BRPI0708471A2

BRPI0708471A2 - métodos para inibir a atividade de uma protease de tipo catepsina l em células ou tecido, para inibir a superexpressão de uma protease de tipo catepsina l em células ou tecido, e para tratar uma condição associada com atividade aberrante e/ou superexpressão de uma protease de tipo catepsina l em um paciente, propeptìdeo de catepsina ou um ácido nucleico codificando um propeptìdeo de catepsina, uso de propeptìdeo de catepsina ou de um ácido nucleico codificando um propeptìdeo de catepsina, composição farmacêutica, e, método para produção recombinante de propeptìdeos de catepsina

Info

Publication number: BRPI0708471A2
Application number: BRPI0708471-4A
Authority: BR
Inventors: Christopher Scott; Roberta Burden; Jim Johnston; Mark Mccurley; Philip Snoddy; Richard Buick
Original assignee: Fusion Antibodies Ltd
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2007-03-02
Publication date: 2011-05-31
Also published as: CN101432014A; US20100104554A1; WO2007099348A3; EP2001505A2; GB0604187D0; JP2009528339A; WO2007099348A2; AU2007220307A1; CA2643723A1

Abstract

MéTODOS PARA INIBIR A ATIVIDADE DE UMA PROTEASE DE TIPO CATEPSINA L EM CéLULAS OU TECIDO, PARA INIBIR A SUPER EXPRESSãO DE UMA PROTEASE DE TIPO CATEPSINA L EM CELULAS OU TECIDO, E PARA TRATAR UMA CONDíçãO ASSOCIADA COM ATIVIDADE ABERRANTE E/OU SUPEREXPRES SãO DE UMA PROTEASE DE TIPO CATEPSINA L EM UM PACIENTE, PROPEPTìDEO DE CATEPSINA OU UM áCIDO NUCLEICO CODIFICANDO UM PROPEPTIDEO DE CATEPSINA, USO DE PROPEPTìDEO DE CATEPSINA OU DE UM áCIDO NUCLEICO CODIFICANDO UM PROPEPTìDEO DE CATEPSINA, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, MéTODO PARA PRODUçãO RECOMBINANTE DE PROPEPTìDEOS DE CATEPSINA Um método de inibir a atividade de uma protease de tipo catepsina L em células ou tecido e o uso do método no tratamento de doença como câncer e doenças inflamatórias é descrito. O método compreende a administração de um propeptídeo de catepsina ou ácido nucleico codificando um propeptídeo de catepsina. Em formas de realização particulares, o propeptídeo é propeptídeo de catepsina S. Além disso, o uso de propeptídeos tendo uma porção Fc é descrito.

Description

"MÉTODOS PARA INIBIR A ATIVIDADE DE UMA PROTEASE DETIPO CATEPSINA L EM CÉLULAS OU TECIDO, PARA INIBIR ASUPEREXPRESSÃO DE UMA PROTEASE DE TIPO CATEPSINA L EMCÉLULAS OU TECIDO, E PARA TRATAR UMA CONDIÇÃOASSOCIADA COM ATIVIDADE ABERRANTE E/OUSUPEREXPRESSÃO DE UMA PROTEASE DE TIPO CATEPSINA L EMUM PACIENTE, PROPEPTÍDEO DE CATEPSINA OU UM ÁCIDONUCLEICO CODIFICANDO UM PROPEPTÍDEO DE CATEPSINA, USODE PROPEPTÍDEO DE CATEPSINA OU DE UM ÁCIDO NUCLEICOCODIFICANDO UM PROPEPTÍDEO DE CATEPSINA, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA PRODUÇÃO RECOMBINANTEDE PROPEPTÍDEOS DE CATEPSINA"

Campo da invenção

Este pedido refere-se a um peptídeo e ao seu uso em métodosde tratamento. Em particular, refere-se a um propeptídeo de catepsina,métodos de sua produção e usos do propeptídeo.

Fundamentos da invenção

Proteases são um grupo grande de proteínas que compreendemaproximadamente 2% de todos produtos de gene (Rawlings e Barrett, 1999).Proteases catalisam a hidrólise de ligações de peptídeo e são vitais para ofuncionamento adequado de todas células e organismos. Eventos deprocessamento proteolíticos são importantes em uma extensa faixa deprocessos celulares incluindo formação óssea, cicatrização, angiogênese eapoptose.

As cisteína proteases lisossomais foram inicialmente pensadascomo sendo enzimas que eram responsáveis por degradação de proteínas nãoseletivas nos lisossomas. Normalmente associadas com localização noslisossomas, estas proteases foram originalmente pensadas como sendo apenasenvolvidas na degradação de proteínas não seletiva em compartimentosendossômicos. No entanto, elas são agora conhecidas como sendoresponsáveis em um número de processos celulares específicos, tendo papéisna apresentação de antígeno (Honey e Rudensky, 2003; Bryant & Ploegh,2004) apoptose (Zheng et al., 2005; Broker et al., 2005), processamento pró-hormônio (Hook et al., 2004) e remodelação de matriz extracelular (Chapmanet al., 1994; Chapman et al, 1997).

Catepsinas são enzimas proteolíticas. Até agora, onzecatepsinas humanas foram identificadas, mas os papéis in vivo específicos decada uma ainda estão para ser determinados (Katunuma et al, 2003).

Catepsinas B, L, H, F, O, X e C são expressadas na maioria das células,sugerindo um possível papel na viragem da proteína regulatória, considerandoque as catepsinas S, K, W e V são restritas a células e tecidos particulares,indicando que elas podem ter papéis mais específicos (Kos et al, 2001;Berdowska, 2004). Proteases de tipo de catepsina L (que incluem CatL, S eK) são enzimas proteolíticas que pertencem à família de CA de proteases detipo cisteína. Cada uma destas proteases lisossômicas esteve envolvida naprogressão de vários tumores. Pensa-se que sua secreção anormalmente altade células de tumor conduz à degradação da matriz extracelular (ECM). Estadesagregação aberrante de componentes de ECM como elastina e colágenoacelera a penetração e invasão destas células anormais para o tecido normalcircundante.

Proteases de tipo de catepsina L são. produzidas comoprecursores inativos, contendo um domínio de propeptídeo N terminal. Estepropeptídeo foi previamente mostrado como atuando tanto como umacompanhia para a duplicação da protease nascente como um inibidor dasespécies ativas, ligando ao sítio ativo da protease em lisossomas imaturos.

Estudos de inibição têm mostrado que os propeptídeo de CatS (CatSPP) temum Ki na faixa nanomolar baixa com relação a CatS ativado e talvezsurpreendentemente, também tem propriedades similares contra ambas, CatKe CatL, embora também tenha sido demonstrada como não tendo nenhumefeito em CatB3 CatH ou papaína menos homólogas. Além disso, estapropriedade de CatSPP é única em que o propeptídeos de K e L não têm omesmo perfil de inibição uniforme para cada um de seus membros de famíliacognatos.

Cat S (Catepsina S) foi originalmente identificada delinfonodos bovinos e baço e a forma humana clonada de uma biblioteca decDNA de macrófagos humanos (Shi et al, 1992). O gene codificando Cat Sestá localizado no cromossomo humano Iq21. O transcrito de 996 pares debase codificados pelo gene de Cat S é inicialmente traduzido na proteínaprecursora não processada com um peso molecular de 37,5 kDa. A proteínanão processada é composta de 331 aminoácidos; peptídeos de sinal de 15aminoácidos, seqüências de propeptídeo de 99aminoácidos e peptídeos de 217aminoácidos. Cat S é inicialmente expressada com um peptídeo de sinal que éremovido após entrar no lúmen do retículo endoplasmático. Seqüência depropeptídeo liga ao sítio ativo da protease, tornando-a inativa até que tenhasido transportada para os compartimentos endossômicos acídicos, após o quea seqüência de propeptídeo é removida e a protease é ativada (Baker et al,2003).

Cat S foi identificada como uma enzima chave na apresentaçãode antígeno mediado por complexo de histocompatibilidade de classe II(MHC-II) principal, por clivagem da cadeia invariante, adequado acarregamento de antígeno. Estudo têm mostrado que camundongosdeficientes em Cat S têm a capacidade prejudicada para as proteínas exógenaspresentes por APCs (Nakagawa et al, 1999). A especificidade de Cat S noprocessamento da cadeia invariante li, permite para Cat S alvos terapêuticosespecíficos no tratamento de condições como asma e distúrbios autoimunes(Chapman et al, 1997).

Catepsina L foi originalmente isolada dos lisossomas dofígado de rato antes da forma humana ser identificada em 1988 (Gal eGottesman, 1988; Joseph et al, 1988). O gene codificando CatL foi mapeadopara cromossomo humano 9q21-22 (Fan et al., 1989; Chauhan et al., 1993) eé composto de oito éxons e sete íntrons. O produto de gene é traduzido emuma preproproteína com um peso molecular de 39 kDa e é processado emduas isoformas isomaticamente ativas; uma forma de cadeia simples de 31kDa e a forma de cadeia dupla compreendida de uma cadeia pesada de 24 kDae uma cadeia leve de 5kDa (Mason et al, 1989). O processamento de pró-CatLpara a enzima ativa madura pode ocorrer através de vários mecanismosincluindo ativação autocatalítica (Salminen & Gottesman, 1990) e pela açãode CatD (Nishimura et al., 1989; Wiederanders & Kirschke, 1989) oumetaloendopeptidases (Hara et al., 1988).

CatL tem atividade de endopeptidase, e preferivelmente clivaligações de peptídeo com resíduos de aminoácidos hidrofóbicos nas posiçõesP2 e P3 (Kargel et al., 1980, 1981). Foi demonstrado para hidrolisar váriasproteínas com o mesma atividade específica como catepsina S (Kirschke etal., 1989). No entanto, ela favorece os resíduos aromáticos na posição P2,distinguindo-se das catepsinas SeK intimamente relacionadas (McGrath,1999).

CatL foi proposta como tendo um papel principal em muitosprocessos biológicos incluindo proteólise lisossômica e ressorção óssea, bemcomo em várias doenças como artrite e malignidade (Rukamp e Powers,2002). O papel das proteases de cisteína lisossomais na apresentação deantígeno tem sido amplamente investigado nos últimos anos. CatL tem sidoimplicada neste processo através de sua capacidade para realizar a etapa finalde proteólise de Ii em células epiteliais tímicas corticais. Outra evidência temmostrado que a isoforma p41 da cadeia de Ii tem a capacidade para reagir coma proteína de CatL madura, inibindo sua atividade e estabilizando-a emambientes de pH neutro (Ogrinc et al, 1993; Bevec et al, 1996). Estudos emcamundongos deficientes em CatL foram observados como sendo incapazesda degradação da cadeia invariante em células epiteliais corticais do timo(Nakagawa et al, 1998) e exibiram um defeito distinto em seleção de células TCD4+ (Roth et al, 2000). Camundongos sem catepsina L tambémdesenvolveram perda de pêlo periódica e hiperplasia epidérmica devido aalterações na morfogênese de folículo piloso.

O papel da CatL na metástase e invasão de tumor também foiestudado em grande detalhe devido à sua expressão ubíqua e sua capacidadepara degradar componentes da matriz extracelular e membrana basal. Níveisde expressão elevados de CatL foram associados com uma extensa faixa demalignidades incluindo carcinomas de mama, cólon, próstata, rim eastrocitomas.

