ES2676183T3 - Detección de dianas usando marcas de masa y espectrometría de masas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento que comprende: (a) proporcionar una muestra de tejido fijado con formol e incluido en parafina que comprende una pluralidad de dianas; (b) poner en contacto la muestra de tejido con un primer resto de unión específica que puede reconocer y unirse a una primera diana en la muestra de tejido y un segundo resto de unión específica que puede reconocer y unirse a una segunda diana en la muestra de tejido; (c) poner en contacto la muestra de tejido con un primer conjugado que comprende una primera enzima y un primer anticuerpo que puede reconocer y unirse al primer resto de unión específica; (d) poner en contacto la muestra de tejido con un primer resto de sustrato enzimático y un primer precursor de marca de masa, en el que el primer resto de sustrato enzimático reacciona con la primera enzima y el primer precursor de marca de masa para producir y depositar una primera marca de masa en la primera diana; (e) desactivar la primera enzima; (f) poner en contacto la muestra de tejido con un segundo conjugado que comprende una segunda enzima y un segundo anticuerpo que puede reconocer y unirse al segundo resto de unión específica; (g) poner en contacto la muestra de tejido con un segundo resto de sustrato enzimático y un segundo precursor de marca de masa, en el que el segundo resto de sustrato enzimático reacciona con la segunda enzima y el segundo precursor de marca de masa para producir y depositar una segunda marca de masa en la segunda diana, en el que el primer y segundo restos de sustrato enzimático tienen la misma estructura química, el primer y segundo precursores de marcas de masa tienen la misma estructura química y al menos uno del primer precursor de marca de masa o segundo precursor de marca de masa está radiomarcado de modo que la primera marca de masa y la segunda la marca de masa difieren en masa; (h) ionizar la primera marca de masa y la segunda marca de masa para producir un primer código de masa y un segundo código de masa, en el que cada código de masa tiene la misma estructura química pero difiere en masa de cualquier otro código de masa producido a partir de cualquier otra marca de masa; (i) detectar cada código de masa usando un espectrómetro de masas; y (j) cuantificar relativamente cada diana cuantificando una cantidad de cada código de masa midiendo un pico de espectrometría de masas que tiene una proporción m/z correspondiente a una proporción m/z esperada de ese código de masa.

Description

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Detección de dianas usando marcas de masa y espectrometría de masas Campo

La presente divulgación se refiere a modos de realización de procedimientos para su uso en compuestos y composiciones para la obtención de imágenes de una diana y/o múltiples dianas en una muestra, y kits para realizar los procedimientos. En particular, la presente divulgación se refiere al uso de reacciones enzimáticas para localizar marcas de masa próximas a o en una o más dianas en una muestra de tejido, y detectar códigos de masa depositados enzimáticamente en la(s) diana(s) usando técnicas espectrofotométricas de masas.

Antecedentes

El cáncer es una de las enfermedades más comunes en todo el mundo. Los biomarcadores desempeñan un papel clave en el diagnóstico y pronóstico del cáncer. La determinación de la presencia de y/o cantidades (cantidades relativas y/o cantidades absolutas) de múltiples biomarcadores son útiles para la predicción y pronóstico exactos de los cánceres, y la tasa de supervivencia puede depender al menos en parte del tratamiento dirigido en base a la detección y cuantificación exactas, en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de biomarcadores particulares. Por ejemplo, en el cáncer de mama, la abundancia relativa de biomarcadores del receptor estrogénico (RE), receptor progesterónico (RP) y receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (Her2) se correlaciona con las posibilidades del paciente de sobrevivir cinco o más años.

La inmunohistoquímica (IHQ) ha sido una importante herramienta de diagnóstico para identificar biomarcadores terapéuticos y para subclasificar pacientes con cáncer. Los procedimientos de IHQ convencionales que usan la obtención de imágenes ópticas son adecuados para detectar una o más dianas dentro de una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido). Sin embargo, los procedimientos de IHQ no pueden proporcionar resultados cuantitativos exactos para las dianas detectadas. Típicamente, solo el personal médico certificado está suficientemente capacitado para evaluar el diagnóstico y pronóstico de un sujeto en base a los resultados de imagenología óptica de IHQ. Actualmente, no existe ninguna plataforma IHQ adecuada para ensayos multiplexados cuantitativos útiles para evaluar cánceres y determinar el tratamiento personalizado contra el cáncer.

Se han desarrollado varios procedimientos para detectar y obtener imágenes de biomoléculas, tales como ácidos nucleicos y proteínas. Los ácidos nucleicos, por ejemplo, se pueden analizar usando moléculas sonda marcadas. Los marcadores se detectan para determinar si la unión específica o la hibridación han tenido lugar. Son conocidos diversos procedimientos de marcaje de sonda, incluyendo átomos radiactivos, tintes fluorescentes, reactivos luminiscentes, reactivos de captación de electrones y tintes absorbentes de luz. Cada uno de estos procedimientos tiene rasgos distintivos adecuados para determinadas aplicaciones, pero también existen limitaciones inherentes a cada uno de dichos procedimientos.

El documento EP 0 933 355 A1 divulga la preparación específica de conjugados de tiramida que se pueden usar en ensayos de afinidad incluyendo inmunohistoquímica (IHQ) e hibridación in situ. Los conjugados de tiramida se usan en el denominado ensayo CARD, en el que estos conjugados, que son conjugados entre un derivado de tiramida y un marcador, se dirigen al sitio diana por medio de una actividad de unión específica a diana directa o indirecta. En una reacción impulsada por la peroxidasa, se activa la tiramida en el conjugado en un radical que se agrupa alrededor del sitio diana. Los conjugados de tiramida marcados en el documento EP 0 933 355 A1 se hacen visibles directa o indirectamente por fluorescencia o detección cromógena. Lo mismo es válido para Anonymous: “Tyramide Signal Amplification (TSA) Technology” (Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 9.a ed. 2002, 1 de enero de 2002, páginas 152-159), que describe con más detalle el principio del ensayo de depósito de indicador catalizado (CARD) que hace uso de la amplificación de señal de tiramida en un sitio diana dado.

El documento US 2008/213783 A1 divulga la detección de moléculas diana en muestras biológicas por un depósito enzimático específico de sitio de metal. En particular, se divulga un procedimiento de "hibridación in situ con plata" (SISH), en el que se deposita metal de plata en el sitio de la molécula diana en presencia de una enzima y agentes activadores, antes de detectarse por microscopía óptica.

El documento US 2004/265922 A1 describe un procedimiento de hibridación in situ cromógeno similar, en el que se deposita metal insoluble cerca de un ácido nucleico o epítopo inmunohistoquímico en una muestra biológica. La reducción de iones metálicos a metales insolubles en presencia de especies reductoras inactivas en oxidorreducción está catalizada por una enzima que se dirigió previamente al ácido nucleico o epítopo inmunohistoquímico como parte de un conjugado con un resto de unión específica. En particular, el documento US 2004/265922 A1 divulga la reducción de plata mediada por la fosfatasa alcalina.

La espectrometría de masas se ha usado cada vez más para análisis bioanalíticos.

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El documento WO 2010/026225 A1 divulga procedimientos para detectar proteínas en muestras usando compuestos de tipo tritilo como marcas de masa. La detección se lleva a cabo usando anticuerpos específicos de proteínas diana conjugados con marcas de masa en los que se libera la marca de masa por fotoescisión antes de detectarse por espectrometría de masas de desorción por láser y con analizador del tiempo de vuelo (TOF).

Jaume Seuma et al. (Proteomics 2008; 8(18):3775-3784) divulgan el establecimiento de ensayos para la detección indirecta de MUC-1 y HER2 en secciones de tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) con un anticuerpo primario específico de biomarcador y anticuerpos secundarios marcados con oro que proporcionan la potenciación de la plata alrededor del sitio del biomarcador, y la obtención de imágenes específica de sitio de la plata (iones) por ablación con láser (LA) con espectrometría de masas de acoplamiento inductivo (ICP-EM). Se detectan MUC-1 y HER-2 en diferentes muestras y ajustes de ensayo separados y específicos.

La espectrometría de masas es muy adecuada para la multiplexación porque la diferenciación de masas permite muchos canales de detección simultáneos. Sin embargo, las biomoléculas complejas, tales como el ADN, tienen espectros de masas complejos y pueden ser difíciles de detectar en una matriz debido a la sensibilidad relativamente mala.

Sumario

Existe la necesidad en la técnica de obtener análisis de tejidos y técnicas de obtención de imágenes adicionales. Determinados modos de realización abordan muchos de los inconvenientes asociados con técnicas anteriores, y permiten el uso de muestras de tejido más duraderas, en lugar de muestras de tejido congeladas en fresco usadas en otras técnicas. Puede que no se requiera la espectrometría de masas asistida por matriz con el procedimiento divulgado, lo que permite la detección de muestras sin la interferencia de fondo, y elimina los "puntos calientes" que pueden resultar del uso de una matriz, formación de cristales o limitaciones por la potencia del láser asociados con el uso de espectrometría de masas MALDI. Otros modos de realización también permiten una amplificación de señal sustancial, lo que proporciona una detección mucho más sensible y una mejora en la resolución espacial que las técnicas que no implican amplificación de señal. Todos los procedimientos dan como resultado una amplificación de señal sustancial, lo que permite la detección y obtención de imágenes tanto de proteína como de ácido nucleico.

También existe la necesidad de obtener un procedimiento para cuantificar, en particular en una única muestra, dianas múltiples, por ejemplo, biomarcadores de cáncer, en tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) para diagnóstico y pronóstico. Determinados modos de realización divulgados abordan estas y otras necesidades.

Se divulgan modos de realización de un procedimiento para detectar una diana en una muestra.

Otros modos de realización utilizan varias clases de precursores de marcas de masa incluyendo, a modo de ejemplo, derivados de triarilmetano, tales como compuestos de triarilmetano sustituido, tintes de triarilmetano, especies de triarilmetano-diazonio, compuestos de azo-naftol carbonilo, agrupaciones metálicas ultrapequeñas, oligómeros de sustratos de peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), tales como derivados de anilina y fenol, determinados tintes catiónicos, compuestos de nitrofenilo, compuestos de heteroarilo, complejos de metal- heteroarilo, compuestos a base de nanopartículas y cualquier derivado radiomarcado de los mismos.

Otros modos de realización de los precursores de marcas de masa divulgados se refieren a tintes azoicos que se forman por la adición de diversos derivados de fenol, anilina o naftol, que se generan como producto de una reacción enzimática (por ejemplo, escisión usando una fosfatasa o hidrólisis catalizada por glucosidasa). con diversas sales de diazonio. El tinte de naftol/azoico normalmente es de color intenso y precipita específicamente en la diana. Se puede facilitar la formación de cationes mediada por láser por la presencia de grupos donadores de electrones en los sistemas conjugados aromáticos de la marca de masa naftol/azoica.

Otra clase de precursores de marcas de masa que se divulgan incluye diversos sustratos para una peroxidasa (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante [HRP]), incluyendo compuestos de arilo y heteroarilo sustituidos. Esta clase de precursores de marcas de masa engloba compuestos de arilo y heteroarilo sustituidos que se pueden oligomerizar, tales como diaminobencidina, diaminonaftalenos y aminoquinolinas. Se pueden tratar dianas tisulares marcadas con una peroxidasa, tal como HRP, con estos compuestos y se puede usar espectrometría de masas LDI para ionizar las marcas de masa oligoméricas formadas a través de reacciones enzimáticas, seguido de la detección de los códigos de masa.

Todavía otros modos de realización divulgados se refieren a precursores de marcas de masa de heteroarilo que se someten a fragmentación tras la exposición a una fuente de energía. Los modos de realización divulgados pueden comprender restos de acina (que tienen solo un átomo de nitrógeno en el anillo aromático), restos de diacina (que tienen dos átomos de nitrógeno en el anillo aromático), restos de triacina (que tienen tres átomos de nitrógeno en el anillo aromático) y restos de tetracina (que tienen cuatro átomos de nitrógeno en el anillo aromático). Los modos de realización divulgados particulares utilizan un precursor de marca de masa de tetracina, que se somete fácilmente a fragmentación tras la exposición a una fuente de energía.

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Se pueden usar derivados de naftol con tintes catiónicos para comprender otra clase de precursores de marcas de masa eficaces. En un modo de realización particular, los derivados de naftol precipitan en el sitio deseado por oxidación catalizada y se pueden teñir adicionalmente con diversos tintes catiónicos. Estos tintes son en su mayoría catiónicos y tienen una absorbancia alta a la longitud de onda del láser usado en espectrometría de masas LDI, y por lo tanto son candidatos útiles para precursores de marcas de masa.

Otra clase de precursores de marcas de masa se refiere a restos de nitrofenilo, que se someten a fotólisis para liberar un código de masa correspondiente. En determinados modos de realización divulgados, el código de masa comprende un conector (tal como un conector de polietilenglicol), un resto cargado (tal como arginina, lisina, histidina o fosfato) y/o un cromóforo (tal como un hapteno o tinte).

En algunos modos de realización divulgados, se puede usar un precursor de marca de masa de metal-heteroarilo. Los modos de realización de estos precursores de marcas de masa se pueden seleccionar de complejos de metal- monoheteroarilo, complejos de metal-biheteroarilo y complejos de metal-terheteroarilo. Más típicamente, estos precursores de marcas de masa de metal-heteroarilo se seleccionan de complejos de metal-monopiridina, complejos de metal-bipiridina y complejos de metal-terpiridina. Se divulgan otros precursores de marcas de masa complejadas con metal, en los que el precursor de marca de masa es un complejo de metal-péptido. Estos complejos se pueden ionizar para formar códigos de masa detectables. En modos de realización particulares, estos precursores de marcas de masa comprenden un complejo de níquel que se une a dos o más aminoácidos equivalentes o diferentes. Los aminoácidos ejemplares incluyen cualquier aminoácido (por ejemplo, histidina) que se puede quelar con un metal.

En algunos modos de realización divulgados, se puede usar una nanopartícula funcionalizada con ligandos de marca de masa como precursor de marca de masa. Los ligandos de marca de masa se unen a la nanopartícula por medio de un resto de unión. Las nanopartículas funcionalizadas con marca de masa también se acoplan a uno o más restos de tiramina y/o derivados de tiramina. En otros modos de realización divulgados, los conjugados incluyen la propia nanopartícula como precursor de marca de masa, lo que produce iones metálicos en agrupaciones pequeñas tras la exposición a una fuente de energía. Estos iones metálicos en agrupaciones pequeñas actúan como código de masa. Estos modos de realización divulgados usan metales o un semiconductor, en los que los metales se pueden seleccionar de los grupos 3-15 de la tabla periódica. Típicamente, los metales se seleccionan de Y, La, Ag, Au, Pt, Ni, Pd, Rh, Ir, Co, Cu, Bi o una combinación de los mismos.

En determinados modos de realización divulgados, el precursor de marca de masa se acopla a una tiramina o derivado de tiramina por medio de un conector, tal como un conector alifático, heteroalifático o heterobifuncional. Los modos de realización divulgados particulares se refieren a conectores heteroalifáticos, tales como unidades de polietilenglicol que tienen una fórmula PEGn en la que n varía de 1 a aproximadamente 50, de 1 a aproximadamente 30, de 1 a aproximadamente 25, de 1 a aproximadamente 10, y 4 u 8. Otros modos de realización usan conectores heterobifuncionales para formar conjugados de precursor de marca de masa-tiramina o conjugados de precursor de marca de masa-derivados de tiramina.

En algunos modos de realización, se conjugan múltiples precursores de marcas de masa, restos de tiramina y/o derivados de tiramina a transportadores multivalentes. Estos transportadores incluyen polímeros, biomoléculas, liposomas, micelas y nanopartículas. Los polímeros pueden ser lineales (tales como un poliácido, poliamina, polisacárido, polihidracina o copolímero) o hiperramificados (tales como polietilenimina o dendrímeros). También se puede usar un transportador biomolecular, y se puede seleccionar de una proteína, un polipéptido, un oligopéptido, un péptido, un ácido nucleico, ADN, ARN, un oligosacárido, un polisacárido y monómeros de los mismos. Las nanopartículas están compuestas de un semiconductor, metal o metales múltiples, seleccionados del grupo 3-15 de la tabla periódica. Los modos de realización particulares utilizan nanopartículas que comprenden Y, La, Ag, Au, Pt, Ni, Pd, Rh, Ir, Co, Cu y Bi, o una combinación de los mismos.

Los modos de realización divulgados particulares del conjugado divulgado se pueden formar usando cualquiera de los precursores de marcas de masa divulgados, conectores o transportadores opcionales, restos de tiramina o derivados de tiramina. Los modos de realización divulgados particulares del conjugado divulgado que comprende un precursor de marca de masa de triarilmetano junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador; un precursor de marca de masa de nitrofenilo junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador; un precursor de marca de masa de heteroarilo junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador; un precursor de marca de masa naftol-azo junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador; un precursor de marca de masa de quelato de metal-heteroarilo junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador; un precursor de marca de masa de ligando junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador; y una nanopartícula como precursor de marca de masa junto con una tiramina o derivado de tiramina, conjugado directamente o bien a través de un conector o transportador. Cualquiera de estos modos de realización divulgados se puede usar en los modos de realización divulgados del procedimiento divulgado. Estos modos de realización divulgados también se pueden utilizar para la multiplexación para detectar múltiples dianas en una muestra.

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También se contemplan en los modos de realización divulgados del conjugado divulgado los derivados radiomarcados de cualquiera de los precursores de marcas de masa divulgados.

Un procedimiento para detectar una diana en una muestra se refiere a poner en contacto una muestra con un conjugado de enzima-resto de unión específica seleccionado para reconocer la diana. A continuación, se pone en contacto la muestra con un conjugado de precursor de marca de masa, que comprende un precursor de marca de masa y un sustrato enzimático, un resto de tiramina, o un derivado de tiramina, y un conector opcional. El conjugado de precursor de marca de masa se somete a reacción con la enzima o con el producto de la reacción enzimática para producir marcas de masa precipitadas, marcas de masa unidas de forma covalente o marcas de masa unidas de forma no covalente. Se expone la muestra a una fuente de energía, lo que proporciona suficiente energía para producir un código de masa a partir de la marca de masa. Después de la ionización, se puede detectar el código de masa usando un procedimiento de detección, tal como espectrometría de masas. En algunos modos de realización, se expone la muestra a una primera solución que comprende el conjugado de enzima-resto de unión específica y una segunda solución que comprende el conjugado de precursor de marca de masa. Los restos enzimáticos de la enzima-resto de unión específica se pueden seleccionar de enzimas oxidorreductasas (por ejemplo, peroxidasas), fosfatasas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), lactamasas (por ejemplo, p-lactamasa) y galactosidasas (por ejemplo, p- D-galactosidasa, p-galactosidasa) Los restos de unión específica se pueden seleccionar de una proteína, un polipéptido, un oligopéptido, un péptido, un ácido nucleico, ADN, ARN, un oligosacárido, un polisacárido y monómeros de los mismos. Los modos de realización divulgados particulares se refieren al uso de conjugados de fosfatasa alcalina-anticuerpo y conjugados de peroxidasa de rábano picante-anticuerpo. En algunos modos de realización divulgados, un resto de unión específica reconoce la diana. En otros modos de realización divulgados, el resto de unión específica reconoce un anticuerpo primario unido a la diana.

Además, determinados modos de realización divulgados utilizan una especie activa, generada como el producto de una reacción enzimática, para depositar una marca de masa en la diana. Las reacciones entre la especie activa y el precursor de marca de masa incluyen reacciones de oxidorreducción, reacciones de adición, reacciones de eliminación y reacciones de sustitución. Por ejemplo, se pueden reducir iones metálicos en presencia de diversos reductores, tales como hidroquinona, en presencia de peróxido de hidrógeno y peroxidasa de rábano picante. Este proceso de oxidorreducción provoca que el metal reducido precipite en un sitio diana particular, seguido de la detección posterior de los códigos de masa de la agrupación metálica usando espectrometría de masas LDI-TOF.

Determinados modos de realización divulgados se refieren a un procedimiento para obtener imágenes y cuantificar múltiples dianas en una muestra, tal como una muestra de tejido, usando precursores de marcas de masa marcadas con isótopos estables y técnicas espectrométricas de masas (EM), tales como desorción/ionización por láser, incluyendo espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz con analizador del tiempo de vuelo (EM MALDI-TOF). Las dianas pueden ser proteínas, péptidos, secuencias de ácido nucleico o cualquier combinación de los mismos. En algunos modos de realización, las dianas son biomarcadores de cáncer, y se usan precursores de marcas de masa para identificar y/o cuantificar cada diana. Por ejemplo, los biomarcadores de cáncer pueden ser biomarcadores de cáncer de mama, tales como RE, RP, Her2 y/o Ki67. En modos de realización particulares, las dianas son diferentes formas del mismo biomarcador de cáncer, por ejemplo, formas intacta y truncadas, tales como formas intacta y truncadas de Her2. En determinados modos de realización, la muestra es tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE). Los precursores de marcas de masa usados para identificar y/o cuantificar múltiples dianas dentro de una única muestra de tejido se marcan con isótopos estables (por ejemplo, 2H, 13C, 15N, etc.) para producir precursores de marcas de masa que tienen la misma estructura química pero diferentes masas. En modos de realización particulares, los precursores de marcas de masa son cromógenos marcados con isótopos estables útiles para la tinción de tejidos de IHQ.

Una ventaja del procedimiento divulgado es que se puede usar para la detección multiplexada de múltiples dianas en una muestra particular. Por ejemplo, se pueden usar reacciones enzimáticas consecutivas para distribuir varias marcas de masa en varias localizaciones de dianas diferentes en una muestra. Muchos modos de realización proporcionan nuevos procedimientos para el análisis de tejidos a través del uso de una amplia clase de precursores de marcas de masa que proporcionan procedimientos eficaces y eficientes para la detección de sitios diana particulares. Los precursores de marcas de masa, marcas de masa, códigos de masa y el procedimiento de uso de los conjugados de precursores de marcas de masa descritos en el procedimiento actual están destinados para su uso en aplicaciones de obtención de imágenes de masa de tejido, en especial para muestras de tejido FFPE. Sin embargo, también se pueden utilizar determinados modos de realización para inmunoensayos ligados a enzimas en general. La adopción de estos procedimientos en inmunoensayos ligados a enzimas ofrece una potenciación en la sensibilidad y cuantificabilidad de forma multiplexada.

En algunos modos de realización, el procedimiento comprende depositar una primera marca de masa en una primera diana en una muestra de tejido y depositar una segunda marca de masa en una segunda diana en la muestra de tejido, ionizar cada marca de masa para producir un código de masa correspondiente a una diana en la que se depositó la marca de masa, detectar cada código de masa y cuantificar cada diana cuantificando una cantidad del código de masa depositado en cada diana. La primera marca de masa y la segunda marca de masa tienen la misma estructura química, pero al menos una de la primera marca de masa y la segunda marca de masa

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está radiomarcada de modo que difieren en masa, produciendo de este modo códigos de masa respectivos que tienen la misma estructura química pero difieren en masa En determinados modos de realización, el procedimiento incluye además depositar marcas de masa adicionales en una o más dianas posteriores en la muestra de tejido, en el que cada marca de masa adicional tiene la misma estructura química que la primera y segunda marcas de masa y está radiomarcada de modo que su masa difiere de cualquier otra marca de masa usada para identificar y cuantificar cualquier otra diana en la muestra de tejido. En modos de realización particulares, se realiza la detección de cada código de masa usando espectrometría de masas, y cada código de masa correspondiente a una diana difiere en masa de cualquier otro código de masa correspondiente a cualquier otra diana en una cantidad de masa suficiente para evitar el solapamiento de picos espectrométricos de masa de dos o más códigos de masa.

En algunos modos de realización, se cuantifica una cantidad de un código de masa midiendo un pico espectrométrico de masa que tiene una proporción m/z correspondiente a una proporción m/z esperada del código de masa. En otros modos de realización, se mide una pluralidad de picos espectrométricos de masa y se combinan las mediciones para cuantificar la cantidad del código de masa. La pluralidad de picos incluye un pico primario que tiene una proporción m/z de x correspondiente a la proporción m/z esperada del código de masa y al menos un pico secundario que tiene una proporción m/z de x+n donde n es un número entero > 1 y x+n es menor que una proporción m/z correspondiente a una proporción m/z esperada de cualquier otro código de masa presente.

En algunos modos de realización, depositar una marca de masa incluye inmovilizar una enzima en una diana, y poner en contacto la muestra de tejido con un resto de sustrato enzimático y un precursor de marca de masa. El resto de sustrato enzimático reacciona con la enzima y el precursor de marca de masa para producir y depositar una marca de masa en la diana. Cuando dos o más dianas están presentes en la muestra de tejido, las marcas de masa se depositan secuencialmente en cada diana como se describe anteriormente. Después de que se deposite una marca de masa, la enzima correspondiente se desactiva antes de depositar una marca de masa posterior en una diana posterior. En otros modos de realización divulgados, la enzima reacciona con un conjugado de precursor de marca de masa-tiramina o un conjugado de precursor de marca de masa-derivado de tiramina para depositar, típicamente de forma covalente, la marca de masa próxima a la diana.

En algunos modos de realización, inmovilizar una enzima en una diana incluye poner en contacto la muestra de tejido con un conjugado que comprende un resto de unión específica y una enzima. En determinados modos de realización, el resto de unión específica es un anticuerpo. El resto de unión específica puede reconocer y unirse directamente a la diana o a otro resto de unión específica previamente unido a la diana. En modos de realización particulares, la primera enzima, la segunda enzima y cualquier enzima adicional son la misma.

En algunos modos de realización, la diana es una proteína o un péptido, y el resto de unión específica unido previamente a la diana es un anticuerpo. En algunos modos de realización, la diana es una secuencia de ácido nucleico, y el resto de unión específica unido previamente a la diana es una sonda marcada que puede hibridarse a la secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma.

En algunos modos de realización, las marcas de masa se ionizan exponiendo una o más marcas de masa a ionización/desorción iniciada por láser para producir un código de masa. El uno o más códigos de masa se detectan y cuantifican. La primera diana se cuantifica cuantificando el primer código de masa, y la segunda diana se cuantifica cuantificando el segundo código de masa. En determinados modos de realización, el láser ioniza marcas de masa en una sección de la muestra de tejido. En modos de realización particulares, la muestra de tejido y/o el láser se mueven posteriormente de modo que se sitúa el láser para ionizar marcas de masa en una sección posterior de la muestra de tejido, y los códigos de masa de la sección posterior se detectan y cuantifican. Las etapas de mover la muestra y el láser uno respecto a otro, ionizar marcas de masa, y detectar y cuantificar los códigos de masa se pueden realizar en una pluralidad de secciones posteriores de la muestra de tejido.

En algunos modos de realización, se construye un mapa representativo de la muestra. Determinados modos de realización divulgados se refieren a un mapa que incluye una pluralidad de secciones correspondientes a las secciones de muestra de tejido, y cada sección de mapa incluye datos que se correlacionan con la cuantificación del código de masa en el que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de diana para la sección de muestra de tejido correspondiente. En determinados modos de realización, los datos se presentan de forma representativa, de este modo se proporcionan datos representativos tales como un color, símbolo, etc. que corresponden a un valor numérico para los datos que se correlacionan con la cuantificación del código de masa. En modos de realización particulares, los datos se correlacionan con una proporción de dos códigos de masa cuantificados para dos dianas en la sección de muestra de tejido correspondiente.

En algunos modos de realización, la primera y segunda marcas de masa se depositan en la primera y segunda dianas, y las sales de diazonio se usan para reaccionar con un resto de naftol, formando así un primer precursor de marca de masa y segundo precursor de marca de masa, que tienen las estructuras

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teniendo los ejemplos de trabajo divulgados n = 5 como se

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donde n es 1, 2, 3, 4 o 5. Preferentemente n es 2-5, muestra a continuación.

En determinados modos de realización, la muestra de tejido incluye de dos a cuatro dianas, y las sales de diazonio seleccionadas para producir finalmente el primer precursor de marca de masa, el segundo precursor de marca de masa y cualquier precursor de marca de masa adicional se seleccionan de

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donde n es 0-5, y R1 y R1 son independientemente alquilo inferior opcionalmente sustituido con uno o más isótopos, por ejemplo, -CD3, -CD2CD3, etc. En algunos ejemplos, las sales de diazonio se seleccionan de

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Los anteriores y otros objetivos, rasgos distintivos y ventajas de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama esquemático que ilustra el uso de un conjugado anticuerpo-enzima para depositar marcas de masa en una diana, seguido de ionización y desorción para producir iones detectables.

La FIG. 2 es un diagrama esquemático que ilustra el concepto general de un procedimiento para depositar directamente una marca de masa que comprende un conector a través de una reacción enzimática.

La FIG. 3 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización de un procedimiento por el que el resto de sustrato enzimático del conjugado de precursor de marca de masa se escinde por una enzima para generar una marca de masa insoluble, que se ioniza y se detecta fácilmente bajo irradiación con láser UV como un código de masa.

La FIG. 4 es un diagrama esquemático generalizado que ilustra un procedimiento que comprende formar una

especie activa y convertir un precursor de marca de masa en una marca de masa.

La FIG. 5 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización de un procedimiento para unir un

conjugado de precursor de marca de masa que comprende tiramina, o un derivado de la misma, próximo a la diana

usando un conjugado de enzima-resto de unión específica.

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Las FIGS. 6A-6D son imágenes que ilustran la detección a base de HRP-Ag donde Ag se depositó sobre tejido usando HRP, HQ y H2O2. Se presenta una imagen de la muestra de control, la FIG. 6A, y la FIG. 6B es una imagen donde se detectó Ag2+ como código de masa. La FIG. 6D es una imagen donde se detectó Ag3+ como código de masa, y la FIG. 6C es una imagen solapada de los códigos de masa de Ag2+ y Ag3+.

La FIG. 7 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización de un conjugado de precursor de marca de masa.

La FIG. 8 ilustra los iones indicadores esperados (códigos de masa) y el espectro de masas producido por un modo de realización de un procedimiento para detectar cuatro antígenos con cuatro marcas de masa marcadas con isótopos estables.

La FIG. 9 ilustra modos de realización de transportadores, tales como polímeros y biomoléculas, que se pueden unir a múltiples precursores de marcas de masa y tiramina.

La FIG. 10 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización divulgado de un esquema de detección multiplexada para detectar múltiples dianas en una muestra usando protocolos de detección de marcas de masa enzimáticos.

La FIG. 11 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización en el que se usa un conjugado de precursor de marca de masa que comprende tiramina, o un derivado de la misma, en una técnica de multiplexación.

La FIG. 12 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización de un procedimiento para cuantificar simultáneamente dos biomarcadores en tejido FFPE.

La FIG. 13 ilustra los iones indicadores esperados y los espectros obtenidos cuando se detectan dos antígenos con marcas de masa marcadas con isótopos estables ligeros y pesados.

Las FIGS. 14 y 15 son representaciones codificadas por colores y numéricas de las proporciones RE/RP encontradas en secciones de muestra de tejido para dos modos de realización de trabajo en los que se tiñeron antígenos de RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables.

Las FIGS. 16-18 son representaciones de "mapas térmicos" codificadas por colores de las proporciones RE/RP encontradas en secciones de muestra de tejido para dos modos de realización de trabajo ejemplares en las que se tiñeron antígenos de RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables. La FIG. 16 representa proporciones ER/PR que varían de 0,2-4,0; la FIG. 17 representa proporciones ER/PR que varían de 0,66 a 1,5; la FIG. 18 representa proporciones ER/PR que varían de 2,0 a 4,0.

La FIG. 19 ilustra los iones indicadores esperados (códigos de masa) y los espectros obtenidos cuando se detectan dos antígenos con marcas de masa marcadas con isótopos estables ligeros y pesados.

La FIG. 20 es un diagrama esquemático que ilustra el uso de marcas de masa enzimáticas para inmunoensayos a base de matrices.

Las FIGS. 21A-21C son imágenes que ilustran resultados ejemplares. La FIG. 21A ilustra un mapa térmico de un código de masa de verde de malaquita (MG) usado en el ejemplo 4 usando la obtención de imágenes a escala de color para indicar la intensidad del pico; la FIG. 21B es un mapa de iones en un color, como se analiza en el ejemplo 4; y la FIG. 21C es una imagen óptica de un portaobjetos de control (un portaobjetos con sección en serie) teñido con BCIP/NBT, que ilustra la especificidad de la tinción y obtención de imágenes de marcas de masa.

La FIG. 22 es una imagen de los espectros de masas representativos para los compuestos usados en el ejemplo 6.

La FIG. 23 es una imagen de los espectros de masas representativos para los compuestos usados en el ejemplo 6.

Las FIGS. 24A-24C son imágenes que ilustran resultados ejemplares usando un precursor de marca de masa divulgado en las que las FIGS. 24A y 24B son imágenes de Em que ilustran oligómeros 8-AQ formados por oxidación catalizada por HRP, seguido de la obtención de imágenes en condiciones de LDI, de acuerdo con el ejemplo 7, y la FIG. 24C es un espectro de masas de los oligómeros 8-AQ.

Las FIGS. 25A-25E son imágenes que ilustran resultados ejemplares obtenidos usando un modo de realización del procedimiento divulgado. Las FIGS. 25A y 25B son mapas térmicos obtenidos usando el procedimiento de acuerdo con el ejemplo 8 para V161-G13 de próstata humana FFPE; la FIG. 25C es un portaobjetos de control con BCIP/NBT; la FIG. 25D es un portaobjetos de control con DAB (los puntos rojos rodean la región cancerosa); y la

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FIG. 25E es un espectro de masas promedio global obtenido para toda la región medida.

Las FIGS. 26A-26C son imágenes ópticas de un xenoinjerto de MCF-7 (FIG. 26A), un xenoinjerto de ZR-751 (FIG. 26B), y un xenoinjerto de Calu-3 (FIG. 26C) teñidos con un protocolo SISH de acuerdo con el ejemplo 9.

Las FIGS. 27A-27C son imágenes de mapas térmicos del ion Ag2+ en xenoinjertos de MCF-7 (FIG. 27A),

xenoinjertos de ZR-751 (FIG. 27B) y xenoinjertos de Calu-3 (FIG. 27C) para la detección del gen Her2.

Las FIGS. 28A-28C son imágenes que ilustran los espectros promedio globales para todos los espectros medidos en xenoinjertos de MCF-7 (FIG. 28A), xenoinjertos de ZR-751 (FIG. 28B) y xenoinjertos de Calu-3 (FIG. 28C), que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ detectados para el gen Her2.

Las FIGS. 29A-29C son imágenes ópticas del control negativo del xenoinjerto de MCF-7 (sin sonda del gen Her2) (FIG. 29A), control negativo del xenoinjerto de ZR-751 (sin sonda del gen Her2) (FIG. 29B) y control negativo del xenoinjerto de Calu-3 (sin sonda del gen Her2) (FIG. 29C).

Las FIGS. 30A-30C son imágenes de los mapas térmicos del ion Ag2+ en un portaobjetos de control negativo (sin

sonda del gen Her2) para MCF-7 (FIG. 30A), ZR-751 (FIG. 30B), y para Calu-3 (FIG. 30C).

Las FIGS. 31A-31C son imágenes que ilustran los espectros promedio globales para un portaobjetos de control negativo (sin sonda del gen Her2), que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ detectados en la tinción de fondo para MCF-7 (FIG. 31A), ZR-751 (FIG. 31B) y Calu-3 (FIG. 31C).

Las FIGS. 32A-32F son imágenes de microscopio 40x de portaobjetos con Her2 de muestra obtenidas en EM para MCF-7 (FIG. 32A), ZR-751 (FIG. 32B) y Calu-3 (FIG. 32C); e imágenes de microscopio 40x de portaobjetos con Her2 de control negativo obtenidas en EM para MCF-7 (FIG. 32D), ZR-751 (FIG. 32E) y Calu-3 (FIG. 32F).

La FIG. 33 es un diagrama esquemático que ilustra un procedimiento de detección a base de hibridación in situ con plata (SISH) y fosfatasa alcalina (AP).

Las FIGS. 34A-34D son imágenes ópticas de xenoinjertos de C-33A (FIG. 34A), xenoinjertos de SiHa (FIG. 34B), xenoinjertos de Hela (FIG. 34C) y xenoinjertos de CaSki (FIG. 34D), con detección SISH de genes VIH.

Las FIGS. 35A-35D son imágenes de mapas térmicos del ion Ag2+ en xenoinjertos de C-33A (FIG. 35A), xenoinjertos de SiHa (FIG. 35B), xenoinjertos de HeLa (FIG. 35C), y xenoinjertos de CaSki (FIG. 35D) para la detección del gen PVH.

