中，根据各个设备的运行要求或血红蛋白的灌装要求，可以对层流罩内的惰性气体种类和最终气压进行调整控制。并且，在灌装舱体内进行血红蛋白灌装操作时，同时开启气体循环通道，使层流罩内的氮气通过气体循环通道形成内循环，并且利用脱氧单元对循环过程的氮气进行实时脱氧处理，从而将整个层流罩维持在精准氧气浓度要求的低氧状态，保证整个灌装过程始终处于有效的低氧环境中进行。

优选的，在本实施例中，脱氧单元选用铜触媒的方式对流经的气体进行实时脱氧操作，从而可以对层流罩内产生的氧气进行及时清除，将层流罩内的氧气浓度维持的精准状态。同样，在其他实施例中，根据设计和安装要求，也可以选用钯触媒或碳燃烧方式进行实时脱氧操作。

此外，结合图33所示，在灌装舱体1内还设有一个含氧量检测仪9，并且设置在层流罩4的顶部气体释放位置，用于实时检测内循环气体中的含氧量，从而可以准确控制脱氧单元5的脱氧操作，提高脱氧单元的工作效率。

结合图31所示，在本实施例的灌装舱体1内还设有一个消毒杀菌单元10，用于对灌装舱体进行消毒杀菌操作，提高灌装舱体的内部清洁度。其中，在本实施例中，消毒杀菌单元选用VHP消毒杀菌方式，同样，在其他实施例中也可以选用其他方式进行有效的消毒杀菌。

结合图33所示，在本实施例的气体循环管道6上还设有一个冷却降温单元11，用于对内循环过程中的气体进行冷却降温，从而维持整个灌装舱体内的温度。其中，冷却降温单元优选水冷却，这样既可以有效调节对气体的降温控制，也可以避免借助低温气体进行冷却时可能引入的杂质气体，从而在维持整个灌装舱体低氧环境的情况下，获得准确控制灌装舱体内温度的有益效果。

优选的，结合图31所示，在灌装舱体1和脱内包舱体2之间设有舱门12，通过舱门12的启闭，控制灌装舱体1和脱内包舱体2之间的通断，从而实现两者之间的有效隔离和连通。甚至，还可以在灌装舱体和脱内包舱体之间设置传输带，利用传输带进行灌装瓶或灌装袋的自动化传输，提高操作的便捷性和效率。

优选的，将灌装舱体内的气体压力调整至高于脱内包舱体内的气体压力，例如建立2pa压差，以保证脱内包舱体的气流不会进入灌装舱体，进而达到对灌装舱体内无菌无氧环境的独立控制。

此外，结合图31所示，在灌装舱体1内还配备有一个RTP门13，用于直接向灌装舱体内进行急需物品的传递。另外，在灌装舱体1和脱内包舱体2上还分别设有操作手套14，用于操作人员在舱体外部对舱体内部的设备或装置进行操作。

结合图31所示，本实施例用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统，还设有两个辅助舱体，分别为脱外包舱体15和轧盖舱体16。其中，脱外包舱体15位于脱内包舱体2的上游位置，用于对西林瓶、胶塞、铝盖进行外包装尘埃粒子清除及外包装拆除和对西林瓶、胶塞和轧盖进行分类整理摆放，轧盖舱体16则位于灌装舱体1的下游并且设有轧盖系统17，用于对灌装后的西林瓶进行轧盖操作。

在本实施例中，由于脱外包舱体主要是进行脱外包装操作，因此其内部环境不需要形成并维持在惰性气体环境，从而可以降低维持脱外包舱体为惰性环境的成本。脱外包舱体与脱内包舱体的传递门在西林瓶传递结束后将进行关闭，在整个灌装过程中不再开启，以保证脱内包舱体无氧环境的有效维持。

在本实施例中，脱外包舱体15和轧盖舱体16内均设有百级层流罩和气体循环通道，从而将西林瓶的灌装过程置于无菌环境中，保证对西林瓶进行无菌灌装的有效性和可靠性，在轧盖舱体设有同灌装舱体相同的温度和氧含量的控制单元和检测探头。

与此同时，在脱外包舱体15、脱内包舱体2、灌装舱体1和轧盖舱体16中相邻的两者之间均设有舱门12，用于对各个舱体进行单独隔离，从而满足各个舱体之间有效连通的情况下，通过设定不同气体压力保证各个舱体之间气体环境的有效隔离，进而保证整个西林瓶灌装操作的顺利进行。

此外，结合图31所示，在脱内包舱体2和轧盖舱体16内还分别设有一个选用304或316L不锈钢材料制备的货架18，用于分别对脱掉内包装的西林瓶、胶塞和轧盖进行分类摆放以及对完成轧盖操作的西林瓶进行暂存摆放。

