KR102091751B1

KR102091751B1 - 방사선 피폭 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 방법

Info

Publication number: KR102091751B1
Application number: KR1020180105307A
Authority: KR
Inventors: 이상욱; 하창훈; 김경곤; 염정훈; 유재원
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2018-09-04
Publication date: 2020-03-20
Also published as: KR20200027243A

Abstract

방사선 피폭 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 일 양상에 따른 방사선 피폭 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방사선 피폭 진단 방법에 따르면, 방사선 피폭 시간이나 피폭 선량을 간편하게 진단할 수 있고, 방사선 치료 효과를 예측할 수 있다.

Description

방사선 피폭 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 방법{Biomarker for diagnosing radiation exposure and method using thereof}

방사선 피폭 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.

방사선 피폭은 심장질환이나 암 발생의 위험을 증가시킨다. 방사선 피폭에 의한 인체 손상 정도를 측정하기 위해 세포학적, 유전학적인 측정법들이 지난 수십 년간 사용되어 왔다. 하지만 이러한 측정법들은 방사선에 대한 인체의 유전자 또는 세포의 손상 여부를 확인해 줄 수 있을 뿐, 방사선에 대한 인체 반응의 분자적 기작에 대한 정보는 제공하지는 않는다. 따라서, 방사선 피폭을 편리하고 정확하게 진단할 수 있도록 하는 마커를 찾기 위해 지금도 많은 노력이 경주되고 있다.

지난 수십 년간 방사선 피폭 마커에 대한 연구는 주로 암에 집중되어 왔지만 최근 들어 방사선에 노출된 정상 조직이나 시료에서 발견될 수 있는 피폭 마커를 찾는 연구로 더욱 확대되었다. 지금까지 방사선 피폭 마커로 연구되어 온 단백질 마커들이 일부 존재하나, 방사선 피폭 정도를 정량적으로 예측하기는 어려웠다.

일반적으로, 방사선 종사자들이 작업 시 사용하는 TLD(ThermoLuminescence Dosimeter, 열형광 선량계 배지(badge)로 선량계의 방사선 노출 정도를 계산하는 방법과 피폭 상황을 재구성하여 방사선 선량을 수학적으로 계산하는 방법이 사용되지만, 배지 패용에 대한 간접 측정 또는 이론적 측정으로 인해 개별 인체에 미치는 선량도 측정의 신뢰도가 떨어지는 한계가 있다. 또한, 소핵 형성도 측정, 적혈구의 글리코포린 A(glycophorin A)의 돌연변이 측정, DNA절단 정도, 및 치아의 에나멜(enamel)을 이용한 ESR(Electron Spin Resonance: 전자 스핀 공명)등의 방법들이 시도되었지만 개인차에 따라 지표들의 오차 범위가 매우 커서 방사선 선량측정이 거의 불가능하였다. 방사선 피폭 개체의 피폭 선량을 측정하기 위해, 염색체 이상(conventional chromosome aberration) 측정법으로 피폭환자의 말초혈액을 채취하여 림프구를 배양하고 림프구내에 형성된 염색체 이상인 이동원체(dicentrics)와 환(ring)의 발생빈도를 광학현미경 및 미세구조 관찰장비를 통해 판별할 수 있는 최적 표준(gold standard) 방법이 연구되었으나, 많은 시간 및 비용이 들며, 소수 전문가들만이 진단할 수 있는 한계로 거의 활용되지 못하고 있는 실정이다.

따라서, 채취가 간편한 액체 시료에서 방사선 피폭 선량에 정량적으로 반응하여 방사선 피폭을 정확하고 빠르게 진단할 수 있는 바이오마커에 대한 연구가 필요한 실정이다.

방사선에 노출시 발현이 정량적으로 변화하므로, 방사선 피폭 선량을 예측할 수 있고 방사선 치료 효과를 진단할 수 있는 바이오마커 조성물에 관한 것으로, GPKOW(G-patch domain and KOW motifs, G-패치 도메인 및 KOW 모티프) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물, 키트 및 상기 단백질을 이용한 방사선 피폭을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 방사선 피폭에 대한 단백질 마커를 발견하기 위해 예의 연구한 결과, 방사선에 피폭 시 특정 단백질, 즉 GPKOW와 그 mRNA 발현량이 혈액 세포에서 특이적으로 증가한다는 것을 발견하고 GPKOW의 방사선 피폭 마커로서의 용도를 발명하였다.

