KR20180024107A - 아토피 피부염 진단용 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은, C3dg(C3 보체 단편)를 포함하는, 외인성/내인성 아토피 피부염의 바이오마커 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 정보제공방법, 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단방법에 의할 경우, 기존의 아토피 피부염 환자 혈청 분석의 serum proteomics가 가지고 있는 문제점을 해결하여, 외인성 뿐만 아니라 내인성 환자의 경우에도 모두 적용할 수 있으며, 간편하고 비침습적이며 정확도가 높은 장점을 가지고 있다.

Description

아토피 피부염 진단용 바이오마커{Biomarker for diagnosis of atopic dermatitis}

본 발명은, C3dg(C3 보체 단편)를 포함하는, 외인성/내인성 아토피 피부염의 바이오마커 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 정보제공방법, 및 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.

아토피 피부염(Atopic Dermatitis; AD)은 어린이 및 성인에서 나타나는 습진, 소양감, 및 피부건조와 연관된 만성 염증성 피부질환으로서, 환경 및 유전의 복합적 요인에 의해 유발된다고 알려져 있고, 다양한 면역학적 반응 및 염증 반응을 동반한다. 아토피 피부염은 외인성 아토피 피부염 (extrinsic type AD)과 내인성 아토피 피부염 (비알러지성, intrinsic type AD)으로 구분할 수 있다. 외인성 아토피 피부염은 혈청 IgE 수준이 높고 알러겐 특이적 IgE가 존재하는 알러지 인자와 연관된 아토피 피부염이고, 내인성 아토피 피부염은 혈청 IgE 수준이 정상이나 외인성 아토피 피부염과 비슷한 피부 병흔 (skin lesion) 및 분포 양상을 나타내는 비알러지성 아토피 피부염이다. 내인성 아토피 피부염 환자는 전체 아토피 피부염 환자의 10~45%를 차지하는 것으로 보고되고 있다.

한편, 혈청은 다양한 종류의 단백질을 포함하고, 체내에서 발생하는 다양한 과정에 대한 중요한 정보를 제공한다. 혈청 프로테옴(proteome)은 질환 특이적 단백질 분해에 의해 생성된 펩티드 단편들을 포함하여, 생리학적으로 중요한 다양한 케모카인, 사이토카인 및 펩타이드 호르몬들을 포함한다. 따라서, 많은 임상의/연구자들은 임상적 진단, 약물 반응성 및 의학적 예후를 평가하기 위하여 혈청 유래 샘플에서 질환 특이적 바이오마커를 발굴하기 위해 많은 연구를 수행해오고 있다.

따라서, 아토피 피부염 환자 유래 혈액샘플에서 단백질의 정량 및 정성 분석은 아토피 피부염 질환의 복잡성을 규명하고, 신규한 임상적 바이오마커를 발굴할 수 있는 기회를 제공할 것이다. 즉, 아토피 피부염은 IgE를 포함하는 항원제시세포, T세포 활성, 비만세포의 탈과립, 각질세포, 호산구, 및 즉각적인 세포성 면역반응의 상호작용으로 인한 면역학적 변화의 복합체라는 특징이 있는 바, 아토피 피부염에서 이러한 변화의 기작은 잘 알려져 있지 않으므로, 아토피 피부염의 혈청 프로테오믹스 연구는 그 발병기작을 이해하는데 유용할 것이다.

이와 관련하여, 최근에는 환자 유래 섬유아세포에서 C3 보체 구성성분의 전사적 수준이 외인성 타입의 아토피 피부염(extrinsic type AD; ADe) 및 내인성 타입의 아토피 피부염(intrinsic type AD; ADi) 환자 모두에서 현저히 감소되어 있음이 보고된 바 있다.

C3(보체 구성요소 C3) 단백질은, 22개 아미노산 잔기의 시그널 펩타이드, 992개 잔기의 알파체인, 및 645개 잔기의 베타체인으로 구성되어 있으며, 보체 구성요소 C4 및 알파 2-마크로글로불린과 매우 높은 유사성을 가진다. C3는 C3a 및 C3b로 절단되고, C3b는 이어서 iC3b 및 C3dg로 절단된다. 각 단편 단백질은 고전적인 C3-의존적 기능을 매개하기 위한 특이적 수용체에 결합하는 리간드로 작용한다. 간은 인간의 혈청에서 발견되는 대부분의 C3 단백질을 합성하고, 인간 피부에 존재하는 각질세포(keratinocyte)는 UV 복사 및 사이토카인 유도와 관련된 C3의 주요 원인이다. C3의 고전적 기능은 옵소닌작용(opsonization)이며, 이외의 다양한 역할들이 보고되어 왔다. C3는 다발성 경화증에서 질환의 장애 정도 및 신경퇴화에 대한 마커와 연관이 있으며, C3 유전자의 다형 현상(Polymorphisms)은 노인황반변성(age-related macular degeneration), 루푸스(systemic lupus erythematosus), 및 허혈성 뇌졸중과 관련이 있다. C3와 피브린(fibrin) 사이의 고친화성 결합은 장기적인 섬유소 용해(fibrinolysis)를 일으킨다고 알려져 있다.

