KR20110020853A - 유전자 또는 단백질 발현 프로파일을 이용한 신장 동종이식 거부반응 진단방법 - Google Patents

유전자 또는 단백질 발현 프로파일을 이용한 신장 동종이식 거부반응 진단방법 Download PDF

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Abstract

개체의 생물학적 시료에서, 하나 이상의 핵산 마커들 또는 하나 이상의 단백질 마커들의 핵산 발현 프로파일을 결정하는 단계; 하나 이상의 핵산 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 하나 이상의 핵산 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 핵산 마커들의 증가는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.

Description

유전자 또는 단백질 발현 프로파일을 이용한 신장 동종이식 거부반응 진단방법{METHODS OF DIAGNOSING REJECTION OF A KIDNEY ALLOGRAFT USING GENOMIC OR PROTEOMIC EXPRESSION PROFILING}
본 출원은 본원에 내용이 참조로 포함되는 2008년5월30일 출원된 미국임시출원 61/129,022의 우선권 이익을 주장한다.
본 발명은 유전자 발현 프로파일 또는 단백질 발현 프로파일을 이용한 신장 동종이식 급성 거부반응 진단 방법에 관한 것이다.
말기 주요 장기 부전 환자들에게 이식은 일차적인 치료방법으로 고려된다. 사이클로스포린 및 타크로리무스와 같은 면역억제제가 동종이식 수령자 생존 및 복지를 개선하지만, 동종이식 거부반응을 가능한 조기에 확인하고 유효한 검사 및 면역억제제 투여 조절은 동종이식 수령자의 생존에 있어 여전히 중요하다.
동종이식 거부반응은 제공조직에 의해 발현되는 비자기 항원에 대한 수령자 면역반응 결과이며, 동종이식편 수령 이후 수 시간 또는 수일 또는 그 이후 수개월 또는 수년에 발생할 수 있다. 신장 동종이식 거부반응은 요량 감소, 신장 기능의 신속한 악화 및 경도 단백뇨를 포함한 증상으로 특정된다. 신장 동종이식 거부반응은 신장병 및 신부전에 이를 수 있다.
현재, 침입적 생검 (예를들면, 심내막심장근, 간 중심(core), 및 신장 세침흡인)이 동종이식 거부반응에 대한 감시 및 진단의 최적 표준으로 널리 인식되고 있으나, 침입적 절차는 그 자체 위험성을 동반한다 (참고. Mehra MR, 등. Curr.Opin.Cardiol. 2002 Mar;17(2):131-136.). 또한 생검 결과는 신장 및 간 동종이식 거부반응 등급을 위한 반프 모형(Solez 등 2008 Am J Transplant 8: 753; 표 1)와 같은 국제적 가이드라인이 존재하지만 시료취급 오류 및 관찰자 간의 변동성으로 인하여 재현 및 해석의 문제가 있다. 동종이식편 수령자는 이식 이후 첫해 여러 번 생검 시술을 받을 수 있다. 비-침입적 감시기술이 현재 사용되지만 (혈액 크레아티닌 수준 증가), 혈청 크레아티닌 수준은 신장 손상만을 특이적으로 반영하지는 않는다. 신장 손상은 거부반응, 감염 또는 원 질환에 원인이 있을 수 있으므로 검사는 거부반응에만 특이적이지 않다.
동종이식 거부반응 지표들은 하나 이상의 국소적 또는 전신 염증, 조직 손상, 동종 이식편의 면역세포 침윤, 이식편에 있는 제공자-특이적 항원을 인식하는 염증세포, 동종특이적 항체, 세포독성 T-세포 활성, 조직- 및 혈액 유도 단백질 조성 및 농도 변경, 동종이식조직의 차등 산소화, 부종, 감염, 동종이식편 및/또는 주변 조직 괴사 등에 의해 나타나는 고조된 국소화 면역반응을 포함한다.
동종이식 거부반응은 '급성' 또는 '만성'으로 분류된다. 일반적으로 급성 거부반응 (또는 급성 항체-매개 거부반응, AMR 또는 활성 거부반응이라고 알려짐)은 개체가 동종이식편을 수령한 후 6 내지 12개월 이내 조직 또는 장기 동종이식편의 거부반응이다. 거부반응 또는 급성 거부반응은 제공조직의 세포 및 체액 손상에 특징이 있고 조직 또는 장기의 신속한 이식편 기능장애 및 기능상실로 이어진다. 만성 거부반응은 통상 동종이식편 수령 후 6-12개월 이후 조직 또는 장기의 거부반응이며, 동종이식편 수령 후 수년 후에 발생될 수 있다. 이러한 후기 또는 만성 거부반응은 준-임상적 또는 완전히 해결되지 않은 급성 거부반응 에피소드 결과일 수 있다. 후기 발병 또는 만성 거부반응은 동종면역반응으로 인한 점진적 조직 재형성에 특징이 있고 동맥 내에 신생 내막이 형성되어 폐색 혈관증, 실질조직 섬유증 및 따라서 이식편의 상실 및 손실에 이른다. 거부반응의 특성 및 경중도에 따라 동종이식 거부반응 - 만성 또는 급성 -이 진행 중이거나 의심되는 개체에서 관찰되는 지표 또는 임상적 변수들이 중첩된다.
과학적 및 특허 문헌들은 명명될 수 있는 모든 의료적 병태의 확인/진단/예측/치료에 중요한 이러한 마커들을 보고하고 있다. 동종이식 만성 거부반응 분야에서, 수많은 마커들 (때로는 단일)이 나열되고 일부 경우 상반된 결과들이 존재한다. 이러한 문헌상의 모순이 유전체 (약 30,000개 이상의 전사 유닛들) 복잡성, 인체의 세포 유형 (약 200 종 이상), 장기 및 조직, 및 발현 단백질 또는 폴리펩티드 (약 80,000개 이상) 다양성에 더해져 장기 급성 거부반응 진단에 유용한 잠재적 핵산 서열, 유전자, 단백질, 대사산물 또는 이들의 조합들의 개수는 엄청나다. 개개인 변동성뿐 아니라 관심있는 많은 잠재적 단백질이 매우 낮은 농도로 존재하는 혈장에서의 단백질 농도의 동적 변동 범위 (10-6 내지 103 ㎍/mL) 및 적지만 가장 풍부한 혈장 단백질의 과도한 함량 (총 단백질 중량의 ~ 99% 해당)이 추가적인 장애로 존재한다.
PCT 공개 WO 2006/125301에는 이식조식에서 차별적으로 발현되는 핵산 및 신장조직 거부반응을 검출하기 위한 방법 및 물질들이 개시된다.
미국특허 7235258에는 하나 이상의 개체 유전자 발현수준을 검출하여 개체에서 신장이식을 포함한 이식거부반응을 진단하거나 검사하는 방법이 개시된다. 이들 방법에서 유용한 올리고뉴클레오티드들이 개시된다.
Flechner 등. (Am J Transplant 2004: 4 (9) 1475-1489)은 신장이식을 받은 개체에서 여러 유전자들의 차별적 발현을 동정하기 위하여 DNA 또는 마이크로어레이를 사용한 여러 공개들을 확인하고, 신장이식개체로부터의 말초혈 림프구 및 신장생검시료의 유전자 발현 프로파일을 검사하기 위한 마이크로어레이 분석 및 RT-PCR 사용을 기술하고, 차별적으로 발현된 60개 이상의 유전자들 확인하였다.
Alakulppi 등. 2007 (Transplantation 83:791-798)은 RT-PCR을 이용하여 8개의 핵산마커들에 대한 신장 동종이식 급성 거부반응 진단을 개시한다. Alakulppi 등. (2008, Transplantation 86:1222-8)의 추가 연구에서는 무증상 거부반응에 대하여 신뢰할 수 있는 전혈 유전자 발현 핵산 마커들을 확인할 수 없었다.
Sarwal 등. 2003 ( N. Engl. J. Med 349:125)은 급성 거부반응 동안 신장 생검에서 세포자연사와 연관된 유전자가 증가되었다고 보고하였고 NF-kappaB 및 IFNγ의해 유도되는 림프구 침윤 및 활성을 나타내는 전사체 그룹들을 찾았다.
Mueller 등. (2007. Am J. Transplant 7:2712)은 생쥐 및 인간에서 세포독성 T-림프구, IFNγ 신호, 및 상피세포 손상과 연관되는 신장조직에서의 전사체를 확인하였다.
Mehra 등., 2008은 T-세포 항상성 및 코르티코스테로이드 민감성 조절 경로는 심장 이식에서의 잠재적 만성 거부반응과 연관된다는 것을 제안하였으나 신장이식에 대하여는 언급되지 않았다. ITGAX 발현은 언급된 33개 유전자 중 하나이다.
Fildes 등 2008 (Transplant Immunology 19:1-11)에 의한 검토에서 폐 이식 후 면역 프로세스에서 세포 유형의 기능이 논의되고, 급성 및 만성 거부반응에서의 AICL (CLEC2B)의 NK 세포 단백질과의 상호작용 기능이 개시된다.
다양한 암을 진단하고 검사하기 위한 다중 플랫폼 (단백질, 유전자)의 일체화가 제안되었으나 단백질 및 mRNA 발현 간의 불일치가 본 분야에서 확인되었다 (Chen 등, 2002.Mol Cell Proteomics1:.304-313; Nishizuka 등., 2003 Cancer Research 63:5243-5250). 선행 연구들은 유전자 및 단백질 자료들 사이 낮은 상관을 보고한다 (Gygi SP 등. 1999. Mol Cell Biol.19:1720-1730; Huber 등., 2004 Mol Cell Proteomics 3:43-55).
신장 이식수령자의 소변 총 단백질에 대한 다양한 연구가 진행되었다 (Schaub 등., 2008. Contrib. Nephrol 160:65-75. 리뷰).
Bottelli 등., 2008 (J. Am Soc Nephrol 19:1904-18)은 손상 세관세포 재생 과정에서 대식세포 자극 단백질 (MSP)이 상향 조절된다는 것을 교시하고, 이는 급성 신장 손상 회복에 조력할 수 있다고 제안한다. Gorgi 등. (2009 Transplantation Proceedings 41:660-662)은 급성 신장이식 거부반응, 및 MBL 유전자 다형성과의 연관성을 연구하였고 다형성이 연구 모집단에서 동종이식 급성 거부반응 민감성에 개재될 수 있다고 결론을 내렸다. Fiane 등., 2005 (Eur Heart J 26:1660-5)은 낮은 수준의 MBL이 심장 이식수령자의 급성 거부반응 진행과 관련된다고 개시하였다. Fildes 2008 (J. Heart Lung Transplant 27:1353-1356)은 MBL 결핍 심장 이식수령자는 거의 거부반응 에피소드를 가지지 않았다고 교시한다. Fiane 또는 Fildes는 신장이식에 대하여는 언급하지 않는다.
Berger 등., 2005 (Am J. Transplant 5:1361-1366)은 더 높은 수준의 MBL (만노스-결합 렉틴)은 신장 이식수령자의 더욱 중증 거부반응과 연결될 수 있다고 교시하고, 이식 전 MBL 수준은 신장이식 전에 위험성 성층화에 유용할 수 있다고 제안한다.
덜 침입적이고, 재현 가능하고 더욱 신뢰할 수 있는 (시료채취 및 오류 해석에 덜 민감한), 동종이식 거부반응 평가 또는 진단방법이 매우 요망된다.
본 발명은 개체로부터 채취된 하나 이상의 생물학적 시료의 유전자 발현 프로파일 또는 단백질 발현 프로파일을 이용한 신장 동종이식 거부반응 진단 방법에 관한 것이다.
생물학적 시료는 혈액 또는 혈장시료일 수 있다; 본원에서 기술된 방법에서 이러한 시료들을 사용함으로써, 이러한 시료들은 최소-침입적 방법으로 얻을 수 있고 (예를들면, 말초혈액 시료), 동종이식편 생검이 필요 없으므로, 생검-기반의 신장 동종이식 거부반응 (급성 거부반응 포함) 평가 및/또는 검사보다 이점을 제공한다. 혈액 또는 혈장시료를 사용함으로써 다른 이점 즉 시료채취 오류를 줄일 수 있고, 단백질 또는 핵산마커들의 검출은 해석에 덜 민감하며 - 즉 마커가 존재하거나 존재하지 않으며, 또는 본원에 기술된 바와 같이 기준선, 대조군 등에 대하여 증가되거나 감소된다.
혈액시료 채취를 통한 일부 현재 감시기법(예를들면 혈청 크레아틴 수준)은 거부반응에 특이적이지 않을 수 있다; 본원에 기술되는, 혈액 또는 혈장시료에서 얻은 핵산 또는 단백질마커들은 신장 동종이식 급성 거부반응에 특이적이고 따라서 특이성의 이점을 더욱 제공한다.
본원에서 확인되는 마커들의 이질성에서 신장 동종이식 급성 거부반응의 복잡한 병리생물학이 반영된다. 본원에서 동정되는 마커들은 생물학적 프로세서 범위에 걸쳐 분포된다: 면역신호전달, 세포골격 재구성, 세포자연사, T-세포 활성 및 증식, 세포성 및 체액성 면역반응, 급성기 염증 경로 등.
본 발명의 일 측면에 의하면, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산 마커들의 핵산 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 하나 이상의 핵산마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 핵산 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 핵산마커들의 증가는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시한다.
일부 측면에서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장이다.
일부 측면에서, 핵산마커들의 군은 하나 이상의 SFRS16, NFYC, NCOA3, PGS1, NEDD9, LIMK2, NASP, 240057_at, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6을 더욱 포함한다.
일부 측면에 의하면, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 얻어진다.
일부 측면에서, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 본 방법은 단계 a)에서 표 2에서 선택되는 하나 이상의 핵산마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 하나 이상의 핵산마커들의 핵산 발현 프로파일은 하나 이상의 마커들에 상응하는 RNA 서열 검출에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 하나 이상의 핵산마커들의 핵산 발현 프로파일은 PCR에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 하나 이상의 핵산마커들의 핵산 발현 프로파일은 혼성화에 의해 결정될 수 있다. 혼성화는 올리고뉴클레오티드에 대한 것이다.
일부 측면에서, 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, 하나 이상의 KNG1, AFM, TTN, MSTP9/MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 및 UBR4에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 단백질마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 단백질마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 5개 이상의 단백질마커들의 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시한다.
일부 측면에서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장이다.
일부 측면에서, 하나 이상의 KNG1 및 AFM에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 대비 감소되고, 하나 이상의 TTN, MSTP9, MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 및 UBR4에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 증가된다.
일부 측면에 의하면, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 얻어진다.
일부 측면에서, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 단백질 발현 프로파일은 면역검정에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 발현 프로파일은 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단백질 발현 프로파일은 질량 스펙트럼에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 발현 프로파일은 동위원소 또는 동중원소 표지방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 마커들은 하나 이상의 LBP, VASN, ARNTL2, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C9, LCAT, B2M, SHBG 및 C1S에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체의 동종이식 급성 거부반응 결정방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서, 하나 이상의 단백질그룹코드 111, 224, 23, 18, 100, 116, 38, 135, 125에 포함된 폴리펩티드를 포함하는 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 단백질마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 하나 이상의 단백질마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 5개 이상의 단백질마커들의 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시한다.
일부 측면에서, 단백질그룹코드는 하나이상의 그룹 18, 108, 222, 97, 104, 26, 230, 103, 69 또는 29을 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장이다.
일부 측면에서, 하나 이상의 KNG1 및 AFM에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 대비 감소되고, 하나 이상의 TTN, MSTP9, MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 및 UBR4에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 증가된다.
일부 측면에 의하면, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체에서 얻어진다.
일부 측면에서, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 단백질 발현 프로파일은 면역검정에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 발현 프로파일은 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단백질 발현 프로파일은 질량 스펙트럼에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 발현 프로파일은 동위원소 또는 동중원소 표지방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질 마커들은 하나 이상의 LBP, VASN, ARNTL2, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C9, LCAT, B2M, SHBG 및 C1S에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 대조군은 자가 대조군이다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 하나 이상의 핵산마커 TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073, ITGAX에 대한 하나 이상의 프로브 세트를 포함하는 어레이가 제공된다.
일부 측면에서, 어레이는 하나 이상의 핵산마커 SFRS16, NFYC, NCOA3, PGS1, NEDD9, LIMK2, NASP, 240057_at, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6에 대한 하나 이상의 추가 프로브 세트를 더욱 포함한다.
일부 측면에서, 어레이는 표 2의 핵산마커들에 대한 하나 이상의 추가 프로브 세트를 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 하나 이상의 단백질마커 KNG1, AFM, TTN, MSTP9/MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 및 UBR4에 대한 하나 이상의 검출시약을 포함하는 어레이가 제공된다.
일부 측면에서, 어레이는 하나 이상의 LBP, VASN, ARNTL2, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C9, LCAT, B2M, SHBG 및 C1S에 대한 하나 이상의 추가 검출시약을 더욱 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체의 신장 동종이식 거부반응 평가, 검사 또는 진단방법이 제공되며, 이는 a) 개체의 생물학적 시료에서 표 2에 나열된 최소한 하나 이상의 핵산마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; b) 최소한 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 프로파일과 비교하는 단계; 및 c) 최소한 하나 이상의 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 상향-조절 (증가) 또는 하향-조절 (감소)한지를 결정하는 단계로 구성되며, 최소한 하나 이상의 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 거부반응 상태를 표시한다.
일부 예에서, 본 방법은 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계 및 하나 이상의 임상지표를 대조군과 비교하는 단계를 더욱 포함한다. 대조군은 비??거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체이다. 일부 예에서, 거부반응은 급성 거부반응이다. 일부 예에서, 하나 이상의 핵산마커들은 표 2에 나열된 것으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 핵산마커들을 포함한다. 일부 예에서, 핵산마커들은 표 5에서 나열된 하나 이상의 핵산마커들을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 개체에서 신장 동종이식 거부반응을 평가하거나 진단하기 위한 키트가 제공되며, 키트는 표 2에 나열된 최소한 하나 이상의 마커들을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료 분석법의 지시서로 구성된다. 본 키트는 하나 이상의 마커를 나타내는 유전자, 전사체 또는 서열단위와의 선택적 혼성화를 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 더욱 포함한다. 비-거부반응 컷오프 지표 또는 대조를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
일부 예에서, 키트는 하나 이상의 임상지표를 위한 수치를 획득하고 하나 이상의 임상지표를 대조군과 비교하는 지시서 또는 재료들을 더욱 포함한다. 대조군은 비-거부반응, 동종이식 수령 개체 또는 비-동종이식 수령 개체이다. 일부 예에서, 거부반응은 급성 거부반응이다. 일부 예에서, 하나 이상의 핵산마커들은 표 2에 나열된 것으로부터 선택되는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 핵산마커들을 포함한다. 일부 예에서, 핵산마커들은 표 5에서 나열된 하나 이상의 핵산마커들을 포함한다.
본 발명의 요약은 본 발명의 모든 특성을 기술하지는 않는다. 기타 본 발명의 측면들, 특성들 및 이점들은 하기 특정 예들의 설명을 참조하면 본 분야의 기술자들에게 더욱 분명하여질 것이다.
본 발명 및 기타 특징은 첨부 도면을 참조한 하기 상세한 설명으로부터 더욱 명백하여질 것이다.
도 1은 24개의 핵산 바이오마커들 (표 5에 제시) 패널을 이용한 개체 분류 결과를 도시한 것이다. 개체들은 A) 24-프로브-세트 분류자; B) 가우스 피크 및 하기 시료들을 더욱 명확하게 도시하기 위한 A)의 확대; 을 가진다. A 및 B에 있어서, 급성 거부반응 - 찬 원; 무 거부반응 - 빈 원. C) A 및 B에서와 동일한 데이터 세트는 도 2와 동일한 형식으로 데이터를 보인다. 급성 거부반응 (찬 다이아몬드) 또는 무 거부반응 (찬 원)
도 2는 임상지표 인자들 (혈청 크레아티닌, GFR, BUN)만을 사용한 개체 분류 결과를 보인다. 개체들은 급성 거부반응 (찬 다이아몬드) 또는 무 거부반응 (찬 원)을 가진다.
도 3은 마이크로-어레이 분석에 의해 검출된 BCAR인 및 아닌 개체들 간 프로브-세트 차등 발현. 회색 점들은 LIMMA만으로 동정된 프로브 세트들이고, 검은 점들은 LIMMA, 신뢰 LIMMA 및 SAM에 의해 확인된 프로브 세트들을 나타낸다. 원들은 일차 분류자에 포함된 24개의 프로브 세트들을 표시한다.
도 4는 동일 개체 그룹들 분리를 보이는 주요 성분 분석이며, 모든 그룹들 중심은 명백히 분리된다는 것을 보인다. AR- 급성 거부자; NR- 비-거부자; N- 정상 대조 (20명의 비-수령 개체들). 주요 성분들에 의해 설명되는 백분율 분산은 X 축 (56%) 및 Y 축 (12%)에 제공된다.
도 5는 BCAR에서 차등 발현되는 183개의 프로브 세트 유전자 존재론 및 망 분석. X-축은 -log10 (p-값)을 보인다. A 가장 유의하게 강화된 유전자 존재론 범주 ("생물학적 과정")이며, p-값 증가대로 분류. B 가장 유의하게 강화된 유전자 존재로 범위 (GeneGO MetaCore 생물학적 범주), p-값 증가대로 분류.
도 6은 분류자 성능. (A) 단계적으로 11개의 공통적으로 가장 높은 예측 프로브-세트를 포함하여 보여지는 점차적 분류 정확성. Y-축 - 분류 정확성; X-축, 바이오마커들. (B) BCAR (생검-확인 급성 거부반응)을 가지는 (●, 실선) 및 가지지 않는 (○, 점선) 사례들을 구분하는 11개의 프로브 세트 분류자 성능을 보이는 선형판별분석. (C) 개별 이식전 (기준선) 수치 대비 이식후 분류자 점수 변화. 집단 간 차이는 거부반응 시점에서만 유의하다 (1주) (p=0.0001). Y-축 - 기준선으로부터 차이 (평균 +/- 2 se); X 축 BL- 기준선; W1??W12, 1주 -2주. "START"는 프로브-세트 분류자가 없는 단계적 분석 (step-wise analysis) 개시를 표시한다.
도 7: BCAR 양성 시료의 최소한 2/3 및 BCAR 음성 시료의 2/3에서 발견되는 144개의 단백질 그룹 코드들 모두를 보이는 볼케이노 플롯 (volcano plot). 원 점들은 BCAR인 또는 아닌 개체들 간 유의하게 (p<0.05) 차별 혈장 농도를 보이는 18개의 단백질 그룹을 나타낸다.
도 8은 혈장 단백질 바이오마커에 기반한 BCAR인 또는 아닌 환자들 분리를 보이는 선형판별분석. 실선/ "X" - BCAR 개체들; 점선/ "｜" - 대조 (비-거부자) 개체들.
도 9는 전직 선택 단계적 판별 분석 (SDA)에 의해 선택된 단백질 그룹들의 단계적 포함을 보이는 예측 분류 정확성. Y 축 - 분류 정확성; X 축 - PGC 코드들. "START"는 도 6에서와 같다.
도 10은 표 2에 나열된 신장 동종이식 급성 거부반응 진단에 유용한 핵산 마커들의 표적 서열 (SEQ ID NO: 1-183)을 보인다.
본 발명은 조직 또는 장기 동종이식편, 특히 신장 동종이식편을 수령한 개체의 거부반응 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련되는 유전자 또는 단백질 발현 프로파일 또는 대사산물 발현 프로파일을 제공한다. 유전자 또는 단백질 발현 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 공지되어 있지만, 유전자, T-세포, 단백질 또는 대사산물 마커들 특정 세트의 변경 발현 수준 (대조군 대비 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가 또는 진단에 유용한 새로운 조합을 구성한다.
동종이식편 이란 동일 종의 유전적으로 다른 두 개체들 간 이식된 장기 또는 조직이다. 동종이식을 받은 개체는 "수령자"이고 동종이식편을 제공한 개체는 "제공자"이다. 조직 또는 장기 동종이식편은 달리 '이식체', '이식편', '동종이식편', '제공자 조직' 또는 '제공자 장기' 등의 유사한 용어로 언급될 수 있다. 다른 종들의 두 개체들 간 이식체는 이종이식편이다.
개체들은 동종이식 거부반응 검사 조력 도구로서 문헌에서 잘 알려진 다양한 증상 또는 임상지표들을 보일 수 있다. 동종이식편 생검과 더불어 수많은 임상지표들이 동종이식 거부반응을 가지는 또는 의심되는 개체들을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 이러한 임상지표들에서 얻어진 정보는 임상의사, 내과의사, 수의자 또는 기타 임상분야 진료의사에게 사용되어 거부반응이 발생하는지 및 어느 정도 신속하게 진행되는지 및 개체의 면역억제제 약물치료법의 변경 여부를 결정한다. 표 1에는 임상지표들이 제시된다.
임상지표들 (선택적으로 생검이 수반)은 현재 주류 의료실무에 있어서 임상의사들이 활용할 수 있는 유일한 실무도구이지만, 도 2에서 보이는 바와 같이, 항상 거부자 및 비-거부자 사이를 명확하게 구분하지는 않는다. 극단적으로 좌측 또는 우측 개체들은 거부 또는 비-거부반응 개체들로 옳게 분류되지만, 많은 개체는 중간 범위에 속하고 이들의 상태는 명백하지 않다. 이러한 이유로 동종이식 거부반응을 평가함에 있어서 임상지표들 가치를 부정하지 못하지만, 다른 대안이 없는 경우 적용함에 한계가 있다.
[표 1] 동종이식 거부반응 평가에 잠재적으로 유용한 임상지표들
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
동종이식 거부반응 예측, 진단 및 평가에 있어서 다중요인적 특성으로 인하여 본 분야에서는 동종이식 거부반응의 예측, 진단 또는 평가 중 단 하나의 필요를 충족하는 단일 바이오마커 가능성을 배제한다. 다수의 마커들이 관여되는 전략이 이러한 다중요인적 특성을 감안하여 취하여진다. 달리, 다수의 마커들이 덜 침입적 (예를들면 생검이 불필요한) 임상지표들과 조합되어 평가되어 개체의 동종이식 거부반응 예측, 진단 및/또는 평가가 이루어진다.
동종이식 거부반응의 예측, 진단 및 평가에 사용되는 방법과 관계없이, 장기 또는 조직 기능을 보존하고 더 이상의 유해한 전신 영향을 방지한다는 관점에서 조기 발견이 바람직하다. 동종이식 거부반응에 대한 '치료'는 없으며 단지 개체를 적정하게 면역억제 상태로 유지하거나 또는 일부 경우 거부반응이 너무 빨리 진행되거나 너무 심각하여 면역억제제에 의한 치료가 불가능한 경우 장기를 대체하는 것이다.
다수의 수학적 및/또는 통계적 분석방법을 단백질 또는 폴리펩티드 데이터세트, 대사산물 농도 데이터세트, 또는 핵산 발현 데이터세트에 적용하면 유의한 마커들의 가변 부분집합을 표시할 수 있지만, 어떠한 방법이 '최적' 또는 '더욱 정확한'지에 대한 불확실성에 이른다. 수학적 방법과 무관하게, 중요한 생물적 현상은 데이터세트에 있어서 동일하다. 다수의 수학적 및/또는 통계적 방법을 마이크로어레이에 적용하고 공동 마커들 각각의 통계적으로 유의한 부분집합을 평가함으로써 불확실성은 줄어들고, 임상적으로 연관된 중요한 마커들이 확인될 수 있다.
"마커", "생물학적 마커", "바이오마커"는 상호 교환적으로 사용되며 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 (및 일부 경우 정량 가능한) 분자들 또는 화합물을 언급한다. 동종이식편 이식 후 개체에서 마커는 하향-조절 (감소), 상향-조절 (증가) 또는 실질적으로 변하지 않을 수 있다. 마커는 핵산 (DNA 또는 RNA), 유전자 또는 전사체, 또는 '유전자 마커' (달리 "핵산마커"로 칭함)에 대한 전사체 일부 또는 단편; 폴리펩티드, 펩티드, 단백질, 이형체, 또는 '단백질'마커에 대한 이들의 단편 또는 일부, 또는 선택 분자, 이들의 전구체, 중간체 또는 절단 산물 (예를들면 지방산, 아미노산, 당, 호르몬, 또는 이들의 단편 또는 서브유닛)을 포함할 수 있다. 사용에 있어서, 이들 용어들은, 개체의 생물학적 시료에서, 특정 단백질, 펩티드, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 대사산물 (절대적 용어 또는 다른 시료 또는 표준수치에 대하여 상대적으로) 또는 두 단백질들, 폴리뉴클레오티드들, 펩티드들 또는 대사산물들 수준 비율을 언급할 수 있다. 수준은 농도로써 예를들면 밀리리터당 마이크로그램, 발색 강도로써, 예를들면 특정 빛 파장에서 0.0는 투명 및 1.0은 불투명이며 실험시료는 이에 따라 특정 파장에서 빛 투과 또는 흡수에 기하여 수치를 획득하여; 또는 본 분야에서 공지된 바와 같이 마커를 정량화하는 기타 수단과 관련하여 표기될 수 있다. 일부 예에서, 비율은 단위없는 수치로 표기된다. 또한 "마커"는 비율, 또는 기준선 수치를 차감한 후 알짜 수치를 언급할 수 있다. 또한 마커는 방향성 (증가 또는 감소/상향 또는 하향) 표시와 함께 또는 없이 "폴드-변화"로 나타낼 수 있다. 마커 발현의 증가 또는 감소는 또한 '하향-조절' 또는 '상향-조절' 또는 자극, 생리적 일련의 반응 또는 개체 조건에 대한 반응으로 유사한 증가 또는 감소로 언급될 수 있다. 마커는 제1 생물학적 시료에는 존재하며 제2 생물학적 시료에는 없을 수 있다; 달리 마커는 양쪽에 통계적으로 유의한 차이에서 존재할 수 있다. 생물학적 시료에서 마커의 존재, 부존재 또는 상대수준 표현은 마커 정량화 또는 평가를 위하여 적용되는 분석 특성에 따라 다르며 이러한 표현은 본 분야의 기술자에게 익숙하다.
동종이식을 거부하는 개체의 발현수준이 무-거부반응 개체에서 취한 시료와 차이가 있을 때 마커는 차등 발현된다고 기술될 수 있다. 차등 발현된 마커는 정상 또는 대조 시료 발현수준과 비교하여 과잉발현 또는 과소 발현될 수 있다.
"프로파일"은 하나 이상의 마커들 및 이들의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다 (하나 이상의 대조군에 비하여)에 관한 하나의 세트이다. 예를들면, 대사산물 프로파일은 대사산물 마커들의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다성에 대한 데이터세트이다. 유전자 또는 핵산 프로파일은 발현된 핵산 (예를들면 전사체, mRNA, EST 등)의 존재, 부존재, 상대수준 또는 과다성에 대한 데이터세트이다. 프로파일은 달리 발현 프로파일로 언급될 수 있다.
생물학적 시료에서 마커의 증가 또는 감소 또는 정량화는, 특정 서열, 폴리펩티드 또는 단백질, 대사산물 등을 포함하는 유전자 산물 또는 전사체, 또는 핵산분자의 존재 및/또는 상대적 과다를 측정하기 위하여 본 분야에서 공지된 임의의 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 마커 수준은 절대수치 또는 기준선에 대하여, 및 컷오프 지표 (예를들면 비-거부반응 컷오프 지표)와 비교된 개체 마커 수준으로 결정될 수 있다. 달리 마커의 상대 과다는 대조군에 대하여 결정될 수 있다. 대조군은 임상적으로 정상인 개체 (예를들면 동종이식편을 받은 않은 개체) 또는 거부반응이 없거나 보이지 않는 동종이식 수령자일 수 있다.
일부 예에서, 대조군은 자가 대조군, 예를들면 동종이식편 이식 전에 개체에서 획득된 시료 또는 프로파일일 수 있다. 일부 예에서, 하나의 시점 (이식 전, 후 또는 전 및 후)에서 획득된 프로파일은 동일 개체에서 이전에 획득된 하나 이상의 프로파일과 비교될 수 있다. 경시에 따라 동일 개체에서 동일 생물학적 시료를 반복적으로 채취하여, 경시에 따른 마커 수준 또는 발현을 보이는 조성물 프로파일이 제공될 수 있다. 또한 연속 시료들이 개체에서 얻어지고 각각에 대한 프로파일이 획득되어, 경시에 따른 하나 이상의 마커들의 증가 또는 감소 경로를 알 수 있다. 예를들면 초기 시료 또는 시료들이 이식 전에 획득되고, 연속 시료가 주마다, 2주마다, 달마다, 2달마다 또는 기타 적합한 정기적 구간에서 얻어지고 이전에 취한 시료들의 프로파일과 비교된다. 또한 시료들은 약물 과정 예를들면 면역억제제 과정 이전, 동안 및 이후에 획득될 수 있다.
특정 마커 또는 마커들 세트를 검출 및/또는 정량화하는 기술, 방법, 도구, 알고리즘, 시약 및 기타 필요한 분석 특성들은 가변적이다. 마커 또는 마커들 세트를 검출하는데 사용되는 특정 방법이 중요한 것이 아니라, 중요한 것은 어떠한 마커들을 검색하는 것이다. 문헌에서 고려된 바와 같이, 상당한 가변성이 존재한다. 검색될 또는 정량화될 마커 또는 마커들 세트가 동정되면, 적당한 시약이 있다면 임의의 여러 기법들이 적용될 수 있다. 본 분야의 기술자는, 마커들 세트가 동정되면, 본원에서 개시된 방법을 수행하기 위하여, 적당한 분석법 (예를들면, 핵산 마커들을 위한 PCR 기반 또는 마이크로어레이 기반의 분석법, ELISA, 단백질 또는 항체 마이크로어레이 또는 유사한 면역학적 검정, 또는 일부 예에서, iTRAQ, iCAT 또는 SELDI 단백질 질량 스펙트럼 기반의 방법의 사용)을 선택할 수 있다.
본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가, 예측 또는 진단과 관련되는 핵산 발현 프로파일 및 단백질 발현 프로파일을 제공한다. 유전자 또는 T-세포 또는 단백질 발현 프로파일에서 여러 요소들은 개별적으로 공지되어 있지만, 유전자 또는 단백질 마커들 특정 세트의 변경 발현 수준 (대조군 대비 증가 또는 감소)의 특정 조합은 개체의 동종이식 거부반응 평가 또는 진단에 유용한 새로운 조합을 구성한다.
183개의 프로브 세트는 발현 핵산을 특이적으로 (혼성화 및 표지 검출에 의해) 검출하고 발현 수준을 정량화할 수 있었다. 183개의 개별 발현 전사체 또는 핵산을 나타내는 이들 183개 세트 (표 2에 나열) 중에서, 부분적인 24개의 프로브 세트 (표 5)는 비-거부반응 이식 (NR) 대비 AR 시료에서 통계적으로 유의한 폴드 변화를 보였다. 도 10은 표 2 및 5에 나열된 프로브 세트들로 동정된 핵산 일부의 핵산서열정보를 제공한다. 도 10 (SEQ ID NO: 1-183)의 서열들은 표시된 유전자에 특이적 혼성화를 위한 프로브로 (예를들면, 마이크로어레이, 블롯, 또는 기타 혼성화 기반 검정에서), 또는 표시된 유전자의 특이적 증폭을 위한 프라이머 또는 프라이머들 설계에 (예를들면, PCR, RT-PCR 또는 기타 증폭-기판 검정에 의한) 유용할 수 있다.
멀티플렉스 iTRAQ 방법을 사용하여 18개의 유의한 단백질 그룹 코드들 (표 7)은 AR 및 NR 개체에서 차등적 상대 수준 (참조 시료 대비)을 가진다는 것을 알았다. 이들 단백질 그룹 코드는 하나 이상의 TTN, KNG1, LBP, VASN, ARNTL2, AFM, MSTP9, MST1, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C2, MBL2, SERPINA10, C9, LCAT, B2M, SHBG, C1S, UBR4 및 F9에 의해 코딩되는 단백질 마커들을 포함하였다. 하기되는 바와 같이, 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열 및 이들 폴리펩티드 아미노산서열에 대한 특정 참조를 제공하는 기탁번호가 본원에 제공된다. 표기된 단백질 그룹 코드의 각 멤버에 대한 유일 식별자 (국제 단백질 인덱스 기탁번호)가 표 7에 제시된다. 하나 이상의 이들 서열 일부를 가지는 폴리펩티드는 하나 이상의 단백질 마커들을 특이적으로 검출하는 항체 제조에 유용하거나, 달리 서열은 트립신 분해 및 질량 스펙트럼 분석되고 형성된 펩티드 절편을 서열과 비교하거나 이러한 서열을 가지는 데이터베이스와 비교하여 시료에서 하나 이상의 단백질 마커들을 동정하기 위하여 사용될 수 있다.
핵산의 검출 또는 결정, 및 일부 경우 정량화는 본 분야에서 공지된 재조합 DNA기술, 제한적이지는 않지만 예를들면 서열-특이적 혼성화, 중합효소 연쇄반응 (PCR), RT-PCR, 마이크로어레이 등을 이용한 다수의 방법 또는 분석 중 임의의 하나에 의해 달성될 수 있다. 이러한 검정은 서열-특이적 혼성화, 프라이머 신장, 또는 침입성 절단을 포함한다. 또한 각 유형의 반응 (예를들면 형광, 발광, 질량측량, 전기영동 등) 산물을 분석/검출하는 다수의 방법들이 있다. 또한, 반응은 액상에서 또는 유리 슬라이드, 칩, 비드 등과 같은 고체 지지체에서 일어날 수 있다.
마이크로어레이 또는 바이오칩 사용을 위한 프로브 설계 및 선택방법 또는 PCR-기반 검정에 사용되는 프라이머 선택 또는 설계방법은 본 분야에서 공지되어 있다. 마커 또는 마커들이 동정되고 예를들면 이러한 서열을 가지는 데이터베이스에 질의하거나 적당한 서열을 제공하여 (예를들면 본원에 제공된 서열목록) 핵산 서열이 결정되면, 본 분야의 기술자는 이러한 정보를 이용하여 적당한 프로브 또는 프라이머를 선택하여 선택된 분석법을 수행할 수 있다.
본 분야의 기술자에게 공지된 재조합 DNA기술의 일반원리를 제공하는 표준 참조 문서는 예를들면, Ausubel 등, Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1998 및 2001 증보판); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989); Kaufman 등, Eds., Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)을 포함한다.
단백질, 단백질 복합체 또는 단백질 마커는 본 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 특히 검정 및/또는 정량화되며 이는 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 면역 또는 항체-기반 기법들로는 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA), 웨스턴 블로팅 (western blotting) 면역형광법 (immunofluorescence), 마이크로어레이, 크로마토그래피 기술(즉, 항체친화성 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)), 유동세포계수, 면역침강법 등을 포함한다. 이러한 방법은 관심있는 단백질 또는 단백질 복합체와 결합되는 특정 항원결정부(epitope) 또는 항원결정부 조합에 대한 항체 또는 항체들의 특이성에 기반한다. 비-면역적 방법으로는 단백질 또는 단백질 복합체 자체의 물성에 기반하는 것을 포함한다. 이러한 방법들의 예로는 전기영동, 크로마토그래피 기술 (예를들면, 고성능액체크로마토그래피 (HPLC), 신속단백질액체크로마토그래피 (FPLC), 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피 등), 질량 스펙트럼, 서열화, 단백질분해효소의 분해, 등을 포함한다. 이러한 방법은 질량, 전하, 소수성 또는 친수성에 기반하며, 이는 단백질 또는 단백질 혼합체의 아미노산 보체 (complement) 및 아미노산의 특정 서열에서 유래한다. 예시적 방법은 예를들면 PCT 공개 WO 2004/019000, WO 2000/00208, US 6670194에 기재된 것을 포함한다. 면역 및 비-면역적 방법은 조합되어 단백질 또는 단백질 복합체를 동정 또는 특정화할 수 있다. 또한, 각 유형의 반응 (예를들면 형광, 발광, 질량측량, 전기영동 등) 산물을 분석/검출하는 다수의 방법들이 있다. 또한, 반응은 액상에서 또는 유리 슬라이드, 칩, 비드 등과 같은 고체 지지체에서 일어날 수 있다.
