BR112020012696A2 - diagnóstico multiplex com base em sistema efetor crispr - Google Patents

diagnóstico multiplex com base em sistema efetor crispr Download PDF

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BR112020012696A2
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Feng Zhang
Bernd Zetsche
Jonathan Gootenberg
Omar Abudayyeh
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The Broad Institute Inc.
Massachusetts Institute Of Technology
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Abstract

as modalidades aqui divulgadas utilizam efetores de direcionamento de rna para fornecer um diagnóstico robusto baseado em crispr com sensibilidade atomolar. as modalidades divulgadas neste documento podem detectar dna e rna de caldo com níveis comparáveis de sensibilidade e podem diferenciar alvos de não alvos com base em diferenças de pares de base únicos. além disso, as modalidades divulgadas neste documento podem ser preparadas em formato liofilizado para distribuição conveniente e aplicações de ponto de atendimento (poc). tais modalidades são úteis em múltiplos cenários em saúde humana, incluindo, por exemplo, detecção viral, tipagem de cepa bacteriana, genotipagem sensível e detecção de dna livre de células associadas à doença.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: ”DIAGNÓSTICO MULTIPLEX COM BASE EM SISTEMA EFETOR CRISPR”
REFERÊNCIA CRUZADA A APLICAÇÕES RELACIONADAS
[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório No. 62/610.066, protocolado em 22 de dezembro de 2017; Pedido Provisório No. 62/623.546, apresentado em 29 de janeiro de 2018; Pedido Provisório No. 62/630.814, apresentado em 14 de fevereiro de 2018; e Pedido Provisório No. 62/741.501, registrado em 4 de outubro de 2018. Todo o conteúdo de cada um dos pedidos acima é incorporado por referência neste documento.
DECLARAÇÃO SOBRE PESQUISA PATROCINADA PELO GOVERNO FEDERAL
[0002] Esta invenção foi feita com apoio do governo de acordo com os números de concessão MH110049 e HL141201 concedidos pelo National Institutes of Health. O governo tem determinados direitos sobre a invenção.
REFERÊNCIA PARA UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0003] O conteúdo da listagem de sequências eletrônicas (BROD-2445WP.ST25.txt ”; o tamanho é de 1,8 megabytes e foi criado em 27 de novembro de 2018) é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA TÉCNICA
[0004] O assunto aqui divulgado é geralmente direcionado a diagnósticos rápidos relacionados ao uso de sistemas efetores CRISPR.
Fundamentos
[0005] Os ácidos nucléicos são uma assinatura universal de informações biológicas.A capacidade de detectar rapidamente ácidos nucleicos com alta sensibilidade e especificidade de base única em uma plataforma portátil tem o potencial de revolucionar o diagnóstico e o monitoramento de muitas doenças, fornecer informações epidemiológicas valiosas e servir como uma ferramenta científica generalizável.Embora muitos métodos tenham sido desenvolvidos para a detecção de ácidos nucléicos (Du et al., 2017; Green et al., 2014; Kumar et al., 2014; Pardee et al., 2014; Pardee et al., 2016; Urdea et al.,2006), eles inevitavelmente sofrem trocas entre sensibilidade, especificidade, simplicidade e velocidade.Por exemplo, as abordagens de qPCR são sensíveis, mas são caras e dependem de instrumentação complexa, limitando a usabilidade a operadores altamente treinados em ambientes de laboratório.Outras abordagens, como novos métodos que combinam a amplificação isotérmica de ácido nucleico com plataformas portáteis (Du et al., 2017; Pardee et al., 2016), oferecem alta especificidade de detecção em um ambiente de ponto de atendimento (POC), mas apresentam algumas aplicações limitadas devido à baixa sensibilidade.À medida que o diagnóstico de ácidos nucléicos se torna cada vez mais relevante para uma variedade de aplicações na área da saúde, as tecnologias de detecção que fornecem alta especificidade e sensibilidade a baixo custo seriam de grande utilidade em ambientes de pesquisa clínica e básica.
SUMÁRIO
[0006] Em um aspecto, a invenção fornece um sistema de detecção de ácido nucleico compreendendo: dois ou mais sistemas CRISPR e um construto de mascaramento. Cada sistema CRISPR compreende uma proteína efetora e uma molécula guia compreendendo uma sequência guia projetada para se ligar às moléculas alvo correspondentes; um construto de mascaramento; e opcionalmente, reagentes de amplificação de ácido nucleico para amplificar moléculas alvo em uma amostra.Cada construto de mascaramento compreende ainda uma sequência de motivos de corte que é preferencialmente cortada por um dos sistemas CRISPR ativados.
[0007] Os dois ou mais sistemas efetores CRISPR podem ser proteínas efetoras direcionadas a RNA, proteínas efetoras direcionadas a DNA ou uma combinação das mesmas.As proteínas efetoras direcionadas a RNA podem ser uma proteína Cas13, como Cas13a, Cas13b ou Cas13c.A proteína efetora direcionada ao DNA pode ser uma proteína Cas12, como Cpf1 e C2c1.
[0008] Em outras modalidades, o sistema pode ainda compreender reagentes de amplificação de ácido nucleico.Os reagentes de amplificação de ácido nucleico podem compreender um iniciador compreendendo um promotor de RNA polimerase.Em certas modalidades, os ácidos nucleicos da amostra são amplificados para obter um modelo de DNA compreendendo um promotor de RNA polimerase, pelo qual uma molécula de RNA alvo pode ser gerada por transcrição.O ácido nucleico pode ser DNA e amplificado por qualquer método aqui descrito.O ácido nucleico pode ser RNA e amplificado por um método de transcrição reversa como aqui descrito. A sequência do aptâmero pode ser amplificada após o desmascaramento do local de ligação do iniciador, pelo que um RNA gatilho é transcrito a partir do produto de DNA amplificado.A molécula alvo pode ser um DNA alvo e o sistema pode ainda compreender um iniciador que se liga ao DNA alvo e compreende um promotor de RNA polimerase.
[0009] Em uma modalidade exemplar, a proteína efetora do sistema CRISPR é uma proteína efetora direcionada ao RNA.Exemplo de proteínas efetoras direcionadas a RNA incluem Cas13b e C2c2 (agora conhecido como Cas13a).Será entendido que o termo "C2c2" aqui é usado de forma intercambiável com "Cas13a".Em outro exemplo de modalidade, a proteína efetora direcionada a RNA é C2c2.Em outras modalidades, a proteína efetora C2c2 é de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Leptotriquia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifator, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flaviivola Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter e Lachnospira, ou a proteína efetiva C2c2 é um organismo selecionado do grupo constituído por: Leptotrichia shahii.
wadei, Listeria seeligeri, Clostridium aminophilum, Carnobacterium gallinarum, Paludibacter propionicigenes, Listeria weihenstephanensis ou a proteína efetiva C2c2 é uma proteína efetiva L. wadei F0279 ou L. wadei F0279 (Lw2) C2C2.Em outra modalidade, o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo, variante de emenda de um transcrito ou uma mutação de deslocamento de quadro em um RNA ou DNA alvo.
[0010] Em outras modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo que são diagnósticas para um estado de doença.Em ainda outras modalidades, o estado da doença é uma infecção, uma doença de órgão, uma doença do sangue, uma doença do sistema imunológico, um câncer, uma doença do cérebro e do sistema nervoso, uma doença endócrina, uma doença relacionada à gravidez ou ao parto, uma doença herdada, ou uma doença adquirida ambientalmente. Em ainda outras modalidades, o estado da doença é câncer ou uma doença autoimune ou uma infecção.
[0011] Em outras modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo compreendendo mutações somáticas específicas do câncer.A mutação específica do câncer pode conferir resistência ao medicamento.Amutação da resistência aos medicamentos pode ser induzida pelo tratamento com ibrutinibe, erlotinibe, imatinibe, gefitinibe, crizotinibe, trastuzumabe, vemurafenibe, RAF/MEK, terapia de bloqueio no ponto de verificação ou terapia antiestrogênio.As mutações específicas do câncer podem estar presentes em um ou mais genes que codificam uma proteína selecionada do grupo que consiste no ligante de morte programado 1 (PD-L1), receptor de androgênio (AR), tirosina quinase de Bruton (BTK), receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), BCR- Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1 e ESR1.A mutação específica do câncer pode ser uma mutação em um gene selecionado do grupo que consiste em CASP8, B2M, PIK3CA, SMC1A, ARID5B, TET2, ALPK2, COL5A1, TP53, DNER, NCOR1, MORC4, CIC, IRF6, MYOCD, ANKLE1, CNKSR1,NF1, SOS1, ARID2, CUL4B, DDX3X, FUBP1, TCP11L2, HLA-A, B ou C, CSNK2A1, MET, ASXL1, PD-L1, PD-L2, IDO1, IDO2, ALOX12B e ALOX15B ou ganho de número de cópias,
excluindo eventos cromossômicos inteiros, afetando qualquer uma das seguintes bandas cromossômicas: 6q16.1-q21, 6q22.31-q24.1, 6q25.1-q26, 7p11.2-q11.1, 8p23.1, 8p11.23− p11.21 (contendo IDO1, IDO2), 9p24.2-p23 (contendo PDL1, PDL2), 10p15.3, 10p15.1-p13, 11p14.1, 12p13.32-p13.2, 17p13.1 (contendo ALOX12B,ALOX15B) e 22q11.1-q11.21.
[0012] Em outras modalidades, o um ou mais RNAs guia podem ser projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo compreendendo marcadores de perda de heterozigose (LOH).
[0013] Em outras modalidades, o um ou mais RNAs guia podem ser projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo compreendendo polimorfismos de nucleotídeo único (SNP). A doença pode ser uma doença cardíaca e as moléculas alvo podem ser VKORC1, CYP2C9 e CYP2C19.
[0014] Em outras modalidades, o estado da doença pode ser uma doença relacionada à gravidez ou ao parto ou uma doença herdada.Por conseguinte, a amostra pode ser uma amostra de sangue ou de linfonodo.A doença pode ser selecionada do grupo que consiste em Trissomia 13, Trissomia 16, Trissomia 18, síndrome de Klinefelter (47, XXY), (47, XYY) e (47, XXX), síndrome de Turner, síndrome de Down (trissomia 21), cística Fibrose, Doença de Huntington, Beta Talassemia, Distrofia Miotônica, Anemia Falciforme, Porfiria, Síndrome do XFrágil, Translocação
Robertsoniana, Síndrome de Angelman, Síndrome de DiGeorge e Síndrome de Wolf-Hirschhorn.
[0015] Em outras modalidades, a infecção é causada por um vírus, uma bactéria ou um fungo, ou a infecção é uma infecção viral.Em modalidades específicas, a infecção viral é causada por um vírus de RNA de fita dupla, um vírus de RNA de sentido positivo, um vírus de RNA de sentido negativo, um retrovírus ou uma combinação dos mesmos, ou a infecção viral é causada por um vírus de Coronaviridae, um Picornaviridae vírus, um vírus Caliciviridae, um vírus Flaviviridae, um vírus Togaviridae, um Bornaviridae, um Filoviridae, um Paramyxoviridae, um Pneumoviridae, um Rhabdoviridae, um Arenaviridae, um Bunyaviridae, um Orthomyavovida vírus ou um Deltavírus ou Coronário,SARS, poliovírus, rinovírus, hepatite A, vírus de Norwalk, vírus da febre amarela, vírus do Nilo Ocidental, vírus da hepatite C, vírus da dengue, vírus de Zika, vírus da rubéola, vírus do rio Ross, vírus do sindbis, vírus de chikungunya, vírus da doença de Borna, ebola vírus, vírus Marburg, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus Nipah, vírus Hendra, vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório humano, vírus da raiva, vírus da Lassa, Hantavírus, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, influenza ou vírus da hepatite D.
[0016] Em outras modalidades da invenção, o construto de mascaramento baseado em RNA suprime a geração de um sinal positivo detectável ou o construto de mascaramento baseado em RNA suprime a geração de um sinal positivo detectável mascarando o sinal positivo detectável ou gerando um sinal negativo detectável, ou o construto de mascaramento baseado em RNA compreende um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto genético codificado por um construto de relatório, em que o produto genético gera o sinal positivo detectável quando expresso.
[0017] Em outras modalidades, o construto de mascaramento baseado em RNA é uma ribozima que gera o sinal detectável negativo e em que o sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima é desativada ou a ribozima converte um substrato em uma primeira cor e em que o substrato converte em uma segunda cor quando a ribozima está desativada.
[0018] Em outras modalidades, o agente de mascaramento baseado em RNA é um aptâmero de RNA, ou o aptâmero sequestra uma enzima, em que a enzima gera um sinal detectável após a liberação do aptâmero, agindo sobre um substrato, ou o aptâmero sequestra um par de agentes que quando liberados dos aptâmeros se combinam para gerar um sinal detectável.
[0019] Em outra modalidade, o construto de mascaramento baseado em RNAcompreende um oligonucleotídeo de RNA ao qual um ligante detectável e um componente de mascaramento estão ligados.Em outra modalidade, o ligante detectável é um fluoróforo e o componente de mascaramento é uma molécula inibidora, ou os reagentes para amplificar moléculas de RNA alvo, tais como, sem limitação, reagentes NASBA ou RPA.
[0020] Em outro aspecto, a invenção fornece um dispositivo de diagnóstico compreendendo um ou mais volumes discretos individuais, cada volume discreto individual compreendendo uma proteína efetora CRISPR, um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem à molécula alvo correspondente, um construto de mascaramento baseado em RNA e, opcionalmente, compreendem ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico.
[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece um dispositivo de diagnóstico compreendendo um ou mais volumes distintos individuais, cada volume distinto individual compreendendo uma proteína efetora CRISPR, um ou mais RNAs guia projetados para se ligar a um RNA gatilho, um ou mais aptâmeros de detecção compreendendo um sítio de ligação do promotor de RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação do iniciador mascarado e, opcionalmente, compreendendo ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico.
[0022] Em algumas modalidades, os volumes discretos individuais são gotículas, ou os volumes discretos individuais são definidos em um substrato sólido, ou os volumes discretos individuais são micropoços, ou os volumes discretos individuais são pontos definidos em um substrato, como um substrato de papel.
[0023] Numa modalidade, a proteína efetora de direcionamento de RNA é uma proteína efetora de direcionamento de RNA tipo VI do CRISPR, como C2c2 ou Cas13b.Em certas modalidades de exemplo, a proteína efetora C2c2 é de um organismo selecionado do grupo que consiste em: Leptotriquia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifator, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flaviivola Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma e Campylobacter, ou a proteína efetora C2c2 é selecionada do grupo que consiste em: Leptotrichia shahii, L. wadei, Listeria seeligeri, Lachnospiraceae bacterium, Clostridium aminophilum, Carnobacterium gallinarum, Paludibacter propionicigenes, Listeria weihenstephanensis, Listeriaceae bacterium, and Rhodobacter capsulatus, a proteína efetora C2c2 é uma proteína efetora L. wadei F0279 ou L. wadei F0279 (Lw2) C2c2.Em outra modalidade, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais sequências de RNA alvo que são diagnósticas para um estado de doença.
[0024] Em certas modalidades de exemplo, o construto de mascaramento baseado em RNA suprime a geração de um sinal positivo detectável ou o construto de mascaramento baseado em RNA suprime a geração de um sinal positivo detectável mascarando o sinal positivo detectável ou gerando um sinal negativo detectável, ou o construto de mascaramento baseado em RNA compreende um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto genético codificado por um construto de relatório, em que o produto genético gera o sinal positivo detectável quando expresso.
[0025] Em outra modalidade exemplar, o construto de mascaramento baseada em RNA é uma ribozima que gera um sinal detectável negativo e em que o sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima é desativada. Em uma modalidade exemplar, a ribozima converte um substrato em uma primeira cor e em que o substrato converte em uma segunda cor quando a ribozima é desativada.Numa outra modalidade de exemplo, o agente de mascaramento baseado em RNA é um aptâmero de RNA que sequestra uma enzima, em que a enzima gera um sinal detectável após a liberação do aptâmero, agindo sobre um substrato, ou o aptâmero sequestra um par de agentes que quando liberados dos aptâmeros se combinam para gerar um sinal detectável.
[0026] Em outra modalidade de exemplo, o construto de mascaramento baseado em RNA compreende um oligonucleotídeo de RNA ao qual estão ligados um oligonucleotídeo de ligando detectável e um componente de mascaramento.Em certas modalidades exemplares, o ligante detectável é um fluoróforo e o componente de mascaramento é uma molécula inibidora.
[0027] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para detectar moléculas alvo em amostras, compreendendo: distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, os volumes discretos individuais compreendendo dois ou mais sistema CRISPR compreendendo uma proteína efetiva, uma ou mais RNAs guia, um construto de mascaramento; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo; ativar a duas ou mais proteínas efetoras de CRISPR por meio da ligação de um ou mais RNAs guia às uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora de CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseada em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.
[0028] Em certas modalidades exemplares, esses métodos compreendem ainda a amplificação do RNA da amostra ou do RNA gatilho.Em outras modalidades, o RNA de amplificação compreende a amplificação por NASBA ou RPA.
[0029] Em certas modalidades exemplificativas, a proteína efetora de direcionamento de RNA é uma proteína efetora de direcionamento de RNA tipo VI do CRISPR, como C2c2 ou Cas13b.Em outras modalidades de exemplo, a proteína efetora C2c2 é de um organismo selecionado do grupo que consiste em: Leptotriquia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifator, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flaviivola, Flaviivola, Flaviivola, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma e Campylobacter, ou a proteína efetora C2c2, é selecionada do grupo que consiste em: Leptotrichia shahii, L. wadei, Listeria seeligeri, Lachnospiraceae bacterium, Clostridium aminophilum, Carnobacterium gallinarum, Paludibacter propionicigenes, Listeria weihenstephanensis, Listeriaceae bacterium, e Rhodobacter capsulatus. Numa modalidade específica, a proteína efetora C2c2 é uma proteína efetiva L. wadei F0279 ou L. wadei F0279 (Lw2) C2C2. Em certas modalidades de exemplo, a proteína Cas12 é Cpf1.Cpf1 pode ser selecionado a partir de um organismo do gênero que consiste em; Estreptococos, Campylobacter, Nitratifrator,
Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria,
Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta,
Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium,
Rhodobacteridea, Clisteria, Paludibacterium, Clisteria
Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus,
Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae,
Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium ou
Acidaminococcus; por exemplo, uma proteína efetora quimérica compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento em que cada um dos primeiro e segundo fragmentos é selecionado a partir de um Cpf1 de um organismo que compreende Streptococcus, Campylobacter, Nitratifrator,
Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria,
Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerocha.
Lactobacillus,
Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter,
Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae,
Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella,
Alicyclobacillus, Methanometethyophilus, Porphyromocroidea,
Desotella,Brevibacilus, Methylobacterium ou
Acidaminococcus.Em certas modalidades exemplares, o Cpf1 é selecionado dentre um ou mais dos seguintes Acidaminococcus sp.BV3L6Cpf1 (AsCpf1); Francisella tularensis subsp.Novicida U112Cpf1 (FnCpf1); L. bacterium MC2017Cpf1
(Lb3Cpf1); Butyrivibrio proteoclasticus Cpf1 (BpCpf1);
Bactéria de Parcubacteria GWC2011_GWC2_44_17Cpf1 (PbCpf1);
Bactéria peregrinibactéria GW2011_GWA_33_10Cpf1 (PeCpf1); Leptospira inadai Cpf1 (LiCpf1); Smithella sp.SC_K08D17Cpf1 (SsCpf1); L. bactéria MA2020Cpf1 (Lb2Cpf1); Porphyromonas crevioricanis Cpf1 (PcCpf1); Porphyromonas macacae Cpf1 (PmCpf1); Candidatus Methanoplasma termitum Cpf1 (CMtCpf1); Eubacterium elegens Cpf1 (EeCpf1); Moraxella bovoculi 237Cpf1 (MbCpf1); Prevotella disiens Cpf1 (PdCpf1); ou L.
bacterium ND2006Cpf1 (LbCpf1).
[0030] Em certas modalidades de exemplo, a proteína Cas12 é uma proteína C2c1. C2c1 pode ser selecionado a partir de um organismo do gênero que consiste em Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus, Desulfatirhabdium, Elusimicrobia,Citrobacter, Methylobacterium, Omnitrophicai, Phycisphaerae, Planctomycetes, Spirochaetes, e Verrucomicrobiaceae.Em certas modalidades de exemplo, o C2c1 pode ser selecionado de um ou mais dos seguintes; Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo, ATCC49025), Alicyclobacillus contaminans (por exemplo, DSM17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (por exemplo, DSM17980), Bacillus hisashii cepa C4, Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (por exemplo, DSM10711), Desulfonatronum thiodismutans (por exemplo, cepa MLF-1), Elusimicrobia bacteriumRIFOXYA12, Omnitrophica
WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacteriumST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacteriumRBG_13_46_10, Spirochaetes bacteriumGWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacteriumUBA2429, Tuberibacillus calidus (por exemplo, DSM17572), Bacillus thermoamylovorans (por exemplo, cepa B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (por exemplo, DSM18734), Alicyclobacillus herbarius (por exemplo, DSM13609), Citrobacter freundii (por exemplo, ATCC8090), Brevibacillus agri (por exemplo, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (por exemplo, ORS2060).
[0031] Em certas modalidades de exemplo, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo que são diagnósticas para um estado de doença. Em certas outras modalidades de exemplo, o estado da doença é uma infecção, uma doença de órgão, uma doença do sangue, uma doença do sistema imunológico, um câncer, uma doença do cérebro e do sistema nervoso, uma doença endócrina, uma doença relacionada à gravidez ou ao parto, uma doença herdada, ou uma doença adquirida ambientalmente, câncer ou infecção fúngica, infecção bacteriana, infecção parasitária ou infecção viral. Em certas modalidades de exemplo, o construto de mascaramento suprime a geração de um sinal positivo detectável, ou o construto de mascaramento suprime a geração de um sinal positivo detectável mascarando o sinal positivo detectável ou gerando um sinal negativo detectável, ou o construto de mascaramento compreende um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto genético codificado por um construto de relatório, em que o produto de gene gera o sinal positivo detectável quando expresso, ou o construto de mascaramento é uma ribozima que gera o sinal detectável negativo e em que o sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima está inativada. Em outras modalidades de exemplo, a ribozima converte um substrato em um primeiro estado e em que o substrato converte em um segundo estado quando a ribozima é inativada, ou o agente de mascaramento é um aptâmero, ou o aptâmero sequestra uma enzima, em que a enzima gera um detectável sinal após a liberação do aptâmero agindo sobre um substrato, ou o aptâmero sequestra um par de agentes que quando liberados dos aptâmeros se combinam para gerar um sinal detectável. Em ainda outras modalidades, o construto de mascaramento de RNA compreende um oligonucleotídeo de RNA ou DNA com um ligando detectável em uma primeira extremidade do oligonucleotídeo de RNA ou DNA e um componente de mascaramento em uma segunda extremidade do oligonucleotídeo de RNA ou DNA, ou o ligando detectável é um fluoróforo e o componente de mascaramento é uma molécula de extintor.
[0032] Em outro aspecto, a invenção fornece um dispositivo de fluxo lateral que compreende um substrato com uma primeira extremidade, em que a primeira extremidade compreende uma porção de carregamento de amostra e uma primeira região carregada com um ligando detectável, dois ou mais sistemas efetores CRISPR, dois ou mais construtos de detecção, uma ou mais primeiras regiões de captura, cada uma compreendendo um primeiro agente de ligação, duas ou mais segundas regiões de captura, cada uma compreendendo um segundo agente de ligação, em que cada um dos dois ou mais sistemas efetores CRISPR compreende uma proteína efetora CRISPR e uma ou mais sequências guia, cada sequência guia configurada para ligar uma ou mais moléculas alvo.
[0033] Em algumas modalidades, cada um dos dois ou mais construtos de detecção compreende um oligonucleotídeo de RNA ou DNA, compreendendo uma primeira molécula em uma primeira extremidade e uma segunda molécula em uma segunda extremidade. Em modalidades específicas, o dispositivo de fluxo lateral pode compreender dois sistemas efetores CRISPR e dois construtos de detecção. Em modalidades ainda mais específicas, o dispositivo de fluxo lateral pode compreender quatro sistemas efetores CRISPR e quatro construtos de detecção.
[0034] A porção de carregamento de amostra pode ainda compreender um ou mais reagentes de amplificação para amplificar a uma ou mais moléculas alvo.
[0035] Em algumas modalidades, um primeiro construto de detecção compreende FAM como uma primeira molécula e biotina como uma segunda segunda molécula ou vice-versa e um segundo construto de detecção compreende FAM como uma primeira molécula e Digoxigenina (DIG) como uma segunda molécula ou vice-versa. Em algumas modalidades, a proteína de efetor CRISPR é uma proteína efetora direcionada a RNA.Em algumas modalidades, a proteína efetora direcionada a RNA é C2c2.Em algumas modalidades, a proteína efetora de direcionamento de RNA é Cas13b.
[0036] Em algumas modalidades, um primeiro construto de detecção pode compreender Tye665 como uma primeira molécula e Alexa-fluor-488 como uma segunda molécula ou vice-versa; um segundo construto de detecção pode compreender Tye665 como uma primeira molécula e FAM como uma segunda molécula ou vice-versa; um terceiro construto de detecção pode compreender Tye665 como uma primeira molécula e biotina como uma segunda molécula ou vice-versa; e um quarto construto de detecção pode compreender Tye665 como uma primeira molécula e DIG como uma segunda molécula ou vice-versa.
[0037] Em algumas modalidades, a proteína de efetor CRISPR pode ser uma proteína efetora direcionada a RNA ou direcionada a DNA.O efetor de direcionamento de RNA pode ser C2c2 ou Cas13b.Em algumas modalidades, a proteína efetora direcionada ao DNA é Cas12a.
[0038] Estes e outros aspectos, objetos, recursos e vantagens das modalidades exemplares tornar-se-ão evidentes àqueles versados na técnica mediante consideração da seguinte descrição detalhada de modalidades exemplares ilustradas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0039] FIG.1 - é um esquema de um sistema efetor CRISPR baseado em C2c2 de exemplo.
[0040] FIGs. 2A-2F – fornecem (FIG. 2A) esquemáticos do locus de CRISPR/C2c2 de Leptotrichia wadei.
As estruturas representativas de crRNA dos sistemas LwC2c2 e LshC2c2 são mostradas.(SEQ.IDNos. 1 e 2) (FIG. 2B) Esquema do ensaio bacteriano in vivo para a atividade de C2c2.Um protospacer é clonado a montante do gene da beta- lactamase em um plasmídeo resistente à ampicilina, e esse construto é transformado em E. coli que expressa C2c2 em conjunto com um espaçador de direcionamento ou não de direcionamento. Transformantes bem-sucedidos são contados para quantificar a atividade.(FIG. 2C) Quantificação de LwC2c2 e LshC2c2 in vivo. (n = 2 réplicas biológicas; as barras representam média ± s.e.m.) (Fig. 2D) Filtração em gel de exclusão de tamanho final de LwC2c2. (FIG. 2E) Gel de acrilamida corado com azul de Coomassie da purificação por etapas de LwC2c2.(FIG. 2F) Atividade de LwC2c2 contra diferentes alvos de PFS.OLwC2c2 foi direcionado contra o RNA fluorescente com PFS variável 3 'que flanqueia o espaçador, e os produtos da reação foram visualizados em gel desnaturante.LwC2c2 mostra uma leve preferência contra o GPFS.
[0041] FIG. 3 - Mostra a detecção de um exemplo de construto de mascaramento em diferentes diluições usando 1 µg, 100 ng, 10 ng e 1 ng de alvo com 4 quantidades diferentes de proteína / crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) com 2 conjuntos de crRNAs, sem condição de crRNA, duplicados técnicos, em (96+48)*2 = 288 reações, medidas em um intervalo de 5 minutos durante 3 horas.
[0042] FIG. 4 - Mostra a detecção de um exemplo de construto de mascaramento em diferentes diluições usando 1 µg, 100 ng, 10 ng e 1 ng de alvo com 4 quantidades diferentes de proteína / crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) com 2 conjuntos de crRNAs, sem condição de crRNA, duplicados técnicos, em (96+48)*2 = 288 reações, medidas em um intervalo de 5 minutos durante 3 horas.
[0043] FIG. 5 - Mostra a detecção de um exemplo de construto de mascaramento em diferentes diluições usando 1 µg, 100 ng, 10 ng e 1 ng de alvo com 4 quantidades diferentes de proteína / crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) com 2 conjuntos de crRNAs, sem condição de crRNA, duplicados técnicos, em (96+48)*2 = 288 reações, medidas em um intervalo de 5 minutos durante 3 horas.
[0044] FIG. 6 - Mostra a detecção de um exemplo de construto de mascaramento em diferentes diluições usando 1 µg, 100 ng, 10 ng e 1 ng de alvo com 4 quantidades diferentes de proteína / crRNA (1:4, 1:16, 1:32, 1:64) com 2 conjuntos de crRNAs, sem condição de crRNA, duplicados técnicos, em (96+48)*2 = 288 reações, medidas em um intervalo de 5 minutos durante 3 horas.
[0045] FIG. 7 - fornece um esquema de um esquema de detecção de exemplo usando um construto de mascaramento e proteína de efetor CRISPR, de acordo com certas modalidades de exemplo.
[0046] FIG. 8 - fornece um conjunto de gráficos que mostram mudanças na fluorescência ao longo do tempo ao detectar um alvo usando diferentes conjuntos de RNAs guia.
[0047] FIG. 9 - fornece um gráfico que mostra a fluorescência normalizada detectada em diferentes diluições do RNA alvo em concentrações variáveis da proteína de efetor CRISPR.
[0048] FIG. 10 - é um esquema que mostra as etapas gerais de uma reação de amplificação do NASBA.
[0049] FIG. 11 - fornece um gráfico que mostra a detecção do ssRNA1 do ácido nucleico amplificado por NASBA com três conjuntos de iniciadores diferentes e, em seguida, submetidos à detecção colateral de C2c2 usando uma sonda fluorescente extinta (n = 2 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.).
[0050] FIG. 12 - fornece um gráfico mostrando que o efeito colateral pode ser usado para detectar a presença de um RNA alvo lentiviral.
[0051] FIG. 13 - fornece um gráfico demonstrando que o efeito colateral e o NASBA podem detectar espécies em concentrações aM.
[0052] FIG. 14 - fornece um gráfico demonstrando que o efeito colateral e o NASBA discriminam rapidamente amostras de baixa concentração.
[0053] FIG. 15 - Mostra que a fluorescência normalizada em determinados momentos é preditiva da concentração de entrada da amostra.As medições de fluorescência da detecção de Cas13a sem amplificação estão correlacionadas com a concentração de RNA de entrada.(n=2 réplicas biológicas; barras representam média ± s.e.m.).
[0054] FIG. 16 - fornece um esquema da reação RPA, mostrando os componentes participantes na reação.
[0055] FIG. 17 - esquema de SHERLOCK; fornece um esquema mostrando a detecção de alvos de DNA ou RNA via incorporação de uma etapa RPA ou RT-RPA de acordo. Após o reconhecimento do RNA alvo, o efeito colateral faz com que C2c2 corte o repórter de clivagem, gerando fluorescência.Quantidades de molécula única de RNA ou DNA podem ser amplificadas para DNA via amplificação por recombinase polimerase (RPA) e transcritas para produzir RNA, que é então detectado por C2c2.
[0056] FIG. 18 - fornece um esquema do alvo de ssRNA detectado através da detecção colateral de C2c2 (SEQ.
I.D.Nos 3 e 4).
[0057] FIG. 19 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando a detecção de DNA de molécula única usando RPA (ou seja, 15 minutos após a adição de C2c2).
[0058] FIG. 20 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando que a mistura da T7 polimerase em uma reação RPA afeta adversamente a detecção de DNA.
[0059] FIG. 21 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando que a mistura da polimerase em uma reação RPA não afeta adversamente a detecção de DNA.
[0060] FIG. 22 - fornece um gráfico demonstrando que as reações de detecção de RPA, transcrição T7 e C2c2 são compatíveis e alcançam a detecção de molécula única quando incubadas simultaneamente (n = 2 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.).
[0061] FIG. 23 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando a eficácia das incubações rápidas no tempo de RPA-RNA.
[0062] FIG. 24 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando que o aumento da quantidade de polimerase T7 aumenta a sensibilidade ao RNA-RPA.
[0063] FIG. 25- fornece um conjunto de gráficos mostrando os resultados de um ensaio de detecção de RPA-DNA usando uma reação de um pote com enzimas 1,5x.Detecção de molécula única (2aM) alcançada em 30 minutos.
[0064] FIG. 26 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando que uma reação de um potenciômetro RPA-DNA demonstra uma diminuição quantitativa na fluorescência em relação à concentração de entrada.A curva ajustada revela relação entre a concentração alvo de entrada e a fluorescência de saída.
[0065] FIGs 27A, 27B - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando que (FIG. 27A) a detecção de C2c2 de RNA sem amplificação pode detectar o alvo de ssRNA em concentrações abaixo de 50 fM. (n=2 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.), e que (FIG. 27B) a reação RPA-C2c2 é capaz de detecção de DNA de molécula única (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.).
[0066] FIG. 28 - fornece um conjunto de gráficos demonstrando que um sinal C2c2 gerado de acordo com certas modalidades de exemplo pode detectar um alvo de 20 pM em um substrato de papel.
[0067] FIG. 29 - fornece um gráfico mostrando que um inibidor de RNAse específico é um cabo de remoção do sinal de fundo no papel.
[0068] FIG. 30 é um conjunto de gráficos que mostram a detecção usando sistemas de acordo com certas modalidades exemplificativas em substratos de fibra de vidro.
[0069] FIGs. 31A-31D - fornece um conjunto de gráficos fornecendo (FIG. 31A) um esquema da detecção de RNA de Zika de acordo com certas modalidades de exemplo. O lentivírus foi empacotado com RNA de Zika ou fragmentos homólogos do RNA da dengue, alvo de detecção colateral de C2c2. O meio é colhido após 48 horas e submetido à lise térmica, RT-RPA e detecção de C2c2. (FIG. 31B) A detecção de RT-RAP-C2c2 é capaz de detecção altamente sensível das partículas lentivirais de Zika (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; *****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.) (FIG. 31C) Um esquema da detecção de RNA de Zika usando C2c2 liofilizado em papel, de acordo com certas modalidades de exemplo. (FIG. 31D) O ensaio à base de papel é capaz de detectar partículas de lentivírus de zika altamente sensíveis (réplicas técnicas n-4, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; **, p <0,01, as barras representam média ± s.e.m.).
[0070] FIGs. 32A, 32B - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando (FIG. 32A) um esquema para a detecção de C2c2 do RNA de Zika isolado do soro humano. ORNA de zika no soro é submetido à transcrição reversa, à degradação da RNase H do RNA, à RPA do cDNA e à detecção de C2c2. (FIG.
32B) C2c2 é capaz de detecção altamente sensível de amostras de soro humano de Zika. As concentrações de RNA de Zika mostradas foram verificadas por qPCR (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p &lt; 0,0001; barras representam média ± s.e.m.).
[0071] FIGs. 33A-33G - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando que (Fig. 33A) C2c2 liofilizado é capaz de detecção sensível do ssRNA1 na faixa femtomolar baixa. C2c2 é capaz de detecção rápida de um alvo de ssRNA1200pM em papel na forma líquida (FIG. 33B) ou liofilizada (FIG. 33C). A reação é capaz de detecção sensível de fragmentos de RNA de Zika sintetizados em solução (FIG. 33D) (n=3) e na forma liofilizada (FIG. 33E) (n=3). (FIG. 33F) Curva quantitativa para detecção de cDNA de zika humano mostrando correlação significativa entre a concentração de entrada e a fluorescência detectada. (FIG.
33G) A detecção C2c2 de ssRNA1 realizada na presença de quantidades variáveis de soro humano (n=2 réplicas técnicas, salvo indicação em contrário; barras representam média ± s.e.m.).
[0072] FIGs. 34A-34C - fornecem (FIG. 34A) o esquema da detecção de C2c2 do gene 16S rRNA de genomas bacterianos usando um conjunto de iniciadores V3RPA universal e a capacidade de obter detecção sensível e específica de (FIG. 34B) GDNA de E. coli ou (FIG. 34C) P.
aeruginosa usando um ensaio realizado de acordo com certas modalidades de exemplo (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.). Ec, Escherichia coli; Kp, Klebsiella pneumoniae; Pa, Pseudomonas aeruginosa; Mt, Mycobacterium tuberculosis; Sa, Staphylococcus aureus.
[0073] FIGs. 35A, 35B - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando (FIG. 35A) a detecção de dois genes diferentes de resistência ao carbapenem (KPC e NDM-1) de quatro isolados clínicos diferentes de Klebsiella pneumoniae e (FIG. 35B) a detecção de resistência ao carbapenem (parte A) é normalizada como uma razão de sinal entre os ensaios de KRPC e NDM-1 crRNA (n=2 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.).
[0074] FIGs. 36A-36C - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando que (FIG. 36A) C2c2 não é sensível a incompatibilidades únicas, mas pode distinguir entre diferenças de nucleotídeo único no alvo quando carregado com crRNAs com incompatibilidades adicionais. Os alvos de ssRNA1-3 foram detectados com 11 crRNAs, com 10 espaçadores contendo incompatibilidades sintéticas em várias posições no crRNA. Os espaçadores incompatíveis não mostraram clivagem reduzida do alvo 1, mas mostraram clivagem inibida dos alvos 2 e 3 de incompatibilidade (SEQ.IDs 5 a 18).(FIG.
36B) Esquema mostrando o processo para o projeto racional de espaçadores específicos de base única com incompatibilidades sintéticas.As incompatibilidades sintéticas são colocadas próximas ao SNP ou à base de interesse (SEQ.I.D. Nos. 19 a 23). (FIG. 36C) A detecção altamente específica de SNPs da cepa permite a diferenciação de alvos de Zika Africano versus RNAAmericano que diferem em apenas um nucleotídeo usando a detecção de C2c2 com crRNAs truncados (23 nucleotídeos) (n = 2 réplicas técnicas, teste t de Student com uma cauda; *, p <0,05; ****, p 0,0001; as barras representam média ± s.e.m.).
[0075] FIGs. 37A-37D - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando: (FIG. 37A) o esquema das regiões alvo da cepa de Zika e as sequências de crRNA usadas para a detecção (SEQ. I.D. Nos. 24 a 29). Os SNPs no alvo são destacados em vermelho ou azul e as incompatibilidades sintéticas na sequência guia são coloridas em vermelho.
(FIG. 37B) A detecção altamente específica de SNPs da cepa permite a diferenciação de alvos de Zika Africano versus RNAAmericano usando SHERLOCK (n = 2 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.) (SEQ. I.D. Nos. 30 a 35). (FIG.
37C) Esquema das regiões alvo da cepa da dengue e das sequências de crRNA usadas para a detecção.Os SNPs no alvo são destacados em vermelho ou azul e as incompatibilidades sintéticas na sequência guia são coloridas em vermelho.
(FIG. 37D) A detecção altamente específica de SNPs da cepa permite a diferenciação de alvos de cepa de Dengue 1 versus RNA cepa 3 usando SHERLOCK (n = 2 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.).
[0076] FIGs. 38A-38D - fornecem um conjunto de gráficos mostrando (FIG. 38A) circos plot mostrando a localização de SNPs humanos detectados com C2c2. (FIG. 38B) O ensaio realizado de acordo com certas modalidades de exemplo pode distinguir entre SNPs humanos. OSHERLOCK pode genotipar corretamente quatro indivíduos diferentes em quatro locais SNP diferentes no genoma humano. Os genótipos para cada indivíduo e as identidades dos crRNAs com detecção de alelos são anotados abaixo de cada gráfico (n=4 réplicas técnicas; teste t de Student bicaudal; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 38C) Um esquema do processo para detecção de cfDNA (como detecção de DNA sem células de mutações de câncer) de acordo com certas modalidades de exemplo. (FIG. 38D) Exemplo de sequências de crRNA para detectar EGFRL858R e BRAFV600E. (SEQ.I.D. Nos.
36 a 41). Sequências de dois locos genômicos testados quanto a mutações de câncer no DNA sem células.É mostrada a sequência genômica alvo com o SNP destacado em azul e as sequências de crRNA com detecção de mutante/tipo selvagem com incompatibilidades sintéticas coloridas em vermelho.
[0077] FIGs. 39A, 39B - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando que o C2c2 pode detectar o alelo menor mutante em amostras simuladas de DNA sem células do EGFRL858R (FG.39A) ou do alelo menor BRAFV600E (FIG. 39B) (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; *, p<0,05; **, p<0,01, ****, P<0,0001; as barras representam ± s.e.m.).
[0078] FIGs. 40A, 40B - fornecem um conjunto de gráficos demonstrando que (FIG. 40A) o ensaio pode distinguir entre genótipos em rs5082 (n = 4 réplicas técnicas; *, p <0,05; **, p<0,01; ***, p <0,001; ** **, p <0,0001; as barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 40B) o ensaio pode distinguir entre genótipos em rs601338 no gDNA diretamente da saliva centrifugada, desnaturada e fervida (n = 3 repetições técnicas; *, p <0,05; as barras representam média ± s.e.m.).
[0079] FIGs. 41A, 41B - fornecem (FIG. 41A) um esquema de uma modalidade de exemplo realizada no ssDNA1 no fundo de um alvo que difere do ssDNA1 por apenas uma única incompatibilidade. (FIG. 41B) O ensaio alcança detecção de especificidade de nucleotídeo único de ssDNA1 na presença de antecedentes incompatíveis (alvo que difere apenas por uma única incompatibilidade de ssDNA). Várias concentrações de DNA alvo foram combinadas com um excesso de DNA de fundo com uma incompatibilidade e detectadas pelo ensaio.
[0080] FIG. 42 é um gráfico que mostra um construto de mascaramento com um corante diferente Cy5 também permite uma detecção eficaz.
[0081] FIG. 43 é um esquema de um ensaio baseado em colorimetria de nanopartículas de ouro. Os AuNPs são agregados usando uma combinação de ligantes de DNA e uma ponte de RNA. Após a adição da atividade da RNase, a ponte ssRNA é clivada e os AuNPs são liberados, causando uma mudança de cor característica em direção ao vermelho.
[0082] FIG. 44 é um gráfico que mostra a capacidade de detectar a mudança na cor das nanopartículas dispersas a 520 nm.As nanopartículas foram baseadas na modalidade exemplar mostrada na Figura 43 e dispersas usando a adição de RNase A em concentrações variadas.
[0083] FIG. 45 é um gráfico que mostra que o teste colorimétrico da RNase é quantitativo.
[0084] FIG. 46 é uma imagem de uma placa de micropoços mostrando que a mudança de cor na nanopartícula dispersa é visualmente detectável.
[0085] FIG. 47 é uma figura que demonstra que o deslocamento colorimétrico é visível em um substrato de papel.O teste foi realizado por 10 minutos a 37 graus C em fibra de vidro 934-AH.
[0086] FIGs. 48A, 48B são esquemas de (FIG. 48A) um aptâmero de troca de conformação de acordo com certas modalidades de exemplo para detecção de proteínas ou moléculas pequenas. O produto ligado (FIG. 48B) é usado como um alvo completo para o efetor de direcionamento de RNA, que não pode detectar o produto de entrada não ligado (SEQ. I.D. Nos. 202 e 424).
[0087] FIG. 49 é uma imagem de um gel mostrando que a ligação à base de aptâmero pode criar substratos detectáveis por RPA.Os aptâmeros foram incubados com vários níveis de trombina e depois ligados com sonda.Construtos ligados foram usados como modelos para uma reação RPA de 3 minutos.A trombina 500 nM possui níveis significativamente mais altos de alvo amplificado do que de fundo.
[0088] FIG. 50 mostra a sequência de aminoácidos dos domínios HEPN dos ortólogos C2c2 selecionados (SEQ.
I.D. Nos.42-71, com SEQIDNO:42 representando resíduos 586- 603 para C2c2 de Leptotrichia shahii, SEQIDNO:43 representando os resíduos 586-603 para C2c2-5 da bactéria Leptotrichia, etc.).
[0089] FIG. 51 detecção de RNA de Cas13a com amplificação de RPA (SHERLOCK) pode detectar o alvo de ssRNA em concentrações de até ~ 2 aM, mais sensíveis que o
Cas13a sozinho (n = 4 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.).
[0090] FIGs. 52A, 52BA detecção de Cas13a pode ser usada para detectar patógenos virais e bacterianos. (FIG.
52A) Esquema da detecção de SHERLOCK do RNA do ZIKV isolado de amostras clínicas humanas.(FIG. 52B) OSHERLOCK é capaz de detectar altamente sensíveis amostras de soro (S) ou urina (U) positivas para o ZIKV humano. As concentrações aproximadas de RNA do ZIKV mostradas foram determinadas por qPCR (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; as barras representam média ± s.e.m.; n.d., não detectadas).
[0091] FIG. 53 - Comparação da detecção de ssRNA1 pelo NASBA com o conjunto de iniciador 2 (da Figura 11) e SHERLOCK (n = 2 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.).
[0092] FIGs. 54A-54C - Amplificação de ácido nucleico com RPA e SHERLOCK de reação única. (FIG. 54A) Quantificação por PCR de gotículas digitais de ssRNA1 para diluições usadas na Fig. 1C.As concentrações ajustadas para as diluições com base nos resultados do ddPCR são mostradas acima dos gráficos de barras.(FIG. 54B) Quantificação por PCR de gotículas digitais de ssDNA1 para diluições usadas na Fig. 1D. As concentrações ajustadas para as diluições com base nos resultados do ddPCR são mostradas acima dos gráficos de barras. (FIG. 54C) As reações de detecção de RPA, T7 e transcrição de Cas13a são compatíveis e atingem a detecção de DNA2 de molécula única quando incubadas simultaneamente (n=3 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ns, não significativo; **, p <0,01; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.).
[0093] FIGs. 55A-55D - Comparação do SHERLOCK com outras ferramentas sensíveis de detecção de ácidos nucleicos. (FIG. 55A) Análise de detecção de séries de diluição de ssDNA1 com PCR de gotículas digitais (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; n.s., não significativo; *, p <0,05; **, p <0,01; ****, p <0,0001; as linhas vermelhas representam a média, as barras representam a média ± s.e.m. Amostras com cópia medida/mL abaixo de 10- 1 não mostradas.). (FIG. 55B) Análise de detecção de séries de diluição de ssDNA1 com PCR quantitativa (n = 16 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; n.s., não significativo; **, p <0,01; ****, p <0,0001; as linhas vermelhas representam a média, as barras representam média ± s.e.m. Amostras com sinal relativo abaixo de 10-10 não mostradas). (FIG. 55C) Análise de detecção de séries de diluição de ssDNA1 com RPA com SYBRGreen II (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; *, p <0,05; **, p <0,01; aslinhas vermelhas representam as médias, as barras representam média ± s.e.m. Amostras com sinal relativo abaixo de 100 não mostradas.). (FIG. 55D) Análise de detecção de séries de diluição de ssDNA1 com SHERLOCK (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; **, p <0,01; ****, p <0,0001; as linhas vermelhas representam a média, as barras representam média ± s.e.m. Amostras com sinal relativo abaixo de 100 não mostradas.). (FIG. 55E) Coeficiente de variação percentual para uma série de diluições de ssDNA1 para quatro tipos de métodos de detecção.(FIG. 55F) Coeficiente percentual médio de variação para as diluições 6e2, 6e1, 6e0 e 6e-1 ssDNA1 para quatro tipos de métodos de detecção (as barras representam média ± sem).
[0094] FIG. 56 - Detecção de resistência ao carbapanemo em isolados bacterianos clínicos.Detecção de dois genes diferentes de resistência ao carbapenem (KPC e NDM-1) de cinco isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae e um controle de E. coli (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.; n.d., não detectado).
[0095] FIGs. 57A-57G - Caracterização da sensibilidade do LwCas13a a espaçadores truncados e incompatibilidades únicas na sequência de alvo. (FIG. 57A) Sequências de crRNAs espaçadores truncados (SEQ.IDNos. 72- 83) utilizados em (FIG. 57B-FIG. 57G).Também são mostradas sequências de ssRNA1 e 2, que apresentam uma única diferença de pares de bases destacada em vermelho. Os crRNAs contendo incompatibilidades sintéticas são exibidos com posições de incompatibilidade coloridas em vermelho.(FIG. 57B) Atividade de clivagem colateral no ssRNA1 e 2 para o crRNA espaçador de 28 nt com incompatibilidades sintéticas nas posições 1-7 (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.).
(FIG. 57C) Razões de especificidade de crRNA testadas em (FIG. 57B). As razões de especificidade são calculadas como a razão entre a clivagem colateral do RNA no alvo (ssRNA1) e a clivagem colateral do RNA fora do alvo (ssRNA2) (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.).
(FIG. 57D) Atividade de clivagem colateral no ssRNA1 e 2 para o crRNA espaçador de 23 nt com incompatibilidades sintéticas nas posições 1-7 (n = 4 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 57E) Razões de especificidade de crRNA testadas em (FIG. 57D). As razões de especificidade são calculadas como a razão entre a clivagem colateral do RNA no alvo (ssRNA1) e a clivagem colateral do RNA fora do alvo (ssRNA2) (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 57F) Atividade de clivagem colateral no ssRNA1 e 2 para o crRNA espaçador de 20 nt com incompatibilidades sintéticas nas posições 1-7 (n = 4 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 57G) Razões de especificidade de crRNA testadas em (FIG. 57F). As razões de especificidade são calculadas como a razão entre a clivagem colateral do RNA no alvo (ssRNA1) e a clivagem colateral do RNA fora do alvo (ssRNA2) (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.).
[0096] FIGs. 58A-58C - Identificação da posição ideal de incompatibilidade sintética em relação a mutações na sequência alvo. (FIG. 58A) Sequências para avaliação da posição ideal de incompatibilidade sintética para detectar uma mutação entre ssRNA1 e ssRNA (SEQ. I.D. Nos. 84 – 115).
Em cada um dos alvos, são testados os crRNAs com incompatibilidades sintéticas nos locais coloridos (vermelhos). Cada conjunto de crRNAs de incompatibilidade sintética é projetado de modo que o local da mutação seja deslocado em posição em relação à sequência do espaçador.Os espaçadores são projetados de modo que a mutação seja avaliada nas posições 3, 4, 5 e 6 dentro do espaçador.(FIG.
58B) Atividade de clivagem colateral no ssRNA1 e 2 para crRNAs com incompatibilidades sintéticas em posições variadas.Existem quatro conjuntos de crRNAs com a mutação nas posições 3, 4, 5 ou 6 dentro da região alvo espaçador (n = 4 repetições técnicas; as barras representam a média ± s.e.m.). (FIG. 58C) Razões de especificidade de crRNA testadas em (FIG. 58B). As razões de especificidade são calculadas como a razão entre a clivagem colateral do RNA no alvo (ssRNA1) e a clivagem colateral do RNA fora do alvo (ssRNA2) (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.).
[0097] FIG. 59 - Genotipagem com SHERLOCK em um locus adicional e genotipagem direta a partir da saliva fervida.SHERLOCK pode distinguir entre genótipos no sítio de SNP rs601338 no DNA genômico diretamente da saliva centrifugada, desnaturada e fervida (n = 4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; **, p <0,01; ****, p<0,001; as barras representam média ± s.e.m.).
[0098] FIGs. 60A-60E - Desenvolvimento de padrões de genotipagem sintética para genótipo preciso de SNPs humanos. (FIG. 60A) Genotipagem com SHERLOCK no site SNP rs601338 para cada um dos quatro indivíduos comparados com os padrões de genótipo amplificados por PCR (n=4 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 60B) Genotipagem com SHERLOCK no sítio de rs4363657SNP para cada um dos quatro indivíduos comparados com os padrões de genótipo amplificado por PCR (n = 4 réplicas técnicas; as barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 60C) Mapas de calor dos valores de p computados entre os resultados do SHERLOCK para cada indivíduo e os padrões sintéticos no site do SNP rs601338.Um mapa de calor é mostrado para cada um dos crRNAs de detecção de alelos.O mapa de cores do mapa de calor é redimensionado para que a insignificância (p
>0,05) é vermelho e significância (p <0,05) é azul (n=4 replicas técnicas, ANOVA unidirecional).(FIG. 60D) Mapas de calor dos valores de p calculados entre os resultados do SHERLOCK para cada indivíduo e os padrões sintéticos no sítio de SNP rs4363657. Um mapa de calor é mostrado para cada um dos crRNAs de detecção de alelos.O mapa de cores do mapa de calor é redimensionado para que a insignificância (p >0,05) é vermelho e significância (p <0,05) é azul (n=4 replicas técnicas, ANOVA unidirecional).(FIG. 60E) Um guia para entender os resultados do mapa de calor com valor p da genotipagem SHERLOCK.A genotipagem pode ser facilmente chamada escolhendo o alelo que corresponde a um valor-p >0,05 entre os padrões sintéticos individuais e alélicos.Os blocos vermelhos correspondem a diferenças não significativas entre o padrão sintético e o resultado SHERLOCK do indivíduo e, portanto, um resultado positivo para o genótipo.Os blocos azuis correspondem a diferenças significativas entre o padrão sintético e o resultado SHERLOCK do indivíduo e, portanto, um resultado negativo para o genótipo.
[0099] FIG. 61 - Detecção de ssDNA1 como uma pequena fração do alvo em segundo plano incompatível.Detecção SHERLOCK de uma série de diluição de ssDNA1 em um fundo de DNA genômico humano.Observe que não deve haver semelhança de sequência entre o alvo ssDNA1 sendo detectado e o DNA genômico de fundo (n=2 réplicas técnicas; barras representam média ± s.e.m.).
[00100] FIGs. 62A, 62B – As amostras de urina (FIG.
62A) ou soro (FIG. 62B) de pacientes com vírus Zika foram inativadas pelo calor por 5 minutos 950C (urina) ou 650C (soro). Um microlitro de urina ou soro inativado foi usado como entrada para uma reação RPA de 2 h, seguida por 3 horas de reação de detecção de C2c2/Cas13a, de acordo com um exemplo de modalidade. As barras de erro indicam 1SD com base em n=4 réplicas técnicas para a reação de detecção.
[00101] FIGs. 63A, 63B - As amostras de urina de pacientes com vírus Zika foram inativadas pelo calor por 5 minutos a 95oC. Um microlitro de urina inativada foi usado como entrada para uma reação RPA de 30 minutos seguida por 3 horas (FIG. 63A) ou 1 hora (FIG. 63B) C2c2/Cas13 reação de detecção, de acordo com modalidades de exemplo. As barras de erro indicam 1SD com base em n=4 réplicas técnicas para a reação de detecção.
[00102] FIG. 64 - Amostras de urina de pacientes com vírus Zika foram inativadas pelo por 5 minutos a 95oC. Um microlitro de urina inativada foi usado como entrada para uma reação RPA de 20 minutos seguida por uma reação de detecção de 1 hora C2c2/Cas13a. A urina humana saudável foi usada como controle negativo.As barras de erro indicam 1SD com base em n = 4 réplicas técnicas para a reação de detecção.
[00103] FIGs. 65A, 65B - Amostras de urina de pacientes com vírus Zika foram inativadas pelo por 5 minutos a 95oC. Um microlitro de urina inativada foi usado como entrada para uma reação RPA de 20 minutos seguida por uma reação de detecção de 1 hora C2c2/Cas13a na presença ou ausência de RNA guia. Os dados são mostrados em dois gráficos diferentes e são normalizados subtraindo os valores médios de fluorescência para reações de detecção sem guia das reações de detecção que contêm guias.A urina humana saudável foi usada como controle negativo.As barras de erro indicam 1SD com base em n=4 réplicas técnicas para a reação de detecção.
[00104] FIG. 66 - Mostra a detecção de dois alvos específicos da malária com quatro projetos de RNA guia diferentes, de acordo com exemplos de modalidades. (SEQ.
I.D. Nos. 116-127).
[00105] FIGs. 67A, 67B – Fornece gráficos mostrando as preferências de edição de diferentes ortólogos Cas13b.
Consulte a Tabela 3 para obter a chave.
[00106] FIG. 68 - fornece A) um esquema de um ensaio multiplex usando diferentes ortólogos Cas13b com diferentes preferências de edição e B) dados demonstrando a viabilidade de um ensaio usando Cas13b10 e Cas13b5.
[00107] FIG. 69 - fornece gráficos que mostram a multiplexação dupla com o Cas13b5 (Prevotella sp.Ortólogos MA2106) e Cas13b9 (Prevotella intermedia).As proteínas efetoras e as sequências guia estavam contidas na mesma reação, permitindo a multiplexação dupla na mesma reação, usando diferentes leituras fluorescentes (poli U530 nm e poli A485 nm).
[00108] FIG. 70 - fornece o mesmo que na FIG. 69 mas, neste caso, usando ortólogos Cas13a (Leptorichia wadei LwaCas13a) e ortólogos Cas13b (Prevotella sp. MA2016, Cas13b5).
[00109] FIG. 71 - fornece um método para agrupar sequências alvo com várias sequências guia, a fim de determinar a robustez do direcionamento, de acordo com certas modalidades de exemplo (SEQ. I.D. Nos. 128 e 129).
[00110] FIG. 72 - fornece géis de reação em cadeia híbrida (HCR) mostrando que as proteínas efetoras Cas13 podem ser usadas para desbloquear um iniciador, por exemplo, um iniciador incorporado em um construto de mascaramento, como descrito aqui, para ativar uma reação em cadeia de hibridação.
[00111] FIG. 73 - fornece dados que mostram a capacidade de detectar Pseudomonas aeruginosa em lisado complexo.
[00112] FIG. 74 - fornece dados mostrando preferências de íons de certos ortólogos Cas13 de acordo com certas modalidades de exemplo. Todas as concentrações alvo foram de entrada de 20 nM com concentrações de íons de (1mM e 10mM).
[00113] FIG. 75 - fornece dados que mostram que Cas13b12 tem uma preferência de sulfato de zinco 1mM para clivagem.
[00114] FIG. 76 - fornece dados que mostram que a otimização do tampão pode aumentar o sinal de ruído do Cas13b5 em um repórter polyA. O tampão antigo compreende Tris-HCL40 mM, NaCl 60 mM, MgCl26 mM, pH7,3.O novo tampão compreende HEPES20 mM, pH6,8, MgCl26 mM e NaCl 60 mM.
[00115] FIG. 77 - fornece um esquema de sistemas tipoVI-A/CCrispr e sistemas Tipo VI-B1 e B2, bem como uma árvore filogenética de ortólogos Cas13b representativos.
[00116] FIG. 78 - fornece atividade de clivagem relativa em diferentes nucleotídeos de vários ortólogos de Cas13b e em relação a um LwCas13a.
[00117] FIG. 79 - fornece um gráfico que mostra a sensibilidade relativa de vários exemplos de ortólogos Cas13.
[00118] FIG. 80 - fornece gráfico mostrando a capacidade de atingir níveis de detecção de zepto molar (zM) usando uma modalidade de exemplo.
[00119] FIGs. 81A-81D – fornece o esquema de um ensaio multiplex usando ortólogos Cas13 com diferentes preferências de edição e construto de mascaramento baseadas em polyN.
[00120] FIGs. 82A-82F - fornece dados mostrando os resultados de experimentos de otimização do iniciador e detecção de pseudomonas em uma variedade de condições.
[00121] FIGs. 83A-83H – ilustra a caracterização bioquímica da família Cas13b de enzimas direcionadas a RNA guiadas por RNA e SHERLOCK quantitativo e de sensibilidade aumentada. (FIG. 83A) Esquema da estrutura dos loci CRISPR- Cas13 e da estrutura de crRNA. (FIG. 83B) Um mapa de calor da preferência de base de 15 ortólogos Cas13b direcionando ssRNA1 com sondas de sensor consistindo em um homopolímero hexâmero de bases A, C, G ou U. (FIG. 83C) Esquema da tela de descoberta de preferências de motivos de clivagem e motivos de duas bases preferidos para LwaCas13a e PsmCas13b.Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada duas bases em todos os motivos esgotados.Os motivos são considerados esgotados se o - log2(alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 na condição LwaCas13a ou 0,5 na condição PsmCas13b. No valor - log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente. (FIG. 83D) Preferências ortogonais de base de PsmCas13b e LwaCas13a visando o ssRNA1 com uma sonda de sensor U6 ou A6.(FIG. 83E) Detecção de SHERLOCK de molécula única com LwaCas13a e PsmCas13b visando o alvo ssRNA da dengue.(FIG. 83F) Detecção de SHERLOCK de molécula única com LwaCas13a e PsmCas13b em grandes volumes de reação para aumentar a sensibilidade direcionada ao alvo 1 do ssRNA.
(FIG. 83G) Quantificação do DNA sintético de P. aeruginosa em várias concentrações de iniciadores de RPA. (FIG. 83H) Correlação da concentração de DNA sintético de P.
aeruginosa com fluorescência detectada.
[00122] FIGs. 84A-84H – ilustra SHERLOCK de multiplexação em amostra com enzimas Cas13 ortogonais.
(FIG. 84A) Esquema da multiplexagem em amostra usando enzimas Cas13 ortogonais. (FIG. 84B) Detecção multiplexada em amostra de RNA sintético de 20 nM de zika e dengue com atividade colateral de LwaCas13a e PsmCas13b.(FIG. 84C) RPA multiplexado em amostra e detecção colateral em concentrações decrescentes de almonuclease de S. aureus e alvos sintéticos de P. aeruginosa aciltransferase com LwaCas13a e PsmCas13b.(FIG. 84D) Genotipagem multiplexada com amostras humanas em rs601338 com LwaCas13a e CcaCas13b.(FIG. 84E) Esquema da linha do tempo teranóstica para detecção de alelos da doença, correção com REPAIR e avaliação da correção de REPAIR.(FIG. 84F) Detecção multiplexada em amostra de alelos de APC de amostras saudáveis e que simulam doenças com LwaCas13a e PsmCas13b.(FIG. 84G) Quantificação da eficiência de edição
REPAIR na mutação APC alvo.(FIG. 84H) Detecção multiplexada em amostra de alelos APC de amostras direcionadas e não direcionadas a REPAIR com LwaCas13a e PsmCas13b.
[00123] FIG. 85 - fornece uma árvore de 15 ortólogos Cas13b purificados e avaliados quanto à atividade colateral in vitro. Gene Cas13b (azul), Csx27/Csx28 gene (red/yellow), e matriz CRISPR (cinza) são mostrados.
[00124] FIGs. 86A-86C– ilustra a purificação de proteínas dos ortólogos Cas13. (FIG. 86A) Cromatogramas de cromatografia de exclusão por tamanho para Cas13b, LwCas13a e LbaCas13a usados neste estudo.A absorvância UV medida (mAU) é mostrada contra o volume de eluição (ml).(FIG. 86B) Gel SDS-PAGE de ortólogos Cas13b purificados.Quatorze ortólogos Cas13b são carregados da esquerda para a direita.Uma escada de proteínas é mostrada à esquerda.(FIG.
86C) Gel final SDS-PAGE de diluições de LbaCas13a (direita) e titulação padrão de BSA (esquerda).São mostradas cinco diluições de BSA e duas de LbaCas13.
[00125] FIGs. 87A-87D – mostra gráficos que ilustram a preferência básica da clivagem colateral com ortólogo Cas13b. (FIG. 87A) Atividade de clivagem de catorze ortólogos de Cas13b visando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero adenina com seis nucleotídeos. (FIG. 87B) Atividade de clivagem de catorze ortólogos de Cas13b direcionando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero de uridina com seis nucleotídeos. (FIG. 87C) Atividade de clivagem de catorze ortólogos Cas13b direcionando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero de guanina com seis nucleotídeos. (FIG. 87D) Atividade de clivagem de catorze ortólogos de Cas13b direcionando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero de citidina com seis nucleotídeos.
[00126] FIG. 88 - mostra a análise de tamanho da biblioteca aleatória de motivos após a clivagem colateral de Cas13. Traços de bioanalisadores para amostras de bibliotecas tratadas com LwaCas13a-, PsmCas13b-, CcaCas13b- e RNase A mostrando alterações no tamanho da biblioteca após a atividade da RNase.Os ortólogos Cas13 têm como alvo o ssRNA da Dengue e clivam a biblioteca de motivos aleatórios devido à clivagem colateral.Os padrões dos marcadores são mostrados na primeira faixa.
[00127] FIGs. 89A-89D – mostra uma representação de vários motivos após a clivagem pelas RNases. (FIG. 89A) Gráficos de caixas mostrando a distribuição de motivos de razões alvo para não alvo para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A em pontos de tempo de 5 e 60 minutos.As razões de RNase A foram comparadas com a média das três condições sem alvo de Cas13.As proporções também são uma média de duas repetições da reação de clivagem.(FIG. 89B) Número de motivos enriquecidos para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A no ponto no tempo de 60 minutos.O motivo do enriquecimento foi calculado como acima - log2(target/no alvo) de 1 (LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A) ou 0,5 (PsmCas13b).Um limite de 1 corresponde a pelo menos 50% de exaustão, enquanto um limite de 0,5 corresponde a pelo menos 30% de exaustão.(FIG. 89C) Logotipos de sequência gerados a partir de motivos enriquecidos para LwaCas13a, PsmCas13b e CcaCas13b.LwaCas13a e CcaCas13b mostram uma forte preferência de U como seria de esperar, enquanto PsmCas13b mostra uma preferência única de bases A no motivo, o que é consistente com as preferências de atividade colateral do homopolímero.(FIG. 89D) Mapa de calor mostrando as preferências de motivos ortogonais de LwaCas13a, PsmCas13b e CcaCas13b.Os valores representados no mapa de calor são os -log2(alvo/sem alvo) valor de cada motivo mostrado. No valor -log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente.
[00128] FIGs. 90A-90C – mostra preferências de dibase única e de duas bases de RNases determinadas pela tela de biblioteca de motivos aleatórios. (FIG. 90A) Mapas térmicos mostrando preferências de dibase única para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A no período de tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos.Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada base em todos os motivos esgotados. Motivos são considerados esgotados se o valor -log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 nas condições LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A ou 0,5 na condição PsmCas13b. No valor - log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente. (FIG. 90B) Mapas térmicos mostrando preferência de duas bases para CcaCas13b conforme determinado pela tela de clivagem de biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada 2-bases em todos os motivos esgotados.
Motivos são considerados esgotados se o valor -log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 nas condições LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A ou 0,5 na condição PsmCas13b. No valor -log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente. (FIG. 90C) Mapas térmicos mostrando preferência de duas bases para RNase conforme determinado pela tela de clivagem de biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada duas bases em todos os motivos esgotados.Motivos são considerados esgotados se o valor - log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 nas condições LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A ou 0,5 na condição PsmCas13b. No valor -log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente.
[00129] FIG. 91 - ilustra preferências de três bases de RNases determinadas por tela de biblioteca de motivos aleatórios. Os mapas de calor mostram preferências de três bases para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A no período de tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada 3-bases em todos os motivos esgotados. Motivos são considerados esgotados se o valor -log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 nas condições LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A ou 0,5 na condição PsmCas13b. No valor - log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente.
[00130] FIGs. 92A-92D - ilustram preferências de quatro bases de RNases determinadas por tela de biblioteca de motivos aleatórios. Os mapas de calor mostram preferências de quatro bases para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A no período de tempo de 60 minutos, conforme determinado pela tela de clivagem aleatória da biblioteca de motivos. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada 4-bases em todos os motivos esgotados. Motivos são considerados esgotados se o valor -
log2 (alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 nas condições LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A ou 0,5 na condição PsmCas13b. No valor -log2 (alvo/sem alvo), alvo e sem alvo denotam a frequênciade um motivo nas condições de alvo e sem alvo respectivamente.
[00131] FIGs. 93A-93C - mostra resultados de testes de preferências de clivagem de bases de ortólogos de Cas13 com clivagem in vitro de substratos poli-X. (FIG. 93A) A clivagem in vitro de alvos poli-U, C, G e A com LwaCas13a incubada com e sem crRNA.(FIG. 93B) A clivagem in vitro de alvos poli-U, C, G e A com CcaCas13b incubada com e sem crRNA. (FIG. 93C) A clivagem in vitro de alvos poli-U, C, G e A com PsmCas13a incubada com e sem crRNA.
[00132] FIGs. 94A, 94B - mostra resultados da otimização do tampão da atividade de clivagem de PsmCas13b.
(FIG. 94A) Uma variedade de tampões são testados quanto a seus efeitos na atividade colateral de PsmCas13b após o direcionamento ao ssRNA1. (FIG. 94B) O tampão otimizado é comparado ao tampão original em diferentes concentrações do complexo PsmCas13b-crRNA.
[00133] FIGs. 95A-95F - ilustra a preferência de íons dos ortólogos de Cas13 para clivagem colateral. (FIG.
95A) Atividade de clivagem de PsmCas13b com um sensor poli U fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn.OPsmCas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA sintético da dengue.(FIG. 95B) Atividade de clivagem de PsmCas13b com um sensor poli A fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OPsmCas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA sintético da dengue.(FIG. 95C) Atividade de clivagem de Pin2Cas13b com um sensor poli U fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OPin2Cas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA sintético da dengue. (FIG.
95D) Atividade de clivagem de Pin2Cas13b com um sensor poli A fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OPin2Cas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA sintético da dengue. (FIG. 95E) Atividade de clivagem de CcaCas13b com um sensor poli U fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn.
OCcaCas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA sintético da dengue. (FIG. 95F) Atividade de clivagem de CcaCas13b com um sensor poli A fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OCcaCas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA sintético da dengue.
[00134] FIGs. 96A, 96B – mostra comparação da atividade de clivagem para ortólogos de Cas13 com preferência de clivagem de adenina. (FIG. 96A) Atividade de clivagem de PsmCas13b e LbaCas13a incubada com os respectivos crRNAs direcionando um alvo sintético de Zika em diferentes concentrações (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ns, não significativo; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 96B) Atividade de clivagem de PsmCas13b e LbaCas13a incubada com os respectivos crRNAs visando um alvo sintético de Dengue em diferentes concentrações (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ns, não significativo; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.).
[00135] FIGs. 97A, 97B - ilustram a detecção atomolar do alvo 4 de ssRNAde Zika com SHERLOCK com LwaCas13a e PsmCas13b. (FIG. 97A) Detecção SHERLOCK de ssRNA de zika em diferentes concentrações com LwaCas13a e sensor poli U.(FIG. 97B) Detecção SHERLOCK de ssRNA de zika em diferentes concentrações com PsmCas13b e sensor poli A.
[00136] FIG. 98 - ilustra a detecção atomolar de ssRNA da Dengue com SHERLOCK em diferentes concentrações de CcaCas13b.
[00137] FIGs. 99A, 99B - testando a reprogramabilidade do ortólogo Cas13 com crRNAslado a lado de ssRNA1. (FIG. 99A) Atividade de clivagem de LwaCas13a e CcaCas13b com crRNAs lado a lado através de ssRNA1. (FIG.
99B) Atividade de clivagem de PsmCas13b com crRNAs lado a lado através de ssRNA1.
[00138] FIGs. 100A, 100B - mostram o efeito do comprimento do espaçador crRNA na clivagem do ortólogo Cas13. (FIG. 100A) Atividade de clivagem de PsmCas13b com crRNAs direcionados a ssRNA1 de comprimentos variadores de espaçador.(FIG. 100B) Atividade de clivagem de CcaCas13b com crRNAs direcionados a ssRNA1 de comprimentos variáveis de espaçador.
[00139] FIGs. 101A-101G - ilustram a otimização da concentração do iniciador para SHERLOCK quantitativo. (FIG.
101A) As curvas cinéticas SHERLOCK de LwaCas13a incubadas com alvos de RNA de Zika de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de 480nM. (FIG. 101B) As curvas cinéticas SHERLOCK de LwaCas13a incubada com alvos de RNA de Zika de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de 240nM. (FIG. 101C) As curvas cinéticas SHERLOCK de LwaCas13a incubadas com alvos de RNA de Zika de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de 120nM. (FIG. 101D) As curvas cinéticas SHERLOCK de LwaCas13a incubadas com alvos de RNA de Zika de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de 24nM. (FIG. 101E) Detecção SHERLOCK de RNA zika de diferentes concentrações com quatro concentrações diferentes de iniciadores RPA: 480nM, 240nM, 120nM, 60nM e
24nM. (FIG. 101F) A correlação R2 média entre a fluorescência subtraída de fundo de SHERLOCK e a concentração de RNA alvo de zika em diferentes concentrações de iniciadores de RPA.(FIG. 101G) Detecção quantitativa de SHERLOCK dos alvos de RNA de Zika em diferentes concentrações em uma série de diluições de 10 vezes (pontos pretos) e séries de diluição de 2 vezes (pontos vermelhos).Foi utilizada uma concentração de iniciador de RPA de 120 nM.
[00140] FIGs. 102A-102C - ilustram a detecção multiplexada dos alvos de Zika e Dengue. (FIG. 102A) Detecção de duas cores multiplexada usando LwaCas13a direcionando-se a um alvo de ssRNA de Zika e PsmCas13b direcionando-se a um alvo ssRNA de dengue. Ambos os alvos estão na entrada de 20nM.Todos os dados mostrados representam 180 minutos no ponto de reação.(FIG. 102B) Detecção de duas cores multiplexada usando LwaCas13a direcionando um alvo ssRNA de Zika e PsmCas13b direcionando um alvo ssRNA de Dengue. Ambos os alvos estão na entrada de 200pM. (FIG. 102C) Detecção multiplexada em amostra de RNA sintético de 20 pM de Zika e Dengue com atividade colateral de CcaCas13a e PsmCas13b.
[00141] FIGs. 103A, 103B - ilustram a detecção de RNA multiplexado em amostra de ssRNA de Zika e Dengue. RPA multiplexado em amostra e detecção colateral em concentrações decrescentes de alvos sintéticos de Zika e Dengue com PsmCas13b e CcaCas13b.
[00142] FIGs. 104A, 104B - ilustram detecção teranóstica não multiplexada de mutações e edição REPAIR.
(FIG. 104A) Detecção de alelos de APC de amostras simuladas saudáveis e com doença com LwaCas13a. (FIG. 104B) Detecção com LwaCas13a da correção de edição nos alelos da APC a partir de amostras direcionadas e não direcionadas a REPAIR.
[00143] FIGs. 105A-105E - ilustram a detecção colorimétrica da atividade da RNase com agregação de nanopartículas de ouro. (FIG. 105A) Esquema da leitura colorimétrica baseada em nanopartículas de ouro para a atividade de RNase.Na ausência de atividade da RNase, os ligantes de RNA agregam nanopartículas de ouro, levando à perda de cor vermelha.A clivagem dos ligantes de RNA libera nanopartículas e resulta em uma mudança de cor vermelha.(FIG. 105B) Imagem de repórteres colorimétricos após 120 minutos de digestão com RNase em várias unidades da RNase A. (FIG. 105C) Cinética com absorbância de 520nm de repórteres colorimétricos AuNP com digestão em várias concentrações unitárias de RNase A. (FIG. 105D) A absorbância de 520 nm dos repórteres colorimétricos AuNP após 120 minutos de digestão em várias concentrações unitárias de RNase A. (FIG. 105E) Tempo para atingir metade do A520 máximo de repórteres colorimétricos AuNP com digestão em várias concentrações unitárias de RNase A.
[00144] FIGs. 106A-106C - ilustra a detecção quantitativa do gene CP4-EPSPS a partir do DNA genômico da soja. (FIG. 106A) A correlação média R2 do fundo SHERLOCK subtraiu a fluorescência e a porcentagem de feijão CP4- EPSPS em diferentes pontos no tempo de detecção.A porcentagem de feijão representa a quantidade de grãos prontos para arredondamento em uma mistura de grãos prontos para arredondamento e de tipo selvagem.O gene CP4-EPSPS está presente apenas em grãos prontos para o processamento.(FIG. 106B) Detecção SHERLOCK do gene de resistência CP4-EPSPS em diferentes porcentagens de feijão, mostrando a natureza quantitativa da detecção SHERLOCK aos 30 minutos de incubação.(FIG. 106C) detecção SHERLOCK do gene da lectina em diferentes porcentagens de feijão.A porcentagem de feijão representa a quantidade de grãos prontos para arredondamento em uma mistura de grãos prontos para arredondamento e de tipo selvagem.O gene da lectina está presente nos dois tipos de feijão e, portanto, não mostra correlação com a porcentagem de grãos prontos para o preparo.
[00145] FIG. 107- ilustra a capacidade do Cpf1, com RPA, de detectar até o DNA de 2aM. ORPA amplifica o DNA que é diretamente detectado por AsCpf1 sem a necessidade de mais uma etapa de transcrição de T7.
[00146] FIG. 108 - ilustra a multiplexação de três cores habilitada com Cpf1 devido à sua clivagem ortogonal.
OCpf1 detecta o dsDNA1 no canal HEX.OPsmCas13b (b5) detectou o ssRNA da dengue no canal FAM.OLwaCas13a detecta o ssRNA de Zika no canal Cy5.
[00147] FIG. 109 - ilustra um teste de significância realizado em um multiplex de três cores para todas as condições contra o controle água/água/água.
[00148] FIG. 110 - ilustra a geração de cores do aptâmero.
[00149] FIG. 111 - ilustra o projeto do aptâmero e a otimização da concentração (SEQIDNOS:130 e 131).
[00150] FIG. 112 - ilustra dados de absorbância para detecção colorimétrica.
[00151] FIG. 113 - ilustra a estabilidade da mudança colorimétrica.
[00152] FIG. 114 - ilustra a comparação da detecção colorimétrica com a detecção de fluorescência do ssRNA de Zika.
[00153] FIG. 115 - ilustra uma modalidade da invenção com Cpf1 como a nickase.
[00154] FIG. 116 - ilustra a multiplexação na amostra com as preferências da base do ortólogo.
[00155] FIG. 117 - ilustra 3-plex na amostra com preferências de base única de base ortológica e AsCpf1.
[00156] FIG. 118 - ilustra 4-plex na amostra com preferências de base dupla de base ortológica e AsCpf1.
[00157] FIGs. 119A-119F - ilustram a preferência básica da clivagem colateral de ortólogo de Cas13. (FIG.
119A) Diagrama esquemático do ensaio para determinar as preferências de Cas13a/b enzimas.(FIG. 119B) Um mapa de calor da preferência de base de 15 ortólogos Cas13b direcionando ssRNA1 com repórteres consistindo em um homopolímero de bases A, C, G ou U. (FIG. 119C) Atividade de clivagem de catorze ortólogos de Cas13b visando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero adenina com cinco nucleotídeos. (FIG. 119D) Atividade de clivagem de catorze ortólogos de Cas13b direcionando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero de uridina com cinco nucleotídeos. (FIG. 119E) Atividade de clivagem de catorze ortólogos Cas13b direcionando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero de guanina com cinco nucleotídeos. (FIG. 119F) Atividade de clivagem de catorze ortólogos de Cas13b direcionando ssRNA1 usando um sensor de homopolímero de citidina com cinco nucleotídeos.
[00158] FIGs. 120A, 120B - otimização de tampão da atividade de clivagem de PsmCas13b. (FIG. 120A) Uma variedade de tampões são testados quanto a seus efeitos na atividade colateral de PsmCas13b após o direcionamento ao ssRNA1. (FIG. 120B) O tampão otimizado é comparado ao tampão original em diferentes concentrações do complexo PsmCas13bcrRNA.
[00159] FIGs. 121A-121F – preferência de íons dos ortólogos de Cas13 para clivagem colateral. (FIG. 121A) Atividade de clivagem de PsmCas13b com um sensor poli U fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OPsmCas13b é incubado com um crRNA direcionando um ssRNA sintético 1. (FIG. 121B) Atividade de clivagem de PsmCas13b com um sensor poli A fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OPsmCas13b é incubado com um crRNA direcionando um ssRNA sintético 1.
(FIG. 121C) Atividade de clivagem de Pin2Cas13b com um sensor poli U fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OPin2Cas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA1 sintético. (FIG. 121D) Atividade de clivagem de Pin2Cas13b com um sensor poli A fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn.
OPin2Cas13b é incubado com um crRNA direcionado a um ssRNA1 sintético. (FIG. 121E) Atividade de clivagem de CcaCas13b com um sensor poli U fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OCcaCas13b é incubado com um crRNA direcionando um ssRNA1 sintético. (FIG. 121F) Atividade de clivagem de CcaCas13b com um sensor poli A fluorescente para cátions divalentes Ca, Co, Cu, Mg, Mn, Ni e Zn. OCcaCas13b é incubado com um crRNA direcionando um ssRNA1 sintético.
[00160] FIGs. 122A-122C - testando a reprogramabilidade do ortólogo de Cas13 com crRNAs lado a lado de ssRNA1. (FIG. 122A) Esquema de locais de crRNA lado a lado direcionando ssRNA1 (SEQIDNO: 132). (FIG. 122B) Atividade de clivagem de LwaCas13a e CcaCas13b com crRNAs lado a lado através de ssRNA1. (FIG. 122C) Atividade de clivagem de PsmCas13b com crRNAs lado a lado através de ssRNA1.
[00161] FIGs. 123A, 123B – Efeito do comprimento do espaçador de crRNA na clivagem do ortólogo de Cas13. (FIG.
123A) Atividade de clivagem de PsmCas13b com crRNAs direcionados a ssRNA1 de comprimentos variadores de espaçador. (FIG. 123B) Atividade de clivagem de CcaCas13b com crRNAs direcionados a ssRNA1 de comprimentos variáveis de espaçador.
[00162] FIGs. 124A, 124B – Mostra comparação da atividade de clivagem para ortólogos de Cas13 com preferência de clivagem de adenina. (FIG. 124A) Atividade de clivagem de PsmCas13b e LbaCas13a incubada com os respectivos crRNAs direcionando o alvo de ssRNA de ZIKV em diferentes concentrações (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ns, não significativo; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.). (FIG. 124B) Atividade de clivagem de PsmCas13b e LbaCas13a incubada com os respectivos crRNAs direcionando um alvo de ssRNA de DENV sintético em diferentes concentrações (n=4 réplicas técnicas, teste t de Student bicaudal; ns, não significativo; *, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001; ****, p <0,0001; barras representam média ± s.e.m.).
[00163] FIGs. 125A-125H - Detecção SHERLOCK multiplexada com atividade colateral ortogonal de enzimas da Classe 2. (FIG. 125A) Esquema do ensaio para determinar as preferências di-nucleotídicas das enzimas Cas13a/b.
(FIG. 125B) Atividade colateral de LwaCas13a, CcaCas13b, LbaCas13a e PsmCas13b em repórteres ortogonais de nucleotídeos.(FIG. 125C) Esquema da atividade colateral de Cas12a ativada por dsDNA.(FIG. 125D) Comparação da atividade colateral e atividade colateral aprimorada pré- amplificação (SHERLOCK) de LwaCas13a, PsmCas13b e AsCas12a.A linha pontilhada indica 2e9 (aM), o limite da sensibilidade do AsCas12a sem pré-amplificação.Valores representam média +/– S.E.M (FIG. 125E) Esquema da multiplexagem em 4 canais na amostra usando as enzimas Cas13 e Cas12a ortogonais.(FIG. 125F) Detecção multiplexada em amostra de ssRNA de ZIKV, ssRNA1, ssRNA de DENV e dsDNA1 com LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e AsCas12a.(FIG. 125G) Esquema da detecção multiplexada em amostra de alvos sintéticos de S. aureus termonuclease e P. aeruoginosa aciltransferase com LwaCas13a e PsmCas13b. (FIG. 125H) RPA multiplexado em amostra e detecção colateral em concentrações decrescentes de almonuclease de S. aureus e alvos sintéticos de P. aeruginosa aciltransferase com LwaCas13a e PsmCas13b.
[00164] FIGs. 126A-126D – Preferências de di- nucleotídeos de enzimas Cas13a/b. (FIG. 126A) Mapa de calor da preferência de base de nucleotídeos de 10Cas13a/b ortólogos direcionados ao ssRNA1, a menos que indicado de outra forma, com repórteres consistindo em um di- nucleotídeo de bases de RNAA, C, G ou U. (*) representam ortólogos subtraídos sem fundo e com alta atividade em segundo plano.(FIG. 126B) Mapa de calor da preferência de base de nucleotídeos dos ortólogos de alta atividade de fundo LbuCas13a e PinCas13b testados em alvos indicados.(FIG. 126C) A atividade de clivagem de LbuCas13a no motivo de di-nucleotídeo AU com e sem alvo de 20nM de ssRNA de DENV testado com comprimentos variadores de espaçador.(FIG. 126D) A atividade de clivagem de LbuCas13a no motivo de di-nucleotídeo UG com e sem alvo de 20nM de ssRNA de DENV testado com comprimentos variadores de espaçador.
[00165] FIGs. 127A-127C – Relação de famílias Cas13 com preferências de clivagem por di-nucleotídeos. (FIG.
127A) Matriz de similaridade de sequência de proteínas com base no alinhamento de múltiplas sequências de proteínas de vários membros ortólogos de Cas13a e Cas13b.O agrupamento é mostrado com base na distância euclidiana.(FIG. 127B) Matriz de similaridade de sequência de repetição direta com base no alinhamento de múltiplas sequências de várias sequências de repetição direta de Cas13a e Cas13b. O agrupamento é mostrado com base na distância euclidiana.(FIG. 127C) Aglomeração das preferências da base de atividade de clivagem Cas13 de repórteres de motivo de dinucleotídeo.
[00166] FIGs. 128A, 128B – Cinética da atividade de clivagem para enzimas Cas13 com preferências de clivagem ortogonais. (FIG. 128A) Preferências ortogonais de base de PsmCas13b e LwaCas13a direcionando o ssRNA1 com um repórter U6 ou A6. (FIG. 128B) Preferências ortogonais da base de CcaCas13b e LwaCas13a direcionando o RNA de DENV com um repórter da AU ou UC.
[00167] FIGs. 129A-129E – Tela de clivagem de motivo aleatório para testar as preferências da base Cas13. (FIG.
129A) Esquema da tela de descoberta de preferências de motivos de clivagem para comparar preferências de motivos aleatórios. (FIG. 129B) Traços de bioanalisadores para amostras de bibliotecas tratadas com LwaCas13a-, PsmCas13b- , CcaCas13b- e RNase A mostrando alterações no tamanho da biblioteca após a atividade da RNase. Os ortólogos de Cas13 estão direcionando ssRNA da Dengue e clivam a biblioteca de motivos aleatórios devido à clivagem colateral. Os padrões dos marcadores são mostrados na primeira faixa.(FIG. 129C) Gráficos de caixas mostrando a distribuição de motivos de razões alvo para não alvo para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A em pontos de tempo de 5 e 60 minutos.
As razões de RNase A foram comparadas com a média das três condições sem alvo de Cas13.As proporções também são uma média de duas repetições da reação de clivagem.(FIG. 129D) Número de motivos enriquecidos para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e RNase A no ponto no tempo de 60 minutos. O motivo de enriquecimento foi calculado como motivos acima - limiares log2 (alvo/sem alvo) de 1 (LwaCas13a, CcaCas13b e RNase A) ou 0,5 (PsmCas13b). Um limite de 1 corresponde a pelo menos 50% de exaustão, enquanto um limite de 0,5 corresponde a pelo menos 30% de exaustão.(FIG. 129E) Motivos de duas bases preferidos para LwaCas13a e PsmCas13b.Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada duas bases em todos os motivos esgotados.
Os motivos são considerados esgotados se o -log2(alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0 na condição LwaCas13a ou 0,5 na condição PsmCas13b.No valor -log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente.
[00168] FIGs. 130A-130C – Motivos e sequências ortogonais da tela de clivagem aleatória de motivos. (FIG.
130A) Logotipos de sequência gerados a partir de motivos enriquecidos para LwaCas13a, PsmCas13b e CcaCas13b.
LwaCas13a e CcaCas13b mostram uma forte preferência de U como seria de esperar, enquanto PsmCas13b mostra uma preferência única de bases A no motivo, o que é consistente com as preferências de atividade colateral do homopolímero.(FIG. 130B) Atividade colateral de LwaCas13a e CcaCas13b visando o ssRNA de DENV na maioria dos motivos esgotados da tela de motivos colaterais de RNA.(FIG. 130C) Atividade colateral de PsmCas13b direcionada ao ssRNA de DENV na maioria dos motivos esgotados da tela de motivos colaterais de RNA.