结合图34所示，相较于上述实施例，在其他实施例中用于对血红蛋白进行西林瓶灌装操作的无菌无氧灌装系统，还可以直接去掉脱外包舱体和轧盖舱体的西林瓶暂存功能，即减少一个脱外包舱体和轧盖舱体中的货架。

此时，西林瓶、胶塞、铝盖通过消毒液擦拭或脱一层包装的方式分别放进脱内包舱体2的货架18、灌装舱体1的胶塞储存区19、轧盖舱体16的铝盖储存区20。上述三舱体分别设有脱氧单元、消毒杀菌单元、冷却降温单元以及氧含量检测装置、无菌检测装置和温度检测装置，并且在灌装操作之前，对脱内包舱体2、灌装舱体1和轧盖舱体16同时进行VHP灭菌、氮气外排置换、氮气内循环的操作。

进一步的，结合图34所示，通过消毒液擦拭直接把西林瓶、胶塞、铝盖放置到各相应舱体的区域，减去了脱外包舱体15的设置；通过设置的负压管路21和负压区22直接把轧盖后的西林瓶传输到轧盖舱体外接收盘23，减去了轧盖舱体的货架18设置。这样既解决了外界空气对轧盖舱体的污染，也减少了轧盖舱体的使用面积，从而既节约了装置的生产成本，也降低了装置的运行成本。

优选的，结合图34所示，将带有内包装的西林瓶竖放在脱内包舱体2的货架18上、将胶塞悬挂在灌装舱体1的胶塞储存区19、将铝盖悬挂在轧盖舱体16的铝盖暂存区20，以便于百级循环风的循环流动，从而可以更加稳定和保持各舱体的A级洁净环境。

进一步优选的，胶塞和铝盖的内包装采用呼吸袋形式，以利于包装袋内部氧气与舱体中氮气的置换，通过排氧气、充氮气、排氧气、充氮气的循环脉冲方式进行初始氧气进行置换，符合要求后再进行氮气内循环。

结合图34所示，在本实施例中，可以只在脱内包舱体2中设置一个半身服24，以减少舱体的设置空间。此外，负压区22比轧盖舱体16压力低至少2pa，灌装舱体1的压力比脱内包舱体2和轧盖舱体16高至少2pa，从而避免灌装和轧盖过程中受到外部气体的污染。

同样，在其他实施例中，根据灌装对象的差异和整个灌装操作流程的差异，可以任意调整灌装舱体与辅助舱体的连接关系以及辅助舱体的数量和结构形式，从而满足不同的灌装操作，提高整个灌装装置的使用效率。

实施例8 用于制造和纯化工艺的装置和组件

红细胞纯化方法包括使用分离系统见图像35,示意图见36。该分离系统可以较好的清除血浆成分、血小板及部分白细胞。

聚合组件的例子被描绘为图像(图37)。在该组件中，测试了戊二醛加入比例、血红蛋白稀释度、聚合时间对聚合度的影响。

层析现场图像见图像38。对C800层析系统进行两种不同上样量的优化，上样前柱效的检测见图39和表41，层析缓冲液参数见表42。上样量1层析数据的曲线见图像40，此为上样量超载图像。层析2数据的曲线图像41。层析2的收集物SDS-PAGE纯度检测为99.1％，结果见图像42。

表41

项目	检测液	柱效	对称性
				结果	0.8MNaCl	6440	1.035

表42

初级过滤的滤液经0.65μm中空纤维超滤系统，使用柠檬酸钠缓冲液进行约7倍初始料液体积进行超滤洗涤，图像见43和示意图见44示出了用于0.65μM渗滤处理的组件的例子和操作实例。100kDa渗滤方法包括渗余物，渗透物和渗滤缓冲液，包括在渗余液管中直接通过与静态混合器的T形接头加入渗滤缓冲液，以改善渗余液的均匀性；包括用蠕动泵控制渗透液的流量，防止凝胶层的形成和流量的降低，实现大中试规模的桥接；并包括进料在进入膜之前短暂地通过40℃的热交换器，这促进了瞬时二聚体形式比例的增加，以提高渗滤效率和产量，图像45和示意图46示出了用于100KD渗滤处理的组件的例子和操作实例。图像47和示意图46示出了用于30KD渗滤浓缩处理的组件的例子和操作实例。C500、C800、终产品等都要经脱氧处理才可以较长时间保存，图像48和示意图49示出了用于脱气膜脱氧处理的组件的例子和操作实例。

