KR20060003373A

KR20060003373A - 트랜스크립션 칩

Info

Publication number: KR20060003373A
Application number: KR1020057021749A
Authority: KR
Inventors: 히로시 키도; 미네요시 히요시; 미와 반도; 모리토시 키노시타; 요지 푸쿠다; 히로시 미주구치
Original assignee: 오츠카 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-13
Publication date: 2006-01-10
Also published as: JPWO2004101784A1; US20100323904A1; EP1632570A1; US8841237B2; CA2525912A1; US20130023429A1; WO2004101784A1

Abstract

전사 인자를 결합할 수 있는 엘리멘트 서열을 포함하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드가 기판상에 고정되어 이루어지는 트랜스크립션 칩.

트랜스크립션 칩, 전사 인자의 활성 측정 방법

Description

트랜스크립션 칩 {Transcription Chip}

본 발명은 트랜스크립션 칩 및 상기 칩을 이용한 전사 인자의 활성 측정 방법에 관한 것이다.

DNA칩은 유전자 다형이나 mRNA 발현량의 변동량을 프로파일링하는 툴이며, 현재 넓은 연구 분야에서 이용되고 있다. 게놈 정보의 전달체인 mRNA로부터 번역되어 얻어지는 최종적인 산물인 단백질이, 시시각각 변동하는 생명 현상을 담고 있다. 그 때문에, mRNA의 프로파일링으로부터 얻어지는 정보보다 유용한 정보가 얻어진다고 생각되어, 단백질을 망라적으로 해석하는 프로테옴 해석 기술의 개발이 현재 활발하게 행해지고 있다.

이와 같은 현상 중에서, 단백질을 기판상에 포착하여, 그 성상을 효율적으로 해석하는 시스템이 완성되면, 대규모 해석이나 비용면에서 종래까지의 2차원 전기 영동 또는 액체 크로마토그래피를 이용한 프로테옴 해석법을 능가하는 신기술이 될 것으로 추정된다. 지금까지 프로테옴 해석을 타겟으로 한 칩으로서는 항체 칩이 개발되어 있다. 항체 칩이란, 칩 표면에 항체를 다수 고정화하고, 고정화된 항체 각각과 상호 작용하는 항원량을 프로파일화하는 툴이다. DNA 칩보다는 후에 개발되었지만, 직접 단백질량의 변동을 해석하는 것이 가능하기 때문에, 장래적으로 약 개발, 독성 시험 또는 병태의 진단 등 넓은 분야에서의 응용이 기대된다.

전사 인자는, 각 유전자의 상류 영역의 엘리멘트(element) 서열이라 불리는 영역에 결합하여, 다양한 유전자 발현 조절을 담당하는 단백질이기 때문에, 세포의 염증 반응, 암(癌)화 및 전사 제어 인자의 활성화와 깊이 관여되어 있고, 생물 활성을 유지한 각종 전사 인자의 단백질 수준에서의 프로파일을 행하는 것은 매우 중요하다.

종래부터, 전사 인자는 겔 이동 분석이라 불리는 방사성 동위원소를 이용한 아크릴아미드 겔 전기 영동을 이용한 수법에 의해 해석되고 있지만, 작업 처리성(thoughput), 안전성에 문제가 있어 금후의 프로테오믹스적 수법에는 대응이 어려울 것으로 생각된다.

본 발명은 효율적으로 전사 인자를 프로파일링하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 항체 칩과 트랜스크립션 칩을 비교하여 나타낸다.

도 2는 고정화한 유전자를 나타낸다.

도 3은 FITC 표지한 NFκB 반응 서열 고정화 칩(PRDII-1)을 나타낸다.

도 4는 NFκB 반응 서열의 경합 실험 결과를 나타낸다.

도 5는 고정화 2본쇄 DNA의 검토 결과를 나타낸다.

도 6은 블로킹제의 검토 결과를 나타낸다.

도 7은 동시 재현성 시험과 측정간 재현성 시험(Different lot Competition; DLC)의 결과를 나타낸다.

도 8은 DLC 칩과 진다이아(GeneDia)^TM의 비교를 나타낸다.

도 9는 유의 수준 5 ％에서의 감도 시험의 결과를 나타낸다.

도 10은 A: HeLa 세포 추출액으로부터의 NFκB 검출 결과를 나타낸다. B: 진다이아^TM를 이용한 HeLa 세포 염증 관련 전사 인자의 발현 프로파일링을 나타낸다.

도 11은 2본쇄 DNA의 마이크로어레이화의 결과를 나타낸다.

도 12는 형광 스캐너에 의한 NFκB의 특이적 검출 결과를 나타낸다.

도 13은 NFκB의 칩 상 분해 (on chip digestion)에 의한 펩티드 맵을 나타낸다.

도 14는 용액 중 트립신 분해에 의해 얻어진 NFκB 펩티드 맵을 나타낸다.

도 15는 PMF에 의한 데이타베이스 검색 결과를 나타낸다.

도 16은 칩 상 분해 결과를 나타낸다.

도 17은 용액 중 트립신 분해에 의해 얻어진 VDR 펩티드 질량 핑거프린트를 나타낸다.

도 18은 본 발명의 트랜스크립션 칩으로부터 VDR의 직접 검출의 결과를 나타낸다.

도 19는 MALDI-TOP MS용 DLC 플레이트의 일례를 나타낸다.

도 20은 다이아몬드 박막을 갖는 기판의 수식 방법을 나타낸다.

도 21은 NFκB의 펩티드 질량 핑거프린트(A) 및 1701.10 m/z(B), 1808.01 m/z(C), 2413.35 m/z(D)의 2차 스펙트럼을 나타낸다.

도 22는 MASCOT 데이타베이스 검색에 의해 얻어진 NFκB 동정 결과이다.

<발명의 개시>

본 발명자는 기판상에 전사 인자의 1 이상의 엘리멘트 서열을 포함하는 1본쇄 또는 2본쇄 DNA를 고정화한 트랜스크립션 칩을 제조하고, 상기 칩에 의해 전사 인자 또는 상기 인자와 상호 작용하는 물질의 발현량을 DNA 결합능이라는 생물 기능에 기초하여 프로파일링할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 이하의 트랜스크립션 칩 및 이를 이용한 전사 인자의 분석 방법을 제공하는 것이다.

1. 전사 인자가 결합할 수 있는 1종 이상의 엘리멘트 서열을 포함하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드가 기판상에 고정되어 이루어지는 트랜스크립션 칩.

2. 1항에 있어서, 각각에 전사 인자가 결합할 수 있는 1 이상의 엘리멘트 서열을 포함하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드가 결합되어 이루어지는 칩.

3. 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 각 유전자의 상류(5')측의 프로모터의 부분 서열을 갖는 칩.

4. 1항에 있어서, 상기 기판이 지지체상에 다이아몬드 박막을 형성한 것인 칩.