단백질 또는 항체 어레이 사용을 위한 항체 제조방법 또는 기타 면역에 기반한 어레이 사용을 위한 항체 제조방법은 본 분야에서 공지되어있다. 마커 또는 마커들이 동정되고 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산서열이, 데이터베이스 질의 또는 적당한 서열이 제공되어 (예를들면 본원에 제공된 서열목록) 확인되면, 본 분야의 기술자는 이러한 정보를 이용하여 하나 이상의 적당한 항체를 준비하고 선택된 분석법을 수행할 수 있다.
바이오마커에 대한 단일클론 항체 제조와 관련하여, 항체분자들을 제조할 수 있는 임의 기술들이 사용될 수 있다. 이러한 기술로는 제한적이지는 않지만, 혼성세포 또는 트리오마 (예를들면, Kohler 및 Milstein, 1975, Nature 256:495-497; Gustafsson 등., 1991, Hum. Antibodies Hybridomas 2:26-32), 인간 B-세포 혼성세포 또는 EBV 혼성세포 (Kozbor 등., 1983, Immunology Today 4:72;; Cole 등., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함한다. 인간 또는 인간화 항체가 사용되고 인간 혼성세포들을 이용하여(Cote 등., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026- 2030) 또는 생체 외에서 인간 B 세포를 EBV 바이러스로 형질전환 (Cole 등., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)으로 획득될 수 있다. 특정 바이오마커에 특이적인 생쥐 항체분자를 코딩하는 서열을 적당한 생물학적 활성의 인간 항체분자 코딩 서열과 함께 이어 맞추는 (splicing) "키메릭 항체" 제조용으로 개발된 기술 (Morrison 등, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851- 6855; Neuberger 등, 1984, Nature 312:604-608; Takeda 등, 1985, Nature 314:452-454)이 사용될 수 있고; 이러한 항체는 본 발명의 범위 내에 있다. 단일사슬 항체 제조용으로 기술된 기법 (미국특허 4,946,778)이 바이오마커-특이적 항체 제조에 적용될 수 있다. 본 발명의 추가적인 예로는 바이오마커 단백질에 특이성을 가지는 단일클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 동정할 수 있는 Fab 발현 라이브러리 구축 (Huse 등, 1989, Science 246:1275-1281)을 위한 기술을 이용한다. 비-인간 항체는 공지방법 (예를들면, 미국특허 5,225,539)에 의해 "인간화"될 수 있다.
바이오마커의 전유전물질형을 함유하는 항체단편은 본 분야에서 공지된 기술로 생성될 수 있다. 예를들면, 이러한 단편은 제한적이지는 않지만, 항체분자의 펩신 소화에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화물 다리를 환원하여 (reducing) 생성될 수 있는 Fab1 단편; 항체분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편; 및 Fv 단편을 포함한다. 합성 항체 예를들면 화학합성에 의해 제조되는 항체는 본 발명에서 유용할 수 있다.
본원에서 기술되고 관련 분야 기술자에게 공지된 표준참조문헌은 면역 및 비-면역기법들, 이들의 특정 시료 유형, 항체, 단백질 또는 분해물에 대한 적합성이 기재된다. 본 분야의 기술자들에게 공지된 면역학 및 면역 방법을 이용한 검정을 개시하는 표준참조문헌들은 예를들면 Harlow 및 Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2판., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1999); Harlow 및 Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Coligan 등. eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, NY (1992-2006); 및 Roitt 등., Immunology, 3판, Mosby-Year Book Europe Limited, London (1993)을 포함한다. 본 분야의 기술자에게 공지된 펩티드 합성 기술 및 방법의 일반원리를 설명한 표준참조문헌은 Chan 등., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood 등., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3판, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001 ; 및 Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 John Wiley & Sons, NY, 1994)을 포함한다.
개체의 거부반응 상태는 "거부자" (R 또는 "급성 거부자" 또는 AR) 또는 "비-거부자" (NR)로 분류되고 마커들 농도 및 비-거부자 컷오프 지표를 비교하여 결정된다. "비-거부자 컷오프 지표"는 이를 벗어나거나 이보다 외부에 있으면 개체가 거부자 상태를 가지는 것으로 분류되는 수치 또는 점수이다. 비-거부자 컷오프 지표는 달리 '대조군 수치', '대조군 지표' 또는 단순히 '대조군'으로 언급될 수 있다. 비-거부자 컷오프-지표는 대조 개체군에서의 개별 마커들 농도이며 측정되는 각 마커들에 대하여 개별적으로 고려될 수 있다; 달리 비-거부자 컷오프 지표는 마커들 농도 조합일 수 있고, 진단을 위하여 제공되는 개체 시료에서 마커들 농도 조합과 비교될 수 있다. 대조 개체군은 정상 또는 건강한 대조군일 수 있거나 동종이식 거부반응을 가지지 않은 또는 거부반응이 없는 동종이식 수령군일 수 있다. 대조군 또는 대조군 풀은 예를들면 고정값으로 나타나는 고정치 또는 누적치일 수 있고, 이를 획득하기 위하여 사용된 시료 군은 장소마다 또는 경시에 따라 가변될 수 있고 추가 데이터 포인트를 포함한다. 예를들면, 중앙 건강정보시스템과 같은 중앙 데이터 보관소는 여러 장소들 (병원, 임상실험실, 등)에서 얻어진 데이터를 수신하고 보관하며 이러한 누적 데이터세트를 단일 병원에서, 공동체 치료실에서 최종 사용자가 접근하고 (즉, 개별 진료의사, 의료 치료실 또는 센터 등) 발명의 방법 적용하기 위하여 제공한다. 일부 예에서, 컷오프 지표는 유전자 컷오프 지표 (개체의 유전자 발현 프로파일용), 단백질 컷오프 지표 (개체의 단백질 프로파일용) 등으로 더욱 특징될 수 있다.
"생물학적 시료"는 개략적으로 개체의 체액 또는 조직 또는 장기를 언급한다. 예를들면, 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 소변 또는 침과 같은 체액일 수 있다. 비-액상 조직시료와 같은 조직 또는 장기 시료는 분해, 추출 또는 달리 액상화될 수 있고-이러한 조직 또는 장기의 예시로는 배양세포, 혈구, 피부, 간, 심장, 신장, 췌장, 랑게르한스섬, 골수, 혈액, 혈관, 심판막, 폐, 장, 창자, 비장, 방광, 음경, 안면, 손, 뼈, 근육, 지방, 각막 등을 포함한다. 다수의 생물학적 시료들은 임의로 한번에 수집될 수 있다. 생물학적 시료 또는 시료들은 동종이식편 이식 전, 이식 시점 또는 이식 이후 임의시점을 포함한 임의 시간에 개체로부터 취할 수 있다. 생물학적 시료는 "핵산" 예를들면 단일 또는 이중-사슬 형태인, '디옥시리보핵산' (또는 'DNA') 또는 리보핵산(또는 RNA 또는 'mRNA'), 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산은 '전사체'로 언급될 수 있다.
본원에 기술된 방법은 개체가 동종이식편 수령 전 또는 수령 이후 임의 시간에 적용되어 동종이식 거부반응 여부를 결정할 수 있다. 예를들면 동종이식 수령 이후 임의 시점에 개체에서 얻은 시료는 평가되어 표 2 또는 7에 나열된 하나 이상의 핵산마커 또는 단백질마커의 수준 변경 (증가 또는 감소) 존재가 평가된다. 일부 경우, 시료는 동종이식편 수령 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 그 이상의 시간 후 개체에서 얻어진다. 일부 경우, 시료는 동종이식편 수령 후 하루 이상 (예를들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 그 이상의 일수) 이후 개체에서 얻어진다. 일부 경우, 시료는 동종이식편 수령 후 2 내지 7일 (예를들면 5 내지 7일) 후 얻어지고 표 2 또는 7에 나열된 핵산마커 또는 단백질마커 존재가 평가된다.
용어 "개체" 또는 "환자"는 대체로 포유동물 및 기타 인간 및 기타 영장류를 포함한 기타 동물, 반려동물, 동물원 및 농장동물, 제한적이지는 않지만 고양이, 개, 설치류, 쥐, 생쥐, 햄스터, 토끼, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 가금류 등을 포함한다. 동종이식 거부반응에 대한 예측, 평가 또는 진단 검사를 받으려는 또는 받은 개체를 포함한다. 개체는 기타 방법 예를들면 본원에 기재된 방법 또는 현재 임상적 실무방법으로 이전에 평가 또는 진단을 받았을 수 있거나 일반 군 (대조개체)의 일부에서 선택될 수 있다.
대조군 대비 개체에서 마커의 폴드-변화는 최소한 0.1 , 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0 또는 이상이거나 이들 사이 수치일 수 있다. 폴드 변화는 대조값 대비 감소 또는 증가로 나타난다. 하나 이상은 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 이상을 포함한다.
"하향-조절" 또는 "하향-조절된" 용어는 상호교환적으로 사용되며 마커 예를들면 유전자, 핵산, 대사산물, 전사체, 단백질 또는 폴리펩티드 수준의 감소를 의미한다. "상향-조절" 또는 "상향-조절된" 용어는 상호교환적으로 사용되며 마커 예를들면 유전자, 핵산, 대사산물, 전사체, 단백질 또는 폴리펩티드 수준의 증가를 의미한다. 또한 신호전달 또는 대사경로와 같은 경로는 상향- 또는 하향-조절된다.
임의 방법 (유전자 또는 단백질 또는 이의 조합)에 의해 개체가 급성 거부자 또는 위험성으로 확인되면, 동종이식에 대한 개체 면역반응을 변경하기 위한 치료적 수단이 구현될 수 있다. 개체는 더욱 자주 또는 더욱 민감한 검사방법을 사용하여 추가 임상지표 검사를 받을 수 있다. 또한 개체는 면역반응 감소 또는 증가를 위하여 면역억제제를 투여 받을 수 있다. 동종이식 거부반응을 방지하기 위하여 개체 면역반응이 너무 억제될 필요가 있는 경우에도, 기회감염 방지를 위한 적당한 수준의 면역기능도 필요하다. 개체에 투여 가능한 다양한 약물이 공지된다: 예를들면, 참고 Goodman 및 Gilman의 The Pharmacological Basis of Therapeutics 11판. Ch 52, pp 1405-1431 및 참고문헌; LL Brunton, JS Lazo, KL Parker 편집자. 본 분야의 기술자에게 알려진 의과생리학 및 약리학의 일반원리를 제공하는 표준참고문헌들은: Fauci 등. , Eds., Harrison 's Principles Of Internal Medicine, 14판, McGraw-Hill Companies, Inc. (1998)을 포함한다. 기타 예방적 및 치료적 전략은 의료문헌에서 검토된다- 참고, 예를들면 Djamali 등., 2006. Clin J Am Soc Nephrol 1:623-630 참조.
유전자 핵산 발현 프로파일 형성
본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 개체에서 동종이식 급성 거부반응 진단방법은, 1) 개체의 생물학적 시료에서, 표 2에 제시된 군에서 선택되는 최소한 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 최소한 하나 이상의 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 대조 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 최소한 하나 이상의 마커들 발현 수준이 대조 프로파일에 비하여 상향-조절 (증가) 또는 하향-조절 (감소)되는지를 결정하는 단계로 구성되며, 최소한 하나 이상의 마커들의 상향-조절 또는 하향-조절은 거부반응 상태를 표시한다.
본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 또한 본 발명은, 개체에서 신장 동종이식 거부반응 예측, 평가 또는 진단방법을 제공하며, 이는, 1) 표 2에 제시된 군에서 선택되는 최소한 하나 이상의 마커들의 증가 또는 감소를 측정하는 단계; 및 2) 개체의 '거부반응 상태'를 결정하는 단계로 구성되며, 개체의 '거부반응 상태' 결정은 개체의 마커 발현 프로파일 및 대조군 마커 발현 프로파일을 대비하여 이루어진다.
본원에서 사용되는 "유전자 발현 데이터", "유전자 발현 프로파일", 또는 "마커 발현 프로파일"이라는 용어들은 생물학적 시료에 있는 유전자 또는 유전자 세트의 상대적 또는 절대적 발현 수준에 관한 정보를 언급한다. 유전자 발현 수준은 유전자에 의해 코딩되는 예를들면 mRNA와 같은 RNA 수준에 기반하여 결정된다. 달리, 발현 수준은 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 단편 수준에 기반하여 결정된다.
본원에서 사용되는 '폴리뉴클레오티드', '올리고뉴클레오티드', '핵산' 또는 '뉴클레오티드 고분자'는 센스 또는 안티센스 사슬인 RNA, DNA 또는 RNA 및 DNA을 포함한 핵산의 합성 또는 혼합 고분자를 포함하며, 본 분야의 기술자에게 쉽게 이해되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변경될 수 있거나 비-천연 또는 유도 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은, 예를들면 표지화, 메틸화, 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드를 유사체로 치환, 뉴클레오티드 사이 변경 예를들면 비전하 연결 (예를들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등), 전하 연결(예를들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 측쇄 잔기 (moieties) (예를들면, 폴리펩티드), 및 변경 연결 (예를들면, 알파 아노머 폴리뉴클레오티드 등)을 포함한다. 또한 수소결합 또는 기타 화학작용에 의해 지정된 서열과 결합될 수 있는 능력에 있어서 폴리뉴클레오티드와 유사한 합성분자들을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 다양한 길이의 핵산이며 특정 핵산 검출 및/또는 증폭을 위한 프로브, 프라이머 및 마이크로어레이 (어레이) 제조에 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA 또는 기타 예를들면 US 5,948,902에서 기재된 폴리뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 이러한 DNA 또는 RNA 사슬은 불용성 지지체에 연결될 수 있는 성장사슬에 활성 모노머의 서열적 부가 (5'-3' 또는 3'-5')에 의해 합성될 수 있다. 연속적인 개별적 용도 또는 불용성 지지체 일부로 예를들면 어레이에서 (Lashkari DA. 등. PNAS (1995) 92(17):7912-5; McGall G. 등. PNAS (1996) 93(24):13555-60; Albert TJ. 등. Nucleic Acid Res.(2003) 31(7):e35; Gao X. 등. Biopolymers (2004) 73(5):579-96; 및 Moorcroft MJ. 등. Nucleic Acid Res.(2005) 33(8):e75 및 이의 참고) 올리고뉴클레오티드를 합성하는 다수의 방법들이 본 분야에 공지된다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 사용되는 방법에 의존되는 다양한 조건들 하에서 활성 및 보호된 모노머의 단계적 부가를 통하여 합성된다. 연속적으로, 특정 보호기는 제거되어 신장이 가능하고 연속하여 및 합성이 완료되면 모든 보호기는 제거되고 필요하다면 완료된 사슬의 정제를 위하여 올리고뉴클레오티드는 고상 지지체에서 분리된다.
"유전자"는 특정 염색체의 특정 위치에 있는 뉴클레오티드의 서열이며 특정 기능성 산물을 코딩하며 코딩 영역에 근접한 비-해독 및 비-전사 서열 (5' 및 3' 에서 코딩서열) 및 엑손 및/또는 인트론을 포함한다. 이러한 비-코딩 서열은 서열의 전사 및 해독 또는 예를들면 인트론 스플라이싱에 필요한 조절서열을 가지며, 또는 관심있는 돌연변이 발생이 이상으로 기여하는 임의 기능을 가질 수 있다. 또한 유전자는 하나 이상의 프로모터, 증폭자, 결합부위 전사인자, 종결신호 또는 기타 조절요소를 포함할 수 있다.
용어 "마이크로어레이", "어레이" 또는 "칩"은 정의된 위치에서 기질 표면에 결합된 다수의 정의된 핵산 프로브를 가진다. 기질은 고체 기질일 수 있다. 본 분야에서 마이크로어레이는 미국특허번호 5,143,854 (Pirrung); Fodor에게 부여된 5,424,186, 5,445,934, 5,744,305 및 5,800,992, Winkler에게 부여된 5,677,195 및 6,040,193, 및 Fodor 등. 1991(Science, 251:767-777)에 일반적으로 기술된다. 이들 각각의 참고문언들은 본원에 전체가 참조로서 포함된다.
"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드의 정해진 방식 (서열-특이적)으로 수소결합에 의한 - 또는 '와트슨-클릭' 염기쌍이라고 칭하는- 안정 복합체를 형성하기 위하여 상호 작용하는 반응을 포함한다. 후그스틴 염기쌍을 포함한 비-전형적인 수소결합을 통한 다양한 염기쌍들도 가능하다. 일부 열역학적, 이온 또는 pH 조건하에서 특히 리보핵산의 삼중나선들도 가능하다. 이들 및 기타 가변성 수소결합 또는 염기-쌍들은 본 분야에 공지되며 예를들면 Lehninger - Principles of Biochemistry, 3 판 (Nelson 및 Cox, eds. Worth Publishers, New York.)에 기재되고, 참조로 본원에 포함된다.
혼성화 반응은 차별된 "엄격" ("stringency")조건에서 수행된다. 혼성화 반응의 엄격성은 임의 두 핵산분자들이 서로 혼성화되기 쉽거나 어려운 것을 결정한다. 예를들면 혼성화가 일어나는 온도를 높이고, 혼성화가 일어나는 이온 (염)농도를 낮추고, 또는 이들을 조합하여 엄격성은 증가될 수 있다. 엄격 조건하에서 최소한 60%, 65%, 70%, 75% 또는 이상의 상동성 핵산분자들은 상호 혼성화로 존재하지만, 낮은 상동성의 분자들은 일반적으로 혼성 상태로 잔존하지 않는다. 엄격 혼성화 조건들의 예로는 약 44-45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 이어 50℃, 55℃, 60℃, 65℃ 또는 이들 사이 온도에서 0.2xSSC, 0.1 % SDS의 1회 이상의 세척 조건에서의 혼성화를 포함한다.
두 핵산들 간 혼성화는 역평행 배열로 일어나며 이는 '아닐링'이라고 칭하고, 짝지은 핵산들은 상보적이라 기술된다. 이중-나선 폴리뉴클레오티드는, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 나선들 사이 혼성화가 일어나면, "상보"적이다. 하나의 폴리뉴클레오티드가 다른 것과 상보적인 정도는 상동성이라 칭하며 이는 일반적으로 수용되는 염기-쌍 규칙에 따라 상호 수소결합이 예상되는 반대 나선들의 염기 비율로 정량화된다.
일반적으로, 서열-특이적 혼성화는 혼성화 프로브를 포함하며, 이는 정의된 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 이러한 프로브는 단지 하나 또는 소수의 뉴클레오티드에서의 가변 서열들을 차별하도록 설계될 수 있어 높은 특이성을 제공한다. 검출 및 서열 차별화와 연관된 전략은 "분자 비콘"을 이용하는 것이며, 이에 따라 혼성화 프로브 (분자비콘)은 3' 및/또는 5' 보고자 및 켄처 분자들 및 3' 및 5' 서열을 가지며 이는 상보적이어서 프로브가 헤어핀 루프를 형성할 삽입서열에 대한 적당한 결합표적을 가지지 않는다. 헤어핀 루프는 보고자 및 켄처를 가까이 인접하게 유지하여 형광체 (보고자)를 켄칭하고 형광을 감소시킨다. 그러나, 분자비콘이 표적에 혼성화될 때, 형광체 및 켄처는 충분히 떨어져 있어 형광체로부터 형광 방사가 가능해진다.
혼성화에 사용하는 프로브는 이중-나선 DNA, 단일-나선 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드 핵산을 포함한다. 특정 프로브와 혼성화하는 마커들 동정을 위한 혼성화 조건 및 방법은 본 분야에, 예를들면 Brown, T. "Hybridization Analysis of DNA Blots" in Current Protocols in Molecular Biology. FM Ausubel 등, editors. Wiley & Sons, 2003. doi: 10.1002/0471142727.mb0210s21에 기술된다. 본 발명에 따라 사용하는 적당한 혼성화 프로브는 길이가 약 10 내지 약 400 뉴클레오티드, 달리 약 20 내지 약 200 뉴클레오티드, 또는 약 30 내지 약 100 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 변형 핵산을 포함한다.
특정 서열은 프라이머 또는 프로브와의 이후 검출되는 혼성화로 동정된다.
"프라이머"는 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 일반적으로 자유 3'-OH 기를 가지며 이는 관심있는 표적과의 혼성화에 의해 시료에 있는 표적 또는 "템플렛"과 결합하여 표적에 상보적인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진시킨다. "중합효소연쇄반응" ("PCR")은 "업스트림" 및 "다운스트림" 프라이머를 포함한 "프라이머 쌍" 또는 "프라이머 세트", 및 중합촉매 예를들면 DNA 중합효소, 및 전형적으로 열-안정 중합효소를 이용한 표적 폴리뉴클레오티드 복제본 제조 반응이다. PCR 방법은 본 분야에 공지되고 예를들면 Beverly, SM. Enzymatic Amplification of RNA by PCR (RT-PCR) in Current Protocols in Molecular Biology. FM Ausubel 등, editors. Wiley & Sons, 2003. doi: 10.1002/0471142727.mbl505s56에 교시된다 복제본 합성은 예를들면 형광분자, 바이오틴 또는 방사성 분자와 같은 표지 또는 태그를 가지는 뉴클레오티드 결합을 포함한다. 이후 복제본은 이들 태그를 통하여 종래 방법을 적용하여 검출될 수 있다.
또한 프라이머는 서던 또는 노던 블롯 분석과 같은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 수 있다 (참고, 예를들면 Sambrook, J., Fritsh, E. F., 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
본원에서 사용되는 "프로브 세트"(또는 때로는 '프라이머 세트')는 시료에서 핵산분자 (핵산마커) 존재를 검출하기 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드 군을 의미하며, 검출은 정량 또는 반-정량적일 수 있다. 검출은 예를들면 PCR 및 RT-PCR에서와 같은 증폭을 통하여, 또는 마이크로어레이에서와 같은 혼성화를 통하여, 또는 단일 또는 이중 나선 핵산의 선택적 효소분해에 기반하는 분석에서와 같이 선택적 분해 또는 보호를 통하여 이루어질 수 있다. 프로브 세트에서 프로브들은 하나 이상의 형광, 방사성 또는 기타 검출 잔기 (효소 포함)으로 표지화된다. 프로브는 원하는 유전자를 선택적으로 검출하기에 충분한 크기를 가질 수 있고, 일반적으로 약 15 내지 약 25 또는 약 30 뉴클레오티드 범위의 크기는 충분한 사이즈이다. 프로브 세트는 예를들면 다중 PCR용과 같이 용액에 있을 수 있다. 달리, 프로브 세트는 어레이 또는 마이크로어레이에서와 같이 고체 표면에 고착될 수 있다. 프로브 세트는 전장 유전자, 전량 유전자의 스플라이스-이형체, 전사유닛, 또는 유전자 또는 전사유닛의 단편의 발현 수준을 검출할 수 있다. 프로브 세트는 시료에 존재하는 핵산마커를 동정한다.
본 발명의 일부 예에서, 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, SFRS16, 1558448_a_at, CAMKK2, NFYC, NCOA3, LMAN2, PGS1, NEDD9, 237442_at, FKSG49/LOC730444, LIMK2, UNB, NASP, PRO1073, 240057_at, ITGAX, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6로 구성된 핵산 마커들 세트에 의해 발현되는 핵산을 검출하기 위한 프로브 세트가 제공된다. 이러한 프로브 세트는 개체의 거부반응 상태를 결정함에 유용하다. 프로브 세트는 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, SFRS16, 1558448_a_at, CAMKK2, NFYC, NCOA3, LMAN2, PGS1, NEDD9, 237442_at, FKSG49/LOC730444, LIMK2, UNB, NASP, PRO1073, 240057_at, ITGAX, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6에 상응되는 핵산 서열의 특이적 증폭 (예를들면 PCR 또는 RT-PCR)용 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 프로브 세트는 마이크로어레이 일부이다. 본 발명의 다른 예에서, 핵산마커들은 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX을 포함한다. 마커들은 더욱 상세하게 하기된다.
서열을 구분하고 검출하는 기타 여러 방법이 본 분야에서 공지되어 있다는 것을 이해하여야 하며 이하 더욱 상세하게 설명된다. 또한 어레이 프라이머 신장 미니 서열화, 태그 마이크로어레이 및 서열-특이적 신장과 같은 반응들은 마이크로어레이에서 수행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 어레이 기반의 서열검사 플랫폼은 미소구체 기반의 태그-잇 고효율 어레이 (tag-it high throughput array) (Bortolin S. 등. 2004 Clinical Chemistry 50: 2028-36)이다. 본 방법은 PCR을 통하여 유전자 DNA 증폭 후 보편적 태그 프라이머로 서열-특이적 프라이머 신장이 이루어진다. 이후 산물은 태그-잇 어레이에서 분류되고 Luminex xMAP 시스템으로 검출된다.
본 분야의 기술자들은 서열에서 뉴클레오티드의 수치적 지정은 특정 서열에 대하여 상대적이라는 것을 이해할 것이다. 또한 동일영역은 서열이 수치화되고 선택되는 것에 따라 다른 수치가 지정될 수 있다. 또한 삽입 또는 결실과 같은 서열 변이는 상대 위치 및 이어 돌연변이 자리 또는 주위에 있는 특정 뉴클레오티드의 수치적 지정을 바꿀 수 있다. 예를들면, 기탁번호 AC124566, AF211864, AI035495, AI326085, AK089167, AK131133, AK155816, AK170432, BC042840 및 BC057200로 표시되는 서열들은 모두 인간 ITGAX 뉴클레오티드 서열을 나타내지만, 일부 서열 차이, 및 이들 사이 수치 차이가 있을 수 있다. 다른 예로는, 기탁번호 NP_115925, NP_444509, P20702, NP_776169, NP_000878, NP_001706, NP_04223, AAA59180, AAA51620로 표시되는 서열은 모두 인간 ITGAX 폴리펩티드 서열이지만 일부 서열 차이, 및 이들 사이 수치 차이가 있을 수 있다. 기타 핵산마커들은 이형체 (variant)를 보일 수 있고 하기된다.
상기 유전자를 포함한 관심있는 임의 유전자 발현에 대한 특이적 검출을 위한 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트 선택 및/또는 설계는, 관심있는 유전자의 하나 이상의 핵산서열이 제공될 때, 관련 분야의 기술자 능력 내에 있는 것이다. 또한, 임의 여러 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트 또는 다수의 프로브, 프라이머 또는 프로브 세트가 사용되어 관심있는 유전자를 검출할 수 있고, 예를들면 어레이는 단일 유전자 전사체에 대한 다중 프로브를 포함하며 - 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 측면은 예시된 임의 특정 프로브에 제한되지 않는다.
서열 상동성 또는 서열 유사성은 DNASIS (예를들면, 제한적이지는 않지만, 하기 인자들을 이용: GAP 패널티 5, 최상 대각선 # 5, 고정 GAP 패널티10, k-튜플 2, 플로팅 갭 10, 및 윈도우 사이즈 5)에서 제공되는 바와 같이, (DNA 또는 RNA 서열, 또는 이의 단편 또는 일부에 대하여는) 뉴클레오티드 서열 비교프로그램 또는 (단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 서열 또는 이의 단편 또는 일부에 대하여는) 아미노산 서열비교 비교프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 그러나 다른 서열 비교 정렬 방법이 본 분야에서 잘 알려져 있고 예를들면 Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482) 알고리즘, Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), 및 이들 알고리즘이 구현된 컴퓨터 (e.g. GAP, BESTFIT, FASTA, 및 BLAST), 또는 매뉴얼 정렬 및 시각적 관찰에 의해 가능하다.
관심있는 핵산 또는 유전자, 폴리펩티드 또는 서열이 확인되고 서열 일부 또는 단편 (또는 유전자 폴리펩티드 서열 등)이 제공되면, 유사한 또는 실질적으로 유사한 다른 서열은 상기 예의 프로그램을 이용하여 동정될 수 있다. 예를들면 마이크로어레이 또는 프로브 서열을 구축할 때, 서열 및 위치는 알려져 있어 마이크로어레이 실험이 '히트' 동정하면 (특정 위치에 있는 프로브가 시료의 하나 이상의 핵산과 혼성화), 프로브 서열이 알려진다 (마이크로어레이 제조업자 또는 생산업자에 의해, 또는 제조업자로부터 제공되는 데이터베이스로부터 - 예를들면 Affymetrix의 NetAffx 데이터베이스, 인간 게놈 U133 플러스 2.0 어레이 제조업자). 서열 소스 동정이 제공되지 않으면, 하나 이상의 데이터페이스에 대한 서열-기반 검색에서 프로브 서열을 이용하여 결정된다. 단백질 어레이 예를들면 iTRAQ에 의해 동정된 펩티드 또는 펩티드 단편에 대하여는, 펩티드 또는 단편 서열이 사용되어 상기와 같이 아미노산 서열 데이터베이스에 질의한다. 이러한 데이터베이스의 예로는 National Centre for Biotechnology Information, 또는 Swiss Institute of Bioinformatics, Sanger 센터, 또는 European Bioinformatics Institute 데이터베이스 예를들면 국제 단백질 인테스 (IPI)를 포함한다.
단백질 또는 폴리펩티드, 핵산 또는 이의 단편 또는 일부는 서열이 동일한 계통발생학적 종, 속, 과, 목에서 발견되는 다른 것과 차별될 때 특이적으로 동정된다고 고려된다. 이러한 차별성은 서열비교로 확인된다. 서열 또는 서열들 비교는 BLAST 알고리즘 (Altschul 등. 1009. J. Mol Biol 215:403-410)에 의해 수행된다. BLAST 검색을 통하여 질의서열 및 특이 서열 또는 서열 군 또는 더 큰 서열 라이브러리 또는 데이터베이스 (예를들면 GenBank 또는 GenPept)와 비교하여 100% 상동성을 보이는 서열뿐 아니라 덜한 상동성을 가지는 것을 동정할 수 있다. 예를들면, 다중 이형체 (예를들면 단리 유전자 또는 유전자로부터 핵산 전사체의 가변적 스플라이싱 또는 해독-후 조작 과정에서 유래)을 가진 단백질 경우, 하나의 이형체가 동일 또는 다른 종의 다른 이형체와 차별될 때, 구조, 서열 또는 하나의 이형체에 존재하고 존재하지 않는, 또는 하나 이상의 다른 이형체에서 검출되지 않는 부위의 특이 검출에 의해 특이적으로 동정된다.
본 발명의 방법은 예를들면 개별 마커 검사를 수행하는 임상실험실 또는 기타 검사기관에 의해 최종사용자에게 접근될 수 있으며 - 생물학적 시료들이 개별 검사 및 분석이 수행되는 기관에 제공되고 예측방법이 적용되며; 달리 의료진은 임상실험실로부터 마커수치를 수령하고 지역적 장치 또는 인터넷-기반의 장치를 이용하여 본 예측방법에 접근할 수 있다.
중앙값, 표준오차, 표준편차 등과 같은 통계적 인자뿐 아니라 기타 본원에서 기재된 통계분석을 결정하는 것은 관련 분야에 정통한 기술자에게 공지되어있다. 특정 계수, 수치 또는 지표를 사용하는 것은 예시적일 뿐이고 본원에 개시된 본 발명의 여러 측면을 제한하는 것은 아니다.
예를들면 마이크로어레이 실험 또는 복잡한 RT-PCR 실험에서 획득된 상당한 규모의 유전자 발현 데이터들을 해석하는 것은 엄청난 작업이지만 전체적인 특징을 조명하는 방법으로 데이터를 정리할 수 있는 알고리즘 및 통계적 도구를 사용하여 매우 용이하게 진행된다. 시각적 도구 예를들면 색의 강도 및 색조를 변경하여 차별적인 발현을 나타내는 것도 가치가 있다 (Eisen 등. 1998. Proc Natl Acad Sci 95:14863-14868). 알고리즘 및 사용 가능한 통계적 도구는 어레이 및 생성 데이터세트의 복잡성 증가, 처리속도, 컴퓨터 메모리 증가 및 이들의 상대적 가격 하락으로 정교함이 증가되었다.
핵산 또는 단백질 발현 프로파일의 수학적 및 통계적 분석은 여러 목적을 달성할 수 있다 - 생물학적 시스템의 경로 또는 도메인에서 단순조절을 보이는 유전자 군들의 동정, 둘 이상의 생물학적 시료들 간 유사성 및 차별성의 분석, 개체에서 특정 이벤트 또는 조작과정들을 구별하는 유전자 발현 프로파일의 특징 분석 등. 이러한 것은 치료요법 또는 치료요법 변경의 효능 평가, 특정 병리 진행 검사 또는 검출, 달리 임상적으로 유사한 병리들 간 차별화 등을 포함한다.
군집화 기법이 공지되고 예를들면 계층적 군집, 자기조직화 형상지도, k-평균 또는 결정 아닐링이 마이크로어레이 데이터세트에 적용된다. (Eisen 등, 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:14863- 14868; Tamayo, P., 등. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:2907-2912; Tavazoie, S., 등. 1999. Nat Genet 22:281-285; Alon, U., 등. 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96:6745-6750). 이러한 방법은 유전자 발현 프로파일에서 단순조절을 보이는 유전자 군들을 동정함에 유용하고, 또한 단순조절을 보이는 것들과 동일한 경로 또는 시스템에 참여하는 것으로 보이는 달리 미지 기능의 새로운 유전자를 동정함에 유용할 수 있다.
생물학적 시료에서의 핵산 또는 단백질 발현 패턴은 기능적 상태 및 식별성에 대한 차별적이며 접근 가능한 분자적 모형을 제공한다 (DeRisi 1997; Cho 1998; Chu 1998; Holstege 1998; Spellman 1998). 관련 유전자 발현 패턴을 가지는 두 개의 다른 시료들은 생물학적 및 기능적으로 서로 유사하거나, 역으로 핵산 또는 단백질 발현 패턴에서 유의한 차이를 보이는 두 시료들은 보여진 복잡한 발현 패턴에 의해 차별될 뿐 아니라 특이적 병리상태 또는 기타 생리적 조건 예를들면 동종이식 거부반응의 표시인 유전산물 또는 전사체의 진단적 부분집합을 표시한다.
다수의 수학적 및/또는 통계적 분석방법을 마이크로어레이 데이터세트에 적용하면 유의한 마커들의 가변 부분집합을 표시할 수 있지만, 어떠한 방법이 '최적' 또는 '더욱 정확한'지에 대한 불확실성에 이른다. 수학적 방법과 무관하게, 중요한 생물적 현상은 데이터세트에 있어서 동일하다. 다수의 수학적 및/또는 통계적 방법을 마이크로어레이에 적용하고 모두에 공동적인 마커들 각각의 통계적으로 유의한 부분집합을 평가함으로써 불확실성은 줄어들고, 임상적으로 연관된 중요한 마커들이 확인될 수 있다.
유전자 발현 프로파일 형성 마커들
본 발명은 신장 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가 또는 진단에 유용한 일군의 마커들을 제공하며, 이는 표 2에 제시된 하나 이상의 핵산마커들을 포함하며, 및 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, SFRS16, 1558448_a_at, CAMKK2, NFYC, NCOA3, LMAN2, PGS1, NEDD9, 237442_at, FKSG49/LOC730444, LIMK2, UNB, NASP, PRO1073, 240057_at, ITGAX, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6을 포함할 수 있다.
183개의 프로브 세트가 검출, 정량화되어, 거부반응 (AR) 시료 및 비-거부 이식 (NR) 대조군과 비교할 때 모든 3번의 적합 t-검정에서 오류발견률 (FDR) 1% 이하로, 통계적으로 유의한 차별을 보였고, 논의된 유전자 또는 전사체의 증가/상향-조절 또는 감소/하향-조절을 나타낼 수 있다. 이들 프로브 세트는 발현 핵산을 특이적으로 (혼성화 및 표지 검출에 의해) 검출하고 발현 수준을 정량화할 수 있다. 183개의 개별 발현 전사체 또는 핵산을 나타내는 이들 183개 세트 (표 2에 나열) 중에서, 부분적인 24개의 프로브 세트 (표 5)가 검출, 정량화되어, 모든 3번의 적합 t-검정에서 비-거부반응 이식 (NR) 대비 AR 시료에서 통계적으로 유의한 폴드 변화를 보였고, 논의된 유전자 또는 전사체의 증가/상향-조절 또는 감소/하향-조절을 나타낼 수 있다.이들 24개의 프로브 세트 중에서, 최소한 18개는 특이 유전자 (알려지거나, 또는 공지되지만 기술되지 않음) 유전자 또는 전사체를 검출한다. 도 10은 표 2 및 5에 나열된 프로브 세트들로 동정된 핵산 일부의 핵산서열정보를 제공한다.
일부 예에서, 본 발명은 신장 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 검사, 예측 또는 진단 방법을 제공하며, 이는 표 2에 나열된 군에서 선택되는, 표시된 유전자 기호로 언급되는, 최소한 하나 이상의 마커들 또는 프로브 세트의 발현 수준 측정을 포함한다. 이들 프로브 세트는, 유전자 기호로 언급되는, 개별적이고 유일한 유전자 또는 유전자 단편 발현 수준과 연관되고 특이적으로 측정한다.
표 2 또는 5에서 표기된 유전자 또는 마커들은 동종이식 거부반응 프로세스에서 생물학적 역할을 가지며 치료 표적이 될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명은 신장 동종이식 거부반응을 포함한 동종이식 급성 거부반응 평가 또는 진단에 유용한 일군의 핵산마커들을 제공하며, 이는 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, SFRS16, 1558448_a_at, CAMKK2, NFYC, NCOA3, LMAN2, PGS1, NEDD9, 237442_at, FKSG49/LOC730444, LIMK2, UNB, NASP, PRO1073, 240057_at, ITGAX, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6을 포함한다.
다른 예에서, 본 발명은 신장 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 검사, 예측 또는 진단에 유용한 24개의 군에서 선택되는 부분 세트의 마커들을 제공하며, 이는 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX을 포함한다.
다른 예에서, 본 발명은 신장 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가, 검사, 예측 또는 진단에 유용한 24개의 군에서 선택되는 부분 세트의 마커들을 제공하며, 이는 하나 이상의 TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX 및 하나 이상의 SFRS16, NFYC, NCOA3, PGS1, NEDD9, LIMK2, NASP, 240057_at, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6을 포함한다. 하나 이상은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 이상을 포함한다.
실시예 1-3 결과는 상기 예들을 구현한다 - 24개의 핵산 분류자 세트 (TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073, ITGAX;SFRS16, NFYC, NCOA3, PGS1, NEDD9, LIMK2, NASP, 240057_at, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6)는 급성 거부반응 개체 및 비-거부반응 개체와 구분함에 유용하다. 24개의 세트에서 하나 이상의 임의 조합 역시 급성 거부반응 개체 및 비-거부반응 개체와 구분함에 유용하다. 11개 핵산마커들의 교차 세트 (TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX) 역시 급성 거부반응 개체 및 비-거부반응 개체와 구분함에 유용하다.
[표 2] AR 및 NR 개체 간 약 1.30 내지 1.4-배 차이 (또는 이상)를 보이는 차등 발현 프로브 세트. 표적 서열은 공통 또는 전형 서열 일부이며 이로부터 프로브 서열이 선택되었다(AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스 업데이트 Release 25, 2008년 3월). 공통 또는 전형 서열은 GeneChip U133 2.0 프로브 세트 측정 전사체를 나타내기 위한 어레이 설계 시에 사용된 서열이다. 공통 서열은 서열 데이터를 군들로 정렬하고 결합하는 염기-결정 알고리즘으로부터의 결과이다. 전형 서열은 각 유전자의 대표적 cDNA 서열이다.
