KR102100124B1 - 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법 - Google Patents

질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization), 또는 LDI(Laser Desorption/Ionization) Mass Spectrometry를 이용하여 miRNA 또는 항원 등의 단백질을 높은 민감도 및 높은 선택도로 검출하는 방법에 관한 것으로,
본 발명에 따른 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법을 통해, 표면질량분석법을 이용하여, 생체 분자를 높은 민감도와 높은 특이도로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 방법을 통해 생체 시료로부터 질병 마커로 알려져 있는 miRNA 등의 타겟 탐침(probe)을 정량함으로써 질병의 진단 및 예측에 활용 가능할 것으로 기대된다.

Description

질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법{Ultrasensitive and highly specific detection of biomolecules using mass spectrometry}
본 발명은 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization), 또는 LDI(Laser Desorption/Ionization) Mass Spectrometry를 이용하여 miRNA 또는 항원 등의 단백질을 높은 민감도 및 높은 선택도로 검출하는 방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA(miRNAs/miRs)는 살아있는 유기체에서 다양한 생물학적, 병리학적 현상에 관여하고 있으며, 이와 같이 가치 있는 바이오마커의 검출은 매우 중요한 것이다. 그러나, 이들의 존재량이 적고, 부서지기 쉬우며, 서열 간의 유사성으로 인해, miRNA는 검출하기 어려운 것이 일반적이다. 그 결과, miRNA 검출을 위한 플랫폼은 민감도, 서열 특이성, 표적의 비라벨링(no labeling) 및 멀티플렉스 분석(multiplex assay)을 필요로 한다.
중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 차세대 서열 해독(next-generation seqeucning), 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer), 전기화학 기반 방법, 국부 표면 플라즈마 공명-기반 방법(localized surface Plasmon resonance-based methods), 및 질량분석법(mass spectrometry, MS) 기반 방법이 이러한 요건을 충족시키기 위해 사용되었다. 이들 중 다수는 광학적 판독 기술에 의존한다.
이 중, 질량분석법은 분자량 정보를 제공하기 때문에 유용한 판독 도구이다. 질량분석법은 분자의 정확한 분자량(질량 대 전하비, m/z)을 측정할 수 있으며, 특정 물질에 고유한 동위원소 패턴을 식별할 수 있기 때문에, 분석 물질에 대한 라벨링 없이도 멀티플렉스 분석에 사용될 수 있는 결정적 정보 제공이 가능하다. , 특히, 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS)은 표면의 작은 분자를 높은 민감도로 측정하고 이미징 할 수 있는 강력한 표면 분석 도구이며, 이는 MALDI-ToF에서 종종 분석을 방해하는 매트릭스 처리 없이 수행된다.
생체 분자 검출은 결정적인 것이나, 생체 분자 간의 상관관계를 이해하는 것 또한 매우 큰 생물학적 중요성을 갖는다. 그러나, 질량 분석법은 미량의 생체 분자에 대한 검출 및 비공유 단백질-단백질 및 DNA-RNA 상호 작용에는 부적합하다. 또한, 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 규명은 종종 생물학적 혼합물의 분리 또는 분해를 필요로 한다. 실제로, 생체 분자 검출에서 질량 분석법의 한계를 극복하기 위해 대량 태그 기반 신호 증폭에 대한 시도가 있었으나, 이는 주로 작은 분자 또는 나노 입자의 항체와의 결합과 같은 광범위한 변형에 기반을 두고 있다. 따라서, 타겟과의 상호 작용에 영향을 줄 수 있는 변형 또는 수정 없이도 타겟 신호(target signal)에 대한 민감도가 증가하고, 높은 타겟 특이성(target specificity)을 갖는 새로운 질량 핑거프린트(mass fingerprint)의 개발이 절실히 요구된다.
또한, 일예로 질량 분석법을 사용한 miRNA의 검출은 PCR에 의한 유전자의 증폭을 위한 추가적 단계와, 이어지는 역전사(reverse transcription, RT), 및 라벨링(동위원소 라벨링 포함), 또는 시퀀싱이 필요하기 때문에 비용 및 시간의 측면에서 개선이 필요하다.
따라서, 생체 분자의 검출에 있어, 이와 같은 추가적인 단계를 필요로 하지 않는 보다 효율적인 방법의 개발이 절실한 상황이다.
대한민국 공개특허공보 제2009-0122638호.
Kim Y.K. et al. Nanoscale, 9, 10854 (2017).
상기와 같은 문제의 해결을 위해 본 발명에서는 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법을 제공하고자 하며, 보다 상세하게는 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization), 또는 LDI(Laser Desorption/Ionization) Mass Spectrometry를 이용하여 miRNA 또는 항원 등의 생체 분자를 높은 민감도(sensitivity) 및 높은 특이도(specificity)로 검출하여 정량하는 방법을 제공하고자 하였다.
또한 상기 정량 방법을 이용하여 생물 시료에서 타겟 miRNA 또는 항원 등을 검출함으로써, 암과 같은 질병의 진단 및 예측을 위한 마커로서 활용하는 방법을 제공하고자 하였다.
본 발명은 생체 분자를 결합시킨 효소와 반응하는 기질의 효소 반응에 의한 침전물을 생성하는 단계를 포함하는, 질량분석법(mass spectrometry)을 이용한 생체 분자의 정량방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 정량방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자의 정량을 위해 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제 1 탐침 분자를 금속에 고정하는 단계; 및
상기 고정된 제 1 탐침 분자와 상기 생체 분자를 반응시켜 생체 분자 복합체를 형성하는 단계;
본 발명에서 상기 정량방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자의 정량을 위해 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하기 단계는 상기 생체 분자 복합체를 형성하는 단계 이후에 연속적으로 이루어질 수도 있다.
제 2 탐침 분자를 상기 상기 고정된 제 1 탐침 분자와 상기 생체 분자를 반응시켜 형성된 생체 분자 복합체에 반응시켜 결합시키는 단계; 및
상기 결합된 제 2 탐침 분자에 효소 접합체를 결합시키는 단계;
본 발명에서 상기 생체 분자는 정량방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 세포, DNA, RNA, 유전자, 저분자 물질(small molecule), 마이크로 RNA(miRNA), 또는 단백질일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제 1 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 티올-개질(thiol-modification)을 통해 금속 표면에 고정될 수 있다.
본 발명에서 상기 효소 접합체는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 효소에 상기 제 2 탐침 분자와 상호 작용하는 물질이 접합된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 단백질은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 항원(antigen)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 생체 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 마이크로 RNA(miRNA)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 생체 분자가 항원인 경우, 상기 제 1 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자와 결합하는 항체일 수 있다.
본 발명에서, 상기 생체 분자가 miRNA인 경우, 상기 제 1 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자에 상보적인 서열을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제 2 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 비오틴화 신호 탐침을 포함하고, 상기 효소 접합체는 상기 비오틴화 신호 탐침과 결합하여 고정될 수 있다.
