ES2881535T3 - Detección multiplexada con indicadores codificados con isótopos - Google Patents

Abstract

Un método para la detección simultánea de múltiples analitos en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con un conjunto de agentes de unión conjugados con una pluralidad de indicadores codificados por isótopos (iCORE), en donde los agentes de unión son capaces de unirse específicamente a un conjunto de analitos, en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a los analitos, en donde el conjunto de agentes de unión comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 agentes de unión conjugados con iCORE diferentes, en donde los iCORE son etiquetas de masa de péptidos y en donde (i) la muestra se pone en contacto in vivo o (ii) los agentes de unión se conjugan con los iCORE mediante un enlazador fotoescindible; (b) identificar y/o cuantificar, opcionalmente mediante ensayo EM/EM, los iCORE de los agentes de unión unidos al analito; y (c) identificar y/o cuantificar los analitos presentes en la muestra basándose en los iCORE identificados en (b).

Description

DESCRIPCIÓN

Detección multiplexada con indicadores codificados con isótopos

Solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de EE.UU. con N.° de Serie 61/452.908, titulada "Multiplexed detection of analytes with isotope-coded reporters" presentada el 15 de marzo de 2011.

FINANCIACIÓN GUBERNAMENTAL

La presente invención se realizó con financiación del Gobierno concedida por los National Institutes of Health mediante la Subvención R01-CA124427. El gobierno de EE.UU. posee determinados derechos sobre esta invención. Antecedentes

La espectrometría de masas (EM) es una técnica analítica que es útil para detectar analitos tanto de forma cuantitativa como cualitativa. Durante el proceso de EM, las moléculas detectables, llamadas etiquetas de masa, se ionizan para generar moléculas cargadas o fragmentos de moléculas y, posteriormente, se mide la relación de masa a carga de estas moléculas.

La EM es una tecnología muy versátil que puede usarse en diversos escenarios de detección de analitos, por ejemplo, en diagnóstico biomédico y análisis ambiental. Por ejemplo, EM puede usarse para determinar la presencia o ausencia de un analito, por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, biomoléculas o compuestos de moléculas pequeñas, en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica) y/o para cuantificar un analito en una muestra.

Aunque los ensayos de EM convencionales son capaces de detectar múltiples analitos, por ejemplo, péptidos, simultáneamente, el análisis cuantitativo de múltiples muestras, por ejemplo, de diferentes individuos o puntos de tiempo, actualmente está limitado a formatos de 4-plex, 6-plex y 8-plex. Además, diferentes analitos a menudo tienen propiedades fisicoquímicas muy variables y, por lo tanto, propiedades de EM, lo que da como resultado una variabilidad igualmente amplia en la sensibilidad, especificidad y precisión de la detección basada en EM de diferentes analitos. Esta variabilidad en las propiedades fisicoquímicas de diferentes analitos limita la cuantificación simultánea precisa de tales analitos diferentes en ensayos de EM multiplex. La detección de múltiples analitos de origen natural o endógenos, las estructuras químicas, de los cuales a menudo varían ampliamente, a menudo también es necesario monitorizar una amplia ventana de masa en un solo ensayo de EM, que puede requerir mucho tiempo. Además, la detección de analitos diana en muestras complejas, tales como muestras biológicas (por ejemplo, biopsias de sangre, suero o tejido), a menudo es difícil y desafiante sin un procesamiento previo extenso antes de los ensayos de EM.

Sumario de la divulgación

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a un método para la detección simultánea de múltiples analitos en una muestra y un conjunto de reactivos de unión conjugados a una pluralidad de indicadores codificados por isótopos (iCORE). Las realizaciones de la invención se describen en los siguientes párrafos numerados:

(1) . Un método para la detección simultánea de múltiples analitos en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un conjunto de agentes de unión conjugados con una pluralidad de indicadores codificados por isótopos (iCORE), en donde los agentes de unión son capaces de unirse específicamente a un conjunto de analitos, en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a los analitos, en donde el conjunto de agentes de unión comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 agentes de unión conjugados con iCORE diferentes,

en donde los iCORE son etiquetas de masa de péptidos y

en donde (i) la muestra se pone en contacto in vivo o (ii) los agentes de unión se conjugan con los iCORE mediante un enlazador fotoescindible;

(b) identificar y/o cuantificar, opcionalmente mediante ensayo EM/EM, los iCORE de los agentes de unión unidos al analito; y

(c) identificar y/o cuantificar los analitos presentes en la muestra basándose en los iCORE identificados en (b).2

(2) . El método del párrafo 1, en donde (b) comprende aislar los agentes de unión unidos al analito, opcionalmente, poniendo en contacto la muestra con un agente de afinidad que sea capaz de unirse a los analitos, ya sea solo o cuando esté unido a un agente de unión, y que pueda aislarse de la muestra.

(3) . El método de los párrafos 1-2, en donde los iCORE comprenden 5-20 restos de aminoácidos o

en donde los iCORE comprenden la misma secuencia de aminoácidos entre sí, opcionalmente la secuencia de aminoácidos EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1) o en donde los iCORE están marcados con isótopos.

(4) . El método de cualquiera de los párrafos 1-3, en donde cada agente de unión comprende individualmente un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero o adnectina, o en donde los agentes de unión se conjugan con las etiquetas de masa mediante un enlazador escindible.

(5) . El método del párrafo 4, en donde el enlazador escindible es un enlazador fotoescindible.

(6) . El método del párrafo 5, en donde el método comprende además escindir el iCORE del agente de unión usando luz UV.

(7) . El método de cualquiera de los párrafos 2-6, en donde el agente de afinidad comprende una pluralidad de anticuerpos de unión a analito, fragmentos de anticuerpo, aptámeros o adnectinas conjugadas a un sustrato sólido, opcionalmente una superficie de perlas.

8. El método de cualquiera de los párrafos 1-2, en donde los iCORE comprenden cualquiera de SEQ ID NO: 8 a 17, como sigue:

e+3G+6VndneeGFfsAr-X-K(FAM)GGPQGIWGQC (SEQ ID NO: 8);

e+2G+6Vndnee+1GFfsAr-X-K(FAM)GGLVPRGSGC (SEQ ID NO: 9);

e+1G+6Vndnee+2GFfsAr-X-K(FAM)GGPVGLIGC (SEQ ID NO: 10);

eG+6Vndnee+2GFfs+1Ar-X-K(FAM)GGPWGIWGQGC (SEQ ID NO: 11);

eG+5VndneeGFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPVPLSLVMC (SEQ ID NO: 12);

e+3G+1Vndnee+1GFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPLGLRSWC (SEQ ID NO: 13);

e+3GVndneeG+6FfsAr-X-K(FAM)GGPLGVRGKC (SEQ ID NO: 14);

e+2GVndneeG+6Ffs+1Ar-X-K(FAM)GGf(PiP)RSGGGC (SEQ ID NO: 15);

e+1GVndnee+2G+6FfsAr-X-K(FAM)GGfPRSGGGC (SEQ ID NO: 16);

eGVndnee+3G+6FfsAr-X-K(FAM)GGf(PiP)KSGGGC (SEQ ID NO: 17),

en donde,

X representa ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico,

FAM representa carboxifluoresceína,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

(9) . El método del párrafo 1, en donde los iCORE se conjugan con un dominio vehículo mediante enlazadores escindibles con enzimas.

(10) . El método del párrafo 9, en donde el enlazador escindible con enzimas es un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos: PQGIWGQ (SEQ ID NO: 18), LVPRGSG (SEQ ID NO: 19), PVg LiG (SEQ ID NO: 20), PWGIWGQG (SEQ ID NO: 21), PVPLSLVM (SEQ ID NO: 22), PLGLRSW (SEQ ID NO: 23), PLGVRGK (SEQ ID NO: 24), GGPLANvafARGC (SEQ ID NO: 35), f(PiP)RSGGG (SEQ ID NO: 25), fPRSGGG (SEQ ID NO: 26) o f(PiP)KSGGG (SEQ ID NO: 27),

en donde,

Nva representa norvalina,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

(11) . Un conjunto de reactivos de unión conjugados con una pluralidad de indicadores codificados por isótopos (iCORE), en donde los agentes de unión son capaces de unirse específicamente a un conjunto de analitos, en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a los analitos, en donde el conjunto de agentes de unión comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 agentes de unión conjugados con iCORE diferentes, en donde los iCORE son etiquetas de masa de péptidos y los agentes de unión se conjugan con los iCORE mediante un enlazador fotoescindible.

(12) . El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con el párrafo 11, en donde los iCORE comprenden 5­ 20 restos de aminoácidos o

en donde los iCORE comprenden la misma secuencia de aminoácidos entre sí, opcionalmente la secuencia de aminoácidos EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1) o en donde los iCORE están marcados con isótopos.

(13) . El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con el párrafo 11 o el párrafo 12, en donde cada agente de unión comprende individualmente un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero o adnectina, o en donde los agentes de unión se conjugan con las etiquetas de masa mediante un enlazador escindible, opcionalmente en donde el enlazador escindible es un enlazador fotoescindible.

(14) . El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con cualquiera de los párrafos 11-13, en donde los iCORE comprenden cualquiera de SEQ ID NO: 8 a 17, como sigue:

e+3G+6VndneeGFfsAr-X-K(FAM)GGPQGIWGQC (SEQ ID NO: 8);

e+2G+6Vndnee+1GFfsAr-X-K(FAM)GGLVPRGSGC (SEQ ID NO: 9);

e+1G+6Vndnee+2GFfsAr-X-K(FAM)GGPVGLIGC (SEQ ID NO: 10);

eG+6Vndnee+2GFfs+1Ar-X-K(FAM)GGPWGIWGQGC (SEQ ID NO: 11);

eG+5VndneeGFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPVPLSLVMC (SEQ ID NO: 12);

e+3G+1Vndnee+1GFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPLGLRSWC (SEQ ID NO: 13);

e+3GVndneeG+6FfsAr-X-K(FAM)GGPLGVRGKC (SEQ ID NO: 14);

e+2GVndneeG+6Ffs+1Ar-X-K(FAM)GGf(PiP)RSGGGC (SEQ ID NO: 15);

e+1GVndnee+2G+6FfsAr-X-K(FAM)GGfPRSGGGC (SEQ ID NO: 16);

eGVndnee+3G+6FfsAr-X-K(FAM)GGf(PiP)KSGGGC (SEQ ID NO: 17),

en donde,

X representa ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico,

FAM representa carboxifluoresceína,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

(15) . El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con uno cualquiera de los párrafos 11-14, en donde los iCORE se conjugan con un dominio vehículo mediante enlazadores escindibles con enzimas, opcionalmente en donde el enlazador escindible con enzimas es un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos: PQGIWGQ (SEQ ID NO: 18), LVPRGSG (SEQ ID NO: 19), PVGLIG (SEQ ID NO: 20), PWGIWGQG (SEQ ID NO: 21), PVPLSLVM (SEQ ID NO: 22), PLGLRSW (SEQ ID NO: 23), PLGVRGK (SEQ ID NO: 24), GGPLANvafARGC (SEQ ID NO: 35), f(PiP)RSGGG (SEQ ID NO: 25), fPRSGGG (SEQ ID NO: 26) o f(PiP)KSGGG (SEQ ID NO: 27)

en donde,

Nva representa norvalina,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

Algunos aspectos de esta divulgación abordan las deficiencias de la tecnología de EM convencional al proporcionar novedosos reactivos y métodos para la detección simultánea de un número prácticamente ilimitado de analitos en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica compleja (por ejemplo, una muestra de sangre o tejido obtenida de un sujeto) usando metodología EM.

En algunas opciones, esta divulgación proporciona moléculas indicadoras codificadas por isótopos, denominadas en el presente documento iCORE, que son útiles como etiquetas de masa en la detección de analitos basada en EM multiplexada. En algunas opciones, se proporcionan conjuntos o bibliotecas de iCORE que son útiles en la detección multiplexada de un número prácticamente ilimitado de analitos en una muestra. En algunas opciones, los iCORE en tal conjunto o biblioteca son isobáricos y los diferentes iCORE dentro de tal conjunto o biblioteca se distinguen por su firma iónica de fragmentación única. En algunas opciones, se confieren diferentes firmas de fragmentación a diferentes iCORE mediante marcaje diferencial de isótopos. Por ejemplo, en algunas opciones, esta divulgación proporciona un conjunto o biblioteca de iCORE, por ejemplo, un conjunto de etiquetas de masa de péptidos isobáricas, marcadas con isótopos, que son útiles en los métodos de detección de analitos basados en EM multiplexados proporcionados en el presente documento. También se proporcionan en el presente documento métodos para el uso de iCORE y conjuntos o bibliotecas de iCORE.

Algunos aspectos de esta divulgación proporcionan reactivos y métodos que son útiles para la traducción de un parámetro, por ejemplo, la presencia de un analito diana en una muestra, la presencia de una actividad diana en una muestra o la identidad de una muestra, célula o tejido, en un iCORE para la detección de EM, permitiendo la codificación bioquímica del parámetro. Por ejemplo, en algunas opciones, esta divulgación proporciona reactivos y métodos para la traducción simultánea, o codificación bioquímica, de una pluralidad de analitos, por ejemplo, analitos de estructura química variable, en una muestra compleja (por ejemplo, una muestra de sangre o tejido obtenida de un sujeto) en una pluralidad de iCORE, por ejemplo, una pluralidad de etiquetas de masa de péptidos isobáricas, marcadas con isótopos, de tal manera que cada analito está representado por un iCORE diferente que tiene una firma de fragmentación característica. En consecuencia, cada analito puede identificarse detectando la firma de fragmentación asociada al iCORE específico que codifica el analito, por ejemplo, en un ensayo EM/EM. Para dar otro ejemplo, en algunas opciones, esta divulgación proporciona reactivos y métodos para la traducción simultánea, o codificación bioquímica, de una pluralidad de actividades biológicas, por ejemplo, actividades enzimáticas (por ejemplo, actividades proteasa, quinasa o fosfatasa), en una muestra compleja (por ejemplo, una muestra de sangre o tejido obtenida de un sujeto) en una pluralidad de iCORE, por ejemplo, una pluralidad de etiquetas de masa de péptidos isobáricas, marcadas con isótopos, de tal manera que cada actividad está representada por un iCORE diferente que tiene una firma de fragmentación característica. En consecuencia, cada actividad puede identificarse detectando la firma de fragmentación asociada al iCORE específico que codifica la actividad, por ejemplo, en un ensayo EM/EM.

Cada una de las opciones de la divulgación puede abarcar diversas descripciones hechas en el presente documento. Se anticipa, por lo tanto, que cada una de las menciones de la divulgación que impliquen cualquier elemento o combinaciones de elementos pueden, opcionalmente, incluirse en cada aspecto de la divulgación. De forma similar, cada aspecto o realización de la divulgación puede excluirse de cualquier otro aspecto u opción, o cualquier combinación de aspectos u opciones de la divulgación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Esquema de un método ilustrativo para la detección de analitos traduccionales multiplexados. El método mostrado incluye una etapa de enriquecimiento opcional.

Figura 2. Utilización de un pico canónico de espectros glu-fib EM/EM como indicador. Se muestra el espectro de fragmentación de glu-fib y una estrategia de codificación ilustrativa. EGVNDNEEGFFSAR corresponde a SEQ ID NO: 1.

Figura 3. Datos de EM y EM/EM obtenidos de un experimento de biblioteca iCORE 10-plex. EGVNDNEEGFFSAR corresponde a SEQ ID NO: 1.

Figura 4. Múltiplex, detección cuantitativa de iCORE en biblioteca.

Figura 5. Evaluación del intervalo dinámico de ensayos iCORE multiplexados.

Figura 6. Fotoescisión y eficiencia de fotoescisión. EGVNDNEEGFFSAR corresponde a SEQ ID NO: 1. KGGPVGLIGC corresponde a SEQ ID NO: 2.

Figura 7. Química ilustrativa para la generación de etiquetas iCORE embebidas en hidrogel de PEG.

Figura 8. Esquema del enfoque iCORE para el diagnóstico urinario.

Figura 9. Chaperonas de nanogusanos de óxido de hierro de larga circulación.

Figura 10. Selección de sustratos sensibles a proteasas para el tráfico urinario de NW chaperonado.

Figura 11. Biomarcadores urinarios de fibrosis hepática y resolución en ratones tratados con DDC.

Figura 12. Inmunofluorescencia de secciones de hígado.

Figura 13. Bibliotecas iCORE fotoactivadas (photo-caged) para la generación de perfiles multiplexados de actividades proteasa mediante CL EM/^eM. EGVNDNEEGFFSAR corresponde a SEQ ID NO: 1. KGGPWGIWGQGGC corresponde a SEQ ID NO: 3.

Figura 14. Codificación masiva de indicador codificado isobárico (iCORE). EGVNDNEEGFFSAR corresponde a SEQ ID NO: 1.

Figura 15. Espectro EM/EM de la biblioteca iCORE 10-plex. Grupos de picos iCORE centrados en iones de tipo y. La región y6 delineada por un recuadro rojo se presenta como Figura 13e.

Figura 16. La ventana de recolección de unidades para la fragmentación de péptidos minimiza la superposición de picos que surge de los isótopos de origen natural. (a) Un espectro de E^m típico de un péptido Glu-fib codificado con isótopos. El péptido precursor original se recogió para su fragmentación a través de una ventana de masa unitaria (gris), excluyendo los picos de isótopos de origen natural. (b) Espectro de EM/EM resultante. Se minimizó el pico de isótopos, que comprende ~ 5 % de la intensidad de pico original. EGVNDNEEGFFSAR corresponde a SEQ ID NO: 1. ^g F^fSAR corresponde a SEQ ID NO: 4.

Figura 17. El análisis iCORE CL EM/EM es cuantitativo.

Figura 18. Firmas de masas iCORE específicas de proteasa. (a) perfiles iCORE EM/EM de proteasas recombinantes MMP2, MMP12 y trombina. (b) Representación gráfica de los coeficientes de correlación de Pearson entre proteasas.

Figura 19. Perfiles iCORE de animales control. Gráficos de caja y bigotes de las intensidades de los picos de iCORE individuales (ANOVA de mediciones repetidas, n = 5)

Figura 20. Curvas ROC de biomarcadores fibrosantes.

Figura 21. Curvas ROC de biomarcadores resolutivos.

Figura 22. Secreción de CEA in vitro por células de cáncer colorrectal humano LS 174T. Cuantificación de CEA de los medios en los días 1 y 2 mediante ELISA.

Figura 23. Los biomarcadores sintéticos superan al CEA sérico para la detección temprana del cáncer.

Figura 24. Acumulación de NW en tejido tumoral. (a) Se inyectaron NW marcados con VivoTag-680 o soluciones salinas en animales de xenoinjerto LS 174T. Después de la escisión, los tumores se escanearon en busca de acumulación de NW. (b) Análisis de inmunofluorescencia de secciones tumorales para vasos sanguíneos (rojo) y NW (verde). Barra de escala = 50 pm.

Figura 25. Curvas ROC de biomarcadores tumorales.

Definiciones

El término actividad, como se usa en el presente documento, se refiere a una actividad biológica. El término incluye, en algunas opciones, actividad enzimática, por ejemplo, actividad hidrolasa, transferasa, liasa, isomerasa, ligasa u oxidorreductasa. En algunas opciones, la actividad es una actividad proteasa. En algunas opciones, la actividad es una actividad fosfatasa. En algunas opciones, la actividad es una actividad quinasa. La actividad enzimática puede codificarse en iCORE, por ejemplo, proporcionando un sustrato de la enzima diana comprendida en un iCORE, exponiendo el iCORE a una muestra que comprende la enzima y detectando el sustrato modificado con enzima, por ejemplo, por los métodos descritos en el presente documento. Normalmente, un iCORE para codificar una actividad enzimática comprende un sustrato diana de esa enzima (por ejemplo, un sitio de reconocimiento de proteasa o un sitio de fosforilación, etc.) y la modificación del sitio diana por la enzima (por ejemplo, escisión, fosforilación o desfosforilación) puede detectarse, por ejemplo, por los métodos descritos en el presente documento.

El término analito, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula cuya presencia o ausencia o la cantidad de la cual está sujeta a análisis. Normalmente, un analito es una molécula de interés, por ejemplo, una proteína o péptido, una molécula de ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido, un metabolito, una molécula orgánica pequeña, un fármaco o un derivado de un fármaco (por ejemplo, un metabolito de un fármaco), un marcador de superficie celular, o una molécula secretada, cuya detección o cuantificación sea de interés para un investigador o médico, por ejemplo, con fines de investigación o diagnóstico. Un analito diana es un analito, la presencia, ausencia o cantidad del cual en una muestra, por ejemplo, en una muestra biológica, experimental o ambiental se somete a análisis. Un analito puede ser un biomarcador, por ejemplo, un biomarcador, la presencia, ausencia o cantidad del cual en una muestra indica una condición particular de la muestra o del sujeto, experimento o ambiente del que se obtuvo la muestra. En algunas opciones, un analito es un biomarcador biomédico, por ejemplo, una proteína, péptido, polisacárido, molécula pequeña o metabolito en una muestra obtenida de un sujeto diagnosticado con o sospechoso de tener una enfermedad o afección, en donde la presencia, ausencia o cantidad del biomarcador en la muestra es indicativa de la presencia, ausencia o estado de la enfermedad o afección en el sujeto. Por ejemplo, en algunas opciones, un ensayo de diagnóstico proporcionado en el presente documento comprende la detección de un panel de biomarcadores de proteínas y metabolitos, la presencia, ausencia o cantidad del cual en una muestra de sangre o suero obtenida de un sujeto es indicativa de la presencia, ausencia o estado de un cáncer, o una pluralidad de cánceres en el sujeto. Los biomarcadores de proteínas y metabolitos investigados en un ensayo tal serían los analitos diana de ese ensayo.

El término anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a una inmunoglobulina, ya sea natural o producida entera o parcialmente de forma sintética. Los derivados de anticuerpos que mantienen la capacidad de unión específica, por ejemplo, fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, tales como fragmentos Fab, Fab' o F (ab')2, o anticuerpos modificados por ingeniería genética, tales como scFv, también se incluyen a los que se hace referencia con el término anticuerpo. El término también se refiere a cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo o en gran parte homólogo a un dominio de unión de inmunoglobulina. Estas proteínas pueden derivar de fuentes naturales o producirse parcial o enteramente de forma sintética. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo, pero no limitado a, cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.

La expresión fragmento de anticuerpo, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que tenga menos de longitud completa. Preferentemente, el fragmento de anticuerpo retiene al menos una porción significativa de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv, diacuerpo, dominio de variable única y fragmentos Fd. El fragmento de anticuerpo puede producirse por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente mediante la fragmentación de un anticuerpo intacto o puede producirse de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia de anticuerpo parcial. Alternativamente, el fragmento de anticuerpo puede producirse entera o parcialmente de forma sintética. El fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un fragmento de anticuerpo monocatenario. Alternativamente, el fragmento de anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que están unidas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. El fragmento también puede ser opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional normalmente comprenderá al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más normalmente comprenderá al menos aproximadamente 200 aminoácidos. Los Fv monocatenarios (scFv) son fragmentos de anticuerpos recombinantes que consisten únicamente en la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH) conectadas covalentemente entre sí mediante un enlazador polipeptídico. Tanto VL como VH pueden ser el dominio del terminal NH2. El enlazador polipeptídico puede ser de longitud y composición variables siempre que los dos dominios variables estén puenteados sin interferencia estérica grave. Normalmente, los enlazadores están compuestos principalmente por tramos de restos de glicina y serina con algunos restos de ácido glutámico o lisina intercalados para su solubilidad. Los diacuerpos son scFv diméricos. Los componentes de los diacuerpos tienen normalmente enlazadores peptídicos más cortos que la mayoría de los scFv y muestran una preferencia por asociarse como dímeros. Un fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio VH y un dominio VL unidos por interacciones no covalentes. El término dsFv se usa en el presente documento para referirse a un Fv con un enlace disulfuro intermolecular diseñado para estabilizar el par v H-VL. Un fragmento F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido a partir de inmunoglobulinas (normalmente IgG) por digestión con una enzima pepsina a pH 4,0-4,5. El fragmento puede producirse de forma recombinante. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido por reducción del puente o puentes disulfuro que unen las dos piezas de la cadena pesada en el fragmento F(ab')2. El fragmento Fab' puede producirse de forma recombinante. Un fragmento Fab es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido por digestión de inmunoglobulinas (normalmente IgG) con la enzima papaína. El segmento de cadena pesada del fragmento Fab es el trozo Fd.

La expresión agente de unión, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que se une a otra molécula con alta afinidad. En algunas opciones, la unión se realiza mediante interacción no covalente. En algunas opciones, la unión es específica, lo que significa que el agente de unión se une solo a un tipo particular de molécula, o una clase estrecha de moléculas muy similares con alta afinidad. Los ejemplos no limitantes de agentes de unión son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, aptámeros y adnectinas.

El termino fluido corporal, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier fluido corporal incluyendo, sin limitación, suero, plasma, líquido linfático, líquido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, líquido amniótico, sangre leve, completa, sudor, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, semen, esputo, lágrimas, sudoración, mucosidad, medio de cultivo de tejidos, extractos de tejidos y extractos celulares. También puede aplicarse a fracciones y diluciones de fluidos corporales. La fuente de un fluido corporal puede ser un cuerpo humano, un cuerpo animal, un animal experimental, una planta u otro organismo.