Figure pct00006
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표 6에 표기된 대표 서열은 해당 프로브 세트에 대한 표적 서열을 언급한다. 표적서열은 AR 및 NR 개체 시료들에서 차등적으로 발현되는 것으로 발견되는 발현 핵산마커 일부를 포함한다. 표적서열은 예를들면 본원에 기재된 바와 같은 적당한 데이터베이스에서 BLAST 검색하여 완전한 유전자 또는 발현 핵산마커 서열을 얻는데 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자 바이오마커들과 연관된 생물학적 경로
마이크로어레이와 같은 큰 규모의 유전자 발현 분석에 의하면 상호작용 유전자 군들 (때로는 2 이상의 분리도)은 함께 발현되고 공통의 조절요소를 가진다. 이러한 단순조절 (coordinate regulation)의 기타 예는 본 분야에 공지되며, 예를들면 참고로 효모의 이단 전이 (diauxic shift) (DiRisi 등 1997 Science 278:680-686; Eisen 등. 1998. Proc Natl Acad Sci 95:14863-14868).
이식편 거부반응 동안 참여되는 생물학적 과정을 기술하기 위하여 말초혈 시료를 이용한 마이크로어레이 분석이 적용될 수 있다; 선행 예에서 BCAR 핵산마커들 동정에서도 보였다. 이들 마커들은 높은 교차-검증 특이성으로 시료들을 옳게 분류하였다. 거부반응 동안 차등적 발현되는 유전자의 생물학적 기능 (표 2)는 면역신호전달, 세포골격 재구성, 및 세포자연사 관련 3 부류의 생물학적 과정을 포함하고, 시토카인-활성화 Jak-Stat 경로, 인터페론 신호화, 및 림프구 활성화, 증식, 주화성 및 유착 참여가 강조된다.
BCAR 환자에서 STAT3, STAT5 및 STAT6뿐 아니라 4개의 포유류 Jak 패밀리 키나아제들 상향조절이 거부반응 개체에서 확인되었고 - Jak 티로신 키나아제-Stat 전사인자경로가 면역세포발생, 증식 및 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. 급성 거부반응은 세포독성 T 세포 매개 이벤트로 인한 것으로 분류될 수 있지만, 이들 데이터에 의하면 Th2/STAT6 과정도 중요하다. 인터페론 (IFN) 신호화에 관여하는 유전자 역시 BCAR에서 상향 조절되며, 인터페론-유도성 구아닐산-결합 단백질 (GBP), 인터페론-반응인자 1 (IRF1) 및 STAT1을 포함한다. 두 개의 MHC 클라스I 유전자들, HLA-E 및 HLA-G 들은 면역조절기능을 가지는 것으로 알려져 있고 AR 개체들에서 상승된다.
T 세포 활성화 및 증식은 액틴 재형성을 포함하는 것으로 알려져 있다. MHC-펩티드/TCR 관여에서, 액틴 세포골격이 관여 부위에서 다발을 이르고 면역 시냅스 형성에 중요하다; 본 다발은 구조단백질 예를들면 SLP-76, 및 ADAP, CDC42EP, 및 액틴 다발성 단백질 LCP-2에 의해 매개된다고 알려져 있다. 액틴 세포골격은 재형성되어 탈린 및 파실린과 같은 단백질을 통하여 인테그린-수용체 복합체에 연결된다. 이들 단백질을 코딩하는 유전자들은 AR 개체에서 상향 조절된다. AVIL (아드빌린)은 가장 크게 차등적으로 발현되는 유전자이며, Ca2+ 조절 액틴-결합 단백질 및 액틴 조절 단백질의 겔솔린/빌린 패밀리 멤버로 알려진 것에 대한 코드이다.
본 데이터 세트에서 검출되는 다른 중요한 주제인 세포자연사는 카스파제 4, 프레세닐린 1, NACHT 류신 풍부 반복 및 PYD 함유 1 (NLRP1), 및 종양괴사인자 수용체 1 (TNF-R1)로 나타났다. ANP32A (산성 핵인단백질 32 패밀리, 멤버 a)는 크게 차별적으로 발현되는 핵산마커이며 본 유전자는 세포자연사 기능을 가지는 것으로 알려진 단백질을 코딩하며 본 데이터 세트에서 보이는 바와 같이 AR 개체의 급성 거부반응과 연관된다. AR 개체의 말초혈시료에서 검출되는 세포자연사 신호는 따라서 T 세포 활성화 (TNF-R1는 T 세포 보조-수용체이다) 및 장기에서 이동된 세포의 활성 유도 세포사멸 (AICD)의 결합을 나타낸다.
CAMKK2 (칼슘/칼모듈린-의존 단백질 키나아제 키나아제 2, 베타) 유전자 산물은 세린/트레오닌 단백질 키나아제 패밀리에 속하는 단백질을 코딩하며, 칼슘-매개 신호화에 역할을 수행한다. 6개의 차별적 이형체를 코딩하는 7개의 전사 이형들은 본 유전자로 동정되었다. CAMKK2 베타는 아주 흔하게 발현되며 전사인자 NfkappaB의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 추가적인 스플라이스 이형체가 기술되지만 이들 전장 특성은 결정되지 않았다. 확인된 이형체는 자기인산화를 수행하며 또한 다른 키나아제를 인산화한다. 인간 CAMKK2의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AB018081, CH473973).
FKBP1A (FK506 결합단백질 1A, 12kDa) 유전자 산물은 면역조절 및 단백질 폴딩 및 수송을 포함한 기본 세포과정에서 기능하는 이뮤노필린 단백질 패밀리 멤버인 단백질을 코딩한다. 인간 FKBP1A 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AB241120, AB241121, AB241122, AF483488, AF483489, AI847849, AK002777, AK010693, AK019362, AK085599, AK141261, AK145400, AK145986, AK151047, AK154751, AK168333, AK169186, AK169242, AL928719, BC004671, BG074872, BY065108, CH466551, U65098, U65099, U65100, X60203).
HLA-G (HLA-G 조직적합항원, 클라스 I, G) 유전자 산물은 HLA 클라스 I 중쇄 상동체에 속하는 단백질을 코딩하며 중쇄 및 경쇄로 이루어진 이형이량체이다. 인간 HLA-G의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AB088083, AB103589).
ITGAX (인테그린, 알파 X (보체 성분 3 수용체 4 서브유닛) 유전자 산물은 이형이량체인 알파 사슬 및 베타 사슬로 이루어진 막관통 단백질을 코딩한다. 인간 ITGAX의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AC124566, AF211864, AI035495, AI326085, AK089167, AK131133, AK155816, AK170432, BC042840, BC057200).
JUNB (jun B 원-종양유전자) 유전자 산물은 코딩한다 .인간JUNB 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 BC053234, BX548032, EC268690).
LIMK2 (LIM 도메인 키나아제 2) 유전자 산물은 단백질의 LIM-도메인 함유 패밀리에 속하는 단백질을 코딩한다. LIMK2은 액틴 세포골격 조절에 관여된다. 인간LIMK2 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면NC_000022.9 NT_011520.11).
LMAN2 (렉틴, 만노스-결합 2) 유전자 산물은 세포 내 렉틴을 코딩하며 이는 샤페론 단백질 및 소포체 및 골지체에서 막관통 화물 수용체로 기능한다고 알려져 있다. 인간 LMAN2 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 X76392).
NASP (핵 자기항원 정자 단백질 (히스톤-결합)) 유전자 산물은 히스톤을 분열 세포핵으로 수송함에 관여하는 단백질을 코딩한다. 다중 이형체들이 본 유전자의 전사 이형체에 의해 코딩된다. 인간 NASP의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 BC081913, CH474008).
NCOA3 (핵 수용체 공동활성자 3) 유전자 산물은 핵 수용체 공동활성제를 코딩하며 이는 핵 호르몬 수용체와 상호 작용하여 전사 활성자 기능을 개선시킨다. 인간 NCOA3 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AF322224, BC088343, CH474005).
NEDD9 (신경 전구체 세포 발현, 발생적 하향-조절된 9) 유전자 산물은 도킹 단백질을 코딩하며 세포 유착과 관련된 티로신-키나아제-기반 신호를 위한 중심적 조절 기능을 수행한다. 인간 NEDD9 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AC167669, AF009366, AK030985, AK033729, AK046357, AK054179, AK083374, BB458177, BC004696, BC053713, CH466546, CT025639, D10919).
NFYC (핵 전사인자 Y, 감마) 유전자 산물은 삼량체적 복합체 서브유닛을 코딩하며, 여러 유전자 프로모터 지역에서 CCAAT 모티프에 고도로 특이적으로 결합하는 매우 보존적 전사인자를 형성한다. 인간MFYC 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 BC045364, BC065645, BC155102, CR388024, CT027763).
PGS1 (포스파티딜글리세로포스페이트 합성효소 1) 유전자 산물은 포스파티딜트란스페라제인 단백질을 코딩하며 대사경로에 참여한다. 인간 PGS1 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AC061992, AK024529, AK225030, AL359590, BC008903, BC015570, BC025951, BC035662, BC108732, CH471099, CR594011, CR749720, DQ892813, DQ896059).
RBMS1 (RNA 결합 모티프, 단일 사슬 상호작용 단백질 1) 유전자 산물은 단일 사슬 DNA/RNA 을 결합하는 단백질의 작은 패밀리 멤버인 단백질을 코딩한다. 인간 RBMS1 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AB009975).
SFRS16 (스플라이싱 인자, 알기닌/세린-풍부 16) 유전자 산물은 mRNA 프로세싱 또는 RNA 스플라이싱과 같은 과정에 참여하는 단백질을 코딩한다. 인간 SFRS16 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AC011489, AF042800, AF042802, AF042803, AF042804, AF042805, AF042806, AF042807, AF042808, AF042809, AF042810, AK074590, AK094681, AL080189, AY358944, BC013178, BC080554, BC131496, CH471126, CR604154).
SLC6A6 (용질 캐리어 패밀리 8 (신경전달물질 전달체, 타우린) 멤버 6) 유전자 산물은 아미노산 수송 또는 신경전달물질 수송에 기능하는 단백질을 코딩한다. 인간 SLC6A6 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 NC_006602, NW_876271).
TncRNA (영양막-유래 ncRNA)로 표기되는, 짧은 비-코딩 RNA는 NEAT1의 3-프라임 말단에서 유래하며 전적으로 영양막에서 발현된다. TncRNA는 생쥐에서 CIITApIII 활성 억제를 통하여 MHC 클라스 II 발현을 억제하는 것으로 알려져 있고 TP53 (p53)에 대한 표적일 수 있고, 세포자연사 또는 세포주기조절에 관여하는 것으로 제안된다. 인간 TncRNA 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AF001892, AF001893, AF080092, AF508303, AK027191, AP000769, AP000944, CR611820, CR618687, U60873).
ZNF438 (아연 집게 단백질 438) 유전자 산물은 아연-집게 모티프 함유 단백질 패밀리에 속하는 단백질을 코딩하며 면역글로불린의 DNA-의존성 전사 조절에 기능을 수행한다. 인간 ZNF438 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AF428258, AF440405, AK057323, AK131357, AK292730, AL359532, AL591707, AL596113, AL833056, BC101622, BC104757, CH471072, DQ356011, DQ356012).
PRO1073 유전자 (MALAT1, 전이 연관 폐 선암 전사체 1) 산물은 세포주기 진행에 관여하는 단백질을 코딩한다. 인간 PRO1073 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 AE017126, NP_875465).
프로브 세트 1558448_a_at은 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스에서 주석되지 않지만, NCBI 블라스트에 의하면 표적 서열은 IMAGE 클론 5215251 일부이다. IMAGE 클론 5215251은 특정되지 않는다. IMAGE 클론 5215251 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 BC0324515.1).
프로브 세트 208120_x_at은 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스에서 주석되지 않지만, NCBI 블라스트에 의하면 표적 서열은 유전자 FKSG63 일부이다. FKSG63은 특정되지 않는다. FKSG63 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호AF338192).
프로브 세트 237442_은 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스에서 주석되지 않고 염색체 10 서열을 포함하는 핵산마커로 확인되며 유전자 APBB1IP (아밀로이드 베타 (A4) 전구체 단백질-결합 패밀리 B 멤버 1 상호작용 단백질) 일부일 수 있다. APBB1IP의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 A160287.18).
프로브 세트240057_at은 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스에서 주석되지 않고, NCBI 블라스트에 의하면 EST 일부이다. 인간 EST 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 AP000763.5).
프로브 세트217436_x_at은 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스에서 "가설 단백질" 코드로 주석되나, NCBI 블라스트에 서 호모 사피언스 주요 조직적합성 복합체, 클라스 I, G, mRNA (cDNA 클론 IMAGE:4694038), 부분 cds 일부로 밝혀진다. 인간 HLA-I, G의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 BC020891.1).
FKSG49은 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스에서 주석되지 않는다. 인간 FKSG49 의 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 AC113404.3).
FKSG49, FKSG49/LOC730444, 및 1558448_a_at의 특정 생물학적 기능은 미지이지만, AR 시료에서 이들 동정 및 상향조절은 급성 거부반응의 핵산마커로서의 이들의 민감성을 나타낸다.
동종이식 거부반응 진단을 위한 단백질 프로파일 형성
단백질 프로파일 역시 동종이식 거부반응 진단용으로 사용될 수 있다. 단백질 프로파일은 단독 또는 유전자 발현 프로파일 또는 대사산물 프로파일과 조합하여 사용될 수 있다.
일부 예에서, 본 발명은 개체에서 신장 동종이식 급성 거부반응을 포함한 동종이식 거부반응 평가 또는 진단을 위한 방법을 제공하며, 이는 1) 개체의 생물학적 시료에서, TTN, KNG1, LBP, VASN, ARNTL2, AFM, MSTP9, MST1, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C2, MBL2, SERPINA10, C9, LCAT, B2M, SHBG, C1S, UBR4 및 F9에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계; 2) 하나 이상의 단백질 마커들의 발현 프로파일을 비-거부자 프로파일과 비교하는 단계; 및 3) 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 대조 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며, 하나 이상의 단백질 마커들 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시한다.
또한 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 바와 같이, 개체의 신장 동종이식 급성 거부반응을 포함한, 동종이식 거부반응 평가 또는 진단방법을 제공하며, 이는 1) TTN, KNG1, LBP, VASN, ARNTL2, AFM, MSTP9, MST1, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C2, MBL2, SERPINA10, C9, LCAT, B2M, SHBG, C1S, UBR4, 및 F9에 의해 코딩되는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질 마커들 증가 또는 감소를 측정하는 단계; 및 2) 개체의 '거부반응 상태'를 결정하는 단계를 포함하여 구성되며, 개체의 '거부반응 상태'결정은 개체의 단백질 마커 발현 프로파일을 대조 단백질 마커 발현 프로파일과 비교하여 결정된다.
일부 예에서, 하나 이상의 단백질 마커들은 KNG1, AFM, TTN, MSTP9/MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10 및 UBR4이다.
다수의 단백질 동정 및 정량화 방법들이 현재 가능하며, 예를들면 글리코펩티드 캡처 (Zhang 등, 2005. Mol Cell Proteomics 4:144-155), 다차원 단백질 동정기법 (Mud-PIT) Washburn 등, 2001 Nature Biotechnology (19:242-247), 및 표면-강화 레이저 탈착 이온화 (SELDI-TOF) (Hutches 등., 1993. Rapid Commun Mass Spec 7:576-580). 또한, 다중 단백질 시료들 정량화를 가능하게 하는 다양한 동위원소 표지방법, 예를들면 절대 및 상대 단백질 정량화를 위한 동중원소 태그 (iTRAQ) (Ross 등, 2004 Mol Cell Proteomics 3:1154-1169); 동위원소 코드화 친화성 태그 (ICAT) (Gygi 등., 1999 Nature Biotecnology 17:994-999), 동위원소 코드화 단백질 표지화 (ICPL) (Schmidt 등., 2004. Proteomics 5:4-15), 및 N-말단 동위원소 태그화 (NIT) (Fedjaev 등, 2007 Rapid Commun Mass Spectrom 21:2671-2679; Nam 등, 2005. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sd. 826:91-107)가 대량 발굴 효율 성능, 및 바이오마커 선별/동정 연구에 특히 유용한 특성으로 널리 이용된다.
동종이식 수령자의 혈장 단백질 마커들의 검정에 멀티플렉스 iTRAQ 방법이 적용되었다. iTRAQ는 Ross 등, 2004 (Mol Cell Proteomics 3:1154-1169)에 의해 처음 기술되었다. 간단하게, 개체 혈장시료들 (대조군 및 동종이식 수령자)에서 가장 풍부한 14개의 단백질을 제거시키고 iTRAQ-MALDI-TOF/TOF에 의해 정량 분석되어, 최소한 하나의 BCAR 양성 및 BCAR 음성 시료에서 460개의 단백질 그룹 코드들이 동정되었다. 11개의 BCAR 양성시료들 중 최소한 8개 및 21개의 대조군 중 최소한 14개에서 144개의 단백질 그룹 코드가 검출되었다. 표 7은 동정된 18개의 유의한 단백질 그룹 코드를 나열한다.
따라서, 단일 후보 바이오마커들이 AR 및 NR 개체를 명백하게 차별할 수 없지만, KNG1, AFM, TTN, MSTP9/MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10 및 UBR4로 이루어진 단백질마커들 세트와 함께는 만족스러운 분류를 달성할 수 있었다 (63% 민감성 및 86% 특이성). 하기되고 예시되는 바와 같이, 단백질 그룹 코드의 멤버로 동정된 단백질마커들의 이형체 아미노산 서열들은 알려져 있고 이들은 본원에 기재된 기탁번호들에 의해 특정될 수 있다 (예를들면, GenBank, GenPept, IPI 등).
iTRAQ은 펩티드를 탐색하기 위한 예시적 방법이지만, 기타 본원에 기재된 방법들 예를들면 면역 기반 방법 예를들면 ELISA 역시 유용할 수 있다. 달리, 특이 항체 역시 하나 이상의 단백질, 이형체, 전구체, 폴리펩티드, 펩티드, 이의 일부 또는 단편에 대하여 반응되며, 시료에서 하나 이상의 단백질 마커 존재를 탐색함에 특이 항체가 사용될 수 있다. 적합한 펩티드 선택, 면역혈청 제조를 위한 동물 (예를들면 생쥐, 토끼 등) 면역화 및/또는 단일클론 항체 제조를 위한 혼성세포 제조 및 선별 방법들은 본 분야에서 공지되며 본원에 참고문헌으로 기재된다.
단백질 발현 프로파일 마커들 ("단백질 마커들")
하나 이상의 전구체, 스플라이싱 이체, 이형체가 단일 유전자에 의해 코딩된다. 유전자 및 코딩화 이형체, 전구체 및 이체(variant) 예시는 표 7에 각 단백질 그룹 코드 (PGC)와 함께 제공된다.
TTN (티틴, 커넥틴,TMD, CMH9, CMD1G, CMPD4, EOMFC, HMERF, LGMD2J, FLJ26020, FLJ26409, FLJ32040, FLJ34413, FLJ39564, FLJ43066, DKFZp451N061)에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 심근 및 골격근에서 발현되는 근육단백질이다. TTN을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenBank 기탁번호 AC009948.3, AF321609.2, NM_133437.2, NM_133432.2, NM_003319.3, NM_133378.3, NM133379.2,). TTN에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_597676.2, NP_596870.2, NP_597681.2NP_003310.3, NP_596869.3, Q4ZG20, Q8WZ50, Q6ZP81, Q8WZ42.2).
KNG1 (키니노겐 1, BDK) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈장 칼리크레인 조합에 기능하며, 스플라이싱에 의해 생성되는 높고 낮은 분자량의 이형체를 가진다. KNG1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000893.2, NM001102416.1, AC109780.7, AI133186.1, BC060039.1, ). KNG1에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_000884.1, NP_001095886.1, AAH600396.1, P01042.2, Q05CF8).
LBP(지질다당류 결합 단백질) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 세균감염에 대한 급성기 면역반응에 기능한다. LBP 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_004139.2, AF013512.1, AF106067/1, M35533.1, DQ891394.2). LBP 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_004130.2, AAC39547.1, AAD21962.1, AAA59493.1, ABM85360.1, P18428.3, Q8TCF0).
VASN (바소린) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 맥관성 평활근세포에서 발견되는 TGF-베타 결합 단백질이다. VASN 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_138440.2, CH471112.2, AY166584.1). VASN 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_612449.2, EAW85311.1, Q6EMK4.1, AAO27704.1).
ARNTL2 (아릴 탄화수소 수용체 핵 운반체-유사-2, BMAL2, MOP9) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 전사인자의 기본 나선고리나선구조 패밀리 멤버이며, 활동일주기를 포함한 여러 생리과정에 기능을 수행한다. ARNTL2 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_020183.3, AC068794.25, AB03992.1). ARNTL2 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_064568.3, Q8WYA1.2, BAB01485.4).
AFM (아파민, ALB2, ALBA, ALF, MGC125338, MGC125339, AFM) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 알부민 유전자 패밀리의 혈청 수송 단백질이다. AFM 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_001133.2, AC108157.3, AK290556.1). AFM 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_001124.1, BAF83245.1, P43652.1, Q4W5C5).
MSTP9 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 잠정적 대식세포-자극 단백질 (뇌 구조인자 1)이며, 간세포 성장인자-유사 단백질의 상동이다. MSTP9 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AF083416.1, AF116647.1, AY192149.1, U28055.1). MSTP9 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 Q2TV78.2, AAP20103.12, AAC35412.1).
MST1 (대식세포 자극 1, MSP, HGFL, NF15S2, D3F15S2) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 염증성 장질환에 관여된다 MST1 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM020998.3, AC099668.2, AK222893.1, M74178.1). MST1 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_066278.3, P26928.2, Q13208, Q49A61, Q53GN8, BAD96613.1, AAA50165.1).
PI16 (펩티다아제 억제제 16, PSPBP, CRISP9, MSMBBP, MGC45378, DKFZp586B1817) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 전립선 분비단백질과 상호 작용하는 혈액단백질이다. PI16을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_153370.2, AL122034.29, AK075470.1, AK124589.1, AK302193.1, AK312785.1, BC022399.1). PI16 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_699201.2, Q6UXB8.1, BAC11640.1, BAG35648.1, AAH22399.2).
SERPINA5 (세르핀 펩티다아제 억제제, 클레이드 A 멤버 5, PAI3, PCI, PROCI, 단백질 C 억제제) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 활성 단백질 C의 혈장 단백질 억제제이다. SERPINA5 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000624.4, AF361796.1, AK096131.1, BC018915.2, U35464.1). SERPINA5 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_000615.3, P05154.2AAB60386.1, AAH08915.1, BAG53218.1).
CFD (보체 인자 D, 아디프신) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 펩티다아제의 트립신 인자 멤버이다. CFD 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_001928.2, AC112706.2,AJ313463.1, BC034529.1, BC057807.1, M84526.1). CFD 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_001919.2, P00746.5, Q6FHW3, AAA35527.1, AAH570807.1, CAC48304.1).
USH1C 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 어셔 단백질 복합체의 조합에 기능하는 스캐폴드단백질이다 . USH1C 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_005709.3, NM_153676.3, kAC124799.5, AB006955.1, AF039699.1, AK000936.1, BK000147.1). USH1C 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_005700.2, NP_710142.1,AAC18049.1, BAG62565.1, DAA00086.1, Q7RTU8, Q9H758, Q9Y6N9.3 ).
C2 (보체 성분2, CO2, DKFZp779M0311) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 고전 보체경로에서 기능하는 혈청 당단백질이다. C2 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000063.4, NM_001145903.1, AF019413.1, AK096258.1, BC029781.1, BX537504.1, M26301.1, X04481.1). C2 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_000054.2, NP_001139375.1, AAA35604.1, CAA28169.1, CAD97767.1).
MBL2 (만노스 결합 렉틴 2, MBL, MBP, MBP1, COLEC1, HSMBPC, MGC116832, MGC116833) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 혈청에서 발견되는 용해성 만노스-결합 렉틴이다 . MBL2 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000242.2, AB025350.1, AF360991.1, BC096181.2). MBL2 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_000233.1, BAB17020.1, AAK52907.1, AAH96182.3, P11226.2, Q5SQS3, Q9HCS8).
SERPINA10 (세르핀 펩티다아제 억제제 클레이드 A 멤버 10, ZPI, PDI) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 활성 응고인자 X 및 XI을 억제하는 세르핀이다. SERPINA10 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_001100607.1, NM_016186.2, CH471061.1, AF181467.1, BC022261.1, CR606434.1). SERPINA10 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_001094077.1, NP_057270.1, EAW81564.1, AAD53962.1, CAD62339.1, Q9UK55.1).
LCAT (레시틴-콜레스테롤 아세틸기전이효소) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 세포 외 콜레스테롤 에스테르화 효소이며, 콜레스테롤 수송에 영향을 미친다 . LCAT 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000229.1, AC040162.5, BC014781.1, X06537.1). LCAT 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_000299.1, P04180.1, Q53XQ3, Q9Y5N3, AAH14781.1, CAB56610.1).
B2M (베타-2-마이크로클로불린) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 대부분의 유핵세포 표면에서 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클라스 1 중쇄와 연관되어 발견되는 혈청단백질이다. B2M 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_004048, BU658737.1, BC032589.1 및 AI686916.1). B2M 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 P61769, AAA51811, CAA23830).
SHBG (성호르몬 결합 글로불린, 안드로겐-결합 단백질, ABP, 테스토스테론-결합 베타-글로불린, TEBG) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 성 스테로이드를 결합하는 혈장 당단백질이다. SHBG 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 AK302603.1, NM_001040.2). SHBG 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 P04728.2, CAA34400.1, NP001031.2).
C1S (보체 성분 1, S 부요소) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 세린 프로테아제이며 인간 보체 C1 성분이다. C1S 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_001734.3, NM_201442.2, AB009076.1, AK025309.1, J04080.1, M18767.1). C1S 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_001725.1, NP_958850.1, BAA86864.1, AAA51852.1, AAA51853.1).
UBR4 (유비퀴틴 단백질 리가아제 D3 성분 n-리코닌 4, p600; ZUBR1; RBAF600; FLJ41863; KIAA0462; KIAA1307; RP5-1126H10.1) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 종양유발 바이러스 연관 비-부착 증식 조절에 기능할 수 있다. UBR4 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_020765.2, AL137127.7, AA748129.1, AB007931.1, BC096758.1). UBR4 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_065816.2, CAI19268.1, BAA32307.1, AAH96758.1, Q5T4S7.1, Q6ZUC7, Q96HY5).
F9 (응고인자 XI) 에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 활성 지모겐으로 혈액에서 발견되는 비타민 K-의존 응고인자이다. F9 을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 알려져 있다 (예를들면 GenBank 기탁번호 NM_000133.3, A01819.1, AB186358.1, A13997.1, M11390.1). F9 에 대한 아미노산 서열은 알려져 있다 (예를들면, GenPept 기탁번호 NP_1000124.1, CAA00205.1, BAD89383.1, P00740.2, Q14316, CAA01140.1, AAA52023.1).
본원에 제공되는 표 7 및 IPI 기탁번호들은 데이터베이스 기록을 표시하며 여기서 표기 단백질 그룹 코드 특정 이형체의 아미노산서열정보들이 획득될 수 있다.
예를들면 iTRAQ 단백질 또는 단백질체학 실험에서 획득된 상당한 규모의 발현 데이터들을 해석하는 것은 엄청난 작업이지만 전체적인 특징을 조명하는 방법으로 데이터를 정리할 수 있는 알고리즘 및 통계적 도구를 사용하여 매우 용이하게 진행된다. 시각적 도구 예를들면 색의 강도 및 색조를 변경하여 차별적인 발현을 나타내는 것도 가치가 있다. 알고리즘 및 사용 가능한 통계적 도구는 어레이 및 생성 데이터세트의 복잡성 증가, 처리속도, 컴퓨터 메모리 증가 및 이들의 상대적 가격 하락으로 정교함이 증가되었다.
단백질 또는 폴리펩티드 발현 프로파일의 수학적 및 통계적 분석은 여러 목적을 달성할 수 있다 - 생물학적 시스템의 경로 또는 도메인에서 단순조절을 보이는 유전자 군들의 동정, 둘 이상의 생물학적 시료들 간 유사성 및 차별성의 분석, 개체에서 특정 이벤트 또는 조작 과정들을 구별하는 유전자 발현 프로파일의 특징 분석 등. 이러한 것은 치료요법 또는 치료요법 변경의 효능 평가, 특정 병리 진행 검사 또는 검출, 달리 임상적으로 유사한 (또는 거의 동일한) 병리들 간 차별화 등을 포함한다.
이러한 항체의 선택 및 제조 방법 및 '칩' 또는 어레이 상에 포함, 및 이러한 칩 어레이, 검정 사용방법은 본원에서 참조 또는 기술된다.
기타 실시예
핵산 프로파일은 대사산물 프로파일 ("대사체학") 또는 단백질 프로파일과 조합하여 사용될 수 있다. 개체 게놈에서의 사소한 변경 예를들면 단일 뉴클레오티드 변화 또는 동질이상, 또는 게놈 발현 (예를들면 차등 유전자 발현)은 개체의 소분자 대사산물 프로파일에 신속한 반응으로 이어질 것이다. 또한 소분자 대사산물은 환경변화에 신속하게 반응하며 상당한 대사산물 변경은 환경변화 수초 내지 수분 내에 명백하며 - 반대로, 단백질 또는 유전자 발현 변경은 명백하게 되기 위하여는 수 시간 또는 수일 소요된다. 임상지표 목록은 예를들면 콜레스테롤, 호모시스테인, 포도당, 요산, 말론디알데히드 및 케톤체를 표시한다. 기타 비-제한적 소분자 대사산물들 예시는 표 3에 나열된다.
[표 3] 개체군에서 획득된 혈청 시료의 NMR 스펙트럼에서 동정되고 정량화된 대사산물들
Figure pct00021

개체의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 다양한 기술 및 방법이 적용될 수 있다. 적용되는 방법 및 또한 관심있는 대사산물에 따라 시료준비가 다르며 - 예를들면, 시료에서 아미노산 및 작은 대체적으로 수용성 분자들의 대사산물 프로파일을 획득하기 위하여 시료를 낮은 분자량 컷오프 2-10 kDa으로 여과하는 것이 필요하며, 지질, 지방산 및 기타 대체로 수불용성 분자들의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 하나 이상의 유기용매로의 추출 및/또는 건조 및 잔류물 재용해가 필요하다. 마커들 탐색 및/또는 정량화를 위한 일부 예시적 방법이 본원에 표기되나, 기타 방법들도 본 분야의 기술자에게 공지되어있으며, 쉽게 적용될 수 있다.
개체의 대사산물 프로파일을 얻기 위하여 사용되는 (단일로 또는 조합하여) 일부 예시적 기술 및 방법은 제한적이지는 않지만 핵자기공명 (NMR), 가스크로마토그래피 (GC), 질량분석기 결합 크로마토그래피 (GC-MS), 질량분석기, 푸리에 변환 MS (FT-MS), 고성능액체크로마토그래피 등을 포함한다. 대사산물 프로파일 획득을 위한 예시적 시료준비 방법 및 기술은, 예를들면 Human Metabolome Project website (Wishart DS 등., 2007. Nucleic Acids Research 35:D521-6)에서 찾을 수 있다.
대사산물 프로파일 형성에 유용한 이러한 방법들의 일반적인 원리를 보이는 표준적인 참조문헌들은 예를들면 Handbook of Pharmaceutical Biotechnology, (ed. SC Gad) John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, (2007), Chromatographic Methods in Clinical Chemistry and Toxicology (R Bertholf and R. Winecker, eds.) John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, (2007), Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy by H., Friebolin. Wiley-VCH 4th Edition (2005)을 포함한다.
본 발명의 방법은 예를들면 개별 마커 검사를 수행하는 임상실험실 또는 기타 검사기관에 의해 최종사용자에게 접근될 수 있으며 - 생물학적 시료들이 개별 검사 및 분석이 수행되는 기관에 제공되고 예측방법이 적용되며; 달리 의료진은 임상실험실로부터 마커 수치를 수령하고 지역적 장치 또는 인터넷-기반의 장치를 이용하여 본 예측방법에 접근할 수 있다.
키트들
또한 본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가 또는 진단용 키트가 제공된다. 키트는 TncRNA, FKSG49, ZNF438, SFRS16, 1558448_a_at, CAMKK2, NFYC, NCOA3, LMAN2, PGS1, NEDD9, 237442_at, FKSG49/LOC730444, LIMK2, UNB, NASP, PRO1073, 240057_at, ITGAX, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산마커를 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료 분석방법의 지시서로 구성된다. 일부 예에서, 핵산마커들은 TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX이다. 본 키트는 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 및 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 키트는 예를들면 마커에 선택적으로 혼성화할 수 있는 표지화 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 키트는 예를들면 마커 영역을 (예를들면 PCR에 의해) 증폭하도록 작동하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
또한 본 발명은 핵산 어레이를 제공한다. 어레이는 2-차원 어레이일 수 있으며 최소한 10개의 다른 핵산분자들 (예를들면, 최소한 20, 최소한 30, 최소한 50, 최소한 100, 또는 최소한 200개의 다른 핵산분자들)을 함유할 수 있다. 각 핵산분자는 혼성화에 의해 핵산마커들을 특이적으로 동정하기에 충분한 임의 길이를 가질 수 있다. 예를들면, 각 핵산분자는 길이가 10 내지 250 뉴클레오티드 사이 (예를들면, 12 내지 200, 14 내지 175, 15 내지 150, 16 내지 125, 18 내지 100, 20 내지 75, 또는 25 내지 50 뉴클레오티드 또는 이들 사이 임의 개수)일 수 있다. 예를들면, 본원에서 제공되는 어레이의 핵산분자들은 표 2에 제시된 하나 이상의 핵산마커들을 혼성화 및 특이적으로 동정하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 예들로는 SEQ ID NO: 1-183을 포함한다.
또한 본 발명은 개체의 동종이식 거부반응 평가 또는 진단용 키트가 제공된다. 키트는 TTN, KNG1, LBP, VASN, ARNTL2, AFM, MSTP9, MST1, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C2, MBL2, SERPINA10, C9, LCAT, B2M, SHBG, C1S, UBR4 및 F9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질마커들을 특정하고 정량 검출하기 위한 시약 및 이러한 시약의 사용 및 결과 자료를 분석하는 방법의 지시서로 구성된다. 일부 예에서, 하나 이상의 단백질마커들은 KNG1, AFM, TTN, MSTP9, MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 및 UBR4이다. 예를들면 키트는 단백질 마커들 (1차 항체) 및 검출되는 수준으로 포함된 하나 이상의 2차 항체에 특이적인 항체 또는 이의 단편 포함하며; 이러한 항체는 ELISA와 같은 검정에서 사용될 수 있다. 달리, 항체 또는 이의 단편들은 고체 표면 예를들면 항체 어레이에 고정될 수 있다. 본 키트는 개체 거부반응 상태 예측 또는 진단을 위하여 단독으로 또는 임상지표들 결정을 위한 기타 방법 또는 적합한 기타 검정과 함께 사용될 수 있다. 비-거부반응 컷오프 지표를 제공하는 기타 분석 결과들과 키트 결과를 결합하여 개체 거부반응 상태 진단에 유용한 지시서 또는 기타 정보가 본 키트에 제공될 수 있다.
본 발명은 프로그램 가능한 프로세서로 하여금 동종이식편 거부 여부를 결정하도록 하기 위한 명령으로 구성되는 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체를 제공한다. 동종이식편 거부 여부 결정 방법 (개체의 거부반응 상태)는 본원에서 기재되며, 프로세서는 신호 수신 (광 방출, 형광 강도 또는 주파수 변화 등, 시료에 있는 핵산 또는 단백질마커들 상대 함량 표시) 및 대조군 대비 핵산 또는 단백질 마커들 수준 평가 및 수준의 증가 또는 감소 여부 결정 명령으로 구성된다. 프로세서는 표기된 핵산 또는 단백질마커들의 증가 및/또는 감소 패턴 해석, 및 사용자 (예를들면 의사)에게 개체의 거부반응 상태에 대한 정보를 제공하는 명령을 더욱 포함할 수 있다. 기준선 잡음 또는 기타 비정상 신호를 검출 신호로부터 제거하기 위한 명령 및 정보가 더욱 포함될 수 있다. 명령은 컴퓨터-판독 가능한 저장 매체에 제공되거나 컴퓨터 시스템과 통신되는 고급 절차 또는 객체 지향 프로그램 언어로 구현될 수 있다. 달리, 이러한 명령은 어셈블리 또는 기계어로 구현될 수 있다. 언어는 컴파일 또는 해석될 수 있다.
핵산 검출 신호는 장치 (예를들면 칩 또는 어레이 리더)를 이용하여 획득될 수 있고 조직 거부반응 결정은 별도의 프로세서 (예를들면 컴퓨터)를 사용하여 이루어질 수 있다. 달리, 프로그램 가능한 프로세서를 가지는 단일 장치는 이들 및/또는 기타 기능을 결합하여 검출 신호를 얻고 신호를 처리하여 개체의 거부반응 상태를 결정할 수 있다. 프로세스 단계는 검출 신호 획득 단계와 동시에 수행될 수 있다 (예를들면, "실-시간").
이러한 항체의 선택 및 제조 방법 및 '칩' 또는 어레이 상에 포함, 및 이러한 칩 어레이, 검정 사용방법은 본원에서 참조 또는 기술된다.
방법
개체 및 시료
본 연구의 모든 개체들은 St. Paul 병원 또는 뱅쿠버 종합병원 (Vancouver, UBC, 캐나다)에서 2005 내지 2007년에 신장 이식을 받았으며, 적절한 동의가 이루어졌다. 타크로리무스 및/또는 프레드니소론과 조합된 미코페놀레이트모페틸(MMF)에 기초한 면역억제제 치료를 받는다. 개체 연령, 성별, 민족성 및 일차질환들은 하기 표 4에 정리된다. 이식전 (기준선) 및 이식후 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26주 및 3년까지 매 6개월마다, 및 거부반응 의심 시점에 전혈은 PAXgene™ 튜브에 수집되었다. 소변시료도 동시에 채취되었다. PAXgene™ 전혈시료는 이식환자들 대표적 연령 및 성별로 질병이 없는 대조 개체 집단에서도 채취되었다. 모든 시료들은 분석될 때까지 -80℃ 보관하였다. 33 개체가 유전자마커 연구에, 이들 33 개체 중 32 개체가 단백질마커 연구에 포함되었다.
[표 4] 신장이식 개체 집단들 통계자료
Figure pct00022

모든 신장이식 개체 임상 데이터가 검토되었다. 시료들은 심각한 합병증 (감염, 질환 재발, 또는 기타 공존-질환)이 없는 급성 거부반응, 경계선 거부반응 또는 무-거부반응의 개체들에서 선택되었다. 본 분석에서 동질 표현형을 확보하고 생물적 변이를 최소화하기 위하여, 환자들 연령이 75세 이하; 이식 전에 면역억제를 받지 않고; 이전 전 면역 탈감작을 받지 않고; 사망자 또는 비-HLA-동일 생체 제공자로부터 신장 이식을 받고; AHG-CDC 항-제공자 T-세포 교차검사에서 음성이며; ATG 또는 OKT3로 고갈 항체 유도요법을 받지 않고; 경구 투여를 받을 수 있고, 즉시적 이식편 기능을 보이며, 임상적 또는 실험실적 감염, 질환 재발 및 기타 공존-질환 증거가 없는 환자들은 적격이라고 고려되었다. 생검편은 진단되고 Banff 기준 (Solez 등 2008 Am J Transplant 8: 753; 표 1)을 적용하여 기록되었다. 본 연구 집단은 1주 이내의 11명 급성 거부반응 (AR) 개체들 및 1주 이내의 22명 비-거부반응 (NR) 개체들 (생검-확인 급성 거부반응, BCAR)로 이루어진다. 모든 NR 개체들 데이터는 1, 2, 3, 4주 및 기준선 (BL)에서 얻어졌다. 1명의 AR 개체는 기준선 시료가 없고, 3명의 개체들은 각각 1, 2 및 4주 시료가 없다. 여러 개체는 8 내지 12주 추가 시점에서 데이터가 있었다. 2명의 AR 환자들은 3일째 거부반응이 있었다. 분석을 위하여, 이러한 거부반응은 1주 그룹으로 고려되었다. 20명의 건강한 개인으로부터 20개의 정상 시료들을 얻어 정상-대비 결과를 계산하였다. 따라서, 본 분석에는 53명 개인들로부터의 시료들을 포함하며, 이중 33명의 환자들은 이식후 3개월 동안 여러 시점에서 시료들을 제공하였다.