实施例9 基于氧载体修饰的血红蛋白指标的研究

根据本公开内容生产的几批修饰的血红蛋白氧载体，并根据标准测试方法进行分析。批次结果列于下表43-45中。

表43

批次：OXP2019001

表44

批次：OXP2019002

表45

批次：OXP2019003

实施例10 基于氧载体修饰的血红蛋白稳定性的研究

根据本公开内容生产的几批修饰的血红蛋白氧载体，并根据标准测试方法对分子量分布的变化进行分析。批次结果列于下表46-49中。

表46

批次：OXP007-1

表47

批次：OXP007-2

表48

批次：OXP008-2

表49

批次：OXP008-3

实施例11 基于氧载体的修饰血红蛋白的CGMP生产

参照图50，一种商业规模的生产设计。主要生产室为101、102、103、104，此被设计成满足等级C级规范要求，101室将收集的红细胞通过切向流过滤系统的渗滤或通过在一次性离心机中离心来洗涤。然后通过渗透压裂解红细胞，然后通过100kD TFF膜过滤血红蛋白。收集透过物通过30kD TFF膜浓缩。一旦血红蛋白处于目标浓度，血红蛋白溶液经0.22μM滤膜过滤除菌到无菌容器活袋子，整个操作过程在密闭的系统中完成，以降低微生物和内毒素超标的风险。102室主要通过根据本公开的专用离子交换层析进一步纯化，洗脱液被收集在适当的容器中，以限制和防止氧和微粒暴露。通过管道焊接机和适当的密闭容器进行处理和连接，从而减轻了暴露于室内环境的所有危险。材料在30kDa TFF膜上浓缩冰3倍磷酸氢二钠缓冲液换液，然后将血红蛋白溶液经0.22μM滤膜过滤到预消毒的袋或容器中储存直到进一步处理(没有开放的系统转移)。103室主要用于血红蛋白戊二醛聚合，猝灭反应和使用30kD膜交换缓冲液的工艺设备。聚合系统中的每个容器还通过封闭系统疏水气体交换膜再循环，以通过向工艺中添加化学物质和缓冲液来除去引入到系统中的任何氧。最终聚合的血红蛋白产物经0.22μM滤膜过滤到预消毒容器或袋子。最终产品经检测合格后转运到104室进行产品的无菌无氧灌装。104室可实现在惰性气体环境下的无菌灌装，整个过程在密闭的系统下完成，并设置了安全报警和自动关闭惰性气体阀门系统，以保证操作人员的安全，灌装结束后通过传递窗入到成品库，等待终产品的检测和释放。

进一步参考图50，105室设计成满足C级规格。该室将通过配制在该过程中使用的缓冲液来支持工艺生产。在缓冲制液中使用的化学物质将在安全罩中称重以控制颗粒。缓冲液将通过管道穿过墙壁而被供应到工艺中。

按照药物规定的SOP，工作的每天用消毒剂进行房间清洁。每月将用杀孢子剂或响应于环境监测程序的偏移来清洁房间。该方法将通过使用密闭的预消毒的一次性使用系统来进行。采样将在已经焊接到系统上的管道上的容器上进行，以保持关闭的系统状态。

如图50所示，生产准备室106被设计成满足C级规格。该房间将用于准备组件以在灭菌过程中使用。该房间包括用于漂洗材料的符合药典纯化水和用于根据需要执行组分的最终漂洗的注射水。该房间还将包括用于灭菌的双扉高压锅用来执行灭菌及传递功能。

如图50所示，公用设施房间107包含用于支持设施功能的公用设施。它包括空气压缩机，氮气/氩气系统，PW系统，WFI系统。

如图51所示，为负一层仓库，主要用于安全地储存在生产过程中使用的材料，其包括包材和耗材室001，试剂室002、终产品灯检和包装室003、成品室004、试剂和产品留样室005。每个室都可依据要求调节温度和湿度，各室按需求分有合格品区和非合格品区，每个室都设有门禁，具有权限的人才可以进入。

如图52所示，为二层的QC、研发、公用工程室。理化室201、精密仪器室202、微生物室203为QC质检区，204、205为血红蛋白产品工艺优化室，为防止与QC的人员及物品的交叉，在其分割处设有门禁系统。206室放置的为提供工艺生产区和QC微生物室的空调系统。

原料来源

该方法的起始原料是从受控制的供体群中收集的牛血。

产地

所有动物均来自中国。中国是一个非疯牛病国家，表明在这个国家的家畜不太可能被BSE试剂感染，但也要有防范措施。本采集牛血的养殖场获得了EDQM证书，见附图53。

避免交叉污染危险的方法

用于处理的全牛血液要在受控空间中的屠宰场或牛场收集。来自批准供应商的动物从饲养区进入采血区。根据包括来源和饲料状态的群管理程序，存在任何收集的所有动物将具有完整的文档。在出血或放血之后，将动物从采血室或区移出，以便进一步处理回到畜群管理区域或屠宰设施中。