Evidência recente tem também sugerido que CatL podefuncionar como um ativador transcripcional. Isoformas alternativas de CatLforam previamente reportadas (Rescheleit et al, 1996; Seth et al, 2003), noentanto, uma isoforma faltando o peptídeo de sinal N terminal foidemonstrado para localizar para o núcleo, sugerindo um papel para CatL noprocessamento do fator de transcrição CDP/Cux. Essa teoria foi reforçada porestudos em fibroblastos deficientes em CatL5 que pareceram ter uma reduçãomarcada em processamento CDP/Cux (Goulet et al, 2004).

Catepsina K foi primeiro clonada de cDNA coelho em 1994(Tezuka et al, 1994), antes da descrição do ortólogo humano no ano seguintepor vários grupos independentes (Bromme et al, 1995; Shi et al, 1995; Inaokaet al, 1995). O gene codificando CatK está situado no cromossomo humanoIq21, o mesmo local como CatS, sugerindo que estas duas proteases podemter uma origem comum. A estrutura de promotor de CatK é similar àquela deCatS com a ausência de uma caixa TATA mas com a presença de dois sítiosAP-I; ambos aspectos comuns de genes que mostram padrões de expressãorestritos. Expressão de CatK humana foi demonstrada para ser restrita e éencontrada predominantemente em osteoclastos e no ovário (Bromme et al,1995; Drake et al, 1996).

A seqüência de aminoácidos de CatK mostra elevadasimilaridade de seqüência com catepsinas SeL (52% e 46% respectivamente)e juntos, estes três genes formam uma subfamília pequena dentro dasproteases de cisteína lisossomais de mamíferos. CatK tem sido caracterizadacomo uma das mais potentes enzimas elastinolíticas, com atividade maior queelastase pancreática a pH5,5 (Bromme et al, 1996; Chapman et al, 1997).Também tem a capacidade para catalisar a hidrólise de colágeno tipo I, II e IV(Kafienah et al, 1998).

A relevância fisiológica da atividade colagenolítica de CatK éilustrada através de sua associação com o distúrbio ósseo, picnodisostose(GeIb et al, 1996). Picnodisostose é uma condição recessiva autossômicacaracterizada por osteoesclerose e várias displasias esqueletais. Osteoporoseocorre quando o equilíbrio entre ressorção óssea e formação foi rompido,favorecendo a ressorção. Ressorção é mediada por osteoclastos que geram umambiente acídico em seu sítio de fixação onde ocorre a degradaçãoproteolítica da matriz. CatK tem sido implicada neste processo devido àidentificação de mutações não sentido, sentido errado e de códon de paradaem pacientes de picnodisostose (Gelb et al, 1996). Camundongos nocauteCatK também exibem uma atividade de degradação de matriz diminuída emseus osteoclastos, entretanto o fenótipo de murinos é menor severo que nacondição humana (Saftig et al, 1998).

Expressão de CatK parece ser regulada de modo positivo emsítios de inflamação e por ácido retinóico em linhagens de célulasosteoclásticas (Saneshige et al, 1995). Sua expressão foi detectada emtumores de célula gigante do osso, carcinomas de próstata e mama (Brubakeret al, 2003; Littlewood-Evans et al, 1997) bem como nos fibroblastossinoviais de pacientes com artrite reumatóide (Hummel et al, 1998).Catepsina V foi primeiro identificada de uma biblioteca decDNA de cérebro humano como uma cisteína protease com homologiaexcepcionalmente alta para CatL (78%) (Santamaria et al.,1998). Além disso,o gene codificando CatV foi mapeado para o cromossomo humano 9q21-22,adjacente a CatL. A alta homologia e proximidade entre os genes CatL e Vsugere que as duas proteases podem ter se desenvolvido-se de um precursorancestral comum (Itoh et al., 1999; Bromme et al., 1999). No entanto, opadrão de expressão difundido observado com CatL não foi imitado por CatV,com expressão restrita ao timo, testículo e epitélio corneal (Adachi et al,1998, Bromme et al, 1999, Tolosa et al, 2003). A expressão de tecido restritadesta protease é indicativa de função especializada e pensa-se que CatV éessencial na apresentação de antígeno classe II MHC em tipos de célulaespecíficos (Shi et al., 1999; Tolosa et al., 2003). Alinhamento de seqüênciacom outras catepsinas humanas tem colocado CatV na mesma descendênciafilogenética de peptidases de Cl humano como CatL, SeK (Buhling et al., 2000).

Associação patológica de Catepsinas

As alterações nos padrões de expressão de protease estãosubordinadas a muitos processos patológicos humanos. A expressãodesregulada e atividade de catepsinas, foi ligada a uma faixa de condiçõesincluindo distúrbios neurodegenerativos, doenças autoimunes e tumorigênese.

A regulação de modo positivo de Cat S foi ligada a váriosdistúrbios neurodegenerativos. Acreditou-se ter um papel na produção do βpeptídeo (Αβ) da proteína precursora amilóide (APP) (Munger et al, 1995) esua expressão foi demonstrada como sendo regulada de modo positivo emambas, mal de Alzheimer e síndrome de Down (Lemere et al, 1995). Cat Stambém pode ter um papel em esclerose múltipla e doença de Creutzfeldt-Jakob através da capacidade de Cat S de degradar proteína básica de mielina,um autoantígeno potencial implico na patogênese de MS (Beck et al, 2001) eem pacientes de CJD, expressão de Cat S foi demonstrada como aumentandomais do que quatro vezes (Baker et al, 2002).

Expressão de Cat S aberrante também foi associada comaterosclerose. Expressão de Cat S é negligenciável em artérias normais,contudo ateroma humano exibe forte imunorreatividade (Sukhova et al,1998). Outros estudos usando camundongos nocaute, deficientes em ambos,Cat Seo receptor de LDL, foram mostrados para desenvolversignificantemente menos aterosclerose (Sukhova et al, 2003). Outra pesquisatém ligado a expressão de Cat S com a doença inflamatória de músculo eartrite reumatóide. Amostras de biópsia de músculo de pacientes commiopatia inflamatória tiveram um aumento de 10 vezes na expressão de Cat Scomparada às seções de músculo de controle (Wiendl et al, 2003), e níveis deexpressão de Cat S foram significantemente superiores em fluido sinovial depacientes com artrite reumatóide comparado àqueles com osteoartrite(Hashimoto et al, 2001).

O papel de Cat S também foi investigado em malignidadesespecíficas. A expressão de Cat S foi mostrada como sendo significantementemaior em seções de tumor de pulmão e carcinoma de próstata em comparaçãoao tecido normal (Kos et al, 2001, Fernandez et al, 2001) e sugeriu que Cat Spode ter um papel na invasão de tumor e progressão de doença.

Trabalho recente neste laboratório sobre Cat S demonstrou asignificância de sua expressão em astrocitomas humanos (Flannery et al,2003; Flannery et al, 2006). Análise imuno-histoquímica mostrou a expressãode Cat S em um painel de espécimes de biópsia de astrocitoma de grau sWHO de I a IV, mas pareceu ausente de astrócitos normais, neurônios,oligodendrócitos e células endoteliais. Expressão de Cat S pareceu a maior emtumores de grau IV e níveis de atividade extracelular foram os maiores emculturas derivadas de tumores de grau IV.

Cat S foi demonstrada como sendo ativa na degradação demacromoléculas de ECM como laminina, colágenos, elastina, e sulfato deproteoglicanos de condroitina (Liuzzo et al, 1999) e testes de invasão usandoa linhagem de células de glioblastoma de grau IV U251MG mostrou umaredução de até 61% na invasão na presença de um inibidor de Cat S LHVS29(Flannery et al, 2003). Isso poderia sugerir que Cat S pode ter um importantepapel no processo de invasão de tumor em astrocitomas e conseqüentementepode ser um alvo para terapia anti-invasiva.

CatL tem sido também verificada como tendo papéisimportantes em uma faixa de condições patológicas diferentes incluindotumorigênese. A geração de camundongos nocaute de CatL descreveu umaparte crítica em homeostase epidérmica, regulação do ciclo de pêlo, eapresentação de antígeno mediada de classe II MHC em células epiteliaiscorticais do timo (Reinheckel et al, 2001).

Expressão de Cat K foi previamente correlacionada com umafaixa de patologias diferentes incluindo osteoporose e malignidadesespecíficas. A condição esqueletal rara, picnodisostose é causada por umadeficiência em CatK. CatK normalmente funciona para degradar colágeno detipo 1 e outras proteínas ósseas (Motyckova e Fisher, 2002). Os osteoclastosde pacientes com picnodisostose são disfuncionais devido a mutações dentro do gene de catepsina K (GeIb et al, 1996).

Expressão de CatK é associada com adenocarcinomas depulmão ainda ausente dos carcinomas bronquioalveolares não invasivos,agindo como um marcador potencial do crescimento invasivo de carcinomasde pulmão (Rapa et al, 2006). Em adição, CatK também foi identificada como uma protease principal em tumor de célula gigante do osso (Lindeman et al,2004) e uma associação com carcinomas de mama (Littlewood-Evans et al,1997) tem sido observada. Conseqüentemente, o desenvolvimento deinibidores de CatK têm grande potencial, particularmente em condiçõespatológicas onde a ativação de osteoclasto de excesso e ressorção ósseaocorre como osteoporose, metástase óssea e mieloma múltiplo.

Cat V foi originalmente identificada em carcinomas de mamae colo-retal, bem como algumas carcinomas de célula ovariana e renal comouma protease de cisteína com homologia excepcionalmente alta para CatL(78%) (Santamaria et ai., 1998). Além disso, o gene de CatV foi mapeadopara cromossomo humano 9q21-22, adjacente a CatL. A homologia alta eproximidade de seus genes de codificação sugere que as duas proteasespodem ter se desenvolvido a partir de um precursor ancestral comum (Itoh etal., 1999; Bromme et al., 1999). No entanto, embora CatL tenha expressão detecido difundida, CatV é normalmente restrita ao timo, testículo e epitéliocorneal (Adachi et al., 1998; Bromme et al., 1999). A expressão de tecidorestrita desta protease é indicativa de função especializada e pensa-se queCatV é essencial na apresentação de antígeno classe II MHC em tipos decélula específicos (Shi et al., 1999; Tolosa et al., 2003).

O aumento na expressão e atividade das proteases de tipocatepsina L tem sido observado em uma faixa de doenças e implicado em suapatogênese. Conseqüentemente, a geração de inibidores especificamentemarcando essas proteases tem o potencial como agentes terapêuticos.Inibição de proteases de tipo de catepsina L

Quando proteases são super-expressadas, estratégiasterapêuticas têm focalizado no desenvolvimento de inibidores para bloquear aatividade destas enzimas. A geração de inibidores de molécula pequenaespecífica para as catepsinas têm provado dificuldade no passado, devido aproblemas com seletividade e especificidade. O dipeptídeo a-ceto-P-aldeídosdesenvolvido como inibidores reversíveis potentes para Cat S por Walker etal, teve a capacidade para inibir Cat BeL, embora com menos eficiência(Walker et al, 2000) e o inibidor de Cat S 4-Morfolina uréia-Leu-HomoPhe-vinil sulfona (LHVS) também foi demonstrado como inibindo outrascatepsinas quando usado em maiores concentrações (Palmer et al, 1995).O desenvolvimento de inibidores de molécula pequena para asproteases como CatL5 ambas, reversível e irreversível, é bem documentado. Aaplicação clínica de tais compostos é questionável devido a baixaespecificidade, inibição das proteases em tecido normais, e possívelreatividade a proteínas espectadoras (Turk et al., 2004). Conseqüentementeestratégias alternativas que poderiam objetivar apenas atividades proteolíticassecretadas são atrativas. Ademais, inibidores que têm alta seletividade paraesta subfamília de proteases, ainda uma ampla especificidade dentro destegrupo pode demonstrar ser mais utilizável, devido à superposição na funçãoque foi demonstrada a partir dos estudos de nocaute de gene (Saftig et al,1998; Nakagawa et al, 1998; Nakagawa et al, 1999).