본 연구는 폐쇄 집단 사례-대조 설계를 적용하여 이식후 첫 3개월 동안 BCAR (사례)을 가지거나 그렇지 않은 개체들의 차등적 유전자발현을 비교하였다. 이식후 첫 12주 동안 BCAR (사례)로 진단된 환자들은 동일 관찰 기간 동안 임상적 또는 BCAR (대조) 증거를 보이지 않는 환자들과 1:2로 매치되었다. 모든 거부반응 에피소드는 종래 임상적 및 실험실적 인자들로 진단되고, 생검으로 확인되고, 신장 동종이식 병리학적 분류를 위한 반프 기준에 따라 등급화되었다. 반프 범주 2 및 4 (항체-매개 또는 급성/활성 세포성 거부반응)은 유의하게 고려되었다. 경계선 변동 (범주 3)의 개체들은 따로 분석되었다. 모든 기준선 통계 및 후속 데이터들은 이식 프로그램 전자적 데이터베이스에 기록되었고 연구기간 동안 후속 사망 (loss)은 없었다.
면역억제: 면역억제제는 0 및 4일에 베시리막스 20 mg i.v. 및 타크로리무스 0.075 mg/kg b.i.d 및 미코페놀레이트 1000 mg b.i.d.로 이루어졌다. 약물농도는 이중질량분석기로 측정되었고; 타크로리무스 함량은 이식후 1개월간 12-시간 동안 8-12 ng/mL, 2개월간 6-9 ng/ml, 그 이후는 4-8 ng/ml 수준이 달성되도록 조절되었다. 첫 이식편 및 비-감작화 개체들은 메틸프레드니솔론 125 mg iv을 이식 당일, 1일에 경구 프레드니손 1 mg/kg 투여 받고, 이식후 3일까지 0으로 줄였다. 두 번째 또는 이후 이식편 수령자에 대하여는, 프레드니손 함량을 서서히 단계적으로 줄여 3개월 이후 격일로 10 mg 함량으로 유지되었다. 거부반응 에피소드는 매일 메틸프레드니솔론 500 mg i.v.으로 3-5일 동안 처치되었다. 스테로이드 내성 거부반응은 매일 OKT3 5 mg i.v. 또는 ALG 15mg/kg i.v으로 7-10일 동안 치료되었다.
혈장 채취 및 제거: 이식수령자로부터 정해진 시간에 및 거부반응 의심 시점에 취한 전혈시료들, 및 질환-없는 비교 가능한 연령 및 성별의 정상 대조군에서 취한 유사 혈액시료들은 EDTA 튜브에 채취되어 얼음에 보관되었다. 2시간 이내 혈장이 분리되어 분석될 때까지 액체질소로 옮겨졌다. 이후 혈장시료는 실온으로 해동되고, pH 7.6의 10 mM 인산완충식염수 (PBS)로 5회 희석, 및 스핀-X 원심분리 튜브 필터로 여과되었다. 희석 혈장은 325 uL 시료 루프를 통하여 5 mL 조류 항체 친화성 칼럼 (Genway Biotech; San Diego, CA)으로 주입하여 14개의 가장 풍부한 혈장 단백질: HAS, IgG, 피브리노겐, 트랜스페린, IgA, IgM, 합토글로빈, α2-마크로글로불린, α1-산 당단백질, α1-항트립신, 아폴리프로테인-I, 아폴리프로테인-II, 보체 C3 및 저밀도 지방단백질 (주로 아폴리프로테인 B)을 제거하였다. 유동 분획물을 얻어 TCA 첨가하여 최종 농도가 10%가 되도록 침전시키고 16-18 시간 동안 4℃에서 배양시켰다. 단백질 침전물은 1시간 동안 4℃에서 3200g로 원심 분리하여 회수되고 얼음 냉 아세톤 (EMD; Gibbstown, NJ)으로 3회 세척하고 45:45:10 포화 요소 (J.T. Baker; Phillipsburg, NJ), 0.05 M TEAB 완충액 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO), 및 0.5% SDS (Sigma-Aldrich; St Louis, MO)로 이루어진 200-300 uL iTRAQ 완충액으로 재-수화시켰다. 이후 각 시료는 -80℃에 보관되었다.
RNA 추출 및 마이크로어레이 분석
RNA 추출은 해동 시료를 대상으로 PAXgene™ 혈액 RNA Kit [Cat #762134]을 이용하여 수행되어 전체 RNA을 분리하였다. 2.5 ml 전혈에서 통상 4 내지 10㎍ RNA가 단리되며, RNA 품질은 Agilent BioAnalyzer으로 확인되었다. 1.5 ug RNA, RIN (RNA 상태 값) > 5, 및 A240/A280 >1.9인 시료들이 드라이아이스에 포장되어 Affymetrix 마이크로어레이 분석을 위하여 택배회사를 이용하여 Microarray Core (MAC) 실험실 (아동병원, Los Angeles, CA)으로 보내졌다. 마이크로어레이 분석은 CAP/CLIA 인증 MAC 실험실의 단독 기술자에 의해 수행되었다. 이중나선 cDNA 합성을 위하여 신생 RNA가 사용되었다. cDNA는 Affymetrix cDNA Synthesis Kit (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA)를 이용하여 표지화, 절편, 혼성화 혼합액과 혼합되고 GeneChip Human Genome U 133 Plus 2.0 어레이에서 혼성화되었다. 얻어진 정상 전혈에서 제조된 내부 RNA 대조군과 함께 48 배치에서 Affymetrix System으로 어레이가 스캔되었다. 마이크로어레이는 Affymetrix version 1.16.0 및 affyPLM version 1.14.0 BioConductor 패키지 (Bolstad, B., Low Level Analysis of High-density Oligonucleotide Array Data: Background, Normalization and Summarization. 2004, University of California, Berkeley; Irizarry 등 2003. Biostatistics 4(2): 249-64)을 이용하여 품질 검증되었다. 낮은 품질의 어레이는 동일 시점에서의 다른 RNA 분취량으로 반복되었다. 마이크로어레이 결과 동정 및 분석에는 AffymetrixTM NetAffxTM 주석 데이터베이스 업데이트 Release 25 (2008년 3월)이 사용되었다.
유전자 발현 분석
마이크로어레이 분석은 38,500개의 입증된 인간유전자들로부터 47,000개 이상의 전사체들 및 이형들을 분석하는 54,000개의 프로브 세트를 가지는 시료당 하나의 Cel 파일을 생성하였다. 모든 Cel 파일들은 최종 분석 전에 예비-처리되었다. 예비-처리 단계들은: (1) 유전자 칩 결과 품질 조절, (2) 간섭 강도 조정, (3) 모든 데이트를 함께 정규화, (4) 프로브-수준 데이터를 프로브-세트 강도 수치로 요약화, 및 (5) 프로브-세트들을 시료들 간 매우 높은 강도를 보이지 않는 제거 프로브-세트들로 필터링.
품질 조절은 Affy version 1.16.0 및 affyPLM version 1.14.0 BioConductor 패키지를 사용하여 수행되었다. 낮은 품질의 시료들은 반복 처리되었다. Cel 파일들은 RMA 정규화되고 (Bolstad, 등. Bioinformatics, 2003. 19(2): p. 185-93) 및 Affy BioConductor 패키지 version 1.16.0 (Bolstad, 2004, 상기)으로 log2-변환되었다. 미-가공 발현 (expression) 필터링 결과 416 시료들의 최소한 3개에서 26=64의 신호 강도를 가지는 21,771 프로브 세트가 남았다. 이후 필터링 단계가 적용되어 정규화에 사용된 모든 416 시료들에 걸쳐 최소한 3개의 시료들에서 최소한 6인 log2-발현 수치를 가지는 프로브 세트가 포함되었다. 예비-처리 단계에서 포함된 총 시료 개수는 416이었다; 이중 이식 개체로부터의 33개가 최종 분석에 사용되었다.
트립신 분해 및 iTRAQ 표지화 : 총 단백질 농도는 바이신코닌산 검정 (BCA) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO USA)으로 결정되며 각 시료로부터 총 단백질 100 ug을 얻었다. -20℃에서 HPLC 등급 아세톤 (Sigma-Aldrich, Seelze, 독일) 10 부피 함량을 첨가하면 각 시료는 침전되고 -20℃에서 16-18시간 동안 배양하였다. 단백질 침전물은 10분 동안 16 110g로 원심 분리하여 회수되고 50 mM TEAB 완충액 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) 및 0.2% 전기영동 등급 SDS (Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ)에 용해되었다. 각 시료에 있는 단백질은 TCEP (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) 3.3 mM으로 환원되었고 (reduced) 60분 동안 60℃에서 배양되었다. 시스테인은 최종 농도 6.7 mM에서 메틸 메탄 티오술포네이트로 저해되었고 (blocked) 실온에서 10분 동안 배양되었다.
환원되고 저해된 시료들은 서열분석 등급 변형 트립신 (Promega; Madison, WI)으로 분해되고 16-18 시간 동안 37℃에서 배양되었다. 트립신 분해 펩티드 시료들은 진공농축기(Thermo Savant; Holbrook, NY)에서 건조되고 제조업자 프로토콜에 따라 iTRAQ 시약 (Applied Biosystems; Foster City, CA)으로 표지화시켰다. 표지화 시료들은 수집되어 (pooled) 농축 인산 (ACP Chemicals Inc; Montreal, QC, Canada)을 이용하여 pH 2.5-3.0으로 산성화되었다.
2D-LC 크로마토그래피 : iTRAQ 표지 펩티드는 VISION 워크스테이션 (Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 내부 직경 (ID) 4.6 mm 및 길이 100mm의 300Å 공극을 가지는 5um 비드 충진 폴리술포에틸 A 칼럼 (PolyLC Inc., Columbia, MD USA)을 사용한 강 양이온 교환 크로마토그래피(SCX)로 분리되었다. 사용되는 이동상은 10 mM 제1인산칼륨 (Sigma-Aldrich; St Louis, MO) 및 25% 아세토니트릴 (EMD Chemicals; Gibbstown, NJ) pH 2.7로 이루어진 버퍼 A, 및 0.5M 염화칼륨 (Sigma-Aldrich St Louis, MO, USA)이 추가된 것을 제외하고 A와 동일한 버퍼 B이었다. 500 uL의 분획물들이 1) 0-30 분, 5% 내지 35%의 버퍼 B, 및 2) 30-80 분, 35% 내지 100%의 버퍼 B의 두 선형 프로파일들로 나누어진 80분 구배에 걸쳐 수집되었다. 가장 높은 수준의 펩티드를 가지는, UV에 의해 검출되는, 20 내지 30 분획물들이 선택되고 부피는 나노 역상크로마토그래피를 위하여 150 uL로 감소되었다. 분획물을 C18 PepMap 가드 칼럼 (300 um ID x 5 mm, 5um, 100Å, LC 팩킹, Amsterdam)에 로딩하고, 물/아세토니트릴/TFA 98:2:0.1 (v/v)로 이루어진 이동상 A로 15분 동안 50 uL/분 조건으로 세척되어, 펩티드는 탈염되었다 (desalted). 이후 트래핑 칼럼은 200 nL/분에서의 나노 유동 흐름으로 전환되고 (switched), 여기에서 고해상 크로마토그래피를 위하여 펩티드는 Magic C18 나노 LC 칼럼(15 cm, 5um 공극 크기, 100Å, Michrom Bioresources Inc., Auburn CA, USA)에 로딩되었다. 펩티드는 다음 구배에 따라 용출되었다: 0-45 분, 5% 내지 15% B (아세토니트릴/물/TFA 98:2:0.1, v/v); 45-100 분, 15% 내지 40% B, 및 100-105 분, 40% 내지 75% B. 용출액은 Probot 마이크로분별 수집기 (LC Packings, Amsterdam, Netherlands)를 사용하여 MALDI ABI 4800 플레이트에 직접 스폿되었다. 기질 용액 (matrix solution), 50% ACN, 0.1% TFA 에 녹인 3 mg/mL α-시아노-4-히드록시신남산 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO USA)이 스폿 당 0.75 uL 첨가되었다.
단백질 방법론: 단백질 분석은 iTRAQ-MALDI-TOF/TOF 방법을 적용하여 수행되었다. iTRAQ 기술의 멀티플렉스 성능으로 인하여 실험 동작 당 4개의 시료들 동시 처리가 가능하였다. 다른 실험 동작(run)들에 걸쳐 해석될 수 있는 결과를 얻기 위하여 모든 iTRAQ 동작에서 참조 시료가 3개의 환자 시료들과 함께 처리되었다. 참조시료는 16명의 건강한 자들로부터의 혈장 풀(pool)로 이루어지고 일관되게 iTRAQ 시약 114로 표지화되었다. 환자 시료들은 무작위로 iTRAQ 시약들 115, 116 및 117로 표지화되었다. 각 iTRAQ 실험을 통하여 참조시료 대비 3개의 환자 시료들의 단백질이 동정되고 정량화될 수 있었다.
질량스펙트럼 및 데이터 처리: 각 실험에 있어서, MALDI 플레이트에 스폿된 (spotted) 펩티드는 4000 시리즈 Explorer version 3.5 소프트웨어에 의해 제어되는 4800 MALDI TOF/TOF 분석기(Applied Biosystems; Foster City, CA)로 분석된다. 질량분석기는 MS/MS 충돌에너지 1 keV으로 양이온 모드에서 설정되었다. 각 MS/MS 동작에 최대 1400 쇼트/스펙트럼이 얻어지고, 총 매스(mass) 시간은 35 내지 40 시간 범위가 되었다. 펩티드 동정 및 정량화는 일체화 Paragon™ 검색 알고리즘 (Applied Biosystems) 및 Pro Group™ 알고리즘이 사용되는 ProteinPilot™ 소프트웨어 v2.0 (Applied Biosystems/MDS Sciex, Foster City, CA USA)으로 수행되었다. 데이터베이스 검색은 국제 단백질 인덱스 (IPI HUMAN v3.39) (Kersey 등, 2004, Proteomics 4:1985-8)에 대하여 수행되어, 시료들에 있는 폴리펩티드를 동정하였다. 전구체 허용오차 (precursor tolerance)는 150ppm으로 설정되고, iTRAQ 단편 허용오차는 0.2 Da으로 설정되었다. 동정 인자들은 트립신 절단, MMTS에 의한 시스테인 알킬화로 설정되고, 특정 인자들은 요소변성 및 생물학적 변이상 ID 포커스에서 설정되었다. 검출 단백질 역치는 85% 신뢰구간에서 설정되었다.
Pro Group™ 알고리즘(Applied Biosystems)은 Paragon™ 알고리즘으로부터의 펩티드 증거를 시료 단백질의 종합 요약으로 정리하였다. 각 iTRAQ 동작에서 동정 단백질 세트를 단백질 그룹들로 조직화하여 불필요한 중복을 피하였다. 상대적인 단백질 수준 (표지 114에 대한 각각의 표지 115, 116 및 117 수준)은 각 단백질에 대한 개별 펩티드의 로그 비율의 가중 평균에 기초하여 ProteinPilot에 의해 각 단백질 그룹에 대하여 계산되었다. 각 로그 비율의 가중치는 Pro Group 알고리즘에 의해 계산되는 정량화 오류의 예측치인, 편차 인자의 역이다. 가중평균은 이후 선형 공간으로 다시 전환되어 Pro Group 알고리즘에 있는 Auto Bias 교정 옵션을 이용하여 실험적 편차를 교정하였다. 다음의 경우의 펩티드 비율은 해당 평균 단백질 비율을 계산하는데 제외되었다: 공유 펩티드 (즉, 동일 펩티드 서열은 하나 이상의 단백질로 속함(claimed)), 전구체 중첩된 펩티드 (즉, 동정 펩티드를 보이는 스펙트럼 또한 다른 단백질에 속하나, 비-관련 펩티드 서열을 가짐), 낮은 신뢰성을 가지는 펩티드 (즉, 펩티드 ID 신뢰성 < 1.0%), iTRAQ 변형이 없는 펩티드, 단지 시약 쌍의 하나의 멤버가 동정되는 펩티드, 모든 피크 쌍들에 대한 신호-대-잡음 비율이 9 이하인 펩티드 비율을 가지는 펩티드. 모든 (비-블랭크) 펩티드 비율이 0 또는 999 일 때 (단지 시약 쌍의 하나의 멤버가 동정되는 것을 의미), 상응하는 단백질에 대한 평균 비율은 0 또는 9999로 나타난다. 이들 및 각 단백질에 할당된 기타 정량적 측정 및 편차 교정에 대한 추가 정보는 ProteinPilot 소프트웨어 문서에서 주어진다.
iTRAQ 실험에서 각 단백질 그룹이 하나 이상의 동정된 단백질을 포함하지만, 3개의 iTRAQ 비율들의 단일 세트가 동정된 펩티드 상응 리스트에 기반하여 전체 그룹에 대하여 할당되었다. 내부 알고리즘인 소위 단백질 그룹 코드 알고리즘 (PGCA)을 사용하여 모든 iTRAQ 실험에 걸쳐 단백질 그룹들을 연결시켰다. PGCA는 각 iTRAQ 동작에서 동정 코드를 모든 단백질 그룹들에 부여하고 동작들에 걸쳐 공통코드를 유사한 단백질 그룹들에 부여한다. 뒤 코드는 단백질 그룹 코드 (PGC)라고 언급되며 이는 다른 iTRAQ 동작에 걸쳐 단백질을 매칭시키기 위하여 사용된다. 이러한 과정을 통하여 모든 실험적 동작들에 걸쳐 관련된 단백질 및 단백질 패밀리에 대한 공통 동정자 분류 (common identifier nomenclature)가 보장된다.
통계적 분석
마이크로어레이 실험에 대한 통계 분석은 SAS version 9.1 , R version 2.6.1 및 BioConductor version 2.1 (Gentleman, R., 등., Genome Biology, 2004. 5: p. R80)을 이용하여 수행되었다. Affymetrix BioConductor 패키지에서 유용한 간섭교정, 정규화 및 요약화를 위한 신뢰 멀티-어레이 평균 (RMA) (Bolstad, 2003, 상기) 기술이 사용되었다. 잡음 최소화가 이루어졌고; 최소한 3 시료들에 걸쳐 일관적으로 50 이하의 발현 수치를 가지는 프로브 세트가 잡음으로 간주되고 이후 분석에서 제거되었다. 나머지 프로브 세트들은 3개의 다른 적합 T-검정들로 분석되었다. 두 방법은 마이크로어레이 데이터에 대한 선형모델 (limma) BioConductor 패키지 - eBayes 와 조합된 신뢰 피트 (robust fit) 및 eBayes와 조합된 최소자승피트 - 에서 가능하다. 3번째 통계분석방법, 마이크로어레이의 통계분석 (SAM)은 동일 BioConductor 패키지에서 가능하다. 3가지 모든 방법에서 오류발견률 (FDR) <0.01인 유전자는 통계적으로 유의하다고 간주된다 (Smyth, G., Limma: linear models for microarray data, in Bioinformatics and Computational Biology Solutions using R and Bioconductor, R. Gentleman, 등., Editors. 2005, Springer: New York). 폴드 변화 및 최대 FDR 수치 [3 방법들에서 가장 높은 FDR]은 표 2에 제시된다.
통계적으로 유의한 프로브 세트에 대한 전진선택법 (forward selection)과 함께 핵산마커들은 단계적 판별분석법 (SDA)을 적용하여 동정되었다. 선형판별분석법 (LDA)이 '분류자 마커'로서 바이오마커 패널을 훈련 및 실험하기 위하여 사용되어 최적 정성적 진단을 위한 최소 또는 작은 마커 부분집합을 생성한다. 분류자 구축 전체 과정의 11-폴드 교차검증이 적용되어 바이오마커 패널에 기반한 주요 분류자들 성능이 평가되었다. 시료들이 무작위로 11개의 서로소(disjoint)집합으로 나뉘고, 각각은 개체들에서 BCAR인 하나의 시료 및 BCAR이 아닌 2개의 시료들로 구성되며, 이는 전체 연구 집단에서 1-대-2 분배를 반영하는 것이다. 11개의 서로소 집합에서 각각에 대하여, 새로운 분류자는 주요 분류자와 동일한 방식으로 구축되었다; 3개의 적합 t-검정에 기반한 차별적으로 발현되는 프로브 세트 목록의 확인, 이어 전진선택 판별 분석. 11개의 분류자들 각각의 분류 정확성 (민감성 및 특이성)은 이후 각 폴드에서 빠진 3개의 시료들에 기반하여 결정되었다. 주요 분류자에 대한 민감성 및 특이성은 11-폴드 교자-검증 시료들에 걸친 성능을 평균하여 추정되었다.
단백질에 대한 통계적 분석: 일 시점에서 차등적 상대 수준을 가지는 일 단백질 평가 (실험적 Bayes, eBayes; Smyth 등., 2004 Stat Appl Genet Mol Biol 3: 3장)가 PGCA에 의해 부여된 단백질 그룹 코드를 사용하여 각 분석 그룹 내에서 최소한 2/3에서 검출되는 단백질 세트에 대하여 신뢰 적합 t-검정을 이용하여 수행되었다. eBayes 접근법은 연구 대상 샘플 크기가 줄어들면 인위적으로 낮은 샘플 분산추정치에 의해 유도되는 위양성 수를 줄인다. 추가로, eBayes 신뢰 버전은 통계적 이상값 (outlier)인 단백질 수준에 덜 분석적인 가중치를 부여한다. 이는 고전적, 비-신뢰 검정보다 데이터 크기로부터 벗어나는 관측에 덜 민감하다. BCAR 양성 및 음성 간 유의적으로 차별되는 (예를들면 p-값 < 0.05) 평균 상대농도 (대조군 수준 대비)을 가지는 단백질 그룹 코드는 잠재적 마커로 확인되었다.
단백질 바이오마커 패널 단백질은 잠재적 마커들의 확인 리스트에 기초하여 전진선택 단계적 판별분석법 (SDA)을 적용하여 동정되었다. SDA 알고리즘은 잠재적 마커들 리스트로부터 일 시점에서의 하나의 단백질 그룹과 결합된다. 제1단계에서 단일잔류 교차검증에 기초하여 시료를 최선으로 분류하는 단백질 그룹 코드를 확인한다. 제2단계에서 이전에 확인된 코드와 함께 단일잔류 교차검증에서 최선으로 시료를 분류하는 제2 단백질 그룹 코드를 확인한다. 이러한 절차는 모든 단백질 그룹 코드들이 연속하여 포함될 때까지 또는 (n-2) 단계들이 수행될 때까지, 이때 n은 유용한 시료 개수이며, 반복된다. 단백질 바이오마커 패널은 SDA 알고리즘에 의해 선택되는 제1 k 단백질 그룹 코드에 의해 정의되며, 여기에서 k=k0+km은 제1 시간 (k0) 동안 최대 교차-검증 정확성이 도달되고 km 추가 단계 동안 유지되는 단계이다. 각 교차검증에서, 시료 분류는 각 그룹이 0.5로 설정되는 선행 확률로 선형판별분석 (LDA)를 적용하여 수행된다. LDA에서, 환자 시료(들) 및/또는 채취 대조군에서 검출되지 않은 각 단백질의 상대농도는 각 군에서 남은 훈련시료들 (BCAR 양성 및 음성)로부터 계산된 평균 상대농도를 이용하여 입력되었다.
내적 검증 (단백질 데이터): 통계적 검증은 바이오마커 패널 선택 전체 과정의 단일잔류 교차검증에 의해 수행되었다. 더욱 상세하게는, 단일잔류 교차검증 각 단계에서, 하나의 시료는 분류를 위하여 남고 (실험 세트), 나머지 시료들은 분류자 구축을 위하여 사용된다 (훈련 세트). 전체 바이오마커 선택과정은 즉 SDA에 의한 바이오마커 패널 선택을 통하여 각 그룹에서 시료들의 최소한 2/3에서 검출되는 단백질 그룹 코드가 선택되는 훈련세트에 대하여 수행된다. 생성된 단백질 바이오마커 패널에 기반한 분류자는 LDA를 이용하여 구축되며 실험 세트에 대하여 테스트되었다(선행 및 빠진 수치들은 상기된 바와 같이 처리되었다). 본 과정은 모든 시료들이 한번은 실험세트로 사용될 때까지 반복된다. 전체 특이성 및 민감성은 각 동작의 분류 정확성에 기반하여 추정된다. 모든 통계적 분석은 R version 2.7.0 (The R Project for Statistical Computing)을 이용하여 구현되었다.
기술적 검증: 9개의 단백질 바이오마커들 패널로부터 2개의 단백질들이 상업적으로 유용한 키트를 사용하여 제조업자 지시: 간세포 성장인자-유사 단백질 동종체 (R&D DHG00) 및 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 UBR4 (DiaPharma - DPGR032A)-에 따라 효소결합면역흡착측정법(ELISA)에 의한 검증으로 선택되었다.
본 발명은 하기 예들에서 더욱 상세하게 기술될 것이다. 그러나 이들 예는 다만 예시 목적이며 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해하여야 한다.
실시예 1: 바이오마커들 및 임상 진단 비교
총 33 개체들이 연구에 포함되었고, 이식후 1주일 내 급성 거부반응 11명의 환자들 및 이식후 최소한 6개월 동안 거부반응이 없는 22명의 환자들로 구성되었다. 33명의 이식 환자들은 신장 이식 후 3개월 동안 임상적으로 안정하였다. 160개의 유전자를 나타내는 총 183개의 프로브 세트들은 AR 및 NR 개체들 간 통계적으로 유의하고 차등적으로 발현되었다 (표 2). 프로브 세트들 서열은 도 10에 제시된다. 이식 1주일 내 급성 거부반응 환자들 시료들은 비-거부반응 환자들 시료들과는 별개로 함께 군집되었다.
표 5에 나열된 핵산마커들 패널을 이용한 테스트 개체들 분류는 개체들을 거부자 (AR) 또는 비-거부자 (NR)로 나누었다 (도 1A-C).
비교를 위하여, 단지 임상지표만을 이용한 개체들 독립 분류는 AR 및 NR 개체를 분리하였으나, 두 그룹들 사이 경계는 도 1A-C에 도시된 개체들에 대하여 보여진 바와 같이 명확하지 않고 AR 개체 및 NR 개체들 간 일부 중첩이 관찰되었다 (도 2).
[표 5] 이식편 급성 거부반응 연관 일차 분류자 (24개의 핵산 마커들)
Figure pct00023
Figure pct00024
++ 샘플 외 성능을 추정하기 위한 교차-검증 과정에서 확인된 11개의 프로브 세트 교차(intersection)
실시예 2:
개체들: 관찰 기간 동안 신장 이식을 받은 305명의 개체들에서, 27명 (8.9%)이 이식후 첫 3개월 동안 반프 등급 ≥ 1a인 BCAR로 진행되었고, 다른 24명 (7.9%)는 경계선 변화를 보였다. 생검에서 (범위:3-10일, 평균: 6일) 등급≥ 1a 거부반응을 가지는 총 11/27 (40.74%) 개체들은 즉시 이식편 기능, 및 감염 또는 기타 공존-질환 이벤트가 없는 사례 선택 기준을 충족하였고, 생검에서 (범위:5-7일, 평균: 6일)에서 경계선 변화에 있는 5/24 (20.83%) 개체들도 그러하였다. 즉시 이식편 기능을 가지고, 이식후 최소한 6개월 동안 임상적 또는 BCAR이 없고 임상적 공존-질환 동시 발견이 없는 다른 22 개체들이 매치 대조군으로, 20개의 정상 대조 개체들은 비교자 군으로 선택되었다. 통계적 상세 사항은 표 4에 보인다. 이식편 기능은 이식후 첫 주에 BCAR을 가지는 사례에서 상당히 열등하였지만 (27ㅁ10 대 42ㅁ13 ml/min/1.73M2, P = 0.004), 3개월까지 사례들 및 대조들 양쪽은 대등하였고 (48ㅁ11 대 51ㅁ8 ml/min/1.73M2, P = 0.359) 관찰 12달 동안 양호한 이식편 기능을 가지고 임상적으로 안정하였다 (54ㅁ13 대 53ㅁ15 ml/min/1.73M2, 12개월, P = 0.859).
마이크로-어레이 발현: 말초혈액 시료들은 급성 거부반응 동안 생검 시점에 BCAR을 가지는 각 사례들, 및 각 사례와 동일한 시간 점에서 BCAR이 아닌 대조군에서 선택되었고, 정상 비교자 시료들과 대비되었다. FDR < 0.01에서 BCAR이거나 아닌 환자들 시료의 마이크로어레이 분석을 통하여 LIMMA를 적용하여 차등 발현되는 총 239개 프로브 세트, 및 신뢰 LIMMA으로 575개 프로브 세트, SAM을 적용하여 2677개 프로브 세트를 확인하였다. 세 방법들의 교차점은 모든 세 방법들에 대하여 사례(BCAR) 및 대조(비-BCAR) 사이에 차등적을 발현되는 더욱 제한된 183개 프로브 세트임을 알았다. 유의하게 차별 발현되는 프로브 세트 183개 중에서, 182개는 BCAR인 개체에서 과잉-발현되며, 하나 (1565484_x_at, 상피-성장인자 수용체에 대한 코딩; EGFR)는 과소-발현되었다 (도 3).
이들 프로브 세트들에 기반한 자율적 쌍방 (two-way) 계층적 군집화 및 주요 성분 분석을 통하여 정상 개체들, BCAR인 환자들 및 BCAR이 아닌 환자들 사이 이산적 분리를 보였다. 주요 성분 분석 (도 4)는 개체 그룹들 (AR, NR 및 N)의 분리를 보이고, 모든 그룹들 중심은 명백하게 분리되는 것을 보여준다. 경계선 변화인 시료들이 도입되면, 이들은 BCAR을 가지는 및 가지지 않는 사례들 및 대조군 사이로 균일하지 않게 분배된다. 약 160개의 유전자를 나타내는 183개의 차별 발현 프로브 세트에 의해 참여되는 생물학적 프로세스는, 도 5에 도시된다. 프로브 세트들이 공유되는 중첩 망들의 조합은 면역반응, 신호전달 및 세포골격 재형성과 관련된 과정에 참여되는 세 개의 주요 생물학적 범주를 확인된다. 유전자-유전자 및 단백질-단백질 망 분석(Ekins 등., 2007. Methods Mol Biol 356:319-50)은 사이토킨-활성화 Jak-Stat 경로, 인터페론 신호화, 림프구 활성, 증식, 주화성, 및 세포자연사는 183개의 차별 발현되는 프로브 세트 중에서 나타난다는 것을 보였다.
분류자 선택: 많은 유전자들이 BCAR와 연관되지만, 공선성 (co-linearity)은 모든 것들이 본 이벤트에 대한 분류자 개발에 필요하지는 않다는 것을 의미하였다. 따라서 전진선택 판별분석이 적용되어 처음에 정리된 183개의 차별 발현 프로브 세트들 중에서 더욱 간결한 분류자로 구성된 선형적 판별 기능을 확인하였다. 이들 분류자 내에서 확인되는 주요 24개의 프로브 세트 및 이들의 각 유전자는 표 5에 보여진다.
실시예 3: 핵산마커들 교차검증
동일한 함축 (reductive) 과정을 사용하는 체 유자자 세트 교차검증이 적용되어 본 분류자 신뢰성을 개선하고 샘플 외 효율을 추정하였다. 이러한 과정으로 제공되는 11개의 핵산마커들 세트 리스트는 평균 103개 프로브세트를 포함하였고, 183개의 원래 프로브 세트에서 가장 유의하게 차별적 발현되는 6개 (TncRNA, FKSG49, AVIL, SIGLEC9, ANP32A, SLC25A16)가 각 리스트에 존재하였다. 전진 선택 판별 분석을 통하여 87개의 프로브 세트 조합 (union)와 함께 11개의 분류자 군을 확인하였다. 이들 11개의 프로브 세트는 표 5에 기술되고, 원래의 24개 프로브 세트 분류자에 속한다. 교차 검증을 통하여 BCAR이거나 아닌 시료들 동정에 있어서 전체 평균 민감성은 73%, 특이성은 91%임을 보였다.
최종 11개의 프로브 세트 (핵산마커) 분류자 성능은 도 6에 도시된다. 11개 핵산마커들은 TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및ITGAX을 포함하였다.
진단 정확성은 연속적 프로브 세트 추가로 급격히 개선되었고 (도 6A), 완전한 11개의 프로브 세트 분류자에 대한 선형 판별 점수들은 BCAR인 및 아닌 시료들을 명확하게 분리하였다 (도 6B). 마지막으로, 이식후 첫 3개월에 걸친 종 모드 모니터링 (longitudinal monitoring)에 의하면 BCAR 시점에서 분류자 점수는 상당히 증가하며 (p=0.001),치료 및 거부반응 에피소드 해결 이후 기준선으로 복귀된다. BCAR을 경험하지 않은 개체들에서 비견되는 증가는 발생되지 않고 이식후 임의 기타 시점에서 이들 곡선 간 상당한 차이는 없었다 (도 6C).
11개의 교차-검증 분석은 평균 예측 정확성이 AR에 대하여 72.7% (민감성) 및 NR 에 대하여 90.9% (특이성) (표 6)을 보였고 나열된 24개의 바이오마커들 패널의 예측 정확도 추정치는 표 5에 나타난다. 표 5에서 "++" 표시는 샘플 외 성능을 추정하기 위한 교차검증 과정에서 확인되는 11개의 프로브 세트의 교차 세트에 있는 핵산마커들을 나타낸다.
[표 6] 핵산마커들 교차-검증 분석의 민감성 및 특이성 결과
Figure pct00025

실시예 4: 단백질 마커 동정 및 검증
관찰 기간 동안 신장 이식을 받은 305명의 개체들에서, 27명 (8.8%)이 이식후 첫 3개월 동안 BCAR≥ 1a로 진행되었다. 이들 중 11명이 즉시 이식편 기능, 이식후 첫 4주 이내 BCAR ≥ 1a (범위:3-10일, 평균: 6일), 및 감염 또는 기타 공존-질환 이벤트가 없는 사례 선택 기준을 충족하였다. 즉시 이식편 기능을 가지고, 이식후 최소한 6개월 동안 임상적 또는 BCAR이 없고 임상적 공존-질환 동시 발견이 없는 다른 21 개체들이 총 32 이식 개체들에 대한 대조군으로 선택되었다. BCAR 발병 이외, 모든 환자들은 임상적으로 안정하였고, 관찰 12달 동안 양호한 이식편 기능을 가진다. 6개 추가 BCAR 음성 시료들이 내부 검증을 위하여 선택되었고 BCAR이 없는 3 환자들로부터의 각각 하나 및 새로운 환자들로부터 3개는 발굴 연구에 포함되었다.
14개의 가장 풍부한 단백질 (알부민, 피브리노겐, 트랜스페린, IgG, IgA, IgM, 합토글로빈, α2-마크로글로불린, α1-산 당단백질, α1-항트립신, 아폴리프로테인-I, 아폴리프로테인-II, 보체 C3 및 아폴리프로테인 B)을 면역-친화성 크로마토그래피(Genway Biotech; San Diego, CA)로 제거한 후, 총 단백질 질량 5% 이하가 잔류하였다. 잔류 단백질은 등급 변형 트립신 (Promega; Madison, WI)으로 분해되고 제조업자 프로토콜에 따라 iTRAQ 시약 (Applied Biosystems; Foster City, CA)으로 표지화시켜, 신장 급성 거부반응의 혈장 단백질 마커들을 동정하기 위하여 검사되었다. 총 460 단백질 그룹 코드들이 최소한 하나의 BCAR 양성 시료 및 하나의 BCAR 음성 시료에서 동정되었고, 이중 144개 단백질 그룹 코드들이 11개의 BCAR 양성시료들 중 최소한 8개 및 21개의 대조군 중 최소한 14개에서 검출되었다. 144개 단백질 그룹 코드를 신뢰 eBayes로 분석하여 en 그룹들 간 농도가 유의하게 다른 (p<0.05) 총 18개의 단백질 그룹 코드들을 확인하였다. 18개의 유의한 단백질 그룹 코드들 결과는 표 7에 나타난다.
전진 선택 단계적 판별 분석 (SDA)는 단백질 바이오마커 패널을 구성하는 9개의 단백질 그룹 코드 세트를 확인하였다 (표 7에서 블루 볼드 서체). BCAR이 없는 것과 비교할 때 환자에서 7개의 바이오마커 패널 PGC는 상향-조절되고 (TTN, MSTP9, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, UBR4), 두 개는 하향-조절된다 (KNG1 및 AFM). 도 8은 전진 선택 각 단계에서 단백질 그룹 코드에 의해 달성되는 주변분류 (marginal classification)를 보인다. X-축은 전 단계에서 선택되는 단백질 그룹 코드를 연결하기 위한 각 단계에서 선택되는 단백질 그룹 코드를 보인다. Y-축은 각 연속하는 더 큰 패널에 의해 달성되는 분류 정확성을 보인다. 예측 정확성에 있어서, 한계게인 (marginal gain)은 단백질 그룹 코드가 패널에 추가될 때 신속하게 안정화되고 3개의 단백질로도 충분히 최대 정확성을 달성할 수 있다 (도 8).
[표 7] p-값<0.05에서 차별적 상대 농도를 가지는 혈장 단백질. 칼럼 AR 대 NR에서 확인되는 단백질 그룹은 혈장 단백질 바이오마커 패널을 구성한다. 칼럼 "PGC"는 PGCA에 의해 할당되는 코드를 포함한다. 각 그룹에서 모든 단백질의 기탁번호 및 단백질 명칭, 상응 유전자, 신뢰-eBayes 검정에 의해 계산된 p-값, 폴드 변화 및 BCAR 음성에 대한 양성에서의 방향 (상향- 또는 하향-조절)이 나머지 칼럼에 주어진다.
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029

* "AR 대 NR"에서 "상향"은 하나 이상의 특정 단백질 그룹 코드 멤버가 AR 개체에서 NR 개체 대비 증가되는 것을 나타낸다. "AR 대 NR"에서 "하향"은 하나 이상의 특정 단백질 그룹 코드 멤버가 AR 개체에서 NR 개체 대비 감소하는 것을 나타낸다.
**는 SDA에 의해 선택되는 단백질 그룹 코드를 나타낸다. 하나 이상의 표기 단백질 그룹 코드 멤버는 NR 개체 대비 AR 개체에서 (최-우측 칼럼에 표기된 바와 같이) 증가 또는 감소된다.
기탁번호 #는 국제 단백질 인덱스 (IPI) 기탁번호이며; 해당 폴리펩티드의 아미노산서열은 방법 부분에서 기재된 바와 같이 IPI 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
내부검증에서, 새로운 시료들 분류를 위한 단백질 바이오마커 패널 성능을 예측하기 위하여 두 접근법들이 시도되었다. 먼저, LDA를 이용한 단일잔류 교차검증은 기술된 발굴 전략과 관련하여 63% 민감성 및 86% 특이성을 예측하였다. 둘째, 바이오마커 패널에 있는 9개의 단백질 그룹 코드들에 기초한 분류자들이 LDA를 이용하여 구축되었고 새로운 6개의 NR 시료들에 대하여 테스트되었다. 이들 6개 시료들 중 4개는 옳게 분류되었다.