[00169] FIGs. 131A-131C – Comparação dos principais motivos de atividade colateral das telas de atividade colateral do motivo de RNA. (FIG. 131A) Mapa de calor mostrando as preferências de motivos ortogonais de LwaCas13a, PsmCas13b e CcaCas13b. Os valores representados no mapa de calor são os -log2(alvo/sem alvo) valor de cada motivo mostrado. No valor -log2(alvo/sem alvo), alvo e não alvo denotam a frequência de um motivo nas condições de alvo e não alvo, respectivamente. (FIG. 131B) Atividade de clivagem de LwaCas13a e CcaCas13b em motivos ortogonais superiores derivados da tela de descoberta de preferências de motivos (FIG. 131C) Atividade colateral de LwaCas13a e CcaCas13b visando o ssRNA de DENV nos motivos de RNA ortogonais superiores.
[00170] FIGs. 132A-132D – Comparação da tela da biblioteca de motivos aleatórios em diferentes alvos e enzimas. (FIG. 132A) Comparação entre pares de pontuações de enriquecimento para diferentes alvos de ativação com LwaCas13a.(FIG. 132B) Mapas térmicos mostrando preferência de duas bases para LwaCas13a com o alvo ssRNA de ZIKV, conforme determinado pela tela de clivagem de biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada 2-bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o - log2(alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0. (FIG. 132C) Mapas térmicos mostrando preferência de duas bases para LwaCas13a com o alvo ssRNA de DENV, conforme determinado pela tela de clivagem de biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada 2- bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o -log2(alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0. (FIG. 132D) Mapas térmicos mostrando preferência de duas bases para LwaCas13a com o alvo ssRNA1, conforme determinado pela tela de clivagem de biblioteca de motivos aleatórios. Os valores representados no mapa de calor são as contagens de cada 2-bases em todos os motivos esgotados. Os motivos são considerados esgotados se o - log2(alvo/sem alvo) estiver acima de 1,0.
[00171] FIGs. 133A, 133B – Detecção multiplexada dos alvos ZIKV ssRNA e DENV ssRNA. (FIG. 133A) Detecção multiplexada em amostra de alvos de 20 nM de ZIKV e DENV ssRNA com atividade colateral de LwaCas13a e PsmCas13b.
(FIG. 133B) Detecção multiplexada na amostra de alvos de 20 pM de ZIKV e DENV ssRNA com atividade colateral de CcaCas13a e PsmCas13b.
[00172] FIG. 134 - Detecção atomolar de CcaCas13b- SHERLOCK. Comparação da atividade colateral e colateral intensificada pré-amplificação (SHERLOCK) de CcaCas13b.
[00173] FIGs. 135A, 135B – Detecção triplex usando enzimas CRISPR ortogonais. (FIG. 135A) Esquema da multiplexagem em 3 canais na amostra usando as enzimas Cas13 e Cas12a ortogonais. (FIG. 135B) Detecção multiplexada em amostra de ssRNA de ZIKV, ssRNA de DENV e dsDNA1 com LwaCas13a, PsmCas13b e Cas12a.
[00174] FIGs. 136A-136D - Detecção de RNA multiplexado em amostra de alvos de ZIKV ssRNA e DENV ssRNA e genotipagem humana. (FIG. 136A) RPA multiplexado em amostra e detecção colateral em concentrações decrescentes de alvos de ZIKV e DENV ssRNA com PsmCas13b. (FIG. 136B) RPA multiplexado em amostra e detecção colateral em concentrações decrescentes de alvos de ZIKV e DENV ssRNA com LwaCas13a. (FIG. 136C) Diagrama esquemático do projeto de crRNA e sequências alvo para genotipagem multiplexada em rs601338 com LwaCas13a e PsmCas13b (SEQIDNO:134-137).(FIG.
136D) Genotipagem multiplexada com amostras humanas em rs601338 com LwaCas13a e PsmCas13b.
[00175] FIGs. 137A-137G - Quantificação de molécula única e sinal aprimorado com SHERLOCK e Csm6 (FIG. 137A) Esquema do esquema de reação do DNA para quantificação do DNA sintético de P. aeroginosa. (FIG. 137B) Quantificação do DNA sintético de P. aeroginosa em várias concentrações de iniciadores RPA.Os valores representam a média +/– S.E.M. (FIG. 137C) Correlação da concentração de DNA sintético de P. aeroginosa com fluorescência detectada.
Valores representam média +/– SEM (FIG. 137D) Esquema da leitura independente da atividade de clivagem LwaCas13a e Csm6 com repórteres ortogonais.(FIG. 137E) Ativação de EiCsm6 por clivagem LwaCas13a de ativadores de adenina- uridina 332 com diferentes extensões de faixas de adenina.OLwaCas13a tem como alvo ssRNA sintético de DENV.Valores representam média +/– SEM (FIG. 137F) Combina o sinal LwaCas13a e EiCsm6 para aumentar as concentrações do ativador (A) 6- (U) 5 que detecta 20nM de ssRNA de DENV.Valores representam média +/– Cinética SEM (FIG. 137G) da detecção de LwaCas13a SHERLOCK aprimorada por EiCsm6 do alvo sintético de P. aeruoginosa aciltransferase.
[00176] FIGs. 138A-138G - Otimização da concentração de iniciador para SHERLOCK quantitativo. (FIG. 138A) As curvas cinéticas SHERLOCK de LwaCas13a incubadas com alvos de ssRNA de ZIKV de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de
480nM. (FIG. 138B) As curvas cinéticas SHERLOCK de
LwaCas13a incubadas com alvos de RNA de Zika de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de 240nM. (FIG. 138C) As curvas cinéticas
SHERLOCK de LwaCas13a incubadas com alvos de ssRNA de ZIKV de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de 120nM. (FIG. 138D) As curvas cinéticas SHERLOCK de LwaCas13a incubadas com alvos de RNA de Zika de diferentes concentrações e um crRNA complementar a uma concentração de iniciador de RPA de
24nM. (FIG. 138E) Detecção SHERLOCK de ssRNA de ZIKV de diferentes concentrações com quatro concentrações diferentes de iniciadores RPA: 480nM, 240nM, 120nM, 60nM e
24nM. (FIG. 138F) A correlação R2 média entre a fluorescência subtraída de fundo de SHERLOCK e a concentração de RNA alvo de ssRNA de ZIKV em diferentes concentrações de iniciadores de RPA. (FIG. 138G) Detecção quantitativa de SHERLOCK dos alvos de ssRNA de Zika em diferentes concentrações em uma série de diluições de 10 vezes (pontos pretos) e séries de diluição de 2 vezes
(pontos vermelhos). Foi utilizada uma concentração de iniciador de RPA de 240nM.
[00177] FIGs. 139A-139C - Reações SHERLOCK de grande volume com sensibilidade subatomolar (FIG. 139A) Esquema de grandes reações para detecção de molécula única de sensibilidade aumentada. (FIG. 139B) Detecção de SHERLOCK de molécula única com LwaCas13a em grandes volumes de reação para aumentar a sensibilidade direcionada ao alvo 1 do ssRNA. Para volumes de reação de 250µL, são usados 100µL de entrada de amostra e, para volumes de reação de 1000µL, 540µL de entrada de amostra. (FIG. 139C) Detecção de SHERLOCK de molécula única com PsmCas13b em grandes volumes de reação para aumentar a sensibilidade direcionada ao alvo 1 do ssRNA. Para volumes de reação de 250 µL, é usado 100 µL de entrada de amostra.
[00178] FIGs. 140A-140F - Terapêutica combinada 363 e diagnóstico com enzimas Cas13. (FIG. 140A) Esquema da linha do tempo para detecção de alelos da doença, correção com REPAIR e avaliação da correção de REPAIR. (FIG. 140B) Sequências de alvos e desenhos de crRNA usados para detecção de alelos APC (SEQIDNO:138-141).(FIG. 140C) Sequências do design do alvo e do guia REPAIR usadas para correção dos alelos da APC (SEQIDNO:142 e 143).(FIG. 140D) Detecção multiplexada em amostra de alelos de APC de amostras saudáveis e que simulam doenças com LwaCas13a e
PsmCas13b. A proporção ajustada de crRNA permite comparações entre diferentes crRNAs que terão diferentes níveis de sinal geral (consulte métodos para obter mais detalhes).Os valores representam a média +/– S.E.M. (FIG.
140E) Quantificação da eficiência de edição REPAIR na mutação APC direcionada. Os valores representam média +/– S.E.M. (FIG. 140F) na detecção multiplexada em amostra de alelos APC de amostras direcionadas e não direcionadas a REPAIR com LwaCas13a e PsmCas13b. Valores representam média +/– S.E.M
[00179] FIGs. 141A, 141B - Detecção teranóstica não multiplexada de mutações e edição REPAIR. (FIG. 141A) Detecção de alelos de APC de amostras simuladas saudáveis e com doença com LwaCas13a. (FIG. 141B) Detecção com LwaCas13a da correção de edição nos alelos da APC a partir de amostras direcionadas e não direcionadas a REPAIR.
[00180] FIGs. 142A and 142B - Mostrar resultados do ensaio de fluxo lateral para RNA da Dengue e ssRNA1 usando uma sonda Cas13b10 para dengue e uma sonda LwaCas13a para ssRNA1.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS Definições Gerais
[00181] Salvo definição em contrário, os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado tal como comumente compreendendo por um indivíduo moderadamente versado na técnica a que pertence a presente divulgação.Definições de termos e técnicas comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd edition (1989) (Sambrook, Fritsch, and Maniatis); Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 4th edition (2012) (Green and Sambrook); Current Protocols in Molecular Biology (1987) (F.M. Ausubel et al.
eds.); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR2: APractical Approach (1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.): Antibodies, ALaboratory Manual (1988) (Harlow and Lane, eds.): Antibodies ALaboratory Manual, 2nd edition 2013 (E.A. Greenfield ed.); Animal Cell Culture (1987) (R.I. Freshney, ed.); Benjamin Lewin, Genes IX, published by Jones and Bartlet, 2008 (ISBN0763752223); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCHPublishers, Inc., 1995 (ISBN9780471185710); Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley &Sons (New York, N.Y. 1994), March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley &Sons (New York, N.Y. 1992); and Marten H. Hofker and Jan van Deursen, Transgenic Mouse
Methods and Protocols, 2nd edition (2011)
[00182] Conforme usado neste documento, as formas singulares "um/uma", "um/uma" e "o/a" incluem as formas do plural referentes, a menos que o contexto indique claramente o contrário.
[00183] O termo "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância descrito posteriormente pode ou pode não ocorrer, e que a descrição inclui instâncias em que ocorre o referido acontecimento ou circunstância e instâncias onde isso não acontece.
[00184] A recitação de intervalos numéricos por pontos finais inclui todos os números e frações incluídos nos respectivos intervalos, assim como os pontos finais recitados.
[00185] Os termos "sobre" ou "aproximadamente", conforme aqui utilizados, quando se referem a um valor mensurável, como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e similares, destinam-se a abranger variações de e a partir do valor especificado, como variações de +/-10% ou menos, +/-5% ou menos, +/-1% ou menos e +/-0.1% ou menos do e do valor especificado, na medida em que tais variações sejam apropriadas para executar na invenção divulgada.Deve ser entendido que o valor ao qual o modificador "aproximadamente" ou "aproximadamente" se refere também é específico e preferencialmente divulgado.
[00186] A referência ao longo deste relatório descritivo a "uma modalidade", "certas modalidades", "uma ou mais modalidades" ou "uma modalidade" significa que um determinado recurso, estrutura, material ou característica descrita em conexão com a modalidade está incluída em pelo menos uma modalidade da invenção. Assim, as aparências das frases “em uma modalidade” ou “na modalidade” em vários lugares ao longo deste relatório não são necessariamente todas referentes à mesma modalidade.Além disso, os recursos, estruturas ou características específicas podem ser combinados de forma apropriada em uma ou mais modalidades.Além disso, embora algumas modalidades aqui descritas incluam algumas, mas não outras, características incluídas em outras modalidades, combinações de características de diferentes modalidades devem estar dentro do escopo da invenção.Por exemplo, nas reivindicações anexas, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.
[00187] "C2c2" agora é referido como "Cas13a" e os termos são usados de forma intercambiável aqui, a menos que indicado de outra forma.
[00188] Todas as publicações, documentos de patentes publicados e pedidos de patente citados aqui estão incorporados neste documento por referência na mesma medida como se cada publicação, documento de patente publicado ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.
Visão Geral
[00189] Os sistemas imunológicos adaptativos associados a CRISPR (CRISPR-Cas) contêm endonucleases programáveis, como Cas9 e Cpf1 (Shmakov et al., 2017; Zetsche et al., 2015). Embora ambos Cas9 e Cpf1 tenham como alvo o DNA, recentemente foram descobertas RNases guiadas por RNA efetoras (Shmakov et al., 2015) e caracterizadas (Abudayyeh et al., 2016; Smargon et al., 2017), incluindo C2c2, fornecendo uma plataforma para detecção específica de RNA.As RNases guiadas por RNA podem ser fácil e convenientemente reprogramadas usando o RNACRISPR (crRNAs) para clivar os RNAs alvo.Diferentemente das endonucleases de DNACas9 e Cpf1, que clivam apenas seu alvo de DNA, as RNases guiadas por RNA, como Cas13a e Cpf1, permanecem ativas após a clivagem de seu RNA ou alvo de DNA, levando à clivagem "colateral" de RNAs não-alvo nas proximidades (Abudayyeh et al., 2016).Essa atividade de clivagem de RNA colateral programada por crRNA apresenta a oportunidade de usar RNases guiadas por RNA para detectar a presença de um RNA específico, acionando a morte celular programada in vivo ou a degradação inespecífica in vitro do RNA que pode servir como leitura (Abudayyeh et al., 2016; East-Seletsky et al., 2016).
[00190] As modalidades aqui divulgadas utilizam efetores de direcionamento de RNA para fornecer um diagnóstico robusto baseado em CRISPR com sensibilidade atomolar. As modalidades divulgadas neste documento podem detectar DNA e RNA de caldo com níveis comparáveis de sensibilidade e podem diferenciar alvos de não alvos com base em diferenças de pares de base únicos. Além disso, as modalidades divulgadas neste documento podem ser preparadas em formato liofilizado para distribuição conveniente e aplicações de ponto de atendimento (POC).Tais modalidades são úteis em vários cenários na saúde humana, incluindo, por exemplo, detecção viral, tipagem de cepa bacteriana, genotipagem sensível e detecção de DNA livre de células associadas à doença.Para facilitar a referência, as modalidades divulgadas neste documento também podem ser referidas como SHERLOCK (Desbloqueador de Repóter Enzimático Específico de Alta Sensibilidade).
[00191] Em um aspecto, as modalidades aqui divulgadas são direcionadas a um sistema de detecção de ácido nucleico compreendendo dois ou mais sistemas CRISPR, um ou mais RNAs de guia projetados para se ligarem às moléculas alvo correspondentes, um construto de mascaramento e reagentes de amplificação opcionais para amplificar moléculas de ácido nucleico alvo em uma amostra.
Em certas modalidades exemplares, o sistema pode ainda compreender um ou mais aptâmeros de detecção.Os um ou mais aptâmeros de detecção podem compreender um local de RNA polimerase ou um local de ligação ao iniciador.Os um ou mais aptâmeros de detecção se ligam especificamente a um ou mais polipeptídeos alvo e são configurados de modo que o local da RNA polimerase ou o local de ligação do iniciador seja exposto apenas após a ligação do aptâmero de detecção a um peptídeo alvo.A exposição do local da RNA polimerase facilita a geração de um oligonucleotídeo de RNA de gatilho usando a sequência de aptâmero como molde.Por conseguinte, em tais modalidades, o um ou mais RNAs guia são configurados para se ligarem a um RNA gatilho.
[00192] Em outro aspecto, as modalidades divulgadas neste documento são direcionadas a um dispositivo de diagnóstico compreendendo uma pluralidade de volumes discretos individuais.Cada volume discreto individual compreende uma proteína efetora CRISPR, um ou mais RNAs guia projetados para se ligarem a uma molécula alvo correspondente e um construto de mascaramento. Em certas modalidades exemplares, os reagentes de amplificação de RNA podem ser pré-carregados nos volumes discretos individuais ou adicionados aos volumes discretos individuais simultaneamente ou subsequentemente à adição de uma amostra a cada volume discreto individual.O dispositivo pode ser um dispositivo com base microfluídica, um dispositivo vestível ou dispositivo compreendendo um substrato de material flexível no qual os volumes discretos individuais são definidos.
[00193] Em outro aspecto, as modalidades divulgadas neste documento são direcionadas a um método para detectar ácidos nucleicos alvo em uma amostra que compreende distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um conjunto de volumes discretos individuais, cada volume discreto individual compreendendo uma proteína efetora CRISPR, um ou mais guiar RNAs projetados para se ligarem a um oligonucleotídeo alvo e a um construto de mascaramento.O conjunto de amostras é então mantido em condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo.A ligação de um ou mais RNAs guia a um ácido nucleico alvo, por sua vez, ativa a proteína efetora CRISPR.Uma vez ativada, a proteína efetora CRISPR desativa o construto de mascaramento, por exemplo, clivando o construto de mascaramento de modo que um sinal positivo detectável seja desmascarado, liberado ou gerado.A detecção do sinal detectável positivo em um volume discreto individual indica a presença das moléculas alvo.
[00194] Em ainda outro aspecto, as modalidades aqui divulgadas são direcionadas a um método para detectar polipeptídeos.O método para detectar polipeptídeos é semelhante ao método para detectar ácidos nucleicos alvo descritos acima.No entanto, um aptâmero de detecção de peptídeo também está incluído.Os aptâmeros de detecção de peptídeo funcionam como descrito acima e facilitam a geração de um oligonucleotídeo desencadeador após ligação a um polipeptídeo alvo.Os RNAs de guia são projetados para reconhecer os oligonucleotídeos desencadeadores, ativando assim a proteína efetora CRISPR.A desativação do construto de mascaramento pela proteína efetora CRISPR ativada leva ao desmascaramento, liberação ou geração de um sinal positivo detectável.
SISTEMAS DE DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO
[00195] Em algumas modalidades, a invenção fornece um sistema de detecção de ácido nucleico compreendendo i) dois ou mais sistemas CRISPR, cada sistema CRISPR compreendendo uma proteína Cas e uma molécula guia compreendendo uma sequência guia capaz de se ligar a uma molécula alvo correspondente e projetada para formar um complexo com a proteína Cas; e ii) um conjunto de construções de detecção, cada construto de detecção compreendendo uma sequência de motifs de corte que é preferencialmente cortada por uma das proteínas efetoras CRISPR ativadas.
SistemasCRISPR
[00196] Em geral, um sistema CRISPR-Cas ou CRISPR como usado aqui e em documentos como WO2014/093622
(PCT/US2013/074667), refere-se coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão ou direcionamento da atividade de genes associados ao CRISPR
("Cas"), incluindo sequências que codificam um gene Cas,
uma sequência tracr (CRISPR de ativação trans) (por exemplo, tracrRNA ou um componente parcial ativo tracrRNA),
uma sequência tracr-mate (abrangendo uma “repetição direta”
e uma repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno), uma sequência guia
(também conhecida como “espaçador” no contexto de um sistema CRISPR endógeno) ou "RNA (s)" como esse termo é aqui usado (por exemplo, RNA (s) para guiar Cas, como Cas9,
por exemplo, CRISPRRNA e RNA transativador (tracr) ou um único RNA guia (sgRNA) (RNA quimérico)) ou outras sequências e transcritos de um locus CRISPR.
Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo (também chamado de protospacer no contexto de um sistema CRISPR endógeno).Quando a proteína CRISPR é uma proteína C2c2, não é necessário um tracrRNA.C2c2 foi descrito em Abudayyeh et al.(2016) “C2c2 is a single-
component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”; Science; DOI: 10.1126/science.aaf5573; and
Shmakov et al.(2015) “Discovery and Functional
Characterization of Diverse Class 2CRISPR-Cas Systems”,
Molecular Cell, DOI: dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008; que são incorporados aqui na sua totalidade por referência.Cas13b foi descrito em Smargon et al.(2017) “Cas13b Is a Type VI- BCRISPR-Associated RNA-Guided RNases Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28,” Molecular Cell. 65, 1-13; dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023., que é aqui incorporado na sua totalidade por referência.
[00197] Em certas modalidades, um motivo adjacente ao protospacer (PAM) ou motivo semelhante ao PAM direciona a ligação do complexo de proteínas efetoras, como aqui divulgado, ao local de interesse do alvo.Em algumas modalidades, o PAM pode ser um PAM5 '(isto é, localizado a montante da extremidade 5' do protospacer).Em outras modalidades, o PAM pode ser um PAM3' (isto é, localizado a jusante da extremidade 5' do protoespaçador).O termo "PAM" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "PFS" ou "local de flanco do protospacer" ou "sequência de flanco do protospacer".
[00198] Numa modalidade preferida, a proteína efetora CRISPR pode reconhecer um PAM3 '.Em certas modalidades, a proteína efetora CRISPR pode reconhecer um PAM3 'que é 5'H, em que H é A, C ou U. Em certas modalidades, a proteína efetiva pode ser Leptotrichia shahii C2c2p, mais preferencialmente Leptotrichia shahii
DSM19757C2c2, e o 3 'PAM é um 5' H.
[00199] No contexto da formação de um complexo CRISPR, "molécula alvo ou "sequência alvo" se refere a uma molécula que abriga uma sequência, ou uma sequência na qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, onde hibridação entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender polinucleotídeos de RNA.O termo "RNA alvo" refere-se a um polinucleotídeo de RNA que é ou compreende a sequência alvo.Em outras palavras, o RNA alvo pode ser um polinucleotídeo de RNA ou uma parte de um polinucleotídeo de RNA ao qual uma parte do gRNA, isto é, a sequência guia, é projetada para ter complementaridade e à qual a função efetiva mediada pelo complexo compreendendo o efetor CRISPR proteína e um gRNA deve ser direcionado.Em algumas modalidades, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula.Uma sequência alvo pode compreender polinucleotídeos de DNA.
[00200] Como tal, um sistema CRISPR pode compreender proteínas efetoras direcionadas a RNA.Um sistema CRISPR pode compreender proteínas efetoras direcionadas a DNA. Em algumas modalidades, um sistema CRISPR pode compreender uma combinação de proteínas efetoras direcionadas a RNA e DNA ou proteínas efetoras que têm como alvo tanto RNA quanto DNA.
[00201] A molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína efetora CRISPR, em particular C2c2, é vantajosamente proteína efetiva CRISPR otimizada para códons.Um exemplo de uma sequência otimizada de códon é,
neste caso, uma sequência otimizada para expressão em eucariotos, por exemplo, humanos (isto é, sendo otimizados para expressão em humanos), ou para outro eucariota, animal ou mamífero, como aqui discutido; ver, por exemplo,
sequência otimizada de códon humano SaCas9 no WO2014/093622
(PCT/US2013/074667).Embora isso seja preferido, será apreciado que outros exemplos são possíveis e é conhecida a otimização de códons para uma espécie hospedeira que não seja humana, ou para a otimização de códons para órgãos específicos.Em algumas modalidades, uma sequência de codificação enzimática que codifica uma proteína efetora
CRISPR é um códon otimizado para expressão em células específicas, como células eucarióticas.As células eucarióticas podem ser aquelas de ou derivadas de um organismo específico, como uma planta ou um mamífero,
incluindo mas não se limitando a eucariotos ou animais ou mamíferos humanos ou não humanos, como aqui discutido, por exemplo, camundongo, rato, coelho, cão, gado ou mamífero ou primata não humano.Em algumas modalidades, processos para modificar a identidade genética da linha germinativa de seres humanos e/ouPodem ser excluídos processos para modificar a identidade genética de animais que possam causar sofrimento sem qualquer benefício médico substancial para o homem ou animal, e também animais resultantes de tais processos.Em geral, a otimização do códon refere-se a um processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas células hospedeiras de interesse, substituindo pelo menos um códon (por exemplo, aproximadamente ou mais que 1, 2, 3, 4, 5, 10,
15,20, 25, 50 ou mais códons) da sequência nativa com códons que são usados com mais ou mais frequência nos genes dessa célula hospedeira, mantendo a sequência de aminoácidos nativa.Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular.O viés de utilização códons frequentemente se correlaciona com a eficiência da tradução do RNA mensageiro (mRNA), que por sua vez acredita-se que seja dependente, inter alia, das propriedades dos códons sendo traduzidos e a disponibilidade de moléculas de RNA de transferência (tRNA)
particulares.A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados com mais frequência na síntese de peptídeos.Consequentemente, os genes podem ser adaptados para a expressão gênica ideal em um determinado organismo com base na otimização por códons.As tabelas de uso do códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, no "Banco de dados de uso do códon" disponível em kazusa.orjp/codon/ e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras.Ver Nakamura, Y., et al.“Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl.Acids Res. 28:292 (2000).Também estão disponíveis algoritmos de computador para o códon que otimiza uma sequência específica para expressão em uma célula hospedeira específica, como Gene Forge (Aptagen; Aptus; Jacobus, PA).Em algumas modalidades, um ou mais códons (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais, ou todos os códons) em uma sequência que codifica um Cas corresponde ao códon mais frequentemente usado para um aminoácido específico.
[00202] Em certas modalidades, os métodos descritos aqui podem compreender o fornecimento de uma célula transgênica Cas, em particular uma célula transgênica C2c2, na qual um ou mais ácidos nucleicos que codificam um ou mais RNAs guia são fornecidos ou introduzidos operacionalmente conectados na célula com um elemento regulador compreendendo um promotor de um ou mais genes de interesse.Como usado aqui, o termo "célula transgênica Cas" refere-se a uma célula, como uma célula eucariótica, na qual um gene Cas foi genomicamente integrado.A natureza, tipo ou origem da célula não são particularmente limitantes de acordo com a presente invenção.Também a maneira como o transgene Cas é introduzido na célula pode variar e pode ser qualquer método como é conhecido na técnica.Em certas modalidades, a célula transgênica Cas é obtida através da introdução do transgene Cas em uma célula isolada.Em certas outras modalidades, a célula transgênica Cas é obtida isolando células de um organismo transgênico Cas.Por meio de exemplo, e sem limitação, a célula transgênica Cas, conforme aqui referida, pode ser derivada de um eucarioto transgênico Cas, tal como um eucarioto imune a Cas.É feita referência ao WO2014/093622 (PCT/US13/74667), aqui incorporado por referência.Os métodos das Publicações de Patente USNos. 20120017290 e 20110265198 atribuídos à Sangamo BioSciences, Inc. direcionados para atingir o locus Rosa podem ser modificados para utilizar o sistema Cas CRISPR da presente invenção.Os métodos da Publicação de Patente U.S. 20130236946 atribuída à Cellectis direcionada para direcionar o locus Rosa também podem ser modificados para utilizar o sistema Cas CRISPR da presente invenção.Por meio de outro exemplo, é feita referência a Platt et.
al.(Cell; 159 (2): 440-455 (2014)), descrevendo um camundongo knock-in Cas9, que é incorporado aqui por referência.O transgene Cas pode ainda compreender uma cassete Lox-Stop-polyA-Lox (LSL), tornando assim a expressão de Cas induzível por Cre recombinase.Alternativamente, a célula transgênica Cas pode ser obtida através da introdução do transgene Cas em uma célula isolada.Os sistemas de distribuição para transgenes são bem conhecidos na técnica.Por meio de exemplo, o transgene Cas pode ser distribuído, por exemplo, em células eucarióticas por meio de vetor (por exemplo, AAV, adenovírus, lentivírus) e/ou distribuição de partículas e/ou nanopartículas, como também aqui descrito em outro lugar.
[00203] Será entendido pelo especialista que a célula, como a célula transgênica Cas, como aqui referida pode compreender outras alterações genômicas, além de ter um gene Cas integrado ou as mutações decorrentes da ação específica da sequência de Cas quando complexada com RNA capaz de guiar Cas para um local de destino.
[00204] Em certos aspectos, a invenção envolve vetores, por exemplo, para entregar ou introduzir em uma célula Cas e/ouRNA capaz de guiar Cas a um locus alvo (ou seja, RNA guia), mas também para propagar esses componentes (por exemplo, em células procarióticas).Um usado aqui, um "vetor" é uma ferramenta que permite ou facilita a transferência de uma entidade de um ambiente para outro."Vetor" refere-se a um replicon, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, no qual outro segmento de DNA pode ser inserido de modo a realizar a replicação do segmento inserido.Geralmente, um vetor é capaz de replicação quando associado aos elementos de controle apropriados.Conforme usado no presente documento, o termo
"vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico com capacidade para transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligada.Os vetores incluem, mas não estão limitados a,
moléculas de ácido nucleico que são de fita simples, de fita dupla ou parcialmente de fita dupla; moléculas de ácido nucleico que compreendem uma ou mais extremidades livres, sem extremidades livres (por exemplo, circulares);
moléculas de ácido nucleico que compreendem DNA, RNA ou ambos; e outras variedades de polinucleotídeos conhecidos na técnica.Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça circular de DNA de fita dupla no qual segmentos adicionais de DNA podem ser inseridos, como por técnicas convencionais de clonagem molecular.
Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que seqüências de DNA ou RNA derivadas de vírus estão presentes no vetor para serem empacotadas em um vírus (por exemplo, retrovírus, retrovírus com defeito de replicação, adenovírus, adenovírus com defeito de replicação e vírus adeno-associados (AAVs)) .Os vetores virais também incluem polinucleotídeos transportados por um vírus para transfecção para uma célula hospedeira.Certos vetores têm capacidade para replicação autônoma numa célula hospedeira na qual os mesmos são introduzidos (por exemplo,
vetores bacterianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissômicos).Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) são integrados ao genoma de uma célula hospedeira mediante introdução à célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma hospedeiro.Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados operativamente.Tais vetores são referidos neste documento como "vetores de expressão".Em geral, vetores de expressão útil nas técnicas de DNA recombinante são frequentemente sob a forma de plasmídeos.
[00205] Os vectores de expressão recombinantes da presente invenção compreendem um ácido nucleico da invenção numa forma adequada para expressão do ácido nucleico numa célula hospedeira, o que significa que os vectores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem utilizadas para a expressão, que são operativamenteligadas à sequência de ácido nucleico a ser expressa.Dentro de um vector de expressão recombinante, "operativamenteligado " pretende significar que a sequência de nucleótidos de interesse está ligada à sequência reguladora de um modo que permite a expressão da sequência de nucleótidos (por exemplo,, num sistema de transcrição/translação in vitro ou numa célula hospedeira quando o vector é introduzido na célula hospedeira).No que diz respeito aos métodos de recombinação e clonagem, é mencionado o pedido de patente dos EUA10/815,730, publicado em 2 de setembro de 2004 como US2004-0171156A1, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.Assim, as modalidades divulgadas neste documento também podem compreender células transgênicas compreendendo o sistema efetor CRISPR.Em certas modalidades exemplares, a célula transgênica pode funcionar como um volume discreto individual.Por outras palavras, as amostras compreendendo um construto de mascaramento podem ser entregues a uma célula, por exemplo, numa vesícula de entrega adequada e se o alvo estiver presente na vesícula de entrega, o efetor CRISPR é ativado e é gerado um sinal detectável.
[00206] O (s) vetor (es) pode (m) incluir o (s) elemento (s) regulador (es), por exemplo, promotor (es).O (s) vetor (es) pode (m) compreender sequências de codificação Cas, e/ou um único, mas possivelmente também pode compreender pelo menos 3 ou 8 ou 16 ou 32 ou 48 ou 50RNAs guia (s), por exemplo, sequências codificadoras de sgRNAs, como 1-2, 1-3, 1-41-5,3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3- 8, 3-16, 3-30, 3-32, 3-48, 3-50RNA (s) (por exemplo,, sgRNAs).Em um único vetor, pode haver um promotor para cada RNA (por exemplo, sgRNA), vantajosamente quando houver até cerca de 16RNA (s); e, quando um único vetor fornece mais de 16RNAs, um ou mais promotores podem conduzir a expressão de mais de um RNAs, por exemplo, quando existem 32RNAs,
cada promotor pode direcionar a expressão de dois RNAs e,
quando houver 48RNAs, cada promotor pode direcionar a expressão de três RNAs.Por protocolos aritméticos simples e de clonagem bem estabelecidos e os ensinamentos nesta divulgação, um especialista na técnica pode praticar prontamente a invenção quanto ao RNA (s) para um vetor exemplar adequado como AAV e um promotor adequado como o promotor U6.Por exemplo, o limite de embalagem do AAV é
~4.7 kb.O comprimento de um único U6-gRNA (mais locais de restrição para clonagem) é 361 pb.Portanto, o especialista pode caber facilmente cerca de 12 a 16, por exemplo, 13 cassetes de U6-gRNA em um único vetor.Isso pode ser montado por qualquer meio adequado, como uma estratégia de portão dourado usada para a montagem do TALE (genome-
engineering.org/taleffectors/).O especialista também pode usar uma estratégia de guia em tandem para aumentar o número de U6-gRNAs em aproximadamente 1,5 vezes, por exemplo, para aumentar de 12-16, por exemplo, 13 para aproximadamente 18-24, por exemplo, cerca de 19U6-
gRNAs.Portanto, um especialista na técnica pode facilmente atingir aproximadamente 18-24, por exemplo, cerca de 19RNAs promotores, por exemplo, U6-gRNAs em um único vetor, por exemplo, um vetor AAV.Um outro meio para aumentar o número de promotores e RNAs em um vetor é usar um único promotor
(por exemplo, U6) para expressar uma matriz de RNAs separados por sequências cliváveis.E um meio ainda mais alto para aumentar o número de RNAs promotores em um vetor é expressar uma matriz de RNAs promotores separados por sequências cliváveis no íntron de uma sequência ou gene codificador; e, neste caso, é vantajoso usar um promotor da polimerase II, que pode ter expressão aumentada e permitir a transcrição de RNA longo de uma maneira específica de tecido. (veja, por exemplo, nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short e nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.html).Em uma modalidade vantajosa, o AAV pode empacotar o gRNA em tandem U6 visando até cerca de 50 genes.Por conseguinte, a partir do conhecimento na arte e dos ensinamentos desta divulgação, o especialista pode criar e usar prontamente vetor (es), por exemplo, um único vetor, expressando vários RNAs ou guias sob o controle ou operacional ou funcionalmente ligado a um ou mais promotores - especialmente quanto ao número de RNAs ou guias discutidos aqui, sem qualquer experimentação indevida.
[00207] ORNA guia (s) que codifica sequências e/ouAs sequências de codificação Cas podem ser funcional ou operacionalmente ligadas ao (s) elemento (s) regulador (es) e, portanto, ao (s) elemento (s) regulador (es) acionam a expressão.O (s) promotor (es) podem ser promotores constitutivos e/ou promotor (es) condicional (es) e/ou promotor (es) induzível (s) e/ou promotor (es) específico (s) de tecido.O promotor pode ser selecionado do grupo que consiste em RNA polimerases, pol I, pol II, pol III, T7, U6, H1, promotor LTR retroviral do vírus do sarcoma Rous (RSV), o promotor do citomegalovírus (CMV), o promotor SV40, o promotor de di-hidrofolato redutase, promotor de p- actina, promotor de fosfoglicerol cinase (PGK) e promotor de EF1α.Um promotor vantajoso é o promotor é U6.
[00208] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema de direcionamento de ácido nucleico é derivado de um organismo particular que compreende um sistema de direcionamento de RNACRISPR endógeno.Em certas modalidades exemplares, o sistema de direcionamento de RNA da proteína efetor CRISPR compreende pelo menos um domínio HEPN, incluindo, mas não se limitando aos domínios HEPN aqui descritos, domínios HEPN conhecidos na técnica e domínios reconhecidos como domínios HEPN em comparação com a sequência de consenso motivos.Vários desses domínios são fornecidos aqui.Em um exemplo não limitativo, uma sequência de consenso pode ser derivada das sequências de ortólogos C2c2 ou Cas13b aqui fornecidos.Em certas modalidades exemplares, a proteína efetora compreende um único domínio HEPN.Em certas outras modalidades exemplificativas, a proteína efetora compreende dois domínios HEPN.
[00209] Em uma modalidade exemplar, a proteína efetora compreende um ou mais domínios HEPN compreendendo uma sequência de motivo RxxxxH.A sequência do motivo RxxxxH pode ser, sem limitação, de um domínio HEPN aqui descrito ou um domínio HEPN conhecido na técnica.As sequências de motivos RxxxxH incluem ainda sequências de motivos criadas pela combinação de porções de dois ou mais domínios HEPN.Como observado, as sequências de consenso podem ser derivadas das sequências dos ortólogos divulgadas no Pedido Provisório de Patente U.S. 62/432.240 intitulado Novel CRISPREnzymes and Systems,” Pedido Provisório de Patente U.S. 62/471,710 intitulado “Novel Type VICRISPROrthologs and Systems” depositado em 15 de março de 2017, e Pedido de Patente Provisório U.S. intitulado “Novel Type VICRISPROrthologs and Systems,” rotulado como número de arquivo do procurador 47627-05-2133 e depositado em 12 de abril de 2017.
[00210] Em uma modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende pelo menos um motivo RxxxxH compreendendo a sequência de R{N/H/K}X1X2X3H (IDSEQNO:144).Numa modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende um motivo RxxxxH compreendendo a sequência de R{N/H}X1X2X3H (SEQIDNO:145).
Numa modalidade da invenção, um domínio HEPN compreende a sequência de R{N/K}X1X2X3H (SEQIDNO:146). Em certas modalidades, X1 é R, S, D, E, Q, N, G, Y ou H. Em certas modalidades, X2 é I, S, T, V ou L. Em certas modalidades, X3 é L, F, N, Y, V, I, S, D, E ou A.
[00211] Efetores adicionais para uso de acordo com a invenção podem ser identificados por sua proximidade com os genes cas1, por exemplo, embora não limitados a, dentro da região 20 kb desde o início do gene cas1 e 20 kb a partir do final do gene cas1. Em certas modalidades, a proteína efetora compreende pelo menos um domínio HEPN e pelo menos 500 aminoácidos, e em que a proteína efetiva C2c2 está naturalmente presente em um genoma procariótico dentro de 20 kb a montante ou a jusante de um gene Cas ou de uma matriz CRISPR.Exemplos não limitativos de proteínas Cas incluem Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, seus homólogos ou versões modificadas dos mesmos. Em certas modalidades exemplares, a proteína efetora C2c2 está naturalmente presente em um genoma procariótico dentro de 20kb a montante ou a jusante de um gene Cas1.Os termos "ortólogo" (também aqui referido como "ortólogo") e "homólogo" (também aqui referido como "homólogo") são bem conhecidos na técnica.Por meio de orientações adicionais, um "homólogo" de uma proteína como aqui utilizado é uma proteína da mesma espécie que desempenha a mesma ou uma função semelhante à da proteína da qual é um homólogo.As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.Um "ortólogo" de uma proteína como aqui utilizado é uma proteína de uma espécie diferente que desempenha a mesma função ou uma função semelhante à da qual é um ortólogo.As proteínas ortólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.
[00212] Em modalidades particulares, a enzima Cas direcionada a RNA do Tipo VI é C2c2.Em outras modalidades de exemplo, a enzima Cas direcionada a RNA do Tipo VI é Cas 13b. Em certas modalidades, a proteína Cas13b é de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Bergeyella, Prevotella, Porphyromonas, Bacterioides, Alistipes, Riemerella, Myroides, Capnocytophaga, Porphyromonas, Flavobacterium, Porphyromonas, Chryseobacterium, Paludibacter, Psychroflex,Phaeodactylibacter, Sinomicrobium, Reichenbachiella.
[00213] Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de uma proteína do Tipo VI, como C2c2, conforme referido neste documento, possui uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 30%, ou pelo menos
40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos
70%, ou pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos
85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como, por exemplo, pelo menos 95% com uma proteína do tipo VI como
C2c2 (por exemplo, com base na sequência selvagem de qualquer uma das Leptotrichia shahii C2c2, Lachnospiraceae bacterium MA2020C2c2, Lachnospiraceae bacterium
NK4A179C2c2, Clostridium aminophilum (DSM10710) C2c2,
Carnobacterium gallinarum (DSM4847) C2c2, Paludibacter propionicigenes (WB4) C2c2, Listeria weihenstephanensis
(FSLR9-0317) C2c2, Listeriaceae bacterium (FSLM6-0635)
C2c2, Listeria newyorkensis (FSLM6-0635) C2c2,
Leptotrichia wadei (F0279) C2c2, Rhodobacter capsulatus
(SB1003) C2c2, Rhodobacter capsulatus (R121) C2c2,
Rhodobacter capsulatus (DE442) C2c2, Leptotrichia wadei
(Lw2) C2c2, ou Listeria seeligeri C2c2). Em outras modalidades, o homólogo ou ortólogo de uma proteína do Tipo
VI, como C2c2, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 30% ou pelo menos 40%
ou pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos pelo menos 70% ou pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%,
como por exemplo pelo menos 95% com o tipo selvagem C2c2
(por exemplo, com base na sequência do tipo selvagem de qualquer de Leptotrichia shahii C2c2, Lachnospiraceae bacterium MA2020C2c2, Lachnospiraceae bacterium NK4A179C2c2, Clostridium aminophilum (DSM10710) C2c2, Carnobacterium gallinarum (DSM4847) C2c2, Paludibacter propionicigenes (WB4) C2c2, Listeria weihenstephanensis (FSLR9-0317) C2c2, Listeriaceae bacterium (FSLM6-0635) C2c2, Listeria newyorkensis (FSLM6-0635) C2c2, Leptotrichia wadei (F0279) C2c2, Rhodobacter capsulatus (SB1003) C2c2, Rhodobacter capsulatus (R121) C2c2, Rhodobacter capsulatus (DE442) C2c2, Leptotrichia wadei (Lw2) C2c2, ou Listeria seeligeri C2c2).
[00214] Em certas outras modalidades exemplares, o sistema CRISPR, a proteína efetora, é uma nuclease C2c2.A atividade de C2c2 pode depender da presença de dois domínios HEPN.Demonstrou-se que são domínios da RNase, isto é, RNA cortante de nuclease (em particular uma endonuclease).C2c2HEPN também pode direcionar DNA ou potencialmente DNA e/ou RNA.Com base no fato de que os domínios HEPN de C2c2 são pelo menos capazes de se ligar e, na sua forma selvagem, cortar RNA, é preferível que a proteína efetora C2c2 tenha a função RNase.Em relação aos sistemas C2c2CRISPR, é feita referência às normas provisórias dos EUA. 62/351,662 arquivado em 17 de junho de 2016 e USProvisional 62/376,377 arquivado em 17 de agosto de 2016.Também é feita referência às disposições provisórias dos EUA. 62/351,803 arquivado em 17 de junho de
2016.Também é feita referência ao Provisório U.S.
intitulado “Novel Crispr Enzymes and Systems” filed December 8, 2016 bearing Broad Institute No. 10035.PA4 e Arquivo do Procurador No. 47627.03.2133.Também é feita referência a East-Seletsky et al. “Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection” Nature doi:10/1038/nature19802 and Abudayyeh et al. “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA targeting CRISPR effector” bioRxiv doi:10.1101/054742.
[00215] A função RNase em sistemas CRISPR é conhecida; por exemplo, o direcionamento de mRNA foi relatado para certos sistemas tipo III de CRISPR-Cas (Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic acid research, vol. 43, 406-417) e fornece vantagens significativas.No sistema Staphylococcus epidermis tipo III-A, a transcrição entre os alvos resulta na clivagem do DNA alvo e seus transcritos, mediados por locais ativos independentes dentro do complexo proteico efetor de ribonucleoproteínas Cas10-Csm (ver Samai et al., 2015, Cell, 151, 1164-1174).Um sistema CRISPR-Cas, composição ou método visando o RNA através das presentes proteínas efetoras é assim fornecido.
[00216] Em uma modalidade, a proteína Cas pode ser um ortólogo C2c2 de um organismo de um gênero que inclui, mas não está limitado a, Leptotriquia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifator, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flavi, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma e Campylobacter.As espécies de organismos desse gênero podem ser aqui discutidas de outra forma.
[00217] Alguns métodos para identificar ortólogos das enzimas do sistema CRISPR-Cas podem envolver a identificação de sequências tracr em genomas de interesse.A identificação de sequências tracr pode estar relacionada às seguintes etapas: Procure as repetições diretas ou sequências tracr mate em um banco de dados para identificar uma região CRISPR compreendendo uma enzima CRISPR.Procure sequências homólogas na região CRISPR que flanqueiam a enzima CRISPR nas direções senso e anti-sentido.Procure terminadores de transcrição e estruturas secundárias.Identifique qualquer sequência que não seja uma sequência de repetição direta ou tracr mate, mas que tenha mais de 50% de identidade com a sequência de repetição direta ou tracr mate como uma sequência tracr potencial.
Pegue a sequência tracr potencial e analise as sequências terminadoras da transcrição associadas a ela.
[00218] Será apreciado que qualquer uma das funcionalidades aqui descritas pode ser engenheirada em enzimas CRISPR de outros ortólogos, incluindo enzimas quiméricas compreendendo fragmentos de múltiplos ortólogos.Exemplos de tais ortólogos são descritos em outras partes deste documento.Assim, as enzimas quiméricas podem compreender fragmentos de ortólogos da enzima CRISPR de um organismo que inclui, mas não se limitam a, Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma e Campylobacter.Uma enzima quimérica pode compreender um primeiro fragmento e um segundo fragmento, e os fragmentos podem ser de ortólogos da enzima CRISPR de organismos de gêneros aqui mencionados ou de espécies aqui mencionadas; vantajosamente os fragmentos são de ortólogos da enzima CRISPR de diferentes espécies.
[00219] Em modalidades, a proteína C2c2 como aqui referida também abrange uma variante funcional de C2c2 ou um homólogo ou um ortólogo da mesma.Uma "variante funcional" de uma proteína como aqui utilizada refere-se a uma variante dessa proteína que retém pelo menos parcialmente a atividade dessa proteína.As variantes funcionais podem incluir mutantes (que podem ser de inserção, exclusão ou substituição), incluindo polimorfos, etc.Também estão incluídos nas variantes funcionais produtos de fusão dessa proteína com outro ácido nucleico, proteína, polipeptídeo ou peptídeo, geralmente não relacionado.As variantes funcionais podem ocorrer naturalmente ou podem ser feitas pelo homem.Modalidades vantajosas podem envolver proteína efetora direcionada a RNATipo VI engenheirada ou de ocorrência não natural.
[00220] Em uma modalidade, a(s) molécula(s) de ácido nucleico que codifica o C2c2 ou um ortólogo ou homólogo do mesmo, pode ser otimizada por códon para expressão em uma célula eucariótica.Um eucarioto pode ser como aqui discutido.As moléculas de ácido nucleico podem ser manipuladas ou não naturais.
[00221] Em uma modalidade, o C2c2 ou um ortólogo ou homólogo do mesmo pode compreender uma ou mais mutações (e, portanto, molécula (s) de ácido nucleico que codifica para o mesmo podem ter mutação (ões).As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente e podem incluir, mas não estão limitadas a, uma ou mais mutações em um domínio catalítico.Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Cas9 podem incluir, mas não estão limitados a, domínios RuvCI, RuvCII, RuvCIII e HNH.
[00222] Numa modalidade, o C2c2 ou um ortólogo ou homólogo do mesmo, pode compreender uma ou mais mutações.As mutações podem ser mutações introduzidas artificialmente e podem incluir, mas não estão limitadas a, uma ou mais mutações em um domínio catalítico.Exemplos de domínios catalíticos com referência a uma enzima Cas podem incluir, mas não estão limitados a, domínios HEPN.
[00223] Numa modalidade, o C2c2 ou um ortólogo ou homólogo do mesmo, pode ser usado como uma proteína genérica de ligação ao ácido nucleico com fusão a ou estando operacionalmente ligada a um domínio funcional.Exemplos de domínios funcionais podem incluir, mas não estão limitados a, iniciador de tradução, ativador de tradução, repressor de tradução, nucleases, em particular ribonucleases, um spliceossoma, contas, uma luz inducible/controllable domínio ou um quimicamente inducible/controllable domínio.
[00224] Em certas modalidades exemplificativas, a proteína efetora C2c2 pode ser de um organismo selecionado do grupo que consiste em; Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor,
Mycoplasma, e Campylobacter.
[00225] Em certas modalidades, a proteína efetora pode ser uma Listeria sp.C2c2p, preferencialmente Listeria seeligeria C2c2p, mais preferencialmente Listeria seeligeria serovar 1/2b str.SLCC3954C2c2p e a sequência de crRNA podem ter 44 a 47 nucleotídeos de comprimento, com uma repetição direta 5' 29-nt (DR) e um espaçador de 15-nt a 18-nt.
[00226] Em certas modalidades, a proteína efetora pode ser uma Leptotrichia sp.C2c2p, preferencialmente Leptotrichia shahii C2c2p, mais preferencialmente Leptotrichia shahii DSM19757C2c2p e a sequência de crRNA podem ter 42 a 58 nucleotídeos de comprimento, com uma repetição direta de 5 'de pelo menos 24 nt, como uma sequência direta de 5' 24-28-nt repita (DR) e um espaçador de pelo menos 14 nt, como um espaçador de 14 a 28 nt, ou um espaçador de pelo menos 18 nt, como 19, 20, 21, 22 ou mais nt, como 18-28, 19-28, 20-28, 21-28 ou 22-28 nt.
[00227] Em certas modalidades exemplares, a proteína efetora pode ser uma Leptotrichia sp., Leptotrichia wadei F0279 ou uma Listeria sp., De preferência Listeria newyorkensis FSLM6-0635.
[00228] Em certas modalidades exemplares, as proteínas efetoras C2c2 da invenção incluem, sem limitação, as seguintes 21 espécies de ortólogos (incluindo vários loci CRISPR loci: Leptotrichia shahii; Leptotrichia wadei (Lw2); Listeria seeligeri; Lachnospiraceae bacterium MA2020; Lachnospiraceae bacterium NK4A179; [Clostridium] aminophilum DSM10710; Carnobacterium gallinarum DSM4847; Carnobacterium gallinarum DSM4847 (second CRISPRLoci); Paludibacter propionicigenes WB4; Listeria weihenstephanensis FSLR9-0317; Listeriaceae bacterium FSLM6-0635; Leptotrichia wadei F0279; Rhodobacter capsulatus SB1003; Rhodobacter capsulatus R121; Rhodobacter capsulatus DE442; Leptotrichia buccalis C-1013-b; Herbinix hemicellulosilytica; [Eubacterium] rectale; Eubacteriaceae bacterium CHKCI004; Blautia sp. Marseille-P2398; e Leptotrichia sp. oral taxon 879 str.F0557.Doze (12) outros exemplos não limitativos são:Lachnospiraceae bacterium NK4A144; Chloroflexus aggregans; Demequina aurantiaca; Thalassospira sp. TSL5-1; Pseudobutyrivibrio sp.OR37; Butyrivibrio sp.YAB3001; Blautia sp.Marselha-P2398; Leptotrichia sp.Marselha-P3007; Bacteroides ihuae; Bactéria Porphyromonadaceae KH3CP3RA; Listeria riparia; e Insolitispirillum peregrinum.
[00229] Em certas modalidades, a proteína C2c2 de acordo com a invenção é ou é derivada de um dos ortólogos, como descrito na tabela abaixo, ou é uma proteína quimérica de dois ou mais dos ortólogos, como descrito na tabela abaixo, ou é um mutante ou variante de um dos ortólogos,
conforme descrito na tabela abaixo (ou um mutante ou variante quimérica), incluindo C2c2 morto, C2c2 dividido, C2c2 desestabilizado, etc., conforme definido aqui em outro local, com ou sem fusão com um heterologous/functional domínio.
[00230] Em certas modalidades exemplificativas, a proteína efetora C2c2 é de um organismo selecionado do grupo que consiste em: Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter, e Lachnospira.
[00231] Em certas modalidades exemplares, a proteína efetora C2c2 é selecionada da Tabela 1 abaixo.
Tabela 1 Letras Ortólogo C2c2 Código múltiplas Leptotrichia shahii C2-2 Lsh L. wadeiF0279 (Lw2) C2-3 Lw2 Listeria seeligeri C2-4 Lse Lachnospiraceae bacterium MA2020 C2-5 LbM Lachnospiraceae bacterium NK4A179 C2-6 LbNK179 Clostridium aminophilumDSM10710 C2-7 CA Carnobacterium gallinarumDSM4847 C2-8 CG Carnobacterium gallinarumDSM4847 C2-9 Cg2
Paludibacter propionicigenesWB4 C2-10 Pp Listeria weihenstephanensisFSLR9-0317 C2-11 Lwei Listeriaceae bacterium FSLM6-0635 C2-12 LbFSL Leptotrichia wadeiF0279 C2-13 Lw Rhodobacter capsulatusSB1003 C2-14 Rc Rhodobacter capsulatusR121 C2-15 Rc Rhodobacter capsulatusDE442 C2-16 Rc Leptotrichia buccalis C-1013-b C2-17 LbuC2c2 Herbinix hemicellulosilytics C2-18 HheC2c2 Eubacterium rectale C2-19 EreC2c2 Eubacteriaceae bacteriumCHKC1004 C2-20 EbaC2c2 Blautia sp.Marseille-P2398 C2-21 BsmC2c2 Leptotrichia sp. táxon oral 879 str.F0557 C2-22 LspC2c2 Lachnospiraceae bacterium NK4a144 Agregados de cloroflexo Demequina aurantiaca Thalassospira sp.TSL5-1 Pseudobutyrivibrio sp.OR37 Butyrivibrio sp.YAB3001 Blautia sp.Marseille-P2398 Leptotrichia sp.Marselha-P300 Bacteroides ihuae Bactéria Porphyromonadaceae KH3CP3RA Listeria riparia Insolitispirillum peregrinum
[00232] As sequências de proteínas do tipo selvagem das espécies acima estão listadas na Tabela 2 abaixo.Em certas modalidades, é fornecida uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína C2c2.
Tabela 2
C2c2-2 L. shahii (Lsh)(SEQ.
I.D.
No. 147)
C2c2-2 L. shahii (Lsh)WP_018451595.1 c2c2-3 L. wadei (Lw2) I.D.
No. 148)
c2c2-4 Listeria seeligeri (SEQ.I.D.
No. 149)
c2c2-5 1 Lachnospiraceae bacterium MA2020 (SEQ.
I.D.
No. 150)
c2c2-6 2 Lachnospiraceae bacterium NK4A179 (SEQ.
I.D.
No. 151)
c2c2-7 3 Clostridium aminophilumDSM10710 (SEQ.
I.D.
No. 152)
c2c2-8 5 Carnobacterium gallinarumDSM4847 (SEQ.I.D.
No. 153)
c2c2-9 6 Carnobacterium gallinarumDSM4847 (SEQ.I.D.
No. 154)
c2c2-10 7 Paludibacter propionicigenesWB4 (SEQ.I.D.
No. 155)
c2c2-11 9 Listeria weihenstephanensisFSLR9-0317 (SEQ.
I.D.
No. 156)
c2c2-12 1 Listeriaceae bacterium FSLM6-0635 = 0 Listeria newyorkensisFSLM6-0635 (SEQ.
I.D.
No. 157)
c2c2-13 1 Leptotrichia wadeiF0279 (SEQ.I.D.
No. 158) 2 c2c2-14 1 Rhodobacter capsulatusSB1003 (SEQ.I.D.
No. 5 159)
c2c2-15 1 Rhodobacter capsulatusR121 (SEQ.I.D.
No. 6 160)
c2c2-16 1 Rhodobacter capsulatusDE442 (SEQ.I.D.
No. 7 161)
LbuC2c2 (C2-17) Leptorichia buccalis C-1013-b (SEQIDNO: 162)
HheC2c2 (C2-18) Herbinix hemicellulosilytica (SEQIDNO: 163)
EreC2c2 (C2-19) Eubacterium rectale (SEQIDNO: 164)
EbaC2C2 (C2-20) Eubacteriaceae bacterium CHKCI004 (SEQIDNO: 165)
C2c2 (C2-21) Blautia sp.Marseille-P2398 (SEQIDNO:166)
C2c2 (C2-22) Leptotrichia sp.Táxon oral 879 str.F0557 (SEQIDNO:167)
C2c2NK4A144 Lachnospiraceae bacterium NK4A144 (C2-23)
C2c2Chloro_agg Proteína de ligação ao RNAS1Chloroflexus (C2-24) aggregans (SEQIDNO:168)
C2c2Dem_Aur Demequina aurantiaca (C2-25) (SEQIDNO:169)
C2c2Thal_Sp_TSL Thalassospira sp.TSL5-1 5 (C2-26) (SEQIDNO:170)
C2c2Pseudo_sp Pseudobutyrivibrio sp.OR37 (C2-27) (SEQIDNO:171)
C2c2_Buty_sp Butyrivibrio sp.YAB3001 (C2-28)
C2c2_Blautia_sp Blautia sp.Marseille-P2398 (C2-29) (SEQIDNO:172)
C2c2_Lepto_sp_M Leptotrichia sp.Marseille-P3007 arseille (C2- (SEQIDNO:173) 30)
C2c2_Bacteroide Bacteroides ihuae s_ihuae (C2-31) (SEQIDNO:174)
C2c2_Porph_bact Bactéria Porphyromonadaceae KH3CP3RA erium (C2-32)
C2c2_Listeria_r Listeria riparia iparia (C2-33) (SEQIDNO:175)
C2c2_insolitis_ Insolitispirillum peregrinum peregrinum (C2- (SEQIDNO:176) 34)
[00233] Em uma modalidade da invenção, é fornecida uma proteína efetora que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia de sequência com a sequência do tipo selvagem de qualquer uma das bactérias Leptotrichia shahii C2c2, Lachnospiraceae bacterium MA2020C2c2, Lachnospiraceae bacterium NK4A179C2c2, Clostridium aminophilum (DSM10710) C2c2, Carnobacterium gallinarum (DSM4847) C2c2, Paludibacter propionicigenes (WB4) C2c2, Listeria weihenstephanensis (FSLR9-0317) C2c2, Listeriaceae bacterium (FSLM6-0635) C2c2, Listeria newyorkensis (FSLM6-0635) C2c2, Leptotrichia wadei (F0279) C2c2, Rhodobacter capsulatus (SB1003) C2c2, Rhodobacter capsulatus (R121) C2c2, Rhodobacter capsulatus (DE442) C2c2, Leptotrichia wadei (Lw2) C2c2, ou Listeria seeligeri C2c2.
[00234] Em uma modalidade da invenção, a proteína efetora compreende uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de homologia de sequência com uma sequência de consenso de proteína efetiva Tipo VI, incluindo, mas não se limitando a, uma sequência de consenso aqui descrita.
[00235] De acordo com a invenção, uma sequência de consenso pode ser gerada a partir de múltiplos ortólogos
C2c2, que podem auxiliar na localização de resíduos de aminoácidos conservados e motivos, incluindo, entre outros, resíduos catalíticos e motivos HEPN em ortólogos C2c2 que mediam a função C2c2.Uma dessas seqüências de consenso, geradas a partir dos 33 ortólogos mencionados acima usando o alinhamento Geneious, é a SEQIDNO:177.
[00236] Em outro exemplo não limitativo, uma ferramenta de alinhamento de sequência para auxiliar na geração de uma sequência de consenso e identificação de resíduos conservados é a ferramenta de alinhamento MUSCLE (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/). Por exemplo, usando MUSCLE, os seguintes locais de aminoácidos conservados entre os ortólogos C2c2 podem ser identificados em Leptotrichia wadei C2c2:K2; K5; V6; E301; L331; I335; N341; G351; K352; E375; L392; L396; D403; F446; I466; I470; R474 (HEPN); H475; H479 (HEPN), E508; P556; L561; I595; Y596; F600; Y669; I673; F681; L685; Y761; L676; L779; Y782; L836; D847; Y863; L869; I872; K879; I933; L954; I958; R961; Y965; E970; R971; D972; R1046 (HEPN), H1051 (HEPN), Y1075; D1076; K1078; K1080; I1083; I1090.
[00237] Um alinhamento de sequência exemplar de domínios HEPN mostrando resíduos altamente conservados é mostrado na FIG. 50
[00238] Em certas modalidades de exemplo, a proteína efetora direcionada a RNA é uma proteína efetora do Tipo
VI-B, como Cas13b e proteínas do Grupo 29 ou do Grupo 30.Em certas modalidades de exemplo, a proteína efetora de direcionamento de RNA compreende um ou mais domínios HEPN.Em certas modalidades de exemplo, a proteína efetora de direcionamento de RNA compreende um domínio HEPNC- terminal, um domínio HEPNN-terminal ou ambos. Em relação ao exemplo de proteínas efetoras do Tipo VI-B que podem ser usadas no contexto desta invenção, é feita referência ao Pedido US15/331.792, intitulado “Novel CRISPREnzymes and Systems” e depositado em 21 de outubro de 2016, Pedido Internacional de PatentePCT/US2016/058302, intitulado “Novel CRISPREnzymes and Systems”, and filed October 21, 2016, and Smargon et al. “Cas13b is a Type VI-BCRISPR- associated RNA-Guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28” Molecular Cell, 65, 1- 13 (2017); dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2016.12.023, e Pedido Provisório U.S. a ser atribuído, intitulado “Novel Cas13b Orthologues CRISPREnzymes and System” depositado em 15 de março de 2017.Em modalidades particulares, a enzima Cas13b é derivada de Bergeyella zoohelcum.Em certas outras modalidades exemplares, a proteína efetora é, ou compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de homologia de sequência com qualquer uma das sequências listadas na Tabela 3.
Tabela 3
B-01 Bergeyella zoohelcum B-02 Prevotella intermedia B-03 Prevotella buccae B-04 Alistipes sp.ZOR0009 B-05 Prevotella sp.MA2016 B-06 Riemerella anatipestifer B-07 Prevotella aurantiaca B-08 Prevotella saccharolytica B-09 Prevotella intermedia B-10 Capnocytophaga canimorsus B-11 Porphyromonas gulae B-12 Prevotella sp.P5-125 B-13 Flavobacterium branchiophilum B-14 Porphyromonas gingivalis B-15 Prevotella intermedia
[00239] Em certas modalidades exemplares, a sequência do tipo selvagem do ortólogo Cas13b é encontrada na Tabela 4 ou 5 abaixo.
Tabela 4 Bergeyella zoohelcum (SEQIDNO:178) 1 Prevotella intermedia (SEQIDNO:179) 2 Prevotella buccae (SEQIDNO:180) 3 Porphyromonas gingivalis (SEQIDNO:181) 4 Bacteroides pyogenes (SEQIDNO:182) 5. Alistipes sp.ZOR0009 6. Prevotella sp.MA2016 (SEQIDNO:183) 7a Prevotella sp.MA2016 (SEQIDNO:184) 7b Riemerella anatipestifer (SEQIDNO:185) 8 Prevotella aurantiaca (SEQIDNO:186) 9 Prevotella saccharolytica (SEQIDNO:187) 10 HMPREF9712_03108 [Myroides odoratimimus CCUG10230] 11 Prevotella intermedia (SEQIDNO:188) 12 Capnocytophaga canimorsus (SEQIDNO:189) 13 Porphyromonas gulae (SEQIDNO:190) 14 Prevotella sp.P5-125 (SEQIDNO:191) 15. Flavobacterium branchiophilum (SEQIDNO:192) 16 Myroides odoratimimus (SEQIDNO:193) 17 Flavobacterium columnare (SEQIDNO:194) 18 Porphyromonas gingivalis (SEQIDNO:195) 19 Porphyromonas sp.COT-052OH4946 20 Prevotella intermedia (SEQIDNO:196) 21
PIN17_0200 [Prevotella intermediário 17] AFJ07523 Prevotella intermedia (SEQIDNO:197) BAU18623 HMPREF6485_0083 [Prevotella buchas ATCC33574] EFU31981 HMPREF9144_1146 [Prevotella pallens ATCC700821] EGQ18444 HMPREF9714_02132 [Myroides odoratimimus CCUG12901] EHO08761 HMPREF9711_00870 [Myroides odoratimimus CCUG3837] EKB06014 HMPREF9699_02005 [Bergeyella zoohelcum ATCC43767] EKB54193 HMPREF9151_01387 [Prevotella saccharolytica F0055] EKY00089 A343_1752 [Porphyromonas gengivalis JCVISC001] EOA10535 HMPREF1981_03090 [Bacteroides pyogenes F0041] ERI81700 HMPREF1553_02065 [Porphyromonas gengival F0568] ERJ65637 HMPREF1988_01768 [Porphyromonas gengival F0185] ERJ81987 HMPREF1990_01800 [Porphyromonas gengivalis W4087] ERJ87335 M573_117042 [Prevotella intermediário ZT] KJJ86756 A2033_10205 [Bacteroidetes bactéria GWA2_31_9] OFX18020 .1 SAMN05421542_0666 [Chryseobacterium jejuense] SDI27289 .1 SAMN05444360_11366 [Chryseobacterium carnipullorum] SHM52812 .1 SAMN05421786_1011119 [Chryseobacterium ureilyticum] SIS70481 .1 Prevotella buccae WP_00434 3581 Porphyromonas gingivalis WP_00587 3511 Porphyromonas gingivalis WP_00587 4195 Prevotella pallens WP_00604 4833 Myroides odoratimimus WP_00626 1414 Myroides odoratimimus WP_00626 5509 Prevotella sp.MSX73 WP_00741 2163 Porphyromonas gingivalis WP_01245 8414 Paludibacter propionicigenes WP_01344 6107 Porphyromonas gingivalis WP_01381 6155 Flavobacterium columnare WP_01416 5541 Psychroflexus torquis WP_01502 4765 Riemerella anatipestifer WP_01534 5620 Prevotella pleuritidis WP_02158 4635 Porphyromonas gingivalis WP_02166
Porphyromonas gingivalis WP_02166 5475 Porphyromonas gingivalis WP_02167 7657 Porphyromonas gingivalis WP_02168 0012 Porphyromonas gingivalis WP_02384 6767 Prevotella falsenii WP_03688 4929 Prevotella pleuritidis WP_03693 1485 [Porphyromonas gingivalis WP_03941 7390 Porphyromonas gulae WP_03941 8912 Porphyromonas gulae WP_03941 9792 Porphyromonas gulae WP_03942 6176 Porphyromonas gulae WP_03943 1778 Porphyromonas gulae WP_03943 7199 Porphyromonas gulae WP_03944 2171 Porphyromonas gulae WP_03944 5055 Capnocytophaga cynodegmi WP_04198 9581 Prevotella sp.P5-119 WP_04251 8169 Prevotella sp.P4-76 WP_04407 2147 Prevotella sp.P5-60 WP_04407 4780 Phaeodactylibacter xiamenensis WP_04421 8239 Flavobacterium sp.316 WP_04596 8377 Porphyromonas gulae WP_04620 1018 WP_047431796 Chryseob acterium sp.YR477 Riemerella anatipestifer WP_04935 4263 Porphyromonas gingivalis WP_05291 2312 Porphyromonas gingivalis WP_05801 9250
Flavobacterium columnare WP_06038 1855 Porphyromonas gingivalis WP_06115 6470 Porphyromonas gingivalis WP_06115 6637 Riemerella anatipestifer WP_06171 0138 Flavobacterium columnare WP_06374 4070 Riemerella anatipestifer WP_06497 0887 Sinomicrobium oceani WP_07231
9476.1 Reichenbachiella agariperforans WP_07312
4441.1 Tabela 5 Nome ou número de acesso WP_015345620 WP_049354263 WP_061710138 6 (SEQIDNO:198) SIS70481.1 (SEQIDNO:199) 15 (SEQIDNO:200) WP_042518169 WP_044072147 WP_044074780 8_(modified) (IDSEQNO:201) WP_064970887 5 (SEQIDNO:202) ERI81700 (SEQIDNO:203) WP_036931485 19 (SEQIDNO:204) WP_012458414 WP_013816155 WP_039417390 WP_039419792 WP_039426176 WP_039437199 WP_061156470 12 (SEQIDNO:205) 9 (SEQIDNO:206) EGQ18444 (SEQIDNO:207) KJJ86756 (SEQIDNO:208) WP_006044833 2 (SEQIDNO:209) 3 (IDSEQNO:210) EFU31981 (SEQIDNO:211) WP_004343581 WP_007412163
WP_044218239 21 (SEQIDNO:212) BAU18623 (SEQIDNO:213) WP_036884929 WP_073124441.1 AFJ07523 (SEQIDNO:214) 4 (SEQIDNO:215) ERJ65637 (SEQIDNO:216) ERJ81987 (SEQIDNO:217) ERJ87335 (SEQIDNO:218) WP_005873511 WP_021663197 WP_021665475 WP_021677657 WP_021680012 WP_023846767 WP_039445055 WP_061156637 WP_021584635 WP_015024765 WP_047431796 WP_072319476.1 16 (SEQIDNO:219) EKY00089 (SEQIDNO:220) 10 (SEQIDNO:221) WP_013446107 WP_045968377 SHM52812.1 (SEQIDNO:222) EHO08761 (SEQIDNO:223) EKB06014 (SEQIDNO:224) WP_006261414 WP_006265509 11 (SEQIDNO:225) 17 (SEQIDNO:226) OFX18020.1 (SEQIDNO:227) SDI27289.1 (SEQIDNO:228) WP_039442171 14 (SEQIDNO:229) 20 (SEQIDNO:230) EOA10535 (SEQIDNO:231) WP_005874195 WP_039418912 WP_039431778 WP_046201018 WP_052912312 WP_058019250 WP_014165541 13 (SEQIDNO:232) WP_060381855 WP_063744070 18 (SEQIDNO:233)
WP_041989581 1 (SEQIDNO:234) EKB54193 (SEQIDNO:235) 7_(modified) (SEQIDNO:236) 7_(modified)_-_residues_only (IDSEQNO:237)
[00240] Em certas modalidades de exemplo, a proteína efetora direcionada a RNA é uma proteína efetora Cas13c, conforme divulgado no Pedido de Patente Provisório U.S.
62/525.165 depositado em 26 de junho de 2017 e no Pedido PCTUS2017/047193 depositado em 16 de agosto de 2017.Em certas modalidades exemplares, a proteína Cas13c pode ser de um organismo de um gênero como Fusobacterium ou Anaerosalibacter.Sequências de ortólogos de tipo selvagem de Cas13c são fornecidas na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6 Nome EHO19081 WP_094899336 WP_040490876 WP_047396607 WP_035935671 WP_035906563 WP_042678931 WP_062627846 WP_005959231 WP_027128616 WP_062624740 WP_096402050
[00241] Em certas modalidades de exemplo, a proteína Cas13 pode ser selecionada de qualquer um dos seguintes.
Tabela 7 ID Espécies Seq. ID.
No:
Cas13a1 Leptotrichia shahii 238
Cas13a2 Leptotrichia wadei (Lw2) 239
Cas13a3 Listeria seeligeri 240
Cas13a4 Lachnospiraceae bacterium MA2020 241
Cas13a5 Lachnospiraceae bacterium NK4A179 242
Cas13a6 [Clostridium] aminophilum DSM10710 243
Cas13a7 Carnobacterium gallinarum DSM4847 244
Cas13a8 Carnobacterium gallinarum DSM4847 245
Cas13a9 Paludibacter propionicigenes WB4 246
Cas13a10 Listeria weihenstephanensis FSLR9-0317 247
Cas13a11 BactériaListeriaceae FSLM6-0635 248
Cas13a12 Leptotrichia wadei F0279 249
Cas13a13 Rhodobacter capsulatus SB1003 250
Cas13a14 Rhodobacter capsulatus R121 251
Cas13a15 Rhodobacter capsulatus DE442 252
Cas13a16 Leptotrichia buccalis C-1013-b 253
Cas13a17 Herbinix hemicellulosilytica 254
Cas13a18 [Eubacterium] rectale 255
Cas13a19 Eubacteriaceae bacterium CHKCI004 256
Cas13a20 Blautia sp.Marseille-P2398 257
Táxon oral Leptotrichia sp. 879 str. Cas13a21 F0557 258 Cas13b1 Bergeyella zoohelcum 259 Cas13b2 Prevotella intermedia 260 Cas13b3 Prevotella buccae 261 Cas13b4 Alistipes sp.ZOR0009 262 Cas13b5 Prevotella sp.MA2016 263 Cas13b6 Riemerella anatipestifer 264 Cas13b7 Prevotella aurantiaca 265 Cas13b8 Prevotella saccharolytica 266 Cas13b9 Prevotella intermedia 267 Cas13b10 Capnocytophaga canimorsus 268 Cas13b11 Porphyromonas gulae 269 Cas13b12 Prevotella sp.P5-125 270: Cas13b13 Flavobacterium branchiophilum 271 Cas13b14 Porphyromonas gingivalis 272 Cas13b15 Prevotella intermedia 273 Fusobacterium necrophorum subsp. Cas13c1 ATCC51357 contig00003 274 Fusobacterium necrophorum DJ-2 contig0065, sequência de espingarda do Cas13c2 genoma completo 275 Fusobacterium necrophorum BFTR-1 Cas13c3 contig0068 276 Fusobacterium necrophorum subsp. Ca13c4 funduliforme 1_1_36S cont1.14 277 Fusobacterium perfoetens Cas13c5 ATCC29250T364DRAFT_scaffold00009.9_C 278 Fusobacterium ulcerans ATCC49185 Cas13c6 cont2.38 279 Anaerosalibacter sp.Montagem do genoma Cas13c7 ND1Anaerosalibacter massiliensis ND1 280 Cas12Proteínas
[00242] Em certas modalidades exemplares, os ensaios podem compreender vários ortólogos de Cas12 ou um ou mais ortólogos em combinação com um ou mais ortólogos de Cas13.Em certas modalidades de exemplo, os ortólogos Cas12 são ortólogos Cpf1.Em certas outras modalidades de exemplo, os ortólogos de Cas12 são ortólogos de C2c1.
Ortólogos de Cpf1
[00243] A presente invenção abrange o uso de uma proteína efetora Cpf1, derivada de um locus Cpf1 indicado como subtipo VA. Aqui, essas proteínas efetoras também são chamadas de "Cpf1p", por exemplo, uma proteína Cpf1 (e essa proteína efetora ou proteína Cpf1 ou proteína derivada de um locus Cpf1 também é chamada de "enzima CRISPR").Atualmente, o subtipo VA loci abrange cas1, cas2, um gene distinto denotado cpf1 e uma matriz CRISPR.Cpf1 (proteína Cpf1 associada ao CRISPR, subtipo PREFRAN) é uma proteína grande (cerca de 1300 aminoácidos) que contém um domínio de nuclease semelhante a RuvC homólogo ao domínio correspondente de Cas9 junto com um equivalente ao cluster característico de Cas9 rico em arginina.No entanto, Cpf1 não possui o domínio de nuclease HNH que está presente em todas as proteínas Cas9, e o domínio tipo RuvC é contíguo na sequência Cpf1, em contraste com Cas9, onde contém inserções longas, incluindo o domínio HNH.Por conseguinte, em modalidades particulares, a enzima CRISPR-Cas compreende apenas um domínio de nuclease do tipo RuvC.
[00244] A programabilidade, especificidade e atividade colateral do Cpf1 guiado por RNA também o tornam uma nuclease comutável ideal para a clivagem inespecífica de ácidos nucleicos.Numa modalidade, um sistema Cpf1 é projetado para fornecer e tirar proveito da clivagem colateral não específica do RNA.Em outra modalidade, um sistema Cpf1 é projetado para fornecer e tirar vantagem da clivagem colateral não específica do ssDNA.Por conseguinte, os sistemas Cpf1 projetados fornecem plataformas para detecção de ácidos nucleicos e manipulação de transcriptomas.OCpf1 foi desenvolvido para ser usado como uma ferramenta de ligação e knockdown de transcrição de mamíferos.OCpf1 é capaz de clivagem colateral robusta de RNA e ssDNA quando ativado pela ligação ao DNA direcionado específico da sequência.
[00245] Os termos "ortólogo" (também aqui referido como "ortólogo") e "homólogo" (também aqui referido como "homólogo") são bem conhecidos na técnica.Por meio de orientações adicionais, um "homólogo" de uma proteína como aqui utilizado é uma proteína da mesma espécie que desempenha a mesma ou uma função semelhante à da proteína da qual é um homólogo.As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.Um "ortólogo" de uma proteína como aqui utilizado é uma proteína de uma espécie diferente que desempenha a mesma função ou uma função semelhante à da qual é um ortólogo.As proteínas ortólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.Homólogos e ortólogos podem ser identificados por modelagem de homologia (ver, por exemplo, Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, e Blundell et al.Eur JBiochem vol 172 (1988), 513) or "structural BLAST" (Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B. Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function. Protein Sci.2013Apr;22(4):359-66. doi:
10.1002/pro.2225Veja também Shmakov et al. (2015) para aplicação no campo de CRISPR-Cas loci.As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.
[00246] O gene Cpf1 é encontrado em vários genomas bacterianos diversos, geralmente no mesmo local com os genes cas1, cas2 e cas4 e um cassete CRISPR (por exemplo, FNFX1_1431-FNFX1_1428 de Francisella cf. novicida Fx1).Assim, o layout deste novo sistema putativo CRISPR-Cas parece ser semelhante ao do tipo II-B. Além disso, semelhante ao Cas9, a proteína Cpf1 contém uma região C- terminal prontamente identificável que é homóloga ao transpóson ORF-B e inclui uma nuclease ativa do tipo RuvC, uma região rica em arginina e um dedo Zn (ausente no Cas9).No entanto, ao contrário do Cas9, o Cpf1 também está presente em vários genomas sem um contexto CRISPR-Cas e sua similaridade relativamente alta com o ORF-B sugere que ele pode ser um componente do transposon.Foi sugerido que, se esse fosse um sistema CRISPR-Cas genuíno e o Cpf1 fosse um análogo funcional do Cas9, seria um novo tipo de CRISPR- Cas, o tipo V (consulte Anotação e Classificação dos Sistemas CRISPR-Cas.Makarova KS, Koonin EV.Methods Mol Biol.2015;1311:47-75).No entanto, como aqui descrito, Cpf1 é indicado como estando no subtipo VA para distingui-lo de C2c1p que não possui uma estrutura de domínio idêntica e, portanto, é indicado como estando no subtipo VB.
[00247] Em modalidades particulares, a proteína efetora é uma proteína efetora Cpf1 de um organismo de um gênero que compreende Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eactobacterium, Lactobacillus, Ephilococcus.,Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanometethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatillus, Tubitaminibilus, Bacillobacterus, Bacon.
[00248] Em outras modalidades particulares, a proteína efetora Cpf1 é de um organismo selecionado dentre S. mutans, S. agalactiae, S. equisimilis, S. sanguinis, S.
pneumonia; C. jejuni, C. coli; N. salsuginis, N. tergarcus; S. auricularis, S. carnosus; N. meningitides, N.
gonorrhoeae; L. monocytogenes, L. ivanovii; C. botulinum, C. difficile, C. tetani, C. sordellii.
[00249] A proteína efetora pode compreender uma proteína efetiva quimérica compreendendo um primeiro fragmento de um primeiro ortólogo de proteína efetiva (por exemplo, um Cpf1) e um segundo fragmento de um segundo ortólogo de proteína efetora (por exemplo, um Cpf1) e em que a primeira e a segunda proteína efetora ortólogos são diferentes.Pelo menos um dos primeiro e segundo ortólogos de proteínas efetoras (por exemplo, um Cpf1) pode compreender uma proteína efetora (por exemplo, um Cpf1) de um organismo que compreende Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium ou Acidaminococcus; por exemplo, uma proteína efetora quimérica compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento em que cada um do primeiro e do segundo fragmentos é selecionado de um Cpf1 de um organismo que compreende Streptococcus, Campylobacter, Nitratifrator, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerocha. Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanometethyophilus, Porphyromocroidea, Desotella,Brevibacilus, Methylobacterium ou Acidaminococcus em que o primeiro e o segundo fragmentos não são da mesma bactéria; por exemplo, uma proteína efetora quimérica compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento em que cada um do primeiro e do segundo fragmentos é selecionado de um Cpf1 de S. mutans, S. agalactiae, S.
equisimilis, S. sanguinis, S. pneumonia; C. jejuni, C.
coli; N. salsuginis, N. tergarcus; S. auricularis, S.
carnosus; N. meningitides, N. gonorrhoeae; L.
monocytogenes, L. ivanovii; C. botulinum, C. difficile, C.
tetani, C. sordellii; Francisella tularensis 1, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC20171, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp.BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens and Porphyromonas macacae, em que o primeiro e o segundo fragmentos não são os primeiros e segundos fragmentos.
[00250] Numa modalidade mais preferida, o Cpf1p é derivado de uma espécie bacteriana selecionada de Francisella tularensis 1, Prevotella albensis, Lachnospiraceae bacterium MC20171, Butyrivibrio proteoclasticus, Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10, Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17, Smithella sp. SCADC, Acidaminococcus sp.BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium eligens, Moraxella bovoculi 237, Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium ND2006, Porphyromonas crevioricanis 3, Prevotella disiens e Porphyromonas macacae. Em certas modalidades, o Cpf1p é derivado de uma espécie bacteriana selecionada de Acidaminococcus sp.BV3L6, Lachnospiraceae bacterium MA2020.
Em certas modalidades, a proteína efetora é derivada de uma subespécie de Francisella tularensis 1, incluindo mas não se limitando a Francisella tularensis subsp.Novicida.
[00251] Em algumas modalidades, o Cpf1p é derivado de um organismo do gênero Eubacterium. Em algumas modalidades, a proteína efetora CRISPR é uma proteína Cpf1 derivada de um organismo das espécies bacterianas de
Eubacterium retale. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína efetora Cpf1 corresponde à Sequência de Referência NCBIWP_055225123.1, Sequência de Referência NCBIWP_055237260.1, Sequência de Referência NCBIWP_055272206.1 ou GenBank IDOLA16049.1. Em algumas modalidades, a proteína efetora Cpf1 tem uma homologia de sequência ou identidade de sequência de pelo menos 60%, mais particularmente pelo menos 70, como pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo, pelo menos 95%, com a sequência de referência NCBIWP_055225123.1, a sequência de referência NCBIWP_055237260.1, a sequência de referência NCBIWP_055272206.1 ou GenBank IDOLA16049.1. O especialista compreenderá que isso inclui formas truncadas da proteína Cpf1, através das quais a identidade da sequência é determinada ao longo do comprimento da forma truncada.Em algumas modalidades, o efetor Cpf1 reconhece a sequência PAM de TTTN ou CTTN.
[00252] Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de Cpf1 conforme referido neste documento tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como, por exemplo, pelo menos 95% com Cpf1.Em outras modalidades, o homólogo ou ortólogo de Cpf1, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o Cpf1 de tipo selvagem.Quando o Cpf1 possui uma ou mais mutações (mutadas), o homólogo ou ortólogo do referido Cpf1, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o Cpf1 mutado.
[00253] Em um ambodiment, a proteína Cpf1 pode ser um ortólogo de um organismo de um gênero que inclui, mas não está limitado a Acidaminococcus sp, Lachnospiraceae bacterium or Moraxella bovoculi;; em modalidades particulares, a proteína Cas tipo V pode ser um ortólogo de um organismo de uma espécie que inclui, mas não está limitado a Acidaminococcus sp. BV3L6; Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) or Moraxella bovoculi 237.Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de Cpf1, conforme referido neste documento, tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com uma ou mais das sequências Cpf1 aqui divulgadas.Em outras modalidades, o homólogo ou ortólogo de Cpf, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o tipo selvagem FnCpf1, AsCpf1 ou LbCpf1.
[00254] Em modalidades particulares, a proteína Cpf1 da invenção tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 60%, mais particularmente pelo menos 70, como pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos, 95% com FnCpf1, AsCpf1 ou LbCpf1. Em outras modalidades, a proteína Cpf1, conforme referida neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 70%, mais particularmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos, 95% com o tipo selvagem AsCpf1 ou LbCpf1.Em modalidades particulares, a proteína Cpf1 da presente invenção tem menos de 60% de identidade de sequência com FnCpf1.O especialista compreenderá que isso inclui formas truncadas da proteína Cpf1, através das quais a identidade da sequência é determinada ao longo do comprimento da forma truncada.
[00255] Em alguns dos itens a seguir, os aminoácidos
Cpf1 são seguidos por sinais de localização nuclear (NLS) (itálico), um ligante de glicina-serina (GS), e etiqueta de 3x HA. 1- Franscisella tularensis subsp. novicida U112 (FnCpf1)(SEQIDNO:281); 3- Lachnospiraceae bacterium MC2017 (Lb3Cpf1) (SEQIDNO:282); 4- Butyrivibrio proteoclasticus (BpCpf1) (SEQIDNO:283); 5- Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1)(SEQIDNO:284); 6- Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1) (SEQIDNO:285);7- Smithella sp. SC_K08D17 (SsCpf1)(SEQIDNO:286); 8- Acidaminococcus sp. BV3L6 (AsCpf1)(SEQIDNO:287); 9- Lachnospiraceae bacterium MA2020 (Lb2Cpf1) (SEQIDNO:288); 10-Candidatus Methanoplasma termitum (CMtCpf1) (SEQIDNO:289); 11- Eubacterium eligens (EeCpf1)(SEQIDNO:290); 12- Moraxella bovoculi 237 (MbCpf1) (SEQIDNO:291); 13- Leptospira inadai (LiCpf1) (SEQIDNO:292); 14- Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) (SEQIDNO:293); 15- Porphyromonas crevioricanis (PcCpf1) (SEQIDNO:294); 16- Prevotella disiens (PdCpf1) (SEQIDNO:295); 17- Porphyromonas macacae (PmCpf1) (SEQIDNO:296); 18- Thiomicrospira sp. XS5 (TsCpf1) (IDSEQNO:297); 19- Moraxella bovoculi AAX08_00205 (Mb2Cpf1) (IDSEQNO:298); 20- Moraxella bovoculi AAX11_00205 (Mb3Cpf1) (IDSEQNO:299); e 21- Butyrivibrio sp.NC3005 (BsCpf1) (IDSEQNO:300).
[00256] Outros ortólogos do Cpf1 incluem
NCBIWP_055225123.1, NCBIWP_055237260.1, NCBIWP_055272206.1, e GenBank OLA16049.1.
Ortólogos de C2c1
[00257] A presente invenção abrange o uso de proteínas efetoras C2c1, derivada de um locus C2c1 indicado como subtipo V-B. Aqui, essas proteínas efetoras também são chamadas de "C2c1p", por exemplo, uma proteína C2c1 (e essa proteína efetora ou proteína C2c1 ou proteína derivada de um locus C2c1 também é chamada de "enzima CRISPR").
Atualmente, o loci de V-B de subtipo abrange uma fusão cas1-Cas4, cas2, um gene distinto denotado C2c1 e um arranjo CRISPR. C2c1 (proteína C2c1 associada ao CRISPR) é uma proteína grande (cerca de 1100 - 1300 aminoácidos) que contém um domínio de nuclease semelhante ao RuvC homólogo ao domínio correspondente do Cas9, juntamente com um equivalente ao agrupameto característico de Cas9, rico em arginina.No entanto, C2c1 não possui o domínio de HNH nuclease que está presente em todas as proteínas Cas9 e o domínio tipo RuvC é contíguo na sequência C2c1, em contraste com Cas9, onde contém insertos longos, incluindo o domínio HNH.Por conseguinte, em modalidades particulares, a enzima CRISPR-Cas compreende apenas um domínio de nuclease do tipo RuvC.
[00258] As proteínas C2c1 (também conhecidas como Cas12b) são nucleases guiadas por RNA.Sua clivagem depende de um RNA tracr para recrutar um RNA guia que compreende uma sequência guia e uma repetição direta, em que a sequência guia hibrida com a sequência nucleotídica alvo para formar um DNA/RNA heteroduplex.Com base nos estudos atuais, a atividade da nuclease C2c1 também requer o reconhecimento da sequência do PAM.As sequências C2c1PAM são sequências ricas em T.Em algumas modalidades, a sequência de PAM é 5 'TTN3' ou 5 'ATTN3', em que N é qualquer nucleotídeo.Numa modalidade particular, a sequência PAM é 5 'TTC3'.Numa modalidade particular, o PAM está na sequência de Plasmodium falciparum.
