JP2023542867A - 疾患の検出／診断、病期分類、モニタリング及び処置のための生体外でのプロテアーゼ活性検出 - Google Patents

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Abstract

本出願は、対象の疾患又は状態を決定するための組成物及び方法を提供する。この方法は、体液をそのレポーターを含む分子と接触させることを含み、レポーターは体液中の作用物質によって切断される。本方法によって決定され得る疾患及び状態も記載される。対象由来の血漿試料を生体外で分子と接触させること、及び前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出することを含む方法が、本明細書で提供される。本明細書では、方法をさらに提供する。前記分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、前記切断可能なリンカーが、前記血漿由来の作用物質によって切断され、前記分子から前記レポーターを放出させる方法を、本明細書中にさらに提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０２０年９月１１日に出願された米国仮出願第６３／０７７，５２５号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
簡単な概要
対象由来の血漿試料を生体外で分子と接触させること、及び前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出することを含む方法が、本明細書で提供される。本明細書では、方法をさらに提供する。前記分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、前記切断可能なリンカーが、前記血漿由来の作用物質によって切断され、前記分子から前記レポーターを放出させる方法を、本明細書中にさらに提供する。
血漿試料に抗凝固剤を導入することをさらに含む方法を、本明細書中にさらに提供する。抗凝固剤が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリン、シュウ酸塩、任意の塩、それらの溶媒和物、鏡像異性体、互変異性体及び幾何異性体、又はそれらの任意の混合物である方法を、本明細書中にさらに提供する。
疾患又は状態を有する対象からの体液試料を生体外で分子と接触させる工程を含む方法を、本明細書中に提供する。分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、かつ切断可能なリンカーが、体液由来の作用物質によって切断され、分子からレポーターを放出する、方法を、本明細書中にさらに提供する。放出されたレポーターの形成速度又は量が、健康な対象と有意に異なる方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象からの体液試料を生体外で第１の分子と接触させる工程であって、第１の分子が、第１の切断可能なリンカー及び第１のレポーターを含み、第１の切断可能なリンカーが、体液由来の第１の作用物質によって切断され、第１の分子から第１のレポーターを放出する、工程を含む方法を、本明細書中に提供する。第１の放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する方法を、本明細書中にさらに提供する。対象からの体液試料を生体外で第２の分子と接触させる方法を本明細書中にさらに提供し、第２の分子が、第２の切断可能なリンカー及び第２のレポーターを含み、第２の切断可能なリンカーが、体液由来の第２の作用物質によって切断され、第２の分子から第２のレポーターを放出する。第２の放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する方法を、本明細書中にさらに提供する。第１の放出されたレポーターの検出及び第２の放出されたレポーターの検出に基づいて対象の疾患又は状態を決定する方法を、本明細書中にさらに提供する。
決定が、教師あり機械学習分類アルゴリズム、ロジスティック回帰、単純ベイズ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、勾配ブースティング、ニューラルネットワーク、連続回帰手法、リッジ回帰、カーネルリッジ回帰、サポートベクター回帰、又はそれらの任意の組み合わせを含む方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象からの体液試料を生体外で分子と接触させる工程であって、分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、切断可能なリンカーは、体液由来の作用物質によって切断され、分子からレポーターを放出する、工程を含む方法を、本明細書中に提供する。放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程と、検出に基づいて対象の疾患又は状態を決定する工程であって、疾患又は状態が、特定の線維症病期又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特定の非アルコール性脂肪性肝疾患活動性スコア（ＮＡＳ）である、工程と、を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象からの体液試料を生体外で分子と接触させる工程であって、分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、切断可能なリンカーは、体液由来の作用物質によって切断され、分子からレポーターを放出する、工程を含み方法を、本明細書中に提供する。放出されたレポーターの形成速度又は量を検出し、検出に基づいて対象の疾患又は状態を決定し、疾患又は状態が、肝疾患、癌、臓器移植拒絶、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫、アルツハイマー病及び慢性炎症からなる群から選択され、癌は、膵管腺癌でも非小細胞肺癌でもない、方法を、本明細書中にさらに提供する。
肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、毒素媒介性肝傷害、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、原発性胆管炎（ＰＢＣ）、胆管癌、原発性硬化性胆管炎、移植肝臓の急性又は慢性拒絶、遺伝性肝疾患、又はそれらの組み合わせを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
体液試料が、血液、血漿、骨髄液、リンパ液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脳脊髄液、脊髄液、滑液、精液、管吸引液、糞便、便、膣流出液、涙液、組織溶解物及び患者由来細胞株上清からなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
体液試料が、洗浄液、コンディショニング培地又は緩衝液、スワブウイルス輸送媒体、食塩水、培養培地、又は細胞培養上清を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
洗浄液が、洗口洗浄液、気管支肺胞上皮洗浄液、洗浄液、洗髪洗浄液、鼻スプレー流出物、食塩水若しくは任意の媒体又はその派生物に適用された任意の体表、開口部、臓器構造又は固形腫瘍生検のスワブからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
作用物質が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、β－グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ及びホスホジエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、求核試薬、還元試薬、求電子／酸性試薬、有機金属／金属触媒、酸化試薬、ヒドロキシルイオン、チオール求核剤、窒素求核剤、亜ジチオン酸ナトリウム及び過ヨウ素酸ナトリウムからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
作用物質が、プロテアーゼである、方法を、本明細書中にさらに提供する。プロテアーゼが、エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼである、方法を、本明細書中にさらに提供する。プロテアーゼが、Ａ２０（ＴＮＦａ誘導タンパク質３）、アブヒドロラーゼドメイン含有４、アブヒドロラーゼドメイン含有１２、アブヒドロラーゼドメイン含有１２Ｂ、アブヒドロラーゼドメイン含有１３、アクロシン、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２（ファーティリン－ｂ）、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ４、ＡＤＡＭ４Ｂ、ＡＤＡＭ５、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２メタロプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５／１１、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０、脂肪細胞ｅｎｈ．結合タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質２、気道トリプシン様プロテアーゼ、アミノアシラーゼ、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＢ様１、アミノペプチダーゼＭＡＭＳ／Ｌ－ＲＡＰ、アミノペプチダーゼＮ、アミノペプチダーゼＯ、アミノペプチダーゼＰホモログ、アミノペプチダーゼＰ１、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ、アミノペプチダーゼＱ、アミノペプチダーゼ様１、ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、ＡＭＳＨ－ＬＰ／ＳＴＡＭＢＰＬ１、アンギオテンシン変換酵素１（ＡＣＥ１）、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アンジオテンシン変換酵素３（ＡＣＥ３）、アニオン性トリプシン（ＩＩ）、アポリポタンパク質（ａ）、アーケアメトジンシン（ａｒｃｈａｅｍｅｔｚｉｎｃｉｎ）－１、アーケアメトジンシン－２、アスパルトアシラーゼ、アスパルトアシラーゼ－３、アスパルチルアミノペプチダーゼ、アタキシン－３、アタキシン－３様、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質１、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様２、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様３、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様４、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様５、ＡＴＰ２３ペプチダーゼ、オートファジン－１、オートファジン－２、オートファジン－３、オートファジン－４、アズロシジン、ベータラクタマーゼ、ベータセクレターゼ１、ベータセクレターゼ２、ブレオマイシン加水分解酵素、脳のセリンプロテイナーゼ２、ＢＲＣＣ３６（ＢＲＣＡ２含有複合体、サブ３）、カルパイン、カルパイン１、カルパイン２、カルパイン３、カルパイン４、カルパイン５、カルパイン６、カルパイン７、カルパイン７様、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２、カルパイン１３、カルパイン１４、カルパイン１５（Ｓｏｌｈタンパク質）、システインプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＡ３、カルボキシペプチダーゼＡ４、カルボキシペプチダーゼＡ５、カルボキシペプチダーゼＡ６、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、カルボキシペプチダーゼＯ、カルボキシペプチダーゼＵ、カルボキシペプチダーゼＸ１、カルボキシペプチダーゼＸ２、カルボキシペプチダーゼＺ、カルノシンジペプチダーゼ１、カルノシンジペプチダーゼ２、カスパーゼ動員ドメインファミリー、メンバー８、カスパーゼ、カスパーゼ－１、カスパーゼ－２、カスパーゼ－３、カスパーゼ－４／１１、カスパーゼ－５、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９、カスパーゼ－１０、カスパーゼ－１２、カスパーゼ－１４、カスパーゼ－１４様、ｃａｓｐｅｒ／ＦＬＩＰ、カテプシン、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ（ＣＴＳＳ）、カテプシンＶ（ＣＴＳＶ）、カテプシンＷ、カテプシンＺ（ＣＴＳＺ）、カチオン性トリプシン、ｃｅｚａｎｎｅ／ＯＴＵドメイン含有７Ｂ、ｃｅｚａｎｎｅ－２、ＣＧＩ－５８、キマーゼ、キモパシン（ｃｈｙｍｏｐａｓｉｎ）、キモシン、キモトリプシンＢ、キモトリプシンＣ、凝固因子ＩＸａ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子Ｘａ、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＸＩＩａ、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ２、コラゲナーゼ３、補体プロテアーゼＣ１ｒセリンプロテアーゼ、補体プロテアーゼＣ１ｓセリンプロテアーゼ、補体Ｃ１ｒホモログ、補体成分２、補体成分Ｃ１ｒａ、補体成分Ｃ１ｓａ、補体因子Ｂ、補体因子Ｄ、補体因子Ｄ様、補体因子Ｉ、ＣＯＰＳ６、コリン（ｃｏｒｉｎ）、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１）、円柱腫症タンパク質（ｃｙｌｉｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトゾルアラニルアミノｐｅｐ．様１、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、ＤＤＩ関連プロテアーゼ、デシシン（ＤＥＣＹＳＩＮ）、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー１、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー２、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー３、ＤＥＳＣ１プロテアーゼ、デザートヘッジホッグタンパク質、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ１、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ２、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質１、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質３、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質４、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質５、ＤＩＮＥペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ジペプチジルペプチダーゼ６（ＤＰＰ６）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼ１０（ＤＰＰ１０）、ＤＪ－１、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質２、ＤＵＢ－１、ＤＵＢ－２、ＤＵＢ２ａ、ＤＵＢ２ａ様、ＤＵＢ２ａ様２、ＤＵＢ６、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。プロテアーゼが、Ｔ細胞プロテアーゼ、補体プロテアーゼ、線維症プロテアーゼ及び炎症関連プロテアーゼからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
切断可能なリンカーが、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、エステル、グリコシド、リン脂質、ホスホジエステル、求核剤／塩基感受性リンカー、還元感受性リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属で切断可能なリンカー、酸化感受性リンカー又はそれらの組み合わせである、方法を、本明細書中にさらに提供する。切断可能なリンカーが、ペプチドである、方法を、本明細書中にさらに提供する。ペプチドが、配列番号１～６７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
切断可能なリンカーが、共有結合を介してレポーターに直接連結されている、方法を、本明細書中にさらに提供する。レポーターが、蛍光標識、質量タグ、発色団、電気化学的に活性な分子、バイオレイヤー干渉法若しくは表面プラズモン共鳴で検出可能な分子、沈殿物質、質量分析及び液体クロマトグラフィー基質、磁気的に活性な分子、ゲル形成及び／若しくは粘度変化分子、イムノアッセイで検出可能な分子、細胞ベースの増幅で検出可能若しくは核酸バーコード、又はそれらの任意の組み合わせを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。レポーターが、蛍光標識を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光標識が、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）、２－アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ３及び（５－（（２－アミノエチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸）（ＥＤＡＮＳ）から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
分子が、蛍光消光剤をさらに含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光消光剤が、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＢＢＱ６５０、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＣＰＱ２、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、ＤＡＢＣＹＬ（４－（［４’－ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）ベンゾイル）、Ｄｎｐ（２，４－ジニトロフェニル）及びＥｃｌｉｐｓｅからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光消光剤が、共有結合を介して切断可能なリンカーに直接接続されている、方法を、本明細書中にさらに提供する。
分子が担体をさらに含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。担体が、天然タンパク質、標識タンパク質若しくは合成タンパク質、正確に既知の化学組成の、又は平均分子量付近の分布を有する合成化学ポリマー、オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、フォルダマー、脂質、脂質ミセル、ナノ粒子、ポリスチレン、ポリプロピレン若しくは任意の他の種類のプラスチック製の固体支持体、又はそれらの任意の組み合わせを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象が哺乳動物である、方法を、本明細書中にさらに提供する。哺乳動物が、ヒトである、方法を、本明細書中にさらに提供する。
レポーターが、自壊スペーサーを介して切断可能なリンカーに連結されている、方法を、本明細書中にさらに提供する。自壊スペーサーが、ジスルフィド、ヘテロアミン二官能性ジスルフィド、チオールベースのピリダジンジオン、ｐ－アミンベンジルオキシカルボニル、ジペプチド、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌ－Ｐｈｅ－Ｓａｒ、トランス－シクロオクテンテトラジン、オルトヒドロキシ保護アリールスルフェート、ホスホルアミデートベースのスペーサー、ヒドロキシベンジル、トリメチルカルバメート及びキノンメチドベースのスペーサーからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
検出が、蛍光検出、分光検出、質量分析、免疫学的検出又はイメージング検出を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。検出が、蛍光検出を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光検出が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である、方法を、本明細書中にさらに提供する。
切断されたレポーターが沈殿性フルオロフォアを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。沈殿性フルオロフォアが、ＨＰＱ、Ｃｌ－ＨＰＱ、ＨＴＰＱ、ＨＢＰＱ又はＨＱＰＱを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象からの体液試料中の２又はそれより多い作用物質の活性を測定する工程と、活動に基づいて対象の疾患又は状態を決定する工程であって、疾患又は状態が、肝疾患、臓器移植拒絶、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫、アルツハイマー病及び慢性炎症からなる群から選択される、工程と、を含む、方法を、本明細書中に提供する。
肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、毒素媒介性肝傷害、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、原発性胆管炎（ＰＢＣ）、胆管癌、原発性硬化性胆管炎、移植肝臓の急性又は慢性拒絶、遺伝性肝疾患、又はそれらの組み合わせを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象からの体液試料中の２又はそれより多い作用物質の活性を測定する工程と、活性に基づいて対象の疾患又は状態を決定する工程であって、疾患又は状態が、特定の線維症病期又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特定の非アルコール性脂肪性肝疾患活動性スコア（ＮＡＳ）である、工程と、を含む、方法を、本明細書中に提供する。
測定する工程が、対象からの体液試料を生体外で分子と接触させることであって、分子が、切断可能なリンカー及びレポーターを含み、かつ切断可能なリンカーが、血漿由来のプロテアーゼによって切断され、分子からレポーターを放出する、接触させることと、放出されたレポーターの形成速度又は量を検出することと、を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
作用物質が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、β－グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ及びホスホジエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、求核試薬、還元試薬、求電子／酸性試薬、有機金属／金属触媒、酸化試薬、ヒドロキシルイオン、チオール求核剤、窒素求核剤、亜ジチオン酸ナトリウム及び過ヨウ素酸ナトリウムからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。作用物質が、プロテアーゼである、方法を、本明細書中にさらに提供する。プロテアーゼが、エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼである、方法を、本明細書中にさらに提供する。プロテアーゼが、Ａ２０（ＴＮＦａ誘導タンパク質３）、アブヒドロラーゼドメイン含有４、アブヒドロラーゼドメイン含有１２、アブヒドロラーゼドメイン含有１２Ｂ、アブヒドロラーゼドメイン含有１３、アクロシン、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２（ファーティリン－ｂ）、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ４、ＡＤＡＭ４Ｂ、ＡＤＡＭ５、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２メタロプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５／１１、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０、脂肪細胞ｅｎｈ．結合タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質２、気道トリプシン様プロテアーゼ、アミノアシラーゼ、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＢ様１、アミノペプチダーゼＭＡＭＳ／Ｌ－ＲＡＰ、アミノペプチダーゼＮ、アミノペプチダーゼＯ、アミノペプチダーゼＰホモログ、アミノペプチダーゼＰ１、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ、アミノペプチダーゼＱ、アミノペプチダーゼ様１、ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、ＡＭＳＨ－ＬＰ／ＳＴＡＭＢＰＬ１、アンギオテンシン変換酵素１（ＡＣＥ１）、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アンジオテンシン変換酵素３（ＡＣＥ３）、アニオン性トリプシン（ＩＩ）、アポリポタンパク質（ａ）、アーケアメトジンシン（ａｒｃｈａｅｍｅｔｚｉｎｃｉｎ）－１、アーケアメトジンシン－２、アスパルトアシラーゼ、アスパルトアシラーゼ－３、アスパルチルアミノペプチダーゼ、アタキシン－３、アタキシン－３様、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質１、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様２、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様３、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様４、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様５、ＡＴＰ２３ペプチダーゼ、オートファジン－１、オートファジン－２、オートファジン－３、オートファジン－４、アズロシジン、ベータラクタマーゼ、ベータセクレターゼ１、ベータセクレターゼ２、ブレオマイシン加水分解酵素、脳のセリンプロテイナーゼ２、ＢＲＣＣ３６（ＢＲＣＡ２含有複合体、サブ３）、カルパイン、カルパイン１、カルパイン２、カルパイン３、カルパイン４、カルパイン５、カルパイン６、カルパイン７、カルパイン７様、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２、カルパイン１３、カルパイン１４、カルパイン１５（Ｓｏｌｈタンパク質）、システインプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＡ３、カルボキシペプチダーゼＡ４、カルボキシペプチダーゼＡ５、カルボキシペプチダーゼＡ６、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、カルボキシペプチダーゼＯ、カルボキシペプチダーゼＵ、カルボキシペプチダーゼＸ１、カルボキシペプチダーゼＸ２、カルボキシペプチダーゼＺ、カルノシンジペプチダーゼ１、カルノシンジペプチダーゼ２、カスパーゼ動員ドメインファミリー、メンバー８、カスパーゼ、カスパーゼ－１、カスパーゼ－２、カスパーゼ－３、カスパーゼ－４／１１、カスパーゼ－５、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９、カスパーゼ－１０、カスパーゼ－１２、カスパーゼ－１４、カスパーゼ－１４様、ｃａｓｐｅｒ／ＦＬＩＰ、カテプシン、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ（ＣＴＳＳ）、カテプシンＶ（ＣＴＳＶ）、カテプシンＷ、カテプシンＺ（ＣＴＳＺ）、カチオン性トリプシン、ｃｅｚａｎｎｅ／ＯＴＵドメイン含有７Ｂ、ｃｅｚａｎｎｅ－２、ＣＧＩ－５８、キマーゼ、キモパシン（ｃｈｙｍｏｐａｓｉｎ）、キモシン、キモトリプシンＢ、キモトリプシンＣ、凝固因子ＩＸａ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子Ｘａ、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＸＩＩａ、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ２、コラゲナーゼ３、補体プロテアーゼＣ１ｒセリンプロテアーゼ、補体プロテアーゼＣ１ｓセリンプロテアーゼ、補体Ｃ１ｒホモログ、補体成分２、補体成分Ｃ１ｒａ、補体成分Ｃ１ｓａ、補体因子Ｂ、補体因子Ｄ、補体因子Ｄ様、補体因子Ｉ、ＣＯＰＳ６、コリン（ｃｏｒｉｎ）、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１）、円柱腫症タンパク質（ｃｙｌｉｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトゾルアラニルアミノｐｅｐ．様１、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、ＤＤＩ関連プロテアーゼ、デシシン（ＤＥＣＹＳＩＮ）、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー１、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー２、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー３、ＤＥＳＣ１プロテアーゼ、デザートヘッジホッグタンパク質、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ１、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ２、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質１、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質３、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質４、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質５、ＤＩＮＥペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ジペプチジルペプチダーゼ６（ＤＰＰ６）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼ１０（ＤＰＰ１０）、ＤＪ－１、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質２、ＤＵＢ－１、ＤＵＢ－２、ＤＵＢ２ａ、ＤＵＢ２ａ様、ＤＵＢ２ａ様２、ＤＵＢ６、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
