TW202214869A - 用於檢測 sars-cov-2 刺突蛋白之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白及診斷SARS-CoV-2感染之組合物及方法。本發明亦係關於用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白及診斷SARS-CoV-2感染之套組及裝置。

Description

用於檢測　SARS-COV-2　刺突蛋白之組合物及方法
本發明係關於用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白並診斷SARS-CoV-2感染之組合物及方法。本發明亦係關於用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白並診斷SARS-CoV-2感染之套組及裝置。
嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)係冠狀病毒疾病2019 (COVID-19)之病因，冠狀病毒疾病2019係2019年底在中國武漢首次鑑定並迅速演變成大流行之急性呼吸道症候群。COVID-19之快速及早期診斷與隔離及追蹤組合係全球醫療保健系統用於控制爆發之主要策略。
迄今為止，對SARS-CoV-2爆發之前線反應一直係聚合酶鏈反應(PCR)測試。PCR係用於診斷傳染原之金標準，且其優勢在於倘若已知病毒序列，即可相對快速地產生此等測試所需之引子。在鑑定該病毒後不久，世界衛生組織(WHO)設計並分發用於檢測SARS-CoV-2感染之首個基於定量反轉錄酶之PCR (RT-PCR)測試。然而，RT-PCR方案複雜且昂貴，並因此主要適用於大型、集中之診斷實驗室。測試通常需4至6小時來完成，但將臨床樣本運送至集中實驗室之後勤要求意謂周轉時間最多為24小時。
因此，需一種用於檢測SARS-CoV-2的較快速且便利之測試。
發明人已使用結合至SARS-CoV-2刺突蛋白之DNA適體產生用於檢測SARS-CoV-2之基於奈米顆粒之探針。發明人發現DNA適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合誘導該等DNA適體自該等奈米顆粒分離，以在低奈米莫耳範圍內之靈敏度產生可檢測信號。
因此，在一項態樣中，本發明提供包含可分離地結合至DNA適體之奈米顆粒之組合物，該DNA適體可結合至SARS-CoV-2刺突蛋白。
在另一態樣中，本發明提供包含可分離地結合至DNA適體之奈米顆粒之組合物，該DNA適體可結合至SARS-CoV-2刺突蛋白，其中該DNA適體包含與SEQ ID NO: 1至8中之任一者具有至少90%一致性之序列之核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供包含可分離地結合至DNA適體之奈米顆粒之組合物，該DNA適體可結合至SARS-CoV-2刺突蛋白，其中該DNA適體包含與SEQ ID NO: 1至8中之任一者具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。
在一些實例中，一致性百分比存在於長度為至少約20個核苷酸、或長度為至少約30、40、50、60、70或更多個核苷酸之區域內。在一些實例中，該一致性百分比存在於列舉之整個SEQ ID NO內。
在一些實例中，DNA適體包含具有SEQ ID NO: 1至8之任一者中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 1至8之任一者中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 7具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 7中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 7中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 1具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 1中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 