5. 1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 다이아몬드 박막과 임의로 적당한 스페이서를 개재하여 결합한 것인 칩.

6. 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스크립션 칩에 전사 인자를 포함할 수 있는 시료를 작용시키는 공정을 포함하는, 전사 인자의 결합을 분석하는 방법.

7. 6항에 있어서, 상기 시료가 피검 물질의 존재하에서 배양시킨 세포의 세포 용해물인, 피검 물질의 전사 인자에 대한 영향을 평가하기 위한 방법.

8. 6항 또는 7항에 있어서, 전사 인자의 결합을 전사 인자에 대한 항체 또는 질량 분석을 이용한 방법을 사용하여 검출하는 방법.

9. 8항에 있어서, 항체를 이용한 검출이 ELISA법이고, 질량 분석을 이용한 방법이 펩티드 질량 핑거프린트법인 방법.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 트랜스크립션 칩은 항체 칩, DNA 칩 모두와 다르다(도 1).

전사 인자는, 각 유전자의 상류 영역의 엘리멘트 서열이라 불리는 영역에 결합하여, 다양한 유전자 발현 조절을 담당하는 단백질이기 때문에, 세포의 염증 반응, 암화 및 전사 제어 인자의 활성화와 깊이 관여되어 있어, 생물 활성을 유지한 각종 전사 인자의 단백질 수준에서의 프로파일을 행하는 것은 매우 중요하다.

전사 인자는 DNA에 결합하여 전사 개시 등의 전사 조절에 관여하는 인자이고, 예를 들면 NFκB(예를 들면 p50, p65), NFATc1, CREB, ATF-2, c-Jun, c-Rel, c-Fos, AP1, AP-2, RBP-J, Nrf2, KLF5, BTEB2, NF-AT, MITF, RUNX 패밀리, GATA-1, GATA-2, HIFα, HLF, Brn-3, EBP, CDP, c-Myb, c-Myc, E2F, EGR, Ets, Ets1/PEA3, FAST-1, BRCA1, HNF-4, GATA, NF-1, Max, IRF-1, NFATc, NF-E1, NF-E2, 1-Oct, MEF-1, MEF-2, Myc-Max, p53, Pax-5, Pbx1, TR, AhR, ER, GR, MR, AR, VDR, RAR, RXR, LXR, FXR, PPAR, ERR, ROR, SXR, PXR, USF-1, Sp1, Stat1, Stat3, Stat4, Stat5, Stat6, COUP-TF, Ftz-F1, TFIIB, TFIID, TBP, TFIIE, TFIIF, TFIIH, TAF, PolI, PolII, PolIII, ELL, TFIIS, Elongin, P-TEFb, DSIF, CBP/p300, p160(SRC-1, TIF2, AIB1)TRRAP/GCN5, NcoR, SMRT, HDAC, DRIP/TRAP, Smad 등이 예시된다.

전사 인자는 포유류의 전사 인자가 바람직하고, 특히 인간의 전사 인자가 바람직하다.

엘리멘트 서열은 공지되어 있고, 각종 엘리멘트 서열을 1 또는 2 이상 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적절하게 칩 상에 형성할 수 있다. 구체적으로는 엘리멘트 서열로서는, 하기 실시예 1의 프라이머에 있어서 하선(下線)을 그은 서열(GGAATTTCCC 및 GGGAAATTCC; GGGGATCCC 및 GGGATCCCC; TGACTCAT 및 ATGAGTCA; AGGTCA 및 TGACCT; AGGTCA 및 TGACCT; AGGTCA 및 TGACCT; AGGTCATGACCT; AGAACA 및 TGTTCT; TGACGTCA)이 예시된다. 다른 엘리멘트 서열로서는, 예를 들면 사그로베즈, 티.(Sagroves, T.) 등의 보고[Cancer Cell 1:211-212(2002)], 아이시, 에스.(Ishii, S.) 등의 보고[Science 232:1410-1413(1986)]에 기재되어 있다.

상기 엘리멘트 서열은, 포유류의 전사 인자가 결합할 수 있는 엘리멘트 서열이 바람직하고, 특히 인간 전사 인자가 결합할 수 있는 엘리멘트 서열이 바람직하다.

본 발명의 칩이 그의 동태 파악을 필요로 하는 복수의 전사 인자에 대응한 폴리뉴클레오티드를 칩 상에 고정화하고 있으면, 1매의 칩에서 모든 전사 인자의 프로파일링을 행할 수 있기 때문에 바람직하다. 물론 1개의 어레이에 1종만의 전사 인자에 대응하는 폴리뉴클레오티드를 고정화하고, 필요한 수의 칩을 이용하여 전사 인자의 프로파일링을 행할 수 있다.

1개의 폴리뉴클레오티드에는, 엘리멘트 서열은 1종 이상 포함될 수 있고, 동일한 엘리멘트 서열을 1 또는 복수개 포함할 수도 있으며, 2종 이상의 엘리멘트 서열을 1개의 폴리뉴클레오티드 중에 포함할 수도 있다.

기판상에 결합되는 엘리멘트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 공지된 엘리멘트 서열의 전후에 적당한 올리고 또는 폴리뉴클레오티드를 결합시켜 인공적으로 제조할 수도 있지만, 각 유전자의 상류(5')측의 프로모터의 부분 서열을 바람직하게 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 10 내지 500개 정도, 바람직하게는 15 내지 300개 정도, 보다 바람직하게는 20 내지 100개 정도이다.

너무 긴 염기쌍은 제조가 곤란하거나, 자기 상보적 염기쌍을 발생시키거나, 목적하는 부분과 다른 부분에서 혼성화되거나 하여, 목적하는 올리고뉴클레오티드가 얻어지지 않을 가능성이 있다.

엘리멘트 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 서열 1 내지 22의 폴리뉴클레오티드가 예시된다.

기판으로서는, DNA를 결합시킬 수 있는 것인 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 카르복시메틸덱스트란 또는 카르복실기로 말단 수식된 PEG와 같은 수용성 고분자를 기판 표면에 결합시켜 카르복실기를 도입한 것이나, 금속(특히 금)의 표면 박막을 갖는 기판 등을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 다수의 카르복실기 잔기가 표면상에 형성된 다이아몬드 박막을 갖는 칩, 예를 들면 진다이아(등록 상표), DLC 칩이 예시된다. 다수의 2본쇄 DNA를 고밀도로 결합 가능하기 때문에 다이아몬드 박막을 갖는 기판이 바람직하고, 특히 진다이아^TM이 바람직하다. 다이아몬드 박막은 임의의 지지체, 예를 들면 실리콘 기판상에 형성할 수 있다.

다이아몬드 박막상에, 아미노기, 카르복실기 등의 치환기를 도입하는 방법의 개략을 도 20에 나타낸다.