일 양상은 GPKOW(G-patch domain and KOW motifs) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "진단"은 병태 생리의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것이다. 본 발명에서의 진단은 방사선 피폭 여부 및/또는 그 정도를 확인하는 것이다.

방사선 피폭시, 체세포가 손상되어 조혈조직 손상, 소화기계통 손상, 중추신경계 손상, 또는 피부 손상과 같은 급성 부작용이나 백내장, 종양, 생식력 저하와 같은 만성 부작용이 나타날 수 있다. 또한, 염색체 이상으로 발생되는 생식 세포 손상의 원인이 되기도 한다. 따라서, 방사선 피폭을 정량적으로 진단할 수 있는 마커가 필요하다.

또한, 방사선 치료는 항암 치료에 있어 매우 중요한 역할을 하지만, 방사선 치료시 방사선 피폭에 의해 불가항력적으로 종양 주변의 정상 조직에 손상이 발생한다. 이러한 종양 주변 정상 조직의 손상은 방사선 치료를 향상시키는 데 걸림돌이 된다. 또한, 방사선 치료로 인해 정상 장기에 한계선량 이상의 방사선이 조사되면 장기 고유의 기능을 부분적으로 상실하거나 영구적으로 기능 손상이 유발되어 만성적 부작용을 초래하기도 한다. 따라서, 방사선 노출에 반응하는 정상 조직 및 암 조직의 손상을 모니터링할 수 있는 마커가 필요하고, 이러한 마커를 통해 환자 맞춤형 치료가 가능하다.

본 명세서에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 방사선 피폭된 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상군 개체에 비해 방사선에 피폭된 군에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명에서의 방사선 피폭을 진단하기 위한 마커는 정상 대조군의 시료에 비하여, 방사선 피폭군의 시료에서 특이적으로 낮은 수준의 발현을 보이는 GPKOW 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

상기 GPKOW(G-patch domain and KOW motifs) 단백질은 세포의 생존 항상성을 유지하기 위해 지속적으로 전사되는 유전자들의 pre-mRNA 스플라이싱을 담당하는 스플라이소좀(spliceosome)을 구성하는 단백질체이다. GPKOW 단백질은 주요 혈액 세포에서 발현되나, 방사선 피폭과의 연관성 또는 방사선 피폭에 의한 영향에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다. GPKOW 단백질은 주로 미토콘드리아 (mitochondria), 세포질(cytosol), 세포골격 (cytoskeleton)에서 발현하므로 GPKOW의 발현이나 기능 모니터링을 위해 세포 내 기관의 분리나 분해 과정이 필요 없다는 장점이 있다.

상기 GPKOW 단백질은 T54, Spp2, GPATC5, GPATCH5로도 표시될 수 있으며, 인간에서 Genebank Accession No. NM_015698.5, BC003148.1, BC000397.2, AB209806.1, XM_017029415.2 NCBI Reference Sequence: NG_021310.2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산으로부터 암호화된 단백질일 수 있다. 상기 GPKOW 단백질은 GPKOW 동형 단백질이나 이들의 전구체일 수 있다. 용어 "동형(isoform)"은 동일한 단백질의 다른 형태를 말한다. 상기 GPKOW 단백질은 예를 들어, 인간에서 GenBank Accession No. XP_016884904.1, NP_056513.2, Q92917.2, EAW50694.1, AAH03148.1, AAH00397.1 또는 UniprotKB Accession No. Q92917의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

상기 GPKOW 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있다.

상기 GPKOW 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 상기 GPKOW 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.