Dentre todos os propeptídeos caracterizados, CatSPP tem omais interessante perfil cinético inibitório, como é um inibidor efetivoigualmente de ambas, CatL e CatK, em adição a CatS. Maubach e co-colaboradores mostraram nos testes de ligação de enzima competitiva queCatSPP é um inibidor equipotente de CatS (Ki de 0,27 nM) e CatL (Ki de0,36nM) (Maubach et al., 1997), considerando que trabalho mais recentesugere que CatSPP é realmente um inibidor mais potente de CatL (K1 de 0,46nM) do que é de CatS (Ki de 7,6 nM) e tem eficácia quase idêntica contraCatK (Ki de 7,0 nM) (Guay et al., 2000).

Como descrito acima, em ativação de catepsina normal, opropeptídeo natural sofre uma mudança conformacional e é liberado. Apósliberação, o propeptídeo é suposto ser redundante.

Sumário da invenção

Os presentes inventores mostraram surpreendentemente que opropeptídeo de catepsina S aplicado de modo exógeno (CatSPP) tem umaação inibitória específica potente na atividade de proteases como catepsinas Lem modelos de câncer invasivo. Este resultado foi particularmente inesperadodado que pensa-se que, uma vez que protease de catepsina de cisteína éativada in vivo, o fragmento de propeptídeo restante é redundante e já nãopode ter qualquer efeito na protease. Assumiu-se que, sob as mesmascondições in vivo, propeptídeo adicionado de modo exógeno similarmentenão teria efeito. Além disso, dado que o propeptídeo é básico na natureza,atividades de tipo tripsina presentes dentro e na célula seriam esperadas comorompendo quaisquer propeptídeos exógenos.

Estes resultados indicam que, contrário às expectativas,propeptídeos de catepsina podem ser usados para atenuar a progressão decélulas de câncer invasivas ou metastáticas e deste modo podem ser usadosem um contexto terapêutico.

Assim, em um primeiro aspecto da presente invenção, provê-se um método de inibir a atividade de uma protease de tipo catepsina L emcélulas ou tecido, em que o referido método compreende a administração deum propeptídeo de catepsina ou um ácido nucleico codificando umpropeptídeo de catepsina para referidas células ou tecido.

Em uma forma de realização, o método é in vitro. Em outrométodo é in vivo.

Atividade pode ser inibida completamente ou parcialmente.Deste modo, o método pode ser usado para reduzir atividade aberrante ematividade normal.

Em um segundo aspecto da presente invenção, provê-se ummétodo de inibir superexpressão de uma protease de tipo catepsina L emcélulas ou tecido, o referido método compreende a administração de umpropeptídeo de catepsina ou um ácido nucleico, codificando um propeptídeode catepsina para referidas células ou tecido.

Em um outro aspecto, provê-se um método de tratamento deuma condição associada com superexpressão e/ou atividade aberrante de umaprotease de tipo catepsina L em um paciente em necessidade de tratamento damesma, em que o referido método compreende a administração de umpropeptídeo de catepsina ou um ácido nucleico codificando um propeptídeode catepsina.

Ainda é provido um propeptídeo de catepsina ou um ácidonucleico codificando um propeptídeo de catepsina para uso em medicina.

A invenção ainda provê um propeptídeo de catepsina ou umácido nucleico codificando um propeptídeo de catepsina para uso notratamento de uma condição associada com superexpressão e/ou atividadeaberrante de uma protease de tipo catepsina L.

Também é provido o uso de propeptídeo de catepsina ou umácido nucleico codificando um propeptídeo de catepsina na preparação de ummedicamento para o tratamento de uma condição associada comsuperexpressão e/ou atividade aberrante de uma protease de tipo catepsina L.

Em um outro aspecto, a invenção provê uma composiçãofarmacêutica compreendendo um propeptídeo de catepsina ou um ácidonucleico codificando um propeptídeo de catepsina.

Proteases de tipo catepsina L consistem de protease decatepsina L, protease de catepsina S, protease de catepsina K e proteases decatepsina V.

Propeptídeos de catepsina para uso na invenção podem ser umpropeptídeo de catepsina de qualquer espécie. Em uma forma de realização, aespécie é uma espécie de mamífero, por exemplo, camundongo, rato, humanoetc. Em uma forma de realização, o propeptídeo de catepsina é umpropeptídeo de catepsina humano, por exemplo propeptídeo de catepsinahumano tendo seqüência de aminoácidos correspondendo a resíduos deaminoácidos 17 a 113 da protease de catepsina S como descrito em número deacesso M90696, (reproduzido como resíduos de aminoácidos 13 a 109 daseqüência de aminoácidos mostrada na figura 3).

No contexto da presente invenção, propeptídeos de catepsinaincluem propeptídeos de catepsina compreendendo a seqüência deaminoácidos de um propeptídeo de mamífero tipo selvagem de catepsina ouum fragmento ou derivado do mesmo. Em uma forma de realização, opropeptídeo de catepsina consiste do peptídeo tendo a seqüência deaminoácidos de um propeptídeo de mamífero tipo selvagem de catepsina.

Em uma forma de realização, o propeptídeo de catepsina ouderivado ou fragmento do mesmo para uso na invenção é um propeptídeo decatepsina S, por exemplo, consistindo de aminoácidos 17 a 113 da protease decatepsina S como descrito em número de acesso M90696 (reproduzido comoresíduos de aminoácidos 13 a 109 da seqüência de aminoácidos mostrada nafigura 3b).

O propeptídeo de catepsina pode incorporar uma identificação,por exemplo uma etiqueta poliHis. Em uma forma de realização, opropeptídeo de catepsina é o propeptídeo de catepsina tendo uma etiquetapoliHis como mostrada como a seqüência de aminoácidos 1-118 da Figura 3b.

Como descrito nos exemplos, uma inibição de invasão deTUMOR PARTICULARMENTE POTENTO FOI DEMONSTARDA EM UM TESTE DE INVASAO DEtumor quando usando um propeptídeo de catepsina fusionado a uma porçãoFc de anticorpo. Dado que ao prover o propeptídeo de catepsina como umpeptídeo de fusão com a porção Fc, o formato da molécula seria esperado20 mudar, sendo particularmente surpreendente que, não apenas o propeptídeo decatepsina reteve sua capacidade para inibir a invasão como também suaatividade inibitória foi significantemente maior do que a do propeptídeo decatepsina sem a porção Fc.

Assim, em uma forma de realização da invenção, o25 propeptídeo de catepsina compreende uma porção Fc de anticorpo. Em umatal forma de realização, a porção Fc é um porção Fc de IgG Tipo b, porexemplo uma porção Fc tipo b de IgG de murino.

Propeptídeos de catepsina para uso na invenção podem serusados no tratamento de qualquer condição com que expressão aberrante deuma protease de tipo catepsina L é associada. Por exemplo, condições em quea invenção pode ser usada incluem, mas não são limitadas a, doençaneoplásica, distúrbios inflamatórios, distúrbios neurodegenerativos, distúrbiosautoimunes, asma, ou aterosclerose. Em uma forma de realização dainvenção, a condição é uma condição associada com superexpressão e/ouatividade aberrante de catepsina S.

Preferidos aspectos de cada aspecto da invenção são comopara cada dos outros aspectos mutatis mutandis salvo especificado emcontrário.

Descrição detalhada

Como descrito acima e demonstrado nos exemplos, ospresentes inventores demonstraram que, contrário às expectativas,propeptídeos de catepsina agem nos testes de invasão de tumor parapotencialmente inibir a atividade de proteases de tipo catepsinas L, emparticular a atividade de CatS, CatL, CatV e CatK, e demonstraram quepropeptídeos de catepsina potencialmente bloqueiam invasão de tumor emmama, cólon, próstata e modelos de tumor de astrocitoma usando uma testede invasão de câmara de Boyden modificado. Estes resultados demonstram oefeito que esta molécula pode ter na tumorigênese para atenuar a progressãode células de câncer invasivo ou metastático.

Propeptídeos de catepsina

Propeptídeos de catepsina para uso na invenção podem ser umpropeptídeo de catepsina de qualquer espécie, por exemplo uma espécie demamífero. Em uma forma de realização, o propeptídeo de catepsina é umpropeptídeo de catepsina humano, por exemplo, um propeptídeo de catepsinacompreendendo aminoácidos tendo a seqüência correspondendo à de resíduosde aminoácidos 17 a 113 de M90696 (reproduzidos como resíduos deaminoácidos 13 a 109 da seqüência de aminoácidos mostrada na figura 3).

Em uma forma de realização, o propeptídeo de catepsina ouderivado ou fragmento do mesmo para uso na invenção é um propeptídeo deprotease de tipo catepsina L. Por exemplo, o propeptídeo de catepsina ouderivado ou fragmento do mesmo para uso na invenção pode ser umpropeptídeo de catepsina S.

Um fragmento de um propeptídeo de catepsina para uso nainvenção geralmente significa um pedaço de resíduos de aminoácidos de pelomenos 10 aminoácidos contíguos, tipicamente pelo menos 20, por exemplopelo menos pelo menos 30, como pelo menos 50 ou mais aminoácidosconsecutivos de um propeptídeo de tipo selvagem de catepsina.

Um "derivado" de propeptídeo de catepsina para uso nainvenção tipicamente significa um polipeptídeo que, comparado com umpropeptídeo de tipo selvagem de catepsina, é modificado variando a seqüênciade aminoácidos, por exemplo por manipulação do ácido nucleico codificandoa proteína ou alterando a proteína em si. Tais derivados podem envolverinserção, adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos. Emuma forma de realização, derivados podem envolver a inserção, adição,deleção e/ou substituição de 25 ou menos aminoácidos, por exemplo 15 oumenos, tipicamente 10 ou menos, como 5 ou menos por exemplo de 1 ou 2aminoácidos apenas. Derivados do peptídeo de propeptídeo de catepsinapodem conter outros aminoácidos que os aminoácidos naturais ouaminoácidos substituídos. Por exemplo, derivados podem ser obtidos a partirde peptidomiméticos.

Em uma forma de realização da invenção, o propeptídeo decatepsina compreende uma porção Fc.

Fragmentos ou derivados de propeptídeos de catepsina quepodem ser usados na invenção preferivelmente retêm atividade funcional depropeptídeo de catepsina, referida atividade sendo a capacidade para inibirinvasão de tumor, por exemplo, em um modelo de tumor, por exemplo usandoum teste de invasão de câmara de Boyden modificado. Em uma forma derealização, os fragmentos de propeptídeo de catepsina ou derivados retêmpelo menos 50%, por exemplo pelo menos 75%, pelo menos 85%, ou pelomenos 90% da atividade de inibição de invasão de tumor do propeptídeohumano de tipo selvagem de catepsina.

