JP2020186263A - 放射性および化学的損傷を予防及び治療するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端(N−末端)グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはLys76−Lys77においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でPAによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのArg560−Val561ペプチド結合はuPAまたはtPAによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす[10]。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同のクリングル環を含み、即ちいわゆるkringleであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のKringleはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α2−APの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見された一つのプラスミノゲンは38kDaのフラグメントであり、kringlel−4を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンギオスタチン(Angiostatin)と命名され、幾つかのプロテアーゼがプラスミノゲンを加水分解することにより生成される。
プラスミノーゲンまたはプラスミンが生体の放射および化学的損傷に対して顕著な治療効果を有し、しかも非常に安全であることを研究において意外に発見した。したがって、プラスミノーゲンまたはプラスミンの使用は、異なるタイプの放射と化学的損傷および関連疾患を治療するための新規な治療ストラテジーである。
物または療法と組み合わせて投与されることができる。
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者はプラスミンまたはプラスミノゲンが不足している。具体的に、前記不足は先天的、継発的及び/または局所的である。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日0.0001−2000mg/kg、0.001−800mg/kg、0.01−600mg/kg、0.1−400mg/kg、1−200mg/kg、1−100mg/kg、10−100mg/kg(体重一キロあたりで計算)または0.0001−2000mg/cm2、0.001−800mg/cm2、0.01−600mg/cm2、0.1−400mg/cm2、1−200mg/cm2、1−100mg/cm2、10−100mg/cm2(体表面積平方センチメートルあたりで計算)の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
はプラスミンを含む薬物組成物に係る。一つの実施形態において、前記損傷は、骨髄造血系、皮膚、粘膜、免疫系および生殖系への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体への損傷を含む。一つの実施形態において、前記損傷は、放射線療法、化学療法または化学放射線療法による一般的な健康状況の低下、全身の副作用および局所的な副作用であり、急性副作用、長期的な副作用、および累積副作用を含む。一つの実施形態において、前記損傷の関連疾患は、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害を含む。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するものである。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤および解毒剤を含む、一つまたは複数の他の薬物または療法と組み合わせて投与されることができる。
一つの実施形態において、前記被験者はプラスミンまたはプラスミノゲンが不足している。具体的に、前記不足は先天的、継発的及び/または局所的である。
一つの実施形態において、プラスミノゲンと配列2、6、8、10または12は少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有する。一つの実施形態において、プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12において、1−100、1−90、1−80、1−70、1−60、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、1−10、1−5、1−4、1−3、1−2、1個のアミノ酸を添加、削除及び/または置換したもので、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である。一つの実施形態において、プラスミノゲンはGlu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、マイクロプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはその任意の組み合わせから選ばれるものである。一つの実施形態において、プラスミノゲンは以下から選ばれる保存的な置換変異体である:Glu−プラスミノゲン、Lys−プラスミノゲン、ミニプラスミノゲン、δ−プラスミノゲンまたはマイクロプラスミノゲン。一つの実施形態において、プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2に示されたプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス/ラット、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示されるものである。
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定剤と組み合わせて投与する。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日0.0001−2000mg/kg、0.001−800mg/kg、0.01−600mg/kg、0.1−400mg/kg、1−200mg/kg、1−100mg/kg、10−100mg/kg(体重一キロあたりで計算)または0.0001−2000mg/cm
2、0.001−800mg/cm2、0.01−600mg/cm2、0.1−400mg/cm2、1−200mg/cm2、1−100mg/cm2、10−100mg/cm2(体表面積平方センチメートルあたりで計算)の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。
一つの実施形態において、前記被験者は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。
一つの実施形態において、前記被験者はプラスミンまたはプラスミノゲンが不足している。具体的に、前記不足は先天的、継発的及び/または局所的である。