[00259] C2c1 cria um corte escalonado no local do alvo, com uma saliência de 5 'ou uma “extremidade pegajosa” no lado distal do PAM da sequência alvo.Em algumas modalidades, a saliência 5 'é 7 nt.Veja Lewis e Ke, Mol Cell. 2017 fev 2;65(3):377-379.
[00260] A invenção fornece proteínas e ortólogos efetores C2c1 (Tipo VB; Cas12b).Os termos "ortólogo" (também aqui referido como "ortólogo") e "homólogo" (também aqui referido como "homólogo") são bem conhecidos na técnica.Por meio de orientações adicionais, um "homólogo" de uma proteína como aqui utilizado é uma proteína da mesma espécie que desempenha a mesma ou uma função semelhante à da proteína da qual é um homólogo.As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente,
ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.Um "ortólogo" de uma proteína como aqui utilizado é uma proteína de uma espécie diferente que desempenha a mesma função ou uma função semelhante à da qual é um ortólogo.As proteínas ortólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.Homólogos e ortólogos podem ser identificados por modelagem de homologia (ver, por exemplo, Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, e Blundell et al.Eur JBiochem vol 172 (1988), 513) ou "BLAST estrutural" Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B.
Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function.Protein Sci.2013Apr;22(4):359-66. doi:
10.1002/pro.2225Veja também Shmakov et al. (2015) para aplicação no campo de CRISPR-Cas loci.As proteínas homólogas podem, mas não precisam estar relacionadas estruturalmente, ou estão apenas parcialmente relacionadas estruturalmente.
[00261] O gene C2c1 é encontrado em vários genomas bacterianos diversos, tipicamente no mesmo local com os genes cas1, cas2 e cas4 e um cassete CRISPR.Assim, o layout deste novo sistema putativo CRISPR-Cas parece ser semelhante ao do tipo II-B. Além disso, semelhante ao Cas9, a proteína C2c1 contém uma nuclease ativa do tipo RuvC, uma região rica em arginina e um dedo de Zn (ausente no Cas9).
[00262] Em modalidades particulares, a proteína efetora é uma proteína efetora C2c1 de um organismo de um gênero compreendendo Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus, Desulfatirhabdium, Citrobacter, Elusimicrobia, Methylobacterium, Omnitrophica, Phycisphaerae, Planctomycetes, Spirochaetes, e Verrucomicrobiaceae.
[00263] Em outras modalidades particulares, a proteína efetora C2c1 é de uma espécie selecionada de Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo, ATCC49025), Alicyclobacillus contaminans (por exemplo, DSM17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (por exemploDSM17980), Bacillus hisashii strain C4, Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (por exemplo, DSM10711), Desulfonatronum thiodismutans (por exemplo, cepa MLF-1), Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus (por exemplo, DSM17572), Bacillus thermoamylovorans (por exemplo, cepa B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp.NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (por exemplo, DSM18734),
Alicyclobacillus herbarius (por exemplo, DSM13609), Citrobacter freundii (por exemplo, ATCC8090), Brevibacillus agri (por exemplo, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (por exemplo, ORS2060).
[00264] A proteína efetora pode compreender uma proteína efetora quimérica compreendendo um primeiro fragmento de um primeiro ortólogo de proteína efetora (por exemplo, um C2c1) e um segundo fragmento de um segundo ortólogo de proteína efetora (por exemplo, um C2c1) e em que o primeiro e o segundo ortólogos de proteína efetora são diferentes.Pelo menos um dos primeiro e segundo ortólogos de proteínas efetoras (por exemplo, um C2c1) pode compreender uma proteína efetiva (por exemplo, um C2c1) de um organismo que compreende Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus, Desulfatirhabd Elusimicrobia, Citrobacter, Methylobacterium, Omnitrophicai, Phycisphaerae, Planctomycetes, Spirochaetes e Verrucomicrobiaceae; por exemplo, uma proteína efetora quimérica compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento em que cada um dos primeiro e segundo fragmentos é selecionado a partir de um C2c1 de um organismo compreendendo Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus,
Desulfatirhabdium, Elulfobibrillus Citrobacter,
Methylobacterium, Omnitrophicai, Phycisphaerae,
Planctomycetes, Spirochaetes e Verrucomicrobiaceae em que o primeiro e o segundo fragmentos não são da mesma bactéria;
por exemplo, uma proteína efetora quimérica compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento em que cada um dos primeiro e segundo fragmentos é selecionado a partir de um C2c1 de Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo,
ATCC49025), Alicyclobacillus contaminans (por exemplo,
DSM17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (por exemplo
DSM17980), cepa C4 de Bacillus hisashii, Candidatus
Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (por exemplo, DSM10711), Desulfonatronum thiodismutans (por exemplo, cepa MLF-1), Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium
RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium
RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13,
Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus (por exemplo, DSM17572), Bacillus thermoamylovorans
(por exemplo, cepa B4166), Brevibacillus sp.
CF112,
Bacillus sp.NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (por exemplo, DSM18734), Alicyclobacillus herbarius (por exemplo, DSM13609), Citrobacter freundii (por exemplo,
ATCC8090), Brevibacillus agri (por exemplo, BAB-2500),
Methylobacterium nodulans (por exemplo, ORS2060), em que o primeiro e o segundo fragmentos não são da mesma bactéria.
[00265] Numa modalidade mais preferida, o C2c1p é derivado de uma espécie bacteriana selecionada de Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo, ATCC49025), Alicyclobacillus contaminans (por exemplo, DSM17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (por exemploDSM17980), Bacillus hisashii strain C4, Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (por exemplo, DSM10711), Desulfonatronum thiodismutans (por exemplo, cepa MLF-1), Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus (por exemplo, DSM17572), Bacillus thermoamylovorans (por exemplo, cepa B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp.NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (por exemplo, DSM18734), Alicyclobacillus herbarius (por exemplo, DSM13609), Citrobacter freundii (por exemplo, ATCC8090), Brevibacillus agri (por exemplo, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (por exemplo, ORS2060).Em certas modalidades, o C2c1p é derivado de uma espécie bacteriana selecionada de Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo, ATCC49025),
Alicyclobacillus contaminans (por exemplo, DSM17975).
[00266] Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de C2c1, conforme referido neste documento, tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com C2c1.Em outras modalidades, o homólogo ou ortólogo de C2c1, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o C2c1 de tipo selvagem.Quando o C2c1 possui uma ou mais mutações (mutadas), o homólogo ou ortólogo do referido C2c1, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o C2c1 mutado.
[00267] Em uma modalidade, a proteína C2c1 pode ser um ortólogo de um organismo de um gênero que inclui, mas não está limitado a, Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus, Desulfatirhabdium, Elusimicrobia, Citrobacterium, Phycisphaerae, Planctomycetes, Spirochaetes e Verrucomicrobiaceae; em modalidades particulares, a proteína Cas tipo V pode ser um ortólogo de um organismo de uma espécie que inclui, mas não se limita a Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo,
ATCC49025), Alicyclobacillus contaminans (por exemplo,
DSM17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (por exemplo,
DSM17980), cepa C4 de Bacillus hisashii, Candidatus
Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (por exemplo, DSM10711), Desulfonatronum thiodismutans (por exemplo, cepa MLF-1), Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium
RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium
RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13,
Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus (por exemplo, DSM17572), Bacillus thermoamylovorans
(por exemplo, cepa B4166), Brevibacillus sp.
CF112,
Bacillus sp.NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (por exemplo, DSM18734), Alicyclobacillus herbarius (por exemplo, DSM13609), Citrobacter freundii (por exemplo,
ATCC8090), Brevibacillus agri (por exemplo, BAB-2500),
Methylobacterium nodulans (por exemplo, ORS2060).Em modalidades particulares, o homólogo ou ortólogo de C2c1,
conforme referido neste documento, tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com uma ou mais das sequências C2c1 aqui divulgadas.Em outras modalidades, o homólogo ou ortólogo de C2c1, conforme referido neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, como por exemplo pelo menos 95% com o AacC2c1 ou BthC2c1 de tipo selvagem.
[00268] Em modalidades particulares, a proteína C2c1 da invenção tem uma homologia ou identidade de sequência de pelo menos 60%, mais particularmente pelo menos 70, como pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos, 95% com AacC2c1 ou BthC2c1. Em outras modalidades, a proteína C2c1, conforme referida neste documento, tem uma identidade de sequência de pelo menos 60%, como pelo menos 70%, mais particularmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos, 95% com o tipo selvagem AacC2c1.Em modalidades particulares, a proteína C2c1 da presente invenção tem menos de 60% de identidade de sequência com AacC2c1.O versado compreenderá que isso inclui formas truncadas da proteína C2c1, através das quais a identidade da sequência é determinada ao longo do comprimento da forma truncada.
[00269] Em certos métodos de acordo com a presente invenção, a proteína CRISPR-Cas é preferencialmente mutada em relação a uma enzima de tipo selvagem correspondente, de modo que a proteína CRISPR-Cas mutada não possua a capacidade de clivar uma ou ambas as cadeias de DNA de um locus alvo contendo uma enzima. sequência alvo.Em modalidades particulares, um ou mais domínios catalíticos da proteína C2c1 são mutados para produzir uma proteína Cas mutada que cliva apenas uma fita de DNA de uma sequência alvo.
[00270] Em modalidades particulares, a proteína CRISPR-Cas pode ser mutada em relação a uma enzima de tipo selvagem correspondente, de modo que a proteína CRISPR-Cas mutada não possua substancialmente toda a atividade de clivagem de DNA.Em algumas modalidades, uma proteína CRISPR-Cas pode ser considerada como tendo substancialmente todo o DNAe/ouAtividade de clivagem de RNA quando a atividade de clivagem da enzima mutada não passa de 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01%, ou menos da atividade de clivagem de ácido nucleico da forma não mutada da enzima; um exemplo pode ser quando a atividade de clivagem de ácido nucleico da forma mutada é nula ou desprezível em comparação com a forma não mutada.
[00271] Em certas modalidades dos métodos aqui fornecidos, a proteína CRISPR-Cas é uma proteína mutada de
CRISPR-Cas que cliva apenas uma fita de DNA, isto é, uma nickase.Mais particularmente, no contexto da presente invenção, a nickase garante a clivagem dentro da sequência não alvo, isto é, a sequência que está na fita de DNA oposta da sequência alvo e que é 3 'da sequência PAM.Por meio de orientações adicionais, e sem limitação, uma substituição de arginina-alanina (R911A) no domínio Nuc de C2c1 de Alicyclobacillus acidoterrestris converte C2c1 de uma nuclease que quebra as duas cadeias em uma nickase (quebra uma única cadeia).Será entendido pelo especialista que, onde a enzima não é AacC2c1, uma mutação pode ser feita em um resíduo na posição correspondente.
[00272] Em certas modalidades, a proteína C2c1 é um C2c1 cataliticamente inativo que compreende uma mutação no domínio RuvC.Em algumas modalidades, a proteína C2c1 cataliticamente inativa compreende uma mutação correspondente às posições D570, E848 ou D977 do ácido amial em Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1.Em algumas modalidades, a proteína C2c1 cataliticamente inativa compreende uma mutação correspondente a D570A, E848A ou D977A em Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1.
[00273] A programabilidade, especificidade e atividade colateral do C2c1 guiado por RNA também o tornam uma nuclease comutável ideal para a clivagem inespecífica de ácidos nucleicos.Numa modalidade, um sistema C2c1 é projetado para fornecer e tirar proveito da clivagem colateral não específica do RNA.Em outra modalidade, um sistema C2c1 é projetado para fornecer e tirar vantagem da clivagem colateral não específica do ssDNA.Por conseguinte, os sistemas C2c1 engenheirados fornecem plataformas para a detecção de ácidos nucleicos e manipulação de transcriptomas e induzem a morte celular.OC2c1 foi desenvolvido para ser usado como uma ferramenta de ligação e knockdown de transcrição de mamíferos.OC2c1 é capaz de clivagem colateral robusta de RNA e ssDNA quando ativado pela ligação ao DNA direcionado específico da sequência.
[00274] Em certas modalidades, C2c1 é fornecido ou expresso em um sistema in vitro ou em uma célula, de forma transitória ou estável, e direcionado ou desencadeado para clivar não especificamente ácidos nucleicos celulares.Numa modalidade, C2c1 é projetado para derrubar ssDNA, por exemplo, ssDNA viral.Em outra modalidade, C2c1 é projetado para derrubar o RNA.O sistema pode ser concebido de modo que o knockdown seja dependente de um DNA alvo presente na célula ou no sistema in vitro, ou acionado pela adição de um ácido nucleico alvo ao sistema ou célula.
[00275] Em uma modalidade, o sistema C2c1 é engenheirado para clivar RNA não especificamente em um subconjunto de células distinguíveis pela presença de uma sequência de DNA aberrante, por exemplo, onde a clivagem do
DNA aberrante pode ser incompleta ou ineficaz.Em um exemplo não limitativo, é direcionada uma translocação de DNA presente em uma célula cancerígena e que promove a transformação celular.Enquanto uma subpopulação de células que sofre DNA cromossômico e reparo pode sobreviver, a atividade colateral de ribonuclease inespecífica leva vantajosamente à morte celular de possíveis sobreviventes.
[00276] A atividade colateral foi recentemente alavancada para uma plataforma de detecção de ácido nucleico altamente sensível e específica denominada SHERLOCK, útil para muitos diagnósticos clínicos (Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.Science 356, 438-442 (2017)).
[00277] De acordo com a invenção, os sistemas C2c1 manipulados são otimizados para a atividade de endonuclease de DNA ou RNA e podem ser expressos em células de mamíferos e direcionados para derrubar efetivamente moléculas repórteres ou transcritos nas células.
Sequências guia
[00278] Como usado aqui, o termo "sequência guia" e "molécula guia" no contexto de um sistema CRISPR-Cas, compreende qualquer sequência polinucleotídica com complementaridade suficiente com uma sequência de ácido nucleico alvo para hibridar com a sequência de ácido nucleico alvo e sequência direta- ligação específica de um complexo de direcionamento de ácido nucleico à sequência de ácido nucleico alvo.As sequências guia feitas usando os métodos aqui divulgados podem ser uma sequência guia completa, uma sequência guia truncada, uma sequência sgRNA completa, uma sequência sgRNA truncada ou uma E+F sequência de sgRNA.Em algumas modalidades, o grau de complementaridade da sequência guia para uma determinada sequência alvo, quando idealmente alinhado usando um algoritmo de alinhamento adequado, é aproximadamente ou mais do que aproximadamente 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%,
95%, 97.5%, 99%, ou mais.Em certas modalidades exemplares,
a molécula guia compreende uma sequência guia que pode ser projetada para ter pelo menos uma incompatibilidade com a sequência alvo, de modo que um RNA dúplex formado entre a sequência guia e a sequência alvo.Consequentemente, o grau de complementaridade é preferencialmente menor que 99%.Por exemplo, onde a sequência guia consiste em 24 nucleotídeos,
o grau de complementaridade é mais particularmente de cerca de 96% ou menos.Em modalidades particulares, a sequência guia é projetada para ter um trecho de dois ou mais nucleotídeos incompatíveis adjacentes, de modo que o grau de complementaridade sobre toda a sequência guia seja ainda mais reduzido.Por exemplo, onde a sequência guia consiste em 24 nucleotídeos, o grau de complementaridade é mais particularmente de cerca de 96% ou menos, mais particularmente, cerca de 92% ou menos, mais particularmente cerca de 88% ou menos, mais particularmente cerca de 84% ou menos, mais particularmente cerca de 80% ou menos, mais particularmente cerca de 76% ou menos, mais particularmente cerca de 72% ou menos, dependendo se o trecho de dois ou mais nucleotídeos incompatíveis abrange
2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos, etc.
Em algumas modalidades, além do trecho de um ou mais nucleotídeos incompatíveis, o grau de complementaridade, quando idealmente alinhado usando um algoritmo de alinhamento adequado, é de cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,
97,5%, 99% ou mais.
O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para o alinhamento de seqüências, dos quais um exemplo não limitativo inclui o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo
Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na Transformação
Burrows-Wheeler (por exemplo, o Burrows Wheeler Aligner),
ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft
Technologies; disponível em www.novocraft.com), ELAND
(Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net).A capacidade de uma sequência guia
(dentro de um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico)
de direcionar a ligação específica de sequência de um complexo de direcionamento de ácido nucleico a uma sequência de ácido nucleico alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado.Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR direcionado a ácidos nucleicos suficientes para formar um complexo direcionado a ácidos nucleicos,
incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira com a sequência de ácidos nucleicos alvo correspondente, como por transfecção com vetores que codificam os componentes do complexo de direcionamento de ácido nucleico, seguidos de uma avaliação do direcionamento preferencial (por exemplo, clivagem)
dentro da sequência de ácido nucleico alvo, tal como pelo ensaio Surveyor, como descrito aqui.Da mesma forma, a clivagem de uma sequência alvo de ácido nucleico (ou uma sequência na sua vizinhança) pode ser avaliada em um tubo de ensaio, fornecendo a sequência alvo de ácido nucleico,
componentes de um complexo alvo de ácido nucleico,
incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente da sequência guia de teste e comparando a ligação ou taxa de clivagem na ou nas proximidades da sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controle.Outros ensaios são possíveis e ocorrerão para os especialistas na técnica.Uma sequência guia e, portanto, um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico pode ser selecionada para direcionar qualquer sequência de ácido nucleico alvo.
[00279] Como utilizado neste documento, o termo
"sequência guia", "crRNA", "RNA guia" ou "RNA guia único"
ou "gRNA" refere-se a um polinucleotídeo compreendendo qualquer sequência de polinucleotídeo com complementaridade suficiente com uma sequência de ácido nucleico alvo para hibridar com a sequência de ácido nucleico alvo e para direcionar a ligação específica à sequência de um complexo de direcionamento de RNA compreendendo a sequência guia e uma proteína efetora CRISPR à sequência de ácido nucleico alvo.
Em algumas modalidades de exemplo, o grau de complementaridade, quando otimamente alinhado usando um algoritmo de alinhamento adequado, é de cerca de 50%, 60%,
75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99 %, ou mais.O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para o alinhamento de seqüências, dos quais um exemplo não limitativo inclui o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na
Transformação Burrows-Wheeler (por exemplo, o Burrows
Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign
(Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com),
ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net).A capacidade de uma sequência guia
(dentro de um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico)
de direcionar a ligação específica de sequência de um complexo de direcionamento de ácido nucleico a uma sequência de ácido nucleico alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado.Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR direcionado a ácidos nucleicos suficientes para formar um complexo direcionado a ácidos nucleicos,
incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira com a sequência de ácidos nucleicos alvo correspondente, como por transfecção com vetores que codificam os componentes do complexo de direcionamento de ácido nucleico, seguidos de uma avaliação do direcionamento preferencial (por exemplo, clivagem)
dentro da sequência de ácido nucleico alvo, tal como pelo ensaio Surveyor, como descrito aqui.Da mesma forma, a clivagem de uma sequência de ácido nucleico alvo pode ser avaliada em um tubo de ensaio, fornecendo a sequência de ácido nucleico alvo, componentes de um complexo de direcionamento de ácido nucleico, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente do guia de teste e comparando a ligação ou taxa de clivagem na sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controle.Outros ensaios são possíveis e ocorrerão para os especialistas na técnica.Uma sequência guia e, portanto, uma guia de direcionamento de ácido nucleico pode ser selecionada para direcionar qualquer sequência de ácido nucleico alvo.A sequência alvo pode ser
DNA.A sequência alvo pode ser qualquer sequência de RNA.Em algumas modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em RNA mensageiro (mRNA), pré-mRNA, RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA), micro-RNA (miRNA), RNA interferente pequeno (siRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA não codificante (ncRNA), RNA não codificante longo (lncRNA) e RNA citoplasmático pequeno (scRNA).Em algumas modalidades preferidas, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada a partir do grupo que consiste em mRNA, pré- mRNA e rRNA.Em algumas modalidades preferidas, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em ncRNA e lncRNA. Em algumas modalidades mais preferidas, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de mRNA ou uma molécula pré-mRNA.
[00280] Em certas modalidades, a sequência guia ou comprimento espaçador das moléculas guia é de 15 a 50 nt.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de pelo menos 15 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador é de 15 a 17 nt, por exemplo, 15, 16 ou 17 nt, de 17 a 20 nt, por exemplo, 17, 18, 19 ou 20 nt, de 20 a 24 nt, por exemplo, 20, 21, 22, 23 ou 24 nt, de
23 a 25 nt, por exemplo, 23, 24 ou 25 nt, de 24 a 27 nt, por exemplo, 24, 25, 26 ou 27 nt, de 27 a 30 nt, por exemplo, 27, 28, 29 ou 30 nt, de 30 a 35 nt, por exemplo, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 nt, ou 35 nt ou mais.Exemplos adicionais da pureza estereoisomérica incluem um excesso enantiomérico de pelo menos 15, 16, 1718, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 nt.
[00281] Em algumas modalidades, a sequência da molécula guia (repetição direta e/ou espaçador) é selecionado para reduzir o grau de estrutura secundária na molécula guia.Em algumas modalidades, aproximadamente ou menos que aproximadamente 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, ou menos dos nucleotídeos do RNA guia de direcionamento de ácidos nucleicos participam do emparelhamento de bases auto-complementares quando dobrados de maneira ideal.A dobragem ideal pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleotídeo adequado.Alguns programas são baseados no cálculo da energia livre mínima de Gibbs.Um exemplo de um desses algoritmos é o mFold, como descrito por Zuker e Stiegler
(Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148).Outro exemplo de algoritmo de dobragem é o servidor on-line RNAfold, desenvolvido no Instituto de Química Teórica da Universidade de Viena, usando o algoritmo de previsão da estrutura do centróide (veja, por exemplo, ARGruber et al., 2008, Cell 106 (1): 23-24; e PACarr e GMChurch, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62).
[00282] Em algumas modalidades, é de interesse reduzir a suscetibilidade da molécula guia à clivagem de RNA, como a clivagem por Cas13.Por conseguinte, em modalidades particulares, a molécula guia é ajustada para evitar a clivagem por Cas13 ou outras enzimas de clivagem de RNA.
[00283] Em certas modalidades, a molécula guia compreende ácidos nucleicos de ocorrência não natural e/ou nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou análogos de nucleotídeos, e/ou modificações quimicamente.De preferência, estes ácidos nucleicos de ocorrência não natural e nucleótidos de ocorrência não natural estão localizados fora da sequência guia.Os ácidos nucleicos de ocorrência não natural podem incluir, por exemplo, misturas de nucleotídeos de ocorrência natural e não natural.Os nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou análogos de nucleotídeo podem ser modificados na fração ribose, fosfato e/ou base. Numa modalidade da invenção, um ácido nucleico guia compreende ribonucleotídeos e não ribonucleotídeos.Em uma dessas modalidades, um guia compreende um ou mais ribonucleotídeos e um ou mais desoxirribonucleotídeos.Em uma modalidade da invenção, o guia compreende um ou mais nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente, como um nucleotídeo com ligação fosforotioato, um nucleotídeo de ácido nucleico bloqueado
(LNA) compreendendo uma ponte de metileno entre os carbonos
2 ′ e 4 ′ de o anel da ribose ou ácidos nucleicos em ponte
(BNA).Outros exemplos de nucleotídeos modificados incluem análogos 2'-O-metil, análogos 2'-desoxi ou análogos 2'-
fluoro.Outros exemplos de bases modificadas incluem, mas não estão limitados a, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina,
pseudouridina, inosina, 7-metilguanosina.Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação,
incorporação de 2′-O-metil (M), 2′-O-metil 3′fosforotioato
(MS), etil com restrição de S (cEt) ou 2′-O- metil
3′tioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais.Tais guias quimicamente modificados podem compreender maior estabilidade e maior atividade em comparação com guias não modificados, embora a especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível.(Ver Hendel, 2015, Nat
Biotechnol.33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, publicado online em 29 de junho de 2015; Ragdarm et al., 0215, PNAS,
E7110-E7111; Allerson et al., J.
Med.
Chem.2005, 48:901-
904; Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat.
Biotechnol.(2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066DOI:10.1038/s41551- 017-0066). Em algumas modalidades, o 5 ' e/ouA extremidade 3 'de um RNA guia é modificada por uma variedade de porções funcionais, incluindo corantes fluorescentes, polietileno glicol, colesterol, proteínas ou tags de detecção.(Ver Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74-83).Em certas modalidades, um guia compreende ribonucleotídeos em uma região que se liga a um RNA alvo e um ou mais desoxirribonucletídeos e/ou análogos de nucleotídeos em uma região que se liga a Cas13.Em uma modalidade da invenção, desoxirribonucleotídeos e/ou os análogos de nucleotídeos são incorporados em estruturas-guia manipuladas, como, sem limitação, regiões tronco-alça e região semente.Para a guia Cas13, em certas modalidades, a modificação não está na alça 5'das regiões de haste-loop.A modificação química na alça 5 'da região de haste-loop de um guia pode abolir sua função (ver Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066).Em certas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos de um guia são quimicamente modificados.Em algumas modalidades, 3-5 nucleotídeos na extremidade 3 'ou 5' de uma guia são quimicamente modificados.Em algumas modalidades, apenas pequenas modificações são introduzidas na região de semente, como modificações 2'-F.Em algumas modalidades, a modificação 2'-F é introduzida na extremidade 3 'de um guia.Em certas modalidades, três a cinco nucleotídeos no 5 ' e/ou a extremidade 3 'do guia é modificada quimicamente com 2'-O-metil (M), 2'-O-metil 3' fosforotioato (MS), etil com restrição de S (cEt) ou 2'-O- metil 3 'tioPACE (MSP).Essa modificação pode aumentar a eficiência da edição do genoma (ver, Hendel et al., Nat.
Biotechnol.(2015) 33(9): 985-989).Em certas modalidades, todas as ligações fosfodiéster de um guia são substituídas por fosforotioatos (PS) para aumentar os níveis de interrupção de genes.Em certas modalidades, mais de cinco nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 3' do guia são quimicamente modificados com 2'-O-Me, 2'-F ou etil com restrição de S(cEt). Esse guia quimicamente modificado pode mediar níveis aumentados de ruptura de genes (ver Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111). Em uma modalidade da invenção, um guia é modificado para compreender uma fração química em seus 3 ' e/ou5 'final.Tais frações incluem, mas não estão limitadas a amina, azida, alcino, tio, dibenzociclooctino (DBCO) ou rodamina. Em certa modalidade, a fração química é conjugada ao guia por um ligante, como uma cadeia alquil.Em certas modalidades, a fração química do guia modificado pode ser usada para anexar o guia a outra molécula, como DNA, RNA, proteína ou nanopartículas.Esse guia quimicamente modificado pode ser usado para identificar ou enriquecer células editadas genericamente por um sistema CRISPR (ver Lee et al., ELife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554).
[00284] Em algumas modalidades, um guia de direcionamento de ácido nucleico é selecionado para reduzir o grau de estrutura secundária dentro do guia de direcionamento de ácido nucleico.Em algumas modalidades, aproximadamente ou menos de cerca de 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% ou menos dos nucleotídeos do guia de direcionamento de ácidos nucleicos participam do emparelhamento de bases auto-complementares quando idealmente dobrados.A dobragem ideal pode ser determinada por qualquer algoritmo de dobragem de polinucleotídeo adequado.Alguns programas são baseados no cálculo da energia livre mínima de Gibbs.Um exemplo de um desses algoritmos é o mFold, como descrito por Zuker e Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148).Outro exemplo de algoritmo de dobragem é o servidor on-line RNAfold, desenvolvido no Instituto de Química Teórica da Universidade de Viena, usando o algoritmo de previsão da estrutura do centróide (veja, por exemplo, ARGruber et al.,
2008, Cell 106 (1): 23-24; e PACarr e GMChurch, 2009, Nature Biotechnology 27 (12): 1151-62).
[00285] Em certas modalidades, um RNA guia ou crRNA pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma sequência de repetição direta (DR) e uma sequência guia ou sequência espaçadora.Em certas modalidades, o RNA guia ou o crRNA pode compreender, consistir essencialmente em, ou consistir em uma sequência de repetição direta fundida ou ligada a uma sequência guia ou sequência espaçadora.Em certas modalidades, a sequência de repetição direta pode estar localizada a montante (isto é, 5 ') da sequência guia ou sequência espaçadora.Em outras modalidades, a sequência de repetição direta pode estar localizada a jusante (isto é, 3') da sequência guia ou sequência espaçadora.
[00286] Em certas modalidades, o crRNA compreende um loop de haste, preferencialmente um loop de haste único.Em certas modalidades, a sequência de repetição direta forma uma alça de haste, preferencialmente uma alça de haste única.
[00287] Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 15 a 35 nt.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de pelo menos 15 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador é de 15 a 17 nt, por exemplo, 15,
16 ou 17 nt, de 17 a 20 nt, por exemplo, 17, 18, 19 ou 20 nt, de 20 a 24 nt, por exemplo, 20, 21, 22, 23 ou 24 nt, de 23 a 25 nt, por exemplo, 23, 24 ou 25 nt, de 24 a 27 nt, por exemplo, 24, 25, 26 ou 27 nt, de 27 a 30 nt, por exemplo, 27, 28, 29 ou 30 nt, de 30 a 35 nt, por exemplo, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35 nt, ou 35 nt ou mais.
[00288] Em geral, o sistema CRISPR-Cas, CRISPR-Cas9 or CRISPR systempode ser usado nos documentos anteriores, como WO2014/093622 (PCT/US2013/074667) e refere-se coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão ou direcionamento da atividade de genes associados ao CRISPR ("Cas"), incluindo sequências que codificam um gene Cas, em particular um gene Cas9 no caso de CRISPR-Cas9, uma sequência tracr (CRISPR de ativação trans) (or exemplo, tracrRNA ou um tracrRNA parcial ativo), uma sequência tracr-mate (que inclui uma "repetição direta" e um repetição direta parcial processada por tracrRNA no contexto de um sistema CRISPR endógeno), uma sequência guia (também referida como "espaçador" no contexto de um sistema CRISPR endógeno) ou "RNA(s)", como esse termo é usado aqui (por exemplo, RNA (s) para guiar Cas9, por exemplo RNACRISPR e RNA de transativação (tracr) ou um único RNA guia (sgRNA) (RNA quimérico)) ou outras sequências e transcritos de um locus CRISPR. Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo (também chamado de protospacer no contexto de um sistema CRISPR endógeno).No contexto da formação de um complexo de CRISPR,
"sequência alvo" refere-se a uma sequência na qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, onde a hibridação entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo de CRISPR.A seção da sequência guia através da qual a complementaridade com a sequência alvo é importante para a atividade de clivagem é aqui referida como a sequência de sementes.Uma sequência alvo pode compreender qualquer polinucleotídeo, como polinucleotídeos de DNA ou RNA.Em algumas modalidades, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula e pode incluir ácidos nucleicos em ou de mitocondrial, organelas, vesículas, lipossomas ou partículas presentes dentro da célula.Em algumas modalidades, especialmente para usos não nucleares, os NLSs não são preferidos.Em algumas modalidades, um sistema
CRISPR compreende um ou mais sinais de exportação nuclear
(NESs).Em algumas modalidades, um sistema CRISPR compreende um ou mais NLSs e um ou mais NESs.Em algumas modalidades,
repetições diretas podem ser identificadas in silico,
procurando motivos repetitivos que atendam a um ou todos os seguintes critérios: 1. encontrados em uma janela de 2Kb de sequência genômica que flanqueia o locus CRISPR tipo II; 2.
alcance de 20 a 50 pb; e 3. espaçados por 20 a 50 pb.Em algumas modalidades, 2 desses critérios podem ser utilizados, por exemplo 1 e 2, 2 e 3 ou 1 e 3.Em algumas modalidades, todos os 3 critérios podem ser usados.
[00289] Nas modalidades da invenção, os termos sequência guia e RNA guia, ou seja, RNA capaz de guiar Cas a um locus genômico alvo, são usados de forma intercambiável como nos documentos citados acima, como WO2014/093622 (PCT/US2013/074667).Em geral, uma sequência guia é qualquer sequência polinucleotídica tendo complementaridade suficiente com uma sequência polinucleotídica alvo para hibridar com a sequência alvo e direcionar a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR à sequência alvo.Em algumas modalidades, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente, quando idealmente alinhado usando um algoritmo de alinhamento adequado, é de cerca de 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%,95%, 97,5%, 99% ou mais.O alinhamento ideal pode ser determinado com o uso de qualquer algoritmo adequado para o alinhamento de sequências, dos quais um exemplo não limitativo inclui o algoritmo Smith-Waterman, o algoritmo Needleman-Wunsch, algoritmos baseados na Transformação Burrows-Wheeler (por exemplo, o Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies; disponível em www.novocraft.com),
ELAND (Illumina, San Diego, CA), SOAP (disponível em soap.genomics.org.cn) e Maq (disponível em maq.sourceforge.net). Em algumas modalidades, uma sequência guia é de cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 35, 40, 45,
50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento.Em algumas modalidades, uma sequência guia é menor que cerca de 75,
50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento.Preferencialmente, a sequência guia tem 1030 nucleótidos.A capacidade de uma sequência guia para direcionar a ligação específica da sequência de um complexo
CRISPRa uma sequência alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado.Por exemplo, os componentes de um sistema
CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR,
incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira com a sequência alvo correspondente, como por transfecção com vetores que codificam os componentes da sequência CRISPR, seguido de uma avaliação da clivagem preferencial dentro da sequência alvo, como no ensaio Surveyor, conforme descrito aqui.Da mesma forma, a clivagem de uma sequência polinucleotídica alvo pode ser avaliada em um tubo de ensaio, fornecendo a sequência alvo, componentes de um complexo CRISPR,
incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente do guia de teste e comparando a ligação ou taxa de clivagem na sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controle.Outros ensaios são possíveis e ocorrerão para os especialistas na técnica.
[00290] Em algumas modalidades de sistemas CRISPR- Cas, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente pode ser sobre ou mais do que sobre 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, ou 100%; um guia ou RNA ou sgRNA pode ter cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento; ou guia ou RNA ou sgRNA pode ser menor que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento; e vantajosamente o RNA tracr tem 30 ou 50 nucleotídeos de comprimento.No entanto, um aspecto da invenção é reduzir interações fora do alvo, por exemplo, reduzir o guia que interage com uma sequência alvo com baixa complementaridade.De fato, nos exemplos, é mostrado que a invenção envolve mutações que resultam no sistema CRISPR-Cas sendo capaz de distinguir entre sequências alvo e fora do alvo que possuem mais de 80% a cerca de 95% de complementaridade, por exemplo, 83%-84% ou 88-89% ou 94-95% de complementaridade (por exemplo, distinguindo entre um alvo com 18 nucleotídeos e um alvo fora de 18 nucleotídeos com 1, 2 ou 3 desencontros).Por conseguinte, no contexto da presente invenção, o grau de complementaridade entre uma sequência guia e sua sequência alvo correspondente é maior que 94,5% ou 95% ou 95,5% ou 96% ou 96,5% ou 97% ou 97,5% ou 98% ou 98,5 % ou 99% ou 99,5% ou 99.9%, ou 100%. O objetivo fora do alcance é inferior a 100% ou 99,9% ou 99,5% ou 99% ou 99% ou 98,5% ou 98% ou 97,5% ou 97% ou 96,5% ou 96% ou 95,5% ou 95% ou 94,5% ou 94% ou 93% ou 92% ou 91% ou 90% ou 89% ou 88% ou 87% ou 86% ou 85% ou 84% ou 83% ou 82% ou 81% ou 80% de complementaridade entre a sequência e o guia, com é vantajoso que o fora de alvo seja de complementaridade de 100% ou 99,9% ou 99,5% ou 99% ou 99% ou 98,5% ou 98% ou 97,5% ou 97% ou 96,5% ou 95,5% ou 95% ou 94,5% entre o sequência e o guia.
Modificações guia
[00291] Em certas modalidades, os guias da invenção compreendem ácidos nucleicos de ocorrência não natural e/ou nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou análogos de nucleotídeos e/ou modificações químicas.Os ácidos nucleicos de ocorrência não natural podem incluir, por exemplo, misturas de nucleotídeos de ocorrência natural e não natural.Os nucleotídeos de ocorrência não natural e/ou análogos de nucleotídeo podem ser modificados na fração ribose, fosfato e/ou base. Numa modalidade da invenção, um ácido nucleico guia compreende ribonucleotídeos e não ribonucleotídeos.Em uma dessas modalidades, um guia compreende um ou mais ribonucleotídeos e um ou mais desoxirribonucleotídeos.Em uma modalidade da invenção, o guia compreende um ou mais nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente, como um nucleotídeo com ligação fosforotioato, ligação boranofosfato, um nucleotídeo de ácido nucleico bloqueado
(LNA) compreendendo uma ponte de metileno entre os carbonos
2 ′ e 4 ′ de o anel da ribose ou ácidos nucleicos em ponte
(BNA). Outros exemplos de nucleotídeos modificados incluem análogos 2'-O-metil, análogos 2'-desoxi, análogos 2-
tiouridina, análogos N6-metiladenosina ou análogos 2'-
fluoro.Outros exemplos de bases modificadas incluem, entre outros, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina (Ψ),
N1-metilpseudouridina (me1Ψ), 5-metoxiuridina (5moU),
inosina, 7-metilguanosina.
Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação, incorporação de 2'-O-metil (M), 2'-O-metil-3'-fosforotioato (MS),
fosforotioato (PS), etil com constrição de S(cEt), ou 2’-O-
metil-3’-tioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais.
Tais guias quimicamente modificados podem compreender maior estabilidade e maior atividade em comparação com guias não modificados, embora a especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível.(Ver Hendel, 2015, Nat Biotechnol.33(9):985-9,
doi: 10.1038/nbt.3290, publicado online em 29 de junho de 2015; Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111; Allerson et al., J. Med. Chem.2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front.
Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870- 11875; Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471; Hendel et al., Nat. Biotechnol.(2015) 33(9): 985-989; Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066DOI:10.1038/s41551-017-0066). Em algumas modalidades, o 5 ' e/ouA extremidade 3 'de um RNA guia é modificada por uma variedade de porções funcionais, incluindo corantes fluorescentes, polietileno glicol, colesterol, proteínas ou tags de detecção.(Ver Kelly et al., 2016, J. Biotech.
233:74-83).Em certas modalidades, um guia compreende ribonucleotídeos em uma região que se liga a um DNA alvo e um ou mais desoxirribonucletídeos e/ou análogos de nucleotídeos em uma região que se liga a Cas9, Cpf1 ou C2c1. Em uma modalidade da invenção, desoxirribonucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos são incorporados em estruturas guia engenheiradas, como, sem limitação, regiões 5' e/ou 3', regiões de alça de haste e região de semente.Em certas modalidades, a modificação não está na alça 5' das regiões de haste-alça.A modificação química na alça 5 'da região de haste-loop de um guia pode abolir sua função (ver Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066).Em certas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos de um guia são quimicamente modificados.Em algumas modalidades, 3-5 nucleotídeos na extremidade 3 'ou 5' de uma guia são quimicamente modificados.Em algumas modalidades, apenas pequenas modificações são introduzidas na região de semente, como modificações 2'-F.Em algumas modalidades, a modificação 2'-F é introduzida na extremidade 3 'de um guia.Em certas modalidades, três a cinco nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 3' do guia é modificada quimicamente com 2'-O-metil (M), 2'-O-metil 3' fosforotioato (MS), etil com restrição de S (cEt) ou 2'-O-metil-3'tioPACE (MSP).
Essa modificação pode aumentar a eficiência da edição do genoma (ver, Hendel et al., Nat. Biotechnol.(2015) 33(9): 985-989).Em certas modalidades, todas as ligações fosfodiéster de um guia são substituídas por fosforotioatos (PS) para aumentar os níveis de interrupção de genes.Em certas modalidades, mais de cinco nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 3' do guia são quimicamente modificados com 2'-O-Me, 2'-F ou etil com restrição de S(cEt). Esse guia quimicamente modificado pode mediar níveis aumentados de ruptura de genes (ver Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110- E7111).Em uma modalidade da invenção, um guia é modificado para compreender uma fração química em seus 3 ' e/ou5
'final.Tais porções incluem, mas não estão limitadas a amina, azida, alcino, tio, dibenzociclooctino (DBCO) ou rodamina.Em certa modalidade, a fração química é conjugada ao guia por um ligante, como uma cadeia alquil.Em certas modalidades, a fração química do guia modificado pode ser usada para anexar o guia a outra molécula, como DNA, RNA, proteína ou nanopartículas.Esse guia quimicamente modificado pode ser usado para identificar ou enriquecer células editadas genericamente por um sistema CRISPR (ver Lee et al., ELife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554).
[00292] Em certas modalidades, o sistema CRISPR conforme aqui fornecido pode fazer uso de um crRNA ou polinucleotídeo análogo compreendendo uma sequência guia, em que o polinucleotídeo é um RNA, um DNA ou uma mistura de RNA e DNA, e/ou em que o polinucleotídeo compreende um ou mais análogos de nucleotídeos.A sequência pode compreender qualquer estrutura, incluindo, mas não se limitando a, a estrutura de um crRNA nativo, como uma protuberância, um hairpin ou uma estrutura de loop de haste.Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreendendo a sequência guia forma um duplex com uma segunda sequência polinucleotídica que pode ser uma sequência de RNA ou DNA.
[00293] Em certas modalidades, é feito uso de RNAs guia quimicamente modificados.Exemplos de modificações químicas de RNA guia incluem, sem limitação, incorporação de 2′-O-metil (M), 2′-O-metil 3′fosforotioato (MS) ou 2′-O- metil 3′tioPACE (MSP) em um ou mais nucleotídeos terminais.Tais RNAs guias quimicamente modificados podem compreender maior estabilidade e maior atividade em comparação com RNAs guias não modificados, embora a especificidade no alvo versus fora do alvo não seja previsível.(Ver Hendel, 2015, Nat Biotechnol.33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, publicado on-line em 29 de junho de 2015).Os RNAs guia quimicamente modificados incluem ainda, sem limitação, RNAs com ligações fosforotioato e nucleotídeos de ácido nucleico bloqueado (LNA) compreendendo uma ponte de metileno entre os carbonos 2 'e 4' do anel ribose.
[00294] Em algumas modalidades, uma sequência guia é de cerca de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ou mais nucleotídeos de comprimento.Em algumas modalidades, uma sequência guia é menor que cerca de 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 ou menos nucleotídeos de comprimento.Preferencialmente, a sequência guia tem 10 a 30 nucleotídeos.A capacidade de uma sequência guia para direcionar a ligação específica da sequência de um complexo CRISPR a uma sequência alvo pode ser avaliada por qualquer ensaio adequado.Por exemplo, os componentes de um sistema CRISPR suficientes para formar um complexo CRISPR,
incluindo a sequência guia a ser testada, podem ser fornecidos a uma célula hospedeira com a sequência alvo correspondente, como por transfecção com vetores que codificam os componentes da sequência CRISPR, seguido de uma avaliação da clivagem preferencial dentro da sequência alvo, como no ensaio Surveyor.Da mesma forma, a clivagem de um RNA alvo pode ser avaliada em um tubo de ensaio, fornecendo a sequência alvo, componentes de um complexo CRISPR, incluindo a sequência guia a ser testada e uma sequência guia de controle diferente do guia de teste e comparando a ligação ou taxa de clivagem na sequência alvo entre as reações da sequência guia de teste e controle.Outros ensaios são possíveis e ocorrerão para os especialistas na técnica.
[00295] Em algumas modalidades, a modificação do guia é uma modificação química, uma inserção, uma exclusão ou uma divisão.Em algumas modalidades, a modificação química inclui, mas não está limitada a, incorporação de análogos 2'-O-metil (M), análogos 2'-desoxi, análogos 2- tiouridina, análogos N6-metiladenosina, análogos 2'-fluoro, 2-aminopurina, 5-bromo-uridina, pseudouridina (Ψ), N1- metilpseudouridina (me1Ψ), 5-metoxiuridina (5moU), inosina, 7-metilguanosina, 2'-O-metil-3'-fosforotioato (MS), Etil com restrição de S (cEt), fosforotioato (PS) ou 2'-O-metil- 3'-tioPACE (MSP).Em algumas modalidades, o guia compreende uma ou mais modificações de fosforotioato.Em certas modalidades, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 25 nucleotídeos do guia é quimicamente modificado. Em certas modalidades, um ou mais nucleotídeos na região de semente são quimicamente modificados. Em certas modalidades, um ou mais nucleotídeos no terminal 3' são quimicamente modificados. Em certas modalidades, nenhum dos nucleotídeos na alça 5' é quimicamente modificado. Em algumas modalidades, a modificação química na região de semente é uma modificação menor, como a incorporação de um análogo de 2'-fluoro.Numa modalidade específica, um nucleotídeo da região de semente é substituído por um análogo 2'-fluoro. Em algumas modalidades, 5 ou 10 nucleotídeos no terminal 3' são quimicamente modificados. Tais modificações químicas no terminal 3 'do Cpf1CrRNA melhoram a eficiência do corte de genes (ver Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066).Numa modalidade específica, 5 nucleotídeos no terminal 3 'são substituídos por análogos 2'-fluoro.Numa modalidade específica, 10 nucleotídeos no terminal 3' são substituídos por análogos 2'-fluoro.Numa modalidade específica, 5 nucleotídeos no terminal 3' são substituídos por análogos 2'-O-metil (M).
[00296] Em algumas modalidades, o laço da alça 5 'da guia é modificado.Em algumas modalidades, a alça da alça 5'
da guia é modificado para ter uma exclusão, uma inserção, uma divisão ou modificações químicas.Em certas modalidades, o loop compreende 3, 4 ou 5 nucleotídeos.Em certas modalidades, o loop compreende a sequência de UCUU, UUUU, UAUU ou UGUU.
[00297] Uma sequência guia e, portanto, um RNA guia de direcionamento de ácido nucleico pode ser selecionada para direcionar qualquer sequência de ácido nucleico alvo.No contexto da formação de um complexo de CRISPR, "sequência alvo" refere-se a uma sequência na qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade, onde a hibridação entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo de CRISPR.Uma sequência alvo pode compreender polinucleotídeos de RNA.O termo "RNA alvo" refere-se a um polinucleotídeo de RNA que é ou compreende a sequência alvo.Em outras palavras, o RNA alvo pode ser um polinucleotídeo de RNA ou uma parte de um polinucleotídeo de RNA ao qual uma parte do gRNA, isto é, a sequência guia, é projetada para ter complementaridade e à qual a função efetiva mediada pelo complexo compreendendo o efetor CRISPR proteína e um gRNA deve ser direcionado.Em algumas modalidades, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula.A sequência alvo pode ser DNA.A sequência alvo pode ser qualquer sequência de RNA.Em algumas modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em RNA mensageiro (mRNA), pré-mRNA, RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA), micro-RNA (miRNA), RNA interferente pequeno (siRNA), RNA nuclear pequeno (snRNA), RNA nucleolar pequeno (snoRNA), RNA de fita dupla (dsRNA), RNA não codificante (ncRNA), RNA não codificante longo (lncRNA) e RNA citoplasmático pequeno (scRNA). Em algumas modalidades preferidas, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada a partir do grupo que consiste em mRNA, pré- mRNA e rRNA.Em algumas modalidades preferidas, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de RNA selecionada do grupo que consiste em ncRNA e lncRNA. Em algumas modalidades mais preferidas, a sequência alvo pode ser uma sequência dentro de uma molécula de mRNA ou uma molécula pré-mRNA.
[00298] Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é inferior a 28 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de pelo menos 18 nucleotídeos e menos de 28 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento espaçador do RNA guia está entre 19 e 28 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia está entre 19 e 25 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 20 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 23 nucleotídeos.Em certas modalidades, o comprimento do espaçador do RNA guia é de 25 nucleotídeos.
[00299] Em certas modalidades, modulações da eficiência da clivagem podem ser exploradas pela introdução de incompatibilidades, por exemplo, 1 ou mais incompatibilidades, como 1 ou 2 incompatibilidades entre a sequência espaçadora e a sequência alvo, incluindo a posição da incompatibilidade ao longo do espaçador/alvo.Quanto mais central (ou seja, não 3 'ou 5'), por exemplo, uma incompatibilidade dupla, maior a eficiência da clivagem é afetada. Por conseguinte, escolhendo a posição de incompatibilidade ao longo do espaçador, a eficiência da clivagem pode ser modulada. Por exemplo, se menos de 100 % a clivagem de alvos é desejada (por exemplo, em uma população de células), 1 ou mais, como de preferência 2 desencontros entre espaçador e sequência alvo, podem ser introduzidos nas sequências espaçadoras.
Quanto mais central ao longo do espaçador da posição de incompatibilidade, menor a porcentagem de clivagem.
[00300] Em certas modalidades exemplares, a eficiência da clivagem pode ser explorada para projetar guias únicos que podem distinguir dois ou mais alvos que variam por um único nucleotídeo, como um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), variação ou mutação (pontual). O efetor CRISPR pode ter sensibilidade reduzida a SNPs (ou outras variações de nucleotídeo único) e continuar a clivar alvos de SNP com um certo nível de eficiência.
Assim, para dois alvos, ou um conjunto de alvos, um RNA guia pode ser projetado com uma sequência de nucleotídeos que é complementar a um dos alvos, ou seja, o SNP no alvo.
ORNA guia é ainda projetado para ter uma incompatibilidade sintética.
Como usado aqui, uma "incompatibilidade sintética" refere-se a uma incompatibilidade não natural que é introduzida a montante ou a jusante do SNP de ocorrência natural, como no máximo 5 nucleotídeos a montante ou a jusante, por exemplo, 4, 3, 2 ou 1 nucleotídeo a montante ou a jusante, preferencialmente no máximo 3 nucleotídeos a montante ou a jusante, mais preferencialmente no máximo 2 nucleotídeos a montante ou a jusante, mais preferencialmente 1 nucleotídeo a montante ou a jusante (isto é, adjacente ao SNP). Quando o efetor
CRISPR se liga ao SNP no alvo, apenas uma única incompatibilidade será formada com a incompatibilidade sintética e o efetor CRISPR continuará a ser ativado e um sinal detectável será produzido.
Quando o RNA guia hibrida com um SNP fora do alvo, duas incompatibilidades são formadas, a incompatibilidade do SNP e a sintética e nenhum sinal detectável gerado.
Assim, os sistemas aqui divulgados podem ser projetados para distinguir SNPs dentro de uma população. Por exemplo, os sistemas podem ser usados para distinguir cepas patogênicas que diferem por um único SNP ou detectam certos SNPs específicos da doença, tais como, mas não limitados a, SNPs associados a doenças, como, sem limitação, SNPs associados a câncer.
[00301] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5 '). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5').
Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5'). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado nas posições 3, 4, 5, ou 6 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5'). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que o SNP esteja localizado na posição 3 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5').
[00302] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade (por exemplo, a incompatibilidade sintética, ou seja, uma mutação adicional além de um SNP) esteja localizada nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5'). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5'). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada nas posições 4, 5, 6, ou 7 da sequência espaçadora (começando na extremidade 5'). Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada nas posições 3, 4, 5 ou 6 do espaçador, preferencialmente na posição 3. Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada na posição 5 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5').
[00303] Em certas modalidades, a referida incompatibilidade é de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos a montante ou a jusante, preferencialmente 2 nucleotídeos, preferencialmente a jusante do referido SNP ou outra variação de nucleotídeo único no referido RNA guia.
[00304] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada
2 nucleotídeos a montante do SNP (isto é, um nucleotídeo interveniente).
[00305] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada 2 nucleotídeos a jusante do SNP (isto é, um nucleotídeo interveniente).
[00306] Em certas modalidades, o RNA guia é projetado de modo que a incompatibilidade esteja localizada na posição 5 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5') e o SNP está localizado na posição 3 da sequência espaçadora (iniciando na extremidade 5') .
[00307] Em certas modalidades, o RNA guia compreende um espaçador que é truncado em relação a um espaçador do tipo selvagem. Em certas modalidades, o RNA guia compreende um espaçador que compreende menos de 28 nucleotídeos, de preferência entre e incluindo 20 a 27 nucleotídeos.
[00308] Em certas modalidades, o RNA guia compreende um espaçador que consiste em 20-25 nucleotídeos ou 20-23 nucleotídeos, como de preferência 20 ou 23 nucleotídeos.
[00309] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo em um RNA ou DNA alvo ou em uma variante de emenda de um transcrito de RNA.
[00310] Em certas modalidades, o um ou mais RNAs guia podem ser projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo que são diagnósticas para um estado de doença. Em uma modalidade, a doença é o câncer. Em algumas modalidade, o distúrbio imune é uma doença autoimune. Em algumas modalidades, o estado da doença pode ser uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção pode ser causada por um vírus, uma bactéria, um fungo, um protozoário ou um parasita. Em modalidades específicas, a infecção é uma infecção viral.Em algumas modalidades, a infecção viral é causada por um vírus de DNA.
[00311] As modalidades descritas neste documento compreendem a indução de uma ou mais modificações nucleotídicas em uma célula eucariótica (in vitro, isto é, em uma célula eucariótica isolada) como aqui discutido compreendendo a entrega à célula de um vetor como aqui discutido. A mutação (s) pode incluir a introdução, exclusão ou substituição de um ou mais nucleotídeos em cada sequência alvo de célula (s) através do (s) RNA (s) guia (s). As mutações podem incluir a introdução, exclusão ou substituição de 1-75 nucleotídeos em cada sequência alvo da(s) referida(s) célula(s) através do(s) RNA(s) guia(s).
As mutações podem incluir a introdução, exclusão ou substituição de 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da(s) referida(s) célula(s) através do(s) RNA(s) guia(s). As mutações podem incluir a introdução, exclusão ou substituição de 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da(s) referida(s) célula(s) através do(s) RNA(s) guia(s). As mutações incluem a introdução, exclusão ou substituição de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da(s) referida(s) célula(s) através do(s) RNA(s) guia(s). As mutações podem incluir a introdução, exclusão ou substituição de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, ou 75 nucleotídeos em cada sequência alvo da(s) referida(s) célula(s) através do(s) RNA(s) guia(s). As mutações podem incluir a introdução, exclusão ou substituição de 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos em cada sequência alvo da(s) referida(s) célula(s) através do(s) RNA(s) guia(s).
[00312] Normalmente, no contexto de um sistema CRISPR endógeno, a formação de um complexo CRISPR (compreendendo uma sequência guia hibridada com uma sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta em clivagem em ou próximo (por exemplo, dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 ou mais pares de bases da) sequência alvo, mas podem depender, por exemplo, de estrutura secundária, em particular no caso de alvos de
RNA.
[00313] Os ortólogos de exemplo são fornecidos na Tabela 8 abaixo.
Tabela 8 Hospedeiro Alicyclobacillus macrosporangiidus, estirpe DSM17980 (SEQIDNO:301) Bacillus hisashii estirpe C4 (SEQIDNO:302) Bactéria RIFCSPLOWO2 de Candidatus Lindowbacteria (SEQIDNO:303) Bactéria Elusimicrobia RIFOXYA12 (SEQIDNO:304) Omnitrophica WOR_2 bactéria RIFCSPHIGHO2 (SEQIDNO:305) Bactéria Phycisphaerae ST-NAGAB-D1 (SEQIDNO:306) Bactéria de Planctomycetes RBG_13_46_10 (IDSEQNO:307) Bactéria Spirochaetes GWB1_27_13 (IDSEQNO:308) Bactéria Verrucomicrobiaceae UBA2429 (SEQIDNO:309) Construções de detecção
[00314] Como usado aqui, um "construto de detecção" refere-se a uma molécula que pode ser clivada ou desativada por uma proteína efetora do sistema CRISPR ativada aqui descrita. O termo "construto de detecção" também pode ser referido na alternativa como "construto de mascaramento".
Dependendo da atividade de nuclease da proteína efetora CRISPR, o construto de mascaramento pode ser um construto de mascaramento baseado em RNA ou um construto de mascaramento baseado em DNA. As construções de mascaramento baseadas em ácido nucleico compreendem um elemento de ácido nucleico que é clivável por uma proteína efetora CRISPR. A clivagem do elemento de ácido nucleico libera agentes ou produz alterações conformacionais que permitem a produção de um sinal detectável.
Exemplos de construções que demonstram como o elemento de ácido nucleico pode ser usado para impedir ou mascarar a geração de sinal detectável são descritos abaixo e as modalidades da invenção compreendem variantes do mesmo.
Antes da clivagem, ou quando o construto de mascaramento está em um estado 'ativo', o construto de mascaramento bloqueia a geração ou a detecção de um sinal detectável positivo.
Será entendido que, em certas modalidades de exemplo, um sinal de fundo mínimo pode ser produzido na presença de um construto de mascaramento ativo.
Um sinal detectável positivo pode ser qualquer sinal que possa ser detectado usando métodos de detecção ópticos, fluorescentes, quimioluminescentes,
eletroquímicos ou outros métodos de detecção conhecidos na técnica.
O termo "sinal detectável positivo" é usado para diferenciar de outros sinais detectáveis que podem ser detectáveis na presença do construto de mascaramento.
Por exemplo, em certas modalidades, um primeiro sinal pode ser detectado quando o agente de mascaramento está presente (ou seja, um sinal detectável negativo), que então se converte em um segundo sinal (por exemplo, o sinal detectável positivo) após a detecção das moléculas alvo e clivagem ou desativação do agente de mascaramento pela proteína efetora
CRISPR ativada.
[00315] Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento pode compreender uma sequência do iniciador de HCR e um motivo de corte, ou um elemento estrutural clivável, como um laço ou hairpin, que impede o iniciador de iniciar a reação do HCR. O motivo de corte pode ser cortado preferencialmente por uma das proteínas efetoras CRISPR ativadas.Após a clivagem do motivo de corte ou elemento de estrutura por uma proteína efetora CRISPR ativada, o iniciador é então liberado para desencadear a reação de HCR, sua detecção indicando a presença de um ou mais alvos na amostra.Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento compreende um hairpin com um laço de RNA. Quando uma proteína efetora CRISPR ativada corta o loop de RNA, o iniciador pode ser liberado para desencadear a reação do HCR.
[00316] Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento pode suprimir a geração de um produto genético. O produto do gene pode ser codificado por um construto repórter que é adicionada à amostra.O construto de mascaramento pode ser um RNA interferente envolvido em uma via de interferência de RNA, como um RNA em hairpin curto (shRNA) ou um RNA interferente pequeno (siRNA). O construto de mascaramento também pode compreender microRNA (miRNA). Enquanto presente, o construto de mascaramento suprime a expressão do produto do gene.O produto do gene pode ser uma proteína fluorescente ou outro transcrito ou proteínas de RNA que, de outro modo, seriam detectáveis por uma sonda, aptâmero ou anticorpo marcado, mas pela presença do construto de mascaramento.
Após a ativação da proteína efetora, o construto de mascaramento é clivada ou silenciada de outro modo, permitindo a expressão e a detecção do produto do gene como sinal detectável positivo.
[00317] Em modalidades específicas, o construto de mascaramento compreende um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto de gene codificado por um construto de relatório, em que o produto de gene gera o sinal positivo detectável quando expresso.
[00318] Em certas modalidades de exemplo, o construto de mascaramento pode sequestrar um ou mais reagentes necessários para gerar um sinal positivo detectável, de modo que a liberação de um ou mais reagentes do construto de mascaramento resulte na geração do sinal positivo detectável. O um ou mais reagentes podem combinar para produzir um sinal colorimétrico, um sinal quimioluminescente, um sinal fluorescente ou qualquer outro sinal detectável e podem compreender quaisquer reagentes conhecidos por serem adequados para esses fins. Em certas modalidades exemplares, o um ou mais reagentes são sequestrados por aptâmeros de RNA que se ligam a um ou mais reagentes.O um ou mais reagentes são liberados quando a proteína efetora é ativada após a detecção de uma molécula alvo e os aptâmeros de RNA ou DNA são degradados.
[00319] Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento pode ser imobilizado em um substrato sólido em um volume discreto individual (definido mais abaixo) e sequestrar um único reagente.Por exemplo, o reagente pode ser um grânulo que compreende um corante.Quando sequestradas pelo reagente imobilizado, as esferas individuais são muito difusas para gerar um sinal detectável, mas após a liberação do construto de mascaramento são capazes de gerar um sinal detectável, por exemplo, por agregação ou aumento simples na concentração da solução. Em certas modalidades exemplares, o agente de mascaramento imobilizado é um aptâmero à base de RNA ou DNA que pode ser clivado pela proteína efetora ativada após a detecção de uma molécula alvo.
[00320] Em certas outras modalidades exemplares, o construto de mascaramento se liga a um reagente imobilizado em solução, bloqueando assim a capacidade do reagente de se ligar a um parceiro de ligação marcado separado que está livre em solução. Assim, após a aplicação de uma etapa de lavagem a uma amostra, o parceiro de ligação marcado pode ser lavado para fora da amostra na ausência de uma molécula alvo. No entanto, se a proteína efetora for ativada, o construto de mascaramento é clivada em um grau suficiente para interferir com a capacidade do construto de mascaramento de se ligar ao reagente, permitindo assim que o parceiro de ligação marcado se ligue ao reagente imobilizado. Assim, o parceiro de ligação marcado permanece após o passo de lavagem, indicando a presença da molécula alvo na amostra. Em certos aspectos, o construto de mascaramento que liga o reagente imobilizado é um aptâmero de DNA ou RNA. O reagente imobilizado pode ser uma proteína e o parceiro de ligação marcado pode ser um anticorpo marcado. Alternativamente, o reagente imobilizado pode ser estreptavidina e o parceiro de ligação marcado pode ser marcado como biotina. O marcador no parceiro de ligação usado nas modalidades acima pode ser qualquer marcador detectável conhecido na técnica. Além disso, outros parceiros de ligação conhecidos podem ser utilizados de acordo com o design geral descrito neste documento.
[00321] Em certas modalidades de exemplo, o construto de mascaramento pode compreender uma ribozima. As ribozimas são moléculas de RNA com propriedades catalíticas. As ribozimas, tanto naturais quanto manipuladas, compreendem ou consistem em RNA que pode ser direcionado pelas proteínas efetoras aqui divulgadas. A ribozima pode ser selecionada ou engenheirada para catalisar uma reação que gera um sinal detectável negativo ou impede a geração de um sinal de controle positivo. Após a desativação da ribozima pela proteína efetora ativada, a reação que gera um sinal de controle negativo ou impede a geração de um sinal detectável positivo é removida, permitindo assim que um sinal detectável positivo seja gerado. Em um exemplo de modalidade, a ribozima pode catalisar uma reação colorimétrica fazendo com que uma solução apareça como uma primeira cor. Quando a ribozima é desativada, a solução muda para uma segunda cor, a segunda cor sendo o sinal positivo detectável. Um exemplo de como as ribozimas podem ser usadas para catalisar uma reação colorimétrica é descrito em Zhao et al. “Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS,” Biosens Bioelectron. 2014; 16: 337-42 e fornece um exemplo de como esse sistema pode ser modificado para funcionar no contexto das modalidades divulgadas neste documento. Alternativamente, as ribozimas, quando presentes, podem gerar produtos de clivagem, por exemplo, transcritos de RNA. Assim, a detecção de um sinal detectável positivo pode compreender a detecção de transcritos de RNA não clivados que são gerados apenas na ausência da ribozima.
[00322] Em algumas modalidades, o construto de mascaramento pode ser uma ribozima que gera um sinal detectável negativo e em que um sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima é desativada.
[00323] Em certas modalidades exemplares, o um ou mais reagentes é uma proteína, como uma enzima, capaz de facilitar a geração de um sinal detectável, como um sinal colorimétrico, quimioluminescente ou fluorescente, que é inibido ou sequestrado para que a proteína não possa gerar o sinal detectável pela ligação de um ou mais aptâmeros de DNA ou RNA à proteína. Após a ativação das proteínas efetoras aqui divulgadas, os aptâmeros de DNA ou RNA são clivados ou degradados a tal ponto que não inibem mais a capacidade da proteína de gerar o sinal detectável. Em certas modalidades de exemplo, o aptâmero é um aptâmero inibidor de trombina. Em certas modalidades de exemplo, o aptâmero do inibidor de trombina tem uma sequência de GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC (SEQIDNO:310). Quando este aptâmero é clivado, a trombina se torna ativa e cliva um substrato colorimétrico ou fluorescente do peptídeo. Em certas modalidades exemplares, o substrato colorimétrico é para-nitroanilida (pNA) covalentemente ligado ao substrato peptídico da trombina. Após a clivagem pela trombina, o pNA é liberado e se torna amarelo e facilmente visível aos olhos. Em certas modalidades exemplares, o substrato fluorescente é 7-amino-4-metilcumarina, um fluoróforo azul que pode ser detectado usando um detector de fluorescência.
Aptâmeros inibitórios também podem ser usados para peroxidase de rábano silvestre (HRP), beta-galactosidase ou fosfatase alcalina de bezerro (CAP) e dentro dos princípios gerais descritos acima.
[00324] Em certas modalidades, a atividade de RNAse ou DNAse é detectada colorimetricamente via clivagem de aptâmeros inibidores de enzima. Um modo potencial de converter a atividade de DNAse ou RNAse em um sinal colorimétrico é acoplar a clivagem de um aptâmero de DNA ou RNA à reativação de uma enzima capaz de produzir uma saída colorimétrica. Na ausência de clivagem de RNA ou DNA, o aptâmero intacto se ligará ao alvo da enzima e inibirá sua atividade. A vantagem deste sistema de leitura é que a enzima fornece uma etapa de amplificação adicional: uma vez liberada de um aptâmero por meio de atividade colateral (por exemplo, atividade colateral Cpf1), a enzima colorimétrica continuará produzindo produto colorimétrico, levando a uma multiplicação de sinal.
[00325] Em certas modalidades, um aptâmero existente que inibe uma enzima com uma leitura colorimétrica é usado.
De várias aptamer/enzyme existem pares com leituras colorimétricas, como trombina, proteína C, elastase de neutrófilos e subtilisina. Estas proteases têm substratos colorimétricos baseados em pNA e estão disponíveis comercialmente. Em certas modalidades, é utilizado um novo aptâmero visando uma enzima colorimétrica comum. Enzimas comuns e robustas, como beta-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou fosfatase alcalina intestinal da panturrilha, podem ser alvo de aptâmeros projetados por estratégias de seleção como o SELEX. Tais estratégias permitem a seleção rápida de aptâmeros com eficiência de ligação nanomolar e podem ser usadas para o desenvolvimento de enzyme/aptamer pares para leitura colorimétrica.
[00326] Em certas modalidades, o construto de mascaramento pode ser um aptâmero de DNA ou RNAe/ou pode compreender um inibidor de DNA ou amarrado a RNA.
[00327] Em certas modalidades, o construto de mascaramento pode compreender um oligonucleotídeo de DNA ou RNA ao qual um ligante detectável e um componente de mascaramento estão ligados.
[00328] Em certas modalidades, a atividade de RNAse ou DNase é detectada colorimetricamente via clivagem de inibidores amarrados a RNA. Muitas enzimas colorimétricas comuns têm inibidores reversíveis e competitivos: por exemplo, a beta-galactosidase pode ser inibida pela galactose. Muitos desses inibidores são fracos, mas seu efeito pode ser aumentado pelo aumento da concentração local. Ao vincular a concentração local de inibidores à atividade da DNase RNAse, os pares colorimétricos de enzima e inibidor podem ser modificados nos sensores de DNase e
RNAse. O sensor colorimétrico de DNase ou RNAse baseado em inibidores de pequenas moléculas envolve três componentes: a enzima colorimétrica, o inibidor e um RNA ou DNA ponte que está covalentemente ligado ao inibidor e à enzima, amarrando o inibidor à enzima. Na configuração não clivada, a enzima é inibida pelo aumento da concentração local da molécula pequena; quando o DNA ou RNA é clivado (por exemplo, por clivagem colateral Cas13 ou Cas12), o inibidor será liberado e a enzima colorimétrica será ativada.
[00329] Em certas modalidades, o aptâmero ou inibidor amarrado a DNA ou RNA pode sequestrar uma enzima, em que a enzima gera um sinal detectável após a liberação do aptâmero ou inibidor amarrado a DNA ou RNA, agindo sobre um substrato. Em algumas modalidades, o aptâmero pode ser um aptâmero inibidor que inibe uma enzima e impede a enzima de catalisar a geração de um sinal detectável de uma substância. Em algumas modalidades, o inibidor amarrado a DNA ou RNA pode inibir uma enzima e pode impedir que a enzima catalise a geração de um sinal detectável a partir de um substrato.
[00330] Em certas modalidades, a atividade de RNAse é detectada colorimetricamente via formação e/ou ativação de G-quadruplexos. Os quadruplexos G no DNA podem se complexar com o heme (ferro (III) -proporoporfirina IX) para formar uma DNAzima com atividade da peroxidase. Quando fornecido com substrato de peroxidase (por exemplo, ABTS: (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]- diammonium sal)), o complexo G-quadruplex-heme na presença de peróxido de hidrogênio causa oxidação do substrato, que então forma uma cor verde em solução. Um exemplo de sequência de DNA que forma G-quadruplex é: GGGTAGGGCGGGTTGGGA (SEQIDNO:311). Ao hibridar uma sequência adicional de DNA ou RNA, aqui referida como "grampo", a este aptâmero de DNA, a formação da estrutura G-quadraplex será limitada. Após a ativação colateral, o grampo será clivado, permitindo que o quadraplex G se forme e o heme se ligue. Essa estratégia é particularmente atraente porque a formação de cores é enzimática, o que significa que há amplificação adicional além da ativação colateral.
[00331] Em certas modalidades, o construto de mascaramento pode compreender um oligonucleotídeo de RNA projetado para ligar uma sequência de formação de G- quadruplex, em que uma estrutura G-quadruplex é formada pela sequência de formação de G-quadruplex após a clivagem do construto de mascaramento e em que o G-quadruplex estrutura gera um sinal positivo detectável.
[00332] Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento pode ser imobilizado em um substrato sólido em um volume discreto individual (definido mais abaixo) e sequestrar um único reagente. Por exemplo, o reagente pode ser um grânulo que compreende um corante.
Quando sequestradas pelo reagente imobilizado, as esferas individuais são muito difusas para gerar um sinal detectável, mas após a liberação do construto de mascaramento são capazes de gerar um sinal detectável, por exemplo, por agregação ou aumento simples na concentração da solução. Em certas modalidades de exemplo, o agente de mascaramento imobilizado é um aptâmero à base de RNA ou DNA que pode ser clivado pela proteína efetora ativada após a detecção de uma molécula alvo.
[00333] Em uma modalidade exemplar, o construto de mascaramento compreende um agente de detecção que muda de cor dependendo se o agente de detecção é agregado ou disperso em solução. Por exemplo, certas nanopartículas, como o ouro coloidal, passam por uma visível mudança de cor púrpura para vermelha à medida que passam de agregados para partículas dispersas. Por conseguinte, em certas modalidades de exemplos, esses agentes de detecção podem ser mantidos em agregado por uma ou mais moléculas de ponte. Pelo menos uma porção da molécula ponte compreende RNA ou DNA. Após a ativação das proteínas efetoras aqui divulgadas, a porção de RNA ou DNA da molécula ponte é clivada, permitindo que o agente de detecção se disperse e resultando na alteração correspondente na cor. Em certas modalidades de exemplo, o agente de detecção é um metal coloidal. O material metálico coloidal pode incluir partículas metálicas insolúveis em água ou compostos metálicos dispersos em um líquido, um hidrossol ou um sol metálico. O metal coloidal pode ser selecionado dentre os metais dos grupos IA, IB, IIB e IIIB da tabela periódica, bem como os metais de transição, especialmente os do grupo VIII. Os metais preferidos incluem ouro, prata, alumínio, rutênio, zinco, ferro, níquel e cálcio. Outros metais adequados também incluem os seguintes em todos os seus vários estados de oxidação: lítio, sódio, magnésio, potássio, escândio, titânio, vanádio, cromo, manganês, cobalto, cobre, gálio, estrôncio, nióbio, molibdênio, paládio, índio, estanho, tungstênio, rênio, platina e gadolínio. Os metais são preferencialmente fornecidos na forma iônica, derivados de um composto metálico apropriado, por exemplo, o A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Íons Ni2 + e Ca2 +.
[00334] Quando a ponte de RNA ou DNA é cortada pelo efetor CRISPR ativado, a mudança de cor mencionada acima é observada. Em certas modalidades exemplares, as partículas são metais coloidais. Em certas outras modalidades exemplares, o metal coloidal é um ouro coloidal. Em certas modalidades exemplares, as nanopartículas coloidais são nanopartículas de ouro de 15 nm (AuNPs). Devido às propriedades de superfície únicas das nanopartículas de ouro coloidal, a absorvância máxima é observada a 520 nm quando totalmente dispersa em solução e com uma cor vermelha a olho nu. Após a agregação de AuNPs, eles exibem um desvio para o vermelho na absorbância máxima e aparecem em cores mais escuras, eventualmente precipitando da solução como um agregado roxo escuro. Em certas modalidades exemplares, as nanopartículas são modificadas para incluir ligantes de DNA que se estendem a partir da superfície da nanopartícula. Partículas individuais são ligadas entre si por RNA de fita simples (ssRNA) ou pontes de DNA de fita única que hibridizam em cada extremidade com pelo menos uma porção dos ligantes de DNA. Assim, as nanopartículas formarão uma rede de partículas ligadas e agregadas, aparecendo como um precipitado escuro. Após a ativação dos efetores CRISPR aqui divulgados, a ponte ssRNA ou ssDNA será clivada, liberando o AUNPS da malha vinculada e produzindo uma cor vermelha visível. Exemplos de ligantes de DNA e sequências de pontes estão listados abaixo. Os ligantes tiol na extremidade dos ligantes de DNA podem ser utilizados para a conjugação da superfície com o AuNPS.
Outras formas de conjugação podem ser usadas. Em certas modalidades exemplares, duas populações de AuNPs podem ser geradas, uma para cada ligante de DNA. Isso ajudará a facilitar a ligação adequada da ponte ssRNA com a orientação adequada. Em certas modalidades exemplares, um primeiro ligante de DNA é conjugado pela extremidade 3 ',
enquanto um segundo ligante de DNA é conjugado pela extremidade 5'.
Tabela 9 DNA1 colorimétrico C2c2(SEQIDNO:312 TTATAACTATTCCTAAAAAAAAAAA/3TioMC3-D/ ) DNA2 colorimétrico C2c2(SEQIDNO: /5TioMC6-D/AAAAAAAAAACTCCCCTAATAACAAT 313) Ponte colorimétrica C2c2(SEQIDNO: GGGUAGGAAUAGUUAUAAUUUCCCUUUCCCAUUGUUAUU 314) AGGGAG
[00335] Em certas outras modalidades de exemplo, o construto de mascaramento pode compreender um oligonucleotídeo de RNA ou DNA ao qual está ligado um marcador detectável e um agente de mascaramento desse marcador detectável. Um exemplo de tal detectável label/masking par de agentes é um fluoróforo e um inibidor do fluoróforo. A têmpera do fluoróforo pode ocorrer como resultado da formação de um complexo não fluorescente entre o fluoróforo e outro fluoróforo ou molécula não fluorescente. Esse mecanismo é conhecido como formação de complexo no estado fundamental, resfriamento estático ou resfriamento por contato. Por conseguinte, o oligonucleotídeo de RNA ou DNA pode ser projetado de modo que o fluoróforo e o extintor estejam suficientemente próximos para que ocorra o resfriamento por contato. Os fluoróforos e seus inibidores de cognatos são conhecidos na técnica e podem ser selecionados para esse fim por alguém versado na técnica. O par fluoróforo/extintor específico não é crítico no contexto desta invenção, apenas que a seleção dos pares fluoróforo/extintor garante o mascaramento do fluoróforo. Após a ativação das proteínas efetoras aqui divulgadas, o oligonucleotídeo de RNA ou DNA é clivado, desse modo cortando a proximidade entre o fluoróforo e o extintor necessário para manter o efeito de extinção de contato. Por conseguinte, a detecção do fluoróforo pode ser usada para determinar a presença de uma molécula alvo em uma amostra.
[00336] Em certas outras modalidades exemplares, o construto de mascaramento pode compreender um ou mais oligonucleotídeos de RNA aos quais estão ligados uma ou mais nanopartículas de metal, como nanopartículas de ouro.
Em algumas modalidades, o construto de mascaramento compreende uma pluralidade de nanopartículas de metal reticuladas por uma pluralidade de oligonucleotídeos de RNA ou DNA, formando um loop fechado. Numa modalidade, o construto de mascaramento compreende três nanopartículas de ouro reticuladas por três oligonucleotídeos de RNA ou DNA formando uma alça fechada. Em algumas modalidades, a clivagem dos oligonucleotídeos de RNA ou DNA pela proteína efetora CRISPR leva a um sinal detectável produzido pelas nanopartículas de metal.
[00337] Em certas outras modalidades de exemplo, o construto de mascaramento pode compreender um ou mais oligonucleotídeos de RNA ou DNA aos quais estão ligados um ou mais pontos quânticos. Em algumas modalidades, a clivagem dos oligonucleotídeos de RNA ou DNA pela proteína efetora CRISPR leva a um sinal detectável produzido pelos pontos quânticos.
[00338] Em uma modalidade de exemplo, o construto de mascaramento pode compreender um ponto quântico. O ponto quântico pode ter várias moléculas de ligação ligadas à superfície. Pelo menos uma porção da molécula de ligante compreende RNA ou DNA. A molécula do ligante é anexada ao ponto quântico em uma extremidade e a um ou mais inibidores ao longo do comprimento ou nas extremidades terminais do ligante, de modo que os inibidores sejam mantidos em proximidade suficiente para que ocorra o efeito do quântico. O ligante pode ser ramificado. Como acima, o quantum dot/quencher par não é crítico, apenas essa seleção do quantum dot/quencher par garante o mascaramento do fluoróforo. Os pontos quânticos e seus inibidores de cognatos são conhecidos na técnica e podem ser selecionados para esse fim por alguém versado na técnica. Após a ativação das proteínas efetoras aqui divulgadas, a porção de RNA ou DNA da molécula de ligante é clivada, eliminando assim a proximidade entre o ponto quântico e um ou mais inibidores necessários para manter o efeito de inibição. Em certas modalidades de exemplo, o ponto quântico é conjugado com estreptavidina. RNA ou DNA são ligados via ligantes de biotina e recrutam moléculas de extinção com as seqüências /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQIDNO:315) ou /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ (SEQIDNO:316) Onde /5Biosg/ é uma etiqueta de biotina e /3lAbRQSp/ é um extintor preto de Iowa. Após a clivagem, pelos efetores ativados aqui divulgados, o ponto quântico irá fluorescir visivelmente.
[00339] Em modalidades específicas, o ligando detectável pode ser um fluoróforo e o componente de mascaramento pode ser uma molécula de extintor.
[00340] De maneira semelhante, a transferência de energia de fluorescência (FRET) pode ser usada para gerar um sinal positivo detectável. FRET é um processo não radiativo pelo qual um fóton de um fluoróforo energeticamente excitado (isto é, "fluoróforo doador") eleva o estado de energia de um elétron em outra molécula (isto é "o aceitador") para níveis vibracionais mais altos do estado singleto excitado. O fluoróforo doador retorna ao estado fundamental sem emitir uma característica de fluorescência desse fluoróforo. O aceitador pode ser outro fluoróforo ou molécula não fluorescente. Se o aceitador for um fluoróforo, a energia transferida é emitida como característica de fluorescência desse fluoróforo. Se o aceitador é uma molécula não fluorescente, a energia absorvida é a perda como calor. Assim, no contexto das modalidades divulgadas neste documento, o fluorophore/quencher par é substituído por um doador fluorophore/acceptor par ligado à molécula de oligonucleotídeo. Quando intacta, o construto de mascaramento gera um primeiro sinal (sinal detectável negativo) como detectado pela fluorescência ou calor emitido pelo aceitador. Após a ativação das proteínas efetoras aqui divulgadas, o oligonucleotídeo de RNA é clivado e a FRET é interrompida de modo que a fluorescência do fluoróforo doador seja agora detectada (sinal detectável positivo).
[00341] Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento compreende o uso de corantes intercalantes que alteram sua absorvância em resposta à clivagem de RNAs ou DNAs longos em nucleotídeos curtos.
Existem vários desses corantes. Por exemplo, a pironina-Y se complexa com o RNA e forma um complexo que possui uma absorvância a 572 nm. A clivagem do RNA resulta em perda de absorvância e mudança de cor. O azul de metileno pode ser utilizado de maneira semelhante, com alterações na absorvância a 688 nm após a clivagem do RNA. Por conseguinte, em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento compreende um RNA e um complexo de corante intercalante que altera a absorvância na clivagem do RNA pelas proteínas efetoras aqui divulgadas.
[00342] Em certas modalidades de exemplo, o construto de mascaramento pode compreender um iniciador para uma reação de HCR. Veja, por exemplo, Dirks e Pierce.
PNAS101, 15275-15728 (2004). As reações de HCR utilizam a energia potencial em duas espécies de grampos. Quando um iniciador de fita simples com uma porção complementar de uma região correspondente em um dos grampos de cabelo é liberado na mistura anteriormente estável, ele abre um grampo de cabelo de uma espécie. Este processo, por sua vez, expõe uma região de cadeia simples que abre um hairpin das outras espécies. Esse processo, por sua vez, expõe uma região de cadeia única idêntica ao iniciador original. A reação em cadeia resultante pode levar à formação de uma hélice dupla cortada que cresce até o suprimento de hairpin estar esgotado. A detecção dos produtos resultantes pode ser feita em gel ou colorimetricamente. Exemplos de métodos de detecção colorimétrica incluem, por exemplo, os divulgados em Lu et al. “Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization chain reaction- triggered enzyme cascade amplification ACSAppl Mater Interfaces, 2017, 9(1):167-175, Wang et al. “An enzyme-
free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers” Analyst 2015, 150, 7657- 7662, e Song et al. “Non covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection. ” Spectroscopy aplicado, 70 (4): 686-694 (2016).
[00343] Em certas modalidades exemplares, o construto de mascaramento suprime a geração de um sinal positivo detectável até ser clivada por uma proteína efetora CRISPR ativada. Em algumas modalidades, o construto de mascaramento pode suprimir a geração de um sinal positivo detectável mascarando o sinal positivo detectável ou gerando um sinal negativo detectável.
Amplificação do Alvo
[00344] Em certas modalidades de exemplo, RNAs alvo e/ouOs DNAs podem ser amplificados antes da ativação da proteína efetora CRISPR. Qualquer técnica de amplificação de RNA ou DNA adequada pode ser usada. Em certas modalidades exemplares, a amplificação de RNA ou DNA é uma amplificação isotérmica. Em certas modalidades de exemplo, a amplificação isotérmica pode ser amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), amplificação de polimerase de recombinase (RPA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA)) ou reação de amplificação enzimática de corte (NEAR). Em certas modalidades de exemplo, métodos de amplificação não isotérmica podem ser utilizados, que incluem, entre outros, PCR, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), amplificação de círculo rolante (RCA), reação em cadeia da ligase (LCR) ou método de amplificação de ramificação (RAM).
[00345] Em certas modalidades de exemplo, a amplificação de RNA ou DNA é NASBA, que é iniciada com a transcrição reversa do RNA alvo por um iniciador reverso específico da sequência para criar um RNA/DNA duplex.
ARNase H é então usada para degradar o molde de RNA, permitindo que um iniciador direto contendo um promotor, como o promotor T7, se ligue e inicie o alongamento da fita complementar, gerando um produto de DNA de fita dupla. A transcrição do modelo de DNA mediada pelo promotor da RNA polimerase cria cópias da sequência de RNA alvo. É importante ressaltar que cada um dos novos RNAs alvo pode ser detectado pelos RNAs guia, melhorando ainda mais a sensibilidade do ensaio. A ligação dos RNAs alvo pelos RNAs guia leva à ativação da proteína efetora CRISPR e os métodos prosseguem conforme descrito acima. A reação da NASBA tem a vantagem adicional de poder prosseguir em condições isotérmicas moderadas, por exemplo, a aproximadamente 41oC, tornando-a adequada para sistemas e dispositivos implantados para detecção precoce e direta em campo e longe de laboratórios clínicos.
[00346] Em certas outras modalidades exemplares, uma reação de amplificação por recombinase polimerase (RPA) pode ser usada para amplificar os ácidos nucleicos alvo. As reações de RPA empregam recombinases que são capazes de emparelhar iniciadores específicos de sequência com sequência homóloga em DNAdúplex. Se o DNA alvo estiver presente, a amplificação do DNA será iniciada e nenhuma outra manipulação de amostra, como ciclagem térmica ou fusão química, será necessária. Todo o sistema de amplificação RPA é estável como uma formulação seca e pode ser transportado com segurança sem refrigeração. As reações de RPA também podem ser realizadas a temperaturas isotérmicas com uma temperatura ideal de reação de 37-42o C. Os iniciadores específicos da sequência são projetados para amplificar uma sequência compreendendo a sequência de ácido nucleico alvo a ser detectada. Em certas modalidades de exemplo, um promotor de RNA polimerase, como um promotor de T7, é adicionado a um dos iniciadores. Isto resulta num produto amplificado de DNA de cadeia dupla compreendendo a sequência alvo e um promotor de RNA polimerase. Após, ou durante a reação RPA, é adicionada uma RNA polimerase que produzirá RNA a partir dos modelos de DNA de fita dupla.
ORNA alvo amplificado pode então ser detectado pelo sistema efetor CRISPR. Desta maneira, o DNA alvo pode ser detectado usando as modalidades divulgadas neste documento. As reações de RPA também podem ser usadas para amplificar o RNA alvo. ORNA alvo é primeiro convertido em cDNA usando uma transcriptase reversa, seguida pela síntese de DNA da segunda fita, momento em que a reação RPA prossegue conforme descrito acima.
[00347] Numa modalidade da invenção pode compreender amplificação baseada em nickase. A enzima nicking pode ser uma proteína CRISPR. Por conseguinte, a introdução de nicks no dsDNA pode ser programável e específica de sequência.
AFigura 115 representa uma modalidade da invenção, que começa com duas guias projetadas para atingir as cadeias opostas de um alvo de dsDNA. De acordo com a invenção, a nickase pode ser Cpf1, C2c1, Cas9 ou qualquer ortólogo ou proteína CRISPR que cliva ou é projetada para clivar uma única fita de um duplex de DNA. Os fios cortados podem então ser estendidos por uma polimerase. Em uma modalidade, os locais dos cortes são selecionados de modo que a extensão dos fios por uma polimerase seja direcionada para a porção central do DNA dúplex alvo entre os locais do entalhe. Em certas modalidades, os iniciadores são incluídos na reação capaz de hibridar com as cadeias estendidas seguidas por uma extensão adicional da polimerase dos iniciadores para regenerar duas partes de dsDNA: um primeiro dsDNA que inclui o local guia Cpf1 da primeira fita ou o primeiro e o segundo cordas Cpf1 sites de guia e um segundo dsDNA que inclui o site de guia Cpf1 da segunda cadeia ou os sites de guia Cprf da primeira e segunda cadeia. Essas peças continuam sendo cortadas e estendidas em uma reação cíclica que amplifica exponencialmente a região do alvo entre os locais de corte.
[00348] A amplificação pode ser isotérmica e selecionada para a temperatura. Numa modalidade, a amplificação prossegue rapidamente a 37 graus. Em outras modalidades, a temperatura da amplificação isotérmica pode ser escolhida selecionando uma polimerase (por exemplo, Bsu, Bst, Phi29, fragmento klenow etc.) operável a uma temperatura diferente.
[00349] Assim, quando as técnicas de amplificação isotérmica de corte usam enzimas de corte com preferência de sequência fixa (por exemplo, na reação de amplificação da enzima de corte ou NEAR), o que exige a desnaturação do alvo dsDNA original para permitir o recozimento e a extensão de iniciadores que adicionam o substrato de corte às extremidades do alvo, o uso de uma nickase CRISPR em que os sítios de corte podem ser programados via RNAs guia significa que nenhuma etapa de desnaturação é necessária, permitindo que toda a reação seja verdadeiramente isotérmica. Isso também simplifica a reação, porque esses iniciadores que adicionam o substrato de corte são diferentes dos iniciadores usados posteriormente na reação, o que significa que o NEAR requer dois conjuntos de iniciadores (isto é, 4 iniciadores), enquanto a amplificação de Cpf1 requer apenas um conjunto de iniciadores (isto é, dois iniciadores). Isso torna a amplificação de Cpf1 muito mais simples e fácil de operar, sem instrumentação complicada para executar a desnaturação e, em seguida, resfriar até a temperatura isotérmica.