DNA와 기판의 결합은 커플링 시약에 의해 행할 수 있다. 커플링 시약으로서는, 통상의 펩티드 결합을 형성하는 데 사용되고 있는 시약을 들 수 있고, 예를 들면 카르보디이미드류(DCC, WSC), 카르보닐디이미다졸 등이 예시된다. 또는, 기판의 COOH 말단기를 상기 카르보디이미드류, 특히 수용성 카르보디이미드를 사용하여, N-히드록시숙신산이미드, 1-히드록시벤조트리아졸 등의 활성 에스테르로 만들고, 5' 또는 3' 말단측에 아미노기 등의 결합성기를 갖는 DNA를 결합할 수 있다. DNA와의 결합은, 보다 적합한 스페이서를 개재하여 행하는, 기판과 DNA와의 거리를 적당하게 떨어뜨릴 수도 있고, DNA의 결합 부위와 전사 인자의 결합 부위 사이에 적합한 서열(예를 들면, 프로모터 유래의 서열)을 개재시켜, 전사 인자의 결합 서열을 트랜스크립션 칩의 기판으로부터 떨어뜨릴 수 있다. 적당한 프로모터를 사용함으로써, 표면으로부터 일정 스페이스를 유지한 상태에서 전사 인자의 결합 서열을 고정하는 것이 가능해지고, 전사 인자의 분석을, 전사 인자의 이동성을 확보하 면서 행할 수 있다.

본원 실시예에서는 5' 말단에 NH₂(CH₂)₁₂를 갖는 폴리뉴클레오티드를 사용하였다. 이러한 5' 또는 3' 말단에 아미노기와 같은 결합성기를 갖는 치환기(예를 들면, NH₂(CH₂)₁₂)를 구비한 수식 올리고뉴클레오티드는 공지된 방법에 따라서 제조할 수 있고, 예를 들면 이하의 공개된 방법 및 일본 특허 공고 (평)3-74239호 공보에 따라서 제조할 수 있다.

http://www.eurogentec.be/upload/Oligo_catalogue/oligo_10.pdf

http://www.glenres.com/ProductFiles/10-1912.html

http://www.fasmac.co.jp/

본 발명의 칩은, 기판상에 2본쇄 DNA를 결합시켜 상기 2본쇄 DNA의 엘리멘트 서열에 전사 인자를 결합시키고, 상기 결합 전사 인자를 질량 분석 또는 항체를 사용하는 등의 적당한 검출 방법에 따라서 검출하기 위해서 사용한다.

2본쇄 DNA의 결합은, 5' 또는 3' 말단측에 아미노기 등의 반응성기(이것을 개재하여 기판에 폴리뉴클레오티드를 결합시킴)를 갖는 1본쇄 DNA를 기판에 결합시킨 후에 이것과 상보성의 폴리뉴클레오티드를 혼성화시켜 행할 수도 있고, 또는 하나 이상의 쇄 결합성기(예를 들면 NH2)를 갖는 2본쇄 DNA를 직접 기판에 결합시킬 수도 있다.

이와 같이 하여 제조된 트랜스크립션 칩은, 다음에 전사 인자를 포함할 수 있는 시료와 접촉시켜, 전사 인자를 칩 상에 결합시킨다. 이러한 시료로서는, 포 유류 세포의 세포 용해물(cell lysate)이 바람직하고, 특히 인간 세포의 세포 용해물이 바람직하다. 예를 들면 각종 인간 세포를 다양한 배양 조건 또는 다양한 피검 물질의 존재하에서 배양하고, 그 세포 용해물의 전사 인자를 본 발명의 칩을 사용하여 프로파일링함으로써 전사 인자에 미치는 각종 인자의 영향을 정량적으로 평가할 수 있다.

전사 인자의 정량은, 상기 전사 인자에 대한 항체를 사용하여 ELISA법 등의 공지된 방법을 사용하여 면역학적으로 측정하거나, 또는 질량 스펙트럼을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 질량 스펙트럼으로서는, 전사 인자를 직접 질량 스펙트럼에서 측정할 수도 있지만, 칩에 결합한 전사 인자를 트립신과 같은 적당한 프로테아제로 소화시켜, 얻어진 펩티드 단편을 질량 스펙트럼에 의해 분석하고, 상기 전사 인자의 프로테아제 소화물의 질량 스펙트럼 패턴(질량 핑거프린트)과 비교하여, 결합된 전사 인자의 동정, 정량 분석을 행하는 것이 바람직하다. 질량 스펙트럼으로서는, MALDI-TOP 등이 바람직하게 예시된다.

ELISA법은 트리스계, 탈지유계, 젤라틴계, 에탄올아민계 등의 다양한 블로킹제로 처리하여, 특이성을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는, FITC 등의 플루오레세인, 로다민, cy2, cy3, cy5 등의 형광 색소, 아크리디움 에스테르, 루미놀, 발광성 아다만탄 화합물 등의 발광 물질 등으로 표지하는 것이 바람직하다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세하게 설명한다.

실시예 1

(1) 실험 재료와 방법

(i) 실험 장치

형광 스캐너: CRBIO II(히타치 소프트웨어(주))), 마이크로어레이어: SPBIO(히타치 소프트웨어(주)), 마이크로플레이트 리더: μQuant(BIO-TEK), 플레이트 쉐이커: 마이크로믹서(Micromixer) MX-4(산꼬 쥰야꾸), CO₂인큐베이터: HERAcell(겐드로(Kendro)), 질량 분석 장치: ABI4700 프로테오믹스 분석기(Proteomics Analyzer)(어플라이드 바이오시스템즈), 보야져(Voyager)-DE STR(어플라이드 바이오시스템즈)

(ii) 실험 재료

칩, 플레이트: DLC 칩 C4(3 mmㆍ3 mm)(도요 고한(주)), 진다이아^TM C4(3 mmㆍ3 mm)(도요 고한(주)), 96웰 U저 마이크로플레이트(그라이너), NFκB(p50)(프로메가(promega))

항체: 항-NFκB p50 항체(액티브 모티프(Active motif)사), 항-NFκB p50 항체(록크랜드(Rockland) #100-4164), POD 표지 항 토끼 IgG(액티브 모티프), AP 표지 항 토끼 IgG(나카라이 테스크), FITC 표지 항 토끼 IgG(나카라이 테스크), BD 머큐리 트랜스팩터 키트 인플라메이션 1 (Mercury TransFactor kit Inflamation 1)(BD 바이오사이언시즈(Biosciences))