プラスミノゲンはヒト天然プラスミノゲンであり、例えば配列2に示されたプラスミノゲンのオルソログであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するプラスミノゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス/ラット、ウシ、ウマ、イヌに由来するプラスミノゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のプラスミノゲンのアミノ酸配列は配列2、6、8、10または12に示されるものである。
一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンまたはプラスミンは外部使用、経口、全身または局所投与により投与される。一つの実施形態において、以下の経路により投与される:体表、静脈内、筋肉内、皮下、吸引、髄腔内、局所注射、関節内注射または直腸投与。一つの実施形態において、前記投与方式は外部使用である。一つの実施形態において、前記局所投与は、損傷域において、プラスミノーゲンまたはプラスミンを直接に投与することによって予防及び/または治療を行う。
本発明は、本発明に係る実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせた技術構成は、前記実施形態が単独且つ明確に開示されているように、本出願で明確に開示されている。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせをカバーし、さらに本明細書中において開示されており、それぞれそのようなサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているようにである。
放射損傷と化学的損傷は、生体器官、組織構造及び機能の損傷として現れることがあり、例えば、骨髄造血系の生理学的構造及び機能への損傷、皮膚、粘膜の生理学的構造及び機能への損傷、免疫系の生理学的構造及び機能への損傷および生殖系の生理学的構造及び機能の損傷への損傷がある。一つの実施形態において、前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体の生理学的構造及び機能への損傷を含む。前記損傷の関連疾患は、器官と組織の機能障害として現れ、例えば、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害がある。
療法は通常、X線、γ線、中性子およびその他の放射線源を使用して、癌細胞を殺し、または細胞内の遺伝物質を破壊する。化学療法は、細胞毒性薬を単独でまたは組み合わせて使用することによって癌細胞の複製または増殖を破壊する。正常細胞も放射線療法において損傷を受けてしまい、しかも自己修復することができない。放射線療法中に、皮膚刺激、治療域における脱毛、および骨髄損傷を含む副作用が起こり得る。
「化学療法」とは、細胞毒性薬を単独でまたは組み合わせて使用することによって癌細胞を殺すことをいう。放射線療法の場合と同様に、癌細胞は損傷を受けて最終的に死亡することがあるが、健康的な細胞は化学療法を受けた後の自己修復過程において影響される。細胞毒性薬は成長細胞の分化および増殖能力を妨害することにより作用する。したがって、癌細胞の他に、正常且つ迅速に分化し成長する細胞も影響を受ける。例えば、これらは骨髄の造血機能に影響を及ぼし、骨髄抑制を引き起こす可能性がある。また、消化管、口腔壁および生殖系の細胞に影響を与え、毛包を影響し、下痢、口腔痛および脱毛を引き起こす可能性がある。
ほとんどの副作用は予測または予期可能である。放射線療法の副作用は、通常、患者が治療を受ける局所域のみに限られる。現代の放射線療法の目標は、副作用を最小限に抑え、患者が避けられない副作用を理解し処理できるようにすることである。
骨髄抑制は、放射線療法と化学療法の多くの副作用の一つである。これによって、赤血球、白血球、血小板などの血液細胞の生成が減る。その結果、患者は貧血により疲労し、白血球減少により感染しやすくなり、血小板が減少するため、傷があると、打撲傷が起こりやすく、出血も多くなる。
「プラスミノゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、swiss prot中の配列に基づいて、シグナルペプチドの天然ヒト由来プラスミノゲンのアミノ酸配列(配列4)は計算によれば810個のアミノ酸からなり、分子量は約92kDであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列3に示される通りである。フルサイズのプラスミノゲンは七つのドメインを含む:C末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、N末端に位置するPan Apple(PAp)ドメイン及び5つのKringleドメイン(Kringle1−5)を含む。swiss prot中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Met1−Gly19を含み、Papは残基Glu20−Val98を含み、Kringle1は残基Cys103−Cys181を含み、Kringle2は残基Glu184−Cys262を含み、Kringle3は残基Cys275−Cys352を含み、Kringle4は残基Cys377−Cys454を含み、Kringle5は残基Cys481−Cys560を含む。NCBIデータにより、セリンプロテアーゼドメインは残基Val581−Arg804を含む。
ノ酸からなる(19個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない)、該配列をコードするcDNA配列は配列1に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列2に示される通りである。体内において、さらにGlu−プラスミノゲンの第76−77位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたLys−プラスミノゲンが存在し、例えば配列6に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列5が示す通りである。δ−プラスミノゲン(δ−plasminogen)はフルサイズのプラスミノゲンにKringle2−Kringle5構造の欠損が生じているフラグメントであり、Kringle1及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず[18,19]、δ−プラスミノゲンのアミノ酸配列(配列8)を報告している文献があり[19]、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は例えば配列7である。ミニプラスミノゲン(Mini−plasminogen)はKringle5及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Val443−Asn791(シグナルペプチドGlu−プラスミノゲン配列を含まないGlu残基を開始アミノ酸とする)について文献が報告しており[20]、そのアミノ酸配列は配列10に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列9が示す通りである。しかしマイクロプラスミノゲン(Micro−plasminogen)はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ala543−Asn791(シグナルペプチドを含まないGlu−プラスミノゲン配列のGlu残基は開始アミノ酸である)と文献が報告し[21]、特許文献CN102154253Aはそれが残基Lys531−Asn791を含むと開示し(シグナルペプチドを含まないGlu−プラスミノゲン配列のGlu残基を開始アミノ酸とする)、本特許の配列は特許文献CN102154253Aを参照でき、そのアミノ酸配列は配列12に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするcDNA配列は配列11に示される通りである。