1中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 5具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 5中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 5中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 2中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 2中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 3具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 3中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 3中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 4具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 4中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 4中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 6具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 6中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 6中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，DNA適體包含與SEQ ID NO: 8具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 8中提供之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體由具有SEQ ID NO: 8中提供之序列之核苷酸構成。
在一些實例中，奈米顆粒係貴金屬奈米顆粒。有利地，貴金屬奈米顆粒(諸如金及銀奈米顆粒)可用以在DNA適體結合至SARS-CoV-2刺突蛋白時產生比色信號。在一些實例中，該等奈米顆粒包含金、銀、釕、銠、鈀、鋨、銥、鉑、汞、錸及銅或由其構成。在一些實例中，該等奈米顆粒包含二氧化矽或由其構成。
在一項實例中，奈米顆粒係金奈米顆粒。在一些實例中，該等奈米顆粒包含金或由其構成。
奈米顆粒可具有任何合適之尺寸。在一些實例中，該等奈米顆粒具有在5至100 nm之範圍內之平均直徑。在一些實例中，該等奈米顆粒具有在10至50 nm之範圍內之平均直徑。
在一些實例中，奈米顆粒具有在10至30 nm之範圍內之平均直徑。
在一些實例中，奈米顆粒具有約10 nm、約11 nm、約12 nm、約13 nm、約14 nm、約15 nm、約16 nm、約17 nm、約18 nm、約19 nm或約20 nm之平均直徑。
在一些實例中，奈米顆粒具有約16 nm之平均直徑。
在一些實例中，奈米顆粒具有小於30%、小於25%、小於20%或小於15%之尺寸分散度。在一些實例中，該等奈米顆粒具有小於0.3、小於0.25、小於0.2或小於0.15之多分散性指數(PDI)。
在一些實例中，奈米顆粒具有小於20%之尺寸分散度。
在一些實例中，DNA係結合至親和標籤或可檢測標記。在一些實例中，該DNA適體係經生物素化。例如，此等適體特別適用於側向流動分析中，該等分析利用固定化鏈黴親和素以捕獲該等適體。
在一些實例中，DNA適體係於其5’端處經生物素化。
在一些實例中，DNA適體係吸附至奈米顆粒之表面上。DNA適體可通過與該適體中之DNA鹼基之金屬配位相互作用吸附至奈米顆粒表面上。該適體與該奈米顆粒之間的此相互作用可經本身結合至該適體之SARS-CoV-2刺突蛋白破壞，藉此分離該適體與該奈米顆粒。在一些實例中，該適體與該奈米顆粒之分離產生可檢測信號。例如，該可檢測信號可為由於該等奈米顆粒在自該DNA適體分離後聚集而產生之顏色變化(例如，溶液之顏色變化)。