El término conjugado, como se usa en el presente documento, se refiere a un estado de asociación relativamente estable entre dos entidades, por ejemplo, entre un iCORE y un agente de unión. En algunas opciones, las entidades conjugadas están enlazadas por una interacción covalente o no covalente directa o indirecta. Preferentemente, la asociación se realiza mediante enlace covalente. En algunas opciones, dos péptidos se conjugan mediante fusión de proteínas, por ejemplo, un péptido iCORE como se proporciona en el presente documento, puede conjugarse con un agente de unión peptídico, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, fusionando el iCORE al agente de unión, por ejemplo, por expresión de una proteína de fusión iCORE-agente de unión recombinante. Las interacciones no covalentes que dan como resultado la conjugación incluyen, pero no se limitan a enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, interacciones hidrófobas, interacciones magnéticas e interacciones electrostáticas. Normalmente, dos entidades conjugadas están asociadas entre sí de una manera lo suficientemente estable como para soportar las condiciones que se encuentran normalmente durante un experimento iCORE, por ejemplo, un iCORE conjugado con un agente aglutinante se asocia al agente aglutinante de una manera suficiente para que la unión entre los dos resista las etapas de unión y lavado normalmente comprendidos en los métodos en los que se usan, por ejemplo, antes de que las dos entidades se separen intencionalmente (por ejemplo, escindiendo un enlazador que conecta el iCORE con el agente de unión).

El termino enriquecido, como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra o composición en la cual la proporción de un material de interés en una mezcla de materiales que comprende tanto el material de interés como al menos un material adicional aumenta en comparación con las proporciones originales de la muestra. Este aumento puede lograrse mediante métodos de separación física, interacción o reacción química, y otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia o proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, una muestra original que comprende una población de diferentes iCORE conjugados a diferentes agentes de unión puede enriquecerse para incluir predominantemente aquellos iCORE conjugados a agentes de unión que se unen a sus analitos diana específicos inmovilizando los iCORE unidos al analito en un soporte sólido y lavando todos o la mayoría de los iCORE sin unir. El aislamiento o la purificación están dentro del alcance del término, pero tales etapas no son necesarias para enriquecer un compuesto, por ejemplo, un iCORE deseado.

La expresión firma de fragmentación o firma de iones de fragmentación, como se usa en el presente documento, se refiere al patrón de iones en los que puede fragmentarse un iCORE, por ejemplo, durante un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo EM/EM. En algunas opciones, el marcado diferencial de isótopos de iCORE de la misma secuencia de bases, por ejemplo, de la misma secuencia de aminoácidos en el caso de iCORE peptídicos, se usa para producir un conjunto de diferentes iCORE isobáricos, cada uno de los cuales produce al menos un ion, por ejemplo, un ion y7, que puede distinguirse de otros iones del mismo tipo, por ejemplo, iones y7, producidos por los otros iCORE del conjunto, por ejemplo, en un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo EM/EM. Por ejemplo, los diez ejemplos de iCORE G1-G10 descritos en la Figura 3 exhiben cada uno una firma de fragmentación única, produciendo cada uno un pico de masa diferente que representa el fragmento y7 de los iCORE en un ensayo EM/EM. Una firma de fragmentación única es una firma de una molécula polimérica determinada que da como resultado un ion de fragmentación único, por ejemplo, un ion de fragmentación y7 único, que puede identificarse sin ambigüedades o que puede distinguirse de cualquier otro ion de fragmentación, por ejemplo, cualquier otro ion y7 producido por una biblioteca de iCORE. En algunas opciones, se confieren diferentes firmas de fragmentación a diferentes iCORE mediante marcaje diferencial de isótopos. Por ejemplo, en algunas opciones, se produce una biblioteca iCORE isobárica mediante la distribución de isótopos pesados a través de la molécula iCORE, por ejemplo, a través de los restos de aminoácidos de un péptido iCORE, de tal manera que cada iCORE diferente produzca un ion de fragmentación informador (por ejemplo, un ion y7) de una masa diferente, mientras que toda la secuencia, (por ejemplo, la secuencia de péptidos que comprende el indicador y el resto) de todos los iCORE es de la misma masa.

El término iCORE, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula indicadora codificada por isótopos que puede usarse como etiqueta de masa en un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo EM/E^m . Normalmente, un iCORE es un polímero marcado con isótopos, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido o polisacárido que comprende al menos 5 restos monoméricos, por ejemplo, aminoácidos, restos de nucleótidos o monosacáridos. En algunas opciones, un iCORE comprende más de 5 restos monoméricos. En algunas opciones preferidas, la estructura de un iCORE permite la generación de diferentes firmas de fragmentación, por ejemplo, por marcaje diferencial de isótopos de un resto monomérico, o una combinación de restos monoméricos. En algunas opciones, la estructura del polímero, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos, nucleótidos o monosacáridos de un iCORE permite la generación de al menos aproximadamente 10 moléculas de iCORE, por ejemplo, moléculas iCORE isobáricas, que tienen diferentes firmas de fragmentación que pueden distinguirse en un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo EM/EM. En algunas opciones, la estructura del polímero permite la generación de más de 10 iCORE diferentes con diferentes firmas de fragmentación.

El término isobárico, como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de moléculas que tienen el mismo peso molecular. Por ejemplo, en algunas opciones, un conjunto de iCORE peptídicos isobáricos puede ser un conjunto de péptidos que tienen el mismo peso, pero diferentes firmas de fragmentación.

El término parámetro, como se usa en el presente documento en el contexto de la codificación iCORE, se refiere a una característica, rasgo o factor medible en una muestra, por ejemplo, en una muestra biológica. En algunas opciones, el término incluye la presencia, ausencia o cantidad de un analito. En algunas opciones, el término incluye la presencia, ausencia o cantidad de actividad biológica, por ejemplo, una actividad enzimática o una actividad de unión.

El término pluralidad, como se usa en el presente documento, se refiere a dos o más de los elementos calificados de esta manera.

El término polinucleótido, que se usa en el presente documento indistintamente con los términos y expresiones oligonucleótido y molécula de ácido nucleico en el presente documento, se refiere a un polímero de nucleótidos. El polímero puede incluir nucleósidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina), análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, dihidrouridina, metilpseudouridina, 1-metil adenosina, 1-metil guanosina, N6-metil adenosina, y 2-tiocitidina), bases modificadas químicamente, bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas), bases intercaladas, azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, 2'-O-metilcifidina, arabinosa, y hexosa) o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 5'-N-fosforamidita).

El término polipéptido se usa en el presente documento indistintamente con los términos péptido, oligopéptido y proteína y se refiere a un polímero de restos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos. El término, como se usa en el presente documento, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Normalmente, un polipéptido tiene al menos tres aminoácidos de longitud. En algunas opciones, polipéptidos, por ejemplo, iCORE peptídicos, comprenden aminoácidos de origen natural, aunque pueden emplearse alternativamente aminoácidos de origen no natural (por ejemplo, compuestos que no se encuentran en la naturaleza pero que pueden incorporarse en una cadena polipeptídica y/o análogos de aminoácidos conocidos en la técnica. También, uno o más de los aminoácidos en un polipéptido de la invención pueden modificarse, por ejemplo, mediante la adición de una entidad química tal como un grupo carbohidrato, un grupo hidroxilo, un grupo fosfato, un grupo farnesilo, un grupo isofarnesilo, un grupo ácido graso, un enlazador de conjugación, funcionalización u otra modificación, etc. Un péptido puede estar marcado con isótopos. Un péptido puede comprender D-aminoácidos, L-aminoácidos o una mezcla de D-aminoácidos y L-aminoácidos. En algunas opciones, un D-aminoácido o una pluralidad de D-aminoácidos en un polipéptido confiere una mayor resistencia a proteasas al polipéptido respectivo en comparación con un polipéptido de la misma secuencia pero que consiste en L-aminoácidos. Un polipéptido también puede ser una sola molécula o puede ser un complejo multimolecular. Un polipéptido puede ser un fragmento de una proteína o péptido de origen natural. Un polipéptido puede ser de origen natural, recombinante, sintético o cualquier combinación de estos.

El término polisacárido, como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de azúcares. Normalmente, un polisacárido comprende al menos dos azúcares. El polímero puede incluir azúcares naturales (por ejemplo, glucosa, fructosa, galactosa, manosa, arabinosa, ribosa y xilosa) y/o azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluororibosa, 2'-desoxirribosa y hexosa).

El término muestra, como se usa en el presente documento, se refiere a una composición de materia representativa de un entorno biológico, clínico o experimental. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser una muestra obtenida de un sujeto, tal como una muestra de líquido corporal, una muestra de células o tejidos, o una muestra obtenida de un entorno experimental, tal como una composición que comprende un compuesto de molécula pequeña, un sobrenadante de cultivo celular, una composición que comprende un órgano modificado por ingeniería genética, etcétera. Una muestra compleja es una muestra que comprende una pluralidad de diferentes analitos y/o moléculas que no son analitos además de un analito. Los ejemplos no limitantes de muestras complejas son una muestra de suero, una muestra de sangre, una muestra de orina y una muestra de tejido. En algunas opciones, una muestra compleja es una muestra que comprende un número tan grande de moléculas (por ejemplo, analitos o moléculas que no son analitos) que la detección de un único analito diana, por ejemplo, un péptido o metabolito, no puede lograrse fácilmente mediante un ensayo EM/EM, por ejemplo, debido a la interferencia de otras moléculas con firmas de EM similares. En algunas opciones, una muestra compleja puede requerir un procesamiento previo extenso, por ejemplo, enriquecimiento del analito diana, para permitir la detección de un analito diana en un ensayo de EM convencional.

La expresión molécula pequeña, que se usa en el presente documento indistintamente con las expresiones compuesto de molécula pequeña y fármaco, se refiere a un compuesto sintetizado en el laboratorio o bien encontrado en la naturaleza, que se caracteriza normalmente porque contiene varios enlaces carbono-carbono y tiene un peso molecular de menos de 1500, aunque esta caracterización no pretende ser limitante para los fines de la presente divulgación. Los ejemplos de moléculas pequeñas que se encuentran en la naturaleza incluyen, pero no se limitan a, taxol, dinemicina y rapamicina. Los ejemplos de moléculas pequeñas que se sintetizan en el laboratorio incluyen, pero no se limitan a, compuestos descritos en Tan et al., ("Stereoselective Synthesis of over Two Million Compounds Having Structural Features Both Reminiscent of Natural Products and Compatible with Miniaturized Cell-Based Assays" J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8565) y la Patente de EE.UU. N.° 7.l09.377, titulada "Synthesis of Combinatorial Libraries of Compounds Reminiscent of Natural Products". En determinadas otras opciones preferidas, se utilizan moléculas pequeñas similares a productos naturales.

El término sujeto, como se usa en el presente documento, se refiere a un ser humano, un primate no humano, un mamífero no humano (por ejemplo, una vaca, un caballo, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato o un roedor), un vertebrado, un artrópodo, un cordado, un anélido, un molusco, un nematodo, un equinodermo. En algunas opciones, un sujeto es un animal de laboratorio, por ejemplo, un ratón, rata, gato, perro, cerdo, vaca, hámster, jerbo, rana, pez, gusano (por ejemplo, C. elegans) o mosca (por ejemplo, mosca de la fruta, D. melanogaster). En algunas opciones, un sujeto es un microorganismo, por ejemplo, una levadura, bacteria u hongo. En algunas opciones, por ejemplo, en algunas opciones que implican una aplicación clínica de un aspecto de esta divulgación, al sujeto se le diagnostica o se sospecha que tiene una enfermedad o afección.

Descripción detallada

Algunos aspectos de esta divulgación proporcionan métodos y reactivos para codificar una pluralidad de parámetros biológicos, por ejemplo, la presencia o ausencia de un analito, o de una actividad enzimática en una muestra, en indicadores codificados en masa, denominados iCORE. Esto permite, por ejemplo, la detección multiplexada de analitos o actividades enzimáticas en muestras biológicas complejas. Los indicadores exógenos pueden analizarse en un único ensayo, por ejemplo, un ensayo EM/EM, evitando de esta manera la necesidad de múltiples ensayos de diferentes tipos, ya que a menudo se requieren cuando se evalúan diferentes analitos o actividades enzimáticas en muestras biológicas usando indicadores endógenos.

La dependencia de informadores endógenos para indicar enfermedad en muestras biológicas es una limitación importante para los enfoques de diagnóstico. En el presente documento, se describe el desarrollo de iCORE, indicadores codificados en masa exógenos, como "biomarcadores sintéticos" de la enfermedad. En algunas opciones, los iCORE descritos en el presente documento se usan para diagnósticos in vivo. En algunas opciones, los iCORE están diseñados para realizar tres funciones in vivo (tras la administración a un sujeto): dirigirse a sitios de enfermedad, muestrear actividades proteasa desreguladas y emitir indicadores codificados en masa en la orina del hospedador para la detección multiplexada por espectrometría de masas. Para demostrar aplicaciones ilustrativas de esta tecnología, se aplicó a un modelo xenobiótico de fibrosis hepática como una alternativa no invasiva a la monitorización basada en biopsia y se identificaron biomarcadores sintéticos sensibles y específicos que informan sobre las etapas de fibrosis activa y resolución de la enfermedad hepática. También se identificaron diferentes paneles de iCORE que redujeron notablemente el umbral para la detección temprana del cáncer en comparación con los biomarcadores sanguíneos en un modelo de ratón de cáncer colorrectal. La capacidad de diseñar, cribar e identificar iCORE rápidamente como biomarcadores sintéticos para la monitorización precisa multiplexada de la enfermedad, aparte de los biomarcadores endógenos, es ampliamente susceptible de distintos procesos fisiopatológicos, con aplicaciones adicionales en biología de sistemas, desarrollo de fármacos y diagnóstico en el lugar de atención.

El descubrimiento de biomarcadores está motivado por el deseo de identificar indicadores fiables de enfermedad para la evaluación de riesgos, detección temprana, predicción de respuestas del paciente a las terapias y vigilancia de la enfermedad recurrente.12 Hasta la fecha, se ha desarrollado una amplia gama de especies biológicas distintas tales como metabolitos,3 péptidos,4 proteínas,25 ácidos nucleicos libres de células,6 exosomas7 y células tumorales circulantes,8 en biomarcadores con diversos grados de rendimiento. Sin embargo, la dependencia de componentes nativos para indicar enfermedades está limitada por desafíos técnicos y biológicos fundamentales porque los biomarcadores se encuentran con frecuencia en niveles bajos en la circulación,89 son difíciles de resolver en fluidos biológicos complejos10 y puede degradarse rápidamente tanto in vivo como ex vivo.411

Una alternativa a los biomarcadores endógenos es la administración sistémica de agentes informadores exógenos para interrogar estados biológicos como se describe en el presente documento. Estos enfoques ofrecen el potencial de adaptar agentes para explotar la fisiología del hospedador o interactuar con procesos moleculares específicos de la enfermedad como indicadores alternativos de la enfermedad. Los ejemplos incluyen el polisacárido inulina para evaluar las tasas de filtración del glomérulo, FDG-PET para revelar regiones de aumento del metabolismo de la glucosa y un conjunto de sondas moleculares y basadas en actividad para obtener imágenes de actividades biológicas in vivo.12-14 Debido a que estos agentes pueden diseñarse y probarse in vitro y en modelos preclínicos, pueden optimizarse iterativamente y se pueden administrar a concentraciones significativamente por encima del fondo biológico. Las limitaciones con estos enfoques incluyen la incapacidad de monitorizar una gran familia de sondas simultáneamente debido a las capacidades de multiplexación limitadas y la infraestructura sustancial para análisis in vivo que requieren que los pacientes estén en el lugar (por ejemplo, PET, MRI) que impiden la recolección remota de datos o muestras.

Algunos aspectos de esta divulgación proporcionan un marco para la modificación por ingeniería genética a nanoescala, agentes indicadores codificados en masa isobáricos que se acumulan pasivamente en tejidos enfermos de la circulación del hospedador a través de fenestraciones vasculares específicas de órganos o enfermedades (por ejemplo, endotelio sinusoide hepático o vasos tumorales angiogénicos, respectivamente).1516 En una opción ilustrativa, se proporcionan iCORE que están diseñados para interrogar la actividad de proteasa en microambientes tumorales. Al llegar al microambiente enfermo, los agentes iCORE interactúan con proteasas aberrantemente activas para dirigir la escisión y liberación de los sustratos peptídicos codificados en masa conjugados a la superficie en la orina del hospedador para su detección mediante espectrometría de masas (EM) como biomarcadores sintéticos de enfermedad. Debido a que las actividades de proteasa desreguladas están implicadas en una amplio abanico de enfermedades humanas incluyendo cáncer, fibrosis, aterosclerosis, inflamación, Alzheimer y muchos otros,17 la monitorización altamente multiplexada de las actividades aberrantes de las proteasas tiene el potencial de distinguir diversos estados de enfermedad a través del análisis combinatorio. Si bien los métodos y reactivos proporcionados en este documento son ampliamente aplicables a una amplia diversidad de enfermedades, se describe en el presente documento la aplicación ilustrativa de esta tecnología para abordar dos desafíos clínicos no resueltos: la necesidad de una alternativa no invasiva a la monitorización basada en biopsias para la fibrosis hepática18 y la incapacidad de los biomarcadores sanguíneos actuales utilizados clínicamente para detectar de manera confiable cánceres en fase temprana.19

Otros parámetros ilustrativos que pueden codificarse y medirse con la tecnología iCORE son los analitos. Las herramientas actuales para la detección de analitos incluyen electroforesis en gel, transferencia Western, ELISA, PCR, inmunofluorescencia, micromatrices y plataformas basadas en EM como MALDI y tecnologías de cromatografía líquida-EM, tales como CL ^e M/EM. CL EM es una técnica de química analítica que combina las capacidades de separación física de la cromatografía líquida (por ejemplo, CL, HPLC de alto rendimiento) con las capacidades de análisis de masas de la espectrometría de masas. CL-EM tiene una sensibilidad y selectividad muy altas y es, por lo tanto, ampliamente aplicable a diversos analitos, por ejemplo, a la detección específica y/o identificación de analitos en presencia de otras sustancias químicas (por ejemplo, en un complejo biológico, experimental o ambiental). EM/EM (o EM en tándem) implica dos o más etapas de EM, produciéndose alguna forma de fragmentación entre las fases. EM/EM es una técnica comúnmente usada para identificar información de secuencia, por ejemplo, información de secuencia de péptidos individuales. Los espectrómetros de masas modernos, en línea con un extenso fraccionamiento cromatográfico, puede detectar y evaluar cientos de analitos de una sola muestra. EM, sin embargo, no está exento de limitaciones. Los desafíos actuales asociados con el análisis espectrométrico de masas pueden simplificarse en dos factores contribuyentes principales.

En primer lugar, muchas muestras, por ejemplo, muchas muestras biológicas (por ejemplo, sangre, suero, biopsia de tejido (por ejemplo, tumor), lisado de células, orina, líquido cefalorraquídeo), muestras experimentales (por ejemplo, muestras de interés en exámenes combinatorios de drogas) y las muestras ambientales (por ejemplo, muestras de suelo o agua) que contienen o se sospecha que contienen un analito de interés son muy complejas, comprendiendo diferentes tipos de analitos, por ejemplo, biomoléculas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, metabolitos), moléculas pequeñas, fármacos y metabolitos de fármacos, materia inorgánica y orgánica, células o restos celulares, que están presentes en concentraciones que abarcan muchos órdenes de magnitud (por ejemplo, pg/ml a mg/ml en sangre). La tarea de encontrar y detectar analitos diana dentro de estas muestras tan complejas es difícil debido a la alta señal de fondo y, lo que es más importante, la supresión de la ionización del analito diana, un proceso integral para el análisis espectrométrico de masas, por moléculas transeúntes (por ejemplo, lípidos).

En segundo lugar, muchos analitos en sí mismos son difíciles de detectar de manera confiable y robusta a través de métodos basados en EM o, para algunos analitos, cualquier método convencional para el caso, debido a sus propiedades fisicoquímicas subóptimas (por ejemplo, masa, carga, hidrofilicidad). La variabilidad en las propiedades fisicoquímicas entre los analitos da lugar a una escasa repetibilidad experimental y una alta variación entre los ensayos. Esto es particularmente relevante para la cuantificación de proteínas. A menudo, las muestras que contienen proteínas se digieren con una proteasa, por ejemplo, tripsina, antes del análisis de EM y, normalmente, la mayoría de los péptidos producidos a partir de digestiones con tripsina no contienen secuencias que sean óptimas para el análisis de EM. Dichos péptidos no se detectan o solo se detectan de manera deficiente en un experimento típico de EM, dando como resultado un muestreo insuficiente y una disminución de la sensibilidad general de los ensayos de EM actuales.

Para abordar estos desafíos, las tecnologías y metodologías se han centrado en el enriquecimiento por afinidad del analito diana antes de la EM para aumentar la intensidad de la señal, el agotamiento selectivo de biomoléculas de alta abundancia para reducir el fondo y químicas específicas para aislar sub-proteomas (véase, por ejemplo, Anderson, N.L., Anderson, N.G., Haines, L.R., Hardie, D. B., Olafson, R.W., Pearson, T.W., 2004. Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA). J. Proteome Res. 3, 235.; Whiteaker, J.R., Zhao, L., Zhang, H.Y., Feng, L.C., Piening, B.D., Anderson, L., Paulovich, A.G., 2007b. Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for massspectrometry-based quantification of serum biomarkers. Anal. Biochem. 362, 44; Kuhn, E., Addona, T., Keshishian, H., Burgess,M.,Mani, D.R., Lee, R.T., Sabatine,M.S., Gerszten, R.E., Carr, S.A., 2009. Developing multiplexed assays for Troponin I and Interleukin-33 in plasma by peptide immunoaffinity enrichment and targeted mass spectrometry. Clin. Chem. 55, 1108; Wollscheid B, Bausch-Fluck D, Henderson C, O'Brien R, Bibel M, Schiess R, Aebersold R, Watts JD., Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins. Nat Biotechnol. abril de 2009;27(4):378-86.; Hui Zhang, Xiao-jun Li, Daniel B Martin, Ruedi Aebersold, Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry. Nature Biotechnology 21,660-666 (2003)). Algunos esfuerzos también se han dirigido a desarrollar algoritmos computacionales para predecir péptidos de alta respuesta de una proteína dada y para reducir los recursos requeridos para desarrollar ensayos proteómicos robustos (véase, por ejemplo, Mallick, P., Schirle, M., Chen, S.S., Flory, M.R., Lee, H., Martin, D., Ranish, J., Raught, B., Schmitt, R., Werner, T., Kuster, B., Aebersold, R., Computational prediction ofproteotypic peptides for quantitative proteomics. Nat. Biotechnol. 25: 125-131,2007; Fusaro, V.A., Mani, D.R., Mesirov, J.P., Carr, S.A., Prediction of high-responding peptides for targeted protein assays by mass spectrometry. Nat. Biotechnol. 27: 190-198, 2009).

En general, los enfoques convencionales para abordar las deficiencias de la tecnología de EM actual se centran en el desarrollo de nuevas químicas y tecnologías para mejorar el análisis cuantitativo de masas, aceptando la condición subyacente de que determinados compuestos biológicos son más difíciles de ionizar y detectar en virtud de su estructura química.

Algunos aspectos de la presente divulgación, por el contrario, proporcionan moléculas, composiciones y métodos para la traducción de analitos diana en restos bioquímicos con alta eficiencia de ionización y, por lo tanto, optimizados para la detección y cuantificación basada en MS. En algunas opciones, esta traducción de la identidad y cantidad de analitos en estructuras bioquímicas optimizadas para EM permiten la evaluación simultánea de múltiples analitos, por ejemplo, analitos de diferentes propiedades fisicoquímicas y, por lo tanto, de diferente capacidad de detección en ensayos basados en EM. En algunas opciones, múltiples analitos de diferentes propiedades fisicoquímicas se traducen en un conjunto de indicadores de masa isobáricos, por ejemplo, etiquetas de masa de péptidos isobáricos optimizadas para la detección basada en EM, por ejemplo, en ensayos EM/EM. En algunas opciones, la traducción permite el análisis cualitativo y/o cuantitativo de una pluralidad de analitos diana mediante CL EM/EM. En algunas opciones, la codificación bioquímica de analitos de diferentes propiedades fisicoquímicas en etiquetas de masa isobárica como se proporciona en el presente documento permite enfocar el análisis de EM en la ventana de masa específica de las etiquetas de masa isobárica, lo que aumenta la sensibilidad y precisión del análisis y/o reduce el tiempo requerido para monitorizar la ventana de masa relevante. En algunas opciones, la traducción comprende una etapa de enriquecimiento de los analitos diana, por ejemplo, analitos diana en una muestra biológica compleja.

Algunos aspectos de esta divulgación proporcionan indicadores codificados con isótopos (iCORE), que pueden usarse como etiquetas masivas. En algunas opciones, se proporcionan iCORE que se adhieren a agentes de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, a través de enlazadores fotolábiles. En algunas opciones, los iCORE se utilizan para la detección cualitativa o cuantitativa de un analito diana mediante un ensayo de EM, por ejemplo, por CL EM/EM. En algunas opciones, los iCORE se usan para la detección cualitativa o cuantitativa de una actividad, por ejemplo, de una actividad enzimática diana (por ejemplo, una proteasa, quinasa o actividad fosfatasa) mediante un ensayo de EM, por ejemplo, por CL EM/EM.

En algunas opciones, las muestras complejas, por ejemplo, muestras biológicas o clínicas, que contienen analitos diana se enriquecen en primer lugar selectivamente con anticuerpos de captura recubiertos sobre microesferas magnéticas (véase, por ejemplo, la Figura 1). A continuación, los analitos inmovilizados se ponen en contacto con agentes de unión marcados con iCORE. Después de la unión y retirada de los reactivos de unión no unidos, los iCORE individuales se separan de los agentes de unión a través de irradiación UV y el conjunto de estos iCORE "rescatados" se analiza mediante un ensayo EM, por ejemplo, por CL EM/EM. En algunas opciones, la presencia y/o abundancia de iCORE individuales, como se determina por la presencia y/o la intensidad de la señal obtenida de cada iCORE, se usa para determinar la presencia o ausencia y/o la abundancia (por ejemplo, la concentración) de un analito o actividad diana.