プロテアーゼが、Ｔ細胞プロテアーゼ、補体プロテアーゼ、線維症プロテアーゼ及び炎症関連プロテアーゼからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。切断可能なリンカーが、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、エステル、グリコシド、リン脂質、ホスホジエステル、求核剤／塩基感受性リンカー、還元感受性リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属で切断可能なリンカー、酸化感受性リンカー又はそれらの組み合わせである、方法を、本明細書中にさらに提供する。切断可能なリンカーが、ペプチドである方法を、本明細書中にさらに提供する。ペプチドが、配列番号１～６７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。切断可能なリンカーが、共有結合を介してレポーターに直接連結されている、方法を、本明細書中にさらに提供する。
レポーターが、蛍光標識、質量タグ、発色団、電気化学的に活性な分子、バイオレイヤー干渉法若しくは表面プラズモン共鳴で検出可能な分子、沈殿物質、質量分析及び液体クロマトグラフィー基質、磁気的に活性な分子、ゲル形成及び／若しくは粘度変化分子、イムノアッセイで検出可能な分子、細胞ベースの増幅で検出可能若しくは核酸バーコード、又はそれらの任意の組み合わせを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。レポーターが、蛍光標識を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光標識が、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）、２－アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ３及び（５－（（２－アミノエチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸）（ＥＤＡＮＳ）から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
分子が、蛍光消光剤をさらに含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光消光剤が、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＢＢＱ６５０、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＣＰＱ２、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、ＤＡＢＣＹＬ（４－（［４’－ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）ベンゾイル）、Ｄｎｐ（２，４－ジニトロフェニル）及びＥｃｌｉｐｓｅからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光消光剤が、共有結合を介して切断可能なリンカーに直接接続されている、方法を、本明細書中にさらに提供する。
分子が担体をさらに含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。担体が、天然タンパク質、標識タンパク質若しくは合成タンパク質、正確に既知の化学組成の、又は平均分子量付近の分布を有する合成化学ポリマー、オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、フォルダマー、脂質、脂質ミセル、ナノ粒子、ポリスチレン、ポリプロピレン若しくは任意の他の種類のプラスチック製の固体支持体、又はそれらの任意の組み合わせを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
対象が哺乳動物である、方法を、本明細書中にさらに提供する。哺乳動物が、ヒトである、方法を、本明細書中にさらに提供する。
レポーターが、自壊スペーサーを介して切断可能なリンカーに連結されている、方法を、本明細書中にさらに提供する。自壊スペーサーが、ジスルフィド、ヘテロアミン二官能性ジスルフィド、チオールベースのピリダジンジオン、ｐ－アミンベンジルオキシカルボニル、ジペプチド、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌ－Ｐｈｅ－Ｓａｒ、トランス－シクロオクテンテトラジン、オルトヒドロキシ保護アリールスルフェート、ホスホルアミデートベースのスペーサー、ヒドロキシベンジル、トリメチルカルバメート及びキノンメチドベースのスペーサーからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
検出が、蛍光検出、分光検出、質量分析、免疫学的検出又はイメージング検出を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。検出が、蛍光検出を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。蛍光検出が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である、方法を、本明細書中にさらに提供する。
切断されたレポーターが沈殿性フルオロフォアを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。沈殿性フルオロフォアが、ＨＰＱ、Ｃｌ－ＨＰＱ、ＨＴＰＱ、ＨＢＰＱ又はＨＱＰＱを含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。
体液試料が、血液、血漿、骨髄液、リンパ液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脳脊髄液、脊髄液、滑液、精液、管吸引液、糞便、便、膣流出液、涙液、組織溶解物及び患者由来細胞株上清からなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。体液試料が、洗浄液、コンディショニング培地又は緩衝液、スワブウイルス輸送媒体、食塩水、培養培地、又は細胞培養上清を含む、方法を、本明細書中にさらに提供する。洗浄液が、洗口洗浄液、気管支肺胞上皮洗浄液、洗浄液、洗髪洗浄液、鼻スプレー流出物、食塩水若しくは任意の媒体又はその派生物に適用された任意の体表、開口部、臓器構造又は固形腫瘍生検のスワブからなる群から選択される、方法を、本明細書中にさらに提供する。
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
図面の簡単な説明
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面（本明細書における「図（ＦＩＧＵＲＥ．）」又は「図（ＦＩＧＵＲＥＳ．）」）を参照することによって得られるであろう。
図１は、本出願による複数のプローブを示す。各プローブ１０１は、図１に星印で示されているレポーター１０３を含む。レポーター１０３は、作用物質１０７のための切断可能な基質である切断可能なリンカー１０５に連結されている。
図２は、複数のプローブにおけるレポーターの切断を示す。示されるように、切断可能なリンカー１０５の作用物質１０７による切断は、レポーター１０３がプローブ１０１から切断されることをもたらす。切断されると、切断されたレポーター２０３を検出し、かつ／又は切断されていないレポーター１０３と区別することができる。切断されたレポーター２０３の存在及び検出は、作用物質１０７が試料中に存在し、活性であることを示す。さらに、作用物質活性の欠如は、活性の低下に関連する検出のために使用することができる。作用物質の活性は、例えば、切断反応が起こる速度又は試料中の切断されたレポーターの量に基づいて、又は適切な対照に対する速度の比又は適切な対照に対する切断されたレポーターの比などの他の手段によって定量することができる。
図３は、プローブ１０１を用いて対象の生物学的状態を評価する方法３０１を示す。
図４は、１又はそれを超える特定の生物学的状態又は病状を分析するための作用物質の活性を分析するための組成物において使用するためのプローブの選択を示す。１又はそれを超える作用物質の活性は、生物学的状態又は病状に関連し得る。これは、経時的な特定の状態又は状況の進行を含み得る。したがって、対象の生物学的状態又は病状を評価するために、状態特異的パネル４０３に含めるために、目的の作用物質によって切断され得るプローブがライブラリーから選択される。状態特異的パネルの選択されたプローブ４０５は、所定のプロテアーゼの活性を測定することができるように差次的に標識される３０５。ライブラリー４０１に含まれるものを含む異なるプローブ１０１は、作用物質活性の正確な多重検出を確実にする特性を断片に付与する特徴を含み得る。そのような特性としては、例えば、改善された切断、検出、溶解性、安定性、再現性、堅牢性及び／又は異なるタイプのレポーターとの拡大された適合性が挙げられる。
図５は、スペーサー５０７、溶解性タグ５０９、消光剤及び共有結合又は非共有結合の付着部位５１１を含むプローブ５０１の概略図を示す。これらの構成要素のそれぞれの位置は、原則として相互変換することができる。
図６Ａ～６Ｃは、プローブの切断を示す。図６Ａは、プローブ６０１が、蛍光レポーター６０３及び消光剤６０５を含むことを示す。プローブ６０１はまた、スペーサー５０７、溶解性タグ５０９、及び／又は共有結合若しくは非共有結合の付着部位５１１を含むことができる。図６Ｂは、２成分プローブの切断プロセスを示す。図６Ｃは、３成分プローブの切断プロセスを示す。 図６Ａ～６Ｃは、プローブの切断を示す。図６Ａは、プローブ６０１が、蛍光レポーター６０３及び消光剤６０５を含むことを示す。プローブ６０１はまた、スペーサー５０７、溶解性タグ５０９、及び／又は共有結合若しくは非共有結合の付着部位５１１を含むことができる。図６Ｂは、２成分プローブの切断プロセスを示す。図６Ｃは、３成分プローブの切断プロセスを示す。 図６Ａ～６Ｃは、プローブの切断を示す。図６Ａは、プローブ６０１が、蛍光レポーター６０３及び消光剤６０５を含むことを示す。プローブ６０１はまた、スペーサー５０７、溶解性タグ５０９、及び／又は共有結合若しくは非共有結合の付着部位５１１を含むことができる。図６Ｂは、２成分プローブの切断プロセスを示す。図６Ｃは、３成分プローブの切断プロセスを示す。
図７Ａ～７Ｃは、ＨＰＱフルオロフォアの反応プロセスを示す。図７Ａは、自壊スペーサー（ａｕｔｏ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｓｐａｃｅｒ）７０５及び沈殿性蛍光レポーター７０３を有するプローブ７０１を示す。スペーサー７０５は、沈殿性フルオロフォアレポーターを、明確にするために長方形によって囲まれているエキソペプチダーゼ基質７０７に接続する。特定の所定のエキソペプチダーゼは、エキソペプチダーゼ基質７０７を切断する。その結果、自壊スペーサー７０５は、沈殿性フルオロフォアレポーター７０３から解離する。これにより、レポーター７０３に特定の水素結合７０９を確立することが可能になり、その結果、レポーターは固体状態になり、流体試料から沈殿し、強い蛍光シグナルを提供する。図７Ｂは、詳細なプロセスを示す。図７Ｃは、エンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼの両方を用いた反応プロセスを示す。 図７Ａ～７Ｃは、ＨＰＱフルオロフォアの反応プロセスを示す。図７Ａは、自壊スペーサー（ａｕｔｏ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｓｐａｃｅｒ）７０５及び沈殿性蛍光レポーター７０３を有するプローブ７０１を示す。スペーサー７０５は、沈殿性フルオロフォアレポーターを、明確にするために長方形によって囲まれているエキソペプチダーゼ基質７０７に接続する。特定の所定のエキソペプチダーゼは、エキソペプチダーゼ基質７０７を切断する。その結果、自壊スペーサー７０５は、沈殿性フルオロフォアレポーター７０３から解離する。これにより、レポーター７０３に特定の水素結合７０９を確立することが可能になり、その結果、レポーターは固体状態になり、流体試料から沈殿し、強い蛍光シグナルを提供する。図７Ｂは、詳細なプロセスを示す。図７Ｃは、エンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼの両方を用いた反応プロセスを示す。 図７Ａ～７Ｃは、ＨＰＱフルオロフォアの反応プロセスを示す。図７Ａは、自壊スペーサー（ａｕｔｏ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｓｐａｃｅｒ）７０５及び沈殿性蛍光レポーター７０３を有するプローブ７０１を示す。スペーサー７０５は、沈殿性フルオロフォアレポーターを、明確にするために長方形によって囲まれているエキソペプチダーゼ基質７０７に接続する。特定の所定のエキソペプチダーゼは、エキソペプチダーゼ基質７０７を切断する。その結果、自壊スペーサー７０５は、沈殿性フルオロフォアレポーター７０３から解離する。これにより、レポーター７０３に特定の水素結合７０９を確立することが可能になり、その結果、レポーターは固体状態になり、流体試料から沈殿し、強い蛍光シグナルを提供する。図７Ｂは、詳細なプロセスを示す。図７Ｃは、エンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼの両方を用いた反応プロセスを示す。
図８は、自壊スペーサー８０７、沈殿性又は非沈殿性蛍光レポーター８０５、及び所定の酵素／エンドプロテアーゼ８０３によって切断される酵素／プロテアーゼ基質８０９を有するプローブ８０１を使用する方法を示す。プローブは、所定の２つの酵素／プロテアーゼによって切断される酵素／プロテアーゼ基質８０９を含む。これらの酵素／プロテアーゼの１つ目は、試料中の目的の酵素／エンドプロテアーゼ８０３である。流体試料中の酵素／エンドプロテアーゼ８０３は、酵素／プロテアーゼ基質８０９を切断する。しかしながら、８０３は、スペーサー８０７から完全に／末端又は最後から２番目のアミノ酸をプロテアーゼ基質において切断することができないためである。これにより、所定のエキソペプチダーゼ／酵素８１１が試料に導入される。エキソペプチダーゼ／酵素は、エンドプロテアーゼ／酵素８０３とのインキュベーションの前、後、又はその間に、流体試料に添加することができる。酵素／プロテアーゼ基質８０５は、酵素／エンドプロテアーゼ８０３による切断が、所定の酵素／エキソペプチダーゼ８１１によって切断され得る第二の酵素／プロテアーゼ基質８１３をもたらすように操作される。８１１による切断は、スペーサー８０７を沈殿性／非沈殿性フルオロフォアレポーター８０５から解離させ、その結果、レポーター８０５は強い蛍光シグナルを提供する。
図９にＮＡＳＨの進行を示す。
図１０は、プロテアーゼ活性を検出するために使用されるインビボプローブを示す。
図１１は、インビボプローブを用いて測定したプロテアーゼ活性を示す。
図１２は、本願の実験の概要を示す。
図１３は、本願の実験の概要を示す。
図１４は、プローブが、マウスＫ２ＥＤＴＡ血漿中のＮＡＳＨ関連プロテアーゼに遭遇したときに、肝生検を介してＮＡＳＨと診断された患者からの試料と健康な患者の試料とを正確に検出し、区別することができることを示す。
図１５Ａ～１５Ｂは、本願の特定のペプチドリンカーが、健康なマウスとＫ２ＥＤＴＡマウス血漿由来のＮＡＳＨ＋試料におけるＮＡＳＨ関連プロテアーゼ活性を区別することができることを示す実験結果を提供する。図１５Ａは、健康な試料からの結果を示す。図１５Ｂは、ＮＡＳＨ＋試料からの結果を示す。
図１６は、生体外のプローブ、及びＮＡＳＨ（ＣＤＨＦＤ）試料（右データポイント）と健康（ＣＤ）試料（左データポイント）とを区別するそれらの能力を比較する実験結果を提供する。
図１７は、プローブ＃４９２について測定された蛍光増加率が、Ｋ２ＥＤＴＡマウス血漿中のプロテアーゼ活性及びＮＡＳＨ疾患に起因し得ることを示す生の実験結果を提供する。ｎ＝１０試料にわたる平均蛍光増加率は、疾患条件及び健康条件の両方におけるプールされた血漿（ｎ＝１０）蛍光増加と一致する。
図１８は、プローブ＃１０２について測定された蛍光増加率が、Ｋ２ＥＤＴＡマウス血漿のプロテアーゼ活性及びＮＡＳＨ疾患に起因し得ることを示す実験結果を提供する。ｎ＝１０の試料にわたる平均蛍光増加率は、疾患条件及び健康条件の両方におけるプールされた血漿（ｎ＝１０）蛍光増加と一致する。
図１９Ａ～１９Ｂは、Ｋ２ＥＤＴＡマウス血漿試料における疾患ベースのプロテアーゼ活性の差の決定に、存在量ではなく活性が関与することを示す実験結果を提供する。図１９Ａは、プロテアーゼ存在量レベルの試験結果を示し、図１９Ｂは、プロテアーゼ活性の試験結果を示す。
図２０は、本出願の実験設計の概要を示す。
図２１Ａ～２１Ｆは、いくつかのプローブが健康なＫ２ＥＤＴＡ血漿試料（左）、退縮試料（中央）及びＮＡＳＨ試料（右）の間で区別することができることを示す実験結果を提供する。図２１Ａは、プローブ＃４２８の結果を示し、図２１Ｂは、プローブ＃５２０の結果を示し、図２１Ｃは、プローブ＃９６の結果を示し、図２１Ｄは、プローブ＃１０２の結果を示し、図２１Ｅは、プローブ＃４９２の結果を示し、図２１Ｆは、プローブ＃６４７の結果を示す。 図２１Ａ～２１Ｆは、いくつかのプローブが健康なＫ２ＥＤＴＡ血漿試料（左）、退縮試料（中央）及びＮＡＳＨ試料（右）の間で区別することができることを示す実験結果を提供する。図２１Ａは、プローブ＃４２８の結果を示し、図２１Ｂは、プローブ＃５２０の結果を示し、図２１Ｃは、プローブ＃９６の結果を示し、図２１Ｄは、プローブ＃１０２の結果を示し、図２１Ｅは、プローブ＃４９２の結果を示し、図２１Ｆは、プローブ＃６４７の結果を示す。
図２２は、プローブが、生体外で健康なＪＯ２マウスモデルと、劇症肝炎試料のＪＯ２マウスモデルとを区別することができることを示す実験結果を提供する。Ｊｏ２抗体は、アポトーシスを誘導することによって、マウスＦａｓを発現する細胞株に対して細胞溶解活性を示す。
図２３は、プローブがマウスモデルにおいてインビボで健康な試料と劇症肝炎試料とを区別することができることを示す実験結果を提供する。＋／＋＋群は、軽度の肝炎症状を示し、＋＋＋／＋＋＋＋群はマウスの生理病理学的検査に基づく劇症肝炎を示す。Ｊｏ２抗体は、アポトーシスを誘導することによって、マウスＦａｓを発現する細胞株に対して細胞溶解活性を示す。
図２４は、ペプチド断片が、それらの異なる生物学的機構のために、肝疾患の２つの異なる前臨床モデルを区別することができることを示す。
図２５は、本出願の実験設計の概要を示す。
図２６は、プローブが健康、肥満及びＮＡＳＨヒト試料を区別することができることを示す実験結果を提供する。
図２７は、様々な採取日、採取プロトコル、輸送などを有する独立した試料コホート間の再現性を示す実験結果を提供する。
図２８は、ペプチド断片が特定のアッセイ条件においてＮＡＳＨ疾患進行の異なる病期を区別することができることを示す実験結果を提供する。
図２９は、ＮＡＳＨと健康なヒトＫ２ＥＤＴＡ血漿を区別することができるペプチド断片の多重度を示す実験結果を提供する。
図３０Ａ～３０Ｆは、マウスＫ２ＥＤＴＡ血漿中のＮＡＳＨ試料における疾患特異的活性の差の検出における特異的プロテアーゼの関連を実証する実験結果を提供する。図３０Ａは、汎プロテアーゼ阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｂは、システインプロテアーゼファミリー阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｃは、カテプシンファミリー阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｄは、ＣＴＳＢ特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｅは、ＣＴＳＫ特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｆは、ＣＴＳＬ特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。これらの結果は、この基質がＣＴＳＬによって切断されることを示す。 図３０Ａ～３０Ｆは、マウスＫ２ＥＤＴＡ血漿中のＮＡＳＨ試料における疾患特異的活性の差の検出における特異的プロテアーゼの関連を実証する実験結果を提供する。図３０Ａは、汎プロテアーゼ阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｂは、システインプロテアーゼファミリー阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｃは、カテプシンファミリー阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｄは、ＣＴＳＢ特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｅは、ＣＴＳＫ特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。図３０Ｆは、ＣＴＳＬ特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。これらの結果は、この基質がＣＴＳＬによって切断されることを示す。
図３１Ａ～３１Ｂは、血漿中に豊富に存在する２つの一般的な乱雑プロテアーゼ（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ）が、Ｋ２ＥＤＴＡマウス血漿中のＮＡＳＨ試料における疾患ベースのプロテアーゼ活性の差の決定に関与しないことを示す実験結果を提供する。図３１Ａは、トリプシン特異的阻害剤で試験した場合の結果を示し、図３１Ｂは、トロンビン特異的阻害剤で試験した場合の結果を示す。
図３２Ａ～３２Ｂは、ヒト試料における疾患ベースのプロテアーゼ活性の差の決定に、存在量ではなく活性が関与することを示す実験結果を提供する。図３２Ａは、プロテアーゼ活性を比較した場合の健康血漿及びＮＡＳＨ血漿のプール試料の試験結果を示す。図３２Ｂは、健康試料とＮＡＳＨ試料との間のプロテアーゼ活性の定量比を示す。
図３３Ａ～３３Ｂは、カテプシン－Ｌが健康及びＮＡＳＨヒト試料の両方において等しく豊富であるが、その活性レベルの差が健康試料とＮＡＳＨ試料との間の区別を可能にすることを示す。図３３Ａは、ＣＴＳＬ存在量レベルについての試験の結果を示し、図３３Ｂは、ＣＴＳＬ活性レベルについての試験が、ＣＴＳＬ存在量についての試験よりも優れていることを示す。
図３４Ａ～３４Ｂは、プローブが、血漿採取の２つの異なる条件下で、血漿中の宿主応答及びＣＯＶＩＤウイルスの存在の両方を検出し得るという実験的証拠を提供する。図３４Ａは、Ｋ２ＥＤＴＡ血漿コホートからの結果を示し、一方、図３４Ｂは、Ｌｉヘパリン血漿コホートからの結果を示す。プローブ＃１８は、好中球エラスターゼ基質である。プローブ＃４０９は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２ ３Ｃプロテアーゼである。プローブ＃４６２は、ＭＭＰ８基質である。プローブ＃８４は、フューリン基質である。プローブ＃２６は、カテプシンＫ／Ｂ、トリプシン、トロンビン、トリプターゼ基質である。
図３５は、プローブが健康なスワブ試料とＣＯＶＩＤスワブ試料とを区別することができる実験データを提供する。
図３６Ａ～３６Ｂは、唾液又はスワブ試料に添加した場合に、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ２由来の３Ｃｌプロテアーゼが検出され得ることを示す実験データを提供する。図３６Ａは唾液試料からの結果を示し、一方、図３６ＢはＶＴＭ（１０％までのＦＢＳを含有するウイルス輸送媒体）で馴化したスワブ試料からの結果を示す。
図３７は、健康な試料とＣＯＶＩＤ試料とを区別することができるいくつかのプローブを示す。
図３８Ａは、プローブ＃６４７がＣＯＶＩＤ関連プロテアーゼの活性を検出して、食塩水で馴化した健康スワブ試料とＣＯＶＩＤプールスワブ試料とを区別できる実験的証拠を提供する。 図３８Ｂは、ＣＯＶＩＤ＋（ｎ＝１８）試料とＣＯＶＩＤ－（ｎ－１９）試料との間に有意差（ｐ＝０．０２９）があることを示す。図３８Ｃは、ＣＯＶＩＤ＋（７つの試料が活性であった）及びＣＯＶＩＤ－（１つの試料が活性であった）試料についての時点にわたる補正ＲＦＵを示す。
図３９Ａ～３９Ｂは、他の自己免疫疾患に関連するプロテアーゼであるグランザイムＢが、プローブ＃６４７が健康な試料とＣＯＶＩＤ試料とを区別することを可能にするプロテアーゼであるという実験的証拠を提供する。図３９ＡはグランザイムＢを含む阻害実験の結果を示し、一方、図３９Ｂはカスパーゼを含む阻害実験の結果を示す。差次的なプロテアーゼ活性は、カスパーゼ阻害剤よりもＧｚｍＢ特異的阻害剤に対して感受性であり、スワブで検出される疾患シグナルにおけるＴ細胞活性の顕著な特徴であるＧｚｍＢを暗示している。
図４０は、グランザイムＢ活性をモニタリングすることができる紙ストリップ試験を示す。
図４１Ａ～４１Ｂは、ペプチド断片が健康な試料と膵管腺癌（ＰＤＡＣ）試料とを区別できることを示す実験的証拠を提供する。図４１Ａは、第１のセットの実験の結果を示し、一方、図４１Ｂは、第２のセットの実験の結果を示す。 図４１Ａ～４１Ｂは、ペプチド断片が健康な試料と膵管腺癌（ＰＤＡＣ）試料とを区別できることを示す実験的証拠を提供する。図４１Ａは、第１のセットの実験の結果を示し、一方、図４１Ｂは、第２のセットの実験の結果を示す。
図４２は、ペプチド断片が健康な試料、ＰＤＡＣ試料、及び膵炎試料を区別できることを示す実験的証拠を提供する。
図４３は、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いたＭＰＯの塩素化及び過酸化活性の検出の模式図を示す。ＡＨは、非蛍光Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ基質を表し、Ａはその蛍光酸化生成物を表す。過酸化水素は、ＭＰＯをＭＰＯ－Ｉに変換し、ＭＰＯは過酸化水素の存在なしでは不活性である。次いで、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄをＭＰＯ－Ｉによって酸化し、Ｅｘ／Ｅｍ＝５３０／５９０で読み取ることができる蛍光酸化生成物Ａを生成する。
図４４Ａ～４４Ｃは、ペルオキシダーゼの検出結果を示す。図４４Ａは、ＭＰＯ活性が健康マウスとＮＡＳＨマウスとで異なることを示す。図４４Ｂは、ＭＰＯ活性が、標準的な固形飼料（ＣＤ）を与えられたマウス、コリン欠乏Ｌ－アミノ酸規定高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を与えられたマウスの間で異なることを示す。図４４Ｃは、健康ヒト対象と関節リウマチを有する対象とでＭＰＯ活性が異なることを示す。
図４５Ａ～４５Ｂは、基質としてオレイン酸レゾルフィンを使用したヒト血漿中の添加組換えプロテアーゼのプール結果を示す。図４６Ａは、３つの組換え酵素－カルボキシルエステラーゼ１、ホスホリパーゼＡ２及びリポタンパク質リパーゼの結果を示す。図４６Ｂは、各種濃度のリポタンパク質リパーゼの結果を示す。
図４６Ａ～４６Ｃは、ＦＲＥＴ基質のための例示的な切断可能なリンカーの一般的な設計を示す。図４６Ａは、エンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼ基質の一般的な設計を示す。図４６Ｂは、レポーター及び消光剤を反転させることができる例を示す。図４６Ｃは、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼの一般化された基質設計を示す。 図４６Ａ～４６Ｃは、ＦＲＥＴ基質のための例示的な切断可能なリンカーの一般的な設計を示す。図４６Ａは、エンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼ基質の一般的な設計を示す。図４６Ｂは、レポーター及び消光剤を反転させることができる例を示す。図４６Ｃは、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼの一般化された基質設計を示す。 図４６Ａ～４６Ｃは、ＦＲＥＴ基質のための例示的な切断可能なリンカーの一般的な設計を示す。図４６Ａは、エンドペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼ基質の一般的な設計を示す。図４６Ｂは、レポーター及び消光剤を反転させることができる例を示す。図４６Ｃは、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼの一般化された基質設計を示す。
詳細な説明
対象由来の体液試料を生体外で分子と接触させることを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、分子は、切断可能なリンカー及びレポーターを含み、切断可能なリンカーは、体液由来の作用物質によって切断され、分子からレポーターを放出する。いくつかの実施形態では、方法は、放出されたレポーターの形成速度又は量を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、放出されたレポーターの形成速度又は量は、健康な対象とは有意に異なる。いくつかの実施形態では、体液は、血漿であってもよい。いくつかの実施形態では、方法は、検出に基づいて対象の疾患又は状態を決定することをさらに含む。
一態様では、体液試料を、第２の切断可能なリンカー及び第２のレポーターを有する第２の分子により接触させる。いくつかの実施形態では、第２の切断可能なリンカーは、体液由来の第２の作用物質によって切断され、第２の分子から第２のレポーターを放出する。いくつかの実施形態では、方法は、第２の放出されたレポーターの形成速度又は量を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の放出されたレポーターの検出及び第２の放出されたレポーターの検出に基づいて対象の疾患又は状態を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、単一の体液試料を使用して複数の選択作用物質の活性を確認することができるように、多重化形式で使用することができる。これにより、特定の病理及び状態について診断パネルを作成することが可能になり、これは複数の作用物質の活性を活用して特定の状態のより完全で正確な評価を提供する。これらのパネルは、複数の作用物質の活性を特定の状態又は病状と相関させるために使用することができる。これらのシグネチャは、例えば、データベースに保存し、特定のプロテアーゼ活性パネルによって評価されたその後の個体の状態又は病状を評価するために使用することができる。いくつかの実施形態では、分類ツールを分析に使用して、健康な患者と疾患患者とを区別するか、又は疾患の個々の病期を区別する。分類ツールは、ロジスティック回帰、単純ベイズ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、勾配ブースティング、又はニューラルネットワークを含むがこれらに限定されない教師付き機械学習分類アルゴリズムであってもよい。さらに、モデル化された変数が本質的に連続的である場合（例えば腫瘍体積）、リッジ回帰、カーネルリッジ回帰、又はサポートベクター回帰などの連続回帰手法（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ）を使用することができる。これらのアルゴリズムは、プローブ測定値と病状との間の関係を学習するために、複数のプローブの測定値（又はプローブ比などのそれらの測定値の数学的関数）によって定義される多次元特徴空間上で動作するだろう。最後に、プローブ測定値を、年齢、性別、又は患者の併存症状態などの臨床的変数と組み合わせることができる。その場合、臨床的特徴を分類器に直接組み込むか、あるいは、プローブのみの予測を臨床的特徴と組み合わせてそれらの変数に対して較正された結果を生成する二次分類器を学習することができる。
いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、特定の線維症病期又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特定の非アルコール性脂肪性肝疾患活動性スコア（ＮＡＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、肝疾患、癌、臓器移植拒絶、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫及び慢性炎症であり得る。
