CN101432014A - 组织蛋白酶前肽及其应用 - Google Patents

Abstract

描述了细胞或组织中抑制组织蛋白酶L－类蛋白酶活性的方法和所述方法在治疗疾病例如癌症和炎性疾病中的应用。所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸。在具体实施方式中，前肽是组织蛋白酶S前肽。此外，描述了含有Fc部分的前肽的应用。

Description

组织蛋白酶前肽及其应用

技术领域

本申请是关于一种肽和其在治疗方法中的应用。具体而言，是关于一种组织蛋白酶前肽、它的产生方法和所述前肽的应用。

背景技术

蛋白酶是包括了大约2％的所有基因产物的一大群蛋白(Rawlings和Barrett，1999)。蛋白酶催化肽键水解并且对于所有细胞和生物体的正常功能是极其重要的。蛋白酶解加工事件在范围广泛的细胞代谢过程(cellularprocess)是重要的，所述过程包括骨形成、创伤愈合、血管发生和细胞凋亡。

溶酶体半胱氨酸蛋白酶最初认为是负责非选择性降解溶酶体中蛋白的酶。通常与溶酶体位置有关，这些蛋白酶被最初认为仅与非选择性降解内涵体间隔(endosomal compartment)蛋白有关。然而，现在已知它们负责许多特殊的细胞代谢过程，在抗原递呈((Honey和Rudensky，2003；Bryant和Ploegh，2004)、细胞凋亡(Zheng等，2005；Broker等，2005)、激素原加工(Hook等，2004)和细胞外基质重建(extracellular matrixremodelling)(Chapman等，1994；Chapman等，1997)中发挥作用。组织蛋白酶是蛋白水解酶。迄今为止，鉴定了11种人类组织蛋白酶，但仍需要测定每种蛋白酶在体内的特殊作用(Katunuma等，2003)。组织蛋白酶B、L、H、F、O、X和C在多数细胞中表达，提示了在调节蛋白质转换中的可能作用，然而组织蛋白酶S、K、W和V限制在特殊的细胞和组织中，提示它们可能有更特殊的作用(Kos等，2001；Berdowska，2004)。组织蛋白酶L-类(L-like)蛋白酶(其包含CatL、S和K)是蛋白水解酶，其属于半胱氨酸蛋白酶的CA家族。这些溶酶体蛋白酶中的每一种都牵涉于各种肿瘤的发展中。据认为在肿瘤细胞中它们的异常高分泌导致细胞外基质(ECM)的降解。这种ECM组分(例如弹性蛋白和胶原)的异常破坏加速了这些异常细胞对周围正常组织的渗透和侵入。

组织蛋白酶L-类蛋白酶作为失活前体产生，含有N末端前肽域。这种前肽先前显示既充当新生蛋白酶折叠的分子伴侣又充当活性物质的抑制剂，结合到未成熟溶酶体中蛋白酶的活性位点。抑制研究显示CatS前肽(CatSPP)含有对于活化的CatS的在低纳摩尔范围的抑制常数(K_i)，并且可能令人惊奇地，针对CatK和CatL二者也有相似性质，尽管已显示它对于更低同源的CatB、CatH或木瓜蛋白酶没有作用。然而，CatSPP这种性质是独特的，在于前肽K和L针对每种它的同族家庭成员不具有相同均匀抑制图(uniform inhibition profile)。

Cat S(组织蛋白酶S)从牛淋巴结和脾以及从人巨噬细胞cDNA文库克隆的人类形式中最初鉴定(Shi等，1992)。编码Cat S的基因位于人染色体1q21上。由Cat S基因编码的996碱基对转录物最初翻译成具有37.5kDa分子量的未加工前体蛋白。所述未加工蛋白主要由331个氨基酸组成：15个氨基酸的信号肽、99个氨基酸的前肽序列和217个氨基酸的肽。Cat S最初与信号肽一起表达，当它进入内质网腔后所述信号肽被除去。前肽序列结合到蛋白酶活性位点，使其失活直到它被运输到酸性内涵体间隔之后除去前肽序列，并且激活蛋白酶(Baker等，2003)。

Cat S作为在主要组织相容性复合物II类(MHC-II)中介导抗原递呈的关键酶被鉴定，通过抗原负载前切割恒定链。研究显示Cat S缺陷型小鼠通过APC递呈外源蛋白的能力受损(Nakagawa等，1999)。Cat S在加工恒定链Ii中的特异性，允许Cat S在治疗例如哮喘和自身免疫性疾病等病症中，作为特异性的治疗靶点(Chapman等，1997)。

组织蛋白酶L在1988年鉴定人类形式前最初从大鼠肝脏溶酶体中分离(Gal和Gottesman，1988；Joseph等，1988)。编码Cat L的基因绘图在人染色体9q21-22中，并且主要由8个外显子和7个内含子组成(Fan等，1989；Chauhan等，1993)。基因产物翻译成具有39kDa分子量的前蛋白原并且加工成2种酶活性同工型：31kDa的单链形式和包括24kDa重链以及5kDa轻链的双链形式(Mason等，1989)。前-Cat L变为成熟活性酶的加工经由包括自催化活化法(Salminen和Gottesman，1990)的各种机制，以及通过Cat D(Nishimura等，1989；Wiederanders和Kirschke，1989)或金属内肽酶(Hara等，1988)作用发生。

Cat L有内肽酶活性，并且优先地切割P2和P3位间疏水性氨基酸残基肽键(

等，1980，1981)。已显示它以例如组织蛋白酶S相同的特异活性水解几种蛋白(Kirschke等，1989)。然而，它偏爱P2位中的芳香族残基，使其与密切相关的组织蛋白酶S和K区分开来(McGrath，1999)。

Cat L被提出在许多生物过程中具有主要作用，所述过程包括溶酶体蛋白水解和骨吸收，以及几种疾病例如关节炎和恶性肿瘤(Rukamp和Powers，2002)。溶酶体半胱氨酸蛋白酶在抗原递呈中的作用在过去的几年里被广泛研究。Cat L通过它在皮质的胸腺上皮细胞中进行Ii蛋白水解最后步骤的能力牵涉于这个过程中。进一步的证据显示Ii链p41同工型有与成熟的Cat L蛋白相互作用的能力，从而在中性pH环境中稳定它和抑制它的活性(Ogrinc等，1993；Bevec等，1996)。在Cat L缺陷小鼠研究中观察到其不能降解胸腺皮质上皮细胞中恒定链(Nakagawa等，1998)，并且表现出在CD4+T细胞选择中的明显缺陷(Roth等，2000)。缺失组织蛋白酶L小鼠由于毛囊形态形成中的改变也形成周期性落发和表皮增殖性异常(epidermal hyperplasia)。

由于它的普遍存在的表达(ubiquitous expression)和它的降解细胞外基质和基底膜组分的能力，Cat L在肿瘤侵袭和转移中作用也被非常详细研究。Cat L升高的表达水平与宽范围的恶性肿瘤有关，包含乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌和星形细胞癌等。

最近的证据也提示了Cat L可能作为转录激活因子起作用。先前报道了Cat L的备选同工型(Rescheleit等，1996；Seth等，2003)，然而缺失N末端信号肽的同工型显示其集中在细胞核，提示了在加工CDP/Cux转录因子中Cat L的作用。这个理论被Cat L缺陷型成纤维细胞研究加强，所述研究中出现CDP/Cux加工的显著减少(Goulet等，2004)。

由几个独立组在下一年描述人同源物(ortholog)前(Bromme等，1995；Shi等，1995；Inaoka等，1995)，组织蛋白酶K于1994年最初从cDNA兔中克隆(Tezuka等，1994)。编码Cat K的基因位于人染色体1q21上，与Cat S相同的部位，提示了所述的两种蛋白酶可能拥有共同起源。Cat K启动子结构与Cat S结构相似，缺失TATA框但出现2个AP-1位点；两种基因的公共特性都显示限制表达模式(restricted expression pattern)。人Cat K表达已显示为限制性并且主要在破骨细胞和卵巢中发现(Bromme等，1995；Drake等，1996)。

Cat K氨基酸序列显示了与组织蛋白酶S和L的高度序列相似性(分别是52％和46％)，并且在哺乳动物溶酶体半胱氨酸蛋白酶中这三种基因一起形成小型亚家族。Cat K已表现出最有效的弹性蛋白酶(elastinolyticenzymes)之一的特征，具有胰弹性蛋白酶在pH5.5条件下更多的活性(Bromme等，1996；Chapman等，1997)。它也具有催化胶原I、II和IV型水解的能力(Kafienah等，1998)。