En algunas opciones, se administran uno o más iCORE a un sujeto. Por ejemplo, en algunas opciones, pueden formularse iCORE, administrarse a un sujeto y recogerse de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, o aquellos descritos en la Solicitud PCT PCT/US2010/000633, presentada el 2 de marzo de 2010 y titulada Methods And Products For In Vivo Enzyme Profiling. Por ejemplo, los iCORE diseñados para interrogar a los analitos o la actividad enzimática en un sujeto sospechoso de tener una enfermedad pueden administrarse al sujeto y los iCORE modificados con analitos o enzimas pueden recolectarse en un momento suficiente para que los iCORE estén expuestos al analito o la actividad enzimática en el sujeto. En algunas opciones, una muestra (por ejemplo, una muestra de orina, sangre, suero o plasma) se recoge del sujeto y se detectan iCORE "rescatados" dentro de la muestra de orina, por ejemplo, como se describe en el presente documento o en la solicitud PCT PCT/US2010/000633. En algunas opciones, la presencia y/o abundancia de iCORE individuales, como se determina por la presencia y/o la intensidad de la señal obtenida de cada iCORE, se usa para determinar la presencia o ausencia y/o la abundancia (por ejemplo, la concentración) de un analito o actividad diana.

Algunos aspectos de esta divulgación también proporcionan un método para producir conjuntos o bibliotecas, de códigos de masa de un único indicador basado en péptidos para permitir experimentos multiplexados en los que se detectan y/o se cuantifican simultáneamente múltiples analitos en una sola muestra. En algunas opciones, se selecciona un iCORE con propiedades favorables para la EM. En el presente documento se describen algunos ejemplos no limitantes de iCORE adecuados y los iCORE adicionales útiles de acuerdo con algunos aspectos de esta divulgación serán evidentes para los expertos en la materia basándose en esta divulgación. Por ejemplo, en algunas opciones, se usa un péptido glufib (EGVNDNEEGFFSAR, SEQ ID NO: 1) como el iCORE parental. A partir de esta secuencia parental, se diseña un conjunto de análogos isotópicos (por ejemplo, iCORE glu-fib con firma de fragmentación única), creando de esta manera una biblioteca iCORE que comprende varios iCORE de masa idéntica (iCORE isobáricos), pero con distintos iones indicadores de fragmentación, por ejemplo, iones y de diferentes masas. Dichos iCORE isobáricos son indistinguibles durante el análisis de Em , pero tras la fragmentación del péptido, por ejemplo, mediante disociación inducida por colisión (CID), disociación multifotónica infrarroja (IRMPD) o cualquier otro método de fragmentación adecuado conocido por los expertos en la materia, cada miembro del conjunto, puede distinguirse por su ion indicador de fragmentación único en un ensayo de EM en tándem (EM/EM) (Figura 2). La generación de firmas de fragmentación únicas, distinguibles se logra, en algunas opciones, mediante la sustitución estratégica de aminoácidos enriquecidos con isótopos estables en la secuencia del péptido parental. En algunas opciones, un conjunto de agentes de unión se conjuga con un conjunto de iCORE que tienen un conjunto de firmas de fragmentación únicas, distinguibles, por ejemplo, un conjunto de iCORE marcados diferencialmente con isótopos que dan lugar a iones de fragmentación que pueden identificarse mediante EM/EM, de tal manera que cada patrón de marcado de isótopos único y la firma de iones de fragmentación asociada, se asocia solo a agentes de unión que se unen específicamente a un analito. En dichas opciones, la especificidad análoga de cada agente de unión está codificada por el patrón de marcado de isótopos y la firma de fragmentación asociada del iCORE asociado. En algunas opciones, dicho conjunto de iCORE conjugados con agentes de unión se usa para la detección multiplexada y/o cuantificación de analitos o actividades en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica o clínica, o in vivo, de acuerdo con los métodos proporcionados en el presente documento.

Hay varias ventajas asociadas con los reactivos y métodos proporcionados en el presente documento en comparación con la metodología de detección de analitos basada en EM convencional. Por ejemplo, en algunas opciones, los analitos diana se enriquecen mediante agentes de unión, por ejemplo, mediante anticuerpos de captura que se unen específicamente a un analito de interés, inmovilizado sobre un sustrato sólido, por ejemplo, una perla o microesfera magnética, o una membrana o resina. En algunas opciones, este enriquecimiento permite una detección de analitos más sensible y/o específica y/o reduce la señal de fondo, particularmente en muestras complejas, tales como muestras de fluidos corporales (por ejemplo, sangre o suero), tejidos o células.

Además, en algunas opciones, los analitos diana se traducen en indicadores codificados por isótopos sustitutos (iCORE) que están prediseñados para una fácil detección y/o cuantificación por EM/EM. En algunas opciones, esta traducción, o codificación bioquímica, de analitos, por ejemplo, analitos que son difíciles de detectar mediante ensayos de EM, en etiquetas EM que son fáciles de detectar, permite eludir los desafíos de la detección directa de péptidos o estructuras químicas endógenas. Esto es de ventaja particular en el contexto de ensayos multiplexados, en los cuales se ensaya una pluralidad de analitos de diferente estructura. La detección directa de diferentes estructuras en un ensayo de EM multiplex generalmente requiere el cribado de una ventana de masa grande y, aunque algunos analitos pueden detectarse fácilmente a través de EM, muchos analitos son difíciles o imposibles de detectar sin un preprocesamiento extenso, o no pueden identificarse sin ambigüedades al analizar muestras complejas.

En algunas opciones, una única molécula de analito se traduce en una pluralidad de moléculas iCORE, dando como resultado una sensibilidad más alta de detección de analitos, por ejemplo, mediante una amplificación de la señal de aproximadamente 3-20 veces. Por ejemplo, en algunas opciones, un agente de unión que se une específicamente a una sola molécula o dos moléculas de un analito diana, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo, está conjugado con una pluralidad de moléculas iCORE, por ejemplo, a aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 moléculas de iCORE, proporcionando una ampliación de aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10 o aproximadamente 20 veces el número de moléculas disponibles para EM en comparación con la detección directa por EM del analito diana, respectivamente. Los expertos en la materia apreciarán que pueden lograrse velocidades de amplificación más altas fijando más moléculas iCORE a una molécula de agente de unión. En el presente documento se proporcionan métodos y reactivos para la unión de iCORE a agentes de unión y los métodos adicionales serán evidentes para aquellos expertos en la materia.

El uso de enlazadores fotolábiles durante el proceso de traducción, por ejemplo, en opciones donde se emplean iCORE unidos a agentes de unión, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, permite la liberación de iCORE desencadenada por luz ultravioleta de los agentes de unión. La alta eficiencia de este proceso fotoquímico contrasta notablemente con la derivación de péptidos a partir de proteínas mediante digestión enzimática (necesaria para la detección de proteínas multiplexadas en los ensayos CL EM/EM convencionales) que está limitada por las propiedades biofísicas de la enzima empleada (por ejemplo, KD, kcat, especificidad del sustrato) y el requisito de las condiciones óptimas de la muestra para la actividad enzimática (por ejemplo, pH, concentración de sal). Ambas limitaciones conducen a un aumento de los requisitos de procesamiento de muestras y/o una disminución de la eficiencia de detección.

Además, el uso de etiquetas de masa predeterminadas, por ejemplo, iCORE isobáricos, con masas conocidas simplifica enormemente la recopilación y el análisis de datos, ya que no es necesario consultar una ventana de masa grande (por ejemplo, 50-2000 m/z) para analitos de diversos pesos moleculares. Más bien, con códigos isobáricos, las ventanas de masa estrechas pueden centrarse en la masa principal (por ejemplo, ± 0,5 m/z) para recoger la señal eficientemente. En algunas opciones, este enfoque dirigido, combinado con la amplificación de la señal del analito durante la traducción, aumenta la sensibilidad de detección en ~30-300 veces. Por otra parte, en algunas opciones, la simplificación de la recopilación de datos y la disminución resultante en el tiempo de funcionamiento del espectrómetro reduce los costes generales en ~10 veces.

Además, el método para generar bibliotecas de etiquetas masivas iCORE isobáricas, por ejemplo, bibliotecas de péptidos iCORE isobáricos, es una mejora con respecto a las tecnologías actuales debido al gran grado de codificación que puede lograrse, lo que se traduce en capacidades de multiplexación mucho más allá de las limitaciones actuales. El estado actual de la técnica en multiplexación EM isobárica es la tecnología de etiquetas de masa iTRAQ (Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ., Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents, Mol Cell Proteomics. diciembre de 2004; 3(12): 1154-69). Los reactivos de marcaje iTRAQ son moléculas pequeñas reactivas con amina que proporcionan 4 o como máximo 8 códigos de masa únicos. Una biblioteca más grande está excluida por el número de átomos disponibles en moléculas pequeñas para la sustitución isotópica. Con los iCORE, por ejemplo, iCORE peptídicos, como se proporciona por algunos aspectos de la presente divulgación, sin embargo, el número de átomos disponibles para la sustitución isotópica se aumenta mediante el número de monómeros, por ejemplo, aminoácidos, que pueden marcarse con isótopos pesados. En consecuencia, es factible construir, por ejemplo, al menos ~30-40 códigos únicos de una longitud de péptido promedio de ~15 aminoácidos. El tamaño de la biblioteca y, por lo tanto, el número de etiquetas de codificación únicas puede aumentarse aún más usando péptidos más largos y/o combinando distintos conjuntos de péptidos iCORE isobáricos, proporcionando ~100-1000, o más, elementos.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan moléculas indicadoras codificadas por isótopos (iCORE) y métodos para su uso. En algunas opciones, los iCORE son útiles como etiquetas de masa en ensayos de EM, por ejemplo, en ensayos de CL EM/EM multiplex, como se describe con más detalle en otras partes del presente documento. En algunas opciones, los iCORE son útiles en la detección cualitativa y/o cuantitativa simultánea de decenas, cientos o miles de analitos en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica compleja, o en el seguimiento simultáneo de decenas, cientos o miles de células, tejidos o muestras usando una lectura de EM.

En algunas opciones, se proporciona un conjunto, una pluralidad o biblioteca de diferentes iCORE que es útil en ensayos de EM multiplex, por ejemplo, en ensayos de CL EM/EM multiplex. En algunas opciones, los iCORE de un conjunto, pluralidad, o biblioteca de iCORE son isobáricos. Por ejemplo, en algunas opciones, se proporciona un conjunto, una pluralidad o biblioteca de iCORE isobáricos en la cual todos los iCORE son polímeros, por ejemplo, péptidos de la misma secuencia de aminoácidos (por ejemplo, péptidos glu-fib (EGVNDNEEGFFSAR, SEQ ID NO: 1)), y tienen, en consecuencia, las mismas propiedades fisicoquímicas que son relevantes para el análisis de EM. En consecuencia, todos los iCORE de un conjunto, pluralidad, o biblioteca tal se detectan sustancialmente con la misma especificidad, sensibilidad y precisión en un ensayo CL EM/EM. En algunas opciones, diferentes iCORE en un conjunto, pluralidad o biblioteca tal de iCORE isobáricos tienen diferentes firmas de fragmentación, que pueden distinguirse fácilmente en un ensayo EM/EM como se describe con más detalle en otras partes del presente documento. Debido a que incluso los polímeros cortos, por ejemplo, polipéptidos cortos, permiten la generación de una gran cantidad de firmas de fragmentación únicas en un conjunto, pluralidad o biblioteca de iCORE isobáricos que pueden distinguirse mediante ensayos EM/EM, , por ejemplo, mediante marcaje diferencial de isótopos de los iCORE, esta tecnología puede usarse para el análisis EM cualitativo o cuantitativo multiplexado mucho más allá de las limitaciones de las tecnologías de Em multiplex actuales, tales como iTRAQ (4- u 8-plex máx.) o tecnologías de etiquetas de masa en tándem (TMT, 6-plex máx.).

Un conjunto no limitante ilustrativo de 10 iCORE peptídicos isobáricos de la secuencia de aminoácidos EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1) se describe en la Figura 3. Los diferentes iCORE G1-G10 tienen diferentes patrones de isótopos y, por lo tanto, diferentes firmas de fragmentación, por ejemplo, G1 tiene el patrón de isótopos E+3G+6VNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1), G2 tiene el patrón de isótopos E+2G+6VNDNEE+1GFFSAR (SEQ ID NO: 1), G3 tiene el patrón de isótopos E+1G+6Vⁿ DNEE+2G^fF^sAR (SEQ ID NO: 1), etcétera. En la primera ronda de EM, solo se observa un único pico, reflejando la naturaleza isobárica de iCORE G1-10 (Figura 3 I.). Después de la fragmentación, sin embargo, las firmas de fragmentación únicas de G1-10 dan como resultado la resolución de los fragmentos como 10 picos distintos (Figura 3 II.). El panel inferior de la figura muestra un primer plano de los picos obtenidos del ion y7 (EGFFSAR, SEQ ID NO: 6, véase la Figura 2 para ver la nomenclatura de ion y), permitiendo el análisis cualitativo (presente/ausente) así como cuantitativo de cada iCORE único en el conjunto. Los expertos en la materia apreciarán que la secuencia del péptido glu-fib permite la generación de más de 10 firmas de fragmentación únicas a través del marcaje diferencial de isótopos, por ejemplo, codificando además los aminoácidos restantes dentro de la secuencia, y que el conjunto ilustrativo de diez iCORE no es limitante a este respecto. Las capacidades de multiplexación de la tecnología iCORE están limitadas solo por la cantidad de patrones de fragmentación únicos que pueden crearse en iCORE. Incluso una pequeña secuencia de péptidos, tal como la secuencia de péptidos glufib ejemplificada en la Figura 3 permite la generación de al menos 30-40 firmas de isótopos únicos, si se usan aminoácidos marcados con isótopos disponibles comercialmente, y más si dichos aminoácidos se sintetizan de forma personalizada.

Se proporcionan a continuación tres estrategias de marcaje de isótopos diferencial no limitantes, ilustrativas para generar bibliotecas de iCORE basadas en glu-fib. En estos ejemplos, los iCORE se marcan con isótopos mediante la sustitución de uno o más átomos en los aminoácidos indicados con uno o más isótopos pesados, dando como resultado un cambio en la masa del aminoácido marcado. Los iCORE resultantes en cada biblioteca son isobáricos, con diferentes iCORE que tienen una firma de fragmentación diferente, por ejemplo, con respecto al ion y7. Los ejemplos están destinados únicamente a la ilustración y no limitan este aspecto de la divulgación. Las estrategias y esquemas de marcaje de isótopos diferenciales útiles adicionales serán evidentes para los expertos en la materia.

Biblioteca de iCORE glu-fib 10-plex (G10):

G101 = E-+3G-+6V-N-D-N-E-E-G-F-F-S-A-R

G102 = E-+2G-+6V-N-D-N-E-E-+1G-F-F-S-A-R

G103 = E-+1G-+6Y-N-D-N-E-E-+2G-F-F-S-A-R

G104 = E-G-+6V-N-D-N-E-E-+2G-F-F-S-+1A-R

G105 = E-G-+5V-N-D-N-E-E-G-F-F-S-+4A-R

G106 = E-+3G-+1V-N-D-N-E-E-+1G-F-F-S-+4A-R

G107 = E-+3G-V-N-D-N-E-E-G-+6F-F-S-A-R

G108 = E-+2G-V-N-D-N-E-E-G-+6F-F-S-+1A-R

G109 = E-+1G-V-N-D-N-E-E-+2G-+6F-F-S-A-R

G1010 = E-G-V-N-D-N-E-E-+3G-+6F-F-S-A-R

(SEQ ID NO: 36)

Biblioteca de iCORE glu-fib 18-plex (G18)

G1^b1 = E-+3G-+6V-+6N-D-+2N-E-E-G-F-F-S-A-R

G182 = E-+2G-+6V-+6N-D-+2N-E-E-G-F-F-S-+1A-R

G183 = E-+1G-+6V-+6N-D-+2N-E-E-+1G-F-F-S-+1A-R

G184 = E-G-+6V-+6N-D-+2N-E-E-+2G-F-F-S-+1A-R

G185 = E-G-+5V-+6N-D-+2N-E-E-G-F-F-S-+4A-R

G186 = E-+1G-+5V-+6N-D-N-E-E-+1G-F-F-S-+4A-R

G187 = E-+3G-V-+6N-D-+2N-E-E-G-+6F-F-S-A-R

G188 = E-+2G-V-+6N-D-+2N-E-E-G-+6F-F-S-+1A-R

G189 = E-+1G-V-+6N-D-+2N-E-E-+1G-+6F-F-S-+1A-R

G1810 = E-+1G-+5V-N-D-+2N-E-E-+2G-+6F-F-S-+1A-R

G1811 = E-G-+5V-N-D-+2N-E-E-G-+10F-F-S-A-R

G1812 = E-+3G-+1V-N-D-+2N-E-E-G-+10F-F-S-+1A-R

G1813 = E-+2G-+1V-N-D-+2N-E-E-+1G-+10F-F-S-+1A-R

G1814 = E-+2G-V-N-D-+2N-E-E-+2G-+10F-F-S-+1A-R

G1815 = E-+1G-V-N-D-+2N-E-E-G-+10F-F-S-+4A-R

G1816 = E-+2G-V-N-D-N-E-E-+1G-+10F-F-S-+4A-R

G1817 = E-+1G-V-N-D-N-E-E-G-+10F-+6F-S-A-R

G1818 = E-G-V-N-D-N-E-E-G-+10F-+6F-S-+1A-R

(SEQ ID NO: 36)

Biblioteca de iCORE glu-fib 22-plex (G22)

G221 = E-+3G-+6V-+6N-D-+6N-E-E-G-F-F-S-A-R

G222 = E-+2G-+6V-+6N-D-+6N-E-E-G-F-F-S-+1A-R

G223 = E-+1G-+6V-+6N-D-+6N-E-E-+1G-F-F-S-+1A-R

G224 = E-G-+6V-+6N-D-+6N-E-E-+2G-F-F-S-+1A-R

G225 = E-G-+5V-+6N-D-+6N-E-E-G-F-F-S-+4A-R

G226 = E-G-+5V-+6N-D-+6N-E-E-+1G-F-F-S-+4A-R

G227 = E-+3G-V-+6N-D-+6N-E-E-G-+6F-F-S-A-R

G228 = E-+2G-V-+6N-D-+6N-E-E-G-+6F-F-S-+1A-R

G229 = E-+1G-V-+6N-D-+6N-E-E-+1G-+6F-F-S-+1A-R

G22IO = E-+1G-+5V-N-D-+6N-E-E-+2G-+6F-F-S-+1A-R

G22II = E-G-+5V-N-D-+6N-E-E-G-+10F-F-S-A-R

G2212 = E-+3G-+1V-N-D-+6N-E-E-G-+10F-F-S-+1A-R

G22I3 = E-+2G-+1V-N-D-+6N-E-E-+1G-+10F-F-S-+1A-R

G22I4 = E-+2G-V-N-D-+6N-E-E-+2G-+10F-F-S-+1A-R

G22I5 = E-+1G-V-N-D-+6N-E-E-G-+10F-F-S-+4A-R

G22I6 = E-+1G-+5V-N-D-N-E-E-+1G-+10F-F-S-+4A-R

G22I7 = E-G-+5V-N-D-N-E-E-G-+10F-+6F-S-A-R

G22I8 = E-+3G-+1V-N-D-N-E-E-G-+10F-+6F-S-+1A-R

G22I9 = E-+2G-+1V-N-D-N-E-E-+1G-+10F-+6F-S-+1A-R

G2220 = E-+2G-V-N-D-N-E-E-+2G-+10F-+6F-S-+1A-R

G222I = E-+1G-V-N-D-N-E-E-G-+10F-+10F-S-A-R

G2222 = E-G-V-N-D-N-E-E-G-+10F-+10F-S-+1A-R

(SEQ ID NO: 36)

En algunas opciones, los aminoácidos marcados con isótopos son D-aminoácidos. En algunas opciones, los aminoácidos marcados con isótopos son L-aminoácidos. En algunas opciones, los aminoácidos marcados con isótopos son una mezcla de D- y L-aminoácidos.

Los expertos en la materia apreciarán que los polímeros más largos, por ejemplo, polipéptidos, polisacáridos o polinucleótidos más largos, permiten que se generen aún más firmas de fragmentación únicas mediante el marcaje diferencial de isótopos, expandiendo de esta manera aún más las capacidades de multiplexación de la tecnología iCORE.

En algunas opciones, un conjunto, pluralidad o biblioteca de iCORE (por ejemplo, iCORE de polipéptido, polinucleótido o polisacárido) que comprende al menos 2, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 500, al menos 1000 o más de 1000 iCORE diferentes, por ejemplo, iCORE que tienen una firma de fragmentación única que se distingue mediante un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo EM/EM. En algunas opciones, los iCORE en el conjunto, pluralidad o biblioteca son iCORE isobáricos, por ejemplo, polipéptido isobárico, iCORE de polinucleótidos o polisacáridos. En algunas opciones, cada firma de fragmentación única en un conjunto de iCORE, por ejemplo, un conjunto de iCORE isobáricos, está asociado con, o representa, un analito o parámetro específico. También se proporcionan métodos para el uso de iCORE, por ejemplo, en la detección de analitos, así como seguimiento de células, tejidos, muestras y líquidos.

El término iCORE se refiere a moléculas indicadoras codificadas por isótopos. En algunas opciones, un iCORE es una molécula que es fácilmente detectable por la tecnología EM. En algunas opciones, un iCORE es un péptido, por ejemplo, un péptido que se sabe que es fácilmente detectable mediante tecnología EM. En otras opciones, un iCORE es un polinucleótido o un polisacárido. Normalmente, un iCORE es una molécula que permite el marcaje diferencial de isótopos, por ejemplo, para la generación de firmas de fragmentación únicas que se distinguen en un ensayo de detección, tales como EM/EM. Esto permite la generación de bibliotecas de iCORE isobáricos que comparten las mismas propiedades fisicoquímicas para la detección de EM, por ejemplo, iCORE de péptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos y se distinguen fácilmente por su firma de fragmentación única, por ejemplo, en ensayos CL EM/EM. Normalmente, un iCORE es un polímero compuesto por monómeros que exhiben diferentes firmas de EM y, por lo tanto, comprende una secuencia de monómeros. Tales polímeros son bien conocidos por aquellos expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a polímeros de aminoácidos, nucleótidos y monosacáridos, por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos y polisacáridos, respectivamente.

La longitud de los iCORE se elige normalmente para producir una firma masiva que sea útil en los ensayos de EM, por ejemplo, una firma de masas que puede detectarse fácilmente en un ensayo EM/EM. Por ejemplo, en algunas opciones, un iCORE es una molécula polimérica (por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido o polisacárido) que comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 restos monoméricos, por ejemplo, restos de aminoácidos, nucleótidos o monosacáridos. En algunas opciones, un iCORE es una molécula polimérica, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido o polisacárido, que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 o 91-100 monómeros, por ejemplo, restos de aminoácidos o nucleótidos. En algunas opciones, un iCORE es un polímero que comprende más de 100 monómeros, por ejemplo, más de 100 aminoácidos, restos de nucleótidos o monosacáridos.

Los ejemplos no limitantes de moléculas poliméricas que son útiles para la generación de iCORE son los polipéptidos glu-fib (EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1)), bradiquinina (PPGFSPFR (SEQ ID NO: 30)), angiotensina I (DRVYIHPFHL (SEQ ID NO: 31)), ACTH1-17 (SYSMEHFRWGKPVGKKR (SEQ ID NO: 32)), ACTH18-39 (RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF (SEQ ID NO: 33)) y ACTH7-38 (FRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLE (SEQ ID NO: 34)). Las moléculas y secuencias poliméricas adicionales que pueden usarse para la generación de iCORE serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia y la divulgación no está limitada a este respecto.

Para generar un iCORE a partir de una molécula polimérica no marcada, por ejemplo, un polipéptido, polinucleótido o polisacárido, la molécula polimérica se marca con isótopos. Los expertos en la materia conocen bien métodos y reactivos para el marcaje isotópico de moléculas poliméricas. En algunas opciones, tales métodos incluyen la generación de una molécula polimérica, por ejemplo, un péptido, a partir de monómeros, por ejemplo, aminoácidos, al menos algunos de los cuales están marcados con isótopos para obtener una molécula polimérica marcada con isótopos. En algunas opciones, el marcaje de isótopos se efectúa mediante la introducción de isótopos pesados. Es posible el marcaje isotópico con isótopos radiactivos o con isótopos estables. En algunas opciones, se prefiere el marcaje con isótopos estables.

Por ejemplo, mientras que los monómeros no marcados, por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos o monosacáridos no marcados, comprenden predominantemente átomos C12, O16, N14 y S32, los monómeros marcados con isótopos, por ejemplo, aminoácidos marcados con isótopos, puede comprender uno o más isótopo o isótopos pesados, por ejemplo, un isótopo C13, N15, O17, O18, H2, S33, S34 o S36 Un monómero que comprende un isótopo pesado tiene una masa diferente a la de un aminoácido no marcado, e incluso un solo isótopo comprendido en un monómero puede medirse fácilmente mediante ensayos EM. Esta diferencia de masa se confiere a cualquier polímero que comprenda tal monómero marcado con isótopos. Por ejemplo, la diferencia de masa resultante de la sustitución de un átomo C12 de un aminoácido con un isótopo C13 puede medirse en un péptido que comprende tal aminoácido marcado con isótopo.