[00350] Por conseguinte, em certas modalidades exemplares, os sistemas aqui divulgados podem incluir reagentes de amplificação. Diferentes componentes ou reagentes úteis para amplificação de ácidos nucleicos são descritos aqui. Por exemplo, um reagente de amplificação como aqui descrito pode incluir um tampão, tal como um tampão Tris. Um tampão Tris pode ser usado em qualquer concentração apropriada para a aplicação ou uso desejado, por exemplo, incluindo, entre outros, uma concentração de 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 1M ou semelhantes. Um versado na técnica será capaz de determinar uma concentração apropriada de um tampão, tal como Tris, para uso com a presente invenção.
[00351] Um sal, como cloreto de magnésio (MgCl2), cloreto de potássio (KCl) ou cloreto de sódio (NaCl), pode ser incluído em uma reação de amplificação, como PCR, a fim de melhorar a amplificação de fragmentos de ácidos nucleicos. Embora a concentração de sal dependa da reação e aplicação particulares, em algumas modalidades, fragmentos de ácido nucleico de um tamanho específico podem produzir resultados ideais em concentrações específicas de sal.
Produtos maiores podem exigir concentrações de sal alteradas, normalmente sal inferior, para produzir os resultados desejados, enquanto a amplificação de produtos menores pode produzir melhores resultados em concentrações mais altas de sal. Um especialista na técnica entenderá que a presença e/ou a concentração de um sal, juntamente com a alteração das concentrações de sal, pode alterar o rigor de uma reação biológica ou química e, portanto, qualquer sal pode ser utilizado que forneça as condições apropriadas para uma reação da presente invenção e como aqui descrito.
[00352] Outros componentes de uma reação biológica ou química podem incluir um componente de lise celular, a fim de abrir ou lisar uma célula para análise dos materiais nela contidos. Um componente de lise celular pode incluir, mas não está limitado a, um detergente, um sal como descrito acima, como NaCl, KCl, sulfato de amônio [(NH4)2SO4], ou outros. Os detergentes que podem ser apropriados para a invenção podem incluir Triton X-100, dodecilsulfato de sódio (SDS), CHAPS (3-[(3-
colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanossulfonato), brometo de etil trimetil amônio, nonilfenoxipolietoxietanol (NP- 40). As concentrações de detergentes podem depender da aplicação específica e, em alguns casos, podem ser específicas da reação. As reações de amplificação podem incluir dNTPs e iniciadores de ácido nucleico usados em qualquer concentração apropriada para a invenção, como incluindo, entre outros, uma concentração de 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 300 nM, 350 nM, 400 nM, 450 nM, 500 nM, 550 nM, 600 nM, 650 nM, 700 nM, 750 nM, 800 nM, 850 nM, 900 nM, 950 nM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM ou semelhantes. Do mesmo modo, uma polimerase útil de acordo com a invenção pode ser qualquer polimerase específica ou geral conhecida na técnica e útil ou na invenção, incluindo a polimerase Taq, a polimerase Q5 ou semelhantes.
[00353] Em algumas modalidades, os reagentes de amplificação como aqui descritos podem ser apropriados para uso na amplificação de partida a quente. A amplificação de arranque a quente pode ser benéfica em algumas modalidades para reduzir ou eliminar a dimerização de moléculas ou oligos adaptadores, ou para impedir produtos ou artefatos de amplificação indesejados e obter amplificação ideal do produto desejado. Muitos componentes aqui descritos para uso em amplificação também podem ser usados em amplificação de partida a quente. Em algumas modalidades, reagentes ou componentes apropriados para uso com amplificação de arranque a quente podem ser usados no lugar de um ou mais dos componentes da composição, conforme apropriado. Por exemplo, uma polimerase ou outro reagente pode ser usado que exibe uma atividade desejada a uma temperatura específica ou outra condição de reação. Em algumas modalidades, os reagentes podem ser utilizados que são projetados ou otimizados para uso em amplificação de arranque a quente, por exemplo, uma polimerase pode ser ativada após a transposição ou após atingir uma temperatura específica. Tais polimerases podem ser baseadas em anticorpos ou em aptâmeros. As polimerases como aqui descritas são conhecidas na técnica. Exemplos de tais reagentes podem incluir, mas não estão limitados a, polimerases de início a quente, dNTPs de início a quente e dNTPs de fotoenvelhecimento. Tais reagentes são conhecidos e estão disponíveis na técnica. Um versado na técnica será capaz de determinar as temperaturas ideais conforme apropriado para reagentes individuais.
[00354] A amplificação de ácidos nucleicos pode ser realizada utilizando máquinas ou equipamentos de ciclo térmico específico, e pode ser realizada em reações únicas ou a granel, de modo que qualquer número desejado de reações possa ser realizado simultaneamente. Em algumas modalidades, a amplificação pode ser realizada usando dispositivos microfluídicos ou robóticos, ou pode ser realizada usando alteração manual nas temperaturas para alcançar a amplificação desejada. Em algumas modalidades, a otimização pode ser realizada para obter as condições ideais de reação para a aplicação ou materiais específicos.
Um versado na técnica compreenderá e poderá otimizar as condições de reação para obter amplificação suficiente.
[00355] Em certas modalidades, a detecção de DNA com os métodos ou sistemas da invenção requer a transcrição do DNA (amplificado) em RNA antes da detecção.
[00356] Será evidente que os métodos de detecção da invenção podem envolver procedimentos de amplificação e detecção de ácidos nucleicos em várias combinações. O ácido nucleico a ser detectado pode ser qualquer ácido nucleico sintético ou natural, incluindo mas não limitado a DNA e RNA, que pode ser amplificado por qualquer método adequado para fornecer um produto intermediário que pode ser detectado. A detecção do produto intermediário pode ser por qualquer método adequado, incluindo, mas não limitado a, ligação e ativação de uma proteína CRISPR que produz uma fração de sinal detectável por atividade direta ou colateral.
Enriquecimento Sistemas CRISPR
[00357] Em certas modalidades exemplares, o RNA ou DNA alvo pode primeiro ser enriquecido antes da detecção ou amplificação do RNA ou DNA alvo. Em certas modalidades exemplares, esse enriquecimento pode ser alcançado pela ligação dos ácidos nucleicos alvo por um sistema efetor CRISPR.
[00358] Os atuais protocolos de enriquecimento específicos para o alvo requerem ácido nucleico de fita simples antes da hibridação com sondas. Entre várias vantagens, as presentes modalidades podem pular esta etapa e permitir o direcionamento direto para o DNA de fita dupla (parcial ou completamente de fita dupla). Além disso, as modalidades divulgadas neste documento são métodos de direcionamento acionado por enzimas que oferecem cinética mais rápida e fluxo de trabalho mais fácil, permitindo enriquecimento isotérmico. Em certos exemplos de modalidades, o enriquecimento pode ocorrer a temperaturas tão baixas quanto 20-37o C. Em certas modalidades de exemplo, um conjunto de RNAs guia para diferentes ácidos nucleicos alvo é usado em um único ensaio, permitindo a detecção de múltiplos alvos e/ou múltiplas variantes de um único alvo.
[00359] Em certas modalidades exemplares, uma proteína efetora CRISPR morta pode se ligar ao ácido nucleico alvo em solução e, em seguida, ser isolada a partir da referida solução. Por exemplo, a proteína efetora CRISPR morta ligada ao ácido nucleico alvo, pode ser isolada da solução usando um anticorpo ou outra molécula, como um aptâmero, que se liga especificamente à proteína efetiva CRISPR morta.
[00360] Em outras modalidades de exemplo, a proteína efetora CRISPR morta pode se ligar a um substrato sólido.
Um substrato fixo pode se referir a qualquer material que seja apropriado ou possa ser modificado para ser apropriado para a ligação de um polipeptídeo ou um polinucleotídeo. Os possíveis substratos incluem, entre outros, vidro e vidro funcionalizado modificado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon ™, etc.), polissacarídeos, nylon ou nitrocelulose, cerâmica, resinas, sílica ou materiais à base de sílica, incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, plásticos, feixes de fibras ópticas e uma variedade de outros polímeros. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma superfície padronizada adequada para imobilização de moléculas em um padrão ordenado. Em certas modalidades, uma superfície padronizada refere-se a um arranjo de diferentes regiões dentro ou sobre uma camada exposta de um suporte sólido. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma matriz de poços ou depressões em uma superfície. A composição e a geometria do suporte sólido podem variar com o seu uso. Em algumas modalidades, o suporte de sólidos é uma estrutura plana, como uma lâmina, chip, microchip e/oumatriz. Como tal, a superfície do substrato pode estar na forma de uma camada plana. Em algumas modalidades, o suporte sólido compreende uma ou mais superfícies de uma célula de fluxo.
O termo "célula de fluxo", conforme aqui utilizado, refere- se a uma câmara que compreende uma superfície sólida através da qual um ou mais reagentes de fluido podem ser escoados. Células de fluxo de exemplo e sistemas fluídicos relacionados e plataformas de detecção que podem ser facilmente utilizados nos métodos da presente divulgação são descritos, por exemplo, em Bentley et al. Nature 456: 53-59 (2008), WO04/0918497, US7.057.026; WO91/06678; WO07/123744; US7.329.492; US7.211.414; US7.315.019; US7.405.281 e US2008/0108082. Em algumas modalidades, o suporte sólido ou sua superfície não é plana, como a superfície interna ou externa de um tubo ou vaso. Em algumas modalidades, as microesferas ou nanopartículas compreendem partículas de lipídios sólidos. “Microesferas”, “cordão”, “partículas” pretendem significar, no contexto de um substrato sólido, pequenas partículas discretas feitas de vários materiais, incluindo, entre outros, plásticos,
cerâmica, vidro e plastireno. Em certas modalidades, as microesferas são microesferas ou esferas magnéticas.
Alternativa ou adicionalmente, as contas podem ser porosas.
Os tamanhos dos cordões variam de nanômetros, por exemplo, 100 nm, a milímetros, por exemplo, 1 mm.
[00361] Uma amostra contendo, ou suspeita de conter, os ácidos nucleicos alvo pode então ser exposta ao substrato para permitir a ligação dos ácidos nucleicos alvo à proteína efetiva CRISPR morta ligada. Moléculas não-alvo podem então ser lavadas. Em certas modalidades de exemplo, os ácidos nucleicos alvo podem então ser liberados a partir do efetor CRISPR protein/guide Complexo de RNA para detecção adicional usando os métodos aqui divulgados. Em certas modalidades exemplares, os ácidos nucleicos alvo podem primeiro ser amplificados como aqui descrito.
[00362] Em certas modalidades de exemplo, o efetor CRISPR pode ser marcado com uma etiqueta de ligação. Em certas modalidades de exemplo, o efetor CRISPR pode ser quimicamente marcado. Por exemplo, o efetor CRISPR pode ser quimicamente biotinilado. Em outro exemplo de modalidade, uma fusão pode ser criada adicionando uma sequência adicional que codifica uma fusão ao efetor CRISPR. Um exemplo dessa fusão é o AviTag™, que emprega uma conjugação enzimática altamente direcionada de uma única biotina em um único marcador peptídico de 15 aminoácidos. Em certas modalidades, o efetor CRISPR pode ser marcado com uma etiqueta de captura, como, sem limitação, GST, Myc, hemaglutinina (HA), proteína verde fluorescente (GFP), bandeira, etiqueta His, etiqueta TAP e etiqueta Fc. A etiqueta de ligação, seja uma etiqueta de fusão, química ou de captura, pode ser usada para puxar o sistema efetor CRISPR uma vez que ele tenha ligado um ácido nucleico alvo ou para fixar o sistema efetor CRISPR no substrato sólido.
[00363] Em certas modalidades de exemplo, o RNA guia pode ser marcado com uma etiqueta de ligação. Em certas modalidades exemplares, o RNA guia inteiro pode ser marcado usando transcrição in vitro (IVT) incorporando um ou mais nucleotídeos biotinilados, como uracil biotinilado. Em algumas modalidades, a biotina pode ser adicionada quimicamente ou enzimaticamente ao RNA guia, como a adição de um ou mais grupos de biotina na extremidade 3 'do RNA guia. A etiqueta de encadernação pode ser usada para puxar a guia para baixo RNA/target complexo de ácido nucleico após a ligação ocorreu, por exemplo, expondo o guia RNA/target ácido nucleico a um substrato sólido revestido com estreptavidina.
[00364] Em modalidades específicas, o substrato sólido pode ser uma célula de fluxo. Em certas modalidades, uma célula de fluxo pode ser um dispositivo para detectar a presença ou quantidade de um analito em uma amostra de teste. O dispositivo de célula de fluxo pode ter meios reagentes imobilizados que produzem uma resposta detectável eletricamente ou opticamente a um analito que pode estar contido em uma amostra de teste.
[00365] Por conseguinte, em certas modalidades de exemplo, um efetor de CRISPR projetado ou de ocorrência não natural pode ser usado para fins de enriquecimento. Numa modalidade, a modificação pode compreender a mutação de um ou mais resíduos de aminoácidos da proteína efetora. As uma ou mais mutações podem estar em um ou mais domínios cataliticamente ativos da proteína efetora. A proteína efetora pode ter atividade de nuclease reduzida ou abolida em comparação com uma proteína efetora sem as referidas uma ou mais mutações. A proteína efetora pode não direcionar a clivagem da fita de RNA no locus alvo de interesse. Numa modalidade preferida, as uma ou mais mutações podem compreender duas mutações. Em uma modalidade preferida, os um ou mais resíduos de aminoácidos são modificados em uma proteína efetora C2c2, por exemplo, uma proteína efetiva modificada ou não natural ou C2c2. Em modalidades particulares, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a R597, H602, R1278 e H1283 (com referência aos aminoácidos Lsh C2c2), como as mutações R597A, H602A, R1278A e H1283A, ou os resíduos de aminoácidos correspondentes nos ortólogos de Lsh C2c2.
[00366] Como tal, o sistema CRISPR de enriquecimento pode compreender uma proteína efetora CRISPR cataliticamente inativa. Em modalidades específicas, a proteína efetora CRISPR cataliticamente inativa é um C2c2 cataliticamente inativo.
[00367] Em modalidades particulares, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a K2, K39, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884,Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, K1548, V1551, I1558, de acordo com a numeração de consenso de C2c2. Em certas modalidades, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a R717 e R1509. Em certas modalidades, o um ou mais resíduos de aminoácidos modificados são um ou mais daqueles em C2c2 correspondentes a K2, K39, K535, K1261, R1362, R1372, K1546 e K1548. Em certas modalidades, as referidas mutações resultam em uma proteína que possui uma atividade alterada ou modificada. Em certas modalidades, as referidas mutações resultam em uma proteína com uma atividade reduzida, como especificidade reduzida. Em certas modalidades, as referidas mutações resultam em uma proteína que não possui atividade catalítica (isto é, C2c2 "morto").
Numa modalidade, os referidos resíduos de aminoácidos correspondem aos resíduos de aminoácidos Lsh C2c2 ou os resíduos de aminoácidos correspondentes de uma proteína C2c2 de uma espécie diferente. Dispositivos que podem facilitar essas etapas. Em algumas modalidades, para reduzir o tamanho de uma proteína de fusão do efetor Cas13b e dos um ou mais domínios funcionais, o terminal C do efetor Cas13b pode ser truncado enquanto ainda mantém sua função de ligação ao RNA. Por exemplo, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos, pelo menos 80 aminoácidos ou pelo menos 100 aminoácidos ou pelo menos 150 aminoácidos ou pelo menos 200 aminoácidos ou pelo menos 250 aminoácidos ou pelo menos 300 aminoácidos, ou pelo menos 350 aminoácidos, ou até 120 aminoácidos, ou até 140 aminoácidos, ou até 160 aminoácidos, ou até 180 aminoácidos, ou até 200 aminoácidos, ou até 250 aminoácidos, ou até 300 aminoácidos, ou até 350 aminoácidos, ou até 400 aminoácidos, podem ser truncados no terminal C do terminal Cas13b. Exemplos específicos de truncamentos Cas13b incluem o terminal C Δ984-1090, o terminal C Δ1026-1090 e o terminal C Δ1053-1090, o terminal C Δ934-1090, o terminal C Δ884-1090, o terminal C Δ834-
1090, o terminal C Δ784-1090 e o C-terminal Δ734-1090, em que as posições de aminoácidos correspondem às posições de aminoácidos de Prevotella sp. Proteína P5-125Cas13b.
[00368] Os sistemas de enriquecimento acima podem também ser utilizados para esgotar uma amostra de certos ácidos nucleicos. Por exemplo, os RNAs guia podem ser projetados para ligar RNAs não-alvo para remover os RNAs não-alvo da amostra. Em uma modalidade exemplar, os RNAs guia podem ser projetados para ligar ácidos nucleicos que carregam uma variação particular de ácido nucleico. Por exemplo, em uma dada amostra, pode ser esperado um número de cópias mais alto de ácidos nucleicos não variantes. Por conseguinte, as modalidades aqui divulgadas podem ser usadas para remover os ácidos nucleicos não variantes de uma amostra, para aumentar a eficiência com a qual o sistema efetor de detecção CRISPR pode detectar as sequências variantes alvo em uma determinada amostra.
Amplificação e/ou Aprimoramento do sinal positivo detectável
[00369] Em certas modalidades de exemplo, podem ser introduzidas outras modificações que amplificam ainda mais o sinal positivo detectável. Por exemplo, a ativação colateral da proteína de efetor CRISPR ativada pode ser usada para gerar um alvo secundário ou uma sequência guia adicional, ou ambos. Em um exemplo de modalidade, a solução de reação conteria um alvo secundário que é cravado em alta concentração.
O alvo secundário pode ser distinto do alvo primário (ou seja, o alvo para o qual o ensaio foi projetado para detectar) e, em certos casos, pode ser comum em todos os volumes de reação.
Uma sequência guia secundária para o alvo secundário pode ser protegida, por exemplo, por uma característica estrutural secundária, como um hairpin com um laço de RNA, e incapaz de se ligar ao segundo alvo ou à proteína efetora CRISPR.
Clivagem do grupo protetor por uma proteína efetora CRISPR ativada
(isto é, após ativação por formação de complexo com o (s)
alvo (s) primário (s) em solução) e formação de um complexo com proteína efetora CRISPR livre em solução e ativação do cravado no alvo secundário.
Em certas outras modalidades exemplares, um conceito semelhante é usado com uma segunda sequência guia para uma sequência alvo secundária.
A sequência alvo secundária pode ser protegida de uma característica estrutural ou grupo de proteção no alvo secundário.
A clivagem de um grupo protetor do alvo secundário permite, então, um efetor CRISPR adicional protein/second guia sequence/secondary complexo alvo a ser formado.
Em ainda outro exemplo de modalidade, a ativação da proteína efetora CRISPR pelo (s) alvo (s) primário (s)
pode ser usada para clivar um iniciador protegido ou circularizado, que é então liberado para realizar uma reação de amplificação isotérmica, como as divulgadas neste documento, em um modelo que codifica uma sequência guia secundária, sequência alvo secundária ou ambas. A transcrição subsequente desse modelo amplificado produziria mais sequências guia secundárias e/ou sequência alvo secundária, seguida por ativação adicional da proteína efetora CRISPR.
Detecção de proteínas
[00370] Os sistemas, dispositivos e métodos aqui divulgados também podem ser adaptados para a detecção de polipeptídeos (ou outras moléculas), além da detecção de ácidos nucleicos, via incorporação de um aptâmero de detecção de polipeptídeo configurado especificamente. Os aptâmeros de detecção de polipeptídeo são distintos dos aptâmeros do construto de mascaramento discutidos acima.
Primeiro, os aptâmeros são projetados para se ligar especificamente a uma ou mais moléculas alvo. Em um exemplo de modalidade, a molécula alvo é um polipeptídeo alvo. Em outro exemplo de modalidade, a molécula alvo é um composto químico alvo, como uma molécula terapêutica alvo. Os métodos para projetar e selecionar aptâmeros com especificidade para um determinado alvo, como SELEX, são conhecidos na técnica. Além da especificidade para um determinado alvo, os aptâmeros são ainda projetados para incorporar um sítio de ligação ao promotor da RNA polimerase. Em certas modalidades de exemplo, o promotor de RNA polimerase é um promotor T7. Antes de ligar a ligação do apatâmero a um alvo, o local da RNA polimerase não é acessível ou, de outro modo, reconhecível pela RNA polimerase. No entanto, o aptâmero é configurado para que, após a ligação de um alvo, a estrutura do aptâmero sofra uma alteração conformacional, de modo que o promotor da RNA polimerase seja então exposto. Uma sequência de aptâmero a jusante do promotor de RNA polimerase atua como um modelo para a geração de um oligonucleotídeo de RNA de gatilho por uma RNA polimerase. Assim, a porção do modelo do aptâmero pode ainda incorporar um código de barras ou outra sequência de identificação que identifique um determinado aptâmero e seu alvo. Os RNAs guia, como descrito acima, podem então ser projetados para reconhecer essas sequências oligonucleotídicas desencadeadoras específicas. A ligação dos RNAs guia aos oligonucleotídeos de gatilho ativa as proteínas efetoras de CRISPR, que passam a desativar as construções de mascaramento e a gerar um sinal detectável positivo, como descrito anteriormente.
[00371] Por conseguinte, em certas modalidades exemplares, os métodos aqui divulgados compreendem a etapa adicional de distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um conjunto de volumes discretos individuais, cada volume discreto individual compreendendo aptâmeros de detecção de peptídeos, uma proteína efetiva CRISPR, um ou mais RNAs guias, um construto de mascaramento e incubação da amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação dos aptâmeros de detecção a uma ou mais moléculas alvo, em que a ligação do aptâmero a um alvo correspondente resulta na exposição do local de ligação do promotor da RNA polimerase de modo que a síntese de um RNA gatilho seja iniciada pela ligação de uma RNA polimerase ao local de ligação do promotor da RNA polimerase.
[00372] Em outro exemplo de modalidade, a ligação do aptâmero pode expor um local de ligação do iniciador após a ligação do aptâmero a um polipeptídeo alvo. Por exemplo, o aptâmero pode expor um site de ligação ao iniciador RPA.
Assim, a adição ou inclusão do iniciador irá então alimentar uma reação de amplificação, como a reação RPA descrita acima.
[00373] Em certas modalidades exemplares, o aptâmero pode ser um aptâmero de troca de conformação, que após ligação ao alvo de interesse pode alterar a estrutura secundária e expor novas regiões do DNA de fita simples. Em certas modalidades exemplares, essas novas regiões do DNA de fita simples podem ser usadas como substratos para ligação, estendendo os aptâmeros e criando moléculas de ssDNA mais longas que podem ser detectadas especificamente usando as modalidades aqui divulgadas. O projeto do aptâmero poderia ser ainda mais combinado com complexos ternários para detecção de alvos de baixo epítopo, como a glicose (Yang et al. 2015: http://pubs. acs.
org/doi/abs/10.1021/acs. analchem. 5b01634). Exemplos de aptâmeros de mudança de conformação e RNAs guia correspondentes (crRNAs) são mostrados na Tabela 10 abaixo.
Tabela 10 Aptâmero de trombina (SEQ. I.D.No. 317) Sonda de ligação de trombina (SEQ. I.D.No. 318) Iniciador de encaminhamento 1 para trombina RPA ((SEQ. I.D.No. 319) Iniciador de encaminhamento 2 para trombina RPA (SEQ. I.D.No. 320) Iniciador reverso 1 de trombina RPA (SEQ. I.D.No. 321) CrRNA da trombina 1 (SEQ. I.D.No. 322) crRNA2 da trombina (SEQ. I.D.No. 323) crRNA3 da trombina (SEQ. I.D.No. 324) Controle de amplificador de comprimento total PTK7 (SEQ. I.D.No. 325) Aptamer PTK7 (SEQ. I.D.No. 326) Sonda de ligação PTK7 (SEQ. I.D.No. 327) Iniciador de encaminhamento 1 para PTK7RPA (SEQ. I.D.No. 328) Iniciador reverso 1 de PTK7RPA (SEQ. I.D.No. 329) PTK7 crRNA1 (SEQ. I.D.No. 330) PTK7 crRNA2 (SEQ. I.D.No. 331) PTK7 crRNA3 (SEQ. I.D.No. 332)
DISPOSITIVOSDE DIAGNÓSTICO
[00374] Os sistemas aqui descritos podem ser incorporados em dispositivos de diagnóstico. Um número de substratos e configurações pode ser usado. Os dispositivos podem ser capazes de definir vários volumes discretos individuais dentro do dispositivo. Conforme usado aqui, um "volume discreto individual" refere-se a um espaço discreto, como um contêiner, receptáculo ou outro volume ou espaço definido que pode ser definido por propriedades que impedem e/ou inibir a migração de moléculas alvo, por exemplo, um volume ou espaço definido por propriedades físicas, como paredes, por exemplo, as paredes de um poço, tubo ou superfície de uma gota, que pode ser impermeável ou semipermeável, ou como definido por outros meios como produtos químicos, taxa de difusão limitada, iluminação eletromagnética ou de luz ou qualquer combinação dos mesmos que possa conter uma amostra dentro de um espaço definido.
Volumes discretos individuais podem ser identificados por marcadores moleculares, como códigos de barras de ácidos nucleicos. Por "taxa de difusão limitada" (por exemplo, volumes definidos por difusão) entende-se espaços acessíveis apenas a certas moléculas ou reações, porque as restrições de difusão definem efetivamente um espaço ou volume, como seria o caso de duas correntes laminares paralelas em que a difusão limitará a migração de uma molécula alvo de uma corrente para a outra. Por volume ou espaço definido "químico", entende-se espaços onde apenas certas moléculas alvo podem existir devido às suas propriedades químicas ou moleculares, como tamanho, onde,
por exemplo, contas de gel podem excluir certas espécies de entrar nas contas, mas não outras, como por carga superficial, tamanho da matriz ou outras propriedades físicas do cordão que podem permitir a seleção de espécies que podem entrar no interior do cordão. Por volume ou espaço definido "eletromagneticamente" entende-se espaços onde as propriedades eletromagnéticas das moléculas alvo ou seus suportes, como propriedades de carga ou magnéticas, podem ser usadas para definir determinadas regiões em um espaço, como capturar partículas magnéticas dentro de um sistema magnético. campo ou diretamente em ímãs. Por volume definido "opticamente" entende-se qualquer região do espaço que possa ser definida iluminando-a com comprimentos de onda visíveis, ultravioleta, infravermelho ou outros comprimentos de onda, de modo que apenas moléculas alvo dentro do espaço ou volume definido possam ser rotuladas.
Uma vantagem do uso de volumes discretos sem paredes ou semipermeáveis é que alguns reagentes, como tampões, ativadores químicos ou outros agentes, podem passar pelo volume discreto, enquanto outros materiais, como moléculas alvo, podem ser mantidos em o volume ou espaço discreto.
Normalmente, um volume discreto incluirá um meio fluido (por exemplo, uma solução aquosa, um óleo, um tampão, e/ou um meio capaz de suportar o crescimento celular) adequado para a marcação da molécula alvo com o identificador de ácido nucleico indexável sob condições que permitem a marcação. Volumes ou espaços discretos exemplares úteis nos métodos divulgados incluem gotículas (por exemplo, gotículas microfluídicas e/ou gotículas de emulsão), contas de hidrogel ou outras estruturas poliméricas (por exemplo, contas de di-acrilato de polietileno glicol ou contas de agarose), lâminas de tecido (por exemplo, lâminas de tecido embebidas em parafina de formalina fixas com regiões, volumes ou espaços específicos definidos por produtos químicos, meios ópticos ou físicos), lâminas de microscópio com regiões definidas pelo depósito de reagentes em matrizes ordenadas ou padrões aleatórios, tubos (como tubos de centrifugação, tubos de microcentrífuga, tubos de ensaio, cubetas, tubos cônicos e similares), frascos (como garrafas de vidro, garrafas de plástico, garrafas de cerâmica, frascos de Erlenmeyer, frascos de cintilação e similares), poços (como os de um prato), pratos, pipetas ou pontas de pipeta, entre outros. Em certas modalidades, o compartimento é uma gota aquosa em uma emulsão de água em óleo. Em modalidades específicas, qualquer uma das aplicações, métodos ou sistemas descritos neste documento que exijam volumes exatos ou uniformes pode empregar o uso de um dispensador de líquido acústico.
[00375] Em algumas modalidades, os volumes discretos individuais podem ser gotículas.
[00376] Em certas modalidades exemplares, o dispositivo compreende um substrato de material flexível no qual um número de pontos pode ser definido. Os materiais de substrato flexíveis adequados para uso em diagnóstico e biossensibilidade são conhecidos na técnica. Os materiais de substrato flexível podem ser feitos de fibras derivadas de plantas, tais como fibras celulósicas, ou podem ser feitas de polímeros flexíveis, tais como filmes de poliéster flexíveis e outros tipos de polímeros. Dentro de cada ponto definido, os reagentes do sistema aqui descrito são aplicados aos pontos individuais. Cada ponto pode conter os mesmos reagentes, exceto um RNA guia diferente ou um conjunto de RNAs guia, ou, quando aplicável, um aptâmero de detecção diferente para rastrear vários alvos ao mesmo tempo. Assim, os sistemas e dispositivos aqui descritos podem ser capazes de rastrear amostras de várias fontes (por exemplo, várias amostras clínicas de indivíduos diferentes) quanto à presença do mesmo alvo, ou um número limitado de alvos ou alíquotas de uma única amostra (ou várias amostras da mesma fonte) para a presença de vários destinos diferentes na amostra. Em certas modalidades exemplares, os elementos dos sistemas descritos neste documento são liofilizados no substrato de papel ou pano.
Exemplos de substratos à base de material flexível que podem ser utilizados em certos dispositivos de exemplo são divulgados em Pardee et al. Cell. 2016, 165(5):1255-66 e Pardee et al. Cell. 2014, 159(4):950-54. Substratos à base de material flexível adequados para uso com fluidos biológicos, incluindo sangue, são divulgados na Publicação de Pedido de Patente Internacional WO/2013/071301, intitulado “Paper based diagnostic test” de Shevkoplyas et al. APublicação do Pedido de Patente US2011/0111517 intitulada “Paper-based microfluidic systems” de Siegel et al. and Shafiee et al. “Paper and Flexible Substrates as Materials for Biosensing Platforms to Detect Multiple Biotargets” Scientific Reports 5:8719 (2015). Outros materiais de base flexível, incluindo aqueles adequados para uso em dispositivos de diagnóstico vestíveis, são divulgados em Wang et al. “Flexible Substrate-Based Devices for Point-of-Care Diagnostics” Cell 34(11):909-21 (2016). Outros materiais de base flexível podem incluir nitrocelulose, policarbonato, metiletilcelulose, fluoreto de polivinilideno (PVDF), poliestireno ou vidro (consulte, por exemplo, US20120238008). Em certas modalidades, volumes discretos são separados por uma superfície hidrofóbica, como mas não se limitando a cera, fotorresistência ou tinta sólida.
[00377] Em algumas modalidades, pode ser fornecido um dosímetro ou crachá que serve como sensor ou indicador, de modo que o usuário seja notificado da exposição a certos micróbios ou outros agentes. Por exemplo, os sistemas aqui descritos podem ser usados para detectar um patógeno específico. Da mesma forma, as modalidades baseadas no aptâmero divulgadas acima podem ser usadas para detectar tanto o polipeptídeo quanto outros agentes, como agentes químicos, aos quais um aptâmero específico pode se ligar.
Esse dispositivo pode ser útil para a vigilância de soldados ou outros militares, assim como clínicos, pesquisadores, funcionários do hospital e semelhantes, a fim de fornecer informações relacionadas à exposição a agentes potencialmente perigosos o mais rápido possível, por exemplo, para detecção de agentes de guerra biológicos ou químicos. Em outras modalidades, esse crachá de vigilância pode ser usado para impedir a exposição a micróbios ou patógenos perigosos em pacientes imunocomprometidos, pacientes queimados, pacientes submetidos a quimioterapia, crianças ou indivíduos idosos.
[00378] Em modalidades específicas, cada volume discreto individual compreende ainda um ou mais aptâmeros de detecção compreendendo um sítio de ligação de promotor da RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação de iniciador mascarado. Como tal, cada volume discreto individual pode ainda compreender reagentes de amplificação de ácido nucleico.
[00379] Em modalidades específicas, a molécula alvo pode ser um DNA alvo e os volumes distintos individuais compreendem ainda um iniciador que liga o DNA alvo e compreende um promotor de RNA polimerase.
[00380] As fontes de amostras que podem ser analisadas usando os sistemas e dispositivos aqui descritos incluem amostras biológicas de um sujeito ou amostras ambientais. As amostras ambientais podem incluir superfícies ou fluidos. As amostras biológicas podem incluir, mas não estão limitadas a, saliva, sangue, plasma, soros, fezes, urina, escarro, mucosa, linfa, líquido sinovial, líquido espinhal, líquido cefalorraquidiano, um cotonete da pele ou membrana mucosa ou combinação disso. Em uma modalidade exemplar, a amostra ambiental é retirada de uma superfície sólida, tal como uma superfície usada na preparação de alimentos ou outras composições e materiais sensíveis.
[00381] Em outras modalidades de exemplo, os elementos dos sistemas aqui descritos podem ser colocados em um substrato de uso único, como cotonete ou pano que é usado para esfregar uma superfície ou amostra de fluido.
Por exemplo, o sistema poderia ser usado para testar a presença de um patógeno em um alimento limpando a superfície de um produto alimentar, como uma fruta ou vegetal. Da mesma forma, o substrato de uso único pode ser usado para esfregar outras superfícies para a detecção de certos micróbios ou agentes, como para o rastreamento de segurança. Os substratos de uso único também podem ter aplicações forenses, em que os sistemas CRISPR são projetados para detectar, por exemplo, a identificação de SNPs de DNA que podem ser usados para identificar um suspeito ou certos marcadores de tecido ou célula para determinar o tipo de matéria biológica presente em uma amostra . Da mesma forma, o substrato de uso único pode ser usado para coletar uma amostra de um paciente - como uma amostra de saliva da boca - ou um cotonete da pele. Em outras modalidades, uma amostra ou zaragatoa pode ser coletada de um produto de carne para detectar a presença de ausência de contaminantes no produto de carne ou dentro dele.
[00382] São necessários diagnósticos microbianos quase em tempo real para ambientes alimentares, clínicos, industriais e outros ambientes ambientais (ver, por exemplo, Lu TK, Bowers J e Koeris MS.,Trends Biotechnol.
2013Jun;31(6):325-7). Em certas modalidades, a presente invenção é usada para detecção rápida de patógenos de origem alimentar usando RNAs guia específicos de um patógeno (por exemplo, Campylobacter jejuni, Clostridium perfringens, Salmonella spp.,Escherichia coli, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Shigella spp.,Staphylococcus aureus,Enterite estafilocócica,
estreptococo, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica e Yersinia pseudotuberculosis, Brucella spp.,Corynebacterium ulcerans, Coxiella burnetii ou Plesiomonas shigelloides).
[00383] Em certas modalidades, o dispositivo é ou compreende uma faixa de fluxo. Por exemplo, uma faixa de fluxo lateral permite a detecção de RNAse (por exemplo, C2c2) por cor. O repórter de RNA é modificado para ter uma primeira molécula (como, por exemplo, FITC) ligada à extremidade 5 'e uma segunda molécula (como, por exemplo, biotina) ligada à extremidade 3' (ou vice-versa). A tira de fluxo lateral é projetada para ter duas linhas de captura com anticorpos anti-primeira molécula (por exemplo, anti- FITC) hibridados na primeira linha e anticorpos anti- segunda molécula (por exemplo, anti-biotina) na segunda linha a jusante. À medida que a reação flui pela tira, o repórter não clivado se liga aos anticorpos anti-primeira molécula na primeira linha de captura, enquanto os repórteres clivados liberam a segunda molécula e permitem a ligação da segunda molécula na segunda linha de captura. Os anticorpos sanduíche da segunda molécula, por exemplo, conjugados com nanopartículas, como as nanopartículas de ouro, ligam qualquer segunda molécula na primeira ou na segunda linha e resultam em uma forte readout/signal (por exemplo, cor). À medida que mais repórter é clivado, mais sinal se acumula na segunda linha de captura e menos sinal aparece na primeira linha. Em certos aspectos, a invenção refere-se ao uso de uma faixa a seguir, como aqui descrito para a detecção de ácidos nucleicos ou polipeptídeos. Em certos aspectos, a invenção refere-se a um método para detectar ácidos nucleicos ou polipeptídeos com uma faixa de fluxo como aqui definido, por exemplo, testes de fluxo (lateral) ou ensaios imunocromatográficos de fluxo (lateral).
[00384] As modalidades divulgadas neste documento são direcionadas a dispositivos de detecção de fluxo lateral que compreendem sistemas SHERLOCK. O dispositivo pode compreender um substrato de fluxo lateral para detectar uma reação SHERLOCK. Os substratos adequados para uso em ensaios de fluxo lateral são conhecidos na técnica.
Isso pode incluir, mas não se limita necessariamente a membranas ou compressas feitas de celulose e/ou fibra de vidro, poliésteres, nitrocelulose ou compressas absorventes (JSaudi Chem Soc 19 (6): 689-705; 2015). O sistema SHERLOCK, isto é, um ou mais sistemas CRISPR e construções repórter correspondentes são adicionados ao substrato de fluxo lateral em uma porção de reagente definida do substrato de fluxo lateral, tipicamente em uma extremidade do substrato de fluxo lateral. As construções de relatório usadas dentro do contexto da presente invenção compreendem uma primeira molécula e uma segunda molécula ligada por um ligante de RNA ou DNA.
O substrato de fluxo lateral compreende ainda uma porção de amostra.
A porção de amostra pode ser equivalente a, contínua com ou ajustada à porção de reagente.
A faixa de fluxo lateral compreende ainda uma primeira linha de captura, tipicamente uma linha horizontal que atravessa o dispositivo, mas outras configurações são possíveis.
A primeira região de captura está próxima e na mesma extremidade do substrato de fluxo lateral que a porção de carregamento da amostra.
Um primeiro agente de ligação que se liga especificamente à primeira molécula do construto repórter é fixo ou de outro modo imobilizado na região de captura do punho.
A segunda região de captura está localizada na extremidade oposta do substrato de fluxo lateral da primeira região de ligação.
Um segundo agente de ligação é fixo ou de outro modo imobilizado na segunda região de captura.
O segundo agente de ligação se liga especificamente à segunda molécula do construto repórter,
ou o segundo agente de ligação pode se ligar a um ligante detectável.
Por exemplo, o ligante detectável pode ser uma partícula, como uma partícula coloidal, que quando agregada pode ser detectada visualmente.
A partícula pode ser modificada com um anticorpo que se liga especificamente à segunda molécula no construto repórter.
Se o construto repórter não for clivado, facilitará a acumulação do ligando detectável na primeira região de ligação. Se o construto repórter é clivado, o ligando detectável é liberado para fluir para a segunda região de ligação. Em tal modalidade, o segundo agente de ligação é um agente capaz de se ligar específica ou não especificamente ao ligante detectável no anticorpo no ligante detectável.
Exemplos de agentes de ligação adequados para tal modalidade incluem, mas não estão limitados a, proteína A e proteína G.
[00385] Os substratos de suporte lateral podem estar localizados dentro de um alojamento (consulte, por exemplo, "Tiras de teste de fluxo lateral rápido" Merck Millipore 2013). O alojamento pode compreender pelo menos uma abertura para carregar amostras e uma segunda abertura única ou aberturas separadas que permitem a leitura do sinal detectável gerado na primeira e na segunda regiões de captura.
[00386] O sistema SHERLOCK pode ser liofilizado no substrato de fluxo lateral e embalado como um dispositivo pronto para uso, ou o sistema SHERLOCK pode ser adicionado à porção de reagente do substrato de fluxo lateral no momento da utilização do dispositivo. As amostras a serem rastreadas são carregadas na porção de carregamento de amostra do substrato de fluxo lateral. As amostras devem ser amostras líquidas ou dissolvidas em um solvente apropriado, geralmente aquoso.
A amostra líquida reconstitui os reagentes SHERLOCK, de forma que uma reação
SHERLOCK possa ocorrer.
A amostra líquida começa a fluir da parte da amostra do substrato para a primeira e a segunda regiões de captura.
O construto repórter intacto é ligado na primeira região de captura pela ligação entre o primeiro agente de ligação e a primeira molécula.
Da mesma forma, o agente de detecção começará a coletar na primeira região de ligação, ligando a segunda molécula no construto repórter intacta.
Se moléculas alvo estiverem presentes na amostra,
o efeito colateral da proteína efetora CRISPR é ativado.
À medida que a proteína efetora CRISPR ativada entra em contato com o construto repórter ligada, as construções repórter são clivadas, liberando a segunda molécula para fluir ainda mais abaixo do substrato de fluxo lateral em direção à segunda região de ligação.
A segunda molécula liberada é então capturada na segunda região de captura por ligação ao segundo agente de ligação, onde um agente de detecção adicional também pode se acumular por ligação à segunda molécula.
Consequentemente, se a (s) molécula (s)
alvo (s) não estiver presente na amostra, um sinal detectável aparecerá na primeira região de captura e se a molécula (s) alvo estiver presente na amostra, um sinal detectável aparecerá no local de a segunda região de captura.
[00387] Moléculas integradoras de ligação específicas compreendem quaisquer membros de pares de ligação que podem ser utilizados na presente invenção. Tais pares de ligação são conhecidos dos especialistas na técnica e incluem, mas não estão limitados a, pares anticorpo-antígeno, pares enzima-substrato, pares receptor- ligante e estreptavidina-biotina. Além desses pares de ligação conhecidos, novos pares de ligação podem ser projetados especificamente. Uma característica dos pares de ligação é a ligação entre os dois membros do par de ligação.
[00388] Os ligantes oligonucleotídicos que possuem moléculas em cada extremidade podem compreender DNA se a proteína efetiva CRISPR tiver atividade colateral de DNA (Cpf1 e C2c1) ou RNA se a proteína efetiva CRISPR tiver atividade colateral de RNA. Os ligantes de oligonucleotídeo podem ser de fita simples ou dupla e, em certas modalidades, eles podem conter regiões de RNA e DNA. Os ligantes oligonucleotídicos podem ter comprimentos variados, como 5-10 nucleotídeos, 10-20 nucleotídeos, 20-50 nucleotídeos ou mais.
[00389] Em algumas modalidades, os elementos identificadores de polipeptídeo incluem etiquetas de afinidade, como etiquetas de hemaglutinina (HA), etiquetas Myc, etiquetas FLAG, etiquetas V5, etiquetas de proteína de ligação à quitina (CBP), etiquetas de proteína de ligação à maltose (MBP), etiquetas GST, etiquetas poli - Suas tags e proteínas fluorescentes (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciana (CFP), dsRed, mCherry, Kaede, Kindling e seus derivados, tags FLAG, tags Myc, Etiquetas AU1, etiquetas T7, etiquetas OLLAS, etiquetas Glu-Glu, etiquetas VSV ou uma combinação das mesmas. Outras etiquetas de afinidade são bem conhecidas na técnica. Tais marcadores podem ser detectados e/ou isolados usando métodos conhecidos na técnica (por exemplo, usando agentes de ligação específicos, como anticorpos, que reconhecem uma determinada etiqueta de afinidade). Tais agentes de ligação específicos (por exemplo, anticorpos) podem ainda conter, por exemplo, marcadores detectáveis, como marcadores isotópicos e/ou códigos de barras de ácidos nucleicos, como os aqui descritos.
[00390] Por exemplo, uma tira de fluxo lateral permite a detecção de RNAse (por exemplo, Cas13a) por cor.
O repórter de RNA é modificado para ter uma primeira molécula (como, por exemplo, FITC) ligada à extremidade 5'e uma segunda molécula (como, por exemplo, biotina) ligada à extremidade 3' (ou vice-versa). A tira de fluxo lateral é projetada para ter duas linhas de captura com anticorpos anti-primeira molécula (por exemplo, anti-FITC) hibridados na primeira linha e anticorpos anti-segunda molécula (por exemplo, anti-biotina) na segunda linha a jusante. À medida que a reação SHERLOCK flui pela tira, o repórter não clivado se liga aos anticorpos anti-primeira molécula na primeira linha de captura, enquanto os repórteres clivados liberam a segunda molécula e permitem a ligação da segunda molécula na segunda linha de captura. Os anticorpos sanduíche da segunda molécula, por exemplo, conjugados com nanopartículas, como as nanopartículas de ouro, ligam qualquer segunda molécula na primeira ou na segunda linha e resultam em uma forte readout/signal (por exemplo, cor). À medida que mais repórter é clivado, mais sinal se acumula na segunda linha de captura e menos sinal aparece na primeira linha. Em certos aspectos, a invenção refere-se ao uso de uma faixa a seguir, como aqui descrito para a detecção de ácidos nucleicos ou polipeptídeos. Em certos aspectos, a invenção refere-se a um método para detectar ácidos nucleicos ou polipeptídeos com uma faixa de fluxo como aqui definido, por exemplo, testes de fluxo (lateral) ou ensaios imunocromatográficos de fluxo (lateral).
[00391] Em certas modalidades exemplares, um dispositivo de fluxo lateral compreende um substrato de fluxo lateral compreendendo uma primeira extremidade para aplicação de uma amostra. A primeira região é carregada com um ligante detectável, como os aqui divulgados, por exemplo, uma nanopartícula de ouro.
A nanopartícula de ouro pode ser modificada com um primeiro anticorpo, como um anticorpo anti-FITC.
A primeira região também compreende um construto de detecção.
Em uma modalidade exemplar, um construto de detecção de RNA e um sistema efetor CRISPR
(uma proteína efetora CRISPR e uma ou mais sequências guia configuradas para se ligarem a uma ou mais sequências alvo), como divulgado aqui.
Em uma modalidade exemplar, e para fins de ilustração adicional, o construto de RNA pode compreender uma molécula de FAM em uma primeira extremidade do construto de detecção e uma biotina em uma segunda extremidade do construto de detecção.
A montante do fluxo da solução a partir da primeira extremidade do substrato do fluxo lateral é uma primeira banda de teste.
A banda de teste pode compreender um ligando de biotina.
Assim, quando o construto de detecção de RNA está presente, seu estado inicial, ou seja, na ausência de alvo, a molécula FAM na primeira extremidade liga o anticorpo anti-FITC na nanopartícula de ouro e a biotina na segunda extremidade do
RNA.
O construto ligará o ligando de biotina, permitindo que o ligando detectável se acumule no primeiro teste,
gerando um sinal detectável.
A geração de um sinal detectável na primeira banda indica a ausência do ligando alvo.
Na presença do alvo, o complexo efetor de CRISPR se forma e a proteína efetora de CRISPR é ativada, resultando na clivagem do construto de detecção de RND. Na ausência de detecção intacta de RNA, o ouro coloidal fluirá além da segunda tira. O dispositivo de fluxo lateral pode compreender uma segunda banda, a montante da primeira banda. A segunda banda pode compreender uma molécula capaz de se ligar à molécula de ouro coloidal marcada com anticorpo, por exemplo, um tampão de anticorpo anti-coelho de se ligar a um anticorpo anti-FTIC de coelho no ouro coloidal. Portanto, na presença de um ou mais alvos, o ligante detectável se acumulará na segunda banda, indicando a presença de um ou mais alvos na amostra.
[00392] Em certas modalidades de exemplo, o dispositivo é um dispositivo microfluídico que gera e/ou mescla diferentes gotículas (ou seja, volumes discretos individuais). Por exemplo, um primeiro conjunto de gotículas pode ser formado contendo amostras a serem rastreadas e um segundo conjunto de gotículas formadas contendo os elementos dos sistemas aqui descritos. O primeiro e o segundo conjunto de gotículas são então mesclados e, em seguida, os métodos de diagnóstico descritos aqui são realizados no conjunto de gotículas mescladas. Os dispositivos microfluídicos aqui divulgados podem ser chips à base de silicone e podem ser fabricados usando uma variedade de técnicas, incluindo, entre outros, estampagem a quente, moldagem de elastômeros, moldagem por injeção, LIGA, litografia macia, fabricação de silício e técnicas de processamento de filmes finos relacionadas . Os materiais adequados para a fabricação dos dispositivos microfluídicos incluem, mas não estão limitados a, copolímero de olefina cíclica (COC), policarbonato, poli (dimetilsiloxano) (PDMS) e poli (metilacrilato) (PMMA).
Numa modalidade, a litografia macia em PDMS pode ser usada para preparar os dispositivos microfluídicos. Por exemplo, um molde pode ser feito usando fotolitografia que define a localização de canais de fluxo, válvulas e filtros dentro de um substrato. O material do substrato é derramado em um molde e permitido a criação de um carimbo. Ocarimbo é então selado em um suporte sólido, como, sem limitação, vidro.
Devido à natureza hidrofóbica de alguns polímeros, como o PDMS, que absorve algumas proteínas e pode inibir certos processos biológicos, pode ser necessário um agente passivador (Schoffner et al. Nucleic Acids Research, 1996, 24:375-379). Os agentes passivantes adequados são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, silanos, parileno, n-Dodecil-bD-matosídeo (DDM), plurônico, Tween-20, outros surfactantes semelhantes, polietileno glicol (PEG), albumina, colágeno e outras proteínas e peptídeos semelhantes.
[00393] Em certas modalidades de exemplo, o sistema e/ou o dispositivo pode ser adaptado para conversão em uma leitura de citometria de fluxo ou permitir todas as medições quantitativas e sensíveis de milhões de células em uma única experiência e aprimorar os métodos baseados em fluxo existentes, como o ensaio PrimeFlow. Em certas modalidades exemplares, as células podem ser moldadas em gotículas contendo monômero de gel não polimerizado, que podem então ser moldadas em gotículas de célula única adequadas para análise por citometria de fluxo. Um construto de detecção compreendendo um marcador detectável fluorescente pode ser lançada na gota compreendendo monômero de gel não polimerizado. Após polimerização do monômero de gel para formar um cordão dentro de uma gota.
Como a polimerização em gel ocorre através da formação de radicais livres, o repórter fluorescente fica covalentemente ligado ao gel. O construto de detecção pode ser ainda modificado para compreender um ligante, como uma amina. Um extintor pode ser adicionado formação pós-gel e se ligará através do ligante ao construto repórter. Assim, o inibidor não está ligado ao gel e é livre para se difundir quando o repórter é clivado pela proteína efetora CRISPR. A amplificação do sinal na gotícula pode ser alcançada acoplando o construto de detecção a uma amplificação da reação em cadeia de hibridação (iniciador de HCR). DNA/RNA grampos de cabelo híbridos podem ser incorporados no gel que pode compreender um laço em hairpin que possui um domínio sensível à RNase. Ao proteger um suporte de deslocamento de fita dentro de uma alça de hairpin que possui um domínio sensível à RNase, os iniciadores de HCR podem ser desprotegidos seletivamente após a clivagem da alça de hairpin pela proteína efetora CRISPR. Após a desproteção dos iniciadores de HCR através do deslocamento da fita mediada por suporte, os monômeros de HCR fluorescentes podem ser lavados em gel para permitir a amplificação do sinal onde os iniciadores são desprotegidos.
[00394] Um exemplo de dispositivo microfluídico que pode ser utilizado no contexto da invenção é descrito em Hour et al. “Direct Detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics” Lap Chip. 15(10):2297-2307 (2016).
[00395] Nos sistemas aqui descritos, pode ainda ser incorporado em dispositivos médicos vestíveis que avaliam amostras biológicas, como fluidos biológicos, de um sujeito fora do ambiente clínico e relatam o resultado do teste remotamente a um servidor central acessível por um profissional de assistência médica. O dispositivo pode incluir a capacidade de auto-amostrar sangue, como os dispositivos divulgados na Publicação do Pedido de Patente US2015/0342509, intitulada “Needle-free Blood Draw de Peeters et al.,Publicação do Pedido de Patente
US2015/0065821, intitulada “Nanoparticle Phoresis” de Andrew Conrad.
[00396] Em algumas modalidades, os volumes distintos individuais são micropoços.
[00397] Em certas modalidades exemplares, o dispositivo pode compreender poços individuais, como poços de microplacas. O tamanho dos poços da microplaca pode ser o tamanho dos poços de tamanho padrão 6, 24, 96, 384, 1536, 3456 ou 9600. Em certas modalidades de exemplo, os elementos dos sistemas descritos neste documento podem ser liofilizados e aplicados à superfície do poço antes da distribuição e uso.
[00398] Os dispositivos aqui divulgados podem ainda compreender orifícios de entrada e saída ou aberturas que, por sua vez, podem ser conectadas a válvulas, tubos, canais, câmaras e seringas e/ou bombas para introdução e extração de fluidos para dentro e para o dispositivo. Os dispositivos podem ser conectados a atuadores de fluxo de fluido que permitem o movimento direcional de fluidos dentro do dispositivo microfluídico. Exemplos de atuadores incluem, mas não estão limitados a, bombas de seringa, bombas de recirculação acionadas mecanicamente, bombas eletroosmóticas, lâmpadas, foles, diafragmas ou bolhas destinadas a forçar o movimento de fluidos. Em certas modalidades exemplares, os dispositivos são conectados a controladores com válvulas programáveis que trabalham juntas para mover fluidos através do dispositivo. Em certas modalidades de exemplo, os dispositivos são conectados aos controladores discutidos em mais detalhes abaixo. Os dispositivos podem ser conectados a atuadores de fluxo, controladores e dispositivos de carregamento de amostras por tubos que terminam em pinos de metal para inserção nas portas de entrada do dispositivo.
[00399] Como mostrado aqui, os elementos do sistema são estáveis quando liofilizados, portanto, também são contempladas modalidades que não requerem um dispositivo de suporte, ou seja, o sistema pode ser aplicado a qualquer superfície ou fluido que suporte as reações aqui divulgadas e permita a detecção de um sinal detectável positivo dessa superfície ou solução. Além da liofilização, os sistemas também podem ser armazenados de forma estável e utilizados em uma forma peletizada. Os polímeros úteis na formação de formas peletizadas adequadas são conhecidos na técnica.
[00400] Em algumas modalidades, os volumes distintos individuais são definidos em um substrato sólido. Em algumas modalidades, os volumes distintos individuais são pontos definidos em um substrato. Em algumas modalidades, o substrato pode ser um substrato de materiais flexíveis, por exemplo, incluindo, mas não limitado a, um substrato de papel, um substrato de tecido ou um substrato flexível à base de polímero. Em modalidades específicas, o substrato de materiais flexíveis é um substrato de papel ou um substrato flexível à base de polímero.
[00401] Em certas modalidades, a proteína efetora CRISPR é ligada a cada volume discreto no dispositivo. Cada volume discreto pode compreender um RNA guia diferente, específico para uma molécula alvo diferente. Em certas modalidades, uma amostra é exposta a um substrato sólido compreendendo mais de um volume discreto cada um compreendendo um RNA guia específico para uma molécula alvo. Não estando limitado por uma teoria, cada RNA guia capturará sua molécula alvo da amostra e a amostra não precisará ser dividida em ensaios separados. Assim, uma amostra valiosa pode ser preservada. A proteína efetora pode ser uma proteína de fusão compreendendo um marcador de afinidade. As tags de afinidade são bem conhecidas na arte (por exemplo, tag HA, tag Myc, tag Flag, tag His, biotina).
A proteína efetora pode estar ligada a uma molécula de biotina e os volumes discretos podem compreender estreptavidina. Em outras modalidades, a proteína efetora CRISPR é ligada por um anticorpo específico para a proteína efetora. Os métodos de ligação a uma enzima CRISPR foram descritos anteriormente (ver, por exemplo, US20140356867A1).
[00402] Os dispositivos aqui divulgados também podem incluir elementos de dispositivos de ponto de atendimento (POC) conhecidos na técnica para analisar amostras por outros métodos. Veja, por exemplo, St John e Price, "Tecnologias existentes e emergentes para testes no local de atendimento" (Clin Biochem Rev. 2014Aug; 35 (3): 155- 167).
[00403] A presente invenção pode ser usada com um sistema de sensor de diagnóstico sem fio de laboratório em chip (LOC) (ver, por exemplo, número de patente US9.470.699 "Sensores de diagnóstico por radiofrequência e aplicações dos mesmos"). Em certas modalidades, a presente invenção é realizada em um LOC controlado por um dispositivo sem fio (por exemplo, um telefone celular, um assistente digital pessoal (PDA), um tablet) e os resultados são relatados ao referido dispositivo.
[00404] Os sistemas de etiquetas de identificação por radiofrequência (RFID) incluem uma etiqueta RFID que transmite dados para recepção por um leitor RFID(também conhecido como interrogador). Em um sistema RFID típico, objetos individuais (por exemplo, mercadoria da loja) são equipados com uma etiqueta relativamente pequena que contém um transponder. O transponder possui um chip de memória que recebe um código eletrônico exclusivo do produto. O leitor RFID emite um sinal ativando o transponder dentro da etiqueta através do uso de um protocolo de comunicação. Por conseguinte, o leitor RFID é capaz de ler e gravar dados na etiqueta. Além disso, o leitor de etiquetas RFID processa os dados de acordo com o aplicativo do sistema de etiquetas RFID. Atualmente, existem tags RFID do tipo passivo e ativo. A etiqueta RFID do tipo passivo não contém uma fonte de energia interna, mas é alimentada por sinais de radiofrequência recebidos do leitor RFID. Como alternativa, a etiqueta RFID do tipo ativo contém uma fonte de energia interna que permite que a etiqueta RFID do tipo ativo possua maiores faixas de transmissão e capacidade de memória. O uso de um tag passivo versus um tag ativo depende do aplicativo específico.
[00405] A tecnologia Lab-on-the-chip está bem descrita na literatura científica e consiste em vários canais microfluídicos, poços de entrada ou químicos. As reações nos poços podem ser medidas usando a tecnologia de identificação por radiofrequência (RFID), uma vez que os condutores condutivos do chip eletrônico RFID podem ser vinculados diretamente a cada um dos poços de teste. Uma antena pode ser impressa ou montada em outra camada do chip eletrônico ou diretamente na parte traseira do dispositivo.
Além disso, os fios, a antena e o chip eletrônico podem ser incorporados ao chip LOC, impedindo assim o curto-circuito dos eletrodos ou eletrônicos. Como o LOC permite análises e separação complexas de amostras, essa tecnologia permite que os testes LOC sejam realizados independentemente de um leitor complexo ou caro. Em vez disso, pode ser usado um dispositivo sem fio simples, como um telefone celular ou um PDA. Numa modalidade, o dispositivo sem fio também controla a separação e o controle dos canais microfluídicos para análises LOC mais complexas. Numa modalidade, um LED e outros dispositivos eletrônicos de medição ou detecção estão incluídos no chip LOC-RFID. Não estando vinculada a uma teoria, essa tecnologia é descartável e permite que testes complexos que exijam separação e mistura sejam realizados fora de um laboratório.
[00406] Em modalidades preferidas, o LOC pode ser um dispositivo microfluídico. OLOC pode ser um chip passivo, em que o chip é alimentado e controlado através de um dispositivo sem fio. Em certas modalidades, o LOC inclui um canal microfluídico para reter reagentes e um canal para introdução de uma amostra. Em certas modalidades, um sinal do dispositivo sem fio fornece energia ao LOC e ativa a mistura da amostra e dos reagentes de ensaio.
Especificamente, no caso da presente invenção, o sistema pode incluir um agente de mascaramento, proteína efetora CRISPR e RNAs guia específicos para uma molécula alvo. Após a ativação do LOC, o dispositivo microfluídico pode misturar a amostra e reagir o ensaio. Após a mistura, um sensor detecta um sinal e transmite os resultados para o dispositivo sem fio. Em certas modalidades, o agente desde mascaramento é uma molécula de RNA condutora. A molécula de RNA condutora pode ser anexada ao material condutor. As moléculas condutoras podem ser nanopartículas condutoras, proteínas condutoras, partículas de metal que estão ligadas à proteína ou látex ou outras esferas condutoras. Em certas modalidades, se DNA ou RNA for usado, as moléculas condutoras podem ser conectadas diretamente às fitas de DNA ou RNA correspondentes. A liberação das moléculas condutoras pode ser detectada através de um sensor. O ensaio pode ser um processo de uma etapa.
[00407] Como a condutividade elétrica da área da superfície pode ser medida, resultados quantitativos precisos são possíveis nos eletroensaios de RFID sem fio descartáveis. Além disso, a área de teste pode ser muito pequena, permitindo que mais testes sejam feitos em uma determinada área e, portanto, resultando em economia de custos. Em certas modalidades, sensores separados, cada um associado a uma proteína efetora CRISPR diferente e o RNA guia imobilizado em um sensor, são usados para detectar várias moléculas alvo. Não estando limitado por uma teoria, a ativação de diferentes sensores pode ser diferenciada pelo dispositivo sem fio.
[00408] Além dos métodos condutivos descritos neste documento, outros métodos podem ser usados que se baseiam em RFID ou Bluetooth como plataforma básica de comunicação e energia de baixo custo para um ensaio de RFID descartável. Por exemplo, meios ópticos podem ser utilizados para avaliar a presença e o nível de uma dada molécula alvo. Em certas modalidades, um sensor óptico detecta o desmascaramento de um agente de mascaramento fluorescente.
[00409] Em certas modalidades, o dispositivo da presente invenção pode incluir dispositivos portáteis para leitura de diagnóstico de um ensaio (ver, por exemplo, Vashist et al.,Dispositivos comerciais baseados em smartphones e aplicativos inteligentes para monitoramento e gerenciamento de assistência médica personalizados, Diagnostics 2014, 4(3), 104-128; mReader do Mobile Assay; e Holomic Rapid Diagnostic Test Reader).
[00410] Como observado neste documento, certas modalidades permitem a detecção via alteração colorimétrica que possui certos benefícios associados quando as modalidades são utilizadas em situações de POC e ou em ambientes com poucos recursos, onde o acesso a equipamentos de detecção mais complexos para ler o sinal pode ser limitado. No entanto, modalidades portáteis divulgadas neste documento também podem ser acopladas a espectrofotômetros portáteis que permitem a detecção de sinais fora da faixa visível. Um exemplo de um dispositivo espectrofotômetro portátil que pode ser usado em combinação com a presente invenção é descrito em Das et al. “Ultra- portable, wireless smartphone spectrophotometer for rapid, non-destructive testing of fruit ripeness. ” Nature Scientific Reports. 2016, 6:32504, DOI: 10. 1038/srep32504.
Finalmente, em certas modalidades que utilizam construções de mascaramento baseadas em pontos quânticos, o uso de uma luz UV portátil ou outro dispositivo adequado pode ser usado com sucesso para detectar um sinal devido ao rendimento quântico quase completo fornecido por pontos quânticos.
MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ALVO
[00411] O baixo custo e a adaptabilidade da plataforma de teste se prestam a várias aplicações, incluindo (i) RNA/DNA/protein quantificação, (ii) rápida, multiplexada RNA/DNA e detecção de expressão de proteínas e (iii) detecção sensível de ácidos nucleicos, peptídeos e proteínas alvo em amostras clínicas e ambientais. Além disso, os sistemas aqui divulgados podem ser adaptados para detecção de transcritos dentro de configurações biológicas, como células. Dada a natureza altamente específica dos efetores de CRISPR aqui descritos, pode ser possível rastrear a expressão específica alélica de transcritos ou mutações associadas a doenças em células vivas.
[00412] Em algumas modalidades, os métodos incluem a detecção de ácidos nucleicos alvo em amostras, compreendendo distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes discretos individuais, compreendendo um sistema CRISPR, como aqui descrito. A amostra ou conjunto de amostras pode então ser incubada sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, e a proteína efetora CRISPR pode ser ativada através da ligação de um ou mais RNAs guia àquele ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseada em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado. O um ou mais sinais positivos detectáveis podem então ser detectados, com a detecção indicando a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.
[00413] Em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem detectar polipeptídeos em amostras, compreendendo distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um conjunto de volumes distintos individuais compreendendo aptâmeros de detecção de peptídeos e um sistema CRISPR como descrito aqui. A amostra ou conjunto de amostras pode então ser incubada sob condições suficientes para permitir a ligação dos aptâmeros de detecção de peptídeo a uma ou mais moléculas alvo, em que a ligação do aptâmero a uma molécula alvo correspondente expõe o local de ligação à RNA polimerase ou o local de ligação ao iniciador resultante na geração de um RNA gatilho. A proteína efetora de RNA pode então ser ativada através da ligação de um ou mais RNAs guia ao RNA gatilho, em que a ativação da proteína efetora de RNA resulta na modificação do construto de mascaramento baseada em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido. O sinal positivo detectável pode então ser detectado, com a detecção do sinal positivo detectável indicando a presença de uma ou mais moléculas alvo em uma amostra.
[00414] Em certas modalidades de exemplo, uma única sequência guia específica para um único alvo é colocada em volumes separados. Cada volume pode então receber uma amostra ou alíquota diferente da mesma amostra. Em certas modalidades de exemplo, várias sequências guia, cada uma para separar o alvo, podem ser colocadas em um único poço, de modo que vários alvos possam ser rastreados em um poço diferente. A fim de detectar vários RNAs guia em um único volume, em certas modalidades de exemplo, várias proteínas efetoras com diferentes especificidades podem ser usadas.
[00415] Nas modalidades, diferentes ortólogos com diferentes especificidades de sequência podem ser utilizados. Motivos de corte podem ser usados para tirar proveito das especificidades de sequência de diferentes ortólogos. O construto de mascaramento pode compreender um motivo de corte cortado preferencialmente por uma proteína Cas. Uma sequência de motifs de corte pode ser uma base nucleotídica específica, uma base nucleotídica repetida em um homopolímero ou um heteropolímero de bases. O motivo de corte pode ser uma sequência dinucleotídica, uma sequência trinucleotídica ou motivos mais complexos compreendendo 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 motivos nuleotídicos. Por exemplo, um ortólogo pode preferencialmente cortar A, enquanto outros preferencialmente cortam C, G, U/ T. Por conseguinte, podem ser geradas construções de mascaramento que compreendem completamente, ou compreendem uma porção substancial, de um único nucleotídeo, cada uma com um fluoróforo diferente que pode ser detectado em diferentes comprimentos de onda.
Dessa maneira, até quatro alvos diferentes podem ser rastreados em um único volume individual. Em certas modalidades exemplares, ortólogos diferentes de uma mesma classe de proteína efetora CRISPR podem ser utilizados, como dois ortólogos Cas13a, dois ortólogos Cas13b ou dois ortólogos Cas13c. As preferências de nucleotídeos de várias proteínas Cas13 são mostradas na FIG. 67Em certas outras modalidades de exemplo, diferentes ortólogos com diferentes preferências de edição de nucleotídeos podem ser usados, como os ortólogos Cas13a e Cas13b, ou os ortólogos Cas13a e Cas13c, ou os ortólogos Cas13b e os ortólogos Cas13c etc.
Em certas modalidades de exemplo, uma proteína Cas13 com uma preferência polyU e uma proteína Cas13 com uma preferência polyA são usadas. Em certas modalidades exemplares, a proteína Cas13 com uma preferência polyU é uma Prevotella intermedia Cas13b e a proteína Cas13 com uma preferência polyA é uma Prevotella sp. MA2106 proteína Cas13b (PsmCas13b). Em certas modalidades de exemplo, a proteína Cas13 com uma preferência polyU é uma proteína Leptotrichia wadei Cas13a (LwaCas13a) e a proteína Cas13 com uma preferência poli A é uma proteina Prevotella sp.
Proteína MA2106Cas13b. Em certas modalidades exemplares, a proteína Cas13 com uma preferência poliU é a proteína Cas13b de Capnocytophaga canimorsus (CcaCas13b).
[00416] Além das preferências de edição de base única, construções de detecção adicionais podem ser projetadas com base em outras preferências de corte de motivo dos ortólogos Cas13 e Cas12. Por exemplo, os ortólogos Cas13 ou Cas12 podem cortar preferencialmente uma sequência dinucleotídica, uma sequência trinucleotídica ou motivos mais complexos compreendendo 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 motivos nuleotídicos. Como exemplo, LwaCas13a mostrou forte preferência por sequências de motivos hexanucleotídicos, com CcaCas13b mostrando forte preferência por outros motivos hexanucleotídicos, como mostrado na FIG. 89D.
Assim, o limite superior para ensaios multiplex utilizando as modalidades divulgadas neste documento é principalmente limitado pelo número de etiquetas detectáveis distinguíveis e pelos canais de detecção necessários para detectá-los. Em certas modalidades exemplares, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,25, 25, 27, 28, 29 ou 30 destinos diferentes são detectados.
Métodos de exemplo para identificar esses motivos são divulgados adicionalmente nos Exemplos de Trabalho abaixo.
[00417] Como demonstrado aqui, os sistemas efetores CRISPR são capazes de detectar concentrações atomolares de moléculas alvo. Ver, por exemplo, FIGs. 13, 14, 19, 22 e os Exemplos de Trabalho descritos abaixo. Devido à sensibilidade dos referidos sistemas, várias aplicações que requerem detecção rápida e sensível podem se beneficiar das modalidades divulgadas neste documento e são contempladas como estando dentro do escopo da invenção. Os ensaios e aplicações de exemplo são descritos em mais detalhes abaixo.
[00418] Em modalidades específicas, a molécula alvo pode ser um DNA alvo e o método pode ainda compreender ligar o DNA alvo a um iniciador compreendendo um sítio de RNA polimerase, como aqui descrito.
[00419] Em modalidades específicas, o um ou mais RNAs guia podem ser projetados para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo em um RNA ou DNA alvo ou em uma variante de emenda de um transcrito de RNA.
[00420] Modalidades específicas envolvem amplificar o RNA da amostra ou o RNA gatilho, conforme descrito aqui.
Como descrito em detalhes neste documento, os métodos para amplificar o RNA incluem, mas não estão necessariamente limitados a, NASBA, RPA, LAMP, SDA, HDA, NEAR, PCR, MDA, RCA, LCR ou RAM. Em modalidades específicas, o RNA pode ser amplificado por NASBA ou RPA.
[00421] Uma amostra para uso com a invenção pode ser uma amostra biológica ou ambiental, como uma amostra de alimentos (frutas ou vegetais frescos, carnes), uma amostra de bebida, uma superfície de papel, uma superfície de tecido, uma superfície de tecido, uma superfície de metal, uma superfície de madeira, uma superfície plástica, uma amostra de solo, uma amostra de água doce, uma amostra de águas residuais, uma amostra de água salina, exposição ao ar atmosférico ou a outra amostra de gás ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, superfícies domésticas/comerciais/industriais feitas de qualquer material, incluindo, mas não limitado a, metal, madeira, plástico, borracha ou semelhantes, podem ser esfregadas e testadas quanto a contaminantes. As amostras de solo podem ser testadas quanto à presença de bactérias ou parasitas patogênicos ou outros micróbios, tanto para fins ambientais quanto para testes em humanos, animais ou plantas. Amostras de água, como amostras de água doce, amostras de águas residuais ou amostras de água salina, podem ser avaliadas quanto à limpeza e segurança, e/ou potabilidade, para detectar a presença de, por exemplo, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia ou outra contaminação microbiana.
Em outras modalidades, uma amostra biológica pode ser obtida de uma fonte incluindo, mas não se limitando a, uma amostra de tecido, saliva, sangue, plasma, soros, fezes, urina, escarro, mucosa, linfa, fluido sinovial, líquido cefalorraquidiano, ascite, derrame pleural, seroma, pus, bile, humor aquoso ou vítreo, transudato, exsudato ou cotonete de pele ou superfície da membrana mucosa. Em algumas modalidades particulares, uma amostra ambiental ou amostras biológicas podem ser amostras brutas e/ou a uma ou mais moléculas alvo não podem ser purificadas ou amplificadas a partir da amostra antes da aplicação do método. A identificação de micróbios pode ser útil e/ou necessária para qualquer número de aplicações e, portanto, qualquer tipo de amostra de qualquer fonte considerada apropriada por um versado na técnica pode ser usada de acordo com a invenção.
[00422] Em algumas modalidades, o um ou mais RNAs guia podem ser projetados para se ligarem a ácidos nucleicos livres de células. Em algumas modalidades, o um ou mais RNAs guia podem ser projetados para detectar um único polimorfismo de nucleotídeo em um RNA ou DNA alvo ou em uma variante de emenda de um transcrito de RNA. Em algumas modalidades, o um ou mais RNAs guia são projetados para se ligarem a uma ou mais moléculas alvo que são diagnósticas para um estado de doença, como descrito acima.
[00423] Em algumas modalidades, o estado da doença pode ser uma infecção, uma doença de órgão, uma doença do sangue, uma doença do sistema imunológico, um câncer, uma doença do cérebro e do sistema nervoso, uma doença endócrina, uma doença relacionada à gravidez ou ao parto, uma doença herdada, ou uma doença adquirida ambientalmente.
[00424] Em certas modalidades exemplares, os sistemas, dispositivos e métodos aqui divulgados são direcionados à detecção da presença de um ou mais agentes microbianos em uma amostra, como uma amostra biológica obtida de um sujeito. Em certas modalidades exemplares, o micróbio pode ser uma bactéria, um fungo, uma levedura, um protozoário, um parasita ou um vírus. Por conseguinte, os métodos aqui divulgados podem ser adaptados para uso em outros métodos (ou em combinação) com outros métodos que requerem identificação rápida de espécies de micróbios, monitorando a presença de proteínas microbianas (antígenos), anticorpos, genes de anticorpos, detecção de certos fenótipos (resistência bacteriana), monitoramento da progressão da doença e/ou surto e triagem de antibióticos.
Devido às capacidades de diagnóstico rápidas e sensíveis das modalidades divulgadas aqui, detecção do tipo de espécie de micróbio, até uma única diferença de nucleotídeo e a capacidade de ser implantada como um dispositivo POC, as modalidades divulgadas neste documento podem ser usados regimes terapêuticos guia, como seleção do antibiótico ou antiviral apropriado. As modalidades divulgadas neste documento também podem ser usadas para rastrear amostras ambientais (ar, água, superfícies, alimentos etc.) quanto à presença de contaminação microbiana.
[00425] É divulgado um método para identificar espécies microbianas, como espécies bacterianas, virais, fúngicas, leveduras ou parasitas, ou similares. Modalidades particulares divulgadas neste documento descrevem métodos e sistemas que identificarão e distinguirão espécies microbianas em uma única amostra ou em várias amostras, permitindo o reconhecimento de muitos micróbios diferentes.
Os presentes métodos permitem a detecção de patógenos e a distinção entre duas ou mais espécies de um ou mais organismos, por exemplo, bactérias, vírus, leveduras, protozoários e fungos ou uma combinação dos mesmos, em uma amostra biológica ou ambiental, detectando a presença de uma sequência alvo de ácido nucleico na amostra. Um sinal positivo obtido da amostra indica a presença do micróbio.
Múltiplos micróbios podem ser identificados simultaneamente usando os métodos e sistemas da invenção, empregando o uso de mais de uma proteína efetora, em que cada proteína efetora direciona uma sequência alvo microbiana específica.
Dessa maneira, uma análise em múltiplos níveis pode ser realizada para um sujeito em particular no qual qualquer número de micróbios pode ser detectado ao mesmo tempo. Em algumas modalidades, a detecção simultânea de múltiplos micróbios pode ser realizada usando um conjunto de sondas que podem identificar uma ou mais espécies microbianas.
[00426] A análise multiplexada de amostras permite a detecção em larga escala de amostras, reduzindo o tempo e o custo das análises. No entanto, análises multiplex são frequentemente limitadas pela disponibilidade de uma amostra biológica. De acordo com a invenção, no entanto, alternativas à análise multiplex podem ser realizadas de modo que múltiplas proteínas efetoras possam ser adicionadas a uma única amostra e cada construto de mascaramento pode ser combinada com um corante extintor separado. Nesse caso, podem ser obtidos sinais positivos de cada corante extintor separadamente para detecção múltipla em uma única amostra.
[00427] São divulgados aqui métodos para distinguir entre duas ou mais espécies de um ou mais organismos em uma amostra. Os métodos também são passíveis de detectar uma ou mais espécies de um ou mais organismos em uma amostra.
[00428] Em algumas modalidades, os métodos proporcionam a detecção de estados de doença que são caracterizados pela presença ou ausência de um gene ou transcrito ou polipeptídeo ou resistência a antibióticos ou medicamentos, de preferência em um patógeno ou célula.
[00429] Em certas modalidades, o método pode ainda compreender a comparação do sinal positivo detectável com um sinal padrão sintético, como por exemplo ilustrado em uma modalidade exemplar na FIG. 60, e como é descrito em detalhes aqui em outro lugar.
Detecção de micróbios
[00430] Em algumas modalidades, é fornecido um método para detectar micróbios em amostras compreendendo distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes distintos individuais, os volumes distintos individuais compreendendo um sistema de CRISPR como descrito aqui; incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a um ou mais alvos específicos de micróbios; ativar a proteína de efetor CRISPR através da ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína de efetor CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra. As uma ou mais moléculas alvo podem ser mRNA, gDNA (codificador ou não codificador), trRNA ou RNA compreendendo uma sequência de corrente de nucleotídeo alvo que pode ser usada para distinguir duas ou mais espécies/cepas microbianas umas das outras. Os RNAs guia podem ser projetados para detectar sequências alvo. As modalidades divulgadas neste documento também podem utilizar certas etapas para melhorar a hibridação entre o RNA guia e as sequências de RNA alvo. Métodos para melhorar a hibridação de ácido ribonucleico são divulgados em WO2015/085194, intitulado "Métodos aprimorados de hibridação com ácido ribonucleico", que é incorporado aqui por referência. O alvo específico para micróbios pode ser RNA ou DNA ou uma proteína. Se o método de DNA puder ainda compreender o uso de iniciadores de DNA que introduzem um promotor de RNA polimerase como descrito aqui. Se o alvo for uma proteína, o método utilizará aptâmeros e etapas específicas para a detecção de proteínas aqui descritas.
Detecção de variantes de nucleotídeo único
[00431] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências alvo identificadas podem ser detectadas usando RNAs guia que são específicos e se ligam à sequência alvo, conforme descrito aqui. Os sistemas e métodos da presente invenção podem distinguir até mesmo entre polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) presentes entre diferentes espécies microbianas e, portanto, o uso de vários RNAs guia de acordo com a invenção pode expandir ainda mais ou melhorar o número de sequências alvo que podem ser usado para distinguir entre espécies. Por exemplo, em algumas modalidades, o um ou mais RNAs guia podem distinguir entre micróbios nas espécies, gênero, família, ordem, classe, filo, reino ou fenótipo, ou uma combinação dos mesmos.
Detecção baseada em sequências de rRNA
[00432] Em certas modalidades exemplares, os dispositivos, sistemas e métodos aqui divulgados podem ser usados para distinguir várias espécies microbianas em uma amostra. Em certas modalidades exemplares, a identificação pode ser baseada em sequências de RNA ribossômico, incluindo as subunidades 16S, 23S e 5S. Os métodos para identificar sequências relevantes de rRNA são divulgados na publicação do pedido de patente US2017/0029872. Em certas modalidades exemplares, um conjunto de RNA guia pode ser projetado para distinguir cada espécie por uma região variável que é única para cada espécie ou cepa. Os RNAs guia também podem ser projetados para direcionar genes de RNA que distinguem micróbios nos gêneros, família, ordem, classe, filo, níveis de reino ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades exemplares em que a amplificação é usada, um conjunto de iniciadores de amplificação pode ser projetado para flanquear regiões constantes da sequência de
RNA ribossômico e um RNA guia projetado para distinguir cada espécie por uma região interna variável. Em certas modalidades exemplares, os iniciadores e os RNAs guia podem ser projetados para regiões conservadas e variáveis na subunidade 16S, respeitosamente. Outros genes ou regiões genômicas que variam exclusivamente entre espécies ou um subconjunto de espécies, como a família de genes RecA, subunidade RNA polimerase β, também podem ser usados.
Outros marcadores filogenéticos adequados, e métodos para identificar os mesmos, são discutidos, por exemplo, em Wu et al. arXiv:1307. 8690 [q-bio. GN].
[00433] Em certas modalidades de exemplo, um método ou diagnóstico é projetado para rastrear micróbios através de múltiplos filogenéticos e/ou níveis fenotípicos ao mesmo tempo. Por exemplo, o método ou diagnóstico pode compreender o uso de vários sistemas CRISPR com diferentes RNAs guia. Um primeiro conjunto de RNAs guia pode distinguir, por exemplo, entre micobactérias, bactérias gram-positivas e gram-negativas. Essas classes gerais podem ser subdivididas ainda mais. Por exemplo, os RNAs guia podem ser projetados e usados no método ou diagnóstico que distingue entérico e não entérico dentro de bactérias gram- negativas. Um segundo conjunto de RNA guia pode ser projetado para distinguir micróbios no nível de gênero ou espécie. Assim, uma matriz pode ser produzida identificando todas as micobactérias, gram-positivas e gram-negativas (divididas em entéricas e não-entéricas) com cada gênero de espécies de bactérias identificadas em uma determinada amostra que se enquadram em uma dessas classes. O precedente é apenas para fins de exemplo. Outros meios para classificar outros tipos de micróbios também são contemplados e seguiriam a estrutura geral descrita acima.
Triagem para resistência a drogas
[00434] Em certas modalidades exemplares, os dispositivos, sistemas e métodos aqui divulgados podem ser usados para rastrear genes microbianos de interesse, por exemplo, antibióticos e/ou genes de resistência antiviral.
Os RNAs guia podem ser projetados para distinguir entre genes de interesse conhecidos. Amostras, incluindo amostras clínicas, podem então ser rastreadas usando as modalidades aqui divulgadas para detecção de tais genes. A capacidade de rastrear a resistência a medicamentos no POC traria um tremendo benefício na seleção de um regime de tratamento apropriado. Em certas modalidades exemplares, os genes de resistência a antibióticos são carbapenemases incluindo KPC, NDM1, CTX-M15, OXA-48. Outros genes de resistência a antibióticos são conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, no banco de dados abrangente de resistência a antibióticos (Jia et al. “CARD2017: expansion and model- centric curation of the Comprehensive Antibiotic Resistance
Database. ”Nucleic Acids Research, 45, D566-573).
[00435] A ribavirina é um antiviral eficaz que atinge vários vírus de RNA. Vários vírus clinicamente importantes evoluíram com resistência à ribavirina, incluindo o vírus da febre aftosa doi:10. 1128/JVI. 03594- 13; vírus da poliomielite (Pfeifer e Kirkegaard. PNAS, 100 (12): 7289-7294, 2003); e vírus da hepatite C (Pfeiffer e Kirkegaard, J. Virol. 79(4):2346-2355, 2005). Vários outros vírus de RNA persistentes, como hepatite e HIV, desenvolveram resistência a drogas antivirais existentes: vírus da hepatite B (lamivudina, tenofovir, entecavir) doi: 10/1002/hep22900; vírus da hepatite C (telaprevir, BILN2061, ITMN-191, SCh6, boceprevir, AG-021541, ACH-806) doi: 10. 1002/hep. 22549; e HIV (muitas mutações de resistência a drogas) hivb. standford. edu. As modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas para detectar essas variantes entre outras.
[00436] Além da resistência à droga, há várias mutações clinicamente relevantes que podem ser detectadas com as modalidades aqui divulgadas, como infecção persistente versus aguda no LCMV (doi: 10. 1073/pnas.
1019304108), e aumento da infectividade do Ebola (Diehl et al. Cell. 2016, 167(4):1088-1098.
[00437] Como aqui descrito em outro lugar, espécies microbianas intimamente relacionadas (por exemplo, tendo apenas uma única diferença de nucleotídeo em uma determinada sequência alvo) podem ser distinguidas pela introdução de uma incompatibilidade sintética no gRNA.
Definir abordagens de capa
[00438] Em modalidades particulares, um conjunto de RNAs guia é projetado que pode identificar, por exemplo, todas as espécies microbianas dentro de um conjunto definido de micróbios. Em certas modalidades de exemplo, os métodos para gerar RNAs guia, conforme descrito neste documento, podem ser comparados aos métodos divulgados em WO2017/040316, aqui incorporado por referência. Como descrito no documento WO2017040316, uma solução de cobertura de conjunto pode identificar o número mínimo de sondas de sequências alvo ou RNAs guia necessários para cobrir uma sequência alvo inteira ou um conjunto de sequências alvo, por exemplo, um conjunto de sequências genômicas. As abordagens de cobertura de conjuntos foram usadas anteriormente para identificar os iniciadores e/ou sondas de microarray, normalmente na faixa de 20 a 50 pares de bases. Ver, por exemplo, Pearson et al., cs. virginia.
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Nucleic Acids Res. 200634(22):6605-11, Jabado et al.
Nucleic Acids Res. 2008, 36(1):e3 doi10. 1093/nar/gkm1106, Duitama et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37(8):2483-2492, Phillippy et al. BMCBioinformtics. 2009, 10:293 doi:10.
1186/1471-2105-10-293. Contudo, tais abordagens geralmente envolviam o tratamento de cada primer/probe como k-mers e pesquisando correspondências exatas ou permitindo correspondências inexatas usando matrizes de sufixos. Além disso, os métodos geralmente adotam uma abordagem binária para detectar a hibridação, selecionando iniciadores ou sondas, de modo que cada sequência de entrada precise apenas ser ligada por um iniciador ou sonda e a posição dessa ligação ao longo da sequência é irrelevante. Métodos alternativos podem dividir um genoma alvo em janelas predefinidas e tratar efetivamente cada janela como uma sequência de entrada separada sob a abordagem binária - ou seja, eles determinam se uma determinada sonda ou RNA guia se liga a cada janela e exigem que todas as janelas sejam ligadas pelo estado de alguma sonda ou RNA guia.
Efetivamente, essas abordagens tratam cada elemento do “universo” no problema de cobertura do conjunto como sendo uma sequência de entrada inteira ou uma janela predefinida de uma sequência de entrada, e cada elemento é considerado “coberto” se o início de uma sonda ou ORNA guia se liga ao elemento. Essas abordagens limitam a fluidez à qual diferentes projetos de sonda ou RNA guia são permitidos para cobrir uma determinada sequência alvo.
[00439] Em contraste, as modalidades divulgadas neste documento são direcionadas para detectar comprimentos mais longos de sonda ou guia de RNA, por exemplo, na faixa de 70 pb a 200 pb que são adequados para o seqüenciamento de seleção híbrido.
Além disso, os métodos divulgados
WO2017/040316 aqui pode ser aplicado para adotar uma abordagem de sequência pan-alvo capaz de definir uma sonda ou guiar conjuntos de RNA que podem identificar e facilitar o sequenciamento de detecção de todas as espécies e/ou seqüências de cepas em uma grande e/ou conjunto de sequência de destino variável.
Por exemplo, os métodos aqui divulgados podem ser utilizados para identificar todas as variantes de um determinado vírus ou vários vírus diferentes em um único ensaio.
Além disso, o método divulgado neste documento trata cada elemento do "universo"
no problema de cobertura de conjunto como sendo um nucleotídeo de uma sequência alvo, e cada elemento é considerado "coberto" desde que uma sonda ou RNA guia se ligue a algum segmento de um genoma alvo que inclui o elemento.
Este tipo de métodos de cobertura de conjunto pode ser usado em vez da abordagem binária de métodos anteriores, os métodos aqui divulgados melhoram como uma sonda ou RNA guia pode hibridar com uma sequência alvo.
Em vez de apenas perguntar se uma determinada sequência de RNA guia se liga ou não a uma determinada janela, essas abordagens podem ser usadas para detectar um padrão de hibridação - ou seja, quando uma determinada sonda ou RNA guia se liga a uma sequência ou sequências alvo - e depois determina a partir desses padrões de hibridação o número mínimo de sondas ou RNAs guia necessários para cobrir o conjunto de sequências alvo em um grau suficiente para permitir o enriquecimento de uma amostra e o seqüenciamento de toda e qualquer sequência alvo. Esses padrões de hibridação podem ser determinados pela definição de certos parâmetros que minimizam uma função de perda, permitindo assim a identificação de conjuntos mínimos de sonda ou RNA guia de uma maneira que permita que os parâmetros variem para cada espécie, por exemplo, para refletir a diversidade de cada espécie, bem como de uma maneira computacionalmente eficiente que não pode ser alcançada usando uma aplicação direta de uma solução de cobertura definida, como as aplicadas anteriormente na sonda ou no contexto de design do RNA guia.