시약: WSC(도진(Dojin)), NHS(와코(Waco)), POD 발색 기질 TMBZ(스미토모 벡라이트(주) #ML-1120T), 활성화 완충액 1(10 mM WSC, 0.1 M MES(pH 4.5)), 활성화 완충액 2(100 mM WSC, 20 mM NHS, 0.1 NaPB(pH 6.0))(Activation buffer), 블로킹 완충액(1 M 트리스(Tris)-HCl(pH 8.0), 150 mM KCl, 0.1 ％ 트윈(Tween) 20), 결합 완충액(1 ％ BSA, 10 mM HEPES 완충액(pH 7.5), 10 ㎍/㎖ 연어 정자 DNA, 2 mM DTT, 100 배 희석 단백질 분해효소 억제제 칵테일(시그마(Sigma)), 세정 완충액(50 mM NaCl, 10 mM NaPB(pH 7.5), 0.1 ％ 트윈 20), 단백질 분석 시약(바이오라드(BioRad)), TNFα(와코 #203-15263), 포볼(Phorbol) 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(시그마 #P1585), 시나핀산 용액(1 mg/㎖ 시나핀산, 50 ％ 아세토니트릴, 0.1 ％ 트리플루오로아세트산(TFA)), α-시아노-4-하드록시신남산(αCHCA) 용액(1 mg/㎖ αCHCA, 50 ％ 아세토니트릴, 0.1 ％ TFA), 저염 농도 완충액(5 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM NaCl), 트립신 반응액(50 mM 중탄산암모늄, 0.1 내지 4 ㎍/㎖ 트립신), GFX 정제 키트(아마샴 #27-9602-01), NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약 (Nuclear and Cyptoplasmic extraction reagents)(피어스(PIERCE) #78833), 프로테오매스 (ProteoMass)^TM 펩티드 MALDI-MS 보정 키트

올리고뉴클레오티드: 이하의 프라이머 및 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 하선부는 전사 인자의 인식 서열(엘리멘트 서열)을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는, 2본쇄의 최종 농도 50 μM가 되도록 상보쇄와 함께 혼합하여 95 ℃에서 5 분간 열 처리 후 서서히 냉각시켰다.

(PCR 프라이머)

(고정화한 올리고뉴클레오티드)

PRD II:

(iii) 실험 방법

i. 엘리멘트 서열 고정화 칩의 제조(ELISA 용)

폴리프로필렌제 96웰 U저 마이크로플레이트에 칩을 코팅면을 위로 하여 칩(DLC 또는 진다이아^TM)을 셋팅하였다. 다음에 각종 농도의 2본쇄 DNA 엘리멘트 서열을 포함하는 활성화 완충액 1을 50 ㎕ 첨가하여 플레이트를 밀봉하였다. 이어서, 1 시간 실온에서 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 2회 세정한 후, 블로킹 완충액을 200 ㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕한 후, 4 ℃에서 보존하였다.

ii. 칩 상 효소-연결 면역흡광 분석법(On Chip Enzyme-linked Immunosorbent Assay)(칩 상 ELISA(On Chip ELISA))

세정 완충액으로 2회 세정 후, 결합 완충액으로 희석한 다양한 농도의 NFκB를 첨가하여 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 3회 세정 후, 항체 희석 완충액으로 2000배 희석한 항 NFκB 항체를 첨가하여 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 3회 세정 후, 항체 희석 완충액으로 2000배 희석한 POD 항 토끼 IgG 2차 항체를 첨가하고, 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 5회 세정 후, POD 발색 기질 TMBZ의 흡광에 기초하는 450 nm의 파장을 세정한 마이크로플레이트 리더로 측정하였다.

iii. HeLa 세포 추출액의 제조

250 cm² 샤알레를 이용하여 25 ㎖의 10 ％ 소태아 혈청(FBS)를 첨가한 DMEM 배지에서 HeLa 세포를 70 ％ 컨플루언트될 때까지 CO₂ 인큐베이터에서 37 ℃로 배양하였다. 무혈청 배지로 교환 후, TNFα를 100 ng/㎖가 되도록 첨가하고, 30 분간 CO₂ 인큐베이터에서 37 ℃로 배양하였다. 셀 스크레이퍼로써 세포를 박리시킨 후, 원심 분리(×1000 g, 5 분)로 배지를 제거하였다. PBS를 첨가하여 혼합한 후, 다시 원심 분리(×1000 g, 5 분)를 행한 후, 상청을 폐기하였다. 세포를 포함하는 침전에 세포 용해 완충액을 첨가하여 세포를 용해시키고, 원심(×1000 g, 5 분) 후, 상청을 회수하고, 단백질 농도를 측정하였다. 1매의 칩당 60 ㎍의 세포 추출액 유래 단백질을 이용하여 칩 상 ELISA를 행하였다. 한편, 전사 인자의 프로파일링에는, TNFα 자극(100 ng/㎖), PMA 자극(1 μM)한 HeLa 세포 및 대조군 세포 유래 의 핵 추출액을 이용하였다. 핵 추출액에는 피어스의 키트를 이용하였다. 1매의 칩당 20 ㎍의 핵 추출액 유래 단백질을 이용하여 칩 상 ELISA를 행하였다.

iv. 칩에의 2본쇄 DNA의 어레이화

폴리프로필렌제 96웰 U저 마이크로플레이트에 칩을 코팅면을 위로 하여 DLC칩을 셋팅하였다. 그 후, 활성화 완충액 2를 50 ㎕ 첨가하여 플레이트를 밀봉하였다. 이어서, 30 분 실온에서 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 증류수로 2회 세정한 후, 원심에 의해 건조시켰다. 마이크로어레이어 내에 활성화시킨 DLC를 셋팅한 후, 25 μM, 30 ％ 글리세롤이 되도록 제조한 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 150 μm 핀을 이용하여 활성화시킨 DLC상에 스폿팅하였다. 50 ℃에서 12 시간 인큐베이팅한 후, 블로킹 완충액을 사용하여 블로킹한 후 4 ℃에서 보존하였다.

v. 트랜스크립션 칩 어레이의 형광 검출

세정 완충액으로 2회 세정 후, 결합 완충액으로 100 ng/㎖로 희석한 NFκB를 첨가하고, 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 3회 세정 후, 항체 희석 완충액으로 100배 희석한 항 NFκB 항체(RCK사)를 첨가하여 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 3회 세정 후, 항체 희석 완충액으로 50배 희석한 FITC 표지 항 토끼 IgG 항체를 첨가하여 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 2회 세정 후, 레이저 파장 473 nm에서 여기하고, FITC의 형광에 기초한 535 nm의 형광 파장을 CRBIO II 마이크로어레이 스캐너에서 검출하였다.

vi. MALDI-TOP MS에 의한 트랜스크립션 칩에 포착된 전자 인자의 검출

폴리프로필렌제 96웰 U저 마이크로플레이트에 칩을 코팅면을 위로 하여 칩 (DLC 또는 진다이아^TM)을 셋팅하였다. 다음에 각종 농도의 2본쇄 DNA 엘리멘트 서열을 포함하는 활성화 완충액 1을 50 ㎕ 첨가하여 플레이트를 밀봉하였다. 이어서, 1 시간 실온에서 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 2회 세정한 후, 블로킹 완충액을 200 ㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 진탕한 후, 4 ℃에서 보존하였다. 세정 완충액으로 2회 세정 후, 결합 완충액으로 희석한 다양한 농도의 NFκB를 첨가하여 1 시간 실온에서 진탕하였다. 세정 완충액으로 3회 세정 후, 저염 농도 완충액으로 세정하였다. 그 후, 칩을 원심에 의해 건조시켰다. MALDI 플레이트에 칩을 양면 테이프로 고정한 후, 1 mg/㎖의 시나핀산 용액 1 ㎕를 매트릭스로서 칩에 첨가하여 건조시켰다.