Propeptídeos de catepsina, fragmentos e derivados para uso nainvenção podem ser produzidos usando qualquer método conhecido natécnica.

No entanto, os presentes inventores desenvolveram um novométodo simplificado para a produção recombinante simplificada depropeptídeo de catepsina. Como mostrado nos exemplos, os inventoresdemonstraram que propeptídeos de catepsina recombinante podem serexpressados com sucesso com uma etiqueta hexahistidina N terminal epurificados usando cromatografia de afinidade de íon metal de reduplicação (IMAC).

Assim, em um aspecto da invenção, o propeptídeo de catepsinaé produzido por um método envolvendo uma etapa de purificação envolvendocromatografia de afinidade de íon metal (IMAC).

De fato, em um outro aspecto independente da invenção,provê-se um método para produção recombinante de propeptídeos decatepsina, referido método compreendendo expressar um propeptídeo decatepsina com uma etiqueta de poliistidina N terminal e purificar opropeptídeo expressado usando cromatografia de afinidade de íon metal(IMAC). Em uma forma de realização, o propeptídeo é purificado na presençade tampão contendo uréia.

Os princípios de IMAC são geralmente apreciados por aquelesversados na técnica. Acredita-se que adsorção é atribuída na formação de umvalência coordenada de metal ente um íon metal, imobilizado por quelaçãosobre a matriz adsorvente, e aminoácidos doadores de elétron acessíveis sobrea superfície da proteína a ser ligada.

Similarmente, a adição de etiquetas poliistidina a proteínasrecombinantes é bem conhecida na técnica (por exemplo, ver patente US4.569.794.

Acido nucleico

Acido nucleico de e para uso na presente invenção podecompreender DNA ou RNA. Pode ser produzido recombinantemente,sinteticamente, ou por qualquer meio disponível para aqueles versados natécnica, incluindo clonagem usando técnicas padrões.

O ácido nucleico pode ser inserido em qualquer vetorapropriado. Em uma forma de realização, o vetor é um vetor de expressão e oácido nucleico é ligado operativamente a uma seqüência de controle que écapaz de prover expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Umavariedade de vetores podem ser usados. Por exemplo, adequados vetorespodem incluir vírus (por exemplo vírus de vacina, adenovírus, baculovírusetc); vetores de levedura, fago, cromossomos, cromossomos artificiais,plasmídeos, ou DNA cosmídeo.

O vetores podem ser usados para introduzir os ácidosnucleicos em um célula hospedeira. Uma extensa variedade de célulashospedeiras podem ser usadas para expressão do ácido nucleico para uso nainvenção. Adequadas células hospedeiras para uso na invenção podem serprocarióticas ou eucarióticas. Elas incluem bactérias, por exemplo E. coli,levedura, células de inseto e células de mamífero. Linhagens celulares demamíferos que podem ser usadas incluem células de ovário de hamsterchinês, células de rim de hamster bebê, células de melanoma de camundongoNSO, linhagens celulares de macaco e humano e derivados dos mesmos emuitas outras.

Uma cepa de célula hospedeira que modula a expressão de,modifica, e/ou especificamente processa o produto de gene pode ser usada.Tal processamento pode envolver glicosilação, ubiquinação, formação deligação de dissulfeto e modificação pós-translacional geral.

Para outros detalhes relacionados a técnicas conhecidas eprotocolos de manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação deconstruções de ácido nucleico, mutagênese, sequenciamento, introdução deDNA nas células e expressão de gene, e análise de proteínas, ver, porexemplo, Current Protocols in Molecular Biology, 2a.ed.,Ausubel et al. eds.,John Wiley & Sons, 1992 e, Molecular Cloning: a Laboratory Manual : 3 a·edição Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000.

Tratamento

"Tratamento" inclui qualquer regime que pode ser benéfico aanimal humano ou não humano. O tratamento pode ser em relação a umacondição existente ou pode ser profilático (tratamento preventivo).Tratamento pode incluir efeitos curativo, de alívio ou profilático.

Os propeptídeos de catepsina, ácido nucleicos e métodos de epara uso na invenção podem ser usados no tratamento de um número decondições médicas. Estas incluem distúrbios neurodegenerativos de distúrbiosinflamatórios, doenças autoimunes, câncer, asma e aterosclerose. Emparticular, eles podem ser usados no tratamento de condições associadas comsuperexpressão (isto é maior do que em células saudáveis normaiscomparáveis similares) e/ou atividade aberrante (por exemplo maior do queem células saudáveis normais comparáveis similares) de proteases decatepsina.

Os propeptídeos, ácido nucleicos e métodos de e para uso nainvenção podem ser usados no tratamento de cânceres. "Tratamento decâncer" inclui tratamento de condições causadas por crescimento canceroso einclui o tratamento de crescimentos neoplásicos ou tumores. A invenção podeser particularmente útil no tratamento de câncer existente e na prevenção darecorrência de câncer após tratamento inicial ou cirurgia.

Exemplos de tumores que pode ser tratados usando a invençãoincluem, por exemplo, sarcomas, incluindo sarcomas osteogênicos e tecidomole, carcinomas, por exemplo, carcinoma de mama, pulmão, bexiga,tireóide, próstata, cólon, reto, pâncreas, estômago, fígado, uterino, próstata,cervical e ovariano, linfomas, incluindo linfomas Hodgkin e não Hodgkin,neuroblastoma, melanoma, mieloma, tumor de Wilms, e leucemias, incluindoleucemia aguda linfoblástica e leucemia aguda mieloblástica, astrocitomas,gliomas e retinoblastomas.

Em uma forma de realização, o câncer é selecionado dentrecâncer de mama, câncer de cólon, câncer de próstata e astrocitomas.

Distúrbios infíamatórios e/ou autoimunes que podem sertratados usando a invenção incluem esclerose múltipla, doença de Grave,doença inflamatória de músculo e artrite reumatóide.

Distúrbios neurodegenerativos que podem ser tratados usandoos membros de ligação, ácido nucleicos e métodos da invenção incluem, masnão são limitados a, mal de Alzheimer, mal de Parkinson, esclerose múltipla edoença de Creutzfeldt-Jakob.

Outras condições que podem ser tratadas usando os métodosda invenção incluem aterosclerose e tuberculose. Evidência foi demonstradaligando aterosclerose e obesidade com CatS aberrante. Catepsina L foidemonstrada para processar antígenos de TB em infecções, deste modo talvezprevenindo seu processamento apropriado.

Composições Farmacêuticas

Os propeptídeos e ácido nucleicos de e para uso na invençãopodem ser administrado como uma composição farmacêutica. Composiçõesfarmacêuticas de acordo com a presente invenção, e para uso de acordo com apresente invenção podem compreender, em adição a ingredientes ativos, umexcipiente farmaceuticamente aceitável, um veículo, estabilizador de tampãoou outros materiais bem conhecidos dos versados na técnica (ver, porexemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a. Ed.,Gennaro AR, et al, eds,. Lippincott Williams & Wilkins, 2005). Tais materiaispodem incluir tampões como acetato, Tris, fosfato, citrato, e outros ácidosorgânicos, antioxidantes; conservantes; proteínas, como soro albumina,gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal comopolivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina,histidina, arginina, ou lisina; carboidratos; agentes quelantes; tonificadores,ou tensoativos.

A composição também pode conter um ou mais outroscompostos ativos selecionados como necessário da indicação particular sendotratada, preferivelrnente com atividades complementares que não afetamadversamente a atividade do propeptídeo, ácido nucleico ou composição dainvenção. Por exemplo, no tratamento de câncer, em adição a um propeptídeode catepsina, a formulação pode compreender um anticorpo que liga uma oumais proteases de tipo catepsina L, ou um anticorpo para alguns outros alvoscomo um fator de crescimento que por exemplo afeta o crescimento do câncerparticular, e/ou o agente quimioterapêutico.

Os ingredientes ativos (por exemplo propeptídeos e/ou agentesquimioterapêuticos) podem ser administrados através de microesferas, lipossomas de microcápsulas, outros sistemas de distribuiçãomicroparticulados. Por exemplo, ingredientes ativos podem ser aprisionadosdentro de microcápsulas que podem ser preparadas, por exemplo, por técnicasde coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo,hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacoscoloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina,microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Paraoutros detalhes, ver Remington: The Science e Practice of Pharmacy, 21a. ed.,Gennaro AR, et al, eds,. Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Preparações de liberação sustentada podem ser usadas paradistribuição de agentes ativos. Exemplos adequados de preparações deliberação sustentada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeroshidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma deartigos moldados, por exemplo filmes, supositórios ou microcápsulas.Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis(por exemplo, poli (2- hidroxietil-metacrilato), ou poli (álcool vinílico)),polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L -glutâmico eglutamato de etila-L, etileno - acetato de vinila não degradável, copolímerosde ácido glicólico-ácido lático degradáveis, e ácido poli-D- (-)-3-hidroxibutírico.

Os propeptídeos descritos aqui se destinam, pelo menos emalgumas formas de realização, a serem administrados a humano ou outromamífero para tratamento médico.

Peptídeos são tipicamente administrados parenteralmente, epodem ser prontamente metabolizados por plasma proteases. Administraçãooral, que é talvez a via de administração mais atrativa, pode ser ainda maisproblemática. No estômago, ácido degrada e enzimas rompem os peptídeos.Aqueles peptídeos que sobreviveram à entrada no intestino intactos sãosubmetidos a proteólise adicional como são continuamente barrados por umavariedade de enzimas, incluindo enzimas gástricas e pancreáticas, exo- eendopeptidases, e peptidases de borda de escova. Como um resultado,passagem de peptídeos do lúmen do intestino na circulação sangüínea podeser severamente limitada. No entanto, vários profármacos têm sidodesenvolvidos que permitem a administração parenteral e oral de peptídeosterapêuticos.

Peptídeos podem ser conjugados a várias porções, comoporções poliméricas, para modificar as propriedades físico-químicas dosfármacos de peptídeo, por exemplo, para aumentar a resistência à degradaçãoacídica e enzimática e para melhorar a penetração de tais fármacos através dasmembranas mucosais. Por exemplo, Abuchowski e Davis descreveram váriosmétodos para a derivação de enzimas para prover produtos estabilizadossolúveis em água, não imunogênicos, in vivo ("Soluble polimer-Enzymeadducts, " Enzymes as Drugs, Eds. Holcenberg e Roberts, J. Wiley e Sons,New York, Ν. Y. (1981)). Abuchowski e Davis discutem várias formas deconjugar enzimas com materiais poliméricos, como dextranos, polivinilpirrolidonas, glicopeptídeos, polietileno glicol e ácidos poliamino. Ospolipeptídeos conjugados resultantes retêm suas atividades biológicas esolubilidade em água para aplicações parenterais. US 4.179.337 ensinacopular peptídeos a polietileno glicol ou polipropropileno glicol tendo umpeso molecular de 500 a 20.000 Daltons para prover uma composição depolipeptídeo solúvel em água não imunogênica fisiologicamente ativa. Opolietileno glicol ou polipropileno glicol protege o polipeptídeo da perda deatividade e a composição pode ser injetada no sistema circulatório domamífero com resposta substancialmente não imunogênica.