Para dar un ejemplo no limitante de marcaje de isótopos monoméricos, el anillo de fenilo de fenilalanina (F) no marcada normalmente comprende seis átomos C12. En algunas opciones, un resto de fenilalanina marcado con isótopo comprende un anillo de fenilo que comprende cinco átomos C12 y un isótopo C13, aumentando la masa del aminoácido marcado por la masa de un neutrón (+1F). En algunas opciones, un resto de fenilalanina marcado con isótopo comprende un anillo de fenilo que comprende cuatro átomos C12 y dos isótopos C13, aumentando la masa del aminoácido marcado por la masa de dos neutrones (+2F). En algunas opciones, un resto de fenilalanina marcado con isótopo comprende un anillo de fenilo que comprende tres átomos C12 y tres isótopos C13 (+3F), dos átomos C12 y cuatro isótopos C13 (+4F), un átomo C12 y cinco isótopos C13 (+5F) o seis isótopos C13 (+6F). Los tres átomos C12 restantes de fenilalanina no marcada y el átomo N14 del grupo amino también pueden estar sustituidos con isótopos, produciendo 7F, 8F, 9F y 10F. Los expertos en la materia apreciarán que es posible cualquier combinación de sustituciones de isótopos, por ejemplo, sustitución del N14 del grupo amino, del C12 del grupo carboxi y de dos C12 del anillo de fenilo produciría 4F, como lo haría una sustitución de tres anillos de fenilo C12 con C13 y de la N14 con N15 o sustitución de cuatro C12 del anillo de fenilo con 4 C13. En algunas opciones, la fenilalanina marcada con isótopos se usa para generar un péptido marcado con isótopos. En algunas opciones, esto implica la síntesis de péptidos in vivo, por ejemplo, mediante células que se incuban en presencia de fenilalanina marcada con isótopos e incorporan el aminoácido marcado en cualquier péptido que sinteticen. En algunas opciones, se sintetizan péptidos marcados con isótopos in vitro, por ejemplo, a través de la síntesis de fmoc usando aminoácidos marcados con isótopos como bloques de construcción.

Los expertos en la materia apreciarán que los aminoácidos distintos de la fenilalanina pueden marcarse con isótopos de acuerdo con el uso de estrategias y métodos similares y reactivos conocidos por los expertos en la materia y la descripción no está limitada a este respecto. Se apreciará además que los monómeros distintos de los aminoácidos pueden marcarse con isótopos, por ejemplo, nucleótidos y monosacáridos. Además, otros métodos para la generación de polímeros marcados con isótopos que son útiles como iCORE, por ejemplo, métodos en los cuales un polímero se marca directamente, también son conocidos por los expertos en la materia y la divulgación no está limitada a este respecto.

Pueden crearse diferentes firmas de fragmentación mediante el marcaje diferencial de isótopos de moléculas poliméricas, por ejemplo, añadiendo diferentes cantidades de isótopos pesados al mismo resto monomérico o generando diferentes combinaciones de restos monoméricos marcados dentro de la molécula polimérica. Para ver un ejemplo de diferentes firmas de fragmentación de iCORE creadas por el marcaje diferencial de isótopos, véanse los iCORE G1-G10 descritos en la Figura 3. El marcaje isotópico de un polipéptido, polinucleótido o polisacárido en un resto específico, por ejemplo, un resto de aminoácido, nucleótido o monosacárido específico, produce una firma de marcaje de isótopos específicos que puede identificarse fácilmente y distinguirse de otros polipéptidos, polinucleótidos o polisacáridos de la misma secuencia monomérica que están marcados en un resto diferente, a través de ensayos de EM, por ejemplo, mediante ensayos EM/EM. Esto permite la generación de múltiples iCORE que comprenden la misma secuencia monomérica, por ejemplo, múltiples iCORE de polinucleótidos que comprenden la misma secuencia de aminoácidos, pero marcados con isótopos en diferentes restos. Tales iCORE isobáricos marcados diferencialmente exhiben propiedades fisicoquímicas idénticas para el fin de los ensayos de EM, y son, por lo tanto, detectables a un nivel igual de sensibilidad, especificidad y precisión en los ensayos de EM, sin dejar de ser distinguible por su firma de fragmentación única, por ejemplo, en ensayos CL EM/^e M como se describe en el presente documento.

En algunas opciones, los iCORE son polipéptidos. Normalmente, los iCORE de polipéptidos comprenden una secuencia que está optimizada para una fácil detección en ensayos de EM, como se ejemplifica por las secuencias iCORE proporcionadas en el presente documento. En algunas opciones, se proporciona una biblioteca de iCORE isobáricos, en la cual todos los iCORE comprenden la misma secuencia de aminoácidos, pero diferentes iCORE comprenden diferentes firmas de marcaje de isótopos. Incluso polipéptidos cortos, por ejemplo, de aproximadamente 5-20 aminoácidos de longitud, permiten la generación de decenas o cientos de firmas de etiquetado de isótopos únicos, lo que se traduce en la posibilidad de detectar y analizar decenas o cientos de analitos en un ensayo de EM multiplexado usando iCORE isobáricos de tales longitudes. En algunas opciones, se proporciona una biblioteca de péptidos iCORE que comprende iCORE de diferentes secuencias de aminoácidos, aumentando aún más el número de firmas de etiquetado de isótopos únicos y, por lo tanto, el número de analitos que pueden analizarse en un único experimento de EM multiplexado. Pueden generarse tales bibliotecas iCORE heterogéneas, por ejemplo, mediante la combinación de una primera biblioteca iCORE que comprende iCORE isobáricos marcados diferencialmente con una biblioteca adicional que comprende iCORE isobáricos marcados diferencialmente. Por ejemplo, tal biblioteca podría generarse combinando una biblioteca de iCORE basados en glu-fib con una biblioteca de iCORE basados en bradiquinina y una biblioteca de iCORE basados en angiotensina I, creando así una biblioteca combinatoria más grande de iCORE.

Algunos aspectos de esta divulgación se refieren al reconocimiento de que incluso un número relativamente pequeño de etiquetas polipeptídicas relativamente cortas que son útiles en ensayos de EM proporcionan capacidades de multiplexación prácticamente ilimitadas, dado que los polipéptidos están compuestos por restos de aminoácidos y hay 20 aminoácidos naturales y un gran número de aminoácidos artificiales que son útiles como bloques de construcción para iCORE. Por ejemplo, una biblioteca iCORE basada en iCORE glu-fib isobáricos marcados diferencialmente (EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1)) permite la detección de aproximadamente 10­ 100 analitos en un ensayo de EM multiplexado, mientras que una biblioteca iCORE basada en iCORE ACTH7-38 isobáricos marcados diferencialmente (FRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDESAEAFPLE (SEQ ID NO: 34)) permite la detección de aproximadamente 10-400 analitos en un ensayo de EM múltiplex. Las bibliotecas iCORE combinatorias, en consecuencia, permiten la evaluación de miles de analitos simultáneamente.

Algunos aspectos de la presente divulgación proporcionan conjuntos o bibliotecas de iCORE. En algunas opciones, los iCORE comprenden o se conjugan a un resto reactivo que reacciona con otra molécula. Por ejemplo, en algunas opciones, los iCORE comprenden un resto reactivo que forma un enlace covalente a una molécula de interés, por ejemplo, a un analito, o un conjunto de analitos. En algunas opciones, la molécula de interés es un péptido o una proteína, un carbohidrato, un ácido nucleico o un lípido. En algunas opciones, la molécula de interés a la que se pretende conjugar el iCORE es un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, aptámero, ligando, receptor o adnectina. Por ejemplo, en algunas opciones, se proporciona un conjunto de iCORE que se conjuga con un resto químico reactivo que forma un enlace covalente a una proteína si se pone en contacto con una proteína. Las fracciones químicas reactivas son bien conocidas por los expertos en la materia. En la Figura 7 se representa una realización ilustrativa para ilustrar este punto. En este punto, el iCORE es un péptido glu-fib, unido covalentemente a un resto químico que polimeriza bajo luz ultravioleta con monómeros de PEG para formar un hidrogel de PEG. El polietilenglicol (PEG), también conocido como poli(oxietilen)glicol, es un polímero de condensación de óxido de etileno y agua que tiene la fórmula química genera1HO(CH2CH2O)[n]H. Tales hidrogeles son útiles, por ejemplo, en la generación de tejidos diseñados y la conjugación de un iCORE a dicho hidrogel permite rastrear un tejido cultivado en un hidrogel etiquetado de este tipo en experimentos in vitro o in vivo como se describe con más detalle en otras partes del presente documento. Otros restos químicos reactivos y métodos para la conjugación de dichos restos a iCORE proporcionados en el presente documento son bien conocidos por los expertos en la materia y la divulgación no se limita a este respecto. Resultará evidente para los expertos en la técnica que el tipo de resto químico reactivo puede seleccionarse para que sea reactivo con un resto comprendido en la molécula de interés a la que se pretende conjugar el iCORE. En algunas opciones, se proporcionan iCORE que se conjugan con un resto químico reactivo mediante un enlace covalente. En algunas opciones, se proporcionan iCORE que se conjugan con un resto químico reactivo mediante un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador fotoescindible.

Proporcionar iCORE conjugados a restos químicos reactivos permite el marcaje personalizado de moléculas de interés por parte del usuario final, por ejemplo, por un científico, extendiendo de esta manera la versatilidad de la tecnología iCORE a diseños experimentales personalizados. Por ejemplo, en algunas opciones, los iCORE conjugados con un resto reactivo que forma un enlace covalente con péptidos pueden usarse para marcar proteínas o péptidos obtenidos de una muestra biológica para compararlos con proteínas o péptidos obtenidos de una muestra diferente, de la misma manera que se usan comúnmente las etiquetas ITRAQ. A diferencia de la tecnología ITRAQ, el número prácticamente ilimitado de diferentes firmas de fragmentación disponibles para un determinado conjunto de iCORE, por ejemplo, un conjunto de iCORE de péptidos isobáricos como se describe en el presente documento, permite la evaluación simultánea de un número prácticamente ilimitado de analitos, por ejemplo, para la evaluación y comparación simultáneas de un número prácticamente ilimitado de muestras de proteínas o péptidos.

La escalabilidad de la tecnología iCORE depende de los agentes de unión específicos usados (para las opciones, en las cuales se usan o se proporcionan iCORE conjugados con agentes de unión específicos) y los indicadores específicos, de masas distinguibles, por ejemplo, iCORE, que tienen una firma única de fragmentación distinguible. En cuanto a los agentes de unión específicos, los iCORE pueden conjugarse con prácticamente todos los agentes de unión disponibles comercialmente, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, aptámeros, proteínas de unión a ligando o dominios de proteínas, y adnectinas mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia. El número de iCORE con firmas de fragmentación únicas escala con el espacio peptídico, que escala como 20n, donde n = longitud del péptido, para péptidos iCORE que comprenden sólo aminoácidos de origen natural. En consecuencia, incluso los iCORE de péptidos muy cortos proporcionan una gran cantidad de posibles firmas de fragmentación únicas, mientras que los péptidos más largos proporcionan firmas únicas prácticamente ilimitadas. En algunas opciones, son preferibles los péptidos iCORE que son fácilmente detectados por EM, pero incluso los iCORE peptídicos ilustrativos fácilmente detectables descritos en el presente documento solos permiten cientos o miles de firmas de fragmentación únicas. Algunas secuencias peptídicas adecuadas para la generación de iCORE se proporcionan en el presente documento y las secuencias peptídicas adicionales adecuadas serán evidentes para los expertos en la materia basándose en esta divulgación.

En algunas opciones, se proporcionan iCORE que se conjugan a un agente de unión. Un agente de unión es un agente que se une específicamente a una molécula, por ejemplo, un analito. En algunas opciones, el agente de unión es un anticuerpo o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas opciones, el agente de unión es un péptido o una proteína. En algunas opciones, el agente de unión es un aptámero o adnectina. En algunas opciones, el agente de unión es un ligando o un receptor, o comprende un dominio de unión a ligando.

En consecuencia, en algunas opciones, se proporcionan conjugados de agente de unión a iCORE que se unen específicamente a un analito. En algunas opciones, la conjugación de iCORE y el agente de unión se realiza a través de un enlace covalente, por ejemplo, un enlace peptídico covalente en una proteína de fusión del agente de unión a iCORE. En algunas opciones, la conjugación de iCORE y el agente de unión se realiza a través de un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible por proteasa o un enlazador fotoescindible. En algunas opciones, el enlazador es un enlazador peptídico que comprende un sitio de escisión de proteasa. En el presente documento se describen algunos enlazadores fotoescindibles y sitios de escisión por proteasa ilustrativos y los enlazadores y sitios de escisión adicionales serán evidentes para los expertos en la materia y la divulgación no está limitada a este respecto. Por ejemplo, en algunas opciones, se proporciona un iCORE que está conjugado con un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo, a través de un enlazador fotoescindible, como se describe en el presente documento. En algunas opciones, se proporciona un conjunto de iCORE que se conjuga con un conjunto de agentes de unión, por ejemplo, un conjunto de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, o péptidos y proteínas de unión a ligandos, o aptámeros o adnectinas, o cualquier combinación de tales agentes. Normalmente, los iCORE en un conjunto tal se conjugan con los agentes de unión de una manera que permita la identificación de un agente aglutinante particular, y, por lo tanto, el analito unido por un agente aglutinante, determinando la identidad del iCORE.

Por ejemplo, en un conjunto de 10 iCORE diferentes (por ejemplo, iCORE G1-G10 en la Figura 2) que se conjugan con un conjunto de 10 agentes de unión diferentes (B1-B10), que, a su vez, se unen específicamente a un conjunto de analitos (A1-A10), los iCORE se conjugan con los agentes de unión de modo que cada iCORE de una firma de fragmentación única se conjuga con un agente de unión particular, por ejemplo, G1 a B1, G2 a B2, G3 a B3 y así sucesivamente. La firma de fragmentación única de cada iCORE puede identificarse y distinguirse de las firmas de fragmentación de los otros iCORE en la biblioteca en un ensayo ^e M, por ejemplo, el ensayo EM/EM representado en la Figura 3. En consecuencia, la presencia o ausencia de un agente de unión específico en una muestra puede inferirse de la presencia o ausencia de la firma de fragmentación única del iCORE asociado a ese agente de unión en particular. En algunas opciones, se analiza una muestra para determinar la presencia o ausencia de un conjunto de analitos poniendo en contacto la muestra con el conjunto de iCORE conjugados con los agentes de unión en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a sus respectivos analitos. Posteriormente, aquellos agentes de unión conjugados con iCORE que se unen específicamente a sus respectivos analitos se enriquecen o se aíslan. En algunas opciones, los iCORE se liberan después, por ejemplo, escindiendo el enlazador que conecta el iCORE al agente de unión. En algunas opciones, los iCORE se someten después a análisis EM, por ejemplo, en un ensayo EM/EM, y se determina la presencia o ausencia y/o la cantidad de cada iCORE. En algunas opciones, la presencia o ausencia y/o la cantidad de cada analito se determina a partir del resultado del ensayo de EM. Por ejemplo, en algunas opciones, si un ensayo iCORE EM da como resultado la detección de iCORE G1, G3, G5-7 y G10, puede determinarse la presencia de analitos A1, A3, A5-7 y A10 y/o la ausencia de analitos A2, A4-6 y A8-9. En algunas opciones, puede usarse una comparación de la señal obtenida para un iCORE dado en el ensayo de EM para determinar la cantidad del analito respectivo en la muestra y/o comparar el nivel de los analitos respectivos en la muestra con el nivel de un analito diferente en la muestra a través de la comparación de señales de EM. Por ejemplo, si el resultado de EM obtenido de una muestra en contacto con 10 iCORE conjugados con 10 agentes de unión que se unen específicamente a 10 analitos representaría el resultado de EM como se muestra en la Figura 3, la presencia de todas las firmas de fragmentación únicas de iCORE G1-10 indicaría que todos los analitos A1-10 están presentes en la muestra. En algunas opciones, el nivel de señal similar de todas las firmas de fragmentación únicas de iCORE G1-10 puede indicar además que todos los analitos A1-10 están presentes en niveles similares en la muestra, si las interacciones agente de unión-analito son sustancialmente similares entre los analitos.

En algunas opciones, se proporciona una biblioteca de iCORE isobáricos en la cual los iCORE comprenden la misma secuencia, por ejemplo, un conjunto de iCORE de péptidos o ácidos nucleicos que comprenden la misma secuencia de aminoácidos o nucleótidos, respectivamente, pero en el cual los diferentes iCORE están marcados con isótopos en diferentes posiciones, por ejemplo, en diferentes restos de aminoácidos o nucleótidos dentro de la secuencia de aminoácidos o nucleótidos.

Algunos aspectos de la tecnología iCORE se basan en o usan tecnologías existentes demostradas, por ejemplo, inmunoenriquecimiento basado en perlas, química de bioconjugación fotolábil, etiquetado directo de analitos, por ejemplo, de proteínas por conjugación de restos químicos reactivos y espectrometría de masas cualitativa y/o cuantitativa, por ejemplo, ensayos CL EM/EM. Estas tecnologías son bien conocidas por los expertos en la materia y muchas variaciones y equivalentes de las opciones ilustrativas descritas en el presente documento serán evidentes para el experto en la técnica basándose en esta divulgación. Se apreciará que la tecnología iCORE puede aplicarse a muchos escenarios diferentes de detección de analitos, por ejemplo, escenarios de diagnóstico, así como muchos escenarios de seguimiento diferentes. La divulgación no se limita a este respecto.

Por ejemplo, algunas opciones de la tecnología iCORE como se describe en el presente documento proporcionan ensayos de diagnóstico molecular (por ejemplo, detección de biomarcadores, seguimiento de vacunas y detección de HLA), así como ensayos cualitativos y cuantitativos para la investigación científica básica (por ejemplo, perfiles de expresión de proteínas, perfiles celulares, perfiles de tejidos y perfiles metabólicos). Por ejemplo, determinadas opciones proporcionan una biblioteca de agentes de unión marcados con iCORE (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos) dirigidos contra un panel de biomarcadores séricos (por ejemplo, marcadores específicos de órganos y/o enfermedades) que pueden usarse para monitorizar procesos biológicos mediante el análisis de fluidos corporales o muestras de tejido obtenidas de un sujeto (por ejemplo, evolución del tumor, respuestas del hospedador después de la administración del fármaco o metabolismo del fármaco). Algunas opciones de la tecnología iCORE son especialmente adecuadas para estos estudios multiparamétricos, particularmente en el diagnóstico de enfermedades o afecciones, debido a que la tecnología iCORE permite aumentos en la sensibilidad de detección y la resolución a través de la multiplexación, que, a su vez, permite la detección eficiente de firmas de diagnóstico de múltiples parámetros.

Algunas opciones proporcionan una biblioteca de iCORE químicamente activos, por ejemplo, iCORE peptídicos isobáricos conjugados con un resto químico reactivo que puede utilizarse por un usuario final para codificar experimentos definidos por el usuario. Por ejemplo, en estudios de proteómica comparativa de casos y controles, las proteínas de cada condición, experimento o sujeto únicos, pueden codificarse (por ejemplo, marcarse) con una firma de fragmentación iCORE particular. Todas las muestras pueden combinarse después y analizarse simultáneamente mediante CL EM/EM para determinar los efectos relativos de las condiciones experimentales. El uso de la tecnología iCORE permite realizar estudios comparativos a una escala excluida por las tecnologías y métodos actuales.

El experto en la materia apreciará que el uso de la tecnología iCORE, como se describe en el presente documento, no se limita a la detección, codificación y traducción de analitos. Debido a que los iCORE son etiquetas de EM versátiles novedosas que tienen múltiples ventajas sobre las etiquetas EM previamente conocidas, la tecnología iCORE puede adaptarse a diversas tecnologías de detección de etiquetas de EM y estrategias de diagnóstico. Por ejemplo, la tecnología iCORE puede usarse en el contexto del perfil de actividad de enzimas multiplexadas (por ejemplo, proteasa) usando estrategias EM/EM, como se describe en la solicitud PCT PCT/US2010/000633, publicada como ^w O/2010/101628 el 9 de octubre de 2010.

Por ejemplo, los iCORE pueden conjugarse con un vehículo, por ejemplo, una nanopartícula (por ejemplo, un nanogusano (NW)), a través de un enlazador que comprende una secuencia de aminoácidos que se escinde por una enzima de interés, por ejemplo, por una proteasa asociada a una enfermedad. Tales NW de iCORE, también denominados a veces reactivos pro-diagnóstico, pueden administrarse después a un sujeto para interrogar la actividad de la enzima en el sujeto. En algunas opciones, se proporciona un conjunto de iCORE que está unido a un vehículo a través de diferentes enlazadores dirigidos por diferentes enzimas (por ejemplo, diferentes proteasas) de manera que la actividad de cada proteasa libera una etiqueta iCORE específica. Usada de esta manera, la tecnología iCORE puede emplearse para interrogar las actividades de una pluralidad de enzimas asociadas a enfermedades (por ejemplo, proteasas asociadas a enfermedades) en paralelo en un ensayo EM multiplexado. En algunas opciones, se administra un conjunto de reactivos iCORE pro-diagnóstico a un sujeto que se sospecha que exhibe un nivel aberrante (por ejemplo, patogénico) de actividad de una o más enzimas (por ejemplo, una o más proteasas) para sondear los niveles de actividad de numerosas proteasas en un ensayo multiplexado. Aunque el vehículo del reactivo pronóstico generalmente no se secreta en la orina del sujeto, cuando se expone a la actividad de la proteasa, el iCORE respectivo se escinde del NW y se libera en la orina del sujeto. Las muestras de orina se recogen después de un tiempo suficiente después de que haya pasado la administración del reactivo pro-diagnóstico al sujeto para que el reactivo se exponga a la actividad enzimática en el sujeto. Después las muestras de orina se someten a ensayos de EM/EM como se describe con más detalle en otra parte en el presente documento o en el documento PCT/US2010/000633, publicado como WO/2010/101628, para detectar los iCORE escindidos y determinar si el sujeto exhibe o no una firma de actividad de proteasa aberrante.

Las actividades proteasa que están asociadas a la enfermedad son bien conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Tabla 1 del documento PCT/US2010/000633, publicado como WO/2010/101628, para algunos ejemplos no limitantes de actividades enzimáticas asociadas a enfermedades). Las secuencias diana de proteasa que son útiles como secuencias enlazadoras de iCORE a vehículos también son bien conocidas por los expertos en la materia. Algunos iCORE, enlazadores escindibles por proteasa y métodos ilustrativos para el diagnóstico de enfermedades en un sujeto se describen en detalle en el presente documento. Los iCORE, enlazadores y métodos adicionales resultarán evidentes para los expertos en la materia basándose en esta divulgación y la divulgación no está limitada en estos aspectos. Como será evidente para el experto en la materia, el uso de la tecnología iCORE en el contexto de ensayos de actividad de proteasa múltiplex permite una mejora de las capacidades de multiplexación y una mayor facilidad de detección en comparación con los métodos descritos anteriormente.

Algunas opciones proporcionan kits de reactivos descritos en el presente documento. Por ejemplo, algunas opciones proporcionan un kit que comprende un conjunto de iCORE, por ejemplo, iCORE peptídicos isobáricos, que comprende iCORE que tienen diferentes firmas de fragmentación. En algunas opciones, los iCORE se conjugan con un resto químico reactivo, por ejemplo, un resto reactivo con el péptido que forma un enlace covalente con un péptido cuando se pone en contacto con dicho péptido. En algunas opciones, los diferentes iCORE en un conjunto de iCORE proporcionado de esta manera están separados, permitiendo de esta manera al usuario final etiquetar una muestra en particular, por ejemplo, una muestra de proteína, con un iCORE específico y una muestra diferente con un iCORE diferente, permitiendo de esta manera la posterior mezcla y el análisis simultáneo de las muestras en un ensayo EM, por ejemplo, en un ensayo CL EM/EM.

En algunas opciones, se proporciona un kit que comprende un conjunto o biblioteca de agentes de unión que se conjugan con iCORE, como se describe en el presente documento. En algunas opciones, cada agente de unión que se une a un analito particular se conjuga con un iCORE de una firma de fragmentación particular, de tal manera que el analito unido por el agente de unión puede identificarse mediante la firma de fragmentación del iCORE.

Algunos aspectos de esta divulgación se refieren a la codificación bioquímica de parámetros, por ejemplo, de analitos, en etiquetas masivas, por ejemplo, iCORE. En algunas opciones, la codificación bioquímica de un parámetro de analito, por ejemplo, la presencia de un analito en una muestra o la cantidad de un analito en una muestra, implica poner en contacto la muestra con un agente de unión (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une específicamente al analito y se une a un iCORE; la firma de fragmentación se asigna al analito específico unido por el agente de unión, aislar o enriquecer las moléculas de agente aglutinante que se han unido al analito, opcionalmente, liberar el iCORE de las moléculas de agente de unión aisladas o enriquecidas y someter el iCORE (liberado o no) a un ensayo de EM. En otras opciones, la codificación bioquímica se logra traduciendo un parámetro, por ejemplo, la presencia de un analito en una muestra, o la identidad de una célula o tejido, en una firma iCORE etiquetando la muestra, célula o tejido con un iCORE único, por ejemplo, añadiendo un iCORE a la muestra o uniendo (por ejemplo, de forma covalente mediante un enlazador escindible) un iCORE a una célula o tejido. En algunas opciones, la codificación bioquímica se lleva a cabo para múltiples parámetros en paralelo, por ejemplo, poniendo en contacto una muestra compleja (por ejemplo, una muestra de sangre o tejido) que contiene o se sospecha que contiene una pluralidad de analitos con una pluralidad de iCORE unidos a una pluralidad de agentes de unión, en el que cada agente de unión se une específicamente a un analito diana particular y se conjuga a un iCORE específico con una firma de fragmentación única. Después del aislamiento o enriquecimiento de los aglutinantes unidos al analito y el rescate de los iCORE conjugados de los aglutinantes aislados o enriquecidos, la presencia o ausencia, así como la cantidad relativa o absoluta de los analitos diana, puede determinarse mediante un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo CL EM/EM como se describe con más detalle en otras partes del presente documento.