상기 GPKOW 단백질의 발현 수준 측정은 GPKOW 단백질의 발현 수준 또는 GPKOW 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 수행할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 수준 측정"이란 방사선 피폭을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 방사선 피폭 진단 유전자에서 발현된 단백질의 발현량을 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 이용하여 단백질을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay: 효소결합 면역흡착 분석), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter, 형광 활성화 세포 분류기), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 방사선 피폭 마커인 GPKOW에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, GPKOW 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 GPKOW 유전자에 의해 코딩되는 GPKOW 단백질을 얻고, 얻어진 GPKOW 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

상기 GPKOW 단백질을 암호화하는 mRNA 발현량을 측정하는 제제는 일 구현에에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드이며, GPKOW 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRANA에 대해 특이적으로 결합하는 프라미어 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "mRNA 발현 수준 측정"이란 방사선 피폭을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 방사선 피폭 마커 유전자의 mRNA 발현정도를 확인하는 과정으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR(Reverse Transctiption-Polymerase Chain Reaction, 역전사-중합효소 연쇄 반응), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RTPCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 GPKOW 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 방사선 피폭을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현량을 확인할 수 있다.

프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면 GPKOW 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 방사선 피폭 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

상기 GPKOW 단백질 및 그 유전자의 mRNA 발현 수준은 방사선 피폭시 혈액 세포 특이적으로 증가하므로, 상기 본 발명에 따른 방사선 피폭을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물은 방사선 피폭이 의심되는 개체 중에서 특히 얻기 쉬운 혈액세포나 혈액으로부터 얻어진 시료에서의 단백질 발현 수준을 측정하는데 이용될 수 있다.

상기 조성물은 방사선 피폭 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 GPKOW 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트를 제공한다.

GPKOW 단백질, GPKOW 단백질의 단편, 발현 수준, 및 발현 수준의 측정은 전술한 바와 같다.

상기 키트는 방사선 피폭 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다.

다른 구체예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring, 다중 반응 탐색) 키트일 수 있다.

다른 양상은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GPKOW 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방사선 피폭 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GPKOW 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계는 상기 생물학적 시료와 상기 GPKOW 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 인큐베이션은 인 비트로(in vitro)에서 수행될 수 있다.

상기 단계 (a)는 상기 GPKOW 단백질에서 유래한 펩타이드를 측정함으로써, 상기 생물학적 시료의 질량 분석을 수행하는 단계를 포함하는 포함할 수 있다.

상기 단계 (a)는 GPKOW 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화(hybridization)를 수행하고, 혼성화 정도를 통해 상기 GPKOW 폴리뉴클레오티드의 mRNA 발현량을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 개체는 방사선 피폭이 의심되는 개체일 수 있고, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

용어 "생물학적 시료"는 생물로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 생물학적 시료가 혈액 또는 혈장일 경우, 채취가 용이한 혈액, 혈장을 검체로 사용하기 때문에 개체의 장기 조직을 적출하지 않기 때문에 개체에게 부담을 주지 않으면서도 간편하게 분석할 수 있다. 또한, 혈액은 인체를 빠른 속도로 순환하기 때문에 방사선 노출에 의해 민감하게 반응할 수 있으므로 진단의 정확도 및 민감도가 높아 방사선 피폭 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 온전한(intact) 단백질을 포함할 수 있다. 온전한 단백질은 별도의 단백질의 변형 없이 생물학적 시료로부터 분리된 단백질일 수 있다. 온전한 단백질은, 예를 들어 단백질 분해 효소에 의한 단백질 분해 없이, 생물학적 시료로부터 분리된 단백질일 수 있다.

상기 측정 방법은 예를 들어, 웨스턴블랏팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA:

Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법

(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등을 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 GPKOW 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 포함한다.

상기 정상 대조군은 방사선에 노출되지 않은 개체, 또는 방사선에 노출되기 전에 동일 개체로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다.

상기 측정된 단백질의 발현 수준은 방사선에 노출된 시간 및/또는 선량에 비례하여 정상 대조군에 비해 증가하기 때문에, GPKOW 단백질의 발현 수준을 정상 대조군의 GPKOW 단백질 발현 수준과 비교함으로써, GPKOW 단백질의 발현 수준이 증가하는 정도에 따라 방사선 피폭 여부 및/또는 그 정도, 예를 들어, 방사선 피폭 선량을 예측하거나, 방사선 치료에 대한 효과를 예측하거나, 방사선 치료시 방사선 조사에 의한 치료 대상 이외의 정상 장기의 손상 정도를 진단, 예측할 수 있다.