각 개별적 공개문헌은 본원에 특정하게 및 개별적으로 참조로 표시되며 전부가 제공되는 것으로 모든 참조문헌들은 본원에 참조로 포함된다. 본원에서 참조문헌의 언급은 이러한 문헌들이 본 발명에 선행기술이라는 것을 인정하는 것이 아니며 이렇게 해석되어서는 아니된다.
하나 이상의 현존하는 바람직한 예들이 예시로 기재되었다. 본 발명은 예시 및 도면을 참조하여 개시된 모든 예시, 실질적인 변경 및 변형을 포함한다. 다양한 변경 및 변형이 청구항에 정의된 본 발명의 사상을 벗어남이 없이 가능하다는 것은 본 분야의 기술자에게 자명하다. 이러한 변경의 예로는 실질적으로 동일한 방법으로 동일한 결과를 달성하기 위한 본 발명의 임의 측면에 대한 공지된 균등적 치환을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA KEOWN, Paul BALSHAW, Robert NG, Raymond MUI, Alice MCMASTER, Robert MCMANUS, Bruce COHEN FREUE, Gabriela MEREDITH, Anna GUNTHER, Oliver SCHERER, Andreas <120> METHODS OF DIAGNOSING REJECTION OF A KIDNEY ALLOGRAFT USING GENOMIC OR PROTEOMIC EXPRESSION PROFILING <130> V82441WO <140> PCT/CA2009/000744 <141> 2009-05-09 <150> 61/129,022 <151> 2008-05-30 <160> 183 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 391 <212> DNA <213> Artificial sequencce <220> <223> Probe No. 1 <220> <221> misc_feature <222> (44)..(44) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ttccagggaa gcattatctt gaccagctga accacatttt gggntattct tggatcccca 60 tcacaagaag acctgaattg tataataaat ttaaaagcta ggaactattt gctttctctt 120 ccacacaaaa ataaggtgcc atggaacagg ctgttcccaa atgctgactc caaagctctg 180 gacttattgg acaaaatgtt gacattcaac ccacacaaga ggattgaagt agaacaggct 240 ctggcccacc catatctgga gcagtattac gacccgagtg acgagcccat cgccgaagca 300 ccattcaagt tcgacatgga attggatgac ttgcctaagg aaaagctcaa agaactaatt 360 tttgaagaga ctgctagatt ccagccagga t 391 <210> 2 <211> 452 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 2 <400> 2 ggaagctact ttcaagcgac ctctttgagg agtggatggg tgctctggag atgcaggacg 60 aggaggacag aatcgaggcc ctgaaacagg ttgcagataa gctcccccgg cccaacctcc 120 tgctactcaa gcacttggtc tatgtgctgc acctcatcag caagaactct gaggtgaaca 180 ggatggactc cagcaatctg gccatctgca ttggacccaa catgctcacc ctggagaatg 240 accagagcct gtcatttgaa gcccagaagg acctgaacaa caaggtttgt tctgcttact 300 gatgagaaat ccccaactta tgatctcacc atctgtttgc caagtccagg caataaaatg 360 cttcagaatg tctccaactg actcagaatc acagtgaaaa tataaaatgc aaaatgcttt 420 tgtcatagtt ccactctctc agatacatgt at 452 <210> 3 <211> 556 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 3 <400> 3 aagaaacggc gcaccacaag actatatccc acacctggct cagagggtcc tacgcccacg 60 gaatctcgct gattgctagc acagcagtct gagatcaaac tgcaaggcgg caacgaggct 120 gggggagggg cgcccgccat tgcccaggct tgcttaggta aacaaagcag cctggaagct 180 cgaactgggt ggagcccacc acagctcaag gaggcctgcc tgcctctgta ggctccacct 240 ctgggggcag ggcacagaca aacaaaaaga cagcagtaac ctctgcagac ttaagtgtcc 300 ctgtctgaca gctttgaaga gagcagtggt tctcccagca cgcagatgga gatctgagaa 360 cgggcagact gcctcctcaa gtgggtccct gacccctgac ccccaagcag cctaactggg 420 aggcaccccc caacaggggc acactgacac ctcacacggc agggtattcc aacagaccta 480 cagctgaggg tcctgtctgt tagaaggaaa actaacaacc agaaaggaca tctacaccga 540 aaacccatct gtacat 556 <210> 4 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 4 <220> <221> misc_feature <222> (325)..(331) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 aacagtacag tcctcaccct gatgaccttg accccagagg ggtcggagct acacatcatc 60 ctgggcctgt tcggcctcct gctgttgctc acctgcctct gtggaactgc ctggctctgt 120 tgcagcccca acaggaagaa tcccctctgg ccaagtgtcc cagacccagc tcacagcagc 180 ctgggctcct gggtgcccac aatcatggag gaggatgcct tccagctgcc cggccttggc 240 acgccaccca tcaccaagct cacagtgctg gaggaggatg aaaagaagcc ggtgccctgg 300 gagtcccata acagctcaga gaccnnnnnn ntccccactc tggtccagac ctatgtgctc 360 cagggggacc caagagcagt ttccacccag ccccaatccc agtctggcac cagcgatcag 420 gctgggcctc ccaggcgatc tgcatacttt aaggaccaga tcatgctcca tccagcccca 480 cccaatggcc ttttgtgctt gtttcctata acttcagta 519 <210> 5 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 5 <220> <221> misc_feature <222> (255)..(255) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (343)..(343) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (356)..(356) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (359)..(359) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (385)..(388) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (391)..(397) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (399)..(399) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 caagggacgc ttggacaacg ggcaagttgg cctatacccg gcaaattatg tggaggcgat 60 ccagtgatga gtcggggaca ggccagcggg gggacggagg cggcgggccc aggagcctca 120 gccagccacg tgggcatcca ctccttttcc tgcaagagat gatggttcca ttgctcttgg 180 cttcatggtg ttcctggaag gcagatgagc tggtcatttc gcctgggact cggcaccttt 240 ccgagtgcag ctggnaggga tctgagcgca ggaagacgca gaacaacaga aatagccgcc 300 cctccccgcc cactgtgcct gttggcctat catagatctc tantgttctt gacttngtnc 360 tctcctttcc gagtcaatgg tgggnnnnac nnnnnnntng ttccactgat tactctctct 420 gacgagtcca tcacctgcaa cttaaatg 448 <210> 6 <211> 394 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 6 <400> 6 ttcacttgct tctcagtgca acttgatagg agaatccagc atcttaaagt tgcatatgtg 60 tagcactaat gtttcttttt aaatagttgg gggaaaatga cctagaaaac caaattgcag 120 tttggtagcc aaaattaact cttggtttat ttgtcctttg tgtgtgaaaa gtcctactat 180 tccgtgcgtc agacttcctc acagaactgt tgactggttt tggttcttag tactattgag 240 atctttcgcg tcgatcccaa cggccttagc ggcggcagac tggaataaca ccttacacct 300 ttctggcctg catttctgta gacttcactc tcaagggagg agttttcttt tcttacgttt 360 tgacttttgc acaccatatg cactagggat tctg 394 <210> 7 <211> 387 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 7 <400> 7 ctcaatgttg gctctttggc aggaatggct gctttaaatg gtggcctggg cagcagtggc 60 ctttccaatg gcaccgggag caccatggag gccctcactc aggcctactc gggtatccag 120 caatatgctg ctgctgcgct ccccactctg tacaaccaga atcttctgac acagcagagt 180 attggtgctg ctggaagcca gaaggaaggt ccagagggag ccaacctgtt catctaccac 240 ctgccccagg agtttggtga tcaggacctg ctgcagatgt ttatgccctt tgggaatgtc 300 gtgtctgcca aggttttcat agacaagcag acaaacctga gcaagtgttt tggttttgta 360 agttacgaca atcctgtttc ggcccaa 387 <210> 8 <211> 446 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 8 <400> 8 ggatgtcgaa gaacacagtg tcgtcggccc gcttccggaa ggtggacgtg gatgaatatg 60 acgagaacaa gttcgtggac gaagaagatg ggggcgacgg ccaggccggg cccgacgagg 120 gcgaggtgga ctcctgcctg cggcaaggaa acatgacagc tgccctacag gcagctctga 180 agaacccccc tatcaacacc aagagtcagg cagtgaagga ccgggcaggc agcattgtct 240 tgaaggtgct catctctttt aaagctaatg atatagaaaa ggcagttcaa tctctggaca 300 agaatggtgt ggatctccta atgaagtata tttataaagg atttgagagc ccgtctgaca 360 atagcagtgc tatgttactg caatggcatg aaaaggcact tgctgctgga ggagtagggt 420 ccattgttcg tgtcttgact gcaaga 446 <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 9 <220> <221> misc_feature <222> (152)..(152) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (157)..(157) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (169)..(169) <223> n is a, c, g, or t <400> 9 ccattctgag tacttctccg caaacccttt gtttcattaa ggactgtttt acatgaaggg 60 tgcaaaagta ggataaaaat gagaacccta gggtgaaaca cgtgacagaa gaataaagac 120 tattgaatag tcctcttctc tacccatgga cnttggnatt tttatattng attttaagga 180 aatataactt agtagtaaag agatgagcat tcaagtcagg cagacctgaa tttgggtcaa 240 ggctgcgcca ctcaaaagct atatgacctc tatatgagca gcttattcaa cctcttttaa 300 cctccatttt gtcatctgta gaatgatgat aaatgcctag ctcagaagga ttcc 354 <210> 10 <211> 220 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 10 <400> 10 taacttccaa ggtcccacca acagttcaga aacctaccac agtaaatgtt ccaactacag 60 aagtctcacc aacttctcag aaaaccacca caaaaaccac cacaccaaat gctcaagcaa 120 cacggagtac acctgtttcc aggacaacca agcattttca tgaaacaacc ccaaataaag 180 gaagtggaac cacttcaggt actacccgtc ttctatctgg 220 <210> 11 <211> 439 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 11 <220> <221> misc_feature <222> (264)..(264) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (270)..(270) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (320)..(320) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (328)..(328) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (352)..(352) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (369)..(369) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (381)..(381) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (393)..(393) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (396)..(396) <223> n is a, c, g, or t <400> 11 caagtactgg cgagaccaag cgcaagagac actgaaatat gccctggagc ttcagaagct 60 caacaccaac gtggctaaga atgtcatcat gttcctggga gatgggatgg gtgtctccac 120 agtgacggct gcccgcatcc tcaagggtca gctccaccac aaccctgggg aggagaccag 180 gctggagatg gacaagttcc ccttcgtggc cctctccaag acgtacaaca ccaatgccca 240 ggtccctgac agcgccggca ccgncaccgn ctacctgtgt ggggtgaagg ccaatgaggg 300 caccgtgggg gtaagcgcan ccactgancg ttcccggtgc aacaccaccc angggaacga 360 ggtcacctnc atcctgcgct ngggccaagg acnctnggga aatctgtggg cattgtgacc 420 accacgagag tgaaccatg 439 <210> 12 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 12 <400> 12 ttgggaggcc cttgaagaat cccctcccac agcactgaca gacagagctg gaagatagga 60 aggatcagga agtcagaggc gtagtctagg aaatctagcc cctgatagga gtttcagaaa 120 aagaaaagtg tcccgggacc caaaggcttt gcatttccag gttaaaaagt ccaccagaaa 180 gtccgcccaa gaatggaaat tacccaaacc acaatgcatc gctgtgaaat ttcacaattc 240 ctggattaaa caaaggccct gaaagcttcc agagcaaaca gatcacataa acagctcacc 300 agact 305 <210> 13 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 13 <400> 13 gaccacttat caaaggcatg tgtgtgcagg acaggcttcg ccgaaggttt gaggagccag 60 aggggtttac attgcacctt gagctggaaa agtaaaatat tggcagtctc cgtccttcaa 120 aaacagcagg tattttgtaa ctcaggctcc tgcct 155 <210> 14 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 14 <400> 14 ctgcacctac gggtcctaat aaatcttcac tgtctgactt tagtctccca ctaaaactgc 60 atttcctttc tacaatttca atttctccct tt 92 <210> 15 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 15 <400> 15 aatgttaact tccatctgtg tgtgtggcgt gtgagcgcac ctgtgcgtgt gcacagaagt 60 gctgggcttt gggaatctct tactagccaa agttgctccg tggtttcaac agttgggctg 120 tgtttgcttt aaaggcaata tggggaatac tgaacacacc cggctttctt ctgagttttt 180 ttggttttcc agtgacaagt tagtcataca attcatcccc caaattccca ttctgagggt 240 ccctaacagc tttgtaaaca ttctacaaga acacagttat tttgagttca cttaactttt 300 ttatcaactt ttgatgaccg tcttggtgag tttttcctga gtattcacgg gcactaagta 360 tctcacttat tttttcaacc tacaggaaag tcagtttaaa tgaaacgcac tgtgttcaca 420 gtattctgct aggtgcttta aggaattaaa aaaacaaaac caaaacaaaa caaaacaaaa 480 aaacacttga agggtaaaag tcattttcca tgacggacac tgaataaggg cagggaaatg 540 cttttacaca tgaagtgctg caca 564 <210> 16 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 16 <400> 16 gcagagcagt cagccctacg gacagcagag ttacagtggt tatagccagt ccacggacac 60 ttcaggctat ggc 73 <210> 17 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 17 <400> 17 ggatgtgttc aaggcaagac cgaattcaga aggatatcga cgtcgtgatc cagaagtcca 60 gagctgagga 70 <210> 18 <211> 551 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 18 <220> <221> misc_feature <222> (431)..(458) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 tttcccagta gagcatacac agacgctcaa cttctgtcaa ggaacactgg caaaccaact 60 tcacttattt gcctaaaaat gtgagtgaga gctgtgaatg taatttcagc ccgaaacttc 120 ccagagggga gaagaaaccg gattaaagtc ttacctgtgg tgtgcccatt tcgcttttgt 180 ggtgaagctt ctgccgttga gcctccaggt actcctgaaa tggcttctgc agagatggac 240 ctatgccggg gacagcactg gaagcagggt acagtagccc aaagaaaaag acacatttgg 300 gaagaaaagc aggaaaaacg ttaaagaaaa tgtacttacc acctggactc aaaaggcagg 360 gattggatag gaagaggaat aaaatataaa aatcagagaa ctgctgaaat tctgtgaccc 420 ctttttagtt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnac tccatctaac aaccccttaa 480 aaaccaaaat ctctcccacc aacatgtctg ggagaaacca agagctgtaa atcagaaacc 540 gcttccagca a 551 <210> 19 <211> 326 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 19 <400> 19 gtagatcatg ttcactgcaa tgctggacac tacaggtatc tgtccctggg ccagcaggga 60 cctctgaagc cttctttgtg gccttttttt tttttcatcc tgtggttttt ctaatggact 120 ttcaggaatt ttgtaatctc ataactttcc aagctccacc acttcctaaa tcttaagaac 180 tttaattgac agtttcaatt gaaggtgctg tttgtagact taacacccag tgaaagccca 240 gccatcatga caaatccttg aatgttctct taagaaaatg atgctggtca tcgcagcttc 300 agcatctcct gttttttgat gcttgg 326 <210> 20 <211> 380 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 20 <400> 20 tgaaggtggc cgggcaggac ggctccgtgg tgcagttcaa gatcaagagg cacacgccgc 60 tgagcaagct gatgaaggcc tactgcgaga ggcagggctt gtcaatgagg cagatcagat 120 tcaggttcga cgggcagcca atcaatgaaa ctgacactcc agcacagctg gagaatggag 180 gacgaggaca ccatcgacgt gttccagcag cagacgggag gtgtgccgga gagcagcctg 240 gcagggcaca gtttctagag ggcccgtccc cagcccgggc cgtccatcct cgcattgctg 300 ttgaatggtg agcacgtgac catgccgacc acaaaggtgt ctgcggaaac tcgaggacat 360 tcaccacgat gattttcctc 380 <210> 21 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 21 <400> 21 gcggcgactg gcaatgtttg gcctcaaaag aaacgcggta atcggactca acctctactg 60 tgggggggcc ggcttggggg ccggcagcgg cggcgccacc cgcccgggag ggcgactttt 120 ggctacggag aaggaggcct cggcccggcg agagataggg ggaggg 166 <210> 22 <211> 443 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 22 <400> 22 ccccacttcc caattcatta ggtatgactg tggaaataca gacaaggatc ttagttgata 60 ttttgggctt ggggcagtga gggcttagga caccccaagt ggtttgggaa aggaggaggg 120 gagtggtggg tttatagggg gaggaggagg caggtggtct aagtgctgac tggctacgta 180 gttcgggcaa atcctccaaa agggaaaggg aggatttgct tagaaggatg gcgctcccag 240 tgactacttt ttgacttctg tttgtcttac gcttctctca gggaaaaaca tgcagtcctc 300 tagtgtttca tgtacattct gtggggggtg aacaccttgg ttctggttaa acagctgtac 360 ttttgatagc tgtgccagga agggttagga ccaactacaa attaatgttg gttgtcaaat 420 gtagtgtgtt tccctaactt tct 443 <210> 23 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 23 <400> 23 acgaggagag catcgactgg accaagatcg agcccagcgt caacttcctc aagtcgccca 60 aagacaacgt ggacgacccc acggggaact tccgcagcgg gcccctgacg gggtggcggg 120 tgttcctgct gctgctgtgc gctctcctgg gcatcgttgt ctgcgccgtg gtgggggccg 180 tggtgttcca gaagcggcag gagcggaaca agcgcttcta ctgagtggcg cctccggcgg 240 ggcctgtccc tgggcccagg agccaatgtg aacttttttt tttaccggga ttataaaaga 300 acaacaagat gaccttattt cttaactgtt tcaaataaat gattaaagta ttttcataca 360 ttttgcttct tgcccagcag ggacaggtgg cagagccgag gcttagggtc tggcaccccc 420 cacagctgga gacggaggct ctcctggggc tggtgtctca ggagcagggg tctgtgtcta 480 cagatgggct gtggcccctg c 501 <210> 24 <211> 512 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 24 <400> 24 caacatcatc tgtggcatca cctctgttgc cttctcgcgc agcggacggc tgctgctcgc 60 tggctacgac gacttcaact gcaacatctg ggatgccatg aagggcgacc gtgcaggagt 120 cctcgctggc cacgacaacc gcgtgagctg cctcggggtc accgacgatg gcatggctgt 180 ggccacgggc tcctgggact ccttcctcaa gatctggaac taatggcccc acccccactg 240 ggcccaggcc aggaggggcc ctgccatgcc cacactacag gccagggctg cggggctggc 300 gcaatcccag cccccttccc cgggccacgg ccttgggtcc ctgccctccc acccaggttt 360 ggttcctccc ggggccccca ctgtggagat aagaagggga tggaatgggg gaagaggagg 420 agcaggaggc cctcatcctt ctgctgccct ggggttgggg cctcacccct ctggagggcc 480 ggacagggag gtggaaaccc caggggctgg ct 512 <210> 25 <211> 544 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 25 <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (389)..(389) <223> n is a, c, g, or t <400> 25 tgtgccttca ttcatgggtt aatggattaa tgggttatca caggaatggg actggtggct 60 ttataagaag aggaaaagag aactgagcta gcatgcccag cccacagaga gcctccacta 120 gagtgatgct aagtggaaat gtgaggtgca gctgccacag agggccccca ccangggaaa 180 tgtctagtgt ctagtggatc caggccacag gagagagtgc cttgtggagc gctgggagca 240 ggacctgacc accaccagga ccccagaact gtggagtcag tggcagcatg cagcgccccc 300 ttgggaaagc tttaggcacc agcctgcaac ccattcgagc agccacgtag gctgcaccca 360 gcaaagccac aggcacgggg ctacctgang ccttgggggc ccaatccctg ctccagtgtg 420 tccgtgaggc agcacacgaa gtcaaaagag attattctct tcccacagat accttttctc 480 tcccatgacc ctttaacagc atctgcttca ttcccctcac cttcccaggc tgatctgagg 540 taaa 544 <210> 26 <211> 289 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 26 <400> 26 atcccacctg tgagaatatg aacttctctt ggaggaatga atgcaaccag tgtaaggccc 60 ctaaaccaga tggcccagga gggggaccag gtggctctca catggggggt aactacgggg 120 atgatcgtcg tggtggcaga ggaggctatg atcgaggcgg ctaccggggc cgcggcgggg 180 accgtggagg cttccgaggg ggccggggtg gtggggacag aggtggcttt ggccctggca 240 agatggattc caggggtgag cacagacagg atcgcaggga gaggccgta 289 <210> 27 <211> 521 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 27 <400> 27 gaactaagcg ataacagagt ctcagggggc ctggaagtat tggcagaaaa gtgtccgaac 60 ctcacgcatc taaatttaag tggcaacaaa attaaagacc tcagcacaat agagccactg 120 aaaaagttag aaaacctcaa gagcttagac cttttcaatt gcgaggtaac caacctgaac 180 gactaccgag aaaatgtgtt caagctcctc ccgcaactca catatctcga cggctatgac 240 cgggacgaca aggaggcccc tgactcggat gctgagggct acgtggaggg cctggatgat 300 gaggaggagg atgaggatga ggaggagtat gatgaagatg ctcaggtagt ggaagacgag 360 gaggacgagg atgaggagga ggaaggtgaa gaggaggacg tgagtggaga ggaggaggag 420 gatgaagaag gttataacga tggagaggta gatgacgagg aagatgaaga agagcttggt 480 gaagaagaaa ggggtcagaa gcgaaaacga gaacctgaag a 521 <210> 28 <211> 478 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 28 <400> 28 aatacatggc ttgctgcctg ttgtaccgtg gtgacgtggt tcccaaagat gtcaatgctg 60 ccattgccac catcaaaacc aagcgcacga tccagtttgt ggattggtgc cccactggct 120 tcaaggttgg catcaactac cagcctccca ctgtggtgcc tggtggagac ctggccaagg 180 tacagagagc tgtgtgcatg ctgagcaaca ccacagccat tgctgaggcc tgggctcgcc 240 tggaccacaa gtttgacctg atgtatgcca agcgtgcctt tgttcactgg tacgtgggtg 300 aggggatgga ggaaggcgag ttttcagagg cccgtgaaga tatggctgcc cttgagaagg 360 attatgagga ggttggtgtg gattctgttg aaggagaggg tgaggaagaa ggagaggaat 420 actaattatc cattcctttt ggccctgcag catgtcatgc tcccagaatt tcagcttc 478 <210> 29 <211> 449 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 29 <400> 29 aggacgacgc tgtcggaggc agggagagca aattaccaca gcttcttggc ccagttctgc 60 ccttctttgc tttgggattg cactgggcca tcagctcatg ccaggctatg ggggcagcca 120 gttggcattg ctccccagac tgaacagaaa cctggccgcc ggatgggacc tcctttggca 180 cagacttgac tgtgtaactg cataaactgc agtagcatca ttgccctaga tgccccagga 240 gacctggcac catgaggatt acagacagtg gaatcttact gtcatctgga cagctgtttt 300 cctgtttgga tggtaaagga agttgagagt ctttagacct gtgcacagcc ccgcaccaag 360 gggtgctgta tgctctaggc atcccctccc ccaggggatt ttttaagtag atggggggac 420 acggtgaact ggctgtgtcc atctttgtc 449 <210> 30 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 30 <400> 30 aggtggccca gctcaaacag aaggtcatga cccacgtcag caacggctgt cagctgctgc 60 ttggggtcaa gggacacgcc ttctgaacgt cccctgcccc tttacggaca ccccctcgct 120 tggacggctg ggcacacgcc tcccactggg gtccagggag caggcggtgg gcacccaccc 180 tgggacctag gggcgccgca aaccacactg gactccggcc cccctaccct gcgcccagtc 240 cttccacctc gacgtttaca agccccccct tccacttttt tttgtatgtt ttttttctgc 300 tggaaacaga ctcgattcat attgaatata atatatttgt gtatttaaca gggaggggaa 360 gagggggcga tcgcggcgga gctggccccg ccgcctggta ctcaagcccg cggggacatt 420 gggaagggga cccccgcccc ctgccctccc ctctctgcac cgtactgtgg aaaagaaaca 480 cgcacttagt ctctaaagag tttattttaa gacgtgtttg tgtttgtg 528 <210> 31 <211> 458 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 31 <400> 31 atcaagtaat ccccttttcc agaatgcatt aacccactcc cctgacctca cgctggggca 60 ggtccccaag tgtgcaagct cagtattcat gatggtgggg gatggagtgt cttccgaggt 120 tcttggggga aaaaaaattg tagcatattt aagggaggca atgaaccctc tcccccacct 180 cttccctgcc caaatctgtc tcctagaatc ttatgtgctg tgaataatag gccttcactg 240 cccctccagt ttttatagac ctgaggttcc agtgtctcct ggtaactgga acctctcctg 300 agggggaatc ctggtgctca aattaccctc caaaagcaag tagccaaagc cgttgccaaa 360 ccccacccat aaatcaatgg gccctttatt tatgacgact ttatttattc taatatgatt 420 ttatagtatt tatatatatt gggtcgtctg cttccctt 458 <210> 32 <211> 364 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 32 <400> 32 ctggctccgt agcagaacac tgtaaaagtg cccgcgtctt tgcagtagtt gcagatttca 60 gtcgtcgtgt tacttgtgca caaacagaag ctgggtctta cccgcagcac gagtgtctcg 120 ggctgcccgg agtcgcccgg gagcaggtgc tgcagccaga gttacgcggg ggccacgcgg 180 gccggcgggg gtggggggaa cgtgggggaa cctgtgtttc acgtgactca gcagtgcccg 240 ccgccgtcac cagctatgca ttcactccgt ttccagtgag cagatgtctt gcttggaaag 300 tggacctgtg tctgtgtctg tcctgagaac ttaccagcag aaatcctcat ttctgtgcta 360 cgga 364 <210> 33 <211> 438 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 33 <400> 33 ggctagactt tgccatggct gtcaaaaggg acagccgcaa agccctggtt gcccaggtaa 60 tcaaagagaa gctaaggctg aagtctgcaa caggctctga ggtccgggga aagctagaaa 120 ctaaatcgga cctgaacatg caacagcagg aagaggagga gaaagcccgg ctcctcattg 180 gtttaagtgt gggcgacaag aaccctggca agaagtccat ctttggcagg cgcaaatgat 240 ttggcgattc gagtggctgc agtacaggat ctgactctgg ctcaggctcc agggacttgt 300 ggggtgggag gggcttcccg ttatccacga ggatttgtgg gtgtcagagc ccataggcat 360 cactcttcag cacctggtct gttcgctgca gggcatggtg gacagtaatg ctgagttctg 420 tctcacactg atcaggct 438 <210> 34 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 34 <400> 34 gcagttctct ccctgaaaac acagtacagg ttgagtcaaa tgaggtcatg ggtgcaccag 60 atgacaggac cagaactccc cttgagccat ccaactgttg gagtgactta gatggtggga 120 accacacaga gaatgtggga gaggcagcag tgactcaggt tgaagagcag gcaggcacag 180 tggcctcgtg tcctttaggg catagtgatg acacagttta tcatgatgac aaatgtatgg 240 tagaggtccc ccaagagtta gagacaagca cagggcatag tttagagaaa gaattcacca 300 accaggaagc agctgagccc aaggaggttc cagcgcacag tacagaagta ggtagggatc 360 acaacgaaga agagggtgaa gaaacaggat taagggacga gaaaccaatc aagacagaag 420 ttcctggttc tccagcagga actgagggca actgtcagga agcgacaggt ccaagtacag 480 tagacactca aaatgaaccc ttag 504 <210> 35 <211> 494 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 35 <400> 35 acaagttgac ctccacggtg atgctgtggc tgcagaccaa caaatctggc tctggcacca 60 tgaacctcgg aggcagcctt accagacaga tggagaagga tgaaactgtg agtgactgct 120 ccccacacat agccaacatc gggcgcctgg tagaggacat ggaaaataaa atcagaagta 180 cgctgaacga gatctacttt ggaaaaacaa aggatatcgt caatgggctg aggtctgtgc 240 agacttttgc agacaaatca aaacaagaag ctctgaagaa tgacctggtg gaggctttga 300 agagaaagca gcaatgctaa acctctgttt catgctaacc agacacgccg tgcactcgtt 360 agattccttt cttagaaaac tcgttttctg ctcccttccc tcgtcccttc cctccccgac 420 aggtcacata acagctgcat cattgaccgc acagcgccat ctctccctga gaataaagcc 480 gatagccacc tcct 494 <210> 36 <211> 527 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 36 <400> 36 cagacaacag cctggtggca gcgggccacg actgcttccc ggtgctgttc acctatgacg 60 ccgccgcggg gatgctgagc ttcggcgggc ggctggacgt tcctaagcag agctcgcagc 120 gtggcttgac ggcccgcgag cgcttccaga acctggacaa gaaggcgagc tccgagggtg 180 gcacggctgc gggcgcgggc ctagactcgc tgcacaagaa cagcgtcagc cagatctcgg 240 tgctcagcgg cggcaaggcc aagtgctcgc agttctgcac cactggcatg gatggcggca 300 tgagtatctg ggatgtgaag agcttggagt cagccttgaa ggacctcaag atcaaatgac 360 ctgtgaggaa tatgttgcct tcatcctaac tgctggggaa gcggggagag gggtcaggga 420 ggctaatggt tgctttgctg aatgtttctg gggtaccaat acgagttccc ataggggctg 480 ctccctcaaa aagggagggg acagatgggg agcttttctt acctatt 527 <210> 37 <211> 438 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 37 <400> 37 gaggaactaa aggaactgct acccgaaatt agagagaaga tagaagatgc aaaggagtct 60 cagcgtagtg ggaatgtagc tgaactggct ctgaaagcta ctctggtgga gagttctact 120 tcaggtttca ctcctggtgg aggaggctct tcagtctcca tgattgccag tagaaagcca 180 acagacggtg cttcctcatc aaattgtgtg actgatattt cccaccttgt cagaaagaag 240 aggaaaccag aggaagagag tccccggaaa gatgatgcaa agaaagccaa acaagagccg 300 gaggtgaacg gaggcagtgg ggatgctgtc ccgagtggaa atgaagtttc ggaaaacatg 360 gaggaggagg ctgagaatca gctgaaacgc ggagcagcag tggaggggac actggaggct 420 ggagctacag ttgaaagc 438 <210> 38 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 38 <400> 38 gacatctcga agtggaagcc ctctcagagc ctacccacca caaacagtgg cgtgagtgct 60 caggatcggc agttgctgtg cttctactat gaccaatgtg agacccattt catttccctt 120 ctcaacgcca ttgacgcact cttcagttgt gtcagctcag cccagccccc gcgaatcttc 180 gtggcacaca gcaagtttgt catcctcagt gcacacaaac tggtgttcat tggagacacg 240 ctgacacggc aggtgactgc ccaggacatt cgcaacaaag tcatgaactc cagcaaccag 300 ctctgcgagc agctcaagac tatagtcatg gcaaccaaga tggccgccct ccattacccc 360 agcaccacgg ccctgcagga aatggtgcac caagtgacag acctttctag aaatgcccag 420 ctgttcaagc gctctttgct g 441 <210> 39 <211> 559 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 39 <400> 39 tgagcatggc cgtggagagc accgggactg ccaaggcgga ggccgagtcc cgtgcggagg 60 cagcccggat tgagggagaa gggtccgtgc tgcaggccaa gctaaaagca caggccttgg 120 ccattgaaac ggaggctgag ctccagaggg tccagaaggt ccgagagctg gaactggtct 180 atgcccgggc ccagctggag ctggaggtga gcaaggctca gcagctggct gaggtggagg 240 tgaagaagtt caagcagatg acagaggcca taggccccag caccatcagg gaccttgctg 300 tggctgggcc tgagatgcag gtaaaactgc tccagtccct gggcctgaaa tcaaccctca 360 tcaccgatgg ctccactccc atcaacctct tcaacacagc ctttgggctg ctggggatgg 420 ggcccgaggg tcagcccctg ggcagaaggg tgccagtggc ccagccctgg ggaggggata 480 tccccccagt ctgctcaggc ccctcaagct cctggagaca accacgtggt gcctgtactg 540 cgctaactcc tgattaata 559 <210> 40 <211> 433 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 40 <400> 40 gatcccggtg cagctgaatg ccggccagct gcagtatatc cgcttagccc agcctgtatc 60 aggcactcaa gttgtgcagg gacagatcca gacacttgcc accaatgctc aacagattac 120 acagacagag gtccagcaag gacagcagca gttcagccag ttcacagatg gacagcagct 180 ctaccagatc cagcaagtca ccatgcctgc gggccaggac ctcgcccagc ccatgttcat 240 ccagtcagcc aaccagccct ccgacgggca ggccccccag gtgaccggcg actgagggcc 300 tgagctggca aggccaagga cacccaacac aatttttgcc atacagcccc aggcaatggg 360 cacagccttc ctccccagag gacccggccg acctcagcgc ctcctgcagg ctaggacact 420 ggtgcactac acc 433 <210> 41 <211> 475 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 41 <400> 41 tgaatcagcc ataacgcaca cacacgccac ccagcctctt gtttctagta tgtactttga 60 aatgctaact gagggtcttg atgcttgagc ctttgactga taaaactcaa atagcagtcc 120 ccagtgattt gcctcttagg ttctttctta aattgttggt ggatgactgt acattttagt 180 gatttgaaaa ataactgaca aaccattgaa acagtttatt ttatgttgga agagatggcg 240 cagatgtgtg tcagaaggga gatcacggtg tgagtttcgt agctatttaa gtgatacata 300 cctctagttt ttgtatgtct tttgagatcc tgagttcatc ccctgtgaat cagagtgcac 360 aagcacctct cctgtgagtg gctaatgaga agagggacag accgaccacc agcacagtag 420 ggcagatctg gacagcagaa tgttataacg caagttcatg tgttgctccc aactc 475 <210> 42 <211> 454 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 42 <400> 42 gtcgtctttc tattttcagg tcagctgatt agccacctta gttccatctg caactttagt 60 tcccactggc tgtgtaacct aacatagtca caggctctgg ggactgtcac gtggacatct 120 ttgggaggcc gttattctgc ccaccgcacc ctccgttcat cccctgccct gccgggcacc 180 tcgctctacc ccaggaaaat gtgagctcgt tttcctgctc ggcatgtgct ccccctaagg 240 ctctgctcct ccctgggcct gaaagttcct tctcagcctg agagggggcc cttcgatctc 300 aggcatgact cagcccggct gatgcctctg cagtgctgag tcaggatttg gggccggctc 360 tcttgggtct gtcccctttt cccaggtact gccttacaaa gctgtggcca ggaagtggcc 420 ggtataaagg atgcccaagg tctttgtacg tgtg 454 <210> 43 <211> 502 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 43 <400> 43 acaggagtca gtgtctggct ttttcctctg agcccagctg cctggagagg gtctcgctgt 60 cactggctgg ctcctagggg aacagaccag tgaccccaga aaagcataac accaatccca 120 gggctggctc tgcactaagc gaaaattgca ctaaatgaat ctcgttccaa agaactaccc 180 cttttcagct gagccctggg gactgttcca aagccagtga atgtgaagga aactcccctc 240 cttcggggca atgctccctc agcctcagag gagctctacc ctgctccctg ctttggctga 300 ggggcttggg aaaaaaactt ggcacttttt cgtgtggatc ttgccacatt tctgatcaga 360 ggtgtacact aacatttccc ccgagctctt ggcctttgca tttatttata cagtgccttg 420 ctcggggccc accaccccct caagccccag cagccctcaa caggcccagg gagggaagtg 480 tgagcgcctt ggtatgactt aa 502 <210> 44 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 44 <400> 44 gcaggagctc agcatagacc cagctctctg ggggatggtc acctggtgat ttcaatgatg 60 gcatccagga attagctgag ccaacagacc atgtggacag ctttggccag agctcccgtg 120 tggcatctgg gagccacagt gacccagcca cctggctcag gctagttcca aattccaaaa 180 gattggcttg taaaccttcg tctccctctc ttttacccag agacagcaca tacgtgtgca 240 cacgcatgca cacacacatt cagtatttta aaagaatgtt ttcttggtgc cattttcatt 300 ttattttatt ttttaattct tggaggggga aataagggaa taaggccaag gaagatgtat 360 agctttagct ttagcctggc aacctggaga atccacatac cttgtgtatt gaaccccagg 420 aaaaggaaga ggtcgaacca accctgcgga aggagcatgg tttcaggagt ttattttaag 480 actgctggga aggaaacagg ccccattttg tat 513 <210> 45 <211> 478 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 45 <400> 45 ctgtggccac agcagctttg tacacgaaga ccatccatcc tcccttcgtc caccactcta 60 ctccctccac cctccctccc tgatcccgtg tgccaccagg agggagtggc agctatagtc 120 tggcaccaaa gtccaggaca cccagtgggg tggagtcgga gccactggtc ctgctgctgg 180 ctgcctctct gctccacctt gtgacccagg gtggggacag gggctggccc agggctgcaa 240 tgcagcatgt tgccctggca cctgtggcca gtactcggga cagactaagg gcgcttgtcc 300 catcctggac ttttcctctc atgtctttgc tgcagaactg aagagactag gcgctggggc 360 tcagcttccc tcttaagcta agactgatgt cagaggcccc atggcgaggc cccttggggc 420 cactgcctga ggctcacggt acagaggcct gccctgcctg gccgggcagg aggttctc 478 <210> 46 <211> 468 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 46 <400> 46 aaagcatcat ttgcacctat gtgggaactt tgcctgttgc aaagtattgt ggccgagctg 60 cagctgggag cctgctttct gccagtcttg aggttctgaa gatcagcttt gaaaggaaag 120 tatgtcctag cttagccatt cagaagagaa aaatggaata tcagagttac agttgtcagt 180 gaaactactt tggattttaa cctcttagag gaagaaaaaa ggttagggaa gtgtcaactc 240 tggatgaagg tgatgtgttt gcctctcagt ctttcattca tagcctgcta gtgaaaagga 300 agtaaatgag attcttttgt gtgactttgt agtctctttg tattaccaaa tagttggggt 360 gttgactcct gtgtgttttg caagaatgtg tggtaagcct gggtaaagag aaggaactgc 420 ggtgttggga gagtctttgt gttggggagt ggcaggggat gatttgtt 468 <210> 47 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 47 <400> 47 actgcccaag gcatgttttg cccaccagat catggcccac gtggaggccc acctgcctct 60 gtctcactga actagaagcc gagcctagaa actaacacag ccatcaaggg aatgacttgg 120 gcggccttgg gaaatcgatg agaaattgaa cttcagggag ggtggtcatt gcctagaggt 180 gctcattcat ttaacagagc ttccttaggt tgatgctgga ggcagaatcc cggctgtcaa 240 ggggtgttca gttaagggga gcaacagagg acatgaaaaa ttgctatgac taaagcaggg 300 acaatttgct gccaaacacc catgcccagc tgtatggctg ggggctcctc gtatgcatgg 360 aacccccaga ataaatatgc tcagccaccc tgtgggccgg gcaatccaga cagcaggcat 420 aaggcaccag ttaccctgca tgttggccca gacctcaggt gctagggaag gcgggaacct 480 tgggttgagt aatgctcgtc tgtgtgtttt 510 <210> 48 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 48 <400> 48 agggcactaa ggcacagtat ctggcagcca aggccctaaa gaagcagtca tggcgattcc 60 acaccaagta catgatgtgg ttccagaggc acgaggagcc caagaccatc actgacgagt 120 ttgagcaggg cacctacatc tactttgact acgagaagtg gggccagcgg aagaaggaag 180 gcttcacctt tgagtaccg 199 <210> 49 <211> 422 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 49 <400> 49 gaagatggtt ggcggcattg cccagatcat cgcagcacag gaagaaatgc ttcggaagga 60 acgagagctg gaagaggcgc ggaagaaact ggcccagatc cggcagcagc agtacaagtt 120 tctgccttca gagcttcgag atgagcacta aagaagcctc ttctatttaa tgcagacccg 180 gcccagagac tgtgcgtgcc actaccaaag ccttctgggc tgtcggggcc caacctgccc 240 aaccccagca ctccccaaag tgcctgccaa accccagggc ctggccccgc ccagtcccgc 300 agtacatccc ctgtcccctc cccaacccca agtgccttca tgccctaggg ccccccaagt 360 gcctgcccct ccccagagta ttaactctcc aagagtatta ttaacgctgc tgtacctcga 420 tc 422 <210> 50 <211> 526 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 50 <400> 50 aaggactcag agccacacag aacttctgag aggggctgtt agcattgcgc agcatcttca 60 gttctccagt aaatgatatt gcgttcgtgc ctcagcttta agcacaagta gcagcagctc 120 ctgcttgagt tctgagggca tcatggccct atgattaacc agagtgatct aacctagact 180 aaaattggga acttatttgc aatttttgac cctgaccact aactagtgat tcttctccaa 240 aattgagaaa gacagcaccc attgaaacag atatgtgtgt gaaagtatat ttttcaattc 300 cagattttta attttaaggc tccaggaaag aaaggagagt agaacatttt tcctcatttt 360 atcaaatcct ctcttgccct ccctcaattc ccctgtaaca ttcctgaagc tgttcccact 420 cccagatggt tttatcaata gcctagaggt aaagaactgt