在一些實例中，組合物包含： i)結合至第一多核苷酸連接子之奈米顆粒；及 ii)結合至第二多核苷酸連接子之奈米顆粒， 其中該DNA適體包含與該第一多核苷酸連接子雜交之區域及與該第二多核苷酸連接子雜交之區域。在此等實例中，該DNA適體藉由與各結合至不同奈米顆粒之兩個連接子雜交而與該等奈米顆粒一起聚集。一經結合至SARS-CoV-2，該DNA適體即自該等連接子分離(且因此亦自該等奈米顆粒分離)並誘導該等奈米顆粒解聚。在此情況下，例如，該可檢測信號可為由該等奈米顆粒解聚引起之顏色變化(例如，溶液之顏色變化)。該顏色變化可為與上文實例相反之顏色變化，其中該DNA適體吸附至該奈米顆粒表面上。
在一些實例中， i)第一及第二多核苷酸連接子係經硫醇化； ii)奈米顆粒係金奈米顆粒；及 iii)該第一及第二多核苷酸連接子係經由硫醇-金鍵結合至該等金奈米顆粒。
在一些實例中，第一多核苷酸連接子或第二多核苷酸連接子係經生物素化。
在一些實例中，DNA適體包含未與第一多核苷酸連接子或第二多核苷酸連接子雜交之區域。有利地，此確保該適體將優先與SARS-CoV-2刺突蛋白結合，因此誘導金奈米顆粒解聚用於信號檢測。在一些實例中，未與該第一多核苷酸連接子或該第二多核苷酸連接子雜交之區域具有在5至50個核苷酸、或10至30個核苷酸之範圍內之長度。
在一些實例中，第一多核苷酸連接子及第二多核苷酸連接子具有在10至20個核苷酸之範圍內之長度。在一些實例中，該第一多核苷酸連接子及該第二多核苷酸連接子具有在13至16個核苷酸之範圍內之長度。
在一些實例中，與第一多核苷酸連接子雜交之DNA適體區域具有在5至20個核苷酸、或5至15個核苷酸、或7至12個核苷酸之範圍內之長度。在一些實例中，與第二多核苷酸連接子雜交之DNA適體區域具有在5至20個核苷酸、或5至15個核苷酸、或7至12個核苷酸之範圍內之長度。
在一些實例中，第一多核苷酸連接子包含具有SEQ ID NO: 9中提供之序列之核苷酸及/或第二多核苷酸連接子包含具有SEQ ID NO: 10中提供之序列之核苷酸。
在一些實例中，第一多核苷酸連接子包含相對於SEQ ID NO: 9具有不超過5、不超過4、不超過3、不超過2、或不超過1個核苷酸變化之序列之核苷酸。
在一些實例中，第二多核苷酸連接子包含相對於SEQ ID NO: 10具有不超過5、不超過4、不超過3、不超過2、或不超過1個核苷酸變化之序列之核苷酸。
在一些實例中，本文揭示之組合物係水溶液。
在一些實例中，可分離地結合至DNA適體之奈米顆粒係以在200至500 nM之範圍內之濃度存在。在一些實例中，可分離地結合至該DNA適體之該等奈米顆粒係以在200至400 nM、或250至350 nM之範圍內之濃度存在。在一些實例中，該等奈米顆粒係以約300 nM之濃度存在於溶液中。
在一些實例中，組合物進一步包含鹽。在一些實例中，該鹽係以在缺乏DNA適體之情況下足以誘導奈米顆粒聚集之濃度存在。在一些實例中，該鹽係以在50至400 mM、100至300 mM、或150 mM至200 mM之範圍內之濃度存在。在一些實例中，該鹽係以在100至700 mM、或200至600 mM、或300至500 mM之範圍內之濃度存在。
在一些實例中，DNA適體係以在200至500 nM之範圍內之濃度存在。在一些實例中，該DNA適體係以在200至400 nM、或250至350 nM之範圍內之濃度存在。在一些實例中，該等奈米顆粒係以約300 nM之濃度存在於溶液中。
在一些實例中，先前針對一批適體測定或最佳化DNA適體之濃度。
在一些實例中，組合物進一步包含氯化鈉。在一些實例中，該組合物進一步包含在50至500 mM之範圍內之濃度之氯化鈉。在一些實例中，該組合物進一步包含在50至400 mM、100至300 mM、或150 mM至200 mM之範圍內之濃度之氯化鈉。在一些實例中，該組合物進一步包含約170 mM之濃度之氯化鈉。
在一些實例中，組合物進一步包含在100至700 mM之範圍內之濃度之氯化鈉。在一些實例中，該組合物進一步包含在200至600 mM、300至500 mM、或350 mM至450 mM之範圍內之濃度之氯化鈉。在一些實例中，該組合物進一步包含約400 mM之濃度之氯化鈉。
在一些實例中，先前針對一批適體測定或最佳化氯化鈉之濃度。
在一些實例中，先前針對一批適體測定或最佳化DNA適體及氯化鈉之濃度。