Las FIGS. 36A-36D son imágenes de los espectros promedio globales para xenoinjertos de C-33A (FIG. 36A), xenoinjertos de SiHa (FIG. 36B), xenoinjertos de HeLa (FIG. 36C) y xenoinjertos de CaSki (FIG. 36D), que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ detectados para el gen PVH.

Las FIGS. 37A-37D son imágenes ópticas de portaobjetos de control negativo de xenoinjerto de C-33A (FIG. 37A), xenoinjerto de SiHa (FIG. 37B), xenoinjerto de HeLa (FIG. 37C), y xenoinjerto de CaSki (FIG. 37D) (sin sonda del gen PVH).

Las FIGS. 38A-38D son imágenes de los mapas térmicos del ion Ag2+ en portaobjetos de control negativo de C-33A (FIG. 38A), SiHa (FIG. 38B), HeLa (FIG. 38C), y CaSki (FIG. 38D) (sin sonda del gen PVH).

Las FIGS. 39A-39D son imágenes de los espectros promedio globales para portaobjetos de control negativo de C- 33A (FIG. 39A), SiHa (FIG. 39B), HeLa (FIG. 39C) y CaSki (FIG. 39D) (sin sonda del gen PVH), que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ detectados en la tinción de fondo para el gen PVH.

Las FIGS. 40A-40H son imágenes de microscopio 40x de portaobjetos de PVH de muestra obtenidas en EM para xenoinjerto de C-33A (FIG. 40A), xenoinjerto de SiHa (FIG. 40B), xenoinjerto de HeLa (FIG. 40C) y xenoinjerto de CaSki (FIG. 40D); y las imágenes de microscopio 40x de portaobjetos de PVH de control negativo obtenidas en EM para xenoinjerto de C-33A (FIG. 40E), xenoinjerto de SiHa (FIG. 40F), xenoinjerto de HeLa (FIG. 40G) y xenoinjerto de CaSki (FIG. 40H).

La FIG. 41 es un diagrama esquemático para la tinción/depósito de marca de masa con respecto a la triplexación.

Las FIGS. 42A-42E son imágenes que ilustran resultados del mapa térmico del espectro de masas para una muestra de xenoinjerto de MCF7, una muestra de xenoinjerto de ZR751 y una muestra de xenoinjerto de Calu3 en las que la región medida para el xenoinjerto se delimita con el recuadro blanco. La FIG. 42a es una imagen de los xenoinjertos; la FIG. 42B ilustra mapas térmicos para los xenoinjertos que emplean el precursor de marca de masa de Her2 (el código de masa tiene m/z = ~ 482), la FIG. 42C ilustra mapas térmicos para los xenoinjertos que emplean el precursor de marca de masa de RE (el código de masa tiene m/z = ~ 454), la FIG. 42D ilustra mapas

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térmicos para los xenoinjertos que emplean el precursor de marca de masa de RP (el código de masa tiene m/z = ~ 438), y la FIG. 42E ilustra mapas térmicos para los xenoinjertos en los que se solapan las imágenes de las tres marcas de masa.

Las FIGS. 43A-43C son imágenes de espectros de masas a partir de puntos de trama individuales, tomadas del xenoinjerto de MCF7 (FIG. 43 A), un xenoinjerto de ZR751 (FIG. 43B) y un xenoinjerto de Calu3 (FIG. 43C).

Las FIGS. 44A-44C son imágenes de espectros de masas promedio globales obtenidos para las regiones medidas de MCF7 (FIG. 44A), ZR751 (FIG. 44B) y Calu3 (FIG. 44c), que muestran códigos de masa detectados para Her2 (m/z = 482), RE (m/z = 454) y RP (m/z = 438).

Las FIGS. 45A-45C son imágenes que ilustran los resultados ejemplares obtenidos usando multiplexación: La FIG. 45A ilustra mapas térmicos producidos por modos de realización ejemplares; la FIG. 45B ilustra histogramas de intensidad (unidades arbitrarias [ua, eje x] frente a frecuencia [eje y]) de códigos de masa ejemplares producidos en el modo de realización de trabajo ejemplar; y la FIG. 45C ilustra un mapa de densidad (carga de masa [m/z, eje x] frente a unidades arbitrarias [ua, eje y]) y un espectro de masas global (carga de masa [m/z, eje x] frente a unidades arbitrarias [ua, eje y]) de códigos de masa ejemplares que detectan xenoinjertos particulares.

Las FIGS. 46A y 46B son imágenes que ilustran los resultados en un modo de realización de trabajo ejemplar en el que el efecto de los tratamientos con tampón de SDS/glicina en la muestra se determinó usando un control (sin tratamiento con SDS/glicina) (FIG. 46A) y una muestra lavada dos veces con tratamiento con SDS/glicina (FIG. 46B).

Las FIGS. 47A y 47B son imágenes que ilustran los resultados ejemplares obtenidos comparando diferentes precursores de marcas de masa ejemplares.

La FIG. 48 es una imagen combinada que ilustra una imagen óptica de un xenoinjerto ejemplar que comprende células positivas y células negativas, un espectro de masas combinado de los códigos de masa de iones de plata detectados en las células positivas y un espectro de masas combinado de los códigos de masa de iones de plata detectados en las células negativas.

La FIG. 49 es un gráfico de intensidad de iones de plata (ua) frente a la puntuación IHQ para Her2, que resume los resultados de intensidades de códigos de masa de iones de plata obtenidos para las células negativas del ejemplo 13.

La FIG. 50 es un gráfico de intensidad de iones de plata (ua) frente a la puntuación IHQ para Her2, que resume los resultados de intensidades de códigos de masa de iones de plata obtenidos para las células positivas del ejemplo 13.

Las FIGS. 51A-51F son imágenes de gráficos (intensidad de código de masa [ua] frente a concentración de proteína [ng/ml]) que ilustran los resultados de espectros de masas (FIG. 51A-51C) y de ImageJ (FIG. 51D-51F) para una proteína unida de forma covalente a un portaobjetos con ITO.

Las FIGS. 52A y 52B son imágenes de espectros de masas de los resultados obtenidos de modos de realización de trabajo ejemplares con una proteína ejemplar en tejido de amígdala teñido con DAB y NiCh.

Las FIGS. 53A y 53B son imágenes de espectros de masas de Ki-67 de amígdala teñida con AEC que ilustran iones de moléculas dímeras e iones de moléculas monómeras.

La FIG. 54 es un gráfico de barras que ilustra el promedio de la intensidad (ua) de múltiples regiones sometidas a obtención de imágenes usando espectrometría de masas. Se analizaron cuatro líneas celulares que expresan Her2 diferentes en el mismo portaobjetos y cada barra mostrada para cada línea celular en el gráfico ilustra una región diferente de la línea celular obtenida en condiciones idénticas.

La FIG. 55 es un gráfico de barras que ilustra la intensidad normalizada de líneas celulares que expresan Her2 (Her2 en Calu-3 = 100). Cada serie (serie 1, 2 y 3) representa un portaobjetos diferente sometido a obtención de imágenes en diferentes momentos.

La FIG. 56 es un espectro de masas obtenido de un ensayo multiplexado usando marcas de masa marcadas con isótopos estables para detectar y cuantificar dos antígenos en tejido FFPE.

Las FIGS. 57A-57C son imágenes ópticas de antígenos RE y RP en tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 FFPE en ratón atímico. Las FIGS. 57A y 57B muestran los antígenos RE y RP, respectivamente, teñidos usando un kit Alkaline Phosphatase Red Detention Kit. La FIG. 57C muestra ambos antígenos RE y RP teñidos de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables; en este ejemplo, las marcas de masa fueron tintes azoicos.

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Las FIGS. 58A-58B son gráficos de barras que ilustran el número de acontecimientos de espectrometría de masas frente a la proporción RE/RP para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables.

La FIG. 59 es un gráfico de la proporción de picos de masa de RE/RP frente al número de espectros determinado clasificando las proporciones RE/RP de baja a alta para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables.

La FIG. 60 es una serie de gráficos que muestran los valores medios de la proporción RE/RP y las barras de error para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables. Las proporciones RE/RP se clasificaron en cuatro grupos, es decir, < 0,67, e (0,67, 1,50), e (1,50, 4,00), y > 4,00.

La FIG. 61 es un gráfico de la intensidad pico de RE frente al acontecimiento de EM para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para la tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables.

La FIG. 62 es un gráfico de la intensidad pico de RP frente al acontecimiento de EM para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de realización del procedimiento divulgado para la tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos estables.

La FIG. 63 es un gráfico del logaritmo de la intensidad pico de RE frente al acontecimiento de EM para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de

realización del procedimiento divulgado para la tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos

estables.

La FIG. 64 es un gráfico del logaritmo de la intensidad pico de RP frente al acontecimiento de EM para dos modos de realización de trabajo ejemplares en los que se tiñeron antígenos RE y RP de acuerdo con un modo de

realización del procedimiento divulgado para la tinción múltiple con marcas de masa marcadas con isótopos

estables.

Las FIGS. 65A-65C son imágenes que ilustran lo siguiente: La FIG. 65A es una imagen de los mapas térmicos de iones detectados en el análisis de Ki-67 en tejido de amígdala tanto para una muestra de interés y la FIG. 65B es una imagen de una muestra de control; y la FIG. 65C es el espectro de masas global correspondiente de la muestra de interés y la muestra de control.

Las FIGS. 66A-66C son imágenes que ilustran mapas térmicos de un xenoinjerto 3 en 1 de Her2; con los resultados mostrados para MCF7 (FIG. 66A), ZR-75-1 (FIG. 66B) y Calu3 (FIG. 66C).

La FIG. 67 es una imagen óptica de la tinción de Ki-67 usando los reactivos de detección AP-Red de Ventana en tejido de amígdala, de acuerdo con el ejemplo 5.

La FIG. 68 es una MSI LDI de Ki-67 usando los reactivos de detección AP-Red de Ventana en tejido de amígdala, de acuerdo con el ejemplo 5.

La FIG. 69 es una imagen combinada que ilustra una vista ampliada de un portaobjetos de control con DAB (los puntos rojos en el portaobjetos de control con DAB rodean la región cancerosa) y una imagen ampliada de un portaobjetos de código de masa con BG, de acuerdo con el ejemplo 8.

La FIG. 70 es una imagen combinada que ilustra una vista ampliada de un portaobjetos de control con DAB y una imagen de un portaobjetos de código de masa con BG, que muestra la región de uretra, de acuerdo con el ejemplo 8.

La FIG. 71 es una imagen combinada que ilustra una imagen de un portaobjetos de control con DAB V175-H7, donde el área a la derecha de los puntos rojos en el portaobjetos de control con DAB es región cancerosa, y una imagen de un portaobjetos de código de masa con BG de la misma región, de acuerdo con el ejemplo 8.

Las FIGS. 72A-72D son imágenes que ilustran lo siguiente: La FIG. 72A es un mapa de iones en un color para el código de masa con BG, de acuerdo con el ejemplo 4; la FIG. 72B es una imagen de un mapa térmico del código de masa con Brilliant Green (BG), con obtención de imágenes con escala de color para indicar la intensidad del pico; la FIG. 72C es una imagen óptica de un portaobjetos de control (un portaobjetos con sección en serie) teñido con BCIP/NBT en condiciones idénticas usadas en el ejemplo 4 para mostrar la especificidad de la tinción y la obtención de imágenes de marcas de masa; y la FIG. 72D es un espectro de masas de BG (m/z = ~ 385) como código de

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masa, como se analiza en el ejemplo 4, incluyendo una región expandida del espectro de masas.

Las FIGS. 73A y 73B son imágenes que ilustran la MSI representativa de la tinción de Ki-67 con violeta cristal (CV, m/z = ~ 372) como código de masa (FIG. 73A), como se analiza en el ejemplo 4 y un espectro de masas de violeta cristal (CV, m/z = ~ 372) como código de masa (FIG. 73B), como se analiza en el ejemplo 4.

Listado de secuencias

Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos proporcionadas en el presente documento se muestran usando abreviaturas de letras estándar para bases nucleotídicas y el código de tres letras para aminoácidos. Solo se muestra una hebra de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la hebra complementaria está incluida por cualquier referencia a la hebra presentada. El listado de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII, denominado "87482-01_ST25", creado el 30 de junio de 2011, 94,2 KB.

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos de Her1 (secuencia de referencia NCBI N.° NP_005219.2).

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de ADNc ejemplar que codifica Her1 (secuencia de referencia NCBI N.° NM_005228.3).

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoácidos de Her2 (secuencia de referencia NCBI N.° NP_004439.2).

La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de ADNc ejemplar que codifica Her2 (secuencia de referencia NCBI N.° NM_004448.2).

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoácidos de Her3 (secuencia de referencia NCBI N.° NP_001973.2).

La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de ADNc ejemplar que codifica Her3 (secuencia de referencia NCBI N.° NM_001982.3).

La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos de Her4 (n.° de acceso de Genbank AAI43750).

La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de ADNc ejemplar que codifica Her4 (n.° de acceso de GenBank BC143749.1).

La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos del receptor estrogénico (secuencia de referencia NCBI N.° NP 000116.2).

La SEQ ID NO: 10 es una secuencia de ADNc ejemplar que codifica un receptor estrogénico (secuencia de referencia NCBI N.° NM_000125.3).

La SEQ ID NO: 11 es una secuencia de aminoácidos del receptor progesterónico (n.° de acceso de Genbank AAD01587.1).

La SEQ ID NO: 12 es una secuencia de ADNc ejemplar que codifica un receptor progesterónico (n.° de acceso de GenBank AF016381.1).

Descripción detallada

I. Términos y abreviaturas

A menos que se indique de otro modo, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Se pueden encontrar definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); y otras referencias similares.

Como se usa en el presente documento, los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. De forma similar, la palabra “o” pretende incluir “y” a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Además, como se usa en el presente documento, el término "comprende" quiere decir "incluye". Por tanto, "que comprende A o B" quiere decir que incluye A, B o A y B. Se debe entender además que todos los tamaños de nucleótidos o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos u otros compuestos son aproximados y se proporcionan para su descripción. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en las pruebas de la presente divulgación, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de los términos, tendrá preferencia. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos

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son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Todas las secuencias a las que se hace referencia por los números de acceso de GenBank en el presente documento son tal como aparecieron en la base de datos el 30 de junio de 2011.

Para facilitar la revisión de los diversos ejemplos de esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos y abreviaturas específicos:

Alifático: cualquier molécula de cadena abierta o cerrada, excluyendo compuestos aromáticos, que contiene solo átomos de carbono e hidrógeno que están unidos por enlaces simples (alcanos), enlaces dobles (alquenos) o enlaces triples (alquinos). Este término engloba compuestos alifáticos saturados e insaturados.

Amplificación: determinados modos de realización de la presente invención permiten que se detecte una única diana usando complejos de visualización plurales, donde los complejos pueden ser iguales o diferentes, para facilitar la identificación y/o cuantificación en los que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de una diana particular.

Análogo o derivado: un análogo es una molécula que difiere en la estructura química de un compuesto original, por ejemplo, un homólogo (que difiere en un incremento en la estructura o masa química, tal como una diferencia en la longitud de una cadena de alquilo o la inclusión de uno o más isótopos), un fragmento molecular, una estructura que difiere en uno o más grupos funcionales, un cambio en la ionización. A menudo se encuentran análogos estructurales que usan relaciones cuantitativas de estructura-actividad (QSAR), con técnicas tales como las divulgadas en Remington (The Science and Practice of Pharmacology, 19.a edición (1995), capítulo 28). Un derivado es una molécula biológicamente activa derivada de la estructura base.

Anticuerpo: "anticuerpo" se refiere conjuntamente a inmunoglobulinas o moléculas de tipo inmunoglobulina (incluyendo, a modo de ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, combinaciones de las mismas y moléculas similares producidas durante una respuesta inmunitaria en cualquier vertebrado, por ejemplo, en mamíferos tales como seres humanos, cabras, conejos y ratones) y fragmentos de anticuerpo que se unen específicamente a una molécula de interés (o un grupo de moléculas de interés altamente similares) hasta la exclusión sustancial de unión a otras moléculas (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que tienen una constante de unión, o afinidad de unión, para la molécula de interés que es al menos 103 M-1 mayor, al menos 104 M-1 mayor o al menos 105 M-1 mayor que una constante de unión para otras moléculas en una muestra biológica. En un modo de realización, se calcula la afinidad de unión por una modificación del procedimiento de Scatchard descrito por Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979. En otro modo de realización, se mide la afinidad de unión por una velocidad de disociación antígeno/anticuerpo. Aún en otro modo de realización, se mide una afinidad de unión alta por un radioinmunoensayo de competición.

Más en particular, "anticuerpo" se refiere a un ligando polipeptídico que comprende al menos una región variable de inmunoglobulina de cadena ligera o de cadena pesada que reconoce y se une específicamente a un epítopo de un antígeno. Los anticuerpos se componen de una cadena pesada y una ligera, de las que cada una tiene una región variable, denominada la región variable pesada (Vh) y la región variable ligera (Vl). En conjunto, la región Vh y la región Vl son responsables de la unión al antígeno reconocido por el anticuerpo.

Antígeno: un compuesto, composición o sustancia que se puede unir específicamente por los productos de inmunidad humoral o celular específica, tal como una molécula de anticuerpo. Los antígenos pueden ser cualquier tipo de molécula incluyendo, por ejemplo, haptenos, metabolitos intermedios simples, glúcidos (por ejemplo, oligosacáridos), lípidos y hormonas, así como macromoléculas tales como carbohidratos complejos (por ejemplo, polisacáridos), fosfolípidos, ácidos nucleicos, proteínas y péptidos. Las categorías comunes de antígenos incluyen antígenos víricos, antígenos bacterianos, antígenos fúngicos, antígenos de protozoos y otros parásitos, antígenos tumorales, antígenos implicados en enfermedades autoinmunitarias, alergia y rechazo de injertos, toxinas y otros antígenos diversos.

Aromático: un término que describe anillos conjugados que tienen enlaces insaturados, pares solitarios u orbitales vacíos, que presentan una estabilización más fuerte de lo que se esperaría por la estabilización de la conjugación sola. También se puede considerar una manifestación de deslocalización cíclica y de resonancia.

Arilo: un compuesto aromático sustancialmente a base de hidrocarburo, o un radical del mismo (por ejemplo, C6H5) como sustituyente unido a otro grupo, en particular otros grupos orgánicos, que tiene una estructura de anillo como se ejemplifica por benceno, naftaleno, fenantreno, antraceno, etc.

Arilalquilo: un compuesto, o un radical del mismo (C7H7 para tolueno) como un sustituyente unido a otro grupo, en particular otros grupos orgánicos, que contiene estructuras tanto alifáticas como aromáticas.

Biomarcador: un marcador biológico o indicador de un estado biológico que se puede medir o evaluar para indicar un estado de enfermedad particular u otro estado fisiológico de un organismo. Los biomarcadores pueden indicar un cambio en la expresión o estado de una proteína que se correlaciona con un riesgo o progresión de la enfermedad.

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Se pueden usar biomarcadores para medir la progresión de una enfermedad. También se pueden usar biomarcadores para predecir o medir la eficacia de un tratamiento particular para una enfermedad. Los biomarcadores pueden ser, por ejemplo, células, moléculas, genes, productos génicos, enzimas u hormonas específicos.

Transportador: una molécula a la que se puede unir otra molécula, tal como un hapteno, una marca de masa, un precursor de marca de masa o un antígeno. Las moléculas transportadoras incluyen transportadores inmunógenos y transportadores de unión específica. Cuando se une a un transportador inmunógeno, la molécula unida se puede volver inmunógena. Se pueden elegir transportadores inmunógenos para incrementar la inmunogenicidad de la molécula unida y/o para provocar anticuerpos contra el transportador, que son diagnóstica, analítica y/o terapéuticamente beneficiosos. La unión covalente de una molécula a un transportador puede conferir inmunogenicidad potenciada y dependencia de linfocitos T. Los transportadores útiles incluyen transportadores poliméricos, que pueden ser materiales naturales (por ejemplo, proteínas de bacterias o virus), semisintéticos o sintéticos que contienen uno o más grupos funcionales a los que se puede unir un resto reactivo. Los transportadores de unión específica pueden ser cualquier tipo de resto de unión específica, incluyendo un anticuerpo, un ácido nucleico, una avidina, una nucleoproteína. El transportador puede ser soluble o insoluble en agua, y en algunos modos de realización es una proteína o polipéptido.

Cromógeno: un compuesto aromático que comprende un grupo químico, o cromóforo, que da color al compuesto provocando el desplazamiento de, o la aparición de, bandas absorbentes en el espectro visible. Los cromóforos ejemplares incluyen -NO (por ejemplo, tintes nitroso), -NO2 (por ejemplo, tintes nitro) y -N=N- (por ejemplo, tintes azoicos).

Conjugado: una molécula que comprende dos moléculas independientes, que se han unido a través de un enlace (típicamente un enlace covalente o iónico), tal como un precursor de marca de masa unido a un sustrato enzimático.

Conjugación, unión, enlace o conexión: unión covalente de una molécula a otra molécula para preparar una molécula más grande. Por ejemplo, preparar con dos polipéptidos una molécula polipeptídica contigua, o unir de forma covalente un precursor de marca de masa, hapteno u otra molécula a un polipéptido, tal como un anticuerpo scFv.

Acoplado: un primer átomo y/o molécula que está unido a un segundo átomo y/o molécula. Acoplar se refiere, en general, a unir los átomos o moléculas por medios no covalentes. El término "acoplado" se refiere tanto a acoplado directamente como a acoplado indirectamente. Un anticuerpo secundario proporciona un ejemplo de acoplamiento indirecto. Un ejemplo específico de acoplamiento indirecto es un anticuerpo primario anti-hapteno de conejo que se une por un anticuerpo anti-IgG de conejo murino, que a su vez se une a un anticuerpo anti-IgG murina de cabra que está unido de forma covalente a un marcador detectable; por tanto, el marcador detectable se "acopla" indirectamente al anticuerpo anti-IgG de conejo murino y al anticuerpo primario anti-hapteno de conejo.

Desactivar/Desactivación: desactivar y desactivación se refieren, en general, a inhibir una enzima o hacer que una enzima sea inactiva. Los ejemplos de desactivar y desactivación incluyen lo siguiente: retirar mecánicamente una enzima después de que haya reaccionado con el conjugado sustrato enzimático-marca de masa, tal como separando por lavado la enzima por medio de elución del anticuerpo secundario, al que está conjugado la enzima, así como el anticuerpo primario (si está presente); desactivar químicamente la enzima después de que haya reaccionado con el conjugado sustrato enzimático-marca de masa, tal como exponiendo la muestra que comprende la enzima a un oxidante, tal como peróxido de hidrógeno; y/o inhibir químicamente la enzima después de que haya reaccionado con el conjugado sustrato enzimático-marca de masa con un agente que puede inhibir una acción enzimática particular. La desactivación engloba cualquiera de estas técnicas, cualquier combinación de las mismas, y cualquier otra técnica conocida ahora o desarrollada a continuación en el presente documento que logre el propósito establecido.

Marcador detectable: un compuesto o composición detectable que se une directa o indirectamente a otra molécula, tal como un anticuerpo o una proteína, para facilitar la detección de esa molécula. Los ejemplos específicos de marcadores incluyen marcas fluorescentes, enzimas e isótopos radiactivos.

Derivado: en química, un derivado es un compuesto que se deriva de un compuesto similar o un compuesto que se supone que surge de otro compuesto, por ejemplo, si un átomo se reemplaza con otro átomo o grupo de átomos. La última definición es común en química orgánica. En bioquímica, derivado se refiere a compuestos que al menos teóricamente se pueden formar a partir del compuesto precursor.

Cantidad eficaz: como se usa en el presente documento, una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para producir un efecto deseado, por ejemplo, una cantidad suficiente para permitir la detección de una diana o analito.

Epítopo: un determinante antigénico. Estos son grupos químicos particulares o secuencias peptídicas contiguas o no contiguas en una molécula que son antigénicas, es decir, que provocan una respuesta inmunitaria específica. Un anticuerpo se une a un epítopo antigénico particular.

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RE: receptor estrogénico.

FFPE: fijado con formol e incluido en parafina.

Hapteno: una molécula, típicamente una molécula pequeña, que se puede combinar específicamente con un anticuerpo, pero típicamente no puede ser sustancialmente inmunógena, excepto en combinación con una molécula transportadora.

Familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (Her): una familia de proteínas estructuralmente relacionadas, incluyendo al menos Her1, Her2, Her3 y Her4 (también conocidas como EGFR1, EGFR2, EGFR3 y EGFR4, respectivamente, o ErbB-1, ErbB-2, ErbB-3 y ErbB-4, respectivamente). Her1, Her2 y Her4 son tirosina cinasas receptoras; aunque Her3 comparte homología con Her1, Her2 y Her4, Her3 es una cinasa inactiva. En la familia Her se incluye p95, una forma truncada de Her2 que carece de porciones del dominio extracelular de Her2 (véase, por ejemplo, Arribas et al., Cáncer Res., 71:1515-1519, 2011; Molina et al., Cáncer Res., 61:4744-4749, 2001).

La familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico humano media en el crecimiento celular y se desregula en muchos tipos de cáncer. Por ejemplo, Her1 y Her2 se regulan por incremento en muchos cánceres humanos, y su señalización excesiva puede ser un factor crítico en el desarrollo y la malignidad de estos tumores. Véase, por ejemplo, Herbst, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 59:21-6, 2004; Zhang et al., J. Clin. Invest. 117 (8): 2051-8, 2007. La dimerización del receptor es esencial para la activación de la vía de Her lo que da lugar a la fosforilación del receptor y a la transducción de señal posterior. A diferencia de Her1, -3 y -4, Her2 no tiene ningún ligando conocido y adopta una conformación abierta, con su dominio de dimerización expuesto para la interacción con otros receptores de Her activados para ligandos.

Aproximadamente un 30 % de los cánceres de mama tienen una amplificación del gen Her2 o una sobreexpresión de su producto proteínico. La sobreexpresión de Her2 también se produce en otros tipos de cánceres, tales como cáncer ovárico, cáncer de estómago y formas biológicamente invasoras de cáncer uterino, tal como carcinoma endometrial seroso uterino. Véase, por ejemplo, Santin et al., Int. J. Gynaecol. Obstet., 102 (2): 128-31, 2008. Los homo y heterodímeros que contienen Her2 son complejos con proteínas competentes para transformación. Trastuzumab, un anticuerpo humanizado que previene la homodimerización de Her2 se usa para tratar determinados cánceres que sobreexpresan Her2, incluyendo cáncer de mama. Adicionalmente, el nivel de expresión de Her2 en tejido canceroso predice la respuesta del paciente a anticuerpos terapéuticos para Her2 (por ejemplo, Trastuzumab). Debido a su función pronóstica así como a su capacidad para predecir la respuesta a Trastuzumab, los tumores (por ejemplo, tumores asociados con cáncer de mama) se vigilan de forma rutinaria para detectar la sobreexpresión de Her2.

La vía de Her también está implicada en la patogénesis del cáncer ovárico. Muchas muestras de tumor ovárico expresan todos los miembros de la familia Her. Se observa coexpresión de Her1 y Her2 con más frecuencia en el cáncer ovárico que en el epitelio ovárico normal, y la sobreexpresión de ambos receptores se correlaciona con un mal pronóstico. También se ha demostrado que la dimerización preferente con Her2 (Her1/Her2, Her2/Her3) y la posterior activación de la vía por medio de la fosforilación del receptor impulsan la proliferación de células tumorales ováricas, incluso en ausencia de sobreexpresión de Her2. Se ha demostrado que Pertuzumab, un anticuerpo humanizado que previene la dimerización de Her2 (consigo mismo y con Her3) proporciona un beneficio terapéutico a pacientes con cáncer ovárico que expresa Her2 y/o Her3.

Los ejemplos de secuencia de aminoácidos de Her1 incluyen los n.os de acceso de NCBI/Genbank. NP_005219.2, CAA25240.1, AAT52212.1, AAZ66620.1, BAF83041.1, BAH11869.1, ADZ75461.1, ADL28125.1, BAD92679.1, AAH94761.1. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de Her2 incluyen los n.os de acceso de NCBI/Genbank BAJ17684.1, P04626.1, AAI67147.1, NP_001005862.1, NP_004439.2, AAA75493.1, AAO18082.1. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de Her3 incluyen los n.os de acceso de NCBI/Genbank NP_001973.3, P21860.1, AAH82992.1, AAH02706.1, AAA35979.1. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de Her4 incluyen los n.os de acceso de NCBI/Genbank AAI43750, Q15303.1, NP 005226.1, NP_001036064.1, AAI43748.1.

Heteroalifático: un grupo alifático que contiene uno o más átomos distintos de carbono e hidrógeno, tales como oxígeno, azufre, nitrógeno, fósforo, cloro, flúor, bromo, yodo y selenio.

Heterobifuncional: una molécula o grupo de átomos que contiene al menos dos grupos reactivos diferentes (típicamente un grupo reactivo en cada extremo), que son reactivos hacia grupos funcionales particulares, incluyendo sulfhidrilos y aminas. Por ejemplo, se puede usar una molécula heterobifuncional para crear enlaces covalentes químicos entre dos o más moléculas.

IHQ: inmunohistoquímica.

Ionización: el proceso de convertir un átomo o molécula en un ion añadiendo o retirando partículas cargadas tales

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como electrones, protones u otros iones poliatómicos.

Composición o conjugado inmunógeno: una composición útil para estimular o provocar una respuesta inmunitaria específica (o respuesta inmunógena) en un vertebrado. En algunos modos de realización, la respuesta inmunógena es protectora o proporciona inmunidad protectora al permitir que el animal vertebrado resista mejor la infección o la progresión de la enfermedad del organismo contra el que se dirige la composición inmunógena. Un ejemplo específico de un tipo de composición inmunógena es una vacuna.

Inmunógeno: un compuesto, composición o sustancia que puede, en condiciones apropiadas, estimular la producción de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan o se absorben en un animal.

Condiciones inmunológicamente reactivas: incluye referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo producido contra un epítopo particular se una a ese epítopo en un grado detectablemente mayor que, y/o hasta la exclusión sustancial de, la unión a sustancialmente todos los otros epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión al anticuerpo y típicamente son las utilizadas en protocolos de inmunoensayo o las condiciones encontradas in vivo. Véase Harlow & Lane, supra, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo. Las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los procedimientos son "condiciones fisiológicas" que incluyen referencia a condiciones (tales como temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas dentro de un mamífero o célula de mamífero vivo. Aunque se reconoce que algunos órganos se someten a condiciones extremas, el entorno intraorgánico e intracelular normalmente se encuentra alrededor de pH 7 (es decir, de pH 6,0 a pH 8,0, más típicamente de pH 6,5 a 7,5), contiene agua como disolvente predominante, y existe a una temperatura superior a 0 °C e inferior a 50 °C. La osmolaridad está dentro del intervalo que mantiene la viabilidad y proliferación celular.

Aislado: un componente "aislado" se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes, por ejemplo, otros componentes de una solución, una mezcla o una célula. Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína u orgánulo) se ha separado o purificado aparte sustancialmente de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que se produce el componente de forma natural, tales como otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y orgánulos. Los ácidos nucleicos y proteínas que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificados por procedimientos de purificación estándar. El término también engloba ácidos nucleicos y proteínas preparados por expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos o proteínas químicamente sintetizados, o fragmentos de los mismos.

Isótopo: una de dos o más formas de un elemento que tienen el mismo número atómico, pero diferentes masas. Las diferencias de masa se deben a la presencia de uno o más neutrones adicionales en el núcleo. Por ejemplo, deuterio y tritio son isótopos de hidrógeno. El hidrógeno tiene un protón, un electrón y ningún neutrón, y tiene una masa de 1 dalton. El deuterio tiene un protón, un electrón y un neutrón, y tiene una masa de 2 daltons. El tritio tiene un protón, un electrón y dos neutrones, y tiene una masa de 3 daltons.

Conector: como se usa en el presente documento, un conector es una molécula o grupo de átomos situados entre dos restos. Por ejemplo, un conjugado de precursor de marca de masa puede incluir un conector entre la marca de masa y el resto de sustrato enzimático. Típicamente, los conectores son bifuncionales, es decir, el conector incluye un grupo funcional en cada extremo, en el que los grupos funcionales se usan para acoplar el conector a los dos restos. Los dos grupos funcionales pueden ser iguales, es decir, un conector homobifuncional, o diferentes, es decir, un conector heterobifuncional.

Péptido conector: un péptido situado entre dos restos. Un ejemplo de un péptido conector es un fragmento de unión a anticuerpo (tal como un fragmento Fv) que une indirectamente la cadena pesada variable a la cadena ligera variable. "Conector" también se puede referir a un péptido que sirve para unir un resto selectivo, tal como un scFv, a una molécula efectora, tal como una citotoxina o un marcador detectable.

Alquilo inferior: cualquier cadena alifática que contiene 1-10 átomos de carbono.

Código de masa/Ion indicador: un ion que se produce a partir de una marca de masa durante una etapa de ionización que se puede detectar, tal como por un espectrómetro de masas. Por ejemplo, un resto fotolábil, que tiene al menos un enlace fotolábil, se puede desorber e ionizar para formar un código de masa. El código de masa, o ion indicador, puede ser una forma ionizada de la marca de masa (por ejemplo, ionización blanda) o puede ser un fragmento ionizado.

Marca de masa: un resto que puede producir un código de masa tras la ionización. Los restos de marca de masa pueden comprender uno o más enlaces lábiles, tales como enlaces fotolábiles, que se escindirán, ionizarán o disociarán tras la fotólisis. En algunos modos de realización, la marca de masa es equivalente a un código de masa, tal como cuando la marca de masa comprende un resto cargado. Se pueden seleccionar marcas de masa de acuerdo con las propiedades que las hacen útiles para ionización y/o las propiedades que las hacen útiles para su depósito próximo a la enzima. La estabilidad de la marca de masa o sus fragmentos dominantes como iones, la

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susceptibilidad a la ablación con láser y la disociación de la matriz pueden todos distinguir las marcas de masa de otros compuestos.

Precursor de marca de masa: un resto que se puede someter a una reacción para formar una marca de masa. Por ejemplo, un precursor de marca de masa se puede convertir enzimáticamente en una marca de masa. El precursor de marca de masa puede ser parte de un conjugado, del que una porción es un sustrato para una enzima. El conjugado de precursor de marca de masa se convierte típicamente por una enzima de manera tal que la marca de masa resultante se localiza en la proximidad de la enzima. Por ejemplo, el precursor de marca de masa puede ser soluble en agua, en el que la enzima cataliza la formación de una marca de masa insoluble en agua que se deposita (por ejemplo, precipita) en la proximidad de la enzima. El precursor de marca de masa también puede incluir un sustrato que es activable por la enzima para formar una especie reactiva. De forma ilustrativa, la especie reactiva puede ser una especie reactiva de vida corta que se une de forma covalente próxima a la enzima. El precursor de marca de masa también puede formar una marca de masa tras la reacción con un intermedio reactivo, por ejemplo un intermedio reactivo formado enzimáticamente.

Quelato de metal-heteroarilo: un complejo que comprende un metal que tiene dos o más interacciones de unión separadas con uno o más grupos arilo que contienen al menos uno o más átomos distintos de carbono. Los ejemplos incluyen quelatos de monoheteroarilo en los que ninguno de A, A', B, B', C o C' están unidos a otro anillo, quelatos de biheteroarilo, en los que los anillos A y A' están unidos entre sí, estando unidos los anillos C y B entre sí, y estando unidos C' y B' entre sí, o quelatos de terheteroarilo, en los que los anillos A, B y C están unidos entre sí, y A', B' y C' están unidos entre sí.

Micela: una micela es un agregado coloidal de moléculas grandes, por ejemplo, moléculas tensioactivas.

Molécula de interés o diana: una molécula para la que se va a determinar la presencia, localización y/o concentración. Los ejemplos de moléculas de interés incluyen proteínas, péptidos y secuencias de ácido nucleico. En determinados ejemplos, la molécula de interés, o diana, es un biomarcador.

Anticuerpo monoclonal: un anticuerpo producido por un único clon de linfocitos B o por una célula en la que se han transfectado los genes de las cadenas ligera y pesada de un único anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales se producen por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, preparando células formadoras de anticuerpos híbridas a partir de una fusión de células de mieloma con células de bazo inmunitarias. Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos monoclonales humanizados.

EM: espectrometría de masas; espectrométrico de masas.