ctttttctct gattctttaa 480 taaattatct ttatagaata tgcacaagtt tttctacact cagtgt 526 <210> 51 <211> 466 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 51 <400> 51 gaatatcaca gcttaccttg ggaatactac tgacaatttc tttaaaattt ccaacctgaa 60 gatgggtcat aattacacgt tcaccgtcca agcaagatgc ctttttggca accagatctg 120 tggggagcct gccatcctgc tgtacgatga gctggggtct ggtgcagatg catctgcaac 180 gcaggctgcc agatctacgg atgttgctgc tgtggtggtg cccatcttat tcctgatact 240 gctgagcctg ggggtggggt ttgccatcct gtacacgaag caccggaggc tgcagagcag 300 cttcaccgcc ttcgccaaca gccactacag ctccaggctg gggtccgcaa tcttctcctc 360 tggggatgac ctgggggaag atgatgaaga tgcccctatg ataactggat tttcagatga 420 cgtccccatg gtgatagcct gaaagagctt tcctcactag aaacca 466 <210> 52 <211> 541 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 52 <400> 52 ctatgtgctc cagggggacc caagagcagt ttccacccag ccccaatccc agtctggcac 60 cagcgatcag gtcctttatg ggcagctgct gggcagcccc acaagcccag ggccagggca 120 ctatctccgc tgtgactcca ctcagcccct cttggcgggc ctcaccccca gccccaagtc 180 ctatgagaac ctctggttcc aggccagccc cttggggacc ctggtaaccc cagccccaag 240 ccaggaggac gactgtgtct ttgggccact gctcaacttc cccctcctgc aggggatccg 300 ggtccatggg atggaggcgc tggggagctt ctagggcttc ctggggttcc cttcttgggc 360 ctgcctctta aaggcctgag ctagctggag aagaggggag ggtccataag cccatgacta 420 aaaactaccc cagcccaggc tctcaccatc tccagtcacc agcatctccc tctcctccca 480 atctccatag gctgggcctc ccaggcgatc tgcatacttt aaggaccaga tcatgctcca 540 t 541 <210> 53 <211> 437 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 53 <400> 53 ctaggaggtg cacgggccac catagtcaca ctggcactga aaagaaagcg ttgccctggt 60 gattctttcc cccccgtttg taatgttaac tgatcaggaa gtgcagtttg ggtgggatgc 120 cgaatcgtcg tgctgacatt gagtcacgga tgaggaaggt acaagtcctt taagatcaaa 180 actcaaacgg gccgttcttt ctaaggtgtc ggtatgtggg gagtggtaca aaatggtctg 240 atgctccttc aaaaacattc actttttaca acgtcaagga attaagcata aaaaagattg 300 gttaaaagct ttggtttcta gtaaaggtta gtgtgtgtgg tttttttaag aagctgtttt 360 gctaaattat ttttacttgg aatgtttcaa acagatttca ggctgcaaac ttgttttata 420 atcgtttgct tctccaa 437 <210> 54 <211> 560 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 54 <400> 54 caagtatcgg ggctctgcta tcaaggtgca aagtccttcg tggatgcaac ctcaaccata 60 tattctacag caccctggtg ccgtgttaac tccctcaatg gagcacacca tgtcactaca 120 gcccgcatca atgatcagcc ctctggccca gcagatgagt catctgtcac taggcagcac 180 cggaacatac atgcctgcaa cgtcagctat gcaaggagcc tacttgccac agtatgcaca 240 tatgcagacg acagcggttc ctgttgagga ggcaagtggt caacagcagg tggctgtcga 300 gacgtctaat gaccattctc catatacctt tcaacctaat aagtaactgt gagatgtaca 360 gaaaggtgtt cttacatgaa gaagggtgtg aaggctgaac aatcatggat ttttctgatc 420 aattgtgctt taggaaatta ttgacagttt tgcacaggtt cttgaaaacg ttatttataa 480 tgaaatcaac taaaactatt tttgctataa gttctataag gtgcataaaa cccttaaatt 540 catctagtag ctgttccccc 560 <210> 55 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 55 <400> 55 cctctctgac acgcctttag gcgaaacatg ccccaagaca cagggaccgt ttctccccta 60 ggagcagcgg tggggagcag ggccaaggtc ccctgaccac tgctcagagg agccctaggc 120 cctggccgca gtgccttcag cgcccgaccc gggcccccac ctggtcagcc ctggcggggc 180 ccactcagga cagctggggg ccggggcgtg gcagggccct ctctgtgcct ctcctcctaa 240 gtaggaaggg gctccgggtg gctgctctgg gactgggcac ccacaagggc tcagtgggcc 300 caaacccttg aaatccgtga aaccgggtgg tcccaagagc tagaaactca ggaaacccca 360 ggtgctcagg gccccgcgtc tcgggggctc cgtggggcag acccctgcta atatatgcaa 420 <210> 56 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 56 <400> 56 cgccatcacc cgcaagagag aagctgacca ggccggccgc gtcccctgct gtgggcgaga 60 agctgaaaaa gaccgaacct gccgctggta aagagacagg agctgccaaa cccaagctga 120 cgcctcagga gaagctgaaa ctgaggatgc agaaggcgct gaacaggcag ttcaaggcgg 180 ataagaaggc ggcacaagaa aagatgatcc agcaggagca tgagcggcag gagcgggaag 240 acgagcttcg agccatggcc cgcaagatcc gcatgaagga gcgggaacgc cgagagaagg 300 agagagaaga gtgggaacgc cagtacagcc ggcagagccg ctcaccctcc ccccgataca 360 gtcgagaata cagctcttct cgaaggcgct caaggtcccg atcccgaagc ccccattacc 420 gacattaggc agaagagtgg ggggtgggga ggacaagggg gtgggtaagg ggctcaagct 480 gtgatgctgc tggttttatc tctagtg 507 <210> 57 <211> 553 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 57 <400> 57 gatctacttg tgacttgttg gccttcttcc cacatctgcc tcagactggg gggggctcag 60 ctcctcgggt gatatctagc ctgcttgtga gctctagcag ggataaggag agctgagatt 120 ggagggaatt gtgttgctcc tggaggaagc ccaggcatca ttaaacaagc cagtaggtca 180 cctggcttcc gtggaccaat tcatctttca gacaagcttt agagaaatgg actcagggaa 240 gagactcaca tgctttggtt agtatctgtg tttccggtgg gtgtaatagg ggattagccc 300 cagaagggac tgagctaaac agtgttatta tgggaaagga aatggcattg ctgctttcaa 360 ccagcgacta atgcaatcca ttcctctctt gtttatagta atctaagggt tgagcagtta 420 aaacggcttc aggatagaaa gctgtttccc acctgtttcg ttttaccatt aaaagggaaa 480 cgtgcctctg ccccacgggt agagggggtg cacgttcctc ctggttcctt cgcttgtgtt 540 tctgtactta cca 553 <210> 58 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 58 <400> 58 gccaaagatt cggaacacca gccagcttga ccaccagaga ccccgaggcg aaagtgggat 60 ttctgaaacc tgtaggcccc aagcccatca acttgcccaa agaagattcc aaacctacat 120 ttccctggcc tcctggaaac aagccatctc ttcacagtgt aaaccaagac catgacttaa 180 agccactagg cccgaaatct gggcctactc ctccaacctc agaaaatgaa cagaagcaag 240 cgtttcccaa attgactggg gttaaaggga aatttatgtc agcatcacaa gatcttgaac 300 ccaagcccct cttccccaaa cccgcctttg gccagaagcc gcccctaagt accgagaact 360 cccatgaaga cgaaagcccc atgaagaatg tgtcttcatc aaaagggtcc ccagctcccc 420 tgggagtcag gtccaaaagc ggccctttaa aaccagcaag ggaagactca gaaaataaag 480 accatgcagg ggagatttca agtttgccct ttcctggagt ggttttga 528 <210> 59 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 59 <400> 59 agcctgggac cctaacattt ggagtgcagg aaaaacatat gaacaattaa aagaagagct 60 gggagatgct gctgctatca tgcgaatcac tgctgacatg aagaatgcaa ccctctccct 120 gaattctaat gacagtgagc caaaatatta ccctatagca gttctgttga aaaaccagaa 180 tcaggagctg cctgaggatg taaaccctgc caaaaaggag aattacctct ctgaacagga 240 ctttgtgtct gtgtttggca tcacaagagg gcaatttgca gctctgcctg gctggaaaca 300 gctccaaatg aagaaagaaa aggggctttt ctaaagcaag aaggcctata cctattgcaa 360 ggccacagaa aagagcagat agtgccaata tcaggaaata atttatccac caatttctgc 420 ctgacattca gctacttaat ttagatataa tagagtctgc aaatcacggc atgttctcca 480 tttttt 486 <210> 60 <211> 514 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 60 <400> 60 ataggaccag gtttacagag ctttatattt gcactaggat tttttttttt tgtaattgtc 60 acagaaaatg taattgtggg tgtgtgtgcg tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tatcgtgtgt 120 gtgtgttttg ttttgatttg ggggatattt tgtacaaaaa gaaaacccac gggaagatgt 180 ccgtggagag gcagagcttt catactgaat tagatgtatt ttatgggaat ttggtaaatt 240 tttctttgta tttttttttt ttacatataa gtatatatac acttagagat tgtcatatac 300 ttttaccact tgaattgatc ttcttgccag caatagatct cattttcaaa agcaattctt 360 cggtctgtgt agctggcaga aagttctgtc cagtaaacgc aggatggaat tttcctggga 420 ctctacaccc atcttaaggt ggtatacctt ccaaatcctg gttcagatgg aagaaatagc 480 aggagagagg acccattagc tggcagaccc aggg 514 <210> 61 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 61 <400> 61 ggagaacgca cacctggtgg tcatcaactc ctgggaggag cagaaattca ttgtacaaca 60 cacgaacccc ttcaatacct ggataggtct cacggacagt gatggctctt ggaaatgggt 120 ggatggcaca gactataggc acaactacaa gaactgggct gtcactcagc cagataattg 180 gcacgggcac gagctgggtg gaagtgaaga ctgtgttgaa gtccagccgg atggccgctg 240 gaacgatgac ttctgcctgc aggtgtaccg ctgggtgtgt gagaaaaggc ggaatgccac 300 cggcgaggtg gcctgacccc agcacacctc tggctaaccc ataccccaca cctgcccagc 360 tctggcttct ctgttgagga ttttgaggaa aggaagaaac actgagacag gggtatgggg 420 aagagctgag caaagagaga aaggaggtag tttaagagtc cctgaccctg gaggactgag 480 atcccacctc cttctgtaat tcattgtaat tattataatc gtcagcctct tcaa 534 <210> 62 <211> 527 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe no. 62 <400> 62 ggccttgaca cattacaagc ctggaaaaaa acatcagaaa taataaaaaa tttcagagag 60 aatcaagata cctttttttt tctttttttt ttcttttttt tattatactc taagttttag 120 ggtacatgtg cacattgtgc aggttagtta catatgtata catgtgccat gctggtgcgc 180 tgcacccact aatgtgtcat ctagcattag gtatatctcc cagtgctatc cctcccccct 240 cccccgaccc caccacagtc cccagagtgt gatattcccc ttcctgtgtc catgtgatct 300 cattgttcaa ttcccaccta tgagtgagaa tatgcggtgt ttggtttttt gttcttgcga 360 tagtttactg agaatgatgg tttccaattt catccatgtc cctacaaagg atatgaactc 420 atcatttttt atggctgcat agtattccat ggtgtatatg tgccacattt tcttaatcca 480 gtctatcatt gttggacatt tgggttggtt ccaagtcttt gctattg 527 <210> 63 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 63 <400> 63 atgcagtagc tgccatgtct aaagataaaa ataacatgca acatcgatat attgaactct 60 tcttgaattc tactcctgga ggcggctctg gcatgggagg ttctggaatg ggaggctacg 120 gaagagatgg aatggataat cagggaggct atggatcagt tggaagaatg ggaatgggga 180 acaattacag tggaggatat ggtactcctg atggtttggg tggttatggc cgtggtggtg 240 gaggcagtgg aggttactat gggcaaggcg gcatgagtgg aggtggatgg cgtgggatgt 300 actgaaagca aaaacaccaa catacaagtc ttgacaacag catctggtct actagacttt 360 cttacagatt 370 <210> 64 <211> 334 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 64 <400> 64 caagtatcgg ggctctgcta tcaaggtgca aagtccttcg tggatgcaac ctcaaccata 60 tattctacag caccctggtg ccgtgttaac tccctcaatg gagcacacca tgtcactaca 120 gcccgcatca atgatcagcc ctctggccca gcagatgagt catctgtcac taggcagcac 180 cggaacatac atgcctgcaa cgtcagctat gcaaggagcc tacttgccac agtatgcaca 240 tatgcagacg acagcggttc ctgttgagga ggcaagtggt caacagcagg tggctgtcga 300 gacgtctaat gaccattctc catatacctt tcaa 334 <210> 65 <211> 434 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 65 <220> <221> misc_feature <222> (328)..(328) <223> n is a, c, g, or t <400> 65 gccattacga actctatttt gcccatcaca atctctttca tgaaggatct aataacttaa 60 tcctcatctt actggaaccc attccacaga acagcattcc caacaagtac cacaagctga 120 aggctctcat gacgcagcgg acttatttgc agtggcccaa ggagaaaagc aaacgtgggc 180 tcttttgggc taacattaga gccgctttta atatgaaatt aacactagtc actgaaaaca 240 atgatgtgaa atcttaaaaa aatttaggaa attcaactta agaaaccatt atttacttgg 300 atgatggtga atagtacagt cgtaagtnac tgtctggagg tgcctccatt atcctcatgc 360 cttcaggaaa gacttaacaa aaacaatgtt tcatctgggg aactgagcta ggcggtgagg 420 ttagcctgcc agtt 434 <210> 66 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 66 <400> 66 gctctaagga ccgtcctgcg agatcgcctt ccaaccccac ttttttctgg aaaggagggg 60 tcctgcaggg gcaagcagga gctagcagcc gcctacttgg tgctaacccc tcgatgtaca 120 tagcttttct cagctgcctg cgcgccgccg acagtcagcg ctgtgcgcgc ggagagaggt 180 gcgccgtggg ctcaagagcc tgagtgggtg gtttgcgagg atgagggacg ctatgcctca 240 tgcccgtttt gggtgtcctc accagcaagg ctgctcgggg gcccctggtt cgtccctgag 300 cctttttcac agtgcataag cagttttttt tgtttttgtt ttgttttgtt ttgtttttaa 360 atcaatcatg ttacactaat agaaacttgg cactcctgtg ccctctgcct ggacaagcac 420 atagcaagct gaactgtcct aaggcagggg cgagcacgga acaatggggc 470 <210> 67 <211> 401 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 67 <400> 67 ggagtcacaa gacactgttg cagagaatga tgatggcggg ttcagtgagg aatgggaagc 60 ccagagggac agtcatctag ggcctcatcg ctctacacct gagtcacgag ctgctgtcca 120 ggaactttcc agcagtatcc tcgctggtga agacccagag gaaaggggag taaaacttgg 180 attgggagat ttcattttct acagtgttct ggttggtaaa gcctcagcaa cagccagtgg 240 agactggaac acaaccatag cctgtttcgt agccatatta attggtttgt gccttacatt 300 attactcctt gccattttca agaaagcatt gccagctctt ccaatctcca tcacctttgg 360 gcttgttttc tactttgcca cagattatct tgtacagcct t 401 <210> 68 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 68 <400> 68 gctgatggag atcgtcacct acggccggat cccttaccca gggatgtcaa accctgaagt 60 gatccgagct ctggagcgtg gataccggat gcctcgccca gagaactgcc cagaggagct 120 ctacaacatc atgatgcgct gctggaaaaa ccgtccggag gagcggccga ccttcgaata 180 catccagagt gtgctggatg acttctacac ggccacagag agccagtacc aacagcagcc 240 atgataggga ggaccagggc agggcagggg gtgcccaggt ggtggctcga aggtggctcc 300 agcaccatcc gccagggccc acaccccctt cctactccca gacacccacc ctcgcttcag 360 ccacagtttc ctcatctgtc cagtgggtag gttggactgg aaaatctctt tttgactctt 420 gcaatccaca atctgacatt ctcaggaagc ccccaagttg atatttctat t 471 <210> 69 <211> 556 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 69 <400> 69 tgaaaagtct cccatgtcta cttctttcta cacagacacg gcaaccatcc gatttctcaa 60 tcttttcccc acctttcccc cttttctatt ccacaaaacc gccattgtca tcatggcccg 120 ttctcaatga gctgttgggt acacctccca gacggggtgg tggccgggca gaggggctcc 180 tcacttccca gtaggggcgg ccgggcagag gcgcccctca cctcctggac ggggcggctg 240 gccgggcggg gggctgaccc ccctacctcc ctcccagaca gggcggctgg ccaggcagag 300 gggctcctca cctcccagac ggggcggcgg ggcagaggcg ctcccatctc agacgatggg 360 cggccgggca gagacgctcc tcacttccta gatgggatgg cggccgggca gagacactcc 420 tcactttcca gactgggcag ccaggcagag gggctcctca catcccagac gatgggcggc 480 caggcagaga cgctcctcac ttcccagacg gggtagcggc cgggcagagg ctgcaatctc 540 ggcactttgg ggggcc 556 <210> 70 <211> 539 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 70 <400> 70 gaggacacgt atctctatat cttcctggga tgacaatcag ctacatttgt gaccccggct 60 acctgttagt gggaaagggc ttcattttct gtacagacca gggaatctgg agccaattgg 120 atcattattg caaagaagta aattgtagct tcccactgtt tatgaatgga atctcgaagg 180 agttagaaat gaaaaaagta tatcactatg gagattatgt gactttgaag tgtgaagatg 240 ggtatactct ggaaggcagt ccctggagcc agtgccaggc ggatgacaga tgggaccctc 300 ctctggccaa atgtacctct cgtgcacatg atgctctcat agttggcact ttatctggta 360 cgatcttctt tattttactc atcattttcc tctcttggat aattctaaag cacagaaaag 420 gcaataatgc acatgaaaac cctaaagaag tggctatcca tttacattct caaggaggca 480 gcagcgttca tccccgaact ctgcaaacaa atgaagaaaa tagcagggtc cttccttga 539 <210> 71 <211> 542 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 71 <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 71 gtagcagtgc tctcattggc ctgctgntca tcgcagtggc cattgccacg gtcatcgtca 60 tcagcctggt gatgctgagg aagaggcagt atggcaccat cagccacggg atcgtggagg 120 ttgatccaat gctcacccca gaagagcgtc acctgaacaa gatgcagaac catggctatg 180 agaaccccac ctacaaatac ctggagcaga tgcagattta ggtggcaggg agcgcggcag 240 ccctggcgga gggatgcagg tgggccggaa gatcccacga ttccgatcga ctgccaagca 300 gcagccgctg ccaggggctg cgtctgacat cctgacctcc tggactgtag gactatataa 360 agtactactg tagaactgca atttccattc ttttaaatgg gtgaaaaatg gtaatataac 420 aatatatgat atataaacct taaatgaaaa aaatgatcta ttgcagatat ttgatgtagt 480 tttctttttt aaattaatca gaaaccccac ttccattgta ttgtctgaca catgctctca 540 at 542 <210> 72 <211> 344 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 72 <220> <221> misc_feature <222> (93)..(93) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> n is a, c, g, or t <400> 72 tcttaccccc ttgatggaag cagcttctgg agggtatgca gaggttggaa gagttcttct 60 tgataaagga gcagatgtta atgctccccc tgngccttcc tcaagagata ctgctttaac 120 natagcagca gacaaaggtc actacaaatt ttgtgaactc ctgattcata ggggagnccc 180 acattgatgt tcgtaacaaa aagggaaata cgccactttg gctggcatcc aatggaggtc 240 attttgatgt tgtgcagttg ctagtgcaag caggtgctga tgtggatgca gcagataacc 300 ggaaaatcac acctcttatg tcagcatttc gcaagggtca tgta 344 <210> 73 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 73 <400> 73 ggacccattt tcatttgact tctttgaaga cccttttgag gacttctttg ggaatcgaag 60 gggtccccga ggaagcagaa gccgagggac ggggtcgttt ttctctgcgt tcagtggatt 120 tccgtctttt ggaagtggat tttcttcttt tgatacagga tttacttcat ttgggtcact 180 aggtcacggg ggcctcactt cattctcttc cacgtcattt ggtggtagtg gcatgggcaa 240 cttcaaatcg atatcaactt caactaaatg gttaatggca gaaaaatcac tacaaagaga 300 attgtcgaga acggtcaaga a 321 <210> 74 <211> 514 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 74 <400> 74 gaagtaagcc tcatcatcag agcctttcct caaaactgga gtcccaaatg tcatcaggtt 60 ttgttttttt tcagccacta agaacccctc tgcttttaac tctagaattt gggcttggac 120 cagatctaac atcttgaata ctctgccctc tagagccttc agccttaatg gaaggttgga 180 tccaaggagg tgtaatggaa tcggaatcaa gccactcggc aggcatggag ctataactaa 240 gcatccttag ggttctgcct ctccaggcat tagccctcac attagatcta gttactgtgg 300 tatggctaat acctgtcaac atttggaggc aatcctacct tgcttttgct tctagagctt 360 agcatatctg attgttgtca ggccatatta tcaatgttta cttttttggt actataaaag 420 ctttctgcca cccctaaact ccagggggga caatatgtgc caatcaatag cacccctact 480 cacatacaca cacacctagc cagctgtcaa gggc 514 <210> 75 <211> 512 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 75 <400> 75 gagtaactgc tctctgagtt ttgcacacga agttgccctc atctgctgga gatcgataag 60 gaaggcacaa gacgttctcc tctgcccgtg aggagcttcc cgcagccgcc tggcccagcc 120 tgggcacgtt ctccgaggca tgtgtctccc tgctcaccct cgtctgggca cctcagcatc 180 tgtggacttg agcgtccaaa aaccctgagt gtgattctgg gcagccggcc tggcttgaag 240 tccgccatga ccctgggcac aggggaagcc cagccgtggg cttaggagag agggaccagc 300 gcccagcgtt agggctggaa gacggcagtg ttcagaattc cagccgctca tctgaacaca 360 gaaggtgtga actgacctct aaagcagcgt gagatgggaa tgatctagaa aactttggat 420 ttttgaagta aattttaatg tttcatatta atttcttgaa aatgtattaa atgtcattga 480 aagccttatt acgcttttca gatcctttca at 512 <210> 76 <211> 501 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 76 <400> 76 agatccaaag agccttcgct atgcctgcac ccacgccttc ctccagcccg gtgcccaccc 60 tctctccaga gcagcaggaa atgttgcaag cattctctac ccagtctggc atgaacctcg 120 agtggtccca gaagtgcctt caggacaaca actgggacta caccagatct gcccaggcct 180 tcactcatct caaggccaag ggcgagatcc cagaagtggc attcatgaag tgatcgtagt 240 catgcctcag aagcagtccc ccctgtaaat agtccttgga tattaccgtc tggttgtcgt 300 ctgtcatctc ctcctgtctg gcccgaggcc gccccgtgac tgtgaccgag ggagggaggg 360 ctgcctgatc cctctcctcg cctgccttct ggaagacttc agaagattga gcctcactgg 420 tgccaggaag ccaaagctta ctttgtagaa ctgacactaa actacccgaa ggacttaggt 480 gctttgtgta cttaacccca g 501 <210> 77 <211> 529 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 77 <400> 77 gaaacacatt cctggttttt gcctacactt acgtgttaga caagaactat gatttttttt 60 tttaaagtac tggtgtcacc ctttgcctat atggtagagc aataatgctt tttaaaaata 120 aacttctgaa aacccaaggc caggtactgc attctgaatc agaatctcgc agtgtttctg 180 tgaatagatt tttttgtaaa tatgaccttt aagatattgt attatgtaaa atatgtatat 240 accttttttt gtaggtcaca acaactcatt tttacagagt ttgtgaagct aaatatttaa 300 cattgttgat ttcagtaagc tgtgtggtga ggctaccagt ggaagagaca tcccttgact 360 tttgtggcct gggggagggg tagtgctcca cagcttttcc ttccccaccc cccagcctta 420 gatgcctcgc tcttttcaat ctcttaatct aaatgctttt taaagagatt atttgtttag 480 atgtaggcat tttaattttt taaaaattcc tctaccagaa ctaagcact 529 <210> 78 <211> 514 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 78 <400> 78 tatctctcca tgttcagttc caaggagtcc cagcggggca tgggctacat gcccaaacgt 60 ggcctggagg tgaacaagtg tgagatcgcc aggttctaca agctgcacga gcggaggtgt 120 gagcccattg ccatgacagt gcctcgaaag tcggacctgt tccaggagga cctgtaccca 180 cccaccgcag ggcccgaccc tgccctcacg gctgaggagt ggctgggggg tcgggatgct 240 gggcccctcc tcatctccct caaggatggc tacgtacccc caaagagccg ggagctgagg 300 gtcaaccggg gcctggacac cgggcgcagg agggcagcac cagaggccag tggcactccc 360 agctcggatg ccgtgtctcg gctggaggag gagatgcgga agctccaggc cacggtgcag 420 gagctccaga agcgcttgga caggctggag gagacagtcc aggccaagta gagccccgca 480 gggcctccag cagggtcaga cattcacacc catc 514 <210> 79 <211> 455 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 79 <400> 79 tgaacacctt ctacagcaaa ctcttgcaag tccagtttca tccctgtaag gcaaatgtct 60 tttcacgcag aaagtgccat atagacgaga taaaggcagc taaaacgagg gcagtagaga 120 gcacttaccc gaccccaagg tgccagagat gccctgagga tggtggttaa ggaaacagga 180 gcaggaaatg tacacacaga ttcctgtccc tttgccaact actccttccc catcaaagaa 240 aaacacttgc acacagtaac taccagctcc ttctctcaaa cttgtatttc tcctggaaat 300 gtatctcaga aatgacctcc tctcccaacc acttcaacga ttctttcttt gggtttgggg 360 ttcttgcagt tctatcatct aaaataacct ttggactgca ggtaaaatgc aattaggaca 420 actaaccaag tagacgaaac aagttcccct aggca 455 <210> 80 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 80 <400> 80 ggaatgacac ttacttacga cccaactaca gctgctatac agaacggatt ttatccttca 60 ccatacagta ttgctacaaa ccgaatgatc actcaaactt ctattacacc ctatattgca 120 tctcctgtat ctgcctacca ggtgcaaagt ccttcgtgga tgcaacctca accatatatt 180 ctacagcacc ctggtgccgt gttaactccc tcaatggagc acaccatgtc actacagccc 240 gcatcaatga tcagccctct ggcccagcag atgagtcatc tgtcactagg cagcaccgga 300 acatacatgc ctgcaacgtc agctatgcaa ggagcctact tgccacagta tg 352 <210> 81 <211> 536 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 81 <400> 81 cagttctgaa tatgctgctc atccccacct gtcttcaaca gctccccatt accctcagga 60 caatgtctga actctccagc ttcgcgtgag aagtcccctt ccatcccaga gggtgggctt 120 cagggcgcac agcatgagag cctctgtgcc cccatcaccc tcgtttccag tgaattagtg 180 tcatgtcagc atcagctcag ggcttcatcg tggggctctc agttccgatt ccccaggctg 240 aattgggagt gagatgcctg catgctgggt tctgcacagc tggcctcccg cggttgggtc 300 aacattgctg gcctggaagg gaggagcgcc ctctagggag ggacatggcc ccggtgcggc 360 tgcagctcac cagccccagg ggcagaagag acccaaccac ttcctatttt ttgaggctat 420 gaatatagta cctgaaaaaa tgccaagcac tagattattt ttttaaaaag cgtactttaa 480 atgtttgtgt taatacacat taaaacatcg cacaaaaacg atgcatctac cgctcc 536 <210> 82 <211> 499 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 82 <400> 82 gcatttcgcg ggcgcagtac aacgcgctca ccctcacctt ccagcgcgcc atgcacgact 60 acaaccaggc cgagatgaag cagcgcgaca actgcaagat ccgcatccag cgccagctgg 120 agatcatggg caaggaagtc tcgggcgacc agatcgagga catgttcgag cagggtaagt 180 gggacgtgtt ttccgagaac ttgctggccg acgtgaaggg cgcgcgggcc gccctcaacg 240 agatcgagag ccgccaccgc gaactgctgc gcctggagag ccgcatccgc gacgtacacg 300 agctcttctt gcagatggcg gtgctggtgg agaagcaggc cgacaccctg aacgtcatcg 360 agctcaacgt acaaaagacg gtcgactaca ccggccaggc caaggcgcag gtgcggaagg 420 ccgtgcagta cgaggagaag aacccctgcc ggaccctctg ctgcttctgc tgtccctgcc 480 tcaagtagca ggccggccc 499 <210> 83 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 83 <400> 83 aaaactcttc agccatatta cttctgccag gaaagctagg aaatatgaaa tacctcattt 60 cagacttaag aaggtggaga atattaaaat atggttatca ctgcgttcct atctaaagag 120 acgggggcca cagcgttcag ttgatgtggt tgtatcctcg gttttcctac tgacactttc 180 gattgctttc atttgttgt 199 <210> 84 <211> 260 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 84 <400> 84 agacggggac acggcaggga tgcctggccc tggtcacctg cggccgggca tgtccgggca 60 ggacgaactc gccgtcggag tcaggggaag aactgggtcc ccgggctggg caggagggac 120 ccggccgcga gggagcagag aggcggtccc cctggctgcc ccgagcccgc gaagggaggg 180 aagttccaga atcgagagag ggagggagtc aaggtggaac ccatagagtg agcctcctga 240 agacacagag cggttgcctc 260 <210> 85 <211> 177 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 85 <400> 85 gggagtttga ccagagatgc aaggggtgaa ggagcgcttc ctaccgttag ggaactctgg 60 ggacagagcg ccccggccgc ctgatggccg aggcagggtg cgacccagga cccaggacgg 120 cgtcgggaac cataccatgg cccggatccc caagacccta aagttcgtcg tcgtcat 177 <210> 86 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe No. 86 <400> 86 tggaccgcag cggacactgc ggctcagatc tccaagcgca agtgtgaggc ggccaatgtg 60 gctgaacaaa ggagagccta cctggagggc acgtgcgtgg agtggctcca cagatacctg 120 gagaacggga aggagatgct gcagcgcgcg gaccccccca agacacacgt gacccaccac 180 cctgtctttg actatgaggc caccctgagg tgctgggccc tgggcttcta ccctgcggag 240 atcatactga cctggcagcg ggatggggag gaccagaccc aggacgtgga gctcgtggag 300 accaggcctg caggggatgg aaccttccag aagtgggcag ctgtggtggt gccttctgga 360 gaggagcaga gatacacgtg ccatgtgcag catgaggggc tgccggagcc cctcatgctg 420 agatggaagc agtcttccct gcccaccatc cccatcatgg gtatcgttgc tggcctggtt 480 gtccttgcag ctgtagtcac tgg 503 <210> 87 <211> 517 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 87 <400> 87 gagtgaggcg atttgacctg ctcaaacgta tcttgaagat ggacagaaaa gctgtggaga 60 cccacctgct caggaaccct caccttgttt cggactatag agtgctgatg gcagagattg 120 gtgaggattt ggataaatct gatgtgtcct cattaatttt cctcatgaag gattacatgg 180 gccgaggcaa gataagcaag gagaagagtt tcttggacct tgtggttgag ttggagaaac 240 taaatctggt tgccccagat caactggatt tattagaaaa atgcctaaag aacatccaca 300 gaatagacct gaagacaaaa atccagaagt acaagcagtc tgttcaagga gcagggacaa 360 gttacaggaa tgttctccaa gcagcaatcc aaaagagtct caaggatcct tcaaataact 420 tcaggatgat aacaccctat gcccattgtc ctgatctgaa aattcttgga aattgttcca 480 tgtgattaac atggaactgc ctctacttaa tcattct 517 <210> 88 <211> 473 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 88 <400> 88 cggctctcag caggtctacc tgaacgtctc cctgcagagc aaagccacat caggagtgac 60 tcagggggtg gtcgggggag ctggagccac agccctggtc ttcctgtcct tctgcgtcat 120 cttcgttgta gtgaggtcct gcaggaagaa atcggcaagg ccagcagcgg gcgtgggaga 180 tacgggcata gaggatgcaa acgctgtcag gggttcagcc tctcaggggc ccctgactga 240 accttgggca gaagacagtc ccccagacca gcctccccca gcttctgccc gctcctcagt 300 gggtgaagga gagctccagt atgcatccct cagcttccag atggtgaagc cttgggactc 360 gcggggacag gaggccactg acaccgagta ctcggagatc aagatccaca gatgagaaac 420 tgcagagact caccctgatt gagggatcac agcccctcca ggcaagggag aag 473 <210> 89 <211> 525 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 89 <400> 89 tggacaatac ctggctttcc taggcagagg tccctgcggc cttccgcagt ttttgtgtcc 60 ctgggtactt gagattaggg agtggtgatg actcttaagg agcatgctgc cttcaagcat 120 ctgtttaaca aagcacatct tgcaccgccc ttaatccatt caactctgtg acacagcaca 180 tgtttcagag agcacggggt tgggggtaag gttatagatt aacagaatct caaggcagaa 240 gaatttttct tagtacagaa caaaatggag tctcctatgt ctacttcttt ctacacagac 300 acagtaacaa tctgatctct cttgcttttc cccacaggtt gtcattactt aattatttaa 360 gattcaaaaa tttaaaaatt ccacattgaa gttgtgtgca gtggctcact actgtagtcc 420 cagttactag ggaagctgag gcaggaagac tgcttgagtc caggagatcg aggctccagt 480 gagccatgat cacaccacta ccctccagcc tgagctacag agaga 525 <210> 90 <211> 539 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 90 <400> 90 aagggcagtt tgctggattt cctgaagagc gatgaaggtg gcaaagtgct gcttccaaag 60 ctcattgact tttctgctca gattgcagag ggaatggcat acatcgagcg gaagaactac 120 attcaccggg acctgcgagc agctaatgtt ctggtctccg agtcactaat gtgcaaaatt 180 gcagattttg gccttgctag agtaattgaa gataatgagt acacagcaag ggaaggtgct 240 aagttcccta ttaagtggac ggctccagaa gcaatcaact ttggatgttt cactattaag 300 tctgatgtgt ggtcctttgg aatcctccta tacgaaattg tcacctatgg gaaaattccc 360 tacccaggga gaactaatgc cgacgtgatg accgccctgt cccagggcta caggatgccc 420 cgtgtggaga actgcccaga tgagctctat gacattatga aaatgtgctg gaaagaaaag 480 gcagaagaga gaccaacgtt tgactactta cagagcgtcc tggatgattt ctacacagc 539 <210> 91 <211> 493 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 90 <400> 91 ttcagaacca cgtcagatat accaagtgac tgtgtgtggg gtttgacaac tgtggaaagg 60 cgagcagaaa actccggcgg tctgaggcca tggaggtggt tgctgcattt gagagggagt 120 agggggctag atgtggctcc tagtgcaaac cggaaaccat ggcaccttcc agagccgtgg 180 tctcaaggag tcagagcagg gagctttgat gcaacttatt tgtaagaagg atttttaaat 240 tttttatggg tagaattgta gtcaggaaaa cagaaagggc ttgaaattta ataagtgctg 300 ctggagggga ttttccaagc ctggaagggt attcagcagc tgtggtgggg aaagatttct 360 cctgaaagac tgaacgtgtt tcttcatgac agctgctcaa agcaggtttc tgagatagct 420 gaccgagctc tggtaaatct ctttgtcaaa ttacgaaaac ttcagggcga aatcctatgc 480 ttccatgtac att 493 <210> 92 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 92 <400> 92 ggacaagcct ctggtcaagg tcacattctt ccagaatgga aaatccaaga aattttcccg 60 ttcggatccc aacttctcca tcccacaagc aaaccacagt cacagtggtg attaccactg 120 cacaggaaac ataggctaca cgctgtactc atccaagcct gtgaccatca ctgtccaagc 180 tcccagctct tcaccgatgg ggatcattgt ggctgtggtc actgggattg ctgtagcggc 240 cattgttgct gctgtagtgg ccttgatcta ctgcaggaaa aagcggattt cagccaattc 300 cactgatcct gtgaaggctg cccaatttga gatgctttcc tgcagccacc tggacgtcaa 360 atgattgcca tcagaaagag acaacctgaa gaaaccaaca atgactatga aacagctgac 420 ggcggctaca tgactctgaa ccccagggca cctactgacg atgataaaaa catctacctg 480 actcttcct 489 <210> 93 <211> 511 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 93 <400> 93 atgtcaatgc tgccattgcc accatcaaaa ccaagcgcag catccagttt gtggattggt 60 gccccactgg cttcaaggtt ggcatcaact accagcctcc cactgtggtg cctggtggag 120 acctggccaa ggtacagaga gctgtgtgca tgctgagcaa caccacagcc attgctgagg 180 cctgggctcg cctggaccac aagtttgacc tgatgtatgc caagcgtgcc tttgttcact 240 ggtacgtggg tgaggggatg gaggaaggcg agttttcaga ggcccgtgaa gatatggctg 300 cccttgagaa ggattatgag gaggttggtg tggattctgt tgaaggagag ggtgaggaag 360 aaggagagga atactaatta tccattcctt ttggccctgc agcatgtcat gctcccagaa 420 tttcagcttc agcttaactg acagacgtta aagctttctg gttagattgt tttcacttgg 480 tgatcatgtc ttttccatgt gtacctgtaa t 511 <210> 94 <211> 481 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 94 <400> 94 ccaagcgcag catccagttt gtggattggt gccccactgg cttcaaggtt ggcatcaact 60 accagcctcc cactgtggtg cctggtggag acctggccaa ggtacagaga gctgtgtgca 120 tgctgagcaa caccacagcc attgctgagg cctgggctcg cctggaccac aagtttgacc 180 tgatgtatgc caagcgtgcc tttgttcact ggtacgtggg tgaggggatg gaggaaggcg 240 agttttcaga ggcccgtgaa gatatggctg cccttgagaa ggattatgag gaggttggtg 300 tggattctgt tgaaggagag ggtgaggaag aaggagagga atactaatta tccattcctt 360 ttggccctgc agcatgtcat gctcccagaa tttcagcttc agcttaactg acagacgtta 420 aagctttctg gttagattgt tttcacttgg tgatcatgtc ttttccatgt gtacctgtaa 480 t 481 <210> 95 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 95 <400> 95 gatcccggtg cagctgaatg ccggccagct gcagtatatc cgcttagccc agcctgtatc 60 aggcactcaa gttgtgcagg gacagatcca gacacttgcc accaatgctc aacagattac 120 acagacagag gtccagcaag gacagcagca gttcagccag ttcacagatg gacagcagct 180 ctaccagatc cagcaagtca ccatgcctgc gggccaggac ctcgcccagc ccatgttcat 240 ccagtcagcc aaccagccct ccgacgggca ggccccccag gtgaccggcg actgagggcc 300 tgagctggca aggccaagga cacccaacac aatttttgcc atacagcccc aggcaatggc 360 acagccttcc tccccagagg acccggccga cctcagcgcc tcctgcaggc taggacactg 420 gtgcactaca ccccatgcct ggggccgaga ttctccagca gaa 463 <210> 96 <211> 535 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 96 <400> 96 gtgcatctga ctgtgctttc tgagtggctg gtgctccaga cccctcacct ggagttccag 60 gagggagaaa ccatcgtgct gaggtgccac agctggaagg acaagcctct ggtcaaggtc 120 atattcttcc agaatggaaa atccaagaaa ttttcccgtt cggatcccaa cttctccatc 180 ccacaagcaa accacagtca cagtggtgat taccactgca caggaaacat aggctacacg 240 ctgtactcat ccaagcctgt gaccatcact gtccaagctc ccagctcttc accgatgggg 300 atcattgtgg ctgtggtcac tgggattgct gtagcggcca ttgttgctgc tgtagtggcc 360 ttgatctact gcaggaaaaa gcggatttca gccacctgga cgtcaaatga ttgccatcag 420 aaagagacaa cctgaagaaa ccaacaatga ctatgaaaca gctgacggcg gctacatgac 480 tctgaacccc agggcaccta ctgacgatga taaaaacatc tacctgactc ttcct 535 <210> 97 <211> 461 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 97 <400> 97 gtgtttgtgt ccctgggtac ttgagattag ggagtggtga tgactcttaa cgagcatgct 60 gccttcaagc atctgtttaa caaagcacat cttgcaccac ccttaatcca ttcaaccctg 120 aggggacaca gcacatgttt cagagagcac agggttgggg gtaaggtcac agatcaacag 180 gatcccaagg cagaagaatt tttcttagta cagaacaaaa tgaaaagtct cccatgtcta 240 cctctttcta cacagacatg gcaaccatcc gatttctcaa tcttttcccc acctttcccc 300 cctttctatt ccacaaaacc gccattgtca tcatggcccg ttctcaatga gctgttgagt 360 acacctccca gacggggtgg tggccgggca gatgggctcc tcacttccca gtaggggcgg 420 ctgggcagag gtgcccctca cctcctggac agggtggctg g 461 <210> 98 <211> 514 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 98 <400> 98 gcagtgagat tcctggaggt ggcacccagt gcactctttt gggccacaga catcattgct 60 gttccccgtt acctcgagct gactctagag gggaaggcag agctcaggag ggtgggtggg 120 agctgcagtg ggctcagagt ccagcaatga ggccccctgg cctgggcacc cagctgcagg 180 cccctgccct acgtgcacta caggaagggg tgaggagagc agccagagga aaaccagccc 240 cagaatgctg caacttctct tctctctgga cttcggtgtc ctcggctctg aaggcgctct 300 ctgcacttag atgctgtcag ccctcaacgt aggaggggcc gtggggtccc taagtgattc 360 ttctccctgg caaggctctt ccttttcagg gatatctctg ccaacccctc ccctgtcctc 420 gggttgggct tggccctctc tgcctgagag agctcagcac acacacagct cagacccacg 480 gacaggaccc cgggacagaa ccccgggagc actg 514 <210> 99 <211> 561 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 99 <400> 99 acaagcatcc tgtctcacga agaacaaatg tttgttaatc gtgtgggcca tgattatcag 60 tggataggcc tcaatgacaa gatgtttgag catgacttcc gttggactga tggcagcaca 