본 발명에서, 상기 효소는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, HRP(Hoseradish peroxidase), AP(alkaline phosphatase) 및 β-gal(β-galactosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명에서, 상기 기질은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 4-chloronaphthol, DAB(3,3′AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/NBT(nitro blue tetrazolium), TR/Naphthol AS-MX(4-Chloro-2-methylbenzenediazonium/3-Hydroxy-2-naphthoic acid 2,4-dimethylanilide phosphate), X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside), S-gal(3,4-Cyclohexenoesculetin β-D-galactopyranoside), Bluo-gal(5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside) 및 Red-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
본 발명에서, 상기 질량분석법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 일예로 표면질량분석법일 수 있으며, 보다 구체적인 일예로 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), 말디-질량분석법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry, MALDI-MS), 레이저 탈착/이온화 질량분석법(Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry; LDI-MS), 탈착 전자 스프레이 이온화 질량분석법(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry, DESI-MS), 또는 실시간 직접 분석 질량분석법(Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry, DART-MS) 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 정량방법에 의해 측정된 이차 이온질량(m/z) 픽의 패턴을 지표로 하는 질병 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 질병은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 위암일 수 있다.
본 발명에서, 상기 패턴은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 이차이온 질량이 1 내지 1000 영역의 총 누적 강도 또는 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)될 수 있다.
본 발명에서, 상기 질병 진단방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 질병을 보유하지 않은 정상인의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 정상 패턴 및 상기 질병을 보유한 환자의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 질병 패턴에서 하나 이상 선택된 기준 패턴과 상기 질병 보유 가능자의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대상 패턴을 비교하여 이차 이온질량 픽들의 위치 변화, 이차 이온질량 픽들의 강도 변화, 이차 이온질량 픽들의 소멸, 이차 이온질량 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 진단될 수 있다.
본 발명에 따른 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법을 통해, 표면질량분석법을 이용하여, 생체 분자를 높은 민감도와 높은 특이도로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 방법을 통해 생체 시료로부터 질병 마커로 알려져 있는 miRNA, 항원 등의 타겟 탐침(probe)을 정량함으로써 질병의 진단 및 예측에 활용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 효소반응을 이용하는 ToF-SIMS에 의한 a) 항원 검출을 위한 전략, b) 초고감도 miRNA 검출을 위한 신호 증폭 전략에 관한 것이다.
도 2는 a) 알칼라인 포스포타아제(AP)의 효소 반응에 의한 불용성 생성물 형성 반응의 메커니즘, b) 인터페론 감마(IFN-γ)의 농도에 따른 피크의 세기에 관한 것이다.
도 3은 a) 3-아미노-9-에틸카르바졸(3-amino-9-ethylcarbazole), b) 4-클로로-2-메틸벤젠디아조니움(4-chloro-2-methylbenzenediazonium)/3-히드록시-2-나프토산 2,4-디메틸아니리드 포스페이트(3-hydroxy-2-naphthoic acid 2,4-dimethylanilide phosphate), 및 c) 5-브로모-3-인돌릴 베타-D-갈락토피라노시드(5-bromo-3-indolyl β과 HRP, AP 및 β-gal 각각에 대한 효소 반응 산물의 ToF-SIMS 스펙트럼에 관한 것이다.
도 4는 β-gal에 의한 a) X-gal, b) S-gal, c) Red-gal의 효소 반응 산물, 및 d) β-gal에 의한 X-gal, S-gal 및 Red-gal 3 종류 기질의 존재 하의 멀티플레스 시험(multiplexed assay)의 ToF-SIMS 스펙트럼에 관한 것이다.
도 5는 a) MALDI-ToF 및 b), c) LDI-MS 분석을 통해 얻은 질량 스펙트럼에 관한 것이다.
도 6은 miR-let-7a의 존재 하에서 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP)의 효소반응에 의해 생성된 NBT-포르마잔의 검출에 관한 것이다.
a) 금(gold) 칩 상의 다양한 농도에서 miR-let-7a를 ToF-SIMS 측정하여 얻은 스펙트럼. b) NBT-포르마잔의 구조. c) miR-let-7a의 정규화된 강도 및 농도 사이의 관계. 데이터 포인트는 평균±표준 편차를 나타낸다.
도 7은 서열 특이적 miR-let-7a 검출(a-c), 및 인간 1차 위암 세포주로부터 전체 RNA 추출물에서 서열 특이적 miR-200a-3p 검출(d-e)에 관한 것이다.
a) miR-let-7a, miR-let-7c 및 miR-let-7f의 존재하에 ToF-SIMS로 측정 된 스펙트럼. b) miRNA의 서열. c) miR-let-7a, miR-let-7c 및 miR-let-7f의 존재하에 m / z 748.3에서 피크의 표준화 된 강도. d) ToF-SIMS에 의해 측정 된 m / z 748.3에서의 피크의 정규화 강도와 RT-PCR에 의해 분석 된 miR-200a-3p 발현 수준 사이의 관계. e) 버퍼 및 인간 위암 세포주인 SNU1의 총 RNA 추출물에 1 nM miR200a-3p의 존재하에 ToF-SIMS로 측정 된 스펙트럼(회색 스펙트럼 및 회색 그래프).
도 8은 HRP (a와 b), AP (a와 c), β(d)에 의해 생성 된 다양한 분자의 검출에 관한 것이다.
a) HRP 반응으로부터의 AEC 생성물인 Au (골드 칩으로부터)에 대응하는 m/z 196.97 (청색), 608.3 (녹색) 및 748.3 (적색) 피크에 의해 재구성된 ToF- 및 AP 반응으로부터의 BCIP / NBT의 생성물이다. b) HRP 효소 반응으로부터의 4-CN의 생성물에 상응하는 m/z 352.0 피크의 ToF-SIMS 스펙트럼 및 이미지 (삽입된, 청색). c) AP 효소 반응으로부터의 BCIP / NBT의 생성물에 상응하는 m/z 748.3 피크의 ToF-SIMS 스펙트럼 및 이미지 (삽입된, 녹색). d) β-gal 효소 반응으로부터의 S-gal의 생성물에 상응하는 m/z 231.1 피크의 ToF-SIMS 스펙트럼 및 이미지 (삽입된, 적색).
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 질량 분석법을 이용한 생체 분자의 고감도 및 고특이적 검출 방법에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에 있어 “탐침” 또는 “프로브”는 “probe”를 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에 있어 “시그널”, “신호”는 “signal”을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에 있어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서　항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 생체 분자를 결합시킨 효소와 반응하는 기질의 효소 반응에 의한 침전물을 생성하는 단계를 포함하는, 질량분석법(mass spectrometry)을 이용한 생체 분자의 정량방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 침전물은 후술하는 기질이 효소에 의해 변화하여 형성되는 불용성(insoluble) 물질을 포함하는 것으로, 금속 표면 상에 형성될 수 있으며, 이유는 알 수 없으나, 접착성을 가질 수 있어, 질량 분석을 위해 금속 표면을 세척시에도 기타 불순물과 함께 씻겨 내려가지 않아, 질량 분석 오차 발생을 감소시켜 주는 새로운 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명에서 상기 정량방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자의 정량을 위해 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다.
제 1 탐침 분자를 금속에 고정하는 단계; 및
상기 고정된 제 1 탐침 분자와 상기 생체 분자를 반응시켜 생체 분자 복합체를 형성하는 단계;
또한, 본 발명에서 상기 정량방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자의 정량을 위해 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다. 하기 단계는 상기 생체 분자 복합체를 형성하는 단계 이후에 연속적으로 이루어질 수도 있다.