[00440] A capacidade de detectar múltiplas abundâncias de transcrição pode permitir a geração de assinaturas microbianas únicas indicativas de um fenótipo específico. Várias técnicas de aprendizado de máquina podem ser usadas para derivar as assinaturas de genes.
Consequentemente, os RNAs guia dos sistemas CRISPR podem ser usados para identificar e/ou quantificar níveis relativos de biomarcadores definidos pela assinatura do gene, a fim de detectar certos fenótipos. Em certas modalidades de exemplo, a assinatura do gene indica suscetibilidade a um antibiótico, resistência a um antibiótico ou uma combinação dos mesmos.
[00441] Em um aspecto da invenção, um método compreende a detecção de um ou mais patógenos. Desta maneira, a diferenciação entre infecção de um sujeito por micróbios individuais pode ser obtida. Em algumas modalidades, essa diferenciação pode permitir a detecção ou diagnóstico por um clínico de doenças específicas, por exemplo, diferentes variantes de uma doença.
Preferencialmente, a sequência do patógeno é um genoma do patógeno ou um fragmento do mesmo. O método pode ainda compreender determinar a evolução do patógeno. A determinação da evolução do patógeno pode compreender a identificação de mutações de patógenos, por exemplo, exclusão de nucleotídeos, inserção de nucleotídeos, substituição de nucleotídeos. Entre os últimos, há substituições não sinônimas, sinônimas e sem codificação.
Mutações são mais frequentemente não-sinônimas durante um surto. O método pode ainda compreender determinar a taxa de substituição entre duas sequências de patógenos analisadas como descrito acima. Se as mutações são deletérias ou mesmo adaptativas exigiriam análise funcional, no entanto, a taxa de mutações não-sinônimas sugere que a progressão contínua dessa epidemia poderia oferecer uma oportunidade para a adaptação de patógenos, ressaltando a necessidade de contenção rápida. Assim, o método pode ainda compreender a avaliação do risco de adaptação viral, em que o número de mutações não-sinônimos é determinado. (Gire, et al.,Science 345, 1369, 2014).
Monitorando surtos de micróbios
[00442] Em algumas modalidades, um sistema CRISPR ou métodos de uso dos mesmos, conforme descrito aqui, podem ser usados para determinar a evolução de um surto de patógeno. O método pode compreender a detecção de uma ou mais sequências alvo de uma pluralidade de amostras de um ou mais sujeitos, em que a sequência alvo é uma sequência de um micróbio que causa os surtos. Esse método pode ainda compreender determinar um padrão de transmissão de patógenos ou um mecanismo envolvido em um surto de doença causado por um patógeno.
[00443] O padrão de transmissão de patógenos pode compreender novas transmissões continuadas do reservatório natural do patógeno ou transmissões de sujeito a sujeito (por exemplo, transmissão de homem para homem) após uma única transmissão do reservatório natural ou uma mistura de ambos. Numa modalidade, a transmissão do patógeno pode ser transmissão bacteriana ou viral; nesse caso, a sequência alvo é preferencialmente um genoma microbiano ou fragmentos dos mesmos. Numa modalidade, o padrão da transmissão de patógenos é o padrão inicial da transmissão de patógenos, isto é, no início do surto de patógenos. A determinação do padrão da transmissão de patógenos no início do surto aumenta a probabilidade de interromper o surto o mais cedo possível, reduzindo assim a possibilidade de disseminação local e internacional.
[00444] A determinação do padrão da transmissão de patógenos pode compreender a detecção de uma sequência de patógenos de acordo com os métodos aqui descritos. A determinação do padrão da transmissão de patógenos pode ainda compreender a detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro da sequência de patógenos entre os sujeitos e determinar se as variações compartilhadas intra- hospedeiro mostram padrões temporais. Padrões na variação intrahost e interhost observados fornecem informações importantes sobre transmissão e epidemiologia (Gire, et al.,2014).
[00445] A detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro entre os indivíduos que mostram padrões temporais é uma indicação de links de transmissão entre indivíduos (em particular entre seres humanos), porque pode ser explicada pela infecção do indivíduo por várias fontes (superinfecção), mutações recorrentes na contaminação da amostra (com ou sem balancear a seleção para reforçar mutações) ou a co-transmissão de vírus ligeiramente divergentes que surgiram por mutação anteriormente na cadeia de transmissão (Park et al.,Cell 161(7):1516–1526, 2015). A detecção de variações intra-hospedeiro compartilhadas entre os sujeitos pode compreender a detecção de variantes intra-hospedeiro localizadas em posições comuns de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).
A detecção positiva de variantes intra-hospedeiro localizadas em posições comuns (SNP) é indicativa de superinfecção e contaminação como explicações primárias para as variantes intra-hospedeiro. A superinfecção e a contaminação podem ser divididas com base na frequência do SNP que aparece como variantes inter-hospedeiros (Park, et al.,2015). Caso contrário, a superinfecção e a contaminação podem ser descartadas. Neste último caso, a detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro entre indivíduos pode compreender ainda avaliar as frequências de variantes sinônimas e não-sinônimas e comparar a frequência de variantes sinônimas e não-sinônimas entre si. Uma mutação não-sinônima é uma mutação que altera o aminoácido da proteína, provavelmente resultando em uma mudança biológica no micróbio sujeita à seleção natural. A substituição sinônima não altera uma sequência de aminoácidos.
Frequência igual de variantes sinônimas e não sinônimas é indicativa de que as variantes intra-hospedeiros evoluíram de maneira neutra. Se as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas forem divergentes, é provável que as variantes intra-hospedeiro sejam mantidas pela seleção equilibrada. Se as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas forem baixas, isso é indicativo de mutação recorrente. Se as frequências de variantes sinônimas e não sinônimas forem altas, isso é indicativo de cotransmissão (Park, et al.,2015).
[00446] Como o vírus Ebola, o vírus Lassa (LASV) pode causar febre hemorrágica com altas taxas de mortalidade. Andersen et al. gerou um catálogo genômico de quase 200 seqüências de LASV a partir de amostras clínicas e de reservatórios de roedores (Andersen, et al.,Cell Volume 162, Edição 4, p 738-750, 13 de agosto de 2015).
Andersen et al. mostram que, enquanto a epidemia de EVD de 2013–2015 é alimentada por transmissões de homem para homem, as infecções por LASV resultam principalmente de infecções de reservatório para humanos. Andersen et al.
elucidaram a disseminação do LASV na África Ocidental e mostram que essa migração foi acompanhada por mudanças na abundância do genoma do LASV, nas taxas de fatalidade, na adaptação do códon e na eficiência da tradução. O método pode ainda compreender comparar filogeneticamente uma primeira sequência de patógenos com uma segunda sequência de patógenos e determinar se existe uma ligação filogenética entre a primeira e a segunda sequências de patógenos. A segunda sequência de patógenos pode ser uma sequência de referência anterior. Se houver uma ligação filogenética, o método pode ainda compreender o enraizamento da filogenia da primeira sequência de patógenos para a segunda sequência de patógenos. Assim, é possível construir a linhagem da primeira sequência de patógenos. (Park et al.,2015).
[00447] O método pode ainda compreender determinar se as mutações são deletérias ou adaptativas. Mutações deletérias são indicativas de vírus prejudicados na transmissão e infecções sem saída, portanto, normalmente presentes apenas em um indivíduo. Mutações exclusivas de um indivíduo são aquelas que ocorrem nos ramos externos da árvore filogenética, enquanto mutações nos ramos internos são aquelas presentes em várias amostras (isto é, em vários indivíduos). Maior taxa de substituição não sinônima é uma característica dos ramos externos da árvore filogenética (Park, et al.,2015).
[00448] Nos ramos internos da árvore filogenética, a seleção teve mais oportunidade de filtrar mutantes deletérios. As ramificações internas, por definição, produziram várias linhagens descendentes e, portanto, são menos propensas a incluir mutações com custos de condicionamento físico. Assim, menor taxa de substituição não sinônima é indicativa de ramificações internas (Park,
et al.,2015).
[00449] Mutações sinônimas, que provavelmente têm menos impacto no condicionamento físico, ocorreram em frequências mais comparáveis nos ramos interno e externo (Park, et al.,2015).
[00450] Ao analisar a sequência alvo sequenciada, como os genomas virais, é possível descobrir os mecanismos responsáveis pela gravidade do episódio epidêmico, como durante o surto de Ebola em 2014. Por exemplo, Gire et al.
Uma comparação filogenética dos genomas do surto de 2014 com todos os 20 genomas de surtos anteriores sugere que o vírus da África Ocidental de 2014 provavelmente se espalhou da África central na última década. O enraizamento da filogenia usando divergência de outros genomas de ebolavírus foi problemático (6, 13). No entanto, o enraizamento da árvore no surto mais antigo revelou uma forte correlação entre a data da amostra e a distância raiz-a-ponta, com uma taxa de substituição de 8 × 10-4 por local por ano (13). Isso sugere que as linhagens dos três surtos mais recentes divergiram de um ancestral comum aproximadamente ao mesmo tempo, por volta de 2004, o que apóia a hipótese de que cada surto representa um evento zoonótico independente da mesma população viral geneticamente diversa em seu reservatório natural. Eles também descobriram que o surto de EBOV de 2014 pode ser causado por uma única transmissão do reservatório natural, seguida pela transmissão de homem para homem durante o surto. Seus resultados também sugeriram que o episódio epidêmico na Serra Leoa poderia resultar da introdução de dois vírus geneticamente distintos da Guiné na mesma época (Gire, et al.,2014).
[00451] Também foi possível determinar como o vírus Lassa se espalhou a partir de seu ponto de origem, em particular graças à transmissão de humano para humano e até mesmo refazer a história desse espalhamento há 400 anos (Andersen, et al.,Cell 162(4):738–50, 2015).
[00452] Em relação ao trabalho necessário durante o surto de EBOV de 2013–2015 e as dificuldades encontradas pela equipe médica no local do surto, e de maneira mais geral, o método da invenção possibilita a realização de sequenciamento usando menos sondas selecionadas, de modo que o seqüenciamento pode ser acelerado, reduzindo assim o tempo necessário desde a coleta de amostras até a obtenção de resultados. Além disso, kits e sistemas podem ser projetados para serem utilizáveis em campo, de modo que os diagnósticos de um paciente possam ser facilmente realizados sem a necessidade de enviar ou enviar amostras para outra parte do país ou do mundo.
[00453] Em qualquer método descrito acima, o sequenciamento da sequência alvo ou fragmento da mesma pode ser utilizado em qualquer um dos processos de sequenciação descritos acima. Além disso, o sequenciamento da sequência alvo ou seu fragmento pode ser um sequenciamento quase em tempo real. O sequenciamento da sequência alvo ou fragmento da mesma pode ser realizado de acordo com os métodos descritos anteriormente (Procedimentos Experimentais: Matranga et al.,2014; e Gire, et al.,2014). Sequenciar a sequência alvo ou seu fragmento pode compreender sequenciação paralela de uma pluralidade de sequências alvo. Sequenciar a sequência alvo ou fragmento da mesma pode compreender sequenciação de Illumina.
[00454] A análise da sequência alvo ou fragmento da mesma que hibridiza com uma ou mais das sondas selecionadas pode ser uma análise de identificação, em que a hibridação de uma sonda selecionada com a sequência alvo ou um fragmento da mesma indica a presença da sequência alvo na amostra.
[00455] Atualmente, o diagnóstico primário é baseado nos sintomas que um paciente apresenta. No entanto, várias doenças podem compartilhar sintomas idênticos, de modo que o diagnóstico depende muito das estatísticas. Por exemplo, a malária desencadeia sintomas semelhantes aos da gripe: dor de cabeça, febre, tremores, dores nas articulações, vômitos, anemia hemolítica, icterícia, hemoglobina na urina, danos na retina e convulsões. Esses sintomas também são comuns para septicemia, gastroenterite e doenças virais. Entre os últimos, a febre hemorrágica do Ebola apresenta os seguintes sintomas febre, dor de garganta, dores musculares, dores de cabeça, vômitos, diarréia, erupção cutânea, função diminuída do fígado e rins, hemorragia interna e externa.
[00456] Quando um paciente é apresentado a uma unidade médica, por exemplo, na África tropical, o diagnóstico básico termina com a malária, porque estatisticamente, a malária é a doença mais provável nessa região da África. Consequentemente, o paciente é tratado de malária, embora possa não ter realmente contraído a doença e acabe não sendo tratado corretamente. Essa falta de tratamento correto pode ser fatal, principalmente quando a doença contraída pelo paciente apresenta uma rápida evolução. Pode ser tarde demais para que a equipe médica perceba que o tratamento dado ao paciente é ineficaz e chegue ao diagnóstico correto e administre o tratamento adequado ao paciente.
[00457] O método da invenção fornece uma solução para esta situação. De fato, como o número de RNAs guia pode ser reduzido drasticamente, isso possibilita fornecer em um único chip sondas selecionadas, divididas em grupos, sendo cada grupo específico para uma doença, de modo que uma pluralidade de doenças, como infecção viral, pode ser diagnosticado ao mesmo tempo. Graças à invenção, mais de 3 doenças podem ser diagnosticadas em um único chip, de preferência mais de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 doenças ao mesmo tempo, preferencialmente as doenças que ocorrem mais comumente na população de uma determinada área geográfica. Como cada grupo de sondas selecionadas é específico para uma das doenças diagnosticadas, um diagnóstico mais preciso pode ser realizado, diminuindo o risco de administrar o tratamento errado ao paciente.
[00458] Em outros casos, uma doença como uma infecção viral pode ocorrer sem sintomas ou ter causado sintomas, mas desapareceu antes que o paciente seja apresentado à equipe médica. Nesses casos, o paciente não procura assistência médica ou o diagnóstico é complicado devido à ausência de sintomas no dia da apresentação.
[00459] A presente invenção também pode ser usada em conjunto com outros métodos de diagnóstico de doenças, identificando patógenos e otimizando o tratamento com base na detecção de ácidos nucléicos, como o mRNA em amostras brutas e não purificadas.
[00460] O método da invenção também fornece uma ferramenta poderosa para resolver esta situação. De fato, uma vez que uma pluralidade de grupos de RNAs guia selecionados, sendo cada grupo específico para uma das doenças mais comuns que ocorrem na população de uma determinada área, é composta por um único diagnóstico, a equipe médica só precisa entrar em contato com uma amostra biológica retirado do paciente com o chip. A leitura do chip revela as doenças que o paciente contraiu.
[00461] Em alguns casos, o paciente é apresentado à equipe médica para o diagnóstico de sintomas específicos. O método da invenção torna possível não apenas identificar qual doença causa esses sintomas, mas ao mesmo tempo determinar se o paciente sofre de outra doença da qual não estava ciente.
[00462] Essas informações podem ser de extrema importância ao procurar os mecanismos de um surto. De fato, grupos de pacientes com vírus idênticos também apresentam padrões temporais, sugerindo links de transmissão sujeito a sujeito.
Triagem de Perturbações Genéticas Microbianas
[00463] Em certas modalidades exemplares, os sistemas CRISPR aqui divulgados podem ser usados para rastrear perturbações genéticas microbianas. Tais métodos podem ser úteis, por exemplo, para mapear vias microbianas e redes funcionais. As células microbianas podem ser geneticamente modificadas e depois rastreadas sob diferentes condições experimentais. Como descrito acima, as modalidades divulgadas neste documento podem rastrear múltiplas moléculas alvo em uma única amostra ou um único alvo em um único volume discreto individual de uma maneira multiplex. Micróbios geneticamente modificados podem ser modificados para incluir uma sequência de código de barras de ácido nucleico que identifica a modificação genética específica realizada por uma célula microbiana específica ou população de células microbianas. Um código de barras é uma sequência curta de nucleotídeos (por exemplo, DNA, RNA ou combinações dos mesmos) que é usada como um identificador. Um código de barras de ácido nucleico pode ter um comprimento de 4-100 nucleotídeos e ser de fita simples ou dupla. Os métodos para identificar células com códigos de barras são conhecidos na técnica. Por conseguinte, os RNAs de guia dos sistemas efetores CRISPR aqui descritos podem ser utilizados para detectar o código de barras. A detecção do sinal detectável positivo indica a presença de uma modificação genética específica na amostra.
Os métodos aqui divulgados podem ser combinados com outros métodos para detectar genótipos complementares ou leituras fenotípicas indicando o efeito da modificação genética sob as condições experimentais testadas. As modificações genéticas a serem rastreadas podem incluir, mas não estão limitadas a um knock-in de gene, um knock-out de gene, inversões, translocações, transposições ou uma ou mais inserções, deleções, substituições, mutações ou adição de ácidos nucleicos que codificam um epítopo com uma consequência funcional, como alteração da estabilidade ou detecção de proteínas. De maneira semelhante, os métodos aqui descritos podem ser utilizados em aplicações de biologia sintética para rastrear a funcionalidade de arranjos específicos de elementos reguladores de genes e módulos de expressão de genes.
[00464] Em certas modalidades exemplares, os métodos podem ser usados para rastrear hipomorfos. A geração de hipomorfos e seu uso na identificação dos principais genes funcionais bacterianos e na identificação de novas terapêuticas antibióticas, conforme divulgado em PCT/US2016/060730 intitulado "Detecção multiplex de alta resolução de cepas de microrganismos, kits relacionados, métodos de diagnóstico e ensaios de triagem" arquivado em 4 de novembro de 2016, que é incorporado aqui por referência.
[00465] As diferentes condições experimentais podem compreender a exposição das células microbianas a diferentes agentes químicos, combinações de agentes químicos, diferentes concentrações de agentes químicos ou combinações de agentes químicos, diferentes durações de exposição a agentes químicos ou combinações de agentes químicos, diferentes parâmetros físicos ou ambos. Em certas modalidades de exemplo, o agente químico é um antibiótico ou antiviral. Diferentes parâmetros físicos a serem rastreados podem incluir diferentes temperaturas, pressões atmosféricas, diferentes concentrações atmosféricas e não atmosféricas de gases, diferentes níveis de pH, diferentes composições de meios de cultura ou uma combinação dos mesmos.
Triagem de amostras ambientais
[00466] Os métodos aqui divulgados também podem ser utilizados para rastrear amostras ambientais de contaminantes, detectando a presença de ácido nucleico ou polipeptídeos alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, a invenção fornece um método para detectar micróbios, compreendendo: expor um sistema CRISPR como descrito aqui a uma amostra; ativar uma proteína efetora de RNA por meio da ligação de um ou mais RNAs guia a um ou mais RNAs alvo específicos de micróbios ou um ou mais RNAs de gatilho, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido. O sinal positivo pode ser detectado e é indicativo da presença de um ou mais micróbios na amostra. Em algumas modalidades, o sistema de CRISPR pode estar em um substrato como aqui descrito, e o substrato pode ser exposto à amostra. Em outras modalidades, o mesmo sistema CRISPR, e/ou um sistema CRISPR diferente pode ser aplicado a vários locais discretos no substrato. Em outras modalidades, o sistema CRISPR diferente pode detectar um micróbio diferente em cada local. Como descrito em mais detalhes acima, um substrato pode ser um substrato de materiais flexíveis, por exemplo, incluindo, entre outros, um substrato de papel, um substrato de tecido ou um substrato flexível à base de polímero.
[00467] De acordo com a invenção, o substrato pode ser exposto passivamente à amostra, imergindo temporariamente o substrato em um fluido a ser amostrado, aplicando um fluido a ser testado no substrato ou entrando em contato com uma superfície a ser testada com o substrato . Qualquer meio de introdução da amostra no substrato pode ser usado conforme apropriado.
[00468] Como aqui descrito, uma amostra para uso com a invenção pode ser uma amostra biológica ou ambiental, como uma amostra de alimentos (frutas ou vegetais frescos, carnes), uma amostra de bebida, uma superfície de papel, uma superfície de tecido, uma superfície de metal, uma superfície de madeira, uma superfície de plástico, uma amostra de solo, uma amostra de água doce, uma amostra de águas residuais, uma amostra de água salina, exposição ao ar atmosférico ou a outra amostra de gás ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, superfícies domésticas/comerciais/industriais feitas de qualquer material, incluindo, mas não limitado a, metal, madeira, plástico, borracha ou semelhantes, podem ser esfregadas e testadas quanto a contaminantes. As amostras de solo podem ser testadas quanto à presença de bactérias ou parasitas patogênicos ou outros micróbios, tanto para fins ambientais quanto para testes em humanos, animais ou plantas. Amostras de água, como amostras de água doce, amostras de águas residuais ou amostras de água salina, podem ser avaliadas quanto à limpeza e segurança, e/ou potabilidade, para detectar a presença de, por exemplo, Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia ou outra contaminação microbiana.
Em outras modalidades, uma amostra biológica pode ser obtida de uma fonte incluindo, mas não se limitando a uma amostra de tecido, saliva, sangue, plasma, soros, fezes, urina, escarro, mucosa, linfa, fluido sinovial, líquido cefalorraquidiano, ascite, derrame pleural, seroma, pus ou zaragatoa de pele ou superfície da membrana mucosa. Em algumas modalidades particulares, uma amostra ambiental ou amostras biológicas podem ser amostras brutas e/ou a uma ou mais moléculas alvo não podem ser purificadas ou amplificadas a partir da amostra antes da aplicação do método. A identificação de micróbios pode ser útil e/ou necessária para qualquer número de aplicações e, portanto, qualquer tipo de amostra de qualquer fonte considerada apropriada por um versado na técnica pode ser usada de acordo com a invenção.
[00469] Em algumas modalidades, verificação de contaminação de alimentos por bactérias, como E. coli, em restaurantes ou outros fornecedores de alimentos; superfícies de alimentos; Teste de água para patógenos como Salmonella, Campylobacter ou E. coli; também verificando a qualidade dos alimentos pelos fabricantes e reguladores para determinar a pureza das fontes de carne; identificar contaminação do ar com patógenos como legionella; Verificar se a cerveja está contaminada ou estragada por patógenos como Pediococcus e Lactobacillus; contaminação de queijo pasteurizado ou não pasteurizado por bactérias ou fungos durante a fabricação.
[00470] Um micróbio de acordo com a invenção pode ser um micróbio patogênico ou um micróbio que resulta em deterioração de alimentos ou produtos consumíveis. Um micróbio patogênico pode ser patogênico ou indesejável para seres humanos, animais ou plantas. Para fins humanos ou animais, um micróbio pode causar uma doença ou resultar em doença. As aplicações animais ou veterinárias da presente invenção podem identificar animais infectados com um micróbio. Por exemplo, os métodos e sistemas da invenção podem identificar animais de companhia com patógenos, incluindo, entre outros, tosse do canil, vírus da raiva e vermes do coração. Em outras modalidades, os métodos e sistemas da invenção podem ser utilizados para testes de parentesco para fins de melhoramento. Um micróbio vegetal pode resultar em danos ou doenças a uma planta, redução no rendimento ou alterar características como cor, sabor, consistência, odor, para fins de contaminação de alimentos ou consumíveis, um micróbio pode afetar adversamente o sabor, odor, cor e consistência ou outras propriedades comerciais do alimento ou consumível. Em certas modalidades de exemplo, o micróbio é uma espécie bacteriana. A bactéria pode ser um psicotrófico, um coliforme, uma bactéria láctica ou uma bactéria formadora de esporos. Em certas modalidades de exemplo, a bactéria pode ser qualquer espécie bacteriana que causa doença ou enfermidade ou resulta em um produto ou trato indesejável. As bactérias de acordo com a invenção podem ser patogênicas para seres humanos, animais ou plantas.
[00471] Amostras apropriadas para uso nos métodos aqui divulgados incluem qualquer amostra biológica convencional obtida de um organismo ou parte dele, como uma planta, animal, bactéria e similares. Em modalidades particulares, a amostra biológica é obtida de um sujeito animal, tal como um sujeito humano. Uma amostra biológica é qualquer amostra sólida ou líquida obtida, excretada ou secretada por qualquer organismo vivo, incluindo, sem limitação, organismos unicelulares, como bactérias, leveduras, protozoários e amebas, entre outros, organismos multicelulares (como plantas ou animais, incluindo amostras de um sujeito humano saudável ou aparentemente saudável ou de um paciente humano afetado por uma condição ou doença a ser diagnosticada ou investigada, como uma infecção por um microorganismo patogênico, como bactérias ou vírus patogênicos). Por exemplo, uma amostra biológica pode ser um fluido biológico obtido de, por exemplo, sangue, plasma, soro, urina, fezes, escarro, mucosa, líquido linfático, líquido sinovial, bile, ascite, derrame pleural, seroma, saliva, líquido cefalorraquidiano, humor aquoso ou vítreo ou qualquer secreção corporal, um transudato, um exsudato (por exemplo, líquido obtido de um abscesso ou qualquer outro local de infecção ou inflamação) ou fluido obtido de uma articulação (por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada pela doença, como artrite reumatóide, osteoartrite, gota ou artrite séptica) ou um cotonete da superfície da pele ou da membrana mucosa.
[00472] Uma amostra também pode ser uma amostra obtida de qualquer órgão ou tecido (incluindo uma biópsia ou amostra de autópsia, como uma biópsia de tumor) ou pode incluir uma célula (seja uma célula primária ou uma célula cultivada) ou um meio condicionado por qualquer célula, tecido ou órgão. Exemplos de amostras incluem, sem limitação, células, lisados celulares, esfregaços de sangue, preparações de citocentrífugas, esfregaços de citologia, fluidos corporais (por exemplo, sangue, plasma, soro, saliva, escarro, urina, lavagem broncoalveolar, sêmen etc.), biópsias de tecidos (biópsias de tumores), aspirados com agulha fina, e/ou seções de tecido (por exemplo, seções de tecido de criostato e/ou secções de tecido embebidas em parafina). Em outros exemplos, a amostra inclui células tumorais circulantes (que podem ser identificadas por marcadores de superfície celular). Em exemplos particulares, as amostras são usadas diretamente (por exemplo, frescas ou congeladas) ou podem ser manipuladas antes do uso, por exemplo, por fixação (por exemplo, usando formalina) e/ou incorporação em cera (como amostras de tecido embebidas em parafina e fixadas em formalina (FFPE)). Será apreciado que qualquer método de obtenção de tecido de um sujeito possa ser utilizado e que a seleção do método utilizado dependerá de vários fatores, como tipo de tecido, idade do sujeito ou procedimentos disponíveis para o praticante. Técnicas padrão para aquisição de tais amostras estão disponíveis na técnica. Ver, por exemplo, Schluger et al.,J. Exp. Med. 176:1327-33 (1992); Bigby et al.,Am. Rev. Respir. Dis. 133:515-18 (1986); Kovacs et al.,NEJM318:589-93 (1988); e Ognibene et al.,Am. Rev.
Respir. Dis. 129:929-32 (1984).
[00473] Em outras modalidades, uma amostra pode ser uma amostra ambiental, como água, solo ou uma superfície como superfície industrial ou médica. Em algumas modalidades, métodos como os divulgados na publicação de patente US2013/0190196 pode ser aplicado para a detecção de assinaturas de ácidos nucleicos, especificamente níveis de RNA, diretamente de amostras celulares brutas com um alto grau de sensibilidade e especificidade. As sequências específicas para cada patógeno de interesse podem ser identificadas ou selecionadas comparando as sequências de codificação do patógeno de interesse com todas as sequências de codificação em outros organismos pelo software BLAST.
[00474] Várias modalidades da presente divulgação envolvem o uso de procedimentos e abordagens conhecidas na técnica para fracionar com sucesso amostras de sangue clínicas. Ver, por exemplo, o procedimento descrito em Han Wei Hour et al.,Microfluidic Devices for Blood Fractionation, Micromachines 2011, 2, 319-343; Ali Asgar S.
Bhagat et al.,Dean Flow Fractionation (DFF) Isolation of Circulating Tumor Cells (CTCs) from Blood, 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, October 2-6, 2011, Seattle, WA; e Publicação de Patente Internacional WO2011109762, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. As amostras de sangue são comumente expandidas em cultura para aumentar o tamanho da amostra para fins de teste. Em algumas modalidades da presente invenção, sangue ou outras amostras biológicas podem ser usadas em métodos como aqui descritos, sem a necessidade de expansão na cultura.
[00475] Além disso, várias modalidades da presente divulgação envolvem o uso de procedimentos e abordagens conhecidas na técnica para isolar com êxito patógenos do sangue total usando microcanal em espiral, conforme descrito em Han Wei Hour et al.,Isolamento de patógenos em sangue total usando microcanal em espiral, Caso 15995JR, Massachusetts Institute of Technology, manuscrito em preparação, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00476] Devido ao aumento da sensibilidade das modalidades divulgadas neste documento, em certas modalidades exemplares, os ensaios e métodos podem ser executados em amostras brutas ou amostras em que as moléculas alvo a serem detectadas não são mais fraccionadas ou purificadas da amostra.
Micróbios de exemplo
[00477] A modalidade aqui divulgada pode ser usada para detectar um número de diferentes micróbios. O termo micróbio como aqui utilizado inclui bactérias, fungos, protozoários, parasitas e vírus.
Bactérias
[00478] A seguir, é fornecida uma lista de exemplos dos tipos de micróbios que podem ser detectados usando as modalidades divulgadas neste documento.
Em certas modalidades de exemplo, o micróbio é uma bactéria.
Exemplos de bactérias que podem ser detectadas de acordo com os métodos divulgados incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de) Acinetobacter baumanii,
Actinobacillus sp.,Actinomycetes, Actinomyces sp. (como
Actinomyces israelii e Actinomyces naeslundii), Aeromonas sp. (como Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria (Aeromonas sobria) e Aeromonas caviae), Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma marginale Alcaligenes xylosoxidans, Acinetobacter baumanii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacillus sp. (como Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis e Bacillus stearothermophilus), Bacteroides sp. (como Bacteroides fragilis), Bartonella sp. (como
Bartonella bacilliformis e Bartonella henselae,
Bifidobacterium sp.,Bordetella sp. (como Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e Bordetella bronchiseptica), Borrelia sp. (como Borrelia recurrentis e
Borrelia burgdorferi), Brucella sp. (como Brucella abortus, Brucella canis, Brucella melintensis e Brucella suis), Burkholderia sp. (Como Burkholderia pseudomallei e
Burkholderia cepacia), Campylobacter sp. hominis,
Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae,
Chlamydophila psittaci, Citrobacter sp.
Coxiella burnetii,
Corynebacterium sp. (como Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium jeikeum e Corynebacterium), Clostridium sp.
(como Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Clostridium botulinum e Clostridium tetani), Eikenella corrodens, Enterobacter sp. (como Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae e Escherichia coli, incluindo Escherichia coli oportunistas, como E. coli enterotoxigênica, E. coli entero-invasiva, E. coli entero-invasiva, E. coli enteropatogênica, E.
coli entero-hemorrágica, E. coli entero-agregadora e E.
uropatogênica coli) Enterococcus sp. (como Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium) Ehrlichia sp. (como Ehrlichia chafeensia e Ehrlichia canis), Epidermophyton floccosum, Erysipelothrix rhusiopathiae, Eubacterium sp.,Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Haemophilus sp.
(como Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Haemophilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus haemolyticus e Haemophilus parahaemolyticus, Helicobacter sp. (tais como Helicobacter pylori, Helicobacter cinaedi e Helicobacter fennelliae), Kingella kingii, Klebsiella sp. (como Klebsiella pneumoniae, Klebsiella granulomatis e Klebsiella oxytoca), Lactobacillus sp.,Listeria monocytogenes, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Peptostreptococcus sp.,Mannheimia hemolytica, Microsporum canis, Moraxella catarrhalis, Morganella sp.,Mobiluncus sp., Micrococcus sp.,Mycobacterium sp.
(como Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium paratuberculosis, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis e Mycobacterium marinum), Mycoplasm sp. (como Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma hominis e Mycoplasma genitalium), Nocardia sp. (como Nocardia asteroides, Nocardia cyriacigeorgica e Nocardia brasiliensis), Neisseria sp.
(como Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis), Pasteurella multocida, Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur), Plesiomonas shigelloides. Prevotella sp.,Porphyromonas sp.,Prevotella melaninogenica, Proteus sp. (como Proteus vulgaris e Proteus mirabilis), Providencia sp. (como Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri e Providencia stuartii), Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Rhodococcus equi, Rickettsia sp. (como Rickettsia rickettsii, Rickettsia akari e Rickettsia prowazekii, Orientia tsutsugamushi (anteriormente: Rickettsia tsutsugamushi) e Rickettsia typhi), Rhodococcus sp.,Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia, Salmonella sp. (como Salmonella enterica, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerasuis e
Salmonella typhimurium), Serratia sp. (como Serratia marcesans e Serratia liquifaciens), Shigella sp. (como
Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii e
Shigella sonnei), Staphylococcus sp. (como Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus saprophyticus), Streptococcus sp. (como Streptococcus pneumoniae (por exemplo, sorotipo
4 resistente ao cloranfenicol, Streptococcus pneumoniae,
sorotipo resistente à espectinomicina 6BStreptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à estreptomicina
9VStreptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à eritromicina 14, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente
18CStreptococcus pneumoniae, sorotipo 19F resistente à tetraciclina Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à penicilina 19FStreptococcus pneumoniae e sorotipo resistente a trimetoprim 23FStreptococcus pneumoniae,
sorotipo 4 resistente ao cloranfenicol, Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente a espectinomicina
6BStreptococo pneumoniae, sorotipo resistente a estreptomicina 9VStreptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à optocina 14Streptococcus pneumoniae, sorotipo resistente à rifampicina 18CStreptococcus pneumoniae,
sorotipo 19F resistente à penicilina Streptococcus pneumoniae ou sorotipo 23F resistente ao trimetoprim
Streptococcus pneumoniae), Streptococcus agalactiae, Streptococcus mutans, Streptococcus pyogenes, Estreptococos do grupo A, Streptococcus pyogenes, Estreptococos do grupo B, Streptococcus agalactiae, Estreptococos do grupo C, Estreptococos do grupo C, Streptococcus anginos, Streptococcus anginos, estreptococos do grupo G do anginoso), Spirillum minus, Streptobacillus moniliformi, Treponema sp. (como Treponema carateum, Treponema petenue, Treponema pallidum e Treponema endemicum, Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Tropheryma whippelii, Ureaplasma urealyticum, Veillonella sp.,Vibrio sp. (como Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Vibrio mimicus, Vibrio hollisae, Vibrio fluvialis, Vibrio metchnikovii, Vibrio damsela and Vibrio furnisii), Yersinia sp. (como Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis e Yersinia pestis e Yersinia pseudotuberculosis) e Xanthomonas maltophilia entre outros.
Fungos
[00479] Em certas modalidades de exemplo, o micróbio é um fungo ou uma espécie de fungo. Exemplos de fungos que podem ser detectados de acordo com os métodos divulgados incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de), Aspergillus, Blastomyces, Candidíase, Coccidiodomicose, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, sp. Histoplasma sp. (como Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (como Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (como Stachybotrys chartarum), mucroimicose, Sporothrix, infecções oculares por fungos micose, Exserohilum, Cladosporium.
[00480] Em certas modalidades exemplares, o fungo é uma levedura. Exemplos de leveduras que podem ser detectadas de acordo com os métodos divulgados incluem, sem limitação, uma ou mais de (ou qualquer combinação de) espécies de Aspergillus (como Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus e Aspergillus clavatus), Cryptococcus sp. (como Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Cryptococcus laurentii e Cryptococcus albidus), uma espécie de Geotrichum, uma espécie de Saccharomyces, uma espécie de Hansenula, uma espécie de Candida (como Candida albicans), uma espécie de Kluyveromyces, uma espécie de Debaryomyces, uma espécie de Debaryomyces, ou combinação dos mesmos. Em certas modalidades exemplificativos, os fungos são um molde. Exemplos de moldes incluem, mas não estão limitados a, uma espécie de Penicillium, uma espécie de Cladosporium, uma espécie de Byssochlamys ou uma combinação das mesmas.
Protozoários
[00481] Em certas modalidades de exemplo, o micróbio é um protozoário. Exemplos de protozoários que podem ser detectados de acordo com os métodos e dispositivos divulgados incluem, sem limitação, qualquer um ou mais de (ou qualquer combinação de), Euglenozoa, Heterolobosea, Diplomonadida, Amoebozoa, Blastocystic e Apicomplexa.
Exemplo Euglenoza inclui, entre outros, Trypanosoma cruzi (doença de Chagas), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L.
mexicana, L. major, L. tropica e L. donovani. Exemplo Heterolobosea inclui, mas não está limitado a, Naegleria fowleri. Exemplo Diplomonadídeos incluem, mas não estão limitados a, Giardia intestinalis (G. lamblia, G.
duodenalis). Exemplo Os amebozoários incluem, mas não estão limitados a, Acanthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica. Exemplo Blastocistos incluem, mas não estão limitados a, Blastocystic hominis.
Exemplo Apicomplexa incluem, mas não estão limitados a, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. vivax, P. ovale, P. malariae e Toxoplasma gondii.
Parasitas
[00482] Em certas modalidades de exemplo, o micróbio é um parasita. Exemplos de parasitas que podem ser detectados de acordo com os métodos divulgados incluem, sem limitação, um ou mais de (ou qualquer combinação de), Trypanosoma cruzi (doença de Chagas), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L.
infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica, L.
donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G.
lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e Toxoplasma gondii, ou combinação dos mesmos.
[00483] Em modalidades específicas, exemplos de parasitas incluem membros das espécies Onchocerca e Plasmodium.
Vírus
[00484] Em certas modalidades de exemplo, os sistemas, dispositivos e métodos aqui divulgados são direcionados à detecção de vírus em uma amostra. As modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas para detectar infecção viral (por exemplo, de um sujeito ou planta) ou determinação de uma cepa viral, incluindo cepas virais que diferem por um único polimorfismo de nucleotídeo. O vírus pode ser um vírus de DNA, um vírus de RNA ou um retrovírus. Exemplos não limitativos de vírus úteis com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a Ebola, sarampo, SARS, Chikungunya, hepatite, Marburg, febre amarela, MERS, Dengue, Lassa, influenza, rabdovírus ou HIV. Um vírus da hepatite pode incluir hepatite A, hepatite B ou hepatite C. Um vírus da influenza pode incluir, por exemplo, influenza A ou influenza B.
Um
HIV pode incluir HIV1 ou HIV2. Em certas modalidades de exemplo, a sequência viral pode ser um vírus sincicial respiratório humano, vírus ebola do Sudão, vírus
Bundibugyo, vírus ebola da floresta Tai, vírus Reston ebola, Achimota, flavivírus Aedes, vírus aguacate, vírus
Akabane, reptarenavírus aletinófido, Allpahuayo mammarenavirus, Amapari mmarenavírus, vírus Andes, vírus
Apoi, vírus Aravan, vírus Aroa, vírus Arumwot,
paramoxivírus de salmão do Atlântico, lisysavírus de morcego australiano, vírus de nascença aviária,
metapneumovírus de aves, paramoxoxírus de aves, vírus de pinguim ou ilhas Falkland, polomavírus de BK, vírus de
Bagaza, vírus de Banna, vírus de Batna, vírus de Banna,
vírus de Batna,Sapovírus de morcego, Mammarenavírus Bear
Canon, vírus Beilong, betacoronoavírus, vírus Betapapilloma
1-6, vírus Bhanja, lisovírus de morcego Bokeloh, vírus da doença de Borna, vírus Bourbon, hepacivírus bovino, vírus da parainfluenza bovina 3, vírus sincicial respiratório bovino, vírus Bunyamwera, vírus Caliciviridae.
Vírus da encefalite da Califórnia, vírus Candiru, vírus da cinomose canina, pneumovírus de Canaína, vírus do cedro, vírus do agente de fusão celular, morbilivírus de cetáceos, vírus de
Chandipura, vírus de Chaoyang, mammarenavírus de Chapare,
vírus de Chikungunya, papilomavírus de macaco Colobus,
vírus da febre do carrapato do Colorado, vírus da varíola,
Vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, Culex flavivírus, Cupixi mammarenavirus, Dengue, vírus Dobrava-
Belgrado, vírus Donggang, vírus Dugbe, vírus Duvenhage,
vírus da encefalite equina oriental, vírus Entebbe morcego,
Enterovírus A-D, lissavírus do morcego europeu 1-2, Eyach vírus, morbillivírus felino, paramixovírus Fer-de-Lance,
Vírus do rio Fitzroy, vírus Flaviviridae, mammarenavírus
Flexal, vírus GBC, vírus Gairo, vírus Gemycircular,
paramyoxiviurs de ganso SF02, vírus Great Island,
mammarenavírus Guanarito, vírus Hantaan, Hantavirus Z10,
vírus Heartland, vírus Hendra, hepatite A/B/C/E,Vírus da hepatite delta, Bocavírus humano, Coronavírus humano,
Retrovírus endógeno humano K, Coronavírus entérico humano,
Vírus de DNA circular associado ao fator humano 1,
Herpesvírus humano 1-8, Vírus da imunodeficiência humana
1/2, Huan mastadenovírus AG, Papilomavírus humano, Vírus da parainfluenza humana 1-4, Paraechovírus humano,
Picobirnavírus humano, Smacovírus humano, Ikoma lyssavirus,
vírus Ilheus, influzena A-C, Ippy mammarenavírus, vírus
Irkut, J-vírus, poliomavírus JC, vírus da encefalite japonesa, mammarenavírus Junin, poliomavírus KI, vírus
Kadipiro, vírus do rio Kamiti, vírus Kedougou, vírus
Khujand, vírus Kokobera, vírus da doença da floresta
Kyasanur, vírus do morcego de Lagos, vírus
Langat,Mammarenavírus Lassa, mammarenavírus latino, vírus
Leopards Hill, vírus Liao ning, vírus Ljungan, Vírus
Lloviu, Vírus Lupus, Mammarenavírus Lujo, Mammarenavírus
Luna, Vírus Lunk, Coromenomeningite linfocítica
Mammarenavírus, Lyssavirus Ozernoe, MSSI2\. Vírus 225,
vírus Mamupo, vírus Mamastrovírus 1, vírus Manzanilla,
vírus Mapuera, vírus Marburg, vírus Mayaro, vírus Sarampo,
vírus Menangle, vírus Mercadeo, Poliomavírus de células de
Merkel, coronavírus da síndrome respiratória do Oriente
Médio, vírus de Mobala mammarenavírus, vírus Modoc, vírus de Moijang, vírus de Mokolo, vírus de Monkeypox, vírus de
Montana myotis leucoencefalite, vírus de Mopeia lassa recombinante 29, vírus de Mopeia lassa, Vírus Morogoro,
vírus Mossman, vírus da caxumba, vírus da pneumonia murina,
vírus da encefalite do vale Murray, vírus Nariva, vírus da doença de Newcastle, vírus Nipah, vírus Norwalk,
hepacivírus de ratos da Noruega, vírus Ntaya, vírus
O'nyong-nyong, vírus Olivermar mammarenavírus, vírus da febre hemorrágica Omsk, vírus Oropouche, vírus
Parainfluenza 5, mammarenavírus paranaense, vírus do rio
Parramatta, vírus Peste-des-petits-ruminantes,
mammarenavírus Pichande, vírus Picornaviridae,
mammarenavírus pirital, Piscihepevírus A, vírus parainfluenza Procina 1, rubulavírus suíno, vírus Powassan,
vírus linfotrópico primata T1-2, eritroparvovírus primata
1, vírus Punta Toro, vírus Puumala, vírus Quang Binh, vírus da raiva, vírus Razdan, vírus do réptil 1, Rinovírus AB,
vírus da febre do Rift Valley, vírus da peste bovina, Vírus
Rio Bravo, vírus Roedor Torque Teno, Hepacivírus de roedor,
vírus Ross River, Rotavírus A-I, Vírus Royal Farm, vírus
Rubéola, Sabia mammarenavírus, vírus Salem, vírus de
Nápoles da febre Sandfly, vírus da Sicília da febre
Sandfly, vírus Sapporo, vírus Sathuperi, anelovírus de focas, vírus da floresta Semliki, vírus Sendai, vírus de
Seul, vírus Sepik, síndrome respiratória aguda grave relacionada a coronavírus, febre grave com vírus da síndrome da trombocitopenia, vírus Shamonda, vírus Shimoni do morcego, vírus Shuni, vírus Simbu, vírus Simian torque teno, Vírus Simian 40-41, vírus Sin Nombre, vírus Sindbis,
anelovírus pequeno, vírus Sosuga, vírus da encefalite de cabra espanhola, vírus Spondweni, vírus da encefalite de
St.
Louis, vírus da luz do sol, mini-vírus semelhante ao
TTV, Tacaribe mammarenavírus, vírus Taila, vírus do morcego
Tamana, Tamiami mammarenavírus, vírus Tembusu, vírus
Thogoto vírus, vírus Thottapalayam, vírus da encefalite transmitida por carrapatos, vírus Tioman, vírus
Togaviridae, vírus torque teno canis, vírus torque teno douroucouli, vírus torque teno felis, vírus torque teno midi, vírus torque teno sus, vírus torque teno tamarin,
vírus torque teno, vírus torque teno zalophus, Vírus
Tuhoko, Vírus Tula, Paramupaxovírus Tupaia, Vírus Usutu,
Vírus Uukuniemi, Vírus Vaccinia, Vírus Variola, Vírus da encefalite equina venezuelana, Vírus da estomatite vesicular Indiana, WUPoliomavírus, Vírus Wesselsbron, vírus do morcego do Cáucaso Ocidental, vírus do Nilo Ocidental,
vírus da encefalite equina ocidental, mammarenavírus
Whitewater Arroyo, vírus da febre amarela, vírus Yokose,
vírus Yug Bogdanovac, ebolavírus Zaire ebolavírus, vírus
Zika ou sequência viral do vírus Zygosaccharomyces bailii
Z.
Exemplos de vírus de RNA que podem ser detectados incluem um ou mais de (ou qualquer combinação de) vírus
Coronaviridae, vírus Picornaviridae, vírus Caliciviridae,
vírus Flaviviridae, vírus Togaviridae, Bornaviridae,
Filoviridae, Paramyxoviridae, Pneumoviridae, um
Rhabdoviridae, um Arenaviridae, um Bunyaviridae, um
Orthomyxoviridae ou um Deltavírus.
Em certas modalidades, o vírus é Coronavírus, SARS, Poliovírus, Rinovírus, Hepatite
A, vírus Norwalk, vírus da febre amarela, vírus do Nilo
Ocidental, vírus da hepatite C, vírus da dengue, vírus
Zika, vírus Rubéola, vírus Ross River, Vírus Sindbis, vírus
Chikungunya, vírus da doença Borna, vírus Ebola, vírus
Marburg, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus Nipah,
vírus Hendra, vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório humano, vírus da raiva, vírus da Lassa,
Hantavírus, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo,
influenza ou vírus da Hepatite D.
[00485] Em certas modalidades exemplares, o vírus pode ser um vírus de planta selecionado do grupo que compreende o vírus do mosaico do tabaco (TMV), o vírus da murcha do tomate (TSWV), o vírus do mosaico do pepino (CMV), o vírus da batata Y (PVY), o vírus da RTCouve-flor vírus do mosaico (CaMV), vírus da ameixa (PPV), vírus do mosaico Brome (BMV), vírus da batata X (PVX), vírus da tristeza cítrica (CTV), vírus da anã amarela de cevada (BYDV), vírus da folha de batata (PLRV), tomate vírus de dublê espesso (TBSV), vírus esférico de arroz tungro (RTSV), vírus de mancha amarela de arroz (RYMV), vírus de hoja blanca de arroz (RHBV), vírus de milho rayado fino (MRFV), vírus de mosaico anão de milho (MDMV), vírus de mosaico de cana de açúcar (SCMV), vírus da semente da batata doce (SPFMV), vírus da fechadura das veias afundadas da batata doce (SPSVV), vírus da folha de videira da videira (GFLV), vírus da videira A (GVA), vírus da videira A (GVA), vírus da videira B (GVB), vírus da mancha de videira (GFkV), Vírus-1, -2 e -3 associados ao leafroll de videira (GLRaV-1, -2 e -3), vírus do mosaico Arabis (ArMV) ou vírus associado à picada de haste de Rupestris (RSPaV).
Numa modalidade preferida, a molécula de RNA alvo é parte do referido patógeno ou transcrita a partir de uma molécula de DNA do referido patógeno. Por exemplo, a sequência alvo pode estar compreendida no genoma de um vírus de RNA. É ainda preferido que a proteína efetora CRISPR hidrolise a referida molécula de RNA alvo do referido patógeno na referida planta se o referido patógeno infectar ou infectar a referida planta. Portanto, é preferível que o sistema CRISPR seja capaz de clivar a molécula de RNA alvo do patógeno da planta quando o sistema CRISPR (ou partes necessárias para sua conclusão) é aplicado terapeuticamente, ou seja, após a infecção ou profilaticamente, ou seja, antes da infecção. .
[00486] Em certas modalidades exemplares, o vírus pode ser um retrovírus. Exemplos de retrovírus que podem ser detectados usando as modalidades aqui divulgadas incluem um ou mais de ou qualquer combinação de vírus do gênero Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus, Spumavirus ou Family Metaviridae, Pseudoviridae e HIVRetroviridae (incluindo Retroviridae)), Hepadnaviridae (incluindo o vírus da hepatite B) e Caulimoviridae (incluindo o vírus do mosaico da couve-flor).
[00487] Em certas modalidades de exemplo, o vírus é um vírus de DNA. Exemplos de vírus de DNA que podem ser detectados usando as modalidades aqui divulgadas incluem um ou mais (ou qualquer combinação de) vírus da Família Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae,
Herpesviridae (incluindo vírus do herpes humano e vírus
Varicella Zozter), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae,
Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae,
Asfarviridae (incluindo vírus da peste suína Africano),
Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae,
Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae,
Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae,
Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae,
Pandoraviridae, Papillomaviridae,
Phycodnaviridae,Plasmaviridae, Polidnavírus, Polyomaviridae
(incluindo vírus Simian 40, vírus JC, vírus BK), Poxviridae
(incluindo varíola e varíola), Sphaerolipoviridae,
Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus,
Rhizidovirus.
Em algumas modalidades, um método para diagnosticar uma infecção bacteriana específica da espécie em um sujeito suspeito de ter uma infecção bacteriana é descrito como a obtenção de uma amostra compreendendo ácido ribonucleico ribossômico bacteriano do sujeito; entrar em contato com a amostra com uma ou mais das sondas descritas e detectar a hibridação entre a sequência bacteriana do ácido ribossômico ribonucleico presente na amostra e a sonda, em que a detecção da hibridação indica que o indivíduo está infectado com Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureus,
Acinetobacter baumannii, Candida albicans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus mirabilis, Staphylococcus agalactiae ou Staphylococcus maltophilia ou uma combinação dos mesmos.
Detecção e Monitoramento da Malária
[00488] A malária é uma patologia transmitida por mosquitos causada por parasitas do Plasmodium. Os parasitas são transmitidos às pessoas através das picadas de mosquitos fêmeas infectados de Anopheles. Cinco espécies de Plasmodium causam malária em humanos: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae e Plasmodium knowlesi. Entre eles, segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), o Plasmodium falciparum e o Plasmodium vivax são responsáveis pela maior ameaça. P.
falciparum é o parasita da malária mais prevalente no continente africano e é responsável pela maioria das mortes relacionadas à malária em todo o mundo. P. vivax é o parasita dominante da malária na maioria dos países fora da África Subsaariana.
[00489] Em 2015, 91 países e áreas mantinham transmissão contínua da malária. Segundo as últimas estimativas da OMS, houve 212 milhões de casos de malária em 2015 e 429. 000 mortes. Em áreas com alta transmissão de malária, crianças menores de 5 anos são particularmente suscetíveis a infecções, doenças e morte; mais de dois terços (70%) de todas as mortes por malária ocorrem nessa faixa etária. Entre 2010 e 2015, a taxa de mortalidade por malária abaixo de 5 anos caiu 29% em todo o mundo. No entanto, a malária continua sendo a principal causa de morte de crianças menores de cinco anos, tirando a vida de uma criança a cada dois minutos.
[00490] Conforme descrito pela OMS, a malária é uma doença febril aguda. Em um indivíduo não imune, os sintomas aparecem 7 dias ou mais após a picada do mosquito infectada. Os primeiros sintomas - febre, dor de cabeça, calafrios e vômitos - podem ser leves e difíceis de reconhecer como malária; no entanto, se não for tratada dentro de 24 horas, a malária por P. falciparum pode progredir para uma doença grave, muitas vezes levando à morte.
[00491] As crianças com malária grave freqüentemente desenvolvem um ou mais dos seguintes sintomas: anemia grave, dificuldade respiratória em relação à acidose metabólica ou malária cerebral. Nos adultos, o envolvimento de múltiplos órgãos também é frequente. Nas áreas endêmicas da malária, as pessoas podem desenvolver imunidade parcial, permitindo a ocorrência de infecções assintomáticas.
[00492] O desenvolvimento de testes diagnósticos rápidos e eficientes é de alta relevância para a saúde pública. De fato, o diagnóstico e o tratamento precoces da malária não apenas reduzem a doença e previnem as mortes,
mas também contribuem para reduzir a transmissão da malária. De acordo com as recomendações da OMS, todos os casos de suspeita de malária devem ser confirmados usando testes de diagnóstico baseados em parasitas (principalmente usando um teste de diagnóstico rápido) antes de administrar o tratamento (consulte "Diretrizes da OMS para o tratamento da malária", terceira edição, publicada em abril de 2015)
[00493] A resistência às terapias antimaláricas representa um problema de saúde crítico que reduz drasticamente as estratégias terapêuticas. De fato, conforme relatado no site da OMS, a resistência de P.
falciparum às gerações anteriores de medicamentos, como a cloroquina e a sulfadoxina/pirimetamina (SP), tornou-se generalizada nas décadas de 1950 e 1960, minando os esforços de controle da malária e revertendo os ganhos na sobrevida infantil. Assim, a OMS recomenda o monitoramento rotineiro da resistência à droga antimalárica. De fato, o diagnóstico preciso pode evitar tratamentos inadequados e limitar a extensão da resistência aos medicamentos antimaláricos.
[00494] Nesse contexto, a Estratégia Técnica Global da OMS para a Malária 2016-2030 - adotada pela Assembléia Mundial da Saúde em maio de 2015 - fornece uma estrutura técnica para todos os países endêmicos da malária. Destina- se a orientar e apoiar programas regionais e nacionais,
enquanto trabalham para o controle e eliminação da malária.
A estratégia estabelece metas globais ambiciosas, porém viáveis, incluindo: • Reduzir a incidência de casos de malária em pelo menos 90% até 2030.
• Reduzir as taxas de mortalidade por malária em pelo menos 90% até 2030.
• Eliminar a malária em pelo menos 35 países até
2030.
• Prevenir o ressurgimento da malária em todos os países livres da malária.
[00495] Esta estratégia foi o resultado de um extenso processo consultivo que durou 2 anos e envolveu a participação de mais de 400 especialistas técnicos de 70Estados-Membros. É baseado em 3 eixos principais: • garantir o acesso universal à prevenção, diagnóstico e tratamento da malária; • acelerar os esforços para a eliminação e obtenção do status de livre de malária; e • transformar a vigilância da malária em uma intervenção central.
[00496] O tratamento contra o Plasmodium inclui álcoois aril-amino, tais como quinino ou derivados de quinino, como cloroquina, amodiaquina, mefloquina,
piperaquina, lumefantrina, primaquina; análogo lipofílico de hidroxinaftoquinona, tal como atovaquona; medicamentos antifolatos, tais como os medicamentos sulfa sulfadoxina, dapsona e pirimetamina; proguanil; a combinação de atovaquone/proguanil; drogas atemisinas; e combinações dos mesmos.
[00497] Sequências alvo que são diagnósticas para a presença de um patógeno transmitido por mosquitos incluem sequências que são diagnósticas para a presença de Plasmodium, especialmente espécies de Plasmodia species affecting humans such as Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, e Plasmodium knowlesi, incluindo sequências dos genomas dos mesmos.
[00498] Sequências alvo que são diagnósticas para monitorar a resistência de drogas ao tratamento contra Plasmodium, principalmente espécies de Plasmodia que afetam seres humanos como Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, e Plasmodium knowlesi.
[00499] Sequências alvo adicionais incluem sequências incluem moléculas alvo/moléculas de ácido nucleico que codificam para proteínas envolvidas no processo biológico essencial para o parasita Plasmodium e principalmente proteínas transportadoras, como proteínas da família transportadora de drogas/metabolitos, a proteína cassete de ligação a ATP (ABC) envolvida na translocação do substrato, como a subfamília do transportador ABC ou o trocador Na +/H +, glutationa de membrana S-transferase; proteínas envolvidas na via do folato, como a di- hidropteroato sintase, a atividade di-hidrofolato redutase ou a di-hidrofolato redutase-timidilato sintase; e proteínas envolvidas na translocação de prótons através da membrana mitocondrial interna e principalmente do complexo do citocromo b. Alvos adicionais também podem incluir o (s) gene (s) que codificam a heme polimerase.
[00500] Outras sequências alvo incluem alvo molecules/nucleic moléculas de ácido que codificam proteínas envolvidas no processo biológico essencial podem ser selecionadas a partir do gene transportador de resistência à cloroquina P. falciparum (pfcrt), transportador de resistência multidrogas 1 a P. falciparum (pfmdr1), gene da proteína associado à resistência multidroga a P. falciparum (Pfmrp), P. falciparum Na+/H+ gene do trocador (pfnhe), o gene que codifica a proteína 1 exportada por P. falciparum, o Ca2 + de P. falciparum transportando a ATPase 6 (pfatp6); os genes de di- hidropteroato sintase de P. falciparum (pfdhps), atividade de di-hidrofolato-redutase (pfdhpr) e genes de di- hidrofolato-redutase-timidilato-sintetase (pfdhfr), o gene do citocromo b, o gene do citocromo b, o gtp ciclo-
hidrolase e o gene Kelch13 (K13), além de seus genes funcionais Espécies de Plasmodium.
[00501] Uma série de mutações, notadamente mutações de ponto único, foram identificadas nas proteínas que são os alvos dos tratamentos atuais e associadas a fenótipos de resistência específicos. Por conseguinte, a invenção permite a detecção de vários fenótipos de resistência de parasitas transmitidos por mosquitos, como o plasmodium.
[00502] A invenção permite detectar uma ou mais mutações e notavelmente um ou mais polimorfismos de nucleotídeo único no núcleo alvo acids/molecules. Por conseguinte, qualquer uma das mutações abaixo, ou a sua combinação das mesmas, pode ser utilizada como marcador de resistência ao medicamento e pode ser detectada de acordo com a invenção.
[00503] Mutações de ponto único em P. falciparum K13 incluem as seguintes mutações de ponto único nas posições 252, 441, 446, 449, 458, 493, 539, 543, 553, 561, 568, 574, 578, 580, 675, 476, 469, 481, 522, 537, 538, 579, 584 e 719 e nomeadamente as mutações E252Q, P441L, F446I, G449A, N458Y, Y493H, R539T, I543T, P553L, R561H, V568G, P574L, A578S, C580Y, A675V, M476I; C469Y; A481V; S522C; N537I; N537D; G538V; M579I; D584V; e H719N. Essas mutações geralmente estão associadas aos fenótipos de resistência aos medicamentos das artemisinas (resistência à terapia combinada à base de artemisinina e artemisinina, abril de 2016WHO/HTM/GMP/2016. 5).
[00504] Na di-hidrofolato redutase de P. falciparum (DHFR) (PfDHFR-TS, PFD0830w), polimorfismos importantes incluem mutações nas posições 108, 51, 59 e 164, notadamente 108D, 164L, 51I e 59R, que modulam a resistência à pirimetamina. Outros polimorfismos também incluem 437G, 581G, 540E, 436A e 613S, os quais estão associados à resistência à sulfadoxina. Mutações observadas adicionais incluem Ser108Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ile164Leu, Cys50Arg, Ile164Leu, Asn188Lys, Ser189Arg e Val213Ala, Ser108Thr e Ala16Val. As mutações Ser108Asn, Asn51Ile, Cys59Arg, Ile164Leu, Cys50Arg, Ile164Leu estão notavelmente associadas à terapia baseada em pirimetamina e/ou resistências à terapia combinada de cloroguanina- dapsona. A resistência ao cicloguanil parece estar associada às mutações duplas Ser108Thr e Ala16Val. A amplificação de dhfr também pode ser de alta relevância para a resistência à terapia, notadamente a resistência à pirimetamina.
[00505] Na di-hidropteroato sintase de P.
falciparum (DHPS) (PfDHPS, PF08_0095), polimorfismos importantes incluem mutações nas posições 436, 437, 581 e 613Ser436Ala/Phe, Ala437Gly, Lys540Glu, Ala581Gly e Ala613Thr/Ser. Polimorfismo na posição 581 e/ou 613 também foram associados à resistência às terapias à base de sulfadoxina-pirimetamina.
[00506] No transportador de resistência à cloroquina de P. falciparum (PfCRT), o polimorfismo na posição 76, notadamente a mutação Lys76Thr, está associado à resistência à cloroquina. Outros polimorfismos incluem Cys72Ser, Met74Ile, Asn75Glu, Ala220Ser, Gln271Glu, Asn326Ser, Ile356Thr e Arg371Ile que podem estar associados à resistência à cloroquina. OPfCRT também é fosforilado nos resíduos S33, S411 e T416, que podem regular a atividade de transporte ou a especificidade da proteína.
[00507] No transportador multirresistente a P.
falciparum 1 (PfMDR1) (PFE1150w), foram identificados polimorfismos nas posições 86, 184, 1034, 1042, notadamente Asn86Tyr, Tyr184-Phe, Ser1034Cys, Asn1042Asp e Asp1246Tyr e foram relatados como influenciados influenciar a suscetibilidade à lumefantrina, artemisinina, quinina, meflocina, halofantrina e cloroquina. Além disso, a amplificação do PfMDR1 está associada à susceptibilidade reduzida à lumefantrina, artemisinina, quinina, meflocina e halofantrina e desamplificação do PfMDR1, levando a um aumento na resistência à cloroquina. A amplificação de pfmdr1 também pode ser detectada. O status de fosforilação do PfMDR1 também é de alta relevância.
[00508] Na proteína associada à resistência a múltiplas drogas de P. falciparum (PfMRP) (referência de gene PFA0590w), polimorfismos nas posições 191e/ou437, como Y191H e A437S, foram identificados e associados a fenótipos de resistência à cloroquina.
[00509] No P. falciparum NA+/H+ trocador (PfNHE) (ref PF13_0019), o aumento da repetição do DNNND no microssatélite ms4670 pode ser um marcador para a resistência ao quinino.
[00510] Mutações que alteram o local de ligação ao ubiquinol da proteína do citocromo b codificado pelo gene be do citocromo (cytb, mal_mito_3) estão associados à resistência ao atovaquona. Mutações nas posições 26, 268, 276, 133 e 280 e notavelmente Tyr26Asn, Tyr268Ser, M1331 e G280D podem estar associadas à resistência ao atovaquona.
[00511] Por exemplo, em PVivax, mutações em PvMDR1, o homólogo de Pf MDR1, foram associadas à resistência à cloroquina, principalmente polimorfismo na posição 976, como a mutação Y976F.
[00512] As mutações acima são definidas em termos de sequências de proteínas. No entanto, o especialista é capaz de determinar as mutações correspondentes, incluindo SNPS, a serem identificadas como uma sequência alvo de ácido nucleico.
[00513] Outros marcadores de resistência a drogas identificados são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em “Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996–2004)”; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (April 2016WHO/HTM/GMP/2016. 5); “Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health” FEBSLett. 2011Jun 6;585(11):1551-62. doi:10. 1016/j.
febslet. 2011. 04. 042. Epub 2011Abr 23. Reveja. PubMed PMID: 21530510; cujo conteúdo é aqui incorporado por referência
[00514] Quanto aos polipeptídeos que podem ser detectados de acordo com a presente invenção, produtos gênicos de todos os genes aqui mencionados podem ser utilizados como alvos. Correspondentemente, está contemplado que tais polipeptídeos possam ser utilizados para identificação de espécies, digitação e/ou detecção de resistência a drogas.
[00515] Em certas modalidades de exemplo, os sistemas, dispositivos e métodos aqui divulgados são direcionados à detecção da presença de um ou mais parasitas transmitidos por mosquito em uma amostra, como uma amostra biológica obtida de um sujeito. Em certas modalidades exemplares, o parasita pode ser selecionado das espécies Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae ou Plasmodium knowlesi. Por conseguinte, os métodos aqui divulgados podem ser adaptados para uso em outros métodos (ou em combinação) com outros métodos que requerem identificação rápida de espécies de parasitas, monitorando a presença de parasitas e formas de parasitas (por exemplo, correspondendo a vários estágios de infecção e ciclo de vida do parasita, como ciclo exo- eritrocítico, ciclo eritrocítico, ciclo esporpogônico; formas de parasitas, incluindo merozoítos, esporozoítos, esquizontes, gametócitos); detecção de certos fenótipos (por exemplo, resistência à droga patogênica), monitoramento da progressão da doença e/ou surto e rastreamento de tratamento (drogas). Além disso, no caso da malária, pode decorrer um longo tempo após a picada infecciosa, ou seja, um longo período de incubação, durante o qual o paciente não apresenta sintomas. Da mesma forma, os tratamentos profiláticos podem atrasar o aparecimento dos sintomas, e longos períodos assintomáticos também podem ser observados antes de uma recaída. Tais atrasos podem facilmente causar erros de diagnóstico ou atraso no diagnóstico e, assim, prejudicar a eficácia do tratamento.
[00516] Devido às capacidades de diagnóstico rápidas e sensíveis das modalidades divulgadas aqui, detecção do tipo de parasita, até uma única diferença de nucleotídeo e a capacidade de ser implantada como um dispositivo POC, as modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas como regimes terapêuticos guia, como uma seleção do curso de tratamento apropriado. As modalidades divulgadas neste documento também podem ser usadas para rastrear amostras ambientais (população de mosquitos, etc.) quanto à presença e à tipificação do parasita. As modalidades também podem ser modificadas para detectar parasitas transmitidos por mosquitos e outros patógenos transmitidos por mosquitos simultaneamente. Em alguns casos, a malária e outros patógenos transmitidos por mosquitos podem apresentar inicialmente sintomas semelhantes. Assim, a capacidade de distinguir rapidamente o tipo de infecção pode orientar importantes decisões de tratamento. Outros patógenos transmitidos por mosquitos que podem ser detectados em conjunto com a malária incluem dengue, vírus do Nilo Ocidental, chikungunya, febre amarela, filariose, encefalite japonesa, encefalite de Saint Louis, encefalite equina ocidental, encefalite equina oriental, encefalite equina venezuelana, encefalite La Crosse, e zika.
[00517] Em certas modalidades de exemplo, os dispositivos, sistemas e métodos divulgados neste documento podem ser usados para distinguir várias espécies de parasitas transmitidas por mosquitos em uma amostra. Em certas modalidades de exemplo, a identificação pode ser baseada em sequências de RNA ribossômico, incluindo as subunidades 18S, 16S, 23S, e 5S. Em certas modalidades exemplares, a identificação pode ser baseada em sequências de genes que estão presentes em várias cópias no genoma,
como genes mitocondriais como CYTB.
Em certas modalidades de exemplo, a identificação pode ser baseada em sequências de genes que são altamente expressos e/ou altamente conservados, como GAPDH, Histona H2B, enolase ou LDH.
Os métodos para identificar sequências relevantes de rRNA são divulgados na publicação do pedido de patente dos
EUA2017/0029872. Em certas modalidades exemplares, um conjunto de RNA guia pode ser projetado para distinguir cada espécie por uma região variável que é única para cada espécie ou cepa.
Os RNAs guia também podem ser projetados para direcionar genes de RNA que distinguem micróbios nos gêneros, família, ordem, classe, filo, níveis de reino ou uma combinação dos mesmos.
Em certas modalidades exemplares em que a amplificação é usada, um conjunto de iniciadores de amplificação pode ser projetado para flanquear regiões constantes da sequência de RNA ribossômico e um RNA guia projetado para distinguir cada espécie por uma região interna variável.
Em certas modalidades exemplares, os iniciadores e os RNAs guia podem ser projetados para regiões conservadas e variáveis na subunidade 16S,
respeitosamente.
Outros genes ou regiões genômicas que variam exclusivamente entre espécies ou um subconjunto de espécies, como a família de genes RecA, subunidade RNA polimerase β, também podem ser usados.
Outros marcadores filogenéticos adequados, e métodos para identificar os mesmos, são discutidos, por exemplo, em Wu et al.
arXiv:1307. 8690 [q-bio. GN].
[00518] Em certas modalidades de exemplo, a identificação de espécies pode ser realizada com base em genes que estão presentes em várias cópias no genoma, como genes mitocondriais como CYTB. Em certas modalidades exemplares, a identificação de espécies pode ser realizada com base em expressões altamente expressas. e/ou genes altamente conservados, como GAPDH, Histona H2B, enolase ou LDH.
[00519] Em certas modalidades de exemplo, um método ou diagnóstico é projetado para rastrear parasitas transmitidos por mosquitos através de múltiplos níveis filogenéticos e/ou fenotípicos ao mesmo tempo. Por exemplo, o método ou diagnóstico pode compreender o uso de vários sistemas CRISPR com diferentes RNAs guia. Um primeiro conjunto de RNAs guia pode distinguir, por exemplo, entre Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. Essas classes gerais podem ser subdivididas ainda mais. Por exemplo, os RNAs guia podem ser projetados e utilizados no método ou diagnóstico que distingue cepas resistentes a medicamentos, em geral ou com relação a um medicamento específico ou combinação de medicamentos. Um segundo conjunto de RNAs guia pode ser projetado para distinguir micróbios no nível de espécie. Assim, uma matriz pode ser produzida identificando todas as espécies ou subespécies de parasitas transmitidas por mosquitos, divididas ainda mais de acordo com a resistência aos medicamentos. O precedente é apenas para fins de exemplo. Outros meios para classificar outros tipos de parasitas transmitidos por mosquitos também são contemplados e seguiriam a estrutura geral descrita acima.
[00520] Em certas modalidades de exemplo, os dispositivos, sistemas e métodos aqui divulgados podem ser usados para rastrear genes de interesse de parasitas transmitidos por mosquitos, por exemplo, genes de resistência à droga. Os RNAs guia podem ser projetados para distinguir entre genes de interesse conhecidos. Amostras, incluindo amostras clínicas, podem então ser rastreadas usando as modalidades aqui divulgadas para detecção de um ou mais tais genes. A capacidade de rastrear a resistência a medicamentos no POC traria um tremendo benefício na seleção de um regime de tratamento apropriado. Em certas modalidades de exemplo, os genes de resistência à droga são genes que codificam proteínas como proteínas transportadoras, como proteínas da família de transportadores de drogas/metabolitos, a proteína cassete de ligação a ATP (ABC) envolvida na translocação de substrato, como a subfamília C de transportador ou o trocador Na+/H+; proteínas envolvidas na via do folato,
como a di-hidropteroato-sintase, a atividade de di- hidrofolato-redutase ou a di-hidrofolato-redutase- timidilato-sintase; e proteínas envolvidas na translocação de prótons através da membrana mitocondrial interna e principalmente do complexo do citocromo b. Alvos adicionais também podem incluir o(s) gene(s) que codifica a heme polimerase. Em certas modalidades exemplificativas, os genes de resistência à droga são selecionados a partir do gene transportador de resistência à cloroquina P.
falciparum (pfcrt), transportador de resistência multidrogas 1 a P. falciparum (pfmdr1), gene da proteína associado à resistência multidroga a P. falciparum (Pfmrp), P. falciparum Na+/H+ gene do trocador (pfnhe), o Ca2+ de P. falciparum transportando a ATPase 6 (pfatp6); os genes de di-hidropteroato sintase de P. falciparum (pfdhps), atividade de di-hidrofolato-redutase (pfdhpr) e genes de di-hidrofolato-redutase-timidilato-sintetase (pfdhfr), o gene do citocromo b, o gene do citocromo b, o gtp ciclo-hidrolase e o gene Kelch13 (K13), além de seus genes funcionais em outras espécies de Plasmodium. Outros marcadores de resistência a drogas identificados são conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito em “Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs (1996–2004)”; WHO; Artemisinin and artemisinin-based combination therapy resistance (April 2016WHO/HTM/GMP/2016.
5); “Drug-resistant malaria: molecular mechanisms and implications for public health” FEBSLett. 2011Jun 6;585(11):1551-62. doi:10. 1016/j. febslet. 2011. 04. 042.
Epub 2011Abr 23. Reveja. PubMed PMID: 21530510; cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.
[00521] Em algumas modalidades, um sistema de CRISPR, sistema de detecção ou métodos de uso do mesmo, conforme descrito aqui, pode ser usado para determinar a evolução de um surto de parasita transmitido por mosquito.
O método pode compreender a detecção de uma ou mais sequências alvo de uma pluralidade de amostras de um ou mais sujeitos, em que a sequência alvo é uma sequência de um parasita transmitido por mosquito que se espalha ou causa os surtos. Esse método pode ainda compreender determinar um padrão de transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos ou um mecanismo envolvido em um surto de doença causado por um parasita transmitido por mosquitos. As amostras podem ser derivadas de um ou mais seres humanos, e/ou ser derivado de um ou mais mosquitos.
[00522] O padrão de transmissão de patógenos pode compreender novas transmissões continuadas do reservatório natural do parasita transmitido por mosquitos ou outras transmissões (por exemplo, através de mosquitos) após uma única transmissão do reservatório natural ou uma mistura de ambos. Numa modalidade, a sequência alvo é preferencialmente uma sequência dentro do genoma do parasita transmitido por mosquitos ou fragmentos dos mesmos. Numa modalidade, o padrão da transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos é o padrão inicial da transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos, isto é, no início do surto de parasitas transmitidos por mosquitos. A determinação do padrão da transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos no início do surto aumenta a probabilidade de interromper o surto o mais cedo possível, reduzindo assim a possibilidade de disseminação local e internacional.
[00523] A determinação do padrão da transmissão de parasitas transmitidos por mosquitos pode compreender detectar uma sequência de parasitas transmitidos por mosquitos, de acordo com os métodos aqui descritos. A determinação do padrão da transmissão do patógeno pode compreender ainda a detecção de variações compartilhadas intra-hospedeiro da sequência de parasitas transmitidos por mosquitos entre os sujeitos e a determinação se as variações compartilhadas intra-hospedeiro mostram padrões temporais. Padrões na variação intrahost e interhost observados fornecem informações importantes sobre transmissão e epidemiologia (Gire, et al.,2014).
[00524] Além de outros tipos de amostra aqui divulgados, a amostra pode ser derivada de um ou mais mosquitos, por exemplo, a amostra pode compreender saliva de mosquito.
[00525] Em outras modalidades, a invenção fornece métodos para detectar um ácido nucleico alvo em uma amostra, compreendendo o contato de uma amostra com um sistema de detecção de ácido nucleico e a aplicação da referida amostra contatada a um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral, como aqui descrito.
[00526] Como aqui descrito, o sistema de detecção de ácido nucleico pode compreender um construto de mascaramento baseado em RNA compreendendo uma primeira e uma segunda molécula, em que o ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral compreende a detecção da primeira e da segunda molécula, preferencialmente em locais de detecção discretos em uma faixa de fluxo lateral. A primeira e a segunda moléculas podem ser detectadas ligando-se a um anticorpo que reconhece a referida primeira ou segunda molécula e detectando a referida molécula ligada, preferencialmente com anticorpos em sanduíche.
[00527] Como aqui descrito em outro lugar, a faixa de fluxo lateral pode compreender um primeiro anticorpo a montante direcionado contra a referida primeira molécula e um segundo anticorpo a jusante direcionado contra a referida segunda molécula. O construto de mascaramento baseado em RNA não clivado é ligado pelo referido primeiro anticorpo se o ácido nucleico alvo não estiver presente na referida amostra e o construto de mascaramento baseado em RNA clivado é ligado tanto pelo referido primeiro anticorpo quanto pelo segundo anticorpo se o ácido nucleico alvo estiver presente em referida amostra.
DISPOSITIVOS LATERAIS DE FLUXO
[00528] Em algumas modalidades, a invenção fornece um dispositivo de fluxo lateral compreendendo um substrato compreendendo uma primeira extremidade, dois ou mais sistemas efetores CRISPR, duas ou mais construções de detecção, uma ou mais primeiras regiões de captura, cada uma compreendendo um primeiro agente de ligação, dois ou mais segundos capturar regiões, cada uma compreendendo um segundo agente de ligação. Cada um dos dois ou mais sistemas efetores CRISPR compreende uma proteína efetora CRISPR e uma ou mais seqüências guia, cada sequência guia configurada para ligar uma ou mais moléculas alvo. A primeira extremidade compreende uma porção de carregamento de amostra e uma primeira região carregada com um ligante detectável.
[00529] Como descrito acima, cada um dos dois ou mais construtos de detecção pode compreender um oligonucleotídeo de RNA ou DNA, compreendendo uma primeira molécula em uma primeira extremidade e uma segunda molécula em uma segunda extremidade.
[00530] Em algumas modalidades, o dispositivo de fluxo lateral pode compreender dois sistemas efetores CRISPR e dois construtos de detecção. Em algumas modalidades, o dispositivo de fluxo lateral pode compreender quatro sistemas efetores CRISPR e quatro construtos de detecção.
[00531] Em algumas modalidades, a porção de carregamento de amostra pode ainda compreender um ou mais reagentes de amplificação para amplificar a uma ou mais moléculas alvo, conforme descrito neste documento.
[00532] Em algumas modalidades, um primeiro construto de detecção pode compreender FAM como uma primeira molécula e biotina como uma segunda segunda molécula ou vice-versa e um segundo construto de detecção pode compreender FAM como uma primeira molécula e Digoxigenina (DIG) como uma segunda molécula ou vice-versa.
Em algumas modalidades, um primeiro construto de detecção pode compreender Tye665 como uma primeira molécula e Alexa- fluor-488 como uma segunda molécula ou vice-versa. Em algumas modalidades, um segundo construto de detecção pode compreender Tye665 como uma primeira molécula e FAM como uma segunda molécula ou vice-versa. Em algumas modalidades, um terceiro construto de detecção compreende Tye665 como uma primeira molécula e biotina como uma segunda molécula ou vice-versa. Em algumas modalidades, um quarto construto de detecção compreende Tye665 como uma primeira molécula e DIG como uma segunda molécula ou vice-versa.
[00533] Como aqui descrito em outro lugar, a proteína efetora CRISPR pode ser uma proteína efetora direcionada a RNA ou direcionada a DNA.
[00534] Como descrito aqui em outro lugar, a proteína efetora CRISPR pode ser uma proteína efetora direcionada ao DNA. Em algumas modalidades, a proteína efetora direcionada ao DNA pode ser Cas12a.
[00535] Como aqui descrito em outro lugar, a proteína efetora CRISPR pode ser uma proteína efetora direcionada a RNA. Em algumas modalidades, a proteína efetora direcionada a RNA pode ser C2c2. Em algumas modalidades, a proteína efetora de direcionamento de RNA pode ser Cas13b.
DETECÇÃO DO BIOMARCADOR
[00536] Em certas modalidades de exemplo, os sistemas, dispositivos e métodos divulgados neste documento podem ser utilizados para detecção de biomarcadores. Por exemplo, os sistemas, dispositivos e métodos aqui divulgados podem ser usados para detecção de SNPe/ou genotipagem. Os sistemas, dispositivos e métodos aqui divulgados também podem ser utilizados para a detecção de qualquer estado ou distúrbio de doença caracterizado pela expressão gênica aberrante. A expressão gênica aberrante inclui aberração no gene expresso, localização da expressão e nível de expressão.
Vários transcritos ou marcadores de proteínas relacionados a doenças cardiovasculares,
imunológicas e câncer, entre outras doenças, podem ser detectados.
Em certas modalidades exemplares, as modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas para detecção de DNA sem células de doenças que envolvem lise, como fibrose hepática e restrictive/obstructive
Doença pulmonar.
Em certas modalidades exemplares, as modalidades podem ser utilizadas para detecção mais rápida e portátil para teste pré-natal de DNA sem células.
As modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas para rastrear painéis de diferentes SNPs associados a,
entre outros, saúde cardiovascular, assinaturas lipídicas/metabólicas, identificação de etnia,
correspondência de paternidade, ID humana (por exemplo,
correspondência de suspeito a um banco de dados criminal de assinaturas SNP). As modalidades divulgadas neste documento também podem ser usadas para detecção de DNA livre de células de mutações relacionadas a e liberadas de tumores de câncer.
As modalidades divulgadas neste documento também podem ser usadas para detecção da qualidade da carne, por exemplo, fornecendo detecção rápida de diferentes fontes animais em um determinado produto de carne.
Modalidades divulgadas neste documento também podem ser usadas para a detecção de OGM ou edição de genes relacionados ao DNA.
Como aqui descrito em outro lugar, genótipos/alelos ou biomarcadores intimamente relacionados (por exemplo, tendo apenas uma única diferença de nucleotídeo em uma determinada sequência alvo) podem ser distinguidas pela introdução de uma incompatibilidade sintética no gRNA.
[00537] Em um aspecto, a invenção refere-se a um método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras, compreendendo: a. distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes distintos individuais, os volumes distintos individuais compreendendo um sistema CRISPR de acordo com a invenção, como aqui descrito; b. incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo; c. ativar a proteína efetora CRISPR através de ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e d. detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.
Tipos de amostras de biomarcadores
[00538] A sensibilidade dos ensaios aqui descritos é bem adequada para a detecção de ácidos nucleicos alvo em uma ampla variedade de tipos de amostras biológicas, incluindo tipos de amostras nos quais o ácido nucleico alvo é diluído ou para o qual o material da amostra é limitado.
O rastreamento de biomarcadores pode ser realizado em vários tipos de amostras, incluindo, entre outros, saliva, urina, sangue, fezes, escarro e líquido cefalorraquidiano.
As modalidades divulgadas neste documento também podem ser usadas para detectar atualizações e/ou regulação negativa de genes. Por exemplo, como a amostra pode ser diluída em série de modo que apenas genes superexpressos permaneçam acima do limiar de detecção do ensaio.
[00539] Em certas modalidades, a presente invenção fornece etapas para obter uma amostra de fluido biológico (por exemplo, urina, plasma ou soro sanguíneo, escarro, fluido espinhal cerebral) e extrair o DNA. A sequência nucleotídica mutante a ser detectada, pode ser uma fração de uma molécula maior ou pode estar presente inicialmente como uma molécula discreta.
[00540] Em certas modalidades, o DNA é isolado de plasma/serum de um paciente com câncer. Para comparação, amostras de DNA isoladas de tecido neoplásico e uma segunda amostra podem ser isoladas de tecido não neoplásico do mesmo paciente (controle), por exemplo, linfócitos. O tecido não neoplásico pode ser do mesmo tipo que o tecido neoplásico ou de uma fonte de órgão diferente. Em certas modalidades, as amostras de sangue são coletadas e o plasma imediatamente separado das células sanguíneas por centrifugação. O soro pode ser filtrado e armazenado congelado até a extração do DNA.
[00541] Em certas modalidades exemplares, os ácidos nucleicos alvo são detectados diretamente de uma amostra bruta ou não processada, como sangue, soro, saliva, líquido cefalorraquidiano, escarro ou urina. Em determinadas modalidades, um ácido nucleico alvo é um RNA.
Células tumorais circulantes
[00542] Numa modalidade, as células circulantes (por exemplo, células tumorais circulantes (CTC)) podem ser analisadas com a presente invenção. O isolamento de células tumorais circulantes (CTC) para uso em qualquer um dos métodos aqui descritos pode ser realizado. Tecnologias exemplares que alcançam detecção e captura específica e sensível de células circulantes que podem ser usadas na presente invenção foram descritas (Mostert B, et al.,Circulating tumor cells (CTCs): métodos de detecção e sua relevância clínica no câncer de mama. Cancer Treat Rev.
2009;35:463-474; e Talasaz AH, et al.,Isolating highly enriched populations of circulating epithelial cells and other rare cells from blood using a magnetic sweeper device.
Proc Natl Acad Sci EUAA. 2009; 106:3970-3975). Tão pouco quanto um CTC pode ser encontrado no fundo de 105-106 células mononucleares do sangue periférico (Ross AA, et al.,Detecção e viabilidade de células tumorais em coleções de células-tronco do sangue periférico de pacientes com câncer de mama usando técnicas de ensaio imunocitoquímico e clonogênico.
Blood. 1993,82:2605-2610). A plataforma
CellSearch® utiliza esferas imunomagnéticas revestidas com anticorpos para a Molécula de Adesão Celular Epitelial
(EpCAM) para enriquecer as células epiteliais que expressam
EPCAM, seguida por imunocoloração para confirmar a presença de coloração por citoqueratina e a ausência do marcador de leucócitos CD45 para confirmar que as células capturadas são células tumorais epiteliais (Momburg F, et al., estudo imuno-histoquímico da expressão de uma glicoproteína de superfície específica do epitélio humano Mr 34. 000 em tecidos normais e malignos.
Cancer Res. 1987; 47: 2883-
2891; e Allard WJ, et al., células tumorais circulam no sangue periférico de todos os principais carcinomas, mas não em sujeitos saudáveis ou pacientes com doenças não malignas.
Clin Cancer Res. 2004; 10:6897-6904). O número de células capturadas foi demonstrado prospectivamente como tendo significado prognóstico para pacientes com câncer de mama, colorretal e de próstata com doença avançada (Cohen
SJ, et al.,JClin Oncol. 2008;26:3213-3221; Cristofanilli M,
et al. NEngl JMed. 2004;351:781-791; Cristofanilli M, et al.,JClin Oncol. 2005;23: 1420-1430; e de Bono JS, et al.
Clin Cancer Res. 2008; 14:6302-6309).
[00543] A presente invenção também fornece isolamento de CTCs com a tecnologia CTC-Chip. OCTC-Chip é um dispositivo de captura de CTC baseado em microfluídicos, onde o sangue flui através de uma câmara contendo milhares de micropostos revestidos com anticorpos anti-EpCAM aos quais os CTCs se ligam (Nagrath S, et al. Isolamento de células tumorais circulantes raras em pacientes com câncer por tecnologia de microchip. Nature. 2007;450: 1235-1239).
OCTC-Chip fornece um aumento significativo nas contagens e pureza do CTC em comparação com o sistema CellSearch® (Maheswaran S, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells, NEngl JMed. 2008; 359: 366- 377), ambas as plataformas podem ser usadas para análises moleculares a jusante.
Cromatina sem células
[00544] Em certas modalidades, fragmentos de cromatina sem células são isolados e analisados de acordo com a presente invenção. Os nucleossomos podem ser detectados no soro de indivíduos saudáveis (Stroun et al.,Annals of the New York Academy of Sciences 906: 161-168 (2000)), bem como indivíduos afetados por um estado de doença. Além disso, a concentração sérica de nucleossomos é consideravelmente maior em pacientes que sofrem de doenças benignas e malignas, como câncer e doenças autoimunes (Holdenrieder et al (2001) Int JCancer 95, 114-120, Trejo- Becerril et al (2003). Int JCancer 104, 663-668; Kuroi et al. 1999Breast Cancer 6, 361-364; Kuroi et al (2001) Int j Oncology 19, 143-148; Amoura et al (1997) Arth Rheum 40, 2217-2225; Williams et al. (2001) J. Rheumatol 28, 81-94).
Não estando limitado por uma teoria, a alta concentração de nucleossomos em pacientes portadores de tumores deriva da apoptose, que ocorre espontaneamente em tumores em proliferação. Os nucleossomos que circulam no sangue contêm histonas exclusivamente modificadas. Por exemplo, a Publicação de Patente US2005/006993131 de março de 2005) refere-se ao uso de anticorpos direcionados contra modificações específicas do terminal N da histona como indicadores de diagnóstico da doença, empregando esses anticorpos específicos para histonas para isolar nucleossomos de uma amostra de sangue ou soro de um paciente para facilitar a purificação e análise dos DNA para fins de diagnóstico/rastreamento. Por conseguinte, a presente invenção pode usar DNA ligado à cromatina para detectar e monitorar, por exemplo, mutações tumorais. A identificação do DNA associado às histonas modificadas pode servir como marcadores diagnósticos de doenças e defeitos congênitos.