动物的隔离

从管理的畜群控制到达收集站或屠宰场的单独识别的牛。在第一种情况下，根据标准群管理程序，在进入专用采血区之前，将对它们进行大量控制。牛通过滑槽进入，在屠宰场的情况下，滑槽将牛直接引导到收集区域或击晕平台。血液收集设施与原发性抽血(如果是屠宰场)或指定设施的收集设施分开。

采血

在每次收集之前验证每个动物的支持文件和识别的准确性和完整性，并检查该动物的任何疾病征兆。使用封闭系统进行血液收集。动物(如果放血)可以固定，如果一次收获，非气动系留栓方法可以用于击晕。在屠宰场的收集从未使用过，也不会使用被称作“配管”的过程。如果在屠宰场，则在击昏之后立即将链卸扣放置在后蹄周围，并且将动物提升到倒立位置。架空输送机系统将动物尸体沿所述线路移动到收集平台。如果是屠宰场供体，从颌部到胸腔入口的角度在皮下做一个切口；然后，通过围绕颈部的背面缠绕的弹性绳将皮从暴露的颈沟中缩回。

使用插入靠近腔静脉的颈静脉中的不锈钢套管针以封闭的方式收集血液。消毒管将消毒套管针连接到消毒不锈钢容器或塑料袋上，消毒不锈钢容器或塑料袋是用柠檬酸钠抗凝剂制备的。在大约30-60秒的时间内收集大约10-15升的血液。收集血液后，移除套管针，并密封血管。然后，尸体移出专用的监督收集设施，然后移到主屠宰场处理台上，而不能返回。如果在动物放血2-5升的可控体积的动物管理设施中，在无害化抗凝血带电收集袋中收集血液的情况下，将在供体期间约束动物。

每个收集容器保持单个动物的血液。每个收集容器的唯一编号被记录并与来自唯一动物耳标的动物编号相关联。耳标号还与唯一的屠宰动物号相关联，该屠宰动物号用于通过包装工厂追踪牛。随后由农业部人员训练的检查人员检查动物是否有疾病或污染的证据。检验人员由受过农业部培训的兽医监督。如果一种动物由于任何原因被农业部工作人员截留用于进一步的检查，那么来自该动物的血液在屠宰场被丢弃。填充的收集容器可以离开该设施，并且被放置在冰中并被装载到卡车上以运输到分离设施。如果所管理的供体群体，则执行类似的编目，并且收集袋子并将其冷却以输送到初始处理设施。

其它组织污染收集的血液的可能性

由于血液采集的封闭方法和通过使用受过良好训练的操作人员进行控制和记录的过程，因此被其它组织污染的可能性最小。在屠宰场中，通过将套管针的刀刃朝向血管定位来避免气管和食道。

头骨上动物被击晕的位置物理上远离套管针插入的位置(1米)。由于动物在采血期间悬空的位置，来自击晕部位的任何流体或骨碎片都不能与采血部位接触。收集的血液不与脑，脊髓，眼睛，回肠，淋巴结，近端结肠，脾，扁桃体，硬脑膜，松果腺，胎盘，脑脊液，垂体，肾上腺，远端结肠，鼻粘膜，外周神经，骨髓，肝脏，肺或胰腺接触。另外，在制造工厂的血液收集过程中，任何潜在的污染组织都将被去除，其中血液依次通过800μ滤网，50μ滤网和60深度过滤器过滤。60μ深度过滤器具有宽的孔径分布；最大孔径为60μ或微米。

水系统

通过将纯蒸汽冷凝到保持在75℃以上的2000L储罐中来生产注射用水，该储罐在操作过程中通过喷射球再循环以冲洗所有内表面。热回路没有任何直接使用点，但是提供了一个冷回路，该冷回路通过热交换器再循环以将温度降低到25℃。一个使用点是缓冲剂制备，另一个是组分制备，以便在高压釜中灭菌之前进行最终漂洗。所述冷回路在限定的时间段内被夜间热水消毒。

除储存在2-8℃的纯化血红蛋白溶液外，其余原料均在受控的室温下储存。标准的一次性使用的产品接触材料，例如聚丙烯，聚碳酸酯，硅氧烷管，C-挠性管和具有由超低密度聚乙烯或等同物制成的惰性内层的袋，用于储存。该系统在使用前将被冲洗以除去颗粒，并在处理前测试泄漏。如果需要卫生，系统用0.5M NaOH冲洗规定的时间范围，然后将NaOH从系统中冲洗出来，并确保在处理之前中和残余物。将最终产品在受控的室温下储存。