vii. 칩 상 분해와 펩티드 질량 핑거프린트 (Peptide Mass Fingerprint)

칩을 새로운 ELISA 플레이트에 옮기고, 칩 표면에 1 ㎕의 트립신 반응액을 첨가하여 2 내지 6 시간 37 ℃에서 인큐베이팅한 후, 1 ㎕의 0.1 ％ TFA를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 그 후, 1 mg/㎖의 αCHCA 용액 1 ㎕를 매트릭스로서 칩에 첨가하여 건조시켰다. 그 중 0.5 ㎕는 MALDI 플레이트에 스폿팅하였다. 펩티드 맵은 MS-Fit Search를 이용하여 해석하였다.

viii. 탠덤(tandem) 질량 스펙트럼에 의한 포착 분자의 동정

상술한 방법을 이용하여 DLC에 NFκB를 포착하고, 칩 상 트립신 소화를 행하였다. 이어서, ABI 4700 프로테오믹스 분석기(Proteomics Analyzer)에서 프로테오매스^TM 펩티드 MALDI-MS 보정 키트를 질량 보정에 사용하여, 펩티드 질량 핑거프린 트를 취득하였다. 얻어진 NFκB의 PMF를 탠덤 질량 해석에 사용하였다.

(3) 실험 결과

(A) 기초적 조건 검토

i. 진다이아^TM 및 DLC 칩에의 2본쇄 DNA의 고정화

NFκB가 인식하는 엘리멘트 서열 중, 인터페론 β1 유전자의 상류 서열에 있는 엘리멘트 영역을 포함하는 영역을 PRD F 프라이머 및 PRD RI 프라이머를 사용하여 PCR법으로 취득하였다(PRD II-1, 도 2). PCR 산물을 GFX 정제 키트를 사용하여 정제한 후 고정한 바, DLC 칩, 진다이아^TM 모두 2본쇄 DNA가 결합된 것을 확인하였다(도 3).

ii 칩 상 ELISA 최적 조건의 검토(DLC)

a. 경합 저해 실험

칩에 고정화된 2본쇄 DNA에서 전사 인자를 포착하여, ELISA에 의해 특이적으로 검출하는 것이 가능한지 어떤지를 검토하기 위해서, 결합 완충액 중에 PRD II-1을 첨가하고, 고정화한 PRD II-1이 NFκB와의 결합에 있어서 경합하는가 어떤가를 검토하였다. 한편, 대조군으로서 결합 완충액 중에 고정화한 PRD II-1 서열을 포함하지 않은 2본쇄 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 실험하였다. 그 결과, 결합 완충액 중에 PRD II-1을 첨가한 경우에는 농도 의존적으로 NFκB의 칩에의 포착은 강하게 저해되었지만, 대조군 서열을 이용한 경우에는 거의 저해 효과는 보이지 않았다(도 4). 이상의 점으로부터, NFκB는 DLC 칩 상의 PRD II 서열을 특이적으로 인 식하여 결합하고 있는 것이 시사되었다.

b. DNA 고정화 서열의 검토

NFκB ELISA 조건을 검토하기 위해서, 길이 또는 카피수가 상이한 엘리멘트 DNA 서열을 포함한 2본쇄 DNA를 PCR법 또는 합성법으로 제조하여 검토하였다. PRD II 서열을 1 카피 포함하는 PRD II-1과 PRD II-2를 비교한 경우, PRD II-2를 고정화하는 것이, NFκB를 포획하는 효율이 우수하였다(도 5). 또한, PRD II-2와 동일한 엘리멘트 서열을 6 카피 포함하는 PCR 산물(PRD II×6)을 비교하여도, PRD II-2가 고정화 효율이 우수하였다. 다음으로, PCR법을 이용하지 않고 인공 합성에 의해 제조한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 NFκB를 효율적으로 포착 가능한지 검토하였다. 면역 글로불린 유래 NFκB 결합 엘리멘트 서열 IgκB를 2 카피 포함하는 2본쇄 올리고뉴클레오티드, 및 PRD II 서열을 2 카피 포함하는 올리고뉴클레오티드 PRD II 어떤 것을 사용하여도, PRD II-2와 동등 또는 그 이상의 NFκB의 포획 효율을 나타내었다(도 5).

이상의 결과로부터, ELISA 검출계에 있어서는, PCR 산물 및 2본쇄 올리고뉴클레오티드의 말단측(고상화 부위와 반대인 액상측)에 NFκB 인식 서열이 근접한 인식 서열이 효율적으로 NFκB를 포획하는 것이 가능하고, 내부 인식 서열은 입체 장해에 의해 NFκB-항체 복합체가 접근하기 어려우며, 카피수는 NFκB의 포획에 중요하지 않은 것이 시사되었다. 그러나, AP1 서열을 고정화한 칩이나 DNA를 고정화하지 않은 네가티브 대조군로부터도 30 내지 50 ％ 정도의 발색이 보였기 때문에, 블로킹 조건을 검토하여 특이성을 향상시킬 필요가 있음이 명백해졌다.

c. 블로킹 조건의 검토

ELISA의 특이성을 향상시키기 위해서 각종 블로킹제를 검토하였다. 블로킹 완충액으로서, 트리스계(1 M 트리스-HCl(pH 8.0), 150 mM KCl, 0.1 ％ 트윈 20), 탈지유계(5 ％ 탈지유, 150 mM KCl, 0.1 ％ 트윈 20), BSA계(5 ％ BSA, 150 mM KCl, 0.1 ％ 트윈 20), 젤라틴계(2.5 ％ 젤라틴, 150 mM KCl, 0.1 ％ 트윈 20) 및 에탄올아민계(0.5 M 에탄올아민, 150 mM KCl, 0.1 ％ 트윈 20)를 이용하였다. 그 결과, 어느 것에서도 특이성에 대하여 큰 차이가 보이지 않았다(도 6). 이 후, 비단백성 블로킹제로서 트리스를 이용하였다. 또한, 블로킹 반응 시간을 실온 1 시간부터, 실온 1 시간 후에 4 ℃ O/N의 스텝을 부가함으로써 측정간 재현성을 높힐 수 있었다.

iii. 재현성의 검토

이전 항에서 최적화된 조건을 이용하여 DLC 칩의 동시 재현성 및 측정간 재현성을 검토하였다. 그 결과, 동시 재현성, 측정간 재현성에 있어서 양호한 성적을 나타내었다(도 7).