일 양상에 따른 방사선 피폭 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방사선 피폭 진단 방법에 따르면, 방사선 피폭 시간이나 피폭 선량을 간편하게 진단할 수 있고, 방사선 치료 효과를 예측할 수 있다.

도 1은 방사선 조사시 혈액 세포에서 단백질 발현 패턴 변화를 비표지 정량법으로 단백질체를 정량하고, 정량값에 따라 단백질들을 분류한 결과이다.
도 2는 혈액세포주 GM10832 및 GM10860에 x선을 2Gy 조사하고 0, 4, 9시간 후의 GPKOW mRNA 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 혈액세포주 GM010833, GM10834, 및 GM10860에 x선을 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 Gy 선량으로 조사하고 9시간 후의 GPKOW mRNA 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 4는 방사선 조사 시간에 따른 GPKOW 단백질 발현 정량값의 변화를 나타낸 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 방사선 피폭 바이오마커의 선별

혈액 세포에 방사선을 조사한 후, 각 시료를 질량분석기술 기반의 프로테옴 프로파일링 방법과 비표지 정량법(Label-Free Quantification, LFQ)으로 바이오마커 후보를 선별하였다. 구체적으로, 혈액세포주에 2Gy의 방사선을 조사하고, 0, 1, 5, 24시간 후 단백질 발현 패턴의 변화를 비표지 정량법을 통해서 단백질을 정량하고, 시료 간의 패턴 변화에 따라 단백질들의 그룹을 6개의 클러스터(cluster)로 분류하였다. 분류 결과를 도 1에 나타내었다. 6개의 클러스터 중 시간이 지남에 따라 발현량이 일관적으로 증가하는 클러스터 3을 선택하였다.

클러스터 3에 속하는 123개의 단백질 중 방사선 피폭 후 24시간이 지난 후에도 발현량이 지속적으로 증가하는 단백질인 GPKOW를 바이오마커로 선택하였다.

실시예 2. 방사선 피폭에 따른 GPKOW mRNA의 발현 변화 평가

실시예 1에서 선택한 GPKOW가 방사선 피폭의 바이오마커로 기능하는지 여부를 평가하기 위해서, 혈액세포주에 방사선을 조사한 후 GPKOW mRNA의 발현 변화를 RT-PCR을 통해 확인하였다.

구체적으로, 림프아구성 세포주(lymphoblastoid cell line)는 GM10832, GM10833, GM10834, 및 GM10860 세포주를 Coriell Cell Repositories (NJ, USA)에서 분양 받았다. 분양 받은 세포주를 2mM L-글루타민과 15% 열처리되지 않은 FBS(fetal bovine serum, 우태아혈청)가 함유된 RPMI 1640 배지에서 부유시켜 T75 플라스크에서 부유된 상태로 배양하였다.

상기 림프아구성 세포주에 X-RAD 320 Biological X-Ray Irradiator (Precision X-Ray, Inc., CT, USA)로 2Gy선량으로 x선을 조사한 후 0, 4, 9시간 후에 샘플링을 하였다. 또한, 림프아구성 세포주에 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 Gy 선량으로 x선을 조사하고 9시간 후에 샘플링을 하였다.

상기 샘플링한 세포주에 대하여, 0.01% Triton X-100, 완전 프로테아제 저해제 칵테일 용액(complete protease inhibitor cocktail solution)과 1% PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, 페닐메틸설포닐 플루오라이드)가 포함된 PBS(Phosphate Buffer Solution, 인산 완충액)을 사용하여 세포 용해물(cell lysate)에 5초 3회 20% 프로브 타입 음파처리(probe type sonication) 과정을 통해 단백질체 분석을 위한 단백질 균질액을 얻었다.