En la Figura 1 se describe un esquema de una estrategia de codificación bioquímica ilustrativa en la cual la presencia de una pluralidad de analitos en una muestra se traduce en iCORE. En algunas opciones, la traducción de un parámetro en un iCORE comprende una etapa de desconvolución, por ejemplo, una etapa de enriquecimiento de analitos de una muestra biológica compleja. La desconvolución puede aumentar la sensibilidad, especificidad y/o precisión del ensayo. En algunas opciones, una muestra que va a evaluarse se enriquece para un analito al ponerse en contacto con un agente de afinidad que se une al analito, específica o no específicamente, y permite el enriquecimiento del analito, por ejemplo, por separación física del analito unido del material no unido. Un agente de afinidad puede ser un agente que se une de forma no específica al analito basándose en una interacción no específica, por ejemplo, una interacción no específica basada en la carga superficial del analito. Dicha unión no específica normalmente dará como resultado un nivel más bajo de desconvolución de la muestra que el uso de un agente de afinidad que se una específicamente al analito, dado que la unión no específica generalmente no se limita al analito específico, sino que también se extiende a otras moléculas de propiedades fisicoquímicas similares. Alternativamente, un agente de afinidad también puede ser un agente que se une específicamente al analito. Por ejemplo, un agente de afinidad puede ser un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que está inmovilizado en un soporte sólido, tal como una perla o una superficie de membrana. Los soportes sólidos útiles para la separación de materiales unidos a su superficie de muestras biológicas son bien conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a, membranas, resinas, perlas y la superficie de placas, platos y tubos.

En algunas opciones, se pone en contacto una muestra compleja para la desconvolución con un agente de afinidad en condiciones adecuadas para que los agentes de afinidad se unan al analito o analitos. Normalmente, la muestra comprende una fase líquida que se pone en contacto con el agente de afinidad. En algunas opciones, el agente de afinidad, y cualquier analito o analitos unidos a él se retiran posteriormente de la muestra, por ejemplo, por separación física o aspiración de sobrenadante líquido. En algunas opciones, el agente de afinidad se lava después de la separación para retirar el residuo restante de la muestra biológica en el agente de afinidad para una desconvolución adicional.

En algunas opciones de codificación bioquímica de analitos, una muestra se pone en contacto con un agente de afinidad o un conjunto de agentes de afinidad que se unen a un conjunto de analitos de interés, en condiciones adecuadas para que los agentes de afinidad se unan a los analitos respectivos y para que los analitos se inmovilicen en el agente de afinidad. En algunas opciones, la muestra después se desconvoluciona, por ejemplo, lavando cualquier material no unido. En algunas opciones, la muestra, desconvolucionada o no, se pone después en contacto con un conjunto de iCORE conjugados con agentes de unión que se unen específicamente a un grupo de analitos en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a sus respectivos analitos. En algunas opciones, aquellos iCORE conjugados con agentes de unión que realmente se han unido a un analito se aíslan o enriquecen posteriormente, por ejemplo, retirando los iCORE no unidos y los agentes de unión de la muestra. Este conjunto "rescatado" de iCORE representa una codificación bioquímica de los analitos presentes en la muestra. En algunas opciones, los iCORE se conjugan con los agentes de unión mediante un enlazador escindible y el proceso de codificación bioquímica de los analitos en la muestra comprende una etapa de escindir el enlazador y liberar los iCORE de los agentes de unión. En algunas opciones, los iCORE rescatados se someten a un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo CL EM/EM como se describe en el presente documento, para determinar su identidad y/o cantidad, y por tanto la identidad y/o cantidad de los respectivos analitos en la muestra.

Se apreciará, que la traducción para la codificación bioquímica no se limita a los analitos, sino que también puede aplicarse a otros parámetros. Por ejemplo, la tecnología iCORE proporciona una posibilidad de rastrear muestras, células, tejidos, reactivos o moléculas. Como ejemplo de codificación bioquímica con fines de seguimiento, la tecnología iCORE puede usarse para codificar identidades de compuestos de moléculas pequeñas, por ejemplo, en el contexto de tamices de moléculas pequeñas. La codificación bioquímica de identidades de compuestos de moléculas pequeñas es particularmente útil en el contexto de grandes tamices de moléculas pequeñas combinatorios, donde miles, decenas de miles o cientos de miles de combinaciones de moléculas pequeñas pueden seguirse sin los problemas logísticos comúnmente impuestos por tales tamices. En algunas opciones, cada molécula pequeña en dicho tamiz está asociada a un iCORE que tiene una firma de fragmentación única, por ejemplo, sencillamente añadiendo el iCORE a la molécula pequeña, generando de esta manera una composición que comprende el iCORE y la molécula pequeña. En algunas opciones, la composición comprende el iCORE en la molécula pequeña a una relación específica conocida. En algunas opciones, la composición se usa después en un ensayo de selección química combinatoria, por ejemplo, en un ensayo en el cual se prueban múltiples combinaciones de múltiples compuestos de moléculas pequeñas en múltiples proporciones de dilución para determinar el efecto deseado. El efecto deseado puede ser cualquier efecto para el que se estén rastreando actualmente bibliotecas de moléculas pequeñas, incluyendo, pero no limitado a, un efecto biológico, tal como la inducción de la muerte celular en una línea celular cancerosa, la inhibición de la proliferación celular aberrante, la inducción o represión de la expresión de un gen específico, o la inducción de una reprogramación epigenética. Muchos otros efectos deseados para los que pueden seleccionarse bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas serán evidentes para los expertos en la materia y la descripción no está limitada a este respecto.

La codificación bioquímica de cada molécula pequeña con un iCORE único permite la identificación y/o la cuantificación de cada compuesto de molécula pequeña en una mezcla o serie de diluciones de compuestos de molécula pequeña sometiendo la mezcla o dilución a un ensayo de EM. Cualquier iCORE específico detectado en el ensayo de EM puede rastrearse hasta el compuesto de molécula pequeña particular que codifica. Si también se codificó la concentración del compuesto de molécula pequeña, por ejemplo, generando la mezcla original iCORE/compuesto de molécula pequeña usada en el tamiz para comprender una proporción particular de los dos componentes, la intensidad de la señal detectada para el iCORE específico puede usarse para determinar la concentración del compuesto de molécula pequeña en la mezcla o dilución de interés.

Por ejemplo, un ensayo de selección de moléculas pequeñas combinatorias sencillo puede comprender una selección de series de diluciones combinatorias de 10 compuestos de moléculas pequeñas (SMC 1-10) en 10 diluciones diferentes (D 1-10), en el cual todas las posibles mezclas de cualquiera o todos los diez compuestos en se ensayará cualquier posible relación de dilución de los compuestos. Por ejemplo, diez candidatos a fármacos contra el cáncer potencialmente sinérgicos podrían probarse de esta manera para determinar su eficacia para destruir células cancerosas, por ejemplo, para investigar qué combinación de estos candidatos en qué proporción produce la mayor sinergia o el mayor efecto biológico. Incluso un tamiz tan sencillo plantea un desafío logístico significativo en vista de la necesidad de mapear el contenido y las concentraciones de fármaco de varios miles de muestras. La codificación bioquímica de los fármacos candidatos con sólo 10 iCORE (por ejemplo, ICORE G1-10, asignado a CD1-10, respectivamente) elude los problemas asociados a esta empresa logística. Por ejemplo, cada candidato a fármaco podría enriquecerse con uno de los iCORE en una relación específica conocida de candidatos a fármacos e iCORE al comienzo del experimento. La generación de series de diluciones y mezclas de candidatos a fármacos puede llevarse a cabo como de costumbre, pero sin la necesidad de realizar un seguimiento de todas las etapas de pipeteo y del contenido de la muestra resultante. Después de la lectura del tamiz, por ejemplo, después de la detección de una muestra que muestra el efecto biológico deseado, puede obtenerse el sobrenadante de la muestra y someterlo a un ensayo de EM. El ensayo de EM no solo identificará la presencia o ausencia de cada uno de los fármacos candidatos, sino que también puede usarse para determinar las proporciones de los fármacos candidatos identificados que están presentes en la muestra basándose en las proporciones conocidas de iCORE/fármaco candidato en la mezcla enriquecida original al comienzo del experimento.

Por ejemplo, si en el tamiz hipotético descrito anteriormente, el ensayo de EM detectaría la presencia de iCORE 1, 4 y 7 en una proporción de 1:10:2 en una muestra de interés, puede inferirse la presencia de candidatos a fármacos 1, 4 y 7. Además, puede inferirse que el fármaco candidato 1 estaba presente en la concentración más baja (por ejemplo, D10), el fármaco candidato 4 en la concentración más alta (por ejemplo, D1) y el fármaco candidato 7 en la segunda concentración más baja (por ejemplo, D9) de la serie de dilución. Si se conocían las proporciones molares de iCORE y el fármaco candidato en la muestra enriquecida original al comienzo del experimento, una determinación de la concentración de cada fármaco candidato puede ser posible directamente a partir de los datos de EM, sin la necesidad de realizar un seguimiento de las diluciones.

Además de eludir la necesidad de realizar un seguimiento de miles de etapas de pipeteo, el seguimiento de candidatos a fármacos con codificación bioquímica iCORE durante el cribado combinatorio permite una evaluación de las condiciones reales en la muestra de interés, que, por ejemplo, evita resultados erróneos provocados por errores de pipeteo. Los iCORE particulares usados para la codificación bioquímica y el cribado de fármacos deben elegirse para no interferir con el proceso que se está probando. Los péptidos iCORE son adecuados para diversas aplicaciones de codificación bioquímica durante la detección de fármacos, ya que los péptidos son inertes a la mayoría de los procesos bioquímicos. Será evidente para los expertos en la materia, que, dependiendo de la duración y las condiciones encontradas por los iCORE durante el proceso de selección de fármacos, los iCORE útiles tendrán que exhibir suficiente estabilidad para soportar las condiciones encontradas. En algunas opciones, los iCORE peptídicos con estabilidad mejorada se generan usando restos de aminoácidos no naturales y/o péptidos que comprenden enlaces no hidrolizables. Los péptidos que exhiben estabilidad aumentada, por ejemplo, péptidos que comprenden enlaces no hidrolizables, son bien conocidos por los expertos en la materia y el experto en la materia podrá determinar fácilmente los métodos y reactivos para la generación.

En algunas opciones, se proporciona un método para rastrear una célula, población celular, tejido o compuesto mediante codificación bioquímica a través de iCORE. En algunas de estas opciones, el método comprende conjugar un iCORE único a una célula, población celular o tejido, por ejemplo, poniendo en contacto la célula, población celular o tejido con un iCORE en condiciones adecuadas para que el iCORE se una a la célula, población celular o tejido. En algunas opciones, se usa un iCORE unido covalentemente a un agente de unión para lograr esta conjugación. Por ejemplo, en algunas opciones, el iCORE está unido a un agente de unión, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que une específicamente un marcador de superficie, por ejemplo, una proteína de superficie o marcador de polisacárido de la célula, población celular o tejido. En otras opciones, una célula, población celular, tejido o compuesto se pone en contacto con un iCORE que comprende o se conjuga con un resto químico reactivo en condiciones adecuadas para que el resto químico reactivo forme un enlace covalente con un marcador de superficie de la célula, población celular, tejido o con el compuesto. En algunas opciones, el compuesto es un compuesto que se usa en la generación de o puede embeberse en un hidrogel, por ejemplo, un hidrogel de PEG como se describe en la Figura 7. En algunas opciones, el hidrogel se usa en la generación de perlas o en la producción de un andamio para la ingeniería de tejidos, por ejemplo, como sustrato para cultivar tejidos artificiales modificados por ingeniería genética, por ejemplo, órganos modificados por ingeniería genética, tales como micro-hígados. El resultado de este enfoque es la producción de perlas o andamios marcados con iCORE y, si dichos andamios se usan para la generación de órganos modificados por ingeniería genética, órganos etiquetados con iCORE. En algunas opciones, una pluralidad de diferentes esferas u órganos modificados por ingeniería genética con iCORE se someten a diferentes condiciones experimentales, por ejemplo, la exposición a diferentes factores de crecimiento y/o compuestos de moléculas pequeñas, o combinaciones de factores de crecimiento y/o compuestos de moléculas pequeñas en diferentes diluciones, y aquellas perlas u órganos diseñados que exhiben un fenotipo o parámetro deseado al final del experimento se identifican rescatando el etiqueta iCORE de la perla u órgano deseado y sometiéndolo a un ensayo de EM, por ejemplo, un ensayo CL EM/EM.

En algunas opciones, se proporciona un conjunto o biblioteca de iCORE que comprende o está conjugado con un grupo químico reactivo que puede formar un enlace covalente a un péptido. Dichos grupos químicos reactivos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a los grupos químicos reactivos conjugados o comprendidos en etiquetas de masa usados en los ensayos iTRAQ. En algunas opciones, se proporcionan métodos para el uso de tales iCORE de unión a péptidos, por ejemplo para el análisis simultáneo de proteínas en muestras de diferente origen, por ejemplo, muestras de sangre o tejido de diferentes sujetos. En algunas opciones, las muestras de proteínas obtenidas de diferentes sujetos, por ejemplo, de diferentes ratones experimentales o de diferentes biopsias tumorales, se conjugan en un iCORE único cada uno. En algunas opciones, una pluralidad de tales muestras marcadas con iCORE se reúne y se analiza simultáneamente en un ensayo de e M, por ejemplo, un ensayo CL EM/EM. En algunas opciones, los datos obtenidos de tales experimentos proteómicos simultáneos se usan para comparar los niveles de expresión de proteínas en un gran número de muestras, por ejemplo, a través de al menos 10, al menos 15, al menos, 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 150, al menos 200, al menos 250, al menos 500, al menos 750, al menos 1000 o más de 1000 muestras. La gran cantidad de posibles firmas de fragmentación únicas que pueden obtenerse a partir de una única secuencia de bases de iCORE, por ejemplo, de una secuencia de aminoácidos de glu-fib, permite el marcaje único y el posterior análisis simultáneo de tales números de muestra, que está mucho más allá de las capacidades de multiplexación de las tecnologías actualmente disponibles, por ejemplo, iTRAQ.

Algunos aspectos de esta divulgación proporcionan ensayos de diagnóstico multiplexados que usan tecnología iCORE. Actualmente, se conocen muchos biomarcadores moleculares que se correlacionan con, y, por lo tanto, son indicativos de una enfermedad o afección en un sujeto. Por ejemplo, se ha informado de una gran cantidad de biomarcadores moleculares para enfermedades tales como cáncer, enfermedad infecciosa, enfermedad cardiovascular, enfermedad renal, enfermedad autoinmunitaria, estados tóxicos y para la detección de determinados efectos secundarios de los fármacos. Los ensayos de diagnóstico actuales generalmente se enfocan en uno o solo unos pocos biomarcadores para detectar una enfermedad o afección específica. Por ejemplo, algunos cánceres, tales como el cáncer de próstata y de ovario, se controlan mediante el uso de biomarcadores únicos en la sangre de sujetos diagnosticados o sospechosos de tener dicho cáncer. Se logran tales técnicas de diagnóstico, por ejemplo, usando detección de fluorescencia de marcadores moleculares que se activan en un estado de enfermedad particular. Otras técnicas de diagnóstico para monitorizar moléculas incluyen el uso de matrices de genes para estratificar a los pacientes con cáncer de mama mediante firmas únicas (Sotiriou C., Piccart, M.J., Taking geneexpression profiling to the clinic: when will molecular signatures become relevant to patient care?, Nat. Rev. Cancer, 7, 534-553, 2007) y la secuenciación de mutaciones de genes diana para descubrir las lesiones moleculares que predicen la respuesta del glioblastoma a los inhibidores de la quinasa EGFR (Mellinghoff, I. et al., Molecular Determinants of the response of glioblastomas to EGFR Kinase Inhibitors, NEJM, 353, 16, 2005).

Algunos de los reactivos y métodos para la detección y cuantificación de analitos múltiplex en muestras complejas, por ejemplo, en una muestra de tejido o fluido corporal obtenida de un sujeto, permiten la evaluación sensible y precisa de múltiples biomarcadores simultáneamente, proporcionando de esta manera una vía para la generación de perfiles de biomarcadores multiparamétricos clínicamente relevantes de una sola enfermedad o afección o de una pluralidad de enfermedades o afecciones a partir de dicha muestra.

En algunas opciones, la tecnología iCORE como se describe en el presente documento se usa para evaluar una pluralidad de biomarcadores, por ejemplo, la presencia o ausencia o la cantidad de un analito en una muestra biológica obtenida de un sujeto, tal como un fluido corporal (por ejemplo sangre, suero, orina, líquido cefalorraquídeo o linfa) o tejido (por ejemplo, tejido tumoral, maligno, neoplásico, hiperplásico, de hígado, de riñón, de pulmón, de músculo, de ganglio linfático o de cerebro). En algunas opciones, la pluralidad de biomarcadores comprende un panel de biomarcadores que se sabe que están asociados a una enfermedad o afección particular.

En algunas opciones, se proporciona un método de diagnóstico iCORE. En algunas opciones, el método comprende obtener una muestra de un sujeto. En algunas opciones, el sujeto es un sujeto humano. En algunas opciones, el sujeto es un mamífero no humano. En algunas opciones, el método comprende una etapa de desconvolución en la cual los analitos diana se aíslan o se enriquecen, por ejemplo, mediante un método de desconvolución como se describe en otras partes del presente documento. En algunas opciones, el método comprende poner en contacto la muestra, ya sea desconvolucionada o no, con un conjunto o biblioteca de iCORE conjugados a un conjunto de agentes de unión que se unen específicamente a los analitos diana, como se describe en el presente documento, en condiciones adecuadas para que los agentes de unión conjugados con iCORE se unan a sus respectivos ligandos diana. En algunas opciones, el método comprende una etapa de aislamiento o enriquecimiento de los agentes de unión conjugados con iCORE unidos, por ejemplo, lavando los agentes de unión no unidos. En algunas opciones, el método comprende rescatar los iCORE conjugados con los agentes de unión que se unen al analito, por ejemplo, por escisión de un enlazador que conecta los iCORE a los agentes de unión, como se describe en otras partes del presente documento. En algunas opciones, el método comprende someter los iCORE rescatados a un ensayo EM/EM, por ejemplo, un ensayo e M/EM como se describe en el presente documento. En algunas opciones, el método comprende además determinar la señal obtenida de cada iCORE específico en la muestra basándose en los resultados del ensayo EM/EM. En algunas opciones, el método comprende determinar la presencia o ausencia del analito representado o identificado por el iCORE específico basándose en si se obtuvo o no una señal en el ensayo EM/EM que identificó el iCORE específico. En algunas opciones, el método comprende cuantificar la cantidad o concentración del analito en la muestra, o en relación con la cantidad o concentración de otros analitos en la muestra, o en relación con la cantidad o concentración del mismo analito en una muestra diferente, por ejemplo, una muestra de referencia o de control, cuantificando la señal obtenida del iCORE específico en el ensayo EM/e M.

En algunas opciones, la evaluación de múltiples biomarcadores en un único ensayo de diagnóstico aumenta la especificidad, sensibilidad y/o precisión de la evaluación de los biomarcadores y/o el diagnóstico inferido del ensayo. En algunas opciones, el ensayo iCORE EM/EM también comprende la evaluación de un marcador de control, por ejemplo, de un analito o un conjunto de analitos que se sabe que son prácticamente constantes en estados sanos y enfermos o en individuos. Hay muchos biomarcadores de proteínas presentes en la sangre que son útiles para la evaluación mediante análisis iCORE EM/EM. Por ejemplo, en determinadas opciones para el cáncer de ovario, pueden monitorizarse 5-20 biomarcadores de proteínas o péptidos (véase, por ejemplo, Petricoin, E., et. Al., Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer, Lancet, 359, 572, 2002). Las citocinas séricas, de las cuales IFN-gamma y TNF-alfa se clasifican normalmente, incluyendo, pero no limitado a, IL-1, 11-2, 11-4, 11-5, 11-6, 11-10, 11-12, 11-13, 11-17, 11-21, 11-23, MCP-1, TGF-beta, TNF-beta, TWEAK, GM-CSF y Granzima B, son útiles para monitorizar los procesos inflamatorios implicados en el cáncer, así como las respuestas del hospedador a las vacunas y enfermedades infecciosas. Resultará evidente para los expertos en la materia que los biomarcadores descritos en el presente documento son solo para ilustración y no pretenden limitar la divulgación a este respecto. Cualquier biomarcador, y en especial, cualquier biomarcador de péptidos o proteínas puede evaluarse mediante los ensayos iCORE EM/EM proporcionados en el presente documento, y la divulgación no está limitada a este respecto. En algunas opciones, la tecnología iCORE se usa en el contexto de la medicina personalizada. Por ejemplo, en algunas opciones, una intervención clínica, por ejemplo, un fármaco, un programa de tratamiento o una intervención quirúrgica, se elige de un grupo de tales intervenciones, basándose en los resultados de un ensayo iCORE realizado en una muestra obtenida del sujeto, por ejemplo, una muestra de sangre o tejido evaluada para un conjunto de biomarcadores, o basada en firmas de actividad enzimática o analito producidas a partir de un ensayo iCORE in vivo, por los métodos descritos en el presente documento.

En algunas opciones, la tecnología iCORE se usa para monitorizar la respuesta de un sujeto a un tratamiento. Por ejemplo, en algunas opciones, los ensayos iCORE se realizan repetidamente durante el tratamiento de un sujeto enfermo, por ejemplo, para determinar si los biomarcadores evaluados se acercan a los valores deseados, por ejemplo, valores normalmente asociados a un estado de salud. En algunas opciones, un régimen de tratamiento puede ajustarse en función de los resultados de un ensayo iCORE realizado durante el curso del tratamiento, por ejemplo, para aumentar la efectividad del tratamiento o para disminuir la dosificación de un fármaco usado a la dosis mínima eficaz para evitar efectos secundarios no deseados.

En algunas opciones, la tecnología iCORE se usa en ensayos clínicos de fármacos nuevos y candidatos a fármacos. La tecnología Multiplex iCORE permite la evaluación de varios de biomarcadores asociados a enfermedades y, en algunas opciones, también para la monitorización de una pluralidad de parámetros básicos, por ejemplo, colesterol en sangre, triacilglicéridos en sangre, cuerpos cetónicos, etcétera, en un sujeto durante un ensayo clínico. Esto permite la monitorización integral de múltiples rutas metabólicas durante un ensayo clínico y la detección de efectos secundarios que pueden ser asintomáticos durante el ensayo.

Los expertos en la materia conocen bien los ensayos de espectrometría de masas (EM). Son de uso particular en el contexto de algunas opciones de la tecnología iCORE y la codificación bioquímica descritas en el presente documento los ensayos de espectrometría de masas en tándem (EM/EM).

La espectrometría de masas en tándem (EM/EM) se usa para producir información estructural sobre un compuesto fragmentando iones de muestra específicos dentro del espectrómetro de masas e identificando los iones de fragmentos resultantes. La espectrometría de masas en tándem permite detectar iCORE específicos en mezclas complejas de iCORE, por ejemplo, en conjuntos complejos o bibliotecas de iCORE debido a su firma de fragmentación única, lo que da como resultado un patrón de fragmentación específico y característico.

Los ensayos de EM/EM normalmente comprenden dos o más etapas de EM con alguna forma de fragmentación que tiene lugar entre las etapas. Un espectrómetro de masas en tándem generalmente comprende más de un analizador, por ejemplo, dos analizadores. En algunas opciones, los analizadores están separados por una célula de colisión en la que se admite que un gas inerte (por ejemplo, argón, xenón) colisione con los iones de muestra seleccionados y provoque su fragmentación. Sin embargo, algunos ensayos de EM/EM también pueden llevarse a cabo en ciertos espectrómetros de masas de un solo analizador, como trampas de iones e instrumentos de tiempo de vuelo, por ejemplo, mediante el uso de un experimento de desintegración posterior a la fuente para efectuar la fragmentación de los iones de muestra.

En algunas opciones, debido a que se conocen tanto las masas del péptido original como los iones informadores de los iCORE individuales, la detección y cuantificación de los iCORE en una muestra compleja puede lograrse mediante la monitorización de reacción seleccionada (SRM), también conocida como monitorización de reacciones múltiples (MRM) (véase, por ejemplo, Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R., Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial, Molecular Systems Biology 4:222, 2008). Un experimento de SRM típico está habilitado por la capacidad única de un EM de triple cuadrupolo (QQQ) para análisis cuantitativo en el que el primer y tercer cuadrupolo actúan como filtros para seleccionar específicamente valores m/z predefinidos correspondientes al ion peptídico y un ion de fragmento específico del péptido.

Por ejemplo, en algunas opciones, para iCORE basados en la biblioteca iCORE de 10-plex glu-fib (G10), el primer cuadrupolo sirve para recoger el péptido Glu-fib parental (por ejemplo, 789,85 m/z doblemente cargado), los fragmentos del segundo cuadrupolo, mientras que el tercer cuadrupolo actúa para filtrar un ion informador individual (por ejemplo, 683,3 m/z) (Figura 14). En algunas opciones, tales 'transiciones' de iones precursores/fragmentos (por ejemplo, 789,85 a 683,3 m/z) se monitorizan a lo largo del tiempo, lo que da como resultado una alta selectividad y sensibilidad, ya que los iones de fondo que coeluyen se filtran eficazmente con este enfoque.

En algunas opciones de QQQ, a diferencia de otras técnicas de EM (por ejemplo, Q-TOF), no se registran espectros de masas completos y la naturaleza de no exploración del análisis QQQ se traduce en un aumento de 1-2 órdenes de magnitud en la sensibilidad en comparación con las técnicas de exploración completa. Debido a que el usuario puede incorporar de forma selectiva aminoácidos isotópicos para generar iones de fragmentos únicos con codificación iCORE, pueden diseñarse múltiples transiciones de iones precursores/fragmentos únicos en una familia de iCORE. Por ejemplo, en la Figura 2 y 3, las transiciones se definen desde el péptido precursor a la familia y7 de iones de fragmentos, mientras que en la Figura 13c, d, e y la Figura 14, las transiciones se definen desde el péptido precursor a la familia y6 de iones de fragmentos.

En algunas opciones, el primer analizador se usa para seleccionar iones de muestra especificados por el usuario que surgen de un iCORE en particular. Estos iones iCORE elegidos, por ejemplo, los iones de los glu-fib iCORE descritos en el presente documento, pasan a la célula de colisión, se bombardean por las moléculas de gas que provocan la formación de iones de fragmentos y estos iones de fragmentos se separan luego de acuerdo con sus relaciones de masa a carga, por el segundo analizador. Los iones del fragmento surgen directamente de los iones iCORE parentales y, por lo tanto, producen un patrón de huellas dactilares específico para el compuesto que se investiga. (Véase la Figura 3 I. para los datos obtenidos en la primera ronda de EM de una biblioteca de glu-fib iCORE; y Figura 3 II. para los datos obtenidos en la segunda ronda (después de la fragmentación) de la misma biblioteca).