그러나, 아직까지 아토피 피부염에서, C3의 구체적인 역할 및 C3 유래의 다양한 단편들의 기능들에 대하여 밝혀진 바는 거의 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 아토피 피부염 환자의 혈청 샘플에서 C3 보체 구성성분에서 유래하는 단편 단백질을 검출하고자 다양한 기술들을 조합하여 연구한 결과, 정상인과 비교하여 외인성/내인성 아토피성 피부염 환자의 혈액 시료에서는 C3dg(C3 보체 단편)의 수준이 특이적으로 증가한다는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은, C3dg을 포함하는, 아토피성 피부염의 바이오마커 조성물, 진단용 조성물, 진단 키트, 진단 정보제공방법, 및 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은, C3 보체단편으로서 C3dg를 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 C3dg는 정상인에 비하여 아토피성 피부염 환자의 혈청에서 mRNA 또는 단백질 수준이 증가되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 아토피성 피부염은 외인성 또는 내인성인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, C3 보체단편으로서 C3dg의 mRNA 또는 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 아토피성 피부염은 외인성 또는 내인성인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는 C3dg 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 단백질 발현수준을 측정하는 제제는 C3dg 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 상기 진단용 조성물을 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 키트는 DNA 마이크로어레이 칩 또는 단백질 칩인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, 개체의 시료로부터 C3 보체단편으로서 C3dg의 mRNA 또는 단백질 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 개체의 시료로부터 C3dg 발현수준 측정 결과, 정상 대조군보다 증가한 경우 아토피성 피부염이라고 판정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 상기 C3dg의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 또는 노던 블랏팅(Northern blotting)을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 C3dg의 단백질 발현수준을 측정하는 단계는 항원-항체 반응을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 항원-항체 반응은 ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이(microarray) 분석법으로 수행하는 것임을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 림프액 또는 소변인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은, (a) 개체로부터 얻어진 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및 (b) C3 보체단편으로서 C3dg의 발현 프로파일을 검출하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예로서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 림프액 또는 소변인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 아토피성 피부염 진단방법에 의할 경우, 기존의 아토피 피부염 환자 혈청 분석의 serum proteomics가 가지고 있는 문제점을 해결하여, 외인성 뿐만 아니라 내인성 환자의 경우에도 모두 적용할 수 있다는 이점이 있다.

또한, 본 발명은 아토피성 피부염 환자의 혈액 시료에서 특이적으로 변화하는 C3dg 양을 측정하여 진단하는 방법으로서, 간편하고 비침습적이며 정확도가 높은 장점을 가지고 있다.

도 1은, 정상인 및 아토피 피부염 환자 혈청에 대하여 프로테옴 분석을 실시하기 위하여, MARC 칼럼으로 혈청내 과량 단백질을 제거한 후 2D-PAGE를 수행한 결과이다.
도 2는, 정상인 및 아토피 피부염 환자 혈청 샘플에 대하여, MARC 전처리 없이 micro-Rotofor에 의해 얻은 분획물(fraction)을 SDS-PAGE 수행한 결과이다.
도 3은, 정상인 및 아토피 피부염 환자 혈청 샘플에 대하여, MARC 전처리 후 micro-Rotofor에 의해 얻은 분획물(fraction)을 SDS-PAGE 수행한 결과이다.
도 4a는 정상인 및 아토피 피부염 환자 혈청 샘플에 대하여 항-C3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이며, 도 4b는 검출된 타겟 C3 단편 밴드에 대해 MALDI-TOF 프로파일 분석을 실시한 결과이다.
도 5는, 정상인 및 아토피 피부염 환자 혈청 샘플에 대하여, 항-C3dg 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이다.
도 6은, 정상인과, 내인성 및 외인성 2가지 타입의 아토피 피부염 환자 혈청 샘플에 대하여, 항-C3dg 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이다.
도 7은, C3dg의 아미노산 서열을 나타내며, C3 보체 단백질의 955번째 아미노산부터 1303번째 아미노산에 해당하는 폴리펩타이드(노란색 하이라이트 표시부분)를 의미한다.

