JP2013245960A - 乳がん患者手術治療後の予後判定方法 - Google Patents

乳がん患者手術治療後の予後判定方法 Download PDF

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達夫 村上
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菊也 加藤
Yasutoshi Miyamoto
泰豪 宮本
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Abstract

【課題】精度よく乳がん患者手術治療後の予後を判定できるバイオマーカーを用いた、乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法や乳がん患者手術治療後の予後判定用キットを提供すること。
【解決手段】１０種類のバイオマーカータンパク質（ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ、ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ、及びＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ）や、４種類のバイオマーカーリン酸化タンパク質におけるアミノ酸残基（ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮの３５２番目のセリン残基、ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮの１２０８番目のスレオニン残基、ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮの４１７番目のセリン残基、ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮの４１７番目のセリン残基、ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮの１３番目のセリン残基）などのアミノ酸残基のリン酸化をバイオマーカーとして用いることにより、精度よく乳がん患者手術治療後の予後を判定することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法や予後判定用キットに関する。
がんは、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに、成人の死亡原因を二分する疾患である。例えば、乳がん罹患率は、日本人では欧米諸国に比べて低いが、近年では増加傾向にあり、１９９８年には胃がんの罹患率を抜いて女性罹患率の第１位となった。最近の報告である２００７年の厚生労働省統計によれば、乳がんの年間罹患数は６万人を超えている。
乳がん患者の外科的手術（根治手術）後の臨床経過によると、術後短期間で再発するケースから、術後１０年以上にわたって無再発で生存するケースまで様々ある。現在臨床では、リンパ節転移の有無、腫瘍径、ステージ、ホルモンレセプターの有無、年齢などを考慮して、乳がん患者手術治療後の予後を予測し、治療方針が決められている（非特許文献１、２）。しかし、かかる方法は非常に煩雑であることから、より簡便に予後を予測できる方法が望まれている。
病理学診断は、がん治療の予後の経過を判定する上で重要であり、この診断の中心となるのは免疫組織学染色法である。例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰｇＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、Ｋｉ−６７などに特異的な抗体を用いた免疫組織学染色法により、luminal A（ローリスク群）とluminal B（ハイリスク群）とに分類し、乳がん再発リスクの判断を行う検査方法が用いられている。しかし、かかる方法は検出感度に問題があり、また定量性が乏しいため病理医の目視診断によって行われているのが現状である。
最近、乳がん患者手術治療後の予後予測検査法としてMammaPrint（登録商標）やOncotype-DX（登録商標）といった原発巣をＤＮＡマイクロアレイ解析する方法が開発されている。MammaPrintやOncotype-DXを用いることにより、複数（それぞれ７０種類と２１種類）の遺伝子群の発現パターンを解析し、再発の危険性が高いハイリスク群と低いローリスク群とに精度よく分類することができるが、検査料が高額なために、臨床の現場では普及していないのが現状である。このため、精度よく乳がん患者手術治療後の予後を判定できるバイオマーカーの探索が急務とされていた。
New Eng．J．Med．，326，p．1756−1761，1992 Breast diseases，Lippincott，Philadelphia，p．327−346，1987
本発明の課題は、精度よく乳がん患者手術治療後の予後を判定できるバイオマーカーを用いた、乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法や乳がん患者手術治療後の予後判定用キットを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、MammaPrintによる予後リスク判定によりハイリスク（予後不良の可能性が高い）群及びローリスク（予後不良の可能性が低い）群と判別された、乳がん患者手術治療後の被験者由来の乳房組織試料を用いて、LTQ-Orbitrap Velos質量分析計を用いたiTRAQショットガンプロテオミクス解析を行った。その結果、ハイリスク群とローリスク群とでタンパク質の発現レベル及びリン酸化レベルの異なるものを探索したところ、５１２２種類のタンパク質、３０４１のリン酸化タンパク質、及び９２６７のリン酸化ペプチドをバイオマーカー候補因子として同定した。さらに、これらの中から有意差検定等による二次選別を行い、TSQ Vantage質量分析計を用いたselected reaction monitoring（ＳＲＭ）／Multiple Reaction Monitoring（ＭＲＭ）法により相対定量プロテオミクス解析を行ったところ、２３種類のタンパク質（ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ、ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ、ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＡＭＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＵＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＢＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＢＬＮ５＿ＨＵＭＡＮ、ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ８Ａ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＤＡ２２＿ＨＵＭＡＮ、ＰＩＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＣ２＿ＨＵＭＡＮ、ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ、及びＩＴＢ８＿ＨＵＭＡＮ）を選定し、これらの中から乳がんとの関係が報告されていない１０種類のタンパク質（ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ、ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ、ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ、及びＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ）を見いだした。
また、１２〜１４種類のタンパク質における１２種類のアミノ酸残基（ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮの３５２番目のセリン残基、ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮの１２０８番目のスレオニン残基、ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮの４１７番目のセリン残基、ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮの１３番目のセリン残基、ＳＨＲＭ３＿ＨＵＭＡＮの４３９番目のセリン残基、３種類のＣＤＫ［ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ］のいずれかにおける１４番目のスレオニン残基、３種類のＣＤＫ［ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ］のいずれかにおける１５番目のチロシン残基、ＭＸ１＿ＨＵＭＡＮの４番目のセリン残基、ＲＬ２３Ａ＿ＨＵＭＡＮの４３番目のセリン残基、ＭＣＭ２＿ＨＵＭＡＮの１３９番目のセリン残基、ＭＵＣ１＿ＨＵＭＡＮの１２２７番目のセリン残基、ＭＰＺＬ１＿ＨＵＭＡＮの２６３番目のチロシン残基）のリン酸化が、精度よく乳がん患者手術治療後の予後を判定できるバイオマーカーとなり得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、（１）以下の［Ａグループ］におけるタンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現の減少、及び／又は［Ｂグループ］におけるタンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現の増加を検出することを特徴とする、乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法に関する。