暖通空调(HVAC)和空气处理

HVAC系统将HEPA过滤的空气提供给已被冷却以将湿气降低到相对湿度小于60％的洁净室，并重新加热到操作者舒适所需的温度。该系统设计成具有足够的空气变化率，该空气变化率适合于在不同分类的房间之间具有0.05“的压力级联的分类，其中主处理区域处于最高压力。该处理套件设计成具有气锁，以允许在对处理区域的影响最小的情况下执行人员和材料的转换。根据标准操作程序，用批准的卫生剂清洁房间。根据房间分类定期进行活的和不活的微粒的环境监测。表面监测也将在由标准操作过程限定的限定位置中进行。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 润方（北京）生物医药研究院有限公司

润方（北京）生物科技有限公司

<120> 一种牛血红蛋白制品中牛源基因组DNA定量检测方法及其应用

<130> IDC200106

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1166

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 1

ccgaggttgc tgccaggcgg cctcggagtg tgtattcagt aggtgcacag tacgttctga 60

agtgaacctc attctggggc cccggcacac tcggctgtgt tccttgcact cttctgcatg 120

tgcccagtct ggcccgactg ccccttgtgg tgtcccagta tgacgcggcc catctcttcc 180

tacagatcat gttcgagacc ttcaacaccc ctgccatgta cgtggccatc caggctgtgc 240

tgtccctgta tgcctctggc cgcaccaccg gcatcgtgat ggactccggt gacggggtca 300

cccacacggt gcccatctat gaggggtacg cccttcccca tgccatcctg cgtctggacc 360

tggctggccg ggacctgacg gactacctca tgaagatcct cacggagcgt ggctacagct 420

tcaccaccac ggccgagcgg gaaatcgtcc gtgacatcaa ggagaagctc tgctacgtgg 480

ccctggactt cgagcaggag atggccaccg cggcctccag ctcctccctg gagaagagct 540

acgagcttcc tgacgggcag gtcatcacca tcggcaatga gcggttccgc tgccctgagg 600

ctctcttcca gccttccttc ctgggtgagt gagaaggccc gccctgcctg ccccacacga 660

aggtcaccct gtggccacac tggaggctaa gtctgccttc tctctctccc caggcatgga 720

atcctgcggc attcacgaaa ctaccttcaa ttccatcatg aagtgtgacg tcgacatccg 780

caaggacctc tacgccaaca cggtgctgtc cggcgggacc accatgtacc ccggcatcgc 840

ggacaggatg cagaaagaga tcactgccct ggcacccagc acaatgaaga tcaaggtgag 900

cgcccagccg tagccggacg gtgcagatag gcgtggtggc tgtcaaggcg gctgccttgc 960

tcgggtccca tgggtaccgg ggagatgacg ccagggccct cactgccccc ttctctctct 1020

ctccagatca tcgcgccccc tgagcgcaag tactccgtgt ggattggcgg ctccatcctg 1080

gcctcgctgt ccaccttcca gcagatgtgg atcagcaagc aggagtacga tgagtccggc 1140

ccctccatcg tccaccgcaa atgctt 1166

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-1F

<400> 2

aggtgcacag tacgttctga agtg 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-1P

<400> 3

cggcacactc ggctgtgttc cttgc 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-1R

<400> 4

gccagactgg gcacatgc 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-2F

<400> 5

tgacatcaag gagaagctct gc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-2P

<400> 6

acgtggccct ggacttcgag ca 22

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-2R

<400> 7

cgcggtggcc atctc 15

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-3F

<400> 8

cgcaagtact ccgtgtgga 19

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-3P

<400> 9

acatctgctg gaaggtggac agcga 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-3R

<400> 10

gactcatcgt actcctgctt gc 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-1F2

<400> 11

ttctgaagtg aacctcattc tggg 24

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> Bov-ACTB-1R2

<400> 12

caccacaagg ggcagtcg 18

<210> 13

<211> 142

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 血红蛋白亚单位α氨基酸序列

<400> 13

Met Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly

1 5 10 15

Lys Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg

20 25 30

Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp

35 40 45

Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala

50 55 60

Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala

65 70 75 80

Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro

85 90 95

Val Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala

100 105 110

His Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys

115 120 125

Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140

<210> 14

<211> 575

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 血红蛋白亚单位α核酸序列

<400> 14

actcttctgg tccccacaga ctcagagaga acccaccatg gtgctgtctc ctgccgacaa 60

gaccaacgtc aaggccgcct ggggcaaggt tggcgcgcac gctggcgagt atggtgcgga 120

ggccctggag aggatgttcc tgtccttccc caccaccaag acctacttcc cgcacttcga 180

cctgagccac ggctctgccc aggttaaggg ccacggcaag aaggtggccg acgcgctgac 240

caacgccgtg gcgcacgtgg acgacatgcc caacgcgctg tccgccctga gcgacctgca 300

cgcgcacaag cttcgggtgg acccggtcaa cttcaagctc ctaagccact gcctgctggt 360

gaccctggcc gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa 420

gttcctggct tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg gagcctcggt 480