제 2 탐침 분자를 상기 상기 고정된 제 1 탐침 분자와 상기 생체 분자를 반응시켜 형성된 생체 분자 복합체에 반응시켜 결합시키는 단계; 및
상기 결합된 제 2 탐침 분자에 효소 접합체를 결합시키는 단계;
본 발명의 일 실시예로부터, 상기 제 1 탐침 분자는 라벨링 없이 생체 분자와 상보적인 결합 등을 통해 특이적으로 결합하고, 이어서 바이오티닐화 신호 탐침(biotimylated signaling probe)와 혼성화된 후, 상기 혼성화된 신호 탐침의 바이오틴에 스트렙타비딘-효소 접합체 등이 결합하며, 이후, 가용성인 기질이 효소 반응을 통해 불용성 생성물(mass fingerprints)을 형성하였다. 이와 같이 형성된 유기 분자를 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry), LDI(Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry), 탈착 전자 스프레이 이온화 질량분석법(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry, DESI-MS) 또는 실시간 직접 분석 질량분석법(Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry, DART-MS) 등을 통해 분석하였다.
이하 상기 생체 분자의 정량을 위한 각 단계에 대해 상세히 설명한다.
제 1 탐침 분자는 후술하는 기능기-개질(functional group-modification)을 통해 금속 표면에 고정될 수 있으며, 상기 금속의 종류는 본 발명의 목적을 저해하지 않는 한 제한되지 않으며, 일예로 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt) 등의 금속 중에서 적절히 선택될 수 있으며, 이들의 합금의 형태로 제조하여 사용하는 것 또한 제한되지 않는다.
이후 상기 고정된 제 1 탐침 분자와 분석하고자 하는 시료에 포함된 생체 분자를 혼합하여 반응시킴으로써, 후술하는 바와 같이 제 1 탐침 분자와 생체 분자 간의 상보적인 상호 작용을 통해 생체 분자 복합체를 형성한다.
이후 형성된 생체 분자 복합체와 후술하는 효소 복합체와의 결합이 가능하도록 하는 제 2 탐침 분자를 반응시켜 생체 분자 복합체-제 2 탐침 분자의 복합체를 형성한다.
상기 제 2 탐침 분자는 후술하는 바와 같이 특정 기질과 반응하는 효소와 접합되어 있는 물질을 인식하여 특이적으로 결합되며, 이후 상기 효소의 작용 하에 가용성 기질을 첨가하여 불용성 침전물을 생성한 후, 이를 상기 질량분석법으로 분석하여, 생체 분자의 정량을 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 정량 분석의 방법은 본 발명의 일 실시예에 따른 결과에 의하면, 생체 분자 시료에 대한 분석에 대해 10-18 M (1 atto M; 1 aM) 단위의 미량에 대해서도 정확한 측정이 가능하여 종래 대비 약 1000배의 민감도 향상이 이루어진 놀라운 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명에서 상기 생체 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 세포, DNA, RNA, 유전자, 저분자 물질(small molecule), 마이크로 RNA(miRNA), 또는 단백질일 수 있다.
상기 세포의 범위는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 동물세포, 식물세포, 진균 세포, 박테리아 세포 등 분석이 가능한 세포를 포함할 수 있으며, 일예로 질병진단을 위한 암세포, 면역세포 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 저분자 물질의 범위는 제한되지 않으나, 통상 분자량이 900 Da 이하로 작은 유기 화합물을 포함할 수 있다. 생체 내에서 저분자 물질은 세포의 신호 물질 등으로 다양한 생물학적 기능을 가지며, 천연 유래의 이차대사산물이거나, 인공적으로 합성될 수도 있으며, 약리 활성 및/또는 유해성을 가질 수도 있다.
상기 저분자 물질은 다양한 세포 활동을 조절할 수 있어, 분자 생물학 분야에서 작용 기전을 규명하는데 활용될 수 있으며, 다양한 기능을 하는 단백질의 기능을 저해하거나, 단백질-단백질 상호 작용을 방해하는 기능을 가질 수 있다.
생체 분자로서의 저분자 물질은 단백질, 폴리사카라이드 등의 생체 분자는 저분자 물질은 아니나, 이를 구성하는 단위체의 일예로 핵산(nucleotide) 또는 아미노산(amino acid)나, 저중합체인 올리고머 등은 저분자 물질에 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 제 1 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 기능기-개질(functional group-modification)을 통해 금속 표면에 고정될 수 있다. 상기 개질을 위한 기능기의 종류는 금속의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 금속이 금(Au)인 경우, 기능기를 이용한 개질은 티올-개질(thiol-modification)을 사용할 수 있다.
상기 개질을 통해 특정 기능기를 갖도록 함으로써, 상기 금속 표면에 안정적으로 결합할 수 있으며, 자기 조립 단분자층(self-assembled monolayer)이 형성될 수도 있어 바람직하다.
상기 제 1 탐침 분자는 생체 분자와 상보적인 서열을 포함하여 특이적 결합이 가능한 경우 제한되지는 않으나, 일예로, DNA, DNA의 변형된 형태인 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 항체(antibody) 등을 포함할 수 있다. 상기 제 1 탐침 분자는 완충 용액 내에 희석되어 제공될 수도 있으며, 상기 완충 용액으로는 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS) 등을 들 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 효소 접합체는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 효소에 상기 제 2 탐침 분자와 상호 작용하는 물질이 접합된 것일 수 있다.
상기 효소 접합체는 또는 호스트-게스트 상호작용이 가능한 기능기의 형태일 수 있으며, 생체 분자의 종류에 따라 일예로 스트렙타비딘-효소, 디그옥시게닌(digoxigenin, DIG)-antiDIG 결합, 등의 형태가 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단백질은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 항원(antigen)일 수 있다.
항원(抗原, antigen)은　면역　반응을 일으켜 항체를 생산하게끔 만드는　물질로서 일반적으로　생명체내에서 이물질로 간주되는 물질의 총체를 포함할 수 있다. 상기 항원의 종류는 제한되지 않으나, 주로　병원균이나　바이러스 등의　단백질이 될 수 있으며, 이외에도 다당류, 인공적으로 합성된 물질,　부착소, 자신의 몸속에 생긴 변이세포(암세포)등의 다양한 것들도 항원에 포함될 수 있다.
항원의 유형으로는 면역원(免疫原, Immunogen), 내성원(耐性原, Tolerogen) 또는 알레르겐(Allergen) 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니며, 면역원은 체내에 들어왔을 때 면역 반응을 일으키는 물질로서 단백질, 다당류 등을 포함하는 고분자물질일 수 있다. 면역원의 면역반응을 일으키는 능력은　숙주에 흔한 정도,　분자의 크기, 화학적 구성의 차이에 달려있다. 내성원은 분자의 구조 때문에　면역학적 관용을 일으키는 항원으로 분자 구조가 바뀌면 면역원으로 변할 수 있다. 또한, 알레르겐은　알레르기 반응을 일으키는 물질로서　소화, 흡입, 주사,　피부　접촉 등의 경로로 들어올 수 있다.
본 발명에서, 상기 생체 분자가 항원인 경우, 상기 제 1 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자와 결합하는 항체일 수 있다.