［Ａグループ］
ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）
ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）
ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）
ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）
ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）
ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）
ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）
ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）
ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）
［Ｂグループ］
ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）
また本発明は、（２）タンパク質が、［Ａグループ］に含まれるＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、又はＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮであることを特徴とする上記（１）記載の方法に関する。
上記本発明の判定方法には医師による診断行為は含まれず、また上記判定方法のその他の態様としては、乳がん患者手術治療後の予後を判定（予測）するためのデータを収集する方法を挙げることができる。
また本発明は、（３）以下の［Ａグループ］におけるタンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、若しくは［Ｂグループ］におけるタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん患者手術治療後の予後判定用キットに関する。
［Ａグループ］
ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）
ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）
ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）
ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）
ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）
ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）
ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）
ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）
ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）
［Ｂグループ］
ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）
また本発明は、（４）タンパク質が、［Ａグループ］に含まれるＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、又はＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮであることを特徴とする上記（３）記載のキットに関する。
さらに本発明は、（５）以下の［Ａグループ］におけるタンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現、及び／又は［Ｂグループ］におけるタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん患者手術治療後の予後判定用キットに関する。
［Ａグループ］
ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）
ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）
ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）
ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）
ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）
ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）
ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）
ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）
ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）
［Ｂグループ］
ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）
また本発明は、（６）タンパク質が、［Ａグループ］に含まれるＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、又はＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮであることを特徴とする上記（５）記載のキットに関する。
また乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法の他の実施の形態として、〔１〕以下の［Ｃグループ］におけるタンパク質のアミノ酸残基から少なくとも１つ以上のアミノ酸残基のリン酸化レベルの増加、及び／又は［Ｄグループ］におけるタンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルの減少を検出することを特徴とする、乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法を挙げることができる。
［Ｃグループ］
ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３２２４６）の３５２番目のセリン残基
ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ２９ＲＦ７−１）の１２０８番目のスレオニン残基
ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＷＷＩ１−３）の４１７番目のセリン残基
ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９２６８５）の１３番目のセリン残基
ＳＨＲＭ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＴＦ７２−１）の４３９番目のセリン残基
ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６４９３）、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２４９４１）、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ００５２６）のいずれかにおける１４番目のスレオニン残基
ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６４９３）、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２４９４１）、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ００５２６）のいずれかにおける１５番目のチロシン残基
ＭＸ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０５９１）の４番目のセリン残基
ＲＬ２３Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６２７５０）の４３番目のセリン残基
ＭＣＭ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９７３６）の１３９番目のセリン残基
ＭＵＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１５９４１−１）の１２２７番目のセリン残基
［Ｄグループ］
ＭＰＺＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９５２９７−１）の２６３番目のチロシン残基
また上記の他の実施の形態として、〔２〕アミノ酸残基が、［Ｃグループ］に含まれる以下の［Ｃ’グループ］から選択されることを特徴とする上記〔１〕に記載の方法を挙げることができる。
［Ｃ’グループ］
ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮの３５２番目のセリン残基
ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮの１２０８番目のスレオニン残基
ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮの４１７番目のセリン残基
ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮの１３番目のセリン残基
そしてまた上記の他の実施の形態として、〔３〕以下の［Ｃグループ］におけるタンパク質のアミノ酸残基から少なくとも１つ以上のアミノ酸残基のリン酸化を特異的に検出する抗体、若しくは［Ｄグループ］におけるタンパク質のアミノ酸残基のリン酸化を特異的に検出する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん患者手術治療後の予後判定用キットを挙げることができる。
［Ｃグループ］
ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３２２４６）の３５２番目のセリン残基
ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ２９ＲＦ７−１）の１２０８番目のスレオニン残基
ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＷＷＩ１−３）の４１７番目のセリン残基
ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９２６８５）の１３番目のセリン残基
ＳＨＲＭ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＴＦ７２−１）の４３９番目のセリン残基
ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６４９３）、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２４９４１）、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ００５２６）のいずれかにおける１４番目のスレオニン残基
ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６４９３）、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２４９４１）、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ００５２６）のいずれかにおける１５番目のチロシン残基
ＭＸ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０５９１）の４番目のセリン残基
ＲＬ２３Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６２７５０）の４３番目のセリン残基
ＭＣＭ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９７３６）の１３９番目のセリン残基
ＭＵＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１５９４１−１）の１２２７番目のセリン残基
［Ｄグループ］
ＭＰＺＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９５２９７−１）の２６３番目のチロシン残基
さらに上記の他の実施の形態として、〔４〕アミノ酸残基が、［Ｃグループ］に含まれる以下の［Ｃ’グループ］から選択されることを特徴とする上記〔３〕に記載のキットを挙げることができる。
［Ｃ’グループ］
ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮの３５２番目のセリン残基
ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮの１２０８番目のスレオニン残基
ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮの４１７番目のセリン残基
ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮの１３番目のセリン残基
本発明によると、乳がん患者手術治療後の予後を精度よく判定（予測）することが可能となり、乳がん患者手術治療後の治療方針を決定することができる。
MammaPrintにより分類されたハイリスク群（High risk）とローリスク群（Low risk）を用いて、TSQ Vantage質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により相対定量プロテオミクス解析を行い、本発明のバイオマーカータンパク質を同定した結果を示す図である。縦軸の領域比（Area ratio）は、質量分析計で定量されたＭＳスペクトルの内部標準に対するピーク比を示す。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。●は各検体を示す。 MammaPrintにより分類されたハイリスク群（High risk）とローリスク群（Low risk）を用いて、TSQ Vantage質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により相対定量プロテオミクス解析を行い、本発明のバイオマーカータンパク質を同定した結果を示す図である。縦軸の領域比（Area ratio）は、質量分析計で定量されたＭＳスペクトルの内部標準に対するピーク比を示す。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。●は各検体を示す。 MammaPrintにより分類されたハイリスク群（High risk）とローリスク群（Low risk）を用いて、TSQ Vantage質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により相対定量プロテオミクス解析を行い、本発明のバイオマーカーリン酸化タンパク質を同定した結果を示す図である。縦軸は、質量分析計で定量されたＭＳスペクトルの内部標準に対するピーク比を示す。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。●は各検体を示す。 MammaPrintにより分類されたハイリスク群（High risk）とローリスク群（Low risk）を用いて、TSQ Vantage質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により相対定量プロテオミクス解析を行い、本発明のバイオマーカーリン酸化タンパク質を同定した結果を示す図である。縦軸は、質量分析計で定量されたＭＳスペクトルの内部標準に対するピーク比を示す。横棒はそれぞれの群での平均値を表す。●は各検体を示す。 MammaPrintにより分類されたハイリスク群（９検体）とローリスク群（９検体）における、本発明の２種類のバイオマーカータンパク質（ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ及びＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ）の発現を、ウェスタンブロッティング法を用いて解析した結果を示す図である。ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ及びＧＰ２＿ＨＵＭＡＮの結果は、それぞれ図５Ａ及びＢに示す。また、各レーン（計９レーン）は、各検体におけるバイオマーカータンパク質の発現量を示す。 MammaPrintにより分類されたハイリスク群（１２検体）とローリスク群（１２検体）における、本発明のバイオマーカータンパク質（ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ）の発現を、免疫組織学染色法を用いて解析した結果を示す図である。右図において、縦軸は、抗ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ抗体による染色レベルを基にした陽性染色スコア（Positive staining score）を０、及び＋１〜＋３で示す。なお、右図における●は、各検体を示す。また、左図にはハイリスク群で陽性染色スコアが０で顕微鏡倍率２００倍(上段)、顕微鏡倍率４００倍（下段）であった乳房組織試料を、またローリスク群で陽性染色スコアが＋３で顕微鏡倍率２００倍(上段)、顕微鏡倍率４００倍（下段）であった乳房組織試料の代表的な顕微鏡観察結果を示す。