120 ctgcaatacg agaattggag acccaaccag ccagacagct tcttttctgc tggagaagac 180 tgtgttgtaa tcatttggca tgagaatggc cagtggaatg atgttccctg caattaccat 240 ctcacctata cgtgcaagaa aggaacagtt gcttgcggcc agccccctgt tgtagaaaat 300 gccaagacct ttggaaagat gaaacctcgt tatgaaatca actccctgat tagataccac 360 tgcaaagatg gtttcattca acgtcacctt ccaactatcc ggtgcttagg aaatggaaga 420 tgggctatac ctaaaattac ctgcatgaac ccatctgcat accaaaggac ttattctatg 480 aaatacttta aaaattcctc atcagcaaag gacaattcaa taaatacatc caaacatgat 540 catcgttgga gccggaggtg g 561 <210> 100 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 100 <400> 100 aaatgtgacc ctcgccatgg taaatacatg gcttgctgcc tgttataccg tggtgacgtg 60 gttcccaaag atgtcaatgc tgccattgcc accatcaaaa ccaagcgtac catccagttt 120 gtggattggt gccccactgg cttcaaggtt ggcattaatt accagcctcc cactgtggtg 180 cctggcggag acctggccaa ggtacagaga gctgtgtgca tgctgagcaa taccacagct 240 gttgccgagg cctgggctcg cctggaccac aagtttgacc tgatgtatgc caagcgtgcc 300 tttgttcact ggtacgtggg tgaggggatg gaggaaggcg agttttcaga ggcccgtgag 360 gacatggctg cccttgagaa ggattatgag gaggttggag cagatagtgc tgacggagag 420 gatgagggtg aagagtatta acctgtgtgc tgtactttta cactcctttg tcttggaact 480 gtc 483 <210> 101 <211> 415 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 101 <400> 101 tgtgacttgt atgaaaccct gaccatcacc caggcagtca tcttcatcaa cacccggagg 60 aaggtggact ggctcaccga gaagatgcat gctcgagatt tcactgtatc cgccatgcat 120 ggagatatgg accaaaagga acgagacgtg attatgaggg agtttcgttc tggctctagc 180 agagttttga ttaccactga cctgctggga aaactatatc cacagaatcg gtcgaggtgg 240 acggtttggc cgtaaaggtg tggctattaa catggtgaca gaagaagaca agaggactct 300 tcgagacatt gagaccttct acaacacctc cattgaggaa atgcccctca atgttgctga 360 cctcatctga ggggctgtcc tgccacccag ccccagccag ggctcaatct ctggg 415 <210> 102 <211> 152 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 102 <400> 102 atggctccac actacaggtt caagagaaga gtaatacgtg gtcctggggg attttgaaga 60 tgttaaaggg aaaagatgac agaaagaaaa gtatacgaga gaaacctaaa gtctctgact 120 cagacaataa tgaaggttca tctttccctg ct 152 <210> 103 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 103 <400> 103 tccctgctcc tcctaaacaa ttggacatgg gagatgaagt ttacgatgat gtggatacct 60 ctgatttccc tgtttcatca gcagagatga gtcaaggaac taattttgga aaagctaaga 120 cagaagaaaa ggaccttaag aagctaaaaa agcaggaaaa agaagaaaaa gacttcagga 180 aaaaatttaa atatgatggt gaaattagag tcctatattc aactaaagtt acaacttcca 240 taacttctaa aaagtgggga accagagatc tacaggtaaa acctggtgaa tctctagaag 300 ttatacaaac cacagatgac acaaaagttc tctgcagaaa tgaagaaggg aaatatggtt 360 atgtccttcg gagttaccta gcggacaatg atggagagat ctatgatgat attgctgatg 420 gctgcatcta tgacaatgac t 441 <210> 104 <211> 496 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 104 <400> 104 agccagtcca gtactatttc acgctggctc agcaacccac cgctctccaa gtccagggcc 60 agcagcaagg ccagcagacc accagctcca cgaccaccat ccaggctggg cagatcatca 120 tcgcacagcc tcagcagggc cagaccacac ctgtgacaat gcaggttgga gagggtcagc 180 aggtgcagat tgtccaggct cagccacagg gtcaagccca acaggcccag agtggcactg 240 gacagaccat gcaggtgatg cagcagatca tcactaacac aggagagatc cagcagatcc 300 cggtccagct gaatgccggc caggtgcagt atatccgctt agcccagcct gtatcaggca 360 ctcaagttgt gcagggacag atccagacac ttgtcaccaa tgctcaacag attacacaga 420 cagaggtcca gcaaggacag cagcagttca gccagttcac agatggacag cagctctacc 480 agatccagca agtcac 496 <210> 105 <211> 567 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe no. 105 <400> 105 tcgagcggga tggacagccc tactgtgaaa aggactacca caacctcttc tccccgcgct 60 gctactactg caacggcccc atcctggata aagtggtgac agcccttgac cggacgtggc 120 accctgaaca cttcttctgt gcacagtgtg gagccttctt tggtcccgaa gggttccacg 180 agaaggacgg caaggcctac tgtcgcaagg actacttcga catgttcgca cccaagtgtg 240 gcggctgcgc ccgggccatc ctggagaact atatctcagc cctcaacacg ctgtggcatc 300 ctgagtgctt tgtgtgccgg gaatgcttca cgccattcgt gaacggcagc ttcttcgagc 360 acgacgggca gccctactgt gaggtgcact accacgagcg gcgcggctcg ctgtgttctg 420 gctgccagaa gcccatcacc ggccgctgca tcaccgccat ggccaagaag ttccaccccg 480 agcacttcgt ctgtgccttc tgcctcaagc agctcaacaa gggcaccttc aaggagcaga 540 acgacaagcc ttactgtcag aactgct 567 <210> 106 <211> 470 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 106 <400> 106 gagagagtat gctctgtgtc gtcccagaca tttctgcatt ccgagaaggt tggagatggg 60 tccggcaacc agtccaggtt ccagtaactt tggtccgaaa tgatggaatc atttattcca 120 ccagccttac ctttacctac acaccagaac cagggccgcg gccacattgc agtgcagcag 180 gagcaatcct tcgagccaat tcaagccagg tgccccctaa cgaatcaaac acaaacagcg 240 agggaagtta cacaaacgcc agcacaaatt caaccagtgt cacatcatct acagccacag 300 tggtatccta actaccgtct ttttgctagg acttaaactg acttgagtgt ggcaaaaagt 360 taacaaaaaa ggagaaaaaa tgaacaatcg tttgtggttt cttgggaaaa cttttcatac 420 caggtgatac tattcaaaaa ccccgttgtc tccctgcaag tgctgatttg 470 <210> 107 <211> 361 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 107 <400> 107 aaaccacgca aacccaagag gcagagggcg gctgagatgg aaccacctcc cgaacccaag 60 aggcggaggg tcggtgacgt ggaaccgtca cgcaaaccca agaggcggag ggccgctgac 120 gtggaaccat catcacccga acccaagagg cggagggtcg gtgatgtgga accgtcacgc 180 aaacccaaga ggcggagggc cgctgacgtg gaaccatcat cacccgaacc caagaggcgg 240 agggtcggtg acgtggaacc gtcacgcaaa cccaagaggc ggagggccgc tgacgtggaa 300 ccatcattac ccgaacccaa gaggcggagg ttgagctgag aagaggccag tgcactcaag 360 c 361 <210> 108 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 108 <220> <221> misc_feature <222> (134)..(139) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (188)..(188) <223> n is a, c, g, or t <400> 108 gcagtagcag ttctagtagc agttcaacca gtagcagcag tggaagtagt tccagcagtg 60 gaagtagtag cagtcgcagt agttccagta gcagctccag tacaagtggc agcagcagca 120 gagatagtag cagnnnnnnt agcactagta gtagtagtga gagtagaagt cggagtaggg 180 gccggggnac ataatagaga tagaaagcac agaaggagcg tggatcggaa gagaagggat 240 acttcaggac tagaaagaag tcacaaatct tcaaaaggtg gtagtagtag agatacaaaa 300 ggatcaaagg ataagaattc ccggtccgac agaaagaggt ctatatcaga gagtagtcga 360 tcaggcaaaa gatcttcaag aagtgaaaga gaccgaaaat cagacaggaa agacaaaagg 420 cgttaatgga agaagccagg ctttcttagc cattctttgc agc 463 <210> 109 <211> 424 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 109 <400> 109 agagggccac gtaactgaga gcttacagtg ccaatgccgt ttgtgttctg gccagagtgg 60 agtgcgcagc cctgactccc aggcgctgag attgttgcct ggttacccag gaagctgctg 120 ttccggctgc ccagcctttc tctgagccag cggatgcaca gtccgtggcc ttcttcaggc 180 ttattgatga tgctttttgc aaatgttgaa tcatggttct gtttctaagt tggatctttt 240 ttgttttctc cttgccaccc taatttgaca tcaaaattct ctcttgtgca ttgggccctg 300 ggtcattcaa acccaggtca cctcattccc cttctctgtt cacacctaat gtcttgaaga 360 gtaggtagca gcagtgtggg ctgaacctag gccagcttgc ttagcgggtc accctgctgt 420 gaag 424 <210> 110 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 110 <220> <221> misc_feature <222> (85)..(85) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (191)..(191) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (206)..(206) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (279)..(279) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (299)..(299) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (301)..(301) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (304)..(305) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (315)..(315) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (331)..(331) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (382)..(384) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (387)..(388) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (447)..(448) <223> n is a, c, g, or t <400> 110 gatcaccaat gcttgctttg agccagccaa ccagatggtg aaatgtgacc ctcgccatgg 60 taaatacatg gcttgctgcc tgttntaccg tggtgacgtg gttcccaaag atgtcaatgc 120 tgccattgcc accatcaaaa ccaagcgcan catccagttt gtggattggt gccccactgg 180 cttcaaggtt nggcatcaac taccancctc ccactgtggt gcctggtgga gacctggcca 240 aggtacagag agctgtgtgc atgctgagca acaccacanc cattgctgag gcctgggcnc 300 nccnnggacc acaantttga cctgatgtat nccaagcgtg cctttgttca ctggtacgtg 360 ggtgagggga tggaggaagg cnnnttnnca gaggcccgtg aagatatggc tgcccttgag 420 aaggattatg aggaggttgg tgtggannct gttgaaggag agggtgagga agaaggagag 480 gaatactaat tatccattcc ttttggccct 510 <210> 111 <211> 344 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 111 <400> 111 aggagtggat cctggagcag ctcacgcgcc tctacgactg ccaggaagag gagatcccag 60 aactggagat tgacgtggat gagctcctgg acatggagag tgacgatgcc cgggctgcca 120 gggtcaagga gctgctggtt gactgttaca aacccacaga ggccttcatt tctggcctgc 180 tggacaagat ccggggcatg cagaagctga gcacacccca gaagaagtga gggtccccga 240 cccaggagaa cggtggctcc cacaggacaa tcgctgcccc ccaacctcgt agcaacagca 300 ataccggggg accctgcggc caggcctggt gccatgagca gggc 344 <210> 112 <211> 451 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 112 <400> 112 gtgctcaatg tatttgcctg cttacaacac tgggagatgt gtttgccagt aagttgctca 60 tcacaagagc accagacttg ggggtgtaat ctccggcaac ttgcatgccc tctgaaagaa 120 gggttttctg tgctgtgaaa tgcatagaac tatactttgc catgcacgac tgttcctgca 180 attgatattg tgtgaaatct gggagggtgg tctttgggtg ttctcagggg ccaatggtaa 240 tttttgggtt ggggagccag cttggggtgg ggaattttca cctgggcctc cgctctttaa 300 ctatataaac atttatctgt atatctatgt ccctgtctgg ggggcaggag gaatctgcca 360 aagaccaaca gtcttacttt atcttactat acttcacaaa ggttctaaaa tgtgaagagt 420 ttacttggat tgcagtagcc cattggttgt t 451 <210> 113 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 113 <400> 113 gtaacgaaat gcccatgacg cttccggaga caaccctgga aacactgaag cataaaatca 60 acccctcggc gggggaggcg ttcccacaag cggtggacgt gctgctctac actccagggc 120 atcttgaccc agccgaaaaa gttgaagatg ctcaccccaa gttatggtgt gctctgagcg 180 aaggcaaggt gaccgtgttc aatgcttctt catggaccat ccaccagcac tcctttaaag 240 tgggcactgc aaaagtgaac tgcatggtga tggccgacca gaaccaggtg tgggttggct 300 cggaagactc cgtcatctac atcatcaacg tccacagcat gtcctgcaac aagcagctca 360 cagcccactg ctccagtgtc acggatttga ttgtgcagga cggacaggag gcacccagca 420 acgtgtactc gtgca 435 <210> 114 <211> 460 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe No. 114 <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (318)..(318) <223> n is a, c, g, or t <400> 114 gaaccagttc gaattgccta tgacaggncn nngnnncgtn ccatgtccaa aaagaagaaa 60 cccaaggact tggacttcgc ccagcagaag ctgaccgata agaacctggg cttccagatg 120 ctgcagaaga tgggctggaa ggagggccat ggcctgggct ccctcggaaa gggcatcagg 180 gagccggtca gcgtgggaac cccctcggaa ggggaagggt tgggtgctga cgggcaggag 240 cacaaagaag acacattcga tgtgttccga cagaggatga tgcagatgta cagacacaag 300 cgggccaaca aatagttncc agggtcaccc ccgagaggac aacaggcatc tggaagtgct 360 ctctcgccac tctgggtgct ttactgtctc tggcttgttt ccatcactgg aaatcactta 420 gagaattgta gtgtttttgg tccttgataa agcctagaag 460 <210> 115 <211> 443 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 115 <220> <221> misc_feature <222> (232)..(232) <223> n is a, c, g, or t <400> 115 gaataatgtg gttcttatgc aggaaaagtg ttccagcaca gaatacagcc agtgcaaatg 60 ccctgggata gcaatgcact aaacatgttt aaagaactgc aatgagacag tgtgaccaaa 120 agagaacgtg agtggagaaa atggcagaga caaattagga gaagcagtga gaagccagat 180 cgcgtggttc tatgttatca catggtaaac ctttaaaaat tattatctga gngagacagg 240 aagcctttct agtgctttag aaaaaagaaa taatatgctt taaattaggt tttacaaaga 300 tcacattttg gtgaatagac taagatgtca cagatggaag tcaagggaag tggcaagagc 360 acatggaaga ggatgcaaga agaatcatga tgagggatgg gatgaaggca gcaaggggta 420 accatcttga ccttctgttt ttt 443 <210> 116 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 116 <400> 116 aaatgtgacc ctcgccatgg taaatacatg gcttgctgcc tgttgtaccg tggtgacgtg 60 gttcccaaag atgtcaatgc tgccattgcc accatcaaaa ccaagcgcag catccagttt 120 gtggattggt gccccactgg cttcaaggtt ggcatcaact accagcctcc cactgtggtg 180 cctggtggag acctggccaa ggtacagaga gctgtgtgca tgctgagcaa caccacagcc 240 attgctgagg cctgggctcg cctggaccac aagtttgacc tgatgtatgc caagcgtgcc 300 tttgttcact ggtacgtggg tgaggggatg gaggaaggcg agttttcaga ggcccgtgaa 360 gatatggctg cccttgagaa ggattatgag gaggttggtg tggattctgt tgaaggagag 420 ggtgaggaag aaggagagga atactaatta tccattcctt ttggccctgc agcatgtcat 480 gctcccagaa tttcagcttc 500 <210> 117 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 117 <220> <221> misc_feature <222> (145)..(146) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (148)..(155) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 cacatctacc aacaatcccg gaaggacaac tccaattccc tgcaggtgaa aacgtgccac 60 ctggtcaggt actggatctc cgccttccca gcggagtttg acttgaaccc ggagttggct 120 gagcagatca aggagctgaa ggctnngnnn nnnnnagaag ggaaccgacg gcacagcagc 180 ctaatcgaca tagacagcgt 200 <210> 118 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 118 <400> 118 gagcagattc tagcacatca tggcagtgac caagcgtggt cccgagaagg gccagagcct 60 ggtagagact agggaaggga ggtctcctct agactgactc acattgcctt gagcttttca 120 gttaagttgc tgtaagcacc tgggctgagg aggctgtttt tgttccttcc tgcgttatag 180 cggggccttg tctcttcctc tgcaggacac agatctggag gacgtggact ggggtaggaa 240 accacctgag ggtgttagta cctagtggtg aaatggatga ggtcatttct aaggtgtgtt 300 gcccgtggat ctgggcacaa tcattggaat tccttggagc cactgggatt catggctttg 360 tatccaactg catccaggcc tgaggctgct gacgtttgac accaggccag tagagagtgc 420 ccttttgtat cttaagccaa gaagtgaggc ctgggggtgg gggaggggga aggggtggga 480 gccaatactg agtgcctgca 500 <210> 119 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe No. 119 <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n is a, c, g, or t <400> 119 tggacttctc aaaccaacag tggcctctca gaaccagaac cttcctgttg ccaaantccc 60 acctagcaag ttagtatctg atgacttgga ttcatcttta gccaaccttg tgggcaatct 120 tggcatcg 128 <210> 120 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 120 <400> 120 caaagagggg caactcacac ccatgccccg agagatggca agatctttca ggagaaagtg 60 cggtcaatca tgtacctgag gcattccagc agtggaggaa ggtcccttat gagccctgga 120 tttatggtaa taagcccatc tggttttact gcttcaccat atgaaggaga gaattcctct 180 aatattattc cacaacagat ggccgcccat atgctgcgtt ctagaagcct accagcattc 240 cctacttctt cactactaac gcaatcacaa aaactgactg gaagtttggg ttgtagtatc 300 gacaggttac aaaatattgc agatacttat gttgccaccc aatcaaagaa acaaaattct 360 ttggggagtt ccgacacact gaaaaaaggc aaagaggacg cattcatcag tagctgtgag 420 tctgcaaaaa ctgtttgtga aatggaagct gtcctctcag cccaggtctc tgtcagtgat 480 gtcccaaagg ga 492 <210> 121 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 121 <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (121)..(121) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 tctcacctat acgtgcaaga aaggaacagt tgcttgcggc cancccctgt tgtagaaaat 60 gccaagacct ttggaaagat gaaacctcgt tatgaaatca actccctgat tagataccac 120 ntgcaaagat ggtttcattc aacgtcacct tccaactatc cggtgcttag gaaatggaag 180 atgggctata cctaaaatta cctgcatgaa cc 212 <210> 122 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 122 <400> 122 gcagatcgtg cggctgaaga ccaaggacag gaagaagcaa gtgggcatca agatccccga 60 gggctgcgtg cgccgggtgc tgcaggagct gcggctgatg gatgcggacg tgaagcgcag 120 gcaggcgccc gccctgggct gccccgcccc gcccgccccg cgcccgctgg cgctgccttg 180 cggccccgga gaggtgctgg acctcaccta cagccccccg gccgaggcct tcccgccgcc 240 cccgcacttc tctttcccgg cgccgctgtc cctggacgcc ggccccggcg tcgtgccgct 300 gggcaccccc gacgcccagg ccgaccctgc ggccctcgcg caccagggct gcgacatcaa 360 cttcaaggag gtgctggagg acatgctgcg ctcgctgcac gcggggccgc cctccgaggg 420 cgcgctgggg gagggcgcgg gggcgggggg cgcggcgggc ggtggtcccg agcggcagag 480 cgtgatccag ttcagccc 498 <210> 123 <211> 439 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 123 <220> <221> misc_feature <222> (250)..(250) <223> n is a, c, g, or t <400> 123 gagaacccgc tggtttattg cgacgggcac ggctgcagcg tcgcggtgca tcaagcttgc 60 tatggcattg ttcaagtacc cactggaccg tggttttgca ggaaatgtga atctcaggag 120 agagcagcca gagtggcacc ccctgtaatg gcctatcctg ctactacacc aacaggcatg 180 ataggatatg gaattcctcc acaaatggga agtgttcctg taatgacgca accaacctta 240 atatacagcn agcctgtcat gagacctcca aacccctttg gccctgtatc aggagcacag 300 atacagttta tgtaacttga tggaagaaaa tggaattact ccaaaaagac aagtgctcaa 360 gcagcaaaat ccttacttcc agcaaaatcc aaactgctgt ctcttaaatc tcttaaactc 420 tcttcttcca ttaaaatgt 439 <210> 124 <211> 421 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 124 <400> 124 gcgaaacctg cggagccaga tttgtacagg tggcccacct ccgtgcccat gtgcttatcc 60 acactggtga gaagccctat ccctgtgaaa tctgtggcac ccgtttccgg caccttcaga 120 ctctgaagag ccacctgcga atccacacag gagagaaacc ttaccattgt gagaagtgta 180 acctgcattt ccgtcacaaa agccagctgc gacttcactt gcgccagaag catggcgcca 240 tcaccaacac caaggtgcaa taccgcgtgt cagccactga cctgcctccg gagctcccca 300 aagcctgctg aagcatggag tgttgatgct ttcgtctcca gccccttctc agaatctacc 360 caaaggatac tgtaacactt tacaatgttc atcccatgat gtagtgcctc tttcatccac 420 t 421 <210> 125 <211> 504 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 125 <220> <221> misc_feature <222> (171)..(171) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (184)..(184) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (186)..(186) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (192)..(192) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(264) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (324)..(324) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (326)..(326) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (342)..(342) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (344)..(344) <223> n is a, c, g, or t <400> 125 agagaccgag tgaacctacc ttcatttcag gagggattgg ccgcttggca catgacaact 60 ttgccagctt ttcctccctt gggttctgat attgccgcac tagaggatat aggagaggaa 120 aagtaaggtg cagttgcccc aacctcagac ttaccaggaa gcagatacat ntgagtgtgg 180 aagncngagg gngtttatgt aagagcacct tcctcacttc catacagctc tacgcggcaa 240 attaacttga gttttattta tctnatcctc tggtttaatt acataaatat ttatttttta 300 agtgtaattt tgccaaataa taanancagn aaggaaattg anantagagg gaggtgttta 360 aagagaggtt atagagtaaa agatttgatg ctggagaggt taaggtgcaa taagaattca 420 gggagaaatg ttgttcatta ttggagggta aatgatgtgg tgcctgaggt ctgtacatta 480 cctcttaaca atttctgtcc ttca 504 <210> 126 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 126 <400> 126 gaaacaaagt tgctcttgca gaggcctggt ttgcagcttt acttctcctt ctacatgggc 60 agcaagaccc tgcgaggcag gaacacatcc tctgaatacc aaatactaac tgctagaaga 120 gaagactctg ggttatactg gtgcgaggct gccacagagg atggaaatgt ccttaagcgc 180 agccctgagt tggagcttca agtgcttggc ctccagttac caactcctgt ctggtttcat 240 gtccttttct atctggcagt gggaataatg tttttagtga acactgttct ctgggtgaca 300 atacgtaaag aactgaaaag aaagaaaaag tgggatttag aaatctcttt ggattctgga 360 ggccaagcac ttgaagctcc aactcagggc tgcgcttaag gacatttaca tcctctgaat 420 accaaatact aactgctaga agagaagact ctgggttata ctggtgcgag gctg 474 <210> 127 <211> 455 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 127 <400> 127 tgcaccgatt ccagagccaa aaaccaagga tgacctagag cagctcacga ctgagattaa 60 gaaaagggcc aacaacgtcc ggaacaaact gaagagcatg gagaagcata ttgaagaaga 120 tgaggtcagg tcatcggcag accttcggat tcggaaatcc cagcactctg tcctttctcg 180 gaagtttgtg gaggtgatga ccaaatacaa tgaagctcaa gtggacttcc gagaacgcag 240 caaagggcga atccagcggc agctcgaaat tactggcaaa aagacaaccg atgaggagct 300 ggaggagatg ttggagagtg gcaacccggc catcttcact tctgggatca ttgactcaca 360 gatttccaag caagccctca gtgagattga gggacgacac aaggacattg tgaggctgga 420 gagcagcatc aaggagcttc acgacatgtt tatgg 455 <210> 128 <211> 523 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 128 <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (102)..(102) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (107)..(108) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (134)..(134) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (323)..(323) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (426)..(440) <223> n is a, c, g, or t <400> 128 tacctggagg gcacctgcat ggagtggctc cgcagacacc tggagaacgg gaaggagacg 60 ctgcagcgcg cggacccccc cnaagacaca cgtgacccac cnccctnnct ctgaacatga 120 ggcataacga ggtnctgggt tctgggcttc taccctgcgg agatcacatt gacctggcag 180 cgggatgggg aggaccagac ccaggacatg gagctcgtgg agaccaggcc cacaggggat 240 ggaaccttcc agaagtgggc ggttgtggta gtgccttctg gagaggaaca gagatacaca 300 tgccatgtgc agcacaaggg gcntgcccaa gcccctcatc ctgagatggg agccctctcc 360 ccagcccacc atccccattg tgggtatcat tgctggcctg gttctccttg gagctgtggt 420 cactgnnnnn nnnnnnnnnn ctgtgatgtg gaggaagaag agctcagata gaaaaggagg 480 gagctactct caggctgcaa gcagccaaag tgcccagggc tct 523 <210> 129 <211> 566 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 129 <400> 129 gcctcaacgt gaagcttttc tgggagaagt ttgttcccac agattgtccc ccggccttct 60 tcccgctggc cgccatctgc tgcagactgg agcctgagag cagagccccc cccggggccg 120 caggagaggg cccgggctgc gcggatgatg agggcccagt gaggcgccaa gggaaggtca 180 ccatcaagta tgaccccaag gagctacgga agcacctcaa cctagaggag tggatcctgg 240 agcagctcac gcgcctctac gactgccagg aagaggagat ctcagaacta gagattgacg 300 tggatgagct cctggacatg gagagtgacg atgcctgggc ttccagggtc aaggagctgc 360 tggttgactg ttacaaaccc acagaggcct tcatctctgg cctgctggac aagatccggg 420 ccatgcagaa gctgagcaca ccccagaaga aaccagcatt ctcgaaattg gaggactcct 480 ttgaggccct ctccctgtac ctgggggagc tgggcatccc gctgcctgca gagctggagg 540 agttggacca cactgtgagc atgcag 566 <210> 130 <211> 184 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 130 <220> <221> misc_feature <222> (131)..(131) <223> n is a, c, g, or t <400> 130 gcagggaatg ggaaccggga aggcacgaag tctctaaagc atccagaaga cccctacacc 60 agggtctggt ccgctcctat tcgccgcagc ctttctgttc cgcctgcaac ccattttcca 120 gacagtaaaa nggcggcgca cttctttctc cgtcaggcac caggtcataa ggaacccaag 180 agtc 184 <210> 131 <211> 250 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 131 <400> 131 gggaccgcta taaggccagt cggactgcga catagcccat cccctcgacc gctcgcgtcg 60 catttggccg cctccctacc gctccaagcc cagccctcag ccatggcatg ccccctggat 120 caggccattg gcctcctcgt ggccatcttc cacaagtact ccggcaggga gggtgacaag 180 cacaccctga gcaagaagga gctgaaggag ctgatccaga aggagctcac cattggctcg 240 aagctgcagg 250 <210> 132 <211> 517 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 132 <400> 132 ttgcatgcgc caggcggtgg gcagcggggg cctgtccagc cctctcccgc catccttccc 60 caagtgacgt ccactgcctt gtcaccagcg acctgcctgt catgcccacc ccctgaggaa 120 gcatggggac cctaacaccc tggtgccctg caccagacag gccgtggtca ggcccaggcc 180 accggccggg ttctgccaca gcttcccacg tgcttgctga catgcgtgtg cctgtgtgtg 240 gtgtctgttg ctgtgtcgtg aaactgtgac catcactcag tccaaacaag tgagtggccc 300 tcgaggccac agttatgcaa ctttcagtgt gtgtcataac gacgtcactg ctttttaaac 360 tcgataactc tttattttag taaaatgccc aggagtcctg gaagctacgc ggacttgcag 420 aggttttatt ttttggcctt agaatctgca gaaattagga ggcaccgagc ccagcgcagc 480 agcctcggac ccggattgcg tttgccttag cggatat 517 <210> 133 <211> 463 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 133 <400> 133 ggggtctcat tagctttgca acaggaaaca tcctgtttta ttatggtagt ggggtcagga 60 atgtaggaac tggtatccat tctgccaatt cccacccatt cagtttgctt atccctacag 120 aacagtgact gaggttcctt tttttttttt tttttttttt tttttcaaat ttccatgtat 180 tttctgccat ttttcagggt ctaagattgg tcatacattc ccaatttact ctcagttcca 240 gtcaagctgg ttgctctgaa agtaacccag cttgttgctc taaaatacct cagtagcctg 300 agtgttatac tagagatcta aagggttaac aggatagggt ggaaaggtta gagactccta 360 gaaatctctg gtcaccgtga tcttcggcct cattctaata cctgttcttt ggacagtctt 420 tttcctttgg tgctctcttg cctttagcta ccttctctaa tat 463 <210> 134 <211> 503 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 134 <400> 134 tcgagactgg tacccggagg agctgtctca ccaggagacc acgtcctgga agtgtccggg 60 actcgcggga cctgtggctg cagaccccgc cggcacgcag gcccagagct ggcgcactcc 120 tgaggatgag actctggggg ccctagccgg ggtccacggg agggctgtcc ttggggactc 180 taggatggct tcgttctggc ccggctcact tctggagctg tgagacccaa gacaaaaggg 240 gctgagggat ttctcattga caagagttcg tgcgggaaaa ccacctgacc cctagggatt 300 tgtcatctta agactcaaaa ggcttaatac caggaaccac cttggcaaga tatttaccca 360 ccggccatct ctgtttactc atgaatgtta aatgttaaaa cgcagcgctc taaccctgca 420 tattatttac ttgcaaatgt ctgtaatctg taattgtgat gcctctgatg gaataaatta 480 tctttttcag tctcctctaa aaa 503 <210> 135 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 135 <400> 135 gtgcagagct tttaccagca ggagctggaa atggtggagt ctttgctgtc ccttgccaat 60 cagcctgtga ttcacagtgc ctgctccgac caagtgaatt ttaagaagga caccacttcc 120 aaggcaattc atagtatatt taagaatgct atacaactgc tgcaggaaaa aggacttgtt 180 ttccagaaag atgatggttt tgataaccta tactatgtaa ccagagaaga caaagacctg 240 cacagaaaga tccaccggat cattcagcag gactgccaga aaccaaatca catggagaag 300 ggctgtcact tcctgcacat cttggcctgt gctcgcctga gcatccgccc gggcctgagc 360 gaggctgtgc tgcagcaagt tctggagctc ctggaggacc agagtgacat tgtcagcaca 420 atggagcact actacacagc gttctgagca gagacacgca gaccagctga ggaggacaaa 480 gataaggtgg cattcacccc caggctctga ctttcagcat catgcagg 528 <210> 136 <211> 488 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 136 <400> 136 ggcaaggaag caggtggatc ccccagaagg aaccgcagct cgcgaggcac ctctcctcgt 60 ccccacccac ccccacattt gcacaccttc cacagggtca ggatggagta gctgccttgc 120 gaggtggtga gactcctgtc tctggaggtc tgcaagcact ggtagtgata ttgcagcaga 180 caaggtctgg gttgggcgtc tgcaggagga gaccttgtgg gacatctgag gacatccgca 240 gattcttgtc agcctgtgaa ctaggccctg cctctgtcac ctcattggtc catgaaggag 300 cagccagggg tggtggaagg agcactgggc taggggtcag gggtcagaga ttctgtcctg 360 ctcctgggat gcactggcta ctcccttagt ctactccctt cccctctctg gtcctcagct 420 tcctccatca tggaggagat gggatcatgg attttctggg cataagtggc tgttctggga 480 gtcattcc 488 <210> 137 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 137 <400> 137 agatgacagg catggccggg gtcagctctt tcagccgcgc ttcagcgatg actccagtct 60 gggtgtccca gcgagcccct gcagggacag tatggctgag ggtcaggtgt gctgccagta 120 agtgagggag gggctggcag gaagggtggg gtcctcacac tccccgccct ttgcagagct 180 gggctctacc ccaaaaggct tcaggccagc tgccacagct ggaagcagag gccttcgtag 240 gtgatggcct gcatgttgta actaccccgt cccgctgggc tcaaggaaca gctcagctaa 300 agccctcggg ttccatccgt ttaaatctgt ggcattttca gagcctcatc tgtcagcctt 360 aatgtcagtg gcaggaagtc ataactccag ctaaaaatta cagagtaaag ttccctgatt 420 cttaatgtgt aatgtctgcc ctatgtgt 448 <210> 138 <211> 551 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 138 <400> 138 gcaagtctcg ggatcactca gatgcagcca agaaacacag gcatgaaagg ggacatcata 60 gggacaggcg tgaacgatct cgctcctttg agaggtccca taaaagcaag caccatggtg 120 gcagtcgctc aggacatggc aggcacaggc gctgactttg tcttcctttg agcctgcatc 180 agttcttggt tttgcctatc taccagtgtg atgtatggac tcaatcaaaa acattaaacg 240 caaaactgat taggatttga tttcttgaaa ccctctaggt ctctagaaca ctgaggacag 300 tttcttttga aaagaactat gttaattttt ttgcacatta aaatgcccta gcagtatcta 360 attaaaaacc atggtcaggt tcaattgtac tttattatag ttgtgtattg tttattgcta 420 taagaactgg agcgtgaatt ctgtaaaaat gtatcttatt tttatacaga taaaattgca 480 gacactgttc tatttaagtg gttatttgtt taaatgatgg tgaatacttt cttaacactg 540 gtttgtctgc a 551 <210> 139 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe no. 139 <400> 139 gtcacagggt cgaatactac tgcacagcaa cgaatatgaa tgaaaatatc gctatgcaca 60 gcaacatgga taaatttcac agacatgagg tcaagcaaaa gaggtcagag tcctcatcat 120 caagagagaa ttcattgtat gattctcttc ctacaaaaag tacagaaata agcaaaactg 180 atccatggtg ttagaagcca ggggaacagt taacagggga gggatactgg ggaggggcat 240 cctggagtgc tggtctacct catctgggtg ttgatttcac gagtattgtc agtttgtttc 300 cagactccct gttggagatg tggaaataaa aaccacctaa acaagagcag agaggccatt 360 tggtcaaagt ttgcaaagga gtcagccatg attgcttgt 399 <210> 140 <211> 532 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 140 <400> 140 atcccgacag agtcatgctc gagccctgag tgaccccacc acgcctctgt gacctggaga 60 agatccagaa cttgcgtgca gcttctcctc tcagcacact ttgggctggg atggcagtgg 120 ggcataatgg agccctgggc gatcgctgaa tttcttccct ctgcttcctg gacacagagg 180 aggtctaacg accagagtat tgccctgcca ccactatctc tagtctccct agcttggtgc 240 cttctcctgc aggagtcaga gcagccacat tgcttgcctt cataccctgg aggtggggaa 300 gttatccctc ttccggtgct ttcccatcct gggccactgt atccaggaca tcactcccat 360 gccagccctc cctggcagcc catgttctcc tcttttctca ccccctgact ttccctgaga 420 agaatcatct ctgccaggtc aactggagtc cctggtgact ccattctgag gtgtcacaag 480 caatgaagct atgcaaacaa taggagggtg tgacagggga accgtagact tt 532 <210> 141 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 141 <400> 141 gcagatgtac aactcaccat accaccgggt gacagactgt gtacgggcag tgtggcaaaa 60 tgaaggggcc ggggcctttt accgcagcta caccacccag ctgaccatga acgttccttt 120 ccaagccatt cacttcatga cctatgaatt cctgcaggag cactttaacc cccagagacg 180 gtacaaccca agctcccacg tcctctctgg agcttgcgca ggagctgtag ctgccgcagc 240 cacaacccca ctggacgttt gcaaaacact gctcaacacc caggagtcct tggctttgaa 300 ctcacacatt acaggacata tcacaggcat ggctagtgcc ttcaggacgg tatatcaagt 360 aggtggggtg accgcctatt tccgaggggt gcaggccaga gtaatttacc agatcccctc 420 cacagccatc gcatggtctg tgtatgag 448 <210> 142 <211> 494 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 142 <400> 142 gaaatacacc cgtcagattc tggagggtgt ccattatttg cacagtaata tgattgtcca 60 tagagatatc aaaggcgcaa atatccttcg agattcaaca ggcaacgtca aactaggaga 120 ttttggggcc agcaaacggc ttcagaccat ctgtctctca gggacaggaa tgaagtctgt 180 cacgggcaca ccatactgga tgagccctga agtcatcagt ggacaaggct atggaagaaa 240 agcagacatc tggagtgttg catgtaccgt ggtagaaatg ctaactgaaa agccgccttg 300 ggctgaattt gaagcaatgg ctgccatctt taaaatcgcc actcagccaa caaacccaaa 360 gctgccacct catgtctcag actatactcg agatttcctc aaacggattt ttgtagaggc 420 caaactgaga ccttcagctg atgaactctt aaggcacatg tttgtgcatt atcactagca 480 gccagtaacc tctc 494 <210> 143 <211> 514 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 143 <400> 143 tccactcagc acagttcatg ttcagtagat gctgaacatt cttagaaata ctgtgtgtga 60 acttagaaaa gtgcaagaag acaggcatgt ctttgacccc aggaatgatc atttgctgaa 120 gatggtgtca agtgaaccta gattaacagc cctccactcc agatggatat ccagtgattc 180 ctagaatggg atatagccag agaacaattc tatgcaccct acactgacag actcccttaa 240 gcaacaccag atgctctact ggtacttgaa gtacatgact ttgaagtctt gaccctccat 300 gaatacctga attatcagca agcgggtttt gaagctggtg cctcattgag gccatattag 360 agcaacttgt acatttgacc tcttgttatc agccatggta ctctacttcg tgtgcaagag 420 ataactatga aagccaaatt caaatactgg caacatttcc taaaggggct caatatctta 480 tcattcgtct tcttttccaa actacacatc actg 514 <210> 144 <211> 560 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 144 <400> 144 gttgtgaagg atgtggctct gccatgaagg atgtcctgtt gcctttaaaa tctggaagcg 60 attcaagcca agctgaccaa gaagccaaag aactggctag gcaaataagc tttaaggcag 120 aagtcaattc atctggaaag actatctctg agtcagactt aaaccactct ttttcactaa 180 ctgatttaca agatgatata cctacaacat tccagggtgc tacggccagt acatcgtacg 240 gagtccagaa ttcctcagca gcatcctttc atcaacctac ccaacctgta gctaagaata 300 cctccatgag ccctcgacag cgccgggccc agcagcagag tcagagaagg ttgtctactt 360 caccagatgt aatccagggc caccagccaa gagacaacca cactgatcat ggtgggtcag 420 ctgtactgat tgtcatcctg actttggcat tggcagctct tatattccga cgaatatatc 480 tggcaaacga atacatattt gactttgagt tataatatgg ttttgtgact tatgagctgt 540 gactcaactg cttcattaaa 560 <210> 145 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 145 <220> <221> misc_feature <222> (270)..