iv. 진다이아^TM(다이아몬드 칩)과 DLC 칩의 비교

a. 농도 변화에 의한 정량성의 비교

DLC 칩과 진다이아^TM의 성능을 비교하기 위해서 각종 NFκB 농도에서 동일한 조건으로 비교하였다. 그 결과, 거의 동일한 정량성을 나타내었지만, 저농도 영역에서 진다이아^TM의 대부분이 NFκB 검출에서 우수하였다(도 8).

b. 검출 한계의 비교

저농도 영역(10 ng/㎖) 이하에서의 프로파일을 상세하게 해석하기 위해서, 각각의 칩에서 검출 한계의 산정을 시도하였다. 그 결과 진다이아^TM에서는 1.0 ng/㎖, 0.33 ng/㎖ 모두에서 PRD II를 고정화한 칩은, AP1 서열을 고정한 서열과 DNA를 고정화하지 않은 칩에 대하여, 유의차 수준 5 ％로 유의차 판정하면 유의차가 보였지만, DLC는 1.0 ng/㎖(20 pM)에서만 AP1 고정화 칩 및 DNA를 고정화하지 않은 칩에 대하여 유의차가 보였다(도 2.1. 3-9). 또한, 0.33 ng/㎖에 있어서는 AP1 고정화 칩에 대해서만 유의차가 보였기 때문에, 검출 한계는, AP1을 대조군으로 한 경우에는 모두 33 ng/㎖(6.7 pM) 이하인 것이 밝혀졌다. 따라서, pM 오더의 저농도 샘플로부터 NFκB를 검출 가능한 것이 시사되었다. 이로부터 다른 전사 인자에 대해서도 동일하게 고감도인 칩 상 ELISA 시스템의 구축이 가능하다고 생각된다.

(B) 트랜스크립션 칩의 응용

i. 세포 배양액으로부터의 전사 인자의 검출

HeLa 세포의 배양 세포 추출액으로부터 전사 인자 NFκB p50을 포착할 수 있는지 어떤지 칩 상 ELISA를 행하여 검토하였다. 그 결과, TNFα(100 ng/㎖)로 자극한 세포 추출액으로부터는, TNFα 자극을 하지 않은 대조군 세포 추출액과 비교하여, PRD II를 고정화한 칩으로부터 강한 발색이 보였다(도 10A).

그 외의 전사 인자에 있어서도 TNFα 자극 또는 PMA 자극(10 nM) 처리를 행함으로써, 다양한 전사 인자의 발현량이 변동하는지 어떤지 검토하였다. 본 방법 에서는 AP 표지 2차 항체를 사용하였다. 그 결과, NFκB p50 이외에도 많은 전사 인자(NFκB p65, c-Rel, c-Fos, c-Jun, ATF2, CREB)를 특이적으로 포착할 수 있었다(도 10B).

ii. 트랜스크립션 칩의 마이크로어레이화

지금까지 DNA 2본쇄를 고상으로 고정화하여 DNA 결합 단백질을 포착하고, ELISA법을 이용하여 검출하는 시험을 행하여 왔지만, 작업 처리성이나 다중 동시 검출수가 한정되기 때문에, 프로테옴 해석을 위한 기술로서 문제는 해결되지 않았다. 본 항에서는, 이들 방법을 대신하는 기술로서 DLC 칩을 이용한 트랜스크립션 마이크로어레이 칩의 개발에 대하여 보고한다.

a. 2본쇄 DNA의 어레이화의 검토

FITC 표지된 PRD II 올리고뉴클레오티드를 9 스폿 고정화한 DLC 칩을 CRBIO II 형광 스캐너를 이용하여 검출하였다(도 11). 어레이어를 이용하여 스폿한 경우에도 동일하게 2본쇄 DNA를 고정화할 수 있음이 명백해졌다.

b. 트랩스크립션 마이크로어레이 칩으로부터 NFκB의 특이적 검출

FITC 표지를 행하지 않은 PRD II, AP1, p53, VDRE, RARE, CRE, TRE, GRE, ERE의 9종의 엘리멘트 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 동일하게 DLC 칩상에 고정화하였다. 이 9종의 전사 인자를 어레이화한 DLC 칩에 NFκB(100 ng/㎖)를 첨가하고, 형광 면역 분석에 의해 검출을 시도하였다. 그 결과, NFκB의 인식 서열인 PRD II를 포함하는 올리고뉴클레오티드로부터만 형광이 검출되었다. 이상으로부터, NFκB는 엘리멘트 서열을 어레이화한 DLC 칩 상에서 특이적으로 검출할 수 있 음이 명백해졌다(도 12). 따라서, 다른 엘리멘트 서열에 결합하는 전사 인자를 특이적으로 인식하는 항체를 조합함으로써, 한번에 복수의 전사 인자를 소량의 샘플로부터 검출하는 시스템을 구축하는 것이 가능해진다.

iii. MALDI-TOF MS에 의한 전사 인자의 검출

전사 인자를 0n chip ELISA로 검출하는 방법은, 특이적 항체를 사용하여 동시에 많은 전사 인자를 해석하는 시스템으로서는, ELISA나 겔 이동 분석과 비교한 경우, 작업 처리성이 우수한 방법이다. 그러나, 이 시스템은 기지의 전사 인자를 검출하는 것은 가능하지만, 미지 단백질의 동정은 불가능하다. 현재의 프로테옴 해석에 있어서는, 미지 단백질의 동정은 매우 중요한 명제이기 때문에, 트랜스크립션 칩을 이용하여 단백질을 동정하는 기술 개발은 매우 유용성이 높다고 생각된다. 본 항목에서는 MALDI-TOF MS 질량 분석계를 이용한 전사 인자의 검출법의 개발에 대하여 보고한다.

a. 칩 상 분해법에 의한 NFκB의 펩티드 질량 핑거프린트(PMF)

칩 상에서 트립신 분해를 행하는 것은 일반적으로는 곤란하다. 그 원인으로서, 소수 표면상에서의 효소 활성의 실활, 또는 입체 장해에 의한 기질 부위의 마스킹 등을 들 수 있다. 그러나, 트랜스크립션 칩은 저염 농도에서 2본쇄 DNA가 해리하기 때문에, DNA 단백질 상호 작용이 저염 농도에서는 실활되어 용이하게 단백질이 효소 반응액 중에 유리되는 것, 또한 칩 표면은 DNA가 공유 결합으로 고정되어 있기 때문에 친수성을 나타낸다고 생각되므로 트랜스크립션 칩은 칩 상 분해를 행하는 데 있어서 이상적인 칩이라고 생각되었다. 2 pmol/칩의 NFκB를 첨가하여 반응시킨 후, 칩 상 트립신 분해를 행하였다. 그 후, 칩 상에 존재하는 펩티드를 ZipTip 정제 칩에 의해 정제하여 MALDI 플레이트에서 검출, 또는 트랜스크립션 칩 상으로부터 직접 검출하는 2 가지 방법을 행하였다.