通过与骨病症(bone disorder)和致密性成骨不全症的关联举例说明Cat K溶胶原活性的生理相关性(Gelb等，1996)。致密性成骨不全症是一种常染色体隐性遗传病症，特征在于骨样硬化和严重骨骼发育不良。当打破骨吸收和形成之间的平衡时(倾向于吸收)发生骨质疏松。吸收是通过破骨细胞介导，其在它们结合位点产生酸性环境，所述位点发生基质的蛋白降解。由于在致密性成骨不全症患者中鉴定无义、错义和终止密码子突变，Cat K牵涉于这个过程中(Gelb等，1996)。Cat K敲除鼠在它们的破骨细胞中也显示了下降的基质降解活性，然而，鼠类表型的严重性低于人类病症(Saftig等，1998)。

通过破骨细胞系中视黄酸作用，在炎症位点Cat K表达出现正调节(Saneshige等，1995)。它的表达在骨的巨细胞肿瘤(giant cell tumour)、前列腺和乳腺癌(Brubaker等，2003；Littlewood-Evans等，1997)，以及在有类风湿性关节炎患者的滑液成纤维细胞(synovial fibroblasts)中被检测到(Hummel等，1998)。

组织蛋白酶V最初从人脑cDNA文库中作为半胱氨酸蛋白酶鉴定，与Cat L有格外的高度同源性(78％)(Santamaria等，1998)。而且，编码Cat V的基因绘图在人染色体9q21-22中，邻近Cat L。在Cat L和V基因间的高度同源性和十分靠近提示了两种蛋白酶可能从共同的祖先前体(ancestral precursor)进化而来(Itoh等，1999；Bromme等，1999)。然而，以Cat L观察到的普遍表达模式没有被Cat V模仿，Cat V表达限制在胸腺、睾丸和角膜上皮中(Adachi等，1998，Bromme等，1999，Tolosa等，2003)。这种蛋白酶的限制组织表达(restricted tissue expression)指示了特殊功能并且认为Cat V在特殊细胞类型MHC II类抗原递呈中是重要的(Shi等，1999；Tolosa等，2003)。与其他人类组织蛋白酶序列对比，Cat V位于如Cat L、S和K的人C1肽酶的相同种系发育分支中(Buhling等，2000)。

组织蛋白酶的病理关联

蛋白酶表达模式的改变成为许多人类病理过程的基础。组织蛋白酶失控的表达(deregulated expression)和活性，与一系列病症连锁，所述病症包括神经退化疾病、自身免疫性疾病和肿瘤发生(tumourigenesis)。

Cat S上调与几种神经退化疾病有关。它被认为在淀粉样前体蛋白(APP)里产生β肽(Aβ)中有作用(Munger等，1995)并且显示它的表达被阿尔茨海默氏病和唐氏综合征上调(Lemere等，1995)。通过Cat S降解髓磷脂碱蛋白(一种潜在自身抗原，牵涉于MS发病机理(Beck等，2001)和CJD患者中)的能力，Cat S在多发性硬化症和Creutzfeldt-Jakob病中也发挥作用，已显示Cat S表达增加超过4倍(Baker等，2002)。

异常Cat S表达与动脉粥样硬化有关。在正常动脉中Cat S表达可忽略不计，然而人动脉粥样化显示了强免疫反应性(Sukhova等，1998)。使用Cat S和低密度脂蛋白受体二者缺陷的敲除鼠深入研究显示，形成明显较少的动脉粥样硬化(Sukhova等，2003)。深入研究把Cat S表达与炎性肌病(inflammatory muscle disease)和类风湿性关节炎联系起来。来源于炎性肌病患者肌肉活组织检查标本的Cat S表达与对照肌肉切片相比有10倍增加(Wiendl等，2003)，来源于类风湿性关节炎患者滑膜液中Cat S表达水平与骨关节炎相比明显较高(Hashimoto等，2001)。

研究了在特殊的恶性肿瘤中Cat S的作用。已显示在肺部肿瘤和前列腺癌切片中Cat S表达与正常组织相比明显较多(Kos等，2001，Fernandez等，2001)，并且提示了Cat S可能在肿瘤侵袭和疾病发展中发挥作用。

本实验室最近对Cat S的工作证明了在人类星形细胞瘤中它的表达重要性(Flannery等，2003；Flannery等，2006)。免疫组织化学分析显示了来源于WHO I到IV级的一组星形细胞瘤活检标本中Cat S的表达，但是出现了正常星形细胞、神经元、少突胶质细胞和内皮细胞的缺席。在IV级肿瘤中Cat S表达出现最大值，并且在由IV级肿瘤衍生的培养物中胞外活性水平最高。

已显示Cat S在降解例如层粘连蛋白、胶原、弹性蛋白和硫酸软骨素蛋白聚糖等ECM大分子(Liuzzo等，1999)，以及使用U251MG IV级恶性胶质瘤细胞系的侵袭实验中是有活性的，所述实验显示在Cat S抑制剂LHVS29存在时侵袭下降达61％(Flannery等，2003)。这提示了Cat S可能在星形细胞瘤肿瘤侵袭过程中发挥重要作用，并且因此可成为抗侵袭治疗靶点。

也发现Cat L在包括肿瘤发生的不同病理学病症范围内发挥重要作用。Cat L敲除鼠的产生显示了在表皮稳态(epidermal homeostasis)中的关键性作用，调节毛发周期和在胸腺的皮质上皮细胞中MHC II类介导的抗原递呈(Reinheckel等，2001)。

Cat K表达先前已与包括骨质疏松和特殊的恶性肿瘤的不同病理学范围相关。致密性成骨不全症这种罕见的骨骼病症，由Cat K缺陷引起。CatK通常功能是降解1型胶原和其他骨蛋白(Motyckova和Fisher，2002)。来源于患有致密性成骨不全症患者的破骨细胞由于组织蛋白酶K基因内突变而具有功能失调性(Gelb等，1996)。

Cat K表达与肺腺癌但不与非侵入性细支气管肺泡癌有关，充当肺癌侵袭性生长的潜在标记(Rapa等，2006)。此外，Cat K也作为骨巨细胞肿瘤中的主要蛋白酶被鉴定(Lindeman等，2004)，并且显示与乳腺癌关联(Littlewood-Evans等，1997)。因此，Cat K抑制剂的开发有巨大潜力尤其在病理学病症中，所述病症发生了过量破骨细胞活化和骨吸收，例如骨质疏松、骨转移和多发性骨髓瘤。

Cat V作为与Cat L有格外高度同源(78％)的半胱氨酸蛋白酶，最初从结肠直肠和乳腺癌以及某些卵巢和肾细胞癌中鉴定(Santamaria等，1998)。而且，Cat V基因被绘图在人染色体9q21-22中，邻近Cat L。高度同源性和它们的编码基因的十分靠近提示了两种蛋白酶可能从共同的祖先前体进化而来(Itoh等，1999；Bromme等，1999)。然而，尽管Cat L有广泛的组织表达，Cat V通常局限于胸腺、睾丸和角膜上皮(Adachi等，1998；Bromme等，1999)。这种蛋白限制的组织表达指示了特殊的功能，并且认为Cat V在特殊细胞类型的MHC II类抗原递呈中是重要的(Shi等，1999；Tolosa等，2003)。

在一系列疾病范围内，观察到组织蛋白酶L-类蛋白酶表达和活性的增加并且牵涉它们的发病机理。因此，特异性导向(targeting)这些蛋白酶的抑制剂的产生有作为治疗剂的潜力。

组织蛋白酶L-类蛋白酶的抑制

当蛋白酶过度表达时，治疗策略就集中在开发用于阻断这些酶活性的抑制剂。针对组织蛋白酶的特异性小分子抑制剂，由于选择性和特异性问题其产生在过去证明是困难的。二肽α-酮-β-醛作为针对Cat S的有效可逆抑制剂由Walker等开发，具有抑制Cat B和L的能力(虽然以较低效力)(Walker等，2000)，并且Cat S抑制剂4-吗啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜(4-Morpholineurea-Leu-HomoPhe-vinylsulphone)(LHVS)当以高浓度使用时也显示能抑制其他的组织蛋白酶(Palmer等，1995)。

Cat L类蛋白酶小分子抑制剂的开发，可逆和不可逆二种都有较多文献记载。这种化合物的临床应用由于低特异性、抑制正常组织中蛋白酶和对于旁观者蛋白(bystander protein)可能的反应性而不可靠(Turk等，2004)。因此能够仅导向分泌蛋白水解活性的另一种策略具有吸引力。此外，由于从基因敲除研究(Saftig等，1998；Nakagawa等，1998；Nakagawa等，1999)中显示的功能重叠，可证明对于蛋白酶的所述亚家族具有高度选择性、并且在所述组中仍然具有广泛特异性的抑制剂更有用。