本発明の乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法としては、例えば、手術による乳がん治療が施された被験者（乳がん患者）から採取された判定用試料中の、上記［Ａグループ］におけるバイオマーカータンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質の発現の減少又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはその逆転写物（ｃＤＮＡ）の発現の減少、及び／又は、上記［Ｂグループ］におけるバイオマーカータンパク質の発現の増加又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現の増加を検出する方法（以下、「本件方法１」という）であれば特に制限されず、また、本発明の乳がん患者手術治療後の予後判定用キットとしては、上記［Ａグループ］におけるバイオマーカータンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、及び／又は上記［Ｂグループ］におけるバイオマーカータンパク質に特異的に結合する抗体、あるいはそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット１」という）や、上記［Ａグループ］におけるバイオマーカータンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現、及び／又は上記［Ｂグループ］におけるバイオマーカータンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット２」という）であれば特に制限されず、上記バイオマーカータンパク質としては、［Ａグループ］に属するＧＰ２＿ＨＵＭＡＮやＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮを好適に例示することができる。
上記他の態様の乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法としては、例えば、手術による乳がん治療が施された被験者（乳がん患者）から採取された判定用試料中の、上記［Ｃグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルの増加、及び／又は上記［Ｄグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルの減少を検出する方法（以下、「本件方法２」という）を挙げることができ、また、他の態様の乳がん患者手術治療後の予後判定用キットとしては、上記［Ｃグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化を特異的に検出できる抗体、及び／又は上記［Ｄグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化を特異的に検出できる抗体、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット３」という）を挙げることができ、上記バイオマーカーリン酸化タンパク質としては、上記［Ｃグループ］に属する上記［Ｃ’グループ］から選択されるものが好ましい。
本件方法１や本件方法２における判定用試料としては、乳房組織由来の組織、細胞、器官等の非液性試料や、血液、唾液等の液性試料を例示することができる。例えば、上記乳房組織は、被験者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。
本発明の乳がん患者手術治療後の予後とは、乳がん治療手術が施された、乳がん発症患者、乳がん再発患者、乳がん転移患者などの乳がん患者（被験者）の、治療後の生存期間や回復期間（乳がん再発や乳房以外の他の臓器への転移が認められない期間）を意味する。なお、本発明の乳がん患者における乳がんには、遺伝性のものも孤発性のものも含まれる。
本件方法１において、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ａグループ］におけるバイオマーカータンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質の発現量や、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量が、対照試料における発現量と比較して減少している場合、及び／又は、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｂグループ］におけるバイオマーカータンパク質の発現量や、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量が、対照試料における発現量と比較して増加している場合、被験者における乳がん手術治療後の予後が悪い（予後不良）と評価（予測）することができ、また、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ａグループ］におけるバイオマーカータンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質の発現量や、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量が、対照試料における発現量と比較して減少していない場合、及び／又は、上記［Ｂグループ］におけるバイオマーカータンパク質の発現量や、該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現量が、対照試料における発現量と比較して増加していない場合、被験者における乳がん手術治療後の予後が良い（予後良好）と評価（予測）することができる。
また、本件方法２において、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｃグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルが、対照試料におけるリン酸化レベルと比較して増加している場合、及び／又は、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｄグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルが、対照試料におけるリン酸化レベルと比較して減少している場合、被験者における乳がん手術治療後の予後が悪い（予後不良）と評価（予測）することができ、また、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｃグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルが、対照試料におけるリン酸化レベルと比較して増加していない場合、及び／又は、被験者から採取された判定用試料中の、上記［Ｄグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基のリン酸化レベルが、対照試料におけるリン酸化レベルと比較して減少していない場合、被験者における乳がん手術治療後の予後が良い（予後良好）と評価（予測）することができる。
上記対照試料としては、健常者やMammaPrint、Oncotype-DX等の乳がん患者手術治療後の予後予測検査法により予後が良いと評価された被験者由来の組織、細胞、血液、唾液などの試料の他、医師等当業者が通常用いる基準に照らして明らかにがん化していないと判断される組織、細胞、器官等の非液性試料や血液、唾液等の液性試料を例示することができる。また、これら対照試料は、採取された後に、判定用試料と同様の処理が施された対照試料であることが好ましい。
本件方法１や本件方法２を用いて、被験者における乳がん手術治療後の予後が悪いと評価した場合の、治療後の生存期間や回復期間は、長くとも５年以内、例えば、４年以内、３年以内、２年以内、１年以内の期間である。また、被験者における乳がん手術治療後の予後が良いと評価した場合の、治療後の生存期間や回復期間は、少なくとも５年以上、例えば、６年以上、７年以上、８年以上、１０年以上の期間である。
本件方法１において、バイオマーカータンパク質の発現の減少又は増加を検出する方法としては、上記［Ａグループ］及び［Ｂグループ］におけるバイオマーカータンパク質（以下、これらを総称して「本件バイオマーカータンパク質」という）の一部又は全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件バイオマーカータンパク質を構成するペプチドを検出する質量分析法や、本件バイオマーカータンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。なお、本件バイオマーカータンパク質のアミノ酸配列情報は、本件バイオマーカータンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号を基に、ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