在一些實例中，組合物係乾燥組合物。在一些實例中，該組合物係在撐體上乾燥。例如，如本文描述，該組合物可在側向分析流動裝置之結合區上乾燥。在一些實例中，該撐體包含玻璃纖維、聚酯、纖維素或人造絲。
發明人已發現本文揭示之組合物對檢測SARS-CoV-2刺突蛋白特別有效。因此，本發明亦提供一種用於在樣本中檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之方法，其包括使該樣本與本文揭示之組合物接觸，其中該SARS-CoV-2刺突蛋白對該DNA適體之結合誘導該DNA適體自奈米顆粒分離，藉此產生指示該樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白之可檢測信號。
如熟習此項技術者將直接認知，本文揭示之組合物可用以在受試者中診斷SARS-CoV-2感染，其中來自該受試者之樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白指示SARS-CoV-2感染。因此，本發明亦提供一種用於在受試者中診斷SARS-CoV-2感染之方法，其包括使來自該受試者之樣本與本文揭示之組合物接觸，其中SARS-CoV-2刺突蛋白對該DNA適體之結合誘導該DNA適體自該等奈米顆粒分離，藉此產生指示SARS-CoV-2感染之可檢測信號。
在一些實例中，可檢測信號係比色信號。在一些實例中，該比色信號係顏色變化。在一些實例中，該比色信號係顏色強度增加。在一些實例中，該比色信號係顏色強度降低。
在一些實例中，可檢測信號係視覺檢測。在一些實例中，該可檢測信號係使用分光光度計檢測。
在一些實例中，該方法係在溶液中進行。例如，本文揭示之組合物可在容器中於溶液中與樣本混合。
在一些實例中，該方法包括量測溶液之吸光度。在一些實例中，該等方法包括獲得在350 nm至750 nm波長之間之吸收光譜。
在一些實例中，該方法包括在590 nm至650 nm之範圍內之波長下及/或在500 nm至540 nm之範圍內之波長下量測溶液之吸光度。在一些實例中，該等方法包括在610 nm之波長下及/或在520 nm之範圍內之光波長下量測該溶液之吸光度。在一些實例中，該等方法包括在645 nm之波長下及/或在525 nm之範圍內之光波長下量測該溶液之吸光度。
在一些實例中，可檢測信號係溶液之吸光度在590 nm至650 nm之範圍內之波長下增加及/或溶液之吸光度在500 nm至540 nm之範圍內之波長下降低。例如，此將在適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合誘導奈米顆粒聚集之實例中(例如，當該適體最初吸附至該等奈米顆粒表面上時)發生。
在一些實例中，可檢測信號係溶液之吸光度在590 nm至650 nm之範圍內之波長下降低及/或溶液之吸光度在500 nm至540 nm之範圍內之波長下增加。例如，此將在適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合誘導奈米顆粒解聚之實例中(例如，當該適體經由多核苷酸連接子結合至該等奈米顆粒時)發生。
在一些實例中，可檢測信號係溶液之吸光度在610相較於520 nm之波長下之比率增加。例如，若對照溶液在610 nm下之吸光度係0.1 AU及該對照溶液在520 nm下之吸光度係0.4，則該比率將係0.1/0.4，其等於0.25。在此假設之情況下，若該溶液(即，包含本文揭示之組合物之溶液)在其與樣本接觸後，在610 nm下具有0.15 AU之吸光度及在520 nm下具有0.3 AU之吸光度，則該比率將係0.5，其相對於該對照溶液之比率增加指示該樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白(且因此病毒)。
在一些實例中，可檢測信號係溶液之吸光度在645相較於525 nm之波長下之比率增加。
在一些實例中，該方法包括在590 nm至650 nm之範圍內之波長下及在500 nm至540 nm之範圍內之波長下量測溶液之吸光度，其中相對於對照溶液，在590 nm至650 nm之範圍內之波長下之吸光度與在500 nm至540 nm之範圍內之波長下之吸光度之比率增加指示存在SARS-CoV-2刺突蛋白或SARS-CoV-2感染。
在一些實例中，該方法包括在610 nm及520 nm之波長下量測溶液之吸光度，其中相對於對照溶液，在610 nm對520 nm下吸光度比率之增加指示存在SARS-CoV-2刺突蛋白或SARS-CoV-2感染。