본 발명은 C3dg(C3 보체 단편)이 아토피성 피부염(AD) 환자의 시료에서 특이적으로 검출된다는 발견에 기초한 것으로, 상기 C3dg을 바이오 마커로 이용하여 아토피성 피부염을 진단하는 기술을 제공한다.

혈청 프로테오믹스(serum proteomics)는 기존의 질병 관련 핵심 인자들을 발견하는데 유용한 기술이나, 혈액 샘플을 활용한 질병 관련 인자의 측정은 혈청내부에 존재하고 있는 단백질들의 특징 및 기술적인 문제로 인해 피부질환에서는 상대적으로 활용성이 적었다.

이에, 본 발명자들은 아토피 피부염 환자의 혈청에서 질환 특이적 바이오마커를 개발하고자 다양한 기술적인 접목을 시도하였다.

첫째, 혈액내 다량 분포되어 있는 주요 단백질을 MARC 전처리를 통해 일부 제거하였으며, 둘째, MARC로 전처리한 샘플에 대해서 micro-Rotofor를 활용하여 액상에서 IEF(단백질 등전점 분획)을 수행하여 10종의 분획을 얻었으며, 셋째, 상기 획득한 분획 샘플에 대해 항-C3 단백질 항체를 이용하여 특이적으로 결합하는 단백질을 발굴하였으며, 넷째, 발굴된 단백질의 MALDI-TOF 동정을 통해 C3dg 단백질임을 확인하였으며, 다섯째, 확인된 정보를 근거로 자체 anti-C3dg 항체를 제작하여 외인성 및 내인성 환자 유래 혈청에서 웨스턴 블랏팅을 수행하였으며, 최종적으로 정상인 대조군에서는 C3dg 단백질이 생성되지 않았으나 환자군 샘플(외인성 및 내인성 아토피 피부염 환자 유래의 혈청)에서는 모두 예외없이 C3dg 단백질이 검출됨을 확인하였다.

특정 단백질을 발굴하기 위하여 2DE-PAGE를 이용한 일반적인 프로테오믹 접근법은 산성 및 중성의 단백질체를 분리하기에 유용하나, 환자의 혈액 유래 샘플을 이용할 경우 상기 접근법은 dysregulated factor들을 분석하기에는 유용하지 않다. 혈청은 주요한 다량의 단백질이 포함되어 있어 가장 분석하기 어려운 샘플이므로, 이러한 한계점을 극복하기 위해 다양한 전처리, 예를 들어 2D-PAGE 수행 전에 과량의 단백질을 제거하기 위해 면역친화성 컬럼(immuno-affinity column)을 실시할 수 있다.

아토피 피부염의 경우, 혈청 프로테오믹스를 위해서는 생검 조직샘플과 비교하여 다량의 환자 유래 혈청이 필요하다. 분취 등전 초점화법(Preparative isoelectric focusing; IEF)은 샘플의 복잡성을 감소시키고, 상대적으로 적은 양의 단백질 양을 높이고, 질량분석법을 위한 단백질의 서열범위를 증가시키기 위해 아토피 피부염 혈청 샘플을 분획하기 위해 이용하였다. IEF 분획은 등전점(isoelectric points; pI)에 따라 액상(liquid phase)에서 micro-Rotofor를 사용하여 이루어지며, 다음으로 SDS-PAGE를 통해 단백질을 전개한다. 액상 IEF는 유사한 등전점을 가진 적은 양의 단백질들을 분리가능하고, 단백질 변성 조건에서 단백질 간 소수성 상호작용을 감소시키는 이점이 있다.

그 결과, 본 발명에서는 상기 방법들을 이용하여 아토피 피부염 환자 유래 혈청 샘플에서 C3 보체의 구성요소의 단편인 C3dg 단백질의 특이적인 존재를 확인하였다. 이러한 결과는 C3dg가 아토피 피부염 발병 연구를 위한 새로운 타겟 단백질이며, 혈청 수준에서 아토피 피부염의 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있음을 보여준다.

따라서, 상기 결과를 바탕으로 C3dg 단백질이 아토피 피부염 질환의 진단에 특이적으로 활용될 수 있는 바이오마커임을 증명하였다.