別の態様では、本明細書に記載の方法は、対象の病理及び処置を診断及びモニタリングするための酵素活性の生体外での多重検出を含む。この酵素活性は、対象の内臓の疾患及び状態を診断及びモニタリングするために使用することができる。
検出プローブ／分子
疾患又は状態の決定は、試料中で検出された放出されたレポーターの形成速度又は量に基づく。プローブ／分子を体液試料に導入する。プローブ／分子は、切断可能なリンカー及びレポーターを含み、体液からの作用物質は、切断可能なリンカーを切断し、切断されたレポーターを放出する。プローブ／分子は、この機能を果たすことができる任意の構造を有し得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、切断可能なリンカーに共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、レポーターは、蛍光標識、質量タグ、発色団、電気化学的に活性な分子、バイオレイヤー干渉法若しくは表面プラズモン共鳴で検出可能な分子、沈殿物質、質量分析及び液体クロマトグラフィー基質（サイズ排除、逆相、等電点などを含む）、磁気的に活性な分子、ゲル形成及び／若しくは粘度変化分子、イムノアッセイで検出可能な分子、細胞ベースの増幅で検出可能な分子、核酸バーコード、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、レポーターは蛍光標識であってよく、分子は消光剤も含む。いくつかの実施形態では、消光剤は、切断可能なリンカーに共有結合している。いくつかの実施形態では、内部消光されたフルオロフォアが切断可能なリンカーに連結される。いくつかの実施形態では、分子は、自壊スペーサーをさらに含む。いくつかの他の実施形態では、分子は、担体をさらに含む。
切断可能なリンカー
いくつかの態様では、本明細書に記載のプローブ／分子は切断可能なリンカーを含む。本明細書に記載の切断可能なリンカーは、作用物質によって切断され得る任意の構造であり得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、エステル、グリコシド、リン脂質、ホスホジエステル、求核剤／塩基感受性リンカー、還元感受性リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属で切断可能なリンカー、酸化感受性リンカー、自壊リンカー（３成分プローブ＝酵素基質＋リンカー＋レポーター）又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、レポーターは不活性形態であってよく、疾患活性が検出可能になる。Ｇｅｏｆｆｒａｙ Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｌｏｕｉｓｅ Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ａｌａｉｎ Ｗａｇｎｅｒ，Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｉｓｓｕｅ ２，２０１２，Ｐａｇｅｓ ５７１－５８２，ＩＳＳＮ ０９６８－０８９６，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１１．０７．０４８。
架橋剤は、１つ又は２つのポリマー鎖内の空間的に隣接する２つの残基間に共有結合を形成することを目的とする。タンパク質結合パートナーを同定するために、架橋剤は、一過性相互作用を検出及び安定化できる必要がある。架橋剤は、しばしば、タンパク質中のリジン又はシステイン残基間に共有結合を形成する。あるいは、架橋剤は光反応性であり得る。架橋切断可能なリンカーを使用して、受容体のタンパク質間相互作用とタンパク質内相互作用、シグナル伝達カスケード、及び多タンパク質複合体の構造を区別することができる。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはペプチドであり得る。ペプチドリンカーのコア構造は、リソソーム酵素によって認識及び切断されるジペプチド又はテトラペプチドのいずれかを含むときがある。プロテアーゼ（ペプチダーゼとも呼ばれる）は、加水分解によるペプチド結合の分解を触媒し、プロテアーゼによって認識可能なアミノ酸の特定の配列に制限される。一般的に使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン又はキモトリプシンを含む。プロテアーゼは多くの疾患において重要な役割を果たすので、ペプチドリンカーは薬物放出システム又は診断ツールにおいて広く使用されている。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、短いペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含み得る。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約２０アミノ酸長未満であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１０～１００アミノ酸長であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～５０、１～７０、１～９０、１～１００、５～１０、５～２０、５～３０、５～５０、５～７０、５～９０、５～１００、１０～２０、１０～３０、１０～５０、１０～７０、１０～９０、１０～１００、２０～３０、２０～５０、２０～７０、２０～９０、２０～１００、３０～５０、３０～７０、３０～９０、３０～１００、５０～７０、５０～９０、５０～１００、７０～９０、７０～１００又は９０～１００アミノ酸長であり得る。
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エンドプロテアーゼについて本明細書に記載されるペプチドリンカーは、以下の設計：ＸｍＡＹｎ又はＡＸｎＢに従う場合があり、式中、それぞれ、Ａは単一のアミノ酸であり、Ａ及びＢは特定のエンドプロテアーゼによって認識されるアミノ酸対であり、Ｘ及びＹはレポーターで標識された又は標識されていない任意のアミノ酸であり、ｍ、ｎは０又は任意の整数である。この設計は例示のみを目的としており、ペプチドリンカーの唯一の可能な設計として解釈されるべきではない。
エキソプロテアーゼについて本明細書に記載されるペプチドリンカーは、以下の設計：ＸｍＡＹｎに従う場合があり、式中、Ａは、特定のエキソプロテアーゼによって認識されるアミノ酸対であり、Ｘ及びＹは、レポーターで標識された又は標識されていない任意のアミノ酸であり、ｎは、０又は任意の整数である。この設計は例示のみを目的としており、ペプチドリンカーの唯一の可能な設計として解釈されるべきではない。
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いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは炭水化物であり得る。Ｔｕｎｇらは、β－ガラクトシダーゼによる切断後に遠赤色蛍光特性を有するβ－ガラクトシドと７－ヒドロキシ－９Ｈ－（１，３－ジクロロ－９，９－ジメチルアクリジン－２－オン）とのコンジュゲートを報告した。Ｔｕｎｇ ＣＨ，Ｚｅｎｇ Ｑ，Ｓｈａｈ Ｋ，Ｋｉｍ ＤＥ，Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒｈｏｕｔ Ｄ，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ Ｒ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｆａｒ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｗｉｔｃｈ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４ Ｍａｒ １；６４（５）：１５７９－８３。Ｈｏらは、β－ガラクトシダーゼ基質を自壊リンカーとしてｐ－ベンジルオキシカルボニルと組み合わせることを報告した。β－ガラクトシダーゼの基質であるβ－Ｄ－ガラクトピラノシドを、パラ置換ベンジルオキシカルボニル基（第１の自壊リンカーとして機能する）及びグリシン残基（消光剤及び第２の自壊リンカーとして機能する）を介して光学プローブにコンジュゲーションさせた。β－Ｄ－ガラクトピラノシドの酵素的切断は、光学活性プローブの放出をもたらす一連の自発的反応を誘発した。Ｈｏ，Ｎ．－Ｈ．，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ｔｕｎｇ，Ｃ．－Ｈ．（２００７），Ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｆｏｒ β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，８：５６０－５６６。いくつかの炭水化物リンカーは、市販されている。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは核酸であり得る。そのコンジュゲートの挙動に対するＤＮＡリンカーの効果は、おそらく核酸ベースのリンカーと細胞表面との非特異的相互作用に起因して、血流中での早期の脱コンジュゲーション（ｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の場合に陽性であるその細胞透過を減少させることによって遊離薬物の毒性を減少させ、抗原低発現細胞に対するオフターゲット毒性を増加させる。例えば、抗体－薬物コンジュゲートにおいて、抗体及び薬物は、相補的ＤＮＡリンカーを使用して非共有結合的に連結され得る。Ｄｏｖｇａｎ，Ｉ．，Ｅｈｋｉｒｃｈ，Ａ．，Ｌｅｈｏｔ，Ｖ．ら Ｏｎ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ＤＮＡ ａｓ ａ ｌｉｎｋｅｒ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，７６９１（２０２０）。Ｄｏｖｇａｎらは、３７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを介してモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）に連結されるトラスツズマブを開示した。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは脂質であり得る。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはリン脂質であり得る。２つの蛍光色素又は色素／消光剤対の間にリン脂質基を挿入することにより、ホスホリパーゼ切断活性の検出が可能になる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはホスホジエステルであり得る。２つの蛍光色素又は色素／消光剤対の間にホスホジエステル基を挿入することにより、ホスホジエステラーゼ切断活性の検出が可能になる。いくつかの実施形態では、脂質はフルオロフォアに直接結合している。脂質とフルオロフォアとの間の共有結合が切断されると、蛍光活性の増加は酵素の存在の検出を可能にする。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはエステルであり得る。エステル基は、鹸化によって切断されることが多い。切断に対するエステルの反応性は、電子吸引基の使用によって増強され得るか、又は自発的加水分解を排除するための自壊スペーサーの使用によって安定化され得る。化学生物学では、エステルベースの切断可能化合物を最初にタンパク質精製及び構造生物学に使用した。ＦＲＥＴベースのプローブは、エステラーゼ活性を画像化するように設計された。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーはグリコシドであり得る。例えば、セルラーゼ酵素は、セルロースをグルコースに分解し、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）を炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に接続するグリコシル化リンカーから構成されることが多い。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、求核剤／塩基感受性リンカーであり得る。これらには、ハロゲン求核剤、酸素求核剤、安全性捕捉リンカー（ｓａｆｅｔｙ－ｃａｔｃｈ ｌｉｎｋｅｒ）、チオール求核剤、窒素求核剤及びフェナシルエステル誘導体が含まれ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼを含むがこれらに限定されないすべての酵素ファミリーからの活性に感受性であり得る。
フッ素分解性リンカー（ｆｌｕｏｒｉｄｏｌｙｚａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）は、アルコールのケイ素ベースの保護基として有機化学において広く使用されている。ケイ素に対するフッ素の高い熱力学的親和性は、フッ素源を使用して直交した温和な条件でのそれらの除去を可能にする。この反応では、フッ化物イオンが求核種としてケイ素と反応し、切断条件はケイ素のアルキル基の立体障害に依存する。フッ化物イオンはまた、それらの塩基性特性のために結合切断を引き起こすことができる。
酸素求核剤にはスルホン及びエステルリンカーが含まれるが、安全性捕捉リンカーは、リンカーが化学修飾によって切断のために活性化されるまで安定なままであるので、結合切断のタイミングに対するより大きな制御を可能にする。
二級アミン合成又は固相合成において、ニトロベンゼンスルホンアミドは、ｂ－メルカプトエタノールのようなチオール求核剤で切断されることが知られている。システインは、電子不足アルキンによって修飾されて、ビニルスルフィド結合を形成することができる。
求核剤として特定の窒素種を含む置換反応は、穏やかな切断可能な条件で起こり得る。これらの反応は、２つのグループ：アミノリシス又は交換反応による切断に分類することができる。アミノリシス切断の例としては、ピロリジン又はヒドラジンによるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）インドール誘導体の切断、及びヒドロキシルアミン又はヒドラジンによるエステルリンカーの切断が挙げられる。アシルヒドラゾン４４及びヒドラゾン４５、１５６は、弱酸性媒体中での遷移を通じて切断可能なリンカーとして使用することができる。アミン触媒（例えば、アニリン、ｐ－アニシジン又はヒドロキシルアミン）は、加水分解を促進し、切断及び交換に必要な安定状態と動的状態との間の効果的な遷移を可能にする。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは還元感受性リンカーであり得る。還元感受性連結は、長い間、化学生物学において使用されており、切断可能なリンカーの一般的に使用されるクラスである。還元条件に感受性の切断可能なリンカーの例としては、ニトロレダクターゼ、ジスルフィド架橋及びアゾ化合物が挙げられる。Ｋａｒａｎらは、ニトロレダクターゼを検出するための蛍光プローブを報告した。Ｓａｎｕ Ｋａｒａｎ，Ｍｉ Ｙｏｕｎｇ Ｃｈｏ，Ｈｙｕｎｓｅｕｎｇ Ｌｅｅ，Ｈｗｕｎｊａｅ Ｌｅｅ，Ｈｙｅ Ｓｕｎ Ｐａｒｋ，Ｍａｈｅｓｈ Ｓｕｎｄａｒａｒａｊａｎ，Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｌ．Ｓｅｓｓｌｅｒ，ａｎｄ Ｋｗａｎ Ｓｏｏ Ｈｏｎｇ．Ｎｅａｒ－Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｈｙｐｏｘｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０２１ ６４（６），２９７１－２９８１。天然に生じるタンパク質では、ジスルフィド架橋は、一般に、タンパク質構造を維持する役割を果たす。これらは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｂ－メルカプトエタノール又はトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）のような穏やかな還元剤によって効率的かつ迅速に切断されることが知られている。化学生物学において、ジスルフィド架橋は、機能的及び構造的プロテオミクス、薬物送達、腫瘍イメージング、ＤＮＡ及びタンパク質－ＤＮＡ複合体精製を含む広範囲の適用で使用されてきた。ジスルフィドベースの切断可能なリンカーは、その直接的な合成及び迅速な切断のために一般的に使用される。アゾリンカーは、穏やかで潜在的に生物直交性の還元剤である亜ジチオン酸ナトリウムで処理した後に切断を受けることができるため、化学生物学者にとって非常に魅力的である。アゾ化合物は、電気化学的還元機構を介して２つのアニリン部分に還元され、これにより、ＴＣＥＰ、ＤＴＴなどの多くの生物学的プロトコルで一般的に使用される還元剤の使用が可能になる。化学生物学において、アゾ化合物は、タンパク質を架橋するために１０年及びそれを超える期間にわたって使用されており、より最近ではタンパク質親和性精製のために使用されている。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、求電子剤／酸感受性リンカーであり得る。酸感受性リンカーは、他の種類のリンカーと組み合わせることができる。例えば、β－Ｄ－ガラクトピラノシドの最初のβ－ガラクトシダーゼ切断は、ベンジルオキシカルボニル基の自壊を引き起こし、光学活性プローブの放出をもたらす。Ｈｏ，Ｎ．－Ｈ．，Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ｔｕｎｇ，Ｃ．－Ｈ．（２００７），Ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｆｏｒ β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，８：５６０－５６６。２つの異なる求電子切断様式が化学生物学において使用される。プロトン源に感受性の酸性感受性リンカー及びアジド化合物に感受性のアルキル２－（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート誘導体。プロトン感受性結合は、有機化学において最も頻繁に使用される切断可能な機能の１つであり、アミンを保護するＢＯＣ基、又は固相合成に使用されるメリフィールド樹脂の開発によって例示される。有機化学では、許容され得る切断条件は、酸、試薬、溶媒、温度及びｐＨ」に関して非常に柔軟であり得る。対照的に、生体適合性の酸切断可能なリンカーは、ｐＨのわずかな変化に応答しなければならない。強酸性条件は、タンパク質及びＤＮＡの変性をもたらし得る。生体適合性の酸切断可能なリンカーは、生理学的ｐＨ付近での不安定性のために選択され、強酸で切断される古典的な保護基とは異なることが多い。水中で結合を切断又は形成することができる化学反応は、切断可能なリンカー、例えばシュタウディンガーライゲーションの基礎として使用することができる。この反応は、アジドに対するアルキル２－（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート誘導体の求核攻撃によって進行し、アザ－イリド中間体を形成する。次いで、エステルはアザ－イリドを捕捉し、アミドの形成をもたらす。このプロセスでは、エステルは切断可能なリンカーとして作用し、アジドは生体直交型化学作用物質として作用し、これは化学選択的及び生体直交型切断を保証する。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、金属で切断可能なリンカーであり得る。有機金属化合物は、非天然アミノ酸を含有するタンパク質の修飾を触媒するために使用されるが、化学生物学における切断試薬としてのそれらの使用は数回しか報告されていない。アリル官能基は、有機合成においてアルコールのために一般的に使用される保護基であり、合成によるＤＮＡシーケンシングにおいて切断可能なリンカーとしても使用される。金属で切断可能なリンカーは、酵素非依存性ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション法のために開発されたペプチド核酸（ＰＮＡ）の設計においても使用された。
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、酸化感受性リンカーであり得る。過ヨウ素酸ナトリウムは、隣接ジオールを切断して２つのアルデヒド化合物を形成する能力のために、間違いなく最も頻繁に使用される生体適合性酸化剤である。このタイプの切断可能なリンカーの一例は、酒石酸スペーサー及び両端に２つの官能基を有するビシナルジオールからなる。セレンベースのリンカーはまた、ポリスチレンビーズ（ヨードビーズ）に固定化された過ヨウ素酸ナトリウム又はＮ－クロロベンゼンスルホンアミドなどの酸化剤に感受性の切断可能な結合を含む。トリガー剤は、不安定な結合を酸化セレンに酸化し、次いで、分子内ｂ脱離又は再配列を介して直接切断される。
レポーター及び検出方法
いくつかの態様では、本明細書に記載のプローブ／分子はレポーターを含む。本明細書中に記載されるようなレポーターは、蛍光検出、分光検出、免疫学的検出又はイメージング検出を含むがこれらに限定されない任意の方法によって検出され得る任意の構造であり得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、蛍光標識、質量タグ又は核酸バーコードであり得る。
いくつかの実施形態では、レポーターは蛍光標識であり得る。蛍光などの小さな化合物を含有する標識、タグ及びプローブを使用して、タンパク質及び核酸を標識することができる。他の分子に対する生物親和性（ビオチン、ジゴキシゲニン）、酵素的（ＡＰ、ＨＲＰ）又は化学発光的（エステル又はアクリジン）も同様に使用することができる。ＧＦＰファミリーの蛍光タンパク質のような遺伝的にコードされたマーカーは、遺伝子発現研究及びタンパク質局在化に最適なレポーターとなっている。細胞内タグと組み合わせて、ＧＦＰを使用してシナプスのような細胞内構造を標識することができ、シナプス形成のような発生プロセスを研究するための新規アプローチが可能になる。他の蛍光標識には、小型有機色素及び親油性色素が含まれるが、これらに限定されない。蛍光標識は、リンカーを添加することなく、それ自体が活性基質として機能し得る。
したがって、一部のレポーターは「内部消光」され、消光剤を必要とせず、内部消光されたフルオロフォアを基質リンカーに連結する結合の切断が蛍光分子を直接もたらす。プロテアーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼなどのための多くの記載されたプローブは、このように機能する。
いくつかの実施形態では、レポーターは、質量タグであり得る。質量タグ試薬は、質量分析（ＭＳ）を使用して異なる試料中のタンパク質の同定及び定量を可能にするように設計されている。セット内の質量タグ付け試薬は、典型的には、同じ公称質量（すなわち、等重である）及びアミン反応性ＮＨＳエステル基、スペーサーアーム（質量正規化剤（ｍａｓｓ ｎｏｒｍａｌｉｚｅｒ））及び質量レポーターから構成される化学構造を有する。
いくつかの実施形態では、レポーターは核酸バーコードであり得る。例えば、ＤＮＡバーコード化は、市販品を区別するためにスーパーマーケットスキャナによって統一商品コードが使用されるのと同様の方法で、「バーコード」として作用する短い標準化された遺伝子領域の使用に焦点を当てた種同定のためのシステムである。
いくつかの実施形態では、レポーターは、リガンド結合アッセイを使用して検出され得る。リガンド結合アッセイは、多くの場合、蛍光、比色、生物発光及び化学発光ＥＬＩＳＡを含むＥＬＩＳＡ、紙試験片若しくは側方流動アッセイ、又はビーズベースの蛍光アッセイなどの検出工程を含む。いくつかの実施形態では、紙ベースのＥＬＩＳＡ試験を使用して、流体試料中の切断されたレポーターを検出することができる。紙ベースのＥＬＩＳＡは、市販の固体インクプリンタから堆積したワックスをリフローイングして、単一の紙片上に試験スポットのアレイを作成することなどによって、安価に作成することができる。固体インクが液体又は半液体状態に加熱されると、印刷されたワックスが紙に浸透し、疎水性障壁が生じる。次いで、疎水性障壁間の空間を個々の反応ウェルとして使用することができる。ＥＬＩＳＡアッセイは、個々の反応ウェル上で検出抗体を乾燥させ、紙の試験スポットを構成し、続いてブロッキング及び洗浄工程を行うことによって実施され得る。次いで、対象から採取した試料からの流体を試験スポットに添加することができる。そして、検出抗体として、例えば、ストレプトアビジンアルカリホスフェート（ＡＬＰ）コンジュゲートを試験スポットに添加してもよい。次いで、結合したＡＬＰをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５－ブロモ－４－クロロ－３”－インドリホスフェートｐ－トルイジン塩／ニトロブルーテトラゾリウムクロリド）などの呈色反応剤に曝露することができ、これは紫色の沈殿物を引き起こし、レポーターの存在を示す。
いくつかの実施形態では、レポーターは、揮発性有機化合物を使用して検出され得る。揮発性有機化合物は、ガスクロマトグラフィー機器、呼気分析装置、質量分析計、又は光学若しくは音響センサの使用などの分析プラットフォームによって検出することができる。ガスクロマトグラフィーを使用して、分解することなく気化することができる化合物（例えば、揮発性有機化合物）を検出することができる。ガスクロマトグラフィー機器は、カラムと呼ばれるガラス又は金属管の内部に、担体ガス、例えばヘリウムなどの不活性ガス又は窒素などの非反応性ガスである移動相（又は移動相）と、不活性固体支持体上の液体又はポリマーの微細な層である固定相とを含む。カラムは固定相でコーティングされ、分析されるガス状化合物はカラムの壁と相互作用し、それらを異なる時間に溶出させる（すなわち、カラム内の変動する保持時間を有する）。化合物は、それらの保持時間によって区別され得る。
質量分析及び濃縮／クロマトグラフィー法を使用して、質量の差及び／又は標識の存在に基づいて、本発明で使用されるインタクトなレポーターから切断されたものを分離及び区別／検出することができる。例えば、酵素反応は、出発基質の質量シフトをもたらす親分子の断片化をもたらすことができ、これはサイズ排除クロマトグラフィー及び親和性濃縮などの異なるクロマトグラフィー／濃縮方法で利用することができる。質量分析では、試料は、例えば電子を衝突させることによってイオン化される。試料は、固体、液体又は気体であり得る。試料をイオン化することにより、試料の分子の一部が帯電した断片に分解される。次いで、これらのイオンは、それらの質量電荷比に従って分離され得る。これは、イオンを加速し、それらを電場又は磁場に供することによって行われることが多く、同じ質量電荷比を有するイオンは同じ量の偏向を受ける。偏向されると、荷電粒子を検出することができる機構、例えば電子増倍管によってイオンが検出され得る。検出された結果は、質量電荷比の関数としての検出されたイオンの相対存在量のスペクトルとして表示することができる。次いで、試料中の分子は、分子全体の質量などの既知の質量を同定された質量と相関させることによって、又は特徴的な断片化パターンによって同定することができる。
レポーターが核酸を含む場合、レポーターは、当該分野で公知の様々なシーケンシング方法、例えば伝統的なサンガーシーケンシング法又は次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって検出され得る。ＮＧＳは、一般に、多くの（すなわち、数千、数百万、又は数十億）核酸鎖を並行してシーケンシングすることができる非サンガーベースのハイスループット核酸シーケンシング技術を指す。このようなＮＧＳシーケンシングの例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（例えば、ＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ、ＭｉｎｉＳｅｑ、及びｉＳｅｑ １００）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（例えば、Ｓｅｑｕｅｌ及びＲＳＩＩ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（例えば、Ｉｏｎ Ｓ５、Ｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｎ、Ｉｏｎ ＰＧＭ、及びＩｏｎ Ｃｈｅｆシステム）によって製造されたプラットフォームが挙げられる。任意の適切なＮＧＳシーケンシングプラットフォームが、本明細書中に記載されるような検出可能な分析物の核酸をＮＧＳが検出するために使用される場合があることが理解される。
分析は、生物学的試料に対して直接行われてもよく、又は検出可能な切断されたレポーターが最初にある程度まで精製されてもよい。例えば、精製工程は、検出可能な分析物を生物学的試料中の他の成分から単離することを含み得る。精製は、親和性クロマトグラフィーなどの方法を含み得る。単離又は精製された検出可能な分析物は、分析前に１００％純粋である必要はなく、実質的に純粋である必要もない。切断されたレポーターを検出することにより、定性的評価（例えば、検出可能な切断されたレポーター、したがって所定のプロテアーゼが存在するか、又は存在しないか）又は定量的評価（例えば、存在する検出可能な切断されたレポーターの量）を提供して、流体試料中の所定のプロテアーゼの比較活性レベルを示すことができる。定量的な値は、試料中に存在する各画分のパーセント相対量を決定することなどの任意の手段によって計算することができる。これらのタイプの計算を行う方法は、当技術分野で公知である。
切断されたレポーターは、特定のレポーターに適し得る任意の検出方法によって検出され得る。いくつかの態様では、検出方法は、蛍光検出、分光検出、質量分析、免疫学的検出又はイメージング検出を含む。いくつかの態様では、検出方法は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）であり得る。
いくつかの実施形態では、検出方法は分光検出であってもよい。分光学的検出方法は、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）で非常に一般的に使用され、使用頻度において導電率検出に次いでいる。これらの方法は、分子分光技術と原子分光技術とに大別することができる。分子分光法には、ＵＶ可視分光光度法、屈折率測定、及びフォトルミネッセンス技術（蛍光及びリン光）が含まれる。原子分光法には、原子発光分光法（様々な励起源を使用）及び原子吸光分光法が含まれる。分光検出方法の多くは、直接又は間接モードで動作することができる。これらの用語の定義は、電気化学的検出モードを説明するために使用されるものと同じである。すなわち、溶質イオンが溶離液イオンよりも測定された検出パラメータの値が大きい場合、直接分光検出が得られる。間接的な検出は、逆が真である場合に生じる。
いくつかの実施形態では、検出方法は質量分析であり得る。質量分析（ＭＳ）は、イオンの質量電荷比を測定するために使用される分析技術である。結果は、典型的には、質量スペクトル、質量電荷比の関数としての強度のプロットとして提示される。
いくつかの実施形態では、検出方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）であり得る。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、光子の放出を伴わない距離依存性双極子－双極子相互作用であり、最初に励起されたドナー分子からアクセプター分子へのエネルギーの移動をもたらす。それは、ナノメートル範囲の分子相互作用の検出を可能にする。ＦＲＥＴペプチドは、ドナー分子及びアクセプター（消光剤）分子で標識される。ほとんどの場合、ドナー及びアクセプターの対は、２つの異なる色素である。アクセプターが非蛍光色素（消光剤）である場合、蛍光ドナーから移動したエネルギーは分子振動に変換される。ＦＲＥＴが（ドナーとアクセプターとを分離することによって）終結すると、ドナー蛍光の増加を検出することができる。ドナー色素及びアクセプター色素の両方が蛍光性である場合、移動したエネルギーは、より長い波長の光として放出され、ドナー蛍光及びアクセプター蛍光の強度比変化を測定することができる。効率的なＦＲＥＴ消光が起こるためには、フルオロフォア及び消光剤分子は互いに近接していなければならず（約１０～１００Å）、消光剤の吸収スペクトルはフルオロフォアの発光スペクトルと重複しなければならない。