在一些實例中，該方法包括在645 nm及525 nm之波長下量測溶液之吸光度，其中相對於對照溶液，在645 nm對525 nm下吸光度比率之增加指示存在SARS-CoV-2刺突蛋白或SARS-CoV-2感染。
在一些實例中，使用機器學習演算法評估可檢測信號。在一些實例中，使用機器學習演算法評估該可檢測信號以確定樣本中是否存在SARS-CoV-2刺突蛋白。此演算法使用訓練資料(即，來自已知存在或缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白之樣本)中觀察到之可檢測信號之間的關係來推斷然後用以預測未知樣本是否含有SARS-CoV-2刺突蛋白之關係。因此，該機器學習演算法可用以基於產生之可檢測信號(例如，吸收光譜)，預測該樣本中是否存在SARS-CoV-2刺突蛋白。因此，在一些實例中，在350 nm至750 nm之波長之間獲得吸收光譜並使用機器演算法評估該吸收光譜以確定是否存在或缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白。在一些實例中，用包含來自已知存在或缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白之樣本之可檢測信號之資料集訓練該機器學習演算法。
在一些實例中，對照溶液係除該對照溶液尚未與包含SARS-CoV-2刺突蛋白之樣本接觸外，等同於已與樣本接觸之溶液之溶液。在一些實例中，該對照溶液所包含的可分離地結合至DNA適體之奈米顆粒的濃度係與已與該樣本接觸之溶液之濃度相同或相似。在一些實例中，該對照溶液所包含的鹽的濃度係與已與該樣本接觸之溶液之濃度相同或相似。
在溶液中進行之方法之一些實例中，在99%信賴度下SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限係小於20 nM。
在溶液中進行之方法之一些實例中，該方法之靈敏度係大於70%。測定靈敏度之方法對熟習此項技術者而言將顯而易見及/或經本文描述並包括，例如，使用RT-PCR之循環臨限(Ct)值。在一些實例中，在32之Ct值下，在溶液中進行之方法之靈敏度係至少75%。在另一實例中，在28之Ct值下，在溶液中進行之方法之靈敏度係至少75%。例如，在28至29之Ct值下，該靈敏度係約77%，諸如在28.3之Ct值下係77.6%。在其他實例中，在26之Ct值下，在溶液中進行之方法之靈敏度係至少90%。
在一些實例中，該等方法係使用側向流動分析進行。本文描述適用於側向流動分析之裝置及方法。
在一些實例中，將樣本施加至側向流動分析裝置上之樣本區。然後該樣本可流動通過該樣本區，進入包含本文揭示之組合物之結合區內(藉此使該樣本與本文揭示之組合物接觸)，及然後施加至檢測區上用於信號檢測。在其他實例中，該樣本在溶液中與本文揭示之組合物接觸(即，與該側向流動分析裝置分開)。隨後，可將包含檢測區之側向流動分析裝置直接「浸入」所得溶液內用於信號檢測。
在使用側向流動分析裝置進行之方法之一些實例中，在99%信賴度下SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限係小於75 nM。
在一些實例中，該等方法係使用比色皿及分光光度計進行方法。
在一些實例中，樣本係唾液樣本。在一些實例中，該樣本係口腔拭子。在一些實例中，該樣本係鼻拭子。在一些實例中，該樣本係咽拭子。其他合適之樣本對熟習此項技術者而言將係顯而易見的。
發明人已發現，當使用唾液作為樣本時，若該唾液在與本發明之組合物接觸前係經稀釋，則本文揭示之方法係經改良。因此，在一些實例中，當與本文揭示之組合物接觸時，將該唾液以至少1:50、至少1:100、至少1:250、至少1:500、至少1:1000、或至少1:5000之因子稀釋於水溶液中。
在一些實例中，將唾液以約1:600之因子稀釋於水溶液中。
在一些實例中，將唾液以在1:100至1:10,000之範圍內之因子稀釋於水溶液中。在一些實例中，將該唾液以在1:600至1:10,000之範圍內之因子稀釋於水溶液中。在一些實例中，將該唾液以在1:500至1:5,000之範圍內之因子稀釋於水溶液中。在一些實例中，將該唾液以約1:1000之因子稀釋於水溶液中。在一些實例中，將該唾液以約1:5000之因子稀釋於水溶液中。