항체는　항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 나타낸다. 항체의 형태는 제한되지는 않으나 폴리클로날(polyclonal)　항체, 모노클로날(monoclonal)　항체(단클론 항체 또는 단일클론 항체), 또는 재조합(recombinant)　항체를 포함할 수 있으며, 모든 면역글로불린(immunoglobulin)　항체가 포함될 수 있다. 상기　항체는 통상 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미하며, 인간화　항체　등의 특수　항체도 포함될 수 있다. 폴리클로날　항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 제한되지는 않으나, 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로　항원성을 증가시키기 위한 아주반트(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및　항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터　항체를 분리, 정제할 수 있다.
단일클론　항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론　항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 약 10 ㎍의 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된　항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론　항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론　항체를 분리, 정제할 수 있다. 또한 단일클론　항체는 상업적으로 판매되는 단백질에 대한　항체를 입수하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 생체 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 마이크로 RNA(miRNA)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제 1 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 상기 생체 분자에 상보적인 서열을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조 또는 구아닌-사중구조(G-quadplex) 등의 형태일 수 있으며, 일예로 생체 분자가 마이크로 RNA인 경우, 제 1 탐침 분자는 LNA일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 구성을 통해 DNA와 유사한 구조를 갖지만 상보적인 올리고뉴클레오티드와 강하게 결합하는 LNA의 높은 서열 특이성을 활용할 수 있어 더욱 좋다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기와 같은 분석 대상인 생체 물질과 상보적으로 결합할 수 있는 헤어핀 구조의 탐침을 이용하여 분석 대상 생체 분자에 서열 변이(sequence mutation)이 1개 또는 그 이상 발생하는 경우에도 분석 대상인 생체 분자와 구별이 가능함을 확인하여, 높은 민감도로 대상 생체 분자의 검출이 가능함을 확인하였다.
본 발명에서, 상기 제 2 탐침 분자는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 비오틴화 신호 탐침(biotinylated signaling probe)을 포함하고, 상기 효소 접합체는 상기 비오틴화 신호 탐침과 결합하여 고정될 수 있다.
본 발명에서, 상기 효소는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, HRP(Hoseradish peroxidase), AP(alkaline phosphatase) 및 β-gal(β-galactosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있다.
상기 효소는 후술하는 기질에 대해 각각 특이적으로 반응하여 가용성 물질을 불용성 물질로 변환하여 침전물을 생성할 수 있다.
본 발명에서, 상기 기질은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 4-chloronaphthol, DAB(3,3′AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/NBT(nitro blue tetrazolium), TR/Naphthol AS-MX(4-Chloro-2-methylbenzenediazonium/3-Hydroxy-2-naphthoic acid 2,4-dimethylanilide phosphate), X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside), S-gal(3,4-Cyclohexenoesculetin β-D-galactopyranoside), Bluo-gal(5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside) 및 Red-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 일예로 4-CN을 이용하는 경우, 다른 기질 대비 상대적으로 효소 반응이 용이하게 이루어질 수 있으며, BCIP/NBT를 이용하는 경우, 다른 기질 대비 상대적으로 침전물의 양이 증가될 수 있다. 침전물의 증가는 제 1 탐침 분자가 고정된 금속 주변의 굴절률 변화를 유도하여, ToF-SIMS에 의한 정량시 민감도의 향상을 얻을 수 있다.
본 발명에서, 상기 질량분석법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 일예로 표면질량분석법일 수 있으며, 보다 구체적으로 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), 말디-질량분석법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry, MALDI-MS), 레이저 탈착/이온화 질량분석법(Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry; LDI-MS), 탈착 전자 스프레이 이온화 질량분석법(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry, DESI-MS), 또는 실시간 직접 분석 질량분석법(Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry, DART-MS) 등일 수 있다.
상기 TOF-SIMS(비행시간 이차이온 질량분석) 장비를 이용하여 시료의 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 측정하는 것은, 1차 이온에 의하여 시료의 표면으로부터 2차 이온이 생성되며, 이렇게 생성된 2차 이온들이 검출기에 도달하는 시간이 2차 이온의 질량에 따라서 달라진다는 원리를 이용한다. 즉, 시료 표면의 분자들의 최소 분자 토막(minimum of molecular fragmentation)을 이용하여 시료 내의 원소(element) 및 화합물(compound)들의 동일성 여부를 분석할 수 있다.
　상기 비행시간 이차이온 질량분석법에서 사용되는 1차 이온은 제한되지는 않으나 Bi 및 Cs를 포함하는 이온원으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 1차 이온을 상기 시료에 조사하는 양은 제한되지 않으나 1013 ions/cm2　이하, 좋게는 105 ions/cm2　내지 1013 ions/cm2, 더욱 좋게는 107 ions/cm2　내지 1010 ions/cm2일 수 있다. 이러한 범위로 1차 이온의 조사량을 한정하는 경우에는, 시료의 표면을 구성하는 분자들이 파괴를 최소화하여 비파괴적인 시료 감별이 가능하게 되어 바람직하다.
상기 시료의 스펙트럼의 범위는 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나 0 내지 1000 m/z, 좋게는 100 내지 700 m/z, 더욱 좋게는 200 내지 400 m/z의 질량값 범위 내에 피크가 존재하는 것일 수 있다.
말디-질량분석법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectroscopy, MALDI-MS)은 기체상의 이온으로 생성하기 어려웠던 펩타이드, 단백질 등과 같은 생화학적 물질 및 합성 고분자를 매트릭스 물질과 함께 혼합하여 용해시킨 후 시료 플레이트에 적하하고 건조시키면, 상기 매트릭스 물질은 분석대상물과 함께 결정(Crystal)으로 플레이트에 남게 된다. 이렇게 준비된 시료 플레이트에 레이저를 조사하여 이온화시켜 질량분석이 가능하다.
상기 매트릭스 물질은 UV 레이저에 의해 쉽게 여기(excitation)되는 구조를 갖는 유기화합물을 일컬으며, 유기화합물을 잘 용해시키면서 분석하고자 하는 대상 시료도 잘 녹일 수 있도록 하기 위해 두 종류 이상의 혼합 용매를 사용할 수 있다.
상기 매트릭스 물질로는 일예로 CHCA(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 및 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid) 등의 유기물질들이 사용될 수 있다. 상기 매트릭스의 500 m/z 미만의 질량을 갖는 작은 분자들은 분석 시 레이저에 의해 자체적으로 분해되므로, 작은 질량범위에서 분석 대상 시료의 분석 결과와 혼합되어 간섭현상을 나타내게 되므로, 분석 대상 시료가 1 kDa 이상, 좋게는 1 kDa 내지 100 kDa의 분자량을 갖는 물질에 대해 상기 매트릭스 물질을 사용하는 것이 바람직하다.
레이저 탈착/이온화 질량분석법(Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry; LDI-MS)은 상기 말디-질량분석법의 단점인 저분자량 질량 분자 측정 시에 발생하는 결과 간섭 현상 해소를 위해 다양한 종류의 금속/반도체 나노 입자(nanoparticles, NPs) 또는 탄소 나노 입자 등이 활용될 수 있다.