[00545] Assim, noutra forma de realização, fragmentos de cromatina isolados são derivados da cromatina em circulação, preferencialmente mono e oligonucleossomos em circulação. Fragmentos isolados de cromatina podem ser derivados de uma amostra biológica. A amostra biológica pode ser de um sujeito ou paciente necessitado. A amostra biológica pode ser soros, plasma, linfa, sangue, frações sanguíneas, urina, líquido sinovial, líquido espinhal, saliva, células tumorais circulantes ou mucosas.
DNA sem células (cfDNA)
[00546] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para detectar DNA livre de células (cfDNA).
ODNA livre de células no plasma ou no soro pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico não invasiva. Por exemplo, o DNA fetal livre de células foi estudado e otimizado para testar fatores RhD compatíveis, determinação de sexo para desordens genéticas ligadas ao X, teste para desordens de um único gene, identificação de pré-eclâmpsia.
Por exemplo, o seqüenciamento da fração de células fetais do cfDNA no plasma materno é uma abordagem confiável para detectar alterações no número de cópias associadas à aneuploidia do cromossomo fetal. Por outro exemplo, o cfDNA isolado de pacientes com câncer foi usado para detectar mutações em genes-chave relevantes para as decisões de tratamento.
[00547] Em certas modalidades de exemplo, a presente divulgação fornece a detecção de cfDNA diretamente de uma amostra de paciente. Em outra modalidade exemplar, a presente divulgação fornece cfDNA enriquecedor usando as modalidades de enriquecimento divulgadas acima e antes da detecção do cfDNA alvo.
Exossomos
[00548] Numa modalidade, os exossomos podem ser analisados com a presente invenção. Exossomos são pequenas vesículas extracelulares que demonstraram conter RNA. O isolamento de exossomos por ultracentrifugação, filtração, precipitação química, cromatografia de exclusão de tamanho e microfluídica é conhecido na técnica. Em uma modalidade, os exossomos são purificados usando um biomarcador de exossomos. O isolamento e a purificação de exossomos de amostras biológicas podem ser realizados por quaisquer métodos conhecidos (ver, por exemplo, WO2016172598A1).
Detecção e Genotipagem SNP
[00549] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para detectar a presença de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) em uma amostra biológica. Os SNPs podem estar relacionados ao teste de maternidade (por exemplo, determinação do sexo, defeitos fetais). Eles podem estar relacionados a uma investigação criminal. Numa modalidade, um suspeito em uma investigação criminal pode ser identificado pela presente invenção. Não estar vinculado a uma teoria forense baseada em evidências forenses pode exigir o ensaio mais sensível disponível para detectar o material genético de um suspeito ou vítima, porque as amostras testadas podem ser limitativas.
[00550] Em outras modalidades, os SNPs associados a uma doença são abrangidos pela presente invenção. Os SNPs associados a doenças são bem conhecidos na técnica e um especialista na técnica pode aplicar os métodos da presente invenção para projetar RNAs guias adequados (ver, por exemplo, www. ncbi. nlm. nih. gov/clinvar?term=human%5Borgn % 5D).
[00551] Em um aspecto, a invenção se refere a um método para genotipagem, como a genotipagem SNP, compreendendo: a) distribuir uma amostra ou conjunto de amostras em um ou mais volumes distintos individuais, os volumes distintos individuais compreendendo um sistema de CRISPR de acordo com a invenção, como aqui descrito; b) incubar a amostra ou conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir a ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo; c) ativar a proteína efetora CRISPR através de ligação de um ou mais RNAs guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína efetora CRISPR resulta na modificação do construto de mascaramento baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e d) detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica a presença de uma ou mais moléculas alvo características de um genótipo específico na amostra.
[00552] Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a (por exemplo, por comparação da intensidade do sinal) um ou mais sinais padrão, preferencialmente um sinal padrão sintético, como por exemplo ilustrado em uma modalidade exemplar na FIG. 60Em certas modalidades, o padrão é ou corresponde a um genótipo específico. Em certas modalidades, o padrão compreende um SNP particular ou outra variação de nucleotídeo (único). Em certas modalidades, o padrão é um padrão de genótipo (amplificado por PCR). Em certas modalidades, o padrão é ou compreende DNA. Em certas modalidades, o padrão é ou compreende RNA. Em certas modalidades, o padrão é ou compreende RNA que é transcrito a partir do DNA. Em certas modalidades, o padrão é ou compreende DNA que é transcrito reversamente a partir do RNA. Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a um ou mais padrões, cada um dos quais corresponde a um genótipo conhecido, como um SNP ou outra variação (única) de nucleotídeo. Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a um ou mais sinais padrão e a comparação compreende análise estatística, como por análise estatística paramétrica ou não paramétrica, como ANOVA de uma ou duas vias, etc. Em certas modalidades, o sinal detectável é comparado a um ou mais sinais padrão e quando o sinal detectável não se desvia (estatisticamente) significativamente do padrão, o genótipo é determinado como o genótipo correspondente ao referido padrão.
[00553] Em outras modalidades, a presente invenção permite genotipagem rápida para farmacogenômica de emergência. Numa modalidade, um único teste de ponto de atendimento pode ser usado para genotipar um paciente trazido para a sala de emergência. Pode-se suspeitar que o paciente tenha um coágulo sanguíneo e um médico de emergência precise decidir uma dosagem de diluente para administrar. Em modalidades exemplares, a presente invenção pode fornecer orientação para a administração de anticoagulantes durante infarto do miocárdio ou tratamento de acidente vascular cerebral com base na genotipagem de marcadores como VKORC1, CYP2C9 e CYP2C19. Numa concretização, o diluente do sangue é a varfarina anticoagulante (Holford, NH (dezembro de 1986).
"Farmacocinética clínica e farmacodinâmica da varfarina, compreendendo a relação dose-efeito".
farmacocinéticaSpringer International Publishing. 11 (6): 483–504). Os genes associados à coagulação sanguínea são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, US20060166239A1; Litin SC, Gastineau DA (1995) "Conceitos atuais em terapia anticoagulante". Mayo Clin. Proc. 70 (3): 266–72; e Rusdiana et al.,Responsiveness to low-dose warfarin associated with genetic variants of VKORC1, CYP2C9, CYP2C19, and CYP4F2 in an Indonesian population. Eur JClin Pharmacol. 2013Mar;69(3):395-405). Especificamente, no polimorfismo de nucleotídeo único VKORC11639 (ou 3673), o alelo G comum ("do tipo selvagem") é substituído pelo alelo A. Pessoas com alelo A (ou o "haplótipo A") produzem menos VKORC1 do que aquelas com o alelo G (ou "haplótipo não A").
A prevalência dessas variantes também varia de acordo com a raça, com 37% dos caucasianos e 14% dos africanos portando o alelo A. O resultado final é um número reduzido de fatores de coagulação e, portanto, uma capacidade diminuída de coagulação.
[00554] Em certas modalidades exemplares, a disponibilidade de material genético para detectar um SNP em um paciente permite detectar SNPs sem amplificação de uma amostra de DNA ou RNA. No caso de genotipagem, a amostra biológica testada é facilmente obtida. Em certas modalidades exemplares, o tempo de incubação da presente invenção pode ser reduzido. O ensaio pode ser realizado em um período de tempo necessário para que ocorra uma reação enzimática. Um especialista na técnica pode realizar reações bioquímicas em 5 minutos (por exemplo, ligação de 5 minutos). A presente invenção pode usar um dispositivo de extração de DNA automatizado para obter DNA do sangue. ODNA pode então ser adicionado a uma reação que gera uma molécula alvo para a proteína efetora. Imediatamente após a geração da molécula alvo, o agente de mascaramento pode ser cortado e um sinal detectado. Em modalidades exemplares, a presente invenção permite um diagnóstico rápido de POC para determinar um genótipo antes de administrar um medicamento (por exemplo, diluente de sangue). No caso em que uma etapa de amplificação é usada, todas as reações ocorrem na mesma reação em um processo de uma etapa. Em modalidades preferidas, o ensaio POC pode ser realizado em menos de uma hora, preferencialmente 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos ou 50 minutos.
[00555] Em certas modalidades, os sistemas, dispositivos e métodos divulgados neste documento podem ser usados para detectar a presença ou o nível de expressão de RNAs não codificadores longos (lncRNAs). A expressão de certos lncRNAs está associada ao estado da doença e/ou resistência à droga. Em particular, certos lncRNAs (por exemplo, TCONS_00011252, NR_034078, TCONS_00010506, TCONS_00026344, TCONS_00015940, TCONS_00028298, TCONS_00026380, TCONS_0009861, TCONS_00026521, TCONS_00016127, NR_125939, NR_033834, TCONS_00021026,
TCONS_00006579, NR_109890, e NR_026873) estão associados à resistência ao tratamento do câncer, como resistência a um ou mais inibidores de BRAF (por exemplo, vemurafenibe, dabrafenibe, sorafenibe, GDC-0879, PLX-4720 e LGX818) para o tratamento de melanoma (por exemplo, melanoma nodular, lentigo maligno, lentigo melanoma maligno, melanoma acral lentiginoso, melanoma de espalhamento superficial, melanoma mucoso, melanoma polipoide, melanoma desmoplásico, melanoma amelanótico e melanoma de tecidos moles). A detecção de lncRNAs usando as várias modalidades descritas neste documento pode facilitar o diagnóstico da doença e/ou a seleção de opções de tratamento.
[00556] Em uma modalidade, a presente invenção pode orientar terapias direcionadas a DNA ou RNA (por exemplo, CRISPR, TALE, proteínas dos dedos de zinco, RNAi), particularmente em locais onde a administração rápida da terapia é importante para os resultados do tratamento.
Detecção:
[00557] As células cancerígenas sofrem uma perda de material genético (DNA) quando comparadas às células normais. Essa exclusão do material genético pelo qual quase todos, se não todos, os cânceres são chamados de "perda de heterozigosidade" (LOH). A perda de heterozigosidade (LOH) é um evento cromossômico grave que resulta na perda de todo o gene e da região cromossômica circundante. A perda de heterozigosidade é uma ocorrência comum no câncer, onde pode indicar a ausência de um gene supressor de tumor funcional na região perdida. No entanto, uma perda pode ser silenciosa porque ainda existe um gene funcional no outro cromossomo do par de cromossomos. A cópia restante do gene supressor de tumor pode ser inativada por uma mutação pontual, levando à perda de um gene supressor de tumor. A perda de material genético das células cancerígenas pode resultar na perda seletiva de um dos dois ou mais alelos de um gene vital para a viabilidade celular ou crescimento celular em um locus específico do cromossomo.
[00558] Um "marcador LOH" é o DNA de um locus microssatélites, uma exclusão, alteração ou amplificação na qual, quando comparado às células normais, está associado a câncer ou outras doenças. Um marcador LOH está frequentemente associado à perda de um gene supressor de tumor ou de outro gene, geralmente relacionado ao tumor.
[00559] O termo "microssatélites" refere-se a pequenas sequências repetitivas de DNA que são amplamente distribuídas no genoma humano. Um microssatélite é um trato de motivos de DNA repetidos em tandem (ou seja, adjacentes) que variam em comprimento de dois a cinco nucleotídeos e são tipicamente repetidos de 5 a 50 vezes. Por exemplo, a sequência TATATATATA (SEQ. IDNo. 333) é um microssatélite de dinucleotídeo e GTCGTCGTCGTCGTC (SEQ. IDNo. 334) é um microssatélite trinucleotídico (com A sendo Adenina, GGuanina, CCitosina e TTimina). Alterações somáticas no comprimento de repetição de tais microssatélites demonstraram representar uma característica dos tumores. Os RNAs guia podem ser projetados para detectar esses microssatélites. Além disso, a presente invenção pode ser usada para detectar alterações no comprimento da repetição, bem como amplificações e deleções com base na quantificação do sinal detectável. Certos microssatélites estão localizados em regiões reguladoras de flanqueamento ou intrônicas de genes, ou diretamente em códons de genes.
Mutações microssatélites nesses casos podem levar a alterações e doenças fenotípicas, principalmente em doenças de expansão tripla, como a síndrome do X frágil e a doença de Huntington.
[00560] A perda frequente de heterozigosidade (LOH) em regiões cromossômicas específicas tem sido relatada em muitos tipos de neoplasias. As perdas alélicas em regiões cromossômicas específicas são as alterações genéticas mais comuns observadas em uma variedade de neoplasias, portanto, análises microssatélites foram aplicadas para detectar o DNA de células cancerígenas em amostras de fluidos corporais, como escarro para câncer de pulmão e urina para câncer de bexiga. (Rouleau et al. Nature 363, 515-521 (1993); e Latif, et al. Science 260, 1317-1320 (1993)).
Além disso, foi estabelecido que concentrações marcadamente aumentadas de DNA solúvel estão presentes no plasma de indivíduos com câncer e algumas outras doenças, indicando que soro ou plasma livre de células pode ser usado para detectar DNA de câncer com anormalidades microssatélites.
(Kamp et al. Science 264, 436-440 (1994); e Steck, et al.
Nat Genet. 15(4), 356-362 (1997)). Dois grupos relataram alterações microssatélites no plasma ou soro de um número limitado de pacientes com câncer de pulmão de pequenas células ou câncer de cabeça e pescoço. (Hahn, et al.
Science 271, 350-353 (1996); e Miozzo, et al. Cancer Res.
56, 2285-2288 (1996)). A detecção da perda de heterozigosidade em tumores e soro de pacientes com melanoma também foi mostrada anteriormente (ver, por exemplo, número de patente US6465177B1).
[00561] Assim, é vantajoso detectar marcadores LOH em um sujeito que sofra de ou em risco de câncer. A presente invenção pode ser usada para detectar LOH em células tumorais. Numa modalidade, as células tumorais em circulação podem ser usadas como uma amostra biológica. Em modalidades preferidas, o DNA sem células obtido a partir de soro ou plasma é utilizado para detectar e/ou monitorizar de forma não invasiva a LOH. Em outras modalidades, a amostra biológica pode ser qualquer amostra aqui descrita (por exemplo, uma amostra de urina para câncer de bexiga). Não estando limitado por uma teoria, a presente invenção pode ser usada para detectar marcadores LOH com sensibilidade aprimorada em comparação com qualquer método anterior, proporcionando assim a detecção precoce de eventos mutacionais. Numa modalidade, o LOH é detectado em fluidos biológicos, em que a presença de LOH está associada à ocorrência de câncer. O método e os sistemas aqui descritos representam um avanço significativo em relação às técnicas anteriores, como PCR ou biópsia de tecido, fornecendo um método não invasivo, rápido e preciso para detectar LOH de alelos específicos associados ao câncer.
Assim, a presente invenção fornece métodos e sistemas que podem ser utilizados para rastrear populações de alto risco e monitorar pacientes de alto risco submetidos a quimioprevenção, quimioterapia, imunoterapia ou outros tratamentos.
[00562] Como o método da presente invenção requer apenas extração de DNA a partir de fluido corporal, como sangue, ele pode ser realizado a qualquer momento e repetidamente em um único paciente. O sangue pode ser coletado e monitorado para LOH antes ou após a cirurgia; antes, durante e após o tratamento, como quimioterapia, radioterapia, terapia genética ou imunoterapia; ou durante o exame de acompanhamento após o tratamento para progressão, estabilidade ou recorrência da doença. Não estando vinculado a uma teoria, o método da presente invenção também pode ser usado para detectar presença ou recorrência subclínica de doença com um marcador LOH específico para esse paciente, uma vez que os marcadores LOH são específicos para o tumor de um paciente individual.
O método também pode detectar se várias metástases podem estar presentes usando marcadores LOH específicos do tumor.
Detecção de modificações epigenéticas
[00563] Variantes de histonas, modificações de DNA e modificações de histonas indicativas de câncer ou progressão do câncer podem ser usadas na presente invenção.
Por exemplo, a publicação da patente US20140206014 descreve que as amostras de câncer apresentaram níveis elevados de nucleossomo H2AZ, macroH2A1. 1, 5-metilcitosina, P-H2AX (Ser139) em comparação com indivíduos saudáveis. A presença de células cancerígenas em um indivíduo pode gerar um nível mais alto de nucleossomos livres de células no sangue como resultado do aumento da apoptose das células cancerígenas.
Numa modalidade, um anticorpo direcionado contra marcas associadas à apoptose, como H2BSer 14 (P), pode ser usado para identificar nucleossomos únicos que foram liberados a partir de células neoplásicas apoptóticas. Assim, o DNA resultante de células tumorais pode ser vantajosamente analisado de acordo com a presente invenção com alta sensibilidade e precisão.
Rastreio pré-natal
[00564] Em certas modalidades, o método e os sistemas da presente invenção podem ser utilizados na triagem pré-natal. Em certas modalidades, o DNA sem células é usado em um método de triagem pré-natal. Em certas modalidades, o DNAassociado a nucleossomos únicos ou oligonucleossomos pode ser detectado com a presente invenção. Em modalidades preferidas, a detecção de DNA associado a nucleossomos únicos ou oligonucleossomos é usada para triagem pré-natal. Em certas modalidades, fragmentos de cromatina sem células são usados em um método de rastreamento pré-natal.
[00565] O diagnóstico pré-natal ou a triagem pré- natal refere-se ao teste de doenças ou condições em um feto ou embrião antes de nascer. O objetivo é detectar defeitos congênitos, como defeitos do tubo neural, síndrome de Down, anormalidades cromossômicas, distúrbios genéticos e outras condições, como espinha bífida, fenda palatina, doença de Tay Sachs, anemia falciforme, talassemia, fibrose cística, distrofia muscular e síndrome do X frágil. A triagem também pode ser usada para discernimento sexual pré-natal. Os procedimentos de teste comuns incluem amniocentese, ultrassonografia, incluindo ultrassonografia de translucência nucal, teste de marcadores séricos ou triagem genética. Em alguns casos, os testes são administrados para determinar se o feto será abortado, embora médicos e pacientes também considerem útil diagnosticar gestações de alto risco mais cedo, para que o parto possa ser agendado em um hospital terciário, onde o bebê pode receber cuidados adequados.
[00566] Foi percebido que existem células fetais que estão presentes no sangue da mãe e que essas células apresentam uma fonte potencial de cromossomos fetais para o diagnóstico pré-natal baseado em DNA. Além disso, o DNA fetal varia de cerca de 2-10% do DNA total no sangue materno. Os testes genéticos pré-natais atualmente disponíveis geralmente envolvem procedimentos invasivos.
Por exemplo, a amostragem das vilosidades coriônicas (CVS) realizada em uma mulher grávida entre 10 e 12 semanas após a gravidez e a amniocentese realizada entre 14 e 16 semanas contêm procedimentos invasivos para obter a amostra para testar anormalidades cromossômicas em um feto. As células fetais obtidas através destes procedimentos de amostragem são geralmente testadas para anormalidades cromossômicas usando análises citogenéticas ou hibridização fluorescente in situ (FISH). Foi demonstrado que o DNA fetal sem células existe no plasma e soro de mulheres grávidas desde a sexta semana de gestação, com concentrações aumentando durante a gravidez e atingindo o pico antes do parto. Como essas células aparecem muito cedo na gravidez, elas podem formar a base de um teste preciso e não invasivo do primeiro trimestre. Não estando limitado por uma teoria, a presente invenção fornece sensibilidade sem precedentes na detecção de baixas quantidades de DNA fetal. Não estando limitado por uma teoria, quantidades abundantes de DNA materno são geralmente recuperadas concomitantemente junto com o DNA fetal de interesse, diminuindo assim a sensibilidade na quantificação do DNA fetal e na detecção de mutações. A presente invenção supera esses problemas pela inesperadamente alta sensibilidade do ensaio.
[00567] A classe de histonas H3 consiste em quatro tipos diferentes de proteínas: os principais tipos, H3. 1 e H3. 2; o tipo de substituição, H3. 3; e a variante específica do testículo, H3t. Embora H3. 1 e H3. 2 estejam intimamente relacionados, diferindo apenas no Ser96, o H3.
1 difere do H3. 3 em pelo menos 5 posições de aminoácidos.
Além disso, o H3. 1 é altamente enriquecido no fígado fetal, em comparação com a sua presença em tecidos adultos, incluindo fígado, rim e coração. No tecido humano adulto, a variante H3. 3 é mais abundante que a variante H3. 1, enquanto o inverso é verdadeiro para o fígado fetal. A presente invenção pode usar essas diferenças para detectar nucleossomos fetais e ácido nucleico fetal em uma amostra biológica materna que compreende células fetais e maternas e/ou ácido nucleico fetal.
[00568] Numa modalidade, os nucleossomos fetais podem ser obtidos do sangue. Em outras modalidades, os nucleossomos fetais são obtidos a partir de uma amostra de muco cervical. Em certas modalidades, uma amostra de muco cervical é obtida por swab ou lavagem de uma mulher grávida no início do segundo trimestre ou no final do primeiro trimestre da gravidez. A amostra pode ser colocada em uma incubadora para liberar o DNA preso no muco. A incubadora pode ser ajustada em 37 ° C. A amostra pode ser agitada por aproximadamente 15 a 30 minutos. O muco pode ser ainda dissolvido com uma mucinase com a finalidade de liberar DNA. A amostra também pode ser sujeita a condições, tais como tratamento químico e similares, como bem conhecido na técnica, para induzir apoptose para liberar nucleossomos fetais. Assim, uma amostra de muco cervical pode ser tratada com um agente que induz apoptose, pelo qual os nucleossomos fetais são liberados. No que se refere ao enriquecimento do DNA fetal circulante, é feita referência às publicações de patente USNos. 20070243549 e 20100240054.
A presente invenção é especialmente vantajosa quando se aplica os métodos e sistemas à triagem pré-natal, onde apenas uma pequena fração de nucleossomos ou DNA pode ter origem fetal.
[00569] O rastreamento pré-natal de acordo com a presente invenção pode ser para uma doença que inclui, mas não se limita a Trissomia 13, Trissomia 16, Trissomia 18, síndrome de Klinefelter (47, XXY), (47, XYY) e (47, XXX), síndrome de Turner, Síndrome de Down (Trissomia 21), Fibrose Cística, Doença de Huntington, Beta Talassemia, Distrofia Miotônica, Anemia Falciforme, Porfiria, Síndrome do XFrágil, Translocação Robertsoniana, Síndrome de Angelman, Síndrome de DiGeorge e Síndrome de Wolf- Hirschhorn.
[00570] Vários outros aspectos da invenção estão relacionados ao diagnóstico, prognóstico e/ou tratamento de defeitos associados a uma ampla gama de doenças genéticas, que são descritas mais detalhadamente no site dos Institutos Nacionais de Saúde sob o tópico subseção Transtornos genéticos (site em health. nih.
gov/topic/Genetic Distúrbios).
Câncer e detecção de resistência a medicamentos contra câncer
[00571] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para detectar genes e mutações associadas ao câncer. Em certas modalidades, mutações associadas à resistência são detectadas. A amplificação de células tumorais resistentes ou o aparecimento de mutações resistentes em populações clonais de células tumorais podem surgir durante o tratamento (ver, por exemplo, Burger JA, et al.,Evolução clonal em pacientes com leucemia linfocítica crônica que desenvolvem resistência à inibição da BTK. Nat Commun. 2016May 20;7:11589; Landau DA, et al.,Mutations driving CLL and their evolution in progression and relapse. Nature. 2015Oct 22;526(7574):525- 30; Landau DA, et al.,Clonal evolution in hematological malignancies and therapeutic implications. Leukemia.
2014Jan;28(1):34-43; e Landau DA, et al.,Evolution and impact of subclonal mutations in chronic lymphocytic leukemia. Célula. 2013 fev 14;152(4):714-26).
Consequentemente, a detecção de tais mutações requer ensaios altamente sensíveis e o monitoramento requer biópsia repetida. As biópsias repetidas são inconvenientes, invasivas e caras. Mutações resistentes podem ser difíceis de detectar em uma amostra de sangue ou em outra amostra biológica não invasiva coletada (por exemplo, sangue, saliva, urina) usando os métodos anteriores conhecidos na técnica. Mutações resistentes podem se referir a mutações associadas à resistência à quimioterapia, terapia direcionada ou imunoterapia.
[00572] Em certas modalidades, mutações ocorrem em cânceres individuais que podem ser usados para detectar a progressão do câncer. Em uma modalidade, mutações relacionadas à atividade citolítica de células T contra tumores foram caracterizadas e podem ser detectadas pela presente invenção (ver, por exemplo, Rooney et al.,Propriedades moleculares e genéticas de tumores associados à atividade citolítica imune local, Cell.
2015January 15; 160 (1-2): 48–61). Terapias personalizadas podem ser desenvolvidas para um paciente com base na detecção dessas mutações (ver, por exemplo, WO2016100975A1). Em certas modalidades, mutações específicas do câncer associadas à atividade citolítica podem ser uma mutação em um gene selecionado do grupo que consiste em CASP8, B2M, PIK3CA, SMC1A, ARID5B, TET2, ALPK2, COL5A1, TP53, DNER, NCOR1, MORC4, CIC, IRF6, MYOCD, ANKLE1, CNKSR1, NF1, SOS1, ARID2, CUL4B, DDX3X, FUBP1, TCP11L2, HLA-A, B ou C, CSNK2A1, MET, ASXL1, PD-L1, PD-L2, IDO1, IDO2, ALOX12BALOX15B, ou ganho de número de cópias, excluindo eventos de cromossomos inteiros, afetando qualquer uma das seguintes bandas cromossômicas: 6q16.
1−q21, 6q22. 31−q24. 1, 6q25. 1−q26, 7p11. 2−q11. 1, 8p23.
1, 8p11. 23−p11. 21 (contendo IDO1, IDO2), 9p24. 2-p23 (contendo PDL1, PDL2), 10p15. 3, 10p15. 1−p13, 11p14. 1, 12p13. 32−p13. 2, 17p13. 1 (contendo ALOX12B, ALOX15B) e 22q11. 1-q11. 21.
[00573] Em certas modalidades, a presente invenção é usada para detectar uma mutação do câncer (por exemplo, mutação da resistência) durante o curso de um tratamento e após o término do tratamento. A sensibilidade da presente invenção pode permitir a detecção não invasiva de mutações clonais que surgem durante o tratamento e pode ser usada para detectar uma recorrência na doença.
[00574] Em certas modalidades de exemplo, a detecção de microRNAs (miRNA) e/ouAs assinaturas de miRNA do miRNA expresso diferencialmente podem ser usadas para detectar ou monitorar a progressão de um câncer e/ou detectar resistência a medicamentos para uma terapia contra o câncer. Como, Nadal et al. (Nature Scientific Reports, (2015) doi: 10. 1038/srep12464) descrevem assinaturas de mRNA que podem ser usadas para detectar câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
[00575] Em certas modalidades exemplares, a presença de mutações de resistência nas subpopulações clonais de células pode ser usada na determinação de um regime de tratamento. Em outras modalidades, terapias personalizadas para o tratamento de um paciente podem ser administradas com base em mutações tumorais comuns. Em certas modalidades, mutações comuns surgem em resposta ao tratamento e levam à resistência ao medicamento. Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada no monitoramento de pacientes para células que adquirem uma mutação ou amplificação de células que abrigam essas mutações resistentes a medicamentos.
[00576] O tratamento com vários agentes quimioterapêuticos, particularmente com terapias direcionadas, como inibidores da tirosina quinase, freqüentemente leva a novas mutações nas moléculas alvo que resistem à atividade da terapêutica. Múltiplas estratégias para superar essa resistência estão sendo avaliadas, incluindo o desenvolvimento de terapias de segunda geração que não são afetadas por essas mutações e o tratamento com múltiplos agentes, incluindo aqueles que atuam a jusante da mutação de resistência. Em uma modalidade exemplar, uma mutação comum ao ibrutinib, uma molécula que visa a tirosina quinase de Bruton (BTK) e usada para CLL e certos linfomas, é uma alteração de cisteína para serina na posição 481 (BTK/C481S). O erlotinibe, que tem como alvo o domínio tirosina-quinase do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), é comumente usado no tratamento de câncer de pulmão e tumores resistentes invariavelmente se desenvolvem após a terapia. Uma mutação comum encontrada em clones resistentes é uma mutação de treonina para metionina na posição 790.
[00577] Mutações não silenciosas compartilhadas entre populações de pacientes com câncer e mutações resistentes comuns que podem ser detectadas com a presente invenção são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, WO/2016/187508). Em certas modalidades, mutações de resistência à droga podem ser induzidas por tratamento com ibrutinibe, erlotinibe, imatinibe, gefitinibe, crizotinibe,
trastuzumabe, vemurafenibe, RAF/MEK, terapia de bloqueio de ponto de verificação ou terapia antiestrogênica. Em certas modalidades, as mutações específicas do câncer estão presentes em um ou mais genes que codificam uma proteína selecionada do grupo que consiste no Ligando de Morte programada 1 (PD-L1), receptor de andrógeno (AR), Tirosina Quinase de Bruton (BTK), Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), BCR-Abl, c-kit, PIK3CA, HER2, EML4-ALK, KRAS, ALK, ROS1, AKT1, BRAF, MEK1, MEK2, NRAS, RAC1 e ESR1.
[00578] Os pontos de verificação imunes são vias inibitórias que desaceleram ou interrompem as reações imunes e previnem danos excessivos aos tecidos decorrentes da atividade descontrolada das células imunes. Em certas modalidades, o ponto de verificação imune direcionado é o gene programado morte-1 (PD-1 ou CD279) (PDCD1). Em outras modalidades, o ponto de verificação imune direcionado é o antígeno citotóxico associado a linfócitos T (CTLA-4). Em modalidades adicionais, o ponto de verificação imune direcionado é outro membro da superfamília CD28 e CTLA4Ig, como BTLA, LAG3, ICOS, PDL1 ou KIR. Em outras modalidades adicionais, o ponto de verificação imune direcionado é um membro da superfamília TNFR, como CD40, OX40, CD137, GITR, CD27 ou TIM-3.
[00579] Recentemente, a expressão genética em tumores e seus microambientes foram caracterizados no nível de uma célula (ver, por exemplo, Tirosh, et al. Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single cell RNA-seq. Science 352, 189-196, doi:10.
1126/science. aad0501 (2016)); Tirosh et al.,RNA-seq de célula única suporta uma hierarquia de desenvolvimento no oligodendroglioma humano. Nature. 2016Nov 10;539(7628):309-
313. doi: 10. 1038/nature20123. Epub 2016Nov 2; e número de série da publicação internacional de patente WO2017004153A1). Em certas modalidades, as assinaturas de genes podem ser detectadas usando a presente invenção. Em uma modalidade, os genes do complemento são monitorados ou detectados em um microambiente de tumor. Numa modalidade, os programas MITF e AXL são monitorados ou detectados. Em uma modalidade, uma célula-tronco específica de tumor ou assinatura de célula progenitora é detectada. Tais assinaturas indicam o estado de uma resposta imune e o estado de um tumor. Em certas modalidades, o estado de um tumor em termos de proliferação, resistência ao tratamento e abundância de células imunes pode ser detectado.
[00580] Assim, em certas modalidades, a invenção fornece painéis de detecção de câncer de baixo custo, rápidos e multiplexados para DNA circulante, como DNA de tumor, particularmente para monitorar a recorrência de doenças ou o desenvolvimento de mutações de resistência comuns.
Aplicações de imunoterapia
[00581] As modalidades divulgadas neste documento também podem ser úteis em outros contextos de imunoterapia.
Por exemplo, em algumas modalidades, métodos de diagnóstico, prognóstico e/ou estadiamento de uma resposta imune em um sujeito compreendem detectar um primeiro nível de expressão, atividade e/ou função de um ou mais biomarcadores e comparar o nível detectado com um nível de controle em que uma diferença no nível detectado e no nível de controle indica que a presença de uma resposta imune no sujeito.
[00582] Em certas modalidades, a presente invenção pode ser usada para determinar a disfunção ou ativação de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL). Os TILs podem ser isolados de um tumor usando métodos conhecidos. Os TILs podem ser analisados para determinar se devem ser usados em terapias adotivas de transferência de células. Além disso, as células T do receptor de antígeno quimérico (células TCAR) podem ser analisadas para uma assinatura de disfunção ou ativação antes de administrá-las a um sujeito.
Assinaturas exemplificativas para células T disfuncionais e ativadas foram descritas (ver, por exemplo, Singer M, et al.,Um Módulo Genético Distinto para Disfunção Desacoplado da Ativação em Células TInfiltrantes de Tumor. Célula. 2016 set 8;166(6):1500-1511. e9. doi: 10. 1016/j. cell. 2016.
08. 052).
[00583] Em algumas modalidades, C2c2 é usado para avaliar esse estado de células imunes, como células T (por exemplo, células CD8 + e/ou CD4+ T). Em particular, a ativação de células T e/ou a disfunção pode ser determinada, por exemplo, com base em genes ou assinaturas de genes associadas a um ou mais dos estados das células T.
Dessa maneira, c2c2 pode ser usado para determinar a presença de uma ou mais subpopulações de células T.
[00584] Em algumas modalidades, C2c2 pode ser usado em um teste de diagnóstico ou pode ser usado como um método para determinar se um paciente é adequado para administrar uma imunoterapia ou outro tipo de terapia. Por exemplo, a detecção de assinaturas de genes ou biomarcadores pode ser realizada via c2c2 para determinar se um paciente está respondendo a um determinado tratamento ou, se o paciente não está respondendo, se isso pode ocorrer devido à disfunção das células T. Essa detecção é informativa sobre os tipos de terapia que o paciente é mais adequado para receber. Por exemplo, se o paciente deve receber imunoterapia.
[00585] Em algumas modalidades, os sistemas e ensaios aqui divulgados podem permitir que os médicos identifiquem se a resposta de um paciente a uma terapia (por exemplo, uma terapia de transferência de células adotiva (ACT)) é devida à disfunção celular e, se houver, níveis de regulação positiva e a regulação negativa na assinatura do biomarcador permitirá que os problemas sejam resolvidos. Por exemplo, se um paciente que recebe ACT não responde, as células administradas como parte do ACT podem ser analisadas por um ensaio aqui divulgado para determinar o nível relativo de expressão de uma assinatura de biomarcador conhecida por estar associada à ativação celular e/ou estados de disfunção. Se um determinado receptor ou molécula inibidora é regulado para cima nas células do TCA, o paciente pode ser tratado com um inibidor desse receptor ou molécula. Se um determinado receptor ou molécula estimulante é sobrerregulado nas células ACT, o paciente pode ser tratado com um agonista desse receptor ou molécula.
[00586] Em certas modalidades exemplares, os sistemas, métodos e dispositivos descritos neste documento podem ser usados para rastrear assinaturas de genes que identificam um tipo de célula, fenótipo celular ou estado celular específico. Da mesma forma, através do uso de métodos como detecção compactada, as modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas para detectar transcriptomas. Os dados de expressão gênica são altamente estruturados, de modo que o nível de expressão de alguns genes é preditivo do nível de expressão de outros. O conhecimento de que os dados de expressão gênica são altamente estruturados permite supor que o número de graus de liberdade no sistema seja pequeno, o que permite supor que a base para o cálculo da abundância relativa de genes seja escassa. É possível fazer várias suposições biologicamente motivadas que permitem aos Requerentes recuperar os termos de interação não linear durante a sub- amostragem sem ter nenhum conhecimento específico de quais genes provavelmente interagem. Em particular, se os Candidatos assumirem que as interações genéticas são de baixa classificação, esparsas ou uma combinação delas, o número real de graus de liberdade é pequeno em relação à expansão combinatória completa, o que permite que os Candidatos deduzam a paisagem não-linear completa com uma relativa pequeno número de perturbações. Para contornar essas premissas, teorias analíticas de conclusão da matriz e sensoriamento comprimido podem ser usadas para projetar experimentos de perturbação combinatória sub-amostrados.
Além disso, uma estrutura de aprendizado de kernel pode ser usada para empregar subamostragem, construindo funções preditivas de perturbações combinatórias sem aprender diretamente qualquer coeficiente de interação individual OSensor de compressas fornece uma maneira de identificar o número mínimo de transcrições de destino a serem detectadas para obter um perfil abrangente de expressão gênica. Os métodos para detecção compactada são divulgados em PCT/US2016/059230 “Sistemas e métodos para determinação de abundâncias relativas de biomoléculas” arquivado em 27 de outubro de 2016, que é incorporado aqui por referência.
Tendo utilizado métodos como sensor comprimido para identificar um conjunto mínimo de alvos de transcrição, um conjunto de RNAs guia correspondentes pode então ser projetado para detectar os referidos transcritos. Por conseguinte, em certas modalidades exemplares, um método para obter um perfil de expressão gênica da célula compreende detectar, usando as modalidades divulgadas, aqui um conjunto mínimo de transcritos que fornece um perfil de expressão gênica de uma célula ou população de células.
DETECTANDO EDIÇÕES GÊNICAS E/OU EFEITOS NÃO ALVO
[00587] As modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas em combinação com outras ferramentas de edição de genes para confirmar que uma edição ou edição genética desejada foi bem-sucedida e/ou para detectar a presença de efeitos fora do alvo. As células que foram editadas podem ser rastreadas usando um ou mais guias para um ou mais locais alvo. Como as modalidades aqui divulgadas utlizam os sistemas CRISPR, também são previstas aplicações teranósticas. Por exemplo, modalidades de genotipagem divulgadas neste documento podem ser usadas para selecionar loci alvo apropriados ou identificar células ou populações de células necessárias na edição do alvo. O mesmo sistema ou sistema separado pode então ser usado para determinar a eficiência da edição. Como descrito nos Exemplos de Trabalho abaixo, as modalidades divulgadas neste documento podem ser usadas para projetar tubulações teranósticas simplificadas em menos de uma semana.
DETECTAR ITENS MARCADOS DE ÁCIDO NUCLEICO
[00588] Alternativamente, as modalidades descritas neste documento podem ser usadas para detectar identificadores de ácido nucleico. Os identificadores de ácido nucleico são ácidos nucleicos não codificadores que podem ser usados para identificar um artigo específico.
Exemplos de identificadores de ácidos nucleicos, como marcas d'água de DNA, são descritos em Heider e Barnekow.
“DNA watermarks: A proof of concept” BMCMolecular Biology 9:40 (2008). Os identificadores de ácido nucleico também podem ser um código de barras de ácido nucleico. Um código de barras baseado em ácido nucleico é uma sequência curta de nucleotídeos (por exemplo, DNA, RNA ou combinações dos mesmos) que é usada como um identificador para uma molécula associada, como uma molécula alvo e/ou ácido nucleico alvo.
Um código de barras de ácido nucleico pode ter um comprimento de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nucleotídeos e podem estar na forma de fita simples ou dupla . Um ou mais códigos de barras de ácidos nucleicos podem ser anexados ou "marcados" a uma molécula alvo e/ou ácido nucleico alvo. Essa ligação pode ser direta (por exemplo, ligação covalente ou não covalente do código de barras à molécula alvo) ou indireta (por exemplo, através de uma molécula adicional, por exemplo, um agente de ligação específico, como um anticorpo (ou outra proteína) ou um adaptador de recebimento de código de barras (ou outra molécula de ácido nucleico). Molécula alvo e/ou os ácidos nucleicos alvo podem ser marcados com vários códigos de barras de ácidos nucleicos de maneira combinatória, como um concatemer de código de barras de ácidos nucleicos.
Normalmente, um código de barras de ácido nucleico é usado para identificar moléculas alvo e/ou visar ácidos nucleicos como sendo de um compartimento específico (por exemplo, um volume discreto), possuindo uma propriedade física específica (por exemplo, afinidade, comprimento, sequência, etc.) ou tendo sido sujeita a certas condições de tratamento. Molécula alvo e/ou o ácido nucleico alvo pode ser associado a vários códigos de barras de ácido nucleico para fornecer informações sobre todos esses recursos (e mais). Os métodos para gerar códigos de barras de ácidos nucleicos são divulgados, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente InternacionalWO/2014/047561.
ENZIMAS
[00589] A aplicação fornece ainda ortólogos de C2c2 que demonstram atividade robusta, tornando-os particularmente adequados para diferentes aplicações de clivagem e detecção de RNA. Esses aplicativos incluem, mas não estão limitados, aos descritos aqui. Mais particularmente, um ortólogo que demonstrou ter uma atividade mais forte do que outros testados é o ortólogo C2c2 identificado a partir do organismo Leptotrichia wadei (LwC2c2). A aplicação fornece, assim, métodos para modificar um locus alvo de interesse, compreendendo entregar ao referido locus uma composição não natural ou manipulada por engenharia compreendendo uma proteína efetora C2c2, mais particularmente uma proteína efetora C2c2 com atividade aumentada, como descrito aqui e um ou mais ácidos nucleicos componentes, em que pelo menos o um ou mais componentes de ácido nucleico são manipulados, o um ou mais componentes de ácido nucleico direciona o complexo para o alvo de interesse e a proteína efetora forma um complexo com um ou mais componentes de ácido nucleico e o complexo se liga a o local de interesse do alvo. Em modalidades particulares, o locus alvo de interesse compreende RNA. O aplicativo ainda fornece o uso das proteínas efetoras Cc2 com atividade aumentada na interferência específica da sequência de RNA, regulação gênica específica da sequência de RNA, triagem de produtos de RNA ou RNA ou lincRNA ou RNA não codificante ou RNA nuclear ou mRNA, mutagênese, Hibridização in situ ou fluorescência fluorescente.
[00590] A invenção será descrita ainda nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.
EXEMPLOS DE TRABALHO EXEMPLO 1 - Protocolos Gerais
[00591] São fornecidas duas maneiras de realizar um teste de diagnóstico de C2c2 para DNA e RNA. Este protocolo também pode ser utilizado com variantes de detecção de proteínas após administração dos aptâmeros de detecção. A primeira é uma reação em duas etapas, onde a amplificação e a detecção de C2c2 são feitas separadamente. A segunda é onde tudo é combinado em uma reação e isso é chamado de reação em duas etapas. É importante ter em mente que a amplificação pode não ser necessária para amostras de maior concentração, por isso é bom ter um protocolo C2c2 separado que não tenha amplificação incorporada.
Tabela 11. Somente Efetor CRISPR - Sem amplificação: Volume Componente (µL) Proteína (44 nM final) 2 crRNA (12 nM final) 1 alvo de plano de fundo (total de 100 ng) 1
RNA alvo (variável) 1 Sonda com sensor de RNA (125 nM) 4 MgCl2 (6 mM final) 2 Tampão de reação 10x 2 Inibidores da RNAse (murinos de NEB) 2 H2O 5 Total 20
[00592] O tampão de reação é: Tris-HCl 40 mM, NaCl 60 mM, pH7,3
[00593] Realizar esta reação por 20 min-3 horas a 37°C. Leitura com excitação: 485 nm/20 nm, emissão: 528 nm/20 nm. Um sinal para a sensibilidade de molécula única pode ser detectado a partir de 20 minutos, mas é claro que a sensibilidade é maior por tempos de reação mais longos.
Reação em duas etapas: Mix de amplificação RPA Tabela 12 Componente Volume (µL) Primário A (100 µM) 0,48 Iniciador B (100 µM) 0,48 Buffer RPA 59 MgAc 5 Alvo (concentração variável) 5 ATP (100 µM do kit 2
NEB) GTP (100 µM do kit NEB) 2 UTP (100 µM do kit NEB) 2 CTP (100 µM do kit NEB) 2 Polimerase T7 (do kit NEB) 2 H2O 25 Total 104,96
[00594] Misture esta reação e, em seguida, re- suspenda dois a três tubos de mistura enzimática liofilizada). Adicione 5 µl de MgAc 280 mM à mistura para iniciar a reação. Reação da pré-forma por 10 a 20 min. Cada reação é de 20 µL, o que é suficiente para até cinco reações.
Tabela 13. Mistura de detecção C2c2 Volume Componente (µL) Proteína (44 nM final) 2 crRNA (12 nM final) 1 alvo de plano de fundo (total de 100 ng) 1 Reação 1 Sonda com sensor de RNA (125 nM) 4 MgCl2 (6 mM final) 2 Tampão de reação 10x 2 Inibidores da RNAse (murinos de NEB) 2 H2O 5 Total 20
[00595] O tampão de reação é: Tris-HCl 40 mM, NaCl 60 mM, pH7,3
[00596] Faça isso por 20 min - 3 horas. O tempo mínimo de detecção é de cerca de 20 minutos para ver a sensibilidade de uma molécula. Realizar a reação por mais tempo apenas aumenta a sensibilidade.
Tabela 14. Reação de uma panela: Volume (µL) Componente Primário A (100 µM) 0,48 Iniciador B (100 µM) 0,48 Buffer RPA 59 MgAc 5 Lw2C2c2 (44 nM final) 2 crRNA (12 nM final) 2 RNA de fundo (de 250 ng/µL) 2 Substrato de alerta RNAse (após ressuspensão em 20 µL) 5 inibição de RNAse murina de NEB 10 Alvo (concentração variável) 5 ATP (100 µM do kit NEB) 2 GTP (100 µM do kit NEB) 2 UTP (100 µM do kit NEB) 2 CTP (100 µM do kit NEB) 2 Polimerase T7 (do kit NEB) 2 H2O 4 Total 104,96
[00597] O kit NEB mencionado é o HighScribe T7High Yield Kit. Para ressuspender o tampão, use uma concentração de 1,5x: ressuspenda três tubos de substrato liofilizado em 59 µL de tampão e use na mistura acima. Cada reação é de 20 µL, o que é suficiente para 5 reações. A sensibilidade de molécula única com esta reação foi observada em 30 a 40 minutos.
EXEMPLO 2 - C2C2 DE LEPTOTRICHIA WADEI MEDIA A
DETECÇÃO ALTAMENTE SENSÍVEL E ESPECÍFICA DE DNA E RNA
[00598] A detecção rápida, barata e sensível de ácidos nucleicos pode ajudar na detecção de patógenos no ponto de atendimento, genotipagem e monitoramento de doenças. O efetor de CRISPR direcionado a RNA e direcionado a RNACas13a (anteriormente conhecido como C2c2) exibe um "efeito colateral" da atividade promíscua de RNAse no reconhecimento do alvo. O requerente combinou o efeito colateral de Cas13a com amplificação isotérmica para estabelecer um diagnóstico baseado em CRISPR(CRISPR-Dx), fornecendo detecção rápida de DNA ou RNA com sensibilidade attomolar e especificidade de incompatibilidade de base única. O requerente usou esta plataforma de detecção molecular baseada em Cas13a, denominada SHERLOCK (Reporter Enzimático Específico de Alta Sensibilidade), para detectar cepas específicas do vírus Zika e Dengue, distinguir bactérias patogênicas, genotipar o DNA humano e identificar mutações no DNA do tumor sem células. Além disso, os reagentes de reação SHERLOCK podem ser liofilizados para independência da cadeia de frio e armazenamento a longo prazo, e facilmente reconstituídos em papel para aplicações em campo.
[00599] A capacidade de detectar rapidamente ácidos nucleicos com alta sensibilidade e especificidade de base única em uma plataforma portátil pode ajudar no diagnóstico e monitoramento de doenças, epidemiologia e tarefas gerais de laboratório. Embora existam métodos para detectar ácidos nucléicos (1-6), eles têm vantagens e desvantagens entre sensibilidade, especificidade, simplicidade, custo e velocidade. As Repetições Palindrômicas Curtas Regularmente Intercaladas Agrupadas microbianas (CRISPR) e os sistemas imunológicos adaptáveis associados a CRISPR (CRISPR-Cas) contêm endonucleases programáveis que podem ser aproveitadas para o diagnóstico baseado em CRISPR (CRISPR- Dx). Enquanto algumas enzimas Cas têm como alvo o DNA (7, 8), RNases efetoras guiadas por RNA efetoras, como Cas13a (anteriormente conhecida como C2c2) (8), podem ser reprogramadas com RNAs CRISPR (crRNAs) (9-11) para fornecer uma plataforma para detecção específica de RNA. Após o reconhecimento de seu alvo de RNA, o Cas13a ativado se envolve na clivagem "colateral" de RNAs não-alvo próximos (10). Essa atividade de clivagem colateral programada por crRNA permite que Cas13a detecte a presença de um RNA específico in vivo desencadeando a morte celular programada (10) ou in vitro por degradação inespecífica do RNA marcado (10, 12). Aqui, o Requerente descreve o SHERLOCK (Reporter Enzimático Específico de Alta Sensibilidade), uma plataforma de detecção de ácido nucleico in vitro com sensibilidade attomolar com base em amplificação de ácido nucleico e clivagem colateral mediada por 3Cas13a de um RNA repórter comercial (12), permitindo a detecção em tempo real do alvo (Fig. 17).
Métodos Clonagem de loci C2c2 e proteínas para expressão
[00600] Para o ensaio de eficiência bacteriana in vivo, as proteínas C2c2 de Leptotrichia wadei F0279 e Leptotrichia shahii foram ordenadas como genes otimizados por códon para expressão de mamíferos (Genscript, Jiangsu, China) e clonadas em backbones de pACYC184, juntamente com as repetições diretas correspondentes, que flanqueavam um beta- espaçador direcionado a lactamase ou espaçador não direcionado. A expressão do espaçador foi conduzida por um promotor J23119.
[00601] Para purificação de proteínas, proteínas C2c2 otimizadas para códons de mamíferos foram clonadas no vetor de expressão bacteriana para purificação de proteínas (6x His/Twin Strep SUMO, um vetor de expressão baseado em pET recebido como presente de Ilya Finkelstein).
Ensaio de eficiência bacteriana de C2c2in vivo
[00602] Os plasmídeos de eficiência in vivo LwC2c2 e LshC2c2 e um plasmídeo beta-lactamase descrito anteriormente (Abudayyeh 2016) foram co-transformados em células competentes NovaBlue Singles (Millipore) a 90ng e 25 ng, respectivamente. Após a transformação, as diluições das células foram plaqueadas na placa de ampicilina e coranficol LB-ágar e incubadas durante a noite a 37C. As colônias foram contadas no dia seguinte.
Alvo do ácido nucleico e preparação de crRNA
[00603] Os alvos de ácido nucleico foram amplificados por PCR com KAPAHifi Hot Start (Kapa Biosystems), extraídos em gel e purificados usando o kit de extração de gel MinElute (Qiagen). O dsDNA purificado foi incubado com polimerase T7 durante a noite a 30 °C usando o kit de síntese de RNA de alto rendimento rápido HiScribe T7 (New England Biolabs) e o RNA foi purificado com o kit de limpeza de transcrição MEGAclear (Thermo Fisher).
[00604] Para a preparação de crRNA, as construções foram ordenadas como DNA (Integrated DNATechnologies) com uma sequência promotora T7 anexada. ODNA do crRNA foi emparelhado com um iniciador T7 curto (concentrações finais 10 uM) e incubado com polimerase T7 durante a noite a 37°C usando o kit de síntese de RNAHiScribe T7Quick High Yield (New England Biolabs). O crRNA foi purificado utilizando esferas limpas de RNAXP (Beckman Coulter) na proporção 2x de esferas para o volume de reação, com uma suplementação adicional de 1,8x de isopropanol (Sigma).
Amplificação isotérmica NASBA
[00605] Detalhes da reação do NASBA estão descritos em [Pardee 2016]. Para um volume total de reação de 20 µL, 6,7 µL de tampão de reação (Life Sciences, NECB-24), 3,3 µl de Nucleotide Mix (Life Sciences, NECN-24), 0,5 µL de água livre de nuclease, 0,4 µL de 12,5 µM de iniciadores de NASBA, 0,1 uL de inibidor de RNase (Roche, 03335402001) e 4 µL de amplicon de RNA (ou água para o controle negativo) foram montados a 4°C e incubados a 65°C por 2 min e depois a 41°C por 10 min. Foram adicionados 5 µL da mistura de enzimas (Life Sciences, NEC-1-24) a cada reação, e a mistura de reação foi incubada a 41°C por 2 h. Os iniciadores de NASBA utilizados foram 5'- AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT-3' (SEQIDNO: 335) e 5'-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGT-3' (SEQIDNO: 336), e a parte sublinhada indica a sequência do promotor T7.
Amplificação de Recombinase Polymerase
[00606] Os iniciadores para RPA foram projetados usando o NCBIPrimer blast (Ye et al.,BMCBioinformaics 13, 134 (2012) usando parâmetros padrão, com exceção do tamanho do amplicon (entre 100 e 140 nt), temperaturas de fusão do iniciador (entre 54C e 67C) e tamanho do iniciador (entre 30 e 35 nt). Os iniciadores foram preparados por IDT (Tecnologias de DNAIntegradas).
[00607] As reações RPA e RT-RPA executadas foram conforme as instruções do TwistAmp® Basic ou TwistAmp® Basic RT (TwistDx), respectivamente, com exceção do aumento de 280 mM de MgAc antes do modelo de entrada. As reações foram realizadas com 1uL de entrada por 2 h a 37°C, a menos que descrito de outra forma.
Purificação de proteína LwC2c2
[00608] Os vetores de expressão bacteriana C2c2 foram transformados em células competentes Rosetta™ 2 (DE3) pLysSSingles (Millipore). Uma cultura inicial de 16 ml foi cultivada em meio de crescimento Terrific Broth 4 (12 g/L triptone, 24 g/L extrato de levedura, 9,4 g/LK2HPO, 2. 2 g/LKH2PO4, Sigma) (TB) foi utilizado para inocular 4L de TB, o qual foi incubado a 37C, 300RPM até um OD600 de 0,6.
Nesse momento, a expressão proteica foi induzida por suplementação com IPTG (Sigma) até uma concentração final de 500uM, e as células foram resfriadas a 18°C por 16h para expressão proteica. As células foram então centrifugadas a 5200 g, 15 min, 4C. O sedimento celular foi colhido e armazenado a -80C para purificação posterior.
[00609] Todos os passos subsequentes da purificação de proteínas são realizados a 4C. O sedimento celular foi triturado e ressuspenso em tampão de lise (Tris-Hcl 20 mM, NaCl 500 mM, DTT1 mM, pH8,0) suplementado com inibidores de protease (comprimidos sem Ultra EDTA completos), lisozima e benzonase, seguidos de sonicação (Sonifier 450, Branson, Danbury, CT) com as seguintes condições: amplitude de 100 por 1segundo ligada e 2 segundos desligada com um tempo total de sonicação de 10 minutos. O lisado foi eliminado por centrifugação durante 1 hora a 4°C a 10. 000 g e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro Stericup de 0,22 mícron (EMDMillipore). O sobrenadante filtrado foi aplicado a StrepTactin Sepharose (GE) e incubado com rotação durante 1 hora, seguido por lavagem da resina StrepTactin ligada à proteína três vezes em tampão de lise.
A resina foi ressuspensa em tampão de digestão SUMO (Tris- HCl 30 mM, NaCl 500 mM, 1 mMDTT, Igepal 0,15% (NP-40), pH8,0) juntamente com 250 unidades de protease SUMO (ThermoFisher) e incubada durante a noite a 4°C com rotação. A digestão foi confirmada por coloração com SDS- PAGE e Commassie Blue e o eluato de proteína foi isolado girando a resina para baixo. A proteína foi carregada em uma coluna de troca catiônica HiTrap SPHP de 5 mL (GEHealthcare Life Sciences) via FPLC (AKTAPURE, GEHealthcare Life Sciences) e eluída sobre um gradiente de sal de 130mM a 2MNaCl em tampão de eluição (20mMTris-HCl, 1mMTDT, 5% Glicerol, pH8,0). As frações resultantes foram testadas quanto à presença de LwC2c2 por SDS-PAGE e as frações contendo a proteína foram reunidas e concentradas através de uma Unidade de Filtro Centrífuga a 1 mL em tampão S200 (HEPES10 mM, NaCl 1M, MgCl25mM, DTT2mM, pH7,0).
A proteína concentrada foi carregada em uma coluna de filtração em gel (Superdex® 20010/300GL, GEHealthcare Life Sciences) via FPLC. As frações resultantes da filtração em gel foram analisadas por SDS-PAGE e as frações contendo LwC2c2 foram reunidas e as tampas trocadas no tampão de armazenamento (NaCl 600 mM, Tris-HCl 50 mM pH7,5, 5% Glicerol, 2mMDTT) e congeladas a -80C para armazenamento.
Detecção colateral de LwC2c2
[00610] Os ensaios de detecção foram realizados com repórter de substrato LwC2c2 purificado a 45nM, crRNA22,5nM, repórter de substrato 125nM (Thermo Scientific RNAse Alert v2), inibidores de 2µL de RNase murina, 100ng de RNA total de fundo e quantidades variáveis de alvo de ácido nucleico de entrada, salvo indicação em contrário, no ensaio de nuclease tampão (Tris-HCl 40 mM, NaCl 60 mM, MgCl26 mM, pH7,3). Se a entrada foi DNA amplificado, incluindo um promotor de T7 a partir de uma reação RPA, a reação C2c2 acima foi modificada para incluir ATP1mM, GTP1mM, UTP1mM, CTP1mM e mistura de polimerase T70,6µL (NEB). Deixou-se que as reações continuassem por 1-3 horas a 37°C (a menos que indicado de outra forma) em um leitor de placas fluorescentes (BioTek) com cinética fluorescente medida a cada 5 minutos.
[00611] A combinação de reação one-pot, amplificação de RPA-DNA, conversão de DNA da polimerase T7 em RNA e detecção de C2c2 foi realizada integrando as condições de reação acima com a mistura de amplificação de RPA.
Resumidamente, em um ensaio de 50 µL de um pote consistiu em 0,48µM de iniciador direto, 0,48µM de iniciador reverso, 1x tampão de reidratação RPA, quantidades variadas de entrada de DNA, proteína recombinante LwC2c245nM, crRNA22,5 nM, RNA total de 250 ng de fundo, repórter de substrato 200 nM (RNase alert v2), 4uL de inibidor de RNase, 2 mMATP, 2 mMGTP, 2 mMUTP, 2 mMCTP, 1 µL de mistura de polimerase T7, 5 mMMgCl2 e 14 mMMgAc.
Análise quantitativa de PCR (qPCR) com sondas TaqMan
[00612] Para comparar a quantificação de SHERLOCK com outros métodos estabelecidos, foi realizado qPCR em uma série de diluições de ssDNA1. Uma sonda TaqMan e um conjunto de iniciadores (sequências abaixo) foram projetados contra ssDNA1 e sintetizados com IDT. Os ensaios foram realizados usando o Master Mix Avançado TaqMan Fast Advanced (Thermo Fisher) e medidos em um Roche LightCycler
480.
Tabela 15. qPCR primer/probe sequências.
Nome Sequência Iniciador GTGGAATTGTGAGCGGATAAAC (SEQIDNO:337) de sentido direto de Iniciador AACAGCAATCTACTCGACCTG (SEQIDNO:338) de sentido reverso de Sonda /56-FAM/AGGAAACAG/ZEN/CTATGACCATGATTACGCC/3IABkFQ/ TaqMan (IDSEQNO:339) RPA em tempo real com SYBRGreen II
[00613] Para comparar a quantificação de SHERLOCK com outros métodos estabelecidos, o Requerente realizou RPA em uma série de diluição de ssDNA1. Para quantificar a acumulação de DNA em tempo real, o Requerente adicionou 1x SYBRGreen II (Thermo Fisher) à mistura de reação RPA típica descrita acima, que fornece um sinal fluorescente que se correlaciona com a quantidade de ácido nucleico. Deixou-se que as reações continuassem por 1 hora a 37°C em um leitor de placas fluorescentes (BioTek) com cinética fluorescente medida a cada 5 minutos.
Preparação e processamento de lentivírus
[00614] A preparação e o processamento do lentivírus foram baseados nos métodos previamente conhecidos.
Resumidamente, 10 µg de derivados de pSB700 que incluem um fragmento de RNA de Zika ou Dengue, 7,5 µg de psPAX2 e 2,5 µg de pMD2. G foram transfectados para células HEK293FT (Life Technologies, R7007) usando o método HeBS-CaCl2. 28 horas após a troca do meio, DMEM suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 4 mM de GlutaMAX (ThermoFisher Scientific), o sobrenadante foi filtrado usando um filtro de seringa de 0,45 µm. Utilizou-se o Kit de Purificação de Lentivírus ViralBind (Cell Biolabs, VPK- 104) e o Lenti-XConcentrator (Clontech, 631231) para purificar e preparar lentivírus do sobrenadante. A concentração viral foi quantificada usando o QuickTiter Lentivirus Kit (Cell Biolabs, VPK-112). Amostras virais foram cravadas em 7% soro humano (Sigma, H4522), foram aquecidos a 95 ° C por 2 min e foram utilizados como entrada no RPA.
Isolamento e purificação de cDNA de amostras de soro humano de Zika
[00615] As amostras suspeitas de soro ou urina humana positiva para zika foram inativadas com tampão AVL (Qiagen) e o isolamento do RNA foi alcançado com o minikit de RNA viral QIAamp (Qiagen). ORNA isolado foi convertido em cDNA por mistura de iniciadores aleatórios, dNTPs e amostra de RNA, seguido de desnaturação por calor por 7 minutos a 70°C. ORNA desnaturado foi então transcrito reversamente com Superscript III (Invitrogen), incubando a 22-25°C por 10 minutos, 50°C por 45 minutos, 55°C por 15 minutos e 80°C por 10 minutos. O cDNA foi então incubado por 20 minutos a 37°C com RNAse H (New England Biolabs)
para destruir o RNA nos híbridos RNA: cDNA.
Extração de DNA genômico da saliva humana
[00616] Foram coletados 2mL de saliva de voluntários que foram impedidos de consumir alimentos ou bebidas 30 minutos antes da coleta. As amostras foram então processadas usando o QIAamp® DNABlood Mini Kit (Qiagen), conforme recomendado pelo protocolo do kit. Para amostras de saliva fervida, 400 µL de solução salina tamponada com fosfato (Sigma) foram adicionados a 100 µL de saliva de voluntário e centrifugados por 5 min a 1800 g. O sobrenadante foi decantado e o sedimento foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 a 0,2% (Sigma) antes da incubação a 95°C por 5 min. 1 mL da amostra foi usada como entrada direta nas reações de RPA.
Liofilização e deposição de papel
[00617] Um papel de filtro de fibra de vidro (Whatman, 1827-021) foi autoclavado por 90 minutos (Consolidated Stills and Sterilizers, MKII) e foi bloqueado em 5% BSA livre de nuclease (EMDMillipore, 126609-10GM) durante a noite. Depois de enxaguar os papéis uma vez com água livre de nuclease (Life technologies, AM9932), eles foram incubados com 4 % RNAsecureTM (Life technologies, AM7006) a 60 ° C por 20 min e foram lavados mais três vezes com a água livre de nuclease. Os papéis tratados foram secos por 20 min a 80°C em uma placa quente (Cole-Parmer,
IKAC-Mag HS7) antes do uso. 1,8 µL da mistura de reação C2c2, como indicado anteriormente, foi colocado no disco (2 mm) que foi colocado em uma placa preta de 384 poços de fundo transparente (Corning, 3544). Para o teste liofilizado, a placa contendo discos de mistura de reação foi congelada rapidamente em nitrogênio líquido e foi liofilizada durante a noite como descrito em Pardee et al (2). As amostras de RPA foram diluídas 1:10 em água isenta de nuclease, e 1,8 µL da mistura foram carregados nos discos de papel e incubados a 37°C usando um leitor de placas (BioTek Neo).
Extração de DNA genômico bacteriano
[00618] Para experimentos envolvendo detecção de CRE, as culturas bacterianas foram cultivadas em caldo de lisogenia (LB) até a fase intermediária, depois sedimentadas e submetidas à extração e purificação de gDNA usando o kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit, usando o protocolo do fabricante para Gram-negativos ou Gram bactérias positivas, conforme apropriado. O gDNA foi quantificado pelo ensaio Quant-It dsDNA em um fluorômetro Qubit e sua qualidade avaliada via espectro de absorbância de 200-300 nm em um espectrofotômetro Nanodrop.
[00619] Para experimentos que discriminam entre E.
coli e P. aeruginosa, as culturas bacterianas foram cultivadas até a fase estacionária precoce no caldo Luria-
Bertani (LB). 1,0 mL de E. coli e P. aeruginosa foram processados usando o kit portátil de extração de gDNA da bactéria PureLyse (Claremont BioSolutions). Foi adicionado tampão de ligação 1X à cultura bacteriana antes de passar pelo cartucho de lise a bateria por três minutos. Tampão de ligação 0,5X em água foi usado como uma solução de lavagem antes de eluir com 150 µL de água.
Quantificação digital de gotículas por PCR
[00620] Para confirmar a concentração das diluições padrão de ssDNA1 e ssRNA1 usadas na Figura 1C, o Requerente realizou o PCR de gotículas digitais (ddPCR). Para quantificação do DNA, as gotículas foram feitas usando o ddPCRSupermix for Probes (sem dUTP) com Sondas qPCRPrimeTime/ensaios de iniciador projetados para direcionar a sequência ssDNA1. Para quantificação de RNA, as gotículas foram feitas usando o kit RT-ddPCR de uma etapa para sondas com sondas PrimeTime qPCR/ensaios de iniciador projetados para direcionar a sequência ssRNA1.
Gotas foram geradas em ambos os casos usando o gerador de gotículas QX200 (BioRad) e transferidas para uma placa de PCR. A amplificação baseada em gotículas foi realizada em um termociclador, conforme descrito no protocolo do kit, e as concentrações de ácido nucleico foram subsequentemente determinadas por medição em um leitor de gotículas QX200.
Padrões sintéticos para genotipagem humana
[00621] Para criar padrões para a chamada precisa de genótipos de amostras humanas, o Requerente projetou iniciadores em torno do alvo SNP para amplificar ~200 regiões bp do DNA genômico humano representando cada um dos dois genótipos homozigotos. O padrão heterozigoto foi então feito misturando os padrões homozigotos em um 1:1Razão.
Esses padrões foram então diluídos para concentrações equivalentes de genoma (~0,56 fg/µL) e usado como entrada para o SHERLOCK ao lado de amostras humanas reais.
Detecção de DNA livre de células mutantes de tumores (cfDNA)
[00622] Padrões simulados de cfDNA simulando amostras reais de cfDNA de pacientes foram adquiridos de um fornecedor comercial (Horizon Discovery Group). Esses padrões foram fornecidos como quatro frações alélicas (100% WT e 0,1%, 1% e 5% de mutante) para os mutantes BRAFV600E e EGFRL858R. 3 µL desses padrões foram fornecidos como entrada para o SHERLOCK.
Análise de dados de fluorescência
[00623] Para calcular os dados de fluorescência subtraídos em segundo plano, a fluorescência inicial das amostras foi subtraída para permitir comparações entre diferentes condições. A fluorescência para condições de fundo (sem entrada ou sem condições de crRNA) foi subtraída das amostras para gerar fluorescência subtraída de fundo.
[00624] As proporções de guia para SNP ou discriminação de deformação foram calculadas dividindo cada guia pela soma dos valores de guia, para ajustar a variação geral de amostra para amostra. As razões de crRNA para discriminação de SNP ou cepa foram calculadas para ajustar a variação geral de amostra para amostra da seguinte maneira: A parte de imagem com identificação de relação rId10 não foi encontrada no arquivo.
Razão crRNA Ai onde Ai e Bi se referem aos valores de intensidade SHERLOCK para a replicação técnica i dos crRNAs que detectam o alelo A ou alelo B, respectivamente, para um determinado indivíduo. Como normalmente um ensaio tem quatro repetições técnicas por crRNA, m e n são iguais a 4 e o denominador é equivalente à soma de todos os oito valores de intensidade do crRNASHERLOCK para um determinado locus e SNP e indivíduo. Como existem dois crRNAs, a média da razão de crRNA em cada um dos crRNAs de um indivíduo sempre será soma a dois. Portanto, no caso ideal de homozigose, a proporção média de crRNA para o alelo positivo crRNA será dois e a proporção média de crRNA para o alelo negativo crRNA será zero. No caso ideal de heterozigosidade, a proporção média de crRNA para cada um dos dois crRNAs será uma.
Caracterização dos requisitos de clivagem LwCas13a.
[00625] O local de flanco protospacer (PFS) é um motivo específico presente próximo ao local de destino necessário para a atividade robusta de ribonuclease por Cas13a. OPFS está localizado na extremidade 3 'do local de destino e foi anteriormente caracterizado por LshCas13a pelo nosso grupo como H (não G) (1). Embora esse motivo seja semelhante a um motivo adjacente ao protospacer (PAM), uma restrição de sequência para os sistemas de Classe 2 direcionados a DNA, ele é funcionalmente diferente, pois não está envolvido na prevenção de auto-direcionamento dos loci CRISPR em sistemas endógenos. Estudos estruturais futuros de Cas13a provavelmente elucidam a importância do PFS para Cas13a:crRNA alvo de formação de complexo e atividade de clivagem.
[00626] O requerente purificou a proteína LwCas13a recombinante de E. coli (Fig. 2D-E) e testou sua capacidade de clivar um ssRNA de 173-nt com cada nucleotídeo possível de um local de flanco protospacer (PFS) (A, U, C ou G) (fig. 2F). Semelhante ao LshCas13a, o LwCas13a pode clivar um alvo com PFSA, U ou C, com menos atividade no ssRNA com um GPFS. Embora tenha sido observada atividade mais fraca contra o ssRNA1 com um GPFS, o Requerente ainda viu uma detecção robusta para os dois locais de destino com motivos GPFS (Tabela 3; rs601338 crRNA e zika direcionado ao crRNA2). É provável que o HPFS não seja necessário em todas as circunstâncias e que, em muitos casos, seja possível obter uma forte clivagem ou atividade colateral com um GPFS.
Discussão da Amplificação da Recombinase Polimerase (RPA) e outras estratégias de amplificação isotérmica.
[00627] A amplificação da polimerase de recombase (RPA) é uma técnica de amplificação isotérmica que consiste em três enzimas essenciais: uma recombinase, proteínas de ligação ao DNA de fita simples (SSBs) e uma polimerase de deslocamento de fita. ORPA supera muitas dificuldades técnicas presentes em outras estratégias de amplificação, particularmente a reação em cadeia da polimerase (PCR), ao não exigir regulação de temperatura, pois todas as enzimas operam a uma temperatura constante em torno de 37°C. ORPA substitui o ciclo de temperatura pela fusão global do modelo de fita dupla e do recozimento do iniciador por uma abordagem enzimática inspirada na replicação e reparo de DNA in vivo. Os complexos de recombinase-primer varrem o DNA de fita dupla e facilitam a troca de fitas em locais complementares. A troca de fita é estabilizada pelos SSBs, permitindo que o primer fique ligado. A desmontagem espontânea da recombinase ocorre em seu estado ligado ao ADP, permitindo que uma polimerase de deslocamento de fita invada e estenda o primer, permitindo a amplificação sem instrumentação complexa indisponível em pontos de atendimento e configurações de campo. A repetição cíclica desse processo em uma faixa temperada de 37-42 °C resulta em amplificação exponencial de DNA. A formulação original publicada usa o Bacillus subtilis Pol I (Bsu) como polimerase de deslocamento de cadeia, T4 uvsX como recombinase e T4 gp32 como proteína de ligação a DNA de cadeia simples (2), embora não esteja claro quais componentes estão presentes na proteína. formulação atual vendida pelo TwistDx usada neste estudo.
[00628] Além disso, o RPA possui várias limitações: 1) Embora a detecção de Cas13a seja quantitativa (fig.
15), a quantificação de RPA em tempo real pode ser difícil devido à sua rápida saturação quando a recombinase usa todo o ATP disponível. Embora a PCR em tempo real seja quantitativa devido à capacidade de alternar a amplificação, o RPA não possui mecanismo para controlar rigidamente a taxa de amplificação. Alguns ajustes podem ser feitos para reduzir a velocidade de amplificação, como reduzir as concentrações disponíveis de magnésio ou de iniciadores, diminuir a temperatura da reação ou projetar iniciadores ineficientes. Embora algumas instâncias do SHERLOCK quantitativo sejam observadas, como nas Fig. 31, 32 e 52, nem sempre é o caso e pode depender do modelo.
2) A eficiência do RPA pode ser sensível ao projeto do iniciador. O fabricante geralmente recomenda projetar iniciadores mais longos para garantir a ligação eficiente à recombinase com conteúdo médio de GC (40-60%) e triagem de até 100 pares de iniciadores para encontrar pares de iniciadores altamente sensíveis. O requerente concluiu com o SHERLOCK que apenas dois pares de iniciadores têm de ser concebidos para se conseguir um teste attomolar com sensibilidade de molécula única. Essa robustez é provavelmente devida à amplificação adicional do sinal pela atividade colateral Cas13a constitutivamente ativa que compensa qualquer ineficiência na amplificação de amplificadores. Essa qualidade é particularmente importante para nossa identificação de patógenos bacterianos na Fig.
34. Houve problemas com a amplificação de regiões altamente estruturadas, como os locais do gene 16S rRNA nos genomas bacterianos, porque não há etapa de fusão envolvida no RPA.
Assim, a estrutura secundária nos iniciadores se torna um problema, limitando a eficiência da amplificação e, portanto, a sensibilidade. As modalidades aqui divulgadas foram consideradas bem-sucedidas, apesar desses problemas específicos da RPA, devido à amplificação de sinal adicional de Cas13a.
3) O comprimento da sequência de amplificação deve ser curto (100-200 pb) para um RPA eficiente. Para a maioria das aplicações, esse não é um problema significativo e talvez seja até vantajoso (por exemplo, detecção de cfDNA em que o tamanho médio do fragmento é de 160 pb). Às vezes, comprimentos grandes de amplicons são importantes, como quando os iniciadores universais são desejados para a detecção de bactérias e os SNPs para discriminação estão espalhados por uma grande área.
[00629] A modularidade do SHERLOCK permite que qualquer técnica de amplificação, mesmo abordagens não isotérmicas, seja usada antes da transcrição T7 e detecção de Cas13a. Essa modularidade é possibilitada pela compatibilidade das etapas T7 e Cas13a em uma única reação, permitindo que a detecção seja realizada em qualquer entrada de DNA amplificada que possua um promotor T7. Antes de usar o RPA, a amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA) (3, 4) foi tentada para o nosso ensaio de detecção (fig. 10). No entanto, o NASBA não melhorou drasticamente a sensibilidade do Cas13a (fig. 11 e 53).
Outras técnicas de amplificação que poderiam ser empregadas antes da detecção incluem PCR, amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) (5), amplificação de deslocamento de cadeia (SDA) (6), amplificação dependente de helicase (HDA) (7) e reação de amplificação de enzima (PRÓXIMO) (8).
A capacidade de trocar qualquer técnica isotérmica permite ao SHERLOCK superar as limitações específicas de qualquer técnica de amplificação.
Projeto de incompatibilidades de engenharia.
[00630] O requerente demonstra que a clivagem do alvo LshCas13a foi reduzida quando houve duas ou mais incompatibilidades no target:crRNA duplex, mas não foi afetado por incompatibilidades únicas, um Requerente de observação confirmou a clivagem colateral de LwCas13a (fig.
36A). ORequerente levantou a hipótese de que, ao introduzir uma mutação adicional na sequência espaçadora de crRNA, o Requerente desestabilizaria a clivagem colateral contra um alvo com uma incompatibilidade adicional (duas incompatibilidades no total), mantendo a clivagem colateral no alvo, pois haveria apenas uma incompatibilidade. Para testar a possibilidade de criar uma especificidade aumentada, o Requerente projetou vários crRNAs direcionados ao ssRNA1 e incluiu incompatibilidades ao longo do comprimento do crRNA (fig. 36A) para otimizar a clivagem colateral no alvo e minimizar a clivagem colateral de um alvo que difere por uma única incompatibilidade . O requerente observou que estas incompatibilidades não reduziram a clivagem colateral do ssRNA1, mas diminuíram significativamente o sinal para um alvo que incluía uma incompatibilidade adicional (ssRNA2). O crRNA projetado que melhor distinguiu entre ssRNA1 e 2 incluía incompatibilidades sintéticas próximas à incompatibilidade com ssRNA2, criando uma "bolha" ou distorção no RNA hibridado. A perda de sensibilidade causada pela coordenação de uma incompatibilidade sintética e uma incompatibilidade adicional presente no alvo (ou seja, uma incompatibilidade dupla) concorda com a sensibilidade de LshCas13a e LwCas13a a incompatibilidades duplas consecutivas ou próximas e apresenta uma base para o design racional de crRNAs que permitem a distinção de nucleotídeo único (Fig. 36B).
[00631] Para detecção de incompatibilidade de cepas de ZIKV e DENV, nosso crRNA completo continha duas incompatibilidades (Fig. 37A, B). Devido à alta divergência de sequência entre as estirpes, o Requerente não conseguiu encontrar um trecho contínuo de 28 nt com apenas uma única diferença de nucleotídeo entre os dois genomas. No entanto, o Requerente previu que os crRNAs mais curtos ainda seriam funcionais e projetou crRNAs de 23nt mais curtos contra alvos nas duas cepas de ZIKV que incluíam uma incompatibilidade sintética na sequência espaçadora e apenas uma incompatibilidade na sequência alvo. Esses crRNAs ainda podem distinguir cepas africanas e americanas de ZIKV (Fig. 36C). Testes subsequentes de 23 nt e 20 nt de crRNA mostram que reduções no comprimento do espaçador reduzem a atividade, mas mantêm ou aumentam a capacidade de discriminar incompatibilidades únicas (Fig. 57A-G). Para entender melhor como as incompatibilidades sintéticas podem ser introduzidas para facilitar a discriminação por mutação de nucleotídeo único, o Requerente colocou a incompatibilidade sintética nas sete primeiras posições do espaçador em três comprimentos diferentes de espaçador: 28, 23 e 20 nt (Fig. 57A). Em um alvo com uma mutação na terceira posição, LwCas13a mostra especificidade máxima quando a incompatibilidade sintética está na posição 5 do espaçador, com especificidade aprimorada em comprimentos mais curtos do espaçador, embora com níveis mais baixos de atividade no alvo (Fig. 57B-G)O requerente também deslocou a mutação alvo pelas posições 3-6 e encontrou diferenças sintéticas lado a lado no espaçador ao redor da mutação (Fig. 58).
Genotipagem com SHERLOCK usando padrões sintéticos.
[00632] A avaliação dos padrões sintéticos criados a partir da amplificação por PCR dos locais SNP permite a identificação precisa dos genótipos (fig. 60A, B). Ao calcular todas as comparações (ANOVA) entre os resultados do SHERLOCK da amostra de um indivíduo e os padrões sintéticos, o genótipo de cada indivíduo pode ser identificado encontrando o padrão sintético que possui a intensidade de detecção do SHERLOCK mais semelhante (Gig.
60C, D). Essa abordagem de genotipagem SHERLOCK é generalizável para qualquer locus SNP (Fig. 60E).
OSHERLOCK é uma plataforma CRISPR-Dx acessível e adaptável.
[00633] Para a análise de custo do SHERLOCK, foram omitidos os reagentes considerados de custo insignificante, incluindo modelos de DNA para a síntese de crRNA, iniciadores usados no RPA, tampões comuns (MgCl2, Tris HCl, glicerol, NaCl, DTT), papel de filtro de microfibra de vidro e reagente RNAsecure. Para modelos de DNA, a síntese de ultrâmeros do IDT fornece material para 40 reações de transcrição in vitro (cada uma sendo suficiente para ~10,000 reações) para ~$70, adicionando custo insignificante à síntese de crRNA. Para iniciadores RPA, uma síntese de 25 nmole IDT de um iniciador de DNA de 30 nt pode ser adquirida por ~$10, fornecendo material adequado para as reações de 5000SHERLOCK. O papel de microfibra de vidro está disponível por U$0,50/folha, o que é suficiente para várias centenas de reações SHERLOCK. O reagente RNAsecure a 4% custa U$7,20/mL, o que é suficiente para 500 testes.
[00634] Além disso, para todas as experiências, exceto os ensaios em papel, foram utilizadas placas de 384 poços (Corning 3544), ao custo de $0,036/reaction. Por causa do custo insignificante, isso não foi incluído na análise geral de custos. Além disso, o SHERLOCK-POC não requer o uso de um recipiente de plástico, pois pode ser facilmente executado em papel. O método de leitura para
SHERLOCK aqui utilizado foi um leitor de placas equipado com um conjunto de filtros ou um monocromador. Como investimento de capital, o custo do leitor não foi incluído no cálculo, pois o custo diminui vertiginosamente à medida que mais reações são executadas no instrumento e é insignificante. Para aplicações POC, alternativas mais baratas e portáteis podem ser usadas, como espectrofotômetros portáteis (9) ou leitores eletrônicos portáteis (4), que reduzem o custo de instrumentação para < $200. Embora essas soluções mais portáteis reduzam a velocidade e a facilidade de leitura em comparação com instrumentos mais volumosos, elas permitem um uso mais amplo.
Resultados
[00635] O ensaio e os sistemas aqui descritos podem geralmente compreender um processo de duas etapas de amplificação e detecção. Durante o primeiro passo, a amostra de ácido nucleico, RNA ou DNA, é amplificada, por exemplo, por amplificação isotérmica. Durante a segunda etapa, o DNA amplificado é transcrito para o RNA e subsequentemente incubado com um efetor CRISPR, como C2c2, e um crRNA programado para detectar a presença da sequência alvo de ácido nucleico. Para permitir a detecção, um RNA repórter que foi marcado com um fluoróforo extinto é adicionado à reação. A clivagem colateral do RNA repórter resulta na desactivação do fluoróforo e permite a detecção em tempo real do alvo do ácido nucleico (Fig. 17A).
[00636] Para obter uma detecção robusta de sinal, um ortólogo de C2c2 foi identificado a partir do organismo Leptotrichia wadei (LwC2c2) e avaliado. A atividade da proteína LwC2c2 foi avaliada expressando-a juntamente com uma matriz CRISPR sintética em E. coli e programando-a para clivar um local-alvo no mRNA da beta-lactamase, o que leva à morte das bactérias sob seleção de ampicilina (Fig.
2B)Menos colônias de E. coli sobreviventes foram observadas com o locus LwC2c2 do que com o locus LshC2c2, demonstrando uma atividade de clivagem mais alta do ortólogo LwC2c2 (Fig. 2C). A proteína LwC2c2 otimizada por códon humano foi então purificada a partir de E. coli (Fig. 2D-E) e sua capacidade de clivar um ssRNA de 173 nt analisado com nucleotídeos de diferentes sítios de flanqueamento de protoespaçador (PFS) (Fig. 2F). OLwC2c2 conseguiu separar cada um dos quatro possíveis alvos de PFS, com um pouco menos de atividade no ssRNA com um GPFS.
[00637] A medição em tempo real da atividade colateral da RNase de LwC2c2 foi medida usando um leitor de placas fluorescentes de RNA disponível comercialmente (Fig.
17A). Para determinar a sensibilidade da linha de base da atividade de LwC2c2, LwC2c2 foi incubado com o alvo 1 de ssRNA (ssRNA1) e um crRNA complementar a um local dentro do alvo de ssRNA, juntamente com a sonda do sensor de RNA (Fig. 18). Isso produziu uma sensibilidade de ~ 50 fM (Fig.
27A), que, embora mais sensível que outras tecnologias recentes de detecção de ácido nucleico(Pardee et al.,2014), não é sensível o suficiente para muitas aplicações de diagnóstico que requerem desempenho de detecção subfemtomolar (Barletta et al.,2004; Emmadi et al.,2011; Rissin et al.,2010; Song et al.,2013).
[00638] Para aumentar a sensibilidade, uma etapa de amplificação isotérmica foi adicionada antes da incubação com LwC2c2. O acoplamento da detecção mediada por LwC2c2 com abordagens de amplificação isotérmica usadas anteriormente, como a amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA)(Compton, 1991; Pardee et al.,2016), melhorou a sensibilidade até certo ponto (Fig. 11). Foi testada uma abordagem alternativa de amplificação isotérmica, a amplificação de recombinase polimerase (RPA) (Piepenburg et al.,2006), que pode ser usada para amplificar exponencialmente o DNA em menos de duas horas.
Ao adicionar um promotor da RNA polimerase T7 nos iniciadores RPA, o DNA amplificado pode ser convertido em RNA para detecção subsequente por LwC2c2 (Fig. 17). Assim, em certas modalidades exemplares, o ensaio compreende a combinação de amplificação por RPA, conversão de DNA polimerase de RNAT7 em RNA e subsequente detecção do RNA por desbloqueio de fluorescência C2c2 de um repórter extinto.
[00639] Utilizando o método de exemplo em uma versão de DNA sintetizada do ssRNA1, foi possível alcançar a sensibilidade attomolar na faixa de 1 a 10 moléculas por reação (Fig. 27B, esquerda). Para verificar a precisão da detecção, a concentração do DNA de entrada foi qualificada com o PCR de gotículas digitais e confirmou que a menor concentração alvo detectável (2 aM) estava na concentração de uma única molécula por microlitro. Com a adição de uma etapa de transcrição reversa, o RPA também pode amplificar o RNA em uma forma de dsDNA, permitindo que a sensibilidade attomolar no ssRNA1 seja atingida (27B, à direita). Da mesma forma, as concentrações dos alvos de RNA foram confirmadas por PCR de gotículas digitais. Para avaliar a viabilidade do método de exemplo para funcionar como um teste de diagnóstico POC, a capacidade de todos os componentes - RPA, amplificação de polimerase T7 e detecção de LwC2c2 - de funcionar em uma única reação foi testada e encontrou sensibilidade attomolar com uma versão de um pote do ensaio (Fig. 22).
O ensaio é capaz de detecção viral sensível em líquido ou em papel
[00640] Em seguida, foi determinado se o teste seria eficaz em aplicações de doenças infecciosas que exigem alta sensibilidade e poderiam se beneficiar de um diagnóstico portátil. Para testar a detecção em um sistema modelo, foram produzidos lentivírus contendo fragmentos de RNA do genoma do vírus Zika e o flavivírus Dengue relacionado (Dejnirattisai et al.,2016) e o número de partículas virais quantificado (Fig. 31A). Níveis de vírus simulados foram detectados até 2 aM. Ao mesmo tempo, também foi possível mostrar uma discriminação clara entre esses vírus proxy que contêm fragmentos de RNA de Zika e da dengue (Fig. 31B).
Para determinar se o ensaio seria compatível com a liofilização para remover a dependência das cadeias frias de distribuição, os componentes da reação foram liofilizados. Após o uso da amostra para reidratar os componentes liofilizados, 20 fM de ssRNA1 foram detectados (Fig. 33A). Como as configurações de POC e com poucos recursos se beneficiariam de um teste em papel para facilitar a usabilidade, a atividade de detecção de C2c2 em papel de fibra de vidro também foi avaliada e constatou que uma reação de C2c2 manchada de papel era capaz de detectar alvos (Fig. 33B). Em combinação, a secagem por congelamento e a detecção de papel na reação de detecção de C2c2 resultaram na detecção sensível do ssRNA1 (Fig. 33C).
Níveis semelhantes de sensibilidade também foram observados para a detecção de um fragmento de RNA viral sintético de Zika entre LwC2c2 em solução e LwC2c2 liofilizado,
demonstrando a robustez do SHERLOCK liofilizado e o potencial para um diagnóstico rápido do vírus Zika POC (Fig. 33D-E)Para este fim, a capacidade da variante POC do ensaio foi testada para determinar a capacidade de discriminar o RNA de Zika do RNA da dengue (Fig. 31C).
Enquanto a detecção e a liofilização do papel reduziram levemente o sinal absoluto da leitura, o ensaio ainda detectou significativamente o vírus Zika falso em concentrações tão baixas quanto 20 aM (Fig. 31D), em comparação com a detecção de vírus falso com a sequência de controle da Dengue.
[00641] Foi relatado que os níveis de RNA viral de Zika em humanos são tão baixos quanto 3 x 106 cópias/mL (4,9 fM) na saliva do paciente e 7,2 x 105 cópias/mL (1,2 fM) no soro do paciente (Barzon et al.,2016; Gourinat et al.,2015; Lanciotti et al.,2008). A partir de amostras de pacientes obtidas, concentrações tão baixas quanto 1,25 x 103 copies/mL (2,1 aM) foram observados. Para avaliar se o ensaio é capaz de detectar o vírus zika de isolados clínicos de baixo título, o RNA viral foi extraído dos pacientes e transcrito reversamente e o cDNA resultante foi usado como entrada para o ensaio (Fig. 32A). Detecção significativa para as amostras de soro humano de Zika foi observada em concentrações abaixo de 1,25 copy/uL (2,1 aM) (Fig. 32B). Além disso, o sinal das amostras dos pacientes era preditivo do número de cópias do RNA viral de Zika e poderia ser usado para prever a carga viral (Fig. 31F).