US 5.681.811, US 5.438.040 e US 5.359.030 descrevemcomplexos de polipeptídeos estabilizados, conjugados, incluindo um agenteterapêutico fusionado a um oligômero que inclui porções lipofílica ehidrofílica. Garmen, et al. descrevem um profármaco de PEG de proteína(Garman, A.J., e Kalindjian, S. B., FEBS Lett., 1987, 223, 361-365). Umprofármaco pode ser preparado usando esta química, primeiro preparando umreagente de anidrido maleico de MPEG5000 polidispersado e entãoconjugando este reagente a peptídeos descritos aqui. A reação de aminoácidoscom anidridos maleicos é bem conhecida. A hidrólise da ligação maleil -amida para reformar o fármaco contendo amina é ajudada pela presença degrupo carboxila livre de vizinhança e a geometria de ataque criada pelaligação dupla. Os peptídeos podem ser liberados (por hidrólise dosprofármacos) sob condições fisiológicas.

Tais estratégias podem ser empregadas para distribuir ospropeptídeos para uso na presente invenção.

Os peptídeos pode também ser copulados a polímeros, comoPEG polidispersado, através de um ligação degradável, por exemplo, a ligação degradável mostrada (com relação a interferon peguilado a-2b) emRoberts, M.J., et ai., Adv. Drug Delivery Rev., 2002, 54, 459-476.

Os peptídeos podem também ser ligados a polímeros comoPEG usando de estratégias de eliminação de 1,6 ou 1,4 benzila (BE) (ver, porexemplo, Lee, S., et al., Bioconjugate Chem., (2001), 12, 163-169;Greenwald, R. B., et al., US 6,180,095, 2001; Greenwald, R. B., et al., J. Med.Chem., 1999, 42, 3657-3667.); o uso de lactonização de bloqueio de trimetila(TML) (Greenwald, R. B., et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 475-487); acopulação de ácido carboxílico de PEG a um ligador de ácido carboxílicoterminado de hidróxi (Roberts, M. J., J. Pharm. Sci., 1998, 87(11), 1440- 1445), e profármacos de PEG envolvendo famílias de éteres fenílicos deMPEG e benzamidas de MPEG ligadas a um fármaco contendo amina atravésde um carbamato de arila (Roberts, M.J., et al., Adv. Drug Delivery Rev.,2002, 54, 459-476), incluindo uma estrutura de profármaco envolvendo umarelação meta entre o carbamato e a amida ou éter PEG (US 6.413.507); eprofármacos envolvendo um mecanismo de redução em oposição a ummecanismo de hidrólise (Zalipsky, S., et al., Bioconjugate Chem., 1999,10(5), 703-707).

Algumas abordagens envolvem usar inibidores de enzima paratornar mais lenta a taxa de degradação de proteínas e peptídeos no tratogastrointestinal e podem ser usados para os propeptídeos descritos aqui;manipulando pH para desativar enzimas digestivas locais; usandomelhoradores de permeação para melhorar a absorção de peptídeosmelhorando seus transportes paracelular e transcelular; usando nanopartículas5 como veículos de particulados para facilitar a absorção intacta pelo epitéliointestinal, especialmente, placas de Peyer, e para aumentar a resistência àdegradação de enzima; emulsões líquidas para proteger o fármaco de rupturaquímica e enzimática no lúmen intestinal; e formulações de micelas parafármacos pouco solubilizados em água.

Em alguns casos, os peptídeos podem ser providos em umacápsula ou comprimido apropriado com um revestimento entérico, de modoque o peptídeo não é liberado no estômago. Alternativamente, ouadicionalmente, o peptídeo pode ser provido como um profármaco. Em umaforma de realização, os peptídeos estão presentes nestes dispositivos deliberação de fármacos como profármacos.

Grupos livres arnino, hidroxila, ou ácido carboxílico dospeptídeos podem ser usados para converter os peptídeos nos profármacos.Profármacos incluem compostos em que um resíduo de aminoácido, ou umacadeia de polipeptídeo de dois ou mais (por exemplo, dois, três ou quatro)resíduos de aminoácidos que são covalentemente ligados através de ligaçõesde peptídeo a grupos livres amino, hidróxi ou ácido carboxílico de váriospolímeros, por exemplo, polialquileno glicóis como polietileno glicol.Profármacos também incluem compostos onde carbonatos, carbamatos,ésteres de amidas e de alquila são covalentemente ligados aos peptídeosacima através de ácidos carboxílicos C terminais.

Profármacos compreendendo os peptídeos (propeptídeos) dainvenção ou profármacos dos quais os peptídeos da invenção (incluindoanálogos e fragmentos) são liberados ou são liberáveis são considerados comosendo derivados da invenção.Peptidomiméticos

A presente invenção ainda engloba o uso de propeptídeosmiméticos que podem ser usados como peptídeos terapêuticos. Propeptídeosmiméticos são peptídeos curtos que imitam a atividade biológica dospropeptídeos de catepsina descritos aqui. Estes peptídeos miméticos podemser obtidos de métodos conhecidos na técnica como, mas não limitados a,exibição de fago ou química combinatória. Por exemplo, o método descritopor Wrighton, et al., Science 273:458-463 (1996) pode ser usado para gerarpeptídeos de QUB 698.8 miméticos.

Como descrito acima, os ácidos nucleicos codificandopropeptídeos de catepsina podem também ser usados em métodos detratamento. Tais ácidos nucleicos podem ser distribuídos em células deinteresse usando qualquer técnica adequada conhecida na técnica. Ácidonucleico (opcionalmente contido em um vetor) pode ser distribuído às célulasde pacientes usando técnicas in vivo ou ex vivo. Para técnicas in vivo,transfecção com vetores virais (como adenovírus, Vírus de Herpes simplex I,ou vírus adeno associado) e sistemas baseados em lipídios (lipídios úteis paratransferência mediada por lipídios do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol,por exemplo) podem ser usados (ver por exemplo, Anderson et al., Science256 : 808-813 (1992). Ver também WO 93/25673).

Em técnicas ex vivo, o ácido nucleico é introduzido nas célulasisoladas do paciente com as células modificadas sendo administradas aopaciente quer diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro demembranas porosas que são implantadas no paciente (ver, por exemplo patentes US 4.892.538 e 5.283.187). Técnicas disponíveis para introduzirácidos nucleicos em células viáveis podem incluir o uso de retrovisores virais,lipossomas, eletroporação, microinjeção, fusão celular, dextrano DEAE, ométodo de precipitação de fosfato de cálcio, etc.

O propeptídeo, ácido nucleico, agente, produto ou composiçãopodem ser administrados em uma maneira localizada em um sítio de tumor ououtro sítio desejado ou pode ser distribuído em uma maneira em que elemarque o alvo do tumor ou outras células. Terapias alvo podem ser usadaspara distribuir os agentes ativos mais especificamente a alguns tipos de célula,pelo uso de sistemas alvo como ligandos específicos de anticorpo ou decélula. A marcação no alvo pode ser desejada para uma variedade de razões,por exemplo se o agente for inaceitavelmente tóxico, ou se, de outro modo,requerer uma dosagem elevada, ou se, de outra forma, não poderia ser capazde entrar nas células alvo.

Dose

Os propeptídeos, ácido nucleicos ou composições da invençãosão preferivelmente administrados a um indivíduo em uma "quantidadeterapeuticamente efetiva", isto sendo suficiente para mostrar os benefícios aoindivíduo. O regime de dosagem real dependerá do número de fatos incluindoa condição sendo tratada, sua severidade, o paciente sendo tratado, o agentesendo usado, e será de acordo com o entendimento do médico.

A dose ótima pode ser determinada por médicos baseada emvários parâmetros, por exemplo, idade, sexo, peso e severidade da condiçãosendo tratada, o ingrediente ativo sendo administrado e a via deadministração.

A invenção será agora ainda descrita nos seguintes exemplosnão limitativos. Referência é feita aos desenhos anexos em que:

Figura 1 ilustra a amplificação de CatSPP. A seqüência decDNA da CatSPP foi amplificada de uma biblioteca de cDNA de baçohumano. Uma banda simples de aproximadamente 330 bp foi produzida,equivalente em tamanho à esperada da seqüência de cDNA de CatSPP.

Figura 2a ilustra os resultados de Colony PCR de clonagem deCatS PP em pQE-30

Figura 2b ilustra o seqüência de proteína e DNA para a matrizde leitura completa da rCatSPP é mostrada como um resultado da sua inserçãoem pQE30.

Figura 3 ilustra purificação da proteína rCatSPP: a) um perfilde eluição de rCatSPP b) mostra análise de SDS-PAGE de frações do segundopico amplo, como indicado pela seta c) Frações de purificação Immunoblotusando um anticorpo de etiqueta poliistidina.

Figura 4 ilustra a capacidade de induzir de expressão derCatSPP por IPTG como demonstrado SDS-PAGE e western blotting, a)Análise de lisados bacterianos por SDS-PAGE e coloração azul coomassie b)Blotting com um anticorpo de etiqueta poli-histidina. Marcadores de pesomolecular são indicados à esquerda de cada imagem (kDa).

Figura 5 ilustra as curvas de progresso para a hidrólise de Cbz-Val-Val-Arg-AMC na presença de rCatSPP. Uma proteína etiquetada (His) 6de controle, produzida a partir do mesmo vetor e purificada da mesmamaneira, foi usada como um controle (500 nM) (inserção).

Figura 6 mostra um gráfico de análise de regressão não linear(Morrison e Walsh, 1988) permitindo a determinação da constante de inibição(Ki).

Figura 7: Inibição de catepsinas Κ, V, L e B pela proteína derCatSPP usando testes fluorimétricos.

Figura 8 ilustra inibição de atividade elastinolítica de CatS. Osubstrato fluorogênico elastina-DQ foi usado para monitorar a viragemelastinolítica de CatS na presença de CatSPP (50 - 500 nM) durante umaincubação de 60 minutos.

Figura 9 mostra expressão relativa de proteases de tipo CatLem linhagens de célula malignas.

Figura IOa mostra os resultados de testes de invasão in vitroem quatro linhagens de célula humana malignas por; i-iv: HCTl 16, U251mg,MDA-MB-231 ePC3.Figura IOb mostra resultados de testes de invasão in vitro emcélulas MCF-7.

Figura 11 mostra resultados de um teste de MTT avaliando osefeitos citotóxicos ou proliferativos da proteína rCatSPP.

Figura 12 ilustra a análise de PCR de colônia da clonagem deCatSPP em pRSET A-Fc.

Figura 13 mostra a expressão da rCatSPP-Fc do pRSET. Umvetor foi induzido pela adição de IPTG conforme resolvido por SDS-PAGE ewestern blotting realizado usando um anticorpo de etiqueta anti-poliistidina.Figura 14: Purificação de rCatSPP-Fc.

a) mostra o perfil de purificação mostrando dois picosdistintos, um pico acentuado em após aproximadamente 200 min e umsegundo pico principal entre 225 e 250 min. b) mostra a análise de fraçõeseluídas da purificação, c) mostra a análise de frações de purificação porwestern blotting usando um anticorpo monoclonal de etiqueta anti-poli-histidina.

Figura 15 ilustra a inibição de CatS pela rCatSPP-Fc usandoum teste fluorométrico.

Figura 16 ilustra Western blots demonstrando a estabilidade deCatS PP versus CatS PP-Fc.

Figura 17 ilustra um histograma mostrando sumárioquantitativo do teste de invasão de PC3 na presença de CatSPP Fc

Figura 18 ilustra histogramas mostrando sumário quantitativode teste de invasão de HCTl 16 na presença de proteínas recombinantesCatSPP e CatSPP-Fc.