대표적인 플라즈마-기반 주변 이온화법인 실시간 직접분석 질량분석법(DART-MS)은 가열된 가스가 섞인 여기 상태의 물분자의 분무 흐름에 고체나 액체 상태의 시료를 쬐어서 시료 중의 목표 화합물 성분의 이온화시킬 수 있다. 한편, 대표적인 분무-기반 주변 이온화법인 탈착 전자 스프레이 이온화 질량분석법(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry, DESI)은 대전시킨 용매의 미소 액적을 시료에 분무하여서 시료 중의 성분을 이온화시킬 수 있다. 이러한 주변 이온화법에서는 이온화를 위한 특별한 샘플 준비가 불필요하고 이온 소스의 구조가 간단하여서 비용 면에서도 유리하고 이온화를 위해서 외부로부터 불활성 가스만 공급하면 되기 때문에 취급도 용이하다는 등의 장점이 있다.
또한, 본 발명은 상기 정량방법에 의해 측정된 이차 이온질량(m/z) 픽의 패턴을 지표로 하는 질병 진단방법에 관한 것이다.
질병 진단을 위해 사용될 수 있는 패턴은 생체 분자 시료 또는 생물학적 샘플을 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry) 또는 LDI(Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry)으로 측정하여 얻은 이차이온 질량(m/z) 픽의 위치, 픽의 강도 또는 이들의 조합 등을 통해 구성될 수 있으며, 상기 패턴에서 특정 이차이온 질량(m/z) 위치에서의 픽의 존재 여부, 강도의 변화 여부를 기준으로 하여, 질병을 판별할 수 있는 기준을 설정할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 생체 분자 시료 또는 샘플의 종류에 따라 패턴의 종류와 개수, 판별 기준은 다르게 설정될 수 있다.
본 발명에서 상기 질병은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 위암일 수 있다.
상기 위암의 진단방법은 비행시간 이차이온 질량분석법을 이용하여 측정된 생체 분자 시료 또는 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들(peaks)의 패턴을 지표로 하여 수행될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 패턴은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 이차이온 질량이 1 내지 1000 m/z, 좋게는 1 내지 400 m/z 영역의 총 누적 강도 또는 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)될 수 있다.
본 발명에서, 상기 질병 진단방법은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 한 제한되지 않으나, 진단의 정확성 및 신뢰성을 높이기 위해, 상기 질병을 보유하지 않은 정상인의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 정상 패턴 및 상기 질병을 보유한 환자의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 질병 패턴에서 하나 이상 선택된 기준 패턴과 상기 질병 보유 가능자의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대상 패턴을 비교하여 이차 이온질량 픽들의 위치 변화, 이차 이온질량 픽들의 강도 변화, 이차 이온질량 픽들의 소멸, 이차 이온질량 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 진단될 수 있다.
상기 기준 패턴은 상기 정상 패턴 또는 상기 질병 패턴일 수 있으며, 이 둘의 조합일 수도 있다. 이 때 상기 정상 패턴은 하나 이상의 정상인의 이차이온질량 패턴이 통계적으로 처리되어 얻어진 것일 수 있으며, 상기 질병 패턴 또한 하나 이상의 환자의 이차이온질량 패턴이 통계적으로 처리되어 얻어진 것일 수 있다.
상기 정상 패턴, 상기 질병 패턴 및 상기 대상 패턴은 각각 1 내지 1000 영역의 동일 이차이온질량 영역의 패턴인 것이 바람직하며, 동일한 비행시간이차이온질량분광 측정 조건에서 측정된 것이 바람직하다.
상기 정상 패턴, 상기 질병 패턴 및 상기 대상 패턴은 각각 이차이온질량 픽들의 영역(패턴을 구성하는 m/z영역)의 총 누적강도 또는 총 누적강도의 평균으로 표준화(normalization) 될 수 있으며, CH3+와 같은 특정 픽의 강도 또는 특정 픽의 강도의 평균으로 표준화 될 수 있다.
보다 효율적인 비행시간이차이온질량분광 측정을 위해 상기 생물학적 샘플은 이차이온화가 용이하고, 낮은 표면 거칠기를 갖도록 통상적 전처리가 수행된 생물학적 샘플일 수 있다. 그러나 이러한 전처리는 비행시간이차이온 질량분광 측정 조건과 마찬가지로 효율적인 이차이온질량 픽들을 얻기 위함이며, 픽들의 위치 또는 상대적 강도(표준화된 각 픽들의 강도)에 미치는 영향이 미미하므로 본 발명에 따른 질병의 진단 방법은 생물학적 샘플의 전처리 조건 또는 비행시간이차이온질량분광 측정 조건에 의해 한정되지 않는다.
또한, 생물학적 샘플의 전처리 조건 또는 비행시간이차이온질량분광 측정조건의 영향을 최소화하기 위하여, 동일한 생물학적 샘플의 전처리 조건 및 동일한 비행시간이차이온질량분광 측정조건 하에서 정상인, 환자, 특정 질병 보유 가능자의 상기 생물학적 샘플의 이차이온질량 패턴을 측정하여, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴을 비교하여 픽들의 위치 변화, 픽들의 강도 변화, 픽들의 소멸, 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 질병이 진단되는 것이 바람직하다.
상기 기준 패턴을 구성하는 정상 패턴 및 질병 패턴은 통상의 통계적 처리에 의해 얻어질 수 있으며, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴의 유사 정도 또한 통상의 통계적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실험재료 및 시약]
- 인터페론 감마(interferon gamma)는 Abcam(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 인터페론 감마 항체 및 Biotin labelled 인터페론 감마 항체는 Abcam(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- DNA 프로브는 제노텍(대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 마이크로 RNA는 바이오니아(대전, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- miR-200a-3p (Cat. No. MS00003738, Qiagen, Valencia, CA)
- PBS(phosphate-buffered saline), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), RPMI 1640 배지, 및 FBS(fetal bovine serum)은 WelGene(경산, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 스트렙타비딘-접합 효소(HRP, AP, 및 β-gal), 및 기질(DAB, AEC, 4-CN, BCIP/NBT, 및 S-gal), BSA(bovine serum albumin), 3-메르캅토프로판올(3-mercaptopropanol), Grace Bio-Labs CultureWellTM removable chambered coverglass는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였다.
- TRIzol reagent는 Invitrogen(Carls bad, CA)에서 구입하여 사용하였다.
- SNORD61 (카탈로그 번호 MS00033705, Qiagen, Valencia, CA)
- 모든 시약은 구입한 상태 그대로 사용하였다.
[실험방법]
1. 마이크로 RNA( miRNA ) 측정
miR-200a-3p (Cat. No. MS00003738, Qiagen, Valencia, CA)의 발현 수준을 SNU1 및 MKN34 세포에서 SYBR Green 방법을 이용하여 분석하였다.
마이크로 RNA 측정시 PBS에 10 aM-100 nM로 처리한 후 사용하였다.
RNA의 역전사(reverse transcription)는 miScript RT 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 수행하였다.
실시간 PCR(real-time PCR)은 SYBR Green miScript PCR 시스템(Qiagen, Valencia, CA) 을 사용하여 제조사의 지침에 따라 ViiATM 7 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, Foster City, CA)에서 수행되었다. 모든 반응은 3회 반복하여 수행하였다.
SNORD61 (카탈로그 번호 MS00033705, Qiagen, Valencia, CA)을 정규화를 위한 대조군(endogenous control)로 사용하였다.
2개의 세포주에서 miR-200a-3p의 상대적 양은 2- ΔΔCT 방법으로 계산 하였다.
2. ToF - SIMS 측정
모든 측정은 ToF-SIMS V 기기 (IONTOF GmbH, Germany)를 사용하여 수행하였다.