MSI: obtención de imágenes por espectrometría de masas.

Múltiple, multiplexado, multiplexación: los modos de realización de la presente invención permiten que se detecten múltiples dianas en una muestra de forma sustancialmente simultánea, o secuencial, como se desee, usando diferentes conjugados plurales. La multiplexación puede incluir la identificación y/o cuantificación de ácidos nucleicos en general, ADN, ARN, péptidos, proteínas, tanto individualmente como en cualquiera y todas las combinaciones. La multiplexación también puede incluir la detección de dos o más de un gen, un mensajero y una proteína en una célula en su contexto anatómico.

Nanopartícula: una partícula a nanoescala con un tamaño que se mide en nanómetros, por ejemplo, una partícula nanoscópica que tiene al menos una dimensión de menos de aproximadamente 100 nm. Los ejemplos de nanopartículas incluyen nanopartículas paramagnéticas, nanopartículas superparamagnéticas, nanopartículas metálicas, materiales de tipo fulereno, nanotubos inorgánicos, dendrímeros (tales como con quelatos metálicos unidos de forma covalente), nanofibras, nanocuernos, nanocebollas, nanobarras, nanocuerdas y puntos cuánticos. Una nanopartícula puede producir una señal detectable, por ejemplo, a través de la absorción y/o emisión de fotones (incluyendo radiofrecuencia y fotones visibles) y resonancia de plasmones.

Neoplasia y tumor: el proceso de crecimiento anómalo e incontrolado de las células. La neoplasia es un ejemplo de un trastorno proliferativo.

El producto de la neoplasia es una neoplasia (un tumor), que es un crecimiento anómalo de tejido que resulta de una división celular excesiva. Un tumor que no metastatiza se denomina "benigno". Un tumor que invade el tejido circundante y/o que puede metastatizar se denomina "maligno". Los ejemplos de tumores hematológicos incluyen leucemias, incluyendo leucemias agudas (tales como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielógena aguda y mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia), leucemias crónicas (tales como leucemia mielocítica (granulocítica) crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano (formas de escasa y de gran malignidad), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas, síndrome mielodisplásico, tricoleucemia y mielodisplasia.

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Los ejemplos de tumores sólidos, tales como sarcomas y carcinomas, incluyen fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteógeno y otros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, liomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, neoplasia maligna linfocítica, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma medular tiroideo, carcinoma papilar tiroideo, feocromocitomas carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, seminoma, carcinoma de vejiga y tumores del SNC (tales como un glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neurinoma del acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma).

Resto fotolábil: un resto que es lábil tras una exposición eficaz a la luz. Los restos fotolábiles contienen uno o más enlaces que se rompen por exposición a la luz.

Fotolisis: un proceso químico en el que un compuesto químico se descompone por fotones.

Polipéptido: un polímero en el que los monómeros son residuos aminoacídicos que están unidos entre sí a través de enlaces amida. Cuando los aminoácidos son aminoácidos a, se puede usar el isómero óptico L o bien el isómero óptico D. Los términos “polipéptido” o “proteína” como se usa en el presente documento pretenden englobar cualquier secuencia de aminoácidos e incluyen secuencias modificadas tales como glucoproteínas. El término “polipéptido” pretende cubrir específicamente proteínas naturales así como las que se producen de forma recombinante o sintética. El término "residuo" o "residuo aminoacídico" se refiere a un aminoácido que se incorpora en una proteína, polipéptido o péptido.

RP: receptor progesterónico.

Proteína: una molécula, en particular un polipéptido, compuesto de aminoácidos.

Próximo, de forma próxima: el término "próximo" quiere decir que está situado en o cerca del punto de unión u origen. Típicamente, unión se refiere a acoplar un resto a otro resto. En algunos casos, "próximo" se refiere a la capacidad de distinguir copias individuales de ADN diana con ISH. Sin embargo, se puede limitar la resolución espacial real por la resolución alcanzable por las técnicas usadas, tales como técnicas espectrométricas. Como se usa en el presente documento, próximo quiere decir dentro de aproximadamente 100 nm, dentro de aproximadamente 50 nm, dentro de aproximadamente 10 nm, o dentro de aproximadamente 5 nm. Próximo también puede indicar dentro de un intervalo de aproximadamente 10 ángstroms a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 10 ángstroms a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 10 ángstroms a aproximadamente 10 nm, o de aproximadamente 10 ángstroms a aproximadamente 5 nm.

Purificado: el término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se destina a un término relativo. Por tanto, por ejemplo, un péptido, proteína, conjugado u otro compuesto activo purificado es uno que está aislado todo o en parte de proteínas u otros contaminantes. En general, los péptidos, proteínas, conjugados u otros compuestos activos sustancialmente purificados para su uso en la divulgación comprenden más de un 80 % de todas las especies macromoleculares presentes en una preparación antes de la mezcla o formulación del péptido, proteína, conjugado u otro compuesto activo con un vehículo, excipiente, tampón, agente potenciador de la absorción, estabilizante, conservante, coadyuvante u otro coingrediente farmacéutico en una formulación farmacéutica completa para administración terapéutica. Más típicamente, el péptido, proteína, conjugado u otro compuesto activo se purifica para representar más de un 90 %, a menudo más de un 95 % de todas las especies macromoleculares presentes en una preparación purificada antes de la mezcla con otros ingredientes de formulación. En otros casos, la preparación purificada puede ser esencialmente homogénea, en la que otras especies macromoleculares no son detectables por técnicas convencionales.

Grupos reactivos o grupos funcionales: las fórmulas en toda esta solicitud se refieren a "grupos reactivos" o "grupos funcionales", que pueden ser cualquiera de una variedad de grupos adecuados para acoplar una primera unidad a una segunda unidad como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el grupo reactivo podría ser un grupo reactivo con amina, tal como un isotiocianato, un isocianato, una acida de acilo, un éster de NHS, un cloruro de ácido, tal como cloruro de sulfonilo, aldehídos y glioxales, epóxidos y oxiranos, carbonatos, agentes de arilación, imidoésteres, carbodiimidas, anhídridos y combinaciones de los mismos. Los grupos funcionales reactivos con tiol adecuados incluyen haluros de haloacetilo y de alquilo, maleimidas, aciridinas, derivados de acriloílo, agentes de arilación, reactivos de intercambio tiol-disulfuro, tales como disulfuros de piridilo, TNB-tiol y reductores de disulfuro, y combinaciones de los mismos. Los grupos funcionales reactivos con carboxilato adecuados incluyen diazoalcanos, compuestos de diazoacetilo, compuestos de carbonildiimidazol y carbodiimidas. Los grupos funcionales reactivos con hidroxilo adecuados incluyen epóxidos y oxiranos, carbonildiimidazol, carbonatos de N,N'- disuccinimidilo o cloroformiatos de N-hidroxisuccinimidilo, compuestos oxidantes de peryodato, oxidación enzimática, halógenos de alquilo e isocianatos. Los grupos funcionales reactivos con aldehído y cetona incluyen hidracinas, bases de Schiff, productos de aminación reductora, productos de condensación de Mannich y combinaciones de los

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mismos. Los compuestos reactivos con hidrógeno activos incluyen derivados de diazonio, productos de condensación de Mannich, productos de reacción de yodación y combinaciones de los mismos. Los grupos funcionales químicos fotorreactivos incluyen arilacidas, arilacidas halogenadas, benzofenonas, compuestos diazoicos, derivados de diacirina y combinaciones de los mismos.

Resonancia: la aparición de electrones deslocalizados dentro de determinadas moléculas o iones poliatómicos, de modo que el enlace no se puede expresar por una única fórmula de Lewis. Usada típicamente en referencia a la deslocalización electrónica de las moléculas.

Muestra: un espécimen biológico, que contiene típicamente ADN, ARN (incluido ARNm), proteína, péptidos, carbohidratos o combinaciones de los mismos, obtenido a partir de un sujeto. Los ejemplos incluyen sangre periférica, orina, saliva, biopsia de tejido, espécimen quirúrgico, muestras de amniocentesis y material de autopsia. En un ejemplo, una muestra incluye una biopsia de un adenocarcinoma, una muestra de tejido no canceroso, una muestra de tejido normal (de un sujeto no afectado con una enfermedad o trastorno conocido).

SILMSI: obtención de imágenes por espectrometría de masas a base de marcadores de isótopos estables.

Resto de unión específica: un miembro de un par de unión específica. Los pares de unión específica son pares de moléculas que se caracterizan por que se unen entre sí hasta la exclusión sustancial de unión a otras moléculas (por ejemplo, los pares de unión específica pueden tener una constante de unión que es al menos 103 M-1 mayor, 104 M-1 mayor o 105 M-1 mayor que una constante de unión para cualquiera de los dos miembros del par de unión con otras moléculas en una muestra biológica). Los ejemplos particulares de restos de unión específica incluyen proteínas de unión específica (por ejemplo, anticuerpos, lectinas, avidinas tales como estreptavidinas, glucoproteínas y proteína A), secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, oligómeros de ácido nucleico) y nucleoproteínas. Los restos de unión específica también pueden incluir las moléculas (o porciones de las mismas) que están unidas específicamente por dichas proteínas de unión específica.

Un sustituyente es un átomo o grupo de átomos que reemplaza otro átomo en una molécula como resultado de una reacción. El término "sustituyente" se refiere típicamente a un átomo o grupo de átomos que reemplaza un átomo de hidrógeno en una cadena o anillo de hidrocarburo original.

Sustituido: un compuesto fundamental, tal como un compuesto de arilo o alifático, o un radical del mismo, que tiene acoplado al mismo, típicamente en lugar de un átomo de hidrógeno, un segundo sustituyente. Por ejemplo, los compuestos de arilo sustituidos o los sustituyentes pueden tener un grupo alifático acoplado al anillo cerrado de la base de arilo, tal como con tolueno. De nuevo, solo a modo de ejemplo, un hidrocarburo de cadena larga puede tener un sustituyente unido al mismo, tal como uno o más halógenos, un grupo arilo, un grupo cíclico, un grupo heteroarilo o un grupo heterocíclico. A menos que se establezca de otro modo, cualquier compuesto o grupo funcional divulgado en el presente documento puede estar sustituido o no sustituido.

Carbono terciario: un átomo de carbono con hibridación sp3 (unido a otros cuatro átomos) que está unido a otros tres átomos de carbono y a un cuarto átomo que no es carbono.

TOF: tiempo de vuelo; se refiere a la espectroscopía de masas con analizador del tiempo de vuelo en la que se determina la proporción de masa con respecto a carga de los iones por medio de una medición del tiempo.

Tiramina: un compuesto que tiene la fórmula C8H11NO, también conocido como 4-(2-aminoetil)fenol.

II. Introducción

Los modos de realización divulgados en el presente documento se refieren a un procedimiento para obtener imágenes y/o cuantificar una o más dianas en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido tal como una muestra de tejido fijado con formol e incluido en parafina, usando marcas de masa y espectrometría de masas (EM), tal como desorción/ionización por láser (LDI), incluyendo desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI). Algunos modos de realización usan un sustrato enzimático y un precursor de marca de masa separado. La enzima convierte el sustrato en una especie activa que puede reaccionar con el precursor de marca de masa para depositar una marca de masa, tal como por precipitación, en el sitio diana.

En modos de realización ilustrativos, en primer lugar se pone en contacto una muestra que tiene una diana de interés con una enzima, que se puede acoplar a un resto de unión específica que reconoce una diana particular, o región de una diana, tal como un epítopo. A continuación, se expone la muestra al conjugado o conjugados múltiples. Se deposita una marca de masa en el sitio de una diana en una muestra en la diana para la detección posterior por EM en forma de un código de masa (un ion). Se pueden depositar las marcas de masa (de forma covalente, de forma no covalente, precipitadas) en una localización diana, o múltiples localizaciones diana, donde se exponen a una fuente de ionización para producir códigos de masa. Se pueden detectar los códigos de masa usando espectrometría de masas. Por ejemplo, espectrometría de masas de desorción/ionización por láser, desorción/ionización por láser asistida por matriz, ionización por descarga luminiscente de flujo a presión

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atmosférica, ionización por descarga luminiscente de flujo a presión atmosférica con ablación por láser, desorción/ionización por electronebulización, de iones secundarios y con plasma de acoplamiento inductivo con ablación por láser son tecnologías conocidas en la técnica que se podrían adaptar para su uso en la identificación de dianas de tejido usando los conjugados de marca de masa. Como tales, los modos de realización divulgados en el presente documento no se limitan al procedimiento de espectrometría de masas utilizado con fines de detección.

El uso de espectrometría de masas y obtención de imágenes de espectros de masas acopladas a una reacción enzimática permite la identificación, cuantificación y obtención de imágenes previamente no disponibles. En particular, la sensibilidad, selectividad, cuantificabilidad y capacidad de multiplexación de la espectrometría de masas se potencia dentro del alcance de la presente divulgación por el acoplamiento con una etapa de amplificación. Por ejemplo, la etapa de amplificación puede incluir el uso de una enzima para crear un gran número de marcas de masa para un único acontecimiento de reconocimiento. Además, la selección de marcas de masa divulgadas potencia el análisis de espectros de masas para potenciar la obtención de imágenes y la cuantificación. El enfoque actual permite una multiplexación esencialmente ilimitada. El uso de marcas de masa radiomarcadas, que se amplificarían enzimáticamente de acuerdo con esencialmente la misma cinética, permite la multiplexación que también puede proporcionar información cuantitativa relativa. Esta información no solo está disponible ahora de forma exclusiva, sino que está vinculada a información contextual a través de imágenes que hasta ahora no estaban disponibles.

Con respecto a la multiplexación, las muestras que tienen dianas múltiples se pueden tratar de manera tal que cada diana se identifica y se detecta usando una masa diferente. Las marcas de masa pueden tener la misma estructura química pero incluir diferentes isótopos y/o diferentes cantidades de un isótopo particular de modo que las marcas de masa sean diferenciables de acuerdo con sus espectros. Como se describe en el presente documento, debido a que la relación cinética entre diversos isótopos de una marca de masa y la enzima permanece constante, la amplificación de los diversos isótopos será constante entre las dianas. En consecuencia, los procedimientos descritos en el presente documento que usan marcas de masa con la misma estructura química facilitan la identificación y al menos la cuantificación de dianas relativa.

III. Precursores de marcas de masa

Aunque la espectrometría de masas se puede aplicar a una amplia gama de especies químicas, la presente divulgación proporciona ejemplos de compuestos con utilidad particular como precursores de marcas de masa. Aunque en el presente documento se divulgan varios ejemplos de precursores de marcas de masa útiles, un experto en la técnica apreciará que estos son simplemente ejemplos seleccionados para proporcionar mejor comprensión de modo que otros puedan apreciar el género completo de los compuestos útiles dentro del alcance de la presente solicitud. En particular, los compuestos con estructuras, propiedades y funciones estrechamente relacionadas están dentro del alcance de la presente divulgación.

Un grupo de precursores de marcas de masa útiles dentro del alcance de la presente divulgación incluye derivados de triarilmetano. Los modos de realización de triarilmetano ilustrativos cumplen las fórmulas generales 1A y 1B a continuación.

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unir a un resto de sustrato enzimático (por ejemplo, un grupo fosfato, una lactama o un galactósido) al triarilmetano. Cada uno de los grupos arilo puede tener diversos sustituyentes diferentes. Por ejemplo, cada uno de los sustituyentes R4 puede ser igual o diferente. Y cada uno de R2 - R4 puede ser independientemente igual o diferente.

Muchos de los derivados de triarilmetano incluyen sustituyentes en la posición para con respecto al carbono terciario que lleva R9. Los sustituyentes en la posición para ayudan a estabilizar la formación de carbocationes, de forma inductiva a través de la introducción de grupos alquilo o bien por resonancia a través de la introducción de grupos donadores de electrones.

Determinados compuestos sustituidos con amina cumplen las fórmulas generales 2A y 2B, a continuación.

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Con referencia a las fórmulas 2A y 2B, R1 y R1 independientemente pueden ser hidrógeno, deuterio, alquilo, particularmente alquilo inferior, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, etc., y arilo. El sustituyente amina se puede 5 localizar en una cualquiera o más de las posiciones de anillo. Por tanto, pueden existir múltiples funcionalizaciones de anillo con cualquiera de cero a cinco sustituyentes dispuestos en cada anillo. Los compuestos particulares incluyen metilo en R1 y/o R1, pero un experto en la técnica reconocerá que R1 y R1 pueden ser iguales o diferentes. En modos de realización divulgados particulares, R3 se puede seleccionar de hidrógeno y oxi-alquileno. En determinados modos de realización divulgados, R3 está en la posición para y comprende una subunidad oxi-etileno, 10 o polietilenglicol.

El esquema 1 ilustra un modo de realización particular del conjugado divulgado en el que las marcas de masa de triarilmetano 2 o 6 se exponen a una fuente de radiación (por ejemplo, un láser) para producir los códigos de masa 4 u 8. Un experto en la técnica reconocerá que cualquier compuesto que tenga una cualquiera de las fórmulas 2A y 2B 15 se puede someter al proceso mostrado en el esquema 1.

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Lsquema I

En un modo de realización, el precursor de marca de masa puede tener la siguiente estructura.

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Otro grupo de precursores de marcas de masa clasificables como derivados de triarilmetano incluye tintes de triarilmetano. Un tinte de triarilmetano ejemplar cumple la fórmula general 3.

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Con referencia a la fórmula 3, R2, R3 y R4 también pueden ser átomos, típicamente átomos de carbono, en un anillo unido o condensado a los anillos ilustrados. Cada uno de los grupos arilo puede tener diversos susbtuyentes diferentes. Por ejemplo, cada uno de los sustituyentes R1 puede ser igual o diferente. Y cada uno de R1, R1, R2, R3 y R4 pueden ser independientemente iguales o diferentes.

Los compuestos de acuerdo con la fórmula 3 se pueden usar en combinación con un agente reductor, tal como 5- bromo-4-cloro-3-indol generado de una escisión catalizada por AP de 5-bromo-4-cloro-3-indol-fosfato (BCIP), como se ilustra en el esquema 2, para producir una marca de masa para su uso de acuerdo con los modos de realización divulgados. De acuerdo con el modo de realización del esquema 2, un sustrato enzimático 10, tal como 5-bromo-4- cloro-indolil-fosfato (BCIP), se pone en contacto con una enzima 12, tal como fosfatasa alcalina. Esto da como resultado la especie activa 14. En este ejemplo particular, la especie 14 es un agente reductor. Se contempla que la especie 14 reduce varios compuestos, tales como el tinte de triarilmetano 18, durante esto, la especie 14 se dimeriza para producir el dímero 16. La reducción proporciona un precipitado de marca de masa incoloro 20. El esquema 2 representa el uso de Brilliant Green. El precipitado 20 se convierte en un código de masa 22, tal como por el uso de un láser. Un experto en la técnica apreciará que también se pueden usar tintes además del tinte Brilliant Green. Cuando se usa BCIP, se forma un precipitado azul dimerizado durante la reacción de 5-bromo-4-cloro-3-indol con un compuesto de triarilmetano que tiene una estructura como se describe en la fórmula 3. La ionización iniciada por láser forma el correspondiente catión de código de masa.

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Asimismo, dichos compuestos cumplen típicamente la siguiente fórmula 4.

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butilo, etc., arilo, arilo alifático, más típicamente arilalquilo, más típicamente hidrógeno, deuterio, metilo, etilo o fenilo. Los compuestos ejemplares que tienen dichos patrones de sustitución incluyen los siguientes compuestos.

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N^CH;

CH

New rucnsine

violeta de metí Id

D* r.r* Cu -r

verde de malaquita

Para determinados modos de realización divulgados, con referencia a las fórmulas 3 y/o 4, R2 - R4 pueden ser sustituyentes, que comprenden típicamente átomos de carbono, pero potencialmente heteroátomos también, tales como nitrógeno y/u oxígeno, en un sistema de anillos. Los modos de realización divulgados particulares también pueden tener las siguientes estructuras.

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Otro derivado de triarilmetano útil dentro de la presente divulgación incluye conjugados de precursor de marca de masa que incluyen un resto naftol y un derivado triarilmetano-diazoico. Dichos compuestos tienen típicamente las siguientes fórmulas generales 5 y 6.

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Los restos hidroxilo y diazoico se pueden unir al anillo de naftaleno en cualquier posición. El resto diazoico se puede localizar en cualquier posición del triarilmetano.

Para determinados modos de realización divulgados, los sustituyentes en los anillos de triarilmetano se localizan en la posición para con respecto al átomo de carbono terciario. Sin limitarse a una teoría de funcionamiento particular, actualmente se cree que tener los sustituyentes en esta posición puede facilitar la estabilización del carbocatión formado durante el análisis con espectrometría de masas, tal como por efectos de resonancia o inductivos. El grupo hidroxilo y los restos diazoicos se pueden unir al anillo de naftaleno en cualquier posición razonable, y cualquier combinación de los mismos. Los modos de realización particulares tienen las fórmulas generales 7 u 8.

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Los compuestos naftol-triarilmetano-diazoicos se pueden usar para obtener imágenes de una diana en una muestra. Un modo de realización divulgado de un procedimiento para el uso de compuestos naftol-triarilmetano-diazoicos se 5 muestra a continuación en el esquema 3. De acuerdo con este modo de realización divulgado, un derivado de naftol 24 que tiene un resto de sustrato, tal como un grupo fosfato, un galactósido, una lactama, etc., se hace reaccionar con una enzima localizada en un epítopo deseado usando un resto de unión específica, tal como un anticuerpo. Esto produce un naftol libre 26, que puede reaccionar con una sal de diazonio soluble en agua 34 que se produce, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto de amina-triarilmetano 32 con un agente oxidante, tal como NaNO2. El 10 conjugado de triarilmetano-naftol 28 no es soluble en agua, y precipita en el sitio diana. Los modos de realización específicos de este tipo de conjugado incluyen los conjugados 36 y 38. La ionización iniciada por láser produce códigos de masa detectables 30.

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enzima

R* = PO (para AP) o glucosa (para beta-Gal)

precintado

NaNO-

soluble en agua

Masa exacta 556.320

Masa exacta 723,334

fc templos especdioos de marcas de masa nattol-tr til-diazoicas

Ksquema 3

15

También se pueden usar restos de marcas de masa naftol-azoicos conjuntamente con un derivado de triarilmetano para producir otra clase de marcas de masa fotolábiles. Estas marcas de masa pueden producir un código de masa tras la ionización del conjugado de precursor de marca de masa. El código de masa producido a partir de estas marcas de masa es una especie de triarilmetano naftol-azoico que tiene un carbocatión terciario. Este código de 20 masa se puede detectar, tal como por el uso de espectrometría de masas. En algunos modos de realización, un resto naftol-azoico se une a un anillo de arilo de un derivado de triarilmetano, como se ilustra a continuación.

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También se pueden usar grupos triarilmetano para formar precursores de marcas de masa a base de tio. Los modos de realización divulgados particulares tienen la siguiente fórmula general 9.

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Con referencia a la fórmula 9, R10 puede ser alifático, tal como alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, arilo alifático, más típicamente arilalquilo, o cualquier péptido que contiene una cisteína, tal como glutatión.

En un modo de realización, el precursor de marca de masa tiene la siguiente estructura:

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Los modos de realización divulgados particulares del conjugado divulgado que comprende precursores de marcas de masa de triarilmetano derivados de tiofosfato se pueden preparar de cualquier manera conocida por un experto 20 en la técnica, por ejemplo, los procedimientos sintéticos ilustrados en el esquema 2.

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Con referencia al esquema 4, los tiofosfatos 40 y 48 son sustratos adecuados para la reacción con fosfatasa alcalina. Los tioéteres 56 y 62 son adecuados para la reacción con otras enzimas, tales como glutatión reductasa y beta-lactamasa, respectivamente. La reacción con la enzima produce un tiol (RSH). El grupo tiol es un buen nucleófilo que puede reaccionar con un compuesto de triarilmetano 44 o 52, para formar una marca de masa de triarilmetano-tiol 46, 54 o 60.

Por tanto, por ejemplo, un resto de unión específica se puede acoplar a una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-lactamasa o glutatión reductasa. El tratamiento de una muestra con el conjugado de enzima-resto de unión específica localiza a continuación la enzima en un epítopo particular en una muestra. A continuación se pone en contacto la muestra con una composición que comprende un compuesto de triarilmetano soluble en disolvente, tal como un compuesto de triarilmetano soluble en agua, que reacciona con el tiol generado enzimáticamente para producir un precursor de marca de masa insoluble, que precipita en el sitio de la diana. La ionización iniciada por láser produce a continuación códigos de masa detectables, lo que permite la obtención de imágenes de la diana en la muestra.

Otros modos de realización divulgados se refieren al uso de compuestos, denominados en el presente documento tintes arilazoicos, tales como tintes fenol-, naftol- o imidazol-azoicos, como se indica a continuación en las fórmulas generales 9-15. Y puede incluir heteroátomos, tales como nitrógeno, oxígeno y azufre; Z puede incluir heteroátomos, tales como oxígeno y azufre; y W puede ser cualquier grupo reactivo para enzimas antes de la reacción con una enzima (por ejemplo, fosfato, lactama o galactósido), o un grupo generado a partir de una reacción enzimática. Con referencia a las fórmulas generales 10-16, W puede ser, por ejemplo, hidroxilo o sulfhidrilo, que se genera como producto de una reacción enzimática, y se puede localizar en cualquier posición de anillo disponible; R21 se puede seleccionar de alifático, arilo, heteroarilo, tiramina, y/o un resto de tiramina.

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Determinados modos de realización divulgados usan derivados de naftol que tienen la siguiente fórmula general 20 en la que el resto de sustrato enzimático está típicamente en C1 o bien en C2.

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Los modos de realización divulgados particulares se refieren a códigos de masa naftol-azoicos producidos a partir de precursores de marcas de masa de naftol que tienen las siguientes estructuras.

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Estos modos de realización divulgados particulares de precursores de marcas de masa se desfosforilan con una enzima, tal como fosfatasa alcalina, y a continuación se hacen reaccionar con un compuesto que contiene grupo diazoico (por ejemplo, metoxi-naftol AS-TR) para producir la marca de masa deseada. La marca de masa se ioniza 20 tras la exposición a una fuente de energía para producir el correspondiente código de masa.

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Como se ilustra adicionalmente en el esquema 5, determinados modos de realización tienen R5 que es hidrógeno, deuterio o un grupo donador de electrones, R4 que es hidrógeno, deuterio o un grupo aceptador de electrones, y R6 que es hidrógeno, deuterio, o un grupo donador de electrones. El esquema 5 ilustra el uso del compuesto 66 que comprende una porción de naftol y una porción azoica derivada de, por ejemplo, Fast Red. El código de masa de 10 tinte naftol-azoico 68 se produce por medio de ionización iniciada por láser.

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Suscept ble a irradiación láser

Naftol

Naftol-fosfato como sustrato para AP

Sal de l

R': grupo aceptador de electrones

Láser

R" grupo donador de electrones

R" grupo donador de electrones

Esquema 5

El esquema 6 ilustra un modo de realización de un procedimiento de marca de masa de tinte naftol-azoico. 15

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Se proporciona un derivado de naftol 70, tal como naftol AS-TR, para su uso con fosfatasa alcalina o naftol-glucosa para su uso con defa-galactosidasa. Estos derivados se usan en combinación con la enzima apropiada para escindir el resto de sustrato enzimático y proporcionar un derivado de naftol para la reacción con una especie de sal de diazonio. El esquema 6 ilustra el proceso usando Fast Red KL como la sal de diazonio. La sal de diazonio 74 reacciona con naftol 72 para producir el compuesto azoico 76 adecuado para la ionización iniciada por láser para formar la marca detectable 78. Un experto en la técnica apreciará que la estructura del derivado de naftol puede variar, al igual que la estructura de sal de diazonio.

Aún otros modos de realización utilizan un resto de nitrofenilo fotolábil, que comprende al menos un enlace fotolábil, como un precursor de marca de masa. Estos modos de realización utilizan un resto de nitrofenilo en el conjugado divulgado, en particular en un conjugado que comprende tiramina o un derivado de tiramina, y un conector o transportador opcional, que comprende un conector de nitrofenilo y un código de masa. A continuación se muestra una fórmula general que ilustra estos tipos de precursores de marcas de masa.

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Fórmula 21

Con referencia a la fórmula 21, R22-R24 se seleccionan independientemente de alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, carbonilo, halógeno, hidrógeno, hidroxilo, isotiocianato, isocianato, nitrilo, nitro, tiol o cualquier combinación de los mismos, siendo al menos uno de R -R nitro. Más típicamente, R es nitro y se localiza en un átomo de carbono en el anillo aromático adyacente al átomo de carbono que lleva un sustituyente R7. R7 se selecciona de alifático, o heteroalifático, más típicamente alifático, en particular -[CH(Me)]-. R8 es un conector, una especie cargada, un cromóforo, o cualquier combinación de los mismos. Más típicamente, R8 es un resto aminoácido cargado, tal como arginina, lisina o histidina, o una especie de tetraalquilamonio, tal como tetrametilamonio, que se une directamente o por medio de un conector a un cromóforo, típicamente un tinte o un hapteno. En algunos modos de realización, el sustituyente R8 tiene un valor m/z en un intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 5000, más típicamente de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000.

El código de masa producido por marcas de masa de nitrofenilo después de la exposición a una fuente de energía típicamente tiene una fórmula [H2NR8]+. Este código de masa se produce por escisión fotoinducida de un enlace covalente entre -[N(H)-R8] y el sustituyente R7, o bien por escisión y posterior ionización. El código de masa se libera de la marca de masa y posteriormente se detecta, tal como por un espectrómetro de masas. El esquema 7 ilustra un modo de realización divulgado particular en el que la marca de masa 80 se convierte en el código de masa 82. El uso de una especie cargada como un resto R8, tal como arginina, proporciona una molécula catiónica a pH neutro. La molécula catiónica es un ion detectable por EM incluso en ausencia de cualquier matriz, lo que ilustra así la capacidad de esta marca de masa para usarse conjuntamente con LDI, no específicamente MALDI. En otros

modos de realización, cuando R8 no es un resto cargado, el código de masa ionizado se produce por ionización, que tiene lugar después de la escisión del enlace.

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5

Determinados modos de realización tienen una fórmula 22, ilustrada a continuación. Con referencia a la fórmula 22,

OO 'y A 7 Q

R -R , y R y R son como se enumera anteriormente.

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Los modos de realización particulares utilizan marcas de masa de nitrofenilo que tienen las siguientes estructuras.

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15 En otros modos de realización ilustrativos, se refieren a un conjugado de precursor de marca de masa fotolábil que comprende un resto heteroarilo como precursor de marca de masa. Las características fotolábiles de estos restos se describen por Smith (Angew. Chem. Int. Ed. (2010) 49:3612). Estos precursores de marcas de masa tienen una fórmula general 23, ilustrada a continuación.

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■ye OQ oc

Con referencia a la fórmula 23, R -R son independientemente carbono o nitrógeno, siendo al menos uno de R -

■yo -ye -yo 1 ^

R nitrógeno; más típicamente R -R son todos nitrógeno, lo que comprende así una tetracina. Un experto en la técnica reconocerá que también es posible que el resto heteroarilo comprenda una acina, una diacina o una triacina. R8 es un conector, una especie cargada, un cromóforo, o cualquier combinación de los mismos. R8 se puede seleccionar de cualquiera de las enumeraciones para R8 presentadas en referencia a marcas de masa de nitrofenilo. En modos de realización particulares, Y es azufre. El esquema 8 ilustra un modo de realización divulgado particular en el que la marca de masa 84 se expone a una fuente de radiación (por ejemplo, un láser) y produce el código de masa 86.

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Determinados modos de realización tienen una fórmula 24, ilustrada a continuación. Con referencia a la fórmula 24, R8 se puede seleccionar de cualquiera de las enumeraciones para R8 presentadas en referencia a precursores de marcas de masa de nitrofenilo.

,í N=N *'S i /)-S-Rn N-N

Fórmula 24

Los modos de realización particulares tienen la siguiente estructura.

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Determinados modos de realización divulgados de los compuestos de arilo y heteroarilo sustituidos cumplen las fórmulas generales 25 y 26 a continuación.

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Fórmula 25

Fórmula 26

Con referencia a las fórmulas generales 25 y 26, A en la fórmula 24 se selecciona de carbono y heteroátomos, tales como oxígeno y nitrógeno. R12 es una amina (NH2, o NR1R1'), éter, tiol (SH), tioéter, hidroxilo (OH), o combinaciones de los mismos. R13 se selecciona independientemente de alifático, tal como alquilo, alquenilo y alquinilo, arilo, arilo alifático, más típicamente arilalquilo, más típicamente alquilo, e incluso más típicamente alquilo inferior, tal como metilo y etilo, arilo, hidrógeno y combinaciones de los mismos. R13 también puede ser átomos en un anillo conectado con el primer anillo. Con referencia a la fórmula 26, el anillo E es un anillo aromático o heteroaromático que tiene cualquier número adecuado de átomos en el anillo, más típicamente 5, 6 o 7 átomos en el anillo, e Y es un carbono o un heteroátomo, tal como nitrógeno, oxígeno o azufre. Para los modos de realización divulgados que tienen un único anillo, los sustituyentes de amina típicamente son orto o bien para entre sí. Los ejemplos de tintes que cumplen la fórmula general 25 para los compuestos de heteroarilo incluyen fenilendiamina y diaminobenzidina (dAb)

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orto y para.

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Los ejemplos de modos de realización divulgados que tienen un segundo anillo aromático unido al primero incluyen diaminonaftalenos (DAN), tales como los mostrados a continuación.

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Un experto en la técnica apreciará que los heteroátomos, tales como nitrógeno, oxígeno y azufre, se pueden sustituir por uno o más átomos de carbono en los anillos de arilo. Los ejemplos de dichos compuestos incluyen las aminoquinolinas, como se muestra a continuación.

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8-aminoqu¡onol¡na 5-aminoquionolina 8-aminoquionoxalina

Además, los anillos de arilo y los átomos de nitrógeno pueden incluir sustituyentes distintos de hidrógeno, incluyendo grupos alifáticos y arilo, siendo los grupos alquilo inferior ejemplos de sustituyentes adecuados.

Determinados modos de realización divulgados se refieren al uso de oligómeros generados por una reacción oxidativa catalizada por peroxidasa detectable por EM. Por ejemplo, el tejido teñido con DAB mostró una señal detectable (dímero DAB) pero el fondo fue alto en algunos casos. 1,8-DAN dio un pico a m/z = 297 y 8-AQ dio picos a m/z = 426 y m/z = 567.

El tejido también se ha teñido con 1,8-DAN y 8-AQ. 8-AQ dio una tinción similar a DAB (Ki-67 en amígdala). Una muestra de tejido teñida por 8-AQ demostró que los oligómeros (en su mayoría trímeros y tetrámeros) de 8-AQ se pueden detectar fácilmente en muestras de tejido sin la necesidad de usar una matriz. Por lo tanto, determinados modos de realización divulgados se refieren al uso de oligómeros de derivados de quinolina formados en una reacción catalizada por HRP. Estos oligómeros están altamente coloreados y, por lo tanto, absorben eficazmente energía láser. En este sentido, sirven como una matriz in situ para su propia ionización y desorción. Además, la presencia de múltiples aminas y compuestos aromáticos que contienen nitrógeno facilita la protonación o la formación de cationes radicales y, por lo tanto, estos oligómeros se pueden ionizar fácilmente para su uso en EM.

Los sustratos de peroxidasa mencionados anteriormente también se pueden usar conjuntamente con un ion metálico. Los ejemplos de iones incluyen Ni , Pd , Zn , Cu , Fe , Mn , Co , y otros. Una solución de sal metálica soluble, por ejemplo NiCl2 se mezcló previamente con una solución de sustrato de peroxidasa, tales como DAB o 1,8-DAN, y se aplicó a una muestra de tejido marcado con peroxidasa en la diana. Normalmente se observa una ionización potenciada de las marcas de masa.

Una ventaja que ofrece HRP es la inhibición irreversible de la enzima por concentraciones altas de H2O2. La inhibición irreversible proporciona capacidad de multiplexación por etapas de depósito e inhibición secuenciales.