循環過程において、プラスミノゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノゲン活性化剤(plasminogen activator,PA)の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン質加水分解生成物及びD−二量体に加水分解して、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノゲンのPapドメインはプラスミノゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要な決定クラスターであり、しかしKRドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む:組織プラスミノゲン活性化剤(tPA)、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤(uPA)、カリクレイン及び凝結因子XII(ハーゲマン因子)などである。
現在、血液中のプラスミノゲン及びその活性測定方法は以下を含む:組織フィブリンプラスミノゲン活性化剤の活性に対する測定(t−PAA)、血漿組織プラスミノゲン活性
化剤抗原に対する測定(t−PAAg)、血漿組織プラスミノゲン活性に対する測定(plgA)、血漿組織プラスミノゲン抗原に対する測定(plgAg)、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定(PAP)。最もよく見られる測定方法は発色基質法である:測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ(SK)と発光基質を転化し、測定対象の血漿中のPLGはSKの作用下においてPLMとなり、後者は発光基質に作用し、その後に分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノゲン活性に対して測定を行う。
「保存的(conservative)置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性(例えば酸性、アルカリ性、疎水性など)のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性のアルカリ性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、MEGALIGNアルゴリズムに基づいて70%〜99%の類似性(同一性)を有する。「保存的置換変異体」はさらにBLASTまたはFASTAアルゴリズムに基づいて60%以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素であり、75%以上に達すればさらによく、最も好ましくは85%以上に達し、さらには90%以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
性と同種性由来のリーダー配列(N端メチオニン残基を有するか有しない)を含む融合物;等々である。
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ(%)」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウエアによって実現できる。当業者は引用配列の適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズを比較することで最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムを含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアALIGN−2により得られるものである。
そのうちXは配列比較プログラムALIGN−2において該プログラムのA及びBの比較において同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちYはBにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである:アミノ酸配列Aの長さとアミノ酸配列Bの長さが等しくない場合、AのBに対するアミノ酸配列の同一性%は、BのAに対するアミノ酸配列同一性%とは異なる。明確に説明した場合を除き、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値%は前記の段落に記載の通りであり、ALIGN−2コンピュータプログラムによって得られるものである。
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ(ラット、マウス)、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物(例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)などを含むがこれらに限られない。
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与され、疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び/または治療を実現するプラスミノゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノゲン、治療しようとする被験者の疾患及び/または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
プラスミノゲンまたはプラスミンは自然界から分離及び精製され、さらに治療の用途に用いられるものであり、さらには標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することができる。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成(SPPS)(配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する)はプラスミノゲンまたはプラスミンの化学的合成に適したものである。各種形式のSPPS、例えばFmoc及びBocは
、プラスミノゲンまたはプラスミンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている:Barany及びSolid−Phase Peptide Synthesis;3−284ページ、The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第二巻:Special Methods