본 발명에서, "C3dg"는 C3 보체(complement)의 단편형으로서 등전점 5.0의 39 kDa 분자량을 가지며, C3 단백질의 955번째 아미노산부터 1303번째 아미노산까지의 폴리펩타이드를 의미한다. C3dg의 서열은 공지된 데이터베이스에서 그 정보를 확인할 수 있다. 예를 들어, 인간 C3dg의 아미노산 서열은 http://www.uniprot.org/blast/?about=P01024[955-1303]&key=Chain&id=PRO_0000005913 에서 확인할 수 있다.

C3dg는 4량체 형태를 형성하고, CD21을 발현하는 B세포를 활성화시킬 수 있다. 또한, C3dg 자체가 식세포작용(phagocytosis)을 위한 보체 수용체 3의 결합도메인에 대한 리간드로써 작용함이 보고되었으며, 발작성 야간혈색소 요증(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 샘플에서 C3dg 매개 적혈구식세포증가(erythrophagocytosis) 수준이 C3dg 옵소닌작용의 정도와 연관이 있다고 보고되었다. 이러한 연구는 C3dg 단백질의 질환 관련 기능적 역할을 보여준다.

본 발명에서 "외인성 아토피 피부염(extrinsic atopic dermatitis: EAD)"이란, 혈청 IgE 수준이 높고 알러겐 특이적 IgE가 존재하는 알러지 인자와 연관된 아토피 피부염을 의미하며, "내인성 아토피 피부염(intrinsic atopic dermatitis: IAD)"이란, 혈청 IgE 수준은 정상적이나 외인성 아토피 피부염과 비슷한 피부 병흔(skin lesion) 및 분포 양상을 나타내는 비알러지성 아토피 피부염을 의미한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 아토피성 피부염 발병 여부를 확인하거나, 나아가 질환의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 "마커"란 아토피성 피부염을 진단할 수 있는 물질로, 아토피성 피부염과 관련된 폴리펩타이드, 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 마커는 C3dg으로서 아토피성 피부염 환자에서 현저하게 발현이 증가하는 C3dg mRNA 또는 단백질이다.

또한, 본 발명은 C3dg mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 mRNA 발현 수준 측정이란, 아토피성 피부염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 아토피성 피부염 관련 유전자 C3dg의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다.

본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 아토피성 피부염 관련 C3dg의 핵산 서열은 Uniprot DB (http://www.uniprot.org)에 PRO_0000005913로 등록되어 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명에서 "단백질 발현 수준 측정"이란, 아토피성 피부염을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

여기에서, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 C3dg 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함될 수 있다. 나아가, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는, C3dg의 정량 수단(프라이머, 프로브, 항체 등) 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, 바람직하게는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트, 단백질 칩 키트, ELISA 키트의 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. ELISA 키트의 경우 항원-항체 복합체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 개체의 시료로부터 C3dg mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다. 본 발명에서는, 상기 개체의 시료로부터 C3dg의 발현수준을 측정한 결과, 정상 대조군보다 증가한 경우 아토피성 피부염이라고 판정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 얻어진 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및 (b) C3dg의 발현 프로파일을 검출하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "시료"란 아토피성 피부염에 의해 C3dg의 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 또는 소변 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 예로는, 혈액, 혈청, 혈장 시료일 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"란 피검체를 의미하는 것으로, 모든 동물, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 실험방법

1-1. 시약

pH 3-10의 IPG strip(0.5 x 3 x 180 mm)은 GE Healthcare(Immobiline DryStrip, Uppsala, Sweden)에서 구매하였고, 도데실 황산나트륨(Sodium dodecyl sulfate; SDS), 아크릴아마이드(acrylamide), 메틸렌 비스 아크릴아마이드(methylene-bisacrylamide), N,N,N′,N′-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED), 트리스(Tris), 글리신(glycine), 글리세롤(glycerol), 및 포름알데히드(formaldehyde)는 Sigma-Aldrich Chemical Company(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 또한, 디티오트레이톨(Dithiothreitol), 우레아(urea), CHAPS, Ready Sol IEF 40% solution^TM 및 IPG 완충액은 GE Healthcare에서 구입하였다. 시퀀싱 등급의 트립신은 Roche(Mannheim, Germany)에서 구입하였으며, 2-DE 및 MS 분석을 위한 기타 시약들은 Sigma-Aldrich Chemical Company 또는 Merck(Whitehouse Station, NJ)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 혈청샘플 준비

아토피 피부염(AD) 혈청 샘플은 본 발명자들의 이전 연구보고에 따라 천식을 보유하지 않은 아토피 환자로부터 수집하였다. 비아토피 피부염의 대조군 샘플은 개인/가족력이 없고 아토피 질환에 대한 어떠한 증상도 나타나지 않은 사람으로부터 얻었으며, 대조군 및 아토피 피부염 환자의 연령은 19~32세였다. 혈청 샘플은 공지의 방법에 따라 수집하여 70℃에 보관하였다. 실험을 위해 대조군 및 아토피 피부염 환자로부터 모두 사전 동의를 얻었으며, 삼성생명과학연구소 의학 윤리위원회의 승인을 받은 후 실험을 진행하였다.