En modos de realización ilustrativos, las marcas de masa complejadas con metal fotolábiles son fuentes de códigos de masa detectables, que se pueden usar para determinar la localización de una diana particular en una muestra. Tras la ionización del conjugado de precursor de marca de masa, se produce un código de masa detectable. Un experto en la técnica reconocerá que la ionización puede implicar la escisión de un enlace covalente para producir un resto cargado o la liberación de un metal de un complejo de coordinación para producir un resto cargado. En determinados modos de realización divulgados, una marca de masa produce un código de masa detectable tras la ionización de un quelato de metal-heteroarilo. En modos de realización divulgados particulares, las marcas de masa de quelato de metal-heteroarilo producen códigos de masa en los que un quelato de metal-biheteroarilo se libera de

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un conjugado de precursor de marca de masa. Los modos de realización ejemplares incluyen la formación de códigos de masa en los que un metal se quela a una bipiridina. Otros modos de realización incluyen marcas de masa de quelato de metal-heteroarilo, que pueden producir códigos de masa en los que un quelato de metal- terheteroarilo se libera del conjugado de precursor de marca de masa. Estos complejos metálicos también pueden contener uno o más ligandos no arílicos, tales como nitrilo, tiocianato, hidroxilo, tiol, amina, carbonilo, fosfonilo, haluro, fosfina o heteroalifático. En ejemplos particulares, estos quelatos incluyen códigos de masa en los que un metal se quela a una terpiridina. El esquema 10 ilustra un modo de realización divulgado en el que las marcas de masa 88 (bipiridilo) y 100 (terpiridilo) se ionizan por una fuente de radiación (por ejemplo, un láser) para producir los códigos de masa 102 y 104, respectivamente.

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Un experto en la técnica reconocerá que los códigos de masa también pueden comprender quelatos de metal- monopiridina. Determinados modos de realización tienen marcas de masa con fórmulas generales 27-31, ilustradas 15 a continuación.

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Con referencia a la fórmula 27, L se selecciona de nitrilo, tiocianato, hidroxilo, tiol, amina, carbonilo, fosfonilo haluro, 20 fosfina o heteroalifático. Y y Z se seleccionan independientemente de oxígeno, azufre y -(nitrógeno-R11)-. Con referencia a la fórmula 28, R29-R33 se seleccionan independientemente de alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, carbonilo, halógeno, hidrógeno, hidroxilo, isotiocianato, isocianato, nitrilo, nitro, tiol y cualquier combinación de los mismos. Con referencia a las fórmulas 27-31, M es un metal seleccionado de los grupos 3-12 de la tabla periódica, que puede formar una estructura de quelato; en algunos modos de realización, M es Zn, Ni, Co, Ru, Cd, Pt y Fe. M 25 se selecciona para coordinar los anillos A, A', B, B', C, C'. Estos anillos pueden formar un quelato de monoheteroarilo, en el que los anillos A, A', B, B', C, C' solo se quelan a M y no se unen entre sí, un quelato de biheteroarilo, en el que los anillos A y A' se unen entre sí, B y C se unen entre sí, y B' y C' se unen entre sí, o un quelato de terheteroarilo, en el que los anillos A, B y C se unen entre sí v los anillos A', B' y C' se unen entre sí. Y y Z se seleccionan independientemente de oxígeno, azufre y -(nitrógeno-R11)-.

Otros modos de realización utilizan dímeros peptídicos como marcas de masa. Estas marcas de masa se producen de la ionización del conjugado de precursor de marca de masa que comprende dímeros peptídicos quelados a

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complejos metálicos. En determinados modos de realización, una tiramina o derivado de tiramina se une a un reactivo quelante, tal como ácido nitrilotriacético (NTA), que se coordina con un metal. El metal también se coordina con una marca de masa de dímero peptídico que comprende un aminoácido que se puede coordinar con un metal, tal como histidina. Tras la ionización, el dímero peptídico se libera y se detecta, tal como por el uso de espectrometría de masas. Las marcas de masa de dímero peptídico tienen una fórmula general (fórmula 32) en la que R14 se selecciona de éter, hidroxilo y -(nitrógeno-R11)-, Y se selecciona de oxígeno, azufre y -(nitrógeno-R11)-, y R8 es como se enumera para los precursores de marcas de masa de nitrofenilo y precursores de marcas de masa de heteroarilo.

R14-annr>oácido—aminoácido—Y-R8

Vl|wV

Fórmula 32

Los modos de realización particulares tienen la siguiente estructura.

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Otra clase de marcas de masa que se pueden emplear en el procedimiento actual incluye nanopartículas que pueden formar un conjugado con un sustrato enzimático, tal como tiramina o derivados de tiramina. La nanopartícula típicamente comprende un semiconductor, un metal o múltiples metales seleccionados de los grupos 3-15, tales como Y, La, Ag, Au, Pt, Ni, Pd, Rh, Ir, Co, Cu y Bi, o una combinación de los mismos. La tiramina o derivados de tiramina se pueden acoplar eficazmente al metal de la nanopartícula. Tras la ionización del conjugado de precursor de marca de masa, los iones en agrupaciones metálicas sirven como código de masa, que se puede detectar usando espectrometría de masas.

En otros modos de realización, se usa una nanopartícula conjuntamente con un resto de marca de masa y un resto de tiramina o derivado de tiramina. En estos modos de realización particulares, la nanopartícula sirve como transportador, que transporta una marca de masa y tiramina o derivado de tiramina, o múltiples de dichos restos, a la diana. Determinados modos de realización utilizan de 1 a aproximadamente unos pocos miles de ligandos, más típicamente de 1 a aproximadamente 1000 ligandos, incluso más típicamente de más de 1 a varios cientos, tal como de más de 1 a aproximadamente 500, de más de 1 a aproximadamente 250, de más de 1 a aproximadamente 200, de más de 1 a aproximadamente 150, de más de 1 a aproximadamente 100, y de más de 1 a aproximadamente 50. En algunos modos de realización, de 1 a aproximadamente 20 tiraminas o derivados de tiramina se unen a la nanopartícula. Los modos de realización particulares utilizan ligandos que comprenden un resto R15, un conector, un resto de unión, y cualquier combinación de los mismos. En determinados modos de realización, estos ligandos tienen una fórmula general 33.

R15— resto de unión-;

Fórmula 33

Con referencia a la fórmula 33, el resto R15 se acopla eficazmente a un resto de unión. R15 se selecciona de cualquier resto de marca de masa previamente descrito, un hapteno, o un péptido, tal como un oligopéptido. R15 se puede unir directamente al resto de unión, o se puede unir al resto de unión con un conector. El conector puede ser alifático, heteroalifático o heterobifuncional. El resto de unión se selecciona para acoplarse eficazmente a la nanopartícula, y típicamente comprende un grupo hidroxilo, un grupo amina, un grupo tiol o un grupo fosfina. El esquema 10 ilustra un modo de realización divulgado particular en el que una nanopartícula que comprende ligandos de marca de masa (106) y una marca de masa de nanopartícula 108 se exponen a una fuente de radiación (por ejemplo, un láser) para producir códigos de masa de ligando 110 y un código de masa de nanopartícula 112, respectivamente.

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Los modos de realización particulares usan los siguientes ligandos de marca de masa.

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Otra clase de marcas de masa útiles para determinados modos de realización divulgados son iones metálicos que se pueden reducir para formar metales, que precipitan en un sitio diana particular. Típicamente, dichos metales se usan en combinación con un agente reductor para reducir un ion metálico de un estado de oxidación no fundamental (por 10 ejemplo, estado de oxidación 1+, 2+, 3+, etc.) a un estado fundamental (estado de oxidación) para su precipitación en una diana específica. El metal se puede irradiar con un láser para formar iones en agrupaciones ultrapequeñas (donde ultrapequeño se refiere al número de átomos en la agrupación, que típicamente es de aproximadamente 2 a aproximadamente 10) y posteriormente detectarse por una técnica de espectrometría de masas adecuada. Solo a modo de ejemplo, y sin limitar la solicitud a una teoría de funcionamiento particular, los metales considerados útiles 15 para esta técnica incluyen bismuto, cobalto, cobre, oro, indio, mercurio, níquel, platino, rutenio, plata y estaño. Se puede encontrar información adicional con respecto a esta materia objeto en la patente de EE. UU. N.° 7.691.598. Además, la descripción del depósito de metal enzimático se divulga en la patente de EE. UU. N.° 6.670.113 y la publicación de patente de EE. UU. N.° US-2008-0213783-A1.

20 Este modo de realización se puede ilustrar con referencia al uso de un protocolo de reducción de iones de plata con peroxidasa de rábano picante en el que el nitrato de plata se reduce a Ag0, que precipita en el sitio de formación. En un modo de realización particular, el nitrato de plata se reduce a Ag0 en presencia de hidroquinona (HQ), peróxido

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de hidrógeno (H2O2) y peroxidasa de rábano picante (HRP). Otros agentes reductores incluyen galato de n-propilo, sulfato de 4-metilaminofenol, 1,4-fenilendiamina, o-fenilendiamina, cloroquinona, bromoquinona, 2- metoxihidroquinona, hidracina y 1-fenil-3-pirazolidinona (fenidona aminofenol). Se puede encontrar información adicional con respecto a esta materia objeto en la patente de EE. UU. N.° 7.183.072. Las enzimas adicionales que se pueden usar incluyen catalasa y/o lactoperoxidasa. Se puede encontrar información adicional con respecto a estas especies enzimáticas en la patente de EE. UU. N.° 7.592.153. La reducción de Ag0 por HQ se detalla en la patente de EE. UU. N.° 7.632.652 (columna 9, línea 20-50).

Los iones Ag2+ y Ag3+ se detectan predominantemente de la plata depositada en condiciones LDI. Se pueden obtener imágenes de la plata depositada en una muestra de tejido usando EM. Las FIGS. 6A-6C ilustran la detección exitosa de Ki-67 en tejido de amígdala en base a la tinción IHQ de HRP-plata y la posterior obtención de imágenes de masa. Por tanto, se puede usar HRP con un nuevo tipo de marca de masa, a saber, iones en agrupaciones metálicas ultrapequeñas (Mn+, n igual a de 2 a 10, más típicamente de 2 a 5). En el caso de la plata, Ag2+ y Ag3+ fueron los iones predominantes detectados. Un experto en la técnica apreciará que se pueden emplear otros metales y aleaciones, tales como Au. Las marcas de masa a base de iones en agrupaciones metálicas se ionizan muy fácilmente y, por tanto, reducen el número de disparos de láser requeridos por punto. Por ejemplo, los esfuerzos de obtención de imágenes típicos sin el uso de marcas de masa a base de iones en agrupaciones metálicas han usado 100 disparos de láser por punto. Sin embargo, con el sistema a base de plata, el número de disparos se puede reducir considerablemente, lo que acelera la velocidad de barrido.

Otro ejemplo de un enfoque a base de metal comprende el uso de un protocolo de reducción de fosfatasa alcalina/5- bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (AP-BCIP). Este procedimiento se ilustra a continuación en el esquema 11. Se pueden lograr resultados de imágenes similares usando este procedimiento. La patente de EE. UU. N.° 7.087.379 enseña el uso de un procedimiento de nitroazul tetrazolio (NBT)/BCIP, que se ha demostrado que da como resultado un "incremento en la sensibilidad para la detección de secuencias de ácido nucleico usando técnicas de detección catalizadas por fosfatasa alcalina". Página 5, líneas 4-5 de la patente de EE. UU. N.° 7.087.379.

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0 j> _e

O-P-O

Fcsfatasa alcalina

¿I O-P-O

116

114

1 Mdac 'ir,

Reducción o*: metal

por eiemplo, Ag* a AgO

Ksquema

Los naftoles, 4-cloro-1-naftol (4-CN) como ejemplo, son sustratos conocidos pero no usados ampliamente para la detección a base de HRP. Por ejemplo, se ha usado 1-naftol como sustrato para HRP, pero sin el uso de técnicas de EM. Véase, por ejemplo, Histochemistry (1985) 83:97-102. El precipitado de naftol se tiñe adicionalmente con diversos tintes básicos (catiónicos), tales como azul A, azul de metileno, violeta de cresilo, violeta cristal, verde de metilo, naranja de acridina y fucsina básica. Determinados modos de realización se refieren al uso de los tintes absorbidos en precipitados de naftol en aplicaciones de marcas de masa.

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Estos tintes están en su mayoría cargados positivamente y tienen una absorbancia alta en la longitud de onda del láser. Por lo tanto, son candidatos útiles para su uso como marcas de masa. Se ha usado violeta cristal en sistemas a base de AP-BCIP. Presumiblemente estos tintes se adsorben físicamente en el precipitado de naftol en lugar de conjugarse químicamente en el precipitado de naftol. Sin embargo, se ha demostrado que son estables y específicos. Se pueden obtener imágenes de una muestra de tejido teñida por dicho procedimiento usando espectrometría de masas.

Este enfoque se puede usar de forma secuencial o bien en un procedimiento de una etapa. El procedimiento de una etapa implica mezclar naftol y el tinte en primer lugar antes de añadirlo a una muestra de tejido. De esta forma, el tinte precipitaría conjuntamente con el naftol a medida que avanza la reacción enzimática, como se muestra a continuación en el esquema 12.

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fcsquema 12

La marca de masa adsorbida, por ejemplo, violeta cristal, se puede detectar fácilmente por EM LDI, incluso en portaobjetos de vidrio normales (portaobjetos distintos de ITO). En este enfoque, se pueden usar muchas moléculas distintas de triarilmetano como marcas de masa.

En otros modos de realización ilustrativos, uno o más átomos de cualquier precursor de marca de masa, marca de masa y/o código de masa divulgados en el presente documento, o a continuación en el presente documento descubiertos por ser útiles para practicar el procedimiento divulgado, se pueden reemplazar con isótopos estables (por ejemplo, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 18O, etc.). Se puede usar el reemplazo de átomos por isótopos estables, por ejemplo, para proporcionar una serie homóloga de marcas de masa que tienen la misma estructura química pero pesos moleculares diferentes. Por ejemplo, uno o más átomos de hidrógeno en uno o más anillos de un compuesto que contiene triarilmetano, un tinte arilazoico, un tinte básico o un compuesto de heteroarilo como se describe en el presente documento se pueden reemplazar por átomos de deuterio o tritio. De forma similar, uno o más átomos de

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carbono se pueden reemplazar por uno o más átomos de carbono-13. En algunos modos de realización, uno o más isótopos pueden estar presentes en un sustrato enzimático, por ejemplo, un naftol (tal como un naftol-fosfato), que reacciona con una enzima y un precursor de marca de masa para formar una marca de masa. De forma deseable, los isótopos están en la porción de la marca de masa que forma el código de masa después de la ionización, proporcionando de ese modo códigos en masa que tienen la misma estructura química pero masas diferentes.

Se divulgan especies adicionales de derivados de triarilmetano en la patente de EE. UU. N.° 6.780.981 y se divulgan tipos de técnicas de espectrometría de masas en la patente de EE. UU. N.° 7.198.893. Los compuestos divulgados en el presente documento incluyen la referencia a sustituyentes por grupos "R" o sustituyentes, tales como "R1". A menos que se indique de otro modo, R1 y R1 se pueden seleccionar de alifático, tal como alquilo, más típicamente alquilo inferior, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, etc., alquenilo, alquinilo, arilo, arilo alifático, tal como arilaquilo, hidrógeno, y deuterio; R2, R3, R4, R5 y R6 se pueden seleccionar de alifático, tal como alquilo, más típicamente alquilo inferior, tal como metilo, etilo, propilo, butilo, etc., alquenilo, alquinilo, arilo, arilo alifático, tal como arilalquilo, y restos que contienen heteroátomos donadores de electrones seleccionados de éter (RaORb), hidroxilo (RaOH), éter silílico (RaRbRcSiORd), fosfina (PRaRbRc), tiol (RaSH), tioéter/sulfuro (RaSRb), disulfuro (RaSSRb), isotiocianato (RaNCS), isocianato (RaNCO), amina (NH2, NHRa, NRaRb), amida (RaNRbC(O)Rc), éster (RaOC(O)Rb); R20 es un grupo aceptador de electrones, y se puede seleccionar de restos que contienen heteroátomos seleccionados de halógeno (I, Br, Cl, F), carbonato (RaOC(O)ORb), carboxilo (RaC(O)OH), carboxilato (RaCOO"), éster (RaC(O)ORb), cetona (RaC(O)Rb), fosfato (RaOP(O)OH2), fosforilo (RaP(O)(OH)2), sulfinilo (RaS(O)Rb), sulfonilo (RaSO2Rb), carbonotioilo (RaC(S)Rb o RaC(S)H), sulfino (RaS(O)OH), sulfo (RaSO3H), amida (RaC(O)NRbRc), acida (N3), nitrilo (RaCN), isonitrilo (RaNO-) y nitro (RaNO2). Con referencia a todos los restos que contienen heteroátomos divulgados en el presente documento, Ra representa uno o más de los anillos de arilo de los códigos de masa/marcas de masa/precursores de marcas de masa diazoicos, de naftol o de triarilmetano descritos en el presente documento; y Rb, Rc y Rd son independientemente hidrógeno, alifático, arilo, heteroalifático, heteroarilo, y cualquier combinación de los mismos. A menos que se indique de otro modo, R9 puede ser cualquier grupo que se pueda formar, o que se pueda retirar para formar, un ion, típicamente un carbocatión. Los grupos R9 ejemplares pueden incluir halógenos (flúor, cloro, bromo y yodo), nitrilos (CN), grupos sulfonilo, tales como mesilo (Ms), tosilo (Ts), trifluorometilo (Tf), hidroxilo, éter, amina, tiol, tioéter y sales de los mismos. A menos que se indique de otro modo, R19 es cualquier grupo que puede formar, o que se puede retirar para formar, un carbocatión. Típicamente, R19 se selecciona de oxígeno, azufre, y -(nitrógeno-R11)-.

Uno cualquiera o más de R1, R1, R2, R3, R4, R5 y R6, en particular R2, R3, R4, R5 y R6, se pueden variar para producir

un compuesto de un peso molecular seleccionado particular. Por ejemplo, R1, R1, R2, R3, R4, R5 y/o R6 pueden ser

una especie, tal como halógeno o un isótopo estable, tal como deuterio, y se pueden usar para proporcionar una serie homóloga de marcas de diferentes pesos moleculares. En algunos modos de realización, uno o más átomos de carbono del anillo se pueden reemplazar con uno o más isótopos 13C y/o 14C para proporcionar una serie homóloga de marcas de diferentes pesos moleculares. A menos que se indique de otro modo, R16 se selecciona de éter, hidroxilo, -(nitrógeno-R11)-; R17 se selecciona de alifático, heteroalifático, arilo y heteroarilo; Y se selecciona de oxígeno, azufre y -(nitrógeno-R11)-; y R11 se selecciona de alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo e hidrógeno.

IV. Tiramina y derivados de tiramina

En algunos modos de realización, los precursores de marcas de masa se conjugan con una tiramina o un derivado de tiramina. Los modos de realización particulares utilizan tiramina para la formación de conjugados. Un conjugado de precursor de marca de masa que comprende una tiramina o derivado de tiramina tiene típicamente la siguiente fórmula general 34.

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Algunos modos de realización utilizan derivados de tiramina para el conjugado de precursor de marca de masa. Estos derivados de tiramina tienen la siguiente fórmula general 35, en la que n es de 1 a 20.

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Fórmula 35

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V. Conectores opcionales

Determinados modos de realización incluyen el uso de un conector, que se usa para acoplar un resto a un segundo resto. Por ejemplo, se pueden usar conectores para acoplar, tal como para unir de manera covalente o electrostática, un precursor de marca de masa a una tiramina o un derivado de tiramina. Estos conectores se pueden seleccionar de cualquier resto que puede acoplar eficazmente dos restos, tales como un precursor de marca de masa y una tiramina o derivado de tiramina, incluyendo conectores alifáticos, heteroalifáticos o heterobifuncionales.

En modos de realización particulares, el conector opcional puede tener la siguiente fórmula 36.

O

ffR18^X-CH2{X-CH2-CH2)^

Fórmula 36

Con referencia a la fórmula 36, cada X independientemente se selecciona de CH2, oxígeno, azufre y -(nitrógeno- R11)-. R18 es carbonilo o sulfoxilo; n es 1-20; y p es 0 o 1.

Otros modos de realización utilizan conectores de polietilenglicol, que tienen una fórmula general PEGn, en la que n es 1-20, típicamente de 4 a 12.

VI. Transportadores

Determinados modos de realización utilizan transportadores como forma de administrar múltiples marcas de masa, restos de tiramina o derivados de tiramina a la diana. Los restos transportadores pueden facilitar el depósito del precursor de marca de masa próximo a la diana. En modos de realización divulgados particulares, se puede usar un transportador para facilitar la formación de enlaces covalentes de conjugados de precursor de marca de masa que comprenden tiramina o un derivado de tiramina a la diana, proporcionando una señal incrementada potencial producida por el código de masa tras la escisión y la ionización.

Los transportadores se pueden seleccionar de polímeros, biomoléculas, liposomas, micelas o nanopartículas. Los polímeros ejemplares incluyen polímeros lineales, tales como poliácido (más típicamente poli(ácido acrílico)), poliamina (más típicamente poli-L-lisina), polisacárido (más típicamente dextrano o quitosano), polihidracina o un copolímero. Otros polímeros ejemplares son polímeros hiperramificados, tales como polietilenimina o un dendrímero. Las biomoléculas ejemplares incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, ácidos nucleicos, ADN, ARN, oligosacáridos, polisacáridos y monómeros de los mismos. Estos transportadores se seleccionan para unir restos de marca de masa, restos de tiramina y/o restos de derivados de tiramina individuales o múltiples. Típicamente, la unión se produce por medio de restos tiol, amina, ácido carboxílico, hidroxilo, haluro, anhídrido o hidracina localizados en el polímero y/o biomolécula.

Los transportadores de nanopartículas típicamente comprenden un material semiconductor, un metal o múltiples metales. Los metales se seleccionan de los grupos 3-15 de la tabla periódica, tales como Y, La, Ag, Au, Pt, Ni, Pd, Rh, Ir, Co, Cu y Bi, o una combinación de los mismos. Las nanopartículas se unen típicamente a un ligando de marca de masa, tiramina y/o derivado de tiramina, o múltiples de dichos restos, a través de un resto de unión, tal como un grupo tiol, un grupo amina, un grupo hidroxilo o un grupo fosfina localizado en la marca de masa, tiramina o derivado de tiramina.

VII. Conjugados de resto de unión específica/enzima

Los modos de realización particulares también se refieren a conjugados que comprenden una enzima acoplada, típicamente que se une de forma covalente, a un resto de unión específica, como se muestra en la fórmula general 37. La enzima puede ser cualquier enzima que puede reconocer un resto de sustrato enzimático conectado a una marca de masa u otra especie. El resto de unión específica puede ser cualquier especie que se puede unir a una diana o a un epítopo.

Enzima - resto de unión específica Fórmula 37

El resto de unión específica puede ser una proteína, un péptido, un anticuerpo, un oligómero, una lectina y/o un ácido nucleico, tal como ADN o ARN, como se indica a continuación.

Enzima - Proteína Enzima - ADN

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Enzima - Anticuerpo

Enzima - ARN

La enzima se une a cualquier resto de unión específica que puede reconocer específicamente una diana. Determinados modos de realización particulares se refieren a fosfatasa alcalina, galactosidasas y lactamasas conjugadas con restos de unión específica, como se muestra a continuación.

Fosfatasa alcalina - Resto de unión específica

Galactosidasa - Resto de unión específica

p-lactamasa - Resto de unión específica

Determinados modos de realización divulgados de conjugados de resto de unión específica/enzima incluyen un anticuerpo unido de forma covalente a fosfatasa alcalina, mostrado en la fórmula 38. Este conjugado se puede usar para escindir enzimáticamente un resto de sustrato enzimático, que posteriormente reaccionará con una marca de masa.

Fosfatasa Alcalina - Anticuerpo Fórmula 38

VIII. Procedimientos sintéticos

Determinados modos de realización divulgados de marcas de masa, tales como compuestos a base de triarilmetano, están disponibles comercialmente. Se pueden realizar otros modos de realización tal como reconocerá un experto en la técnica. El esquema 13 ilustra un modo de realización de un procedimiento para preparar compuestos de triarilmetano particulares que son útiles como marcas de masa de acuerdo con determinados modos de realización divulgados. Como se ilustra en el esquema 13, el compuesto de partida 136, 2-(4-bromofenoxi)etanol, está disponible comercialmente, tal como de Aldrich Chemical Co. El compuesto 136 se convierte en el derivado litiado 138 por reacción con n-butillitio. El compuesto 138 es un buen nucleófilo para la reacción con derivados de carbonilo, por ejemplo, el compuesto 140, tal como 4,4'-(dimetilamino)benzofenonona. Un experto en la técnica reconocerá que se puede usar cualquier derivado de benzofenona disponible comercialmente, tal como 4,4'- bis(dimetilamino)benzofenona, 4,4'-bis(dietilamino)benzofenona, 4,4'-dimetoxibenzofenona, ácido 4-benzoilbenzoico, benzofenona-4-isotiocianato y 4-aminobenzofenona. La reacción con el compuesto 140 produce el derivado de triarilmetano hidroxilado 142, que se puede convertir en el correspondiente compuesto de nitrilo 144 por reacción con cianuro de potasio (KCN). A continuación, el compuesto 144 se convierte en el conjugado 146, que es adecuado para una reacción enzimática, usando oxicloruro de fósforo (POCh).

imagen50

El esquema 14 ilustra un modo de realización para un procedimiento para preparar un sustrato tanto para la peroxidasa de rábano picante (HRP) como para la fosfatasa alcalina. El compuesto 148, 2-metilbenzotiazol, 5 disponible comercialmente de Aldrich, se hace reaccionar con para-anisaldehído 150 (4-metoxibenzaldehído, que también está disponible comercialmente de Aldrich), para formar la olefina 152. A continuación, la olefina 152 se hace reaccionar con ácido yodhídrico (HI) para formar el fenol 154. El fenol 154 es un sustrato adecuado para HRP. El fenol 154 también se puede convertir en un sustrato adecuado para la fosfatasa alcalina haciendo reaccionar el fenol 154 con oxicloruro de fósforo (POCh) para producir el fosfato 156.

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El esquema 15 ilustra un modo de realización de un procedimiento para preparar un sustrato para -lactamasa. En este ejemplo, un derivado de cefalosporina 158 se hace reaccionar con el compuesto 160 para producir un sustrato 15 adecuado para una -lactamasa 162.

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El esquema 16 ilustra un modo de realización para sintetizar precursores de marcas de masa de nitrofenilo. Como se muestra en el esquema 16, los compuestos de marca de masa de nitrofenilo se pueden sintetizar usando síntesis en fase sólida. Un compuesto de nitrofenilo 166 se carga en una resina de cloruro de tritilo 164. El grupo protector Fmoc de la amina protegida 168 se retira en condiciones básicas para proporcionar una amina 170, que se acopla adicionalmente usando condiciones de acoplamiento peptídico para dar lugar a una amina acoplada a aminoácido 172. Esta etapa se puede repetir para conjugar tantos aminoácidos o conectores como se desee, en particular para dar lugar al péptido 174. El precursor de marca de masa deseado 176 se libera de la resina en condiciones ácidas.

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Ismioma 16

El esquema 17 ilustra un modo de realización de un procedimiento para preparar un conjugado de precursor de marca de masa particular. En este esquema, una marca de masa de nitrofenilo se acopla a una tiramina a través de una secuencia de acoplamiento. El ácido carboxílico 176 se somete a una reacción de esterificación usando diciclohexilcarbodiimida (DCC) y N-hidroxisuccinimida para proporcionar el éster activado 178. A continuación, el éster 178 se puede convertir en el conjugado de precursor de marca de masa 180 usando tiramina.

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El esquema 18 ilustra un modo de realización de un procedimiento para preparar un conjugado de precursor de marca de masa particular. En el esquema 18, un ácido carboxílico disponible comercialmente 182 se acopla a un resto de tiramina esterificada 184. La amida resultante 186 se quela con níquel para proporcionar el quelato 188, seguido de la quelación del níquel a un dímero de histidina 190 para dar la marca de masa 192.

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Un modo de realización de un procedimiento para preparar un par precursor de marca de masa marcada con isótopo estable que puede reaccionar con naftol-fosfato en presencia de una fosfatasa, por ejemplo, fosfatasa alcalina, para 5 producir tintes arilazoicos se ilustra a continuación en el esquema 19. El par precursor de marca de masa es adecuado para su uso en un ensayo multiplexado, tal como un ensayo doble, para detectar y cuantificar dos biomarcadores, o dos formas de un único biomarcador, en una muestra de tejido. Se puede usar un par precursor de marca de masa radiomarcada, por ejemplo, para detectar cantidades relativas de biomarcadores RE y RP de cáncer de mama en una muestra de tejido. En algunos modos de realización, se puede usar el par precursor de marca de 10 masa radiomarcada para detectar dos formas de un biomarcador, tal como Her2 intacto y Her2 truncado.

La anilina 194 y análogos de anilina deuterados, tales como anilina-d5 198, se convierten en cationes de bencenodiazonio 196 y 200, respectivamente, por reacción con nitrito de sodio y ácido (por ejemplo, ácido tetrafluorobórico) para producir una sal de diazonio "ligera" que se puede usar para producir un precursor de marca 15 de masa "ligero" y una sal de diazonio "pesada" que se puede usar para producir un precursor de marca de masa "pesado":

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Las sales de diazonio reaccionan con un naftol-fosfato en presencia de una enzima fosfatasa para producir un precursor de marca de masa de tinte azoico, que precipita como marca de masa, que es ionizable para producir iones indicadores, o códigos de masa, con la misma estructura química pero teniendo pesos moleculares que difieren en tan poco como 1 dalton, y quizás 2-5 daltons (esquema 20).

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Se pueden usar otros análogos de anilina deuterados. Los análogos de anilina deuterados adecuados tienen la fórmula general

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Fórmula 39

donde n es 1,2, 3, 4 o 5; preferentemente n es 2-5.

15 En otro modo de realización, se puede usar Fast Blue BB para preparar análogos de diazonio marcados con isótopos estables que pueden reaccionar con un naftol-fosfato, tal como en un ensayo multiplexado para detectar y cuantificar múltiples biomarcadores. Los análogos Fast Blue BB tienen una fórmula general

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donde n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. R1 y R1 son independientemente alquilo, preferentemente alquilo inferior, y pueden incluir uno o más isótopos. Los grupos R1 y R1 adecuados incluyen, por ejemplo, -CD3 y -CD2CD3.

En modos de realización particulares, un conjunto de análogos de sal de diazonio pueden reaccionar con un naftol-

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fosfato en un ensayo cuádruple para detectar y cuantificar hasta cuatro biomarcadores, tales como un ensayo para los marcadores de cáncer de mama RE, RP, Her2 y Ki67. En este ejemplo, las sales de diazonio incrementan su peso molecular en incrementos de 5 daltons.

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Fas'. Bine BB miz 312 13

m/7 317.17

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:d2cd:,

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Aunque los ejemplos precedentes ilustran el marcaje isotópico con deuterio, se pueden usar otros isótopos estables. Por ejemplo, se pueden reemplazar átomos de hidrógeno por átomos de tritio, se pueden reemplazar átomos de carbono por isótopos 13C, se pueden reemplazar átomos de nitrógeno por isótopos 15N, y/o se pueden reemplazar átomos de oxígeno por isótopos 17O. También se contempla que se puede usar una mezcla de isótopos, por ejemplo, 2H y 13C, para crear una mayor variedad de precursores de marcas de masa marcadas con isótopos estables.

En algunos modos de realización, los precursores radiomarcados, por ejemplo, anilina-d5, pueden estar disponibles comercialmente. En otros modos de realización, las marcas de masa se pueden sintetizar o marcar con isótopos usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica de síntesis orgánica. El marcaje isotópico se puede realizar con cualquier marca de masa, precursor de marca de masa, marca de masa, código de masa y/o resto de sustrato enzimático divulgado en el presente documento para producir una serie de dos o más marcas de masa, precursores de marcas de masa, códigos de masa y/o restos de sustrato enzimático adecuados para su uso en ensayos multiplexados para producir dos o más códigos de masa que tienen la misma estructura química pero pesos moleculares diferentes.

Las marcas de masa marcadas con isótopos adecuadas difieren en masa lo suficiente como para producir códigos de masa que se pueden distinguir entre sí durante la detección por espectrometría de masas. Un espectrómetro de masas puede distinguir códigos de masa que difieren en masa solo en 1 dalton. En consecuencia, las marcas de masa marcadas con isótopos útiles difieren en masa al menos en un dalton. En algunos modos de realización, las marcas de masa marcadas con isótopos difieren entre sí en masa en de al menos 1 dalton a al menos 50 daltons, más típicamente de al menos 1 dalton a aproximadamente 20 daltons, incluso más típicamente de al menos 1 dalton a aproximadamente 10 daltons, ejemplificando los modos de realización de trabajo por una diferencia de masa de 15 daltons, tal como por 1, 2, 3, 4 o 5 daltons. En ejemplos de trabajo particulares, las marcas de masa marcadas con isótopos difieren entre sí en masa en 5 daltons.

Debido a los isótopos naturales, se espera que cualquier marca de masa dada, y su correspondiente código de masa, tengan cierta variabilidad en su peso molecular. Por ejemplo, algunas moléculas pueden contener uno o más átomos de deuterio de "naturales", átomos de tritio, átomos 13C, átomos 14C, átomos 15N, etc. Por tanto, un código de masa dado puede producir picos de EM en el valor m/z esperado, x, así como picos progresivamente más pequeños que tienen valores m/z de x+n donde n es un número entero. En modos de realización particulares, n varía de 1 a 3 o de 1 a 4. Típicamente, no se observan picos a x +4 o mayor. Por ejemplo, un ion indicador con una m/z esperada de 482 típicamente generará picos progresivamente más pequeños a 483, 484 y 485. Aunque los códigos en masa que tienen una diferencia de m/z de solo 1 dalton se pueden detectar por separado, si los pares marcados con isótopos tienen una diferencia de masa de menos de 4 daltons, puede existir al menos algo de solapamiento entre los picos de EM producidos por los dos códigos de masa. Cualquier solapamiento significativo puede reducir la exactitud cuando se cuantifica la cantidad de códigos de masa correspondientes a cada diana dentro de la muestra de tejido. Una diferencia de masa de al menos 4 daltons, o al menos 5 daltons, proporciona un solapamiento insignificante o nulo entre los picos de EM producidos por los códigos de masa. Por tanto, en algunos modos de realización, la diferencia de masa entre cualquier par dado de marcas de masa marcadas con isótopos estables, precursores de marcas de masa, o códigos de masa que tienen la misma estructura química es de al menos 4 daltons. En modos de realización particulares, la diferencia de masa es de al menos 5 daltons. La FIG. 8 representa

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el espectro de masas esperado de los cuatro iones indicadores producidos a partir de marcas de masa formadas cuando los cuatro precursores de marcas de masa de Fast Blue BB mostrados anteriormente reaccionan con naftol- fosfato en presencia de una enzima fosfatasa, y las marcas de masa posteriormente se ionizan en un espectrómetro de masas.

IX. Dianas

Los modos de realización particulares se refieren al uso de secuencias de ácido nucleico o proteínas (por ejemplo, Her1, Her2, Her3, Her4, RE, RP y p95Her2) o combinaciones de ácidos nucleicos o proteínas, como dianas en el análisis de multiplexación, en particular cuando dicha detección proporciona mejores capacidades de diagnóstico para una enfermedad particular. En toda la presente divulgación, cuando se hace referencia a una proteína diana, se entiende que las secuencias de ácido nucleico asociadas a dicha proteína también se pueden usar como diana. En algunos ejemplos, la diana es una proteína o molécula de ácido nucleico de un patógeno, tal como un virus, bacteria o parásito intracelular, tal como de un genoma vírico. Como otro ejemplo, una proteína diana se puede producir a partir de una secuencia de ácido nucleico diana asociada con (por ejemplo, correlacionada con, implicada causalmente en, etc.) una enfermedad.

Una secuencia de ácido nucleico diana puede variar sustancialmente de tamaño. La secuencia de ácido nucleico puede tener un número variable de residuos de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico diana puede tener al menos aproximadamente 10 residuos de ácido nucleico, o al menos aproximadamente 20, 30, 50, 100, 150, 500, 1000 residuos. De forma similar, un polipéptido diana puede variar sustancialmente de tamaño. El polipéptido diana incluirá al menos un epítopo que se une a un anticuerpo específico de péptido, o fragmento del mismo. En algunos modos de realización, ese polipéptido puede incluir al menos dos epítopos que se unen a un anticuerpo específico de péptido, o fragmento del mismo.