En algunas opciones, el primer analizador permite la transmisión de todos los iones iCORE, mientras que el segundo analizador está configurado para monitorizar iones de fragmentos iCORE específicos, por ejemplo, los iones glu-fib iCORE y7, como se describe en las Figuras 2 y 3, que se generan por el bombardeo de los iones de muestra con el gas de colisión en la celda de colisión. Esta estrategia es particularmente útil en opciones, donde se utiliza un conjunto de iCORE isobáricos, cuyo fragmento produce iones distintos, pero similares. El uso de esta estrategia permite monitorizar solo la parte del espectro que abarca las masas particulares de los iones iCORE, por ejemplo, el espectro de aproximadamente 812 a aproximadamente 822 Da en el ejemplo usando iCORE G1-G10 como se describe en la Figura 3. Esto, a su vez, permite una reducción drástica en el tiempo de escaneo, porque el resto del espectro puede ignorarse.

En algunas opciones, ambos analizadores son estáticos y solo los iones parentales específicos se transmiten a través del primer analizador y el segundo analizador solo mide los fragmentos específicos que surgen de estos iones parentales. Las propiedades de los iones parentales de cualquier iCORE proporcionado en el presente documento pueden calcularse de acuerdo con métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Adicionalmente, cualquier iCORE puede probarse para determinar su firma específica de ionización y fragmentación en una ejecución de prueba EM/EM. Dado que la estructura y el comportamiento de EM/EM de cada iCORE se conocen o pueden calcularse o establecerse fácilmente, este tipo de ensayo EM/EM puede emplearse para determinar la presencia o ausencia de un ion iCORE específico en una matriz o iones de fragmentos, por ejemplo, una matriz de iones de fragmentos que se originan a partir de una biblioteca iCORE isobárica compleja en un ensayo iCORE multiplex como se proporciona por los aspectos de esta divulgación.

En algunas opciones, se proporcionan iCORE peptídicos, conjuntos o bibliotecas de iCORE peptídicos y métodos para el uso de péptidos iCORE. Es sabido por los expertos en la materia que los péptidos se fragmentan de una manera razonablemente bien documentada en ensayos de EM/EM (véanse, por ejemplo, P. Roepstorrf, J. Fohlmann, Biomed. Mass Spectrom., 1984, 11, 601; y R. S. Johnson, K. Biemann, Biomed. Environ. Mass Spectrom., 1989, 18, 945). En algunas opciones, los péptidos se fragmentan a lo largo de la estructura principal del péptido (véase, por ejemplo, A. E. Ashcroft, P. J. Derrick en "Mass Spectrometry of Peptides" ed. D. M. Desiderio, ^c R^c Press, Florida, 1990).

Hay tres tipos diferentes de enlaces que pueden fragmentarse a lo largo de la cadena principal de aminoácidos: los enlaces NH-CH, CH- CO y CO-NH. Cada rotura de enlace da lugar a dos especies, una neutra y la otra cargada, y el espectrómetro de masas solo monitoriza las especies cargadas. La carga puede permanecer en cualquiera de los dos fragmentos dependiendo de la química y la afinidad relativa del protón de las dos especies. Por lo tanto, hay seis posibles iones de fragmentos para cada residuo de aminoácido y estos están marcados como iones a, b y c, e iones x, y y z, teniendo los iones a, b y c la carga retenida en el fragmento N-terminal y teniendo los iones x, y y z tienen la carga retenida en el fragmento C-terminal. La fragmentación más común se produce en los enlaces CO-NH de la estructura principal del péptido, que da lugar a los iones b y/o y. La Figura 2 muestra una nomenclatura ilustrativa de 13 iones y que se originan a partir de una secuencia de glufib iCORE parental. Dado que la diferencia de masa de los iones de fragmentos adyacentes se correlaciona con la masa del resto de aminoácido respectivo que falta en el ion más corto, por ejemplo, la diferencia en la masa de los iones yg e y-10 es la masa del resto D presente en el ion y-i0 pero no en el y9, pueden identificarse los picos que representan cada ion y. En el ejemplo de experimento EM/EM mostrado en la Figura 2, los iones y y3 - y-n podrían identificarse sin ambigüedades.

En la Figura 3 se ilustra un ejemplo de un espectro EM/EM obtenido a partir de un conjunto de 10 iCORE isobáricos. La primera ronda de ES generó un solo pico, consistente con el carácter isobárico de los iCORE (Figura 3 I.). Los iones iCORE se fragmentaron y el tamaño de los fragmentos se analizó mediante el segundo analizador para producir el espectro EM/EM representado en la Figura 3. II.). Los iCORE fragmentados predominantemente en los iones y de enlaces CO-NH iones y3 - y-n podrían identificarse sin ambigüedades. Un primer plano de la región que abarca la masa de los posibles iones y7 muestra que los diez iCORE se detectaron con una intensidad de señal muy similar, lo que indica que todos los iones de los fragmentos estaban presentes aproximadamente a la misma concentración. Esto indica que no hay sesgo de fragmentación en iCORE de firma de fragmentación diferente, lo que permite que la tecnología iCORE se use en ensayos sensibles EM/EM de cuantificación de analitos.

En algunas opciones, los iCORE son polinucleótidos o polisacáridos. Los ensayos basados en EM/EM, la identificación de oligonucleótidos y fragmentos de oligosacáridos son bien conocidos por los expertos en la materia y son similares a los usados en los ensayos de péptidos EM/EM. Para obtener una descripción general de los ensayos EM/EM útiles para la detección y/o cuantificación de iCORE proporcionados en el presente documento, por ejemplo, de iCORE peptídicos, de oligonucleótidos y/o de oligosacáridos, véanse, por ejemplo, S. Pomerantz, J. A. Kowalak, J. A. McClosky, J. Amer. Soc. Mass Spectrom., 1993, 4, 204; "An Introduction to Biological Mass Spectrometry", C. Dass, Wiley, E^e .UU., 2002; "The Expanding Role of Mass Spectrometry in Biotechnology", G. Siuzdak, MCC Press, San Diego, 2004; "Ionization Methods in Organic Mass Spectrometry", A.E. Ashcroft, Analytical Monograph, Royal Society of Chemistry, RU, 1997; www.astbury.leeds.ac.uk (A.E. Páginas web y tutorial de Ashcroft para e M); Capítulo 9, páginas 415-452 de "Mass Spectrometry: A Textbook" por Jürgen H. Gross, Springer; 2a ed. edición (1 de marzo de 2011), ISBN-10: 9783642107092; Patente de EE.UU. N.° 5.885.775; Patente de EE.UU. N.° 7.412.332; Patente de EE.UU. N.° 6.597.996; y "Mass Spectrometry: Clinical and Biomedical Applications Volume 1 (Modern Analytical Chemistry)" por Dominic M. Desiderio, Springer; 1 edición (31 de enero de 1993), ISBN-13: 978­ 3642107092.

Algunos aspectos de esta divulgación proporcionan kits de reactivos útiles para realizar ensayos de EM basados en iCORE. Normalmente, un kit comprende un recipiente que contiene un reactivo iCORE, o un conjunto o biblioteca de dichos reactivos, como se describe en el presente documento. En algunas opciones, un kit también incluye instrucciones o marcadores que describen el uso de los reactivos iCORE.

En algunas opciones, los reactivos iCORE descritos en el presente documento, por ejemplo, iCORE conjugados con un resto químico reactivo, o iCORE conjugados con un agente de unión que se une específicamente a un ligando diana, o conjuntos o bibliotecas de dichos reactivos iCORE, se ensamblan en kits para aplicaciones clínicas y/o de investigación. Un kit puede diseñarse para facilitar el uso de los métodos descritos en el presente documento por médicos y/o investigadores y puede tomar muchas formas. Cada uno de los reactivos iCORE incluidos en el kit, cuando sea aplicable, puede proporcionarse en forma líquida (por ejemplo, en solución) o en forma sólida, (por ejemplo, un polvo seco). Un kit puede tener diversas formas, tales como una bolsa tipo blíster, una bolsa de envuelta retráctil, una bolsa sellable al vacío, una bandeja termoformada sellable, o una forma de bolsa o bandeja similar, con los accesorios empaquetados libremente dentro de la bolsa, uno o más tubos, recipientes, una caja o una bolsa. En algunas opciones, un kit que comprende reactivos iCORE como se proporciona en el presente documento comprende además componentes adicionales que son útiles para realizar los ensayos basados en iCORE proporcionados en el presente documento. Dichos componentes adicionales pueden incluir, pero no se limitan a reactivos de desconvolución (por ejemplo, agentes de unión que se unen específicamente al conjunto de analitos a los que se dirigen los reactivos iCORE incluidos en el kit, por ejemplo, inmovilizados a un soporte sólido, tales como perlas (por ejemplo, perlas magnéticas), una membrana, portaobjetos de vidrio, resina o superficie del recipiente de plástico), tampones (por ejemplo, tampones de lavado, tampones de unión) y enzimas (por ejemplo, proteasas que cortan un enlazador escindible que conecta iCORE con reactivos de unión).

Ejemplos

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Síntesis de péptidos y Ab-péptidos. Todos los péptidos fueron sintetizados por química Fmoc internamente por la instalación de biopolímeros en el Swanson Biotechnology Center (MIT). Los aminoácidos marcados con isótopos se adquirieron de Cambridge Isotopes. El enlazador fotosensible (ácido 3-Na-Fmoc-Amino-3-(2-nitrofenil)propiónico) se adquirió de Advanced Chemtech. Los anticuerpos de detección contra IFN-gamma y TNF-alfa humanos (eBioscience, clones 4S.B3 y Mab11) se hicieron reaccionar primero con SIA (Pierce) en una relación molar de 50:1. Tras la retirada del exceso de SIA, los péptidos se incubaron con Ab en una proporción molar de 20:1. Los péptidos en exceso se retiraron mediante filtros giratorios de filtración por tamaños (30k mwco, Amicon).

Síntesis de ab-perla. Se hicieron reaccionar perlas magnéticas activadas por tosilo (Myone, Invitrogen) con IFN-gamma antihumano y TNF-alfa antihumano (eBioscience, clones NIB42 y Mab1 respectivamente) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, 1 mg de cualquiera de los anticuerpos se intercambió con tampón en tampón borato (borato sódico 0,1 M, pH 9,0) antes de la incubación con las perlas en tampón de conjugación (Borato 0,1 M, sulfato de amonio 1 M, pH 9,0). Después de la incubación durante la noche a 37 °C, los grupos tosilo restantes se saturaron incubando las perlas en tris 1 M. Las perlas marcadas con Ab se almacenaron en PBS antes de los experimentos.

Ensayos en suero. Se añadió IFN-gamma humano recombinante (eBioscience) en suero bovino al 10% en PBS. Esta solución se incubó después con perlas anti-IFN-gamma durante 1 hora a 37 °C. Las perlas se lavaron después dos veces con PBS antes de la incubación con una solución equimolar de IFN-g y TNF-a marcados con iCORE durante otra hora a 37 °C. Después de que los anticuerpos en exceso se retiraran mediante lavado con BSA PBS al 0. 1 %, los antígenos y anticuerpos unidos se eluyeron en ácido acético al 5 %. A continuación, la solución se expuso a luz UV (365 nm) durante 30 min (CL-1000, UVP) para liberar los códigos iCORE fotoactivados en solución. La muestra se analizó después mediante CL EM/EM.

Síntesis de nanomateriales. Los nano gusanos se sintetizaron de acuerdo con protocolos previamente publicados.25 Los péptidos se sintetizaron en el MIT (Swanson Biotechnology Center); los aminoácidos Fmoc marcados isotópicamente se adquirieron de Cambridge Isotopes y el ácido 3-Na-Fmoc-Amino-3-(2-nitrofenil) propiónico de Advanced Chemtech. Los NW terminados en amina se hicieron reaccionar primero con Vivotag 680 (Perkin Elmer) para permitir la formación de imágenes in vivo, antes de reaccionar con SIA (Pierce) para introducir mangos reactivos con sulfhidrilo. A continuación, se mezclaron péptidos de cisteína y PEG-SH con NW durante la noche a temperatura ambiente (relación molar 95:20:1 respectivamente) y los péptidos en exceso se retiraron mediante filtración por tamaños. Las soluciones madre de péptido-NW se almacenaron en PBS a 4 °C.

Ensayos de proteasa in vitro. Para cribado de sustrato, los Fl-péptido-NW (2,5 pM por péptido) se mezclaron con MMP-2/8/9 recombinante (R&D Systems), MMP-7/14 (AnaSpec, Inc.), Trombina, Factor tisular, Factor Xa o Catepsina B (Haematologic Technologies, Inc.) en una placa de 96 pocillos a 37 °C en tampones de actividad de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se monitorizaron con un lector de microplacas (SpectroMax Gemini EM). Para análisis EM, los NW codificados por iCORE equimolares (Tabla) se incubaron con proteasas durante 2,5 horas a 37 °C. Los fragmentos de escisión se purificaron a partir de NW mediante filtración por tamaños antes del tratamiento con UV (365 nm, reticulante UV CL-1000, UVP). Los indicadores se secaron después mediante una centrifugadora de vacío rápida y se almacenaron a 4 °C.

Formación de imágenes in vivo. Todo el trabajo con animales fue aprobado por el comité de cuidado animal (MIT, protocolo n.° 0408-038-11). Se alimentaron ratones FVB/NJ (Jackson Labs) con pienso para roedores DDC (Sigma) al 0,1 % p/p durante tres semanas (Research Diets). Los animales fibróticos y de control de la edad se infundieron 1. v. con reactivos marcados con VivoTag-680 y se visualizaron mediante formación de imágenes IVIS (Xenogen). Para xenoinjertos de tumores, las líneas de células cancerosas LS 174T se mantuvieron en FBS EMEM al 10 % y se inocularon s.c. (5x106/flanco) en ratones NU/NU (Charles River) antes de la formación de imágenes.

Caracterización de modelos. Para la zimografía in situ, las secciones fibróticas se cubrieron con 90 pl de solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5 % p/v (Sigma) en tampón de activación MMP (Tris 50 mM, NaCl 150, CaCl2 5 mM, Brij 35 al 0,025 %, pH 7,5) con 10 pl de DQ-gelation (1 mg/ml, Invitrogen) y colorante Hoechst a 37 °C. Los cortes se solidificaron a 4 °C y luego se incubaron a temperatura ambiente durante la noche para promover la proteólisis de gelificación por las proteasas tisulares. Para cuantificar el colágeno hepático, el tejido de los lóbulos derecho e izquierdo (250-300 mg) se hidrolizó en 5 ml de HCl 6 N a 110 °C durante 16 horas seguido de cuantificación de hidroxiprolina como se describió previamente.43 Para cuantificar CEA, se recogió sangre de animales con tumor en microtubos Capiject (Terumo) para aislar el suero antes del análisis ELISA (Calbiotech). Para análisis de inmunofluorescencia, se administraron cócteles NW equimolares (5 pM/péptido) en ratones desnudos FVB/NJ fibróticos o portadores de tumores. Después de la perfusión, los hígados o los tumores se fijaron en PFA al 4 %, se congelaron para seccionar y se tiñeron para F4/80 (AbD Serotec), MMP-9 (R&D Biosystems), CD31 (Santa Cruz Biotechnologies) y/o FITC (Genetex) antes de analizarse por microscopía de fluorescencia (Nikon Eclipse Ti). Recolección de péptidos urinarios. Los ratones se infundieron por vía intravenosa con 200 pl de PBS que contenían cócteles de NW equimolares (5 pM por péptido) con comprimidos inhibidores de proteasa sin EDTA (Roche) para aislar la actividad de MMP. Los ratones se colocaron sobre placas de 96 pocillos rodeadas de manguitos cilíndricos para la recogida de orina. Para evitar una degradación adicional del indicador, las muestras evacuadas se enriquecieron con EDTA+ inhibidores de proteasa completos (Roche) inmediatamente después de la recolección. Para cuantificar la fluorescencia urinaria, se incubaron 2 pl de cada muestra con perlas magnéticas (Dynal) recubiertas con anticuerpos a-FITC (Genetex) en 50 pl de tampón de unión (NH4OAc 100 nM, CHAPS al 0,01 %) durante 1 h a 37 °C, se lavaron dos veces con NH4OAc 100 mM y se eluyeron dos veces con 15 pl de ácido acético al 5 %. Las muestras se neutralizaron con Tris 2 M y se cuantificaron mediante fluorimetría en microplacas. Para el análisis iCORE, las muestras se irradiaron con UV durante 30 min antes de la precipitación con TCA (20 % del volumen final) para retirar las proteínas. Se aplicaron fracciones solubles a columnas de fase inversa C18 (Grupo Nest) y se eluyeron mediante gradientes escalonados de incrementos del 20 % de ACN en ácido fórmico al 0,1 %. Se recogieron fracciones de ACN al 60 % que contenían péptidos Glu-fib y se secaron mediante centrifugación al vacío.

Análisis CL EM/EM. Las muestras de péptidos se reconstituyeron en ACN al 5%, ácido fórmico al 0,1 % y se analizaron en el MIT o en las instalaciones de Taplin MS (Harvard Medical School). En el MIT, los péptidos se capturaron y se eluyeron de una columna de HPLC de nanoflujo C18 (75 |jm de diámetro interno Magic C18 AQ, Michrom BioResources, Inc.) a un caudal de 300 nl/min usando un sistema disolvente de agua-acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 %. La espectrometría de masas ESI se llevó a cabo en un espectrómetro de masas QSTAR Elite QTOF (AB Sciex). En Harvard, las muestras se reconstituyen en ACN al 2,5 %, ácido fórmico al 0,1 %. Las muestras se inyectan usando un muestreador automático Famos (LC Packings) en un HPLC Agilent 1100 antes del análisis de masas en un LTQ-Orbitrap (Thermo Electron). Para tener en cuenta las discrepancias en los volúmenes y la concentración de orina, las intensidades máximas de los indicadores individuales se escalaron en relación con su respectiva corriente de iones iCORE total antes de la normalización frente a las muestras de control para tener en cuenta las variaciones técnicas y relacionadas con la edad.

Análisis estadísticos. Los coeficientes de correlación de Pearson entre diferentes perfiles de proteasa se calcularon con MatLAB. Los análisis ANOVA se calcularon con GraphPad 5.0 (Prism). Para análisis ROC, las funciones de puntuación de riesgo se estimaron primero mediante regresión logística de biomarcadores individuales, seguida de análisis de curvas ROC de combinaciones de biomarcadores o de biomarcadores únicos (SigmaPlot).

Ejemplo 2: Detección de TNF-alfa e IFN-gamma en una muestra líquida

Se preparó una muestra líquida que comprendía IFN-gamma humano recombinante mezclado con suero bovino al 10% para simular una muestra biológica compleja. Como se muestra en la Figura 1a, la muestra se desconvolucionó primero poniendo en contacto la muestra con anticuerpos conjugados a la superficie de las perlas. La unión específica a anticuerpos anti-TNF-alfa humano y anti-IFN-gamma humano unidos a la superficie de las perlas dio como resultado la inmovilización del analito diana IFN-gamma en la superficie de la perla. Las perlas se separaron después de la muestra líquida mediante un imán para retirar la fase líquida y cualquier material no unido comprendido en cualquier residuo de muestra que quedara en las perlas se lavó de las perlas lavando las perlas con un tampón de lavado. Los analitos inmovilizados unidos a los agentes de unión sobre la superficie de las perlas se pusieron en contacto después con otro conjunto de anticuerpos contra TNF-a e IFN-g que se conjugaron a un conjunto de iCORE a través de un enlazador fotoescindible (dE-+3G-+6V-dN-dD-dN-dE-dE-G-F-F-dS-A-dR-(ANP)-K(FAM)-G-G-C (SEQ ID NO: 37), dE-+2G-+6V-dN-dD-dN-dE-dE-G-F-F-dS-+1A-dR-(ANP)-K(FAM)-G-G-C (SEQ ID NO: 37), respectivamente).

En este experimento, el conjunto comprendía dos anticuerpos, uno que se une específicamente a IFN-gamma y el otro que se une específicamente a TNF-alfa. Ambos anticuerpos se conjugaron con iCORE isobáricos, teniendo los iCORE unidos a los anticuerpos que se unen al IFN-gamma una firma de fragmentación diferente a la de los iCORE unidos a los anticuerpos que se unen al TNF-alfa. Cualquier anticuerpo sin unir se retiró después de las perlas lavando las perlas con tampón de lavado. Las perlas se incubaron después en una solución de separación para eluir el material unido y la solución resultante se recogió tras la retirada de las perlas con un imán. A continuación, los enlazadores fotoescindibles se escindieron mediante exposición a luz UV. Los iCORE rescatados de esta manera se sometieron después a un ensayo CL EM/EM. La Figura 1b muestra los picos resultantes de la segunda ronda de EM (después de la fragmentación). El analito diana IFN-gamma se detectó en la muestra mientras que los niveles endógenos de TNF-alfa, o la unión no específica contribuyeron al primer pico. Debido a que los iCORE eran isobáricos, la intensidad de la señal de cada iCORE puede traducirse directamente en una abundancia relativa del analito diana. En consecuencia, el IFN-gamma fue mucho más abundante que el TNF-alfa en la muestra analizada, lo que representa una señal robusta a ruido de aproximadamente 10.

Ejemplo 3: Utilización de un pico canónico de espectros Glu-Fib EM/EM como un indicador

Se evaluó la utilidad de Glu-fib como secuencia de bases para la generación de una biblioteca iCORE isobárica. Glufib es un péptido de 13 aminoácidos de la secuencia EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1). El espectro de fragmentación resultante de la disociación inducida por colisión da como resultado la generación de iones de tipo y. La Figura 2 es un espectro típico para ilustrar los iones de tipo y resultantes (y1-y13) y sus intensidades relativas. La propensión de glu-fib a fragmentarse a lo largo de determinados enlaces peptídicos se aprovechó para construir 10 códigos de masa centrados en el ion "indicador" y7 (EGFFSAR (SEQ ID NO: 6)) enriqueciendo la secuencia truncada con aminoácidos pesados para producir variantes diferenciadas por 1 Da cada una. Este desplazamiento de masa introducido se compensa después mediante el enriquecimiento de isótopos dentro del fragmento de "equilibrio" (EGVNDNE (SEQ ID NO: 7)). Como resultado, cada péptido se caracteriza por una masa nominal idéntica y un ion de fragmento y7 distinto. Por lo tanto, este conjunto de iCORE es isobárico, con una masa parental compartida de 1579,68 Da. La masa del fragmento b7 (equilibrio) se calculó para cada equilibrio como Mb7(i) = (Mb7 n)-i y la masa de cada fragmento y7 como My7(i) = (My7+i), con Mb7 =767,3 y My7 = 812,38. Las masas calculadas de cuatro iCORE del conjunto se dan en la tabla en la parte inferior derecha de la Figura 2. A continuación, el conjunto de iCORE isobáricos se sometió a un ensayo EM/EM. Los datos obtenidos se muestran en el gráfico EM/EM de la Figura 3.

Ejemplo 4: Datos EM/EM de bibliotecas iCORE isobáricas

Una biblioteca de 10-plex de glu-fib iCORE se sometió a un ensayo EM/EM. Los resultados se representan en la Figura 3. El panel superior de la figura proporciona las secuencias y firmas de fragmentación de los iCORE en el conjunto (ícOr E G1, G2, G3, G4, G5, g6, G7, G8, G9 y G10). El panel superior también muestra el cromatógrafo de iones extraído obtenido de la biblioteca iCORE de 10-plex (G1-G10) después de la primera ronda de EM. Solo se observó un pico (m/z = 789,7-790,0). En consecuencia, cada iCORE es una masa indistinguible del conjunto multiplexado, así como indiferenciable por cromatografía, que, en algunas opciones, es beneficioso para la cuantificación, lo cual es consistente con los cálculos del Ejemplo 3. El panel central de la Figura 3 muestra los resultados de EM/EM después de la fragmentación del pico observado en el panel superior. Los resultados demuestran que, también consistente con las observaciones del Ejemplo 3, los iones y y3-yn podrían identificarse. Lo más importante, la magnificación de la ventana m/z alrededor de los valores m/z predichos de los iones y7 de fragmentación generados revelaron picos individuales distinguibles correspondientes a firmas de fragmentación iCORE individuales (panel inferior). La cuantificación relativa de las señales obtenidas para G1-G10 reveló que la representación relativa de los iCORE en la muestra original (cantidades iguales de cada iCORE) se reflejaba de cerca en el patrón de pico obtenido, indicando que el método no solo es apto para la detección cualitativa (ausencia/presencia de un analito), sino también para estudios cuantitativos y cuantitativos comparativos.

Ejemplo 5: Ensayos cuantitativos iCORE EM/EM

Para investigar si las cantidades relativas de abundancias de iCORE en una muestra se reflejan con precisión en los ensayos EM/EM a los que se someten dichas bibliotecas, se creó una muestra que comprende una biblioteca iCORE de 10-plex (G1-G10), como se describe en el Ejemplo 4, en la cual los diferentes iCORE estaban comprendidos en diferentes abundancias relativas en relaciones definidas. La muestra original comprendía la siguiente estequiometría de iCORE: G1:G2:G3:G4:G5:G6:G7:G8:G9:G10 estaban a una relación de 1:2:3:4:5:10:10:5:3:2:1. La muestra se sometió a un análisis EM/EM y los resultados se muestran en la Figura 4. El gráfico de barras muestra una buena correlación de la estequiometría original y las abundancias medidas de los iCORE. Un análisis más detallado de las abundancias esperadas (teóricas) y observadas (extraídas) de cada iCORE demuestra que los resultados de EM/EM se parecen mucho a las abundancias reales en la muestra. El coeficiente de correlación del conjunto de datos observado y esperado se calculó como R2 = 0,99. Estos resultados indican que los ensayos multiplex iCORE son adecuados para el análisis cuantitativo y que la abundancia de iCORE se mantiene y refleja con precisión después de los ensayos multiplex EM/EM.