그 결과, 칩 상에서 트립신 분해를 행하고, ZipTip에 의해 정제 후, MALDI 플레이트에 시료를 첨가한 경우에는 이상적인 펩티드 맵이 관찰되었다(도 13). 또한 이것은, 용액 중에서 트립신(4 ㎍/㎖)을 이용하여 NFκB를 분해하여 관찰되는 펩티드 맵과 매우 잘 일치하고 있었다(도 14). 이 펩티드 질량 핑거프린트 정보를 바탕으로, MS-FIT Search에 의해 데이타베이스 검색을 행한 결과 NFκB가 매우 높은 점수로 히트(hit)하였기 때문에, 많은 NFκB 유래 펩티드를 포착한 것이 확인되었다.(도 15).

b. PMF법에 의한 비타민 D 수용체(VDR)의 칩 상 검출ㆍ동정

다음으로 500 fmol/칩의 비타민 D 수용체를, 그의 인식 서열인 엘리멘트 서열 VDRE를 고정화한 칩에서 트립신(1 ㎍/㎖)을 이용하여 칩 상 분해를 행한 후, MALDI 플레이트에 샘플을 첨가한 바, NFκB와 동일하게 용액 중에서 트립신 분해를 행한 시료와 동일하게 펩티드 맵이 얻어졌다(도 16, 도 17).

한편, 트랜스크립션 칩 상에 직접 레이저 조사를 행하여 직접 펩티드 맵을 관찰할 수 있는지 어떤지도 시도하였다. 그 결과, 칩 상으로부터 직접 VDR의 펩티드 맵을 관찰할 수 있었다(도 18).

c. 탠덤 질량 스펙트럼 해석에 의한 전사 인자의 동정

펩티드 질량 핑거프린트(PMF)법은, 질량 분석에 의한 시료 중에 함유되는 단 백질의 동정에 이용되지만, 얻어지는 스펙트럼 피크수가 적으면, 시료 중에 함유되는 목적 단백질의 동정을 행하기가 어렵다. 따라서, 협잡물이 많이 포함된 시료로부터, 목적으로 하는 단백질을 동정하는 경우, 탠덤 질량 스펙트럼 해석에 의한 동정이 자주 행해진다. 그러나, 탠덤 질량 스펙트럼은 일반적으로 펩티드 질량 핑거프린트법과 비교하면 감도가 낮다는 것이 난점이었다.

NFκB를 고정화한 트랜스크립션 칩으로부터, 질량 보정하여 얻어진 펩티드 질량 핑거프린트(도 21A)로부터, 1701.10 m/z, 1808.01 m/z, 2413.35 m/z의 피크에 대해서는, 탠덤 질량 해석을 행하였다(도 21B, C, D). 각각의 피크로부터, 2차 스펙트럼을 얻을 수 있었기 때문에, MASCOT 데이타베이스 검색에 이들 분석 결과를 사용하였다. 그 결과 모든 펩티드가 NFκB의 데이타베이스상의 질량 데이타와 잘 일치하였다(도 22). 이상의 결과는, 트랜스크립션 칩이 엘리멘트 DNA를 통하여 효율적으로 NFκB를 포착하는 것이 가능하고, 그 결과 탠덤 질량 해석을 행할 수 있음을 제시한다.

(4) 본 발명의 응용 가능성

(A) 트랜스크립션 칩을 이용한 전사 인자 고감도 정량 검출

엘리멘트 서열을 DLC 칩 또는 진다이아^TM상에 고정화한 칩(트랜스크립션 칩)에 단백질(전사 인자)을 포착시켜, 고감도로 특이성이 높은 실험계를 구축하고, 고감도인 정량 검출계를 확립하는 것이 본 연구의 제1 대과제이다. 이 과제를 해결하기 위해서는, 전사 인자의 포착능이 높은 DNA 고정화 칩을 제조하고, 전사 인자 나 항체의 비특이적 결합을 가능한 한 억제할 수 있는 분석계의 확립이 중요했다. 블로킹 조건 등 결합 반응 조건의 검토, 고정화한 DNA 서열을 검토함으로써 이상의 과제에 대응하였다.

전사 인자 NFκB의 인식 서열(엘리멘트 서열) 부분은, 카피수보다 오히려 고정화한 2본쇄 DNA 내에서의 위치가 중요하다고 생각되는 결과가 얻어졌다(도 5). 2본쇄 DNA의 엘리멘트 서열의 위치가 액층측에서 가까운 것이 NFκB의 포착능이 높았다. 올리고뉴클레오티드의 표면측에서 떨어진 위치에 존재하는 내부의 인식 서열은 입체 장해에 의해 전사 인자-항체 복합체가 형성되기 어려운 것이 시사되었다. 따라서, 고감도인 검출을 실현하는 일반적인 방법으로서, 2본쇄 올리고뉴클레오티드의 표면측(고상화 부위와 반대측) 근처에 엘리멘트 서열을 설계하는 것이 전사 인자의 포착능에 중요하다고 시사되었다. 고정화하는 DNA에는 올리고뉴클레오티드, PCR 산물 모두 고정화가 가능한 것이 밝혀졌기 때문에, 올리고뉴클레오티드를 이용한 통상의 분석에 더하여, 어떤 특정 유전자 영역을 PCR법에 의해 취득하여 고정화함으로써, 특정 유전자 영역에서의 전사 개시 복합체에 대하여 장래 해석이 가능해질 것으로 생각되었다.

분석의 비특이적 결합을 감소시키기 위해서는 블로킹 조건의 검토는 중요하였다. 결합 완충액 중의 BSA 농도가 1 ％인 경우가 최적인 조건이었다. 또한, 실험계 구축시에 있어서, 비특이적 결합의 영향이라고 생각되는 음성 대조군으로부터의 분석값의 상승은 자주 보였지만, 트리스 완충액을 이용한 블로킹의 시간을 길게 잡음으로써(4 ℃, O/N), 재현성이 높은 실험계를 구축할 수 있었다(도 7).

이상의 점을 중심으로 검토한 결과, 최종적으로 진다이아^TM를 이용한 경우, 0.33 ng/㎖까지, DLC 칩을 이용한 경우 1.00 ng/㎖까지 검출 한계가 얻어졌다. 또한, HeLa 세포핵 추출액을 이용하여, TNFα 자극이나 PMA 자극에 의해 활성화된 염증계 전사 인자의 단백질 수준의 프로파일링을 행하는 것이 가능해졌다

(B) 2본쇄 DNA의 고집적화(마이크로어레이화) 칩을 이용한 전사 인자의 검출

소규모의 연구 용도로서는, 종래 기술에서 이미 전사 인자의 프로파일링ㆍ정량에 대해서는 달성되었다고 할 수 있지만, 금후의 프로테옴 해석적인 입장에서의 진단ㆍ약 개발에의 지원 시스템으로서는, 작업 처리성과 샘플 소비량의 점에서 고려한다면 실용화에는 이르지 못한 실정이다.