En ejemplos específicos, se produce una proteína diana por una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) asociada con una neoplasia (por ejemplo, un cáncer). Se han identificado numerosas anomalías cromosómicas (incluyendo translocaciones y otros reordenamientos, amplificación o deleción) en células neoplásicas, en especial en células cancerosas, tales como leucemias de linfocitos B y linfocitos T, linfomas, cáncer de mama, cáncer de colon y cánceres neurológicos. Por lo tanto, en algunos ejemplos, al menos una porción de la molécula diana se produce por una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) amplificada o delecionada en al menos un subconjunto de células en una muestra. En un ejemplo, se selecciona la secuencia de ácido nucleico diana genómico para que incluya un gen (por ejemplo, un oncogén) que se reduplica en una o más neoplasias malignas (por ejemplo, una neoplasia maligna humana). Por ejemplo, Her2, también conocido como c-erbB2 o Her2/neu, es un gen que desempeña un papel en la regulación del crecimiento celular (se proporciona una secuencia genómica de Her2 humana representativa en el n.° de acceso de GENBANK™ NC_o0oO17, nucleótidos 35097919-35138441) El gen codifica un receptor de superficie celular transmembranario de 185 kd que es miembro de la familia de la tirosina cinasas. Her2 se amplifica en cáncer de mama, ovárico y otros tipos de cánceres humanos. Por lo tanto, se puede usar un gen Her2 (o una región del cromosoma 17 que incluye el gen Her2) como secuencia de ácido nucleico diana genómico, o se puede usar su producto proteínico como proteína diana. Otras proteínas relevantes de cáncer de mama incluyen RE, RP y Ki67.

Se sabe que los oncogenes son responsables de varias neoplasias malignas humanas. Por ejemplo, los reordenamientos cromosómicos que afectan al gen SYT localizado en la región del punto de ruptura del cromosoma 18q11.2 son comunes entre los tumores de partes blandas de sarcoma sinovial. La translocación t(18q11.2) se puede identificar, por ejemplo, usando sondas con diferentes marcadores: la primera sonda incluye moléculas de ácido nucleico de FPC generadas a partir de una secuencia de ácido nucleico diana que se extiende distalmente desde el gen SYT, y la segunda sonda incluye ácido nucleico de FPC generado a partir de una secuencia de ácido nucleico diana que se extiende en 3' o próxima al gen SYT. Cuando se usan sondas que corresponden a estas secuencias de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico diana genómico) en un procedimiento de hibridación in situ, las células normales, que carecen de una t(18q 11.2) en la región del gen SYT, presentan dos señales de fusión (generadas por los dos marcadores en estrecha proximidad), lo que refleja las dos copias intactas de SYT. Las células anómalas con una t(18q11.2) presentan una única señal de fusión.

En otros ejemplos, se selecciona una proteína diana producida a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) que es un gen supresor de tumor que se deleciona (se pierde) en células malignas. Por ejemplo, la región p16 (incluyendo D9S1749, D9S1747, p16(INK4A), p14(ARF), D9S1748, p15(INK4B) y D9S1752) localizada en el cromosoma 9p21 se deleciona en determinados cánceres de vejiga. Las deleciones cromosómicas que implican la región distal del brazo corto del cromosoma 1 (que engloba, por ejemplo, SHGC57243, TP73, EGFL3, AbL2, ANGPTL1 y SHGC-1322) y la región pericentromérica (por ejemplo, 19p13-19q13) del cromosoma 19 (que engloba, por ejemplo, MAN2B1, ZNF443, ZNF44, CRX, GlTSCr2 y GLTSCR1) son rasgos distintivos moleculares característicos de determinados tipos de tumores sólidos del sistema nervioso central.

Los ejemplos mencionados anteriormente se proporcionan solo con fines de ilustración y no pretenden ser limitantes. Numerosas otras anomalías citogenéticas que se correlacionan con enfermedades, tales como

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transformación y/o crecimiento neoplásico, son conocidas por los expertos en la técnica, o se descubrirán a continuación en el presente documento. Las proteínas diana que se producen por secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico diana genómico), que se han correlacionado con la transformación neoplásica son útiles en los procedimientos divulgados.

En otros ejemplos, una proteína diana se selecciona de un virus u otro microorganismo asociado con una enfermedad o afección. La detección de la secuencia de ácido nucleico diana derivado de virus o microorganismo (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) en una muestra de célula o tejido es indicativa de la presencia del organismo. Por ejemplo, el péptido, polipéptido o proteína diana se puede seleccionar del genoma de un virus oncógeno o patógeno, una bacteria o un parásito intracelular (tal como, Plasmodium falciparum y otras especies de Plasmodium, Leishmania (sp.), Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, así como especies de Toxoplasma, Eimeria, Theileria y Babesia). En algunos ejemplos, la proteína diana se produce a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) a partir de un genoma vírico.

En determinados ejemplos, la proteína diana se produce a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) de un virus oncógeno, tal como el virus de Epstein-Barr (VEB) o un papilomavirus humano (PVH, por ejemplo, PVH16, PVH18 ) En otros ejemplos, la proteína diana producida a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico diana genómico) es de un virus patógeno, tal como un virus respiratorio sincicial, un virus de la hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis C), un coronavirus (por ejemplo, el virus del SRAG), un adenovirus, un poliomavirus, un citomegalovirus (CMV) o un virus del herpes simple (VHS).

X. Procedimiento de uso de los modos de realización divulgados del conjugado de precursor de marca de masa

Los modos de realización divulgados en el presente documento se refieren a un procedimiento para obtener imágenes y/o cuantificar una o más dianas en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido tal como una muestra de tejido fijado con formol e incluido en parafina, usando precursores de marcas de masa, marcas de masa, códigos de masa y técnicas de espectrometría de masas (EM), tales como desorción/ionización por láser, incluyendo desorción/ionización por láser (lDi). Algunos modos de realización usan un sustrato enzimático y un precursor de marca de masa separado. La enzima convierte el sustrato en una especie activa que puede reaccionar con el precursor de marca de masa para depositar una marca de masa, tal como por precipitación, en el sitio diana. Otros modos de realización particulares se refieren al uso de un sustrato enzimático y un conjugado de precursor de marca de masa. La enzima convierte el conjugado de precursor de marca de masa en una especie activada que está acoplada eficazmente (por ejemplo unida de forma covalente) a restos de tirosina próximos a la diana, tal como en restos de tirosina en la enzima, en el resto de unión específica, o en la diana.

En determinados modos de realización que se refieren a muestras que tienen múltiples dianas, cada diana se identifica y se detecta usando una marca de masa, típicamente una marca de masa diferente. Para determinados modos de realización divulgados, las marcas de masa tienen la misma estructura química pero incluyen diferentes isótopos y/o diferentes cantidades de un isótopo particular de modo que cada marca de masa tiene una masa diferente. El uso de marcas de masa con la misma estructura química facilita la cuantificación de dianas exacta, en el que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de la diana.

Una muestra que tiene una diana de interés se pone en contacto en primer lugar con una enzima, que se puede acoplar a un resto de unión específica que reconoce una diana particular, o región de una diana, tal como un epítopo. A continuación, se expone la muestra al conjugado o a una pluralidad de dichos conjugados. Se deposita una marca de masa en el sitio de una diana en una muestra, tal como por precipitación, en la diana para para la detección posterior por EM en forma de un código de masa (un ion).

Las marcas de masa como se describe en el presente documento se depositan (de forma covalente o no covalente) o precipitan en una localización diana, o múltiples localizaciones diana, donde se exponen a ionización iniciada por láser, produciendo códigos de masa, que se detectan usando espectrometría de masas LDI. Sin embargo, se contempla que las tecnologías de espectrometría de masas adicionales son adaptables y susceptibles para las composiciones divulgadas para la identificación de dianas en tejido. Por ejemplo, la espectrometría de masas con desorción/ionización por electronebulización (DESI; Wiseman et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. 105:18120-18125), espectroscopía de masas de iones secundarios (SIMS; Boxer et al., 2009, Annu. Rev. Biophys. 38:53-74), espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo con ablación por láser (LA-ICP; Becker et al., 2010, Mass. Spectrom. Rev. 29:156-175), y espectrometría de masas a presión ambiente para descarga luminiscente de flujo a presión atmosférica con ablación por láser (LA-FAPA; Shelley et al., Anal. Chem. 2008, 80, 8308-8313) son tecnologías conocidas en la técnica que se podrían adaptar para su uso en la identificación de dianas en tejido usando el conjugado de precursor de marca de masa divulgado. Como tales, los modos de realización divulgados en el presente documento no se limitan al procedimiento de espectrometría de masas utilizado con fines de detección.

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Una representación general de un modo de realización de un procedimiento para el uso del depósito de marcas de masa se proporciona en la FIG. 1. La FIG. 1 ilustra una diana 2, que se marca en primer lugar con un conjugado de anticuerpo-enzima 4 de modo que el anticuerpo se une específicamente a un epítopo diana o una sonda hibridada a una secuencia diana de ácido nucleico. Se añade el conjugado 4 a una concentración y de una manera eficaz para permitir que el anticuerpo (u otro resto de unión específica) detecte la diana 2. A continuación se expone la muestra a una solución de sustrato enzimático o una mezcla de sustrato y precursores de marcas de masa 6 de forma simultánea o secuencial de modo que, después de la reacción enzimática, se depositan las marcas de masa 8 en el sitio de la diana 2 para producir un precipitado de marcas de masa 8 localizado en la diana 2. Estas marcas de masa 8 se ionizan fácilmente en códigos de masa 10 y se desorben de la muestra por irradiación por láser, y se detectan adicionalmente en un detector de masa (TOF, por ejemplo).

La FIG. 2 ilustra un modo de realización divulgado particular del procedimiento divulgado. Se acopla el conjugado 12 que comprende un sustrato enzimático 14 (típicamente un sustrato hidrófilo) a un precursor de marca de masa 18. Se puede acoplar el sustrato enzimático 14 directamente al precursor de marca de masa 18, o se puede acoplar opcionalmente al precursor de marca de masa por un conector 16. En presencia de una enzima, se separa el sustrato enzimático 14 del conjugado 12 para producir una marca de masa insoluble en agua 20 en una localización diana deseada, tal como por precipitación. Se forma un código de masa 22, tal como por ionización iniciada por láser, para producir una señal detectable por EM.

La FIG. 3 es un diagrama esquemático que ilustra la detección de una diana en una muestra usando un conjugado 24. El conjugado 24 comprende un sustrato enzimático 26 (por ejemplo, un sustrato enzimático) acoplado a un precursor de marca de masa 30 por un conector de oxi-etileno 28. Una enzima, por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP), escinde el sustrato enzimático 26 del conjugado 24 para producir una marca de masa insoluble en agua 32. Se forma el código de masa 34 a partir de la marca de masa insoluble en agua 32, tal como por ionización iniciada por láser. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que se pueden usar otros tipos de enzimas y por tanto, restos de sustrato enzimático para practicar modos de realización particulares.

La FIG. 4 es una representación esquemática de otro modo de realización divulgado del procedimiento actual. La FIG. 4 ilustra el uso de una enzima 38 para convertir un sustrato 36 en una especie "activa" 40. El término "activo" en este contexto se refiere a un compuesto que puede reaccionar o interactuar con un precursor de marca de masa 42 para depositar una marca de masa 44, tal como por precipitación, en un sitio diana deseado. Por ejemplo, la especie activa 40 podría ser un agente reductor que dona uno o más electrones al precursor de marca de masa soluble en agua 42 para producir una marca de masa insoluble en agua 44 en la localización diana deseada. A continuación se convierte el precipitado en un código de masa 46, tal como por el uso de un láser LDI.

Una representación general de un modo de realización de un procedimiento para el uso de un conjugado de precursor de marca de masa se proporciona en la FIG. 5. Se une un conjugado de enzima-resto de unión específica 54, que comprende una enzima 48 y un anticuerpo 50, a una diana 52 en una muestra. A continuación se añade un conjugado de precursor de marca de masa 56, que comprende una tiramina o un derivado de tiramina, a la muestra. La enzima 48 actúa para acoplar eficazmente el conjugado 54 próximo a la diana 52, la enzima 48 o el anticuerpo 50 para producir el complejo 58.

También se pueden usar el precursor de marca de masa, y tiramina o derivado de tiramina, o múltiples de dichos restos, conjuntamente con polímeros, biomoléculas y/o nanopartículas para lograr el depósito de múltiples tiraminas, derivados de tiramina y marcas de masa, incrementando así las posibilidades de detección fiable. La FIG. 9 ilustra modos de realización de los transportadores, tales como polímeros y biomoléculas, que pueden unir múltiples precursores de marcas de masas, restos de tiramina y/o derivados de tiramina. Se puede usar un transportador polimérico lineal 68 para unir múltiples restos de tiramina 70 y acoplar eficazmente los restos de tiramina con un precursor de marca de masa 72. Se pueden usar polímeros hiperramificados 74 de la misma manera que las biomoléculas, tal como la proteína 76.

En modos de realización ilustrativos, se divulga un análisis multiplexado de una muestra. Un modo de realización multiplexado de este tipo se ilustra en la FIG. 10. Una muestra 78 incluye una pluralidad de diferentes dianas 80, 82 y 84. Se pone en contacto la muestra 78 con un primer conjugado 86 que comprende un resto de unión específica 100, tal como un anticuerpo, y una enzima 88 de una manera eficaz para permitir que el resto de unión específica se una a la diana 80. A continuación se trata el complejo resultante con un sustrato S1 adecuado para la enzima particular 88 para precipitar una marca de masa MT1 en la diana 80. La FIG. 10 ilustra el uso de fosfatasa alcalina y una etapa de desactivación enzimática para desactivar la enzima 88 del conjugado 86 antes de poner en contacto la muestra 78 con un segundo conjugado 102. Un experto en la técnica apreciará que no es necesario que las enzimas sean iguales. En modos de realización en los que se usan diferentes enzimas, puede que no sea necesaria una etapa de desactivación enzimática. El conjugado 102 comprende un resto de unión específica 104, tal como un anticuerpo, y una enzima 106, tal como hRp. A continuación se pone en contacto la muestra con un sustrato S2 para que la enzima 106 precipite una marca de masa MT2 en la diana 82. Se realiza una etapa de desactivación para desactivar la segunda enzima. La FIG. 10 ilustra una tercera diana 84 y un tercer conjugado 110 que comprende el resto de unión específica 108 y la enzima 112. A continuación se trata la muestra 78 con el sustrato S3 adecuado para la reacción con la enzima 112, precipitando de ese modo una marca de masa MT3 en la diana

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84. Una vez que se detectan todas las dianas deseadas con un conjugado adecuado que tiene un resto de unión específica apropiado, se irradia la muestra, tal como usando un láser LDI, para producir códigos de masa en las dianas que se pueden detectar usando una técnica de EM adecuada.

Determinados ejemplos divulgados de análisis multiplexado incluyen el uso de una primera enzima para producir una primera marca de masa para detectar una primera diana, y a continuación el uso de una segunda enzima para detectar una segunda diana. Por ejemplo, se puede detectar una primera diana en una muestra usando un enfoque de depósito de marca de masa catalizada por fosfatasa alcalina, como se analiza anteriormente. Se puede detectar una segunda diana usando una segunda enzima, tal como peroxidasa de rábano picante. Un experto en la técnica apreciará que se pueden detectar incluso dianas adicionales usando aún una tercera, o incluso más, reacciones enzimáticas para depositar una marca de masa en una diana en la muestra. Por tanto, este enfoque de detección se denomina sistema de pluralidad de enzimas, tal como sistema dual de enzimas.

No es necesario usar una pluralidad de enzimas. En cambio, se puede usar una única enzima, con una pluralidad de etapas de desactivación de enzimas intermedias. Por ejemplo, se puede detectar una primera diana por una primera reacción enzimática. A continuación se desactiva la enzima residual de la primera alícuota. Por ejemplo, se puede usar peroxidasa de rábano picante, y después de que se deposita una primera marca de masa en una primera diana, se puede desactivar la peroxidasa de rábano picante residual usando un exceso de peróxido de hidrógeno. A continuación se detecta la segunda diana usando una segunda marca de masa depositada usando una segunda reacción de peroxidasa de rábano picante. Los modos de realización particulares de un procedimiento de multiplexación se refieren al uso de un conjugado de precursor de marca de masa. Un modo de realización multiplexado de este tipo se ilustra en la FIG. 11 para detectar una pluralidad de dianas 114, 116 y 118. Un conjugado de precursor de marca de masa 120, que comprende una tiramina o derivado de tiramina, se une a una diana 114 próxima al primer conjugado de enzima-resto de unión específica 122, para formar el complejo de MT1. Una vez se ha formado el complejo de MT1, se obtiene la enzima desactivada 124 del primer conjugado de enzima- resto de unión específica por adición de un exceso de un reactivo de peróxido, en este caso peróxido de hidrógeno (H2O2) o una combinación de peróxido y EDTA. Después de esta etapa de desactivación, se lava la muestra para retirar el exceso de reactivo de peróxido. A continuación se añade un segundo conjugado de enzima-resto de unión específica 126 y se une a la diana 116. Se deposita un segundo conjugado de precursor de marca de masa 128 sobre un segundo sitio diana 116 para formar el complejo de MT2. Una vez se ha formado el complejo de MT2, se obtiene la enzima desactivada 130 del segundo conjugado de enzima-resto de unión específica por adición de un exceso de un reactivo de peróxido, en este caso peróxido de hidrógeno (H2O2) o una combinación de peróxido y EDTA. Después de esta etapa de desactivación, se lava la muestra para retirar el exceso de reactivo de peróxido. A continuación se añade un tercer conjugado de enzima-resto de unión específica 132 y se une a la diana 118. Se deposita un tercer conjugado de precursor de marca de masa 134 sobre un tercer sitio diana 118 para formar el complejo de MT3. Se puede repetir esta secuencia cualquier cantidad de veces para proporcionar múltiples complejos de marcas de masa-diana, 136, 138, 140 y 142. Tras la ionización de las marcas de masa, se produce una pluralidad de códigos de masa, 144, 146, 148 y 150, que se pueden detectar a continuación usando espectrometría de masas. Esta técnica de multiplexación proporciona la detección de múltiples dianas de interés en la misma muestra de tejido, que puede tener un valor médico significativo.

Los modos de realización de los precursores de marcas de masa marcadas con isótopos estables, marcas de masa y códigos de masa divulgados son adecuados para ensayos multiplexados, en los que se obtienen imágenes de múltiples dianas en una muestra, tal como una muestra de tejido, y se cuantifican usando marcas de masa y técnicas de EM. Las dianas adecuadas incluyen proteínas, péptidos y secuencias de ácido nucleico tales como secuencias de ADN y/o ARN de interés. En algunos modos de realización, las dianas son biomarcadores de cáncer. En determinados modos de realización, se inmoviliza una enzima en la diana. Se expone la enzima a un precursor de marca de masa y un resto de sustrato enzimático con el que la enzima puede reaccionar. La reacción forma un conjugado de precursor de marca de masa que comprende el resto de sustrato enzimático y el precursor de marca de masa, y se deposita la marca de masa próxima a la diana. Posteriormente se escinde un código de masa, o ion indicador, de la marca de masa y se detecta por espectrometría de masas.

Cuando están presentes múltiples dianas, se inmoviliza una enzima en cada una de las dianas. Se expone cada enzima a un precursor de marca de masa y un resto de sustrato enzimático con el que la enzima puede reaccionar, formando así marcas de masa próximas a cada diana. Posteriormente se escinde un código de masa, o ion indicador, de cada marca de masa y se detecta por EM. En algunos modos de realización, las dianas son biomarcadores de cáncer. En determinados modos de realización, la muestra es tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE).

La obtención de imágenes por espectrometría de masas a base de marcas de isótopos estables (SILMSI) tiene varias ventajas en comparación con el análisis de tejidos IHQ convencional. En algunos modos de realización, SILMSI proporciona una detección exacta para la cuantificación simultánea en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de múltiples biomarcadores de cáncer en tejido FFPE. En determinados modos de realización, las técnicas SILMSI demuestran una buena linealidad (por ejemplo, 0,96 < R2 < 0,99) dentro de un intervalo dinámico de 103 en la medición de intensidad de pico de espectrometría de masas. SILMSI proporciona información objetiva y cuantitativa para múltiples biomarcadores,

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mientras que típicamente las imágenes IHQ se evalúan subjetivamente por personal médico capacitado. SILMSI puede proporcionar a un médico información más exacta para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de un paciente, permitiendo de este modo al profesional idear un plan de tratamiento personalizado para el paciente.

En un modo de realización, se pone en contacto una primera diana con una primera enzima, que se puede acoplar a un resto de unión específica que reconoce la primera diana, o una región de la primera diana, tal como un epítopo, dentro de la muestra de tejido. A continuación se expone la muestra de tejido al resto de sustrato enzimático y un primer precursor de marca de masa. El resto de sustrato enzimático reacciona con la enzima y el precursor de marca de masa, depositando de ese modo una marca de masa en el sitio de la diana en una muestra, tal como por precipitación. Se pone en contacto una diana posterior con una enzima posterior, que se puede acoplar a un resto de unión específica que reconoce la diana posterior, o una región de la diana posterior. La enzima posterior puede ser igual que o diferente de la primera enzima. A continuación se expone la muestra al resto de sustrato enzimático y un precursor de marca de masa posterior. Se deposita una marca de masa en el sitio de la diana posterior en la muestra. La primera marca de masa y la marca de masa posterior tienen sustancialmente la misma estructura química, pero difieren en el peso molecular. Se varía el peso molecular reemplazando átomos particulares en la estructura química del precursor de marca de masa y/o el resto de sustrato enzimático con isótopos de esos átomos. Por ejemplo, se pueden reemplazar átomos de hidrógeno por átomos de deuterio. Posteriormente se escinden los códigos de masa de las marcas y se detectan por EM. Se cuantifican las cantidades de los códigos de masa para determinar las cantidades relativas de cada diana en la muestra.

Con referencia a las FIGS. 10 y 11, en algunos modos de realización, cada marca de masa (MT1, MT2 y MT3) tiene la misma estructura química, pero las marcas de masa difieren en el peso molecular debido a la presencia de isótopos. En dichos modos de realización, típicamente se usa una única enzima, con una pluralidad de etapas de desactivación de enzimas intermedias, puesto que cada marca de masa tiene la misma estructura química. Por ejemplo, se puede detectar una primera diana por una primera reacción enzimática. A continuación se desactiva la enzima residual de la primera reacción. Por ejemplo, se puede usar peroxidasa de rábano picante, y después de que se deposita una primera marca de masa en una primera diana, se puede desactivar la peroxidasa de rábano picante residual usando un exceso de peróxido de hidrógeno. A continuación se detecta la segunda diana usando una segunda marca de masa depositada usando una segunda reacción de peroxidasa de rábano picante.

Un modo de realización de un procedimiento para cuantificar una pluralidad de dianas (por ejemplo, biomarcadores de cáncer) en tejido FFPE se muestra en la FIG. 12. Se aplica un primer anticuerpo 152 que puede reconocer y unirse a un primer antígeno 154 (por ejemplo, un primer biomarcador) al tejido fijado con formol e incluido en parafina 156 montado sobre un portaobjetos. Se aplica un primer conjugado de anticuerpo-enzima 158 que puede reconocer y unirse al primer anticuerpo 152. En el modo de realización mostrado, el primer antígeno 154 es RE, y el conjugado anticuerpo-enzima 158 incluye fosfatasa alcalina 160. Se detecta el primer antígeno 154 añadiendo un sustrato enzimático 162 y una primera especie de diazonio 164. La enzima 160 reacciona con y activa el primer sustrato enzimático 162, que a continuación reacciona con el primer diazonio 164 para depositar una primera marca de masa 166 en la proximidad de la diana (es decir, antígeno 154), tiñendo así el primer antígeno 154 con una marca de masa 166 (por ejemplo, una marca de masa "ligera" que no incluye uno o más isótopos más pesados, tales como deuterio). Se desactiva el primer conjugado de anticuerpo-enzima 158 por cualquier medio adecuado incluyendo desactivación química o desactivación física. Se aplica un segundo anticuerpo 168 que puede reconocer un segundo antígeno 170 (por ejemplo, un segundo biomarcador) al tejido FFPE 156. (Típicamente, se detectan ambos antígenos en la misma sección de tejido en un único portaobjetos). Se aplica un segundo conjugado de anticuerpo-enzima 172 que puede reconocer y unirse al segundo anticuerpo 168. En el modo de realización mostrado, el segundo antígeno 170 es RP, y el segundo conjugado anticuerpo-enzima 172 incluye fosfatasa alcalina 174. Se detecta el segundo antígeno 170 añadiendo un sustrato enzimático 176 y una segunda sal de diazonio 178. Los sustratos enzimáticos 162 y 176 tienen la misma estructura química. La primera y segunda sales de diazonio 164 y 178 tienen la misma estructura química, pero difieren en el peso molecular. En el modo de realización mostrado, la segunda sal de diazonio 178 tiene la misma estructura química que la primera sal de diazonio 164, pero los átomos de hidrógeno se han reemplazado por deuterio. Un experto en la técnica entenderá que el procedimiento también se puede realizar utilizando la sal de diazonio pesada como primera sal de diazonio 164 y la sal de diazonio ligera como segunda sal de diazonio 178. La enzima 174 reacciona con y activa el segundo sustrato enzimático 176 y que a continuación reacciona con la segunda sal de diazonio 178 para depositar una segunda marca de masa 180 en la proximidad del segundo antígeno, tiñendo así el segundo antígeno 170 con una marca de masa pesada marcada con isótopo estable 184. El primer y segundo iones indicadores 182, 184 (o códigos de masa) se generan usando técnicas de desorción/ionización por láser (LDI), y el primer y segundo iones indicadores 182, 184 se detectan y se cuantifican por un espectrómetro de masas. Debido a que se usa el mismo sustrato enzimático, 162 y 176, con ambos antígenos 154, 170 y las sales de diazonio 164, 178 difieren solo en el peso molecular, los precipitados de tinte azoico (marcas de masa 166, 180) también tienen la misma estructura química y difieren solo en el peso molecular. Por tanto, la fragmentación en la fuente de las marcas de masa 166 y 180 tras la irradiación por láser tendrá la misma eficacia con ambos tintes azoicos y producirá los iones indicadores 182, 184 con la misma estructura química pero pesos moleculares diferentes. El espectro de masas esperado producido por los iones indicadores 182, 184 se muestra en la FIG. 13 (experimento 1).

Se detecta cada código de masa producido y se cuantifica la cantidad de código de masa en la sección de muestra

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de tejido. El tamaño de la sección de muestra de tejido depende, en parte, del tamaño del haz de láser. Por ejemplo, un haz de láser con un diámetro de 30 pm puede ionizar marcas de masa en una sección de 30 pm x 30 pm de la muestra de tejido. El haz de láser puede tener un diámetro que varía de unos pocos micrómetros a varios cientos de micrómetros. En algunos modos de realización, el haz de láser tiene un diámetro en el intervalo de 5-200 pm, 10100 pm, 15-75 pm o 20-50 pm. Por ejemplo, el diámetro del haz de láser puede ser de 10 pm, 15 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm o 100 pm.

En algunos modos de realización, después de que se hayan ionizado las marcas de masa en una sección de muestra de tejido, la muestra de tejido y el láser se mueven uno con respecto al otro. Por ejemplo, la muestra de tejido y/o el láser se resitúa de modo que el láser pueda ionizar marcas de masa en una sección posterior de la muestra de tejido. En determinados modos de realización, se resitúa la muestra de tejido y/o láser una pluralidad de veces, y se realiza la ionización/desorción por láser seguido de detección y cuantificación de códigos de masa, en los que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de una diana, para una pluralidad de secciones de muestra de tejido. En modos de realización particulares, se realiza un entramado, es decir, se mueve la muestra de tejido y/o láser en un patrón de tipo cuadrícula de modo que se ionizan las marcas de masa sustancialmente en cada sección de la muestra de tejido y los respectivos códigos de masa se detectan y cuantifican. Por ejemplo, si el haz de láser tiene un diámetro de 30 pm y el tamaño de muestra del tejido es de 0,9 mm x 1,2 mm, la muestra de tejido se "divide" en una cuadrícula de 30 x 40 secciones y se obtienen datos para las 1200 secciones resultantes.

Por tanto, los datos de imágenes de espectrometría de masas obtenidos se correlacionan con los puntos de coordenadas espaciales regularmente espaciados de la muestra de tejido, y cada punto puede contener información de espectrometría de masas de una pluralidad de códigos de masa. Los puntos de coordenadas regularmente espaciados tomados conjuntamente representan una 'imagen' de la muestra. Para visualizar los datos del espectro de masas en dos dimensiones que se correlacionan con las secciones de muestra, se extrae la información relevante de los espectros de masas en cada coordenada y se convierte en un único valor escalar en una matriz bidimensional. Por ejemplo, cuando se detectan dos o más dianas en una muestra, se extraen los datos correspondientes a los códigos de masa esperados de cada diana de los espectros de masas obtenidos para cada sección de muestra de tejido (o coordenada) y se cuantifican. Se puede utilizar un programa informático analítico de imágenes para convertir los datos en una imagen bidimensional. En un modo de realización particular, se desarrolló y usó un programa interno "Ventana Analytical Image".

Para cada diana de interés, se crea una imagen bidimensional. Cada imagen contiene una matriz bidimensional de datos cuantitativos (numéricos) que se correlacionan con el código de masa esperado producido por una marca de masa depositada en una diana particular. En algunos modos de realización, los datos cuantitativos pueden comprender el área, o intensidad, de un pico de espectrometría de masas que tiene una proporción m/z correspondiente a una proporción m/z esperada del código de masa. En otros modos de realización, se mide una pluralidad de picos espectrométricos de masa y se combinan las mediciones para cuantificar el código de masa. La pluralidad de picos incluye típicamente un pico primario que tiene una proporción m/z de x correspondiente a la proporción m/z esperada del código de masa y al menos un pico secundario que tiene una proporción m/z de x+1, x+2 o x+3.

Para crear una única imagen de una muestra de tejido, se combinan los datos numéricos de las matrices de datos individuales correspondientes a dianas individuales realizando operaciones matemáticas sobre los valores numéricos para analizar la(s) relación/relaciones entre los valores en coordenadas homólogas. Por ejemplo, la proporción de dos dianas, tales como RE y RP, puede ser de interés. En dichos modos de realización, se calcula un valor numérico correspondiente a la proporción de las dos dianas (como se determina por los tamaños de pico relativos producidos por los respectivos códigos de masa generados de marcas de masa depositadas en cada diana) en cada coordenada. Los valores numéricos forman una única matriz de datos que representa las proporciones diana en toda la muestra de tejido. En teoría, la proporción puede variar de cero a infinito si el código de masa correspondiente a cualquier diana no produce un pico medible, tal como cuando no hay una marca de masa depositada en la diana en esa coordenada particular. En algunos modos de realización, las proporciones varían de más de cero a 100, tal como de 0,01 a 100, de 0,02 a 50, de 0,04 a 25 o de 0,1 a 10.

En algunos modos de realización, puede ser deseable una imagen visual que represente los datos numéricos. Por ejemplo, una persona que revisa los datos puede preferir evaluar las proporciones de dos dianas (por ejemplo, RE y RP) viendo una imagen en color que representa las proporciones encontradas en cada sección de muestra de tejido en lugar de una cuadrícula numérica. En algunos modos de realización, se puede asignar un color u otro símbolo a un intervalo de valores numéricos, produciendo de este modo un mapa de colores o símbolos con colores o símbolos diferenciados en un patrón de tipo cuadrícula (véanse, por ejemplo, las FIGS. 14-15). Por ejemplo, cuando la proporción es menor a 0,7, el color puede ser verde; cuando la proporción está entre 0,7 y 1,5, el color puede ser amarillo; y cuando la proporción es más de 1,5, el color puede ser rojo. En determinados modos de realización, se produce una representación de un "mapa térmico" en la que se asignan colores a través de una serie continua de valores. Por ejemplo, los colores se pueden transformar de azul a rojo a medida que se incrementan las proporciones numéricas (véanse, por ejemplo, las FIGS. 16-18). Por ejemplo, a medida que se incrementa la proporción de 0,1 a 4, los colores pueden variar a lo largo de una serie continua de color de azul a amarillo a rojo.

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Dichas imágenes de mapas térmicos proporcionan grandes cantidades de datos en un formato que se puede interpretar fácilmente.

Se diseña el programa informático de análisis de datos de imágenes digitales más convencional para aceptar valores enteros positivos producidos típicamente por cámaras digitales. La capacidad de manejar fracciones decimales con signo y valores de coma flotante se proporciona típicamente por herramientas de procesamiento de matrices matemáticas. Para visualizar valores de coma flotante como datos de imagen, se desarrolló una interfaz de programa informático personalizada basada en bibliotecas de programas informáticos ampliamente disponibles para el procesamiento y visualización de datos científicos (Python, Numpy, SciPy, VTK, ITK, wxPython). El programa informático puede leer en matrices numéricas en formato de coma flotante, como archivos de texto, y crear mapas de colores en los que se pueden asignar valores numéricos a diferentes combinaciones de matiz, saturación, valor y alfa. Al aplicar estos tipos de mapas de colores a las matrices numéricas resultantes del procesamiento de los datos de espectrometría de masas, se pueden visualizar los datos y se puede correlacionar la organización espacial de la muestra de tejido con las relaciones entre analitos, de manera cuantitativa. La herramienta de programa informático también puede recopilar estadísticas sobre valores de datos y representar una escala para comprender el color como una función del valor de los puntos de datos. En algunos modos de realización, también se proporciona la distribución de valores y la relación con la escala de color (es decir, una guía de referencia de colores) en la misma pantalla al lado de la imagen. En determinados modos de realización, se selecciona el intervalo de valores de datos visualizados para cubrir un intervalo de interés especificado, por ejemplo, las proporciones que varían de 0,5-1,5 o 24. Limitar el intervalo mostrado puede facilitar la comparación de la distribución de valores de datos entre las muestras. Se pueden guardar los mapas térmicos generados para proporcionar un registro conveniente de los datos obtenidos de la muestra.

En algunos modos de realización del procedimiento divulgado para detectar una pluralidad de dianas en una muestra de tejido, los datos numéricos y/o las imágenes de mapa térmico producidos facilitan el diagnóstico, pronóstico y/o tratamiento de un estado de enfermedad. Por ejemplo, conocer las proporciones de biomarcadores de cáncer, tales como los biomarcadores de cáncer de mama, facilita el diagnóstico, estadificación y/o pronóstico exactos del estado de enfermedad de un paciente. En determinados modos de realización, se pueden utilizar los datos numéricos y/o las imágenes de mapa térmico para adaptar un plan de tratamiento para un paciente. Por ejemplo, un paciente que tiene un tumor de cáncer de mama con proporciones altas de RE/RP se puede beneficiar de un plan de tratamiento diferente que un paciente con tumor de cáncer de mama que tiene proporciones bajas de RE/RP.

En algunos modos de realización, las dianas pueden ser dos o más formas de un biomarcador particular, por ejemplo, una forma intacta y una o más formas truncadas. Por ejemplo, se puede encontrar el biomarcador Her2 en forma tanto intacta como truncada, por ejemplo, fragmentos p95Her2 (o fragmentos carboxiterminales de Her2). Her2 es un receptor transmembranario con un dominio intracelular y un dominio extracelular. Las metaloproteinasas pueden escindir proteínas como Her2, produciendo de este modo fragmentos de Her2. En algunos casos, se forma Her2 truncado cuando el inicio de la traducción del ARNm que codifica Her2 comienza a partir de diferentes codones AUG dentro del gen. Se pueden formar varias formas truncadas de Her2. Aproximadamente un 20-40 % de los tumores con Her2 expresan una serie de fragmentos de p95Her2. Una forma truncada, p95Her2 110-115 kDa, es biológicamente hiperactiva porque forma fácilmente dímeros consigo misma o con Her3, y la dimerización da lugar a la progresión del cáncer de mama. Otra forma truncada, p95Her2 95-100 kDa, tiene una actividad biológica equivalente al Her2 intacto. Una tercera forma truncada, p95Her2 90-95 kDa, es biológicamente inactiva.

Los pacientes con cáncer de mama con Her2 (detectado por IHQ) se tratan típicamente con trastuzumab (Herceptin), un fármaco de anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de la proteína Her2. El ensayo basado en IHQ para la detección de Her2 usa un anticuerpo primario (4B5, Ventana Medical Systems, Inc.) que puede reconocer un epítopo en el dominio intracelular de Her2. En Her2 el dominio extracelular son los aminoácidos 1-652, la región transmembranaria son los aminoácidos 653-675, y el dominio intracelular son los aminoácidos 6761255. El anticuerpo 4B5 se une específicamente a un epítopo en el dominio intracelular de Her2 incluyendo los aminoácidos 1231-1250 de la SEQ ID NO: 3 (GAPPSTFKGTPTAENPEYLG).