沈殿性フルオロフォア
いくつかの態様では、切断されるレポーターは、沈殿性フルオロフォアであり得る。いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアは、ＨＰＱ、Ｃｌ－ＨＰＱ、ＨＴＰＱ、ＨＴＰＱＡ、ＨＢＰＱ、又はＨＱＰＱであり得る。
いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアは、２－（２”－ヒドロキシフェニル）－４（３Ｈ）－キナゾリノンとしても知られるＨＰＱであり得る。ＨＰＱは、励起状態分子内プロトン移動（ＥＳＩＰＴ）によるその古典的な発光機構で知られている小さな有機色素であり、固体状態では強い発光を示すが、溶液中では発光を示さない。ＨＰＱは、水に厳密に不溶性であることが見出され、テトラフェニルエチレンの固体蛍光と同様の強い固体蛍光を示す。さらに、イミン窒素とフェノール性ヒドロキシル基との間の内部水素結合の確立を妨げることによって、不溶性及び強い固体蛍光というその本質的な特性を打ち消し、逆転させることができる。
いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアはＣｌ－ＨＰＱであり得る。Ｃｌ－ＨＰＱは、水溶性で非蛍光性の分子であるＨＰＱＦがフューリンと反応すると放出される。Ｃｌ－ＨＰＱは、酵素活性部位の近くで沈殿を開始し、沈殿は６０倍を超える蛍光増強を有する明るい固体蛍光を発する。Ｌｉら、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｆｕｒｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｂｅ ｂｙ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１８，９０，１９，１１６８０－１１６８７。
いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアは、ＨＴＰＱであり得る。ＨＴＰＱは、水に厳密に不溶性であることが見出され、固体状態において強い蛍光を示し、最大の励起波長及び発光波長がそれぞれ４１０ｎｍ及び５５０ｎｍである。これにより、共焦点顕微鏡での使用にはるかに適している。ＨＴＰＱの大きなストークスシフトは、感度の増加、バックグラウンド蛍光の最小化、及びバイオイメージングコントラストの向上という追加の非常に望ましい利点に寄与する。Ｌｉｕら、Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ａ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２０１７ Ｓｅｐ １８；５６（３９）：１１７８８－１１７９２。
いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアは、ＨＴＰＱＡであり得る。ＨＴＰＱＡは、ＨＴＰＱに由来する別の酵素応答性蛍光発生プローブである。ＡＬＰによって変換されると、プローブは遊離ＨＴＰＱを放出し、これは非常に短い遅延の後に沈殿し始める。沈殿物は、１００倍を超える蛍光増強を有する明るい固体蛍光を発する。
いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアは、ＨＢＰＱであり得る。ＨＢＰＱは水に完全に不溶性であり、４０５ｎｍレーザーで励起すると強い黄色の固体発光を示す。Ｌｉｕら、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０２１，９３，１６，６４６３－６４７１，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔｅ：Ａｐｒｉｌ １４，２０２１。
いくつかの実施形態では、沈殿性フルオロフォアは、ＨＱＰＱであり得る。ＨＱＰＱは、水に不溶性の新規な固体フルオロフォアである。Ｌｉら、Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ａｎａｌｙｔｅｓ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０２１，９３，４，２２３５－２２４３．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔｅ：Ｊａｎｕａｒｙ ５，２０２１。
沈殿性及び非沈殿性フルオロフォアは、初期プローブを安定化し、酵素的切断が犠牲スペーサーを介して沈殿性フルオロフォア又は非内部消光可溶性フルオロフォアの形成に変換されることを確実にするために、自壊基質によって酵素基質から分離され得る。
蛍光消光剤
いくつかの態様では、本明細書に記載のプローブ／分子は蛍光消光剤を含む。本明細書に記載の蛍光消光剤は、所与の物質の蛍光強度を低下させることができる任意の構造であり得る。いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＢＢＱ６５０、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＣＰＱ２、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、ＤＡＢＣＹＬ（４－（［４’－ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）ベンゾイル）、Ｄｎｐ（２，４－ジニトロフェニル）又はＥｃｌｉｐｓｅ（登録商標）であり得る。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、又はＢＢＱ６５０を含むがこれらに限定されないＢＨＱ消光剤であり得る。ＢＨＱ又はブラックホール消光剤、色素は、ＦＲＥＴと静的消光の組み合わせによって機能し、ＴＡＭＲＡなどの蛍光消光剤に共通の残留バックグラウンドシグナル、又は低いシグナル対ノイズ比の回避を可能にする。異なるタイプのＢＨＱ色素は、異なる着色色素を消光するために使用され、ＢＨＱ１は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、又はＨＥＸなどの緑色及び黄色の色素を消光するために使用され、そしてはＢＨＱ２は、橙色及び緑色の色素を消光するために使用される。ＢＨＱ色素は、それらの多環芳香族（ｐｏｌｙａｃｒｏｍａｔｉｃ）－アゾ骨格のために天然の発光がない真の暗消光剤である。芳香環上の電子供与基及び電子求引基を置換すると、可視スペクトルにまたがる広い吸収曲線を有する完全な一連の消光剤が生成される。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、又はＡＴＴＯ６１２Ｑを含むが、これらに限定されないＡＴＴＯ消光剤であってもよい。ＡＴＴＯ消光剤は、強い吸収（高い吸光係数）及び高い光安定性という特徴的な特性を有する。ＡＴＴＯ消光剤は、ＦＲＥＴ実験のためのアミン標識ヌクレオチド上の蛍光消光剤としてしばしば利用される。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤はＣＰＱ２であり得る。消光剤ＣＰＱ２は、蛍光ドナー５－カルボキシフルオレセインと対として使用されることが多い。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７又はＱＳＹ－９を含むが、これらに限定されないＱＳＹ消光剤であり得る。ＱＳＹプローブは、フルオロフォアから励起エネルギーを吸収し、そのエネルギーを熱として放散する物質である暗消光剤である。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、ＤＡＢＣＹＬ（４－（［４’－ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）ベンゾイル）であり得る。ＤＡＢＣＹＬは、ＦＲＥＴベースの核酸プローブ及びプロテアーゼ基質を開発するための最も一般的なアクセプターの１つである。ＤＡＢＣＹＬ色素は、ＦＲＥＴベースの蛍光プローブにおいてＥＤＡＮＳと対になることが多い。ＤＡＢＣＹＬは、広くて強い可視吸収を有するが、蛍光はない。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤はＤｎｐ（２，４－ジニトロフェニル）であり得る。Ｄｎｐは、安定な消光剤であり、その吸収スペクトルはｐＨで変化しないため、この基は溶液中の基質定量のための便利なマーカーとなる。
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）であってもよい。Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）は、非蛍光発色団であり、二重標識プローブにしばしば使用される暗消光剤である。暗消光剤として、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）は蛍光を発することなくエネルギーを吸収する。Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）は、３９０ｎｍ～６２５ｎｍの吸収範囲を有し、広範囲の着色ＦＲＥＴプローブにおいて有効な性能を有することができる。
担体
いくつかの態様では、本明細書に記載のプローブ／分子は担体を含む。本明細書に記載の蛍光消光剤は、任意の構造であってもよい。いくつかの実施形態では、担体が、天然タンパク質、標識タンパク質若しくは合成タンパク質、正確に既知の化学組成の、又は平均分子量付近の分布を有する合成化学ポリマー（例えば、直鎖又は分岐ＰＥＧポリマー）、オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、若しくはフォルダマー、脂質、脂質ミセル、ナノ粒子（例えば、酸化鉄、金、及び非金属ナノ粒子）、ポリスチレン、ポリプロピレン、又は任意の他の種類のプラスチック若しくはポリマーで作製された固体支持体であり得る。いくつかの実施形態では、担体は、ペプチドリンカーよりも長いペプチドであり得る。担体は、切断可能なリンカーに共有結合又は非共有結合され得る。
いくつかの実施形態では、担体はナノ粒子であり得る。ナノ粒子を介した不溶性薬物の輸送は、それらの小さな粒径のために改善されている。ナノ粒子担体は、ナノスケール顕微鏡に属するサブマイクロ粒子送達システムの一種である。サブ粒子にカプセル化された薬物は、薬物放出の速度を調整し、バイオフィルムの透過性を増加させ、インビボでの分布を変化させ、バイオアベイラビリティを改善することができる。ナノ粒子は、官能化システムのコアとして使用される１０から１００ｎｍのサイズの範囲の固体コロイド粒子である。それらは、一般に、天然又は合成高分子物質から構成され、薬物を伝導又は輸送するための担体として使用することができる。ナノスフェア及びナノカプセルを形成することができる。ナノ材料の化学物質は、キトサン、ゼラチン、分枝ポリマー、炭素ベースの担体などである。金ナノ粒子は、チオール（ＳＨ）基を含有する部分の単層の付加によって官能化することができる金原子のコアからなる。
いくつかの実施形態では、担体は、天然タンパク質、標識タンパク質又は合成タンパク質であり得る。タンパク質は、化学物質及び生体分子薬物、例えば抗癌剤及び治療用タンパク質の送達のための担体として使用することができる。タンパク質ナノ粒子は、薬物送達系として、生分解性、安定性、粒子の表面修飾、粒径制御の容易さなどのいくつかの利点を有し、免疫原性などの毒性問題に関連する問題が少ない。タンパク質ナノ粒子は、フィブロイン、アルブミン、ゼラチン、グリアジン、レグミン、３０Ｋｃ１９、リポタンパク質、及びフェリチンタンパク質などのタンパク質を使用して生成することができ、エマルジョン、エレクトロスプレー、及び脱溶媒和法によって調製される。Ｈｏｎｇ Ｓ，Ｃｈｏｉ ＤＷ，Ｋｉｍ ＨＮ，Ｐａｒｋ ＣＧ，Ｌｅｅ Ｗ，Ｐａｒｋ ＨＨ．Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０２０；１２（７）：６０４．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ２０２０ Ｊｕｎ ２９。例えば、分子量６６ｋＤａの血漿タンパク質であるアルブミンは、薬物担体として広く研究されている。
いくつかの実施形態では、担体は合成化学ポリマーであってもよい。ポリマーナノ粒子は、薬物ナノ担体として広く研究されている。薬物負荷は、（ｉ）ケージ及びカプセルなどのナノスケール構造を形成するためのポリマーを使用した水性薬物相の捕捉、又は（ｉｉ）インビボで加水分解することができる単純なエステル又はアミド結合によるポリマー骨格への薬物分子の化学結合のいずれかによって達成される。最も広く研究されている合成ポリマーには、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）及びＰＥＧが含まれる。３つのポリマーはすべてインビボで加水分解され、生分解性である。Ｍａｌａｍ Ｙ，Ｌｏｉｚｉｄｏｕ Ｍ，Ｓｅｉｆａｌｉａｎ ＡＭ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｎａｎｏｓｉｚｅｄ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００９ Ｎｏｖ；３０（１１）：５９２－９。
いくつかの実施形態では、担体はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。ＰＥＧは、有機溶媒及び親水性溶媒の両方に可溶であるため、担体として包括的に研究されてきた。多くの他の合成ポリマーとは異なり、ＰＥＧは比較的親水性である。ＰＥＧとのコンジュゲーションは、疎水性分子の溶解性を増加させ、生物における循環時間を延長する。ＰＥＧはまた、薬物などの分子の非特異的吸収を最小化し、標的化された組織に対する特異的親和性を提供し、悪性組織における薬物蓄積を増加させる。ＰＥＧを他のポリマーにコンジュゲートさせて、それらの疎水性を低くし得る（すなわち、ＰＥＧ化）。表面親水性の変化はタンパク質吸着を防ぎ、それによって生体材料足場上の細胞接着及び増殖を可能にする。ＰＭＯ骨格は、ホスホロジアミデート結合を有するモルホリノ環で作られており、相補的な塩基対合を依然として維持しながらヌクレアーゼ分解からそれらを保護する。細菌病原体を標的とするＰＭＯベースのアンチセンス技術の潜在的な適用は、新しいクラスの抗菌薬物の開発のために探索されている。Ｐａｎｃｈａｌ ＲＧ、Ｇｅｌｌｅｒ ＢＬ、Ｍｅｌｌｂｙｅ Ｂ、Ｌａｎｅ Ｄ、Ｉｖｅｒｓｅｎ ＰＬ、Ｂａｖａｒｉ Ｓ．ペプチドコンジュゲートホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーは、Ａｍｅｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓでチャレンジしたマウスの生存を増加させる。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．２０１２；２２（５）：３１６－３２２。フルオレセイン特異的抗体と組み合わせたフルオレセインタグ付きモルホリノを、インサイツでｍｉＲＮＡへのハイブリダイゼーションのためのプローブとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、担体はオリゴヌクレオチドであり得る。ケージ様ＤＮＡナノ構造体、ＤＮＡ粒子、ＤＮＡポリポッド、及びＤＮＡヒドロゲルを含む様々な構造体の生物安定性の高ペイロードＤＮＡナノアセンブリが報告されている。ケージ様ＤＮＡ構造体は、構造内に薬物分子をしっかりと保持し、空洞内に大きな空間を残す。これらのＤＮＡナノ構造体は、豊富なＣｐＧを担持するためにそれらの固有の構造、並びに様々な疾患の免疫療法を達成するために免疫細胞に入るためのそれらの生体適合性及びサイズの利点を使用する。ＤＮＡナノ構造体の一部はまた、ａＰＤ１、ＲＮＡ、ＴＬＲリガンドなどの他の機能的成分と併せてより有効な処置を達成することができる。球状核酸、ハイブリッドＤＮＡベースのナノ粒子、ポリポッド様ＤＮＡナノ構造体、ＤＮＡヒドロゲルなどのＤＮＡベースのナノ粒子が報告されている。Ｃｈｉ Ｑ，Ｙａｎｇ Ｚ，Ｘｕ Ｋ，Ｗａｎｇ Ｃ ａｎｄ Ｌｉａｎｇ Ｈ（２０２０）ＤＮＡ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓ ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０：１５８５。
いくつかの実施形態では、担体はホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であり得る。アンチセンスホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）及びそれらの誘導体は、リボソームのｍＲＮＡへの結合を妨害し、それによってタンパク質翻訳を阻害することによって配列依存的に標的遺伝子発現を下方制御する。
いくつかの実施形態では、担体は、脂質又は脂質ミセルであり得る。リポソーム二重層は、合成リン脂質又は天然リン脂質のいずれかから構成され得る。リポソームの主な物理的及び化学的な特性は、透過性、電荷密度及び立体障害を含む構成要素のリン脂質の正味の特性に基づく。脂質二重層は、水分子とリン脂質の疎水性リン酸基との間の相互作用のためにそれ自体で閉じる。両親媒性リン脂質が二重層に自己会合するので、リポソーム形成のこのプロセスは自発的である。リポソームへの薬物負荷は、（ｉ）可溶性薬物で飽和した水溶液中でのリポソーム形成、（ｉｉ）有機溶媒及び溶媒交換機構の使用、（ｉｉｉ）親油性薬物の使用、（ｉｖ）ｐＨ勾配法によって達成することができる。Ｍａｌａｍ Ｙ，Ｌｏｉｚｉｄｏｕ Ｍ，Ｓｅｉｆａｌｉａｎ ＡＭ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ｎａｎｏｓｉｚｅｄ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２００９ Ｎｏｖ；３０（１１）：５９２－９。
いくつかの実施形態では、担体は、ポリスチレン、ポリプロピレン、又は任意の他の種類のプラスチックで作られた固体支持体であってもよい。例えば、微孔質ポリスチレン固形フォームの薬物送達特性は、Ｃａｎａｌらによって報告されている。これらの材料は、転相温度法によって調製された高度に濃縮されたエマルジョンの連続相での重合によって得られた。それらの多孔度、比表面及び表面トポグラフィは、薬物取り込み及び放出特性に関連する。Ｃａｎａｌ，Ｃｒｉｓｔｉｎａ＆Ａｐａｒｉｃｉｏ，Ｒｏｓａ＆Ｖｉｌｃｈｅｚ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ＆Ｅｓｑｕｅｎａ，Ｊｏｒｄｉ＆Ｇａｒｃｉａ－Ｃｅｌｍａ，Ｍａｒｉａ．（２０１２）．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｓｏｌｉｄ Ｆｏａｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ＆ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ａ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｃｉｅｔｅ ｃａｎａｄｉｅｎｎｅ ｄｅｓ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅｓ．１５．１９７－２０７．
いくつかの実施形態では、担体は、フォルダマーであってもよい。フォルダマーは、明確に定義されたコンフォメーションを有する折り畳まれたオリゴマー又はポリマーである。フォルダマーのコンフォメーションは、それらの一次配列から高度に予測可能であり、したがって、官能基を標的位置に配置することが可能であり、効率的な細胞取り込みなどのために機能的フォルダマーを設計することが可能であり得る。例えば、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）フォルダマーは、細胞膜透過性を備えたペプチドベースのフォルダマーである。ペプチドフォルダマーは、非天然アミノ酸、非タンパク質原性アミノ酸を含有し、ペプチドを短い配列であっても安定な二次構造、特にらせん構造を採用させる。この特性は、安定したらせん構造を有する両親媒性ＣＰＰの設計に役立つ。さらに、非天然アミノ酸を含有するペプチドは、一般に、身体全体及び細胞中に豊富であるプロテアーゼによる加水分解に対する耐性を示す。酵素分解に対するペプチドフォルダマーの高い安定性は、インビボでのそれらの機能の延長をもたらし得る。Ｍａｋｏｔｏ Ｏｂａ，Ｃｅｌｌ－Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｏｌｄａｍｅｒｓ：Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｏｏｌｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １０．１００２／ｃｂｉｃ．２０１９００２０４。
自壊スペーサー
いくつかの態様では、本明細書に記載のプローブ／分子は、自壊スペーサーを含む。いくつかの実施形態では、自壊スペーサーは、ジスルフィド、ｐ－アミノベンジルアルコール、ａ－キノンメチドスペーサー、ヘテロアミン二官能性ジスルフィド、チオールベースのピリダジンジオン、ｐ－アミンベンジルオキシカルボニル、ジペプチド、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌ－Ｐｈｅ－Ｓａｒ、トランス－シクロオクテンテトラジン、オルトヒドロキシ保護アリールスルフェート、ホスホルアミデートベースのスペーサー、ヒドロキシベンジル、トリメチルカルバメート、キノンメチドベースのスペーサー、環化スペーサー、トリメチルロック、２－アミノメチルピペリジン又はエチレンジアミン由来環化スペーサーを含む。Ｇｏｎｚａｇａら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ａｂｏｕｔ ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １０９（２０２０）３２６２－３２８１。
所定のプロテアーゼ又は酵素による切断可能なリンカーの切断は、自壊スペーサーを沈殿性の蛍光又は非蛍光レポーターから解離させ、それによって検出可能なシグナルをもたらす。複数のプローブ／分子の切断可能なリンカーは、体液試料中の所定のエンドプロテアーゼによって切断可能であってよく、自壊及びレポーター放出をもたらすか、又は所定のエキソペプチダーゼによって切断され得るプロテアーゼ基質をもたらす。いくつかの実施形態では、所定のエキソペプチダーゼは体液試料に添加される。いくつかの実施形態では、所定のエキソペプチダーゼはプロテアーゼ基質を切断し、それによって自壊スペーサーを沈殿性蛍光レポーターから解離させ、それによって検出可能なシグナルをもたらす。
体液試料
疾患又は状態の決定は、体液試料中で検出された放出されたレポーターの形成速度又は量に基づく。いくつかの実施形態では、体液試料は、血液、血清、血漿、骨髄液、リンパ液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脳脊髄液、滑液、精液、管吸引液（ｄｕｃｔａｌ ａｓｐｉｒａｔｅ）、糞便、膣流出液、嚢胞液、組織ホモジネート、組織由来液、涙液及び患者由来細胞株上清であり得る。いくつかの実施形態では、体液試料は、洗浄液を含む。いくつかの実施形態では、洗浄液は、洗口洗浄液、気管支肺胞上皮洗浄液、洗浄液、洗髪洗浄液、鼻スプレー流出物、食塩水若しくは任意の媒体又はその派生物に適用された任意の体表、開口部、臓器構造のスワブであってもよい。
いくつかの実施形態では、体液試料は、血液であり得る。血液は、体に栄養、酸素、及び老廃物の除去を提供する絶えず循環する流体である。血液は、ほとんどが液体であり、多数の細胞及びタンパク質が懸濁している。血液は、血漿、赤血球、白血球、及び血小板を含むいくつかの主要な因子で作られる。
いくつかの実施形態では、体液試料は、血漿であり得る。血漿は、抗凝固剤の添加によって凝固が防止されるときに残る液体である。血清は、凝固因子が血漿から除去されたときに残る流体についての当技術分野における従来の用語である。抗凝固剤は、血栓の予防に役立つ医薬品である。抗凝固剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、ヘパリン、シュウ酸塩、それらの任意の塩、溶媒和物、鏡像異性体、互変異性体及び幾何異性体、又はそれらの任意の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＥＤＴＡであり得る。孤立電子対を有する４つのカルボン酸基及び２つのアミン基を含有する多塩基酸であるＥＤＴＡの主な特性は、１：１金属－ＥＤＴＡ錯体中の金属イオンをキレート化又は錯体形成する能力である。酵素の補因子である金属イオンとの錯体形成が強いため、ＥＤＴＡは、一部の酵素反応が起こるのを防ぐ捕捉剤として広く使用されている。適切な容器（血液チューブ）内に添加剤なしで血液を採取すると、かなり急速に凝固する。カルシウムイオンがこのプロセスに必要であるので、ＥＤＴＡのカルボン酸基及びカルシウム間の特異的な会合は、凝固を防止し、いくつかの実験室分析に必要なように全血を流体形態で安定化するための信頼できる解決策である。さらに、ＥＤＴＡは、血液細胞及び粒子の最適な長期安定化を示した。抗凝固剤としては、Ｎａ２ＥＤＴＡ、Ｋ２ＥＤＴＡ及びＫ３ＥＤＴＡの３つのＥＤＴＡ製剤を使用することができ、これらの製剤の選択は、主に実行される分析の種類に依存する。
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、クエン酸塩であり得る。クエン酸塩（Ｃ６Ｈ７Ｏ７）は、１９１ダルトンの分子量を有する負に帯電した小分子である。クエン酸塩は、保存された血液産物に最適な抗凝固剤として、典型的には酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）（３．２２％クエン酸塩、１１２．９ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、１２３．６ｍｍｏｌ／ｌグルコース、２２４．４ｍｍｏｌ／ｌナトリウム及び１１４．２ｍｍｏｌ／ｌ水素イオン）、又はクエン酸三ナトリウム（ＴＣＡ）Ｎａ３Ｃ３Ｈ５Ｏ（ＣＯＯ）３、（４％ＴＣＡ、１３６ｍｍｏｌ／ｌクエン酸塩、４２０ｍｍｏｌ／ｌナトリウム）として使用することができる。クエン酸塩はカルシウムをキレート化し、０．２ｍｍｏｌ／ｌ未満のイオン化カルシウムで４～６ｍｍｏｌ／ｌの濃度で、凝固カスケードと血小板の両方の活性化を防ぐ。したがって、クエン酸塩は、血液学者によって使用される標準的な抗凝固剤であり、保存された血液産物のための輸血サービスであり、また、遠心血小板及び白血球除去法技術並びに血漿交換のための体外抗凝固剤でもある。
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリンであり得る。ヘパリンの抗凝固作用の分子的基礎は、凝固系のいくつかのセリンプロテアーゼ、最も重要なのは第ＩＩａ因子（トロンビン）、第Ｘａ因子及び第ＩＸａ因子に対する血漿タンパク質アンチトロンビンに結合し、その阻害活性を増強する能力にある。２つの主要な機構が、ヘパリンによるアンチトロンビンの増強の根底にある。ヘパリン結合によって誘導されるコンフォメーション変化は、反応性ループの排出及び酵素標的に直接結合するアンチトロンビンの表面のエキソサイトの曝露の両方を引き起こし、かつ阻害剤と酵素の両方が同じヘパリン分子に結合する鋳型機構が存在する。これら２つの作用様式の相対的な重要性は酵素間で異なる。さらに、ヘパリンは、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ阻害剤及び組織因子プラスミノーゲン阻害剤などの他のセリンプロテアーゼ阻害剤を介して作用することができる。インビボでのヘパリンの抗血栓作用は、抗凝固機構が支配的であるが、より複雑であり、他の血漿タンパク質及び細胞との相互作用は、生体脈管構造において重要な役割を果たす。
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、シュウ酸塩であり得る。ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及びリチウムのシュウ酸塩は、カルシウムと不溶性複合体を形成することによって血液凝固を阻害する。血液１ｍｌあたり１～２ｍｇの濃度のシュウ酸カリウムが広く使用されている。シュウ酸アンモニウム及び／又はシュウ酸カリウムの組み合わせは、赤血球の収縮を引き起こさない。それは、赤血球の膨潤を引き起こすシュウ酸アンモニウム３重量部と、それとバランスをとる収縮を引き起こすシュウ酸カリウム２部とからなる。３：２の比のＮＨ４＋＆Ｋ＋シュウ酸塩の混合物、及び血液１ｍｌあたり２ｍｇが必要量である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、骨髄液であり得る。骨髄は、ほとんどの骨の中心に見られ、多くの血管を有する。骨髄には赤色と黄色の２種類がある。赤色骨髄は、赤血球、白血球、又は血小板になり得る血液幹細胞を含む。黄色骨髄は、大部分が脂肪で作られている。
いくつかの実施形態では、体液試料は、リンパ液であり得る。リンパ液は、リンパとも呼ばれ、細胞及び組織から排出され、毛細血管に再吸収されない余分な体液の集合である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、胆汁であり得る。胆汁は、肝臓によって産生され、胆嚢に貯蔵された消化液である。胆汁の逆流中、消化液は胃、場合によっては食道に逆流する。
いくつかの実施形態では、体液試料は、羊水であり得る。羊水は、妊娠中の胎生児（胎児）を取り囲む透明でわずかに黄色がかった液体である。これは、羊膜嚢に含まれる。
いくつかの実施形態では、体液試料は、粘膜液であり得る。粘液とも呼ばれる粘膜液は、粘膜によって分泌され、病原体及び汚れが体内に入るのを防ぐために使用される粘度が高い保護液である。粘液はまた、身体組織が脱水されるのを防ぐために使用される。
いくつかの実施形態では、体液試料は唾液であり得る。唾液は、口内の唾液腺によって産生及び分泌される細胞外液である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、尿であり得る。尿は、ヒト及び他の多くの動物における代謝の液体副産物である。尿は、腎臓から尿管を通って膀胱に流れる。
いくつかの実施形態では、体液試料は、脳脊髄液であり得る。脳脊髄液は、脳及び脊髄を取り囲む透明な流体である。これは、傷害から脳及び脊髄を緩衝し、脳のための栄養送達及び老廃物除去システムとしても機能する。
いくつかの実施形態では、体液試料は、滑液であり得る。関節液としても知られる滑液は、関節の間に位置する粘度の高い液体である。この流体は、骨の端部を緩衝し、関節が動かされるときの摩擦を低減する。
いくつかの実施形態では、体液試料は、精液であり得る。精液は、懸濁液中に精子を含有する男性生殖液である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、管吸引液であり得る。管洗浄液、管液（ｄｕｃｔａｌ ｆｌｕｉｄ）又は洗浄液としても知られる管吸引液は、乳房の乳管（ｍｉｌｋ ｄｕｃｔ）などの管から採取される流体である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、糞便であり得る。排泄物又は便としても知られる糞便は、食物が消化された後に腸から排出される排泄物である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、膣流出液であり得る。膣流出液は、膣分泌物としても知られており、膣から出てくる透明又は白っぽい流体である。
いくつかの実施形態では、体液試料は、涙液であり得る。涙液は、涙液（ｌａｃｒｉｍａｌ ｆｌｕｉｄ）としても知られており、眼を潤滑し細菌と戦うために、涙腺によって分泌される。
いくつかの実施形態では、体液試料は組織ホモジネートであり得る。組織ホモジネートは、新鮮な組織の機械的微小破壊によって得られ、細胞膜は機械的に透過処理される。
プロテアーゼ及び他の作用物質