agcagttcct cctgccagat gggcctccca acgggccctc ctcccctcct tgcaccggcc 540

cttcctggtc tttgaataaa gtctgagtgg gcggc 575

<210> 15

<211> 147

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 血红蛋白亚单位β氨基酸序列

<400> 15

Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp

35 40 45

Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp

65 70 75 80

Asn Leu Lys Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln

115 120 125

Ala Ala Tyr Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His

130 135 140

Lys Tyr His

145

<210> 16

<211> 628

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 血红蛋白亚单位β核酸序列

<400> 16

acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc atggtgcatc 60

tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac gtggatgaag 120

ttggtggtga ggccctgggc aggctgctgg tggtctaccc ttggacccag aggttctttg 180

agtcctttgg ggatctgtcc actcctgatg ctgttatggg caaccctaag gtgaaggctc 240

atggcaagaa agtgctcggt gcctttagtg atggcctggc tcacctggac aacctcaagg 300

gcacctttgc cacactgagt gagctgcact gtgacaagct gcacgtggat cctgagaact 360

tcaggctcct gggcaacgtg ctggtctgtg tgctggccca tcactttggc aaagaattca 420

ccccaccagt gcaggctgcc tatcagaaag tggtggctgg tgtggctaat gccctggccc 480

acaagtatca ctaagctcgc tttcttgctg tccaatttct attaaaggtt cctttgttcc 540

ctaagtccaa ctactaaact gggggatatt atgaagggcc ttgagcatct ggattctgcc 600

taataaaaaa catttatttt cattgcaa 628

<210> 17

<211> 147

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 血红蛋白亚单位γ氨基酸序列

<400> 17

Met Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp

1 5 10 15

Gly Lys Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg Leu

20 25 30

Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn

35 40 45

Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His

50 55 60

Gly Lys Lys Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Ile Lys His Leu Asp

65 70 75 80

Asp Leu Lys Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys

85 90 95

Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val

100 105 110

Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Glu Val Gln

115 120 125

Ala Ser Trp Gln Lys Met Val Thr Gly Val Ala Ser Ala Leu Ser Ser

130 135 140

Arg Tyr His

145

<210> 18

<211> 586

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 血红蛋白亚单位γ核酸序列

<400> 18

acactcgctt ctggaacgtc tgaggttatc aataagctcc tagtccagac gccatgggtc 60

atttcacaga ggaggacaag gctactatca caagcctgtg gggcaaggtg aatgtggaag 120

atgctggagg agaaaccctg ggaaggctcc tggttgtcta cccatggacc cagaggttct 180

ttgacagctt tggcaacctg tcctctgcct ctgccatcat gggcaacccc aaagtcaagg 240

cacatggcaa gaaggtgctg acttccttgg gagatgccat aaagcacctg gatgatctca 300

agggcacctt tgcccagctg agtgaactgc actgtgacaa gctgcatgtg gatcctgaga 360

acttcaagct cctgggaaat gtgctggtga ccgttttggc aatccatttc ggcaaagaat 420

tcacccctga ggtgcaggct tcctggcaga agatggtgac tggagtggcc agtgccctgt 480

cctccagata ccactgagct cactgcccat gatgcagagc tttcaaggat aggctttatt 540

ctgcaagcaa tcaaataata aatctattct gctaagagat cacaca 586

<210> 19

<211> 141

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Human alpha的氨基酸序列

<400> 19

Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys Thr Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys

1 5 10 15

Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met

20 25 30

Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu

35 40 45

Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Lys Lys Val Ala Asp

50 55 60

Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu

65 70 75 80

Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val

85 90 95

Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His

100 105 110

Leu Pro Ala Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140

<210> 20

<211> 141

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Bovine alpha的氨基酸序列

<400> 20

Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Gly Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys

1 5 10 15

Val Gly Gly His Ala Ala Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg Met

20 25 30

Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu

35 40 45

Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys Gly His Gly Ala Lys Val Ala Ala

50 55 60

Ala Leu Thr Lys Ala Val Glu His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu

65 70 75 80

Ser Glu Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys Leu Arg Val Asp Pro Val

85 90 95

Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Ser Leu Leu Val Thr Leu Ala Ser His

100 105 110

Leu Pro Ser Asp Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Leu Ala Asn Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys Tyr Arg

130 135 140

<210> 21

<211> 144

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Human beta的氨基酸序列

<400> 21

Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly Lys Val

1 5 10 15

Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Val Val

20 25 30

Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser Thr

35 40 45

Pro Asp Ala Val Met Gly Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly Lys Lys