在所有表征的前肽中，CatSPP具有最感兴趣的抑制动力图(inhibitorykinetic profile)，因为它是除了Cat S之外，Cat L和Cat K二者的均等有效抑制剂。Maubach和同事们在竞争性酶结合测定中显示CatSPP是Cat S(Ki是0.27nM)和Cat L(K_i是0.36nM)的等效抑制剂(Maubach等，1997)，然而更近的工作提示，与它对Cat S的作用(K_i是7.6nM)和与几乎同等效率对于Cat K的作用(K_i是7.0nM)相比，CatSPP实际上是对于Cat L(K_i是0.46nM)的更有效的抑制剂(Guay等，2000)。

如上描述，通常对于组织蛋白酶的活化，天然前肽要经过构象变化和释放。释放之后，前肽假定为多余的。

发明内容

本发明人令人惊奇的显示了外源应用的组织蛋白酶S前肽(CatSPP)具有在侵入性癌模型中有效特异性抑制组织蛋白酶L-类蛋白酶活性的功能。这个结果是非常始料未及地，因为现在认为一旦半胱氨酸组织蛋白酶在体内激活，遗留的前肽片段便是多余的并且不再对于蛋白酶有任何作用。假定在相同的体内条件下，外源加入的前肽与其相似地没有作用。而且，考虑到前肽是本质上碱性的，存在于细胞中和表面的胰蛋白酶类活性预期能损坏任何外源前肽。

这些结果指示，与期待结果相反，组织蛋白酶前肽可用于弱化侵袭性或转移性癌细胞的发展，并且因此可用于治疗领域。

相应地，在本发明的第一方面，提供了一种在细胞或组织中抑制组织蛋白酶L-类蛋白酶活性的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸到所述的细胞或组织中。

在一个实施方式中，方法是体外方法。在另一个实施方式中方法是体内方法。

活性可被完全或部分抑制。因此所述方法可用于降低异常活性至正常活性。

在本发明的第二方面，提供了一种在细胞或组织中抑制组织蛋白酶L-类蛋白酶过度表达的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸到所述的细胞或组织中。

在另一方面，提供了一种在需要对其治疗的患者中治疗与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸。

更进一步提供了一种用于药物中的组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸。

本发明还提供了一种用于治疗病症的组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸，所述病症与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关。

还提供了组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸在制备药物中的应用，所述药物用于治疗与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症。

在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸。

组织蛋白酶L-类蛋白酶由组织蛋白酶L蛋白酶、组织蛋白酶S蛋白酶、组织蛋白酶K蛋白酶和组织蛋白酶V蛋白酶组成。

用于本发明的组织蛋白酶前肽可以是任何物种的组织蛋白酶前肽。在一个实施方式中，所述物种是哺乳动物，例如小鼠、大鼠和人等。在一个实施方式中，所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，例如具有与登记号M90696中公开的组织蛋白酶S蛋白酶氨基酸残基17至113相应的氨基酸序列(复制为图3中显示氨基酸序列的13至109氨基酸残基)的人组织蛋白酶前肽。

在本发明范围中，组织蛋白酶前肽包含组织蛋白酶前肽，所述组织蛋白酶前肽包括野生型哺乳动物组织蛋白酶前肽或其片段或衍生物的氨基酸序列。在一个实施方式中，组织蛋白酶前肽由具有野生型哺乳动物组织蛋白酶前肽氨基酸序列的肽组成。

在一个实施方式中，用于本发明中的组织蛋白酶前肽或其衍生物或片段是组织蛋白酶S前肽，例如，由登记号M90696中公开的组织蛋白酶S蛋白酶中17至113氨基酸组成(复制为图3b中显示氨基酸序列的13至109氨基酸残基)。

组织蛋白酶前肽可合并有标记，例如多组氨酸标记。在一个实施方式中，组织蛋白酶前肽是具有多组氨酸标记的组织蛋白酶前肽，所述标记与图3b中显示的氨基酸序列1至118一样。

如实施例中所描述，使用组织蛋白酶前肽融合到抗体Fc部分的肿瘤侵袭测定中证明了肿瘤侵袭的具体有效抑制。通过提供作为融合肽的组织蛋白酶前肽与抗体Fc部分，分子形状就会预期改变，尤其令人惊奇的是，不仅组织蛋白酶前肽保持了它抑制侵袭的能力，而且它的抑制活性与没有Fc部分的组织蛋白酶前肽相比明显更高。

相应地，在本发明一个实施方式中，组织蛋白酶前肽包括抗体Fc部分。在这个实施方式中，Fc部分是b型IgG Fc部分，例如鼠b型IgG Fc部分。

用于本发明中的组织蛋白酶前肽可用于治疗任何与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常表达有关的病症。例如，可使用本发明的病症包括但不限于肿瘤性疾病、炎性疾病、神经退化疾病(neurodegenerative disorder)、自身免疫性疾病、哮喘或动脉粥样硬化。在本发明一个实施方式中，所述病症是与组织蛋白酶S过度表达和/或异常活性有关的病症。

本发明每个方面的优选特征是对于每个其他方面做必要变更，除非本文另有要求。

具体实施方式

如上文所描述和实施例中证明地，本发明人显示与所期待的相反，组织蛋白酶前肽在肿瘤侵袭测定中作用是有效抑制组织蛋白酶L-类型蛋白酶活性，尤其是CatS、CatL、CatV和CatK活性，并且显示使用改良的博伊登室侵袭测定(Boyden chamber invasion assay)方法，组织蛋白酶前肽有效阻断了在乳腺、结肠、前列腺和星形细胞瘤模型中的肿瘤侵袭。这些结果证明了这种分子能够作用于肿瘤发生，弱化侵袭性或转移性癌细胞的发展的效力。

组织蛋白酶前肽

用于本发明中的组织蛋白酶前肽可以是任何物种的组织蛋白酶前肽，例如哺乳动物。在一个实施方式中，组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，例如包括与M90696中的氨基酸残基17至113具有相应序列的氨基酸(复制为图3中显示氨基酸序列的13至109氨基酸残基)的组织蛋白酶前肽。

在本发明范围中，组织蛋白酶前肽包括含野生型哺乳动物组织蛋白酶前肽或其片段或衍生物的氨基酸序列的组织蛋白酶前肽。在一个实施方式中，组织蛋白酶前肽由具有野生型哺乳动物组织蛋白酶前肽氨基酸序列的肽组成。

在一个实施方式中，用于本发明的组织蛋白酶前肽或其衍生物或片段是组织蛋白酶L-类型蛋白酶前肽。例如，用于本发明的组织蛋白酶前肽或其衍生物或片段可以是组织蛋白酶S前肽。

用于本发明的组织蛋白酶前肽片段通常指一段氨基酸残基，含有至少10个连续的氨基酸，通常至少20，例如至少至少30，例如至少50或野生型组织蛋白酶前肽中更多连续的氨基酸。

用于本发明中的组织蛋白酶前肽“衍生物”通常指一种多肽，所述多肽与野生型组织蛋白酶前肽相比，其通过改变氨基酸序列被修饰，例如通过控制编码蛋白的核酸或通过改变蛋白本身。这种衍生物可以包括插入、添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸。在一个实施方式中，衍生物可包括插入、添加、缺失和/或取代25个或更少的氨基酸，例如15个或更少，通常10个或更少，例如5个或更少例如仅1个或2个氨基酸。组织蛋白酶前肽的肽衍生物可含有其他氨基酸，但不是天然氨基酸或取代的氨基酸。例如，能从模拟肽(Peptidomimetic)中获得衍生物。

在本发明的一个实施方式中，组织蛋白酶前肽包括Fc部分。

可用于本发明中组织蛋白酶前肽的片段或衍生物优选保持组织蛋白酶前肽功能活性，所述活性是抑制肿瘤侵袭的能力，例如在肿瘤模型中，例如使用改良的博伊登室侵袭测定。在一个实施方式中，组织蛋白酶前肽片段或衍生物保持至少50％，例如至少75％，至少85％或至少90％的野生型人组织蛋白酶前肽肿瘤侵袭抑制活性。

用于本发明中的组织蛋白酶前肽、片段和衍生物可使用本领域已知的任何方法生产。

然而本发明人开发了用于组织蛋白酶前肽简化重组生产的新颖简化方法。如实施例中显示地，本发明人证明重组组织蛋白酶前肽可成功地表达为带有N末端6组氨酸标记，并且使用再折叠金属离子亲和层析(IMAC)纯化。

相应地，在本发明的一个方面，组织蛋白酶前肽由一种方法生产，所述方法包括纯化步骤，所述步骤包括金属离子亲和层析(IMAC)。

实际上，在本发明另一个独立方面中，提供了一种重组产生组织蛋白酶前肽的方法，所述方法包括表达具有N末端多组氨酸标记的组织蛋白酶前肽以及使用金属离子亲和层析(IMAC)纯化表达的前肽。在一个实施方式中，在含有尿素的缓冲液存在下纯化所述前肽。

本领域技术人员通常理解IMAC原理。据信吸附是基于金属配位络合物的形成，所述络合物形成于通过螯合作用固定在吸附基质表面的金属离子，和待结合的蛋白表面的易接近的电子供体氨基酸之间。