本件方法２において、アミノ酸残基のリン酸化レベルの増加又は減少を検出する方法としては、上記［Ｃグループ］及び［Ｄグループ］におけるバイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基（以下、これらを総称して「本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基」という）のリン酸化を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基がリン酸化したペプチドとして検出する質量分析法や、本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基がリン酸化したペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができる。なお、本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸配列情報は、本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号を基に、ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索することにより得ることができる。
上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。また、上記質量分析法とは、ペプチド試料を、イオン源を用いて気体状のイオンとし（イオン化）、分析部において、真空中で運動させ電磁気力を用いて、あるいは飛行時間差によりイオン化したペプチド試料を質量電荷比に応じて分離し、検出できる質量分析計を用いた測定方法のことをいい、イオン源を用いてイオン化する方法としては、ＥＩ法、ＣＩ法、ＦＤ法、ＦＡＢ法、ＭＡＬＤＩ法、ＥＳＩ法などの方法を適宜選択することができ、また、分析部において、イオン化したペプチド試料を分離する方法としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型などの分離方法を適宜選択することができる。また、２以上の質量分析法を組み合わせたタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）やトリプル四重極型質量分析を利用することができる。また、サンプルがリン酸化したペプチドを含む試料の場合、質量分析計へのサンプル導入前に、サンプルを鉄イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（Fe-IMAC）を用いて濃縮することができる。また、液体クロマトグラフ（ＬＣ）やＨＰＬＣにより、本件バイオマーカータンパク質や本件バイオマーカーリン酸化タンパク質を構成するペプチドを分離・精製してサンプルとすることができる。また、検出部やデータ処理方法も適宜選択することができる。なお、質量分析法を用いて本件バイオマーカータンパク質を構成するペプチドや本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基がリン酸化したペプチドを質量分析法で検出・定量する場合、かかるペプチドと同一のアミノ酸配列からなる、濃度が既知の安定同位体で標識したペプチドを内部標準とすることができる。かかる安定同位体標識ペプチドとしては、検出する本件バイオマーカータンパク質を構成するペプチドや本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基がリン酸化したペプチドにおけるアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、数などは適宜選択することができ、かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてＦ−ｍｏｃ法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で化学合成することができるが、ｉＴＲＡＱ（登録商標）試薬、ＩＣＡＴ（登録商標）試薬、ＩＣＰＬ（登録商標）試薬、ＮＢＳ（登録商標）試薬などの標識試薬を用いて作製することもできる。
本件バイオマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの発現の減少若しくは増加を検出する方法としては、本件バイオマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの一部若しくは全部を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、本件バイオマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、本件バイオマーカータンパク質をコードするｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、本件バイオマーカータンパク質をコードするｃＤＮＡに相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。
本件キット１や本件キット３における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。また、上記本件キット１や本件キット３には、本件バイオマーカータンパク質や本件バイオマーカーリン酸化タンパク質のアミノ酸残基に結合した本件キット１や本件キット３における抗体を検出するための、蛍光物質、酵素等の標識物質をコンジュゲートした２次抗体を含めることや、本件キット１や本件キット３における抗体とは異なるエピトープと反応する少なくとも１種類の抗体を含めることができる。また、本件キット１や本件キット３には、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器等をさらに備えたものであってもよい。
本件キット２におけるプライマー対としては、本件バイオマーカータンパク質をコードするｃＤＮＡの上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー対であれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。例えば、プライマー配列の長さとしては、１５〜３０塩基を選択することができ、また、増幅するｃＤＮＡの長さとしては、１００〜３００塩基を選択することができる。なお、本件バイオマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡやｃＤＮＡの配列情報は、本件バイオマーカータンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号を基に、ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースで検索し、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースにリンクすることにより得ることができる。
本件キット２におけるプローブとしては、本件バイオマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの一部若しくは全部がハイブリダイゼーションするプローブであれば、プローブの長さ、かかるスプライシングバリアントとハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮して適宜選択することができる。
本件キット１や本件キット３における抗体や、本件キット２におけるプライマー対やプローブの標識物における標識物質としては、例えばビオチン、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein；ＧＦＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ(Horse Radish Peroxidase;ＨＲＰ)、３２Ｐなどを具体的に挙げることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．大規模膜タンパク質プロテオーム解析によるバイオマーカー候補タンパク質の探索
乳がんの予後を予測できるバイオマーカーを探索するために、MammaPrintで分類されたハイリスク群及びローリスク群を用いて解析を進めた。MammaPrintにより分類された、ハイリスク群（９検体）とローリスク群（９検体）の計１８症例の乳がん組織をホモジュナイザーで破砕処理し、低速遠心で核や未破砕の細胞を除いた後、超高速遠心処理を行い、得られた沈殿物を膜タンパク質画分として単離した。ハイリスク群及びローリスク群における各検体由来の膜タンパク質画分を、それぞれの群の中で混合させた後、界面活性剤（デオキシコール酸及びラウロイルサルコシン酸）を含む溶液でタンパク質の可溶化処理を行い、トリプシンによるタンパク質の消化処理を行った後、相間移動溶解法（ＰＴＳ法）を用いて溶液中の界面活性剤を除き、ペプチドの抽出を行った。ｉＴＲＡＱ試薬（エービーサイエックス）を用いて各群のペプチドをそれぞれ異なる同位体標識体でラベルした後、ＳＣＸカラム（アジレント・テクノロジーズ社）により分画を行い、LTQ-Orbitrap Velos質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いたiTRAQショットガンプロテオミクス解析により、タンパク質の定量・同定を行った。その結果、ハイリスク群及びローリスク群で発現するタンパク質として、８２９種類の膜タンパク質、３４０種類の細胞外タンパク質を含む計５１２２種類のタンパク質が同定された。このうち、ハイリスク群とローリスク群間で２倍以上の発現の差が認められた６１種類の膜タンパク質や細胞外タンパク質をバイオマーカー候補タンパク質とした。
［参考例１］
２．大規模リン酸化タンパク質プロテオーム解析によるバイオマーカー候補リン酸化タンパク質の探索