本明細書に記載のプローブ／分子は、体液由来のプロテアーゼによって切断され得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、エンドペプチダーゼを含む。エンドペプチダーゼは、ペプチド鎖の末端のもの以外のペプチド結合を切断する酵素である。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはエキソペプチダーゼを含む。エキソペプチダーゼは、末端又は最後から２番目のペプチド結合の切断を触媒する酵素である。このプロセスは、ペプチド鎖から単一のアミノ酸又はジペプチドを放出する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ａ２０（ＴＮＦａ誘導タンパク質３）、アブヒドロラーゼドメイン含有４、アブヒドロラーゼドメイン含有１２、アブヒドロラーゼドメイン含有１２Ｂ、アブヒドロラーゼドメイン含有１３、アクロシン、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２（ファーティリン－ｂ）、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ４、ＡＤＡＭ４Ｂ、ＡＤＡＭ５、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２メタロプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５／１１、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０、脂肪細胞ｅｎｈ．結合タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質２、気道トリプシン様プロテアーゼ、アミノアシラーゼ、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＢ様１、アミノペプチダーゼＭＡＭＳ／Ｌ－ＲＡＰ、アミノペプチダーゼＮ、アミノペプチダーゼＯ、アミノペプチダーゼＰホモログ、アミノペプチダーゼＰ１、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ、アミノペプチダーゼＱ、アミノペプチダーゼ様１、ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、ＡＭＳＨ－ＬＰ／ＳＴＡＭＢＰＬ１、アンギオテンシン変換酵素１（ＡＣＥ１）、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アンジオテンシン変換酵素３（ＡＣＥ３）、アニオン性トリプシン（ＩＩ）、アポリポタンパク質（ａ）、アーケアメトジンシン（ａｒｃｈａｅｍｅｔｚｉｎｃｉｎ）－１、アーケアメトジンシン－２、アスパルトアシラーゼ、アスパルトアシラーゼ－３、アスパルチルアミノペプチダーゼ、アタキシン－３、アタキシン－３様、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質１、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様２、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様３、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様４、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様５、ＡＴＰ２３ペプチダーゼ、オートファジン－１、オートファジン－２、オートファジン－３、オートファジン－４、アズロシジン、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ベータラクタマーゼ、ベータセクレターゼ１、ベータセクレターゼ２、ブレオマイシン加水分解酵素、脳のセリンプロテイナーゼ２、ＢＲＣＣ３６（ＢＲＣＡ２含有複合体、サブ３）、カルパイン、カルパイン１、カルパイン２、カルパイン３、カルパイン４、カルパイン５、カルパイン６、カルパイン７、カルパイン７様、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２、カルパイン１３、カルパイン１４、カルパイン１５（Ｓｏｌｈタンパク質）、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、システインプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＡ３、カルボキシペプチダーゼＡ４、カルボキシペプチダーゼＡ５、カルボキシペプチダーゼＡ６、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、カルボキシペプチダーゼＯ、カルボキシペプチダーゼＵ、カルボキシペプチダーゼＸ１、カルボキシペプチダーゼＸ２、カルボキシペプチダーゼＺ、カルノシンジペプチダーゼ１、カルノシンジペプチダーゼ２、カスパーゼ動員ドメインファミリー、メンバー８、カスパーゼ、カスパーゼ－１、カスパーゼ－２、カスパーゼ－３、カスパーゼ－４／１１、カスパーゼ－５、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９、カスパーゼ－１０、カスパーゼ－１２、カスパーゼ－１４、カスパーゼ－１４様、ｃａｓｐｅｒ／ＦＬＩＰ、カテプシン、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ（ＣＴＳＳ）、カテプシンＶ（ＣＴＳＶ）、カテプシンＷ、カテプシンＺ（ＣＴＳＺ）、カチオン性トリプシン、ｃｅｚａｎｎｅ／ＯＴＵドメイン含有７Ｂ、ｃｅｚａｎｎｅ－２、ＣＧＩ－５８、キマーゼ、キモパシン（ｃｈｙｍｏｐａｓｉｎ）、キモシン、キモトリプシンＢ、キモトリプシンＣ、凝固因子ＩＸａ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子Ｘａ、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＸＩＩａ、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ２、コラゲナーゼ３、補体プロテアーゼＣ１ｒセリンプロテアーゼ、補体プロテアーゼＣ１ｓセリンプロテアーゼ、補体Ｃ１ｒホモログ、補体成分２、補体成分Ｃ１ｒａ、補体成分Ｃ１ｓａ、補体因子Ｂ、補体因子Ｄ、補体因子Ｄ様、補体因子Ｉ、ＣＯＰＳ６、コリン（ｃｏｒｉｎ）、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１）、円柱腫症タンパク質（ｃｙｌｉｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトゾルアラニルアミノｐｅｐ．様１、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＤＤＩ関連プロテアーゼ、デシシン（ＤＥＣＹＳＩＮ）、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー１、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー２、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー３、ＤＥＳＣ１プロテアーゼ、デザートヘッジホッグタンパク質、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ１、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ２、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質１、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質３、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質４、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質５、ＤＩＮＥペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ジペプチジルペプチダーゼ６（ＤＰＰ６）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼ１０（ＤＰＰ１０）、ＤＪ－１、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質２、ＤＵＢ－１、ＤＵＢ－２、ＤＵＢ２ａ、ＤＵＢ２ａ様、ＤＵＢ２ａ様２、ＤＵＢ６、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、エナメリシン、エンドペプチダーゼＣｌｐ、小胞体メタロペプチダーゼ１、エンドセリン変換酵素１、エンドセリン変換酵素２、エンテロペプチダーゼ、表皮特異的ＳＰ様、エピライシン、上皮細胞形質転換配列（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）２癌遺伝子様、エピテリアシン（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｓｉｎ）、エポキシドヒドロラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ関連タンパク質、ｅｕｋａｒ．翻訳開始Ｆ３ＳＦ、ｅｕｋａｒ．翻訳開始Ｆ３ＳＨ、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ、ＦＡＣＥ－１／ＺＭＰＳＴＥ２４、ＦＡＣＥ－２／ＲＣＥ１、配列類似性を有するファミリー１０８、メンバーＡ１、配列類似性を有するファミリー１０８、メンバーＢ１、配列類似性を有するファミリー１０８、メンバーＣ１、配列類似性を有するファミリー１１１、Ａ、配列類似性を有するファミリー１１１、Ｂ、フューリン又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ガンマ－グルタミルヒドロラーゼ、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ１、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ２、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ５、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ６、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼｍ－３、ガンマ－グルタミルトランスフェラーゼ様３、ＧＣＤＦＰ１５、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢ、Ｇｌｎ－フルクトース－６－Ｐトランスアミダーゼ１、Ｇｌｎ－フルクトース－６－Ｐトランスアミダーゼ２、Ｇｌｎ－フルクトース－６－Ｐトランスアミダーゼ３、Ｇｌｎ－ＰＲＰＰアミドトランスフェラーゼ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、グルタミルシクラーゼ、グルタミニルシクラーゼ２、グリコシルアスパラギナーゼ、グリコシルアスパラギナーゼ－２、グランザイム、グランザイムＡ、グランザイムＢ、グランザイムＨ、グランザイムＫ、グランザイムＭ、ハプトグロビン－１、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ハプトグロビン関連タンパク質、ＨＡＴ様２、ＨＡＴ様３、ＨＡＴ様４、ＨＡＴ様５、ＨＡＴ関連プロテアーゼ、ＨＳＰ９０ＡＡ１？（熱ショック９０ｋＤａタンパク質１、アルファ）、ＨＳＰ９０ＡＢ１？（熱ショック９０ｋＤａタンパク質１、ベータ）、熱ショックタンパク質７５、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ（Ｇｒｐ９４）、メンバー１／腫瘍拒絶抗原（ｇｐ９６）、肝細胞増殖因子、ヘプシン、ＨｅｔＦ様、ＨＧＦ活性化因子、ｈＧＰＩ８、Ｈｉｎ－１／ＯＴＵドメイン含有４、ホモログＩＣＥＹ、ＨＰ４３．８ＫＤ、ＨＴＲＡ１セリンプロテアーゼ、ＨＴＲＡ２、ＨＴＲＡ３、ＨＴＲＡ４、ヒアルロナン結合ｓｅｒ－プロテアーゼ、埋め込みセリンプロテアーゼ２、インディアンヘッジホッグタンパク質、インスリジン、腸セリンプロテアーゼ１、ジョセフィン（ｊｏｓｅｐｈｉｎ）－１、ジョセフィン－２、又はこれらの組み合わせが含まれる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、カリクレイン（ＫＬＫ）、カリクレインｈＫ１、カリクレインｈＫ２、カリクレインｈＫ３、カリクレインｈＫ４、カリクレインｈＫ５、カリクレインｈＫ６、カリクレインｈＫ７、カリクレインｈＫ８、カリクレインｈＫ９、カリクレインｈＫ１０、カリクレインｈＫ１１、カリクレインｈＫ１２、カリクレインｈＫ１３、カリクレインｈＫ１４、カリクレインｈＫ１５、Ｋｅｌｌ血液型タンパク質、ＫＨＮＹＮ ＫＨ及びＮＹＮ ドメイン含有、ラクトトランスフェリン、レグマイン、レイシマノリシン（ｌｅｉｓｈｍａｎｏｌｙｓｉｎ）－２、ロイシルアミノペプチダーゼ、ロイシル－シスチニルアミノペプチダーゼ、ロイコトリエンＡ４加水分解酵素、リソソームカルボキシペプチダーゼＡ、リソソームＰｒｏ－Ｘ Ｃ－ペプチダーゼ、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）、マクロファージエラスターゼ、マクロファージ刺激タンパク質、哺乳動物トロイド様１タンパク質、哺乳動物トロイド様２タンパク質、ＭＡＰ１Ｄメチオニンアミノペプチダーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）１Ｄ、マラプシン、マラプシン２、ＭＡＳＰ１／３（ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ３）、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２）、マスチン、マトリリシン、マトリリシン－２、マトリプターゼ、マトリプターゼ－２、マトリプターゼ－３、膜ジペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ２、膜ジペプチダーゼ３、膜型モザイクＳｅｒタンパク質、メプリンアルファサブユニット、メプリンβサブユニット、中胚葉特異的転写物、メソトリプシン特異的転写物、メチオニルアミノペプチダーゼＩ、メチオニルアミノペプチダーゼＩＩ、メチオニルアミノペプチダーゼＩＩ様、ミトコンドリア内膜プロテアーゼ２、ミトコンドリア中間体ペプチダーゼ、ミトコンドリアＰｒｏｃ．ペプチダーゼｂ－サブユニット、ミトコンドリアＰｒｏｃ．プロテアーゼ、ミトコンドリアシグナルペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２７、ＭＰＮＤ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ２－ＭＭＰ、ＭＴ３－ＭＭＰ、ＭＴ４－ＭＭＰ、ＭＴ５－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、ＭＹＳＭ１、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＮＡＡＬＡＤＡＳＥ ＩＩ、ＮＡＡＬＡＤＡＳＥ様２、ＮＡＡＬＡＤＡＳＥ様１、ナプシンＡ、ナプシンＢ、ナルディライジン、鼻の胚性ＬＨＲＨ因子、ＮＥＤＤ４結合タンパク質１、ネプリライシン、ネプリライシン－２、ニューロリシン、ニューロトリプシン、好中球エラスターゼ（ＥＬＡＮＥ、ＥＬＡ２）、ＮＬＲＰ１自己切断タンパク質、核内ｒｅｃｅｐｔ．相互作用タンパク質２、核内ｒｅｃｅｐｔ．相互作用タンパク質３、ヌクレオポリン９８、ＮＹＮドメインおよびレトロウイルスインテグラーゼ含有、ＮＹ－ＲＥＮ－６０、ＯＭＡ１、Ｏ－シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、Ｏ－シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ様１、骨芽細胞セリンプロテアーゼ、ＯＴＵドメイン含有６Ｂ、ＯＴＵドメイン含有－１、ＯＴＵドメイン含有－３、ＯＴＵドメイン含有－５、ＯＴＵドメイン含有－６Ａ、ｏｔｕｂａｉｎ－１、ｏｔｕｂａｉｎ－２、ＯＴＵＤ２／ＹＯＤ１、オバスタシン、オビダクチン様／オボキマーゼ－２、オボキマーゼ様、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、プロテイナーゼ３（ＰＲＴＮ３）、パパイン、ＰＡＣＥ４プロタンパク質変換酵素、膵臓エラスターゼ、膵臓エラスターゼＩＩ（ＩＩＡ）、膵臓エラスターゼＩＩ形態Ｂ、膵臓エンドペプチダーゼＥ（Ａ）、膵臓エンドペプチダーゼＥ（Ｂ）、パパライシン－１、パパライシン－２、パラカスパーゼ、パラプレギン、ペプシンＡ、ペプシンＣ、ＰＨＥＸエンドペプチダーゼ、ＰＩＤＤ自己プロセシングタンパク質ユニット１、ＰＩＭ１エンドペプチダーゼ、ＰＩＭ２エンドペプチダーゼ、ピトリリシンメタロプロテイナーゼ１、血漿Ｇｌｕ－カルボキシペプチダーゼ、血漿カリクレイン、血漿カリクレイン様２、血漿－カリクレイン様３、血漿－カリクレイン様４、プラスミン（プラスミノーゲン）、ＰＭ２０Ｄ２ペプチダーゼ、ＰＯＨ１／ＰＳＭＤ１４、ポリセラーゼ－２、ポリセラーゼ－３、ポリセラーゼ－Ｉ、Ｐｐｎｘ、プレセニリン１、プレセニリン２、プレセニリンホモログ１／ＳＰＰＬ３、プレセニリンホモログ２、プレセニリンホモログ３／ＳＰＰ、プレセニリンホモログ４／ＳＰＰＬ２Ｂ、プレセニリンホモログ５、プレセニリン－ａｓｓｏｃ．ロンボイド様、プロコラーゲンＣ－プロテイナーゼ、増殖関連タンパク質１、プロリルオリゴペプチダーゼ、プロリルオリゴペプチダーゼ様、プロタンパク質転換酵素１、プロタンパク質転換酵素２、プロタンパク質転換酵素４、プロタンパク質転換酵素５、プロタンパク質転換酵素７、プロタンパク質転換酵素９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型、ＰＣＳＫ９）、プロスタシン（プロテアーゼ、セリン、５６）、プロテアソームアルファ１サブユニット、プロテアソームアルファ２サブユニット、プロテアソームアルファ３サブユニット、プロテアソームアルファ３様サブユニット、プロテアソームアルファ４サブユニット、プロテアソームアルファ５サブユニット、プロテアソームアルファ６サブユニット、プロテアソームアルファ７サブユニット、プロテアソームアルファ８サブユニット、プロテアソームｂサブユニットＬＭＰ７様、プロテアソームβ１サブユニット、プロテアソームβ２サブユニット、プロテアソームβ３サブユニット、プロテアソームβ３様サブユニット、プロテアソームβ４サブユニット、プロテアソーム触媒ｓｕｂ．１様、プロテアソーム触媒サブユニット１、プロテアソーム触媒サブユニット１ｉ、プロテアソーム触媒サブユニット２、プロテアソーム触媒サブユニット２ｉ、プロテアソーム触媒サブユニット３、プロテアソーム触媒サブユニット３ｉ、プロテインＣ、プロテインＣ様、プロテインＺ、プロテイナーゼ３、ＰＲＰＦ８、ＰＳＭＤ７、ピログルタミルペプチダーゼＩ、ピログルタミルペプチダーゼＩＩ、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、リーリン、レニン、レチノール結合タンパク質３、ロンボイド５ホモログ１、ロンボイド５ホモログ２、ロンボイドドメイン含有１、ロンボイドドメイン含有２、ロンボイド、細脈様（ｖｅｉｎｌｅｔ－ｌｉｋｅ）２、ロンボイド、細脈様３（ｅｉｎｌｅｔ－ｌｉｋｅ ３）、ロンボイド様タンパク質１、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ３（ＰＲＳＳ３）、Ｓ２Ｐプロテアーゼ、ＳＡＤ１、ｓｅｃｅｒｎｉｎ－１、ｓｅｃｅｒｎｉｎ－２、ｓｅｃｅｒｎｉｎ－３、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ２）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ３）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ５）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ５様１）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ６）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ７）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ８）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ９）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１１）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１２）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１３）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１４）を含む、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１５）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１６）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１７）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１８）、セントリン（ＳＵＭＯプロテアーゼ１９）、セパレース、セプレース、セリンカルボキシペプチダーゼ１、シグナラーゼ１８ｋＤａ成分、シグナラーゼ２１ｋＤａ成分、シグナラーゼ様１、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）Ｓｅｒ－ｐｒｏｔ．に類似、ＳＰＵＶＥに類似、サイト１プロテアーゼ、ソニックヘッジホッグタンパク質、ｓｐｉｎｅｓｉｎ、ＳｐｒＴ様のＮ末端ドメイン、ストロメリシン１、ストロメリシン２、ストロメリシン３、Ｔｙ１６ホモログのサプレッサー、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、タスパーゼ（ｔａｓｐａｓｅ）、ＴＢＰ関連因子２、ＴＥＳＰ２、ＴＥＳＰ３、テスターゼ２、精巣セリンプロテアーゼ２、精巣セリンプロテアーゼ３、精巣セリンプロテアーゼ４、精巣セリンプロテアーゼ５、精巣セリンプロテアーゼ６、テスチシン、精巣特異的タンパク質ｔｓｐ５０、チメットオリゴペプチダーゼ（ｔｈｉｍｅｔ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、トロンビン、胸腺特異的セリンペプチダーゼ、ＴＩＮＡＧ関連タンパク質、ＴＭＰＲＳＳ１１Ａ、ｔ－プラスミノーゲン活性化因子、ＴＲＡＦ結合タンパク質ドメイン、トランスフェリン受容体２タンパク質、トランスフェリン受容体タンパク質、膜貫通Ｓｅｒプロテアーゼ３、膜貫通Ｓｅｒプロテアーゼ４、トランスサイレチン、ＴＲＨ分解エクト酵素、トリペプチジル－ペプチダーゼＩ、トリペプチジル－ペプチダーゼＩＩ、トリプシン、トリプシン１０、トリプシン１５、トリプシンＣ、トリプシンＸ２、トリプターゼ、トリプターゼアルファ／ベータ１、トリプターゼベータ２、トリプターゼデルタ１、トリプターゼガンマ１、トリプターゼホモログ２／ＥＯＳ、トリプターゼホモログ３、尿細管間質性腎炎抗原、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ユビキチンＣ－ｔｅｒｍ．ヒドロラーゼＢＡＰ１、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ１、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ３、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ４、ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ５、ユビキチン特異的ペプチダーゼ様１、ＵＣＲ１、ＵＣＲ２、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼサブユニット、Ｕｆｍ－１特異的プロテアーゼ１、Ｕｆｍ－１特異的プロテアーゼ２、ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ、ｕＰＡ）、臍静脈プロテイナーゼ、ｕプラスミノーゲン活性化因子、ＵＳＰ１、ＵＳＰ２、ＵＳＰ３、ＵＳＰ４、ＵＳＰ５、ＵＳＰ６、ＵＳＰ７、ＵＳＰ８、ＵＳＰ９Ｘ、ＵＳＰ９Ｙ、ＵＳＰ１０、ＵＳＰ１１、ＵＳＰ１２、ＵＳＰ１３、ＵＳＰ１４、ＵＳＰ１５、ＵＳＰ１６、ＵＳＰ１７、ＵＳＰ１７様、ＵＳＰ１８、ＵＳＰ１９、ＵＳＰ２０、ＵＳＰ２１、ＵＳＰ２２、ＵＳＰ２４、ＵＳＰ２５、ＵＳＰ２６、ＵＳＰ２７、ＵＳＰ２８、ＵＳＰ２９、ＵＳＰ３０、ＵＳＰ３１、ＵＳＰ３４、ＵＳＰ３５、ＵＳＰ３６、ＵＳＰ３７、ＵＳＰ４０、ＵＳＰ４１、ＵＳＰ４２、ＵＳＰ４３、ＵＳＰ４４、ＵＳＰ４５、ＵＳＰ４６、ＵＳＰ４７、ＵＳＰ４８、ＵＳＰ４９、ＵＳＰ５０、ＵＳＰ５１、ＵＳＰ５２、ＵＳＰ５３、ＵＳＰ５４、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＶＣＰ（ｐ９７）／ｐ４７相互作用タンパク質、ＶＤＵ１、卵黄形成カルボキシペプチダーゼ－Ｌ、Ｘ－Ｐｒｏジペプチダーゼ、Ｘ－プロリルアミノペプチダーゼ２、ＹＭＥ１様１、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｂ、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｃ、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ｄ、ジンクフィンガー含有ユビキチンペプチダーゼ１、又はこれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、Ａ２０（腫瘍壊死因子、アルファ誘導性タンパク質３、ＴＮＦアルファ誘導性タンパク質３）を含む。Ａ２０は、ジンクフィンガータンパク質及び脱ユビキチン化酵素である。Ａ２０は、ＮＦ－κＢ活性化並びにＴＮＦ媒介性アポトーシスを阻害し、炎症を制限することが示されている。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む。ＡＣＥ２は、腸、腎臓、精巣、胆嚢及び心臓に位置する細胞の膜に位置する膜細胞に結合した酵素である。ＡＣＥ２は、アンジオスタチンＩＩの量を減少させることによって、関連するアンジオテンシン変換酵素ＡＣＥの活性に対抗する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはカテプシンを含む。カテプシンは、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）、カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、カテプシンＳ（ＣＴＳＳ）、カテプシンＶ（ＣＴＳＶ）及びカテプシンＺ（ＣＴＳＺ）であり得るが、これらに限定されない。カテプシンは、プロテアーゼのサブセットであり、その多くは低ｐＨで活性化される。カテプシンは、とりわけ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、及びアスパルチルプロテアーゼを含む。カテプシンは、癌、アルツハイマー病、関節炎、エボラ、膵炎、緑内障、ＣＯＰＤ、及び他の疾患に関与している。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、カスパーゼを含む。カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、カスパーゼ１３、及びカスパーゼ１４であり得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、カルパインを含む。カルパインは、カルパイン１、カルパイン２、カルパイン３、カルパイン４、カルパイン５、カルパイン６、カルパイン７、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２、カルパイン１３、カルパイン１４、及びカルパイン１５であり得るが、これらに限定されない。カスパーゼは、プログラム細胞死及び細胞恒常性において必須の役割を果たすプロテアーゼ酵素のファミリーである。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、システインプロテアーゼを含む。チオールプロテアーゼとしても知られるシステインプロテアーゼは、タンパク質を分解する加水分解酵素である。これらのプロテアーゼは、触媒性の三つ組または触媒性の対において求核性システインチオールを含む共通の触媒機構を共有する。システインプロテアーゼファミリーは、パパイン（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ）、ブロメライン（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）、カテプシンＫ（苔類）、カルパイン（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ａｓｐａｓｅ－１（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、セパラーゼ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、アデナイン（ヒトアデノウイルス２型）、ピログルタミル－ペプチダーゼＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ソルターゼＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルスペプチダーゼ２（Ｃ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス型ｎｓＰ２ペプチダーゼ（シンドビスウイルス）、ジペプチジル－ペプチダーゼＶＩ（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ＤｅＳＩ－１ペプチダーゼ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウイルス）、アミドホスホリボシルトランスフェラーゼ前駆体（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ガンマ－グルタミルヒドロラーゼ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、ヘッジホッグタンパク質（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ＤｍｐＡアミノペプチダーゼ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ）等を含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、補体Ｃ１ｒセリンプロテアーゼ（補体成分１ｒ）を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、補体Ｃ１ｓセリンプロテアーゼ（補体成分１ｓ）を含む。Ｃ１ｒは、Ｃ１ｑ及びＣ１ｓとともにＣ１複合体を形成する。Ｃ１ｒは、Ｃ１複合体の活性化を担う非常に狭いトリプシン様特異性を有する。Ｃ１活性化は、（１）Ｃ１ｒ分子内自己活性化及び（２）活性化Ｃ１ｒによるＣ１ｓ切断を含む２段階プロセスである。Ｃ１ｒは、そのＣ末端にキモトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含み、Ｃ１ｒ及びＣ１ｓにおいて単一のＡｒｇ－Ｉｌｅ結合を切断する。Ｚｖｉ Ｆｉｓｈｅｌｓｏｎ，ｉｎ ｘＰｈａｒｍ：Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００７。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、キモトリプシン（キモトリプシンＡ及びＢ、ａｌｐｈａ－ｃｈｙｍａｒ ｏｐｈｔｈ、ａｖａｚｙｍｅ、ｃｈｙｍａｒ、ｃｈｙｍｏｔｅｓｔ、ｅｎｚｅｏｎ、ｑｕｉｍａｒ、ｑｕｉｍｏｔｒａｓｅ、ａｌｐｈａ－ｃｈｙｍａｒ、アルファ－キモトリプシンＡ、アルファ－キモトリプシン）を含む。