Por tanto, el ensayo no puede distinguir entre las formas intacta y truncadas de Her2 y en cambio detecta ambas formas. Una desventaja significativa de este ensayo, y para el bienestar del paciente, es que trastuzumab solo es eficaz frente a la forma intacta de Her2 ya que se une al dominio extracelular. Puesto que el Her2 truncado (p95Her2) no tiene dominio extracelular, trastuzumab es terapéuticamente ineficaz en pacientes con una cantidad significativa de Her2 truncado. Otro fármaco, lapatinib, es eficaz frente a las formas truncadas de Her2.

Si un tumor incluye un porcentaje significativo de Her2 truncado, el paciente se puede tratar con lapatinib en lugar de, o simultáneamente con, trastuzumab. Lapatinib es un inhibidor de la tirosina cinasa que interrumpe la vía del receptor de crecimiento Her2. Actualmente, se usa lapatinib cuando el cáncer de un paciente continúa progresando a pesar del tratamiento con trastuzumab. También se usa lapatinib cuando el cáncer de un paciente es "triple positivo", es decir, RE+/EGFR+/Her2+. Por tanto, se puede usar un ensayo que cuantifica las formas intacta y truncadas de Her2 y/o determina una proporción de Her2 intacto:truncado, para determinar el tratamiento dirigido apropiado para los tumores con Her2.

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Debido a que las formas truncadas de Her2 carecen del dominio extracelular, un anticuerpo que se une al dominio extracelular de Her2 solo detectará el Her2 intacto en una muestra de tejido. Los anticuerpos que pueden reconocer y unirse al dominio extracelular de Her2 incluyen SP3 (Spring Bioscience) y p95 D9 (Biomatik).

Una muestra de tejido incluye principalmente Her2 truncado si es positiva para Her2 cuando se usa el anticuerpo 4B5 para la detección IHQ, pero negativa para Her2 cuando se usa el anticuerpo SP3 o p95 D9. Una muestra de tejido incluye principalmente Her2 intacto si los resultados IHQ son similares con ambos anticuerpos 4B5 y SP3 (o p95 D9). Una muestra de tejido con una mezcla de ambas formas intacta y truncadas tendrá un resultado IHQ positivo con el anticuerpo SP3 (o p95 D9), pero tendrá un resultado más fuertemente positivo con el anticuerpo 4B5.

Por tanto, en algunos modos de realización (véase, por ejemplo, la FIG. 12), se aplica un primer anticuerpo 152 que se puede unir a un biomarcador intacto 154, y que no se puede unir a una forma truncada del biomarcador, al tejido FFPE 156. Se aplica un primer conjugado de anticuerpo-enzima 158 que puede reconocer y unirse al primer anticuerpo 152, seguido de un sustrato enzimático 162 y una primera sal de diazonio 164. La enzima 160 reacciona con y activa el primer sustrato enzimático 162, que a continuación reacciona con la primera sal de diazonio 164 para depositar una primera marca de masa 166 en la proximidad de la diana (es decir, biomarcador intacto 154), tiñendo así el biomarcador intacto 154 con una marca de masa 166 (por ejemplo, una marca de masa "ligera" que no incluye uno o más isótopos más pesados, tales como deuterio). A continuación, se desactiva el primer conjugado de enzima-anticuerpo 158, y se aplica un segundo anticuerpo 168 que puede reconocer y unirse a una forma truncada del biomarcador 170 al tejido FFPE 156. (Típicamente, se detectan ambas formas del biomarcador en la misma sección de tejido en un único portaobjetos). Se aplica un segundo conjugado de anticuerpo-enzima 172 que puede reconocer y unirse al segundo anticuerpo 168, seguido de un sustrato enzimático 176 y una segunda sal de diazonio 178. Los sustratos enzimáticos 162 y 176 tienen la misma estructura química. La primera y segunda sales de diazonio 164, 178 tienen la misma estructura química, pero difieren en el peso molecular. En el modo de realización mostrado, la segunda sal de diazonio 178 tiene la misma estructura química que la primera sal de diazonio 164, pero los átomos de hidrógeno se han reemplazado por deuterio. (Un experto en la técnica entenderá que el procedimiento también se puede realizar utilizando la sal de diazonio pesada como primera sal de diazonio 164 y la sal de diazonio ligera como segunda sal de diazonio 178). La enzima 174 reacciona con y activa el segundo sustrato enzimático 176 y que a continuación reacciona con la segunda sal de diazonio 178 para depositar una segunda marca de masa 180 en la proximidad del biomarcador truncado, tiñendo así el biomarcador truncado 170 con una marca de masa pesada marcada con isótopo estable 180. El primer y segundo iones indicadores 182, 184 (o códigos de masa) se generan usando técnicas de desorción/ionización por láser (LDI), y el primer y segundo iones indicadores 182, 184 se detectan y se cuantifican por un espectrómetro de masas como se describe previamente en el presente documento.

En determinados modos de realización, el segundo anticuerpo 168 puede reconocer y unirse al biomarcador truncado 170 y al biomarcador intacto 154. En dichos modos de realización, la segunda marca de masa 180 se depositará en la proximidad tanto del biomarcador truncado 170 como del biomarcador intacto 154, tiñendo de este modo ambas formas del biomarcador con la marca de masa 180. Se cuantifica el biomarcador intacto 154 cuantificando el primer ion indicador 182. Sin embargo, la cuantificación del segundo ion indicador 184 determina la cantidad total tanto del biomarcador intacto 154 como del biomarcador truncado 170. Para cuantificar el biomarcador truncado 170 por sí mismo, se resta la intensidad de pico del primer ion indicador 182 de la intensidad de pico del segundo ion indicador 184.

En un modo de realización particular, se detectan y se cuantifican las formas intacta y truncadas de Her2 usando SP3 como primer anticuerpo 152 y 4B5 como segundo anticuerpo 168. SP3 se une solo a Her2 intacto, y 4B5 se une a ambas formas intacta y truncadas de Her2. En el modo de realización mostrado en la FIG. 12, se depositan marcas de masa ligeras en la proximidad de Her2 intacto y se depositan marcas de masa pesadas en la proximidad tanto de Her2 intacto como de Her2 truncado. La FIG. 19 muestra los espectros esperados obtenidos cuando el primer ion indicador (código de masa) es la forma "ligera" y el segundo ion indicador es la forma "pesada" (por ejemplo, marcada con deuterio) (experimento 1), y los espectros esperados obtenidos cuando el primer ion indicador es la forma pesada y el segundo ion indicador es la forma ligera (experimento 2). En cada caso, el pico correspondiente al anticuerpo SP3 representa marcas de masa depositadas en la proximidad de Her2 intacto, y el pico correspondiente al anticuerpo 4B5 representa marcas de masa depositadas en la proximidad de Her2 intacto y truncado. Al comparar las intensidades de pico, se puede determinar la proporción de Her2 intacto/Her2 total. Con respecto al experimento 1, se puede determinar la cantidad de Her2 truncado restando la intensidad de pico del pico del ion indicador pesado (solo Her2 intacto) de la intensidad de pico del pico del ion indicador ligero (Her2 intacto y truncado) para determinar la porción del pico del ion indicador pesado debida a Her2 truncado. A continuación se puede calcular la proporción de Her2 intacto/Her2 truncado. Con respecto al experimento 2, se restaría la intensidad de pico del pico del ion indicador ligero de la intensidad de pico del pico del ion indicador pesado.

En algunos modos de realización, puede ser deseable una imagen visual que represente los datos numéricos. Por ejemplo, una persona que revisa los datos puede preferir evaluar las proporciones de dos dianas (por ejemplo, Her2 intacto y p95Her2 truncado) viendo una imagen en color que representa las proporciones encontradas en cada sección de muestra de tejido en lugar de una cuadrícula numérica. En algunos modos de realización, se puede

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asignar un color a un intervalo de valores numéricos, produciendo de ese modo un mapa de colores con colores diferenciados en un patrón de tipo cuadrícula (similar a las FIGS. 14-15). En determinados modos de realización, se produce una representación de un "mapa térmico" en la que se asignan colores a través de una serie continua de valores. Por ejemplo, los colores se pueden transformar de azul a rojo a medida que se incrementan las proporciones numéricas (similar a las FIGs. 16-18).

También se pueden usar determinados modos de realización para inmunoensayos a base de matrices. Un inmunoensayo a base de matrices de este tipo se ilustra en la FIG. 20. Se produce una matriz formando una superficie modificada 186 que contiene anticuerpos de captura 188 y/o sondas de captura 190 que pueden estar o no marcadas adicionalmente, tal como marcadas con hapteno. Se trata la matriz con una muestra que comprende moléculas diana de interés, tales como proteínas, ácidos nucleicos, células, etc. Se capturan las moléculas diana de interés por los anticuerpos 188 y/o sondas 190 para formar un complejo anticuerpo/proteína diana 196 o un complejo sonda/ácido nucleico diana 194. A continuación se marcan los complejos anticuerpo/proteína diana 196 o complejos sonda/ácido nucleico diana 194 con la enzima deseada 198, seguido de amplificación de marca de masa enzimática. Una vez que ha tenido lugar la amplificación de marca de masa, se pueden someter las muestras a ionización inducida por láser para liberar los códigos de masa y proporcionar un procedimiento para la cuantificación, en el que la cantidad del código de masa es proporcional a la intensidad de la señal.

XI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ejemplificar determinados rasgos distintivos de los modos de realización de trabajo. Un experto en la técnica apreciará que el alcance de la presente invención no se limita a los rasgos distintivos de trabajo de dichos ejemplos.

Varios de los siguientes ejemplos se refieren a la tinción tisular y posterior obtención de imágenes de masa. Un procedimiento general para tinción tisular y obtención de imágenes de masa es como sigue:

Se seccionó una muestra de tejido humano fijado con formol e incluido en parafina a 4 pm y se dispusieron secciones de tejido en portaobjetos Plus o Superfrost Plus (VWR International) y se dispusieron secciones de tejido EM en portaobjetos de vidrio recubiertos con óxido de indio y estaño (ITO) (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Se realizaron la desparafinación, acondicionamiento celular (recuperación de antígeno), tinción IHQ y/o la aplicación de marcas de masa usando un instrumento IHQ automatizado Benchmark XT o Discovery XT (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, Arizona, EE. UU.) y reactivos Ventana, a menos que se especifique de otro modo.

Si la marca de masa depositada era soluble en alcohol, se aclararon los portaobjetos de muestra con agua después de completar el protocolo de tinción Discovery XT, se secaron durante 30 min, a 65 °C y se aclararon con hexano antes del análisis de EM.

Si las marcas de masa depositadas eran insolubles en alcohol, se deshidrataron los portaobjetos usando una secuencia de alcohol etílico (80 %, 80 %, 90 %, 90 %, 100 %, 100 %) y se secaron al aire o a vacío. En general, las muestras que se expusieron a vacío durante un período prolongado de tiempo proporcionaron señales más intensas.

Se usó un espectrómetro de masas lineal de ionización/desorción por láser (LDI) con analizador del tiempo de vuelo (TOF) usando el programa informático de adquisición FlexControl (Autoflex III, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) para el análisis de la muestra de tejido con marcas de masa. Se seleccionó un intervalo de masa adecuado de acuerdo con la masa de las marcas. Se recogieron los espectros de masas en cada punto de trama a través de la región de medición designada. En general, se usa un ancho de trama de 25-100 pm, pero se puede cambiar como se desee. A menos que se especifique de otro modo, se hizo funcionar el láser Smartbeam a una frecuencia de 200 Hz y acumuló 100 disparos en cada punto de trama. Se eligieron los ajustes de atenuador y enfoque láser para generar una señal con intensidad y proporción señal/ruido satisfactorias. Se usó el modo de ion positivo con la fuente de iones 1 a 20 kV, la fuente de iones 2 a 18,73 kV, la lente a 6 kV y el retraso en extracción iónica posterior ajustado a 0 ns.

A. Procedimientos de hibridación in situ

La hibridación in situ (ISH) de tejidos humanos en estados de enfermedad tiene un lugar bien establecido en el diagnóstico del cáncer, sin embargo, todavía existe la necesidad de obtener alternativas a las tecnologías ISH que se basen en la detección de dianas de señales fluorescentes y/o cromógenas. Los modos de realización divulgados en el presente documento para la detección de dianas usando la detección por obtención de imágenes de espectrometría de masas (MSI) de genes o productos génicos proporcionan dichas alternativas, tales como aplicaciones de multiplexación a base de MSI. Por ejemplo, se pueden marcar sondas dirigidas a las correspondientes dianas de ácido nucleico con haptenos afines reconocidos por los correspondientes anticuerpos anti-haptenos asociados con marcas de peso molecular que son detectables por MSI. Además, las tecnologías de ISH fluorescentes y cromógenas determinan típicamente la intensidad de tinción con valores cualitativos mientras que la ISH a base de MSI permite una cuantificación relativa numérica (en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad) y por lo tanto ofrece una ventaja

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significativa sobre los procedimientos de ISH que no se basan en MSI.

En modos de realización de trabajo ejemplares realizados para apoyar los modos de realización de la presente invención, se utilizó plata como precursor de marca de masa para detectar dianas del genotipo del papilomavirus humano (PVH) y ADN genómico relacionadas con Her2 en xenoinjertos de ratón de líneas celulares de cáncer humano. Se realizaron modos de realización de trabajo ejemplares utilizando procedimientos de detección basados en hibridación in situ de plata (SISH) de fosfatasa alcalina (AP) como se describe en la patente de los EE. UU. 7.632.652. Después de la hibridación de una sonda de ácido nucleico al precursor de marca de masa diana deseado, depósito y detección, se procedió como se describe previamente para IHQ.

B. Procedimientos de modificación de portaobjetos con óxido de indio y estaño (ITO)

En modos de realización particulares, se llevó a cabo el depósito de marca de masa utilizando portaobjetos de espectrometría de masas recubiertos con ITO que se han sumergido en una gelatina. Los tratamientos eficaces de preparación de portaobjetos se refieren a la conservación de la capa de ITO conductora sobre los portaobjetos de espectrometría de masas. Sin limitarse a una teoría de funcionamiento, actualmente se cree que esto evita cualquier carga superficial durante el proceso de ionización EM. Los modos de realización particulares se refieren a portaobjetos que comprenden una capa hidrófila, que promueve el depósito de marcas de masa sobre los filtros automáticos de VMSI. En modos de realización particulares, se puede obtener un recubrimiento hidrófilo adecuado sumergiendo los portaobjetos en gelatina al 1 % (de piel de pescado de agua fría, Sigma PN G7041) en IX PBS durante varias horas a temperatura ambiente, aclarando con agua destilada y secando al aire el portaobjetos a temperatura ambiente antes de la colocación de tejido. Se aplicó esta técnica a ejemplos de trabajo particulares usando portaobjetos con ITO.

En otros modos de realización, el recubrimiento hidrófilo comprende un recubrimiento de proteína hidrófila. Determinados modos de realización se refieren a sumergir el portaobjetos sin tejido en una solución de gelatina, tal como gelatina de piel de pescado de agua fría, una proteína, tal como seroalbúmina bovina (BSA), un detergente, tal como octilfenoxipolietoxietanol (IGEPAL CA-630®), y un compuesto orgánico, tal como glutaraldehído para formar una capa proteínica reticulada en la parte superior del recubrimiento de ITO, proporcionando así un recubrimiento hidrófilo para promover el depósito de marcas de masa automático sin dañar el recubrimiento de ITO requerido para el análisis de espectrometría de masas. Los modos de realización particulares se refieren al uso de una mezcla de gelatina al 0,1 % (Sigma G7041) y BSA al 0,1 % (Roche), a lo que se añadió IGEPAL CA-630 al 10 % y glutaraldehído al 5 %, seguido de una mezcla completa. Se usaron los portaobjetos con ITO (Bruker) sin limpieza previa. Se añadió la solución de proteína sobre el extremo no marcado del portaobjetos y se extendió para cubrir el portaobjetos de manera uniforme. Se dejó que la solución se secara al aire y se dispuso en una placa caliente a 80 °C durante aproximadamente 10 minutos y se almacenó en una caja de portaobjetos. Adicionalmente, la aplicación de recubrimientos hidrófilos antes de la colocación del tejido, tales como polilisina, aminodextrano y caseína, al portaobjetos EM recubierto con ITO puede conservar la capa de ITO conductora en el portaobjetos.

Se exploraron otros tratamientos para la preparación de portaobjetos con ITO; sin embargo, estos tratamientos no conservaron suficientemente la capa de ITO conductora. Los ejemplos de estos tratamientos incluyen procedimientos de limpieza, en los que se sumerge el portaobjetos en una secuencia de diferentes disolventes, tales como tricloroetileno, acetona, metanol, isopropanol e hidróxido de potasio, y a continuación se seca al aire. Otros procedimientos de limpieza incluyen sumergir los portaobjetos en etanolamina al 20 % y someter a sonicación a 80 °C, a continuación secar al aire. Los procedimientos adicionales incluyen modificaciones de recubrimiento hidrófilo, tales como el uso de los reactivos Ventana ChipMap Prep 1 (PN 760-4121) y ChipMap Prep 2 (PN 7604122) durante el procedimiento de tinción (es decir, después de la colocación del tejido). Los componentes principales de ChipMap Prep 1 son tampón y detergente, y el componente principal de ChipMap Prep 2 es caseína. Un enfoque adicional implicó tratar el portaobjetos con una solución de poli(alcohol vinílico) y glutaraldehído (ChipSpread™) antes de la colocación del tejido. Otros procedimientos incluyen usar una combinación de limpieza y recubrimiento de los portaobjetos, tal como limpiar en primer lugar el portaobjetos de vidrio (muestra de tejido aún no dispuesta) con HCl 6 N, a continuación recubrir el portaobjetos con (3-aminopropil)trietoxisilano, seguido de inmersión en 1,4-fenilendiisocianato.

C. Modos de realización de trabajo

Ejemplo 1: Este ejemplo se refiere al uso de la fosfatasa alcalina para escindir un grupo fosfato a partir de un conjugado de precursor de marca de masa, y demuestra la reacción enzimática esperada y la posterior detección del código de masa (esquema 21).

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Fosfato de verde de malaquita

N-CHj

M-CHj

Procipilado

Esquema 21

Para someter a prueba el sustrato, se preparó una solución de 1 mg/ml de fosfato de verde de malaquita en agua. A 200 pl de tampón tris (pH = 10) se añadieron 40 pl de la solución de fosfato de verde de malaquita. Se dividió la mezcla en dos tubos que contenían 120 pl cada uno. Se añadieron 10 pl de una solución de fosfatasa alcalina (250 pl/ml) a un tubo. A continuación se incubaron ambos tubos a temperatura ambiente. Después de aproximadamente 15 minutos, la solución que comprendía la fosfatasa alcalina se volvió ligeramente turbia. El tubo sin fosfatasa alcalina se mantuvo transparente. Puesto que el producto hidrolizado no es soluble en agua, la solución turbia sugirió que la fosfatasa alcalina catalizó la hidrólisis del sustrato. Después de dejar que la solución reposara durante la noche, se añadieron 100 pl de acetonitrilo (CH3CN) a cada tubo para disolver el precipitado, de haberlo. Se analizaron adicionalmente ambas soluciones de muestra en MALDI (LDI sin matriz). El código de masa producido por LDI de la muestra tratada con la fosfatasa alcalina tuvo un pico de ion molecular de m/z = 389,22.

Ejemplo 2: Este ejemplo demuestra el uso de tintes de estirilo como precursores de marcas de masa. Los tintes de estirilo generan señales de EM comparables a las de un tinte de triarilmetano típico (los tintes de triarilmetano son marcas de masa comprobadas).

Los resultados de LDI de una mezcla de verde de malaquita y 4-[4-(dimetilamino)estiril]piridina (DMA-SP; Aldrich n.° 394211) a diferentes concentraciones produjeron los siguientes códigos de masa: dMA-SP = 224,573 y verde de malaquita = 329,266. Se observó el catión radical de DMA-SP, lo que demuestra el uso de tintes de estirilo como marcas de masa eficaces. Los tintes de estirilo adicionales, tales como (E)-4-(2-(benzo[d]tiazol-2-il)vinil)-N,N- dimetilanilina y (E)-2-(4-metoxiestiril)benzo[d]tiazol, demostraron el mismo efecto para su uso como marcas de masa.

Ejemplo 3: Este ejemplo ilustra el uso de precursores de marcas de masa naftol/triarilmetano-diazoicos, como se describe en el esquema 22.

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imagen64

Se puede genefar

en/iimilieamenlc lal como

usando foslalasa alcalina

o Bcla-galaclosidasa

Precipitado rojo

Esquema 22

Se preparó una solución de 1 mg/ml de Amino Brilliant Green (ABG) en ácido clorhídrico (HCl) 0,01 N (preparado a partir de 40 mg/ml de solución madre de ABG en DMF). Se añadió solución de NaNO2 en agua a la solución de ABG hasta proporcionar una concentración final de nitrato de sodio al 0,125 % (NaNO2). El color de la solución cambió de incoloro a amarillo claro a verde en aproximadamente 0,5 horas. Se preparó una solución de 1 -naftol (1 mg/ml) en tampón Tris (0,1 M, pH = 7,5) a partir de 28 mg/ml de solución madre de dimetilformamida (DMF). Se añadieron 50 pl de solución de ABG a 100 pl de solución de 1-naftol. Se observó un precipitado rojo en menos de un minuto, lo que indica la formación de tinte azoico. Se separó el precipitado por centrifugación y se disolvió el residuo rojo en acetonitrilo (CH3CN) para dar una solución roja. La LDI de esta solución dio como resultado un pico a m/z a 555,312, lo que demuestra la presencia de la masa esperada del catión triarilmetano-azoico.

Ejemplo 4: Se obtuvieron Brilliant Green (BG), verde de malaquita (MG) y violeta cristal (CV) de Sigma-Aldrich y se usaron sin purificación adicional. Se preparó una solución 0,3 mM del precursor de marca de masa de triarilmetano (BG o MG o CV) en agua desionizada y se almacenó en un distribuidor oscuro. Se dispuso tejido de amígdala humana fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) en portaobjetos de vidrio con ITO compatibles con MALDI (Bruker).

Para marcar un epítopo específico en el tejido (Ki-67 o Bcl-2, por ejemplo), se incubó el tejido desparafinado con un anticuerpo primario dirigido al epítopo (anti-Ki-67 de conejo o anti-Bcl-2 de ratón) durante un período de tiempo (por ejemplo, 16 min). Después del lavado, se expuso el tejido a un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP) (por ejemplo, multímero de AP ultraView de Ventana Medical Systems, Inc.) durante un período de tiempo de aproximadamente 16 a aproximadamente 32 minutos. Después del lavado, se añadieron 100 l de BCIP (Ventana Medical Systems, Inc.) y 100 ul de solución de precursor de marca de masa (0,3 mM de tinte de triarilmetano) al portaobjetos y se dejó que se incubara en el tejido durante 32 minutos. Para el modo de realización de trabajo ejemplar de IHQ de control, se usaron 100 l de BCIP y 100 l de solución de NBT (kit AP Blue de Ventana Medical Systems, Inc.) para dar una señal azul oscura que indica el epítopo Ki-67. Después de la incubación, se lavaron los portaobjetos con tampón de reacción (Ventana Medical Systems, Inc.). Se realizaron todas las etapas anteriores automáticamente en un sistema de tinción Ventana Benchmark Discovery.

Después de la tinción automática, se lavó el portaobjetos con ITO en agua y finalmente en agua desionizada. Se dispuso el portaobjetos en un horno y se horneó durante 20-30 minutos a ~ 65 °C para retirar la mayor parte del agua. Se aclaró el portaobjetos con hexanos y se dejó que se secara al aire durante al menos 10 minutos. La muestra de tejido marcada con la marca de masa (tinte de triarilmetano) estuvo lista para la obtención de imágenes de EM (MSI). Las imágenes se realizaron en un espectrómetro Bruker Autoflex III, equipado con un detector TOF lineal. No se aplicó ningún material de matriz. Se seleccionó una región de interés y se seleccionó una etapa de barrido específico (trama) (normalmente 30-100 micrómetros). Las FIGS. 21A-21C proporcionan una ilustración ejemplar de los múltiples resultados obtenidos después de MSI en el tejido de amígdala. Los resultados demuestran el uso de tintes de triarilmetano como marcas de masa en la identificación de biomarcadores en tejido humano. La FIG. 72A muestra un mapa de iones en un color para el código de masa con BG. La FIG. 72B es una imagen de un mapa térmico del código de masa con BG, indicando la escala de color la intensidad del pico. La FIG. 72C es una

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imagen óptica de un portaobjetos de control (un portaobjetos con sección en serie) teñido con BCIP/NBT en condiciones idénticas para mostrar la especificidad de la tinción y la obtención de imágenes de marcas de masa. La FIG. 72D es un espectro de masas de BG (m/z = 385) como código de masa incluyendo una región expandida que muestra el espectro con mayor detalle. La FIG. 73A es una imagen de un mapa térmico del código de masa con Cv, indicando la escala de color la intensidad del pico. La FIG. 73B es un espectro de masas de CV.

Ejemplo 5: Se pueden usar productos azoicos formados entre un naftol y una sal de diazonio como precursores de marcas de masa para aplicaciones de obtención de imágenes de tejidos. Un ejemplo es el kit de detección AP Red de Ventana en el que se usan naftol AS-TR fosfato y Fast Red KL para generar un precipitado rojo en el sitio de la enzima. Se analizó el producto de la reacción en condiciones de LDI y se determinó que el enlace de amida en el naftol era susceptible a la irradiación con láser. La formación y detección de marcas de masa a base de tintes azoicos, como se describe en los esquemas 3 y 4, se describe a continuación. Se combinaron 100 microlitros de naftol AS-TR fosfato con 100 microlitros de Fast Red y 100 microlitros de multímero de fosfatasa alcalina como se encuentra en el kit de detección AP-Red de Ventana. Se formó un precipitado rojo en 5-10 minutos. Se recogió el precipitado por centrifugación y se lavó con acetonitrilo (MeCN). Se aisló el precipitado lavado por centrifugación, se dispersó en acetonitrilo (MeCN), se vertió en una diana y se analizó por LDI. Los resultados de este análisis indicaron que el principal constituyente detectado fue un producto de reacción de Fast Red y naftol.

Para demostrar que se podrían usar los precursores de marcas de masa generados como se describe anteriormente en tejido humano, se tiñó tejido de amígdala de acuerdo con el protocolo de AP Red de Ventana usando anticuerpo anti-Ki67. Se obtuvieron imágenes del tejido teñido en condiciones de LDI y se observó el código de masa específico que tenía una m/z de 347,932 a partir de la escisión del enlace naftol-amida. En referencia ahora a la FIG. 67, se muestra una imagen óptica de la tinción de Ki-67 usando los reactivos de detección AP-Red de Ventana en tejido de amígdala. La FIG. 68 es una MSI LDI de Ki-67 usando los reactivos de detección AP-Red de Ventana en tejido de amígdala. Se observó que existía una fuerte correlación entre la imagen óptica y el mapa térmico.

Ejemplo 6: De acuerdo con el procedimiento del ejemplo 5, se sometieron a prueba diez sales de diazonio adicionales. Véanse las FIGS. 22 y 23 para los espectros de masas para cada muestra. Para cada reacción, se añadieron 20 l de solución de sal de diazonio 1 mM, como se indica en la tabla 1 a continuación, a 20 l de naftol AS-TR fosfato 1 mM y se mezclaron bien. Se añadió fosfatasa alcalina (10 l de 25 g/ml) y se mezcló bien. Después de la incubación durante la noche, se analizó el producto (suspensión de la precipitación) en condiciones de LDI. Sin limitarse a una sola teoría de funcionamiento, actualmente se cree que la formación del catión probablemente se facilita por los grupos donadores de electrones de la sal de diazonio, y se inhibe por la presencia de grupos aceptadores de electrones. El examen de las sales de diazonio demostró una tendencia de que los grupos sustituyentes en las sales de diazonio desempeñan un papel en la formación del producto fotoescindible. En general, si están presentes grupos donadores de electrones (por ejemplo, metoxilo, etoxilo, etc.) en la sal de diazonio, el producto azoico se escinde fácilmente por el láser. Sin embargo, si están presentes grupos aceptadores de electrones (por ejemplo, NO2, etc.) se observa poca o ninguna fotoescisión.

Grupo R

Nombre

Masa de

imagen65

Masa de

imagen66

Masa

observada de pico(s) principal(es)

imagen67

Fast Red KL

348,10

488,13

347,9

imagen68

Diazo Red RC

339,05

479,08, 502,1 (+Na+)

338,9

502,3

Grupo R

Nombre

Masa de

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Masa de

imagen70

Masa

observada de pico(s) principal(es)

imagen71

Fast Red B

350,08

490,11

333,9

440,0

imagen72

Var Blue RT

366,12

506,15 529,2 (+Na+)

366,0

559,9

imagen73

Var Blue B

396,13

536,16 559,2 (+Na+)

369

559,9

imagen74

Fast Black K

484,13

624,16

333,9

484,3

imagen75

Fast Garnet GBC

407,15

547,18

407,0

imagen76

Fast Blue RR

454,14

594,17

454,1

imagen77

Fast Red TR

323,06

463,09

322,9

486,3

imagen78

Fast Red BB

482,17

622,20

482,4

imagen79

Fast Blue B

438,13

578,16

288,1

411.0

441.1

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Ejemplo 7: Este ejemplo se refiere al uso de compuestos de heteroarilo para formar oligómeros detectables por EM en condiciones de LDI. Los ensayos iniciales con tejido teñido con DAB mostraron una señal detectable (dímero DAB) pero el fondo fue bastante alto. Se sometieron a prueba compuestos adicionales mezclándolos con HRP y H2O2 y posteriormente examinando los precipitados en EM LDI. Por ejemplo, 1,8-DAN dio un pico a m/z = 297 y 8- AQ dio picos a m/z = 426 y m/z = 567.

Se tiñeron muestras de tejido con 1,8-DAN y 8-AQ. Los resultados iniciales indicaron que 8-AQ dio una tinción similar a DAB (Ki-67 en amígdala). Una muestra de tejido teñida por 8-AQ demostró que los oligómeros (en su mayoría trímeros y tetrámeros) de 8-AQ se pueden detectar fácilmente en muestras de tejido sin usar una matriz (FIGS. 24A-24C).

Ejemplo 8: Un ensayo de inmunohistoquímica (IHQ) usado frecuentemente emplea fosfatasa alcalina conjugada a un anticuerpo secundario que une un anticuerpo primario al antígeno de interés. A continuación se oxida el sustrato de fosfatasa alcalina 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP), que se une estrechamente al sitio activo de la fosfatasa alcalina, por nitroazul tetrazolio (NBT) para producir un precipitado azul. Se modifica este ensayo en un protocolo de marca de masa para el uso de Brilliant Green (BG) como presumiblemente agente oxidante y un código de masa detectado.

Un anticuerpo primario policlonal anti-fosfo-4EBP1 (Thr70) de conejo se une a fosfo-4EBP1 en tejido de próstata humano fijado con formol e incluido en parafina (FFPE). Un anticuerpo secundario anti-IgG de conejo caprino conjugado a fosfatasa alcalina se une al anticuerpo primario fosfo-4EBP1. Después de la escisión con fosfatasa alcalina del grupo de fosfato de BCIP, presumiblemente se oxida el BCIP por BG para generar un precipitado de dímero de BCIP azul y un precipitado de BG incoloro. A continuación, se ioniza el precipitado de BG incoloro por el láser del espectrómetro de masas y se detecta como un código de masa para fosfo-4EBP1.

Se seccionó el tejido de próstata humana FFPE a 3 pm para IHQ y a 5 pm para análisis de espectrometría de masas (EM). Se dispusieron secciones de tejido para iHq en portaobjetos Superfrost Plus (VWR International) y se dispusieron secciones de tejido para EM en portaobjetos de vidrio recubiertos con óxido de indio y estaño (ITO) (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). Se realizaron la desparafinación, recuperación de antígeno, tinción IHQ y la aplicación de marcas de masa usando un instrumento IHQ automatizado Discovery XT (Ventana Medical Systems, Tucson, Arizona, EE. UU.) y reactivos Ventana, a menos que se especifique de otro modo.

Se tiñeron los portaobjetos de control y de marca de masa con anticuerpo primario p4EBP1 (Thr70) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE. UU.), que se diluyó 1:5 y se incubó en el tejido durante 60 min a 37 °C. Se tiñó un portaobjetos de control IHQ con DABMAP (Ventana Medical Systems), un kit de detección que usa un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, sustrato 3,3'-diaminobencidina (DAB) y oxidante de peróxido de hidrógeno. Se tiñó un segundo portaobjetos de control IHQ con un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina y se detectó con el sustrato BCIP y oxidante NBT. Se contratiñeron portaobjetos de control con hematoxilina. Se tiñó el portaobjetos de marca de masa con un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina, usando BCIP como sustrato y BG (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, eE. UU.) como oxidante y marca de masa. Se incubaron los anticuerpos secundarios 32 minutos a 37 °C antes de la adición de sustratos.

Se aclararon los portaobjetos de muestra de marca de masa con agua después de completar el protocolo de tinción Discovery XT, se secaron durante 30 min, a 65 °C y se aclararon con hexano antes del análisis de EM. No se usó ninguna matriz.

Se usó un espectrómetro de masas lineal de ionización/desorción por láser (LDI) con analizador del tiempo de vuelo (TOF) usando el programa informático de adquisición FlexControl (Autoflex III, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) para el análisis de la muestra de tejido con marcas de masa. Se recogieron los espectros de masas que cubren el intervalo de masa de 240 Da - 1000 Da en cada punto de trama a través de la región de medición designada, usando un ancho de trama de 100 pm. Se hizo funcionar el láser Smartbeam a una frecuencia de 100 Hz y acumuló 100 disparos en cada punto de trama. Se eligieron los ajustes de atenuador y enfoque láser para producir un diámetro de láser esperado de aproximadamente 50 pm. Se usó el modo de ion positivo con la fuente de iones 1 a 20 kV, la fuente de iones 2 a 18,73 kV, la lente a 6 kV y el retraso en extracción iónica posterior ajustado a 0 ns. Se analizaron dos casos diferentes de tejido de próstata humano para p4EBP1 (Thr70) con marca de masa Brilliant Green. Se lograron resultados de tinción similares en los portaobjetos de control IHQ con HRP/DAB/H2O2 y AP/BCIP/NBT para ambos casos de tejido. Los resultados de marcas de masa en las FIGS. 25A-25E muestran una localización similar para p4EBP1 tanto en los portaobjetos de control IHQ como en el correspondiente portaobjetos de marca de masa. De forma notable, la señal principal detectada en el espectro de masas es la de BG a 385 Da (FIG. 25E).

El código de masa del carbocatión de BG estabilizado por resonancia produce una señal intensa con espectrometría de masas LDI. Las potencias de láser bajas permiten la detección del código de masa del carbocatión de BG mientras que minimizan la ionización de analitos adicionales del tejido, proporcionando proporciones señal/ruido altas para la marca de masa deseada. La capacidad de obtener señales intensas sin el uso de matriz elimina

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numerosos inconvenientes asociados con la LDI asistida por matriz (MALDI).

Se llevaron a cabo análisis de imágenes directos de MALDI en secciones en serie de los casos de próstata humana usados para análisis de marcas de masa, usando ácido sinapínico como matriz. Aunque se obtuvieron espectros ricos en proteínas (datos no mostrados), no se detectaron señales a las proporciones m/z esperadas para 4EBP1 o bien cualquiera de sus formas fosforiladas. La detección de p4EBP1 usando análisis de eM solo ha sido posible usando el enfoque de marca de masa diana descrito aquí. La distribución de marcas de masa está bien correlacionada con la tinción de p4EBP1 como se demostró en los portaobjetos de control IHQ.

En referencia ahora a la FIG. 69 se muestra una imagen combinada que ilustra una vista ampliada de un portaobjetos de control con DAB (los puntos rojos en el portaobjetos de control con DAB rodean la región cancerosa) y una imagen ampliada de un portaobjetos de código de masa con BG. La FIG. 70 es una imagen combinada que ilustra una vista ampliada de un portaobjetos de control con DAB y una imagen de un portaobjetos de código de masa con BG, que muestra la región de uretra. La FIG. 71 es una imagen combinada que ilustra una imagen de un portaobjetos de control con DAB V175-H7, donde el área a la derecha de los puntos rojos en el portaobjetos de control con DAB es región cancerosa, y una imagen de un portaobjetos de código de masa con BG de la misma región.