50 55 60

Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn Leu Lys

65 70 75 80

Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu His Val

85 90 95

Asp Pro Glu Asn Phe Arg Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Val Leu

100 105 110

Ala His His Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala Ala Tyr

115 120 125

Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys Tyr His

130 135 140

<210> 22

<211> 144

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> Bovine beta的氨基酸序列

<400> 22

Leu Thr Ala Glu Glu Lys Ala Ala Val Thr Ala Phe Trp Gly Lys Val

1 5 10 15

Lys Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg Leu Leu Val Val

20 25 30

Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser Thr

35 40 45

Ala Asp Ala Val Met Asn Asn Pro Lys Val Lys Ala His Gly Lys Lys

50 55 60

Val Leu Asp Ser Phe Ser Asn Gly Met Lys His Leu Asp Asp Leu Lys

65 70 75 80

Gly Thr Phe Ala Ala Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys Leu His Val

85 90 95

Asp Pro Glu Asn Phe Lys Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Val Val Leu

100 105 110

Ala Arg Asn Phe Gly Lys Glu Phe Thr Pro Val Leu Gln Ala Asp Phe

115 120 125

Gln Lys Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Arg Tyr His

130 135 140

Claims (10)

1.一种牛源血红蛋白制品中牛基因组DNA的荧光定量PCR检测方法，其包括：

对所述牛源血红蛋白制品中的DNA进行提取，和

利用荧光定量PCR方法对提取的DNA进行扩增检测；

其中：

所述提取包括如下步骤：

1)每取250μL所述牛源血红蛋白制品至2ml离心管中，加入20μL Proteinase K溶液和300μL裂解液GHL，振荡混匀，75℃裂解15min，期间颠倒混匀3回，每回5次；

2)向步骤1)获得的产物中加入300μL异丙醇，振荡混匀10sec，加入15μL磁珠悬浮液GH，振荡混匀1min，共静置9min，每3min振荡混匀1min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

3)向步骤2)获得的产物中加入900μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

4)向步骤3)获得的产物中加入500μL缓冲液GDZ，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

5)将所述2ml离心管从磁力架上取下，加入250μL漂洗液，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

6)将所述2ml离心管从磁力架上取下，加入250μL漂洗液，振荡混匀2min；之后将所述2ml离心管放置于磁力架上静置30sec，磁珠完全吸附后，吸去液体；

7)将所述2ml离心管放置于磁力架上，室温晾干10-15min，之后将所述2ml离心管从磁力架上取下，加入50-100μL洗脱缓冲液TB，振荡混匀，置于56℃温度下孵育10min，期间颠倒混匀3回，每回3-5次；

8)将所述2ml离心管放置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至一个新离心管中，获得了DNA提取液；

所述牛源血红蛋白制品的体积至少为2mL，

所述漂洗液的组成为：100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.5，75％-85％(优选80％)乙醇，0.4％-0.6％(优选0.5％)Triton X-100，

所述Proteinase K溶液、裂解液GHL、磁珠悬浮液GH、缓冲液GDZ和洗脱缓冲液TB来自天根生化科技(北京)有限公司DP705-1磁珠试剂盒；

所述荧光定量PCR方法中：

扩增使用的上游引物Bos-ACTB-1F2的序列为：5′-TTCTGAAGTGAACCTCATTCTGGG-3’(SEQID NO：11)，下游引物Bos-ACTB-1R2的序列为5′-CACCACAAGGGGCAGTCG-3’(SEQ ID NO：12)，探针Bos-ACTB-P1的序列为：5’-CGGCACACTCGGCTGTGTTCCTTGC-3’(SEQ ID NO：3)；

其中：

所述牛源血红蛋白制品是通过下述方法制备的:

1)使用含有抗凝剂的无菌容器收集牛血；

2)所述收集牛血结束后用超滤法洗涤所述牛血；

3)通过离心法或膜过滤法对所述洗涤后的所述牛血进行细胞分离，获得牛血红细胞，

裂解所述牛血红细胞，获得血红蛋白溶液；

或者，通过溶出法对所述洗涤后的所述牛血进行血红蛋白溶出处理，获得血红蛋白溶液；

4)对所述血红蛋白溶液进行除氧，获得脱氧血红蛋白溶液，从而稳定所述血红蛋白溶液；

5)纯化所述脱氧血红蛋白溶液，从而减少非特异性血细胞成分，其中所述纯化是通过色谱法实现的；

6)通过30,000Da中空纤维膜超滤所述纯化后的所述脱氧血红蛋白溶液，达到所需的血红蛋白浓度，从而稳定所述纯化后的所述脱氧血红蛋白溶液；

7)将步骤6)获得的脱氧纯化血红蛋白溶液通过30,000Da中空纤维膜超滤，并用储存缓冲液进行渗滤换液，所述储存缓冲液包括2.63g/L十二水合磷酸三钠，7.0g/L七水合磷酸氢二钠和2.0g/L乙酰半胱氨酸；