상기 단백질 균질액에서 당업계에서 사용되는 공지된 방법을 통해 총 RNA를 추출하였다. 추출된 총 RNA는 260/280 nm에서 1.95이상, 260/230nm에서 1.2이상의 순도로 정제하였다. 정제한 mRNA 1μg으로부터 cDNA를 합성하기 위해, 정제한 mRNA 1μg으로부터 High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, USA)에 기술된 방법을 이용하여 20μl의 cDNA를 합성하였다. 키트 사용법은 10μl의 2X RT 버퍼, 1μl의 20X Enzyme mix, 1μg total RNA를 9 μl까지 혼합하여 반응물 조성을 구성하고 최종 부피가 20μl가 되도록 nuclease-free H₂O로 맞추었다. 37℃에서 60분간 효소반응 후 95℃에서 5분간 반응정지와 동시에 4℃에서 합성된 cDNA합성을 종료하였다. 각 유전자 발현을 위해 PCR을 수행하기 전까지 완성된 cDNA는 -15 내지 -25℃ 구간의 냉동고에 저장하여 사용하였다.

cDNA 합성 후, GPKOW(NM_015698.5)의 프라이머 쌍(정방향: 5'-accagatgaggagcaagaga-3', 역방향: 5'-ctgctttctcactcttggct-3'; 377bp)을 사용하여 94℃ 4분 1 사이클, 94℃ 30초와 57℃ 50초와 72℃ 1분 27사이클, 72℃ 10분 1사이클로 PCR을 수행하였다. PCR을 통해 얻어진 PCR 산물을 2% 아가로오스 겔에서 전기영동하여 mRNA의 발현을 확인하였다.

도 2는 혈액세포주 GM10832 및 GM10860에 x선을 2Gy 조사하고 0, 4, 9시간 후의 GPKOW mRNA 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 두 종류의 혈액 세포에서 x선 조사 후 시간이 지남에 따라 GPKOW mRNA의 발현량이 정량적으로 증가하였고, 9시간이 지난 후에도 계속하여 증가하는 것을 확인하였다.

도 3은 혈액세포주 GM010833, GM10834, 및 GM10860에 x선을 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 Gy 선량으로 조사하고 9시간 후의 GPKOW mRNA 발현을 RT-PCR로 확인한 결과이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 세 종류의 혈액 세포에서 x선을 조사한 선량에 비례하여 GPKOW mRNA의 발현량이 정량적으로 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, GPKOW mRNA는 방사선 조사 선량 및 조사 시간에 비례하여 발현량이 정량적으로 증가하는 것을 알 수 있다.