분석 이온 빔(analysis ion beam)으로 150 us의 사이클 시간에서 약 0.05 pA의 bi3+를 이용하여 스펙트럼 및 이미지를 얻었다.
스펙트럼의 경우, 분석 영역은 250 um x 250 um이며, 정적 한계의 보장을 위해 1차 이온 흡수 밀도(primary ion dose density, PIDD)는 1.0 x 1011 이온/cm2로 하였다.
패치의 크기는 약 300 um x 300 um이고, PIDD는 1.15 x 109 이온/cm2로 하였다.
음이온 스펙트럼은 C2H-, C3H-, C4H-, C5H- 및 C7H- 피크를 사용하여 질량을 보정하였다.
검출한계(limit of detection, LOD)는 하기 수학식을 사용하여 계산하였다.
LOD = 3.3 (SD/S)
SD: 표준편차
S: 검정 곡선의 기울기
3. MALDI 측정
CHCA matrix를 처리한 후 MALDI-ToF 양이온 모드에서 골드 칩 상의 불용성 생성물을 측정하였다.
4. LDI -MS 측정
MALDI-ToF 장비를 이용해 양이온모드에서 골드 칩 상의 불용성 생성물을 측정하였다.
[실시예 1] ToF-SIMS를 이용한 초민감도 단백질(항원) 검출
1. 자기-조립 단일층 (self-assembled monolayers )의 형성
금 웨이퍼는 15 nm 두께의 크롬(Cr) 막을 진공 증착한 다음, 실리콘 웨이퍼 상에 100 nm 두께의 금 층(gold layer)을 증착하여 제조한 후, H2O2 20 mL, HNO3 2 mL 및 H2SO4 12 mL가 혼합된 Super-pirahana 용액으로 처리하여 세척하였다.
1 mM 농도의 thiol 혼합물 (1:99=mercaptoundecanoic acid: mercaptoundecanol)에 골드 칩을 담그고 하룻밤 동안 반응시킨 다음 에탄올/물을 이용해 칩을 5회 세척하였다.
2. 골드 칩 상에 항체의 도입
자기조립 단일층이 형성된 골드 칩에 EDC/NHS (N-Ethyl-N′carbodiimide hydrochloride/ N-hydroxysuccinimde)를 10 mM 농도로 처리한 다음 1시간 동안 반응시키고 PBS로 1회 세척한 다음 0.1 mg/mL 농도의 인터페론 감마 항체를 골드 칩 상에 처리하였다. 실온에서 2시간 반응시킨 다음 PBS로 3회 세척하였다.
3. 골드 칩 상에서 항원 처리 및 효소 반응
항체로 개질된 골드 칩은 실온에서 1 nM 인터페론 감마 (가능한 농도범위는 10 aM-1 nM)로 처리하였다.
이후, 혼합물을 실온에서 2시간 배양 한 후 PBS로 3회 세척하고, 바이오틴화된 항체(biotinylated antibody)을 골드 칩 상에 적용하였다.
1시간 동안 배양 후, 골드 칩을 PBS로 5회 세척하고, PBS에 1% BSA를 첨가한 후 1시간 동안 배양하였다. 1% BSA가 첨가된 PBS에 스트렙타비딘-AP(streptavidin- alkaline phosphatase) 접합체 용액을 25 ug/mL의 농도로 1 시간 동안 골드 칩에 첨가하였다.
이후, PBS로 반복 세척하고, 골드 칩을 미리 혼합된 BCIP/NBT 용액과 함께 10분간 배양하였다.
3. 불용성 산물의 생성
상기와 같이 배양한 후, 스트렙타비딘-AP의 기질로서 BCIP/NBT(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨)을 첨가하여 불용성 산물을 골드 칩 상에 형성시켰다.
4. ToF - SIMS를 이용한 정량
상기 실험방법에 기재된 ToF-SIMS 측정 방법을 이용하여, 상기 불용성 산물에 대한 분석을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
이로부터, AP에 의해 BCIP의 가수분해 및 이 가수분해 생성물에 의해 유도된 NBT의 감소에 의해 생성된 NBT 포르마잔의 완전한 분자(intact molecule)인 [M]-에 상응하는 피크가 m/z 748.3에서 분명하게 검출됨을 확인하였다(도 2b).
도 2c에서, 피크의 강도는 인터페론 감마에 의존적으로 감소하였으며, 정규화 후 그래프에서, m/z 748.3에서 최대값을 갖는 것을 확인하였다.
다양한 농도에서 얻은 인터페론 감마의 값을 전체 이온 수로 나눈 결과, 인터페론 감마의 농도와 정규화된 피크 강도 사이에는 선형 관계가 나타나는 것을 확인하였다(도 2c).
검출 한계는 상기 계산 공식에 의해 130 aM로 계산되었다.
상기 결과로부터, 효소에 의해 생성된 Mass fingerprint에 기반한 새로운 신호 증폭 전략을 사용하여, ToF-SIMS로 단백질 중 항원을 초민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 2] 효소 반응 산물의 ToF-SIMS 스펙트럼 측정.
상기 실시예 1에서, 효소로서 AP(alkaline phosphatase)이외에 HRP(horseradish peroxidase), 및 β-gal(β-galactosidase)를 추가로 사용하고, 이에 대한 기질로 각각 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), AS-MX(4-Chloro-2-methylbenzenediazonium/3-Hydroxy-2-naphthoic acid 2,4-dimethylanilide phosphate), 및 X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)을 사용하는 것을 제외하고 나머지 과정은 동일하게 하여 ToF-SIMS 발현을 측정하여 그 결과를 도 3에 도시하였다.
이로부터, HRP, AP, 및 β-gal에 의해 가수분해 된 후 생성된 불용성 물질에 대하여, [M-NH2]+, [M+H]+ 및 [M+]에 대한 피크가 각각 608.3, 441.1 및 198.0 위치에서 분명하게 검출됨을 확인하였다(도 3a~c).
[실시예 3] 멀티플렉스 시험에 의한 ToF-SIMS 스펙트럼 측정
상기 실시예 1에서 기질로 X-gal, S-gal, Red-gal을 각각 사용하는 경우와, 상기 세 가지 기질을 동일한 양을 혼합하여 사용하는 것을 제외하고 나머지 과정은 동일하게 하여 ToF-SIMS 발현을 측정하여 그 결과를 도 4에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, X-gal, S-gal 및 Red-gal을 이용한 경우의 피크의 위치(도 4a~c)가 기질을 혼합하여 사용한 경우에도 각각 유지되어, 동일한 위치에서 측정되는 것을 확인하였다(도 4d).
이로부터, 본 발명에 따른 ToF-SIMS 측정 방법은 단일 기질을 사용하여 불용성 산물에 대해서도 높은 민감도로 검출이 가능할 뿐만 아니라, 이에 대한 혼합 기질에 대해서도 단일 기질이 고유하게 가지고 있는 분석 피크가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터, 기질의 혼합에 따른 간섭 현상 없이 멀티플렉스 분석이 가능한 효과가 있음을 확인하였다.
[실시예 4] MALDI, LDI-MS를 이용한 바이오마커의 고민감도, 고특이적 측정
상기 실시예 1에서 ToF-SIMS 대신 MALDI 및 LDI-MS 질량분석법을 이용하여 질량 분석을 수행하여 그 결과를 도 5에 도시하였다.