in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield,tら J.Am.Chem.Soc.,85:2149−2156(1963);Stewartら,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd
ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984);及びGanesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3−10及びCamarero JAら 2005Protein Pept Lett.12:723−8。簡単に言えば、その上にペプチド鎖の機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング/脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離N末端アミンと単一のN保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいN末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノゲンを生産する。例えば、プラスミノゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター(例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター)、シグナル配列、エンハンサー素子及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーター系とすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞(例えばCOSまたはCHO細胞)を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノゲンの収集及び精製の条件下において宿主を維持できる。
大腸菌(Escherichia coli)はクローンするプラスミノゲンをコードするポリヌクレオチドの原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)及びその他の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、例えばサルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、及び各種シュードモナス属(Pseudomonas)種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と許容する発現制御配列(例えば複製開始点)を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、β−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージλ由来のプロモーター系である。プロモーターは通常発現を制御し、遺伝子配列を操縦する場合、さらにリボソームの結合位置配列を有し、転写及び翻訳を起動させてもよい。
微生物以外に、哺乳動物細胞(例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞)も本発明のプラスミノゲンの発現および生成に用いることができる(例えばプラスミ
ノゲンをコードするポリヌクレオチド)。例えばWinnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)参照。適した哺乳動物宿主細胞はCHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたB細胞またはハイブリドーマである。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー(Queenら,Immunol.Rev.89:49(1986))、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合位置、RNAの切断位置、ポリアデノシン酸化位置、及び転写終止子配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Coら、J.Immunol.148:1149(1992)を参照すること。
必要とする純度のプラスミノゲンまたはプラスミンと選択可能な薬用担体、賦形剤、または安定剤(Remington′s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.ed.(1980))を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定剤は所要の使用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む;防腐剤(例えばベンジルジメチルステアリルアンモニウムクロリド水和物;塩化ヘキサメチレンジアミン;塩化ベンザルコニウム(benzalkonium chloride)、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール;アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルのパラヒドロキシ安息香酸エステル;ピロカテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンチルアルコール;m−クレゾール);低分子量ポリペプチド(少なくとも10個の残基を有するもの);タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性重合体、例えばポリゼニールピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンである;単糖、二糖及びその他の炭水化物はブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む;キレート剤は例えばEDTAである;糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである;塩形成イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば亜鉛−タンパク複合体);及び/または非イオン界面活性剤、例えばTWEENTM、PLURONICSTMまたはポリエチレングリコール(PEG)である。好ましくは凍結乾燥された抗−VEGF抗体配合剤であり、WO 97/04801に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤または解毒剤等である。
ポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル)中に入れまたはエマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―(メタアクリル酸メチル)マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術は以下に開示されている。Remington′s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌ろ過膜でろ過することで容易に実現できる。