さらに、タンパク質のリン酸化に着目したバイオマーカーの探索を進めた。MammaPrintにより分類された、ハイリスク群（６検体）とローリスク群（６検体）の計１２症例の乳がん組織は、トリプシンで消化後、ＰＴＳ法で界面活性剤を除き、Feイオン固定化アフィニティークロマトグラフィー (Ｆｅ−ＩＭＡＣ)法を用いてリン酸化ペプチドの濃縮を行った。その後、4plex iTRAQ試薬（エービーサイエックス）を用いた安定同位体標識体によるラベルは、以下の手順にしたがって行った。すなわち、１２検体のうち、任意の４検体ずつを、それぞれｉＴＲＡＱ１１５試薬、ｉＴＲＡＱ１１６試薬、及びｉＴＲＡＱ１１７試薬で標識し、かかる３種類の試薬で標識したものからなるセットを計４セット用意した。なお、１２検体由来のリン酸化したペプチド（リン酸化ペプチド）を等量ずつ混合したもの（プールサンプル）をｉＴＲＡＱ１１４試薬で標識し、ｉＴＲＡＱ１１４で標識したプールサンプルを内部コントロールとして用いた。上記４セットそれぞれに内部コントロールを加えた後、ＳＣＸカラム（アジレント・テクノロジーズ社）により分画を行い、LTQ-Orbitrap XL又はVelos質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いたiTRAQショットガンプロテオミクス解析により、タンパク質の定量・同定を行った。その結果、ハイリスク群及びローリスク群で発現するリン酸化タンパク質として、３０４１のリン酸化タンパク質、９２６７のリン酸化ペプチドが同定された。このうち、ハイリスク群とローリスク群間で２倍以上のリン酸化レベルの差が認められ、有意差（ｐ＜０．１）を有し、かつ４セット中少なくとも３セットで同定されたものとして、１１７種類のリン酸化タンパク質及び１３３種類のリン酸化ペプチドが同定された。このうちのリン酸化タンパク質の中から、両群間で特にリン酸化レベルの差が大きいものとして４種類、また、タンパク質レベルで乳がんの予後不良に関与することが報告されているものとして１２〜１６種類、さらに細胞膜タンパク質をリン酸化するタンパク質として３種類の、計１９〜２３種類のリン酸化タンパク質をバイオマーカー候補リン酸化タンパク質とした。
３．ＳＲＭ／ＭＲＭ法を用いたバイオマーカータンパク質の同定
実施例１に記載の方法により同定した６１種類のバイオマーカー候補タンパク質の中から、乳がんの予後を予測できるバイオマーカーを、トリプル四重極型質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により探索した。まず、ＳＲＭ／ＭＲＭ法が実施可能なタンパク質として、６１種類のバイオマーカー候補タンパク質の中から４９種類のタンパク質を選抜した。このうち、ローリスク群よりもハイリスク群でタンパク質の発現が増加するバイオマーカー候補タンパク質は、表１に示すとおり１５種類あり、またそれらタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＩＤは以下のとおりである。
ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）、ＴＲＰＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７５７６２）、ＫＫＬＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ５Ｈ９４３）、Ｆ１８Ｂ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＮＹＺ１）、ＴＴＹＨ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｈ３１３）、ＭＡＮＢＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＮＱＧ１）、ＣＯ２Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２４５８）、Ｓ２６Ａ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５０４４３）、ＩＴＢ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０１２）、ＦＯＬＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１５３２８）、ＰＲＯＭ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３４９０）、ＬＡＴ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０１６５０）、ＴＲＰＶ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＨＢＡ０）、ＭＯＴ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５３９８５）、ＡＢＣＢ６＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＮＰ５８）。
また、残りの３４種類のバイオマーカー候補タンパク質は、表２に示すとおりローリスク群よりもハイリスク群でタンパク質の発現が減少するタンパク質であり、またそれらタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔＩＤは以下のとおりである。
ＦＢＬＮ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＢＸ５）、ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）、ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０１０１１）、ＰＬＴＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０５８）、ＨＴＲＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９２７４３）、ＬＵＭ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５１８８４）、ＬＡＴ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＵＨＩ５）、ＦＢＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２３１４２）、ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）、ＡＤＡ２２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９Ｐ０Ｋ１）、ＧＰＮＭＢ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１４９５６）、ＭＭＰ１９＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９５４２）、ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）、ＡＳＰＮ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９ＢＸＮ１）、ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）、ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）、ＣＸＬ１３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３９２７）、ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）、ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）、ＳＴＣ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ７６０６１）、ＭＹＰ０＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２５１８９）、ＭＩＭＥ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０７７４）、ＣＴＬ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ５３ＧＤ３）、ＣＯ８Ａ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２７６５８）、ＮＥＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２９１２０）、Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０１００９）、ＳＡＭＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０２７４３）、ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）、ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２５３１１）、ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）、ＳＣＧ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０６０）、ＣＢＰＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１５０８６）、ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５０９０）、ＰＩＰ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１２２７３）。