실시예 3. 방사선 피폭에 따른 GPKOW 단백질의 발현 변화 평가

GPKOW 단백질의 방사선 피폭에 따른 변화를 평가하기 위해서, 고분해능 질량분석기를 이용하여 펩타이드들의 스펙트럼 강도를 통계적으로 분석하는 비표지 정량법을 통해 정량을 수행하였다. 구체적으로는, 프로테아제/포르파타제 저해제 칵테일이 추가된 8M 우레아 100μl를 이용하여 1x10⁶의 세포를 용해시킨 후 50mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)로 37℃에서 이황화 결합을 환원시켰다. 이후 55mM 요오드아세트아미드(iodoacetamide)로 빛이 없는 조건에서 알킬화(alkylation)를 수행한 후 55mM 디티오트레이톨로 급냉(quenching)을 수행하였다. 50mM 탄산수소 암모늄(ammonium bicarbonate)을 800 ml까지 추가하여 단백질:프로테아제 = 25:1의 비율로 처리하고 37℃에서 O/N으로 분해를 수행하였다. 분해된 후 10% 포름산을 이용하여 반응을 중지시키고 C18 역상 탈염 카트리지(reverse phase desalting cartridge)를 이용하여 탈염을 수행하였다. 탈염된 펩타이드는 진공 건조기(Speed Vac)를 이용하여 건조한 후 0.1% 포름산으로 녹여LC-MS 분석을 수행하였다. MS장비는 Q-Exactive Plus BioPharm version (Thermo, USA)을, LC는 UltiMate™ 3000 RSLCnano System (Thermo, USA)를 사용하였으며 펩타이드 시료는 4μl씩 주입하여 300 μl/min의 유속으로 NanoLC와 연동된 이온 트랩 질량 분석기(Ion trap mass spectrometer)로 분석을 수행하였다. LC는 Solution A (5% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)와 solution B (95% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)의 농도 구배 120분을 포함하여 총 150분 동안 분리하며 사용하는 분석 컬럼은 AQUA C18 (5μm, 125A)을 충진한 내직경 75μm, 외직경 360μm, 길이 50cm 용융 실리카 모세관 칼럼(fused silica capillary column)을 사용하여 펩타이드 혼합체를 분리하였다. 분리된 펩타이드는 2000V의 전자분무 이온화 전압(Electrospray ionization voltage)을 이용하여 이온 분사하며 이온 방출기는 내직경 20 μm 트랩 이온 스프레이 방출기(tappered ion spray emitter)를 통해 질량분석기로 주입하여 스펙트럼 데이터를 획득하였다. 오비트랩(Orbitrap) MS 분석은 400~2000 m/z 범위에 대해 이온 트랩 MS로 1번의 서베이 스캔(survey scan) (resolution 30,000)후에 고에너지 충돌유도 해리(Higher energy collision-induced dissociation, HCD, 25% energy level) 방식을 이용하여 오비트랩 MS를 이용, 8번의 MS/MS (resolution 60,000) 분석을 수행하였다. 5분의 dynamic exclusion option을 통해 중복된 펩타이드 이온 검출을 최소화하였다. 이온 트랩의 Auto gain control target setting은 Full MS에 대해서는 3E04를, FT MS/MS에 대해서는 2E5을 사용하였다. 획득한 RAW 파일을 Sequest 알고리즘 기반의 데이터 베이스 분석 소프트웨어인 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) (Thermo, USA, version 2.2)를 이용하여 정성 분석 및 비표지 정량 분석을 수행하였다. 시스테인에는 시스테인 카르바이도메틸화(cystein carbamidomethylation)을 고정값(fixed modification)으로 처리하고, 메티오닌(methionine)에는 산화(oxidation)를 변수 수정(variable modification)으로 수행하였다. 트립신 미절단(Trypsin missed cleavage)은 “1”값을 이용하며 서열 데이터베이스(sequence database)는 최신 swissprot sequence DB를 사용하며 비표지 정량을 위해서 펩타이드 이온 강도를 이용한 정량분석을 수행하였다. 동정된 단백체들을 Uniprot accession number를 쿼리(query)로 사용하여 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.7 (http://david.abcc.ncifcrf.gov)을 이용, gene ontology (GO)를 세포 성분(cellular component), 분자 기능 및 생물학적 공정의 세 분야를 대상으로 분석하였으며 Perseus(http://www.perseus-framework.org)를 이용하여 히트 맵(heat map) 및 클러스터링 분석과 Volcano plot 분석을 수행하였다.

실험 결과, 하기 표 1에 방사선 피폭 후 시간 경과에 따른 GPKOW의 단백질 발현 정량값을 나타내었다. GPKOW 발현 정량값은 3회 분석하여 얻은 값의 평균이다.