1-3. 친화성 컬럼을 이용한 혈청 내 다량의 단백질 제거

혈청에 존재하는 6개의 주요한 단백질들인 알부민(albumin), 트랜스페린(transferrin), IgG, IgA, 합토글로빈(haptoglobin), 및 항트립신(antitrypsin)을 제거하기 위해 Multiple Affinity Removal Column(MARC)(Agilent, Wilmington, DE, USA)을 이용하였다. MARC에 의한 단백질의 크로마토그래피 분리는 제조사의 표준 LC 프로토콜에 따라 이동상 시약 키트(mobile phase reagent kit)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 사람의 혈청 샘플을 프로테아제 억제제(COMPLETE^TM, Roche)를 포함하는 완충액 A를 이용해 5배 희석한 후 실온에서 1분 동안 16,000 x g의 속도로 회전시키면서 0.22μ 스핀 필터(spin filters)를 통해 여과시켰다. 이후 여과된 분획을 수집하여 사용 전까지 70℃에 보관하였다. 이후 2D-PAGE로 혈청 샘플 내 단백질을 분리하기 위해, MARC을 통해 얻은 분획을 모아 TCA 침전법(TCA precipitation method)에 따라 침전시켰다.

1-4. 샘플 준비 및 2D-PAGE

혈청 단백질은 브래드포드 단백질 정량법(Bradford protein assay)에 따라 정량하였고, IEF는 Multiphor II(GE Healthcare)를 이용하였으며, IPG strips은 제조사의 지침에 따라 이용하였다. 적정량의 단백질을 포함하고 있는 샘플을 350 ㎖의 재수화(rehydration) 용액(7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 2% (v/v) IPG buffer, trace bromophenol blue)으로 희석하여 strip(pH 310, non-linear)에 로딩하고 트레이에서 밤새 재수화되도록 하였다. 이후 재수화시킨 IPG strips를 이용해 총 80 kVh(pH 310)에서 IEF를 실시하였다.

플랫폼 온도는 18℃로 유지되도록 하였고, strip당 0.05 mA 전류가 흐르도록 하였다. IPG strips은 strip당 10 ㎖의 평형화 용액(equilibrating solution)(6 M urea, 2% SDS, 0.375 M 트리스, pH 8.8, 20% 글리세롤, 2.5% 아크릴아마이드, 0.5% 이소프로판올, 및 2.6% 트리부틸포스핀)을 포함하는 IPG strip equilibration tubes(SPL Labware, Kyunggi Do, Korea)에서 이황화결합을 감소시키기 위해 30분 동안 일정하게 흔들어 평형화되도록 하였다. 2-DE PAGE는 Iso-DALT 기구(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA)에서 8-16% 2차원 겔(200 x 250 x 1.0 mm)을 이용해 겔의 양극 말단이 tracking dye에 도달할 때까지 실시하였다.

1-5. m icro - Rotofor를 이용한 Liquid-phase IEF

혈청 샘플을 분획 완충액(3.5 M urea, 1M thiourea, and 2% CHAPS)을 이용해 4%(v/v)의 최종 농도가 되도록 희석하고, 10개 구역으로 나누어진 focusing chamber로 구성된 micro-Rotofor 장치(BioRad, Hercules, CA)에서 분획하였다. 양극액 및 음극액은 각각 0.1 M의 인산 및 0.1 M의 수산화나트륨을 이용하였다. 제한 전력은 10 mA로 맞추고 3.5시간 후에 모든 10개의 분획을 동시에 수집하였으며, 각 분획의 농도는 브래드포드 정량법으로 측정하였다.

1-6. 단백질 시각화 및 이미지 분석

겔을 일반적으로 이용 가능한 콜로이드성의 쿠마시 용액으로 쿠마시 염색을 실시하고, 탈이온수로 세척한 후 4℃에서 밀봉된 플라스틱에 보관하였다. 겔 내 단백질 패턴은 high-resolution scanner(GS-700 Calibrated Imaging Densitometer: Bio-Rad)를 이용해 이미지를 얻고, 상기 이미지를 2-DE 프로그램인 Melanie III(Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Geneva, Switzerland)를 이용해 분석하였다.