続いて、これら選抜したタンパク質のアミノ酸配列情報を基に、ＳＲＭ／ＭＲＭ法で特異的に検出されるペプチドを推定し、かかるペプチドと同じアミノ酸配列からなる安定同位体標識ペプチドをグライナーバイオ-ワンから購入し、内部標準ペプチドとして用いた。上記実施例１に記載に方法により上記４９種類のバイオマーカー候補タンパク質由来の膜タンパク質画分を単離し、内部標準ペプチドを混合した後、トリプシンによるタンパク質の消化処理を行い、ＰＴＳ法を用いて溶液中の界面活性剤を除き、ペプチドの抽出を行った後、TSQ Vantage質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により相対定量解析を行った。その結果、ハイリスク群及びローリスク群で統計学的な有意差（ｐ＜０．０５、Wilcoxon test）を有する２３種類のタンパク質（ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ、ＡＡＣＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＡＰＯＤ＿ＨＵＭＡＮ、ＳＡＭＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＬＵＭ＿ＨＵＭＡＮ、ＦＢＬＮ１＿ＨＵＭＡＮ、Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ、ＦＢＬＮ５＿ＨＵＭＡＮ、ＺＡ２Ｇ＿ＨＵＭＡＮ、ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＯ８Ａ１＿ＨＵＭＡＮ、ＡＤＡ２２＿ＨＵＭＡＮ、ＰＩＰ＿ＨＵＭＡＮ、ＩＴＢ８＿ＨＵＭＡＮ、ＳＴＣ２＿ＨＵＭＡＮ、ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ、ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ、ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ、ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ、ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ、及びＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ）を、バイオマーカータンパク質として同定することができた（図１及び２）。
［参考例２］
４．ＳＲＭ／ＭＲＭ法を用いたバイオマーカーリン酸化タンパク質とそのリン酸化部位の同定
参考例１に記載の方法により同定した１９〜２３種類のバイオマーカー候補リン酸化タンパク質の中から、乳がんの予後を予測できるバイオマーカーを、三連四重極型質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により探索した。まず、ＳＲＭ／ＭＲＭ法が実施可能なタンパク質として、１９種類のバイオマーカー候補リン酸化タンパク質の中から表３に記載の１５〜１９種類のバイオマーカー候補リン酸化タンパク質を選抜した。このうち、ローリスク群よりもハイリスク群でタンパク質のリン酸化レベルが減少する５種類のタンパク質におけるＵｎｉＰｒｏｔＩＤとそのリン酸化部位は以下のとおりである。
ＲＬ２３Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ６２７５０）の４３番目のセリン残基、Ｋ２Ｃ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０５７８７）の２９１番目のセリン残基、ＳＨＲＭ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＴＦ７２−１）の４３９番目のセリン残基、ＭＰＺＬ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９５２９７−１）の２６３番目のチロシン残基、ＰＫＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９５９−１）の１５１番目のセリン残基。
また、ローリスク群よりもハイリスク群でタンパク質のリン酸化レベルが増加する１０〜１４種類のタンパク質におけるＵｎｉＰｒｏｔＩＤとそのリン酸化部位は以下のとおりである。
３種類のＣＤＫ（ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６４９３］、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２４９４１］、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ００５２６］）のいずれかにおける１４番目のスレオニン（Ｔ）残基、ＭＣＭ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ４９７３６）の１３９番目のセリン（Ｓ）残基、ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ２９ＲＦ７−１）の１２０８番目のスレオニン残基、３種類のＣＤＫ（ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６４９３］、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２４９４１］、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ［ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ００５２６］）のいずれかにおける１５番目のチロシン（Ｙ）残基、ＭＸ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２０５９１）の４番目のセリン残基、ＭＵＣ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１５９４１−１）の１２２７番目のセリン残基、ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＷＷＩ１−３）の４１７番目のセリン残基、ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９２６８５）の１３番目のセリン残基、ＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ３２２４６）の３５２番目のセリン残基、ＩＮＡＤＬ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ８ＮＩ３５−１）の６４５番目のセリン残基。
続いて、これら選抜したバイオマーカー候補リン酸化タンパク質を検出するリン酸化ペプチドと同じアミノ酸配列からなり、かつ同じアミノ酸残基にリン酸化修飾した安定同位体標識ペプチドをグライナーバイオ-ワンから購入し、ＳＲＭ／ＭＲＭ法における内部標準リン酸化ペプチドとして用いた。上記参考例１に記載に方法により上記１５〜１９種類のバイオマーカー候補リン酸化タンパク質由来のリン酸化タンパク質精製物を単離した後、内部標準リン酸化ペプチドを混合し、ＰＴＳ法を用いて溶液中の界面活性剤を除き、ペプチドの抽出を行った後、TSQ Vantage質量分析計を用いたＳＲＭ／ＭＲＭ法により相対定量解析を行った。その結果、４種類のタンパク質におけるリン酸化部位（ＰＤＳ５Ａ＿ＨＵＭＡＮの１２０８番目のスレオニン残基、ＬＭＯ７＿ＨＵＭＡＮの４１７番目のセリン残基、ＡＬＧ３＿ＨＵＭＡＮの１３番目のセリン残基、及びＣＣＲ１＿ＨＵＭＡＮの３５２番目のセリン残基）が、ハイリスク群及びローリスク群の両群間で統計学的な有意差（ｐ＜０．０５、T-test）を有することが明らかとなった（図３）。また、８〜１２種類のタンパク質におけるリン酸化部位（ＲＬ２３Ａ＿ＨＵＭＡＮの４３番目のセリン残基、ＳＨＲＭ３＿ＨＵＭＡＮの４３９番目のセリン残基、ＭＰＺＬ１＿ＨＵＭＡＮの２６３番目のチロシン残基、３種類のＣＤＫ（ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ）のいずれかにおける１４番目のスレオニン残基、ＭＣＭ２＿ＨＵＭＡＮの１３９番目のセリン残基、３種類のＣＤＫ（ＣＤＫ１＿ＨＵＭＡＮ、ＣＤＫ２＿ＨＵＭＡＮ、及びＣＤＫ３＿ＨＵＭＡＮ）のいずれかにおける１５番目のチロシン残基、ＭＸ１＿ＨＵＭＡＮの４番目のセリン残基、及びＭＵＣ１＿ＨＵＭＡＮの１２２７番目のセリン残基）は、ハイリスク群及びローリスク群の両群間で有意差を有する傾向(ｐ＜０．２、T-test)が認められた（図４）。
５．ウェスタンブロッティング法や免疫組織学染色法による検証