2Gy후 시간	0시간	1시간	5시간	24시간
GPKOW 단백질 발현 정량값	9.2	27.4	41.1	322.3

표 1에 나타낸 바와 같이, 방사선 피폭 후 GPKOW 단백질의 발현량이 시간에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다. 도 4는 방사선 조사 시간에 따른 GPKOW 단백질 발현 정량값의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4에 나타낸 바와 같이, x축을 시간으로, y축을 GPKOW 단백질의 발현 정량값으로 하여 그래프를 그린 결과, 그래프가 선형을 나타내어 GPKOW 단백질이 방사선 조사 후 시간에 비례하여 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Biomarker for diagnosing radiation exposure and method using thereof <130> PN123358 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Leu Gln Gln Ala Ala Arg Arg Pro Gly Lys Arg Ser Lys Met 1 5 10 15 Ala Asp Ser Lys Glu Gly Val Leu Pro Leu Thr Ala Ala Ser Thr Ala 20 25 30 Pro Ile Ser Phe Gly Phe Thr Arg Thr Ser Ala Arg Arg Arg Leu Ala 35 40 45 Asp Ser Gly Asp Gly Ala Gly Pro Ser Pro Glu Glu Lys Asp Phe Leu 50 55 60 Lys Thr Val Glu Gly Arg Glu Leu Gln Ser Val Lys Pro Gln Glu Ala 65 70 75 80 Pro Lys Glu Leu Val Ile Pro Leu Ile Gln Asn Gly His Arg Arg Gln 85 90 95 Pro Pro Ala Arg Pro Pro Gly Pro Ser Thr Asp Thr Gly Ala Leu Ala 100 105 110 Asp Gly Val Val Ser Gln Ala Val Lys Glu Leu Ile Ala Glu Ser Lys 115 120 125 Lys Ser Leu Glu Glu Arg Glu Asn Ala Gly Val Asp Pro Thr Leu Ala 130 135 140 Ile Pro Met Ile Gln Lys Gly Cys Thr Pro Ser Gly Glu Gly Ala Asp 145 150 155 160 Ser Glu Pro Arg Ala Glu Thr Val Pro Glu Glu Ala Asn Tyr Glu Ala 165 170 175 Val Pro Val Glu Ala Tyr Gly Leu Ala Met Leu Arg Gly Met Gly Trp 180 185 190 Lys Pro Gly Glu Gly Ile Gly Arg Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Pro 195 200 205 Arg Val Asn Ser Leu Arg Pro Lys Gly Leu Gly Leu Gly Ala Asn Leu 210 215 220 Thr Glu Ala Gln Ala Leu Thr Pro Thr Gly Pro Ser Arg Met Pro Arg 225 230 235 240 Pro Asp Glu Glu Gln Glu Lys Asp Lys Glu Asp Gln Pro Gln Gly Leu 245 250 255 Val Pro Gly Gly Ala Val Val Val Leu Ser Gly Pro His Arg Gly Leu 260 265 270 Tyr Gly Lys Val Glu Gly Leu Asp Pro Asp Asn Val Arg Ala Met Val 275 280 285 Arg Leu Ala Val Gly Ser Arg Val Val Thr Val Ser Glu Tyr Tyr Leu 290 295 300 Arg Pro Val Ser Gln Gln Glu Phe Asp Lys Asn Thr Leu Asp Leu Arg 305 310 315 320 Gln Gln Asn Gly Thr Ala Ser Ser Arg Lys Thr Leu Trp Asn Gln Glu 325 330 335 Leu Tyr Ile Gln Gln Asp Asn Ser Glu Arg Lys Arg Lys His Leu Pro 340 345 350 Asp Arg Gln Asp Gly Pro Ala Ala Lys Ser Glu Lys Ala Ala Pro Arg 355 360 365 Ser Gln His Trp Leu His Arg Asp Leu Arg Val Arg Phe Val Asp Asn 370 375 380 Met Tyr Lys Gly Gly Gln Tyr Tyr Asn Thr Lys Met Ile Ile Glu Asp 385 390 395 400 Val Leu Ser Pro Asp Thr Cys Val Cys Arg Thr Asp Glu Gly Arg Val 405 410 415 Leu Glu Gly Leu Arg Glu Asp Met Leu Glu Thr Leu Val Pro Lys Ala 420 425 430 Glu Gly Asp Arg Val Met Val Val Leu Gly Pro Gln Thr Gly Arg Val 435 440 445 Gly His Leu Leu Ser Arg Asp Arg Ala Arg Ser Arg Ala Leu Val Gln 450 455 460 Leu Pro Arg Glu Asn Gln Val Val Glu Leu His Tyr Asp Ala Ile Cys 465 470 475 480 Gln Tyr Met Gly Pro Ser Asp Thr Asp Asp Asp 485 490 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Ala Asp Ser Lys Glu Gly Val Leu Pro Leu Thr Ala Ala Ser Thr 1 5 10 15 Ala Pro Ile Ser Phe Gly Phe Thr Arg Thr Ser Ala Arg Arg Arg Leu 20 25 30 Ala Asp Ser Gly Asp Gly Ala Gly Pro Ser Pro Glu Glu Lys Asp Phe 35 40 45 Leu Lys Thr Val Glu Gly Arg Glu Leu Gln Ser Val Lys Pro Gln Glu 50 55 60 Ala Pro Lys Glu Leu Val Ile Pro Leu Ile Gln Asn Gly His Arg Arg 65 70 75 80 Gln Pro Pro Ala Arg Pro Pro Gly Pro Ser Thr Asp Thr Gly Ala Leu 85 90 95 Ala Asp Gly Val Val Ser Gln Ala Val Lys Glu Leu Ile Ala Glu Ser 100 105 110 Lys Lys Ser Leu Glu Glu Arg Glu Asn Ala Gly Val Asp Pro Thr Leu 115 120 125 Ala Ile Pro Met Ile Gln Lys Gly Cys Thr Pro Ser Gly Glu Gly Ala 130 135 140 Asp Ser Glu Pro Arg Ala Glu Thr Val Pro Glu Glu Ala Asn Tyr Glu 145 150 155 160 Ala Val Pro Val Glu Ala Tyr Gly Leu Ala Met Leu Arg Gly Met Gly 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Glu Gly Ile Gly Arg Thr Phe Asn Gln Val Val Lys 180 185 190 Pro Arg Val Asn Ser Leu Arg Pro Lys Gly Leu Gly Leu Gly Ala Asn 195 200 205 Leu Thr Glu Ala Gln Ala Leu Thr Pro Thr Gly Pro Ser Arg Met Pro 210 215 220 Arg Pro Asp Glu Glu Gln Glu Lys Asp Lys Glu Asp Gln Pro Gln Gly 225 230 235 240 Leu Val Pro Gly Gly Ala Val Val Val Leu Ser Gly Pro His Arg Gly 245 250 255 Leu Tyr Gly Lys Val Glu Gly Leu Asp Pro Asp Asn Val Arg Ala Met 260 265 270 Val Arg Leu Ala Val Gly Ser Arg Val Val Thr Val Ser Glu Tyr Tyr 275 280 285 Leu Arg Pro Val Ser Gln Gln Glu Phe Asp Lys Asn Thr Leu Asp Leu 290 295 300 Arg Gln Gln Asn Gly Thr Ala Ser Ser Arg Lys Thr Leu Trp Asn Gln 305 310 315 320 Glu Leu Tyr Ile Gln Gln Asp Asn Ser Glu Arg Lys Arg Lys His Leu 325 330 335 Pro Asp Arg Gln Asp Gly Pro Ala Ala Lys Ser Glu Lys Ala Ala Pro 340 345 350 Arg Ser Gln His Trp Leu His Arg Asp Leu Arg Val Arg Phe Val Asp 355 360 365 Asn Met Tyr Lys Gly Gly Gln Tyr Tyr Asn Thr Lys Met Ile Ile Glu 370 375 380 Asp Val Leu Ser Pro Asp Thr Cys Val Cys Arg Thr Asp Glu Gly Arg 385 390 395 400 Val Leu Glu Gly Leu Arg Glu Asp Met Leu Glu Thr Leu Val Pro Lys 405 410 415 Ala Glu Gly Asp Arg Val Met Val Val Leu Gly Pro Gln Thr Gly Arg 420 425 430 Val Gly His Leu Leu Ser Arg Asp Arg Ala Arg Ser Arg Ala Leu Val 435 440 445 Gln Leu Pro Arg Glu Asn Gln Val Val Glu Leu His Tyr Asp Ala Ile 450 455 460 Cys Gln Tyr Met Gly Pro Ser Asp Thr Asp Asp Asp 465 470 475