Para testar a ampla aplicabilidade para situações de doença nas quais a purificação de ácido nucleico não está disponível, foi testada a detecção de ssRNA1 cravado no soro humano e foi determinado que o ensaio foi ativado nos níveis séricos abaixo 2% (Fig. 33G).
Distinção de patógenos bacterianos e distinção de genes
[00642] Para determinar se o ensaio poderia ser usado para distinguir patógenos bacterianos, a região 16SV3 foi selecionada como alvo inicial, pois as regiões de flanqueamento conservadas permitem que os iniciadores RPA universais sejam usados entre as espécies bacterianas e a região interna variável, permitindo a diferenciação das espécies. . Um painel de 5 possíveis crRNAs de direcionamento foi projetado para cepas patogênicas e isolado de E. coli e Pseudomonas aeruginosa gDNA (Fig.
34A). O ensaio foi capaz de distinguir o gDNA de E. coli ou P. aeruginosa e mostrou baixo sinal de fundo para os crRNAs de outras espécies (Fig. 34A, B).
[00643] O ensaio também pode ser adaptado para detectar e distinguir rapidamente genes bacterianos de interesse, como genes de resistência a antibióticos. As enterobactérias resistentes ao carbapenemo (CRE) são um importante desafio emergente à saúde pública (Gupta et al.,2011). A capacidade do ensaio para detectar genes de resistência ao carbapenem foi avaliada e se o teste poderia distinguir entre diferentes genes de resistência ao carbapenem. A pneumonia por Klebsiella foi obtida de isolados clínicos abrigando genes de resistência à metalo- beta-lactamase 1New Dehli (NDM-1) ou Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) e crRNAs projetados para distinguir entre os genes. Todos os CRE tiveram sinal significativo sobre bactérias sem esses genes de resistência (Fig. 35A) e que pudemos distinguir significativamente entre as cepas de resistência KPC e NDM-1 (Fig. 35B).
Especificidade de incompatibilidade de base única de RNases guiadas por RNACRISPR
[00644] Foi demonstrado que certos ortólogos da RNase guiados por RNACRISPR, como LshC2c2, não distinguem prontamente incompatibilidades de base única. (Abudayyeh et al.,2016)Como demonstrado aqui, o LwC2c2 também compartilha esse recurso (Fig. 37A). Para aumentar a especificidade da clivagem de LwC2c2, um sistema para introduzir incompatibilidades sintéticas no crRNA:target foi desenvolvido um duplex que aumenta a sensibilidade total a incompatibilidades e permite a sensibilidade de incompatibilidade de base única. Vários crRNAs para o alvo 1 foram projetados e incluíram incompatibilidades ao longo do comprimento do crRNA (Fig. 37A) para otimizar a clivagem no alvo e minimizar a clivagem de um alvo que difere por uma única incompatibilidade. Essas incompatibilidades não reduziram a eficiência de clivagem do alvo 1 do ssRNA, mas diminuíram significativamente o sinal para um alvo que incluía uma incompatibilidade adicional (alvo 2 do ssRNA).
O crRNA projetado que melhor distinguiu entre os alvos 1 e 2 incluiu incompatibilidades sintéticas próximas à incompatibilidade do alvo 2, criando, na verdade, uma "bolha". A perda de sensibilidade causada pela coordenação de uma incompatibilidade sintética e uma incompatibilidade adicional presente no alvo (ou seja, uma incompatibilidade dupla) concorda com a sensibilidade de LshC2c2 para incompatibilidades duplas consecutivas ou próximas (Abudayyeh et al.,2016) e apresenta um formato para o projeto racional de crRNAs que permitem a distinção de nucleotídeo único (FIG. 37B).
[00645] Tendo demonstrado que o C2c2 pode ser manipulado para reconhecer incompatibilidades de base única, foi determinado se essa especificidade manipulada poderia ser usada para distinguir entre patógenos virais intimamente relacionados. CrRNAs múltiplos foram projetados para detectar as cepas africanas ou americanas do vírus Zika (FIG. 37A) e as cepas 1 ou 3 do vírus da Dengue (Fig.
37C). Esses crRNAs incluíram uma incompatibilidade sintética na sequência espaçadora, fazendo com que uma única bolha se formasse quando duplexada para a deformação no alvo devido à incompatibilidade sintética. No entanto, quando o espaçador de incompatibilidade sintética é duplexado para a deformação fora do alvo, duas bolhas se formam devido à incompatibilidade sintética e à incompatibilidade SNP. Os crRNAs de incompatibilidade sintética detectaram suas cepas correspondentes com sinal significativamente mais alto que a cepa fora do alvo, permitindo uma distinção de cepa robusta (Fig. 37B, 37D).
Devido à semelhança significativa da sequência entre as cepas, não foi possível encontrar um trecho contínuo de 28 nt com apenas uma única diferença de nucleotídeo entre os dois genomas, a fim de demonstrar uma verdadeira distinção de cepa de nucleotídeo único. No entanto, foi predito que os crRNAs mais curtos ainda funcionariam, como são com LshC2c2(Abudayyeh et al.,2016), e, portanto, os crRNAs de 23 nt mais curtos foram projetados contra alvos nas duas cepas de Zika que incluíam uma incompatibilidade sintética na sequência espaçadora e apenas uma incompatibilidade na sequência alvo. Esses crRNAs ainda eram capazes de distinguir as cepas africanas e americanas de zika com alta sensibilidade (Fig. 36C).
Genotipagem rápida usando DNA purificado da saliva
[00646] A rápida genotipagem da saliva humana pode ser útil em situações farmacogenômicas de emergência ou em diagnósticos em casa. Para demonstrar o potencial das modalidades aqui divulgadas para genotipagem, cinco locais foram escolhidos para comparar a detecção de C2c2 usando dados de genotipagem 23andMe como padrão-ouro (Eriksson et al.,2010) (Fig. 38A). Os cinco locais abrangem uma ampla gama de associações funcionais, incluindo sensibilidade a medicamentos, como estatinas ou acetaminofeno, suscetibilidade a norovírus e risco de doença cardíaca (Tabela 16).
Tabela 16: Variantes SNP testadas ID Gene Categoria Consumo de gordura saturada e rs5082 APOA2 ganho de peso rs1467558 CD44 Metabolismo do acetaminofeno rs2952768 perto de CREB1 dependência de morfina 4,5x aumentam o risco de miopatia rs4363657 SLCO1B1 para usuários de estatina rs601338 FUT2 resistência ao norovírus
[00647] A saliva de quatro indivíduos humanos foi coletada e o DNA genômico purificado usando um kit comercial simples em menos de uma hora. Os quatro sujeitos tinham um conjunto diversificado de genótipos nos cinco locais, fornecendo um espaço amostral amplo o suficiente para a referência do teste para genotipagem. Para cada um dos cinco locos SNP, o DNA genômico de um indivíduo foi amplificado usando RPA com os iniciadores apropriados, seguidos pela detecção com LwC2c2 e pares de crRNAs projetados para detectar especificamente um dos dois alelos possíveis (Fig. 38B). O ensaio foi específico o suficiente para distinguir alelos com alto significado e inferir genótipos homozigotos e heterozigotos. Como um protocolo de extração de DNA foi realizado na saliva antes da detecção, o ensaio foi testado para determinar se poderia ser ainda mais acessível para a genotipagem de POC usando saliva aquecida a 95 oC por 5 minutos sem nenhuma extração adicional. O ensaio foi capaz de genotipar corretamente dois pacientes cuja saliva foi submetida apenas a aquecimento por 5 minutos e, em seguida, amplificação subsequente e detecção de C2c2 (Fig. 40B).
Detecção de mutações cancerígenas no cfDNA em frações alélicas baixas
[00648] Como o teste é altamente específico para diferenças de nucleotídeos únicos nos alvos, foi desenvolvido um teste para determinar se o teste era sensível o suficiente para detectar mutações de câncer no DNA sem células (cfDNA). Os fragmentos de cfDNA são uma pequena porcentagem (0,1% a 5%) de fragmentos de cfDNA de tipo selvagem (Bettegowda et al.,2014; Newman et al.,2014; Olmedillas Lopez et al.,2016; Qin et al.,2016). Um desafio significativo no campo do cfDNA é detectar essas mutações porque elas são normalmente difíceis de descobrir, dados os altos níveis de DNA não mutado encontrados no sangue no fundo (Bettegowda et al.,2014; Newman et al.,2014; Qin et al.,2016). Um teste de câncer POC cfDNA também seria útil para a triagem regular da presença de câncer, especialmente para pacientes em risco de remissão.
[00649] A capacidade do ensaio para detectar DNA mutante em background de tipo selvagem foi determinada diluindo o alvo 1 de dsDNA em um background de ssDNA1 com uma única mutação no local alvo de crRNA (Fig. 41A-B).
OLwC2c2 foi capaz de detectar o dsDNA1 em níveis tão baixos quanto 0,1% do dsDNA de fundo e dentro das concentrações atomolares do dsDNA1. Este resultado mostra que a clivagem por LwC2c2 do dsDNA1 mutante de fundo é baixa o suficiente para permitir a detecção robusta do dsDNA no alvo na fração alélica a 0,1%. Em níveis inferiores a 0. 1%, a atividade em segundo plano provavelmente é um problema, impedindo qualquer detecção significativa adicional do destino correto.
[00650] Como o teste podia detectar alvos sintéticos com frações alélicas em uma faixa clinicamente relevante, foi avaliado se o teste era capaz de detectar mutações de câncer no cfDNA. Os iniciadores RPA para duas mutações de câncer diferentes, EGFRL858R e BRAFV600E, foram projetados e padrões comerciais de cfDNA foram usados com frações alélicas de 5%, 1%, e 0,1% que se assemelham a amostras reais de cfDNA humano para testar. Utilizando um par de crRNAs que poderiam distinguir o alelo mutante do alelo do tipo selvagem (FIG. 38C), foi alcançada a detecção da fração alélica a 0,1% para ambos os locos mutantes (Fig.
39AB).
Discussão
[00651] Ao combinar as propriedades naturais de C2c2 com amplificação isotérmica e uma sonda fluorescente extinta, o ensaio e os sistemas aqui divulgados foram demonstrados como um método versátil e robusto para detectar RNA e DNA e adequado para uma variedade de diagnósticos rápidos, incluindo aplicações de doenças infecciosas e genotipagem rápida. Uma grande vantagem dos ensaios e sistemas aqui divulgados é que um novo teste POC pode ser reprojetado e sintetizado em questão de dias por um período tão baixo quanto possível. $0,6/test.
[00652] Como muitas aplicações de doenças humanas exigem a capacidade de detectar incompatibilidades únicas, uma abordagem racional foi desenvolvida para projetar os crRNAs para serem altamente específicos a uma única incompatibilidade na sequência alvo, introduzindo uma incompatibilidade sintética na sequência espaçadora do crRNA. Outras abordagens para obter especificidade com os efetores CRISPR contam com métodos baseados em triagem em dezenas de projetos de guias (Chavez et al.,2016). Usando crRNAs de incompatibilidade projetados, foi demonstrada a discriminação de cepas virais de zika e dengue em locais que diferem por uma única incompatibilidade, genotipagem rápida de SNPs do gDNA da saliva humana e detecção de mutações de câncer em amostras de cfDNA.
[00653] O baixo custo e a adaptabilidade da plataforma de teste se prestam a outras aplicações, incluindo (i) RNA/DNA experiência em quantificação em substituição a ensaios específicos de qPCR, como Taqman, (ii) detecção rápida e multiplexada de expressão de RNA semelhante a microarrays e (iii) outras aplicações de detecção sensível, como a detecção de contaminação por ácidos nucleicos de outras fontes em alimentos. Além disso, C2c2 poderia potencialmente ser usado para a detecção de transcritos em ambientes biológicos, como nas células, e dada a natureza altamente específica da detecção de C2c2, pode ser possível rastrear a expressão específica alélica de transcritos ou mutações associadas a doenças em células vivas. Com a ampla disponibilidade de aptâmeros, também pode ser possível detectar proteínas acoplando a detecção de proteínas por um aptâmero à revelação de um local de amplificação criptográfico para RPA seguido pela detecção de C2c2.
Detecção de ácido nucleico com CRISPR-Cas13a/C2c2:
sensibilidade attomolar e especificidade de nucleotídeo único
[00654] Para obter uma detecção robusta de sinal, o Requerente identificou um ortólogo de Cas13a de Leptotrichia wadei (LwCas13a), que exibe maior atividade de RNase guiada por RNA em relação a Leptotrichia shahii Cas13a (LshCas13a) (10) (fig. 2, consulte também acima "Caracterização de LwCas13a requisitos de clivagem ”).
LwCas13a incubado com ssRNA alvo 1 (ssRNA1), crRNA e repórter (RNA fluorescente extinto) (Fig. 18) (13) produziu uma sensibilidade de detecção de ~50 fM (Fig. 51, 15), que não é sensível o suficiente para muitas aplicações de diagnóstico (12, 14-16). O requerente, portanto, explorou a combinação da detecção baseada em Cas13a com diferentes etapas de amplificação isotérmica (fig. 10, 11, 53, 16) (17, 18). Dos métodos explorados, a amplificação por recombinase polimerase (RPA) (18) proporcionou a maior sensibilidade e pode ser acoplada à transcrição T7 para converter DNA amplificado em RNA para detecção subsequente por LwCas13a (ver também acima "Discussão sobre amplificação por recombinase polimerase (RPA) e outras estratégias de amplificação isotérmica”). O requerente refere-se a esta combinação de amplificação por RPA, transcrição de RNA polimerase T7 de DNA amplificado para RNA e detecção de RNA alvo por liberação colateral mediada por clivagem de RNA de Cas13a como sinal SHERLOCK.
[00655] O requerente determinou primeiro a sensibilidade do SHERLOCK para a detecção de RNA (quando acoplado à transcrição reversa) ou alvos de DNA. O requerente alcançou sensibilidade de molécula única para RNA e DNA, como verificado por PCR de gota digital (ddPCR) (Fig. 27, 51, 54A, B). A sensibilidade atomolar foi mantida quando todos os componentes do SHERLOCK foram combinados em uma única reação, demonstrando a viabilidade dessa plataforma como um diagnóstico de ponto de atendimento (POC) (Fig. 54C). OSHERLOCK possui níveis de sensibilidade semelhantes aos do ddPCR e da PCR quantitativa (qPCR), duas abordagens de detecção de ácidos nucleicos sensíveis estabelecidas, enquanto o RPA sozinho não foi sensível o suficiente para detectar baixos níveis de alvo (Fig. 55A- D). Além disso, o SHERLOCK mostra menos variação que o ddPCR, qPCR e RPA, conforme medido pelo coeficiente de variação entre as réplicas (fig. 55E-F).
[00656] O requerente examinou em seguida se o SHERLOCK seria eficaz em aplicações de doenças infecciosas que requerem alta sensibilidade. O requerente produziu lentivírus contendo fragmentos do genoma do vírus Zika (ZIKV) ou do dengue de flavivírus relacionado (DENV) (19) (Fig. 31A). SHERLOCK detectou partículas virais até 2 aM e poderia discriminar entre ZIKV e DENV (Fig. 31B). Para explorar o uso potencial de SHERLOCK em campo, o Requerente primeiro demonstrou que os complexos Cas13acrRNA liofilizados e subsequentemente reidratados (20) podiam detectar 20 fM de ssRNA1 não amplificado (Fig. 33A) e que a detecção de alvos também era possível em papel de fibra de vidro (Fig. 33B). Os outros componentes do SHERLOCK também são passíveis de liofilização: o RPA é fornecido como um reagente liofilizado à temperatura ambiente e o Requerente demonstrou anteriormente que a polimerase T7 tolera a liofilização (2). Em combinação, a liofilização e a mancha de papel na reação de detecção de Cas13a resultaram em níveis comparáveis de detecção sensível de ssRNA1 como reações aquosas (FIG. 33C-E). Embora a detecção de papel e a liofilização tenham reduzido ligeiramente o sinal absoluto da leitura, o SHERLOCK (Fig. 31C) pode detectar prontamente o vírus ZIKV falso em concentrações tão baixas quanto 20 aM (Fig. 31D). OSHERLOCK também é capaz de detectar o ZIKV em isolados clínicos (soro, urina ou saliva), onde os títulos podem ser tão baixos quanto 2 x
103 copies/mL (3,2 aM) (21). ORNA do ZIKV extraído das amostras de soro ou urina do paciente e transcrito reversamente em cDNA (Fig. 32E e 52A) pode ser detectado em concentrações inferiores a 1,25 x 103 copies/mL (2,1 aM),
como verificado por qPCR (Fig. 32F e 52B). Além disso, o sinal das amostras dos pacientes era preditivo do número de cópias do RNA de ZIKV e poderia ser usado para predizer a carga viral (Fig. 33F). Para simular a detecção de amostras sem purificação de ácido nucleico, o Requerente mediu a detecção de ssRNA1 cravado no soro humano e descobriu que Cas13a podia detectar RNA em reações contendo tanto quanto 2% soro (Fig. 33G). Outra aplicação epidemiológica importante para as modalidades aqui divulgadas é a identificação de patógenos bacterianos e a detecção de genes bacterianos específicos. ORequerente direcionou a região V3 do gene 16S rRNA, onde as regiões de flanqueamento conservadas permitem o uso de iniciadores de RPA universais entre espécies bacterianas e a região interna variável permite a diferenciação de espécies. Em um painel de cinco possíveis crRNAs direcionados para diferentes cepas patogênicas e gDNA isolados de E. coli e Pseudomonas aeruginosa (Fig. 34A), o SHERLOCK genotipou corretamente as cepas e mostrou baixa reatividade cruzada (Fig. 34B). Além disso, o Requerente foi capaz de usar SHERLOCK para distinguir entre isolados clínicos de Klebsiella pneumoniae com dois genes de resistência diferentes: Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) e Nova Deli metalo-beta-lactamase 1 (NDM-1) (22) (fig. 56) .
[00657] Para aumentar a especificidade do SHERLOCK, o Requerente introduziu incompatibilidades sintéticas no crRNA:target duplex que permite ao LwCas13a discriminar entre destinos que diferem por uma incompatibilidade de base única (Fig. 36A, B; consulte também acima "Design de incompatibilidades de engenharia"). ORequerente projetou vários crRNAs com incompatibilidades sintéticas nas sequências espaçadoras para detectar as cepas africanas ou americanas de ZIKV (Fig. 37A) e as cepas 1 ou 3 de DENV (Fig. 37C). Os CRRNAs de incompatibilidade sintética detectaram suas cepas correspondentes com sinal significativamente mais alto (teste t de Student bicaudal; p <0,01) do que a cepa fora do alvo, permitindo uma discriminação robusta da cepa com base em incompatibilidades únicas (Fig. 37B, D, 36C).
Caracterização adicional revelou que a detecção de Cas13a atinge a máxima especificidade, mantendo a sensibilidade no alvo quando uma mutação está na posição 3 do espaçador e a incompatibilidade sintética está na posição 5 (Fig. 57 e 58). A capacidade de detectar diferenças de base única abre a oportunidade de usar o SHERLOCK para genotipagem humana rápida. O requerente escolheu cinco locos abrangendo uma variedade de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) relacionados à saúde (Tabela 1) e a detecção comparada de SHERLOCK usando dados de genotipagem 23andMe como padrão- ouro nesses SNPs (23) (Fig. 38A). O requerente coletou saliva de quatro indivíduos humanos com diversos genótipos nos locais de interesse e extraiu o DNA genômico por meio de purificação comercial da coluna ou aquecimento direto por cinco minutos (20). OSHERLOCK distinguiu alelos com alto significado e especificidade suficiente para inferir genótipos homozigotos e heterozigotos (Fig. 38B, 40, 59, 60; ver também acima "Genotipagem com SHERLOCK usando padrões sintéticos"). Finalmente, o Requerente procurou determinar se o SHERLOCK poderia detectar mutações de câncer de baixa frequência em fragmentos de DNA sem células (cf), o que é desafiador devido aos altos níveis de DNA do tipo selvagem no sangue do paciente (24-26). O requerente primeiro descobriu que o SHERLOCK podia detectar o ssDNA1 em concentrações attomolares diluídas em um fundo de DNA genômico (fig. 61). Em seguida, o Requerente descobriu que o SHERLOCK também foi capaz de detectar alelos contendo polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) (Fig. 41A, B) em níveis tão baixos quanto 0,1% do DNA de fundo, que está na faixa clinicamente relevante. O requerente demonstrou então que o SHERLOCK poderia detectar duas mutações de câncer diferentes, EGFRL858R e BRAFV600E, em amostras falsas de cfDNA com frações alélicas tão baixas quanto 0,1% (Fig.
38,39) (20).
[00658] A plataforma SHERLOCK se presta a outras aplicações, incluindo (i) quantificação geral de RNA/DNA em vez de ensaios específicos de qPCR, como TaqMan, (ii) detecção rápida e multiplexada de expressão de RNA e (iii)
outras aplicações de detecção sensível, como detecção de contaminação por ácidos nucleicos. Além disso, Cas13a poderia detectar transcritos em ambientes biológicos e rastrear a expressão específica de alelos de transcritos ou mutações associadas a doenças em células vivas. OSHERLOCK é um método versátil e robusto para detectar RNA e DNA, adequado para diagnósticos rápidos, incluindo aplicações de doenças infecciosas e genotipagem sensível. Um teste de papel SHERLOCK pode ser reprojetado e sintetizado em questão de dias por um período tão baixo quanto possível.
$0. 61/test (veja também acima “SHERLOCK é uma plataforma CRISPR-Dx acessível e adaptável”) com confiança, pois quase todos os crRNA testados resultaram em alta sensibilidade e especificidade. Essas qualidades destacam o poder do CRISPR-Dx e abrem novos caminhos para a detecção rápida, robusta e sensível de moléculas biológicas.
Tabela 17: Primers RPA usados Nome Sequência 1ª Fig. Fig. RP0683 - RPA ssDNA/ssRNA1F (SEQ. I.D.No. 340) 27B Fig. RP0684 - RPA ssDNA/ssRNA1R (SEQ. I.D.No. 341) 27B Fig. AMPL-25Zika 8B long-rpa3-f (SEQ. I.D.No. 342) 31B Fig. AMPL-26Zika 8B longo-rpa3-r (SEQ. I.D.No. 343) 31B Fig. RP819 - região zika 8F (SEQ. I.D.No. 344) 31C Fig. RP821 - região zika 8R (SEQ. I.D.No. 345) 31C
Fig. 517 bacteriana V3F (SEQ. I.D.No. 346) 34B Fig. RP758 bacteriano V3R (SEQ. I.D.No. 347) 34B Fig. wR0074A2 rs5082F (SEQ. I.D.No. 348) 38B Fig. wR0074E2 rs5082R (SEQ. I.D.No. 349) 38B Fig. wR0074A4 rs1467558F (SEQ. I.D.No. 350) 38B Fig. wR0074E4 rs1467558R (SEQ. I.D.No. 351) 38B Fig. wR0074A5 rs2952768F (SEQ. I.D.No. 352) 38B Fig. wR0074E5 rs2952768R (SEQ. I.D.No. 353) 38B Fig. wR0074A9 rs4363657F (SEQ. I.D.No. 354) 38B Fig. wR0074E9 rs4363657R (SEQ. I.D.No. 355) 38B Fig. wR0074A11 rs601338F (SEQ. I.D.No. 356) 38B Fig. wR0074E11 rs601338R (SEQ. I.D.No. 357) 38B Fig. RP824BRAFV600E cfDNAF (SEQ. I.D.No. 358) 39A Fig. RP769BRAFV600E cfDNAR (SEQ. I.D.No. 359) 39A Fig. RP826EGFR858R cfDNAF (SEQ. I.D.No. 360) 39B Fig. RP804EGFR858R cfDNAR (SEQ. I.D.No. 361) 39B AMPL-31T1-nasba1-f (SEQ. I.D.No. 362) AFIG11.
AMPL-32T1-nasba1-r (SEQ. I.D.No. 363) AFIG11.
AMPL-33T1-nasba2-f (SEQ. I.D.No. 364) AFIG11.
AMPL-34T1-nasba2-r (SEQ. I.D.No. 365) AFIG11.
AMPL-35T1-nasba3-f (SEQ. I.D.No. 366) AFIG11.
AMPL-36T1-nasba3-r (SEQ. I.D.No. 367) AFIG11. Fig. wR0075A1KPCF (SEQ. I.D.No. 368) 35A Fig. wR0075B1KPCR (SEQ. I.D.No. 369) 35A
Fig. wR0075A3NDMF (SEQ.
I.D.No. 370) 35A Fig. wR0075B3NDMR (SEQ.
I.D.No. 371) 35A
Tabela 18: Sequências de crRNA usadas
Sequência Seqüência de 1ª PFS Nome completa de crRNA Espaçador Fig.
C. (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
Alvo 1 crRNA 372) 373) 2F Zika visando o (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
U crRNA1 374) 375) 31A Zika G direcionando (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. crRNA2 376) 377) 33D CRRNA de U detecção de E. (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. coli 378) 379) 22B CRRNA de U detecção de K. (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. pneumoniae 380) 381) 34B CRRNA de U detecção de P. (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. aeruginosa 382) 383) 34B CRRNA de U detecção de M. (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. tuberculosis 384) 385) 34B CRRNA de G detecção de S. (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. aureus 386) 387) 34B (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
U KPC crRNA 388) 389) 35A (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C.
NDM crRNA 390) 391) 35A incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C. de crRNA1 392) 393) 36A incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C. de crRNA2 394) 395) 36A incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C. de crRNA3 396) 397) 36A incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C. de crRNA4 398) 399) 36A incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C. de crRNA5 400) 401) 36A incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C. de crRNA6 402) 403) 36A incompatibilida (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. de crRNA7 404) 405) 36A incompatibilida (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. de crRNA8 406) 407) 36A incompatibilida (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. de crRNA9 408) 409) 36A incompatibilida (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. de crRNA10 410) 411) 36A CrRNA africano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. 1 412) 413) 38A (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. crRNAAfricano 2 414) 415) 38A crRNAAmericano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. U 1 416) 417) 38A
U crRNAAmericano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. 2 418) 419) 38A Cepa de dengue (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a 3 crRNA1 420) 421) 38C Cepa de dengue (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a 3 crRNA2 422) 423) 38C Cepa de dengue (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a 1 crRNA1 424) 425) 38C Cepa de dengue (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a 1 crRNA2 426) 427) 38C C. crRNA africano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. mais curto 1 428) 429) 36C C. crRNA africano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. mais curto 2 430) 431) 36C
U crRNA americano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. mais curto 1 432) 433) 36C
U crRNA americano (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. mais curto 2 434) 435) 36C rs1467558 (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. crRNAC 436) 437) 38B rs1467558 (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. C. crRNAT 438) 439) 38B rs2952768 (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a crRNAC 440) 441) 38B rs2952768 (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a crRNAT 442) 443) 38B rs4363657 (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a crRNAC 444) 445) 38B rs4363657 (SEQ. I.D.No. (SEQ. I.D.No. Fig. a crRNAT 446) 447) 38B (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
G rs601338 crRNAA 448) 449) 38B (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
G rs601338 crRNAG 450) 451) 38B (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. a rs5082 crRNAG 452) 453) 40A (SEQ.
I.D.No. a rs5082 crRNAA 454) CrRNA de tipo C. selvagem (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
EGFRL858R 455) 456) 38C CRFN mutante de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig.
C.
EGFRL858R 457) 458) 38C BRAFV600E crRNA a de tipo (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. selvagem 459) 460) 38C CRFN mutante (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
Fig. a BRAFV600E 461) 462) 38C 23 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 463) 464) 57D de 1 23 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. incompatibilida 465) 466) 57D de 2 23 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. incompatibilida 467) 468) 57D de 4 23 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. incompatibilida 469) 470) 57D de 5 23 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. incompatibilida 471) 472) 57D de 6 23 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. incompatibilida 473) 474) 57D de 7 20 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 475) 476) 57F de 1 20 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 477) 478) 57F de 2 20 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 479) 480) 57F de 4 20 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 481) 482) 57F de 5 20 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 483) 484) 57F de 6 20 nt crRNA de (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No.
FIG.
C. incompatibilida 485) 486) 57F de 7 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 4 487) 488) 58B incompatibilida de crRNA1 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 4 crRNA 489) 490) 58B de incompatibilida de 2 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 4 crRNA 491) 492) 58B de incompatibilida de 3 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 4 crRNA 493) 494) 58B de incompatibilida de 5 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 4 crRNA 495) 496) 58B de incompatibilida de 6 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 4 crRNA 497) 498) 58B de incompatibilida de 7 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 5 crRNA 499) 500) 58B de incompatibilida de 2 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 5 crRNA 501) 502) 58B de incompatibilida de 3 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 5 crRNA 503) 504) 58B de incompatibilida de 4 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 5 crRNA 505) 506) 58B de incompatibilida de 6 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 5 crRNA 507) 508) 58B de incompatibilida de 7 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 5 crRNA 509) 510) 58B de incompatibilida de 8 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 6 crRNA 511) 512) 58B de incompatibilida de 3 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 6 crRNA 513) 514) 58B de incompatibilida de 4 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 6 crRNA 515) 516) 58B de incompatibilida de 5 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 6 crRNA 517) 518) 58B de incompatibilida de 7 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 6 crRNA 519) 520) 58B de incompatibilida de 8 incompatibilida (SEQ.
I.D.No. (SEQ.
I.D.No. fig.
C. de alvo 6 crRNA 521) 522) 58B de incompatibilida de 9
Tabela 19: Alvos de RNA e DNA usados neste exemplo
Nome Sequência 1aFig ssRNA1 (CPFS) (SEQ.
I.D.No. 523) fig. 2F ssRNA1 (GPFS) (SEQ.
I.D.No. 524) fig. 2F ssRNA1 (APFS) (SEQ.
I.D.No. 525) fig. 2F ssRNA1 (UPFS) (SEQ.
I.D.No. 526) fig. 2F ssDNA1 (SEQ.
I.D.No. 527) Fig. 27. DNA2 (SEQ.
I.D.No. 528) FIG. 54B ZIKV no (SEQ.
I.D.No. 529) Fig. 31B lentivírus DENV em (SEQ.
I.D.No. 530) Fig. 31B lentivírus Alvo ZIKV (SEQ.
I.D.No. 531) fig. 33D sintético Alvo ZIKV (SEQ.
I.D.No. 532) Fig. 37A africano sintético Alvo ZIKV (SEQ.
I.D.No. 533) Fig. 37A americano sintético Alvo da cepa 1 (SEQ.
I.D.No. 534) Fig. 37C da Dengue Sintética Alvo da cepa 3 (SEQ.
I.D.No. 535) Fig. 37C da Dengue Sintética ssRNA2 (SEQ.
I.D.No. 536) fig. 36A ssRNA3 (SEQ.
I.D.No. 537) fig. 36A
Tabela 20: plasmídeos usados neste exemplo
Nome Descrição Link para o mapa de do plasmídeo plasmí deo pC004 alvo de triagem de beta- https://benchling. lactamase com/s/lPJ1cCwR pC009 Locus LshCas13a no pACYC184 https://benchling. com espaçador de com/s/seqylkMuglYmiG4A3Vh direcionamento ShZg pC010 Locus LshCas13a no pACYC184 https://benchling. com espaçador de não com/s/seq- direcionamento 2WApFr3zni1GOACyQY8a pC011 Locus LwCas13a no pACYC184 https://benchling. com espaçador de com/s/seq- direcionamento Vyk8qK2fyhzegfNgLJHM pC012 Locus LwCas13a no pACYC184 https://benchling. com espaçador de não com/s/seq- direcionamento RxZAgPBzBUGQThkxR2Kx pC013 Twinstrep-SUMO-huLwCas13a https://benchling. para expressão bacteriana com/s/seq- 66CfLwu7sLMQMbcXe7Ih EXEMPLO 3 - CARACTERIZAÇÃODEORTOOLOGIASCas13b
COMPREFERÊNCIASBASEORTOGONAL
[00659] O requerente caracterizou bioquimicamente catorze ortólogos da família CRISPR-Cas13b do tipo VI, recentemente definida, de enzimas de direcionamento de RNA guiadas por RNA para encontrar novos candidatos para melhorar a tecnologia de detecção SHERLOCK (Figs. 83A e 85). O requerente foi capaz de expressar heterologicamente catorze ortólogos Cas13b em E. coli e purificar as proteínas para um ensaio de atividade de RNase in vitro (Fig. 86). Como diferentes ortólogos Cas13 podem ter preferências de dibase variadas para a atividade ideal de clivagem, o Requerente gerou sensores homopolímeros fluorescentes de RNase que consistiam em 5As, Gs, Cs ou Us para avaliar as preferências de clivagem ortogonais. O requerente incubou cada ortólogo com seu crRNA cognato direcionado a um ssRNA1 sintético de 173nt e mediu a atividade de clivagem colateral usando os sensores fluorescentes do homopolímero (Figuras 83B e 87).
EXEMPLO 4 – TELA DE DESCOBERTA DO MOTIVO COM
BIBLIOTECA
[00660] Para explorar ainda mais a diversidade de preferências de clivagem dos vários ortólogos Cas13a e Cas13b, o Requerente desenvolveu uma abordagem baseada em biblioteca para caracterizar motivos preferidos para a atividade de endonucleases em resposta à atividade colateral. O requerente utilizou um repórter de ARN de 6- mero degenerado, ladeado por constantes punhos de DNA, o que permitiu a amplificação e leitura de sequências não clivadas (Fig. 83C). Incubar esta biblioteca com enzimas Cas13 ativadas colaterais resultou em clivagem detectável e dependeu da adição de RNA alvo (Fig. 88). A sequenciação de motivos esgotados revelou um aumento na inclinação da biblioteca ao longo do tempo de digestão (Fig. 89A), indicativo de preferência de base, e a seleção de sequências acima de uma razão limiar produziu sequências enriquecidas em número que correspondiam à clivagem das enzimas (Fig. 89B)Os logotipos de sequência de motifs enriquecidos reproduziram a preferência U observada para LwaCas13a e CcaCas13b e a preferência A de PsmCas13b (Fig.
89C). O requerente também determinou múltiplas sequências que mostraram clivagem para apenas um ortólogo, mas não outros, para permitir uma leitura independente (Fig. 89D).
Para entender os submotivos específicos da preferência enzimática, o Requerente analisou os motivos esgotados quanto às preferências de dibase única (Fig. 90A), que concordaram com os motivos de homopolímeros testados, bem como para os motivos de duas bases (Fig. 83C e 90B). Esses motivos de duas bases revelam uma preferência mais complexa, especialmente para LwaCas13a e PsmCas13b, que prefere as seqüências de dibase TA, GA e AT. Motivos de ordem superior também revelaram preferências adicionais (Figs. 91 e 92).
[00661] O requerente confirmou as preferências colaterais de LwaCas13a, PsmCas13b e CcaCas13b com digestão in vitro de alvos (Fig. 93). A fim de melhorar a digestão fraca de PsmCas13b, o Requerente otimizou a composição do tampão e a concentração de enzimas (Fig. 94A, B). Outras dições testadas nos ortólogos PsmCas13b e Cas13b não tiveram grandes efeitos (Fig. 95A-F). O requerente também comparou PsmCas13b a um membro da família Cas13 de preferência A previamente caracterizado para dois alvos de RNA e encontrou sensibilidade comparável ou melhorada (Fig.
96A, B). A partir desses resultados, o Requerente comparou a cinética de LwaCas13a e PsmCas13b, em reações separadas com repórteres independentes, e encontrou baixos níveis de interferência entre os dois canais (Fig. 83D).
EXEMPLO 5 – DETECÇÃO DE MOLECULA ÚNICA COM LwaCas13a, PsmCas13b E CcaCas13b
[00662] Uma característica fundamental da tecnologia SHERLOCK é que ela permite a detecção de molécula única (2aM ou 1molecule/µL) pela atividade colateral da RNase de LwaCas13a. Para caracterizar a sensibilidade das enzimas Cas13b, o Requerente realizou o SHERLOCK com PsmCas13b e CcaCas13b, outra enzima Cas13b altamente ativa com preferência pela uridina (Fig. 83E). O requerente constatou que LwaCas13a, PsmCas13b e CcaCas13b eram capazes de alcançar a detecção de 2aM de dois diferentes tipos de RNA, ssRNA1 e um zika ssRNA sintético (Figs. 83E; 97 e 98). Para investigar a robustez do direcionamento com essas três enzimas, o Requerente projetou onze crRNAs diferentes, uniformemente espaçados pelo ssRNA1, e descobriu que o LwaCas13a alcançou consistentemente a detecção de sinal, enquanto CcaCas13b e Psmcas13b mostraram muito mais variabilidade na detecção do crRNA para o crRNA (Fig.
99)Para identificar o crRNA ideal para detecção, o Requerente variou o comprimento do espaçador de PsmCas13b e CcaCas13b de 34 a 12 nt e descobriu que o PsmCas13b tinha um pico de sensibilidade no comprimento do espaçador de 30, enquanto o CcaCas13b apresentava sensibilidade equivalente acima do comprimento do espaçador de 28nt (Fig. 100)O requerente também testou se o limite de detecção poderia ser ultrapassado 2aM, permitindo maiores entradas de volume de amostra no SHERLOCK. Ao aumentar a etapa RPA de pré- amplificação, o Requerente descobriu que tanto o LwaCas13a quanto o PsmCas13b poderiam fornecer sinais de detecção significativos para amostras de entrada de 200, 20 e 2zM e permitir entradas de volume de 250µL e 540µL.
EXEMPLO 6 – SHERLOCK QUANTITATIVO COM RPA
[00663] Como o SHERLOCK depende de uma amplificação exponencial, a quantificação precisa de ácidos nucleicos pode ser difícil. O requerente levantou a hipótese de que a redução da eficiência da etapa RPA poderia melhorar a correlação entre a quantidade de entrada e o sinal da reação SHERLOCK. O requerente observou que a cinética da detecção de SHERLOCK era muito sensível à concentração de iniciador em um intervalo de concentrações da amostra (Fig.
101A-D). ORequerente diluiu concentrações de iniciadores que aumentaram a precisão do sinal e quantitativa (Fig. 83G e 101E). Esta observação pode ser devida a uma diminuição na formação do iniciador-dímero, permitindo uma amplificação mais efetiva e evitando a saturação.
Concentrações de iniciadores de 120nM exibiram a maior correlação entre sinal e entrada (Fig. 101F). Essa precisão foi sustentável em uma ampla faixa de concentrações até a faixa attomolar (Figs. 83H e 101G).
EXEMPLO 7 – MULTIPLEX DE DUAS CORES COM ORTOGONIAS ORTOGONAIS Cas13
[00664] Uma característica vantajosa do diagnóstico de ácido nucleico é a capacidade de detectar simultaneamente várias entradas de amostra, permitindo painéis de detecção multiplexados ou em controles de amostra. As preferências ortogonais das enzimas Cas13 oferecem a oportunidade de ter o SHERLOCK multiplexado. O requerente pode testar a atividade colateral de diferentes enzimas Cas13 na mesma reação por meio de sensores homopolímeros fluorescentes de diferentes identidades de base e cores de fluoróforo, permitindo que vários alvos sejam medidos simultaneamente (Fig. 84A). Para demonstrar esse conceito, o Requerente projetou um crRNA de LwaCas13a contra o ssRNA do vírus Zika e um crRNA de PsmCas13b contra o ssRNA do vírus da dengue. O requerente constatou que este ensaio com os dois conjuntos de complexos Cas13-crRNA na mesma reação era capaz de identificar se o RNA de Zika ou da dengue, ou ambos, estava presente na reação (Fig. 84B).
O requerente também descobriu que, devido às preferências ortogonais entre CcaCas13b e PsmCas13b, essas duas enzimas também poderiam ser aproveitadas para a detecção multiplexada dos alvos de zika e dengue (Fig. 102). O requerente conseguiu estender este conceito com sucesso a toda a reação SHERLOCK, contendo os iniciadores RPA multiplexados e os complexos Cas13-crRNA. O requerente concebeu um crRNA de LwaCas13a contra P. aeruginosa e um crRNA de PsmCas13b contra S. aureus e foi capaz de detectar ambos os alvos de DNA até o intervalo attomolar (Fig. 84C). Da mesma forma, o uso do PsmCas13b e do Requerente LwaCas13a foi capaz de alcançar a detecção multiplexada attomolar do RNA de Zika e da dengue usando SHERLOCK (Fig. 103).
[00665] O requerente mostrou que o LwaCas13a permitiu a detecção de variantes de nucleotídeo único e que isso poderia ser aplicado para genotipagem rápida a partir da saliva humana, mas a detecção exigia duas reações separadas: uma para cada crRNA com detecção de alelo. Para permitir uma genotipagem SHERLOCK de reação única, o Requerente projetou um crRNALwaCas13a contra o alelo G e um crRNAPsmCas13b contra o alelo A do SNP rs601338SNP, uma variante do gene FUT2 alfa (1,2) -fosiltransferase alfa que se associa a resistência ao norovírus. Utilizando esta abordagem multiplexada de amostra única, o Requerente conseguiu genotipar com sucesso quatro indivíduos humanos diferentes usando sua saliva e identificar com precisão se eram homozigotos ou heterozigotos.
[00666] Para demonstrar ainda mais a versatilidade da família de enzimas Cas13, o Requerente simulou uma abordagem terapêutica que envolve o Cas13, servindo como diagnóstico complementar e à própria terapia.
AAppicant desenvolveu recentemente o PspCas13b para edição programável de transcritos de RNA, que pode ser usado para corrigir mutações em doenças genéticas, usando um sistema chamado RNAEditing for Programmable A to IReplacement
(REPAIR). Como o diagnóstico pode ser muito útil quando combinado com terapias para orientar as decisões de tratamento ou monitorar o resultado de um tratamento, o
Requerente pensou que o SHERLOCK poderia ser usado para genotipagem para orientar o tratamento REPAIR e também como uma leitura no RNA editado para acompanhar a edição eficiência da terapia (Fig. 84E). O requerente optou por demonstrar este conceito teranóstico para corrigir uma mutação no APC (APC:c. 1262G>A) na polipose adenomatosa familiar 1, um distúrbio hereditário que envolve câncer no intestino grosso e no reto.
O requerente concebeu ADNc saudáveis e mutantes do gene APC e transfectou-os para células HEK293FT.
O requerente foi capaz de colher o DNA destas células e genotipar com sucesso as amostras corretas usando SHERLOCK multiplexado de amostra única com LwaCas13a e PsmCas13b (Fig. 84F). Simultaneamente, o Requerente desenhou e clonou RNAs guia para o sistema REPAIR e células transfectadas que tinham o genótipo doente com o RNA guia e o sistema dPspCas13b-ADAR2dd (E488Q) REPAIR. Após 48 horas, o Requerente coletou o RNA, que o Requerente dividiu para entrada no SHERLOCK para detectar o resultado da edição e para a análise de sequenciamento de próxima geração (NGS) para confirmar a taxa de edição. A sequenciação revelou que o Requerente alcançou 43% de edição com o sistema REPAIR (Fig. 84G) e foi capaz de detectá-lo com SHERLOCK, pois o crRNA de detecção saudável mostrou um sinal mais alto do que a condição de controle guia não direcionada e o crRNA com detecção de doença mostrou um diminuição do sinal (Fig.
84H e 104). No geral, o projeto e a síntese dos reagentes para este ensaio demoraram 3 dias, a genotipagem demorou 1 dia e a correção com REPAIR e a detecção da taxa de edição demoraram 3 dias, resultando em um gasoduto total de theranóstica que dura apenas 7 dias.
[00667] Applicnat demonstrou a detecção altamente sensível e específica de ácidos nucleicos usando o ortólogo CRISPR-Cas13a direcionado a RNA tipo VI de Leptotrichia wadei. O requerente demonstrou ainda que a família de enzimas Cas13b é bioquimicamente ativa e tem propriedades únicas que as tornam passíveis de detecção multiplexada de ácidos nucleicos por SHERLOCK. Ao caracterizar as preferências ortogonais da base das enzimas Cas13b, o Requerente encontrou sequências específicas de sensores de
RNA fluorescente que são reconhecidos por PsmCas13b que LwaCas13a não reconhece. O requerente foi capaz de alavancar essas preferências básicas para possibilitar a detecção multiplexada na amostra de dois alvos diferentes e mostrar a utilidade desse recurso para distinguir cepas virais e indivíduos de genotipagem. Além disso, através da engenharia da etapa de pré-amplificação, o SHERLOCK pode ser quantitativo, permitindo a aproximação da concentração ou quantificação de ácidos nucleicos de entrada.
ORequerente demonstrou adicionalmente que o PsmCas13b ortogonal é capaz de detectar uma única molécula e que, ao aumentar o volume, o Requerente pode realizar a detecção de amostras até ~0,5mL e até concentrações de 2zM.
[00668] A detecção multiplexada com SHERLOCK é possível através da realização espacial de múltiplas reações, mas a multiplexação em amostra via preferências de dibase ortogonal permite que muitos alvos sejam detectados em escala e a um custo mais barato. Embora o Requerente tenha mostrado aqui a multiplexação de duas entradas, as telas de motivos de clivagem permitem o projeto de sensores de clivagem ortogonais adicionais (Fig. 90). LwaCas13a e CcaCas13b, que clivam o mesmo homopolímero de uridina e, portanto, não são ortogonais, conforme medido pelos sensores de homopolímeros (Fig. 83B), mostraram preferências de clivagem muito únicas pelas telas de motivos (Fig. 90). Ao rastrear ortólogos Cas13a, Cas13b e Cas13c adicionais, é provável que muitos ortólogos revelem preferências únicas de motivos de 6 mer, o que teoricamente poderia permitir o SHERLOCK altamente multiplexado limitado apenas pelo número de sensores fluorescentes espectralmente únicos. OSHERLOCK altamente multiplexado permite muitas aplicações tecnológicas, especialmente aquelas que envolvem detecção de entrada complexa e computação lógica.
[00669] Esses refinamentos adicionais da detecção baseada em Cas13 para leituras visuais, mais sensíveis e multiplexadas permitem aplicações maiores para a detecção de ácidos nucléicos, especialmente em ambientes onde são necessárias análises portáteis e sem instrumentos. A genotipagem rápida e multiplexada pode informar as decisões farmacogenômicas, testar várias características das culturas no campo ou avaliar a presença de patógenos co- ocorrentes. A leitura rápida e isotérmica aumenta a acessibilidade dessa detecção para configurações em que os leitores de energia ou portáteis não estão disponíveis, mesmo para espécies raras como o DNA em circulação. Os testes aprimorados de ácido nucleico baseados em CRISPR facilitam o entendimento da presença de ácidos nucleicos na agricultura, na detecção de patógenos e em doenças crônicas.
EXEMPLO 8 – DETECÇÃO COLORIMÉTRICA DE SHERLOCK
[00670] Quadruplexos de DNA podem ser usados para a detecção de analitos de biomoléculas (Fig. 110). Em um caso, o OTA-aptâmero (azul) reconhece o OTA, causando uma alteração conformacional que expõe o qradruplex (vermelho) para ligar a hemina. O complexo hemin-quadruplex possui atividade de peroxidase que pode oxidar o substrato TMB para uma forma colorida (geralmente azul em solução). Os requerentes criaram formas de RNA desses quadruplexos que Cas13 pode degradar como parte da atividade colateral aqui descrita. A degradação causa uma perda do aptâmero do RNA e, portanto, uma perda do sinal de cor na presença do alvo do ácido nucleico. Dois projetos exemplares são ilustrados abaixo.
1) rUrGrGrGrUrUrGrGrGrUrUrGrGrGrUrUrGrGrGrA (SEQIDNO:538) 2) rUrGrGrGrUrUrUrGrGrGrUrUrUrGrGrGrUrUrUrGrGrGrA (SEQIDNO:539)
[00671] As guaninas formam os pares de bases principais que geram a estrutura quadruplex e, em seguida, ligam a molécula de hemina. Os Requerentes espaçaram os conjuntos de guaninas com uridina (mostrada em Negrito) para permitir que Cas13 degradasse o quadruplex, pois os dados de di-nucleotídeos mostram que as guaninas são pouco degradadas.
[00672] Os Requerentes testaram os dois projetos de aptâmero em duas concentrações diferentes (Fig. 111). A menor concentração de 100nM não foi suficiente para formar cores. A condição 400nM formou cor. Os dados de absorbância correspondentes para esta análise também foram quantificados (Fig. 112). Especificamente, o design 1 teve os melhores resultados para b9 e o design 2 teve os melhores resultados para Lwa.
[00673] Os requerentes testaram ainda a estabilidade da alteração colorimétrica (Fig. 113). A alteração colorimétrica Cas13 é estável após 1 hora. O sinal colorimétrico LwaCas13a é estável durante 1 hora, enquanto o diferencial de cores Cas13b9 é menos estável. Os candidatos observaram que mesmo a condição de 100nM de aptâmero agora funciona para Cas13b9 porque, após uma hora, a cor pode surgir devido à oxidação do substrato e uma diferença de cor pode ser observada.
[00674] Os candidatos compararam a detecção colorimétrica à detecção de fluorescência (Fig. 114). A concentração de 2 aM pode ser detectada em ambos os sistemas, no entanto, o aumento da fluorescência no fundo foi menor que a diminuição na detecção colormétrica no fundo. Isso indica que o ensaio colorimétrico pode fornecer resultados mais sensíveis.
[00675] O ensaio colorimétrico é aplicável para uso como ensaio de diagnóstico, conforme descrito aqui. Numa modalidade, os quadruplexos são incubados com uma amostra de teste e o sistema Cas13SHERLOCK. Após um período de incubação para permitir a identificação de Cas13 de uma sequência alvo e para degradação de aptâmeros por atividade colateral, o substrato pode ser adicionado. A absorvância pode então ser medida. Em outras modalidades, o substrato é incluído no ensaio com os quadruplexos e o sistema Cas13SHERLOCK.
EXEMPLO 9 – PLATAFORMA MULTIPLEX COM BASE EM
PREFERÊNCIAS ÚNICAS DE LAVAGEM DE ENZIMAS CAS Resultados
[00676] Muitas aplicações requerem a detecção de mais de uma molécula alvo em uma única reação, e, portanto, procuramos criar uma plataforma multiplex que se baseia em preferências únicas de clivagem das enzimas Cas (Abudayyeh et al. Science 353, aaf5573 (2016); Gootenberg et al.
Science 356:438-442 (2017); East-Seletsky et al. Nature 538:270-273 (2016); East-Seletsky et al. Mol Cell 66:373- 383 (2017)). Para identificar possíveis enzimas candidatas compatíveis com a multiplexação, caracterizamos bioquimicamente três membros da família CRISPR-Cas13a e quatorze membros da família CRISPR-Cas13b (Shmakov et al.
Nat Rev Microbiol 15:169-182 (2017); Smargon et al. Mol
Cell 65:618-630 (2017)) (Figs. 77, 85, 86 e Tabela 21).
Criamos perfis de preferências de clivagem em repórteres de homopolímeros e descobrimos que a maioria dos ortólogos preferia uridina, uma combinação de bases ou adenina (Fig.
119 e Tabelas 22-25) e a clivagem poderia ser melhorada com a otimização do design de buffer e crRNA (Figs. 120-123, consulte métodos). Entre as enzimas de clivagem da adenina, o PsmCas13b foi mais sensível que o LbaCas13a (Fig. 124).
Refinamos as preferências da sequência de clivagem avaliando a atividade colateral através de motivos de nucleotídeos (Fig. 125A), encontrando uma grande diversidade de preferências de motivos de clivagem de nucleotídeos (Figs. 126 e 127 e métodos). A partir dessas telas de clivagem de nucleotídeos, descobrimos que as atividades de LwaCas13a, CcaCas13b, LbaCas13a e PsmCas13b poderiam ser medidas independentemente com os quatro repórteres de nucleotídeos AU, UC, AC e GA, respectivamente (Fig. 125B e Fig. 128)Além disso, usando uma tela aleatória de clivagem de motivos de biblioteca de RNA in vitro, identificamos numerosos RNA6-mers que permitiram maior ortogonalidade entre as enzimas Cas13 (Figs. 129-132 e métodos).
Tabela 21. Proteínas Cas13 e Csm6Purificadas neste Estudo.
A parte de imagem com identificação de relação rId10 não foi encontrada no arquivo.
Abreviação Nome proteína Nome cepa Link Benchling Número de acessão Tabela 22. crRNA usado neste estudo. São mostrados o IDSEQNO:540-863, com SEQIDNOs:540, 541 e 542 representando a sequência completa de crRNA, espaçador e repetição direta, respectivamente, etc.
Sequência Repe Nome Ortólogo completa de Espaç tiçã Alvo 1ª Fig. crRNA ador o dire ta
GATTTAGACTA CTAC ssRNA/ssDNA1 LwaCas13a CCCCAAAAACG CAAG GATTTAG ssRN FIG. crRNA2 AAGGGGACTAA TAAT ACTACCC A1 1B/fi AACCTACCAAG CCAT CAAAAAC g. S3
TAATCCATATT ATTT GAAGGGG TCTAGAGGATC CTAG ACTAAAA AGGA C
TC BzoCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD BzoCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGGAA ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTGCTCT A1 1B/fi GGAACTGCTCT CCAT CATTTTG g. S3
CATTTTGGAGG ATTT GAGGGTA GTAATCACAAC CTAG ATCACAA AGGA C
TC PinCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PinCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGCAT ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTGCCTG A1 1B/fi GCATCTGCCTG CCAT CTGTTTG g. S3
CTGTTTGCAAG ATTT CAAGGTA GTAAAAACAAC CTAG AAAACAA AGGA C
TC PbuCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PbuCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGCAT ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTGCCTT A1 1B/fi GCATCTGCCTT CCAT CTTTTTG g. S3
CTTTTTGAAAG ATTT AAAGGTA GTAAAAACAAC CTAG AAAACAA AGGA C
TC AspCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD AspCas13b TCCATATTTCT CAAG GCTGTTA ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGCT TAAT TATCCTT A1 1B/fi GTTATATCCTT CCAT ACCTTTG g. S3
ACCTTTGTAAG ATTT TAAGGGA GGAAGTACAGC CTAG AGTACAG AGGA C
TC PsmCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PsmCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGTAG ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT AAGCTTA A1 1B/fi GTAGAAGCTTA CCAT TCGTTTG g. S3
TCGTTTGGATA ATTT GATAGGT GGTATGACAAC CTAG ATGACAA AGGA C TC
RanCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD RanCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGGGA ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTGCTCT A1 1B/fi GGGACTGCTCT CCAT CACTTTG g. S3
CACTTTGAAGG ATTT AAGGGTA GTATTCACAAC CTAG TTCACAA AGGA C
TC PauCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PauCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGTAT ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTGCCTT A1 1B/fi GTATCTGCCTT CCAT CTGTTTG g. S3
CTGTTTGAAAG ATTT AAAGGTA GTAAAAACAAC CTAG AAAACAA AGGA C
TC PsaCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PsaCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGTGT ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTACCTC A1 1B/fi GTGTCTACCTC CCAT CTTTTTG g. S3
CTTTTTGAGAG ATTT AGAGGTA GTAAAAACAGC CTAG AAAACAG AGGA C
TC Pin2Cas13 CTACCAAGTAA CTAC b Pin2Cas13 TCCATATTTCT CAAG GTTGCAT ssRN FIG. ssRNA/ssD b AGAGGATCGTT TAAT CTGCCTG A1 1B/fi NA crRNA2 GCATCTGCCTG CCAT CTGTTTG g. S3
CTGTTTGCAAG ATTT CAAGGTA GTAAAAACAAC CTAG AAAACAA AGGA C
TC CcaCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD CcaCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGGAA ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTGCTCT A1 1B/fi GGAACTGCTCT CCAT CATTTTG g. S3
CATTTTGGAGG ATTT GAGGGTA GTAATCACAAC CTAG ATCACAA AGGA C
TC PguCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PguCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGGAT ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTACCCT A1 1B/fi GGATCTACCCT CCAT CTATTTG g. S3
CTATTTGAAGG ATTT AAGGGTA GTACACACAAC CTAG CACACAA AGGA C TC
PspCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PspCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGTGG ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT AAGGTCC A1 1B/fi GTGGAAGGTCC CCAT AGTTTTG g. S3
AGTTTTGAGGG ATTT AGGGGCT GCTATTACAAC CTAG ATTACAA AGGA C
TC PigCas13b CTACCAAGTAA CTAC ssRNA/ssD PigCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGGAT ssRN FIG. NA crRNA2 AGAGGATCGTT TAAT CTACCCT A1 1B/fi GGATCTACCCT CCAT CTATTCG g. S3
CTATTCGAAGG ATTT AAGGGTA GTACACACAAC CTAG CACACAA AGGA C
TC Pin3Cas13 CTACCAAGTAA CTAC b Pin3Cas13 TCCATATTTCT CAAG GTTGCAT ssRN FIG. ssRNA/ssD b AGAGGATCGTT TAAT CTGCCTG A1 1B/fi NA crRNA2 GCATCTGCCTG CCAT CTGTTTG g. S3
CTGTTTGCAAG ATTT CAAGGTA GTAAAAACAAC CTAG AAAACAA AGGA C
TC CrRNA de GATTTAGACTA TGCT DENV DENV LwaCas13a CCCCAAAAACG TCTG GATTTAG ssRN Figura LwaCas13a AAGGGGACTAA TCCA ACTACCC A 1D
AACTGCTTCTG GTGA CAAAAAC TCCAGTGAGCA GCAT GAAGGGG TGGTCTTCG GGTC ACTAAAA
TTCG C CrRNA de TTTGCTTCTGT TTTG DENV DENV PsmCas13b CCAGTGAGCAT CTTC GTTGTAG ssRN Figura PsmCas13b GGTCTTCGGTT TGTC AAGCTTA A 1D
GTAGAAGCTTA CAGT TCGTTTG TCGTTTGGATA GAGC GATAGGT GGTATGACAAC ATGG ATGACAA TCTT C CG
DENV LbuCas13a LbuCas13a GACCACCCCAA TGCT GACCACC DENV FIG. 22nt AAATGAAGGGG TCTG CCAAAAA ssRN S7C espaçador ACTAAAACATG TCCA TGAAGGG A
CTTCTGTCCAG GTGA GACTAAA TGAGCATGG GCAT ACA GG
DENV Espaçador LbuCas13a GACCACCCCAA TGCT GACCACC DENV FIG. LbuCas13a AAATGAAGGGG TCTG CCAAAAA ssRN S7C 20nt ACTAAAACATG TCCA TGAAGGG A
CTTCTGTCCAG GTGA GACTAAA TGAGCAT GCAT ACA
DENV Espaçador LbuCas13a GACCACCCCAA TGCT GACCACC DENV FIG. LbuCas13a AAATGAAGGGG TCTG CCAAAAA ssRN S7C 18nt ACTAAAACATG TCCA TGAAGGG A
CTTCTGTCCAG GTGA GACTAAA TGAGC GC ACA
TGTTC Teste CcaCas13b TGTTCTACCAA TAC GTTGGAA ssRN FIG. espaçador GTAATCCATAT CAAG CTGCTCT A1 S10A CcaCas13b TTCTAGAGGAT TAAT CATTTTG 34 nt CGTTGGAACTG CCAT GAGGGTA
CTCTCATTTTG ATTT ATCACAA GAGGGTAATCA CTAG C CAAC AGGA TC
GTTCT Teste CcaCas13b GTTCTACCAAG ACC GTTGGAA ssRN FIG. espaçador TAATCCATATT AAGT CTGCTCT A1 S10A CcaCas13b TCTAGAGGATC AATC CATTTTG 33 nt GTTGGAACTGC CATA GAGGGTA
TCTCATTTTGG TTTC ATCACAA AGGGTAATCAC TAGA C AAC GGAT C
TTCTACCAAGT TTCT Teste CcaCas13b AATCCATATTT ACCA GTTGGAA ssRN FIG. espaçador CTAGAGGATCG AGTA CTGCTCT A1 S10A CcaCas13b TTGGAACTGCT ATCC CATTTTG 32 nt CTCATTTTGGA ATAT GAGGGTA
GGGTAATCACA TTCT ATCACAA AC AGAG C GATC
TCTACCAAGTA TCTA Teste CcaCas13b ATCCATATTTC CCAA GTTGGAA ssRN FIG. espaçador TAGAGGATCGT GTAA CTGCTCT A1 S10A CcaCas13b TGGAACTGCTC TCCA CATTTTG 31 nt TCATTTTGGAG TATT GAGGGTA
GGTAATCACAA TCTA ATCACAA C GAGG C
ATC Teste CTACCAAGTAAT CTACC espaçador CcaCas13b CCATATT AAG GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b TCTAGAGGATC TAAT CTGCTCT A1 S10A 30 nt GTTGGAACTGC CCAT CATTTTG
TCTCATTTTGG ATTT GAGGGTA AGGGTAATCAC CTAG ATCACAA AAC AGGA C TC
Teste TACCAAGTAATC TACCA espaçador CcaCas13b CATATTT AGT GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b CTAGAGGATCG AATC CTGCTCT A1 S10A 29 nt TTGGAACTGCT CATA CATTTTG
CTCATTTTGGA TTTC GAGGGTA GGGTAATCACA TAGA ATCACAA AC GGAT C
C Teste ACCAAGTAATCC ACCAA espaçador CcaCas13b ATATTTC GTA GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b TAGAGGATCGT ATCC CTGCTCT A1 S10A 28 nt TGGAACTGCTC ATAT CATTTTG
TCATTTTGGAG TTCT GAGGGTA GGTAATCACAA AGAG ATCACAA
C GATC C Teste CCAAGTAATCCA CCAAG espaçador CcaCas13b TATTTCT TAA GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b AGAGGATCGTT TCCA CTGCTCT A1 S10A 27 nt GGAACTGCTCT TATT CATTTTG
CATTTTGGAGG TCTA GAGGGTA GTAATCACAAC GAGG ATCACAA
ATC C Teste CAAGTAATCCAT CAAGT espaçador CcaCas13b ATTTCTA AAT GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b GAGGATCGTTG CCAT CTGCTCT A1 S10A 26 nt GAACTGCTCTC ATTT CATTTTG
ATTTTGGAGGG CTAG GAGGGTA TAATCACAAC AGGA ATCACAA
TC C Teste AAGTAATCCATA AAGTA espaçador CcaCas13b TTTCTAG ATC GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b AGGATCGTTGG CATA CTGCTCT A1 S10A 25 nt AACTGCTCTCA TTTC CATTTTG
TTTTGGAGGGT TAGA GAGGGTA AATCACAAC GGAT ATCACAA
C C Teste AGTAATCCATAT espaçador CcaCas13b TTCTAGA AGTA GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b GGATCGTTGGA ATCC CTGCTCT A1 S10A 24 nt ACTGCTCTCAT ATAT CATTTTG
TTTGGAGGGTA TTCT GAGGGTA ATCACAAC AGAG ATCACAA
GATC C Teste GTAATCCATATT espaçador CcaCas13b TCTAGAG GTAA GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b GATCGTTGGAA TCCA CTGCTCT A1 S10A 23 nt CTGCTCTCATT TATT CATTTTG
TTGGAGGGTAA TCTA GAGGGTA TCACAAC GAGG ATCACAA ATC C
Teste TAATCCATATTT espaçador CcaCas13b CTAGAGG TAAT GTTGGAA ssRN FIG. CcaCas13b ATCGTTGGAAC CCAT CTGCTCT A1 S10A 22 nt TGCTCTCATTT ATTT CATTTTG
TGGAGGGTAAT CTAG GAGGGTA CACAAC AGGA ATCACAA
TC C Teste AATCCATATTT AATC GTTGGAA espaçador CcaCas13b CTAGAGGATCG CATA CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b TTGGAACTGCT TTTC CATTTTG A1 S10A 21 nt CTCATTTTGGA TAGA GAGGGTA
GGGTAATCACA GGAT ATCACAA
AC C C Teste ATCCATATTTC ATCC GTTGGAA espaçador CcaCas13b TAGAGGATCGT ATAT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b TGGAACTGCTC TTCT CATTTTG A1 S10A 20 nt TCATTTTGGAG AGAG GAGGGTA
GGTAATCACAA GATC ATCACAA
C C Teste TCCATATTTCT TCCA GTTGGAA espaçador CcaCas13b AGAGGATCGTT TATT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b GGAACTGCTCT TCTA CATTTTG A1 S10A 19 nt CATTTTGGAGG GAGG GAGGGTA
GTAATCACAAC ATC ATCACAA
C Teste CCATATTTCTA CCAT GTTGGAA espaçador CcaCas13b GAGGATCGTTG ATTT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b GAACTGCTCTC CTAG CATTTTG A1 S10A 18 nt ATTTTGGAGGG AGGA GAGGGTA
TAATCACAAC TC ATCACAA
C Teste CATATTTCTAG CATA GTTGGAA espaçador CcaCas13b AGGATCGTTGG TTTC CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b AACTGCTCTCA TAGA CATTTTG A1 S10A 17 nt TTTTGGAGGGT GGAT GAGGGTA
AATCACAAC C ATCACAA
C Teste ATATTTCTAGA GTTGGAA espaçador CcaCas13b GGATCGTTGGA ATAT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b ACTGCTCTCAT TTCT CATTTTG A1 S10A 16 nt TTTGGAGGGTA AGAG GAGGGTA
ATCACAAC GATC ATCACAA
C Teste TATTTCTAGAG GTTGGAA espaçador CcaCas13b GATCGTTGGAA TATT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b CTGCTCTCATT TCTA CATTTTG A1 S10A 15 nt TTGGAGGGTAA GAGG GAGGGTA
TCACAAC ATC ATCACAA C
Teste ATTTCTAGAGG GTTGGAA espaçador CcaCas13b ATCGTTGGAAC ATTT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b TGCTCTCATTT CTAG CATTTTG A1 S10A 14 nt TGGAGGGTAAT AGGA GAGGGTA
CACAAC TC ATCACAA
C Teste TTTCTAGAGGA GTTGGAA espaçador CcaCas13b TCGTTGGAACT TTTC CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b GCTCTCATTTT TAGA CATTTTG A1 S10A 13 nt GGAGGGTAATC GGAT GAGGGTA
ACAAC C ATCACAA
C Teste TTCTAGAGGAT GTTGGAA espaçador CcaCas13b CGTTGGAACTG TTCT CTGCTCT ssRN FIG. CcaCas13b CTCTCATTTTG AGAG CATTTTG A1 S10A 12 nt GAGGGTAATCA GATC GAGGGTA
CAAC ATCACAA C
TGTT Teste PsmCas13b TGTTCTACCAA CTAC GTTGTAG ssRN FIG. espaçador GTAATCCATAT CAAG AAGCTTA A1 S10B PsmCas13b TTCTAGAGGAT TAAT TCGTTTG 34 nt CGTTGTAGAAG CCAT GATAGGT
CTTATCGTTTG ATTT ATGACAA GATAGGTATGA CTAG C CAAC AGGA TC
GTTCT Teste PsmCas13b GTTCTACCAAG ACC GTTGTAG ssRN FIG. espaçador TAATCCATATT AAGT AAGCTTA A1 S10B PsmCas13b TCTAGAGGATC AATC TCGTTTG 33 nt GTTGTAGAAGC CATA GATAGGT
TTATCGTTTGG TTTC ATGACAA ATAGGTATGAC TAGA C AAC GGAT C
TTCTACCAAGT TTCT Teste PsmCas13b AATCCATATTT ACCA GTTGTAG ssRN FIG. espaçador CTAGAGGATCG AGTA AAGCTTA A1 S10B PsmCas13b TTGTAGAAGCT ATCC TCGTTTG 32 nt TATCGTTTGGA ATAT GATAGGT
TAGGTATGACA TTCT ATGACAA AC AGAG C GATC
TCTACCAAGTA TCTA Teste PsmCas13b ATCCATATTTC CCAA GTTGTAG ssRN FIG. espaçador TAGAGGATCGT GTAA AAGCTTA A1 S10B PsmCas13b TGTAGAAGCTT TCCA TCGTTTG 31 nt ATCGTTTGGAT TATT GATAGGT
AGGTATGACAA TCTA ATGACAA C GAGG C ATC
Teste CTACCAAGTAA CTAC espaçador PsmCas13b TCCATATTTCT CAAG GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b AGAGGATCGTT TAAT AAGCTTA A1 S10B 30 nt GTAGAAGCTTA CCAT TCGTTTG
TCGTTTGGATA ATTT GATAGGT GGTATGACAAC CTAG ATGACAA AGGA C
TC Teste TACCAAGTAAT TACC espaçador PsmCas13b CCATATTTCTA AAGT GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b GAGGATCGTTG AATC AAGCTTA A1 S10B 29 nt TAGAAGCTTAT CATA TCGTTTG
CGTTTGGATAG TTTC GATAGGT GTATGACAAC TAGA ATGACAA GGAT C
C Teste ACCAAGTAATCC ACCAA espaçador PsmCas13b ATATTTC GTA GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b TAGAGGATCGT ATCC AAGCTTA A1 S10B 28 nt TGTAGAAGCTT ATAT TCGTTTG
ATCGTTTGGAT TTCT GATAGGT AGGTATGACAA AGAG ATGACAA
C GATC C Teste CCAAGTAATCCA CCAAG espaçador PsmCas13b TATTTCT TAA GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b AGAGGATCGTT TCCA AAGCTTA A1 S10B 27 nt GTAGAAGCTTA TATT TCGTTTG
TCGTTTGGATA TCTA GATAGGT GGTATGACAAC GAGG ATGACAA
ATC C Teste CAAGTAATCCAT CAAGT espaçador PsmCas13b ATTTCTA AAT GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b GAGGATCGTTG CCAT AAGCTTA A1 S10B 26 nt TAGAAGCTTAT ATTT TCGTTTG
CGTTTGGATAG CTAG GATAGGT GTATGACAAC AGGA ATGACAA
TC C Teste AAGTAATCCATA AAGTA espaçador PsmCas13b TTTCTAG ATC GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b AGGATCGTTGT CATA AAGCTTA A1 S10B 25 nt AGAAGCTTATC TTTC TCGTTTG
GTTTGGATAGG TAGA GATAGGT TATGACAAC GGAT ATGACAA
C C Teste AGTAATCCATAT espaçador PsmCas13b TTCTAGA AGTA GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b GGATCGTTGTA ATCC AAGCTTA A1 S10B 24 nt GAAGCTTATCG ATAT TCGTTTG
TTTGGATAGGT TTCT GATAGGT ATGACAAC AGAG ATGACAA GATC C
Teste GTAATCCATATT espaçador PsmCas13b TCTAGAG GTAA GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b GATCGTTGTAG TCCA AAGCTTA A1 S10B 23 nt AAGCTTATCGT TATT TCGTTTG
TTGGATAGGTA TCTA GATAGGT TGACAAC GAGG ATGACAA
ATC C Teste TAATCCATATTT espaçador PsmCas13b CTAGAGG TAAT GTTGTAG ssRN FIG. PsmCas13b ATCGTTGTAGA CCAT AAGCTTA A1 S10B 22 nt AGCTTATCGTT ATTT TCGTTTG
TGGATAGGTAT CTAG GATAGGT GACAAC AGGA ATGACAA
TC C Teste AATCCATATTT AATC GTTGTAG espaçador PsmCas13b CTAGAGGATCG CATA AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b TTGTAGAAGCT TTTC TCGTTTG A1 S10B 21 nt TATCGTTTGGA TAGA GATAGGT
TAGGTATGACA GGAT ATGACAA
AC C C Teste ATCCATATTTC ATCC GTTGTAG espaçador PsmCas13b TAGAGGATCGT ATAT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b TGTAGAAGCTT TTCT TCGTTTG A1 S10B 20 nt ATCGTTTGGAT AGAG GATAGGT
AGGTATGACAA GATC ATGACAA
C C Teste TCCATATTTCT TCCA GTTGTAG espaçador PsmCas13b AGAGGATCGTT TATT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b GTAGAAGCTTA TCTA TCGTTTG A1 S10B 19 nt TCGTTTGGATA GAGG GATAGGT
GGTATGACAAC ATC ATGACAA
C Teste CCATATTTCTA CCAT GTTGTAG espaçador PsmCas13b GAGGATCGTTG ATTT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b TAGAAGCTTAT CTAG TCGTTTG A1 S10B 18 nt CGTTTGGATAG AGGA GATAGGT
GTATGACAAC TC ATGACAA
C Teste CATATTTCTAG CATA GTTGTAG espaçador PsmCas13b AGGATCGTTGT TTTC AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b AGAAGCTTATC TAGA TCGTTTG A1 S10B 17 nt GTTTGGATAGG GGAT GATAGGT
TATGACAAC C ATGACAA
C Teste ATATTTCTAGA GTTGTAG espaçador PsmCas13b GGATCGTTGTA ATAT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b GAAGCTTATCG TTCT TCGTTTG A1 S10B 16 nt TTTGGATAGGT AGAG GATAGGT
ATGACAAC GATC ATGACAA C
Teste TATTTCTAGAG GTTGTAG espaçador PsmCas13b GATCGTTGTAG TATT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b AAGCTTATCGT TCTA TCGTTTG A1 S10B 15 nt TTGGATAGGTA GAGG GATAGGT
TGACAAC ATC ATGACAA
C Teste ATTTCTAGAGG GTTGTAG espaçador PsmCas13b ATCGTTGTAGA ATTT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b AGCTTATCGTT CTAG TCGTTTG A1 S10B 14 nt TGGATAGGTAT AGGA GATAGGT
GACAAC TC ATGACAA
C Teste TTTCTAGAGGA GTTGTAG espaçador PsmCas13b TCGTTGTAGAA TTTC AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b GCTTATCGTTT TAGA TCGTTTG A1 S10B 13 nt GGATAGGTATG GGAT GATAGGT
ACAAC C ATGACAA
C Teste TTCTAGAGGAT GTTGTAG espaçador PsmCas13b CGTTGTAGAAG TTCT AAGCTTA ssRN FIG. PsmCas13b CTTATCGTTTG AGAG TCGTTTG A1 S10B 12 nt GATAGGTATGA GATC GATAGGT
CAAC ATGACAA
C LwaCas13a GATTTAGACTA CCGG ladrilhos LwaCas13a CCCCAAAAACG GTAC GATTTAG ssRN fig. crRNA1 AAGGGGACTAA CGAG ACTACCC A1 S11
AACCCGGGTAC CTCG CAAAAAC CGAGCTCGAAT AATT GAAGGGG TCACTGGCC CACT ACTAAAA
GGCC C LwaCas13a GATTTAGACTA TTTC crRNA2 LwaCas13a CCCCAAAAACG TAGA GATTTAG ssRN fig. lado a AAGGGGACTAA GGAT ACTACCC A1 S11 lado AACTTTCTAGA CCCC CAAAAAC
GGATCCCCGGG GGGT GAAGGGG TACCGAGCT ACCG ACTAAAA
AGCT C LwaCas13a GATTTAGACTAC CCAAG crRNA3 LwaCas13a CCCAAAA TAA GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC TCCA ACTACCC A1 S11 lado TAAAACCCAAG TATT CAAAAAC
TAATCCATATT TCTA GAAGGGG TCTAGAGGATC GAGG ACTAAAA
C ATCC C LwaCas13a GATTTAGACTAC AGATT crRNA4 LwaCas13a CCCAAAA GCT GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC GTTC ACTACCC A1 S11 lado TAAAACAGATT TACC CAAAAAC
GCTGTTCTACC AAGT GAAGGGG AAGTAATCCAT AATC ACTAAAA A CATA C
LwaCas13a GATTTAGACTAC CCTGC crRNA5 LwaCas13a CCCAAAA AGG GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC TCGA ACTACCC A1 S11 lado TAAAACCCTGC GTAG CAAAAAC
AGGTCGAGTAG ATTG GAAGGGG ATTGCTGTTCT CTGT ACTAAAA
A TCTA C LwaCas13a GATTTAGACTAC GCCAA crRNA6 LwaCas13a CCCAAAA GCT GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC TGCA ACTACCC A1 S11 lado TAAAACGCCAA TGCC CAAAAAC
GCTTGCATGCC TGCA GAAGGGG TGCAGGTCGAG GGTC ACTAAAA
T GAGT C LwaCas13a GATTTAGACTAC ATGAC crRNA7 LwaCas13a CCCAAAA CAT GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC GATT ACTACCC A1 S11 lado TAAAACATGAC ACGC CAAAAAC
CATGATTACGC CAAG GAAGGGG CAAGCTTGCAT CTTG ACTAAAA
G CATG C LwaCas13a GATTTAGACTAC CACAG crRNA8 LwaCas13a CCCAAAA GAA GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC ACAG ACTACCC A1 S11 lado TAAAACCACAG CTAT CAAAAAC
GAAACAGCTAT GACC GAAGGGG GACCATGATTA ATGA ACTAAAA
C TTAC C LwaCas13a GATTTAGACTAC TGTGA crRNA9 LwaCas13a CCCAAAA GCG GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC GATA ACTACCC A1 S11 lado TAAAACTGTGA AACA CAAAAAC
GCGGATAAACA CAGG GAAGGGG CAGGAAACAGC AAAC ACTAAAA
T AGCT C LwaCas13a GATTTAGACTAC ATGTT crRNA10 LwaCas13a CCCAAAA GTG GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC TGGA ACTACCC A1 S11 lado TAAAACATGTT ATTG CAAAAAC
GTGTGGAATTG TGAG GAAGGGG TGAGCGGATAA CGGA ACTAAAA
A TAAA C LwaCas13a GATTTAGACTAC TGCTT crRNA11 LwaCas13a CCCAAAA CCG GATTTAG ssRN fig. lado a ACGAAGGGGAC GCTC ACTACCC A1 S11 lado TAAAACTGCTT GTAT CAAAAAC
CCGGCTCGTAT GTTG GAAGGGG GTTGTGTGGAA TGTG ACTAAAA T GAAT C
CcaCas13b CCCCGGGTACCG ATCCG crRNA1 CcaCas13b AGCTCGA GGT GTTGGAA ssRN fig. lado a ATTCACTGGCC ACCG CTGCTCT A1 S11 lado GTTGGAACTGC AGCT CATTTTG
TCTCATTTTGG CGAA GAGGGTA AGGGTAATCAC TTCA ATCACAA AAC CTGG C
CC CcaCas13b TATTTCTAGAGG TATTT crRNA2 CcaCas13b ATCCCCG CTA GTTGGAA ssRN fig. lado a GGTACCGAGCT GAGG CTGCTCT A1 S11 lado GTTGGAACTGC ATCC CATTTTG
TCTCATTTTGG CCGG GAGGGTA AGGGTAATCAC GTAC ATCACAA AAC CGAG C
CT CcaCas13b TACCAAGTAATC TACCA crRNA3 CcaCas13b CATATTT AGT GTTGGAA ssRN fig. lado a CTAGAGGATCC AATC CTGCTCT A1 S11 lado GTTGGAACTGC CATA CATTTTG
TCTCATTTTGG TTTC GAGGGTA AGGGTAATCAC TAGA ATCACAA AAC GGAT C
CC CcaCas13b GTAGATTGCTGT GTAGA crRNA4 CcaCas13b TCTACCA TTG GTTGGAA ssRN fig. lado a AGTAATCCATA CTGT CTGCTCT A1 S11 lado GTTGGAACTGC TCTA CATTTTG
TCTCATTTTGG CCAA GAGGGTA AGGGTAATCAC GTAA ATCACAA AAC TCCA C
TA CcaCas13b TGCCTGCAGGTC TGCCT crRNA5 CcaCas13b GAGTAGA GCA GTTGGAA ssRN fig. lado a TTGCTGTTCTA GGTC CTGCTCT A1 S11 lado GTTGGAACTGC GAGT CATTTTG
TCTCATTTTGG AGAT GAGGGTA AGGGTAATCAC TGCT ATCACAA AAC GTTC C
TA CcaCas13b ACGCCAAGCTTG ACGCC crRNA6 CcaCas13b CATGCCT AAG GTTGGAA ssRN fig. lado a GCAGGTCGAGT CTTG CTGCTCT A1 S11 lado GTTGGAACTGC CATG CATTTTG
TCTCATTTTGG CCTG GAGGGTA AGGGTAATCAC CAGG ATCACAA AAC TCGA C GT
CcaCas13b GTTGGAA crRNA7 CcaCas13b CTATGACCATG CTAT CTGCTCT ssRN fig. lado a ATTACGCCAAG GACC CATTTTG A1 S11 lado CTTGCATGGTT ATGA GAGGGTA
GGAAC TTAC ATCACAA C TGCTCTCATTTTG GCCAAG GAGGGT CT
AATCACAAC TGCATG CcaCas13b AACACAGGAAACA AACACA crRNA8 CcaCas13b GCTATG GG GTTGGAA ssRNA fig. S11 lado a ACCATGATTACGT AAACAG CTGCTCT 1 lado TGGAACTGCTCTC CTATGA CATTTTG
ATTTTGGAGGGTA CCATGA GAGGGTA ATCACAAC TTAC ATCACAA
C CcaCas13b ATTGTGAGCGGAT ATTGTG crRNA9 CcaCas13b AAACAC AG GTTGGAA ssRNA fig. S11 lado a AGGAAACAGCTGT CGGATA CTGCTCT 1 lado TGGAACTGCTCTC AACACA CATTTTG
ATTTTGGAGGGTA GGAAAC GAGGGTA ATCACAAC AGCT ATCACAA
C CcaCas13b GTATGTTGTGTGG GTATGT crRNA10 CcaCas13b AATTGT TG GTTGGAA ssRNA fig. S11 lado a GAGCGGATAAAGT TGTGGA CTGCTCT 1 lado TGGAACTGCTCTC ATTGTG CATTTTG
ATTTTGGAGGGTA AGCGGA GAGGGTA ATCACAAC TAAA ATCACAA
C CcaCas13b TATGCTTCCGGCT TATGCT crRNA11 CcaCas13b CGTATG TC GTTGGAA ssRNA fig. S11 lado a TTGTGTGGAATGT CGGCTC CTGCTCT 1 lado TGGAACTGCTCTC GTATGT CATTTTG
ATTTTGGAGGGTA TGTGTG GAGGGTA ATCACAAC GAAT ATCACAA
C PsmCas13b CCCCGGGTACCGA ATCCGG crRNA1 PsmCas13b GCTCGA GT GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a ATTCACTGGCCGT ACCGAG AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT CTCGAA TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT TTCACT GATAGGT ATGACAAC GGCC ATGACAA
C PsmCas13b TATTTCTAGAGGA TATTTC crRNA2 PsmCas13b TCCCCGGGTACCG TAGAGG GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a AGCTGTTGTAGAA ATCCCC AAGCTTA 1 lado GCTTATCGTTTGG GGGTAC TCGTTTG
ATAGGTATGACAA CGAGCT GATAGGT C ATGACAA C
PsmCas13b TACCAAGTAATCC TACCAA crRNA3 PsmCas13b ATATTTCTAGAGG GTAATC GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a ATCCGTTGTAGAA CATATT AAGCTTA 1 lado GCTTATCGTTTGG TCTAGA TCGTTTG
ATAGGTATGACAA GGATCC GATAGGT C ATGACAA
C PsmCas13b GTAGATTGCTGTT GTAGAT crRNA4 PsmCas13b CTACCA TG GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a AGTAATCCATAGT CTGTTC AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT TACCAA TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT GTAATC GATAGGT ATGACAAC CATA ATGACAA
C PsmCas13b TGCCTGCAGGTCG TGCCTG crRNA5 PsmCas13b AGTAGA CA GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a TTGCTGTTCTAGT GGTCGA AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT GTAGAT TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT TGCTGT GATAGGT ATGACAAC TCTA ATGACAA
C PsmCas13b ACGCCAAGCTTGC ACGCCA crRNA6 PsmCas13b ATGCCT AG GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a GCAGGTCGAGTGT CTTGCA AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT TGCCTG TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT CAGGTC GATAGGT ATGACAAC GAGT ATGACAA
C PsmCas13b CTATGACCATGAT CTATGA crRNA7 PsmCas13b TACGCC CC GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a AAGCTTGCATGGT ATGATT AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT ACGCCA TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT AGCTTG GATAGGT ATGACAAC CATG ATGACAA
C PsmCas13b AACACAGGAAACA AACACA crRNA8 PsmCas13b GCTATG GG GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a ACCATGATTACGT AAACAG AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT CTATGA TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT CCATGA GATAGGT ATGACAAC TTAC ATGACAA
C PsmCas13b ATTGTGAGCGGAT ATTGTG crRNA9 PsmCas13b AAACAC AG GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a AGGAAACAGCTGT CGGATA AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT AACACA TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT GGAAAC GATAGGT ATGACAAC AGCT ATGACAA C
PsmCas13b GTATGTTGTGTGG GTATGT crRNA10 PsmCas13b AATTGT TG GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a GAGCGGATAAAGT TGTGGA AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT ATTGTG TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT AGCGGA GATAGGT ATGACAAC TAAA ATGACAA
C PsmCas13b TATGCTTCCGGCT TATGCT crRNA11 PsmCas13b CGTATG TC GTTGTAG ssRNA fig. S11 lado a TTGTGTGGAATGT CGGCTC AAGCTTA 1 lado TGTAGAAGCTTAT GTATGT TCGTTTG
CGTTTGGATAGGT TGTGTG GATAGGT ATGACAAC GAAT ATGACAA C
ZIKV CTTGAACTCTACC CTTGAA ZIKV CcaCas13b CcaCas13b AGTGCT CT GTTGGAA ssRNA FIG. TCTTTGTTGTTGT CTACCA CTGCTCT S16B
TGGAACTGCTCTC GTGCTT CATTTTG ATTTTGGAGGGTA CTTTGT GAGGGTA ATCACAAC TGTT ATCACAA
C CrRNA de TTTGCTTCTGTCC TTTGCT DENV DENV CcaCas13b AGTGAG TC GTTGGAA ssRNA FIG. CcaCas13b CATGGTCTTCGGT TGTCCA CTGCTCT S17A
TGGAACTGCTCTC GTGAGC CATTTTG ATTTTGGAGGGTA ATGGTC GAGGGTA ATCACAAC TTCG ATCACAA
C ID humano rs601338A CCGCTTCACCGGC CCGCTT Lócus - PsmCas13b TACCCCTGCTCCA CACCGG GTTGTAG human fig. detecção AGAGTTGTAGAAG CTACCC AAGCTTA o S18C de alelo CTTATCGTTTGGA CTGCTC TCGTTTG rs601 PsmCas13b TAGGTATGACAAC CAAGA GATAGGT 338
ATGACAA
C ID humano rs601338G GATTTAGACTACC CTGCAC Lócus - LwaCas13a CCAAAAACGAAGG CTTCTA GATTTAG human fig. detecção GGACTAAAACCTG CCACCA ACTACCC o S18C de alelo CACCTTCTACCAC CCTCCG CAAAAAC rs601 LwaCas13a CACCTCCGCCAG CCAG GAAGGGG 338
ACTAAAA
C ssRNA/ssD GATTTAG NA1 LwaCas13a GATTTAGACTACC TAGATT ACTACCC ssRNA fig. S20 crRNA1 CCAAAAACGAAGG GCTGTT CAAAAAC 1
GGACTAAAACTA CTAC GAAGGGG ACTAAAA C GATTGCTGTTCTA CAAGTA CCAAGT AT AATCCAT CCAT
EGFR T790M T790M GATTTAGACTACC GCAAGA ssDNA crRNA do LwaCas13a CCAAAAACGAAGG TGAGCT GATTTAG sinté FIG. S24 alelo com GGACTAAAACGCA GCACGG ACTACCC tico detecção AGATGAGCTGCAC TGGAGG CAAAAAC mutan de GGTGGAGGTGAG TGAG GAAGGGG te mutante ACTAAAA
C
EGFR T790M T790M GATTTAGACTACC GCGTCA Peso crRNA de LwaCas13a CCAAAAACGAAGG TGAGCT GATTTAG ssDNA FIG. S24 alelo de GGACTAAAACGCG GCACGG ACTACCC sinté detecção TCATGAGCTGCAC TGGAGG CAAAAAC tico de tipo GGTGGAGGTGAG TGAG GAAGGGG selvagem ACTAAAA
C ssRNA3 TAGATTGCTGTTC TAGATT (alvo PsmCas13b TACCAAGTAATCC GCTGTT GTTGTAG ssRNA FIG. S25 PsmCas13b ATATGTTGTAGAA CTACCA AAGCTTA 3 ) crRNA GCTTATCGTTTGG AGTAAT TCGTTTG
ATAGGTATGACAA CCATAT GATAGGT C ATGACAA
C ssRNA2 GATTTAGACTACC GATTGC (alvo LwaCas13a CCAAAAACGAAGG TGTTCT GATTTAG ssRNA FIG. S25 LwaCas13a GGACTAAAACGAT ACCAAG ACTACCC 2 ) crRNA TGCTGTTCTACCA TAATCC CAAAAAC
AGTAATCCATAT ATAT GAAGGGG ACTAAAA
C Tabela 23. Alvos de RNA e DNA usados neste estudo. 7 Sequência Ácido 1ª Nuclei Fig. co
AGUACAUAUUCAGGGGCCAACCUCU SsRNA de DENV CAACAAUGACGAAGACCAUGCUCAC RNA AFigur (SEQIDNO:864) UGGACAGAAGCAAAAAUGCUGCUGG a 1B:
ACAACAUCAACACACCAGAAGGGAU UAUACCAGCUCUCUUUGAACCAGAG AGAGGGGAAGAGAGGAGA
GGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACC ssDNA1 (SEQIDNO:865) CGGGGATCCTCTAGAAATATGGATT DNA Fig. ACTTGgtAGAACAGCAATCTACTCG 1F
ACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGT AATCATGGTCATAGCTGTTTACCTG TGTACTATAGCC
GACACCGGAACUCCACACUGGAACA ZIKV ssRNA ACAAAGAAGCACUGGUAGAGUUCAA RNA Fig. (SEQIDNO:866) GGACGCACAUGCCAAAAGGCAAACU 1F
GUCGUGGUUCUAGGGAGUCAAGAAG GAGCAGUUCACACGGCCCUUGCUGG AGCUCUGGAGGCGAGC
TTAATTAAAGCGATTGATGGTGATA SsDNA de CTGTTAAATTAATGTACAAAGGTCA DNA Fig. termonuclease ACCAATGACATTCAGACTATTATTG 1H (SEQIDNO:867) GTTGATACACCTGAAACAAAGCATC
CTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGG TCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAA AAGATGGTAGAAAATGCAAAGAAAA TTGAAGTCGAGTTTG
GGGGAGGATGTCGGGCGCGCACGTT SsDNA da TTCCCTTCGCTGAGCACGCTGCGCG DNA Fig. aciltransferase CGTCGCCTACGTGAATGCGCTGTTC 1H (SEQIDNO:868) GATGCGTTGGCCGAAGGCAACCCGC
GGGTGAGCGTGCTCGACCCCTCCAG CGTGCTCTGCGATGGCCTGGATTGT TTCGCCGAACGTGATGGCTGGTCGC TGTACATGGATAACA
GGCCAGUGAAUUCGAGCUCGGUACC ssRNA1 (SEQIDNO:869) CGGGGAUCCUCUAGAAAUAUGGAUU RNA fig. ACUUGgUAGAACAGCAAUCUACUCG S3
ACCUGCAGGCAUGCAAGCUUGGCGU AAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCCUGU GUUUAUCCGCUCACAAUUCCACACA
ACAUACGAGCCGGAAGCAUAAAG TTCCTGTGAAGCTAAAGAAGGAGAATG Mist Biblioteca de rNrNrNrNrNrNTATTGATAGCAGCTG urad FIG. motivos aleatórios TGGCACCTGCAC o S12 (SEQIDNO:870) DNA/
RNA
TGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTC EGFRExon19 TCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCA DNA FIG. deleção ssDNA GAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG S24A sintético
TCGCTATCAAGACATCTCCGAAAGC mutante
CAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGT (SEQIDNO:871) TTCTGCTTTGCTGTGTGGGGGTCCA
TGGCTCTGAACCTCAGGCCCACCTT TTCTCAT
TGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTC EGFRExon19 deleção TCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCA DNA FIG. ssDNA sintético WT GAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCG S24A (SEQIDNO:872) TCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGC
AACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAA ATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTG CTGTGTGGGGGTCCATGGCTCTGAA CCTCAGGCCCACCTTTTCTCAT
CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGAT ssDNA GGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTG DNA fig. sintético TGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA S24E mutante CCTCCACCGTGCAGCTCATCATGCA EGFRT790M GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTG (SEQIDNO:873) GACTATGTCCGGGAACACAAAGACA
ATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAA CTGGTGTGTGCAGATCGCA
CCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGAT ssDNA sintético GGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTG DNA fig. EGFRT790MWT TGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCA S24E (SEQIDNO:874) CCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCA
GCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTG GACTATGTCCGGGAACACAAAGACA ATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAA CTGGTGTGTGCAGATCGCA
UAGGUGUUCCACAGGGUAGCCAGCA ssRNA2 (alvo GCAUCCUGCGAUGCAAAUAUGGAUU RNA fig. LwaCas13a) ACUUGGUAGAACAGCAAUCUAAUCC S25B (SEQIDNO:875) GGAACAUAAUGGUGCAGGGCGCUGA
CUUCCGCGUUUGUUUUAAAUCAAAC ACGGAAACCGAAGACCAUUCAUGUU
GUUGCUGCCGGAAGCAUAAAG ssRNA3 (alvo UAGGUGUUCCACAGGGUAGCCAGCAGC RNA fig. PsmCas13b) AUCCUGCGAUGCAAAUAUGGAUUACUU S25B
GGUAGAACAGCAAUCUAAUCCGGAACA (SEQIDNO:876) UAAUGGUGCAGGGCG Tabela 24. Primers RPA usados neste estudo. São mostrados o IDSEQNO:877-906, com SEQIDNO:877, 878 e 879 representando a sequência iniciador direta, sequência iniciador direta (com o promotor T7RNAP) e sequência iniciador reversa, respectivamente, etc.