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内(例えば頸動脈)、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と許容し得るpH及び等張状態に調整する。
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性/水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約0.0001〜2000mg/kgであり、または約0.001〜500mg/kg(例えば0.02mg/kg,0.25mg/kg,0.5mg/kg,0.75mg/kg,10mg/kg,50mg/kgなど)である。例えば、用量は1mg/kg体重または50mg/kg体重または1−50mg/kgの範囲とすることができ、または少なくとも1mg/kgである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量の日程表は連続数日1−10mg/kg投与することである。本発明の薬物の投与過程において放射性と化学的損傷及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
本発明の一つの実施形態はプラスミノゲンまたはプラスミンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。そのうち前記治療効力を判断する方法は以下を含むが、これらに限られない:1)免疫系の回復に対する検査で、具体的には、例えば、白細胞、血小板数量の回復であり、被験者が本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンによる治療を受けた後、前記検査が正常値の範囲内に戻るまたは改善されることは予期され、例えば、白細胞は4〜10×109/Lに戻り、血小板は100〜300×109/Lに戻る;2)食欲不振、吐き気嘔吐、下痢、便秘などの症状を含み、消化系の不良表現が改善される;3)アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)などの肝機能、総ビリルビン値、腎機能などを含む、生体の各器官の機能が改善され、具体的には、被験者が本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンによる治療を受けた後、前記検査が正常値の範囲内に戻るまたは改善されることは予期され、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT):0〜40μ/L、総ビリルビン:3.4〜20.5μmоl/Lである;4)静脈炎、潰瘍などその他の症状が改善される。また、本発明はさらにプラスミノゲンまたはプラスミンを用いて被験者に対して治療を行う過程中及び治療後において、前記該治療案の安全性に対する判断に係り、被験者の血清半減期、治療半減期、半数中毒量(TD50)、半数致死量(LD50)に対して統計を行い、または治療過程中においてまたは治療後に発生する各種望ましくない事件例えばアレルギー反応に対して観察を行うことを含むが、これらに限られない。
本発明の一つの実施形態は、放射損傷と化学的損傷および関連疾患の治療に用いられる本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含有する、製品または薬物キットに係るものである。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはパンフレットを含む。適切な容器はボトル、小瓶、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する(例えば前記容器は静脈輸液用パックまたは小瓶であり、皮下注射針によって貫通される栓を含む)。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノゲンまたはプラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは、前記組成物を本発明の前記放射損傷と化学的損傷及びその関連疾患の治療に用いられることを説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びブドウ糖溶液である。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するパンフレットを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノゲンまたはプラスミン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
材料及び方法:
実験動物:7〜8週齢のSPFレベル健康なオスC57マウスを5.0Gyにて照射した後に脾臓、肝臓、腎臓などの器官の病理学的変化を調べた。動物を7日間適応給餌した後、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群、単純照射群、およびプラスミノーゲン投与群である。
実験方法:線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyであり、準致死量照射であり、脾臓、肝臓、腎臓などの器官の組織病理学的変化、造血および免疫機能の研究およびフリーラジカルの検出に用い、ソーススキン距離100cm、照射面積30cm×30cmで、正常対照群に対して鉛ブロックを覆って保護した。照射後、
マウスが死亡するあるいは特定の時間で殺処分するまでに投与を行い、対照群に同じ体積の溶媒を投与した。照射されたマウスの全身状態を観察し、肝臓、腸組織、腎臓組織のHE染色の組織病理学的変化およびF4/80の免疫組織化学的染色を光学顕微鏡下で観察した。
1.肝臓、腸、腎臓の組織病理学的観察:
眼球を摘出して血を採取しマウスを殺処分した後脾臓肝臓、腸、腎臓組織を取り、10%中性ホルマリンにて固定し、アルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹にし、パラフィンで包埋させ、パラフィン切片にし(切片の厚みは5μmである)、通常HE染色の後、中性ゴムに封入し、各組織病理学的変化を顕微鏡下で観察した。
2.肝臓、腸、腎臓F4/80免疫組織化学的染色の観察
肝臓、腸、腎臓をパラフィン切片にし(切片の厚みは5μmである)、免疫組織化学的染色後、各組織における発現状況を顕微鏡下で観察した。
実験動物:7〜8週齢のSPFレベル健康なオスC57マウスをアンチシスプラチンの毒性効果の観察に用い、動物を7日間適応給餌した後、ランダムに三つの群に分け、それぞれブランク対照群、単純モデル群、およびプラスミノーゲン投与群である。
実験方法:
シスプラチン群:シスプラチン注射剤を、生理食塩水を用いて質量濃度が1mg/mlである水溶液に調製し、3.5ml/kg体重で腹腔注射により投与した。対照群のマウスに対して毎回同じ体積の生理食塩水を腹腔注射した。5日間連続的に投与してモデルを構築し、モデルを構築した後、治療群に1mg/匹でプラスミノーゲンを投与し、対照群とモデル群に同じ体積の溶媒を投与し、プラスミノーゲンを投与して7日目に動物を殺処分した。血と腎臓組織などをそれぞれ採取して指標検出を行った。
1. 体重変化曲線:毎日投与する前にマウスの体重を測定し、各群のマウスの体重の変化を観察した。
2. 腎臓係数:マウスを殺処分した直後に腎臓組織を採取して重量を測り、腎臓係数[腎臓係数Z(臓器質量/体重)×100%]を算出した。