Ejemplo 6: Intervalo dinámico lineal de ensayos ICORE EM/EM

Con el fin de investigar el intervalo dinámico en el que los iCORE podrían detectarse y cuantificarse de forma fiable, se generó una serie de diluciones de una biblioteca de iCORE de 10-plex, como se describe en el Ejemplo 4. La biblioteca comprende cada iCORE (G1-G10) en la misma abundancia. Cinco muestras diluidas, con una concentración de 10'7M (100 nM), 10'8M (10 nM), 10'9 M (1 nM), 10'1°M (100 pM) y 10'11 M (10 pM), respectivamente, se sometieron después a un ensayo EM/EM. Las intensidades observadas para cada iCORE en cada concentración se representaron gráficamente en relación con la concentración de los iCORE en la muestra de dilución. La Figura 5 muestra que todos los iCORE se detectaron con precisión en todas las concentraciones, lo que indica que la sensibilidad de los ensayos iCORE EM/EM y el intervalo dinámico lineal, en el cual las abundancias reales de iCORE en la muestra se reflejan con precisión en la intensidad de la señal observada, se extiende al menos desde el rango picomolar al rango nanomolar, abarcando al menos cinco órdenes de magnitud. Estos resultados indican que la detección precisa de iCORE en un ensayo multiplex EM/EM es posible a alta sensibilidad, con niveles incluso picomolares de iCORE que son detectables con una precisión que permite un análisis cuantitativo.

Ejemplo 7: Eficiencia de la liberación de iCORE del sustrato unido covalentemente a través de la fotoescisión

Para evaluar la eficiencia de la liberación de iCORE unidos covalentemente a un sustrato, por ejemplo, un agente de unión que se une específicamente a un analito diana, se generó un iCORE basado en glu-fib y se conjugó con un sustrato mediante un enlace covalente. El iCORE estaba conectado al sustrato, otro péptido a través de un enlazador fotoescindible, generando de esta manera un péptido en tándem iCORE-sustrato fotoactivado o fotoescindible. El péptido en tándem fotoactivado se expuso a luz ultravioleta de ~350 nm de longitud de onda durante un tiempo (30 min) suficiente para la fotoescisión del enlazador, lo que dio como resultado una liberación del iCORE del péptido en tándem como se muestra en el panel superior de la Figura 6. El proceso de fotoescisión se monitorizó por CL EM (panel inferior). Los datos obtenidos demuestran que el péptido en tándem fotoactivado (I, m/z = 881,7) se escindió cuantitativamente y se rescató cerca del 100% de la cantidad teóricamente recuperable del iCORE liberado (II, m/z = 785,4). Estos resultados indican que la fotoescisión de iCORE unidos covalentemente a otras moléculas, por ejemplo, otros péptidos, tales como agentes de unión o moléculas formadoras de hidrogel, a través de un enlazador fotoescindible, pueden liberarse de manera eficiente por exposición a los rayos UV y pueden rescatarse cuantitativamente y cuantificarse con precisión en ensayos de CL EM.

Ejemplo 8: Marcaje de moléculas con iCORE mediante conjugación a restos reactivos.

Para investigar si los iCORE podrían usarse para marcar covalentemente otras moléculas, los iCORE de glu-fib se conjugan con un grupo químico reactivo capaz de formar un enlace covalente con un resto químico compatible bajo ciertas condiciones. Para esto, un glu-fib iCORE se une a un resto químico reactivo capaz de formar un enlace covalente a un monómero de PEG cuando se expone a luz UV en presencia de monómeros de PEG. Como se representa en la Figura 7, la exposición a los rayos UV da como resultado la formación de un polímero PEG marcado con glu-fib iCORE, en este caso un hidrogel, en el cual el andamio de PEG está unido covalentemente por iCORE.

Este experimento de prueba de principio demuestra que los sustratos pueden marcarse covalentemente con iCORE y que los hidrogeles marcados con iCORE, útiles, por ejemplo, como andamios para la modificación por ingeniería genética de tejidos, puede lograrse fácilmente.

Ejemplo 9: Biomarcadores sintéticos codificados en masa para la monitorización urinaria multiplexada de enfermedades

Se desarrolló una plataforma de detección de proteasas que comprende biomarcadores sintéticos multiplexados para la detección de enfermedades. La Figura 8 muestra un esquema de este enfoque. La Figura 8a muestra una biblioteca de biomarcadores sintéticos compuesta por una biblioteca de péptidos de sustrato codificada en masa conjugada en nanopartículas de nanogusano. La administración de cócteles de NW en animales enteros conduce a la acumulación en los tejidos de la enfermedad (b). Las proteasas locales escinden los fragmentos de péptidos que posteriormente se filtran a la orina. Los indicadores de masa fotoactivados se liberan tras la exposición a luz ultravioleta y se cuantifican mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (c).

Para establecer una plataforma sensora de proteasas, se identificaron sustratos peptídicos que serían susceptibles de escisión por proteasas extracelulares asociadas a fibrosis hepática y cáncer. Los derivados marcados con fluoresceína de ~50 secuencias de péptidos candidatos20'24 se sintetizaron y se conjugaron a nanopartículas de nanogusano (NW) recubiertas con PEG, de óxido de hierro de larga circulación25 (Figura 9a, b, c) y se incubaron con proteasas recombinantes comúnmente sobreexpresadas en estas enfermedades (por ejemplo, metaloproteasas de matriz (MMP), catepsinas) así como proteasas normalmente presentes en la sangre (FXa, factor tisular (TF), trombina) para evaluar la especificidad del sustrato y la accesibilidad de los péptidos conjugados en la superficie a las proteasas. La Figura 9 muestra chaperonas de nanogusanos de óxido de hierro de larga circulación. La distribución de tamaño de NW determinada por la dispersión dinámica de la luz de nanogusanos de óxido de hierro recubiertos con dextrano se muestran en (a). Los espectros de absorbancia de NW libres (rojo) y NW conjugados con péptidos marcados con fluoresceína (~500 nm) y Alexa 647 (azul) se muestran en (b). La cinética de eliminación in vivo de NW recubiertos con PEG (azul) y sin PEG (rojo) conjugados con péptidos sustrato se muestra en (c). Los NW pegilados prolongaron la semivida de circulación en ~4 horas.

Usando este ensayo, se observaron aumentos en la fluorescencia de la muestra tras la escisión proteolítica de los péptidos fluorescentes unidos como resultado de la abrogación de la homogeneización entre fluoróforos adyacentes. Las velocidades de reacción iniciales se extrajeron para cada combinación de proteasa-sustrato y se compilaron para análisis comparativo (Figura 10a, b). La Figura 10 ilustra la selección de sustratos sensibles a proteasas para el tráfico urinario de NW Chaperonado. La cinética de la escisión péptido-NW monitorizada por fluorimetría se muestra en (a). Las combinaciones específicas de proteasa-sustrato condujeron a una activación rápida. La Figura 10b muestra una comparación de mapa de calor de las velocidades de escisión iniciales para diferentes combinaciones de sustrato-proteasa agrupadas de acuerdo con la actividad y la especificidad. Formación de imágenes IVIS in vivo de animales tratados y de control con DDC después de la inyección intravenosa de péptidos Glu-fib marcados con VivoTag-680, (d) NW sin péptidos o (e) NW conjugados con péptidos.

De este conjunto, se seleccionaron 10 péptidos con fuerte susceptibilidad a proteasas para que sirvieran como biblioteca de péptido-NW (Tabla 1).

Tabla 1. Biblioteca de biomarcadores de péptidos codificados por iCORE. Sustratos de sonda individuales codificados con códigos de masa isobárica fotoactivados para cuantificación mediante CL EM/EM.

Biblioteca de biomarcadores Sustrato Código de masa isobárica[cdj indicador y6 [ya+H+j sintéticos[a, b]

G1 e+3G+6VndneeGFfsAr-X- PQGIWGQ e+3G+6VndneeGFfsAr GFfsAr 683,4 K(FAM)GGPQGIWGQC-NW

G2 e+2G+6Vndnee+1GFfsAr-X- LVPRGSG e+2G+8Vndnee+1GFfsAr 1GFfsAr 684,4 K(FAM)GGLVPRGSGC-NW

G3 e+1G+6Vndnee+2GFfsAr-X- PVGLIG e+1G+6Vndnee+2GFfsAr 2GFfsAr 685,4 K(FAM)GGPVGLIGC-NW

G4 eG+6Vndnee+2GFfs+1Ar-X- PWGIWGQG eG+6Vndnee+2GFfs+1Ar 2GFfs+1Ar 686,4 K(FAM)GGPWGiWGQGC-NW

(continuación)

Biblioteca de biomarcadores Sustrato Código de masa isobárica[cd] indicador y6 [y6+H+] sintéticos[a, b]

G5 eG+5VndneeGFfs+4Ar-X- PVPLSLVM eG+5VndneeGFfs+4Ar GFfs+4Ar 687,4 K(FAM)GGPVPLSLVMC-NW

G6 e+3G+1Vndnee+1GFfs+4Ar-X- PLGLRSW e+3G+1Vndnee+1GFfs+4Ar 1GFfs+4Ar 688,4 K(FAM)GGPLGLRSWC-NW

G7 e+3GVndneeG+6FfsAr-X- PLGVRGK e+3GVndneeG+6FfsAr G+6FfsAr 689,4 K(FAM)GGPLGVRGKC-NW

G8 e+2GVndneeG+6Ffs+1Ar-X- f(Pip)RSGGG e+2GVndneeG+6Ffs+1Ar G+6Ffs+1Ar 690,4 K(FAM)GGf(Pip)RSGGGC-NW

G9 e+1GVndnee+2G+6FfsAr-X- fPRSGGG e+1GVndnee+2G+6FfsAr 2G+6FfsAr 691,4 K(FAM)GGfPRSGGGC-NW

G10 eGVndnee+3G+6FfsAr-X- f(Pip)KSGGG eGVndnee+3G+6FfsAr 3G+6FfsAr 692,4 K(FAM)GGf(Pip)KSGGGC-NW

[a] X (ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico), FAM (carboxifluoresceína), Pip (ácido pipecólico), NW (nanogusano) [b] minúscula = d-aminoácido

[c] extremo C fotoescindido = CONH2

[d] masa = 1589,8 Da

Las secuencias de G1-G10 corresponden, de arriba a abajo, a SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 17, respectivamente. Las secuencias de sustrato se corresponden, de arriba a abajo, a SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 27, respectivamente. Los códigos de masa isobárica corresponden a SEQ ID NO: 28 y los indicadores y6 corresponden a SEQ ID NO: 29.

Para diseñar un sistema que analice microambientes enfermos, la biodistribución de cada componente del sistema (es decir, péptido y nanopartícula) se investigó en modelos de enfermedades in vivo. En este punto, se seleccionó un modelo de ratón de fibrosis hepática en el cual los ratones FVB/NJ alimentados con 3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidrocolidina (DDC) desarrollan enfermedad hepática progresiva como resultado de una lesión crónica del conducto biliar.26 (Figura 11a, b, c), dando lugar a hígados fibróticos y proteolíticamente activos (Figura 12b, c, d).

La Figura 11 ilustra biomarcadores urinarios de fibrosis hepática y resolución en ratones tratados con DDC. La Figura 11a muestra la inducción de fibrosis hepática y la línea de tiempo de administración de NW. La Figura 11b muestra la cuantificación del colágeno hepático total mediante análisis de hidroxiprolina. El tratamiento con DDC condujo a un aumento de ~3 veces en el colágeno hepático en la semana 3 (*** P < 0,001) y una caída de ~30 % entre la semana 7 y la 11 (* P <0,05) que se mantuvo por encima de los valores pre-tratamiento (* P <0,05) (ANOVA de una vía, prueba posterior de Tukey, n = 3, s.e.m.). La histoquímica de rojo sirio de secciones de hígado (barra de escala = 50 pm) indicó la presencia de extensiones fibróticas que emanan de tríadas portales en la semana 3, persistiendo hasta la semana 7 y resolviéndose a las 11 semanas (c). La formación de imágenes IVIS in vivo mostró acumulación urinaria de la biblioteca de indicadores de conjunto en animales tratados con DDC (d). La cinética de la acumulación urinaria cuantificada por inmunoprecipitación de a-FITC (punto de tiempo de 3 semanas, * P <0,05, ANOVA de dos vías, prueba posterior de Tukey; barras de error = s.e.m.) se muestran en (e). La Figura 11f muestra diagramas de caja y bigotes de las intensidades de los picos de iCORE individuales representadas como DDC sobre el control a las 0, 3, 7 y 11 semanas (* P < 0,05, ** P < 0,01; ANOVA de mediciones repetidas, prueba posterior de Tukey; n = 10). La Figura 11g muestra las curvas ROC de combinaciones únicas, dobles y triples de biomarcadores fibrosantes con áreas bajo la curva (AUC) asociadas. (h) curvas ROC de combinaciones únicas, dobles y triples de biomarcadores resolutivos con áreas bajo la curva (AUC) asociadas.

La Figura 12 ilustra la inmunofluorescencia de secciones de hígado. La Figura 12a muestra imágenes periportales de macrófagos (rojo) y NW (verde) infiltrados en zonas fibrosantes. Las flechas resaltan áreas de colocalización. La Figura 12b muestra imágenes periportales de MMP9 (rojo) y NW (verde). La expresión de MMP9 no se encontró en hígados sanos (c). La Figura 12d muestra una imagen de fluorescencia de la zona periportal después de la zimografía en gelatina in situ. Barras de escala = 100 pm.

Para evaluar el tráfico de péptidos, el péptido glutamato fibrinopéptido B (Glu-fib, EGVNDNEEGFFSAR, SEQ ID NO: 1) se seleccionó como marcador urinario prototípico porque su derivado endógeno (fibrinopéptido B) es biológicamente inerte y normalmente se filtra libremente en la orina cuando se libera durante la coagulación.27 El Glu-fib marcado con fluoróforo administrado por vía intravenosa (iv) se filtró eficazmente en la orina tanto en animales fibrosantes como en animales sanos con un retorno al hígado indetectable (Figura 10c). Por el contrario, los NW sin péptido más grandes (radio hidrodinámico de ~ 40 nm, Figura 9a) se alojaron en el hígado (Figura 10d), consistente con el tráfico de nanomateriales dependiente del tamaño y un umbral de aclaramiento renal de ~ 5 nm para nanopartículas inorgánicas.28 De forma importante, en animales tratados con péptidos marcados con fluoróforos conjugados con NW, se observó un direccionamiento de péptido mediado por NW significativo en hígados fibrosantes y sanos que conducen a un fuerte aumento de la fluorescencia urinaria en animales enfermos como resultado de la filtración renal de fragmentos de péptidos escindidos (Figura 10e).

Perfilado de las actividades de las proteasas mediante espectrometría de masas

A pesar de las ventajas de multiplexación de la codificación masiva, un desafío de la detección de la actividad de las proteasas por EM es que los sustratos peptídicos en entornos proteolíticos complejos pueden escindirse en múltiples sitios por proteasas promiscuas y truncarse por exoproteasas429 para producir diversos grupos de fragmentos mal definidos que confunden el análisis de masas. En este punto, se diseñaron indicadores de masas bien definidos para codificar una biblioteca de sustratos. A la luz de las propiedades favorables de aclaramiento renal de Glu-fib, se añadieron derivados ricos en isómeros d de Glu-fib a los extremos N de cada sustrato de proteasa para servir como indicadores de masas resistentes a proteasas y para promover la filtración renal tras la escisión del sustrato y la liberación de los NW (Tabla 1). Estos péptidos en tándem se modificaron adicionalmente con restos internos fotolábiles30 para permitir la recuperación de péptidos de Glu-fib bien definidos por fotólisis de fragmentos complejos de escisión urinaria después de proteólisis in vivo. Para probar esta construcción, se sintetizó un péptido en tándem fotoactivado modelo (compuesto I, Figura 13a). De acuerdo con informes publicados anteriormente sobre grupos nitrofenilo, la exposición del compuesto I (triplemente cargado, 881,7 m/z; Figura 13b, panel superior) a luz UV desencadenó la escisión del péptido, dando como resultado la aparición de Glu-fib doblemente cargado terminado en acetamida (785,4 m/z; Figura 13b, panel inferior).

La Figura 13 muestra bibliotecas iCORE fotoactivadas para la generación de perfiles multiplexados de actividades proteasa mediante CL EM/EM. La Figura 13a ilustra la estructura del péptido en tándem (compuesto I) que contiene un enlazador interno sensible a UV. Se muestra aquí la estructura de Glu-fib libre (compuesto II) generada después de la fotólisis (~ 350 nm). La Figura 13b muestra los espectros de CL EM del compuesto I antes (arriba, m/z con carga triple: 881,7) y después (abajo, doblemente cargada m/z: 785,4) de la exposición a la luz UV. La Figura 13c muestra una biblioteca de péptidos isobáricos de 10-plex derivados de Glu-fib. La Figura 13d muestra un cromatograma de iones extraído de una mezcla de iCORE de 10-plex equimolar (789,80-789,90 m/z). Todo el conjunto multiplexado era cromatográficamente indistinguible. La Figura 13e muestra un espectro de iCORE EM/EM después de la disociación inducida por colisión. Los indicadores individuales se identificaron mediante iones reporteros y6 únicos (683,3-692,3 m/z), cada uno de los cuales podía diferenciarse por una sola unidad de masa. La Figura 13f muestra un espectro de iCORE EM/EM después de la incubación de un cóctel de péptido-NW codificado por iCORE de 10-plex con MMP9 recombinante.

La Figura 14 ilustra la Codificación masiva de indicador codificado isobárico (iCORE). La Figura 14a muestra un espectro de EM/EM después de la disociación inducida por colisión de Glu-fib. Los picos corresponden a fragmentos peptídicos de tipo y c-terminales. La Figura 14b enumera 10 análogos isotópicos y las masas correspondientes producidas mediante codificación isobárica. Cada secuencia se construyó enriqueciendo selectivamente el equilibrio o las regiones informadoras con aminoácidos "pesados" para producir iones informadores y6 únicos mientras se mantiene una masa total uniforme.

Para diseñar una estrategia de codificación extensible para la biblioteca de sustratos de proteasa, se investigó la capacidad de codificación de masa isobárica3132 para extenderla a andamios peptídicos como el indicador urinario Glu-fib para producir una familia de indicadores de masa. La característica distintiva de una estrategia de codificación isobárica es que los miembros individuales de una familia de indicadores comparten una masa parental para facilitar la recolección eficaz de péptidos por EM, pero pueden identificarse posteriormente mediante iones EM/EM únicos tras la fragmentación. Primero se determinó que los fragmentos Glu-fib en iones de tipo y C-terminal (Figura 10a) y 10 códigos de masa se construyeron centrados en el ion y6 (GFFSAR, SEQ ID NO: 4) enriqueciendo el hexámero con aminoácidos pesados para producir variantes diferenciadas por 1 Da cada una (Figura 10b). Este cambio de masa introducido se equilibró luego mediante el enriquecimiento de isótopos dentro del resto del péptido (EGVNDNEE, SEQ ID NO: 5). Como resultado, cada péptido se caracterizó por una masa nominal idéntica y un ion de fragmento y6 distinto. Este método de codificación se denominó "indicadores codificados isobáricos" (iCORE). Para validar este enfoque, se analizó una mezcla equimolar de iCORE 10-plex (Figura 13c) mediante CL EM/EM y se descubrió que la biblioteca peptídica completa aparecía inicialmente como un único pico sin resolver (cromatograma de iones extraídos, 789,95 ± 0,5 m/z, Figura 13d) pero después de la fragmentación, a resolver en un espectro de 10 picos sin sesgo de fragmentación (683,4-692,4 m/z, Figura 15, Figura 13e). Para retirar el solapamiento de picos de confusión que surge de los isótopos naturales (por ejemplo, 13C), los péptidos iCORE se fragmentaron selectivamente a través de una ventana de masa unitaria centrada en el ion precursor (Figura 16a) para minimizar la señal de los isótopos naturales a ~ 5 % del pico original (Figura 16b). Por lo tanto, en las muestras enriquecidas con indicadores en relaciones definidas (1:2:3:5:10:10:5:3:2:1), se observó una correlación lineal entre la intensidad máxima y la estequiometría en el análisis tanto sin modificar como con sustracción de picos (n = 3, R2=0,99 y R2 = 0,99 respectivamente, Figura 17a, b, c). La Figura 17 demuestra que el análisis iCORE CL Em/EM es cuantitativo. La Figura 17a muestra un espectro EM/EM de una mezcla de indicadores iCORE de 10-plex combinados en una relación 1:2:3:5:10:10:5:3:2:1. Las intensidades de los picos extraídos estaban altamente correlacionadas con la estequiometría del indicador de entrada (r2 = 0,99; n = 3; barras de error = s.e.m.) (b). Para tener en cuenta los isótopos de origen natural (Figura 16), las intensidades de los indicadores individuales se modificaron restando el 5 % de la intensidad del indicador anterior (c). Las relaciones de indicador compensadas también se correlacionan fuertemente con las relaciones de indicador (r2 = 0,99; n = 3; barras de error = s.e.m.). Todas las muestras posteriores se ajustaron al pico para reflejar las contribuciones de los isótopos naturales.

Para evaluar la capacidad de la multiplexación iCORE para informar simultáneamente sobre las actividades de muchas combinaciones de proteasa-sustrato, se trató un cóctel equimolar de 10-plex de péptido-NW codificados por iCORE con MMP9 recombinante (Tabla 1). Después de la incubación, los productos de escisión se aislaron mediante filtración por tamaños y se expusieron a luz UV antes del análisis EM/EM. De forma notable, las actividades colectivas del sustrato se tradujeron en distintos paisajes iCORE caracterizados por intensidades de indicador y6 marcadamente diferentes (Figura 13F). Esta biblioteca se aplicó a varias otras proteasas recombinantes (Figura 18a) y no se encontró una fuerte correlación entre los diferentes perfiles de proteasas iCORE (es decir, MMP2, MMP9, MMP12 y trombina) como se determina a partir del análisis de correlación de Pearson (Figura 18b), que ilustra la capacidad de los NW codificados por iCORE para controlar de forma única muchas combinaciones de proteasa y proteasa-sustrato.

Ejemplo 10: Monitorización de la fibrogénesis hepática y la resolución

La fibrosis hepática es una respuesta de curación de heridas a una lesión hepática crónica y da como resultado la acumulación de tejido cicatricial que puede dar lugar a cirrosis, insuficiencia hepática y cáncer.18 La dinámica de la acumulación de matriz extracelular tal como el colágeno está impulsada en gran medida por las células estrelladas hepáticas fibrogénicas y los microfibroblastos, y las proteasas de remodelación de la matriz, tales como las MMP y sus inhibidores. El estándar de oro actual para la monitorización es una biopsia con aguja seguida de un análisis histológico; sin embargo, esta técnica es invasiva, confundida por la alta heterogeneidad de muestreo, conlleva un riesgo finito de complicaciones y no puede realizarse con frecuencia según sea necesario (por ejemplo, monitorización de terapias antifibróticas).33 Los ensayos no invasivos que incluyen formación de imágenes por ultrasonido, la elastografía y los biomarcadores séricos están limitados por su baja precisión y utilidad pronóstica limitada.34 Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad urgente de biomarcadores no invasivos para reemplazar la monitorización basada en biopsias, identificar y validar nuevos agentes antifibróticos y apoyar la toma de decisiones clínicas.35 Aquí, se buscó identificar biomarcadores sintéticos con la capacidad de monitorizar la fibrosis hepática y extender el modelo inducido por DDC para incluir tanto la enfermedad fibrosante como la resolutiva (Figura 11a, b, c).

Se determinó el tráfico in vivo y la capacidad de los biomarcadores sintéticos codificados por iCORE para producir una señal urinaria en conjunto durante la progresión fibrótica. La administración intravenosa de un cóctel de péptido-NW de 10-plex marcado con fluoróforo dio como resultado un aumento de 2 veces en la fluorescencia urinaria en animales tratados con DDC durante 3 semanas (* P < 0,05, ANOVA de dos vías; Figura 11d, e). Las imágenes de inmunofluorescencia de las secciones de hígado revelaron que la mayoría de los NW escaparon del secuestro por los macrófagos residentes (Figura 12a, flecha), infiltrándose libremente en el parénquima y en zonas periportales de fibrosis activa caracterizadas por una expresión puntiforme de MMP9 (Figura 12b, c). Aparecieron patrones similares en secciones tratadas con sustratos de DQ-gelatina (Figura 12d) que permiten la visualización in situ de proteasas activas que degradan el colágeno.

Colectivamente, estos resultados indicaron que los NW se alojan en microambientes hepáticos fibrosantes que contienen proteasas activas. Con el fin de determinar el comportamiento de los reporteros individuales para identificar biomarcadores sintéticos sensibles y específicos, los procesos de fibrosis y resolución se probaron mediante análisis de masas iCORE. Los ratones tratados de forma transitoria con DDC durante 3 semanas seguidas de la restauración de la comida sin DDC desarrollan distintas ventanas de fibrosamiento y resolución (0-3 y 7­ 11 semanas respectivamente, Figura 11a) como se verifica macroscópicamente mediante tinción de colágeno con rojo Sirio de secciones de hígado (Figura 11c) y mediante análisis de hidroxiprolina que cuantifica el colágeno tisular total (Figura 11b). Con este régimen de tratamiento, el colágeno hepático aumentó ~ 3 veces en comparación con los niveles previos al tratamiento después de 3 semanas con DDC, persistió desde la semana 3-7 después de la retirada inicial de DDC y disminuyó significativamente desde la semana 7-11 después de la retirada sostenida de DDC (* P < 0,05, *** P < 0,005, n = 3).