Alvo Sequência de Sequência de Sequênci 1ª primer direto iniciador direta a de Fig (com promotor primer . T7RNAP) reverso DENV GTACATATTCAGGGGC gaaattaatacgactcact TTTCTGGT Fig ssRNA CAACCTCTC ataggg TCAAAGAG ura GTACATATTCAGGGGCCAA AGCTGGTA 1D
CCTCTC T Termonuc TGTACAAAGGTCAACCA gaaatTAATACGACTCAC TGCACTTG Fig lease ATGACATTCAG TATAGGGTGTACAAAGGT CTTCAGGA . ssDNA CAACCAATGACATTCAG CCATATTT 1H
C
Acyltran CTACGTGAATGCGCTGT gaaatTAATACGACTCACT GAAACAAT Fig sfe rase TCGATG ATAGGGCTACGTGAATGCG CCAGGCCA . CTGTTCGATG TCGCAGAG 1H EGFRL TCTGGATCCCAGAAGGT gaaatTAATACGACTCAC CCACACAG Fig 858R GAGAAAGTTAAAA TATAGGGTCTGGATCCCA CAAAGCAG . GAAGGTGAGAAAGTTAAA AAACTCAC 3E
A ATCGAG EGFR TCTGGATCCCAGAAGGT gaaatTAATACGACTCAC CCACACAG Fig Exclu GAGAAAGTTAAAA TATAGGGTCTGGATCCCA CAAAGCAG . são GAAGGTGAGAAAGTTAAA AAACTCAC 3H do A ATCGAG éxon1 9 Therano AGGGCCGCCACTCCACC gaaatTAATACGACTCAC GAAGAGTT Fig sti c GGCGGCATGGATGAG TATAGGGAGGGCCGCCAC CTTCACCT . APC TCCACCGGCGGCATGGAT TTACTCAC 5B alvo GAG ggaT (NM_000 CCtcc 038,5) ZIKV CCACACTGGAACAACA gaaatTAATACGACTCACT ACAGCCTT fig ssRNA AAGAAGCAC ATAGGGCCACACTGGAACA CCCTTTGC . ACAAAGAAGCAC ACCATCCA S6
TCTCAG locus ATAGTCCCCTCGGCGAA gaaattaatacgactcac GAGTACGT fig rs6013 CATGGACCCCTACAA tataggg CCGCTTCA . 38 ATAGTCCCCTCGGCGAAC CCGGCTAC S18
ATGGACCCCTACAA CCCTGCTC C ssDNA/ss ATCCTCTAGAAATATGG AATTCTAATACGACTCAC GATAAACA fig RNA1 ATTACTTGGTAGAACAG TATAGGGATCCTCTAGAA CAGGAAAC . ATATGGATTACTTGGTAG AGCTATGA S20
AACAG CCATGATT
ACG EGFRT790 ATCCACGTGTGCCGCCT gaaatTAATACGACTCAC ATATTGTC fig M GCTGGGCATCTGC TATAGGGCCCACGTGTGC TTTGTGTT . CGCCTGCTGGGCATCTGC CCCGGACA S24
TAGTCC E Tabela 25. Repórteres de clivagem usados neste estudo.
Nome Sequência Fluorófo 1ª Fig. ro repórter poli U /56- FAM Fig. 1 FAM/rUrUrUrUrU/3IABkF Q/(SEQIDNO:907) repórter poli A /56- FAM Fig. 1 FAM/rArArArArA/3IABkF Q/ (SEQIDNO:908)
repórter poli U para /5HEX/rUrUrUrUrU/3IAB HEX Fig. 1 multiplexaçã kFQ/ o (SEQIDNO:909)
repórter rArA para Fig. 1 e testar FAM fig.
S7 /56- preferências de FAM/TArArAGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:910) repórter rArU para Fig. 1 e testar FAM fig.
S7 /56- preferências de FAM/TArArUGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:911)
repórter rArC para Fig. 1 e testar FAM fig.
S7 /56- preferências de FAM/TArArCGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:912)
repórter rArG para Fig. 1 e testar FAM fig.
S7 /56- preferências de FAM/TArArGGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:913) repórter rUrA para /56- Fig. 1 e testar FAM fig.
S7 FAM/TArUrAGC/3IABkFQ/ preferências de dibase (SEQIDNO:914) repórter rUrU para /56- Fig. 1 e testar FAM/TArUrUGC/3IABkFQ/ FAM fig.
S7 preferências de (SEQIDNO:915) dibase repórter rUrC para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArUrCGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:916)
repórter rUrG para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArUrGGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:917)
repórter rCrA para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArCrAGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:918)
repórter rCrU para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArCrUGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:919) repórter rCrC para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArCrCGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:920)
repórter rCrG para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArCrGGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:921) repórter rGrA para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArGrAGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:922)
repórter rGrU para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArGrUGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:923) repórter rGrC para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArGrCGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:924)
repórter rGrG para Fig. 1 e testar /56- FAM fig.
S7 preferências de FAM/TArGrGGC/3IABkFQ/ dibase (SEQIDNO:925)
poli UCy5 para /5Cy5/rUrUrUrUrU/3IAbR FAM Fig. 1 multiplexação QSp/ (SEQIDNO:926) /56- FAM/mArArUrGrGrCmAmArA N/D Repórter de fluxo Fig. 3. rUrGrGrCmA/3Bio / lateral com (SEQIDNO:927) FAM/Biotina repórter C poli /56- FAM fig.
S3 FAM/rCrCrCrCrC/3IABkFQ / (SEQIDNO:928) repórter poli G /56- FAM fig.
S3 FAM/rGrGrGrGrG/3IABkFQ / (SEQIDNO:929)
Biblioteca de TTCCTGTGAAGCTAAAGAAGGA motivos de RNA para GAATGrNrNrNr N/D FIG.
S12 triagem de NrNrNTATTGATAGCAGCTGTG preferências de GCACCTGCAC base (SEQIDNO:930) Motivo de validação /56- FAM fig.
S13 LwaCas13a 1 FAM/TrGrUrUrUrUrC/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:931)
Motivo de /56- FAM fig.
S13 validação FAM/TrUrUrUrUrUrC/3IAB 2LwaCas13a kFQ/ (SEQIDNO:932)
Motivo de validação /56- FAM fig.
S13 LwaCas13a 3 FAM/TrCrArUrUrUrG/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:933) Motivo de validação 1 de /56- FAM fig.
S13 PsmCas13b FAM/TrUrArUrUrGrA/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:934)
Motivo de validação 2 de /56- FAM fig.
S13 PsmCas13b FAM/TrArUrUrGrArU/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:935)
Motivo de validação 3 de /56- FAM fig.
S13 PsmCas13b FAM/TrUrUrGrArUrA/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:936)
Motivo de validação 1 de /56- FAM fig.
S13 CcaCas13b FAM/TrUrUrUrGrUrU/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:937)
Motivo de validação 2 de /56- FAM fig.
S13 CcaCas13b FAM/TrUrGrUrUrUrU/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:938) Motivo de validação 3 de /56- FAM fig.
S13 CcaCas13b FAM/TrArUrUrUrUrU/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:939) Motivo ortogonal /56- FAM fig.
S14 Lwa 1 FAM/TrCrGrArArUrG/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:940)
Motivo ortogonal /56- FAM fig.
S14 Lwa 2 FAM/TrGrUrCrUrCrC/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:941)
Motivo ortogonal /56- FAM fig.
S14 Lwa 3 FAM/TrGrCrArUrGrA/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:942) Motivo ortogonal /56- FAM fig.
S14 Lwa 4 FAM/TrCrArUrArCrA/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:943)
Motivo ortogonal /56- FAM fig.
S14 Lwa 5 FAM/TrCrArUrArCrG/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:944) Motivo ortogonal /56- FAM fig.
S14 Lwa 6 FAM/TrGrCrArUrArA/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:945)
Motivo ortogonal 1 de CcaCas13b /56- FAM fig.
S14 FAM/TrCrUrArCrUrU/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:946)
Motivo ortogonal 2 de CcaCas13b /56- FAM fig.
S14 FAM/TrCrUrArCrGrU/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:947)
Motivo ortogonal 3 de CcaCas13b /56- FAM fig.
S14 FAM/TrUrUrArArArC/3IAB kFQ/ (SEQIDNO:948) /5TioMC6- D/rCrUrCrCrCrUrArArUrA N/D ligante de fig.
S21 rArCrArArUrU nanopartículas de rUrArUrArArCrUrArUrUrC ouro rCrUrArCrCrC rUrUrUrCrCrCrArArArArA rArA/3TioMC3-D/ (SEQIDNO:949)
oligo conjugado de /5AmMC12/AGAGCATCACCAT conta magnética GATCCTGrUrUr N/D fig.
S22 UrUrUrUrUrUTG/iBiodT/C TCGGATATCTCGACTA/36- FAM/ (SEQIDNO:950)
/56- N/D Motivo de fig.
S29 FAM/TrGrArCrGrUrG/3IAB validação 1 de kFQ/ EiCsm6 (SEQIDNO:951)
/FamCE/rArArArArArA/Bi N/D poli A curto para fig. oBB/ fluxo lateral S34A (SEQIDNO:952)
/FamCE/rArArArArArArAr ArArArArA/Bi oBB / N/D poli A longo para fig. (SEQIDNO:953) fluxo lateral S34A
/56- N/D poli C curto para fig.
FAM/rCrCrCrCrCrC/3Bio/ fluxo lateral S34A (SEQIDNO:954)
/56- FAM/rCrCrCrCrCrCrCrCrC N/D poli C longo para fig. rCrCrC/3Bio/ fluxo lateral S34A (SEQIDNO:955) /56- N/D poli A/C curto fig. FAM/rArCrArCrArC/3Bio/ para fluxo lateral S34A (SEQIDNO:956) /56- FAM/rArCrArCrArCrArCrA N/D poli A/C longo fig. rCrArC/3Bio/ para fluxo lateral S34A (SEQIDNO:133) Tabela 26. plasmídeos REPAIR usados neste estudo Nome do Descrição Link para o mapa de
REPAIR plasmídeo CMV- https://bench plasmídeo plasmídeo dPspCas13b- ling. Plasmídeo de pCMV- https://bench (pC0039) GS- com/s/seq- tipo selvagem mScarlett- ling. ADAR2DD(E48 arzpsupZEzGu3
APC Plasmídeo APCWT- EGFP pCMV- com/s/seq- https://bench 8Q) ghBDhtv mutante APC mScarlett- w2vU03qnxfuxK ling. Guia U6-guide- APC-EGFP https://bench 4OjSxiT com/s/seq- REPAIR (no PspCas13b mutante DR ling. LlmQkX8dJ4sBo
REPAIR pC0043)guia Guia de não https://benchli com/s/seq- ZfqoxHy de não segmentação ng. com/s/seq- OLVAsGt655E7p segmentação U6 - U9gHnOW41C1DVUB TACczl1 (pC0052) PspCas13b GQypw
DR
[00677] Usando essas preferências exclusivas de clivagem, conseguimos detectar ssRNA80 do vírus Zika sintético (ZIKV) no canal HEX e ssRNA do vírus sintético da dengue (DENV) sintético no canal FAM na mesma reação (Fig.
133). Para expandir os recursos de multiplexação na amostra do SHERLOCK, projetamos um sistema de detecção baseado no Cas12a, que também exibe atividade colateral (Chen et al.
BioRxiv (2017)) (Fig. 125C). Embora a atividade colateral de AsCas12a não produza um sinal detectável em concentrações de entrada abaixo de 100nM, a pré- amplificação com amplificação por recombinase polimerase (RPA) permitiu a detecção de moléculas únicas a 2aM (Fig.
125D, 134) (a menos que indicado de outra forma, todas as reações SHERLOCK que envolvem um pré- A amplificação é realizada em duas etapas, com a reação RPA sendo diretamente adicionada ao ensaio Cas13 sem nenhuma etapa de purificação). Para detecção triplex, projetamos um repórter de uridina LwaCas13a no canal Cy5, um repórter de adenina PsmCas13b no canal FAM e um repórter AsCas12a ssDNA no canal HEX (Fig 135A). Fomos capazes de detectar três alvos (um alvo de ssDNA sintético, ssRNA de ZIKV e ssRNA de DENV) em uma única reação (Fig. 135B). Ampliamos ainda mais a detecção para quatro alvos, aproveitando os motivos ortogonais de dinucleotídeos, com repórteres para LwaCas13a, PsmCas13b, CcaCas13b e AsCas12a nos canais FAM, TEX, Cy5 e HEX, respectivamente (Fig. 125E), e conseguimos distinguir todas as combinações de alvos (Fig. 125F).
Quando combinados com o RPA, detectamos dois alvos de DNA (o gene da P. aeruginosa aciltransferase e o gene da termonuclease de S. aureus) (Fig. 125G) até a faixa attomolar (Fig. 125H). Da mesma forma, SHERLOCK multiplexado com PsmCas13b e LwaCas13a alcançou detecção multiplexada attomolar de diluições de RNA de ZIKV e DENV, bem como genotipagem específica de alelo de amostras de saliva humana (Fig. 136). Esses avanços na multiplexação dentro da amostra por meio de preferências ortogonais de base permitem que muitos alvos sejam detectados em escala e com custos mais baratos.
[00678] Em seguida, focamos no ajuste da saída do sinal SHERLOCK para torná-lo mais quantitativo, sensível e robusto para ampliar a utilidade da tecnologia. OSHERLOCK conta com uma pré-amplificação exponencial, que satura rapidamente e dificulta a quantificação precisa, mas observamos que concentrações mais concentradas de iniciadores aumentaram o sinal bruto e a precisão quantitativa, indicando que, em concentrações de iniciadores mais baixas, a reação não satura (Fig. 137, B e Fig. 138A-E). Testamos uma faixa de concentrações de iniciadores e descobrimos que 240nM exibia a maior correlação entre sinal e entrada (Fig. 138F), e a quantificação era sustentável em uma ampla faixa de concentrações de amostras até a faixa attomolar (Fig. 137C e Fig. 138G) . Muitas aplicações de detecção de ácidos nucleicos, como a detecção do HIV (W. H. Organization in Guidelines for Using HIVTesting Technologies in Surveillance: Selection, Evaluation and Implementation: 2009Update (Geneva, 2009); Barletta et al. Am JClin Pathol
122: 20-27 (2004)) exigem sensibilidade de molécula única/mL e, portanto, testamos se o limite de detecção poderia ser empurrado além de 2aM, permitindo entradas de amostra mais diluídas no SHERLOCK. Ao escalonar a etapa RPA de pré-amplificação, descobrimos que o LwaCas13a poderia dar sinal de detecção para amostras de entrada de 200, 80 e 8zM e permitir entradas de volume de molécula única de 250µL e 540µL (Fig. 139A-B), e o PsmCas13b poderia detectar Amostras de entrada de 200zM em reações de 250µL (Fig.
139C).
[00679] Finalmente, aplicamos o SHERLOCKv2 em uma abordagem simulada que envolve o Cas13, servindo como um diagnóstico complementar e a própria terapia, pois o Cas13 foi desenvolvido para uma variedade de aplicações em células de mamíferos, incluindo knockdown de RNA, imageamento e edição (Abudayyeh et al. Nature 550:280-284 (2017); Cox et al. Science 358: 1019-1027 (2017)) (Fig.
140A e Tabela 26). Recentemente, aproveitamos o Cas13b da Prevotella sp. P5-125 (PspCas13b) para corrigir mutações em doenças genéticas usando um sistema chamado RNAEditing for Programmable A-IReplacement (REPAIR) (Cox et al. Science 358: 1019-1027 (2017)). Para direcionar e monitorar o resultado de um tratamento, testamos se o SHERLOCK poderia ser usado tanto para genotipagem para orientar o tratamento REPAIR quanto como uma leitura do RNA editado para rastrear a eficiência da terapia. Utilizamos uma mutação na APC (APC:c. 1262G>A) implicada na polipose adenomatosa familiar 1 (Fig. 140B, C) (Cottrell et al. Lancet 340:626-630 (1992)) e transfectaram cDNAs sintéticos e mutantes saudáveis do fragmento que envolve a mutação em células HEK293FT. Coletamos DNA dessas células e genotipamos com sucesso as amostras corretas usando SHERLOCK multiplexado de amostra única com LwaCas13a e PsmCas13b (Fig. 140D).
Simultaneamente, desenhamos e clonamos RNAs guia para o sistema REPAIR e células transfectadas que tinham o genótipo doente com o RNA guia e o sistema dPspCas13b- ADAR2dd (E488Q) REPAIR. Confirmamos a edição por análise de sequenciamento de próxima geração (NGS), descobrindo que 43% da edição foi realizada com o sistema REPAIR (Fig.
140E), e conseguimos detectar essa edição com SHERLOCK (Fig. 140F e Fig. 141).
[00680] Os refinamentos adicionais apresentados aqui para a detecção baseada em Cas13 permitem leituras quantitativas, visuais, mais sensíveis e multiplexadas, permitindo aplicações adicionais para a detecção de ácidos nucleicos, especialmente em ambientes onde são necessárias análises portáteis e sem instrumentos (Tabela 27).
SHERLOCKv2 pode ser usado para genotipagem multiplexada para informar o desenvolvimento e aplicação terapêutica da farmacogenômica, detectando organismos geneticamente modificados no campo ou determinando a presença de patógenos co-ocorrentes. Além disso, a leitura rápida e isotérmica do SHERLOCKv2, possibilitada pelo fluxo lateral e pelo Csm6, oferece uma oportunidade para a detecção em ambientes onde os leitores de energia ou portáteis não estão disponíveis, mesmo para espécies raras como o DNA em circulação. No futuro, pode ser possível fazer leituras colorimétricas baseadas em solução e ensaios de fluxo lateral multiplex contendo várias tiras de teste para diferentes alvos. Os testes aprimorados de ácido nucleico CRISPR-dx facilitam a detecção da presença de ácidos nucléicos em uma variedade de aplicações na biotecnologia e na saúde e agora estão prontos para o campo para implantação rápida e portátil.
Tabela 27. Comparação de SHERLOCKv1 e SHERLOCKv2.
Característica SHERLOCKv1 SHERLOCKv2 Sensibilidades 2aM 8zM Especificidade Nucleotídeo Nucleotídeo único único Multiplexagem na Simples Até quatro amostra alvos Multiplexação Ilimitado Ilimitado espacial Velocidade: 2 horas 30 minutos (da amostra bruta à detecção) Leituras Fluorescência Fluorescênci a visual por fluxo lateral Amplificação Nenhum Aprimoramento de Csm6 Custo <$ 0,60 <$ 0,60
Sistema de Nenhum Emparelhado Diagnóstico com REPAIR Complementar para medir resultados de edição de RNA. Compatibilidade Cas13a Cas13a, com Nuclease Cas13b, Cas12a e Csm6 Métodos
[00681] Expressão e purificação de proteínas de ortólogos Cas13 e Csm6. A expressão e purificação de LwaCas13a foram realizadas como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438-442 (2017)) com pequenas modificações e é detalhado abaixo. Os ortólogos LbuCas13a, LbaCas13a, Cas13b e Csm6 foram expressos e purificados com um protocolo modificado. Em resumo, os vetores de expressão bacteriana foram transformados em células competentes Rosetta™ 2 (DE3) pLysSSingles (Millipore). Uma cultura inicial de 12,5 mL foi cultivada durante a noite em meio de crescimento Terrific Broth 4 (Sigma) (TB), que foi utilizado para inocular 4L de TB para crescimento a 37°C e 300RPM até um OD600 de 0,5. Neste momento, a expressão proteica foi induzida por suplementação com IPTG (Sigma) até uma concentração final de 500 µM, e as células foram resfriadas a 18°C por 16 h para expressão proteica. As células foram então centrifugadas a 5000 g durante 15 min a 4°C. O pelete celular foi colhido e armazenado a -80°C para purificação posterior.
[00682] Todas as etapas subsequentes da purificação da proteína foram realizadas a 4°C. O pelete celular foi triturado e ressuspenso em tampão de lise (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, DTT1 mM, pH 8,0) suplementado com inibidores de protease (comprimidos sem Ultra EDTA completos), lisozima (500µg/1 ml) e benzonase seguidos por ruptura celular de alta pressão usando o sistema LM20Microfluidizer a 27. 000PSI. O lisado foi eliminado por centrifugação durante 1 hora a 4°C a 10.
000 g. O sobrenadante foi aplicado a 5 mL de StrepTactin Sepharose (GE) e incubado com rotação por 1 hora seguido de lavagem da resina StrepTactin ligada à proteína três vezes em tampão de lise. A resina foi ressuspensa em tampão de digestão SUMO (Tris-HCl 30 mM, NaCl 500 mM1DMT, Igepal 0,15% (NP-40), pH8,0), juntamente com 250 unidades de protease SUMO (250 mg/ml) e incubada durante a noite a 4°C com rotação. A suspensão foi aplicada a uma coluna para eluição e separação da resina por fluxo de gravidade. A resina foi lavada duas vezes com 1 volume de coluna de tampão Lysis para maximizar a eluição da proteína. O eluto foi diluído em tampão de troca catiônica (HEPES20 mM, DTT1 mM, 5% glicerol, pH7,0; pH7,5 para LbuCas13a, LbaCas13a, EiCsm6, LsCsm6, TtCsm6) para diminuir a concentração de sal em preparação para a cromatografia de troca catiônica para
250mM.
[00683] Para troca catiônica e purificação por filtração em gel, a proteína foi carregada em uma coluna de troca catiônica HiTrap SPHP de 5 mL (GEHealthcare Life Sciences) via FPLC (AKTAPURE, 3GEHealthcare Life Sciences) e eluída sobre um gradiente de sal de sal 250 mM a 2MNaCl em tampão de eluição (HEPES20 mM, DTT1 mM, glicerol a 5%, pH7,0; pH7,5 para LbuCas13a, LbaCas13a). As frações resultantes foram testadas quanto à presença de proteína recombinante por SDS-PAGE, e as frações contendo a proteína foram reunidas e concentradas através de uma Unidade de Filtro Centrífuga (Millipore 50MWCO) a 1 mL em tampão S200 (HEPES10 mM, NaCl 1M, 5 mMMgCl2, DTT2 mM, pH7,0). A proteína concentrada foi carregada em uma coluna de filtração em gel (Superdex® 20010/300GL, GEHealthcare Life Sciences) via FPLC. As frações resultantes da filtração em gel foram analisadas por SDS-PAGE e as frações contendo proteína foram reunidas e as tampas trocadas em Tampão de Armazenamento (NaCl 600 mM, Tris-HCl 50 mM pH7,5, glicerol a 5%, DTT2 mM) e congelado a -80°C para armazenamento.
[00684] Os números de acesso e mapas de plasmídeos para todas as proteínas purificadas neste estudo estão disponíveis na Tabela 21.
[00685] Alvo do ácido nucleico e preparação de crRNA. Os alvos do ácido nucleico para Cas12a e a detecção de DNA genômico foram amplificados por PCR com a mistura principal NEBNext PCR, extraídos em gel e purificados usando o kit de extração em gel MinElute (Qiagen). Para detecção baseada em RNA, o dsDNA purificado foi incubado com T7 polimerase durante a noite a 30°C usando o kit HiScribe T7Quick High Yield RNASynthesis (New England Biolabs) e o RNA foi purificado com o kit MEGAclear Transcription Clean-up (Thermo Fisher).
[00686] A preparação de crRNA foi realizada como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438- 442 (2017)) com pequenas modificações e é detalhado abaixo.
Para a preparação dos crRNAs, os construtos foram ordenados como DNA ultrâmero (Integrated DNATechnologies) com uma sequência promotora T7 anexada. ODNA do crRNA foi recozido em um iniciador T7 curto (concentrações finais 10 uM) e incubados com T7 polimerase durante a noite a 37°C usando o kit HiScribe T7Quick High Yield RNASynthesis (New England Biolabs). crRNAs foi purificado usando esferas limpas de RNAXP (Beckman 4Coulter) na razão 2x de esferas para o volume de reação, com uma suplementação adicional de 1,8x de isopropanol (Sigma).
[00687] Todas as sequências de crRNA usadas neste estudo estão disponíveis na Tabela 22. Todas as sequências alvo de DNA e RNA usadas neste estudo estão disponíveis na Tabela 23.
[00688] Os iniciadores para RPA foram projetados usando NCBIPrimer-BLAST (Ye et al. BMCBioinformatics 13: 134 (2012)) usando parâmetros padrão, com exceção do tamanho do amplicon (entre 100 e 140 nt), temperaturas de fusão do iniciador (entre 54°C e 67°C) e tamanho do iniciador (entre 30 e 35 nt)Os iniciadores foram preparados por IDT (Tecnologias de DNAIntegradas).
[00689] As reações RPA e RT-RPA executadas foram conforme as instruções do TwistAmp® Basic ou TwistAmp® Basic RT (TwistDx), respectivamente, com a exceção de que 280 mM de MgAc foram adicionados antes do modelo de entrada. As reações foram realizadas com 1 mL de entrada por 1 hora a 37°C, a menos que descrito de outra forma.
[00690] Para quantificação de ácido nucleico SHERLOCK, a concentração de iniciador de RPA foi testada na concentração padrão (480nM final) e menor (240nM, 120nM, 60nM, 24nM) para encontrar a concentração ideal. As reações RPA foram realizadas ainda por 20 minutos.
[00691] Quando múltiplos alvos foram amplificados com RPA, a concentração de iniciador foi ajustada para uma concentração final de 480nM. Ou seja, foram adicionados 120 nM de cada iniciador para dois pares de iniciadores para detecção duplex.
[00692] Todos os iniciadores de RPA utilizados neste estudo estão disponíveis na Tabela 24.
[00693] Ensaio de clivagem fluorescente. Os ensaios de detecção foram realizados como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438-442 (2017)) com pequenas modificações e o procedimento é detalhado abaixo.
Os ensaios de detecção foram realizados com Cas13 purificado a 45 nM, crRNA22,5 nM, repórter de RNA fluorescente extinto (125nMRNAse Alert v2, Thermo 5Scientific, repórteres de homopolímeros e di-nucleotídeos (IDT); 250nM para repórter polyATrilink), inibidor de 0,5 µL de RNase murina (New England Biolabs), 25 ng de RNA humano total de fundo (purificado a partir da cultura HEK293FT) e quantidades variadas de alvo de ácido nucleico de entrada, a menos que indicado de outra forma, no tampão de ensaio de nuclease (HEPES20 mM, NaCl 60 mM, MgCl26 mM, pH6,8). Para reações de clivagem fluorescente Csm6, a proteína foi usada na concentração final de 10nM, juntamente com 500nM de oligoadenilato de fosfato cíclico 2', 3', 250nM de repórter fluorescente e 0,5 µL de inibidor de RNase murina em tampão de ensaio de nuclease (HEPES20 mM, NaCl 60 mM, MgCl26 mM, pH6,8). Deixou-se que as reações continuassem por 1-3 h a 37°C (a menos que indicado de outra forma) em um leitor de placas fluorescentes (BioTek) com cinética fluorescente medida a cada 5 min. Nas reações envolvendo AsCas12a, 45nMAsCas12a foi incluído usando a proteína recombinante da IDT. No caso de reações multiplexadas, 45nM de cada proteína e 22,5nM de cada crRNA foram utilizados na reação.
[00694] Todos os repórteres de clivagem usados neste estudo estão disponíveis na Tabela 25.
[00695] Detecção de ácido nucleico de SHERLOCK. Os ensaios de detecção foram realizados com Cas13 purificado a 45 nM, crRNA22,5 nM, repórter de RNA fluorescente extinto (125nMRNAse Alert v2, Thermo Scientific, repórteres de homopolímeros e di-nucleotídeos (IDT), 250nM para repórter polyATrilink), 0,5 µL de inibidor da RNase murina (New England Biolabs), 25 ng de RNA humano total de fundo (purificado a partir da cultura HEK293FT) e 1 uL de reação RPA em tampão de ensaio de nuclease (20 mMHEPES, 60 mMNaCl, 6 mMMgCl2, pH6,8), mistura de rNTP (1mM final, NEB), 0,6 µLT7 polimerase (Lucigen) e 3mMMgCl2. Deixou-se que as reações continuassem por 1-3 h a 37°C (a menos que indicado de outra forma) em um leitor de placas fluorescentes (BioTek) com cinética fluorescente medida a cada 5 min.
[00696] Para a detecção de ácido nucleico de um pote, o ensaio de detecção foi realizado como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438-442 (2017)) com pequenas modificações. Um único ensaio de reação combinada de 100 µL consistiu em 0,48 µM de iniciador direto, 0,48 µM de iniciador reverso, 1x tampão de re-hidratação RPA, quantidades variadas de entrada de DNA, 45 nM de proteína recombinante LwCas13a, 22,5 nM de crRNA, 125 ng de RNA humano total de fundo, 125 nM de repórter de substrato (RNase alert v2), 2,5 µL de inibidor da RNase murina (New England Biolabs), 2 mMATP, 2 mMGTP, 2 mMUTP, 2 mMCTP, 1 µL de mistura de T7 polimerase (Lucigen), 5 mMMgCl2, e 14 mMMgAc. Deixou-se que as reações continuassem por 1-3 h a 37°C (a menos que indicado de outra forma) em um leitor de placas fluorescentes (BioTek) com cinética fluorescente medida a cada 5 min. Para a leitura do fluxo lateral, foram adicionados 20 µL da reação combinada a 100 uL de tampão de ensaio HybriDetect 1 (Milenia) e executados em tiras de fluxo lateral HybriDetect 1 (Milenia).
[00697] Marcação de ácido nucleico para análise de fragmentos de clivagem. ORNA alvo foi transcrito in vitro a partir de um modelo de dsDNA e purificado como descrito acima. A reação de clivagem in vitro foi realizada como descrito acima para a reação de clivagem por fluorescência com as seguintes modificações. O repórter de fluorescência foi substituído por 1µg de RNA alvo e nenhum RNA de fundo foi usado. A reação de clivagem foi realizada por 5 minutos (LwaCas13a) ou 1 hora (PsmCas13b) a 37°C. A reação de clivagem foi purificada usando o kit RNA clean &
concentrator-5 (Zymo Research) e eluída em 10 uL de água UltraPure (Gibco). A reação de clivagem foi ainda rotulada com 10µg de maleimida IRDye 800CW (Licor), seguindo o protocolo do kit de reação de rotulagem 5'EndTag (Vector Laboratories). Para determinar a extremidade 5 'produzida pela clivagem Cas13, o protocolo foi modificado para realizar um tratamento com fosfatase alcalina (AP) ou substituir com água UltraPure para rotular apenas espécies de RNA contendo 5'-OH, enquanto espécies de RNA trifosforiladas (PPP) não digeridas são marcado somente quando o tratamento da PA é realizado.
[00698] Espectrometria de massa para análise de fragmentos de clivagem de alta resolução. Para determinar as extremidades de clivagem produzidas pela atividade de RNase colateral Cas13 por Espectrometria de Massa, uma reação de clivagem in vitro foi realizada como descrito acima com as seguintes modificações. O alvo de RNA do Cas13 foi usado na concentração final de 1 nM, o ativador Csm6 na concentração final de 3µM e nenhum RNA de fundo foi utilizado. Para reações de controle, o alvo Cas13 foi substituído por água UltraPure ou a reação de clivagem padrão in vitro foi incubada com hexaadenilato contendo um ativador de fosfato cíclico 2 ', 3' na ausência de alvo Cas13, proteína Cas13 e Cas13 crRNA. As reações de clivagem foram realizadas por 1h a 37°C e purificadas usando um protocolo de purificação de siRNA da New England Biolabs.
Em resumo, um décimo volume de 3MNaOAc, 2µL de RNasefree Glycoblue (Thermofisher) e três volumes de etanol 95% frio foram adicionados, colocados a -20 ° C por 2 horas e centrifugados por 15 minutos a 14. 000 g. O sobrenadante foi removido e dois volumes de 80% de EtOH foram adicionados e incubados por 10 minutos à temperatura ambiente. O sobrenadante foi decantado e as amostras centrifugadas por 5 minutos a 14. 000 g. Após a secagem ao ar do sedimento, 50µL de água UltraGrade foram adicionados e enviados em gelo seco para análise por espectrometria de massa.
[00699] Para análise por espectrometria de massa, as amostras foram diluídas 1:1 com água UltraGrade e analisadas no espectrômetro de massa q-TOFBruker Impact II no modo de íon negativo acoplado a uma HPLCAgilent 1290. 10 µL foram injetados em uma coluna PLRP-S (50 mm, tamanho de partícula de 5 um, coluna PLRP-S com tamanho de poro de 1000 angstrons, 2,1 mm ID) usando hidróxido de amônio 0,1% v/v em água como fase móvel A e acetonitrila como fase móvel B. A taxa de fluxo foi mantida constante ao longo de 0,3 ml/minuto. A composição da fase móvel começou em 0%B e foi mantido nos primeiros 2 minutos. Após esse ponto, a composição foi alterada para 100% B nos próximos 8 minutos e mantida por um minuto. A composição foi então retornada para 0% B durante 0,1 minuto e, em seguida, mantido pelos 4,9 minutos seguintes para permitir que a coluna se reequilibre às condições de partida. O espectrômetro de massa foi ajustado para íons MW grandes e os dados foram adquiridos entre m/z 400-5000. Todo o conjunto de dados do espectrômetro de massa foi calibrado por m/z usando uma injeção de formato de sódio. Os dados foram analisados usando o Bruker Compass Data Analysis 4,3 com uma licença para o algoritmo de deconvolução MaxEnt para gerar um espectro de massa neutro calculado a partir dos dados de íons carregados negativamente.
[00700] Extração de DNA genômico da saliva humana. A extração do DNA da saliva foi realizada como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438-442 (2017)) com pequenas modificações e é detalhado abaixo.
Foram coletados 2mL de saliva de voluntários que foram impedidos de consumir alimentos ou bebidas 30 min antes da coleta. As amostras foram então processadas usando o QIAamp® DNABlood Mini Kit (Qiagen), conforme recomendado pelo protocolo do kit. Para amostras de saliva fervida, 400 µL de solução salina tamponada com fosfato (Sigma) foram adicionados a 100 µL de saliva de voluntário e centrifugados por 5 min a 1800 g. O sobrenadante foi decantado e o sedimento foi ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 a 0,2% (Sigma) antes da incubação a 95°C por 5 min. 1 mL da amostra foi usada como entrada direta nas reações de RPA.
[00701] Quantificação de PCR de gotículas digitais.
A quantificação do ddPCR foi realizada como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438-442 (2017)) com pequenas modificações e é detalhado abaixo.
Para confirmar a concentração das diluições alvo, realizamos o PCR de doppler digital (ddPCR). Para quantificação de DNA, as gotículas foram feitas usando o ddPCRSupermix for Probes (sem dUTP) (BioRad) com sondas de qPCRPrimeTime/ensaios de iniciador (IDT) projetados para a sequência alvo. Para quantificação de RNA, as gotículas foram feitas usando o kit RT-ddPCR de uma etapa para sondas com sondas PrimeTime qPCR/ensaios de iniciador projetados para a sequência alvo. Gotas foram geradas em ambos os casos usando o gerador de gotículas QX200 (BioRad) e transferidas para uma placa de PCR. A amplificação baseada em gotículas foi realizada em um termociclador, conforme descrito no protocolo do kit, e as concentrações de ácido nucleico foram subsequentemente determinadas por medição em um leitor de gotículas QX200.
[00702] Ensaio de clivagem fluorescente de Cas13- Csm6. Os ensaios de clivagem fluorescente combinada Cas13- Csm6 foram realizados conforme descrito para as reações padrão de clivagem fluorescente Cas13 com as seguintes modificações. A proteína Csm6 foi adicionada à concentração final 10 nM, 400 nM de repórter fluorescente Csm6 e ativador 500 nMCsm6, a menos que indicado de outra forma.
Para distinguir Cas13 da atividade de RNase colateral Csm6, foram utilizados dois fluoróforos distintos para detecção de fluorescência (FAM e HEX). Devido à interferência dos rNTPs na atividade Csm6, a IVT foi realizada na etapa de pré-amplificação do RPA e, em seguida, 1µL dessa reação foi adicionado como entrada ao ensaio de clivagem Cas13-Csm6.
[00703] No caso em que testamos um ensaio de clivagem de Cas13-Csm6 em três etapas, o RPA foi realizado normalmente como discutido acima por períodos variados e depois usado como entrada para uma reação normal de IVT por períodos variados. Em seguida, 1µL da IVT foi usado como entrada para a reação Cas13-Csm6descrita no parágrafo anterior.
[00704] Rastreamento de descoberta de motivos com biblioteca. Para rastrear a preferência de clivagem Cas13, uma reação de clivagem de RNA in vitro foi configurada como descrito acima com as seguintes modificações. O alvo Cas13 foi usado a 20nM, o repórter fluorescente foi substituído por 1 µM de oligonucleotídeo de DNA-RNA (IDT) que contém um trecho de 6-mer de ribonucleotídeos randomizados, flanqueados por alças de DNA para a preparação da biblioteca NGS. As reacções foram realizadas durante 60 minutos (salvo indicação em contrário) a 37°C. As reações foram purificadas usando o kit Zymo oligo-clean e concentrator-5 (pesquisa Zymo) e 15µL de água UltraPure foram utilizados para eluição. 10µL de reação purificada foram utilizados para a transcrição reversa usando um iniciador específico de gene que se liga ao identificador de DNA.
[00705] A transcrição reversa (RT) foi realizada por 45 minutos a 42 °C, de acordo com o protocolo qScript Flex cDNA-kit (quantabio). Para avaliar a eficiência da clivagem e a pureza do produto, as reações de RT foram diluídas 1:10 em água e carregados em um kit Small RNA e executados em um Bioanalyzer 2100 (Agilent). Foram utilizados quatro microlitros da reação de RT na primeira rodada da preparação da biblioteca NGS. ONEBNext (NEB) foi usado para amplificar o cDNA da primeira fita com uma mistura de iniciadores diretos no final de 625 nM e um iniciador reverso no 625 nM por 15 ciclos com desnaturação inicial de 3 minutos a 98 °C, desnaturação inicial de 10 segundos a 98 °C, 10s recozimento a 63 °C, extensão de 20s 72 °C e extensão de extensão final de 2 minutos a 72 °C.
[00706] Dois microlitros da reação de PCR do primeiro turno foram utilizados para amplificação do segundo turno para anexar índices compatíveis com Illumina (NEB) para o sequenciamento de NGS. O mesmo protocolo de
PCRNEBNext foi usado para amplificação. O produto de PCR foi analisado por geleletroforese em agarose (sistema Sybr Gold E-Gel Invitrogen a 2%) e 5µL de cada reação foram reunidos. As amostras reunidas foram extraídas em gel, quantificadas com kit de alta sensibilidade Qubit DNA2,0DNA e normalizadas para concentração final de 4 nM. A biblioteca final foi diluída para 2 pM e sequenciada em um sistema NextSeq 500Illumina usando um kit de 75 ciclos.
[00707] Análise de tela de motivos. Para analisar o esgotamento de motivos preferidos da tela da biblioteca de motivos aleatórios, regiões de 6-mer foram extraídas dos dados da sequência e normalizadas para a contagem geral de leitura para cada amostra. As contagens de leitura normalizadas foram então usadas para gerar razões de log, com ajuste de contagem de contas, entre condições experimentais e controles correspondentes. Para experimentos Cas13, os controles correspondentes não tiveram o RNA alvo adicionado; para experimentos com Csm6 e RNase A, os controles pareados não possuíam enzima. O formato da distribuição da razão de toras foi utilizado para determinar os pontos de corte para motivos enriquecidos. Motivos enriquecidos foram então utilizados para determinar a ocorrência de combinações de 1, 2 ou 3 nucleotídeos. Os logotipos de motivos foram gerados usando Weblogo3 (Crooks et al. Genome Res 14:1188-1190 (2004)).
[00708] Análise filogenética da proteína Cas13 e repetições diretas de RNA cr. Para estudar o agrupamento de ortólogos, vários alinhamentos de sequência foram gerados com as sequências de proteínas Cas13a e Cas13b em Geneious com MUSCLE e, em seguida, agrupadas usando a distância euclidiana em R com o mapa de calor. 2Função. Para estudar o agrupamento direto por repetição, foram gerados alinhamentos de várias sequências com as sequências de repetição direta Cas13a e Cas13b em Geneious usando o algoritmo Geneious e, em seguida, agrupadas usando a distância euclidiana em R com o mapa de calor. 2Função.
Para estudar o agrupamento de ortólogos com base na preferência do motivo dos dinucleotídeos, a matriz de atividade de clivagem foi agrupada usando a distância euclidiana em R usando a função o mapa de calor. 2Função.
[00709] Nanopartículas de ouro colorimétricas. Um RNA oligo foi sintetizado a partir do IDT com tióis nas extremidades 5 'e 3' (Tabela 25 para a sequência). A fim de desproteger os grupos tiol, o oligo a uma concentração final de 20 mM foi reduzido em tampão de fosfato de sódio 150 mM contendo DTT100 mM por 2 horas à temperatura ambiente. Os oligo foram então purificados usando colunas de sephadex NAP-5 (GEHealthcare) em um volume final de 700µL de água. Como descrito anteriormente (Zhao et al.
Anal Chem 80:8431-8437 (2008)), o oligo reduzido a 10µM foi adicionado a um volume de 280µL a 600µL de nanopartículas de 2,32nM de ouro e 15nm (Ted Pella), que é um 2000:1 proporção de oligo para nanopartículas. Posteriormente, 10µL de Tris-HCl 1M a pH8,3 e 90µL de NaCl 1M foram adicionados à mistura de oligo-nanopartículas e incubados por 18 horas em temperatura ambiente com rotação. Após 18 horas, Tris-HCl 1M adicional (5µL a pH8,3) foi adicionado com NaCl 5M (50µL) e este foi incubado por 15 horas adicionais à temperatura ambiente com rotação. Após a incubação, a solução final foi centrifugada por 25 min a
22. 000 g. O sobrenadante foi descartado e as nanopartículas conjugadas foram ressuspensas em 50µL de NaCl 200mM.
[00710] As nanopartículas foram testadas quanto à sensibilidade à RNase usando um ensaio de RNase A.
Quantidades variáveis de RNase A (Thermo Fischer) foram adicionadas a 1x tampão de RNase A e 6µL de nanopartículas conjugadas em um volume total de reação de 20µL. A absorbância a 520 nm foi monitorada a cada 5 minutos por 3 horas usando um espectrofotômetro de placa.
[00711] Clonagem de construções REPAIR, transfecção de células de mamíferos, isolamento de RNA e preparação da biblioteca NGS para REPAIR. Construtos para simular a reversão de mutações APC e construtos guia para REPAIR foram clonados como descrito anteriormente (Cox et al.
Science 358: 1019-1027 (2017)). Resumidamente, sequências de 96 nt centradas no APC:c. 1262G>A a mutação foi projetada e o portão dourado foi clonado sob um vetor de expressão e as seqüências guia correspondentes foram clonadas no portão de ouro em vetores de expressão U6 para os guias PspCas13b. Para simular amostras de pacientes, 300 ng de vetor de expressão de APC mutante ou de tipo selvagem foram transfectados para células HEK293FT com Lipofectamina 2000 (Invitrogen), e dois dias após a transfecção foi coletado o DNA pós-transfecção com o Kit Qiamp DNABlood Midi (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. 20 ng de DNA foram usados como entrada nas reações SHERLOCK- LwaCas13a.
[00712] A correção do RNA usando o sistema REPAIR foi realizada conforme descrito anteriormente (Cox et al.
Science 358:1019-1027 (2017)): 150 ng de dPspCas13b-ADAR (DD) E488Q, 200 ng do vetor guia e 30 ng do vetor de expressão APC foram co-transfectados e o RNA pós- transfecção de dois dias foi colhido usando o RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. 30 ng de RNA foram usados como entrada nas reações SHERLOCK- LwaCas13a. Todos os plasmídeos usados para edição do RNAREPAIR neste estudo estão disponíveis na Tabela 26.
[00713] As frações de edição de RNA foram determinadas independentemente por NGS como descrito anteriormente. ORNA foi transcrito reversamente com o kit qScript Flex (Quanta Biosciences) com um iniciador específico de sequência. O cDNA da primeira cadeia foi amplificado com o NEBNext High Fidelity 2XPCRMastermix (New England Biosciences) com uma mistura de iniciadores diretos a 625nM final e um iniciador reverso a 625nM por 15 ciclos com desnaturação inicial de 3minutos a 98°C, ciclo de 10 segundos de desnaturação a 98°C, segundo recozimento a 65°C, extensão de 30 segundos a 72°C e extensão extensão final de 2 minutos a 72°C. Dois microlitros da reação de PCR do primeiro ciclo foram utilizados para amplificação de PCR de segundo ciclo para fixar índices compatíveis com Illumina para o sequenciamento de NGS, com NEBNext, usando o mesmo protocolo com 18 ciclos. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose (2% Sybr Gold E-Gel Invitrogen) e 5µL de cada reação foram reunidos. As amostras reunidas foram extraídas em gel, quantificadas com o kit de alta sensibilidade Qubit DNA2. 0DNA e normalizadas para concentração final de 4nM e lidas com um kit MiSeq de 300 ciclos v2 (Illumina).
[00714] Análise de dados de fluorescência de SHERLOCK. A análise de fluorescência SHERLOCK foi realizada como descrito anteriormente (Gootenberg et al. Science 356: 438-442 (2017)) com pequenas modificações e é detalhado abaixo. Para calcular os dados de fluorescência subtraídos em segundo plano, a fluorescência inicial das amostras foi subtraída para permitir comparações entre diferentes condições. A fluorescência para condições de fundo (sem entrada ou sem condições de crRNA) foi subtraída das amostras para gerar fluorescência subtraída de fundo.
[00715] As razões de crRNA para discriminação de SNP foram calculadas para ajustar a variação geral de amostra para amostra da seguinte maneira: A parte de imagem com identificação de relação rId10 não foi encontrada no arquivo.
Razão crRNAAi onde Ai e Bi se referem aos valores de intensidade SHERLOCK para a replicação técnica i dos crRNAs que detectam o alelo A ou alelo B, respectivamente, para um determinado indivíduo. Como normalmente temos quatro repetições técnicas por crRNA, m e n são iguais a 4 e o denominador é equivalente à soma de todos os oito valores de intensidade do crRNASHERLOCK para um determinado locus e SNP e indivíduo. Como existem dois crRNAs, a média da razão de crRNA em cada um dos crRNAs de um indivíduo sempre será soma a dois. Portanto, no caso ideal de homozigose, a proporção média de crRNA para o alelo positivo crRNA será dois e a proporção média de crRNA para o alelo negativo crRNA será zero. No caso ideal de heterozigosidade, a proporção média de crRNA para cada um dos dois crRNAs será uma. Como no SHERLOCKv2, realizamos a genotipagem medindo Ai e Bi em diferentes canais de cores, escalamos o canal de 530 cores em 6 para corresponder aos valores de intensidade no canal de 480cores.
[00716] Clivagem promíscua de ortólogos Cas13 na ausência de alvo. Alguns membros da família Cas13, como PinCas13b e LbuCas13a, demonstram clivagem promíscua na presença ou ausência do alvo, e essa atividade de segundo plano depende do repórter di-nucleotídeo (Fig. 123B). Esta atividade de segundo plano também era dependente do espaçador para LbuCas13a (Fig. 123C-D). Em alguns repórteres, as preferências de dibase U e A agruparam-se dentro da similaridade de proteína ou DR. Curiosamente, as preferências de di-nucleotídeos aqui identificadas não correspondiam às famílias Cas13 agrupadas de similaridade de repetição direta ou similar de proteína (Fig. 124A-D).
[00717] Caracterização de projetos de crRNA para PsmCas13b e CcaCas13b. Para identificar o crRNA ideal para a detecção com PsmCas13b e CcaCas13b, testamos comprimentos de espaçador de crRNA de 34 a 12 nt e descobrimos que o PsmCas13b tinha um pico de sensibilidade no espaçador de 30, enquanto CcaCas13b apresentava sensibilidade equivalente acima dos comprimentos de 28nt, justificando o uso de espaçadores de 30nt para avaliar a atividade de Cas13 (Fig. 127). Para explorar ainda mais a robustez da segmentação de CcaCas13b e PsmCas13b em comparação com LwaCas13a, projetamos onze crRNAs diferentes espaçados uniformemente pelo ssRNA1 e descobrimos que a atividade colateral de LwaCas13a era robusta ao design do crRNA, enquanto CcaCas13b e PsmCas13b mostravam mais variabilidade na atividade entre diferentes crRNAs (Fig. 128).
[00718] Triagem aleatória de motivos de biblioteca para motivos ortogonais adicionais. Para explorar ainda mais a diversidade de preferências de clivagem dos ortólogos Cas13a e Cas13b, desenvolvemos uma abordagem baseada em biblioteca para caracterizar motivos preferidos para a atividade de endonuclease colateral. Utilizamos um repórter de ARN de 6-mero degenerado, ladeado por constantes punhos de DNA, o que permitiu a amplificação e leitura de sequências não clivadas (Fig. 129A). A incubação dessa biblioteca com enzimas Cas13 resultou em padrões de clivagem detectáveis que dependiam da adição do RNA alvo (Fig. 129), e o seqüenciamento de motivos esgotados dessas reações revelou um aumento na inclinação da biblioteca ao longo do tempo de digestão (Fig. 129C), indicativo de uma população de motivos preferidos para clivagem. Logotipos de sequência e preferências de dibase aos pares de motivos altamente esgotados (Fig. 129D) reproduziram a preferência U observada para LwaCas13a e CcaCas13b e a preferência A de PsmCas13b (Fig. 129E e Fig. 130A). Sintetizamos repórteres dos principais motivos, conforme determinado na tela para validar as descobertas, e descobrimos que LwaCas13a, CcaCas13a e PsmCas13b clivavam seus motivos mais preferidos (Fig. 130B, C). Também encontramos várias seqüências que mostraram clivagem para apenas um ortólogo, mas não para outras, o que poderia permitir uma leitura ortogonal alternativa de motivos de di-nucleotídeos (Fig. 131).
OLwaCas13a incubado com diferentes alvos produziu preferências semelhantes de motivos de clivagem, indicando que a preferência básica da atividade colateral é constante, independentemente da sequência do alvo (Fig.
132).
EXEMPLO10 – FLUXO LATERAL MULTIPLEX Conceito para fluxo lateral de dois plexos
[00719] Esse conceito envolve duas análises: FAM- T*A*rArUG*C*-Biotin (Cortes LwaCas13a) e FAM-T*A*rUrAG*C*- DIG (Cortes CcaCas13b10). Essas sondas ligam a linha anti- DIG e a linha estreptavidina na faixa de fluxo lateral do plex duplo. Pode-se então procurar fluorescência e detectar diminuições na intensidade da linha correspondente à atividade colateral e, assim, atingir a presença das sequências alvo. Outros motivos ou sondas (poli A para PsmCas13b e sensores de DNA para detecção de Cas12) também podem ser usados.
Ensaio de fluxo lateral de dois plexos para RNA e ssRNA1 da Dengue
[00720] Neste ensaio, duas sondas foram usadas: • FAM-T*A*rArUG*C*-Biotin (Cortes LwaCas13a) - detecção de ssRNA1 • FAM-T*A*rUrAG*C*-DIG (Cortes CcaCas13b10) - detecção do RNA da dengue Os resultados são mostrados nas Figuras 103A e 103B.
Ensaio de fluxo lateral em quatro plexos
[00721] Os candidatos projetaram e sintetizaram faixas de fluxo lateral que permitem 4 linhas e detecção simultânea de 4 alvos.
[00722] As sondas utilizadas foram as seguintes: • /5TYE665/T*A*rArUG*C*/3AlexF488N/ - LwaCas13a • /5TYE665/T*A*rUrAG*C*/36-FAM/ - CcaCas13b • /5TYE665/rArArArArA/3Bio/ - PsmCas13b • /5TYE665/AAAAA/3Dig_N/ - AsCas12a As tiras contêm linhas anti-Alexa-fluor-488, anti-FAM, estreptavidina e anti-Dig, permitindo a detecção de até 4 alvos. O corante Tye665 será detectado e as diminuições na intensidade da linha fluorescente indicarão a presença do alvo.
***
[00723] Diversas modificações e variações do método e sistema descrito da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica sem se afastar do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com modalidades preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não deve ser excessivamente limitada por essas modalidades específicas.
De fato, várias modificações dos modos descritos para realizar a invenção que são óbvios para os especialistas nas ciências médicas se destinam a estar no escopo das reivindicações que seguem. Enquanto a invenção tem sido descrita em conexão modalidades específicas da mesma, será compreendido que ela é também capaz de ainda outras modificações, e este pedido tem a intenção de cobrir quaisquer variações, usos, ou adaptações da invenção que segue, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais divergências da presente divulgação como conhecido e de costume na técnica da qual a invenção é pertinente, e pode ser aplicado às características essenciais apresentadas neste documento.

Claims (128)

REIVINDICAÇÕES
1. Sistema de detecção de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende: i) dois ou mais sistemas CRISPR, cada sistema CRISPR compreendendo uma proteína Cas e uma molécula guia compreendendo uma sequência guia capaz de ligar a uma molécula alvo correspondente e projetada para formar um complexo com a proteína Cas; e ii) um conjunto de construtos de detecção, cada construto de detecção compreendendo uma sequência de motif de corte que é preferencialmente cortada por uma das proteínas Cas, em que a proteína Cas de cada sistema CRISPR exibe atividade de clivagem de ácido nucleico colateral e cliva preferencialmente a sequência de motif de corte de um ou mais do conjunto de construtos de detecção.
2. Sistema para detectar a presença de dois ou mais polipeptídeos alvo em uma amostra in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende: i) um conjunto de construtos de detecção, cada construto de detecção compreendendo sequência de motivos de corte que é preferencialmente cortada por uma das proteínas Cas, ii) um conjunto de aptâmeros de detecção, cada um projetado para ligar a um dos dois ou mais polipeptídeos alvo, e cada aptâmero de detecção compreendendo uma sequência de motifs de corte que é preferencialmente cortada por uma proteína Cas de um dos dois ou mais Sistemas CRISPR; um sítio de ligação de promotor da RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação de iniciador mascarado; e um modelo de sequência gatilho, codificando uma sequência gatilho; iii) dois ou mais sistemas CRISPR, cada sistema CRISPR compreendendo uma proteína Cas e um polinucleotídeo guia compreendendo uma sequência guia capaz de ligar a sequência gatilho codificada pelo modelo de sequência gatilho; em que a proteína Cas exibe atividade de clivagem de ácido nucleico colateral e cliva a sequência não alvo do construto de máscara baseado em ácido nucleico, uma vez ativada pela sequência gatilho.
3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico para amplificar a sequência alvo.
4. Sistema, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico para amplificar a sequência alvo.
5. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais sistemas CRISPR são proteínas Cas direcionadas a RNA, proteínas Cas direcionadas a DNA ou uma combinação das mesmas.
6. Sistema, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a RNA compreende um ou mais domínios HEPN.
7. Sistema, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os um ou mais domínios HEPN compreendem uma sequência de motifs RxxxxH.
8. Sistema, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o motif RxxxH compreende uma sequência R{N/H/K]X1X2X3H.
9. Sistema, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que X1 é R, S, D, E, Q, N, G ou Y e X2 é independentemente I, S, T, V ou L e X3 é independentemente L, F, N, Y, V, I, S, D, E ou A.
10. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas13 direcionada a RNA de CRISPR.
11. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13 é uma proteína Cas13a, Cas13b ou Cas13c.
12. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13 é uma proteína Cas13 a.
13. Sistema, de acordo com a reivindicação 12,
caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13a é de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifractor, Mycoplasma, Campylobacter, e Lachnospira.
14. Sistema, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13a é selecionada da Tabela 1, Tabela 2 ou uma combinação das mesmas.
15. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13 é uma proteína Cas13b.
16. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13b é de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Bergeyella, Prevotella, Porphyromonas, Bacterioides, Alistipes, Riemerella, Myroides, Capnocytophaga, Porphyromonas, Flavobacterium, Porphyromonas, Chryseobacterium, Paludibacter, Psychroflexus, Riemerella, Phaeodactylibacter, Sinomicrobium, Reichenbachiella.
17. Sistema, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13b é selecionada da Tabela 4, 5 ou uma combinação das mesmas.
18. Sistema, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13 é uma proteína Cas13c.
19. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13c é de um organismo de um gênero selecionado do grupo que consiste em: Fusobacterium e Anaerosalibacter.
20. Sistema, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas13c é selecionada da Tabela 6.
21. Sistema, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a DNA é uma proteína Cas12.
22. Sistema, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas12 é Cpf1.
23. Sistema, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que Cpf1 é selecionada de um organismo do gênero que consiste em; Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria,
Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium ou Acidaminococcus; por exemplo, uma prote[ina Cas quimérica compreendendo um primeiro fragmento e um segundo fragmento, em que cada um do primeiro e do segundo fragmentos é selecionado de uma Cpf1 de um organismo compreendendo Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium ou Acidaminococcus.
24. Sistema, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a Cpf1 é selecionada de um ou mais dos seguintes Acidaminococcus sp. BV3L6 Cpf1 (AsCpf1); Francisella tularensis subsp. Novicida U112 Cpf1 (FnCpf1);
L. bacterium MC2017 Cpf1 (Lb3Cpf1); Butyrivibrio proteoclasticus Cpf1 (BpCpf1); Parcubacteria bacterium GWC2011_GWC2_44_17 Cpf1 (PbCpf1); Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10 Cpf1 (PeCpf1); Leptospira inadai Cpf1 (LiCpf1); Smithella sp. SC_K08D17 Cpf1 (SsCpf1); L.
bacterium MA2020 Cpf1 (Lb2Cpf1); Porphyromonas crevioricanis Cpf1 (PcCpf1); Porphyromonas macacae Cpf1 (PmCpf1); Candidatus Methanoplasma termitum Cpf1 (CMtCpf1); Eubacterium eligens Cpf1 (EeCpf1); Moraxella bovoculi 237 Cpf1 (MbCpf1); Prevotella disiens Cpf1 (PdCpf1); ou L.
bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1).
25. Sistema, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o sistema Cas12 é um sistema C2c1.
26. Sistema, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a C2c1 é selecionada de um organismo do gênero consistindo em Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus, Desulfatirhabdium, Elusimicrobia, Citrobacter, Methylobacterium, Omnitrophicai, Phycisphaerae, Planctomycetes, Spirochaetes, e Verrucomicrobiaceae.
27. Sistema, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a C2c1 é selecionada de um ou mais de Alicyclobacillus acidoterrestris (por exemplo, ATCC
49025), Alicyclobacillus contaminans (por exemplo, DSM 17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (por exemplo, DSM 17980), cepa C4 de Bacillus hisashii , Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (por exemplo, DSM 10711), Desulfonatronum thiodismutans (por exemplo, cepa MLF-1), Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus (por exemplo, DSM 17572), Bacillus thermoamylovorans (por exemplo, cepa B4166), Brevibacillus sp. CF112, Bacillus sp. NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (e.g., DSM 18734), Alicyclobacillus herbarius (por exemplo, DSM 13609), Citrobacter freundii (por exemplo, ATCC 8090), Brevibacillus agri (por exemplo, BAB-2500), Methylobacterium nodulans (por exemplo, ORS 2060).
28. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais sistemas CRISPR compreendem duas ou mais proteínas Cas13, duas ou mais proteínas Cas12 ou uma combinação de proteínas Cas13 e Cas12.
29. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara suprime a geração de um sinal positivo detectável até clivado por uma proteína Cas CRISPR ativada.
30. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara suprime a geração de um sinal positivo detectável mascarando o sinal positivo detectável ou gerando um sinal negativo detectável em vez disso.
31. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara compreende um RNA de silenciamento que suprime a geração de um produto de gene codificado por um construto repórter, em que o produto de gene gera o sinal positivo detectável quando expresso.
32. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara é uma ribozima que gera um sinal detectável negativo e em que o sinal detectável positivo é gerado quando a ribozima é desativada.
33. Sistema, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a ribozima converte um substrato em uma primeira cor e em que o substrato converte em uma segunda cor quando a ribozima é desativada.
34. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara é um aptâmero de DNA ou RNA e/ou compreende um inibidor amarrado a DNA ou RNA.
35. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o aptâmero ou inibidor amarrado a DNA ou RNA sequestra uma enzima, em que a enzima gera um sinal detectável mediante liberação do aptâmero ou inibidor amarrado a DNA ou RNA, agindo sobre um substrato.
36. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o aptâmero é um aptâmero inibidor que inibe uma enzima e impede a enzima de catalisar a geração de um sinal detectável de uma substância ou em que o inibidor amarrado a DNA ou RNA inibe uma enzima e impede a enzima de catalisar geração de um sinal detectável de um substrato.
37. Sistema, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a enzima é trombina e o substrato é para-nitroanilida covalentemente ligado a um substrato de peptídeo para trombina ou 7-amino-4 - metilcumarina covalentemente ligado a um substrato de peptídeo para trombina.
38. Sistema, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o aptâmero sequestra um par de agentes que quando liberados dos aptâmeros combinam para gerar um sinal detectável.
39. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara compreende um oligonucleotídeo de DNA ou RNA ao qual estão fixados um ligante detectável e um componente de máscara.
40. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara compreende uma nanopartícula mantida em agregado por moléculas de ponte, em que pelo menos uma porção das moléculas de ponte compreende DNA ou RNA e em que a solução sofre uma mudança de cor quando a nanopartícula é desembolsada em solução.
41. Sistema, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a nanopartícula é um metal coloidal.
42. Sistema, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o metal coloidal é ouro coloidal.
43. Sistema, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara compreende um ponto quântico ligado a uma ou mais moléculas extintoras por uma molécula de ligação, em que pelo menos uma porção da molécula de ligação compreende DNA ou RNA.
44. Sistema, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o construto de máscara compreende DNA ou RNA em complexo com um agente intercalante, em que o agente intercalante muda absorbância mediante clivagem do DNA ou RNA.
45. Sistema, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o agente intercalante é pironina-Y ou azul de metileno.
46. Sistema, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o ligante detectável é um fluoróforo e o componente de máscara é uma molécula extintora.
47. Sistema, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais moléculas guia projetadas para ligar às moléculas alvo correspondentes compreendem uma incompatibilidade (sintética).
48. Sistema, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a referida incompatibilidade está a montante ou a jusante de uma SNP ou outra variação de nucleotídeo simples na referida molécula alvo.
49. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 48, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais moléculas guia são projetadas para detectar um polimorfismo de nucleotídeo simples em um RNA ou DNA alvo, ou uma variante splice de um transcrito de RNA.
50. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais moléculas guia são projetadas para ligar a uma ou mais moléculas alvo que são diagnóstico para um estado de doença.
51. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o estado de doença é câncer.
52. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o estado de doença é uma doença autoimune.
53. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o estado de doença é uma infecção.
54. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um vírus, uma bactéria, um fungo, um protozoário ou um parasita.
55. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção viral.
56. Sistema, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por um vírus de DNA.
57. Sistema, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o vírus de DNA é um membro de Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (incluindo vírus do herpes humano e vírus Varicella Zoster), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (incluindo o vírus da peste suína Africana),
Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polydnaviruses, Polyomaviridae (incluindo vírus Simian 40, vírus JC, vírus BK), Poxviridae (incluindo Varíola bovina e varíola, Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus, Rhizidovirus.
58. Sistema, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por um vírus de RNA de fita dupla, um vírus de RNA de senso positivo, um vírus de RNA de senso negativo, um retrovírus ou uma combinação dos mesmos.
59. Sistema, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por um vírus Coronaviridae, vírus Picornaviridae, vírus Caliciviridae, vírus Flaviviridae, vírus Togaviridae , um Bornaviridae, um Filoviridae, um Paramyxoviridae, um Pneumoviridae, um Rhabdoviridae, um Arenaviridae, um Bunenaviridae, um Bunyaviridae, um Orthomyxoviridae ou um Deltavirus.
60. Sistema, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada por Coronavírus, SARS, Poliovírus, Rinovírus, Hepatite A,
vírus Norwalk, vírus da febre amarela, vírus do Nilo Ocidental, vírus da hepatite C, vírus da dengue, vírus Zika, vírus Rubéola, vírus Ross River, Vírus Sindbis, vírus Chikungunya, vírus da doença Borna, vírus Ebola, vírus Marburg, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus Nipah, vírus Hendra, vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório humano, vírus da raiva, vírus da Lassa, Hantavírus, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, influenza ou vírus da Hepatite D.
61. Sistema, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é causada pelo vírus da febre da Dengue.
62. Sistema, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a infecção é uma infecção bacteriana.
63. Sistema, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a bactéria causando a infecção bacteriana é Acinetobacter species, Actinobacillus species, Actinomycetes species, an Actinomyces species, Aerococcus species uma Aeromonas species, uma Anaplasma species, uma Alcaligenes species, uma Bacillus species, a Bacteriodes species, uma Bartonella species, uma Bifidobacterium species, uma Bordetella species, uma Borrelia species, a Brucella species, uma Burkholderia species, a Campylobacter species, uma Capnocytophaga species, uma Chlamydia species,
uma Citrobacter species, uma Coxiella species, uma
Corynbacterium species, uma Clostridium species, uma
Eikenella species, uma Enterobacter species, uma Escherichia species, uma Enterococcus species, uma Ehlichia species, uma
Epidermophyton species, uma Erysipelothrix species, uma
Eubacterium species, uma Francisella species, uma
Fusobacterium species, uma Gardnerella species, uma Gemella species, uma Haemophilus species, uma Helicobacter species,
uma Kingella species, uma Klebsiella species, uma
Lactobacillus species, uma Lactococcus species, uma Listeria species, uma Leptospira species, uma Legionella species, uma
Leptospira species, Leuconostoc species, uma Mannheimia species, uma Microsporum species, uma Micrococcus species,
uma Moraxella species, uma Morganell species, uma Mobiluncus species, uma Micrococcus species, Mycobacterium species, uma
Mycoplasm species, uma Nocardia species, uma Neisseria species, uma Pasteurelaa species, uma Pediococcus species,
uma Peptostreptococcus species, uma Pityrosporum species,
uma Plesiomonas species, uma Prevotella species, uma
Porphyromonas species, uma Proteus species, uma Providencia species, uma Pseudomonas species, uma Propionibacteriums species, uma Rhodococcus species, uma Rickettsia species,
uma Rhodococcus species, uma Serratia species, uma
Stenotrophomonas species, uma Salmonella species, uma
Serratia species, uma Shigella species, uma Staphylococcus species, uma Streptococcus species, uma Spirillum species, uma Streptobacillus species, uma Treponema species, uma Tropheryma species, uma Trichophyton species, uma Ureaplasma species, uma Veillonella species, uma Vibrio species, uma Yersinia species, uma Xanthomonas species, ou combinação dos mesmos.
64. Sistema, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um fungo.
65. Sistema, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o fungo é Aspergillus, Blastomyces, Candidiasis, Coccidiodomycosis, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gatti, sp. Histoplasma sp. (tal como, Histoplasma capsulatum), Pneumocystis sp. (tal como, Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (tal como, Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, tinha de infecções oculares fúngicas, Exserohilum, Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, uma Hansenula species, uma Candida species, uma Kluyveromyces species, uma Debaryomyces species, uma Pichia species, uma Penicillium species, uma Cladosporium species, uma Byssochlamys species ou uma combinação das mesmas.
66. Sistema, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um protozoário.
67. Sistema, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o protozoário é Euglenozoa, a Heterolobosea, um Diplomonadida, um Amoebozoa, um Blastocystic, um Apicomplexa, ou uma combinação dos mesmos.
68. Sistema, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a infecção é causada por um parasita.
69. Sistema, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o parasita é Trypanosoma cruzi (doença de Chagas), T. brucei gambiense, T. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L.
mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, e Toxoplasma gondii, ou combinação dos mesmos.
70. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de que os reagentes para amplificar moléculas de RNA alvo compreendem amplificação baseada em sequência de ácido nucleico (NASBA), amplificação de recombinase polimerase (RPA), amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP ), amplificação de deslocamento de fita (SDA), amplificação dependente de helicase (HDA), reação de amplificação de enzima nicking (NEAR), PCR, amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), amplificação de círculo rolante (RCA), reação em cadeia da ligase (LCR) ou método de amplificação de ramificação (RAM).
71. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 70, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um sistema CRISPR de enriquecimento, em que o sistema CRISPR de enriquecimento é projetado para ligar as moléculas alvo correspondentes antes da detecção pelo sistema CRISPR de detecção.
72. Sistema, de acordo com a reivindicação71, caracterizado pelo fato de que o sistema CRISPR de enriquecimento compreende uma proteína Cas CRISPR cataliticamente inativa.
73. Sistema, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a proteína CRISPR Cas cataliticamente inativa é uma C2c2 cataliticamente inativa.
74. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 73, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas CRISPR de enriquecimento compreende ainda uma tag, em que a tag é usada para puxar para baixo o sistema de Cas CRISPR de enriquecimento ou ligar o sistema CRISPR de enriquecimento a um substrato sólido.
75. Sistema, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o substrato sólido é uma célula de fluxo.
76. Dispositivo de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais volumes discretos individuais, cada volume discreto individual compreendendo um sistema CRISPR de qualquer uma de 1 a 75.
77. Dispositivo de diagnóstico, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que cada volume discreto individual compreende ainda um ou mais aptâmeros de detecção compreendendo um local de ligação ao promotor de RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação de iniciador mascarado.
78. Dispositivo, de acordo com as reivindicações 76 ou 77, caracterizado pelo fato de que cada volume discreto individual compreende ainda reagentes de amplificação de ácido nucleico.
79. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a molécula alvo é um DNA alvo e os volumes discretos individuais ainda compreendem um iniciador que liga ao DNA alvo e compreende um promotor da RNA polimerase.
80. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são gotículas.
81. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 80, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são definidos em um substrato sólido.
82. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são micropoços.
83. Dispositivo de diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 82, caracterizado pelo fato de que os volumes discretos individuais são pontos definidos em um substrato.
84. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o substrato é um substrato de materiais flexíveis.
85. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o substrato de materiais flexíveis é um substrato de papel ou um substrato à base de polímero flexível.
86. Método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras, caracterizado pelo fato de que compreende: distribuir uma amostra ou um conjunto de amostras para um ou mais volumes distintos individuais, os volumes distintos individuais compreendendo um sistema CRISPR de qualquer uma das reivindicações 1 a 75; incubar a amostra ou o conjunto de amostras sob condições suficientes para permitir ligação das uma ou mais moléculas guia a uma ou mais moléculas alvo;
ativar a proteína Cas CRISPR via ligação das uma ou mais moléculas guia a uma ou mais moléculas alvo, em que a ativação da proteína Cas CRISPR resulta em modificação do construto de máscara baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja gerado; e detectar os um ou mais sinais positivos detectáveis, em que a detecção dos um ou mais sinais positivos detectáveis indica uma presença de uma ou mais moléculas alvo na amostra.
87. Método para detectar polipeptídeos em amostras, caracterizado pelo fato de que compreende: distribuir uma amostra ou um conjunto de amostras para um conjunto de volumes discretos individuais, os volumes discretos individuais compreendendo aptâmeros de detecção de peptídeo, um sistema CRISPR de qualquer uma das reivindicações 1 a 73; incubar a amostra ou o conjunto de amostras em condições suficientes para permitir ligação dos aptâmeros de detecção de peptídeos às uma ou mais moléculas alvo, em que a ligação do aptâmero a uma molécula alvo correspondente expõe o sítio de ligação da RNA polimerase ou o sítio de ligação de iniciador resultando na geração de um RNA gatilho; ativar a proteína Cas CRISPR via ligação das uma ou mais moléculas guia ao RNA gatilho, em que a ativação da proteína Cas CRISPR resulta em modificação do construto de máscara baseado em RNA, de modo que um sinal positivo detectável seja produzido; e detectar o sinal positivo detectável, em que a detecção do sinal positivo detectável indica uma presença de uma ou mais moléculas alvo em uma amostra.
88. Método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras, caracterizado pelo fato de que compreende: contatar uma ou mais amostras com i) dois ou mais sistemas CRISPR, cada sistema CRISPR compreendendo uma proteína Cas e uma molécula guia compreendendo uma sequência guia capaz de ligar a uma molécula alvo correspondente e projetada para formar um complexo com a proteína Cas; e ii) um conjunto de construtos de detecção, cada construto de detecção compreendendo uma sequência de motif de corte que é preferencialmente cortada por uma das proteínas Cas, em que a proteína Cas de cada sistema CRISPR exibe atividade de clivagem de ácido nucleico colateral e cliva preferencialmente a sequência de motif de corte de um ou mais do conjunto de construtos de detecção; e detectar um sinal da clivagem da sequência de motivos de corte da construção de detecção, detectando assim uma ou mais sequências alvo de ácido nucleico na amostra.
89. Método para detectar ácidos nucleicos alvo em amostras, caracterizado pelo fato de que compreende:
contatar uma ou mais amostras com i) ii) um conjunto de construtos de detecção, cada construto de detecção compreendendo sequência de motivos de corte que é preferencialmente cortada por uma das proteínas
Cas,
ii) um conjunto de aptâmeros de detecção, cada um projetado para ligar a um dos dois ou mais polipeptídeos alvo, e cada aptâmero de detecção compreendendo uma sequência de motifs de corte que é preferencialmente cortada por uma proteína Cas de um dos dois ou mais Sistemas CRISPR; um sítio de ligação de promotor da RNA polimerase mascarado ou um sítio de ligação de iniciador mascarado; e um modelo de sequência gatilho, codificando uma sequência gatilho;
iii) dois ou mais sistemas CRISPR, cada sistema CRISPR compreendendo uma proteína Cas e um polinucleotídeo guia compreendendo uma sequência guia capaz de ligar a sequência gatilho codificada pelo modelo de sequência gatilho;
em que a proteína Cas exibe atividade de clivagem de ácido nucleico colateral e cliva a sequência não alvo do construto de máscara baseado em ácido nucleico, uma vez ativada pela sequência gatilho; e detectar um sinal da clivagem da sequência de motifs de corte da construção de detecção, detectando assim uma ou mais sequências alvo de ácido nucleico na amostra.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 89, caracterizado pelo fato de que a molécula alvo é um DNA alvo e o método compreende ainda a ligação do DNA alvo a um iniciador compreendendo um local de RNA polimerase.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 89, caracterizado pelo fato de que compreende ainda amplificar o ácido nucleico de amostra ou o ácido nucleico gatilho.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a amplificação do ácido nucleico compreende a amplificação por NASBA.
93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a amplificação do ácido nucleico compreende a amplificação por RPA.
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 93, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra biológica ou uma amostra ambiental.
95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é um sangue, plasma, soro, urina, fezes, escarro, muco, líquido linfático, líquido sinovial, bile, ascite, derrame pleural, seroma, saliva, líquido cerebroespinhal, humor aquoso ou vítreo, ou qualquer secreção corporal, um transudato, um exsudato (por exemplo, fluido obtido de um abscesso ou qualquer outro sítio de infecção ou inflamação) ou fluido obtido de uma articulação (por exemplo, uma articulação normal ou uma articulação afetada por doença, tal como artrite reumatoide, osteoartrite, gota ou artrite séptica) ou um swab de superfície de pele ou membrana de mucosa.
96. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a amostra ambiental é obtida de uma amostra de alimento, superfície de papel, um tecido, uma superfície de metal, uma superfície de madeira, uma superfície de plástico, uma amostra de solo, uma amostra de água doce, uma amostra de água residual, uma amostra de água salina ou uma combinação dos mesmos.
97. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 96, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais moléculas guia são projetadas para detectar um polimorfismo de nucleotídeo simples em um RNA ou DNA alvo, ou uma variante splice de um transcrito de RNA.
98. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 88 a 97, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais moléculas guia são projetadas para ligar a uma ou mais moléculas alvo que são diagnóstico para um estado de doença.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 97 ou 98, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais moléculas guia são projetadas para ligarem a ácidos nucleicos livres de células.
100. Método, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que o estado de doença é uma infecção, uma doença de órgão, uma doença de sangue, uma doença do sistema imune, um câncer, uma doença do cérebro e do sistema nervoso, uma doença endócrina, uma doença relacionada à gravidez ou ao parto, uma doença herdada ou uma doença adquirida ambientalmente.
101. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o referido estado de doença é distinguido pela presença ou ausência de um gene ou transcrito ou polipeptídeo de resistência ou sucetibilidade a antibiótico ou droga, preferencialmente em um patógeno ou em uma célula.
102. Sistema, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a referida molécula alvo é um gene ou transcrito ou polipeptídeo de resistência ou suscetibilidade a antibiótico ou droga.
103. Sistema, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a incompatibilidade sintética na referida molécula guia está na posição 3, 4, 5 ou 6 do espaçador, preferencialmente na posição 3.
104. Sistema, de acordo com a reivindicação 47, 48 ou 100, caracterizado pelo fato de que a referida incompatibilidade na referida molécula guia está na posição
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 do espaçador, preferencialmente na posição 5.
105. Sistema, de acordo com a reivindicação 47 ou 97, caracterizado pelo fato de que a referida incompatibilidade é de 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos a montante ou a jusante, preferencialmente 2 nucleotídeos, preferencialmente a jusante do referido SNP ou outra variação de nucleotídeo simples na referida molécula guia.
106. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou 101 a 105, caracterizado pelo fato de que a referida molécula guia compreende um espaçador que é truncado em relação a um espaçador tipo selvagem.
107. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou 101 a 106, caracterizado pelo fato de que a referida molécula guia compreende um espaçador que compreende menos de 28 nucleotídeos, de preferência entre e incluindo 20 a 27 nucleotídeos.
108. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou 101 a 106, caracterizado pelo fato de que a referida molécula guia compreende um espaçador que consiste em 20 a 25 nucleotídeos ou 20 a 23 nucleotídeos, tal como preferencialmente 20 ou 23 nucleotídeos.
109. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69 ou 101 a 108, caracterizado pelo fato de que o referido construto de máscara compreende um oligonucleotídeo de RNA projetado para ligar uma sequência de formação de G-quadruplex, em que uma estrutura G- quadruplex é formada pela sequência de formação de G- quadruplex mediante clivagem do construto de máscara e em que a estrutura G-quadruplex gera um sinal positivo detectável.
110. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 86 a 100, caracterizado pelo fato de que compreende ainda comparar o sinal positivo detectável com um sinal padrão (sintético).
111. Método para detectar um ácido nucleico alvo em uma amostra, caracterizado pelo fato de que compreende: contactar uma amostra com um sistema de detecção de ácido nucleico conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 75; e aplicar a referida amostra contatada a um ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral.
112. Método, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o referido sistema de detecção de ácido nucleico compreende um construto de máscara baseado em RNA compreendendo uma primeira e uma segunda moléculas e em que o referido ensaio imunocromatográfico de fluxo lateral compreende detectar a referida primeira e segunda moléculas, preferencialmente em sítios de detecção discretos em um faixa de fluxo lateral.
113. Método, de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo fato de que a referida primeira molécula e a referida segunda molécula são detectadas por ligação a um anticorpo que reconhece a referida primeira ou segunda moléculas e detecta a referida molécula ligada, preferencialmente com anticorpos em sanduíche.
114. Método, de acordo com a reivindicação 112 ou 113, caracterizado pelo fato de que a referida faixa de fluxo lateral compreende um primeiro anticorpo a montante direcionado contra a referida primeira molécula e um segundo anticorpo a jusante direcionado contra a referida segunda molécula, e em que o construto de máscara baseado em RNA não clivado é ligado pelo referido primeiro anticorpo se o ácido nucleico alvo não estiver presente na referida amostra e em que o construto de máscara baseado em RNA clivado está ligado tanto pelo referido primeiro anticorpo quanto pelo referido segundo anticorpo se o ácido nucleico alvo estiver presente na referida amostra.
115. Dispositivo de fluxo lateral, caracterizado pelo fato de que compreende um substrato compreendendo uma primeira extremidade, em que a primeira extremidade compreende uma porção de carregamento de amostra e uma primeira região carregada com um ligando detectável, dois ou mais sistemas de Cas CRISPR, dois ou mais construtos de detecção, uma ou mais primeiras regiões de captura, cada uma compreendendo um primeiro agente de ligação, duas ou mais segundas regiões de captura, cada uma compreendendo um segundo agente de ligação, em que cada um dos dois ou mais sistemas de Cas CRISPR compreende uma proteína Cas CRISPR e uma ou mais sequências guia, cada sequência guia configurada para ligar uma ou mais moléculas alvo.
116. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que cada um dos dois ou mais construtos de detecção compreende um oligonucleotídeo de RNA ou DNA, compreendendo uma primeira molécula em uma primeira extremidade e uma segunda molécula em uma segunda extremidade.
117. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que compreende dois sistemas Cas CRISPR e dois construtos de detecção.
118. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que compreende quatro sistemas Cas CRISPR e dois construtos de detecção.
119. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com qualquer das reivindicações 115 a 118, caracterizado pelo fato de que a porção de carregamento de amostra compreende ainda um ou mais reagentes de amplificação para amplificar as uma ou mais moléculas alvo.
120. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que um primeiro construto de detecção compreende FAM como uma primeira molécula e biotina como uma segunda molécula ou vice-versa e um segundo construto de detecção compreende FAM como uma primeira molécula e Digoxigenina (DIG) como uma segunda molécula ou vice-versa.
121. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 116, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas CRISPR é uma proteína Cas direcionada a RNA.
122. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a RNA é C2c2.
123. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a RNA é Cas13b.
124. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que um primeiro construto de detecção compreende Tye665 como uma primeira molécula e Alexa-fluor-488 como uma segunda molécula ou vice- versa; em que um segundo construto de detecção compreende Tye665 como uma primeira molécula e FAM como uma segunda molécula ou vice-versa; em que um terceiro construto de detecção compreende Tye665 como uma primeira molécula e biotina como uma segunda molécula ou vice-versa; e em que um quarto construto de detecção compreende Tye665 como uma primeira molécula e DIG como uma segunda molécula ou vice-
versa.
125. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas CRISPR é uma proteína Cas direcionada a RNA ou direcionada a DNA.
126. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 125, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a RNA é C2c2.
127. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a RNA é Cas13b.
128. Dispositivo de fluxo lateral, de acordo com a reivindicação 126, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas direcionada a DNA é Cas12a
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