Figura 19 mostra curvas de resposta de dose usadas paradeterminar valores de EC50 para rCatS PP e rCatS PP-Fc em células de tumorMDA-MB-231.

ExemplosMateriais e MétodosClonagem e expressão de CatSPP

A CatSPP humana, resíduos 17-113, foi amplificada de umabiblioteca de cDNA de baço humano (Origene) usando iniciadores CATSPPF(5' TTT TTTGGATCCCAGTTGCATAAAGATCCTAC) e CATSPPR (5'TTTTTTGTCGACCCGATTAGGGTTTGA) contendo sítios de restrição deBamH. 1 e SalX respectivamente (como sublinhado). A banda esperada de 330bp foi visualizada por eletroforese de agarose. Esta banda foi purificada porgel e clonada usando BamHI e SalI em PQE30 (Qiagen), que incorporou uma10 etiqueta de hexahistidina N terminal para manipulações a jusante. Clonespositivos foram identificados por PCR de colônia e seqüência alinhada anúmero de acesso M90696. Um clone simples verificado foi usado emexperimentos subseqüentes.

Clonagem e expressão de CatSPP-Fc

Para clonagem da CatSPP no vetor pRSET-Fc, a seqüência de

DNA foi amplificada usando iniciadores CATSPPFCF (5'TTTTTTGGATCCCAGTTGCATAAA GAT) e CATSPPFCR (5'TTTTTTGTCGACTATCCGATTAGGGTT), novamente com sítios deenzima de restrição BamHI e SalI respectivamente (como sublinhado). A banda amplificada foi excisada do gel e clonada no vetor de expressãobacteriano pRSET que tinha sido previamente engenheirado para conter umdomínio de Fc de IgG2. Clones positivos foram identificados por PCR decolônia e alinhados em seqüência para número de acesso M90696. Um clonesimples verificado foi usado em todos os experimentos subseqüentes.

Expressão de Proteína e purificação de CatSPP e CatSPP-FcPara análise de expressão, o clone positivo de CatSPP foitransformado em células de TOPlOF' células e cultivado em frascos agitadores(500 ml) até atingir fase Iog médio (A550 0,5 , 3 7 0C). Análise de expressão doclone positivo de CatSPP-Fc foi realizada por transformação usando a cepaBL21 (DE3) pLysS de E.coli.

Expressão de ambas as proteínas recombinantes foi induzidapela adição de isopropil-P-D-tiogalactosídeo (IPTG, 1 mM) para as culturasbacterianas e propagada por um outro período de 4 horas antes da colheita. Os grânulos de células foram colocadas em suspensão novamente e lisadas em 50mM de NaH2PO4 pH 8,0, contendo 8M de uréia, 300 mM de NaCl e 10 mMde imidazol. O lisado desnaturado bruto foi clarificado por centrifugação(10.000 g, 60 minutos a 4 0C), antes da aplicação para uma coluna de IMACcarregada com íons Ni2+ (HiTrap 1 ml de coluna, GE Healthcare). Material ligado não especificamente foi lavado da coluna usando 50 mM de NaH2PO4pH 8,0, contendo 8 M uréia, 300 mM de NaCl e 20 mM imidazol, antes da re-duplicação na coluna por redução da uréia de 8 a 0 M sobre 200 volumes decoluna. Material ligado da coluna reduplicado foi lavado com outros 20volumes de coluna 50 mM de NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM de NaCl e 20 mM imidazol, antes da eluição com 50 mM de NaH2PO4 pH 8,0, 300 mM de NaCle 250 mM de imidazol. Frações de proteína foram coletadas, dessalinizadasem PBS e analisadas por SDS-PAGE e western blotting para determinar apureza e integridade. Lotes de proteína recombinante purificada foramarmazenados a -20 0C antes do uso.

Inibição de catepsinas de cisteína com rCatSPP

Testes enzimáticos foram usados para averiguar a capacidadeda rCatSPP para inibir a atividade peptidolítica de catepsinas humanas S, L,Κ, V e B (Calbiochem). Testes foram realizados em triplicata em placas demicrotitulação de 96 cavidades na presença de 100 mM de acetato de sódio, 1 mM de etilenodiaminatetraacetato (EDTA), 0,1% de Brij e 1 mM deditiotreitol (DTT) a pH 5,5. Atividade de CatS foi monitorada usando osubstrato fluorigênico de carbobenzloxi-L-valinil-L-valinil-L- arginilamido-4-metil coumarina (Z-Val-Val-Arg-AMC, 25 μΜ), testes para catepsinas L, K eV foram realizados usando carbobenzloxi-L-fenilalanil-L-arginilamido-4-metila coumarina (Z-Phe-Arg-AMC, 25 μΜ) e testes para CatB foramrealizados usando de carbobenzloxi-L- arginilamido -L-arginilamido-4-metilcoumarina (Z- Arg-Arg-AMC, 25 μΜ) como substratos. rCatSPP purificadofoi adicionado para testes como requerido em várias concentrações (0 a 1000 nM). Todos experimentos foram realizados usando um espectrofluorímetroCytofluor® 4000 com excitação a 395 nm e emissão a de 460 nm. Paraconfirmar que a rCatSPP-Fc também teve a capacidade para inibir atividadede CatS, testes fluorimétricos foram realizados usando CatS, Z-Val-Val-Arg-AMC, 25 μΜ) na presença de rCatSPP-Fc (0 nM a 200 nM).

Análise de RT-PCR de expressão de catepsina de cisteína

Os níveis de expressão relativa das catepsinas de cisteína S, L,KeV em um painel de linhagens de células malignas humanas foideterminado por análise de RT-PCR. RNA foi extraído de linhagens celularesU251mg, MDA-MB-231, HCTl 16 e PC3 usando o kit Absolutely RNA™RT-PCR Miniprep e determinados usando um espectrofotômetro. RT-PCR foirealizado usando o kit de RT-PCR One Step sob as seguintes condições :50°C durante 30 min, 95°C durante 15 min, e 35 ciclos de 94°C durante 1 min,55°C durante 1 min e 72°C durante 1 min e 30 s, seguido por 72°C durante 10min ou como detalhado no texto. Amplificação de uma série de catepsinas decisteína foi realizada usando os iniciadores detalhados na tabela abaixo.Amplificação do gene de β-actina foi usada como um controle interno parademonstrar carga igual. Produtos de RT-PCR foram analisados poreletroforese de gel de agarose e imagens foram tomadas sob luz UV usandosoftware Kodak ID 3.4 USB e uma câmera digital.

Seqüência de iniciador de RT-PCR de gene

CatS (F) GGG TAC CTC ATG TGA CAA GCatS (R) TCA CTT CTT CAC TGG TCA TGCatL (F) ATG AAT CCT ACA CTC ATC CTT GCCatL (R) TCA CAC AGT GGG GTA GCT GGC TGC TGCatK (F) ATG TGG GGG CTC AAG GTT CTG CCatK (R) TCA CAT CTT GGG GAA GCT GGC CCatV (F) ATG AAT CTT TCG CTC GTC CTG GCCatV (R) TCA CAC ATT GGG GTA GCT GGCActina (F) ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAGCTG CG

Actina (R)CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACATCT GC

Testes de invasão In vitro

Testes de invasão in vitro foram realizados usando umacâmera de Boyden modificada com 12μηι de membranas de poro (placas deCostar Transwell, Corning Costar Corp., Cambridge, MA, USA). Asmembranas foram revestidas com Matrigel (100 μg/cm ) (Becton Dickinson,Oxford, UK) e permitidas secar durante a noite em uma coifa de fluxolaminar.

As células foram adicionadas a cada cavidade em 500 μι demeio de cultura livre de soro na presença de concentrações predeterminadasda rCatSPP. Todos testes foram realizados em triplicata e placas de invasãoforam incubadas a 37 e 5% de CO2 por 24 horas após que célulaspermanecendo no superfície superior da membrana foram removidas e célulasinvadidas fixadas em Fixador de Carnoy por 15 minutos. Após secagem, osnúcleos das células invadidas foram tingidos com Hoechst 33258 (50 ng/ml)em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente. A inserção de câmara foilavada duas vezes em PBS, montada em Citifluor e células invadidas foramvistas com um microscópio fluorescente Nikon Eclipse TE300. Dez imagensdigitais de campos representativos de cada membrana triplicada foramtomadas usando uma câmera digital Nikon DXM1200 a ampliação de x20. Osresultados foram analisados usando Lucia GF 4.60 por Laboratory Imaging eforam expressados como uma porcentagem das células invadidas.Teste de viabilidade de células

Efeitos citotóxicos ou proliferativos da rCatSPP foramdeterminados por teste de MTT usando linhagem celular de carcinomacoloretal HCTl 16. Células foram adicionadas em uma concentração de 1 χ 10^4 células por 200 μΐ para uma placa 96 cavidades. 200 nM de rCatSPP, umaproteína de controle gerada do mesmo vetor sob condições idênticas e umcontrole apenas de veículo foram adicionados às células e incubados durante24, 48 e 72 h a 37 0C e 5% C02. Após o meio de cultura ser cuidadosamenteremovido e 200 μΐ de 0,5 mg/ml de brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2,5 difeniltetrazólio (MTT) foram adicionados e incubados a 37 0C durante 2 h. Oreagente de MTT foi removido e os cristais de formazano insolúveis foramdissolvidos em 100 μΐ de DMSO. Absorvência foi medida a 570 nm e osresultados foram expressados como uma porcentagem de viabilidade de célulaou proliferação relativa a cada controle de apenas veículo. Todos testes foram realizados em quintuplicata.

Resultados e Discussão

Previamente a purificação da CatSPP foi realizada por umnúmero de diferentes abordagens. Maubach e co-colaboradores produziramCatSPP de um sistema de expressão de Escherichia coli, isolando o peptídeo,correspondendo à resíduos 16-114, dos corpos de inclusão por re-duplicaçãocontra um gradiente de concentração de GdnHCl (Maubach et a.l., 1997).Guay e colaboradores também produziram o PP (resíduos 17-114) em E. coli,usando a abordagem alternativa de produção como uma fusão de término C deglutationa S-transferase. A proteína recombinante foi novamente produzidaem corpos de inclusão, que foram subseqüentemente reduplicados contra umgradiente de concentração de GdnHCl, antes da purificação por afinidade emuma coluna de sefarose GST e o PP removido da fusão de GST por uma etapade clivagem de trombina (Guay et a.l., 2000). Este último procedimentotambém foi usado para produção da CatKPP e CatLPP. Ambos estes métodosprévios produziram proteína bioativa, mas são laboriosos e consomem tempo,particularmente com o isolamento e re-duplicação dos corpos de inclusão. Emum esforço para determinar uma método simplificado mais rápido daprodução de CatSPP, os inventores expressaram o peptídeo (resíduos 17-113) com uma etiqueta hexahistidina N terminal e purificaram a proteína por re-duplicação IMAC.

Usando os iniciadores específicos de genes CATSPPF eCATSPPR detalhados, a matriz de leitura aberta codificando a região depropeptídeo (resíduos 17-113) foram amplificados da biblioteca de cDNAcomercialmente disponível por reação de cadeia de polimerase (PCR).Quando analisada por eletroforese de agarose, uma banda de tamanhoesperado foi visualizada (Fig 1). Seguindo a extração de gel, a banda foiclonada em um vetor comercialmente disponível (pQE30). A análise de 16clones por PCR de colônia descreve uma banda de aproximadamente 650 bpamplificada da colônia 10 (figura 2a. Isto poderia sugerir que apenas a colônia10 pode conter a seqüência de cDNA de CatSPP clonada com sucesso novetor de expressão bacteriano pQE-30.