3. 腎臓組織のHE観察:10%中性ホルマリンにて固定し、アルコールで段階的に脱水させ、キシレンで透徹にし、パラフィンで包埋させ、パラフィン切片にし(切片の厚みは5μmである)、通常HE染色の後、中性ゴムに封入し、各組織病理学的変化を顕微鏡下で観察した。
4. 動物の胸腺係数および脾臓係数:マウスを殺処分した直後に胸腺と脾臓を採取して重量を測り、胸腺係数と脾臓係数[臓器係数Z(臓器質量/体重)×100%]を算出した。
5. 精巣および精巣上体の重量:各群のマウスを殺処分した後、精巣と精巣上体を採取し、重量を測ってから統計分析をした。
6. 精巣組織の形態の観察:精巣組織を通常固定し、脱水させ、包埋、切片化した後、HE染色して精巣組織の形態変化を観察した。
本実験において、6〜8週齢の健康なオスC57マウスを10匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用
いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は10日間で、投与が完了した後に動物に対して投与停止後11日間観察し、全実験期間は21日である。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。実験の第0、5、12、21日目にそれぞれマウスの体重を測定して記録した。
その結果、溶媒PBS投与対照群とプラスミノゲン投与群は、0、5、12、21日目の体重データ統計に明らかな差異がない(図1)。X線照射および投与処理はマウスの体重に対して影響がないことが示されている。
本実験において、6〜8週齢の健康なオスC57マウスを10匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は10日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後11日間観察し、全実験期間は21日である。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。21日目にマウスを殺処分して解剖し、腎臓を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
その結果、溶媒PBS投与対照群(図2A)において、糸球体萎縮(*)、管状たんぱく質キャスト(矢じり)が観察されたが、プラスミノーゲン投与群(図2B)において、糸球体の毛細管内腔には閉塞がなく、バルーン管腔がはっきり見えた。プラスミノーゲン投与群の腎臓の損傷は、溶媒PBS投与対照群より明らかに軽く、プラスミノゲンがX線照射による腎臓損傷の修復を促進できることは示されている。
本実験において、6〜8週齢の健康なオスC57マウスを10匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は10日間で、投与が完了した後に動物に対して投与停止後11日
間観察し、全実験期間は21日である。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。21日目にマウスを殺処分して解剖し、腎臓を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水した後にさらに1回水洗した。Tris−EDTAで30分間修復し、室温にて20分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%の正常ヒツジ血清液 (Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングする;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗マウスF4/80抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水してから透徹にして封入させ、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
F4/80はマクロファージマーカーであって、炎症反応の程度及び段階を示すことができる。その結果は以下のように示している。溶媒PBS投与対照群(図3A)のマウスのマクロファージマーカーF4/80の発現量は、プラスミノゲン投与群(図3B)より高く、これはプラスミノゲンを投与した後の動物の腎臓組織の炎症が顕著に減軽されていることを示している。定量分析の結果は、顕微鏡観察と一致し、しかも統計学的差異が顕著であり(図3C)、これは、プラスミノゲンがX線照射による腎臓の炎症の修復を促進できることを示している。
本実験において、6〜8週齢の健康なオスC57マウスを10匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は10日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後11日間観察し、全実験期間は21日である。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。21日目にマウスを殺処分して解剖し、十二指腸を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の十二指腸組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
その結果、溶媒PBS投与対照群(図4A)において、局所腸粘膜上皮が剥離し、変性し壊死し、剥離したところの正常粘膜層の構造が消えたに対して、プラスミノーゲン投与群(図4B)において、赤く染色された屈折縞が見られ、粘膜上皮に杯細胞が見られ、絨毛の中心は固有層であり、その構造ははっきりしている。プラスミノーゲン投与群の十二指腸の損傷は、溶媒PBS投与対照群より明らかに軽く、プラスミノゲンがX線照射による十二指腸の損傷の修復を促進できることは示されている。
本実験において、6〜8週齢の健康なオスC57マウスを10匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は10日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後11日間観察し、全実験期間は21日である。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。21日目にマウスを殺処分して解剖し、十二指腸を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の十二指腸組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせて浸水した後にさらに1回水洗した。Tris−EDTAで30分間修復し、室温にて20分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%の正常ヒツジ血清液 (Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングする;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄した。ウサギ抗マウスF4/80抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水して透徹にしてから封入させ、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