본 성과의 칩 상 ELISA의 결과에서 나타난 바와 같이, 3 mm×3 mm 크기로 정량적 측정이 가능하였기 때문에, 유리 슬라이드 2매 정도의 크기로 96웰 마이크로플레이트와 동일한 수의 정량적인 고감도 측정이 가능해졌다.

또한, 칩 상 형광 면역 분석에 있어서는, 2본쇄 DNA를 마이크로어레이화한 트랜스크립션 칩을 제조함으로써, 2본쇄 DNA를 3 mmㆍ3 mm 크기의 칩으로 9 스폿의 DNA를 고정화한 칩으로부터 NFκB가 PRD II 서열에 특이적으로 결합한 것을 모니터링할 수 있었다(도 12).

(C) MALDI-TOF MS를 이용한 전사 인자의 검출 및 동정

질량 분석계를 이용하여 단백질을 검출함으로써, ELISA에서는 검출이 곤란한, 미지 단백질의 검출ㆍ동정 또는 번역 후 수식의 해석 등이 가능해진다.

현재, 사이페르젠(Ciphergen)사 SELDI-TOE MS를 이용한 단백 칩 시스템이 시판되고 있고, 이 시스템을 이용하여 항체를 고정화한 단백 칩이 개발되어 있지만, 작업 처리성, 질량 분석 정밀도의 점에서는 충분하다고 할 수 없다.

한편, DNA를 고정화한 트랜스크립션 칩에 대해서도, 전사 인자는 일반적으로 분자량이 5만 정도인 것이 많고, 질량 정보로부터 동정을 행하는 것은 현재 질량 분석계의 정밀도로는 곤란하였다, 따라서, 트립신 분해에 의한 펩티드 질량 핑거프린트법을 이용하여, DNA를 고밀도로 고정화 가능한 다이아몬드(DLC) 칩과 MALDI-TOP MS를 이용한 시스템을 이용하면, 칩 상으로부터 직접 전사 인자의 분자의 질량 정보를 취득할 수 있지 않을까라고 생각하여, 검출 시스템을 제조한 결과, 처음으로 칩 상으로부터의 직접 전사 인자의 검출ㆍ동정을 실현할 수 있었다(도 18). 또한, 탠덤 질량 스펙트럼 해석과 조합함으로써, 칩에 포착된 전사 인자의 검출ㆍ동정을 행하는 것이 가능해졌다(도 21).

본 발명에 따르면, 칩 상 ELISA에 의해 고감도인 트랜스크립션 칩을 이용한 다수의 전사 인자의 프로파일링이 실현되고, 배양 세포 추출액이나 조직으로부터 전사 인자를 고감도로 검출ㆍ정량화가 가능해지며, 약 개발시에 스크리닝이나 독성 예측의 툴로서, 또는 진단 정보의 툴로서 사용 가능하다.

또한, 펩티드 질량 핑거프린트법을 사용하여 직접 칩 상에서 전사 인자의 동정을 행하는 것이 가능하다. 또한, 탠덤 질량 스펙트럼 해석이 가능하였기 때문에, 협잡물을 포함하는 시료 중으로부터 전사 인자를 동정할 수 있다.

이온화 레이저의 촛점 위치에 대응하는 트랜스크립션 칩(도 19)을 이용함으 로써 종래부터 사용되고 있는 MALDI 플레이트 이상의 감도 및 정밀도를 유지한 전사 인자의 검출 및 동정을 행할 수 있다.

본 발명에 의해 효율적으로 전사 인자를 프로파일링할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Transcription Tips <130> P04-37 <160> 22 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 1 cctcacagtt tgtaaatctt tttccc 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 2 ggcctattta tatgagatgg tcctc 25 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 3 agaggaattt cccactttca cttc 24 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 4 gggagctgag tagggaaatt ccatgcatgc gggaaattcc catg 44 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 5 catgggaatt tcccgcatgc atggaatttc cctactcagc tccc 44 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 6 catgggaatt tcccgcatgc atggaatttc cctactcagc tccc 44 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 7 gggagctgag taggggatcc catgcatgcg gggatcccca tg 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 8 catggggatc cccgcatgca tgggatcccc tactcagctc cc 42 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 9 gggagctgag tatgactcat atgcatgctg actcatcatg 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 10 catgatgagt cagcatgcat atgagtcata ctcagctccc 40 <210> 11 <211> 54 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 11 gggagctgag taaggtcaag gaggtcaatg catgcaggtc aaggaggtca catg 54 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 12 catgtgacct ccttgacctg catgcattga cctccttgac cttactcagc tccc 54 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 13 gggagctgag taaggtcacc aggaggtcaa tgcatgcagg tcaccaggag gtcacatg 58 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 14 catgtgacct cctggtgacc tgcatgcatt gacctcctgg tgaccttact cagctccc 58 <210> 15 <211> 54 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 15 gggagctgag taaggtcaca gtgacctatg catgcaggtc acagtgacct catg 54 <210> 16 <211> 50 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 16 tcaggtcaca gtgacctgat ctcaggtcac agtgaccttt cacgaggtac 50 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 17 gggagctgag taaggtcatg acctatgcat gcaggtcatg acctcatg 48 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 18 catgaggtca tgacctgcat gcataggtca tgaccttact cagctccc 48 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 19 gggagctgag taagaacact gtgttctatg catgcagaac actgtgttct catg 54 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 20 catgagaaca gactgttctg catgcataga acagactgtt cttactcagc tccc 54 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 21 gggagctgag tatgacgtca atgcatgctg acgtcacatg 40 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Transcription Factor <400> 22 catgtgacgt cagcatgcat tgacgtcata ctcagctccc 40

Claims

전사 인자가 결합할 수 있는 1종 이상의 엘리멘트 서열을 포함하는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드가 기판상에 고정되어 이루어지는 트랜스크립션 칩.
제1항에 있어서, 각각에 전사 인자가 결합할 수 있는 1종 이상의 엘리멘트 서열을 포함하는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드가 결합되어 이루어지는 칩.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 각 유전자의 상류(5')측에 프로모터의 부분 서열을 갖는 것인 칩.
제1항에 있어서, 상기 기판이 지지체상에 다이아몬드 박막을 형성하여 제조된 것인 칩.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 다이아몬드 박막과 임의로 적당한 스페이서를 개재하여 결합한 것인 칩.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스크립션 칩에 전사 인자를 포함할 수 있는 시료를 작용시키는 공정을 포함하는, 전사 인자의 결합을 분석하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 시료가 피검 물질의 존재하에서 배양시킨 세포의 세포 용해물인, 피검 물질의 전사 인자에 대한 영향을 평가하기 위한 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 전사 인자의 결합을 전사 인자에 대한 항체 또는 질량 분석을 이용한 방법을 사용하여 검출하는 방법.
제8항에 있어서, 항체를 이용한 검출이 ELISA법이고, 질량 분석을 이용한 방법이 펩티드 질량 핑거프린트법인 방법.