相似地，添加多组氨酸标记到重组蛋白中在本领域内广泛知晓(例如参阅美国专利号4,569,794)。

核酸

本发明的和用于本发明中的核酸可包括DNA或RNA。可以重组、合成或通过本领域可用的任何方法生产核酸，包含使用标准技术的克隆。

核酸可插入到任何适当的载体中。在一个实施方式中载体是表达载体并且核酸可操作地与控制序列连接，所述控制序列能够在宿主细胞中实现所述核酸的表达。可以使用多种载体。例如合适的载体可包括病毒(例如痘苗病毒、腺病毒和杆状病毒等)、酵母载体、噬菌体、染色体、人工染色体、质粒或粘粒DNA。

可使用载体把核酸引入宿主细胞中。很多种宿主细胞可用来表达用于本发明中的核酸。用于本发明的合适的宿主细胞可以是原核的或真核的。它们包括细菌(例如大肠杆菌)、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。可使用的哺乳动物细胞系包含中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO鼠黑色素瘤细胞、猴和人细胞系和其衍生物和许多其他种类。

可使用，调节表达、修饰、和/或特异性加工基因产物的宿主细胞株。所述加工可包括糖基化、泛素化(ubiquination)、二硫键形成和广泛的翻译后修饰。

用于操纵核酸，例如制备核酸构建体、诱变、序列测定、引入DNA到细胞中和基因表达和分析蛋白质的已知技术和方案的更多详细内容参阅，例如，Current Protocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等编辑，John Wiley和Sons，1992和，Molecular Cloning：a Laboratory Manual：第3版Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000。

治疗

“治疗”包含对人类或非人类动物有益的任何方案(regime)。治疗可以是关于现存的病症或可以是预防性的(预防治疗)。治疗可以包含治愈、缓解或预防效果。

本发明的和用于本发明的组织蛋白酶前肽、核酸和方法可用于治疗许多医疗病症。这些病症包括炎性疾病、神经退化疾病、自身免疫性疾病、癌症、哮喘和动脉粥样硬化。具体而言，它们可用于治疗与组织蛋白酶过度表达(即多于相似可比的正常健康细胞)和/或异常活性(例如多于相似可比的正常健康细胞)有关的病症。

本发明的和用于本发明的前肽、核酸和方法可用于治疗癌症。“治疗癌症”包含治疗由癌生长引起的病症，并且包含治疗肿瘤增殖或肿瘤。本发明可特别应用于治疗存在的癌症和预防初次治疗或手术后的癌症复发。

使用本发明能够治疗的肿瘤的例子包含，例如肉瘤(包含成骨和软组织肉瘤)、癌(例如乳腺、肺、膀胱、甲状腺、前列腺、结肠、直肠、胰腺、胃、肝、子宫、前列腺、子宫颈和卵巢癌)、淋巴瘤(包含霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、成神经细胞瘤、黑素瘤、骨髓瘤、维尔姆斯瘤和白血病(包含急性成淋巴细胞性白血病和急性成髓细胞性白血病)、星形细胞瘤、神经胶质瘤和视网膜母细胞瘤。

在一个实施方式中，癌症选自乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和星形细胞瘤。

使用本发明可治疗的炎性和/或自身免疫性疾病包含多发性硬化症、Grave′s病、炎性肌病和类风湿性关节炎。

使用本发明的结合成分(binding member)、核酸和方法可治疗的神经退化疾病包括但不限于，阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症和Creutzfeldt-Jakob病。

使用本发明的方法可治疗的其他病症包含动脉粥样硬化和结核。证据显示动脉粥样硬化和肥胖症与异常CatS相关。在感染中显示组织蛋白酶L加工TB抗原，因而可能阻止了它们的正常加工。

药物组合物

本发明的和用于本发明的前肽和核酸可作为药物组合物施用。根据本发明并且依照本发明使用的药物组合物可包括，除了活性成份以外，药学可接受的赋形剂、载体、缓冲液稳定剂或本领域技术人员广泛知晓的其他物质(参阅例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Gennaro AR，等编辑，.Lippincott Williams & Wilkins，2005)。所述物质可包括缓冲剂例如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂；防腐剂；蛋白质例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白类；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如，甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物；螯合剂；张力调节剂(tonicifier)或表面活性剂。

组合物也可含有一种或多种为治疗特殊适应症所需选择的其他活性化合物，优选具有互补活性(complementary activity)，所述活性不会反向影响本发明前肽、核酸或组合物的活性。例如，在治疗癌症中，除了组织蛋白酶前肽之外，制剂可包括结合一种或多种组织蛋白酶L-类型蛋白酶的抗体，或结合一些其他靶点例如生长因子(例如影响特定癌症的生长)的抗体，和/或化学治疗剂。

活性成分(例如前肽和/或化学治疗剂)可经由微球、微囊脂质体和其他微粒递药系统给药。例如，在胶体递药系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、毫微型颗粒和毫微型胶囊)或在粗乳状液中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微囊(gelatinmicrocapsule)和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊)，有效成分可被包埋入所制备的微囊。关于更多详细内容，参阅Remington:The Science andPractice of Pharmacy，第21版，Gennaro AR，等编辑，.Lippincott Williams& Wilkins，2005。

缓释制剂(sustained-release preparation)可用来递送活性剂。适合的缓释制剂例子包含固体疏水聚合物的半渗透基质(含有抗体)，所述基质具有成形物品形式(shaped article)，例如膜、栓剂或微囊。缓释基质的例子包含聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、多乳酸化合物(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和乙基-L谷氨酸共聚物、非降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解乳酸-羟乙酸共聚物和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。

对于医学疗法，本文描述的前肽，至少在一些实施方式里，预期施用到人类或其他哺乳动物中。

肽通常是肠胃外施用，并且容易被血浆蛋白酶代谢。口服施用，可能是最有吸引力的施用方式，但也可能更有问题。在胃中，酸降解和酶破坏肽。幸存进入肠中完整的肽遭受另外的蛋白水解，因为它们连续地被许多种酶攻击，所述酶包含胃和胰酶、外和内肽酶和刷状缘(brush border)肽酶。结果，严重限制了从肠腔通过到达血流的肽。然而，开发了多种前药能够肠胃外和口服施用治疗肽。

肽能结合多种部分，例如聚合部分，以修饰肽药的生理化学性质，例如，增加对酸和酶降解的抵抗力并且增强这种药横穿粘膜的渗透。例如，Abuchowski和Davis对于衍生酶描述了多种方法以提供水溶性的、非免疫原性的、体内稳定的产物(＂Soluble polymers-Enzyme adducts，＂Enzymes asDrugs，编辑Holcenberg和Roberts，J.Wiley and Sons，New York，N.Y.(1981))。Abuchowski和Davis讨论了结合酶与聚合物质(例如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、糖肽、聚乙二醇和聚氨基酸)的多种方式。对于肠胃外应用，产生的结合多肽保持了它们的生物活性和水溶性。US 4,179,337教授了偶合肽到聚乙二醇或聚丙二醇(polypropropylene glycol)(具有500至20,000道尔顿分子量)，以此提供了具有生理活性非免疫原性水溶性多肽组合物。聚乙二醇或聚丙二醇保护多肽防止活性损失，而且组合物可以注射到哺乳动物循环系统而基本上没有免疫原性应答。

US 5,681,811、US 5,438,040和US 5,359,030公开了稳定的、结合多肽络合物，所述络合物包含偶联到低聚物中的治疗剂，所述低聚物包含亲脂和亲水部分。Garmen等描述了蛋白-PEG前药(Garman，A.J.，和Kalindjian，S.B.，FEBS Lett.，1987，223,361-365)。前药能使用这种化学作用制备：通过首先从多元分散系MPEG5000中制备马来酸酐试剂，然后结合这个试剂到本文公开的肽上。氨基酸与马来酸酐的反应是已知的。马来酰基-酰胺键水解重新形成含胺药，其是由邻近存在的游离羧基协助，并且通过双键构成起化学反应的几何结构。在生理条件下能释放(通过水解前药)肽。

所述策略可用于递送前肽而用于本发明中。

经由可降解键，肽也能被聚合物例如多元分散系PEG偶联，例如可降解键显示(关于聚乙二醇化的干扰素α-2b)在Roberts，M.J.，等，Adv.DrugDelivery Rev.，2002，54,459-476中。