Claims

GPKOW(G-patch domain and KOW motifs) 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 방사선 피폭 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 GPKOW 단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방사선 피폭 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는 GPKOW 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 것인 방사선 피폭 진단용 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체인 것인 방사선 피폭 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는 GPKOW 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것인 방사선 피폭 진단용 조성물.
청구항 1 내지 5 중 어느 하나의 항에 따른 조성물을 포함하는 방사선 피폭 진단용 키트.
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 GPKOW 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준 또는 GPKOW 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군의 단백질 발현 수준과 비교하여 정상 대조군에 비해 GPKOW 단백질의 발현 수준이 증가하는 경우, 상기 개체가 방사선에 피폭된 것으로 결정하는 단계를 포함하는 방사선 피폭 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈소판, 혈청, 복수액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 점막액, 양수, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 생물학적 시료와 상기 GPKOW 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 인큐베이션(incubation)시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 GPKOW 단백질에서 유래한 펩타이드를 측정함으로써, 상기 생물학적 시료의 질량 분석을 수행하는 단계를 포함하는 것인 방법.
청구항 7에 있어서, 상기 단계 (a)는 GPKOW 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화(hybridization)를 수행하고, 혼성화 정도를 통해 상기 GPKOW 폴리뉴클레오티드의 mRNA 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.