DNA seqüenciado para validação completa (seqüênciasalinhadas ao Número de acesso M90696) (ver Figura 2b). Um cloneselecionado foi usado para uma outra nova propagação e fermentação, do quala espécie de rCatSPP foi isolada para outro estudo.

Expressão de rCatSPP do clone validado foi então analisada,primeiramente para super-expressão da proteína e verificação que continhauma etiqueta his N terminal e tinha o peso molecular esperado de 16 kDa eque a expressão da proteína estava sob controle do promotor T5, indutívelcom IPTG.

A rCatSPP foi expressada do vetor de expressão bacterianopQE-30 e purificada usando re-duplicação em coluna IMAC. Como mostradona figura 3a) O perfil de eluição da rCatSPP contém vários picos; um picoinicial acentuado após 185 min, seguido por um pico principal entre 190 e 195min. Frações do segundo pico principal, como indicado pela seta na Figura3b, foram resolvidas por SDS-PAGE e descreveram a presença de uma bandaaltamente purificada simples, com um peso molecular de aproximadamente16 kDa, correspondendo àquela prevista para rCatSPP 6-etiquetada (His).Figura 3c) mostra immunoblotting de frações de purificação usando umanticorpo de etiqueta poli-histidina confirmando a presença de uma espécieetiquetada his em aproximadamente 16 kDa.

A capacidade de induzir a expressão de rCatSPP por IPTG foidemonstrada por SDS-PAGE e western blotting (figura 4). A análise delisados bacterianos por SDS-PAGE e coloração azul coomassie mostra apresença da rCatSPP em aproximadamente 16 kDa na trilha b que foiinduzida mas não em trilha a não induzida. (Figura 4a) A transferência doslisados bacterianos para membrana de nitrocelulose e blotting com um anticorpo de etiqueta poliistidina confirmam a expressão da proteína na trilhab induzida apenas. (Figura 4b) Marcadores de peso molecular são indicados àesquerda de cada imagem (kDa).

Após dessalinização final no PB S, o propeptídeo foi entãotestado para sua atividade biológica. A atividade biológica da proteína derCatSPP foi averiguada por teste fluorométrico usando CatS e o substratofluorigênico Cbz-Val-Val-Arg-AMC na presença de concentraçõespredeterminadas de rCatSPP (0 nM a 500 nM). Curvas de progresso para ahidrólise de Cbz-Val-Val-Arg-AMC na presença de rCatSPP foram traçadasem gráfico e a inibição dependente de dose de atividade de CatS foi25 observada (figura 5) Uma proteína etiquetada (His) β de controle, produzidado mesmo vetor e purificada da mesma maneira, foi usada como um controle(500 nM) para confirmar que a perturbação de atividade de CatS foi devido àrCatSPP (inserção). Testes foram todos realizados em triplicata.

As curvas de progresso são indicativas da ação de um inibidorreversível de ligação lenta. A taxa aparente da primeira ordem para curvasproduzidas foi então submetida à análise de regressão não linear (Morrison eWalsh, 1988) onde a produção de fluorescência [P] ao longo do tempo podeser representada pela seguinte equação:

<formula>formula see original document page 38</formula>

Usando software GraFit®, os valores para as curvas deprogressão mostrados na Fig 7a foram fixados por análise de regressão nãolinear na equação (1), produzindo um gráfico de vs contra [I], de que Ki(observado) foi determinado. Isto foi então corrigido para contar o substratode competição, como mostrado na equação (2).

<formula>formula see original document page 38</formula>

Usando essa análise, valores de Ki foram calculados dainibição de CatS com rCatSPP. (Figura 6).

Além disso, como mostrado na figura 7, testes fluorimétricos foram realizados usando catepsinas Κ, V, L e B (a-d, respectivamente) napresença de concentrações predeterminadas da rCatSPP. Fluorescência foimonitorada por 30 min e a RFU traçada em gráfico ao longo do tempo paragerar curvas de progresso fluorométricas. As constantes de taxa de primeiraordem aparentes produzidas pela inibição da catepsinas pela rCatSPP foramsubmetidas à análise de regressão não linear (inserção) possibilitando adeterminação de constante de inibição (Ki) como 17,6 nM (± 1,3), 4,8 nM (±0,6), e 0,62 nM (± 0,14), respectivamente. Todos os testes fluorimétricosforam realizados em réplicas de três.

Com o estabelecimento de atividade anti-peptidolíticaconfirmada, os inventores então usaram rCatSPP para demonstrar suacapacidade para bloquear a atividade elastinolítica de CatS. O substratofluorogênico elastina-DQ foi usado para monitorar a viragem elastinolítica deCatS na presença de CatSPP (50 a 500 nM) durante uma incubação de 60minutos e os inventores foram capazes de demonstrar a inibição destaatividade (Fig 8).

A expressão de CatS, L, K e V em quatro linhagens de célulashumanas malignas foi avaliada por RT-PCR. Cada uma das catepsinas pareceser expressada nas quatro linhagens celulares e amplificação de Actina foiusada como um controle interno (Figura 9).

Baseado no perfil de inibição peptidolítico completo calculadoa partir da rCatSPP, e evidência que atividade elastinolítica de pelo menosCatS poderia ser demonstrada, os inventores prosseguiram a análise daefetividade do peptídeo para bloquear a atividade dessas proteases emmodelos de cânceres invasivos. Para esses experimentos os inventoresempregaram estudos examinando a invasão de células de tumor através decâmera de Boyden modificadas revestidas com matrigel (Flannery et al.,2003). Estes experimentos foram realizados em linhagens celularesrepresentativas de tipos comuns de câncer. Especificamente estas foram PC3(linhagem de célula de próstata), HCT 116 (coloretal), U251MG(astrocitoma) MDA-MB-231 (mama) e MCF7 (mama), e resultados sãomostrados na figura 10. Figura 10 ilustra a análise de quatro linhagens decélulas humanas malignas por teste de invasão in vitro; a-d: HCTl 16,U251mg, MDA-MB-231 e PC3. Cada linhagem celular mostrou reduçãosignificante em célula invasão de tumor na presença da CatSPP. (* = p: <0.01, ** = p: < 0.001, *** = p: < 0.0001). Todas as variáveis foram realizadasem triplicata com dez imagens digitais capturadas e analisadas do célula deinvasão de tumor. Os erros padrão foram traçados em gráfico como ± erromédio. Significância estatística foi calculada usando o teste t de Students.

Figura 10 b mostra um histograma ilustrando a redução significante (63%) emcélula de invasão de tumor MCF7 na presença da CatSPP.

Um teste MTT foi realizado para avaliar os efeitos citotóxicosou proliferativos da proteína rCatSPP. O teste de MTT foi realizado usandocélulas de carcinoma coloretal HCTl 16, incubadas com 200 nM da rCatSPP,proteína de controle e controle de apenas veículo. Os resultados (Figura 11)ilustram que a proteína recombinante não tem efeito significante nocrescimento celular. Todas variáveis foram repetidas em quintuplicata.

Os inventores prosseguiram os estudos para investigar o efeito5 de prover uma porção Fc no propeptídeo de catepsina na inibição de proteasesde tipo catepsina L em modelos de câncer invasivo.

Um propeptídeo de catepsina S compreendendo uma porçãoFc C-terminal (CatSPP Fc) foi clonada e expressada usando os métodos comodescritos para CatSPP acima. A seqüência de cDNA da CatSPP foi clonáda no vetor de pRSET A-Fc. Uma seleção de 8 colônias da placa positivamentetransformada foi submetida à análise de PCR de colônia usando iniciadoresespecíficos de vetores. Todas as 8 colônias parecem positivas devido àamplificação de uma banda de aproximadamente 1100 bp (Figura 12). Aexpressão da rCatSPP-Fc do vetor de pRSET A foi induzida pela adição deIPTG. Os resultados são mostrados na Figura 13. Amostras nas trilhas A, B, Ce D contêm não induzida e induzida (B=0,2, C=O,5 e D=O,7 OD (A550 nm)respectivamente). Amostras foram resolvidas por SDS-PAGE e westernblotting realizado usando um anticorpo de etiqueta poli-histidina. A espéciede proteína etiquetada His com um peso molecular de aproximadamente 46kDa foi detectada, equivalente ao tamanho previsto de rCatSPP-Fc. A induçãode expressão na cultura com um OD de 0,2 pareceu a melhor para a produçãode proteína.

A rCatSPP-Fc foi purificada usando IMAC devido à suaetiqueta His N terminal . Os resultados são mostrados na figura 14 a) O perfilde purificação mostra dois picos distintos, um pico acentuado em apósaproximadamente 200 min e um segundo pico principal entre 225 e 250 min.b) A análise das frações eluídas da purificação sugere que o primeiro picorepresenta eluição de proteínas de ligação não especificamente da coluna(frações 1-5), considerando o pico secundário principal mostrando a eluiçãode uma espécie de aproximadamente 46 kDa, de acordo com o tamanhoesperado da rCatSPP-Fc (frações 6-15). c) Análise de frações de purificaçãopor western blotting usando um anticorpo monoclonal de etiqueta poliistidinamostra a presença de uma espécie etiquetada his de aproximadamente 46 kDacomo esperado para rCatSPP-Fc.

A inibição de atividade peptidolítica de CatS usando CatSPPFc foi medida. A rCatSPP-Fc foi avaliada por teste fluorométrico usando osubstrato fluorogênico Z-WR-AMC para determinar se a espécie tem acapacidade para reter sua inibição de CatS após a adição do domínio de Fcsem quaisquer efeitos negativos na cinética. Os resultados são mostrados nafigura 15: a) Curvas de progresso demonstram a inibição de atividade de CatSna presença de concentrações aumentadas da rCatSPP-Fc (0 nM a 200 nM). a,inserção) A proteína de controle de Fc (200 nM) não teve efeitos discerníveisna atividade de CatS, b) Taxas foram extrapoladas das curvas de progresso e acinética da inibição foi calculada como 8,9 nM (± 2,5). Os testes foramrepetidos três vezes.

A estabilidade de CatS PP versus CatS PP-Fc foi avaliadacomo segue. As proteínas de rCatSPP e rCatSPP-Fc foram incubadas comcélulas de carcinoma coloretal HCTl 16 para avaliar a estabilidade dasproteínas recombinantes por adição do domínio de Fc de IgG2 anticorpo.

Amostras de sobrenadantes foram avaliadas por western blotting (figura 16)para determinar a estabilidade dentro do sobrenadante de célula. A rCatSPPpode apenas ser detectada em 0 h considerando que a estabilidade darCatSPP-Fc parece melhorada, devido à sua detecção após 24 h. Comocontroles, sobrenadantes de células não contendo proteína adicionada (-)foram também avaliados e membranas foram tingidas com Ponceau vermelhopara confirmar carga igual de sobrenadantes. Experimentos foram realizadosem triplicata.

O efeito da CatSPP Fc na catepsina S em um teste de invasãoin vitro usando células PC3 de próstata foi então testado. Os resultados sãomostrados na figura 17. O histograma mostra um sumário quantitativo doteste de invasão de PC3 na presença de CatSPP Fc (0-32 nM). Cada teste foirealizado em triplicata e dez campos foram contados em cada teste.