その結果、溶媒PBS投与対照群(図5A)のマウスのF4/80の発現量は、プラスミノゲン投与群(図5B)より明らかに高く、これはプラスミノゲンを投与した後の十二指腸の炎症が顕著に減軽されていることを示し、プラスミノゲンがX線照射による十二指腸の炎症の修復を促進できることを示している。
本実験は6〜8週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は10日間で投与が完了した後に動物に対して投与停止後11日間観察し、全実験期間は21日である。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。21日目にマウスを殺処分して解剖して肝臓を取り、それから肝臓を10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定させた。固定後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いし
た。Tris−EDTAで30分間修復し、室温にて20分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲む。10%の健常ヒツジ血清液 (Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスF4/80抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗った。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水してから透徹にして封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
本実験において、6〜8週齢の健康なオスC57マウスを24匹用い、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群12匹ずつである。群分けが完了した後に、放射損傷モデルを構築し、線形加速器6MV X線を用いて5.0Gyにてマウス全身に対して一回の均一な照射を行い、吸収線量率は2.0Gy/minであり、吸収線量は5.0Gyである(2.5分間照射)。モデルを構築してから、3時間以内にプラスミノゲンを投与した。プラスミノゲン投与群に対して1mg/0.1mL/匹/日で尾静脈から注射することで投与し、溶媒PBS投与対照群には同じ体積のPBSを投与した。実験が開始した当日を0日目として体重測定して群分けを行い、1日目から放射処理を行いさらにプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は14日間である。照射後1、4、7、14日目にそれぞれ三匹の動物を殺処分し、マウスの肝臓を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
その結果は以下のように示している。溶媒PBS投与対照群(図7a−d)の1日目の肝臓について、肝細胞索は中央静脈を中心に放射状に周りに広がり、テクスチャが規則的であり、肝類洞壁が明晰であり、一部の肝細胞は変性し壊死し、細胞核が溶解し、サイトゾルが淡く染色された(↓);4日目に肝類洞壁に軽度な炎症性細胞浸潤が見られ(▼)、肝類洞壁が狭窄した;7日目に肝細胞の壊死はさらに悪化し、且つ肝細胞は軽度な水様変性が起こり(矢じり)、サイトゾルが溶解し、肝細胞索に乱れが生じた;14日目に肝臓はすでに大きく改善し、肝細胞索は規則的であり、肝類洞壁は明晰であったが、中央静脈付近の肝類洞壁に少量の炎症性細胞浸潤があった。
目と比べてより規則的である。
総じていえば、PBS対照群では、1日目から7日目までに肝臓には進行性の損傷が示され、14日目までに改善傾向が示される。これに対して、プラスミノーゲン投与群では、1日目から4日目までに肝臓には損傷の傾向があるが、7日目から肝臓は大幅に改善し始めた。これは、プラスミノゲンがX線照射による肝臓損傷の修復を促進できることを示している。
本実験において、8〜9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間であり、第0日目と第7日目に体重を測定した。その結果、溶媒PBS投与対照群のマウスの体重は顕著に減り、しかも統計学的差異があるに対して、プラスミノーゲン投与群のマウスの体重は減ったが明らかではない(図8)。これは、プラスミノーゲンが動物の体重に対する化学療法薬物シスプラチンの影響を顕著に減軽できることを示している。
本実験において、8〜9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日1mg/匹/日でプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分して腎臓を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
HEの結果は以下のように示している。溶媒PBS投与対照群(図9A)において、腎尿細管上皮細胞壊死が示され(矢じり)、炎症性細胞浸潤も伴われる(↓)に対して、プラスミノーゲン投与群(図9B)において、明らかな腎尿細管壊死はなく、少量の炎症性細胞浸潤だけが伴われる。これは、プラスミノーゲンが化学療法薬物シスプラチンによる腎臓損傷を減軽できることを示している。
本実験において、8〜9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つ
の群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って10%中性フルマリン固定液において24〜48時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で30分間修復し、室温にて10分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%の健常ヒツジ血清液 (Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスフィブリン抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果は以下のように示している。触媒PBS投与対照群(図10A)におけるフィブリンの陽性着色は明らかにプラスミノゲン投与群(図10B)より深い。これはプラスミノゲンが化学療法薬物シスプラチンによるフィブリンの沈着を顕著に減少させたことを示し、化学療法薬物シスプラチンによる腎臓損傷の修復に寄与できることを示している。
本実験において、8〜9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間である。8日目にマウスを殺処分し、腎臓を取って10%中性フルマリン固定液において24〜48時間固定を行った。固定後の腎臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で30分間修復し、室温にて10分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%の健常ヒツジ血清液 (Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした;時間になった後に、
ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスBcl−2抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