キモトリプシンは、十二指腸で作用する膵液の消化酵素成分であり、そこでタンパク質分解、タンパク質及びポリペプチドの分解を行う。キモトリプシンは、切断性アミド結合に対してＮ末端側のアミノ酸の側鎖が大きな疎水性アミノ酸（チロシン、トリプトファン、及びフェニルアラニン）であるペプチドアミド結合を優先的に切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、キマーゼ（肥満細胞プロテアーゼ１、骨格筋プロテアーゼ、皮膚キモトリプシンプロテイナーゼ、肥満細胞セリンプロテイナーゼ、骨格筋プロテアーゼ）を含む。キマーゼは、肥満細胞、好塩基球顆粒球に見られるセリンプロテアーゼのファミリーである。キマーゼは、広範なペプチド分解活性を示し、炎症反応、高血圧及びアテローム性動脈硬化症に関与する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）を含む。ＤＰＰは、カテプシンＣ（ＤＰＰ１）、ＤＰＰ２、ＤＰＰ３、ＤＰＰ４、ＤＰＰ６、ＤＰＰ７、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９、ＤＰＰ１０を含む。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＤＰＰ４（アデノシンデアミナーゼ複合体化タンパク質２、ＣＤ２６）を含む。ＤＰＰ４は、細胞表面に発現され、免疫調節、シグナル伝達、及びアポトーシスに関連する。ＤＰＰ４は、Ｘ－プロリン又はＸ－アラニンジペプチドをポリペプチドのＮ末端から切断するセリンエキソペプチダーゼである。ＤＰＰ－４は、成長因子、ケモカイン、神経ペプチド及び血管作用性ペプチドを含む広範囲の基質を切断することが知られている。ＤＰＰ４は、グルコース代謝において主要な役割を果たし、ＧＬＰ－１などのインクレチンの分解を担い、いくつかの腫瘍の発生においてサプレッサーとして働くと思われる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＤＰＰ１（カテプシンＣ、ＣＴＳＣ）を含む。ＤＰＰ１は、ペプチダーゼＣ１ファミリーに属するリソソームエキソシステインプロテアーゼである。カテプシンＣは、免疫／炎症細胞における多くのセリンプロテアーゼの活性化のための中心的コーディネータであると思われる。カテプシンＣは、タンパク質及びペプチド基質のＮ末端からのジペプチドの切除を触媒する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）を含む。ＡＤＡＭは、一回膜貫通及び分泌型メタロエンドペプチダーゼのファミリーである。すべてのヒトＡＤＡＭが機能性プロテアーゼドメインを有するわけではない。活性プロテアーゼであるＡＤＡＭは、膜貫通タンパク質の細胞外部分を切断又は除去するので、シェダーゼとして分類される。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭ１２メタロプロテアーゼを含む。ＡＤＡＭ１２は、インスリン成長因子結合タンパク質－３（ＩＧＦＢＰ－３）に結合し、早期ダウン症候群マーカーであると思われ、受精、筋肉発生、及び神経発生を含む細胞－細胞及び細胞－マトリックスの相互作用を含む様々な生物学的プロセスに関与している。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）を含む。ＡＤＡＭＴＳは、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５（＝ＡＤＡＭＴＳ１１）、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８（又はＭＥＴＨ－２）、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、及びＡＤＡＭＴＳ２０を含むマルチドメイン細胞外プロテアーゼ酵素のファミリーである。ＡＤＡＭＴＳプロテアーゼの既知の機能には、プロコラーゲン及びフォン・ヴィレブランド因子のプロセシング、並びにアグリカン、バーシカン、ブレビカン及びニューロカンの切断が含まれ、それらを細胞外マトリックスの重要なリモデリング酵素にする。それらは、結合組織の組織化、凝固、炎症、関節炎、血管新生及び細胞遊走において重要な役割を有することが実証されている。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＡＤＡＭＴＳ１を含む。ＡＤＡＭＴＳ１は、ＡＤＡＭＴＳタンパク質ファミリーのメンバーである。ＡＤＡＭＴＳ１の発現は、様々な炎症過程、癌悪液質の発生、正常な成長、妊孕性、並びに器官の形態及び機能に関連し得る。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、第ＶＩＩ因子活性化プロテアーゼ（ＦＳＡＰ）を含む。ＦＳＡＰは、線維素溶解酵素と高い相同性を有する循環セリンプロテアーゼであり、凝固及び線維素溶解の調節に関連し得る。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、フューリンを含む。フューリンは、スブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属し、カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンの基質には、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータ－セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニット及びフォン・ヴィレブランド因子が含まれる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）を含む。ＨＤＡＣは、ヒストン上のε－Ｎ－アセチルリジンアミノ酸からアセチル基（Ｏ＝Ｃ－ＣＨ３）を除去し、ヒストンがＤＮＡをよりしっかりと包むことを可能にする酵素のクラスである。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ＨＴＲＡ１セリンプロテアーゼを含む。ＨＴＲＡ１は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）の利用可能性を、ＩＧＦ結合タンパク質を切断することによって調節すると提案されている分泌型酵素である。細胞増殖の調節因子であることも示唆されている。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、グランザイムを含む。グランザイムは、細胞傷害性Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞内の細胞質顆粒によって放出されるセリンプロテアーゼである。グランザイムは、標的細胞においてプログラム細胞死を誘導する。グランザイムはまた、細菌を死滅させ、ウイルス複製を阻害する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、カリクレイン（ＫＬＫ）を含む。カリクレインは、セリンプロテアーゼのサブグループである。カリクレインは、血圧、精液液化及び皮膚落屑を含む様々な生理学的機能の調整を担う。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ、マトリックスメタロペプチダーゼ、マトリキシン）を含む。ＭＰＰは、カルシウム依存性亜鉛含有エンドペプチダーゼである。ＭＭＰは、細胞表面受容体の切断、アポトーシスリガンドの放出、ケモカイン／サイトカイン不活性化、細胞増殖及び細胞遊走に関与している。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）を含む。ＭＭＥは、疎水性残基のアミノ側でペプチドを切断し、グルカゴン、エンケファリン、サブスタンスＰ、ニューロテンシン、オキシトシン及びブラジキニンを含むいくつかのペプチドホルモンを不活性化する亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。ＭＭＥは、多種多様な組織で発現され、特に腎臓に豊富である。ＭＭＥはまた、一般的な急性リンパ性白血病抗原である。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ２（ＭＡＳＰ２、マンナン結合レクチン－セリンプロテアーゼ２、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ２）を含む。ＭＡＳＰ２は補体系に関与し、補体成分Ｃ４及びＣ２をＣ４ａ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａ及びＣ２ｂに切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、マンノース結合タンパク質関連セリンプロテアーゼ３（ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ３、ＭＡＳＰ３）を含む。ＭＡＳＰ３は、差次的なスプライシングを介してＭＡＳＰ１遺伝子に由来し、主にフィコリン－３との複合体で高血清濃度で循環し、フィコリン－３媒介補体活性化を調節する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、好中球エラスターゼ（ＥＬＡＮＥ、ＥＬＡ２）を含む。ＥＬＡＮＥは、炎症中に好中球及びマクロファージによって分泌されるセリンプロテイナーゼであり、細菌及び宿主組織を破壊する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、プロテイナーゼ３（ＰＲＴＮ３）を含む。ＰＲＴＮ３は、主に好中球顆粒球で発現されるセリンプロテアーゼ酵素であり、抗菌ペプチドのタンパク質分解生成に寄与する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはプラスミン（別名プラスミノーゲン）を含む。プラスミンは、プラスミノーゲンとして知られる不活性血漿前駆体に由来するタンパク質分解酵素である。それは、血液中に存在し、フィブリン塊を含む多くの血漿タンパク質を分解する。ヒトでは、プラスミンはＰＬＧ遺伝子によってコードされる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ペプシンを含む。ペプシンは、タンパク質をより小さなペプチドに切断するエンドペプチダーゼである。これは、その活性部位に触媒アスパラギン酸を使用するアスパラギン酸プロテアーゼである。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、プレセニリン－１（ＰＳ－１）を含む。ＰＳ－１は、アミロイド前駆体タンパク質からのアミロイドベータの生成に重要な役割を果たすと考えられているガンマセクレターゼ複合体の４つのコアタンパク質の１つであるプレセニリンタンパク質である。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を含む。ＰＣＳＫ９は、ペプチダーゼＳ８ファミリーのメンバーである。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼを含む。セリンプロテアーゼは、セリンが酵素の活性部位で求核性アミノ酸として働くタンパク質中のペプチド結合を切断する。セリンプロテアーゼには多くのサブファミリーが含まれる。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプターゼを含む。トリプターゼは、肥満細胞に含まれる最も豊富な分泌顆粒由来セリンプロテイナーゼであり、肥満細胞活性化のａａマーカーとして使用されている。これは、正常な免疫応答の一部として、並びにアレルギー応答において活性化されると、マスク細胞（ｍａｓｋ ｃｅｌｌ）から放出される。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはトリプシンを含む。トリプシンは、消化系に見られるＰＡファミリースーパーファミリー由来のセリンプロテアーゼである。トリプシンは、主にアミノ酸リジン又はアルギニンのカルボキシル側でペプチド鎖を切断する。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼはウロキナーゼ（ＰＬＡＵ、ｕＰＡ）を含む。ウロキナーゼは、ヒト及び他の動物に存在するセリンプロテアーゼである。それは、ヒトの尿、血液及び多くの組織の細胞外マトリックス中に存在する。これは、細胞外マトリックスの分解、及びおそらく腫瘍細胞の移動及び増殖に関与している。ウロキナーゼは、セリンプロテアーゼドメイン、クリングルドメイン、及びＥＧＦ様ドメインの３つのドメインからなる４１１残基タンパク質である。ウロキナーゼは、チモーゲン形（プロウロキナーゼ又は一本鎖ウロキナーゼ）として合成され、Ｌｙｓ１５８とＩｌｅ１５９との間のタンパク質分解的切断によって活性化される。得られた２つの鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に保持される。
オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、β－グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ及びホスホジエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、求核試薬、還元試薬、求電子／酸性試薬、有機金属／金属触媒、酸化試薬、ヒドロキシルイオン、チオール求核剤、窒素求核剤、亜ジチオン酸ナトリウム及び過ヨウ素酸ナトリウムを含むがこれらに限定されない検出される作用物質が、本明細書に記載される。
本明細書に記載されるように、いくつかの作用物質の活性検出は、切断に依存しない。例えば、いくつかのオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼは、基質リンカー修飾及び検出され得るレポーター分子の放出又は形成をもたらす。実例として、特定の酸化プロセスは、基質リンカーを必要とせずに不活性フルオロフォアを修飾し、それを蛍光性／検出可能にすることができ、又は結合事象（非共有結合プロセスの場合）は、特定のレポーターの磁気的／蛍光的物理化学的特性を変化させ、それらを検出可能にすることができる。
疾患及び状態
本明細書に記載の方法は、対象の疾患又は状態を決定することを含む。いくつかの態様では、疾患又は状態は、肝疾患、癌、代謝性疾患、線維性疾患、臓器移植拒絶、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫、アルツハイマー病又は慢性炎症を含む。いくつかの実施形態では、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、毒素媒介性肝傷害（薬物／薬物適用、アルコール、環境）、ウイルス性肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ、肝臓に感染する他のウイルス）、自己免疫性肝炎、原発性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、劇症肝炎、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、胆管癌、移植肝臓の急性又は慢性拒絶、遺伝性肝疾患（例えば、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、又はアルファ－１アンチトリプシン）、又はそれらの組み合わせであり得る。
いくつかの実施形態では、癌は、腺様嚢胞癌、副腎腫瘍、アミロイドーシス、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調症、ベックウィス・ウィーデマン症候群、胆管癌（ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ ｃａｎｃｅｒ）（胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、ビルト・ホッグ・デュベ症候群、膀胱癌、骨癌（骨の肉腫）、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、カーニー複合体、中枢神経系腫瘍、子宮頸癌、結腸直腸癌、カウデン症候群、頭蓋咽頭腫、デスモイド腫瘍、線維形成性乳児神経節膠腫、上衣腫、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、眼瞼癌、家族性腺腫性ポリポーシス、家族性ＧＩＳＴ、家族性悪性黒色腫、家族性膵臓癌、胆嚢癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛疾患、頭頸部癌、乳癌及び卵巣癌、びまん性胃癌、平滑筋肉腫及び腎細胞癌、混合型ポリポーシス症候群、乳頭状腎癌、若年性ポリポーシス症候群、腎臓癌、涙腺腫瘍、喉頭及び下咽頭癌、白血病、骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、好酸球性白血病、リー・フラウメニ症候群、肝臓癌、肺癌、ホジキン性肺癌、非ホジキン性肺癌、Ｌｙｎｃｈ症候群、肥満細胞症、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、多発性内分泌新生物、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、神経線維腫症、母斑基底細胞癌症候群、口腔及び中咽頭癌、副甲状腺癌、骨肉腫、卵巣癌、ファロピアン管癌、腹膜癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、Ｐｅｕｔｚ－Ｊｅｇｈｅｒｓ症候群、褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）、傍神経節腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、肉腫、非黒色腫皮膚癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺腫及び胸腺癌腫、甲状腺癌、結節性硬化症、子宮癌、膣癌、フォンヒッペル・リンダウ症候群、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウェルナー症候群、ウィルムス腫瘍、又は色素性乾皮症を含む。
いくつかの実施形態では、疾患は、ＮＡＳＨであり得る。ＮＡＳＨとも呼ばれる非アルコール性脂肪性肝炎は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）のより活動性の炎症形態である。ＮＡＦＬＤは、肝臓における脂肪の蓄積によって引き起こされる。この蓄積が炎症及び損傷を引き起こす場合、ＮＡＳＨとして知られており、肝臓の瘢痕化をもたらし得る。ＮＡＳＨに関連する外向きの徴候又は症状はないことが多いが、最も一般的な症状は疲労又は右上腹部の軽度の疼痛である。ＮＡＳＨは、状態が進行するにつれて、出血しやすい、あざができやすい、皮膚のかゆみ、黄疸、腹水貯留、食欲不振、悪心、脚の腫れ、錯乱、眠気、言語の不明瞭化、又はクモ様血管のうちの１又はそれを超える症状を引き起こす肝臓の肝硬変をもたらし得る。
ＮＡＳＨは、過体重又は肥満の患者において最も一般的であり、他の危険因子としては、糖尿病、高コレステロール、高トリグリセリド、不十分な食事、メタボリックシンドローム、多嚢胞性卵巣症候群、睡眠時無呼吸及び甲状腺機能亢進症が挙げられる。
ＮＡＦＬＤは、脂肪肝～脂肪性肝炎～肝硬変に及ぶ、著しいアルコール摂取のない個体における脂肪肝疾患の全範囲を包含する。非アルコール性脂肪肝は、肝細胞の風船様化（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）の形態の肝細胞傷害の証拠も線維症の証拠もない５％超の脂肪肝の存在である。肝硬変及び肝不全への進行のリスクは、最小限であると考えられる。ＮＡＳＨは、炎症を伴う５％超の脂肪肝及び線維症を伴う又は伴わない肝細胞傷害（風船様化）の存在である。これは、肝硬変、肝不全、及びまれに肝臓癌に進行し得る。ＮＡＳＨ肝硬変は、脂肪症又は脂肪性肝炎の現在又は以前の組織学的証拠を伴う肝硬変の存在である。
ＮＡＳは、脂肪症、小葉炎症、及び風船様化スコアの重み付けされていない複合物である。ＮＡＳは、臨床試験においてＮＡＦＬＤを有する患者における肝臓組織学における変化を測定するための有用なツールである。線維症は別々にスコアリングされ、Ｆ１～Ｆ４として分類することができる。具体的には、ステージ１は、ゾーン３（細静脈周囲）、類洞周囲線維症、又は門脈周囲線維症である。ステージ２は、ゾーン３と門脈周囲の線維症の両方である。ステージ３は、小結節を伴う架橋線維症である。ステージ４は、肝硬変である。
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いくつかの実施形態では、疾患は、ＮＡＦＬＤであり得る。非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールをほとんど又は全く摂取していない人々に影響を及ぼす様々な肝臓の状態の総称である。その名称が暗示するように、ＮＡＦＬＤの主な特徴は、肝細胞に蓄えられた脂肪が多すぎることである。ＮＡＦＬＤに関連する外向きの徴候又は症状はないことが多いが、最も一般的な症状は、疲労又は右上腹部の軽度の疼痛である。
いくつかの実施形態では、疾患は、劇症肝炎であり得る。劇症肝炎、又は劇症肝不全は、肝性昏睡及び肝臓の合成能力の低下を引き起こす重度の肝機能障害の臨床症候群として定義される。その後、急速に重度のしばしば生命を脅かす肝不全を発症する。これは、数時間、数日、又は時には数週間以内に起こり得る。重度の肝不全の症状には、錯乱、極端な過敏性、意識変化、血液凝固欠陥、並びに腹腔内の体液の蓄積及び多臓器系不全が含まれる。
いくつかの実施形態では、疾患は肝細胞癌（ＨＣＣ）であり得る。ＨＣＣは、原発性肝癌の最も一般的なタイプである。ＨＣＣは、進行した線維症又は肝硬変に至る慢性肝疾患を有する人々において最も頻繁に起こる。ＨＣＣに関連する最も一般的な肝疾患は、Ｂ型又はＣ型ウイルス性肝炎、アルコール関連肝疾患及びＮＡＳＨである。
いくつかの実施形態では、疾患は、原発性胆管炎（ＰＢＣ）であり得る。以前は原発性胆汁性肝硬変と呼ばれていた原発性胆管炎は、肝臓の胆管が徐々に破壊される慢性疾患である。胆汁は、肝臓で作られる流体である。肝臓の慢性炎症は、胆管損傷、肝臓組織の不可逆的な瘢痕化（肝硬変）、最終的には肝不全をもたらし得る。ＰＢＣは、自己免疫疾患と考えられており、これは、身体の免疫系が健康な細胞及び組織を誤って攻撃していることを意味する。研究者らは、遺伝的要因と環境的要因の組み合わせが疾患の引き金になると考えている。それは通常ゆっくりと発達する。この時点では、原発性胆管炎の治療法はないが、特に処置が早期に開始された場合、薬物療法は肝損傷を遅らせることができる。
いくつかの実施形態では、肝疾患は、毒素媒介性肝傷害（例えば、薬物／薬物適用、アルコール、環境から）であり得る。毒素媒介性肝傷害は、アルコール、化学物質、薬物／薬物適用、環境因子又は栄養補助食品などの特定の物質に対する反応における肝臓の炎症である。肝臓は通常、ほとんどの薬物及び化学物質を血流から除去及び分解し、肝臓に損傷を与え得る副産物を生成する。肝臓は再生能力が高いが、毒性物質への継続的な曝露は、重篤な、時には不可逆的な害を引き起こす可能性がある。
いくつかの実施形態では、肝疾患はウイルス性肝炎（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ、肝臓に感染する他のウイルス）であり得る。ウイルス性肝炎は、ウイルス感染による肝臓の炎症である。それは、比較的急速に発症する最近の感染として急性形態で、又は慢性形態で存在し得る。ウイルス性肝炎の最も一般的な原因は、５つの無関係な肝指向性ウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型及びＥ型肝炎である。サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス及び黄熱病を含む他のウイルスも肝臓炎症を引き起こす可能性がある。単純ヘルペスウイルスによって引き起こされるウイルス性肝炎の記録された症例のスコアもある。ウイルス性肝炎は、汚染された食物又は水（Ａ、Ｅ）を介して、又は血液及び体液（Ｂ、Ｃ）を介して伝染する。Ａ型肝炎及びＢ型肝炎は、ワクチン接種によって予防することができる。Ｃ型肝炎に対する有効な処置が利用可能であるが、費用がかかる。
いくつかの実施形態では、肝疾患は、自己免疫性肝炎であり得る。自己免疫性肝炎は、免疫系が肝細胞を攻撃すると起こる肝臓の炎症である。自己免疫性肝炎の正確な原因は不明であるが、疾患を誘発する際に遺伝的及び環境的要因が経時的に相互作用するようである。未処置の自己免疫性肝炎は、肝臓の瘢痕化（肝硬変）をもたらし、最終的には肝不全をもたらし得る。早期に診断され処置される場合、自己免疫性肝炎は、しばしば免疫系を抑制する薬物で制御することができる。肝移植は、自己免疫性肝炎が薬物処置に反応しない場合、又は進行した肝疾患の症例において選択肢となり得る。自己免疫性肝炎には２つの主な形態がある。（１）１型自己免疫性肝炎。Ｉ型自己免疫性肝炎は、最も一般的なタイプであり、任意の年齢で起こり得る。１型自己免疫性肝炎を有する人々の約半数は、セリアック病、関節リウマチ又は潰瘍性大腸炎などの他の自己免疫障害を有する。（２）２型自己免疫性肝炎。成人は、２型自己免疫性肝炎を発症する可能性があるが、小児及び若年者に最も一般的である。２型自己免疫性肝炎には、他の自己免疫疾患が随伴し得る。
いくつかの実施形態では、肝疾患は、原発性硬化性胆管炎であり得る。原発性硬化性胆管炎は、胆管の疾患である。原発性硬化性胆管炎では、炎症により胆管内に瘢痕が生じる。これらの瘢痕は、管を硬く狭くし、徐々に深刻な肝損傷を引き起こす。原発性硬化性胆管炎を有する人々の大部分はまた、潰瘍性大腸炎又はクローン病などの炎症性腸疾患を有する。原発性硬化性胆管炎のほとんどの場合、疾患はゆっくりと進行する。それは最終的に、肝不全、反復感染症、及び胆管又は肝臓の腫瘍をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、肝疾患は、肝臓の肝硬変であり得る。肝硬変は、肝炎及び慢性アルコール中毒症などの多くの形態の肝疾患及び状態によって引き起こされる肝臓の瘢痕化（線維症）の後期段階である。肝臓の自己修復のプロセスで、瘢痕組織が形成される。肝硬変が進行するにつれて、ますます多くの瘢痕組織が形成され、肝臓が機能しにくくなる（非代償性肝硬変）。
いくつかの実施形態では、肝疾患は胆管癌であり得る。胆管癌（胆管癌）は、胆管に形成される癌の一種である。胆管癌の危険因子としては、原発性硬化性胆管炎（胆管の炎症性疾患）、潰瘍性大腸炎、肝硬変、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、特定の肝吸虫による感染、及びいくつかの先天性肝奇形が挙げられる。胆管癌は、胆管に発生する癌の位置に基づいて分類することができる：肝内胆管癌、肝門部胆管癌、遠位胆管癌。胆管癌は、進行したときに診断されることが多く、処置の成功を困難にする。
いくつかの実施形態では、肝疾患は、遺伝性肝疾患（例えば、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、又はアルファ－１アンチトリプシンなど）であり得る。遺伝性肝疾患は、重度の肝疾患及び他の健康問題を引き起こし得る遺伝的障害である。ウィルソン病は、銅が肝臓、脳及び他の重要臓器に蓄積するまれな遺伝性障害である。ヘモクロマトーシスは、鉄の沈着物が肝臓及び他の器官に集まる疾患である。ヘモクロマトーシスの主な形態は、米国で最も一般的な遺伝性疾患の１つである。アルファ－１アンチトリプシンタンパク質は、主に肝細胞によって肝臓で合成され、血流に分泌され、炎症中に主に肺で放出される好中球エラスターゼの阻害剤として作用する。アルファ－１アンチトリプシン欠損症は、アルファ１アンチトリプシンタンパク質が欠損しているか、又は血液中に正常レベルよりも低いレベルで存在する場合に引き起こされる。
いくつかの実施形態では、疾患は、臓器移植拒絶であり得る。移植拒絶は、移植された組織が、移植された組織を破壊するレシピエントの免疫系によって拒絶されるときに起こる。ドナーとレシピエントとの間の分子類似性を決定することによって、及び移植後に免疫抑制薬物を使用することによって、移植拒絶を軽減することができる。
いくつかの実施形態では、疾患は、感染性疾患であってよく、感染性疾患は、細菌、ウイルス、真菌又は寄生生物などの生物によって引き起こされる障害である。細菌は、連鎖球菌性上気道感染症、尿路感染症及び結核などの病気の原因となる単細胞生物である。ウイルスは、風邪からＡＩＤＳに及ぶ多数の疾患を引き起こす。白癬及び足白癬などの多くの皮膚疾患は、真菌によって引き起こされる。他の種類の真菌は、肺又は神経系に感染し得る。マラリアは、蚊の咬傷によって伝染する小さな寄生生物によって引き起こされる。他の寄生生物は、動物の糞便からヒトに伝染し得る。いくつかの実施形態では、感染性疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９である。
いくつかの実施形態では、疾患は、アレルギー性疾患であり得る。アレルギー性疾患は、アレルゲン誘発性の好ましくない免疫応答が様々な器官において様々な症状を惹起することによって引き起こされ、これは現代医学によって完全に制御することができないことが多い。アレルギー性疾患の免疫学的基礎は、好酸球、先天性リンパ系細胞、樹状細胞サブセット、上皮細胞及び組織の炎症／傷害、上皮バリア、喘息、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）及びアレルギー性鼻炎（ＡＲ）における組織リモデリング及び慢性化に関連する、メモリーＴ及びＢ細胞応答の感作及び発達、並びにＩｇＥ産生及びエフェクター機能の２つの段階で観察される。異なる疾患表現型及びエンドタイプ（ｅｎｄｏｔｙｐｅ）は、異なる優勢な分子機構、関連するバイオマーカー及び生物学的治療に対する応答によって明らかになり得る。複数の機構的因子がアレルギー性炎症の病因に複雑に関与している。いくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患／自己免疫であり得る。自己免疫疾患は、免疫系が誤って自分の身体を攻撃する状態である。通常、免疫系は、外来細胞と自身の細胞との間の違いを見分けることができる。自己免疫疾患では、免疫系は、関節又は皮膚などの身体の一部を異物と間違える。それは、健康な細胞を攻撃する自己抗体と呼ばれるタンパク質を放出する。いくつかの自己免疫疾患は、１つの器官のみを標的とする。１型糖尿病は、膵臓を損傷する。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの他の疾患は、多くの異なる器官系に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症（ＭＳ）又は乾癬性関節炎（ＰｓＡ）であり得る。
いくつかの実施形態では、疾患は、慢性炎症であり得る。慢性炎症は、数ヶ月から数年の長期間持続する緩慢な長期炎症とも呼ばれる。一般に、慢性炎症の程度及び影響は、傷害の原因及び損傷を修復し克服する身体の能力によって異なる。血管の拡張（血管拡張）、血流の増加、毛細管透過性及び毛細管壁を通る感染組織への好中球の移動（漏出）を含む、急性炎症の特徴のほとんどは、炎症が慢性になるにつれて続く。しかしながら、白血球の組成はすぐに変化し、マクロファージ及びリンパ球は短命の好中球を置換し始める。したがって、慢性炎症の特徴は、組織部位におけるマクロファージ、リンパ球、及び形質細胞などの主要な炎症性細胞の浸潤であり、炎症性サイトカイン、成長因子、酵素を産生し、したがって線維症及び肉芽腫形成などを含む組織損傷及び二次修復の進行に寄与する。
いくつかの実施形態では、疾患は、線維性疾患であり得る。線維性疾患は、様々な組織の過剰増殖、硬化及び／又は瘢痕化によって定義され、コラーゲンを含む細胞外マトリックス成分の過剰な沈着に起因する。線維症は、持続性感染、自己免疫反応、アレルギー反応、化学的傷害、放射線及び組織傷害を含む様々な刺激によって誘発される慢性炎症反応の最終結果である。線維性障害には、全身性線維性疾患、例えば全身性硬化症（ＳＳｃ）、強皮症性移植片対宿主病、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、腎性全身性線維症、並びに放射線誘発性線維症並びに心臓、肺、肝臓及び腎臓の線維症を含む臓器特異的障害が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、疾患は、代謝性疾患であり得る。代謝障害／疾患は、体内の異常な化学反応が代謝を破壊する場合に起こる。これが起こると、個体が健康を保つのに必要とするいくつかの物質が多すぎるか、又は他の物質が少なすぎる可能性がある。様々な障害群が存在する。いくつかは、アミノ酸、炭水化物、又は脂質の分解に影響を及ぼす。別の群、ミトコンドリア性疾患は、エネルギーを産生する細胞の部分に影響を及ぼす。肝臓又は膵臓などのいくつかの器官が罹患するか、又は正常に機能しないと、代謝障害を発症する可能性がある。糖尿病は一例である。