1-7. 겔 내 분리, MALDI - TOF 분석, 및 데이터 분석

쿠마시로 염색된 부분을 오려내어 탈염용액(25 mM ammonium bicarbonate, 50% acetonitrile)으로 염색시약을 제거하였다. 염색시약이 제거된 겔을 탈수하고 25 ng/㎕의 시퀀싱 등급 트립신이 포함된 25 mM의 탄산수소암모늄(ammonium bicarbonate)을 이용해 10분 동안 얼음 위에서 재수화시켰다. 과잉의 트립신은 25 mM의 탄산수소암모늄으로 교체한 후 37℃에서 밤새 겔 분해를 진행하였다. 이후 겔 분해 부피와 동일한 부피의 추출 완충액(50% (v/v) ACN and 25 mM ammonium bicarbonate)을 첨가하고 음파처리하여 펩타이드를 추출하였다.

다음으로, 펩타이드 용액을 진공 원심분리기를 이용해 건조시키고, 건조된 펩타이드는 5% (v/v) 포름산(formic acid)에 재용해시킨 후 펩타이드 샘플을 탈염 및 농축시키기 위해 적은 양의 POROS R2 resin을 인공적으로 trapping하는 겔 로더 팁에 로딩하였다. 샘플이 로딩된 컬럼을 5%(v/v) 포름산(2 × 5 ㎕)으로 세척한 후 펩타이드를 1 ㎕의 50%(v/v) ACN, 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA), 및 5 ㎎/㎖의 알파-시아노-4-히드록시신남산(alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid; CHCA)이 담긴 스테인리스강 타겟 위로 직접적으로 용출시켰다. 이후 관찰하고자 하는 단백질 스팟을 MALDI-TOF-MS로 분석하였다. 질량분석은 양이온 검출을 위해 reflector 모드에서 PerSeptive Biosystem Voyager-DE STR^TM MALDI-TOF-MS(Applied Biosystems)를 수행하였다. 분광기는 가속전압: 20 kV, 그리드 전압: 65%, 및 지연: 100 NS으로 세팅하여 작동시켰다.

500 ㎕의 트립신 분해를 통해 얻어진 펩타이드 추출물은 10 ㎎/㎖의 알파-시아노-4-히드록시신남산, 0.1% TFA, 및 50% ACN으로 구성된 0.5 ㎖의 매트릭스 용액이 담긴 MALDI 샘플 플레이트위에 분주하였다. 이후 External peptide calibrants, 안지오텐신 I(angiotensin I)(monoisotopic mass, 1296.6853), 레닌 기질(rennin substrate)(1758.9331) 및 부신피질 자극 호르몬(adrenocorticotropic hormone)(2465.1989)을 이용해 질량 교정을 실시하였다.

단백질은 서치 엔진 프로그램인 ProFound (http://prowl.rockefeller.edu/profound_bin/WebProFound.exe) 및 MASCOT (www.matrix-science.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=PMF)을 이용하여 펩타이드 질량 지문법으로 확인하였다. 모든 질량 분석은 0과 300 kDa 사이의 mass window를 이용하여 수행하였다. 검색 매개변수는 시스테인의 카복시아미도메틸화(carboxyamidomethylation) 및 메티오닌의 산화에 한하였다. 단백질의 적극식별은 하기에 나타낸 조건을 만족하는 것으로 하였다. (i) 적어도 4개 매칭 펩타이드 질량, (ii) 50 ppm 또는 그 이상의 질량 정확성, 및 (iii) 확인된 단백질의 M, 및 pI가 이미지 분석결과 얻어진 추정치와 일치해야함.

1-8. 면역블롯팅 분석

각 분획물 또는 혈청 샘플을 10% 아크릴아마이드 겔에 로딩하여 전기영동을 수행한 후 니트로셀룰로오스 트랜스퍼 멤브레인(Scheicher & Schuell, Protran, Germany)으로 단백질들이 옮겨지도록 트랜스퍼 과정을 수행하였다. 이후 TBST(50mM Tris-HCl(pH7.4), 150 mM NaCl, 및 0.2%Tween-20)에 희석한 3% non-fat milk를 멤브레인에 처리하여 1시간 동안 블로킹 과정을 실시한 후 각 타겟 단백질에 대한 항체를 처리하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 결합된 항체를 검출하기 위해 홀스래디쉬 페록시다아제가 접합된 항 IgG(SantaCruzBiotechnology, SantaCruz, CA) 항체를 TBST에 희석하여 멤브레인에 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 TBST로 멤브레인을 세척하고 enhanced chemiluminescence 시약(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 멤브레인에 처리하였다.