(270) <223> n is a, c, g, or t <400> 145 gagtgaagaa aacggctctt tccttagtaa ggattttgat gcccgaaagg cctacctggc 60 tggcttcatc aaagacattg tatctcagtt tggaatggga aactgttatc ttacacacag 120 cactgatgct aaagaaaaga attgtggtgt atcaccccaa gatagaagcg gtccaggagt 180 tcaccaggac tctgcctgcc ctggtgtggc accgacagga ctggaccatc cttcactctt 240 acgtgcacct caacgccgat gagctggaan cctgcagatg tgcacaggtt acgtcgctgg 300 atttgtagac ttggaggtga gcaacagacc agacctctat gatgtgtttg tgaatctggc 360 agagagtgag attaccattg ctccccttgc aaaagaggcc atg 403 <210> 146 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 146 <400> 146 cagcctcact gcggcttata cagtacccta acctgctact aatcacagag aaaaatgtga 60 agaaggagga gaagaggaag gctagaagcc tgagcaagtg agggtagaac cttttgggac 120 tggcctttga agctctggcc agggatgggg tgggggccaa aaggacagag cctggtatgt 180 cttcatagtc attgagaatg tggagatacc agtttgggtg gggggtgatc accaggggac 240 ctagggagat ccccttccca ccctctctgt tggcctcaga gtcactcctg ccccctctcc 300 ctgacttggt gctcacatgc acctcactag ggtttgtgac cagggtctgg atgagcttga 360 atttgaatga attgagtttg tatttctaga accctgggtt tttacatgtt tggtcttttt 420 ttgttttggt ttgtcaccct cgataaagga 450 <210> 147 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 147 <400> 147 aagcccaccc tctaagagac attcaagctg aactatcaca attcttaatc agttacaatt 60 tacaaacaga taagtttaaa ataaacaatt tacaaaattt ttgaagcata ccttaacatc 120 ttgttttgca gttaaacaat ggaaaagtat ttctcctaca ctaaaaaaaa acttgcttac 180 acacaactga aaatagaatc ttacttgata atacaaaagc taccatcaga agaaatccct 240 tcaggatcat taagccactt cctttgctct gcagtttcta tagtagtttt aaattattat 300 taaatcacct gaaaaaaatt ccaaaagaga accacacact accatatcca aacaactttt 360 gcatttccca taattgtagt taatgtcagc ccagtaggcc agaccaaccc ccagttcaat 420 actttccttc cccaaaagct ctatactttg aaggaaaaca gatacagtat caaattatga 480 cactttcctt gcccaaatta atgcactggt acacccagtg gctcatattt aacttccccc 540 <210> 148 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 148 <400> 148 cacctggcca agaataccac ttttgaagtt aatccttttg tgtgatacag gatgaacttg 60 ggatgtttga accctggaca ttccaaataa agaataggcc cctgcctggc tcctgggaga 120 taacctctaa gccattagaa tatcttgcct gataagagtg tttttgttta cctgtgggcc 180 ttgggccatg cagtatcagc ttgaccttgc aaggtcaagc tgaggagact aagttagcca 240 tgtgggcagt gaagcatgcc aatgtgatca atccctagta aaagccctgg acacctaggc 300 atg 303 <210> 149 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe no. 149 <400> 149 acaccaaaac cccatctgta tgtcaccatc atcgaggacc aaaggtagat aaaaccacaa 60 agatggggaa aaaacagagc agaaaagctg aaaattataa aaatcagagc gcttctcccc 120 ctccaaagga ccgcagctcc tcaccagcaa cggaacaaag ctggacacag aatgactttg 180 atgagttgag agaagaaggc ttcagagaat cagacttctc cgagctaaag gaggaagttc 240 gaacccatcg caaagaagct aaaaaccttg agaaaagatt agacaaatgg ctaactagag 300 taaccagtgt agagaagtcc ttaaatgacc tgatggagct gaaaaccatg gcatgagaac 360 tacgtgacga atgcacaagc tttagtagct gattcaatca ac 402 <210> 150 <211> 443 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 150 <400> 150 agacagcctg tttcagaggg ttgttttgtt tggggtgtgg gtgttatcaa gtgaattagt 60 cacttgaaag atgggcgtca gacttgcata cgcagcagat cagcatcctt cgctgcccct 120 tagcaactta ggtggttgat ttgaaactgt gaaggtgtga ttttttcagg agctggaagt 180 cttagaaaag ccttgtaaat gcctatattg tgggctttta acgtatttaa gggaccactt 240 aagacgagat tagatgggct cttctggatt tgttcctcat ttgtcacagg tgtcttgtga 300 ttgaaaatca tgagcgaagt gaaattgcat tgaatttcaa gggaatttag tatgtaaatc 360 gtgccttaga aacacatctg ttgtcttttc tgtgtttggt cgatattaat aatggcaaaa 420 tttttgccta tctagtatct tca 443 <210> 151 <211> 528 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 151 <400> 151 cccccagacg gccacagagt gggccgagat cctggcgctg cagaagcaat tccacagcgt 60 ggaggtgcac aagtggaggc agatcctgcg ggcctccgtg gagctcctgg atgagatgaa 120 gttctcgctg gagaagctgc accaaggcat cacagtctca gaccctccct ttgacaccca 180 gccccggccc gatgacagct tttcctgagg accccggcca cgcagctgtt cccccacatg 240 gacagatgga cacacagagc ctcggcggcc actgctggca cggtgtgagc gccaggcatc 300 tcccacccgc ccctcccgac ggcccaacca ggggctgtgc agacgtgggg accacggaac 360 cgagatgcac tttagaccag ggagctggcc cggcctctgg caggcccccc actaacttat 420 tttgcccggc tgaggttgtg gggggcgcct cctggggtgc acgattccct cagctctggg 480 tttaatgtat tatatttatt tggggccgac agtgccccaa taaagggt 528 <210> 152 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 152 <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (335)..(335) <223> n is a, c, g, or t <400> 152 ggtgctggag acccatagag ctgatgggag cagctggtgc ctggccttcg gntcctgcgt 60 ccccagaacc caagggaacg tcatggaggc cacatggggc cacccggctc cctcgggatg 120 gctccgcctg cacttttgaa accccggttt ccttcaacnt ccacattcca ggtgaccaca 180 cgtgtctcct cctcctcatc ttagcttcca ggttcaccct aaccctgtac taacctgctt 240 ggtggacttg gaaaagactt ggctctgtcg ggaaaggaga gacggggcct ccatcacgcc 300 tgttaccaga ggatccccga gagccacacc agctntggac atcaccgccc ctggaactgg 360 ggccaccagc cctgggcacg agatttgctc tgactttat 399 <210> 153 <211> 448 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 153 <220> <221> misc_feature <222> (349)..(350) <223> n is a, c, g, or t <400> 153 gagggacagc gatgtggccc tctgtgttaa gaataacgtg tcctgctttg gcagagagaa 60 gaaaatagcc actgcccgct ttcaaggcaa gatcgacctt ttctgttttg ttttgttttt 120 ctttcttttt cctggccatg aggacaaaaa ttactgagtg gcccttaaag agggaagttt 180 gttttcagct gttctctttt gcccgtaggt gggagggtgg ggattgctgc gtcctagcta 240 gaggaatggc tttgcttgaa tgtgtagtgc acacgcacgg gtgtttctgt gtgctagttg 300 cttcttgctg ctgcttcctg cttgtctggg actcacatac ataacgtgnn atatatatat 360 atatatataa atgtataaat atatatttta ttttttttta aatccttgga gcttctggtt 420 cctatcagtt cctgttgtta atcgtaga 448 <210> 154 <211> 431 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 154 <220> <221> misc_feature <222> (129)..(130) <223> n is a, c, g, or t <400> 154 actttgcctc tctagaagca gcttctcgcc tttccctccc gagggctggc aggagtcact 60 gtcagtcacc cttcatgggg tctgaaaggt tgcatgggct cacctggtct tagacaagga 120 cagttgcann ttccgcacca ggcagacctg cagtttgagt ggctggggat aggtggagcg 180 gcggcctggc cacagtgccc tggacagcag cacatcacat cagttaacac tgtttgcctt 240 ccaactagtt attacggtgt cctgtgggac aattagactg gaggagccaa aggaatgtgc 300 aggggcactg ggtttctgtt tggagagagg ctctcggtaa acagagttcg cattcctcca 360 gattctgtgg gaccagagta aatatcatta tgccacagcc aggcttaagc aatctatctg 420 cagtgccgtt c 431 <210> 155 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 155 <400> 155 gggtgtaagg attcccactg tggctcttca catgatggaa ctgtttgaca caactgtaga 60 gcagctgtat agcatcttca ctgtaaagga gttaacaaat aagaagatca tcatgaaatg 120 gagatgtggg aactggccag aagaacacta tgccatggtt gcactgaatt ttgtgcctac 180 tctagggcaa acagaattac aattgaagga gttcctatct atctgtaaag aagagaacat 240 gaaattctgt tggcagaagc agcattttga agaaataaaa ggttcactgc agctgacccc 300 cctaaatggt tgaattaaaa tttattataa ggcattactt tttgtaagcg gaaaaagtgt 360 cacatttacc tcttc 375 <210> 156 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 156 <220> <221> misc_feature <222> (109)..(109) <223> n is a, c, g, or t <400> 156 caacagggtc agtgtcacag ccacaacttc agaaagcagc catcccgcgt gtcgtccaaa 60 cagcagtgcc tgcgtcccgc tccacggagt cttccagaac acctccctnt gaactaatcc 120 cggagcaccc cacccccagc gagtcccacc tggacctctt caaagtcaaa actcttctct 180 cgggacaaac aaatattcgg gactttcgaa gccctgaact tgagacacca agtttgtctc 240 catggaaaca cgtagccgct gcagttggac agctgcgtgc tggagttctg tccccaaacc 300 aactgcagag aagaaagacg agcctcggcc caggacgcga tttctaacga aa 352 <210> 157 <211> 396 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 157 <400> 157 attgactcca ctggatttgt gctctgttga gtcagaggct cccgggggtt ggggatcgag 60 gggcgggggt cagctatgca gcccatcacg tgtgtttttc atctgggatg aaaaagcctg 120 gttctctttt gaaatgcttg attgtactta ttgagctaaa caagtcttgg tgactgttgt 180 tgatttgcct caaaagtttt aagtcctggg ttttcagact actgtgtagc agctgtgtgt 240 ttaacatact gtagcttttt ctcccttggg ggcacataca aataggatgt gttgatgtgg 300 actctaaact gtaattttcc tgtaactatt ttggaatgat gcatatttct aatgtttgtt 360 atacttgtac agagtattgc tgttggttgc tttttt 396 <210> 158 <211> 450 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 158 <400> 158 tgggaaggcc gtctgtggca agtgcagctc caagcgctcc tccatccccc tgatgggctt 60 cgagtttgaa gtgagggtct gtgacagctg ccacgaggcc atcacagatg aagaacgtgc 120 acccacagcc accttccatg acagtaaaca taacattgtg catgtgcatt tcgatgcaac 180 cagaggatgg ttactgactt ctggaactga caaggttatt aagttgtggg atatgacccc 240 agtcgtgtct tgatgactct cccaggaatc agaaagatag tatttactaa agaaacggtt 300 gttttaaccc aaatcattac cagagtggta aagcagacat gtgagaagta agaaagaaac 360 taaagaccct gaatgaattt gcagattacc catgtgcaca gtggggacct ggccagtgag 420 cactcgcaag gggactcttc caacttgttc 450 <210> 159 <211> 438 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 159 <400> 159 aagaccatcc caaaatgctt caagtaaaaa ataacaagtt taaggggtta agcactttta 60 aagtctgatt aagggggtgg ggggaaaaaa gagtaactac cagccatttc tccaatggac 120 atctcttcca cagacctcaa cgtgagaact gctctagttt ctataaactg taaacctgtg 180 gtggtctgat tatcctgata ttggattttc ttgttttctg ttacaccttg agtcatttgc 240 ctttaggatt ctagacagac ctaagggaaa aagaactgaa aacatatttt gcccccaccc 300 ccacaaaaaa aaatactgaa aactcccccc cgcctcagtt acacatccaa actctacatt 360 tacaaaacga attcagggtg aggaagtaaa aacaggtcat ctattcacaa aactgaaata 420 cttcattacc ccaactaa 438 <210> 160 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 160 <400> 160 ctgccatagc actgatcagt gacaatttac aggaatgtag cagcgatgga attacctgga 60 acagtttttt gtttttgttt ttgtttttgt ttttgtgggg gggggcaact aaacaaacac 120 aaagtattct gtgtcaggta ttgggctgga cagggcagtt gtgtgttggg gtggtttttt 180 tctctatttt tttgtttgtt tcttgttttt taataatgtt tacaatctgc ctcaatcact 240 ctgtctttta taaagattcc acctccagtc ctctctcctc ccccctactc aggcccttga 300 ggctattagg agatgcttga agaactcaac aaaatcccaa tccaagtcaa actttgcaca 360 tatttatatt ta 372 <210> 161 <211> 454 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe no. 161 <220> <221> misc_feature <222> (58)..(58) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (310)..(310) <223> n is a, c, g, or t <400> 161 actacctaag attattttca cagctaccaa tttgtcagaa actttggtgg tgttttgngg 60 gaggctgaga ttttttaaat taaaaatcaa gtgaaaacac aaagactcta agacacgatc 120 ctgatttgtg tcatttctaa gtatcagatt tgttctccct tcatttgaca ggtgttctca 180 gtctctcctc ctgtaagatt ctgtccttcc cctgatgaca agccaatagt tcttggtggg 240 gttgcatgtc tcctagagcc ccaggacccc tgtcgtgtcg gggaaggggg gagggcagga 300 gggtgggcan agactcgggt tgggggaggg agttcaaaga aagagtgaaa atatgggttt 360 atataaacat atttaaagca gtttagcaaa agctttctcg ttgaacagct ttaagaacaa 420 tgtgaatgaa atcttagcaa cttggttagt aatc 454 <210> 162 <211> 410 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 162 <400> 162 aacatttcca cttgccagtt taatttcttg aagactgttg cttgtttgga atgtttcttg 60 tcactgattt taaggttgca tctggaaaag actaaaggct tcagtcccct cccaccacca 120 gaaatgaaca aaaagcattt tacctaaaaa tacaccagca aaatgtactc agcttcaatc 180 acaaatacga ctgcttaaaa ctgcagaaat ttcctcaaca ctcagccttt atcactcagc 240 tggatttttt ccttcaacaa tcactactcc aagcattggg gaacacaact tttaatcata 300 ctccagtcgt ttcacaatgc attctaatag cagcgggatc agaacagtac tgcatttact 360 tgccaacaga acagacagac ctgaagtcaa gacaactgca ttctctgtga 410 <210> 163 <211> 442 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 163 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (115)..(115) <223> n is a, c, g, or t <400> 163 agatattttt ggctgctgac ctaggnnaat gattctactc tatcacatct gnatactatg 60 nntacttact gagtagactc agattttgag taatcatacc ttgactgtag ttgtncatat 120 actctgaaag aaatttatat atcaacctga aataattggt tgaaaccctt tgctcaggta 180 ctttttaaac ttcgtaatta tggaaatttg ttttaagaaa tgttcagtgc tgatacatca 240 tctttctgaa aggatgtaag ttctgtctgt gatcaatgtg aagtaaaaga gttacagcct 300 tttttgtacc attttatccc tgaatactta cctgtatttt aatctgaagt atgatcattt 360 gtgccttcta aagcagatta tttaactgat taaagagtcc cttgaaattg atttttcaag 420 cgttagaagg ttagccatgt aa 442 <210> 164 <211> 282 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 164 <400> 164 ttctgccatt tttcagggtc taagattggt catacattcc caatttactc tcagttccag 60 tcaagctggt tgctctgaaa gtaacccagc ttgttgctct aaaatacctc agtagcctga 120 gtgttatact agagatctaa agggttaaca ggatagggtg gaaaggttag agactcctag 180 aaatctctgg tcaccgtgat cttcggcctc attctaatac ctgttctttg gacagtcttt 240 ttcctttggt gctctcttgc ctttagctac cttctctaat at 282 <210> 165 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 165 <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (386)..(386) <223> n is a, c, g, or t <400> 165 tctgcctttc ttgacctaaa ctgtcatggt aaattcttct tantccnntg tcaccagcca 60 cagacagtcg ccacaagcca tgacaagtct gcgatttcat ggtctttttt tattttgatg 120 atatttcccc agtgtttggg ggacagaaga atgcccacaa tctataggtc ttagtcacat 180 ggatggggac agaatatctg agagagagag aaggaacaag atctactggg gctccttaaa 240 attcttcttg aagaactcct ttctcacctt ggagtaggga agactttctg attatgactc 300 aaaatttaga agctaagaaa gaaaatacct ttaaatctga aaacataaaa ctcaaaaact 360 tctgggtgtt tttttggggg ggttgntttt ttttaaacag cacaagcaac tcaaagggca 420 <210> 166 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 166 <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(64) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (69)..(69) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (79)..(79) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(82) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (86)..(86) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (88)..(88) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (95)..(95) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (99)..(99) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (104)..(104) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> n is a, c, g, or t <400> 166 actgcagcaa actttctagc atctgatatt ggataagnat agcttgtgct anangntgga 60 gatnaatcng gtctgctgnc tngcancntt agagnctgna tctnatggtt ggtgtnagga 120 tgttgttgac agttctgaaa gttagccatc aattcctgtg cagggtggag tcagacccag 180 tgacttcctt ttcaatgtca gcaagagttt tctcatgcct gctttggtca ctttctcttg 240 gaaacttcac gcatttgact tgcagcttct tgacccgagg aatcaactga gctcccagtg 300 ctggctacct tgggcaaata aaatctgtgg ttgagagagt tctctttgct gtgccacagt 360 ccctgtgatg tgccaaatgg caccagcatt tgcagcaaag ctcgttaaat ctttttggaa 420 tgggcaaata ttttttcaac ttgagccctg ctgagc 456 <210> 167 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 167 <220> <221> misc_feature <222> (110)..(114) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (267)..(268) <223> n is a, c, g, or t <400> 167 cttacctatt gcctctgata tttacttgct taaatttttt tttattggaa atccagaaaa 60 agtggattta gagaacaaca ctaactccca cctaatctat gacagagatn nnnnanagag 120 tanctgtgaa aaatgtgaaa gtatctgaaa aatgtaacct ttggcagcct gagcatagtc 180 aaccagaaaa actatctgaa ttaaaataat tggtccatag gtactatttt atttggtcca 240 taaggattat tttttcaact ttttttnnaa gtgtattatt atgtcatttc ccacgtaggt 300 tactgatacc tgaagacttt ttccaccttt aaccttactc gttgaggagc tttg 354 <210> 168 <211> 536 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 168 <400> 168 cttgtctttg gtttctgcta ggttatccag tttgttggcc tgtgattttt catagtgccg 60 tagtctaacc ttgtctttgg tttctgctag gttatccagt ttgttggcct gtgatttttc 120 atagtgccgt agtctaacct tgtctttggt ttctgctagg ttatccagtt tgttggcctg 180 tgatttttca tagtgccgta gtctaacctt gtctttggtt tctgctaggt tatccagttt 240 gttggcctgt gatttttcat agtgccgtag tctaaccttg tctttggttt ctgctaggtt 300 atccagtttg ttggcctgtg atttttcata gtgccgtagt ctaaccttgt ctttggtttc 360 tgctaggtta tccagtttgt tggcctatga tttttcatag tgccgtagtc taaccttgtc 420 tttggtttct gctaggttat ccagtttgtt gacctatgat ttttcatagt gccgtagtct 480 aaccttgtct ttggtttctg ctaggttatc tggtttgttg gcctatgatt tttcat 536 <210> 169 <211> 515 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 169 <400> 169 gatagggtta ctacttgagt tgctatggct ccagctgaaa gaaagcccgt gcagtcatat 60 cacgcgtaaa catttgcttt atgctaaaaa tatggtggac ctggcattac agctattaca 120 aatctcctaa gatgtctcgg gtagtgtatt agttactttt catactgcta tgaagaaata 180 ctggaaactg ggtaatttat aaagaaaaag aggtttaatg tactcacagt tccacaaggc 240 tggagaggcc tcagaatcat ggtggaaggc aaagaaggag caaaaaggta tgtcttccat 300 ggcagcaggc aagagagcac gtgcagggaa actgcccttt ataaaaccat cagatttagt 360 gagatgtatt cactatcacg agaacagtat gggaaaaacc tgcccccatg attcgattac 420 ctcctaccgg gtccctccca cgacacatgg ggattatggg aactacaatt caagatgaaa 480 tttgggtggg gacgcagcca aaccatatcg ggtag 515 <210> 170 <211> 498 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 170 <220> <221> misc_feature <222> (465)..(465) <223> n is a, c, g, or t <400> 170 gacacttgag tttgaaatcc agcccaacca tttactagtt gtgtgacctc tatcaagtta 60 tgcaacctct ctgtgcctca gtttcctttt tggcaaattg gtgctaacac ctcacaggac 120 tattgtaagg attaagttca tgtagataaa gcacttaaca cagcatccga cacatctcat 180 cactcaataa attatcactg ccctttgtta ctgtggttaa caaacacttg ctgtaatttc 240 tctcttctaa cttataggac aaacaaataa tggaaatttt taacataagt atgtagagat 300 tgtggtacca cagtgataaa ctgattttta tgcttaagtt aatgactctg gtttatgtat 360 gacaatttat tcagtatgag aatctcagaa aactaatgtt tttttctatt ccttaacctt 420 cctacccttt ttttggtaaa gaaaattacc gaaaaaacaa aaaanaaaaa aaaaactacc 480 tctgtctatt tattccat 498 <210> 171 <211> 529 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 171 <220> <221> misc_feature <222> (239)..(239) <223> n is a, c, g, or t <400> 171 gcatctagct catagcaagt gcttaataaa tgatctgaaa taaagcaaaa gagattttat 60 caagttgtga ttgcccagtg gcaatcacaa acagagaagt gatgccttct ctgttttttt 120 caggtgcagg tgcacttttg tctatatgac caagatcagt ccttccattc agagtagccc 180 ctctttgagt agtgctgata cctaattttt gatgttgata atttttctgc tctggagtnt 240 gctgcctacc acccttcaga catattatgt taattaaatt atatcatatt ttaccctagc 300 acaccccaga gtaggccctc tacagatatt tgctaaatca gttagatttt agcatctgga 360 agatttggta gacttcttgg tcttataagc aacttttctt tttaaacctt atttccaaac 420 tatgggtatg tactttattt atacagctct tcatagatta cactatgtac tttgaataca 480 tagtatttgt tttcattcga tttactacgt tggttttttt atcttgatg 529 <210> 172 <211> 508 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> probe No. 172 <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (97)..(98) <223> n is a, c, g, or t <400> 172 gccagcagat tccattcatt cgcttcagct ggagactaag agaacagnan gagagggcaa 60 gtatttcctg ccatatatca gacagtgaga aagtgtnncc atgatttagt ttagatgaat 120 tataatggca cacacaaagc acaagctgcc ttgattcaac aaagaagatg gaaaacagaa 180 gccgctctga tcagtgagga agaaaagaaa attacgaaga caagttatgt atttgctctg 240 atttcagaca ctccgaatgt atttgttctg tggtgcagaa tattaagaaa ataacagaca 300 cgctcatgca ttaaaagaat aaccgcaatg tactcatgca taatctacaa catgttttta 360 aaggatggaa atcaaatcta tctgtcatac tttgccctca agtattctgt gggctgttga 420 catcattttg aattacaaat gatgtataca gcttgtgcta caaagatttt ggaactagaa 480 acagaatcag actcatgcat tactttta 508 <210> 173 <211> 455 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 173 <400> 173 atgagtgacc ctctgatagc tactttacag gagcatccta aacatttctc agcattcatc 60 tcatcacact ttcgttcatt ctatgtaact gcagccaatc ttatattcca cagtccttta 120 caacaactct ttgttttgag ctttattata gtggaggtag acttttatga gtattttgtc 180 aagagcgagc cagggaactt ccatattatc ctttcaagag aattggcttc caaagtgact 240 tttcaagaga accagaaggg tcatcccatg ccttagtagt agagctaaac tatcccagaa 300 tagaggctac ttcaaaccta ccctaaacac gtttaaaaag aagccatgaa aggatcaaac 360 aaatctgatt ttccagtaac ttaactgtct tctaacgaag ccattcttta agggaacatg 420 gcaaagttca gatacttaac tcaatgtcca ccagc 455 <210> 174 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 174 <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (275)..(275) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (280)..(281) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (284)..(285) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (287)..(287) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (300)..(300) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (310)..(310) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (314)..(314) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (316)..(319) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (326)..(327) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (334)..(334) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (367)..(367) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (378)..(378) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (389)..(389) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (393)..(393) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (403)..(405) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (413)..(413) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (422)..(424) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (433)..(433) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (436)..(436) <223> n is a, c, g, or t <400> 174 aactgttcaa agccatacct gcacatgttt gaacttcaaa ccctgtgggt gattcagtgg 60 catctttctc taacccccag cctcccttcc cacagaggcc accgtcatgg ccagttgctg 120 cantttcttt ccagagaacc tgtgtatgtg taaagctgta caggcgtggg tacaccacac 180 agcctgtctt gcactgtgga ctgttgagtt actagtacat ctaggtaagc accgcatatc 240 tgtattcatg tctgccttgg tcttttcaac atctntgtgn nagnngngtt tgaattaccn 300 ttcccttttn gggnannnnc cattanngtt gttncagcaa tttttactgt agataaggct 360 ataccgnata tctgtgtnca tgggttttna tgnacatggg cannnatatc tgngagagaa 420 annnttcctc agnagnaatt ctgggcacag catgtgtaaa tttctaaata tgatggacac 480 ccccagcttc cacctcaagg aggttggtcc cattga 516 <210> 175 <211> 458 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 175 <220> <221> misc_feature <222> (148)..(148) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (163)..(163) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (263)..(263) <223> n is a, c, g, or t <400> 175 actagtgtag gctgacaacc caaattaagg aagcaggaga gatcaaacag aactgctgct 60 gggtggttgt caggagctgc tacacggaga accctggact attcgatcaa gcagcaaggc 120 tatatgttca cttatgcaga aatggacnat tgcagatgct aanctttgtt gtgcaagcga 180 aggctcactt ggaaggaaat actcagcccc tctctgggca gcatttgagt tccttatgga 240 tgccgagtcg cgaaacaagt tanttttttt aatgtatcct tctttatgag gagaatgcta 300 cccaaaaatg tattaaagga atattaagtc gtccagagac tgtcttgcta ccaagaactg 360 tgcaatggaa ttctttttac caacattaga ctcctacact agagttagat aacgttttct 420 cacattgagt ttagaagatc tgccttgtca gggaagcc 458 <210> 176 <211> 423 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 176 <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <400> 176 ctcgtgggat gagcaaatga ctctgaaacg gtcccatgcg ggaaatgtcc atgaagtcct 60 ggattttatc taaaaagccc aggcaggggt ggggcggggg cggcggggct acagttccac 120 gctgagctnc ctcctggccg ctcgtccccg ccgcagtgcc tnggcggccc gggcgcccga 180 ccttggccgt ggacaccttc gcggtgcgtg ctgctcctcc ccatctgcca ctggaagatg 240 ctggggcgac ccggctccag gtttagcagg acactgagaa aagggaatgg ctgcctttcg 300 gaggctgggt gagcccttct ctgtgcctca cctgcccgcc ccacagcggc cctgcacctc 360 gtcccacggg gcccattgcc ccggtaggat gcgcgctttt gttttgaggg tcaggcatct 420 tcc 423 <210> 177 <211> 493 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 177 <400> 177 tcagataaag caaacccatg ccctcaagac cccgcaggaa tgccattagg gggcaggagg 60 cctgaatttg gctgtaggaa tttagagaat ttggaggttc tcttccattc aaattttttc 120 ctccaagtgg tatatacttt accataattt tcatcataag ccaaaagtct gacattagcc 180 tgaaggactg tgtgaccatt aaagttagta aattaaacta acttattctt tacaaaagag 240 taaatcattc ttttatccaa agagtgactg aggtctacac tgcactcagc actgagggga 300 gcgccacggt ggaagggaac acacgtgggt cacagtcacc gcacacaagg tacttatggt 360 ctagctgggg atgcaacaca gccacacgcc aaccagggag tgaacaagac agcatgatac 420 atagtaaaat aatgttccag gttaaccagg aaagaagcaa gtgcgactgt gcctttggtt 480 actatgtctt ttc 493 <210> 178 <211> 485 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 178 <220> <221> misc_feature <222> (251)..(251) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (260)..(260) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (334)..(334) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (338)..(338) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (436)..(438) <223> n is a, c, g, or t <400> 178 ggcagtagca gtaatgatgg accggttaat aagagactct gagtgtgatg taaatagtat 60 gtttattaaa caatagagcc cattggaatt tttttcttcc acgtattgtt agatgtaaaa 120 cctgatacac taccatacag acaggtgatt gactagacct tgtttatgta gttctaatgt 180 ggaatactta gagttgttat gaattacgat tatccataac ttttgaatct aaaaagctgg 240 ctacacaacg nattttgttn ggaatctttt tgtaatacca aatgtctaca ctctttgatc 300 tagagaatca caaaatttta gaaacatcac tacncagntt aattgacttt tttattgttt 360 actgtccaaa tacctgttac atattaatag tattctactt tatatacctg taataaacta 420 ttcagggttt cttaannngg ttgttgaaat gttttgtaat actgctcttc ttaccttgtt 480 atagg 485 <210> 179 <211> 389 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 179 <220> <221> misc_feature <222> (125)..(125) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (242)..(242) <223> n is a, c, g, or t <400> 179 gtacatcaga tacaacactc ttctcatctt ttttgtcatt atttttcaat gttgttttaa 60 tctttccact gttgtttcat gtcatgcact ttgttaatat tctttaagtt attcttagtt 120 tttancaatg atacttaaga aagacttaat aggnctatag aataggtact ccctattccc 180 caaccctggg aacacaatat aacatattag ttcatttgta tttaagatct atcttgttta 240 cncctcagtt tagttattgc tcttaccttt caaacagtta atattttgta tctagttctg 300 tgaaagcaaa aagcaacttt attctttctt acaattcccc ttttacttaa tcggaacatt 360 tctttcctgt ttgttcatta gtcactctc 389 <210> 180 <211> 521 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 180 <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (46)..(46) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (107)..(107) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> n is a, c, g, or t <400> 180 tagtgatgga ttgctttgta atactttggg antctgggtt tgncanagtg tgcccctatn 60 aagactaagt gggactataa tgattgngtt ttcttaaatc agaatcngga tgcataacca 120 gatgaaggaa gacatagtcg ggagccatag ttttantatc tagattttgg aattttaggg 180 tgatttacta tagggacaaa gtatttgaaa ttgggattgg cggaacatca gtggaaccag 240 cgattgctaa gttaaatata tacagggaca ttagataatg gatgatgagg aaatgggtaa 300 aagaaagtga gggccttgtg agttgaaaca aaaataatca aacctggaac actttccatt 360 tattgtatta gatatcttca tttcaataaa attaatgtat atgacaaaat tttattgtcc 420 tcctagttca agtggtattc tacttttatt tccataaaaa tatactttca ggatagggaa 480 agggtaaact tgcattataa gtttgtattt tctcacgaag g 521 <210> 181 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 181 <220> <221> misc_feature <222> (154)..(154) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (161)..(161) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (170)..(170) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (176)..(176) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (186)..(186) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (203)..(203) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (236)..(236) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (310)..(310) <223> n is a, c, g, or t <400> 181 ctctcaagta gcttttctca tggacttaag tccccatcgg tgacacggag ggaaaagaac 60 ttcagaacca actgttggcc ctgaaaagac ctcaaagagg gtgcaatcca gttgattttt 120 acattgaaag gtcacagttc cccctctgag agtntgacgg nttgtacaan cccctncccc 180 aggaancctg tatacacagt canccanccc atgaagcagt ctcaggctaa gaactntatt 240 atggaccgta gcccaatctg ttcattttac agatgaggca actgagtcca caggagagca 300 gaacgtgacn tgcgtagaac acaaagttag ttagaggcag acctaggacc caggtaacca 360 <210> 182 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 182 <400> 182 gacctcacag ctctttcagg gaaagcacac tttgtaagca agataacatc tagtaaacct 60 tctgctgttg ccagtgaaaa atttaaagaa caagttgatc ttgcaaaaac catgaccaat 120 ttatcaccaa ccattcttgg caatgcagtt cagttgatct cttcagtccc caaagggaaa 180 ctgccaatcc caccctactc aagaatgaag acaatggagg tttacaaaat caaatcagat 240 gctaacattg caggtttttc tttaccagga cctaaggccg actgtgataa gataccctcc 300 accacagaag gctttaatgc agccaccaag gtggcaagca ggctacctgt tccacaagtg 360 tcacagcaga gtgcctgtga aagtgccttt 390 <210> 183 <211> 407 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Probe No. 183 <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (131)..(131) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (133)..(134) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (184)..(184) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (188)..(209) <223> n is a, c, g, or t <400> 183 tgagactccc ctaaaggcca gaaaggtgcg cttctccgag aaggtcactg tccatttcct 60 ggctgtctgg gncagggncg gcccaggccg cccgccaggg cccctgggag cagcttgctc 120 gggatcgcag ncnnttcgca cgccgcatca cccaggccca ggaggagctg agcccctgcc 180 tcancccnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng gcacgcctca ggaacccacc tttagccccc 240 atccctgccc tcacccagac cttgccttcc tcctctgtcc cttcgtcccc agtccagacc 300 acgcccttga gccaagctgt ggccacacct tcccgctcgt ctgctgctgc agcggctgcc 360 ctggacctca gtgggaggcg tggctgagac caactggttt gcctata 407 - 1 -

Claims (22)

  1. 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법에 있어서,
    a. 개체의 생물학적 시료에서, TncRNA, FKSG49, ZNF438, 1558448_a_at, CAMKK2, LMAN2, 237442_at, FKSG49/LOC730444, JUNB, PRO1073 및 ITGAX로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 핵산 마커들의 핵산 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b. 하나 이상의 핵산 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    c. 하나 이상의 핵산 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며,
    하나 이상의 핵산마커들의 증가는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  2. 제1항에 있어서, 핵산마커들의 군은 하나 이상의 SFRS16, NFYC, NCOA3, PGS1, NEDD9, LIMK2, NASP, 240057_at, LOC730399/LOC731974, FKBP1A, HLA-G, RBMS1 및 SLC6A6을 더욱 포함하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  3. 제1항에 있어서, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식편 수령 개체 또는 비-동종이식편 수령 개체에서 얻어지는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  4. 제1항에 있어서, 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  5. 제1항에 있어서, 단계 a)에서 표 2로부터 선택되는 하나 이상의 핵산마커들의 발현 프로파일을 결정하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  6. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산마커들의 핵산 발현 프로파일은 하나 이상의 마커들에 상응하는 RNA 서열 검출에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  7. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산마커들의 핵산 발현 프로파일은 PCR에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  8. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵산마커들의 핵산 발현 프로파일은 혼성화에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  9. 제9항에 있어서, 혼성화는 올리고뉴클레오티드에 대한 것인, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  10. 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법에 있어서,
    a. 개체의 생물학적 시료에서, KNG1, AFM, TTN, MSTP9/MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 및 UBR4에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 단백질 마커들의 단백질 발현 프로파일을 결정하는 단계;
    b. 단백질 마커들의 발현 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하는 단계; 및
    c. 하나 이상의 단백질 마커들 발현 수준이 대조군 프로파일에 비하여 증가 또는 감소한지를 결정하는 단계로 구성되며,
    5개 이상의 단백질 마커들의 증가 또는 감소는 개체의 급성 거부반응 상태를 표시하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  11. 제10항에 있어서, KNG1 또는 AFM에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 대비 감소하고, 하나 이상의 TTN, MSTP9, MST1, PI16, C2, MBL2, SERPINA10, F9 또는 UBR4에 의해 코딩되는 폴리펩티드 수준은 대조군 프로파일 대비 증가하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  12. 제10항에 있어서, 대조군 프로파일은 비-거부반응, 동종이식편 수령 개체 또는 비--종이식편 수령 개체에서 얻어지는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  13. 제10항에 있어서, 하나 이상의 임상 지표를 위한 수치를 획득하는 단계를 더욱 포함하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  14. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 면역검정에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  15. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 ELISA에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  16. 제10항에 있어서, 단백질 발현 프로파일은 질량 스펙트럼에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  17. 제10항에 있어서,단백질 발현 프로파일은 동위원소 또는 동중원소 표지방법에 의해 결정되는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  18. 제10항에 있어서,단백질 마커들은 하나 이상의 LBP, VASN, ARNTL2, PI16, SERPINA5, CFD, USH1C, C9, LCAT, B2M, SHBG 및 C1S에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 더욱 포함하는, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  19. 제1항에 있어서, 대조군은 자가 대조군인, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  20. 제10항에 있어서, 대조군은 자가 대조군인, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  21. 제1항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장인, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
  22. 제10항에 있어서, 생물학적 시료는 혈액 또는 혈장인, 개체의 동종이식 급성 거부반응 상태 결정방법.
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