上記実施例２で同定された２３種類のバイオマーカータンパク質が、ウェスタンブロッティング法や免疫組織学染色法などのより簡便な解析法においてバイオマーカーとして用いることができるかどうか検討した。上記実施例１に記載に方法により膜タンパク質画分を単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで膜タンパク質画分に含まれるタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写させた後、抗ＭＦＡＰ４抗体（Proteintech Group, Inc）を一次抗体とし、ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を二次抗体として用いたウェスタンブロッティング法による解析と、抗ＧＰ２抗体（SIGMA- ALDRICH）を一次抗体とし、ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を二次抗体として用いたウェスタンブロッティング法による解析を行った。検出は化学発光検出試薬（Enhanced Chemiluminescence Detection reagents）(GE Healthcare)を用いて行った。その結果、ＭＦＡＰ４（ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ）は、ハイリスク群と比べローリスク群でその発現レベルが顕著に増加していることが示された（図５Ａ）。また、ＧＰ２（ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ）も同様にハイリスク群と比べローリスク群でその発現レベルが顕著に増加していることが示された（図５Ｂ）。さらに免疫組織学染色法による解析は、以下のとおり行った。すなわち、MammaPrintにより分類された、ハイリスク群（１２検体）とローリスク群（１２検体）の計２４症例の乳房組織を、ホルマリンを用いて固定し、アルコールで脱水処理をした後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸しパラフィン包埋を行い、組織試料を作製した。上記２４検体の組織試料を３μｍの切片にし、キシレンで脱パラフィン処理を行い、アルコール処理を行った後、脱イオン水で洗浄し、抗ＧＰ２抗体（SIGMA- ALDRICH）を一次抗体とし、ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた免疫組織学染色法による解析を行った。検出は化学発光検出試薬（ＤＡＢ）(DAKO)を用いて行った。その結果、免疫組織学染色法においても同様にＧＰ２の発現がハイリスク群と比べローリスク群で顕著に増加していることが示された（図６）。以上の結果は、実施例１及び２に記載の質量分析による解析結果を支持するとともに、ＭＦＡＰ４やＧＰ２などの本発明のバイオマーカーは、ウェスタンブロッティング法や免疫組織学染色法などの簡便な解析においても有用であることを示している。
本発明により、乳がん患者手術治療後の予後予測をすることができるため、術後の治療方針を決定することができる。また、術後の生存期間や回復期間を延ばすことが期待される。

Claims (6)

  1. 以下の［Ａグループ］におけるタンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現の減少、及び／又は［Ｂグループ］におけるタンパク質又は該タンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現の増加を検出することを特徴とする、乳がん患者手術治療後の予後を判定する方法。
    ［Ａグループ］
    ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）
    ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）
    ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）
    ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）
    ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）
    ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）
    ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）
    ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）
    ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）
    ［Ｂグループ］
    ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）
  2. タンパク質が、［Ａグループ］に含まれるＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、又はＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 以下の［Ａグループ］におけるタンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体、若しくは［Ｂグループ］におけるタンパク質に特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん患者手術治療後の予後判定用キット。
    ［Ａグループ］
    ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）
    ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）
    ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）
    ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）
    ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）
    ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）
    ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）
    ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）
    ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）
    ［Ｂグループ］
    ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）
  4. タンパク質が、［Ａグループ］に含まれるＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、又はＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮであることを特徴とする請求項３に記載のキット。
  5. 以下の［Ａグループ］におけるタンパク質から少なくとも１つ以上のタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現、及び／又は［Ｂグループ］におけるタンパク質をコードするｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とする乳がん患者手術治療後の予後判定用キット。
    ［Ａグループ］
    ＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５２５９）
    ＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ５５０８３）
    ＣＯＥＡ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ０５７０７）
    ＴＲＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ１５６６１）
    ＡＢＣＡ８＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ９４９１１）
    ＣＢＧ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０８１８５）
    ＫＥＲＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ６０９３８）
    ＯＭＤ＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｑ９９９８３）
    ＰＩ１５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｏ４３６９２）
    ［Ｂグループ］
    ＰＴＸ３＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ２６０２２）
  6. タンパク質が、［Ａグループ］に含まれるＧＰ２＿ＨＵＭＡＮ、又はＭＦＡＰ４＿ＨＵＭＡＮであることを特徴とする請求項５に記載のキット。
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