本実験において、8〜9週齢のC57マウスを10匹取り、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間であった。8日目にマウスを殺処分して肝臓を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
本実験において、8〜9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日でプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目
からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間であった。8日目にマウスを殺処分し、肝臓を取って10%中性フルマリン固定液において24〜48時間固定を行った。固定後の肝臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してから一回水洗いした。クエン酸で30分間修復し、室温にて10分間冷却してから水でやさしく洗い流した。3%過酸化水素水で15分間インキュベーションし、PAPマーカーで組織を丸で囲んだ。10%の健常ヒツジ血清液 (Vector laboratories,Inc.,USA)で1時間ブロッキングした;時間になった後に、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスフィブリン抗体(Abcam)4℃で終夜インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。ヤギ抗ウサギIgG(HRP)抗体(Abcam)二次抗体を室温で1時間インキュベーションし、TBSで2回洗い、毎回5分間であった。DABキット(Vector laboratories,Inc.,USA)で呈色させ、3回水洗いした後にヘマトキシリンで30秒複染色して、流水で5分間流した。段階的に脱水してから透徹にし封入させ、切片を顕微鏡下で200倍にて観察した。
その結果は以下のように示している。触媒PBS投与対照群(図13A)の肝臓組織におけるフィブリンの陽性着色は明らかにプラスミノゲン投与群(図13B)より深い。これはプラスミノゲンがフィブリンの沈着を顕著に減少させることができ、化学療法薬物シスプラチンによる肝臓損傷の修復に寄与できることを示している。
本実験において、8〜9週齢の健康なオスC57マウスを10匹取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒PBS投与対照群及びプラスミノゲン投与群で、各群5匹ずつである。群分けが完了した後に、化学療法損傷モデルを構築し、10mg/Kg体重で一回経腹腔でシスプラチンを注射した。モデル構築が完了した後にプラスミノゲン投与群を1mg/0.1mL/匹/日に応じてプラスミノゲンを投与し、溶媒PBS投与対照群は同じ体積のPBSを投与した。実験開始当日を0日目として体重を測ってから群分けし、一日目からシスプラチンを腹腔注射してモデル構築を行い、モデル構築後3時間以内にプラスミノゲンまたは溶媒PBSを投与し、投与期間は7日間であった。8日目にマウスを殺処分して精巣と精巣上体を取り、10%中性ホルマリン固定液中において24〜48時間固定した。固定した後の精巣と精巣上体組織をアルコールで段階的に脱水させてさらにキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋させた。組織切片の厚みは5μmであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してからヘマトキシリン及びエオジンで染色させ(HE染色)、1%塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入し、顕微鏡下で200倍にて切片を観察した。
プラスミノゲンが化学療法薬物シスプラチンによる生殖器官への毒性を低下できることを示している。
(1) 被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患を治療及び/または解消するための方法。
(2) 被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷及び関連疾患を治療及び/または解消するための方法。
(3) 前記損傷は、骨髄造血系、皮膚、粘膜、免疫系および生殖系への損傷を含む、(1)または(2)に記載の方法。
(4) 前記損傷は、肝臓、脾臓、腎臓、肺、胃腸管、胸腺、骨髄、精巣、精巣上体への損傷を含む、(1)〜(3)のいずれか一項に記載の方法。
(5) 前記損傷は、放射線療法、化学療法または化学放射線療法による一般的な健康状況の低下、全身の副作用および局所的な副作用であり、急性副作用、長期的な副作用、および累積副作用を含む、(1)〜(4)のいずれか一項に記載の方法。
(6) 前記損傷の関連疾患は、粘膜潰瘍、免疫機能の低下、骨髄抑制、消化機能障害、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、卵巣、精巣毒性機能障害、神経系毒性機能障害を含む、(1)〜(5)のいずれか一項に記載の方法。
(7) 前記プラスミノゲンは配列2、6、8、10または12と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノゲン活性を有するものである、(1)〜(6)のいずれか一項に記載の方法。
(8) 前記プラスミノゲンはプラスミノゲン活性フラグメントを含み、且つ依然プラスミノゲン活性を有するタンパク質である、(1)〜(7)のいずれか一項に記載の方法。(9) 前記プラスミノーゲンは、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤および解毒剤を含む、一つまたは複数の他の薬物または療法と組み合わせて投与されることができる、(1)〜(8)のいずれか一項に記載の方法。
(10) 有効使用量のプラスミノーゲンを含有する容器、および被験者の放射損傷と化学的損傷および関連疾患の治療および/または解消に前記製品を投与することを指導するプロトコルを含む、被験者の放射損傷と化学的損傷および関連疾患を治療および/または解消するための製品。
(11) 有効使用量のプラスミノーゲンを含有する容器、および被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷および関連疾患の治療および/または解消に前記製品を投与することを指導するプロトコルを含む、被験者の放射線療法、化学療法または化学放射線療法による生体器官と組織損傷および関連疾患を治療および/または解消するための製品。
(12) さらに一つまたは複数のその他の薬物を含有する容器を含む、(10)または(11)に記載の製品。
(13) 前記その他の薬物は、抗癌剤、抗感染剤、免疫賦活剤、鎮痛剤、栄養剤、解毒剤である、(12)に記載の製品。
(14) 前記プロトコルはさらに、前記プラスミノゲンが前記その他の薬物を投与する前、投与と同時、及び/または後に投与できることを説明している、(13)または(14)に記載の製品。
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- 被験者に有効量のプラスミノゲンを投与することを含む、被験者の放射損傷と化学的損傷及び関連疾患を治療及び/または解消するための方法。
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