Por lo tanto, para monitorizar las transiciones entre la fibrosis y la resolución de la enfermedad, se administraron NW a las 0, 3, 7 y 11 semanas en animales de control tratados con DDC y de la misma edad, seguido de análisis iCORE EM/EM. Las actividades resultantes de los biomarcadores individuales mostraron cinéticas marcadamente divergentes (Figura 11f). Los biomarcadores G3 y G4 aumentaron ambos fuertemente en relación con las líneas de base previas al tratamiento, alcanzando una meseta en la semana 11 a pesar del inicio escalonado en la semana 7 y 3 respectivamente. G5 y G6 mostraron cinéticas opuestas, disminuyendo significativamente en la semana 3 antes de regresar gradualmente a las intensidades previas al tratamiento (G5) o persistir hasta la semana 11 (G6). De forma interesante, G7 se siguió con la cinética del tratamiento DDC, elevándose bruscamente en la semana 3 seguido de una reversión rápida en la semana 7. Todos los biomarcadores restantes (G1, G2, G8, G9 y G10) no se desviaron de las actividades iniciales de pretratamiento (G1-G10; * P < 0,05, ** P < 0,01, ANOVA de mediciones repetidas, prueba posterior de Tukey, n=10). De forma importante, todos los biomarcadores en los animales control tampoco se apartaron significativamente del valor inicial (Figura 19).

El rendimiento diagnóstico de estos biomarcadores se determinó realizando análisis de características operativas del receptor (ROC) para combinaciones individuales y de biomarcadores. Las curvas ROC caracterizan la sensibilidad y la especificidad de un biomarcador en función del umbral de discriminación al devolver el área bajo la curva (AUC) como una métrica de rendimiento con un AUC de valor inicial de 0,5 que representa un clasificador de biomarcadores aleatorios (línea discontinua, Figura 11g, h). Dentro de la ventana fibrosante de 0 a 3 semanas, G5 mostró el AUC más alto entre los 10 biomarcadores (0,96, Figura 20), que se mejoró aún más al incluir G7 en una combinación de biomarcadores doble (0,98), o G6 y G7 en una combinación triple (1,00), lo que dio como resultado un clasificador de biomarcador sintético perfecto para enfermedad fibrosante en este modelo (Figura 11g). Dentro del marco de tiempo de resolución de 7-11 semanas, G1 1ed con AUC = 0,73 (Figura 21), que mejoró significativamente mediante la combinación doble de G1+G9 (AUC = 0,9) y finalmente la combinación triple G1+G7+G9 (AUC = 0,91) (Figura 11h).

Colectivamente, estos experimentos demuestran que la fibrosis hepática y la resolución se revelan mediante distintas colecciones de biomarcadores sintéticos, y que las combinaciones multiplexadas permiten el mayor rendimiento diagnóstico, lo que ilustra la capacidad de esta plataforma para iluminar de forma no invasiva aspectos de la evolución de la enfermedad hepática que de otro modo serían inaccesibles.

Ejemplo 11: Detección precoz de tumores colorrectales

Cuando se diagnostican antes de la diseminación sistémica, muchos tumores primarios pueden tratarse eficazmente con intervenciones clínicas convencionales.36 Sin embargo, la mayoría de los biomarcadores utilizados clínicamente carecen de la precisión y la sensibilidad diagnósticas para discriminar tumores pequeños, y no está claro si las estrategias actuales de biomarcadores de sangre endógenos dirigidas a los subproductos desprendidos o procesados de tejido canceroso pueden mejorarse lo suficiente para la detección temprana.19 Por otra parte, se está volviendo evidente que los biomarcadores séricos individuales (por ejemplo, CA-125 para ovario, PSA para el cáncer de próstata) no poseen la sensibilidad y especificidad necesarias para la detección temprana, y lo más probable es que se requieran paneles de biomarcadores.37

En este punto, se investigó si los paneles de biomarcadores urinarios sintéticos podrían adaptarse fácilmente para permitir una detección más temprana y precisa del cáncer en comparación con los biomarcadores sanguíneos clínicos individuales, por ejemplo, porque las nanopartículas pueden dirigirse pasivamente a tumores para tomar muestras de proteasas a través de vasos tumorales angiogénicos fenestrados.16. Para explorar este concepto, se usaron ratones desnudos atímicos con tumores de xenoinjerto LS174T, una línea celular de cáncer colorrectal humano (CRC)38 que secreta el biomarcador sanguíneo antígeno carcinoembrionario (CEA) como un sistema modelo (Figura 22). La Figura 23a muestra una línea de tiempo de la inoculación de células de cáncer colorrectal LS 174T y la administración de NW en ratones desnudos. La Figura 23b ilustra la cuantificación macroscópica del crecimiento tumoral (n=5, s.d.) y la Figura 23c muestra los niveles circulantes de CEA en animales control y de tumor analizados cada tercer día después de la implantación del tumor mediante ELISA (** P < 0,01, ANOVA de dos vías, prueba posterior de Tukey). La formación de imágenes IVIS in vivo mostró acumulación urinaria de la biblioteca de indicadores de animales que llevan tumores (d). La Figura 23e muestra la cuantificación de la fluorescencia urinaria mediante inmunoprecipitación con FITC (* P < 0,05, ANOVA de dos vías, prueba posterior de Tukey; n=5, s.d.). La Figura 23f muestra las curvas ROC de una combinación única, doble y triple de biomarcadores con AUC asociadas (n=16; 8 ctrl, 8 tumor) y la Figura 23g muestra la comparación de ROC entre la combinación de triple biomarcador (G1+G2+G3) con CEA sérico en el día 10. Después de la implantación, el injerto del tumor se controló tomando muestras de suero cada 3 días y analizando CEA mediante ELISA (Figura 23b, c). El día 10, los niveles de CEA no estaban lo suficientemente elevados para distinguir los animales de tumor de los animales control, correspondiendo a una carga tumoral promedio de ~ 130 mm3 (diámetro esférico d ~ 6,3 mm). Los tumores a los que se les permitió crecer más se detectaron fácilmente mediante análisis de CEA (día 13 y 16), lo que representa un límite de detección de ~ 330 mm3 (d ~ 8,6 mm) (** P < 0,01, ANOVA de dos vías, n = 5). Para determinar si los biomarcadores urinarios sintéticos podrían superar el CEA sérico, la biblioteca de péptido-NW de 10-plex marcados con fluoróforo descrita en el presente documento se administró los días 0 y 10. La formación de imágenes ex vivo de tumores extirpados y el análisis de inmunofluorescencia de las secciones correspondientes indicaron que los NW se dirigían fácilmente al medio extravascular después de la administración i.v. (Figura 24). A pesar de la incapacidad de CEA para indicar la presencia de cáncer en el día 10, la escisión del conjunto de péptidos dio como resultado una fuerte elevación de 2 veces en la fluorescencia de la orina (Figura 23d, e), lo que permite la detección de tumores ~ 2,5 veces más pequeños que CEA (130 frente a 330 mm3) por fluorescencia urinaria sola. Para determinar el potencial diagnóstico total del análisis multiplexado, los biomarcadores individuales se cuantificaron mediante iCORE EM/EM. Similar a los estudios hepáticos descritos en el presente documento, el poder de clasificación del biomarcador único de rendimiento más alto (G1, AUC = 0,78, Figura 25) mejoró constantemente en combinaciones dobles (G1+G2, AUC = 0,88) y triples (G1+G2+G3, AUC = 0,89) de biomarcadores (n = 16, Figura 23f). Esta triple combinación superó significativamente al CEA sérico, que detectó mal la enfermedad con un AUC de 0,61 en el día 10 (Figura 23g).

Análisis

A pesar del hecho de que se están descubriendo rápidamente muchas características nuevas de la enfermedad con enfoques de elaboración de perfiles globales, el desarrollo de este conocimiento en biomarcadores de última generación sigue estando fundamentalmente limitado por muchos desafíos técnicos y biológicos intrínsecos a las dianas endógenas. Idealmente, un biomarcador candidato se secretaría en niveles altos en relación con el fondo nativo, permaneciendo estable o persistente en circulación hasta la detección, siendo fácilmente accesible a partir de fluidos del hospedador de composición sencilla y siendo capaz de discriminar enfermedades con alta sensibilidad y especificidad. En la práctica, tales parámetros son difíciles de mejorar o controlar, y muchos biomarcadores prometedores fallan durante una evaluación rigurosa para la traducción clínica.

En este punto, se diseñó un sistema de biomarcadores sintéticos con la capacidad de (i) amplificar los niveles de biomarcadores a través del recambio de sustrato dirigiéndose a actividades aberrantes de proteasa, (ii) liberar indicadores de masa enriquecidos con isómero d estables diseñados para ser detectados dentro de una ventana de masa estrecha libre de moléculas hospedadoras, (iii) desencadenar la eliminación del indicador de la sangre a la orina para reducir la complejidad de la matriz y para facilitar la extracción y (iv) perfilar simultáneamente bibliotecas de biomarcadores sintéticos candidatos in vivo para identificar combinaciones multiplexadas para un diagnóstico altamente sensible y específico. El trabajo descrito en el presente documento muestra que mediante la modificación por ingeniería genética de agentes exógenos para interrogar a los tejidos enfermos, los desafíos biológicos y de transporte clave pueden abordarse por separado antes de la integración, dando como resultado biomarcadores sintéticos que pueden diseñarse, probarse e identificarse rápidamente para distintas enfermedades.

Los estudios hepáticos descritos en el presente documento demuestran el potencial de esta tecnología para controlar tanto la fibrosis hepática como la resolución. Actualmente, la biopsia con aguja sigue siendo el estándar de oro a pesar de que los resultados de la biopsia a menudo son variables porque solo se toma una muestra de una pequeña parte del hígado y puede dar lugar a un diagnóstico inexacto o biopsias repetidas. Adicionalmente, los grandes cambios arquitectónicos se producen con frecuencia en una escala de tiempo más larga en comparación con las alteraciones en las actividades de la proteasa como ocurre durante la resolución, lo que dificulta la predicción de la trayectoria del paciente basándose en el análisis histológico. De forma notable, este estudio mostró que los agentes a nanoescala penetran por todo el hígado, delineó un panel de biomarcadores fibrosantes y de resolución (0-3 y 7-11 semanas respectivamente) e incluso reveló biomarcadores entre la semana 3 y 7 (por ejemplo, G3, G7) que podrían representar potencialmente una firma anticipatoria antes de la resolución, ya que las secciones de hígado dentro esta ventana de tiempo era indistinguible por los ensayos histológicos o de cuantificación de matriz utilizados clínicamente. Los biomarcadores predictivos tempranos de resolución fibrótica acelerarían la tasa en la que se identifican nuevos fármacos antifibróticos en estudios preclínicos y clínicos al diferenciar rápidamente a los respondedores potenciales de los no respondedores con histología idéntica.

Actualmente, existen pocos datos clínicos que correlacionen el tamaño de los tumores con los niveles de biomarcadores circulantes y no está claro si los tumores pequeños (<1 cm3) pueden detectarse de forma fiable. Recientemente, Gambhir y colaboradores19 han estimado mediante modelos matemáticos que los tumores sólidos podrían permanecer indetectables durante 10-12 años y alcanzar un diámetro esférico > 2,5 cm antes de que los biomarcadores sanguíneos pudieran indicar una enfermedad. Para ser útiles para la detección temprana, los enfoques actuales que dependen de especies endógenas deberán mejorarse en gran medida. En comparación, este estudio mostró que los paneles de biomarcadores sintéticos multiplexados pueden detectar tumores de CCR antes y con mayor precisión que el CEA sérico, permitiendo la detección de cargas tumorales ~ 2,5 veces más pequeñas. También ilustró que los sitios enfermos relativamente pequeños (~ 130 mm3) fuera del hígado son accesibles para interrogatorios, abriendo la posibilidad de detectar enfermedades en sitios que actualmente son difíciles de explorar con imágenes de infrarrojo cercano (por ejemplo, tumores de semillas profundas) o con otras modalidades de imágenes (por ejemplo tejidos enfermos con contraste deficiente de resonancia magnética o tomografía computarizada, como metástasis hepáticas).39

La tecnología descrita en el presente documento puede ampliarse fácilmente para abarcar enfermedades adicionales y aplicaciones alternativas. Dada la riqueza acumulada de formulaciones de nanopartículas experimentales y aprobadas, el trabajo descrito en el presente documento es transferible a otros nanomateriales y andamios que pueden apuntar activamente o transportar carga de péptidos a diferentes órganos, tipos de vasculatura y profundidad de los tejidos.4041 Además, el esquema de codificación de masas iCORE desvelado en el presente documento puede ampliarse para crear cientos de códigos ortogonales incorporando aminoácidos adicionales enriquecidos con isótopos y haciendo uso de péptidos parentales distintos. Una biblioteca de codificación más grande no solo permitiría la monitorización simultánea de cientos de biomarcadores sintéticos, sino que además podría permitir que las identidades de proteasas desreguladas se revelen mediante desconvolución matemática42 para superar los desafíos de diseñar sustratos específicos para proteasas promiscuas. Una colección de diversas estrategias de administración, capacidades de multiplexación más amplias y algoritmos matemáticos precisos brindarían excelentes oportunidades para la monitorización de enfermedades a nivel de sistemas y aclararían claramente las funciones que desempeñan las redes de proteasas complejas en la salud y la enfermedad.

REFERENCIAS

[1] Sawyers, C. L. The cancer biomarker problem. Nature 452, 548-552 (2008).

[2] Hanash, S. M., Pitteri, S. J. y Faca, V. M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature 452, 571-579 (2008).

[3] Sreekumar, A. et al. Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cáncer progression. Nature 457, 910-914 (2009).

[4] Villanueva, J. et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. J. Clin. Invest. 116, 271-284 (2006).

[5] Surinova, S. et al. On the development of plasma protein biomarkers. J. Proteome Res. 10, 5-16 (2011).

[6] Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B. y Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nat. Rev. Cancer 11, 426-437 (2011).

[7] Moon, P.-G., You, S., Lee, J.-E., Hwang, D. y Baek, M.-C. Urinary exosomes and proteomics. Mass Spectrom. Rev. 30, 1185-1202 (2011).

[8] Nagrath, S. et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature 450, 1235-1239 (2007).

[9] Lutz, A. M., Willmann, J. K., Cochran, F. V., Ray, P. y Gambhir, S. S. Cancer screening: a mathematical model relating secreted blood biomarker levels to tumor sizes. PloS Med. 5, e 170 (2008).

[10] Anderson, N. L. y Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. Proteomics 1, 845-867 (2002).

[11] Haun, J. B. et al. Micro-nmr for rapid molecular analysis of human tumor samples. Sci. Transl. Med. 3, 71ra16 (2011).

[12] Fonovic, M. y Bogyo, M. Activity-based probes as a tool for functional proteomic analysis of proteases. Expert Rev. Proteomics 5, 721-730 (2008).

[13] Baruch, A., Jeffery, D. A. y Bogyo, M. Enzyme activity-it's all about image. Trends Cell. Biol. 14, 29-35 (2004).

[14] Hilderbrand, S. A. y Weissleder, R. Near-infrared fluorescence: application to in vivo molecular imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 14, 71-79 (2010).

[15] Braet, F. y Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comp. Hepatol. 1, 1 (2002).

[16] Jain, R. K. y Stylianopoulos, T. Delivering nanomedicine to solid tumors. Nat. Rev. Clin. Oncol. 7, 653-664 (2010).

[17] Lopez-Otin, C. y Bond, J. S. Proteases: multifunctional enzymes in life and disease. J. Biol. Chem. 283, 30433-30437 (2008).

[18] Schuppan, D. y Afdhal, N. H. Liver cirrhosis. Lancet 371, 838-851 (2008).

[19] Hori, S. S. y Gambhir, S. S. Mathematical model identifies blood biomarker-based early cancer detection strategies and limitations. Sci. Transl. Med. 3, 109ra116 (2011).

[20] Bremer, C., Tung, C. H. y Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nat. Med. 7, 743-748 (2001).

[21] Kridel, S. J. et al. A unique substrate binding mode discriminates membrane type-1 matrix metalloproteinase from other matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem. 277, 23788-23793 (2002).

[22] Lutolf, M. P. et al. Repair of bone defects using synthetic mimetics of collagenous extracellular matrices. Nat. Biotechnol. 21, 513-518 (2003).

[23] Mahmood, U. y Weissleder, R. Near-infrared optical imaging of proteases in cancer. Mol. Cancer Ther. 2, 489-496 (2003).

[24] Turk, B. E., Huang, L. L., Piro, E. T. y Cantley, L. C. Determination of protease cleavage site motifs using mixture-based oriented peptide libraries. Nat. Biotechnol. 19, 661-667 (2001).

[25] Park, J.-H. et al. Systematic surface engineering of magnetic nanoworms for in vivo tumor targeting. Small 5, 694-700 (2009).

[26] Fickert, P. et al. A new xenobiotic-induced mouse model of sclerosing cholangitis and biliary fibrosis. Am. J. Pathol. 171, 525-536 (2007).

[27] Morris, T. A. et al. Urine and plasma levels of fibrinopeptide b in patients with deep vein thrombosis and pulmonary embolism. Thromb. Res. 110, 159-165 (2003).

[28] Choi, H. S. et al. Renal clearance of quantum dots. Nat. Biotechnol. 25, 1165-1170 (2007).

[29] Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Yi, S. S., Robbins, R. J. y Tempst, P. A sequence-specific exopeptidase activity test (sseat) for "functional" biomarker discovery. Mol. Cell. Proteomics 7, 509-518 (2008).

[30] Brown, B. B., Wagner, D. S. y Geysen, H. M. A single-bead decode strategy using electrospray ionization mass spectrometry and a new photolabile linker: 3-amino-3-(2-nitrophenyl)propionic acid. Mol. Divers. 1,4-12 (1995).

[31] Ross, P. L. et al. Multiplexed protein quantitation in saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell. Proteomics 3, 1154-1169 (2004).

[32] Thompson, A. et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by EM/EM. Anal. Chem. 75, 1895-1904 (2003).

[33] Rockey, D. C., Caldwell, S. H., Goodman, Z. D., Nelson, R. C., Smith, A. D., and for the Study of Liver Diseases, A. A. Liver biopsy. Hepatology 49, 1017-1044 (2009).

[34] Popov, Y. y Schuppan, D. Targeting liver fibrosis: strategies for development and validation of antifibrotic therapies. Hepatology 50, 1294-1306 (2009).

[35] Bedossa, P., Dargére, D. y Paradis, V. Sampling variability of liver fibrosis in chronic hepatitis C. Hepatology 38, 1449-1457 (2003).

[36] Etzioni, R. et al. The case for early detection. Nat. Rev. Cancer 3, 243-252 (2003).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la detección simultánea de múltiples analitos en una muestra, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra con un conjunto de agentes de unión conjugados con una pluralidad de indicadores codificados por isótopos (iCORE), en donde los agentes de unión son capaces de unirse específicamente a un conjunto de analitos, en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a los analitos, en donde el conjunto de agentes de unión comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 agentes de unión conjugados con iCORE diferentes, en donde los iCORE son etiquetas de masa de péptidos y

en donde (i) la muestra se pone en contacto in vivo o (ii) los agentes de unión se conjugan con los iCORE mediante un enlazador fotoescindible;

(b) identificar y/o cuantificar, opcionalmente mediante ensayo EM/EM, los iCORE de los agentes de unión unidos al analito; y

(c) identificar y/o cuantificar los analitos presentes en la muestra basándose en los iCORE identificados en (b).

2. El método de la reivindicación 1, en donde (b) comprende aislar los agentes de unión unidos al analito, opcionalmente, poniendo en contacto la muestra con un agente de afinidad que sea capaz de unirse a los analitos, ya sea solo o cuando esté unido a un agente de unión, y que pueda aislarse de la muestra.

3. El método de las reivindicaciones 1-2, en donde los iCORE comprenden 5-20 restos de aminoácidos o en donde los iCORE comprenden la misma secuencia de aminoácidos entre sí, opcionalmente la secuencia de aminoácidos EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1) o en donde los iCORE están marcados con isótopos.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde cada agente de unión comprende individualmente un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un aptámero o una adnectina, o en donde los agentes de unión se conjugan con las etiquetas de masa mediante un enlazador escindible.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el enlazador escindible es un enlazador fotoescindible.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el método comprende además escindir el iCORE del agente de unión usando luz UV.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde el agente de afinidad comprende una pluralidad de anticuerpos de unión a analito, fragmentos de anticuerpo, aptámeros o adnectinas conjugados a un sustrato sólido, opcionalmente una superficie de perlas.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde los iCORE comprenden cualquiera de SEQ ID NO: 8 a 17, como sigue:

e+3G+6VndneeGFfsAr-X-K(FAM)GGPQGIWGQC (SEQ ID NO: 8);

e+2G+6Vndnee+1GFfsAr-X-K(FAM)GGLVPRGSGC (SEQ ID NO: 9);

e+1G+6Vndnee+2GFfsAr-X-K(FAM)GGPVGLIGC (SEQ ID NO: 10);

eG+6Vndnee+2GFfs+1Ar-X-K(FAM)GGPWGIWGQGC (SEQ ID NO: 11);

eG+5VndneeGFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPVPLSLVMC (SEQ ID NO: 12);

e+3G+1Vndnee+1GFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPLGLRSWC (SEQ ID NO: 13);

e+3GVndneeG+6FfsAr-X-K(FAM)GGPLGVRGKC (SEQ ID NO: 14);

e+2GVndneeG+6Ffs+1Ar-X-K(FAM)GGf(PiP)RSGGGC (SEQ ID NO: 15);

e+1GVndnee+2G+6FfsAr-X-K(FAM)GGfPRSGGGC (SEQ ID NO: 16);

eGVndnee+3G+6FfsAr-X-K(FAM)GGf(PiP)KSGGGC (SEQ ID NO: 17),

en donde,

X representa ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico,

FAM representa carboxifluoresceína,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

9. El método de la reivindicación 1, en donde los iCORE se conjugan con un dominio vehículo mediante enlazadores escindibles con enzimas.

10. El método de la reivindicación 9, en donde el enlazador escindible con enzimas es un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos: PQGIWGQ (SEQ ID NO: 18), LVPRGSG (SEQ ID NO: 19), PVGLIG (SEQ ID NO: 20), PWGIWGQG (SEQ ID NO: 21), PVPLSLVM (SEQ ID NO: 22), PLGLRSW (SEQ ID NO: 23), PLGVRGK (SEQ ID NO: 24), GGPLANvafARGC (SEQ ID NO: 35), f(PiP)RSGGG (SEQ ID NO: 25), fPRSGGG (SEQ ID NO: 26) o f(PiP)KSGGG (SEQ ID NO: 27),

en donde,

Nva representa norvalina,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

11. Un conjunto de reactivos de unión conjugados con una pluralidad de indicadores codificados por isótopos (iCORE), en donde los agentes de unión son capaces de unirse específicamente a un conjunto de analitos, en condiciones adecuadas para que los agentes de unión se unan a los analitos, en donde el conjunto de agentes de unión comprende al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 agentes de unión conjugados con iCORE diferentes, en donde los iCORE son etiquetas de masa de péptidos y los agentes de unión se conjugan con los iCORE mediante un enlazador fotoescindible.

12. El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con la reivindicación 11, en donde los iCORE comprenden 5­ 20 restos de aminoácidos o

en donde los iCORE comprenden la misma secuencia de aminoácidos entre sí, opcionalmente la secuencia de aminoácidos EGVNDNEEGFFSAR (SEQ ID NO: 1) o en donde los iCORE están marcados con isótopos.

13. El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde cada agente de unión comprende individualmente un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un aptámero o una adnectina, o en donde los agentes de unión se conjugan con las etiquetas de masa mediante un enlazador escindible, opcionalmente en donde el enlazador escindible es un enlazador fotoescindible.

14. El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde los iCORE comprenden cualquiera de SEQ ID NO: 8 a 17, como sigue:

e+3G+6VndneeGFfsAr-X-K(FAM)GGPQGIWGQC (SEQ ID NO: 8);

e+2G+6Vndnee+1GFfsAr-X-K(FAM)GGLVPRGSGC (SEQ ID NO: 9);

e+1G+6Vndnee+2GFfsAr-X-K(FAM)GGPVGLIGC (SEQ ID NO: 10);

eG+6Vndnee+2GFfs+1Ar-X-K(FAM)GGPWGIWGQGC (SEQ ID NO: 11);

eG+5VndneeGFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPVPLSLVMC (SEQ ID NO: 12);

e+3G+1Vndnee+1GFfs+4Ar-X-K(FAM)GGPLGLRSWC (SEQ ID NO: 13);

e+3GVndneeG+6FfsAr-X-K(FAM)GGPLGVRGKC (SEQ ID NO: 14);

e+2GVndneeG+6Ffs+1Ar-X-K(FAM)GGf(PiP)RSGGGC (SEQ ID NO: 15);

e+1GVndnee+2G+6FfsAr-X-K(FAM)GGfPRSGGGC (SEQ ID NO: 16);

eGVndnee+3G+6FfsAr-X-K(FAM)GGf(PiP)KSGGGC (SEQ ID NO: 17),

en donde,

X representa ácido 3-amino-3-(2-nitrofenil)propiónico,

FAM representa carboxifluoresceína,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.

15. El conjunto de reactivos de unión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en donde los iCORE se conjugan con un dominio vehículo mediante enlazadores escindibles con enzimas, opcionalmente en donde el enlazador escindible con enzimas es un enlazador peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos: PQGIWGQ (SEQ ID NO: 18), LVPRGSG (SEQ ID NO: 19), PVGLIG (SEQ ID NO: 20), PWGIWGQG (SEQ ID NO: 21), PVPLSLVM (SEQ ID NO: 22), PLGLRSW (SEQ ID NO: 23), PLGVRGK (SEQ ID NO: 24), GGPLANvafARGC (SEQ NO: 35), f(PiP)RSGGG (SEQ ID NO: 25), fPRSGGG (SEQ ID NO: 26) o f(PiP)KSGGG (SEQ ID NO: 27) en donde,

Nva representa norvalina,

PiP representa ácido pipecólico y

minúscula representa d-aminoácido.