항-C3 항체는 시판하는 것을 이용하였고(C3 Antibody (H-300): sc-20137, Santa Cruz Biotechnology), 항-C3dg은 직접 제조하였다. 간략히, anti-C3dg 폴리클론 항체를 생산하기 위해 LKHLIVTPSGCGEQNMIGMTPT 서열의 펩타이드를 합성하여 이용하였다. 토끼 유래 폴리클론 항-C3dg 항체는 1회 용량: 300 μg/head, 일주일 안정화, 전면역 블리딩(preimmune bleeding) 및 펩타이드 주입, 2주 후 1차 부스팅, 일주일 후 테스트 블리딩 및 혈청 샘플링, 일주일 후 2차 부스팅, 일주일 후 ELISA 테스트를 위한 블리딩, 일주일 후 3차 블리딩, 일주일 후 product bleeding의 일반적인 과정에 따라 상기 항체를 생산하였다. 이후 상기 항-C3dg 항체는 C3dg 단백질이 접합된 세파로오스 비드를 이용해 정제하였다.

실시예 2: 실험결과

2-1. 아토피 피부염 환자 혈청 샘플의 MARC coupled 2D-PAGE 분석

정상인 및 아토피 피부염 환자 유래 혈청에 대하여 MARC column을 이용해 혈청내 과량 단백질을 제거한 후, 2D-PAGE를 실시하여 프로테옴 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 다양한 단백질 스팟이 정량적으로(% 부피) 증가하거나 감소한 것을 확인하였으며, 특히 이들중 C3d 단백질은 정상인(Normal)에 비하여 아토피 피부염 환자(ADe) 유래 샘플에서 증가되어 있음을 확인하였다.

2-2. micro- Rotofor system을 이용한 아토피 피부염 환자 혈청 샘플의 분획

C3 단편 단백질을 검출하기 위해 MARC 및 액상 IEF를 조합한 방법을 통해 아토피 피부염 환자 유래 혈청 프로테옴 분석을 실시하였다.

우선, MARC 전처리하지 않은 혈청 샘플에 대하여 micro-Rotofor 장치를 이용하여 액상 IEF를 실시하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 혈청 단백질들은 주로 산성 등전점(pI) 부분에 분포되어 있으며, 분획이 잘 이루어졌음을 확인하였다.

또한, 혈청 내에 과량 존재하는 단백질(abundant proteins)은 효과적인 단백질 분리에 영향을 미쳐 특정 부분 및/또는 밴드는 분석할 수 없기 때문에, MARC 전처리를 통하여 과량의 단백질을 제거하는 과정을 수행하여 분리과정을 최적화한 후, micro-Rotofor 장치를 이용하여 액상 IEF를 실시하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상인(Normal) 및 외인성 아토피 피부염 환자(ADe)의 혈청에서 다양한 등전점 범위의 단백질체가 적절히 분리된 것을 확인하였다.

2-3. 아토피 피부염 환자 혈청 샘플에서 C3 단백질 단편 검출

상기 실시예 2-1의 결과(도 1)에서는 정상인 및 아토피 피부염 환자 샘플 간에 C3d 단백질양의 차이를 확인하였으나, C3에서 유래한 다른 단백질을 검출하고자 다음 단계의 면역블롯팅을 실시하여 C3 단백질에서 유래한 단편을 찾고자 하였다.

구체적으로, C3 전구체, C3a 아나필라톡신, C3 알파, C3 베타 및 C3b를 검출할 수 있는 anti-activated C3 항체(C3 antibody (H-300): sc-20137, Santa Cruz)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였으며, 정상인 혈청과 (외인성 타입의) 아토피 피부염 환자 혈청의 C3 단편 프로파일을 비교하기 위해, anti-C3 항체를 사용하여 면역블롯팅을 실시하고 분획된 샘플을 분석하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 다양한 밴드가 나타났으며, 이중 40 kDa 및 pI 5.1 영역내의 분획 3(f3) 밴드에서 아토피 피부염 환자 특이적인 C3 보체 유래의 단편을 확인하였다(화살표 표시). 이 단편은 항체의 특이성을 근거로 C3 보체 구성요소의 단편화에 의해 생성된 것임을 알 수 있다.