いくつかの実施形態では、疾患はアルツハイマー型であり得る。アルツハイマー型は、記憶、思考及び行動に影響を及ぼす認知症の一種である。症状は、最終的に、毎日の作業を妨げるほど重度になる。アルツハイマー型の変化は、典型的には、学習に影響を及ぼす脳の部分で始まる。アルツハイマー型が、脳を通って進行するにつれて、それは、見当識障害、気分及び行動の変化、イベント、時間、場所に関する混乱を深めること；家族、友人、及び専門の介護者に関する根拠のない疑い；より深刻な記憶喪失及び行動変化；発話、嚥下及び歩行の困難を含むますます重度の症状をもたらす。
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。示されている構成要素の割合の変化及び要素の代替形態は、当業者には明らかであり、本明細書に提示されている実施形態の範囲内であることが理解されよう。
実施例１ マウスにおけるプローブを用いたＮＡＳＨの診断
この実験では、本出願のプローブは、対象のＮＡＳＨを診断するために流体試料中の非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に関連するプロテアーゼの活性レベルを正確に検出することが示された。
ＮＡＳＨに関連するプロテアーゼ活性レベルを、１つは健康であり、１つはＮＡＳＨである２つのマウス集団においてインビボで評価した。インビボで使用されるプローブを図１０に示す。
標準的な固形飼料（ＣＤ）を与えた健康なマウス、及びコリン欠乏Ｌ－アミノ酸規定高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を与えたＮＡＳＨマウスにおけるプロテアーゼによるこれらのプローブのタンパク質分解的切断から得られた質量バーコード化レポーター尿中濃度レベルを図１１に示す。ＮＡＳＨ関連プローブは、増大したＮＡＳＨ関連プロテアーゼ活性によって切断され、健康なマウスと比較してＮＡＳＨマウスからの尿におけるより大きい質量バーコード化レポーター蓄積に関連した。
図１２に示すように、それぞれの食餌で１２週間後に健康（ＣＤ）なマウス又はＮＡＳＨ（ＣＤＡＨＦＤ）を有するマウスからＫ２ＥＤＴＡチューブに血液試料を採取した。すべての動物を動物ケアガイドラインに従って使用した。４℃、３，５００ＲＰＭで２０分間の遠心分離によって、これらの血液試料から血漿を得た。血漿を、実験目的に必要とされるまで－８０℃で保存した。
図１３に示すように、解凍した血漿試料をプールし、様々なペプチド及び血清濃度で蛍光消光剤及びプロテアーゼ切断可能蛍光レポーターを有するプローブと接触させた。試料を、９６ウェルプレート中でプロテアーゼ基質及び消光剤／レポーターと混合した。４６５，５３５の励起／発光設定を使用して、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１で９６ウェルプレートを読み取った。
図１４に示されるように、本出願のプローブは、２つのマウス集団において１分間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表されるようなＮＡＳＨ関連プロテアーゼの活性を測定することができた。カテプシン活性を測定するプローブは、健康マウスと比較して、ＮＡＳＨを有するマウスではプロテアーゼ切断動態が３倍高かった。対照的に、カスパーゼ活性を感知するプローブは、健康マウスとＮＡＳＨマウスとの間で検出可能な活性の変化を示さなかった。図１５Ａ及び図１５Ｂは、ＮＡＳＨ関連プロテアーゼ活性の検出における１つのプローブ（プローブ＃１０２）についての結果のサブセットを示す。ここで、蛍光レポーター及び消光剤の使用は、図５で論じたものと同様に、健康マウス（図１５Ａ）及びＮＡＳＨマウス（図１５Ｂ）の血漿中のＮＡＳＨ関連プロテアーゼの活性レベルを正確に測定することが示された。
したがって、本出願のプローブは、体液試料を使用して、生体外で、対象の生物学的状態又は病状に関連するプロテアーゼの活性レベルを正確に検出することができる。
実施例２：マウスの血漿中のＮＡＳＨプロテアーゼ活性の検出
図１４に示すように、本願のプローブは、実施例１及び図１３で説明したように、２つのマウス集団から採取した血漿試料中のＮＡＳＨ関連プロテアーゼのプロテアーゼ活性を多重形式で正確に検出することができる。単一の血漿試料を各所定のプロテアーゼのプローブと接触させて、試料中のプロテアーゼ活性の多重評価を提供した。
図１６では、各プローブセットについて、健康マウスにおけるプロテアーゼ活性を左側に示し、ＮＡＳＨマウスにおけるプロテアーゼ活性を右側に示している。示されるように、本出願のプローブは、ＮＡＳＨ関連プロテアーゼ活性の増加を測定することができた。
図１７及び図１８に示すように、ＲＦＵ／分として測定されたプロテアーゼ活性は、同じ動物群内のプール血漿試料において、その群の各動物からのプロテアーゼ活性の平均よりも同様であった。さらに、広範なプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＩＮＨ）を添加すると、健康動物群とＮＡＳＨ動物群の両方でプロテアーゼ活性が完全に無効になり、経時的に測定される蛍光シグナルがタンパク質分解活性に依存するという証拠が得られた。
図１９Ａ及び図１９Ｂは、マウス血漿の試料を研究する場合、存在量ではなく活性が健康な試料とＮＡＳＨ試料との間を区別するのにより重要であることを示す。ＮＡＳＨ関連プロテアーゼ（ここではカテプシンＬ又はＣＴＳＬ）の存在量は、健康なＣＤマウスとＮＡＳＨ ＣＤＡＨＦＤマウスとの間で同等であり得るが（図１９Ａ）、これらのプロテアーゼの活性レベルは同等ではない（図１９Ｂ）。この実験では、プロテアーゼ存在量を、ＬＳ Ｂｉｏ製のＥＬＩＳＡキットを使用して測定し、活性を、実施例１に記載されるプローブ＃１０２（ＣＴＳＬ感知プローブ）蛍光アッセイを使用して測定した。
したがって、本出願のプローブは、多重形式の血漿などの体液試料を使用して、生体外で、対象の生物学的状態又は病状に関連するプロテアーゼの活性レベルを正確に検出することができる。
実施例３：液体生検はＮＡＳＨの進行対退縮を決定する
この実験では、本出願のプローブは、健康なマウス、ＮＡＳＨマウス、及び疾患退縮を生じているＮＡＳＨマウスを区別することができた。
図２０は、２０週間のＣＤＡＨＦＤ ＮＡＳＨマウス（ＮＡＳＨ進行）、２０週間の健康ＣＤマウス、及び４週間の固形飼料に切り替える前に１６週間のＣＤＡＨＦＤを与えたマウス（ＮＡＳＨ退縮）の３群のマウスを含む実験設計を示す。２０週ですべての動物から血漿試料を採取した。
図２１Ａ～図２１Ｆに見られるように、実施例１に記載されているように、いくつかのプローブを使用して解凍した血漿と接触させ、これにより、健康試料、退縮試料、及びＮＡＳＨ試料の明確な区別が得られた。ＮＡＳＨにおいて最も区別を示すプローブを、カテプシン及び／又はＭＭＰプロテアーゼ活性に関連付けた。
この実験は、健康な試料と疾患試料とを区別することができるだけでなく、健康な試料、疾患進行試料、及び疾患退縮試料を区別することもできることを示した。
実施例４：マウスにおける劇症肝炎に対する液体生検適用
この実験では、別のマウス肝臓疾患モデル（劇症肝炎のモデル）を研究して、本出願のより広い使用を決定した。この実験は、ＦＲＥＴ基質ライブラリーにおいて血漿及び既存のセンサを使用する肝炎モデルにおける適用のための生体外アッセイ技術を開発するのに役立った。
モノクローナル抗体抗ＣＤ９５（Ｊｏ２、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、４ｕｇ／動物）の腹腔内注射後に劇症肝炎を誘発し、Ｊｏ２注射３時間後にマウス血漿試料を採取した。図２２に示されるように、実施例１において先に記載される方法を使用してプローブをマウス血漿試料と接触させたとき、プローブは、生体外において健康な試料とＪｏ２試料とを区別することができた。図２３は、生体外でのアプローチとの直接比較のために注射可能なプローブ製剤を受けた同じマウスを用いて、インビボでの同じ結果を示す。
Ｊｏ２肝炎モデルは、マウスにおけるＮＡＳＨ肝臓モデルデータと比較して差次的なプローブ切断を実証する。主にカスパーゼ中心プローブ（プローブ＃６４７、プローブ＃８、プローブ＃１２）は、Ｊｏ２モデルに特異的で感受性のコントラストを示す。質量分析データとの比較はまた、生体外でのアプローチとの高い一致を整列及び確認し、これは生物学的に関連するシグナルの存在を確認するのに再び保証する。
図２４は、肝疾患の２つの前臨床モデルについて、本出願が、各疾患のプロテアーゼ活性の根底にある異なる生物学的機構のために各疾患を明確に同定できることを実証している（すなわち、ＮＡＳＨにおけるカテプシン活性及び肝炎におけるカスパーゼ活性）。
実施例５：ヒト血漿中のＮＡＳＨの検出
この実験は、ヒトにおけるＮＡＳＨの検出に関する。
図２５に示すように、健康／痩せ、健康／肥満、又はＮＡＳＨと診断されたヒト対象から血液試料を採取した。これらの血液試料から、実施例１と同様の方法で血漿を得た。血漿を－８０℃で２年以下、各試料について凍結／解凍サイクル数≦１で保存した。
図２６に示すように、実施例１に記載の方法を用いてプローブをヒト血漿試料と接触させた場合、健康と比較してＮＡＳＨ試料で経時的に蛍光レベルの上昇が観察され、健康試料とＮＡＳＨ試料のプロテアーゼ活性レベルを区別することができた。
図２７は、独立した試料コホートを試験した場合の健康な試料とＮＡＳＨ試料とを区別する適用の能力における高レベルの再現性を示す。
図２８は、本出願が健康なヒト試料とＮＡＳＨヒト試料とを区別することができるだけでなく、驚くべきことに、初期病期（Ｆ０～Ｆ２）と後期病期（Ｆ３＋）のＮＡＳＨとを区別することもできることをさらに実証している。Ｆ０～Ｆ４データセット全体は１００個のＮＡＳＨ試料を含み、実験は実施例１の方法を用いて行った。
図２９に示されるように、本出願の複数のプローブは、ヒトにおいて健康な試料とＮＡＳＨ試料とを区別することができ、この多重度は、試料を試験した場合により低い偽陽性率をもたらす。
この実験は、この適用が、ヒト対象において非侵襲的に健康とＮＡＳＨ（及びＮＡＳＨの異なる線維症病期）とを区別することに非常に適していることを実証する。
実施例６：液体生検の機能の機構
この実験では、特定のプローブによって切断された特定のプロテアーゼを、それが検出する疾患差異に関する適用の特異性を示すために決定する。この実験はまた、プロテアーゼ活性（存在量ではない）が、試料中の疾患マーカーの適用の決定における駆動因子であることを示す。
この実験のために、すべての血漿試料を個々に調製し、ＰＢＳで１／１０ｅに希釈し、阻害剤を試料に直接添加した。最終濃度に対して１５倍濃度で阻害剤を調製した。プレート上の最終濃度が６ｕＭになるように、基質をＤＩ水で１８ｕＭに希釈した。すべての試料は、プレート上での最後の希釈が所望の最終濃度に影響を及ぼさないように調製した。１０ｕｌの各個々の試料をそれらの対応するウェルにピペットで入れ、次いで、プレートを遠心分離機で１５００ＲＰＭで３０秒間スピンダウンして、各ウェルの底部を試料でコーティングした。５ｕｌの１８ｕＭ基質溶液を、３８４ウェルプレート上で使用している各ウェルにピペットで入れ、次いで、プレートを遠心分離機で１５００ｒｐｍで３０秒間スピンダウンした。プレートを直ちに３７℃のプレートリーダーに入れ、３０分間の蛍光動態読み取りを４８５／５３５の拡大ゲインで行った。
プローブ＃１０２のタンパク質分解性切断パターンを評価するために、セリン、システイン、トレオニン、ＭＭＰ及びアスパラギン酸プロテアーゼファミリーメンバーに対する広範な阻害剤のプール（広範な阻害剤）を使用して試料を試験して、一般的なプロテアーゼ活性、セリンプロテアーゼに対するＡＥＢＳＦ、システインプロテアーゼに対するＥ６４、カテプシンＬ、Ｓ、Ｋ及びＢの広範なカテプシン阻害に対するＣＴＳｉ、又はカテプシンＬに対する特異的阻害剤（ＳＩＤ）、カテプシンＢに対する特異的阻害剤（ＣＡ０７４）またはカテプシンＫに対する特異的阻害剤（Ｌ００６２５）を評価した。
Ｅ６４（広範なシステイン）、ＳＩＤ（ＣＴＳＬ）及びＣＴＳｉ（ＣＴＳＬ、Ｓ、Ｋ、Ｂ）阻害剤はすべて、ＮＡＳＨシグナルを有意に減少させ、健康についてのシグナルの減少はより少なく、シグナルの減少の性質が疾患特異的であることを示した。広範な阻害剤又はＥ６４を使用した場合、本発明者らは、ＮＡＳＨと健康な試料との間のＲＦＵシグナルコントラストの６倍を超える減少を観察し、システインプロテアーゼが疾患コントラストの原因であることを示した。広範なカテプシン阻害剤ＣＴＳｉは、ＮＡＳＨを４７％減少させたが、健康は１８％しか減少させず、カテプシンが疾患コントラストの原因であることを実証した。ＣＴＳＬ（ＳＩＤ）に対する特異的カテプシン阻害剤は、ＮＡＳＨを６０％減少させたが、健康を３３％減少させただけであった。ＮＡＳＨ及び健康の両方が、セリン阻害剤ＡＥＢＳＦの添加とともに減少した。ＮＡＳＨは６５％阻害されたが、健康は６０％阻害された。ＮＡＳＨ及び健康の両方についてのＲＦＵの同様の減少は、プローブ＃１０２によって感知されているＡＥＢＳＦシグナルが疾患特異的シグナル及びバックグラウンドの性質に有意に寄与しないことを示している。
カテプシンＫ及びＢに対する特異的阻害剤、Ｌ００６２３５及びＣＡ０７４はそれぞれ、ＮＡＳＨ又は健康な試料に対するシグナルを有意に減少させなかった。
図３０Ａは、プローブ＃１０２が健康試料とＮＡＳＨ試料との間の差を決定するためにプロテアーゼと特異的に接触することを示すために、広範なプロテアーゼ阻害剤と組み合わせたプローブ＃１０２を示す。図３０Ｂは、プローブ＃１０２がシステインプロテアーゼと接触することを示し、図３０Ｃは、これをカテプシンファミリープロテアーゼにさらに限定する。図３０Ｄ～Ｆは、プローブ＃１０２がＮＡＳＨ関連プロテアーゼであるカテプシンＬ（ＣＴＳＬ）の活性に特異的に応答することを示すために個々のカセプシンを試験する。したがって、カテプシンＬ活性は、本出願によって認識されるように、試料中のプロテアーゼ活性の疾患対健康の差の原因である。
図３１Ａ～図３１Ｂに示すように、本出願の健康な組織とＮＡＳＨ組織との識別は、トリプシン又はトロンビン（両方とも血液中に常に存在する乱雑なプロテアーゼである）のいずれによっても引き起こされない。
図３２Ａ～Ｂに示すように、プロテアーゼ活性は、プロテアーゼの量ではなく、疾患の真の尺度である。これは、実施例２で以前に見られたように、及び図１９で以前に示したように、活性が存在量よりも重要であるというマウスにおける以前の決定を裏付けている。
より具体的には、図３３は、ＣＴＳＬが健康なヒト試料及びＮＡＳＨヒト試料の両方で等しく豊富であるが、ＣＴＳＬ活性がこれらの２つの試料集団の間で異なることを示す。
本出願は、特定の疾患関連プロテアーゼの存在量ではなく活性レベルを測定することによって機能することが示され、試料中の特定の疾患の正確な決定を与える。
実施例７：ＣＯＶＩＤ診断に向けた液体生検の適用
この実施例では、本出願はＣＯＶＩＤの診断を対象としている。
ＣＯＶＩＤを用いた最初の実験では、Ｋ２ＥＤＴＡ及びリチウムヘパリン採取血漿を使用した。試料を－８０℃で貯蔵から氷上で解凍し、次いでＰＢＳで１０％に希釈した。試料を調製した後、体積を半分に分割し、広範なプロテアーゼ阻害剤を１本のチューブに添加した－最終的に１００倍希釈、チューブ内で６７倍。各試料１０ｕＬを９６ウェルプレートのウェルに入れ、プレートを氷上で保存した。ＤＭＦ中で調製した１ｍＭストックを使用して、基質をｄｄＨ２Ｏ中１８ｕＭで調製した。５ｕＬの基質を各ウェルに添加した。９６ウェルプレートを１０００ＲＰＭで３０秒未満スピンダウンした。プレートをＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダー、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５で、動態読み取り、拡張ダイナミックレンジを１時間使用して４分３０秒のサイクリング時間で読み取った。
図３４Ａ～Ｂに示すように、複数のセンサは、ＣＯＶＩＤ試料と健康な試料との間の差次的切断を示した。プローブ＃４６２、プローブ＃１８及びプローブ＃８４は両方のセットにおいてコントラストを示し、プローブ＃４０９、すなわち、ＳＡＲＳ ＣｏＶ２コロナウイルス基質は、Ｋ２ＥＤＴＡ試料において中程度のコントラストを示した。
図３５に示すように、ＣＯＶＩＤ陽性スワブ及びＣＯＶＩＤ陰性スワブ（臨床現場でのＰＣＲによって決定される）をＬＢｘセンサと組み合わせて、スワブを使用してプロテアーゼ活性を生体外で感知できるかどうかを決定した。
試料を氷上で解凍し、次いで、ＤＰＢＳ（中性ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ）で１０％に希釈した。必要に応じて、条件ごとに等体積の各試料を用いて条件に従って試料をプールし、次いで、続いてＤＰＢＳで希釈した。試料を調製した後、体積を半分に分割し、広範なプロテアーゼ阻害剤を１本のチューブに添加した－最終的に１００倍希釈、チューブ内で６７倍。各試料１０ｕＬを９６ウェルプレートの対応するウェルに添加し、プレートを氷上で保存した。ＤＭＦ中で調製した１ｍＭストックを使用して、基質をｄｄＨ２Ｏ中１８ｕＭで調製した。５ｕＬの基質を９６ウェルプレートの各試料に添加し、プレートを１０００ｘ ｒｐｍで３０秒未満スピンダウンした。プレートをＢｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１プレートリーダー、Ｅｘ／Ｅｍ＝４８５／５３５で、動態読み取り、拡張ダイナミックレンジを２時間使用して４分３０秒のサイクリング時間で読み取った。
図３６Ａ～Ｂは、ウイルス輸送媒体（ＶＴＭ）で処理したスワブ及び唾液試料の両方を示し、この媒体は、本出願のプローブとの接触後に血清中にいくつかのプロテアーゼを含有する。しかし、図３７に示すように、ＶＴＭの代わりに食塩水媒体を使用して実験１の方法を使用してスワブを試験した場合、ＣＯＶＩＤ－試料とＣＯＶＩＤ＋試料との間に明確な差が見られた（臨床ＰＣＲ試験によって決定された）。食塩水媒体スワブは、添加剤を含まない食塩水媒体に採取されたので、ＶＴＭスワブと比較して優れたプロテアーゼ活性シグナルを与える。これは、本出願が生体液にわたって広範な適用性を有することを示している。
特異的プローブ、プローブ＃６４７は、図３８Ａ～Ｃに示すように、ＣＯＶＩＤ＋試料とＣＯＶＩＤ－試料との間の重要な差別化要因（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）であることが示された。
図３９Ａ～Ｂに示すように、プローブ＃６４７シグナルは、プロテアーゼグランザイムＢの活性を測定して、健康な試料とＣＯＶＩＤ試料とを区別する。グランザイムＢは、他の自己免疫疾患及びウイルス感染症に関連するプロテアーゼであり、本出願が、幅広い疾患生物学に適用できることを示す。
ビオチン及びプローブ＃６４７を、ストックのプローブ＃６４７粉末を５０／５０ ＤＭＦ／ＰＢＳに２ｍＭで溶解することによってコンジュゲーションした。ビオチン－マレイミドを粉末から１００ｍＭで再構成し、ＰＢＳ中で以下の濃度－２ｍＭ、３ｍＭ及び６ｍＭに希釈した。以下のモル当量を用いて３つの反応混合物を作成した：１）１：１－１０ｕＬ：１０ｕＬの２ｍＭビオチン＋２ｍＭプローブ＃６４７、２）１：１．５－１０ｕＬ：１０ｕＬの３ｍＭビオチン＋２ｍＭプローブ＃６４７、及び３）１：３－１０ｕＬ：１０ｕＬの６ｍＭビオチン＋２ｍＭプローブ＃６４７。混合したら、これらを室温で２時間、Ｈｕｌａ試料ミキサー上で反転させた。コンジュゲーション反応が完了したら、上記３つの反応からの６ｕＭプローブ＃６４７－ビオチンコンジュゲートを有する１００ｎＭ組換えグランザイムＢを使用して、組換えプロテアーゼ及び試料を試験した。次いで、これらを複数の時点－０分、５分、３０分、１時間及び必要に応じたＯ／Ｎにわたり、インキュベートした。次いで、それらを１：２０に希釈し、紙ストリップを混合物に浸漬し、紙ストリップを視覚的に読み取った。組換えプロテアーゼを使用して活性が確認されたら、強ＣＯＶＩＤ＋食塩水スワブ試料及びＣＯＶＩＤ－食塩水スワブ試料（臨床ＰＣＲ試験によって決定）で結果を確認した。１０ｕＬの希釈食塩水スワブ試料を５ｕＬのプローブ＃６４７－ビオチンコンジュゲートと合わせ、複数の時点－０時間及び２時間インキュベートした。反応後、試料を１：２０に希釈し、紙ストリップで視覚的に読み取った。
本出願のプローブを用いてグランザイムＢ活性をモニタリングするための紙ストリップ試験の使用を図４０に示す。ビオチンでタグ付けされた５ＦＡＭセンサのプロテアーゼ切断の検出のためのこのポイントオブケア試験は、リアルタイムでの疾患モニタリング及び応答に意味あいを有する。
実施例８：膵管腺癌に対する液体生検適用
本実施例では、本出願は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の診断を対象とする。
図４１Ａ～Ｂに示すように、ヒト血漿を実験１の方法を使用して本出願のプローブと接触させると、健康なヒト血漿試料とＰＤＡＣヒト血漿試料のプロテアーゼ活性を区別することができる。
さらに、図４２に示すように、プローブは、健康、ＰＤＡＣ、及び膵炎の試料を区別することができる。
この実験は、異なるプロテアーゼ生物学を有する異なる種類の疾患に関して本出願に広い適用可能性があることを示し続けている。
実施例９：蛍光レポーターを有するプローブはマウスにおけるＮＡＳＨ関連プロテアーゼ活性レベルを正確に測定するであろう
この予測実験では、図８で考察したプローブのように、沈殿性蛍光レポーター及びエンドプロテアーゼによって切断可能なプロテアーゼ基質を含む本開示のプローブは、健康なマウス及びＮＡＳＨマウスにおけるＮＡＳＨ関連プロテアーゼの活性レベルを正確に測定することができるであろう。
プローブは、プロテアーゼ基質がプロテアーゼ（例えば、エンドプロテアーゼカスパーゼ８など）によって切断されることがあり、それにより、自壊スペーサーによって沈殿性蛍光レポーターに連結された第２のプロテアーゼ基質が得られるように操作されるであろう。あるいは、第２のプロテアーゼ基質は、エンドプロテアーゼＣＴＳＤによって切断され得る。
過剰なＣＴＳＤで血漿試料をスパイクしても、カスパーゼ８活性の測定された増加はもたらされない。したがって、プロテアーゼ基質を切断するカスパーゼ８の非存在下では、第２の基質はＣＴＳＤによる切断に利用できず、最終的に蛍光レポーターの沈殿を防止する。
しかし、流体試料に低濃度のカスパーゼ８を添加すると、沈殿性フルオロフォアによって強いシグナルが検出される。したがって、カスパーゼ８はプロテアーゼ基質を切断することができ、それによって第２のプロテアーゼ基質が得られ、これはＣＴＳＤによって切断される。これは、最終的に、沈殿性蛍光レポーターからのスペーサーの解離をもたらし、それによって蛍光シグナルをもたらす。
区別可能な沈殿性蛍光レポーターを有するプローブを有する血漿試料を、カスパーゼ８及びＣＴＳＤとのインキュベーション後にプールすることになる。個々に、健康マウス又はＮＡＳＨを有するマウスから血漿試料を採取して、カスパーゼ８の検出によって健康試料とＮＡＳＨ試料との差を決定する。
実施例１０：代替酵素の検出
この実験では、疾患検出のための代替酵素活性の測定が調査される。異なる酵素クラスには、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、アミラーゼなどが含まれる。
図４３は、ＥｎｚＣｈｅｋ（登録商標）Ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いたＭＰＯの塩素化及び過酸化活性の検出の模式図を示す。ＡＨは、非蛍光Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄ基質を表し、Ａはその蛍光酸化生成物を表す。過酸化水素は、ＭＰＯをＭＰＯ－Ｉに変換し、ＭＰＯは過酸化水素の存在なしでは不活性である。次いで、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）ＵｌｔｒａＲｅｄをＭＰＯ－Ｉによって酸化し、Ｅｘ／Ｅｍ＝５３０／５９０で読み取ることができる蛍光酸化生成物Ａを生成する。
図４４Ａ～４４Ｃは、ペルオキシダーゼの検出結果を示す。図４４Ａは、ＭＰＯ活性が健康マウスとＮＡＳＨマウスとで異なることを示す。図４４Ｂは、標準的な固形飼料（ＣＤ）を与えたマウスとコリン欠乏Ｌ－アミノ酸規定高脂肪食（ＣＤＡＨＦＤ）を与えたマウスとでは、ＭＰＯ活性が異なることを示す。図４４Ｃは、健康対象と関節リウマチを有する対象とでＭＰＯ活性が異なることを示す。この結果は、本発明者らが、滑液中のヒトプールにおける血漿中ＮＡＳＨ及び関節リウマチの差次的活性を検出することができることを示す。
図４５Ａ～４５Ｂは、基質としてオレイン酸レゾルフィンを使用したヒト血漿中の添加組換えプロテアーゼのプール結果を示す。図４６Ａは、３つの組換え酵素－カルボキシルエステラーゼ１、ホスホリパーゼＡ２及びリポタンパク質リパーゼの結果を示す。図４６Ｂは、各種濃度のリポタンパク質リパーゼの結果を示す。この結果は、オレイン酸レゾルフィン及び酪酸レゾルフィンが広範囲の酵素の検出に有望であったことを実証している。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書内で提供される特定の例によって限定されることを意図しない。本発明を前述の明細書を参照して説明してきたが、本明細書の実施形態の説明及び例示は、限定的な意味で解釈されることを意味しない。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、及び置換が思い浮かぶであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載の特定の描写、構成又は相対的な割合に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、任意のそのような代替形態、修正形態、変形形態又は均等物も包含すると考えられる。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

Claims (71)

  1. 対象からの血漿試料を生体外で分子と接触させる工程であって、
    前記分子が、切断可能なリンカー及びレポーターを含み、かつ
    前記切断可能なリンカーが、前記血漿からの作用物質によって切断され、前記分子から前記レポーターを放出する、工程と、
    前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程と、
    を含む、方法。
  2. 前記血漿試料に抗凝固剤を導入する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記抗凝固剤が、ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリン、シュウ酸塩、それらの任意の塩、溶媒和物、鏡像異性体、互変異性体及び幾何異性体、又はそれらの任意の混合物である、請求項２に記載の方法。
  4. 疾患又は状態を有する対象からの体液試料を生体外で分子と接触させる工程であって、
    前記分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、かつ
    前記切断可能なリンカーが、前記体液由来の作用物質によって切断され、前記分子から前記レポーターを放出する、工程と、
    前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程であって、
    前記放出されたレポーターの前記形成速度又は前記量が、健康な対象と有意に異なる、工程と、
    を含む、方法。
  5. 対象からの体液試料を生体外で第１の分子と接触させる工程であって、
    前記第１の分子が、第１の切断可能なリンカー及び第１のレポーターを含み、
    前記第１の切断可能なリンカーが、前記体液由来の第１の作用物質によって切断され、前記第１の分子から前記第１のレポーターを放出する、工程と、
    前記第１の放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程と、
    前記対象からの前記体液試料を生体外で第２の分子と接触させる工程であって、
    前記第２の分子が、第２の切断可能なリンカー及び第２のレポーターを含み、前記第２の切断可能なリンカーが、前記体液由来の第２の作用物質によって切断され、前記第２の分子から前記第２のレポーターを放出する、工程と、
    前記第２の放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程と、
    前記第１の放出されたレポーターの前記検出及び前記第２の放出されたレポーターの前記検出に基づいて前記対象の疾患又は状態を決定する工程と、
    を含む、方法。
  6. 前記決定が、教師あり機械学習分類アルゴリズム、ロジスティック回帰、単純ベイズ、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、勾配ブースティング、ニューラルネットワーク、連続回帰手法、リッジ回帰、カーネルリッジ回帰、サポートベクター回帰、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 対象からの体液試料を生体外で分子と接触させる工程であって、
    前記分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、
    前記切断可能なリンカーは、前記体液由来の作用物質によって切断され、前記分子から前記レポーターを放出する、工程と、
    前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程と、
    前記検出に基づいて前記対象の疾患又は状態を決定する工程であって、
    前記疾患又は状態が、特定の線維症病期又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特定の非アルコール性脂肪性肝疾患活動性スコア（ＮＡＳ）である、工程と、
    を含む、方法。
  8. 対象からの体液試料を生体外で分子と接触させる工程であって、
    前記分子が切断可能なリンカー及びレポーターを含み、
    前記切断可能なリンカーは、前記体液由来の作用物質によって切断され、前記分子から前記レポーターを放出する、工程と、
    前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出する工程と、
    前記検出に基づいて前記対象の疾患又は状態を決定する工程であって、
    前記疾患又は状態が、肝疾患、癌、臓器移植拒絶、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫、アルツハイマー病及び慢性炎症からなる群より選択され、前記癌は、膵管腺癌でも非小細胞肺癌でもない、工程と、
    を含む、方法。
  9. 前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、毒素媒介性肝傷害、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、原発性胆管炎（ＰＢＣ）、胆管癌、原発性硬化性胆管炎、移植肝臓の急性又は慢性拒絶、遺伝性肝疾患、又はそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記体液試料が、血液、血漿、骨髄液、リンパ液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脳脊髄液、脊髄液、滑液、精液、管吸引液、糞便、便、膣流出液、涙液、組織溶解物及び患者由来細胞株上清からなる群より選択される、請求項４～９に記載の方法。
  11. 前記体液試料が、洗浄液、コンディショニング培地又は緩衝液、スワブウイルス輸送媒体、食塩水、培養培地、又は細胞培養上清を含む、請求項４～９に記載の方法。