肽也能连接到聚合物例如PEG，使用1，6或1，4苄基排除(BE)策略(参阅例如，Lee，S.，等，Bioconjugate Chem.，(2001)，12，163-169；Greenwald，R.B.，等，US 6,180,095,2001；Greenwald，R.B.，等，J.Med.Chem.，1999，42，3657-3667.)；三甲基锁内酯化(TML)的使用(Greenwald，R.B.，等，J.Med.Chem.，2000，43,475-487)；PEG羧酸与羟基末端羧酸连接体的偶联(Roberts，M.J.，J.Pharm.Sci.，1998，87(11)，1440-1445)和PEG前药，其包括MPEG苯醚和MPEG苯甲酰胺家族，经由芳基氨基甲酸酯连接到含胺药上(Roberts，M.J.，等，Adv.Drug Delivery Rev.，2002，54，459-476)，包含前药结构，所述结构包括在氨基甲酸酯和PEG酰胺或醚之间的间位关系(meta relationship)(US 6,413,507)；和包括还原机制(与水解机制相反)的前药(Zalipsky，S.，等，Bioconjugate Chem.，1999，10(5)，703-707)。

一些在胃肠道中包括使用酶抑制剂来降低蛋白和肽降解速度的方法可用于本文描述的前肽；调整pH使局部消化酶失活；使用渗透促进剂通过增加它们的旁细胞和跨细胞转运改善肽的吸收；使用毫微型颗粒作微粒载体使其容易被肠上皮完整吸收，尤其是派伊尔淋巴集结，以及增加对酶降解抵抗力；在肠腔中液体乳剂保护药物免受化学作用和酶的破坏；以及用于水溶性差的药品的微团制剂。

在一些例子中，能以具有肠溶衣的适合胶囊或片剂提供肽，使得肽不会在胃中释放。可选择地或另外地，肽能作为前药提供。在一个实施方式中，肽存在于这些给药装置中作为前药。

能用肽的游离氨基、羟基或羧基使肽变换成前药。前药包括化合物，其中一个氨基酸残基或含有二个或多个(例如二、三或四)氨基酸残基的多肽链，其通过肽键共价结合多种聚合物的游离氨基、羟基或羧酸基团，所述聚合物例如，聚亚烷基二醇类(例如聚乙二醇)。前药也包含化合物，其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通过C末端羧酸共价结合到上述肽。

包括本发明的肽(前肽)的前药，或本发明的肽(包括类似物和片段)从其中被释放或具有释放性的前药，被认为是本发明的衍生物。

模拟肽

本发明进一步包括了模拟前肽的应用，其可用作治疗肽。模拟前肽是短肽，其模拟本文描述的组织蛋白酶前肽的生物活性。这种模拟肽可从本领域已知的方法获得，例如不限于，噬菌体展示或组合化学。例如，由Wrighton，等，Science 273：458-463(1996)公开的方法能用于产生模拟QUB698.8肽。

如上描述的编码组织蛋白酶前肽的核酸也可用在治疗方法中。所述核酸使用本领域任何适合的技术可递送到目的细胞中。使用体内或间接体内技术核酸(任选地包含在载体中)可递送到患者细胞中。关于体内技术，病毒载体(例如腺病毒、单纯疱疹I型病毒或腺相关病毒)转染和基于脂质的体系(例如，用于脂质介导基因转移的有用脂质是DOTMA、DOPE和DC-胆固醇)可被使用(参阅例如，Anderson等，Science 256：808-813(1992).也可参阅WO 93/25673)。

在间接体内技术中，用修饰细胞施用到患者方式把核酸引入到患者分离细胞中，直接地或者例如被多孔膜包裹植入患者体中(参阅例如美国专利号4,892,538和5,283,187)。引入核酸到有活力细胞中的可用技术可包含逆转录病毒载体、脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀方法等的使用。

前肽、核酸、试剂、产物或组合物可用局部方式施用到肿瘤位点或其他期望位点，或者可以以它导向肿瘤或其他细胞的方式递送。通过使用导向系统例如抗体或细胞特异性配体，导向疗法可用来更特异地递送活性剂到某些类型细胞中。多种原因期望实现导向，例如如果试剂具有不可接受的毒性，或如果是非如此需要过高剂量，或如果是非如此不能进入靶细胞。

剂量

本发明的前肽、核酸或组合物优选以“治疗有效量”施用到个体，这种有效量对于个体足以显示益处。实际给药方案取决于许多因素，包含被治疗的病症，它的严重度、被治疗的患者、所使用的试剂，并由医师酌情处理。

医师可基于许多参数测定合适剂量，所述参数包含例如，年龄、性别、体重、被治疗病症严重度、被施用的有效成分和给药途径。

现在接下来的非限制性例子中会深入描述本发明。参照附图，其中：

图1说明了CatSPP的扩增。CatSPP的cDNA序列从人类脾cDNA文库中扩增。产生大约330bp的单链，与所期待的CatSPP cDNA序列大小相等。

图2a说明了从CatS PP克隆入pQE-30的菌落PCR结果。

图2b显示了rCatSPP完整阅读框的DNA和蛋白质序列，作为其插入到pQE30中的结果。

图3说明了rCatSPP蛋白的纯化：a)rCatSPP洗脱图，b)显示SDS-PAGE分析来自于第二个宽峰的分馏物，如箭头所指，c)使用抗-多组氨酸标记抗体免疫印迹纯化分馏物。

图4说明了IPTG对rCatSPP表达的诱导，由SDS-PAGE和蛋白质印迹证明。a)通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色分析细菌裂解产物b)以抗-多组氨酸标记抗体印迹。在每个图像的左侧指示分子量标记(kDa)。

图5说明了在rCatSPP存在下水解Cbz-Val-Val-Arg-AMC的发展曲线。从相同载体产生并且以相同方式纯化的对照(组氨酸)6-标记蛋白，用作对照(500nM)(插图)。

图6显示用于测定抑制常数(Ki)的非线性回归分析曲线图(Morrison和Walsh，1988)。

图7：组织蛋白酶K、V、L和B被rCatSPP蛋白的抑制，使用荧光测定。

图8说明了Cat S弹性蛋白活性(elastinlytic activity)的抑制。荧光底物弹性蛋白-DQ用于监控在CatSPP(50-500nM)存在下经过60分钟孵育的CatS弹性回转。

图9显示CatL-类蛋白酶在癌细胞系中的相对表达。

图10a显示在4种人癌细胞系中(i-iv：HCT116、U251mg、MDA-MB-231和PC3)体外侵袭测定结果。

图10b显示在MCF-7细胞中体外侵袭测定结果。

图11显示评估rCatSPP蛋白的细胞毒性或增殖效应的MTT测定结果。

图12说明了CatSPP克隆入pRSET A-Fc的菌落PCR分析。

图13显示由加入IPTG诱导的、来自pRSET A载体中rCatSPP-Fc的表达，通过SDS-PAGE和使用抗-多组氨酸标记抗体来进行的蛋白质印迹分辨。

图14：rCatSPP-Fc纯化。

a)显示了纯化图，显示了两个不同的峰，在大约200分钟后的尖峰和在225到250分钟间的第二个宽峰。b)显示来自纯化过程的被洗脱分馏物的分析。c)显示纯化分馏物的分析，由使用抗-多组氨酸标记单克隆抗体的蛋白质印迹实现。

图15说明了Cat S被rCatSPP-Fc的抑制，使用荧光测定。

图16说明蛋白质印迹证明与CatS PP-Fc比较CatS PP的稳定性。

图17说明了柱状图，显示在CatSPP Fc存在下PC3侵袭测定的定量分析(quantitative summary)。

图18说明了柱状图，显示在CatSPP和CatSPP-Fc重组蛋白存在下HCT116侵袭测定的定量分析。

图19显示剂量响应曲线，用于为MDA-MB-231肿瘤细胞中的rCatS PP和rCatS PP-Fc确定EC50值。

实施例

材料和方法

CatSPP的克隆和表达

从人脾cDNA文库(Origene)扩增了人CatSPP中17至113残基，使用引物CATSPPF(5′TTTTTTGGATCCCAGTTGCATAAAGATCCTAC)和CATSPPR(5′TTTTTTGTCGACCCGATTAGGGTTTGA)，分别含有BamHI和SalI限制位点(如加下划线的)。预期的330bp条带可通过琼脂糖凝胶电泳辨认。这个条带凝胶纯化并使用Bam HI和SalI克隆入PQE30(Qiagen)，为下游控制其整合了N末端6组氨酸标记。阳性克隆用菌落PCR鉴定并且序列与登记号M90696比对。单个验证的克隆用于后续实验。

CatSPP-Fc的克隆和表达

关于克隆CatSPP到pRSET-Fc载体，使用引物CATSPPFCF(5′TTTTTTGGATCCCAGTTGCATAAA GAT)和CATSPPFCR(5′TTTTTTGTCGACTATCCGATTAGGGTT)扩增DNA序列，再次分别含有BamHI和SalI限制酶位点(如加下划线的)。扩增条带被凝胶切除并且克隆到pRSET细菌表达载体，所述载体预先被设计为含有IgG2Fc结构域。阳性克隆用菌落PCR鉴定并且序列与登记号M90696比对。单个验证的克隆用于所有后续实验。