8)将步骤7)获得的脱氧纯化血红蛋白溶液与戊二醛进行交联聚合；

9)用硼氢化钠还原步骤8)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白；

10)通过对步骤9)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白进行透析滤过，使所述聚合纯化的脱氧血红蛋白稳定下来，获得聚合血红蛋白溶液；

11)过滤步骤10)获得的聚合血红蛋白溶液，获得最终聚合血红蛋白溶液；

12)用柔性袋或西林瓶灌装所述最终聚合血红蛋白溶液，获得所述牛源血红蛋白制品。

2.权利要求1所述的检测方法，其中，所述探针5’端和3’端分别进行了化合物标记，5’端标记的化合物选自异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)、羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)、六氯-6-甲基荧光素(Hexachloro fluorescein，HEX)，3’端标记的化合物选自6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)和广谱荧光淬灭剂BHQ-1(Black HoleQuencher 1)；

或者，所述扩增反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸15秒，扩增40个循环，最后72℃延伸5分钟。

3.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤11)中的过滤为0.5μm深度过滤、0.2μm除菌过滤,和至少一个额外的0.2μm除菌过滤；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，以无菌无氧的方式对所述最终血红蛋白溶液进行柔性袋或西林瓶灌装，以得到可长期保存的产品。

4.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述离心法是在离心力12500xG，温度10℃，时间25min的条件下进行的，或者所述膜过滤法是通过去除白细胞的方式实现所述细胞分离的，或者所述血红蛋白溶出处理是利用20mOsm CSB缓冲液实现的，所述CSB缓冲液包括7.9g/L氯化钠和6.0g/L二水合物柠檬酸钠。

5.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述裂解所述牛血红细胞是通过如下方式进行的：将所述牛血红细胞在100kDa和30kDa膜上进行细胞裂解和顺序渗滤。

6.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤4)中，所述除氧是通过如下方式进行的：以500mL/min的流速将所述血红蛋白溶液泵送通过两个串联排列的液相脱气膜，在75psi下氮气逆流流动，除氧直到溶解氧读数低于0.02mg/mL；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述除氧后进一步包括将所述脱氧血红蛋白溶液经过0.3μm和至少一个0.22μm深度过滤器的步骤。

7.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述色谱系统使用配备有填充有阴离子交换填料的GE Healthcare XK硼硅酸盐柱(5cm I.D.×100cm长)的赛谱SCG层析系统进行，床高为70±5cm；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述色谱系统的缓冲液是使用注射用水制备的，并通过10kDa膜过滤以进一步降低热原含量，所述缓冲液包括：(1)缓冲液A：2.42g/L tris碱，调至pH 9.0±0.1，(2)缓冲液B：6.05g/L Tris碱，调节pH7.0±0.1，(3)缓冲液C：2.42g/L Tris碱，58.38g/L NaCl,调节pH8.9±0.1。

8.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述聚合是在温度为42±2℃下进行的，戊二醛溶液的浓度为6.2g/L，所述戊二醛与所述脱氧纯化血红蛋白的质量比为0.037:1；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述戊二醛通过静态混合器加入，以确保快速均匀地与血红蛋白混合，当所述戊二醛的加入完成时，将反应混合物的温度冷却到25℃以下；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，将所述反应混合物通过30,000Da中空纤维膜进行透析过滤浓缩，使得血红蛋白浓度为60-70g/L。

9.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述硼氢化钠的水溶液包括9.45g/L的硼氢化钠、4.58g/L的十水硼酸钠和0.91g/L氢氧化钠，所述硼氢化钠的水溶液经10,000Da膜过滤以降低热原含量；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤9)中，将所述硼氢化钠的水溶液在温度为18-25℃，流速为7ml/min的条件下与步骤8)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白溶液进行混合；

或者，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，步骤10)中，将步骤9)获得的聚合纯化的脱氧血红蛋白通过30kd超滤膜浓缩至血红蛋白浓度为100±5g/L。

10.权利要求1所述的检测方法，其中，制备所述牛源血红蛋白制品的方法中，所述洗涤所述牛血是通过如下方式进行的：以200-500mL/min的流速泵送抗凝化的牛血，同时与柠檬酸钠溶液以280-700mL/min的流速混合，并使混合物经过0.6μm和0.4μm深度过滤膜，再将所述深度过滤后的所述混合物以1-2L/min循环通过0.2μm中空纤维,最后以超滤方式并以300-500ml/min速度注入柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液包括7.9g/L氯化钠和6.0g/L二水合物柠檬酸钠。

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