이로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 측정 방법은 종래 MALDI 및 LDI-MS 측정 방법이 가지고 있던 저질량 분석시의 단점을 극복하여, 간섭 현상을 최소화하고, 생체 시료가 가지고 있는 고유의 질량을 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 5] ToF-SIMS를 이용한 초민감도 miRNA 검출
1. 자기-조립 단일층 (self-assembled monolayers )의 형성
금 웨이퍼는 15 nm 두께의 크롬(Cr) 막을 진공 증착한 다음, 실리콘 웨이퍼 상에 100 nm 두께의 금 층(gold layer)을 증착하여 제조한 후, H2O2 20 mL, HNO3 2 mL 및 H2SO4 12 mL가 혼합된 Super-pirahana 용액으로 처리하여 세척하였다.
다중-웰 골드 칩의 제조를 위해 16-웰 CultureWellTM cover glasses를 금 웨이퍼 상에 도입하였다.
자기조립 단일층 형성 전에 DNA 프로브를 95 ℃에서 5분간 어닐링한 다음, 10 uM PBS에서 서서히 4℃로 냉각하였다. PBS 용액에 함유된 헤어핀 프로브 용액을 골드 칩 상의 100 uL/웰에 분주하고, 하룻 밤 배양 후, PBS로 칩을 5회 세척하였다.
2. 골드 칩 상에서 miRNA 처리 및 효소 반응
프로브로 개질된 골드 칩은 실온에서 하룻 밤 동안 RNase가 포함되지 않은 PBS(또는 PBS에 용해된 전체 RNA)에 100 nM miRNA로 처리하였다.
이후, 혼합물을 55℃에서 1시간 배양한 후, PBS로 55℃에서 10분간 세척하였다.
세척 후, PBS 중의 골드 칩을 4℃로 냉각하였다.
바이오틴화된 신호 탐침(biotinylated signaling probe)을 500 nM 농도로 PBS에 용해하고, 골드 칩 상의 각 웰에 적용하였다.
상기 신호 탐침의 서열은 하기 표 1과 같다.
바이오틴화된 신호 탐침
제 1 탐침 분자 서열 (5' to 3') 개질
miR-200a-3p UAA CAC UGU CUG GUA ACG AUG U None
miR-let-7a UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U None
miR-let-7c UGA GGU AGU AGG UUG UAU GGU U None
miR-let-7f UGA GGU AGU AGA UUG UAU AGU U None
miR-200a-3p 검출용
헤어핀 탐침		 GCC TAA CAC TGT ACA TCG TTA CCA GAC AGT GTT AGG C 3'-Thiol
miR let-7a 검출용헤어핀 탐침 GGC AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ATA TAG TTG CC 5'-Thiol
miR-200a-3p 검출용 신호 탐침 AGT GTT AGG C 3'-Biotin
miR-let-7a 검출용 신호 탐침 GGC AAC TAT A 5'-Biotin
3시간 동안 배양 후, 골드 칩을 PBS로 5회 세척하고, PBS에 1% BSA를 첨가한 후 1시간 동안 배양하였다. 1% BSA가 첨가된 PBS에 스트렙타비딘-AP(streptavidin- alkaline phosphatase) 접합체 용액을 25 ug/mL의 농도로 1 시간 동안 골드 칩에 첨가하였다.
이후, PBS로 반복 세척하고, 골드 칩을 미리 혼합된 BCIP/NBT 용액과 함께 10분간 배양하였다.
3. 불용성 산물의 생성
상기와 같이 배양한 후, 스트렙타비딘-AP의 기질로서 BCIP/NBT(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로 블루 테트라졸륨)을 첨가하여 불용성 산물을 골드 칩 상에 형성시켰다.
4. ToF - SIMS를 이용한 정량
상기 실험방법에 기재된 ToF-SIMS 측정 방법을 이용하여, 상기 불용성 산물에 대한 분석을 수행하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
이로부터, AP에 의해 BCIP의 가수분해 및 이 가수분해 생성물에 의해 유도된 NBT의 감소에 의해 생성된 NBT 포르마잔의 완전한 분자(intact molecule)인 [M]-에 상응하는 피크가 m/z 748.3에서 분명하게 검출됨을 확인하였다(도 6a, 도 6b).
도 6a에서, 피크의 강도는 miR-let-7a에 의존적으로 감소하였으며, 정규화 후 그래프에서, m/z 748.3에서 최대값을 갖는 것을 확인하였다.
다양한 농도에서 얻은 miR-let-7a의 값을 전체 이온 수로 나눈 결과, miR-let-7a 농도와 정규화된 피크 강도 사이에는 선형 관계가 나타나는 것을 확인하였다(도 6c).
검출 한계는 상기 계산 공식에 의해 130 aM로 계산되었다.
상기 결과로부터, 효소에 의해 생성된 Mass fingerprint에 기반한 새로운 신호 증폭 전략을 사용하여, ToF-SIMS로 miRNA를 초민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 상기 방법은 비공유 DNA-RNA 상호작용 인식을 기반으로 하고 있으며, 단백질-단백질, 단백질-기질 또는 RNA-단백질 등 다른 생체 분자 간의 분석으로 확장이 가능한 장점이 있다.
[실시예 6] 염기서열 다형성에 대한 miRNA의 민감도 측정
miRNA 서열에 다형성(polymorphism)이 발생하였을 때, ToF-SIMS를 이용한 분석 결과에 미치는 영향의 측정을 위해, miR-let-7a의 서열에서 1개씩의 염기가 치환된 2개의 대조군을 혼합하여, 검출의 효율을 측정하였다.
하기 표 2의 실험군 및 대조군 서열을 갖는 miRNA를 혼합한 후 상기 실시예 1-2에서와 같이 처리하였다.
다형성을 갖는 miRNA 실험군
물질 염기 서열
miR-let-7a UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U
비교예1 (miR-let-7c) UGA GGU AGU AGG UUG UAU G GU U
비교예2 (miR-let-7f) UGA GGU AGU AG A UUG UAU AGU U
*표에서 밑줄친 굵은 글자는 염기서열에 대한 변이를 나타냄
상기와 같이 혼합된 다형성을 갖는 miRNA가 제 1 탐침 분자에 경쟁적으로 제 1 탐침 분자에 결합하는지 확인하기 위해, 상기 miRNA가 처리된 골드 칩을 55℃로 열처리하였다.
이후 실험은 실시예 5에서와 동일하게 하여 ToF-SIMS를 이용하여 피크를 측정하였다.
그 결과를 도 7에 도시하였다.
도 7a 내지 도 7c로부터 확인할 수 있는 바와 같이, m/z 748.3에서 피크의 강도를 확인한 결과, miR-let-7a의 존재하에서는 강한 피크의 관찰이 가능하였으나, 대조군인 비교예 1, 비교예 2의 경우에 있어서, 측정된 피크의 강도는 miR-let-7a의 강도 대비하여 무시할 정도로 작은 값을 나타내었다.
이로부터, 본 발명의 헤어핀 기반 신호 증폭 방법은 유전자 증폭 또는 시퀀싱 단계를 포함하지 않고도, 염기서열에 존재하는 다형성에 의해 발생하는 결과를 높은 민감도로 구분할 수 있는 장점이 있음을 확인하였다.