또한, 상기 아토피 피부염 환자 특이적인 C3 보체 유래의 단편에 대하여 MADL-TOF 질량분석을 실시하여 구체적으로 어떠한 종류의 단편인지 프로파일 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 검출된 C3 단편이 C3dg임을 확인하였으며, 매칭 부분은 C3 알파 체인에 위치한 C3dg 부위와 완벽히 일치하였다. C3dg 단백질은 등전점 5.0의 39 kDa 분자량을 갖는 C3 전체 단백질 서열에서 955 내지 1303 범위의 아미노산을 가진다.

따라서, 정상인 유래 샘플 및 상기 외인성 타입의 아토피 피부염(ADe) 환자 유래 샘플의 비교를 통해, C3dg이 아토피 피부염에 대한 신규의 바이오마커임을 확인하였다.

2-4. 2종류의 아토피 피부염 환자 유래 혈청에 대한 C3dg 단백질 검출

상기 결과에 근거하여, 정상인 및 외인성 타입의 아토피 피부염(ADe) 환자 유래 혈청 샘플에 대하여 C3 단편화 현상을 더욱 검증하기 위해, 전 분획 과정 없이 항-C3dg 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 40 kDa 분자량의 단백질 단편이 검출되었고, 정상인 유래 혈청과 비교하여 특이적으로 아토피 피부염 환자 유래 샘플에서만 C3dg 밴드가 나타났다(빨간 박스 표시).

다음으로, 정상인의 혈청 샘플과 비교하여 2개 타입의 아토피 피부염 환자 유래 혈청 샘플들을 새롭게 수집하여 C3dg 단편 단백질이 특이적으로 아토피 피부염 환자의 샘플에서만 검출되는지 추가적으로 검증하고자 하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 외인성(ADe) 및 내인성(ADi) 타입의 아토피 피부염 환자 유래 샘플에서 C3dg 단백질이 모두 검출되었다. C3dg 단백질은 정상인 유래 샘플에서는 검출되지 않았으므로, C3 단편화 -> C3 alpha chain -> C3dg이 아토피 피부염의 특이적인 경로임을 알 수 있다.

이상의 결과는, 본 발명에서 발굴한 C3dg이, 외인성(ADe) 및 내인성(ADi) 타입의 아토피 피부염에서 모두 유용한 바이오마커로 이용될 수 있음을 의미하는 것이다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (17)

1. C3 보체단편으로서 C3dg를 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 바이오마커 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 C3dg는 정상인에 비하여 아토피성 피부염 환자의 혈청에서 mRNA 또는 단백질 수준이 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 아토피성 피부염은 외인성 또는 내인성인 것을 특징으로 하는, 바이오마커 조성물.
4. C3 보체단편으로서 C3dg의 mRNA 또는 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 아토피성 피부염은 외인성 또는 내인성인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
6. 제 4 항에 있어서, 상기 mRNA 발현수준을 측정하는 제제는 C3dg 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
7. 제 4 항에 있어서, 상기 단백질 발현수준을 측정하는 제제는 C3dg 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
8. 제 4 항의 조성물을 포함하는, 아토피성 피부염의 진단용 키트.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 키트는 DNA 마이크로어레이 칩 또는 단백질 칩인 것을 특징으로 하는, 진단용 키트.
10. 개체의 시료로부터 C3 보체단편으로서 C3dg의 mRNA 또는 단백질 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 진단을 위한 정보제공방법.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 개체의 시료로부터 C3dg 발현수준 측정 결과, 정상 대조군보다 증가한 경우 아토피성 피부염이라고 판정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
12. 제 10 항에 있어서, 상기 C3dg의 mRNA 발현수준을 측정하는 단계는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 또는 노던 블랏팅(Northern blotting)을 이용하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
13. 제 10 항에 있어서, 상기 C3dg의 단백질 발현수준을 측정하는 단계는 항원-항체 반응을 이용하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 항원-항체 반응은 ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 웨스턴 블랏, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter) 또는 마이크로어레이(microarray) 분석법으로 수행하는 것임을 특징으로 하는, 정보제공방법.
15. 제 10 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 림프액 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
16. 하기의 단계를 포함하는, 아토피성 피부염 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 개체로부터 얻어진 시료에 후보 약물을 처리하는 단계; 및
    (b) C3 보체단편으로서 C3dg의 발현 프로파일을 검출하는 단계.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 림프액 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.

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