CatSPP和CatSPP-Fc的蛋白表达和纯化

关于表达分析，CatSPP阳性克隆转化入TOP10F′细胞中并且在摇瓶(500ml)中培养直到达到对数生长期中期(A₅₅₀0.5，37℃)。CatSPP-Fc阳性克隆的表达分析，通过使用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株的转化来进行。在收获前，两种重组蛋白的表达，通过加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，1mM)到细菌培养物中并且再繁殖4小时进行诱导。重悬细胞沉淀并在50mM NaH₂PO₄ pH 8.0(含有8M尿素、300mM NaCl和10mM咪唑)裂解。在应用到带有Ni²⁺离子的IMAC柱(HiTrap 1ml柱，GE Healthcare)前，未加工的变性裂解液通过离心(10,000g，在4℃ 60分钟)澄清。在用超过200柱体积从8M减少到0M尿素的柱上再折叠之前，使用50mM NaH₂PO₄pH8.0(含有8M尿素、300mM NaCl和20mM咪唑)从柱中洗去非特异结合物质。在以50mM NaH₂PO₄ pH8.0、300mM NaCl和250mM咪唑洗脱前，再折叠的柱结合物质再以20柱体积的50mM NaH₂PO₄ pH 8.0、300mMNaCl和20mM咪唑洗涤。收集蛋白质分馏物，除去盐分到PBS中，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析以测定纯度和完整性。纯化的重组蛋白储液使用前保存在-20℃。

用rCatSPP抑制半胱氨酸组织蛋白酶

酶的测定用于确定rCatSPP抑制人组织蛋白酶S、L、K、V和B(Calbiochem)分解肽的活性的能力。在100mM醋酸钠、1mM乙二胺四乙酸盐(EDTA)、0.1％Brij和1mM二硫苏糖醇(DTT)在pH5.5存在下，在96孔微量滴定板中以三个重复进行测定。使用荧光底物苄氧羰基(carbobenzloxy)-L-缬氨酰-L-缬氨酰-L-精氨酰酰氨基(arginylamido)-4-甲基香豆素(Z-Val-Val-Arg-AMC，25μM)监控CatS活性，使用苄氧羰基-L-苯丙氨酰-L-精氨酰酰氨基-4-甲基香豆素(Z-Phe-Arg-AMC，25μM)进行组织蛋白酶L、K和V的测定，并且使用苄氧羰基-L-精氨酰酰氨基-L-精氨酰酰氨基-4-甲基香豆素(Z-Arg-Arg-AMC，25μM)作为底物进行CatB的测定。纯化的rCatSPP以所需的多种浓度(0-1000nM)加入到测定中。使用激发光在395nm和发射光在460nm的

 4000荧光分光光度计进行所有实验。为证实rCatSPP-Fc也具有抑制CatS活性能力，在rCatSPP-Fc(0nM-200nM)存在下使用CatS、Z-Val-Val-Arg-AMC(25μM)进行荧光测定。

RT-PCR分析半胱氨酸组织蛋白酶表达

通过RT-PCR分析测定半胱氨酸组织蛋白酶S、L、K和V在一组人癌细胞系中的相对表达水平。使用完全RNA^TM RT-PCR小量制备试剂盒(Absolutely RNA^TM RT-PCR Miniprep kit)从U251mg、MDA-MB-231、HCT116和PC3细胞系中提取出RNA并用分光光度计定量。使用一步RT-PCR试剂盒在下列条件进行RT-PCR：50℃ 30分钟、95℃ 15分钟，和35个循环的94℃1分钟、55℃1分钟和72℃ 1分30秒，接下来是72℃ 10分钟或者按本文中详细内容。使用在下面列表中详述的引物进行一系列半胱氨酸组织蛋白酶扩增。扩增β-肌动蛋白基因用作内部对照指示相等的上样量。RT-PCR产物分析用琼脂糖凝胶电泳并且使用Kodak 1D 3.4USB软件和数码相机在UV光下采集图像。

基因      RT-PCR引物序列

CatS(F)   GGG TAC CTC ATG TGA CAA G

CatS(R)   TCA CTT CTT CAC TGG TCA TG

CatL(F)   ATG AAT CCT ACA CTC ATC CTT GC

CatL(R)   TCA CAC AGT GGG GTA GCT GGC TGC TG

CatK(F)   ATG TGG GGG CTC AAG GTT CTG C

CatK(R)   TCA CAT CTT GGG GAA GCT GGC C

CatV(F)   ATG AAT CTT TCG CTC GTC CTG GC

CatV(R)   TCA CAC ATT GGG GTA GCT GGC

肌动蛋白(F)    ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTGCG

肌动蛋白(R)    CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCTGC

体外侵袭测定

使用12μm孔膜(Costar Transwell plates，Corning Costar Corp.，Cambridge，MA，USA)的改良博伊登室进行体外侵袭测定。膜以基质胶(100μg/cm²)(BectonDickinson，Oxford，UK)包被并且允许在层流通风橱中过夜干燥。在预定浓度rCatSPP存在下细胞以每孔500μl无血清培养基加入。所有测定以三个重复执行并且侵袭板孵育在37℃和5％ CO₂条件24小时，之后保留在膜上表面的细胞被除去而且被侵袭细胞在卡诺依固定液中固定15分钟。干燥后，被侵袭细胞的细胞核用含Hoechst 33258(50ng/ml)的PBS在室温条件染色30分钟。室插入物(chamber insert)用PBS洗二遍，包埋入抗荧光衰退封片剂(Citifluor)中并且被侵袭细胞用Nikon EclipseTE300荧光显微镜观察。三个重复膜中每个代表性区域的10个数码图像，使用Nikon DXM1200数码相机在放大20倍时采集。使用Lucia GF 4.60通过实验室成像分析结果，并且以被侵袭细胞百分比表示。

细胞活力测定

rCatSPP的细胞毒性或增殖效应通过使用HCT116结肠直肠癌细胞系的MTT测定检测。细胞以每200μl含1 x 10⁴细胞的浓度加入96孔板。200nM rCatSPP(以相同载体在相同条件下产生的对照蛋白)和仅有载体的对照加入到细胞中并且在37℃和5％ CO₂条件孵育24、48和72小时。在这之后小心除去培养基并且加入200μl 0.5mg/ml 3-4，5-二甲基噻唑-2，5联苯四唑盐溴化物(MTT)并且在37℃孵育2小时。除去MTT试剂并且不溶性甲臜(formazan)结晶用100μl DMSO溶解。在570nm测量吸光度并且结果以相对于每种仅有载体对照的细胞活力或增殖百分比表示。所有试验以5个重复进行。

结果和讨论

先前纯化CatSPP是通过许多不同方法实现。Maubach和同事从大肠杆菌表达系统中产生CatSPP，通过抗GdnHCl浓度梯度再折叠从包涵体分离相应于16至114残基的肽(Maubach等，1997)。Guay和同事也在大肠杆菌中产生PP(17至114残基)，使用另一种方法，作为谷胱甘肽S-转移酶(GST)C端融合蛋白产生。重组蛋白再次在包涵体中产生，接下来在GST-琼脂糖凝胶柱中亲和纯化和通过凝血酶裂解阶在GST融和蛋白中除去PP之前，所述蛋白抗GdnHCl浓度梯度重折叠(Guay等，2000)。所述后面方法还用于产生CatKPP和CatLPP。这些先前方法都产生生物活性蛋白，但是很费劲和很费时，尤其是分离和重折叠包涵体。在确定更快速简洁用于产生CatSPP方法的努力中，本发明人表达了具有N末端6组氨酸标记的肽(17至113残基)并且通过再折叠IMAC纯化蛋白。

使用详述的基因特异性引物CATSPPF和CATSPPR，编码前肽结构域(17至113残基)的开放阅读框通过聚合酶链式反应(PCR)从商业可获得的cDNA文库中扩增。当通过琼脂糖凝胶电泳分析时可看见期待大小的带(图1)。凝胶萃取后，将所述带克隆入商业可获得的载体(pQE30)中。菌落PCR分析16个克隆显示一条来自克隆10扩增的大约650bp的带(图2a)。这提示了只有克隆10可能含有成功克隆入pQE-30细菌表达载体的CatSPPcDNA序列。