Ejemplo 9: Este ejemplo se refiere a la detección de Her2 y ADN de PVH en tejido usando marcas de masa. Se cortó un multibloque FFPE de tejidos de xenoinjerto de ratón que contienen líneas celulares de cáncer de mama humano del número de copias del gen Her2 diferencial MCF-7 (ATCC HTB-22™; contiene 1 - 2 copias génicas de Her2), ZR-751 (ATCC CRL-1500™; contiene 2 - 4 copias génicas de Her2) y Calu-3 (ATCC HTB-55™; contiene >6 copias génicas de Her2) con un grosor de 4 pm y se dispuso en un portaobjetos de vidrio con ITO (Bruker). Las FIGS. 26A-26C, FIGS. 27A-27C, FIGS. 28A-28C, FIGS. 29A-29C, FIGS. 30A-30C y FIGS. 31A-31C muestran los resultados de EM para xenoinjertos de Her2. Las FIGS. 26A-26C ilustran imágenes ópticas de xenoinjertos de Her2 obtenidos de MCF-7, ZR-751, Calu-3, respectivamente. Las FIGS. 27A-27C muestran mapas térmicos de iones Ag2+ observados a partir de modos de realización de trabajo ejemplares con MCF-7, ZR-751, Calu-3, respectivamente. La escala de intensidad relativa para estos mapas térmicos se incluye en la FIG. 27C. Los espectros de masas promedio globales para todos los espectros medidos de MCF-7, ZR-751, Calu-3 en xenoinjertos de Her2, que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ se ilustran en las FIGS. 29A-28C.

Las FIGS. 29A-29C ilustran imágenes ópticas de muestras de control negativo de xenoinjertos de Her2, en las que no está presente ninguna sonda del gen Her2, para MCF-7, ZR-751, Calu-3, respectivamente. Las FIGS. 30A-30C muestran los mapas térmicos de iones Ag2+ observados a partir de modos de realización de trabajo ejemplares con MCF-7, ZR-751, Calu-3, respectivamente, usando un portaobjetos de control negativo (ninguna sonda del gen Her2 está presente). La escala de intensidad relativa para estos mapas térmicos se incluye en la FIG. 30C. La intensidad absoluta es significativamente menor que en los portaobjetos de muestra con la sonda del gen Her2. Las FIGS. 31A- 31C ilustran los espectros promedio globales para portaobjetos de control negativo de Her2 (sin sonda del gen Her2), que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ detectados en la tinción de fondo, se muestran para MCF-7, ZR-751, Calu-3, respectivamente. Los espectros promedio globales incluyen todos los espectros, sin requisito de intensidad mínima. Por lo tanto, los espectros nulos para las células negativas disminuirán los espectros promedio globales a menos que se defina un valor umbral de intensidad mínimo. Para lograr esto, se exportaron los espectros para cada punto de trama a Excel y se calculó una intensidad promedio para todos los espectros con la proporción S/N > 10.

Las imágenes de microscopio de xenoinjertos de Her2 teñidos con AP SISH, MCF-7, ZR-751, Calu-3, respectivamente, se ilustran en la FIG. 32A-32C. Las imágenes de microscopio de muestras de control negativo de xenoinjertos de Her2 teñidos con AP SISH (sin sonda del gen Her2) para MCF-7, ZR-751, Calu-3, también se ilustran en las FIGS. 32D-32F. Estas muestras, de las que se obtuvieron imágenes en EM, muestran el incremento esperado en la tinción de plata con el incremento en el número de copias del gen Her2. La tabla 2, a continuación, indica la intensidad promedio de Ag2+ en xenoinjertos de Her2. El incremento esperado en la tinción de plata no se recoge en los datos de espectros de masas, lo que puede estar relacionado con pequeñas diferencias en el número de copias del gen Her2 para cada xenoinjerto que la EM no puede distinguir o posiblemente debido a una tinción de fondo que difiere con cada xenoinjerto.

Intensidad promedio (UA)

MCF7 ZR751 Calu3

Muestra

1686 1701 1669

Control neg.

4,4 5,7 7,4

Tabla 2

Se marcó con mella una sonda de ADN de Her2 con el hapteno 2,4-dinitrofenol (DNP) y se incubó en los tejidos relacionados durante 2 horas a 52 °C para dirigirse al aDn genómico relacionado con Her2 (Ventana Medical

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Systems, 760-4332; 200 ul). Se incubó un anticuerpo primario anti-DNP de conejo (Ventana Medical Systems, 7804335, 100 ul) en tejidos durante 20 min a 37 °C para detectar la sonda de ADN Her2.

Un diagrama esquemático general para este procedimiento se ilustra en la FIG. 33. Después de la adición de los anticuerpos anti-hapteno de conejo 200, se añaden a los portaobjetos el anticuerpo secundario conjugado con AP anti-IgG de conejo caprino 202, para el reconocimiento del anticuerpo primario de conejo 200. Se unen anticuerpos conjugados con nanopartículas de oro anti-IgG caprina de conejo 204 a los anticuerpos secundarios, funcionando de este modo como un sitio de siembra para el posterior depósito de plata. Tras la adición de AgNO3 y BCIP a los portaobjetos, se reducen los iones de plata a átomos de plata 206 por la fosfatasa alcalina, lo que da como resultado su depósito en el sitio de las nanopartículas de oro. Se completa el tono por la adición de AuCl3, se amplifica la señal con AgNO3 adicional y se fija con Na2S2O3. A continuación, se pueden detectar los iones Ag2+ y Ag3+ por espectrometría de masas.

Ejemplo 10: Se cortó un multibloque FFPE de tejidos de xenoinjerto de ratón que contienen líneas celulares de cáncer de cuello uterino humano del número de copias del genotipo de PVH diferencial C-33 A (ATCC HTB-31™; contiene 0 genes de PVH), SiHa (ATCC HTB-35™; contiene 1-2 genes de PVH), HeLa (ATCC CcL-2™; contiene 10-50 genes de PVH), y CaSki (ATCC CRL-1550™; contiene 400-600 genes de PVH) con un grosor de 4 pm y se dispuso sobre un portaobjetos de vidrio con ITO (Bruker). Las FIGS. 34A-34D, FIgS. 35A-35D, FIGS. 36A-36D, FiGs. 37A-37D, FIGS. 38A-38D y FIGS. 39A-39D muestran los resultados de EM para xenoinjertos de PVH. Al igual que con los datos de xenoinjerto de Her2, los espectros promedio globales mostrados en las FlGS. 52 y 55 incluyen todos los espectros, sin requisito de intensidad mínima. Por lo tanto, los espectros nulos para las células negativas disminuirán los espectros promedio globales a menos que se defina un valor umbral de intensidad mínimo. Para lograr esto, se exportaron los espectros para cada punto de trama a Excel y se calculó una intensidad promedio para todos los espectros con la proporción S/N > 10. Las intensidades promedio globales calculadas de esta manera para cada xenoinjerto se muestran en las FIGS. 39A-39D.

Las FIGS. 34A-34D ilustran imágenes ópticas de xenoinjertos de PVH obtenidos de C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente. Las FIGS. 35A-35D muestran los mapas térmicos de iones Ag2+ observados a partir de modos de realización de trabajo ejemplares con C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente. La escala de intensidad relativa para estos mapas térmicos se incluye en la FIG. 35D. Los espectros de masas promedio globales para todos los espectros medidos de C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente, en xenoinjertos de PVH, que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ se ilustran en las FIGS. 36A-36D, respectivamente.

Las FIGS. 37A-37D ilustran imágenes ópticas de muestras de control negativo de xenoinjertos de PVH, en las que no está presente ninguna sonda del gen de PVH, para C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente. Las FlGS. 38A-38D muestra los mapas térmicos de iones Ag2+ observados a partir de modos de realización de trabajo ejemplares con C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente, usando un portaobjetos de control negativo (ninguna sonda del gen de PVH está presente). La escala de intensidad relativa para estos mapas térmicos se incluye en la FIG. 38D. La intensidad absoluta es significativamente menor que en los portaobjetos de muestra con la sonda del gen de PVH. Las FIGS. 39A-39D ilustran los espectros promedio globales para portaobjetos de control negativo de PVH (sin sonda del gen de PVH), que muestran los iones Ag2+ y Ag3+ detectados en la tinción de fondo, se muestran para C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente.

Las imágenes de microscopio de xenoinjertos de PVH teñidos con AP SISH, C-33 A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente, se ilustran en las FIGS. 40A-40D. Las imágenes de microscopio de muestras de control negativo de xenoinjertos de PVH teñidas con AP SISH (sin sonda del gen de PVH) para C-33A, SiHa, HeLa y CaSki, respectivamente, se ilustran en las FIGS. 40E-40H. La tabla 3, a continuación, indica la intensidad promedio de Ag2+ en xenoinjertos de PVH.

Intensidad promedio (UA)

C33a SiHa HeLa CaSki

Muestra

4,0 407 481 837

Control neg.

12 116 23 0

Tabla 3

Se incubó una sonda de ADN de PVH, marcada con mella con el hapteno digoxigenina (DIG) (Ventana Medical Systems, 200 pl de 8 pg/ml), en los tejidos relacionados durante 6 horas a 42 °C para dirigirse al ADN de PVH. Mientras, se incubó un anticuerpo primario anti-DIG de conejo (Sigma-Aldrich PN 07782, diluido 1:2000, 100 ul) en los tejidos durante 12 min a 37 °C para detectar la sonda de ADN de PVH.

Ejemplo 11: En este punto, el protocolo para la detección de dianas tanto de Her2 como de PVH es el mismo. Como

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tal, independientemente de la diana, después de la adición de los anticuerpos anti hapteno de conejo, se añadió anticuerpo secundario conjugado con AP anti-IgG de conejo caprino para el reconocimiento del anticuerpo primario de conejo a los portaobjetos (100 ul de 20 ug/ml durante 32 min, a 37 °C). Se añadieron anticuerpos conjugados con nanopartículas de oro anti-IgG caprina de conejo (100 pl de 100 nM durante 32 min a 37 °C) y se unieron a los anticuerpos secundarios, funcionando de este modo como un sitio de siembra para el posterior depósito de plata. Tras la adición de AgNO3 (100 ul de 50 nM durante 20 min a 37 °C) y BCIP (Ventana Medical Systems, 95405, 100 ul durante 20 min a 37 °C) a los portaobjetos, se redujeron los iones de plata a átomos de plata por la fosfatasa alcalina, lo que da como resultado su depósito en el sitio de las nanopartículas de oro. Se completó el tono por la adición de AuCh (100 ul de solución al 0,20 % durante 4 min, a 37 °C), se amplificó la señal con AgNO3 adicional (100 ul durante 4 min, a 37 °C) y se fijó con Na2S2O3 (100 ul durante 4 min a 37 °C). Se detectaron los iones Ag2+ y Ag3+ en EM usando condiciones descritas previamente.

Los dos ejemplos anteriores de ISH demuestran claramente la capacidad de detectar materiales genéricos en muestras de tejido FFPE usando un enfoque de marca de masa amplificada enzimática, que no es posible usando el procedimiento MSI directo o no amplificado. De forma más importante, en un intervalo dinámico adecuado, también se pudo establecer el enfoque de marca de masa enzimático como un procedimiento de cuantificación relativa para el diagnóstico de tejidos. Las imágenes de microscopio de xenoinjertos de PVH teñidos con AP SISH (FIGS. 40A- 40D) de los que se obtuvieron imágenes en EM muestran el incremento esperado en la tinción de plata con el incremento en el número de copias del gen de PVH. Sin embargo, los números de copias génicas en la detección cromógena no se pueden contar en general con más de cuatro copias génicas presentes, porque por encima de este nivel, la tinción cromógena aparece como un agregado, en lugar de señales contables discretas. Como se indica en la tabla 3, se recoge una tendencia entre las copias génicas y la intensidad de la señal EM en los datos EM. La cuantificación relativa lograda a través de la detección de MSI de marcas de masa para genes o productos génicos de interés puede lograr, por lo tanto, una ventaja significativa sobre la detección cromógena.

Se ha demostrado la detección múltiple de tres proteínas relevantes para el cáncer de mama (Her2, RE, RP) con la detección de marcas de masa LDI en xenoinjertos y tejido humano FFPE. Se usaron xenoinjertos de ratón de las siguientes líneas celulares para evaluación y desarrollo del ensayo: MCF-7 (carcinoma ductal de mama), ZR-75-1 (carcinoma ductal de mama) y Calu-3 (adenocarcinoma de pulmón no microcítico). También se demostró el ensayo en muestras de tejido de mama humano.

Se incluyeron los xenoinjertos de MCF-7, ZR-75-1 y Calu-3 en un bloque de parafina, de modo que se dispusieron los tres xenoinjertos en un portaobjetos. Se cortaron bloques de xenoinjerto y tejido de mama a 4 pm y se dejaron secar al aire en portaobjetos recubiertos con ITO o SuperFrost+. Se trataron los portaobjetos con IT O con gelatina al 1 % antes de la colocación del tejido para facilitar el depósito de marca de masa con éxito en BenchMark XT.

Se realizó la tinción/depósito de marca de masa en un BenchMark XT usando un protocolo automatizado. El esquema de tinción general usado se muestra en la FIG. 41. De acuerdo con la FIG. 41, se reconoce un anticuerpo primario 210 que reconoce una primera diana 208 por un conjugado de anticuerpo secundario-enzima 212. Se añade un conjugado de precursor de marca de masa 214 a la muestra y se deposita después de la reacción con la enzima. Después de que se retiren el anticuerpo primario 210 y el conjugado de anticuerpo-enzima 212 por medio de elución (es decir, el proceso de desactivación), se reconoce un segundo anticuerpo primario 216 que reconoce una segunda diana 218 por un conjugado de anticuerpo secundario-enzima 220. Se añade un segundo conjugado de precursor de marca de masa 222 a la muestra y se deposita después de la reacción con la enzima. Se repite el proceso de desactivación, y se reconoce un tercer anticuerpo primario 230 que reconoce una tercera diana 224 por un tercer conjugado anticuerpo-enzima 226. Se añade un tercer conjugado de precursor de marca de masa 228 a la muestra y se deposita después de la reacción con la enzima. Todos los reactivos usados fueron de Ventana Medical Systems, Inc. a menos que se indique de otro modo. Después de la recuperación del antígeno, un anticuerpo monoclonal de conejo primario anti-Her2 (PN 790-2991) se une a la proteína Her2. Un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (AP) anti-IgG de conejo caprino (PN 760-4314) se une al anticuerpo anti-Her2.

AP cataliza la desfosforilación del naftol AS TR fosfato (PN 760-4308); a continuación el producto desfosforilado se somete a un acoplamiento azoico con una sal de diazonio, produciendo un precipitado insoluble en el sitio del antígeno. La química del depósito de marca de masa catalizada por AP se muestra a continuación en el esquema 23. Las sales de diazonio usadas fueron Fast Blue BB (FB BB, Sigma-Aldrich PN F3378), Fast Blue RR (FB RR, Sigma-Aldrich PN F0500) y Fast Violet B (FV B, Sigma-Aldrich PN 201596) para Her2, RE y RP respectivamente. Se preparó cada sal de diazonio a aproximadamente 4 mM en tampón (NaCH3COOH 10 mM pH 3,95, MgCh 250 mM, Brij-35 al 0,37 %) y se almacena en un distribuidor impenetrable a la luz.

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imagen80

Her2 detectado con Fast Blue BB

Compuesto 37000 oepcs-’.aco er * s to

<Je Herí

NafW AS TR

Marca de rrasa de Her2

FÓTnula química Cj^i¿|NjO|*

• Masa intacta 4Í?,17

RE detectado con Fast Blue RR

Marca de masa de RE

Fórmula coimes C«, " i■ .

Masa exacta 454,14

Fast Blue RR

RP detectado con Fast Violet B

Marca de masa de RP

Fórmula química

Mju exacto 438 14

Fast Violet B

resquema 23

Después del depósito de marca de masa Her2, se eluyen los anticuerpos primario y secundario de la sección de tejido usando tampón de SDS al 1 % (Sigma-Aldrich PN L3771-500) y glicina 25 mM (Bio-Rad PN 161-0718) a pH 2 (Pirici, D., Mogoanta, L., et al. (2009) “Antibody Elution Method for Múltiple Immunohistochemistry on Primary Antibodies Raised in the Same Species and of the Same Subtype.” Journal of Histochemistry and Cytochemistry 57(6): 567 - 575.

A continuación, se tiñen secuencialmente RE y RP de manera similar en la misma muestra de tejido. El complejo de anticuerpo primario y secundario usado para el depósito de marca de masa RP no se eluye del tejido usando el tampón de glicina/SDS.

Una vez completada la tinción/depósito de marca de masa con BenchMark XT, se lavan los portaobjetos con detergente diluido para retirar los reactivos hidrófobos usados en el teñidor automático, se aclaran con agua corriente, a continuación se secan durante la noche a alto vacío (~10-4 torr) antes del análisis EM-LDI de la muestra de tejido intacto con el espectrómetro de masas Autoflex III de Bruker Daltonic.

Se realizó la obtención de imágenes de espectrometría de masas usando un diámetro de láser de aproximadamente 20 pm. Los datos de imágenes usaron un ancho de trama de 30 pm. Se hizo funcionar el espectrómetro de masas en el modo de ion positivo sin retraso en extracción iónica posterior. Los voltajes usados fueron: fuente de iones 1 20 kV, fuente de iones 2 18,85 kV, lente 6 kV y detector lineal 1,545 kV. La frecuencia del láser fue de 200 Hz, y se sumaron hasta 100 disparos por punto de trama. Se recogieron los datos en el intervalo de masa de 400 - 500 Da.

Los datos típicos obtenidos para muestras de xenoinjerto se muestran en las FIGS. 42A-42E. Los espectros de masas en las FIGS. 44A-44C son consistentes con los resultados de tinción óptica. La tinción óptica usando técnicas

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inmunohistoquímicas (IHQ) habituales muestra una tinción aproximadamente igual para RE y RP en el xenoinjerto de MCF7, en su mayoría RP con poca tinción RE en el xenoinjerto de ZR751, y solo tinción para Her2 en el xenoinjerto de Calu3.

Se realizaron tres muestras de control diferentes para evaluar el sistema modelo de xenoinjerto: (1) sin anticuerpo primario para Her2, RE o RP; (2) sin conjugado de anticuerpo secundario-fosfatasa alcalina; y (3) sin elución de anticuerpos con tampón de glicina/SDS antes de la tinción de RE y RP. Los primeros dos tipos de muestras de control mostraron tejido incoloro sin marcas de masa detectadas en el espectrómetro de masas usando potencias de láser iguales a las usadas en las muestras.

Ejemplo 12: El modo de realización divulgado ejemplar descrito en el ejemplo 11 se ha ampliado a la detección cuádruple de Her2, RE, RP y Ki67 usando procedimientos sustancialmente similares a los procedimientos descritos en el ejemplo 11. Se demostró la detección cuádruple en un multibloque FFPE que contenía xenoinjertos de MCF-7, ZR-75-1 y Calu-3. Debido a que la expresión de Her2 en estos xenoinjertos es sustancialmente mayor que RE, RP o Ki67, se eligió una marca de masa con ionización considerablemente más baja por EM-LDI para Her2. Esto permite la detección de marcas de masa para los cuatro antígenos usando una potencia de láser para muestrear los xenoinjertos de MCF-7, ZR-75-1 y Calu-3 contenidos en un portaobjetos.

En este ejemplo, se usaron las siguientes sales de diazonio para generar marcas de masa para cada antígeno: Fast Red Violet LB (FR V LB, Sigma-Aldrich PN F3381) para Her2; FB BB para RE; FB RR para RP; y FV B para Ki67 (enumerados en el orden de tinción secuencial). La estructura de FR V LB y la marca de masa detectada se ilustran a continuación. Los resultados de EM-LDI se muestran en las FIGS. 45A-45C. El precursor de marca de masa FR V LB tiene una ionización sustancialmente menos intensa por desorción láser que los otros tres precursores de marcas de masa usados, lo que da como resultado una pequeña señal detectada para Her2 aunque la concentración de antígeno Her2 sea alta con respecto a los otros tres antígenos detectados.

imagen81

Se evaluó el posible daño antigénico provocado por el tratamiento de elución de anticuerpo con SDS al 1 % y glicina 25 mM a pH 2 para RE, RP, Ki67 y Her2, realizando la evaluación para cada antígeno en secciones de tejido separadas. Se cortaron los xenoinjertos a 4 pm y se dispusieron sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO tratados con gelatina al 1 %. Después de la recuperación del antígeno, se sometieron los xenoinjertos a cero o dos ciclos de SDS al 1 % y glicina 25 mM a pH 2 lavando a 50 °C. A continuación, se completó la detección con la adición de lo siguiente: un anticuerpo primario apropiado; anticuerpo secundario conjugado con AP; naftol AS TR fosfato; y FB BB. Se detectó la marca de masa de FB BB usando EM-LDI. Los resultados para RE se muestran en las FIGS. 46A y 46B. Un resumen de los resultados para todos los antígenos se muestra en la tabla 4. El tratamiento con SDS y glicina no disminuyó la detección de la marca de masa de FB BB para RE y no tuvo un impacto significativo en la detección de la marca de masa de FB BB para Her2.

Tabla 4: Efectos del tratamiento con SDS/Gly, antes de la adición del anticuerpo primario, sobre la detección EM-LDI de la marca de masa de FB BB.

Intensidad de FB BB (UA) en el espectro promedio global

Xenoinjerto

Antígeno 0 tratamientos con SDS/Gly 2 tratamientos con SDS/Gly

Calu-3

Her2 1854 1950

MCF-7

Ki67 2280 2329

MCF-7

RP 696 1748

MCF-7

RE 1464 1936

Se evaluó la posible retirada de los productos de reacción de acoplamiento de diazonio precipitados por el tratamiento de elución de anticuerpo con SDS al 1 % y glicina 25 mM a pH 2. Se realizó la detección de antígeno

individual para RE o Her2 en secciones de xenoinjerto. Después de que se completaron todas las etapas de depósito de marca de masa y se depositó el precursor de marca de masa en el sitio del antígeno, se trataron los portaobjetos con cero, una, dos o tres rondas del tratamiento de elución de anticuerpo de SDS al 1 % y glicina 25 mM a pH 2 a 50 °C. Las intensidades de la marca de masa obtenida del espectro de masas promedio global para 5 la región de la que se obtuvieron imágenes por EM-LDI se resumen en la tabla 5. Los parámetros de EM-LDi se mantuvieron constantes para los cuatro portaobjetos examinados para un antígeno y una marca de masa particular, pero no se mantuvieron necesariamente constantes para el análisis de otra combinación de marca de masa/antígeno. El tratamiento con tampón de SDS y glicina no redujo la intensidad de las marcas de masa detectadas.

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Tabla 5: Intensidades de marca de masa (en unidades arbitrarias UA) en el espectro de masas promedio global, después del tratamiento con tampón de SDS/glicina después de que se depositara la marca de masa. Un antígeno detectado con una marca de masa por portaobjetos. NT = no sometido a prueba

Xenoinjerto

Antígeno N.° tratamientos con SDS/Gly Intensidad de marca de masa (UA)

FB BB

FB RR FVB FRVFB

MCF-7

RE 0 41,1 14,8 45,4 NT

MCF-7

RE 1 64,7 28,8 36,2 NT

MCF-7

RE 2 53,6 37,2 51,1 NT

MCF-7

RE 3 74,3 38,3 39,3 NT

Calu-3

Her2 0 39,8 25,6 NT 14,2

Calu-3

Her2 1 40,4 24,2 NT 21,9

Calu-3

Her2 2 53,6 17,4 NT 29,5

Calu-3

Her2 3 52,7 28,6 NT 28,8

Se examinaron las intensidades de las marcas de masa cuádruples con respecto a las intensidades de marca de masa de antígeno individual. Se completó la detección cuádruple para Her2, Re, RP y Ki-67 en un portaobjetos que contenía los xenotrasplantes de MCF-7, ZR-75-1 y Calu-3. Se tiñeron individualmente cuatro portaobjetos de sección 15 en serie por separado para cada antígeno separado, usando la misma marca de masa para cada antígeno como en el portaobjetos cuádruple. Las intensidades de marcas de masa del espectro promedio global para la región medida por EM-LDi se resumen en la tabla 6. Las intensidades más bajas observadas en el portaobjetos cuádruple con respecto a los portaobjetos de antígeno individual posiblemente se deben a la supresión iónica, un fenómeno documentado en EM-LDI. Sin limitarse a una teoría de funcionamiento particular, actualmente se cree que la 20 presencia de múltiples marcas de masa en el sitio del antígeno puede disminuir la intensidad de cada marca de masa detectada.

Tabla 6: Intensidades de marcas de masa del espectro promedio global para detección de antígeno cuádruple frente a individual. ND = no detectado

MCF-7 ZR-75-1 Cal u-3

Marca de masa

Antígeno Cuad. Indiv. Cuad. Indiv. Cuad. Indiv.

FVB

Ki-67 29,8 84,2 32,7 87,4 18,0 37,7

FB RR

RP 17,0 39,1 35,8 76,5 4,8 2,0

FB BB

RE 12,4 53,6 6,2 17,9 2,5 ND

FR V LB

Her2 ND ND ND ND 5,3 19,2

Ejemplo 13: Este modo de realización ejemplar se refiere al uso de un diámetro de láser pequeño para el análisis. 25 Se estimó que el diámetro de láser era de aproximadamente 50 pm para los datos mostrados en los ejemplos 9 y 10. La tinción de plata de fondo varía heterogéneamente a través de las secciones de tejido, afectando de forma variable a la intensidad global medida cuando se ionizan átomos de plata por medio de LDI. Con un diámetro de láser más pequeño, se pueden muestrear las células que muestran tinción con plata positiva con menos solapamiento del láser en células negativas que solo tienen tinción de fondo, proporcionando teóricamente una 30 medición más exacta de la intensidad de plata en células positivas. Los resultados se muestran en las FIGS. 67 y 68.

Se dispusieron secciones de 4 pm de tejido de mama humano en portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO tratados con gelatina al 1 % y se tiñeron para ADN de Her2 usando el procedimiento de hibridación in situ de plata y AP 35 descrito en el ejemplo 9. Se detectaron los iones de plata con EM-LDI en modo de prueba recogiendo los espectros

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individuales en puntos de trama individuales. Para cada punto de trama muestreado, se acumularon los disparos y se sumaron hasta que disminuyó la señal de plata a una potencia de láser determinada. La potencia de láser y los ajustes de enfoque produjeron un diámetro de aproximadamente 15 - 25 pm. Los resultados ejemplares se muestran en la FIG. 48. Un resumen numérico de datos se muestra en la tabla 7, y un resumen gráfico en la FIG. 49 y FIG. 50. Se tiñeron los tejidos con procedimientos IHQ tradicionales para la proteína Her2, clasificando el estado de la proteína Her2 como 0, +1, +2 o +3 por un patólogo. Estas puntuaciones de la proteína Her2 se incluyen con los datos mostrados en la FIG. 48, FIG. 49 y FIG. 50, y tabla 7. Aunque existe una variabilidad sustancial en los datos (que, sin limitarse a una teoría de funcionamiento particular, podría ser un reflejo de la heterogeneidad de las células cancerosas) la intensidad del ion de plata detectado como marca de masa del gen Her2 se correlaciona con los niveles de expresión de la proteína Her2 conocidos.

Tabla 7: Intensidades (en UA) de iones de plata detectados como marcas de masa para el gen Her2 en el tejido de mama humano. Las intensidades son para espectros de prueba. Bkgrd = fondo/respuesta celular negativa.

m/z = 322 (célula pos.) m/z = 322 (fondo)

IHQ 1 +

Portaobjetos A Portaobjetos B Portaobjetos A Portaobjetos B

538 92 ND ND

48 134 120 60

100 66 78 54

153 178 71 ND

326 88 62 ND

360 221 ND ND

Promedio

254 130 83 57

D.E.

186 60 26 4

% D.E.R.

73 46 31 7

m/z = 322 (célula pos.) m/z = 322 (fondo)

IHQ 2+

Portaobjetos C Portaobjetos D Portaobjetos C Portaobjetos D

96 305 245 315

128 507 177 335

327 427 174 296

798 243 74 181

331 661 70 141

404 261 146 212

Promedio

347 401 148 247

D.E.

252 163 67 79

% D.E.R.

73 41 45 32

m/z = 322 (célula pos.) m/z = 322 (fondo)

IHQ 3+

Portaobjetos E Portaobjetos F Portaobjetos E Portaobjetos F

687 1073 383 300

283 318 429 149

1251 423 617 287

343 445 333 387

1188 309 389 293

299 594 308 298

Promedio

675 527 410 286

D.E.

447 287 110 77

% D.E.R.

66 54 27 27

Ejemplo 14: Los modos de realización divulgados particulares se refieren a la cuantificación de marcas de masa depositadas enzimáticamente. Para evaluar la viabilidad de la cuantificación (en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de una diana particular) usando la detección EM-LDI de marcas de masa depositadas enzimáticamente, se realizaron modos de realización de trabajo ejemplares sin tejido para eliminar la variación de muestra inherente a las muestras de tejido. Se modificaron químicamente portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO para unir de forma covalente la proteína al portaobjetos sin alterar el recubrimiento de ITO. Se hizo gotear seroalbúmina bovina (BSA) en el portaobjetos en concentraciones

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conocidas. A continuación, se completó la tinción/depósito de marca de masa en el Benchmark XT como se describe en el ejemplo 11, usando un anticuerpo primario anti-BSA de ratón y FB BB. El tratamiento con tampón de SDS/glicina no fue necesario en estos modos de realización de trabajo ejemplares de antígeno individual; sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que se puede usar dicho tratamiento con tampón. Se detectó la marca de masa de FB BB usando EM-LDI.

Para permitir la comparación de los resultados de EM-LDI con alguna técnica ortogonal, se usó el programa informático ImageJ para determinar un valor en la escala de grises para cada punto antes de que se obtuvieran las imágenes de los portaobjetos en la EM. Debido a que los valores de gris varían logarítmicamente con la concentración de antígeno, se ajustaron los datos de ImageJ con una línea de tendencia logarítmica. Se observó una correlación para las concentraciones de BSA goteadas que varía de 0 a 450 ng/ml, lo que demuestra la viabilidad de la cuantificación (en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de una diana particular) de la detección EM-LDI de marcas de masa depositadas enzimáticamente. La detección EM-LDI de los resultados de valores de gris de FB BB e ImageJ se muestra en las FIGS. 51A-51F.

Ejemplo 15: Este modo de realización ejemplar particular se refiere al uso de compuestos de heteroarilo conjuntamente con iones de metales de transición para una detección potenciada por EM en condiciones de LDI. Un modo de realización divulgado particular se refiere al uso de DAB combinado con cloruro de níquel (NiCl2) para tinción catalizada con HRP y posterior MSI. Para este modo de realización ejemplar, se usó el siguiente procedimiento de tinción general. Excepto para la solución de NiCl2, todos los demás reactivos (inhibidor de DAB, multímero de HRP, cromógeno de DAB y H2O2 DAB) se obtuvieron del kit de detección Universal DAB de Ventana ultraView™ (número de catálogo: 760-500). Después de aplicar el multímero de HRP, se aplicaron una gota de cromógeno de DAB y una gota de NiCh (16 mM en agua) sobre la sección de tejido y se incubó durante un determinado período (por ejemplo, 4-32 minutos). De forma alternativa, se preparó una mezcla previa de cromógeno de DAB y solución de NiCh por separado del portaobjetos y se incubó antes de añadirla sobre el tejido. A continuación, se distribuyó aproximadamente una gota de H2O2 DAB en el portaobjetos y se incubó durante 8 minutos. Después de la tinción, se trataron los portaobjetos como con tinción de DAB estándar y se secaron adicionalmente a alto vacío. Se examinaron los portaobjetos secos en Autoflex III en condiciones de LDI (por ejemplo, no se usó material de matriz). Una imagen representativa se muestra en las FIGS. 52A y 52B.

Ejemplo 16: El procedimiento de tinción de este ejemplo se basó en la reducción de plata catalizada por HRP (Ag+) en presencia de H2O2 e hidroquinona. Se usaron procedimientos de tinción generales, como se divulga en el presente documento, para los modos de realización divulgados. Para la detección, se aplicó aproximadamente una gota de reactivo de plata A y se incubó durante 4 minutos, seguido de la aplicación de aproximadamente una gota de plata B y aproximadamente una gota de plata C y la incubación durante 8 minutos. Después de la tinción, se lavaron y se deshidrataron los portaobjetos y se secaron adicionalmente a alto vacío. Se examinaron los portaobjetos secos en Autoflex III en condiciones de LDI (por ejemplo, no se usó material de matriz).

Ejemplo 17: Este modo de realización divulgado particular se refiere al uso de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) como ejemplo adicional del uso de compuestos de heteroarilo como sustrato de HRP para MSI. Se usaron procedimientos de tinción generales, como se divulga en el presente documento, para los modos de realización divulgados. Se aplicaron cromógeno de AEC y H2O2 AEC de un kit de detección Ventana AEC (número de catálogo: 760-020) y se incubaron durante un período de tiempo (por ejemplo, 8-32 minutos) en el tejido. Después de la tinción, se lavó el portaobjetos con agua jabonosa y agua pura antes de secar a vacío. No se aplicó ningún tratamiento de deshidratación de alcohol puesto que la precipitación es soluble en alcohol. Se obtuvieron imágenes del portaobjetos seco usando Autoflex III bajo LDI. Para el modo de realización mostrado en las FIGS. 53A y 53B, se tiñó la proteína Ki-67 en tejido de amígdala y se obtuvieron imágenes. Estos modos de realización particulares demuestran una buena correlación de señal entre IHQ y MSI.

Ejemplo 18: Se usó un multibloque celular FFPE 4 en 1 de Calu-3, BT-474, SKOV3 y MDA-MB-453 para examinar si se puede correlacionar la intensidad de MSI con el nivel de expresión de proteína conocido. Se ha informado que las líneas celulares divulgadas expresan niveles diferentes de proteína Her2, expresando Calu-3 un nivel mayor de proteína Her2 que BT-474, que expresa un nivel de proteína Her2 sustancialmente similar al de SKOV3, ambos expresan un nivel mayor de proteína Her2 que MDA-MB-453 (por ejemplo, Calu 3>BT-474~SKOV3>MDA-MB-453). La tinción para este modo de realización divulgado particular se basó en la reacción de naftol-diazonio catalizada por AP. Se usó Fast Blue BB (Sigma F3378) como componente de diazonio, mientras que se usó Red Naphthol de ultraView (del kit Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit de Ventana ultraView™) como precursor de naftol. Se tiñeron múltiples portaobjetos usando un protocolo idéntico, pero se obtuvieron imágenes en un punto temporal diferente para examinar la reproducibilidad de los datos de intensidad. Para cada línea celular divulgada, se obtuvieron imágenes de múltiples regiones dentro de una sección de línea celular específica y la FIG. 54 muestra un gráfico representativo de la intensidad promedio global de las regiones. Un experto en la técnica reconocerá que la variación intra-portaobjetos de la intensidad fue en general muy pequeña. Además, la tendencia de los niveles de intensidad se correlaciona con el nivel de expresión de Her2 entre las líneas celulares divulgadas.

Para examinar la variación y reproducibilidad entre portaobjetos, se obtuvieron imágenes de los portaobjetos teñidos

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de forma idéntica en diferentes puntos temporales. Se encontró que los valores de intensidad promedio de la misma línea celular de diferentes modos de realización de trabajo ejemplares de obtención de imágenes eran diferentes. Sin limitarse a una teoría de funcionamiento particular, actualmente se cree que la diferencia en los valores de intensidad promedio se debe probablemente a las diferentes condiciones instrumentales y al parámetro de configuración de la obtención de imágenes ligeramente diferente. Sin embargo, en modos de realización particulares, las intensidades absolutas se normalizaron frente a una de la línea celular (por ejemplo Her2 en la línea celular de Calu-3 como 100 UA), con lo que se obtuvieron niveles de intensidad relativa reproducibles que se correlacionaron con los niveles de expresión de Her2 informados (FIG. 55). Estos resultados ilustran información de semicuantificación (en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de una diana particular) obtenida de MSI usando modos de realización particulares del procedimiento divulgado. Además, en modos de realización particulares, se pueden establecer comparaciones tanto entre como intra-portaobjetos.