  12. 前記洗浄液が、洗口洗浄液、気管支肺胞上皮洗浄液、洗浄液、洗髪洗浄液、鼻スプレー流出物、食塩水若しくは任意の媒体又はその派生物に適用された任意の体表、開口部、臓器構造又は固形腫瘍生検のスワブからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記作用物質が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、β－グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ及びホスホジエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、求核試薬、還元試薬、求電子／酸性試薬、有機金属／金属触媒、酸化試薬、ヒドロキシルイオン、チオール求核剤、窒素求核剤、亜ジチオン酸ナトリウム及び過ヨウ素酸ナトリウムからなる群より選択される、請求項１～１２に記載の方法。
  14. 前記作用物質が、プロテアーゼである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記プロテアーゼが、エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記プロテアーゼが、Ａ２０（ＴＮＦａ誘導タンパク質３）、アブヒドロラーゼドメイン含有４、アブヒドロラーゼドメイン含有１２、アブヒドロラーゼドメイン含有１２Ｂ、アブヒドロラーゼドメイン含有１３、アクロシン、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２（ファーティリン－ｂ）、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ４、ＡＤＡＭ４Ｂ、ＡＤＡＭ５、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２メタロプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５／１１、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０、脂肪細胞ｅｎｈ．結合タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質２、気道トリプシン様プロテアーゼ、アミノアシラーゼ、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＢ様１、アミノペプチダーゼＭＡＭＳ／Ｌ－ＲＡＰ、アミノペプチダーゼＮ、アミノペプチダーゼＯ、アミノペプチダーゼＰホモログ、アミノペプチダーゼＰ１、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ、アミノペプチダーゼＱ、アミノペプチダーゼ様１、ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、ＡＭＳＨ－ＬＰ／ＳＴＡＭＢＰＬ１、アンギオテンシン変換酵素１（ＡＣＥ１）、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アンジオテンシン変換酵素３（ＡＣＥ３）、アニオン性トリプシン（ＩＩ）、アポリポタンパク質（ａ）、アーケアメトジンシン（ａｒｃｈａｅｍｅｔｚｉｎｃｉｎ）－１、アーケアメトジンシン－２、アスパルトアシラーゼ、アスパルトアシラーゼ－３、アスパルチルアミノペプチダーゼ、アタキシン－３、アタキシン－３様、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質１、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様２、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様３、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様４、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様５、ＡＴＰ２３ペプチダーゼ、オートファジン－１、オートファジン－２、オートファジン－３、オートファジン－４、アズロシジン、ベータラクタマーゼ、ベータセクレターゼ１、ベータセクレターゼ２、ブレオマイシン加水分解酵素、脳のセリンプロテイナーゼ２、ＢＲＣＣ３６（ＢＲＣＡ２含有複合体、サブ３）、カルパイン、カルパイン１、カルパイン２、カルパイン３、カルパイン４、カルパイン５、カルパイン６、カルパイン７、カルパイン７様、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２、カルパイン１３、カルパイン１４、カルパイン１５（Ｓｏｌｈタンパク質）、システインプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＡ３、カルボキシペプチダーゼＡ４、カルボキシペプチダーゼＡ５、カルボキシペプチダーゼＡ６、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、カルボキシペプチダーゼＯ、カルボキシペプチダーゼＵ、カルボキシペプチダーゼＸ１、カルボキシペプチダーゼＸ２、カルボキシペプチダーゼＺ、カルノシンジペプチダーゼ１、カルノシンジペプチダーゼ２、カスパーゼ動員ドメインファミリー、メンバー８、カスパーゼ、カスパーゼ－１、カスパーゼ－２、カスパーゼ－３、カスパーゼ－４／１１、カスパーゼ－５、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９、カスパーゼ－１０、カスパーゼ－１２、カスパーゼ－１４、カスパーゼ－１４様、ｃａｓｐｅｒ／ＦＬＩＰ、カテプシン、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ（ＣＴＳＳ）、カテプシンＶ（ＣＴＳＶ）、カテプシンＷ、カテプシンＺ（ＣＴＳＺ）、カチオン性トリプシン、ｃｅｚａｎｎｅ／ＯＴＵドメイン含有７Ｂ、ｃｅｚａｎｎｅ－２、ＣＧＩ－５８、キマーゼ、キモパシン（ｃｈｙｍｏｐａｓｉｎ）、キモシン、キモトリプシンＢ、キモトリプシンＣ、凝固因子ＩＸａ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子Ｘａ、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＸＩＩａ、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ２、コラゲナーゼ３、補体プロテアーゼＣ１ｒセリンプロテアーゼ、補体プロテアーゼＣ１ｓセリンプロテアーゼ、補体Ｃ１ｒホモログ、補体成分２、補体成分Ｃ１ｒａ、補体成分Ｃ１ｓａ、補体因子Ｂ、補体因子Ｄ、補体因子Ｄ様、補体因子Ｉ、ＣＯＰＳ６、コリン（ｃｏｒｉｎ）、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１）、円柱腫症タンパク質（ｃｙｌｉｎｄｒｏｍａｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトゾルアラニルアミノｐｅｐ．様１、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、ＤＤＩ関連プロテアーゼ、デシシン（ＤＥＣＹＳＩＮ）、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー１、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー２、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー３、ＤＥＳＣ１プロテアーゼ、デザートヘッジホッグタンパク質、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ１、脱ＳＵＭＯ化イソペプチダーゼ２、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質１、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質３、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質４、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質５、ＤＩＮＥペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ジペプチジルペプチダーゼ６（ＤＰＰ６）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼ１０（ＤＰＰ１０）、ＤＪ－１、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質２、ＤＵＢ－１、ＤＵＢ－２、ＤＵＢ２ａ、ＤＵＢ２ａ様、ＤＵＢ２ａ様２、ＤＵＢ６、又はそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記プロテアーゼが、Ｔ細胞プロテアーゼ、補体プロテアーゼ、線維症プロテアーゼ及び炎症関連プロテアーゼからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記切断可能なリンカーが、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、エステル、グリコシド、リン脂質、ホスホジエステル、求核剤／塩基感受性リンカー、還元感受性リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属で切断可能なリンカー、酸化感受性リンカー又はそれらの組み合わせである、請求項１～１７に記載の方法。
  19. 前記切断可能なリンカーが、ペプチドである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ペプチドが、配列番号１～６７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記切断可能なリンカーが、共有結合を介して前記レポーターに直接接続されている、請求項１～２０に記載の方法。
  22. 前記レポーターが、蛍光標識、質量タグ、発色団、電気化学的に活性な分子、バイオレイヤー干渉法若しくは表面プラズモン共鳴で検出可能な分子、沈殿物質、質量分析及び液体クロマトグラフィー基質、磁気的に活性な分子、ゲル形成及び／若しくは粘度変化分子、イムノアッセイで検出可能な分子、細胞ベースの増幅で検出可能若しくは核酸バーコード、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～２１に記載の方法。
  23. 前記レポーターが、蛍光標識を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記蛍光標識が、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）、２－アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ３及び（５－（（２－アミノエチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸）（ＥＤＡＮＳ）から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記分子が、蛍光消光剤をさらに含む、請求項２３～２４に記載の方法。
  26. 前記蛍光消光剤が、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＢＢＱ６５０、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＣＰＱ２、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、ＤＡＢＣＹＬ（４－（［４’－ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）ベンゾイル）、Ｄｎｐ（２，４－ジニトロフェニル）及びＥｃｌｉｐｓｅからなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記蛍光消光剤が、共有結合を介して前記切断可能なリンカーに直接接続されている、請求項２５～２６に記載の方法。
  28. 前記分子が担体をさらに含む、請求項１～２７に記載の方法。
  29. 前記担体が、天然タンパク質、標識タンパク質若しくは合成タンパク質、正確に既知の化学組成の、又は平均分子量付近の分布を有する合成化学ポリマー、オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、フォルダマー、脂質、脂質ミセル、ナノ粒子、ポリスチレン、ポリプロピレン若しくは任意の他の種類のプラスチック製の固体支持体、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記対象が哺乳動物である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記レポーターが、自壊スペーサーを介して前記切断可能なリンカーに連結されている、請求項１～３１に記載の方法。
  33. 前記自壊スペーサーが、ジスルフィド、ヘテロアミン二官能性ジスルフィド、チオールベースのピリダジンジオン、ｐ－アミンベンジルオキシカルボニル、ジペプチド、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌ－Ｐｈｅ－Ｓａｒ、トランス－シクロオクテンテトラジン、オルトヒドロキシ保護アリールスルフェート、ホスホルアミデートベースのスペーサー、ヒドロキシベンジル、トリメチルカルバメート及びキノンメチドベースのスペーサーからなる群より選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記検出が、蛍光検出、分光検出、質量分析、免疫学的検出又はイメージング検出を含む、請求項１～３３に記載の方法。
  35. 前記検出が、蛍光検出を含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記蛍光検出が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記切断されたレポーターが沈殿性フルオロフォアを含む、請求項３２～３６に記載の方法。
  38. 前記沈殿性フルオロフォアが、ＨＰＱ、Ｃｌ－ＨＰＱ、ＨＴＰＱ、ＨＢＰＱ又はＨＱＰＱを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 対象からの体液試料中の２又はそれより多い作用物質の活性を測定する工程と、
    前記活性に基づいて前記対象の疾患又は状態を決定する工程であって、
    前記疾患又は状態が、肝疾患、臓器移植拒絶、感染性疾患、アレルギー性疾患、自己免疫、アルツハイマー病及び慢性炎症からなる群より選択される、工程と、
    を含む、方法。
  40. 前記肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、毒素媒介性肝傷害、ウイルス性肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、肝硬変、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、原発性胆管炎（ＰＢＣ）、胆管癌、原発性硬化性胆管炎、移植肝臓の急性又は慢性拒絶、遺伝性肝疾患、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 対象からの体液試料中の２又はそれより多い作用物質の活性を測定する工程と、
    前記活性に基づいて前記対象の疾患又は状態を決定する工程であって、
    前記疾患又は状態が、特定の線維症病期又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の特定の非アルコール性脂肪性肝疾患活動性スコア（ＮＡＳ）である、工程と、
    を含む、方法。
  42. 前記測定する工程が、
    前記対象からの前記体液試料を生体外で分子と接触させることであって、
    前記分子が、切断可能なリンカー及びレポーターを含み、かつ
    前記切断可能なリンカーが、血漿由来のプロテアーゼによって切断され、前記分子から前記レポーターを放出する、接触させることと、
    前記放出されたレポーターの形成速度又は量を検出することと、
    を含む、請求項３９～４１に記載の方法。
  43. 前記作用物質が、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、プロテアーゼ（ペプチダーゼ）、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、β－グリコシダーゼ、ホスホリパーゼ及びホスホジエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、求核試薬、還元試薬、求電子／酸性試薬、有機金属／金属触媒、酸化試薬、ヒドロキシルイオン、チオール求核剤、窒素求核剤、亜ジチオン酸ナトリウム及び過ヨウ素酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項３９～４２に記載の方法。
  44. 前記作用物質が、プロテアーゼである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記プロテアーゼが、エンドペプチダーゼ又はエキソペプチダーゼである、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記プロテアーゼが、Ａ２０（ＴＮＦａ誘導タンパク質３）、４を含有するアブヒドロラーゼドメイン、１２を含有するアブヒドロラーゼドメイン、１２Ｂを含有するアブヒドロラーゼドメイン、１３を含有するアブヒドロラーゼドメイン、アクロシン、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）、ＡＤＡＭ１ａ、ＡＤＡＭ２（Ｆｅｒｔｉｌｉｎ－ｂ）、ＡＤＡＭ３Ｂ、ＡＤＡＭ４、ＡＤＡＭ４Ｂ、ＡＤＡＭ５、ＡＤＡＭ６、ＡＤＡＭ７、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１１、ＡＤＡＭ１２メタロプロテアーゼ、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１８、ＡＤＡＭ１９、ＡＤＡＭ２０、ＡＤＡＭ２１、ＡＤＡＭ２２、ＡＤＡＭ２３、ＡＤＡＭ２８、ＡＤＡＭ２９、ＡＤＡＭ３０、ＡＤＡＭ３２、ＡＤＡＭ３３、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５／１１、ＡＤＡＭＴＳ６、ＡＤＡＭＴＳ７、ＡＤＡＭＴＳ８、ＡＤＡＭＴＳ９、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＭＴＳ１４、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＡＤＡＭＴＳ１７、ＡＤＡＭＴＳ１８、ＡＤＡＭＴＳ１９、ＡＤＡＭＴＳ２０、脂肪細胞ｅｎｈ．結合タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質１、Ａｆｇ３様タンパク質２、気道トリプシン様プロテアーゼ、アミノアシラーゼ、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＢ、アミノペプチダーゼＢ様１、アミノペプチダーゼＭＡＭＳ／Ｌ－ＲＡＰ、アミノペプチダーゼＮ、アミノペプチダーゼＯ、アミノペプチダーゼＰホモログ、アミノペプチダーゼＰ１、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ、アミノペプチダーゼＱ、アミノペプチダーゼ様１、ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、ＡＭＳＨ－ＬＰ／ＳＴＡＭＢＰＬ１、アンギオテンシン変換酵素１（ＡＣＥ１）、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）、アンジオテンシン変換酵素３（ＡＣＥ３）、アニオン性トリプシン（ＩＩ）、アポリポタンパク質（ａ）、アルケメトジンシン－１、アーケメチンシン－２、アスパルトアシラーゼ、アスパルトアシラーゼ－３、アスパルチルアミノペプチダーゼ、アタキシン－３、アタキシン－３様、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質１、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様２、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様３、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様４、ＡＴＰ／ＧＴＰ結合タンパク質様５、ＡＴＰ２３ペプチダーゼ、オートファジン－１、オートファジン－２、オートファジン－３、オートファジン－４、アズロシジン、ベータラクタマーゼ、ベータセクレターゼ１、ベータセクレターゼ２、ブレオマイシン加水分解酵素、脳のセリンプロテイナーゼ２、ＢＲＣＣ３６（ＢＲＣＡ２含有複合体、サブ３）、カルパイン、カルパイン１、カルパイン２、カルパイン３、カルパイン４、カルパイン５、カルパイン６、カルパイン７、カルパイン７様、カルパイン８、カルパイン９、カルパイン１０、カルパイン１１、カルパイン１２、カルパイン１３、カルパイン１４、カルパイン１５（Ｓｏｌｈタンパク質）、システインプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ１、カルボキシペプチダーゼＡ２、カルボキシペプチダーゼＡ３、カルボキシペプチダーゼＡ４、カルボキシペプチダーゼＡ５、カルボキシペプチダーゼＡ６、カルボキシペプチダーゼＢ、カルボキシペプチダーゼＤ、カルボキシペプチダーゼＥ、カルボキシペプチダーゼＭ、カルボキシペプチダーゼＮ、カルボキシペプチダーゼＯ、カルボキシペプチダーゼＵ、カルボキシペプチダーゼＸ１、カルボキシペプチダーゼＸ２、カルボキシペプチダーゼＺ、カルノシンジペプチダーゼ１、カルノシンジペプチダーゼ２、カスパーゼ動員ドメインファミリー、メンバー８、カスパーゼ、カスパーゼ－１、カスパーゼ－２、カスパーゼ－３、カスパーゼ－４／１１、カスパーゼ－５、カスパーゼ－６、カスパーゼ－７、カスパーゼ－８、カスパーゼ－９、カスパーゼ－１０、カスパーゼ－１２、カスパーゼ－１４、カスパーゼ－１４様、キャスパー／フリップ、カテプシン、カテプシンＡ（ＣＴＳＡ）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、カテプシンＣ（ＣＴＳＣ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、カテプシンＥ（ＣＴＳＥ）、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、カテプシンＬ（ＣＴＳＬ）、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ（ＣＴＳＳ）、カテプシンＶ（ＣＴＳＶ）、カテプシンＷ、カテプシンＺ（ＣＴＳＺ）、カチオン性トリプシン、７Ｂを含有するセザンヌ／ＯＴＵドメイン、セザンヌ－２、ＣＧＩ－５８、キマーゼキモパシン、キモシン、キモトリプシンＢ、キモトリプシンＣ、凝固因子ＩＸａ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子Ｘａ、凝固因子ＸＩａ、凝固因子ＸＩＩａ、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ２、コラゲナーゼ３、補体プロテアーゼＣ１ｒセリンプロテアーゼ、補体プロテアーゼＣ１ｓセリンプロテアーゼ、補体Ｃ１ｒホモログ、補体成分２、補体成分Ｃ１ｒａ、補体成分Ｃ１ｓａ、補因子Ｂ、補因子Ｄ、補数因子Ｄ様、補体因子Ｉ、ＣＯＰＳ６、コリン、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１）、円柱腫症タンパク質、サイトゾルアラニルアミノペプチド様１、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、ＤＤＩ関連プロテアーゼ、デシシン、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー１、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー２、Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、メンバー３、ＤＥＳＣ１プロテアーゼ、砂漠のハリネズミのタンパク質、デスモイル化イソペプチダーゼ１、デスモイル化イソペプチダーゼ２、ジヒドロオロターゼ、ジヒドロピリミジナーゼ、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質１、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質２、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質３、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質４、ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質５、ＤＩＮＥペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ１）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ４）、ジペプチジルペプチダーゼ６（ＤＰＰ６）、ジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ、ジペプチジルペプチダーゼ１０（ＤＰＰ１０）、ＤＪ－１、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質、ＤＮＡ損傷誘導性タンパク質２、ＤＵＢ－１、ＤＵＢ－２、ＤＵＢ２ａ、ＤＵＢ２ａ様、ＤＵＢ２ａ様２、ＤＵＢ６、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記プロテアーゼが、Ｔ細胞プロテアーゼ、補体プロテアーゼ、線維症プロテアーゼ及び炎症関連プロテアーゼからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
  48. 前記切断可能なリンカーが、ペプチド、炭水化物、核酸、脂質、エステル、グリコシド、リン脂質、ホスホジエステル、求核剤／塩基感受性リンカー、還元感受性リンカー、求電子剤／酸感受性リンカー、金属で切断可能なリンカー、酸化感受性リンカー又はそれらの組み合わせである、請求項４２～４７に記載の方法。
  49. 前記切断可能なリンカーが、ペプチドである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記ペプチドが、配列番号１～６７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記切断可能なリンカーが、共有結合を介して前記レポーターに直接連結されている、請求項４２～５０に記載の方法。
  52. 前記レポーターが、蛍光標識、質量タグ、発色団、電気化学的に活性な分子、バイオレイヤー干渉法若しくは表面プラズモン共鳴で検出可能な分子、沈殿物質、質量分析及び液体クロマトグラフィー基質、磁気的に活性な分子、ゲル形成及び／若しくは粘度変化分子、イムノアッセイで検出可能な分子、細胞ベースの増幅で検出可能若しくは核酸バーコード、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４２～５１に記載の方法。
  53. 前記レポーターが、蛍光標識を含む、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記蛍光標識が、５－カルボキシフルオレセイン（５－ＦＡＭ）、７－アミノ－４－カルバモイルメチルクマリン（ＡＣＣ）、７－アミノ－４－メチルクマリン（ＡＭＣ）、２－アミノベンゾイル（Ａｂｚ）、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ３及び（５－（（２－アミノエチル）アミノ）ナフタレン－１－スルホン酸）（ＥＤＡＮＳ）から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記分子が、蛍光消光剤をさらに含む、請求項４２～５４に記載の方法。
  56. 前記蛍光消光剤が、ＢＨＱ０、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、ＢＢＱ６５０、ＡＴＴＯ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ５８０Ｑ、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、ＣＰＱ２、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、ＤＡＢＣＹＬ（４－（［４’－ジメチルアミノ）フェニル］アゾ）ベンゾイル）、Ｄｎｐ（２，４－ジニトロフェニル）及びＥｃｌｉｐｓｅからなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記蛍光消光剤が、共有結合を介して前記切断可能なリンカーに直接接続されている、請求項５５～５６に記載の方法。
  58. 前記分子が担体をさらに含む、請求項４２～５７に記載の方法。
  59. 前記担体が、天然タンパク質、標識タンパク質若しくは合成タンパク質、正確に既知の化学組成の、又は平均分子量付近の分布を有する合成化学ポリマー、オリゴヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、フォルダマー、脂質、脂質ミセル、ナノ粒子、ポリスチレン、ポリプロピレン若しくは任意の他の種類のプラスチック製の固体支持体、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
  60. 前記対象が哺乳動物である、請求項４２～５９に記載の方法。
  61. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記レポーターが、自壊スペーサーを介して前記切断可能なリンカーに連結されている、請求項４２～６１に記載の方法。
  63. 前記自壊スペーサーが、ジスルフィド、ヘテロアミン二官能性ジスルフィド、チオールベースのピリダジンジオン、ｐ－アミンベンジルオキシカルボニル、ジペプチド、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ、Ｌ－Ｐｈｅ－Ｓａｒ、トランス－シクロオクテンテトラジン、オルトヒドロキシ保護アリールスルフェート、ホスホルアミデートベースのスペーサー、ヒドロキシベンジル、トリメチルカルバメート及びキノンメチドベースのスペーサーからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記検出が、蛍光検出、分光検出、質量分析、免疫学的検出又はイメージング検出を含む、請求項４２～６３に記載の方法。
  65. 前記検出が、蛍光検出を含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記蛍光検出が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記切断されたレポーターが沈殿性フルオロフォアを含む、請求項４２～６６に記載の方法。
  68. 前記沈殿性フルオロフォアが、ＨＰＱ、Ｃｌ－ＨＰＱ、ＨＴＰＱ、ＨＢＰＱ又はＨＱＰＱを含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記体液試料が、血液、血漿、骨髄液、リンパ液、胆汁、羊水、粘膜液、唾液、尿、脳脊髄液、脊髄液、滑液、精液、管吸引液、糞便、便、膣流出液、涙液、組織溶解物及び患者由来細胞株上清からなる群から選択される、請求項３９～６８に記載の方法。
  70. 前記体液試料が、洗浄液、コンディショニング培地又は緩衝液、スワブウイルス輸送媒体、食塩水、培養培地、又は細胞培養上清を含む、請求項３９～６８に記載の方法。
  71. 前記洗浄液が、洗口洗浄液、気管支肺胞上皮洗浄液、洗浄液、洗髪洗浄液、鼻スプレー流出物、食塩水若しくは任意の媒体又はその派生物に適用された任意の体表、開口部、臓器構造又は固形腫瘍生検のスワブからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。

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