O efeito da CatSPP Fc na catepsina S em um teste de invasãoin vitro usando outras linhagens celulares de tumor foi então testado (Figura18). As proteínas de rCatSPP e rCatSPP- Fc foram aplicadas para testes deinvasão in vitro usando linhagem celular coloretal HCTl 16. Testes foramrealizados na presença de concentrações aumentadas da rCatSPP (0 nM a 250nM) ou rCatSPP-Fc (0 nM a 50 nM) e também proteínas de controleapropriadas na concentração máxima. Desvios padrões são traçados emgráfico como barras de erro. Testes foram repetidos em triplicata com dezimagens capturadas de cada. O desvio padrão em célula de invasão de tumorde meio é traçado como ± barras de erro.

Resultados similares foram encontrados no teste de invasãoconduzido usando células MDA-MB-231. Figura 19 ilustra valores de EC50relativos para rCatS PP e rCatS PP-Fc. A taxa relativa de célula de invasão detumor de MDA-MB-231 na presença de concentrações variantes de rCatSPPou rCatSPP-Fc foram submetidas à análise de regressão não linear e curvasdose - resposta sigmóides construídas. Os valores de EC50 resultantes foramverificados como sendo 78,0 nM e 8,3 nM da (a) rCatSPP e (b) rCatSPP-Fcrespectivamente.

Como pode ser visto, CatSPP Fc agiu como um potenteinibidor da catepsina S nos testes de invasão, com a inibição máxima sendosignificantemente maior e a concentração inibitória sendo significantementemenor que aquela produzida com CatSPP sem porção Fc. Embora, possa tersido esperado que a estabilidade da molécula de CatSPP seria melhorada paraum extensão pequena pela porção Fc, é, contudo, muito surpreendente que ainclusão da porção de Fc melhore tão significantemente o efeito inibitório.Assim, os resultados demonstram que a inclusão de uma porção de Fc comum propeptídeo de catepsina melhora a inibição da atividade de protease detipo catepsina L em modelos de invasão de tumor. Outros estudos foramrealizados usando inibidores de molécula pequena de espectro extenso decatepsinas em modelos de tumorigênese, demonstrando efeitos similares.Joyce e colaboradores empregaram o uso de JPM-OEt, um análogo permeávelde célula de inibidor de catepsina de cisteína de espectro amplo E64, emestudos em camundongos de RIP-Tag2 transgênicos (Joyce et a.l., 2004).

Estes camundongos desenvolveram tumores de ilhotas pancreáticas em 12-14semanas devido à presença de antígeno de SV40 T oncogênico. Elesdemonstraram que a administração deste inibidor de espectro amplo para estescamundongos poderia significantemente inibir os múltiplos estágios dedesenvolvimento de tumor, incluindo o desenvolvimento de carcinomasaltamente invasivos após análise histológica dos animais. Em uma outrainvestigação, Flannery e colaboradores examinaram o uso de A-morfolineuréia-Leu- homoPhe-vinilsulfona (LHVS), no bloqueio da invasãode astrocitoma. Usando o mesmo modelo de invasão como os inventoresempregaram aqui, foi demonstrado que LHVS, que potencialmente inibe CatSe Cat de menor extensão, poderia bloquear células de U251MG invadindo ematé 60% em uma concentração de 50 nM (Flannery et al., 2003).Coletivamente, estes estudos prévios claramente demonstraramprimeiramente o papel que proteases de tipo CatL desempenham emprocessos de invasão nestas linhagens celulares, e segundo seu potencialcomo alvos terapêuticos para terapêutica de cânceres.

Apesar dos esforços consideráveis de pesquisa, a extensão dopapel de cada uma destas proteases na tumorigênese ainda está para serplenamente apreciado. Claramente uma quantidade substancial de provas paracom seu papel na ruptura de elastina, colágeno e outros componentes damatriz extracelular, uma vez que eles foram secretados pelas célulastumorigênicas. No entanto, o papel que estas enzimas desenvolvem naativação e controle de cada outra e de outras proteases menos intimamenterelacionadas, como as metaloproteases, está agora emergindo (Kobayashi etal., 1993). Além disso, nova evidência surgiu para destacar o papel de CatS naruptura de fatores anti-angiogênicos derivados de matriz, e produção defatores pro-angiogênicos durante progressão de tumor (Wang et al., 2005).Isto demonstra que estas proteases poderiam ter outros papéis do quesimplesmente a digestão de ECM circundante para permitir progressão emigração de tumor.

Conclusões

Assim aqui os inventores descreveram um novo método deexpressão e purificação para a produção de propeptídeos de catepsina, porexemplo CatSPP. Os inventores demonstraram que, por inibição de proteasesde tipo catepsina L usando propeptídeos de catepsina, por exemplo rCatSPP,tumorigênese pode ser atenuada. Dados os perfis de inibição que osinventores verificaram em testes de invasão in vitro usando uma faixa delinhagens celulares de tumor diferentes, é evidente que a inibição ampla dasproteases de tipo CatL tem um claro benefício terapêutico para o tratamentoclínico de câncer. A capacidade para desenvolver agentes que podembloquear a difusão de tumores, particularmente para sítios secundários docorpo seria atraente para a co-administração de regimes de agentescitotóxicos. A capacidade para rapidamente produzir rCatSPP a partir deculturas bacterianas e aplicá-las com sucesso nestes modelos de invasão detumor sugere que isso poderia representar uma nova abordagem para o projetode inibidores de proteases terapêuticas.

Todos os documentos referidos neste relatório são aquiincorporados por referência. Vários modificações e variações nas formas derealização da invenção descritas serão evidentes para os versados na técnicasem se desviar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenhasido descrita em conexão com formas de realização preferidas específicas,deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve serindevidamente limitada a tais formas de realização específicas. De fato, váriasmodificações dos modos descritos de realizar a invenção que são óbvios paraos versados na técnica são destinados a serem cobertos pela presenteinvenção.

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Claims

1. Método para inibir a atividade de uma protease de tipocatepsina L em células ou tecido, caracterizado pelo fato de que o referidométodo compreende a administração de um propeptídeo de catepsina ou umácido nucleico codificando um propeptídeo de catepsina para referidas célulasou tecido.

2. Método para inibir a superexpressão de uma protease de tipocatepsina L em células ou tecido, caracterizado pelo fato de que o referidométodo compreende a administração de um propeptídeo de catepsina ou umácido nucleico codificando um propeptídeo de catepsina para referidas célulasou tecido.

3. Método para tratar uma condição associada com atividadeaberrante e/ou superexpressão de uma protease de tipo catepsina L em umpaciente em necessidade de tratamento da mesma, caracterizado pelo fato deque o referido método compreende a administração de um propeptídeo decatepsina ou um ácido nucleico codificando um propeptídeo de catepsina.

4. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelofato de que a condição associada com atividade aberrante e/ou superexpressãode uma protease de tipo catepsina L é uma doença neoplásica, um distúrbioinflamatório, um distúrbio neurodegenerativo, um distúrbio autoimune, asma,ou aterosclerose.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que o propeptídeo de catepsina é um propeptídeode catepsina humano compreendendo seqüência de aminoácidoscorrespondendo a resíduos de aminoácidos 17 a 113 da catepsina S proteasecomo descrito em número de acesso M90696.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o propeptídeo de catepsina é umpropeptídeo de catepsina humano tendo seqüência de aminoácidoscorrespondendo à seqüência de aminoácidos 1-118 da Figura 3.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o propeptídeo de catepsinacompreende uma porção Fc de anticorpo.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que a protease de tipo catepsina L écatepsina S.

9. Propeptídeo de catepsina ou um ácido nucleico codificandoum propeptídeo de catepsina, caracterizado pelo fato de ser para uso emmedicina.

10. Propeptídeo de catepsina ou um ácido nucleico codificandoum propeptídeo de catepsina, caracterizado pelo fato de ser para uso notratamento de uma condição associada com atividade aberrante e/ousuperexpressão de uma protease de tipo catepsina L.

11. Propeptídeo ou ácido nucleico de acordo com areivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a condição associada comatividade aberrante e/ou superexpressão de uma protease de tipo catepsina L éuma doença neoplásica, um distúrbio inflamatório, um distúrbioneurodegenerativo, um distúrbio autoimune, asma, ou aterosclerose.

12. Propeptídeo ou ácido nucleico de acordo com qualqueruma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o propeptídeode catepsina é um propeptídeo de catepsina humano compreendendoseqüência de aminoácidos correspondendo a resíduos de aminoácidos 17 a113 da catepsina S protease como descrito em número de acesso M90696.

13. Propeptídeo ou ácido nucleico de acordo com qualqueruma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o propeptídeode catepsina é um propeptídeo de catepsina humano tendo seqüência deaminoácidos correspondendo à seqüência de aminoácidos 1-118 da Figura 3.

14. Propeptídeo ou ácido nucleico de acordo com qualqueruma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o propeptídeode catepsina compreende uma porção Fc de anticorpo.

15. Propeptídeo ou ácido nucleico de acordo com qualqueruma das reivindicações 9 a 14, caracterizado pelo fato de que a protease detipo catepsina L é catepsina S.

16. Uso de propeptídeo de catepsina ou de um ácido nucleicocodificando um propeptídeo de catepsina, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para o tratamento de uma condição associadacom atividade aberrante e/ou superexpressão de uma protease de tipocatepsina L.

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelofato de que a condição associada com atividade aberrante e/ou superexpressãode uma protease de tipo catepsina L é uma doença neoplásica, um distúrbioinflamatório, um distúrbio neurodegenerativo, um distúrbio autoimune, asma,ou aterosclerose.

18. Uso de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que o propeptídeo de catepsina é um propeptídeo decatepsina humano compreendendo seqüência de aminoácidos correspondendoresíduos de aminoácidos 17 a 113 da catepsina S protease como descrito emnúmero de acesso M90696.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a-18, caracterizado pelo fato de que o propeptídeo de catepsina é umpropeptídeo de catepsina humano tendo seqüência de aminoácidoscorrespondendo à seqüência de aminoácidos 1-118 da Figura 3.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a-19, caracterizado pelo fato de que o propeptídeo de catepsina compreendeuma porção Fc de anticorpo.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 16a-20, caracterizado pelo fato de que a protease de tipo catepsina L é catepsina S.

22. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um propeptídeo de catepsina ou um ácido nucleico codificandoum propeptídeo de catepsina.

23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-22, caracterizada pelo fato de que o propeptídeo de catepsina é umpropeptídeo de catepsina humano compreendendo seqüência de aminoácidoscorrespondendo a resíduos de aminoácidos 17 a 113 da catepsina S proteasecomo descrito em número de acesso M90696.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-22 ou reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o propeptídeo decatepsina é um propeptídeo de catepsina humano tendo seqüência deaminoácidos correspondendo à seqüência de aminoácidos 1-118 da Figura 3.

25. Composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 22 a 24, caracterizada pelo fato de que o propeptídeo decatepsina compreende uma porção Fc de anticorpo.

26. Composição farmacêutica de acordo com qualquer umadas reivindicações 22 a 25, caracterizada pelo fato de que a protease de tipocatepsina L é a catepsina S.

27. Método para produção recombinante de propeptídeos decatepsina, caracterizado pelo fato de compreender expressar um propeptídeode catepsina com uma etiqueta de poliistidina N-terminal e purificar opropeptídeo expressado usando cromatografia de afinidade de íon metal (IMAC).