Ejemplos 19-21: Se usó un bloque de tejido FFPE de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 en ratón atímico (número de bloque: 20718, Ventana Medical System Inc., AZ, EE. UU.) como muestra para la tinción IHQ y el análisis SILMSI. Se cortó el bloque de tejido fFpE en un micrótomo al grosor deseado (5 pm) y se fijó sobre el portaobjetos recubierto con óxido de indio y estaño (ITO) pretratado (número de pieza: CG-81IN-S115, Delta Technologies Inc, MN, EE. UU.). Se pretrató el portaobjetos con ITO con gelatina sumergiendo el portaobjetos con ITO en una solución de gelatina con gelatina al 1 % p/v (número de pieza: G7041, Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.) en 1x PBS (número de pieza: 14190, Invitrogen, NY, EE. UU.) durante 5 horas a temperatura ambiente. A continuación, se aclaró el portaobjetos con ITO con dH2O y se dejó que se secara al aire antes de su uso.

Se realizó toda la inmunohistoquímica en plataformas de tinción automatizadas Ventana Benchmark XT®. Se precualificaron las muestras de tejido y anticuerpos primarios (es decir, se sometieron a ensayo para determinar su idoneidad y rendimiento) usando el kit Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit de ultraView (número de pieza: 760-501, Ventana Medical System Inc., AZ, EE. UU.). En todos los casos, una gota de reactivo es igual a 100 l.

Se tiñó tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 FFPE en ratón atímico montado en Superfrost Plus Micro Slide (número de pieza: 48311, VWR, IL, EE. UU.) con el kit Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit de ultraView (número de pieza: 760-501, Ventana Medical System Inc., AZ, EE. UU.) para detección de RE en un portaobjetos y detección de RP en otro portaobjetos. Se usó la misma sección de tejido del mismo bloque de tejido para la tinción IHQ. Se tomaron imágenes ópticas de los portaobjetos con tinción IHQ con microscopía óptica (Axio Imager A2, Carl Zeiss Microimaging Inc., Gottingen, Alemania).

Se tiñó tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 FFPE en ratón atímico montado en un portaobjetos con ITO pretratado con gelatina por el protocolo de tinción múltiple usando cromógenos marcados con isótopos estables sintetizados de forma interna. Se tiñó secuencialmente el mismo portaobjetos para detección de RE y detección de RP. Hubo dos modos de realización de trabajo ejemplares de tinción IHQ independientes para el análisis de imágenes de EM LDI. En un modo de realización de trabajo ejemplar de tinción IHQ (experimento-1), se realizó la tinción IHQ usando una forma ligera de cromógeno para la detección de RE y una forma pesada de cromógeno marcado con isótopo estable para la detección de RP en el portaobjetos con iTo. En otro modo de realización de trabajo ejemplar de tinción IHQ (experimento-2), se realizó la tinción IHQ usando una forma ligera de cromógeno para la detección de RP y una forma pesada de cromógeno marcado con isótopo estable para la detección de RE en el otro portaobjetos con ITO. Se analizaron los dos portaobjetos con ITO con tinción IHQ por análisis de imágenes EM LDI, por separado.

Ejemplo 19: En referencia ahora al esquema 24, se sintetizó lo siguiente.

Síntesis de marcas de masa marcadas con isótopos estables (SIL) y formulación

imagen82

NaNOj.

HBK

----------—►

HjO, ere

imagen83

Y = 'H Ligero o 'H (D) Pesado

Compuesto 1a: Y ■ ’H Compuesto 1b: Y = !H (D)

Esquema 24

Compuesto (1a) - Sal de bencenodiazonio ligera: De acuerdo con el esquema 26, se disolvieron 0,3 ml de anilina (3,3 mmol, 1 equivalente, Sigma 10400) en 1,3 ml de H2O desionizada. Se añadieron gota a gota 1,02 ml de ácido tetrafluorobórico (5,6 mmol, 1,7 equivalentes, Sigma 207934) y se enfrió la mezcla posteriormente a 0 °C. Se disolvieron 228 mg de nitrito sódico (3,3 mmol, 1 equivalente, Fluka 71759) en 0,9 ml de H2O desionizada y se

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añadió gota a gota a la reacción. Se agitó la reacción durante 30 minutos. Se filtró el precipitado, se lavó con H2O desionizada. Se disolvió el residuo en un volumen mínimo de acetona y se precipitó con éter dietílico frío. Se filtró el precipitado, se lavó con éter dietílico frío y se secó a vacío. Se aisló un polvo blanquecino con un rendimiento de un 60 %. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) ó (CDCI3) 8,00 (2,0H, dd, J=7,92, 8,56 Hz), 8,30 (1,0H, t, J=7,72 Hz), 8,64 (1,9H, d, J=7,84 Hz). RMN de 13C (101 MHz, CD3OD) ó 141,2, 132,3, 131,3. IR (cm-1) 3105 (C-H), 2292 (NeN), 1565, 1458, 1307, 1283, 1026, 751,662.

Compuesto (1b) - Sal de bencenodiazonio pesada: De acuerdo con el esquema 26, se disolvieron 0,3 ml de d5- anilina (3,1 mmol, 1 equivalente, Sigma 175692) en 1,3 ml de H2O desionizada. Se añadieron gota a gota 1,02 ml de ácido tetrafluorobórico (5,6 mmol, 1,7 equivalentes, Sigma 207934) y se enfrió la mezcla posteriormente a 0 °C. Se disolvieron 215 mg de nitrito sódico (3,1 mmol, 1 equivalente, Fluka 71759) en 0,9 ml de H2O desionizada y se añadió gota a gota a la reacción. Se agitó la reacción durante 30 minutos. Se filtró el precipitado, se lavó con H2O desionizada. Se disolvió el residuo en un volumen mínimo de acetona y se precipitó con éter dietílico frío. Se filtró el precipitado, se lavó con éter dietílico frío y se secó a vacío. Se aisló un polvo blanquecino con un rendimiento de un 51 %. IR (cm-1) 3342 (C-D), 2361, 2292 (NeN), 1524, 1303, 1017.

Los compuestos 1a y 1b se formularon cada uno en tampón acetato 10 mM hasta una concentración final de 5 mM. Ejemplo 20

Protocolo de tinción múltiple - RE ligero/RP pesado (experimento 1)

La FIG. 12 es un diagrama esquemático de un ensayo multiplexado para la detección de RE y RP con marcas de masa ligera y pesada. Se desparafinó tejido con xenoinjerto de mCF-7 fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) montado en portaobjetos con ITO pretratados con gelatina (EZ Prep, Ventana n.° 950-100) y se recuperó el antígeno (patrón CC1, Ventana n.° 950-124). Después de la recuperación, se añadió una gota de anticuerpo anti-RE (SP1) (Ventana n.° 790-4324) y se incubó a 37 °C durante 16 minutos. Después del lavado, se añadió una gota del conjugado anticuerpo anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina UltraMap (Ventana n.° 760-4314) y se incubó durante 16 minutos. Se logró la detección añadiendo una gota de naftol-fosfato (Ventana n.° 253-4328) y una gota de una solución del compuesto 1a e incubando durante 12 minutos (Light SIL). Se logró la elución de anticuerpo añadiendo tres gotas de un tampón de elución (glicina 25 mM, SDS al 0,1 %, pH 2,0)4, calentando el portaobjetos a 50 °C e incubando durante 28 minutos. Después del lavado, se añadió una gota de anticuerpo anti-RP (1E2) (VMSI n.° 7904296) y se incubó a 37 °C durante 16 minutos. A continuación, se añadió una gota del conjugado anticuerpo anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina y se incubó durante 16 minutos. Se logró la detección añadiendo una gota de naftol- fosfato y una gota de una solución del compuesto 1b e incubando durante 12 minutos (Heavy SIL). Se aclararon los portaobjetos con agua y se secaron al aire. Los iones indicadores esperados y los espectros se ilustran en la FIG. 13.

Protocolo de tinción múltiple - RP ligero/RE pesado (experimento 2)

Se repitió el experimento anterior tiñéndose RP con el compuesto 1a y tiñéndose RE con el compuesto 1b para determinar si existía una diferencia cuantificable cuando se marca un antígeno dado con marcas de masa ligera o pesada. Los iones indicadores esperados y los espectros se ilustran en la FIG. 13.

Análisis de imágenes EM-LDI

Se realizaron mediciones de EM LDI-TOF en un espectrómetro de masas MALDI-TOF Autoflex III™ equipado con un Smartbeam laser™ (Bruker Daltonics Inc, Bremen, Alemania). Se midió la muestra con el EM LDI-TOF (modo lineal) controlado con el programa informático FlexControl (versión 3.3) y el programa informático flexImaging (versión 2.1). Se ajustó el diámetro de láser a "pequeño" con un diámetro de láser de 30 pm y una resolución de imagen de 30 pm. La frecuencia del láser fue de 200 Hz con 100 disparos por adquisición de datos. Se ajustó la potencia de láser a un 40 %, y el intervalo de masa de adquisición de datos fue de 60 ~ 600 Da. Se ajustaron los otros parámetros del instrumento como sigue: fuente de iones 1 (20 kV), fuente de iones 2 (18,85 kV), lente (6 kV), ganancia electrónica de detector (potenciada), tensión de equilibrio de ganancia de detector (lineal, 1300 V). Al mover el láser en incrementos de 30 pm a través de la muestra de tejido, se obtuvieron 1444 espectros del experimento 1 y se obtuvieron 1177 espectros del experimento 2. La FIG. 56 muestra un espectro de masas obtenido del experimento 1 (RE ligero/RP pesado).

Los cromógenos usados en la tinción IHQ, es decir, la forma ligera del cromógeno (compuesto 1a) y el cromógeno marcado con isótopo estable pesado (compuesto 1b), tienen estructura química y composición exactas. La única diferencia es el reemplazo de hidrógeno en la forma ligera del cromógeno por deuterio en el cromógeno marcado con isótopo estable pesado. Por tanto, la eficacia de la reacción química IHQ debería ser exactamente la misma en los dos experimentos independientes (véase la FIG. 12). Esto proporciona un requisito previo para garantizar una detección cuantitativa exacta por EM LDI-TOF.

Además, los precipitados de tinte azoico generados de la reacción química IHQ (FIG. 12) también tienen

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exactamente la misma estructura química y composición excepto por el reemplazo de hidrógeno en la forma ligera de tinte azoico por deuterio en la forma pesada de tinte azoico marcado con isótopo estable; por lo tanto, la fragmentación en la fuente de ambas formas de tinte azoico tras la irradiación láser tendrá exactamente la misma eficacia. Esto, a su vez, proporciona otro requisito previo para garantizar una detección cuantitativa exacta por EM LDI-TOF. En el espectro eM, la intensidad de pico de los iones indicadores generados por la fragmentación en la fuente del tinte azoico se correlacionará únicamente con la concentración del antígeno detectado (RE o RP) en tejido FFPE, permitiendo de este modo una cuantificación exacta (en la que la cuantificación comprende determinar el tamaño de un pico de masa y correlacionarlo con la cantidad de los dos antígenos en la muestra de tejido).

Se exportaron las mediciones de imágenes EM-LDI adquiridas de flexlmaging a Excel (Microsoft Office 2003, SP3, Microsoft Corporation, WA, EE. UU.) para análisis cuantitativo. Los datos de cada medición se componen de la intensidad de pico y sus correspondientes coordenadas para RE y RP, por separado. Se calculó la cuantificación relativa (es decir, la proporción de RE/RP) por la comparación de la intensidad de pico de RE frente a RP en dos experimentos independientes. Se guardaron los resultados cuantitativos como un archivo .txt y se exportaron al programa informático desarrollado de forma interna para el análisis de imágenes (Ventana Analytical Image, Ventana Medical System Inc., AZ, EE. UU.).

Se tiñó tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 FFPE en ratón atímico montado en Superfrost Plus Micro Slide con el kit Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit de ultraView para detección de RE en un portaobjetos y detección de RP en otro portaobjetos. Se tomaron las imágenes ópticas de los portaobjetos con tinción IHQ con microscopía óptica. Como se muestra en las FIGS. 57A-57B, con tinción óptica, el tejido parece tener más antígeno RE que antígeno RP. La FIG. 57C es una imagen óptica de tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 FFPe en ratón atímico montado en un portaobjetos con ITO pretratado con gelatina después de la tinción IHQ múltiple como se describe anteriormente en el experimento 2 donde se tiñó RE con la marca de masa pesada y se tiñó RP con la forma ligera. Puesto que ambas formas de la marca de masa/cromógeno tienen la misma estructura química y composición, la única diferencia es el reemplazo de hidrógeno en la forma ligera por deuterio en la forma pesada. Por tanto, el color del tinte azoico para la detección tanto de RE como de RP es el mismo.

Se procesaron los resultados cuantitativos del análisis de RE/RP por la técnica SILMSI de los experimentos 1 y 2 comparando la intensidad de pico del ion indicador para RE y el ion indicador para RP. Diez puntos de datos representativos del experimento 1 se muestran en la tabla 8.

Tabla 8

Experimento 1

N.° localización punto

Intensidad de pico RE 275 (ligero) Intensidad de pico RP 280 (pesado) Proporción RE/RP

0_R00X215Y073

6,50 2,50 2,60

0_R00X216Y073

7,97 6,10 1,31

0_R00X217Y073

5,71 3,33 1,72

0_R00X218Y073

4,90 6,80 0,72

0_R00X219Y073

7,16 6,32 1,13

0_R00X220Y073

53,65 35,34 1,52

0_R00X221Y073

3286,10 2058,26 1,60

0_R00X222Y073

6,50 4,29 1,52

0_R00X223Y073

6,06 3,86 1,57

0_R00X224Y073

143,57 96,59 1,49

La tabla 9 resume los resultados y compara los dos experimentos usando cuatro categorías de proporción RE/RP, es decir, RE/RP < 0,67, RE/RP e (0,67, 1,50), RE/RP e (1,50, 4,0) y RE/RP > 4,00. Cada "acontecimiento de EM" es un espectro de EM obtenido a medida que el láser pasa por el entramado a través de la muestra de tejido en incrementos de 30 pm.

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Tabla 9

Resumen de resultados de SIL MSI (cáncer de mama con xenoinjerto de MCF 7 en ratón atímico)

RE/RP <0,67 e (0,67,1,50) e (1,50, 4,00) >4,00

N.° de acontecimientos de EM

Experimento 1 61 739 636 8

Experimento 2

32 603 540 2

% de acontecimientos de EM

Experimento 1 4,22 51,18 44,17 0,55

Experimento 2

2,72 51,23 45,88 0,17

Media

Experimento 1 0,55 1,14 1,97 6,53

Experimento 2

0,54 1,17 2,04 4,72

Desviación estándar

Experimento 1 0,10 0,22 0,40 3,50

Experimento 2

0,11 0,21 0,46 0,74

Error estándar de la media

Experimento 1 0,01 0,01 0,02 1,24

Experimento 2

0,02 0,01 0,02 0,52

Al analizar los resultados cuantitativos de los dos experimentos independientes, queda claro que el nivel de expresión de RE es mayor que el de RP en el tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 en ratón atímico. En la categoría de RE/RP e (1,50, 4,00), existe un 44,17 % de mediciones en el experimento-1 y un 45,88 % de mediciones en el experimento-2. De forma interesante, en la categoría de RE/RP e (0,67, 1,50), existe un 51,18% de mediciones en el experimento-1 y un 51,23% de mediciones en el experimento-2. Estos resultados indican que aproximadamente un 45 % de las mediciones muestran un RE regulado por incremento en comparación con la expresión de RP en el tejido de cáncer de mama con xenoinjerto de MCF-7 en ratón atímico, y aproximadamente un 50 % de las mediciones muestran que RE y RP tienen niveles de expresión similares. Solo un 4,22 % de las mediciones del experimento-1 muestran RE/RP < 0,67, y un 2,72 % de las mediciones del experimento-2 muestran RE/RP < 0.67. Las FIGS. 58A-58B son gráficos de barras que resumen los resultados de los experimentos 1 y 2, respectivamente. Aunque se observa que el nivel de expresión global de RE es mayor que el de RP visualizando las imágenes ópticas de la tinción IHQ usando el kit Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit de ultraView, no se puede determinar la proporción exacta de RE/RP a través de la sección de tejido con tinción IHQ convencional. Sin embargo, al aplicar un modo de realización de la técnica SILMSI divulgada, las se pueden determinar cuantitativamente las proporciones RE/RP a través de la sección de tejido teñida. Esto, a su vez, proporcionará información valiosa en la evaluación histológica del cáncer.

Para investigar la influencia del orden de marcaje con isótopo estable (dirección) en el análisis cuantitativo de RE/RP por SILMSI, se realizaron dos experimentos independientes como se describe anteriormente para demostrar que los resultados no se vieron afectados en base a qué antígeno se marcó con la marca de masa ligera y qué antígeno se marcó con la marca de masa pesada. La FIG. 59 muestra el perfil de tendencia/relación similar de las proporciones RE/RP a través de las mediciones (o acontecimientos de EM) de los dos experimentos independientes con dirección inversa de marcaje con isótopo estable. Para cada experimento, se clasificaron las proporciones RE/RP calculadas a partir de los espectros obtenidos desde baja a alta y se representaron. El gráfico demuestra que no existe una influencia significativa de la dirección de marcaje con isótopo estable en los resultados cuantitativos. En otras palabras, se obtuvieron resultados sustancialmente similares tanto si RE se marcó con la marca de masa ligera y RP se marcó con la marca de masa pesada, o viceversa. Para investigar la fiabilidad o reproducibilidad de la técnica SILMSI, se analizaron estadísticamente los resultados de los experimentos 1 y 2 (FIG. 60). Una comparación lado a lado de la proporción de RE/RP entre los dos experimentos muestra que el valor medio fue de 0,55 con una barra de error de 0,01 en el experimento 1, y el valor medio fue de 0,54 con una barra de error de 0,02 en el experimento-2 para el tramo de RE/Rp <0,67. El valor medio fue de 1,14 con una barra de error de 0,01 en el experimento-1, y el valor medio fue de 1,17 con una barra de error de 0,01 en el experimento-2 para el tramo de RE/RP e (0,67, 1,50). El valor medio fue de 1,97 con una barra de error de 0,02 en el experimento-1, y el valor medio fue de 2,04 con una barra de error de 0,02 en el experimento-2 para el tramo de RE/RP e (1,50, 4,00). Por tanto, tanto los valores medios como las barras de error del análisis cuantitativo de RE/RP en los tres tramos diferentes fueron muy similares y no se encontraron diferencias significativas entre los dos experimentos en el mismo tramo. Aunque el valor medio fue de 6,53 con una barra de error de 1,24 en el experimento-1, y el valor medio fue de 4,72 con una barra de error de 0,52 en el experimento-2 para el tramo de RE/RP > 4,00, solo hubo 8 mediciones (un 0,55 % de las mediciones totales) en el experimento-1 y 2 mediciones (un 0,17 % de las mediciones totales) en el experimento-2 para el tramo de RE/RP > 4,00. Los resultados de este tramo se consideraron valores atípicos. Por tanto, la técnica SILMSI proporciona un análisis cuantitativo exacto y fiable para múltiples biomarcadores (Re y RP) en tejido FFPE.

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Para investigar el intervalo dinámico y la linealidad de la técnica SILMSI, se clasificaron las intensidades de pico para RE (FIG. 61) y RP (FIG. 62) desde baja a alta y se representaron frente a las mediciones (acontecimientos de EM) para el experimento 1 (RE marcado con marca de masa ligera) y experimento 2 (RE marcado con marca de masa pesada). Como se muestra en las FIGS. 81 y 82, la tinción IHQ produce una relación observable entre la intensidad de pico del ion indicador y la concentración de RE o RP en el tejido FFPE. Las FIGS. 83 y 84 ilustran el log de la intensidad de pico de RE y RP con la medición. Este resultado es indicativo del intervalo dinámico. La medición de la intensidad de pico se observó en el intervalo de aproximadamente 5-3500.

La proporción de RE/RP de cada sección de 30 x 30 pm de las muestras de tejido de los experimentos 1 y 2 se procesó en Microsoft Excel® y se generaron "mapas térmicos" usando tres puntos de corte diferentes de RE/RP. Cuando RE/RP < 0,67, la sección correspondiente en el mapa térmico se coloreó en verde. Cuando RE/RP >1,50, la sección correspondiente se coloreó en rojo. Cuando RE/RP e (0,67, 1,50), la sección correspondiente se coloreó en amarillo. El número en cada recuadro es la proporción numérica de RE/RP determinada a partir de la medición real en la sección de tejido. La muestra de tejido del experimento 1 midió 1,14 mm x 1,14 mm, y la muestra de tejido del experimento 2 midió 1,05 mm x 0,96 mm. La FIG. 14 es el mapa térmico del experimento-1, y la FIG. 15 es el mapa térmico del experimento-2.

Las FIGS. 16-18 son otras representaciones de "mapas térmicos" de los datos de RE/RP mostrados en las FIGS. 24-27. Se exportaron los datos procesados en Microsoft Excel® a un programa informático interno, Ventana Analytical Image (descrito en el presente documento), y se convirtieron en una imagen con colores que se transforman de azul a rojo a medida que se incrementa la proporción RE/RP. La resolución de imagen para las FIGS. 16-18 es de 30 pm. La FIG. 16 representa proporciones rE/RP que varían de 0,2 a 4,0 para los experimentos 1 y 2. La FIG. 17 representa un subconjunto de las proporciones RE/RP que varía de 0,66 a 1,5 para los experimentos 1 y 2. La FIG. 18 representa un subconjunto de las proporciones Re/RP que varía de 2,0 a 4,0 para los experimentos 1 y 2.

Ejemplo 21: Detección multiplexada de Her2 intacto y truncado

La FIG. 12 es un diagrama esquemático de un ensayo multiplexado para la detección de Her2 intacto y truncado con marcas de masa ligera y pesada. Se desparafina tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) montado en portaobjetos con ITO pretratados con gelatina y se recupera el antígeno. Después de la recuperación, se añade anticuerpo SP3 y se incuba. El anticuerpo SP3 se unirá a Her2 intacto. Después del lavado, se añade un conjugado de anticuerpo anti-SP3/fosfatasa alcalina y se incuba. Se logra la detección añadiendo naftol-fosfato y compuesto 1a e incubando. Se logra la elución de anticuerpo añadiendo tampón de elución e incubando. Después del lavado, se añade anticuerpo 4B5 y se incuba. El anticuerpo 4B5 se unirá a Her2 truncado e intacto. Después del lavado, se añade un conjugado de anticuerpo anti-4B5-fosfatasa alcalina y se incuba. Se logra la detección añadiendo naftol- fosfato y compuesto 1b e incubando. Se aclara el portaobjetos con agua y se seca al aire.

Se realizan mediciones de EM LDI-TOF. Se obtienen múltiples espectros moviendo el láser en incrementos a través de la muestra de tejido. Las mediciones de imágenes se exportan para el análisis cuantitativo. Los datos para cada medición se componen de la intensidad de pico y sus correspondientes coordenadas para el código de masa ligero (solo Her2 intacto) y el código de masa pesado (Her2 truncado e intacto). Para cada medición, se calcula la cuantificación relativa (es decir, la proporción de Her2 intacto/Her2 total) por la comparación de la intensidad de pico del código de masa ligero frente al código de masa pesado. Se calcula la proporción de Her2 intacto/Her2 truncado comparando la intensidad de pico del código de masa ligero con la diferencia entre las intensidades de pico de los códigos de masa pesado y ligero (es decir, intensidad de pico de código de masa pesado - intensidad de pico de código de masa ligero).

Procedimientos generales para tinción tisular y obtención de imágenes de masa usando modos de realización ejemplares del conjugado de precursor de marca de masa divulgado: Se puede teñir una muestra de tejido fijado con formol e incluido en parafina (FFPE) en un instrumento Ventana Benchmark XT con reactivos estándar. Después de la desparafinación y el acondicionamiento celular adecuado (recuperación de antígeno), se marca la diana específica de interés en la muestra de tejido con un conjugado de anticuerpo-HRP para localizar la peroxidasa en la diana. Se expone el tejido a una mezcla de 100 l de H2O2 de un kit de detección Ventana

UltraView™ y 100 l de solución de sustrato de tiramina o de derivado de tiramina a una concentración

adecuada, normalmente en el intervalo de 1 a 200 M. Se deja que la reacción avance a 37 °C durante un determinado período de tiempo (por ejemplo, 4-60 minutos). Después de la reacción, se lava a fondo el portaobjetos con tampones y agua. Se puede secar el portaobjetos a vacío o en un horno para retirar agua. Se aplica material de matriz tal como CHCA, SA o DHB sobre el tejido usando un pulverizador Bruker Imageprep. Se obtienen imágenes de la muestra recubierta con matriz usando un espectrómetro MALDI AutoFlex III (Bruker). Se hace referencia a las FIGS. 4 y 5 para el procedimiento de tinción ejemplar. Se seleccionó Ki-67 de amígdala con Rb-anti-Ki-67 para producir una diana marcada. Se marcó adicionalmente la diana con un conjugado de enzima-resto de unión específica, que comprende anticuerpo anti-IgG de conejo caprino y peroxidasa de rábano picante (HRP). Se usó un conjugado de precursor de marca de masa [por ejemplo, Dabsy1-PEG8-PL-tiramina (68 M)] como sustrato. A continuación se ionizó la muestra y se detectaron los códigos de masa. Los picos a m/z = aproximadamente 728 y 750 corresponden al código de masa y su aducto de sodio. Se usó ácido a-ciano-4-hidroxicinámico como matriz.

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Ejemplo 22: Con referencia al esquema 18, en primer lugar se cargó un conector fotoescindible de nitrofenilo 166 (Advanced ChemTech, RT1095) sobre una resina de cloruro de tritilo 164. Se retiró el grupo protector Fmoc de la amina protegida 168 en 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno al 2 %/dimetilformamida (DBU/DMF) durante 10 minutos para proporcionar la amina 170. Se activó un aminoácido protegido con Fmoc usando los reactivos de acoplamiento de péptidos estándar diisopropilcarbodiimida (DIC)/hidroxibenzotriazol (HOBt) y se conjugó con el grupo amino del conector de nitrofenilo en la resina 172. Después de la reacción de acoplamiento, se retiró posteriormente el grupo Fmoc en DBU al 2 %/DMF. Se escindió el conjugado final 174 de la resina en un cóctel de ácido trifluoroacético (TFA) adecuado para proporcionar un conjugado de nitrofenilo 176 con un grupo ácido carboxílico libre para una conjugación adicional con tiramina.

Ejemplo 23: Con referencia al esquema 19, se conjugó la tiramina con el ácido carboxílico conector fotoescindible de nitrofenilo 176 a través de una reacción de acoplamiento mediada por carbodiimida estándar. A un equivalente de 1 en DMF se le añadieron 1,5 eq de DCC y NHS para proporcionar el éster activo 178. Se usó el éster NHS 178 sin separación en la siguiente reacción añadiendo de 2 a 5 eq de tiramina. Después de agitar a temperatura ambiente durante al menos 4 horas, se retiró el material insoluble por filtración y se concentró la solución. Se purificó adicionalmente el conjugado de tiramida 180 por HPLC. Se usa este procedimiento para producir una variedad de códigos de masa detectables, que tienen, por ejemplo, las siguientes proporciones m/z.

imagen84

imagen85

Fwmula química

Masa exacta 396,151

r

Formula química:

Masa exacta: 1120,554

Peso molecular: 1121.23-4

Ejemplo 24: Se sintetizó un conjugado de tiramida, CDO-PEG8-Arg-PL-Tyr (ilustrado a continuación) de acuerdo con los procedimientos generales descritos en los ejemplos 1 y 2. Se escindió la molécula en condiciones MALDI para dar un ion detectable a m/z = 840.

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Se depositó la marca de tiramida en la diana tisular (Ki-67 en tejido de amígdala) a través de una reacción de adición oxidativa mediada por HRP usando el procedimiento de tinción de tejido general y el esquema en la FIG. 85. También se realizó en paralelo un portaobjetos de control (se añadió AP en lugar de HRP) con la muestra de interés, usándose el mismo tratamiento de tinción posterior. Después de la aplicación de la matriz (CHCA), se obtuvieron imágenes de los portaobjetos usando Bruker Autoflex III. Los resultados se muestran en las FIGS. 65A-65C. Se observó el ion de marca de masa esperado de m/z = 840 en la muestra con HRP, mientras que este ion de marca de masa particular estaba ausente del portaobjetos de control (sin HRP).

Ejemplo 25: Otro modo de realización de trabajo ejemplar se realizó en un portaobjetos de xenoinjerto 3 en 1 de Her2 con anticuerpo anti-Her2 (Ventana 4B5) como anticuerpo primario. Se siguió un procedimiento sustancialmente similar al del ejemplo 3. Las FIGS. 66A-66C muestran el mapa térmico de m/z = 840 obtenido del modo de realización de trabajo ejemplar de MSI. Como se esperaba, se observó una señal fuerte para el xenoinjerto de Calu- 3, mientras que se registró poca señal de los otros dos xenoinjertos (ZR-75-1 y MCF7).

Las siguientes patentes de EE. UU., publicaciones de patente y solicitudes están asignadas a Ventana Medical Systems, Inc., el cesionario de la presente solicitud: patente de EE. UU. N.° 7,695,929; publicación de patente de EE. UU. N.° 2007/0117153; publicación de patente de EE. UU. N.° 2006/0246524; publicación de patente de EE. UU. N.° 2006/0246423; solicitud de patente de EE. UU. N.° 12/154.472; solicitud provisional de EE. UU. N.° 61/328.494; solicitud provisional de EE. UU. N.° 61/398.946; y solicitud provisional de EE. UU. N.° 61/464.216.

En vista de los muchos modos de realización posibles a los que se pueden aplicar los principios de la invención divulgada, se debe reconocer que los modos de realización ilustrados son solo ejemplos preferentes de la invención. Más bien, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones.

Claims (13)

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   1. Un procedimiento que comprende:

   (a) proporcionar una muestra de tejido fijado con formol e incluido en parafina que comprende una pluralidad de dianas;

   (b) poner en contacto la muestra de tejido con un primer resto de unión específica que puede reconocer y unirse a una primera diana en la muestra de tejido y un segundo resto de unión específica que puede reconocer y unirse a una segunda diana en la muestra de tejido;

   (c) poner en contacto la muestra de tejido con un primer conjugado que comprende una primera enzima y un primer anticuerpo que puede reconocer y unirse al primer resto de unión específica;

   (d) poner en contacto la muestra de tejido con un primer resto de sustrato enzimático y un primer precursor de marca de masa, en el que el primer resto de sustrato enzimático reacciona con la primera enzima y el primer precursor de marca de masa para producir y depositar una primera marca de masa en la primera diana;

   (e) desactivar la primera enzima;

   (f) poner en contacto la muestra de tejido con un segundo conjugado que comprende una segunda enzima y un segundo anticuerpo que puede reconocer y unirse al segundo resto de unión específica;

   (g) poner en contacto la muestra de tejido con un segundo resto de sustrato enzimático y un segundo precursor de marca de masa, en el que el segundo resto de sustrato enzimático reacciona con la segunda enzima y el segundo precursor de marca de masa para producir y depositar una segunda marca de masa en la segunda diana, en el que el primer y segundo restos de sustrato enzimático tienen la misma estructura química, el primer y segundo precursores de marcas de masa tienen la misma estructura química y al menos uno del primer precursor de marca de masa o segundo precursor de marca de masa está radiomarcado de modo que la primera marca de masa y la segunda la marca de masa difieren en masa;

   (h) ionizar la primera marca de masa y la segunda marca de masa para producir un primer código de masa y un segundo código de masa, en el que cada código de masa tiene la misma estructura química pero difiere en masa de cualquier otro código de masa producido a partir de cualquier otra marca de masa;

   (i) detectar cada código de masa usando un espectrómetro de masas; y

   (j) cuantificar relativamente cada diana cuantificando una cantidad de cada código de masa midiendo un pico de espectrometría de masas que tiene una proporción m/z correspondiente a una proporción m/z esperada de ese código de masa.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer precursor de marca de masa y el segundo precursor de marca de masa tienen las estructuras

   imagen1

   donde n es 1, 2, 3, 4 o 5, opcionalmente en el que el primer precursor de marca de masa y el segundo precursor de marca de masa tienen las estructuras

   imagen2
3. 3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el primer y segundo restos de sustrato enzimático se seleccionan de un compuesto de metoxi-naftol o naftol-azoico y

   la primera enzima y las segundas enzimas son enzimas fosfatasas.
4. 4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:

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   poner en contacto la muestra de tejido en la etapa (b) con uno o más restos de unión específica posteriores, cada resto de unión específica posterior puede reconocer y unirse a una diana posterior en la muestra de tejido;

   desactivar la segunda enzima después de la etapa (g);

   realizar secuencialmente las siguientes etapas para cada una de las una o más dianas posteriores antes de realizar la etapa (h):

   poner en contacto la muestra de tejido con un conjugado adicional para una de las una o más dianas posteriores, comprendiendo el conjugado adicional un anticuerpo adicional y una enzima adicional, en el que el anticuerpo adicional puede reconocer y unirse a la una de las una o más dianas posteriores o a un resto de unión específica previamente unido a la una de las una o más dianas posteriores,

   poner en contacto la muestra con un resto de sustrato enzimático adicional y un precursor de marca de masa adicional, en el que el resto de sustrato enzimático adicional reacciona con la enzima adicional y el precursor de marca de masa adicional para producir y depositar una marca de masa adicional en la una de las una o más dianas posteriores, en el que el resto de sustrato enzimático adicional tiene la misma estructura química que el primer y segundo restos de sustrato enzimático, el precursor de marca de masa adicional tiene las mismas estructuras químicas que el primer y segundo precursores de marca de masa, y el precursor de marca de masa adicional está radiomarcado de modo que la marca de masa adicional tiene una masa que difiere de las masas de la primera marca de masa, la segunda marca de masa y cualquier otra marca de masa adicional; y

   desactivar la enzima adicional si está presente otra diana posterior.
5. 5. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en el que la muestra de tejido comprende de 2 a 4 dianas, y el primer precursor de marca de masa, el segundo precursor de marca de masa y cualquier precursor de marca de masa adicional se seleccionan de

   imagen3

   donde n es 0, 1, 2, 3, 4 o 5, y R1 y R1' son independientemente alquilo inferior y están opcionalmente sustituidos con uno o más isótopos.
6. 6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el primer precursor de marca de masa, el segundo precursor de marca de masa y cualquier precursor de marca de masa adicional se seleccionan de

   imagen4
7. 7. El procedimiento de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que el primer resto de sustrato enzimático, el segundo resto de sustrato enzimático y cualquier resto de sustrato enzimático adicional tienen la estructura

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   la primera enzima, la segunda enzima y cualquier enzima adicional son enzimas fosfatasas.
8. 8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la pluralidad de dianas comprende una pluralidad de biomarcadores de cáncer.
9. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los biomarcadores de cáncer comprenden al menos dos biomarcadores de cáncer de mama seleccionados de RE, RP, Her1, Her2, Her3, Her4 o Ki67.
10. 10. El procedimiento de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que cada biomarcador de cáncer comprende una proteína o un péptido, y en el que el primer resto de unión específica es un anticuerpo que puede reconocer y unirse a un primer biomarcador de cáncer, el segundo resto de unión específica es un anticuerpo que puede reconocer y unirse a un segundo biomarcador de cáncer, y cada resto de unión específica posterior es un anticuerpo que puede reconocer y unirse a un biomarcador de cáncer posterior.
11. 11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que cada biomarcador de cáncer comprende una secuencia de ácido nucleico, y en el que el primer resto de unión específica es una sonda marcada que puede reconocer e hibridarse a un primer biomarcador de cáncer o una porción del mismo, el segundo resto de unión específica es un sonda marcada que puede reconocer e hibridarse a un segundo biomarcador de cáncer o una porción del mismo, y cada resto de unión específica posterior es una sonda marcada que puede reconocer e hibridarse a un biomarcador de cáncer posterior o una porción del mismo.
12. 12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la primera diana comprende una forma intacta de un biomarcador y la segunda diana comprende una o más formas truncadas del biomarcador.
13. 13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el primer resto de unión específica puede reconocer y unirse a la forma intacta del biomarcador, y el segundo resto de unión específica puede reconocer y unirse a una forma truncada del biomarcador y a la forma intacta del biomarcador, en el que el segundo resto de sustrato enzimático reacciona con la segunda enzima y el segundo precursor de marca de masa para producir y depositar una segunda marca de masa en la forma truncada del biomarcador y en la forma intacta del biomarcador, y en el que cuantificar la forma truncada del biomarcador comprende cuantificar el primer código de masa y el segundo código de masa y determinar la diferencia numérica entre el segundo código de masa cuantificado y el primer código de masa cuantificado.