DNA测序用于充分验证(序列与登记号M90696比对)(参阅图2b)。选择的克隆用于所有后续繁殖和发酵，从中分离rCatSPP种用于后续研究。

然后分析有效克隆中的rCatSPP表达，首先是对蛋白过度表达并且验证它含有N末端组氨酸标记而且具有期待的16kDa分子量，并且蛋白的表达是在T5启动子调控下由IPTG诱导。

rCatSPP从pQE-30细菌表达载体表达并且使用柱上再折叠IMAC纯化。如图3a)中显示，rCatSPP洗脱图含有几个峰；185分钟后的尖的初始峰，接着是在190和195分钟间的宽峰。从第二个宽峰的分馏物，如图3b中箭头指示，用SDS-PAGE分辨显示了单个高纯度的带，具有大约16kDa分子量，对应于预期的(组氨酸)6-标记的rCatSPP。图3c)显示纯化分馏物的免疫印迹，使用抗-多组氨酸标记抗体证实在大约16kDa位置组氨酸标记物质的存在。

rCatSPP表达被IPTG的诱导被SDS-PAGE和蛋白质印迹证明(图4)。通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色分析细菌裂解液显示，在被诱导泳道b中而不在未诱导的泳道a中的大约16kDa位置存在rCatSPP(图4a)。转移细菌裂解液到硝酸纤维素膜并且用抗-多组氨酸标记抗体印迹，证实仅在诱导的泳道b中的蛋白表达(图4b)。分子量标记在每个图像的左侧显示(kDa)。

最后去盐化到PBS中后，然后测试前肽的生物活性。rCatSPP蛋白的生物活性通过在预定浓度rCatSPP(0nM到500nM)存在下，使用CatS和荧光底物Cbz-Val-Val-Arg-AMC的荧光测定来确定。标绘了在rCatSPP存在下水解Cbz-Val-Val-Arg-AMC的发展曲线并且观察了CatS活性的剂量依赖性抑制(图5)。用相同载体产生并且以相同方式纯化的对照(组氨酸)6-标记蛋白，用作对照(500nM)来证实由于rCatSPP干扰了CatS活性(插图)。测定都以三个重复进行。

发展曲线指示了缓慢结合可逆抑制剂的作用。产生的表观一级速率曲线(first order rate order curve)然后用于非线性回归分析(Morrison和Walsh，1988)，其中随时间荧光的产生[P]能以下面的方程代表：

[P]＝v_st-(V_s-V_o)(1-exp(-k_obst))/k_obs+d        (1)

使用

软件，显示在图7a中发展曲线的值通过非线性回归分析拟合于方程(1)中，产生了v_s对[I]的曲线，从中测定了K_i(实测的)。然后对其校正用于说明竞争底物，如方程(2)中显示。

{K_i＝K_i(实测的)/(1+[S]/K_m)}                   (2)

使用这种分析，计算用rCatSPP抑制CatS的K_i值(图6)。

关于这方面更多内容在图7中显示，在预定浓度rCatSPP存在下使用组织蛋白酶K、V、L和B(分别是a-d)进行荧光测定。监控荧光30分钟，随时间标绘的RFU产生了荧光发展曲线。通过rCatSPP抑制组织蛋白酶产生表观一级速率常数，其用于非线性回归分析(插图)能够测定抑制常数(Ki)分别是17.6nM(±1.3)、4.8nM(±0.6)和0.62nM(±0.14)。所有荧光测定以三个重复进行。

关于确立抗-分解肽活性的确认，本发明人随后使用rCatSPP证明了它阻断CatS弹性蛋白活性的能力。荧光底物弹性蛋白-DQ用于监控在CatSPP(50-500nM)存在下，经过60分钟孵育的CatS弹性回转，并且本发明人能够证明这种活性的抑制(图8)。

用RT-PCR评估在四种人癌细胞系中Cat S、L、K和V的表达。组织蛋白酶的每一种在四种细胞系中都出现表达并且扩增肌动蛋白用作内部对照(图9)。

基于计算rCatSPP的全部分解肽的抑制图，能显示至少CatS弹性蛋白活性的证据，本发明人继续分析了肽在侵袭性癌症模型中阻断这些蛋白酶活性的效应。关于这些实验本发明人采用了研究，所述研究通过基质胶包被改良的博伊登室(Flannery等，2003)检查肿瘤细胞的侵袭。这些实验在代表了通常类型癌症的细胞系中执行。具体而言这些是PC3(前列腺癌细胞系)、HCT116(结肠直肠癌)、U251MG(星形细胞瘤)、MDA-MB-231(乳腺癌)和MCF7(乳腺癌)，结果显示在图10中。图10说明了四种人癌细胞系的分析，通过体外侵袭测定实现；a-d：HCT116、U251mg、MDA-MB-231和PC3。每种细胞系均显示在CatSPP存在下肿瘤细胞侵袭显著减少。(^*＝p：≤0.01，^**＝p：≤0.001，^***＝p：≤0.0001)。所有变量以采集10个数码图像进行三个重复并且用于分析肿瘤细胞侵袭。以平均值的±误差标绘出标准误差。使用学生t检验(students t-test)计算统计学显著性。图10b显示柱状图，其说明在CatSPP存在下MCF7肿瘤细胞侵袭显著减少(63％)。

用MTT测定评估rCatSPP蛋白的细胞毒性或增殖效应。使用HCT116结肠直肠癌细胞，与200nM的rCatSPP、对照蛋白和仅有载体的对照共同孵育，进行MTT测定。结果(图11)说明重组蛋白对于细胞生长没有明显作用。所有变量进行5个重复。

本发明人继续研究在组织蛋白酶前肽上提供Fc部分在侵袭性肿瘤模型中对L类型组织蛋白酶的抑制效应。

使用上述对CatSPP描述的方法，克隆和表达了包括C末端Fc部分的组织蛋白酶S前肽(CatSPP Fc)。CatSPP的cDNA序列克隆到pRSET A-Fc载体中。使用载体特异性引物，从阳性转化板选择8个克隆用于菌落PCR分析。由于扩增了大约1100bp的带(图12)，所有8个克隆均呈现阳性。pRSET A载体中rCatSPP-Fc的表达通过加入IPTG诱导。结果显示在图13中。泳道A、B、C和D中含有未诱导的和诱导的样品(分别是B＝0.2，C＝0.5和D＝0.7OD(A550nm))。通过进行SDS-PAGE和使用抗-多组氨酸标记抗体的蛋白质印迹分辨样品。检测到具有大约46kDa分子量的所述组氨酸标记蛋白物质，与期待大小的rCatSPP-Fc相等。具有OD 0.2的培养物诱导表达对于蛋白产生是最佳的。

通过N末端组氨酸标记特点使用IMAC纯化rCatSPP-Fc。结果显示在图14a)中，纯化图显示2个不同的峰，在大约200分钟后的一个尖峰，和在225和250分钟间的第二个宽峰。b)来自纯化过程的洗脱分馏物分析提示，第一个峰代表了从柱中非特异性结合蛋白的洗脱(分馏物1-5)，而第二个宽峰显示大约46kDa物质的洗脱，与期待大小的rCatSPP-Fc(分馏物6-15)一致。c)通过使用抗-多组氨酸标记单克隆抗体的蛋白质印迹分析纯化的分馏物，其显示如所期待的rCatSPP-Fc一样大约46 kDa的组氨酸标记物质的存在。

使用CatSPP Fc测量CatS分解肽活性的抑制。rCatSPP-Fc通过使用荧光底物Z-VVR-AMC的荧光测定评估，测定在加入Fc结构域后，是否所述物质具有保持它抑制CatS的能力，对动力学没有任何负面影响。结果显示在图15中：a)说明在存在rCatSPP-Fc浓度增加(0nM至200nM)情况下，抑制CatS活性的发展曲线。a，插图)Fc对照蛋白(200nM)对CatS活性没有可辨别的影响。b)从发展曲线推断出速率并且抑制动力学计算为8.9nM(±2.5)。测定重复三次。

CatS PP相对CatS PP-Fc的稳定性按下述方法评估。rCatSPP和rCatSPP-Fc蛋白与HCT116结肠直肠癌细胞一起孵育，通过加入抗体IgG₂Fc-结构域评估重组蛋白的稳定性。通过蛋白质印迹评估上清液样品(图16)，测定在细胞上清液内的稳定性。rCatSPP仅能在0hr检测到而rCatSPP-Fc稳定性出现改善，因为24hr后能检测到它。至于对照，也评估了不含加入蛋白的细胞上清液(-)并且用丽春红给膜染色，以证实上清液的同等加样量。以三个重复进行实验。

之后在使用前列腺PC3细胞的体外侵袭测定中试验了CatSPP Fc对组织蛋白酶S的作用。结果显示在图17中。柱形图显示在CatSPP Fc(0-32nM)存在下PC3侵袭测定中的定量分析。每个测定进行三个重复并且每个测定计数10个区域。

在使用其他肿瘤细胞系的体外侵袭测定中试验了CatSPP Fc对组织蛋白酶S的作用(图18)。rCatSPP和rCatSPP-Fc蛋白用于使用HCT116结肠直肠细胞系的体外侵袭测定中。测定在存在rCatSPP(0nM至250nM)或rCatSPP-Fc(0nM至50nM)浓度增加，以及最大浓度的适当对照蛋白情况下进行。标准偏差以误差线标绘。测定重复三次，对于其中每个采集10个图像。平均肿瘤细胞侵袭的标准偏差以±误差线标绘。