[실시예 7] 암세포 추출물에서의 miRNA 검출
miR-200a-3p를 발현하지 않는 SNU1 및 miR-200a-3p를 발현하는 MKN45의 인간 위암 선암 세포주에 대하여, 전체 RNA 추출물에서 miRNA 분석을 위해 본 발명의 분석 방법을 적용하였다.
상기 세포주에 대해 통상적인 방법으로 RNA 추출물을 확보한 후, 각 세포주에 존재하는 RNA를 miR-200a-3p를 혼합하여 ToF-SIMS 측정을 수행하였다.
그 결과, SNU1 세포주의 RNA 추출물과 1 nM miR-200a-3p가 함유된 버퍼를 이용하여 분석한 결과 m/z 748.3 상에서의 피크 강도에 유의한 차이점이 발생하지 않았다.
이는 다양한 좋류의 RNA 분자가 존재하더라도 특정 miRNA와 프로브 간의 특이적 상호 작용을 거의 간섭하지 않는다는 것을 의미하며, 이를 통해 다양한 종류의 생물학적 샘플을 이용하여 표적 miRNA(target miRNA)를 검출하기 위해 본 발명의 ToF-SIMS 분석 방법의 높은 민감도를 활용하는 것이 가능한 것을 새롭게 확인하였다.
도 7d에 도시한 바와 같이, NBT-포르마잔 분자는 MKN45 세포로부터 얻은 전체 RNA 추출물에서 검출되었으나, SNU1 세포주로부터는 검출되지 않았다. 이 결과는 RNA의 역전사 PCR을 이용한 결과와도 일치하는 결과이다(데이터는 제시하지 않음).
또한, 효소-기반 신호 증폭을 사용한 본 발명은 질량 분석법을 사용한 종래 기술의 접근 방법이 달성하지 못한, 복잡한 환경에서 저농도 분석 물질의 검출이 가능한 새롭고 현저한 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[실시예 8] ToF-SIMS를 이용한 멀티플렉스 분석(multiplex assay)
본 발명의 분석 방법에 대하여 멀티플렉스 분석 분석을 위해, 스트렙타비딘과 결합하는 효소를 HRP, AP 및 β-gal의 3가지로 확장하여 이들의 혼합물을 사용하는 것을 제외하고, 나머지 절차는 실시예 1과 동일하게 하여 ToF-SIMS 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 8에 도시하였다.
도 8a로부터, HRP 및 AP의 기질(substrate)인 3-아미노-9 에틸 카르바졸(AEC) 및 BCIP/NBT의 효소 반응 생성물의 [M-NH2]+ 및 [M]+에 대한 분리된 화학 이미지를 m/z 608.3 및 748.3에서 각각 관찰할 수 있었다.
또한, m/z 196.97에서 [Au]+의 이미지가 외부 패턴에서 관찰되었다.
도8b 내지 도 8d는 HRP, AP 및 β의 세 가지 다른 효소에 의해 생성된 침전물의 ToF-SIMS 분석 결과를 나타내는 것으로, HRP와 AP에 의한 4-클로로 나프톨(4-CN)과 BICP/NBT의 효소 반응 생성물은 각각 [M]-에 해당하는 m/z 352.0과 748.3에서 관찰되었다. 또한 β효소 반응에 의한 3,4-cyclohexenoesculetin-βctopyranoside (S-gal)의 생성물은 m/z 231.1에서 탈 양성자 이온 [M-H]-과 일치하는 것으로 관찰되었다.
또한, 도 8e는 세 효소를 처리하여 얻은 스펙트럼을 나타내는 것으로, 이로부터 본 발명을 통해 ToF-SIMS를 이용하여, 다양한 종류의 효소 생성물에 대한 멀티플렉스 분석이 가능한 것을 확인하였다.

Claims (18)

  1. 제 1 탐침 분자를 금속에 고정하는 단계;
    상기 고정된 제 1 탐침 분자와 생체 분자를 반응시켜 생체 분자 복합체를 형성하는 단계; 및
    상기 생체 분자 또는 생체 분자 복합체를 결합시킨 효소와 반응하는 기질의 효소 반응에 의한 침전물을 생성하는 단계;
    를 포함하는, 질량분석법(mass spectrometry)을 이용한 생체 분자의 정량방법으로,
    상기 생체 분자는 항원(antigen)이고, 상기 제 1 탐침 분자는 상기 항원과 결합하는 항체인, 질량분석법(mass spectrometry)을 이용한 생체 분자의 정량방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 정량방법은 상기 생체 분자의 정량을 위해 하기 단계를 추가로 포함하는, 정량방법.
    제 2 탐침 분자를 상기 고정된 제 1 탐침 분자와 상기 생체 분자를 반응시켜 형성된 생체 분자 복합체에 반응시켜 결합시키는 단계; 및
    상기 결합된 제 2 탐침 분자에 효소 접합체를 결합시키는 단계;
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 탐침 분자는 티올-개질(thiol-modification)을 통해 금속 표면에 고정되는, 정량방법.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 효소 접합체는 효소에 상기 제 2 탐침 분자와 상호 작용하는 물질이 접합된 것인, 정량방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 3항에 있어서,
    상기 제 2 탐침 분자는 비오틴화 신호 탐침을 포함하고, 상기 효소 접합체는 상기 비오틴화 신호 탐침과 결합하여 고정되는, 정량방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 효소는 HRP(Hoseradish peroxidase), AP(alkaline phosphatase) 및 β-gal(β-galactosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인, 정량방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 기질은 4-chloronaphthol, DAB(3,3′AEC(3-amino-9-ethylcarbazole), TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine), BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/NBT(nitro blue tetrazolium), TR/Naphthol AS-MX(4-Chloro-2-methylbenzenediazonium/3-Hydroxy-2-naphthoic acid 2,4-dimethylanilide phosphate), X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside), S-gal(3,4-Cyclohexenoesculetin β-D-galactopyranoside), Bluo-gal(5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside) 및 Red-gal (6-Chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인, 정량방법.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 질량분석법은 비행시간 이차이온 질량분석법(Time-of-flight Secondary Ion Mass Spectrometry; ToF-SIMS), 말디-질량분석법(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry; MALDI-MS), 레이저 탈착/이온화 질량분석법(Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry; LDI-MS), 탈착 전자 스프레이 이온화 질량분석법(Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry, DESI-MS), 또는 실시간 직접 분석 질량분석법(Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry, DART-MS)인, 정량방법.
  15. 제 1항의 정량방법에 의해 측정된 이차 이온질량(m/z) 픽의 패턴을 지표로 하는 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 질병은 위암인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 패턴은 이차이온 질량이 1 내지 1000 영역의 총 누적 강도 또는 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)된 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 질병을 보유하지 않은 정상인의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 정상 패턴 및 상기 질병을 보유한 환자의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 질병 패턴에서 하나 이상 선택된 기준 패턴과 질병 보유 가능자의 생물학적 샘플의 이차 이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대상 패턴을 비교하여 이차 이온질량 픽들의 위치 변화, 이차 이온질량 픽들의 강도 변화, 이차 이온질량 픽들의 소멸, 이차 이온질량 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 진단되는 것인, 질병 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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Nanomedicine, 2011, Vol. 6, pp 1447-1462.

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