在使用MDA-MB-231细胞实施的侵袭测定中发现相似的结果。图19说明对于rCatS PP和rCatS PP-Fc相对的EC50值。在不同浓度rCatSPP或rCatSPP-Fc存在下的MDA-MB-231肿瘤细胞侵袭相对速率用于非线性回归分析和构建的S形剂量响应曲线。发现对于(a)rCatSPP和(b)rCatSPP-Fc产生的EC50值分别是78.0nM和8.3nM。

可以看出，CatSPP Fc作为在侵袭测定中组织蛋白酶S的有效抑制剂，具有明显较高的最高抑制性能并且其抑制浓度明显低于以无Fc部分CatSPP所需要的浓度。虽然，期待通过Fc部分在小程度上加强CatSPP分子稳定性，然而非常惊奇地发现包含Fc部分非常明显地加强了抑制效应。因此，结果说明包含Fc部分的组织蛋白酶前肽增强了在肿瘤侵袭模型中对组织蛋白酶L-类型蛋白酶活性的抑制。在肿瘤发生模型中使用组织蛋白酶的广谱小分子抑制剂进行了其他研究，指示相似效应。Joyce和同事在研究转基因RIP-Tag2鼠中运用了JPM-OEt的应用，其是一种广谱半胱氨酸组织蛋白酶抑制剂E64的细胞可渗透类似物(Joyce等，2004)。因为致瘤的SV40T抗原存在，这些鼠在12-14周形成了胰岛瘤。他们证明了对这些鼠施用这种广谱抑制剂能明显抑制肿瘤发展的多个阶段，包含动物组织学分析中高侵袭性癌的发展。在另一个研究中，Flannery和同事在阻断星形细胞瘤侵袭中，考查了4-吗啉尿素-亮氨酸-高苯丙氨酸-乙烯砜(LHVS)的用途。使用与本发明人在本文所使用的相同侵袭模型，说明LHVS有效抑制CatS并且在较少程度上抑制Cat，LHVS在50nM浓度时能够以高达60％阻断U251MG细胞侵袭(Flannery等，2003)。总之，这些先前的研究清楚地说明了，首先CatL-类蛋白酶在这些细胞系的侵袭过程中发挥的作用，其次它们作为癌症治疗治疗靶点的潜力。

尽管有可观的研究成果，然而关于这些蛋白酶中每一种在肿瘤发生中作用的范围仍需充分理解。显然一旦它们被致瘤的细胞分泌，大量的证据指向它们在破坏弹性蛋白、胶原和细胞外基质的其他成分中的作用。然而，现在新出现的这些酶在活化和控制彼此和其他较少密切相关的蛋白酶(如金属蛋白酶)中发挥作用(Kobayashi等，1993)。而且，新的证据加强了Cat S在破坏基质衍生的抗-血管原性因子和在肿瘤发展过程中产生前血管原性因子的作用(Wang等，2005)。这说明这些蛋白酶能比仅消化周围ECM以允许肿瘤发展和迁移具有更多作用。

结论

本发明人在本文中描述了用于产生组织蛋白酶前肽例如CatSPP的新的表达和纯化方法。本发明人证明，通过使用组织蛋白酶前肽(例如rCatSPP)抑制组织蛋白酶L-类型蛋白酶，可弱化肿瘤发生。给出了本发明人在使用不同范围肿瘤细胞系的体外侵袭测定中看出的抑制图，显然广泛抑制CatL-类蛋白酶对于临床治疗癌症具有明显的治疗益处。开发能阻断肿瘤蔓延(尤其是在体内的继发灶)的药剂的能力，对于共施用细胞毒性药剂的方案具有吸引力。迅速从细菌培养物中产生rCatSPP和成功应用于这些肿瘤细胞侵袭模型的能力，提示了它能够代表设计治疗性蛋白酶抑制剂的新方法。

在此通过引用并入本说明书提及的所有文献。对于本领域技术人员而言，本发明所述实施方式的各种修改和变化是清楚的，并未脱离本发明的范围和精神。尽管本发明以联系具体优选的实施方式进行描述，也应理解如权利要求所述本发明不应不当地限于所述特定实施方式。实际上，对于本领域技术人员明显的、实现本发明的所述方式的各种修改都预期涵盖在本发明中。

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序列表

<110>克里斯多佛.斯科特

罗伯塔.波尔登

吉姆.约翰斯顿

马克.麦克理

菲利普.斯诺迪

理查德.别克

<120>组织蛋白酶前肽及其应用

<130>P44458.wo.01

<150>GB0604187.5

<151>2006-03-02

<160>17

<170>PatentIn 3.3版本

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CATSPPFCF引物

<400>1

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CATSPPFCR引物

<400>2

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Cats(F)RT-PCR引物序列

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Cats(R)RT-PCR引物序列

<400>4

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CatL(F)RT PCR引物序列

<400>5

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CatL(R)RT-PCR引物序列

<400>6

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CatK(F)RT-PCR引物序列

<400>7

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>CatK(R)RT-PCR引物序列

<400>8

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CatV(F)RT-PCR引物序列

<400>9

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CatV(R)RT-PCR引物序列

<400>10

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>肌动蛋白(F)RT-PCR引物序列

<400>11

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>肌动蛋白(R)RT-PCR引物序列

<400>12

<210>13

<211>118

<212>PRT

<213>人类

<400>13

<210>14

<211>357

<212>DNA

<213>人类

<400>14

<210>15

<211>357

<212>DNA

<213>人类

<400>15

<210>16

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CATSPPF引物

<400>16

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CATSPPR引物

<400>17

Claims (27)

1.一种在细胞或组织中抑制组织蛋白酶L-类蛋白酶活性的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸到所述的细胞或组织中。

2.一种在细胞或组织中抑制组织蛋白酶L-类蛋白酶过度表达的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸到所述的细胞或组织中。

3.一种在需要对其治疗的患者中治疗与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症的方法，所述方法包括施用组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症是肿瘤性疾病、炎性疾病、神经退化疾病、自身免疫性疾病、哮喘或动脉粥样硬化。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其包括与登记号M90696中公开的组织蛋白酶S蛋白酶氨基酸残基17至113相应的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其具有与图3中氨基酸序列1-118相应的氨基酸序列。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织蛋白酶前肽包括抗体Fc部分。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织蛋白酶L-类蛋白酶是组织蛋白酶S。

9.一种组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸，其用于药物。

10.一种组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸，其用于治疗与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症。

11.根据权利要求10所述的前肽或核酸，其中所述与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症是肿瘤性疾病、炎性疾病、神经退化疾病、自身免疫性疾病、哮喘或动脉粥样硬化。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的前肽或核酸，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其包括与登记号M90696中公开的组织蛋白酶S蛋白酶氨基酸残基17至113相应的氨基酸序列。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的前肽或核酸，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其具有与图3中氨基酸序列1-118相应的氨基酸序列。

14.根据权利要求9至13中任一项所述的前肽或核酸，其中所述组织蛋白酶前肽包括抗体Fc部分。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的前肽或核酸，其中所述组织蛋白酶L-类蛋白酶是组织蛋白酶S。

16.组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸在制备用于治疗与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症的药物中的应用。

17.根据权利要求16所述的应用，其中所述与组织蛋白酶L-类蛋白酶异常活性和/或过度表达有关的病症是肿瘤性疾病、炎性疾病、神经退化疾病、自身免疫性疾病、哮喘或动脉粥样硬化。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的应用，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其包括与登记号M90696中公开的组织蛋白酶S蛋白酶氨基酸残基17至113相应的氨基酸序列。

19.根据权利要求16至18中任一项所述的应用，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其具有与图3中氨基酸序列1-118相应的氨基酸序列。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的应用，其中所述组织蛋白酶前肽包括抗体Fc部分。

21.根据权利要求16至20中任一项所述的应用，其中所述组织蛋白酶L-类蛋白酶是组织蛋白酶S。

22.一种药物组合物，其包括组织蛋白酶前肽或编码组织蛋白酶前肽的核酸。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其包括与登记号M90696中公开的组织蛋白酶S蛋白酶氨基酸残基17至113相应的氨基酸序列。

24.根据权利要求22或权利要求23所述的药物组合物，其中所述组织蛋白酶前肽是人组织蛋白酶前肽，其具有与图3中氨基酸序列1-118相应的氨基酸序列。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的药物组合物，其中所述组织蛋白酶前肽包括抗体Fc部分。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的药物组合物，其中所述组织蛋白酶L-类蛋白酶是组织蛋白酶S。

27.一种重组产生组织蛋白酶前肽的方法，所述方法包括表达具有N末端多组氨酸标记的组织蛋白酶前肽以及使用金属离子亲和层析(IMAC)纯化表达的前肽。

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