在一些實例中，將包含唾液樣本之水溶液離心，然後與本文揭示之組合物接觸。在一些實例中，將包含該唾液樣本之水溶液過濾，然後與本文揭示之組合物接觸。
發明人亦發現當在獲得唾液樣本前受試者使用漱口水時，本文揭示之方法係經進一步改良。因此，在一些實例中，在受試者已使用漱口水後，自該受試者獲得唾液。在一些實例中，所用漱口水之體積係在10至30 mL之範圍內。因此，在一些實例中，在受試者已使用漱口水後30 min內，自該受試者獲得唾液。因此，在一些實例中，在受試者已使用漱口水後15 min內，自該受試者獲得唾液。因此，在一些實例中，在受試者已使用漱口水後5 min內，自該受試者獲得唾液。
在一些實例中，漱口水包含醇，諸如乙醇。在一些實例中，該漱口水包含一或多種精油。在一些實例中，該漱口水包含薄荷醇、百里酚、水楊酸甲酯及/或桉葉油素。該漱口水可包含其他合適之成分，諸如山梨醇、泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆407)、苯甲酸、氯化鋅、蔗糖素及/或糖精。
在一些實例中，漱口水包含在20%至30%之範圍內之濃度之乙醇。在一些實例中，該漱口水包含在0.05%至0.15%之範圍內之濃度之桉葉油素，在0.01%至0.1%之範圍內之濃度之薄荷醇，在0.01%至0.1%之範圍內之濃度之水楊酸甲酯，及在0.01%至0.1%之範圍內之濃度之百里酚。
在一些實例中，漱口水不包含醇。例如，該漱口水不含酒精。
在一些實例中，受試者在使用漱口水後已用水沖洗其等口腔。在一些實例中，所用水之體積係在10至30 mL之範圍內。在一些實例中，該受試者在使用該漱口水後已用水沖洗其等口腔一或多次。例如，該受試者在使用該漱口水後已用水沖洗其等口腔至少3次。
在一些實例中，受試者係人類。其他非人類動物亦係適用於本文揭示之方法之受試者。
本發明亦提供一種用於在樣本中檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之套組，該套組包含本文揭示之組合物。本發明亦提供一種用於診斷SARS-CoV-2感染之套組，該套組包含本文揭示之組合物。
在一些實例中，套組包含於溶液中之本發明之組合物。例如，在一些實例中，該套組包括包含該溶液之容器。在一些實例中，該套組包括包含該溶液之兩個或更多個容器。例如，一個容器之溶液可用作對照溶液，及其他一或多個容器可用於使本發明之組合物與樣本接觸。
在一些實例中，該容器係適用於量測該容器中溶液之吸光度。在一些實例中，該容器係比色皿。
在一些實例中，套組進一步包含分光光度計。有利地，此等套組容許由受試者在護理點環境之溶液中檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之存在(或SARS-CoV-2感染之診斷)，而無需將該樣本送回至集中實驗室。在一些實例中，該分光光度計係掌上型分光光度計及/或可攜式分光光度計。
在一些實例中，套組包含陽性對照。例如，該套組包含重組SARS-CoV-2刺突蛋白及/或經純化之SARS-CoV-2刺突蛋白溶液。在一項實例中，包含陽性對照之套組包括包含重組SARS-CoV-2刺突蛋白及/或經純化之SARS-CoV-2刺突蛋白溶液之容器。
在一些實例中，套組包含陰性對照。例如，該套組包含未與樣本接觸及/或尚未與樣本接觸之本文揭示之組合物。
在一些實例中，套組包含漱口水之容器。本文描述合適之漱口水溶液。
在一些實例中，套組包含移液管。在一些實例中，該移液管適用於分配固定體積。在一些實例中，該移液管適用於分配固定體積之唾液。此等移液管適用於轉移及/或稀釋唾液樣本。
在一些實例中，套組包含在本文描述之任何方法中使用本文揭示之套組及/或組合物之說明書。
本發明亦提供一種用於在樣本中檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之側向流動分析套組，該套組包含本文揭示之組合物及側向流動分析裝置。
在一些實例中，側向流動分析套組包含於溶液中之本發明之組合物。
在一些實例中，側向流動分析套組包含於溶液中之本發明之組合物，及側向流動分析裝置包括包含測試區及對照區之檢測區。因此，在該側向流動分析套組之一些實例中，向該套組中之側向流動分析裝置單獨提供本發明之組合物。
在一些實例中，測試區包含結合至DNA適體之化合物。在一些實例中，該測試區包含固定化鏈黴親和素。此等測試區適用於該適體或多核苷酸連接子係經生物素化之實例中。
在一些實例中，對照區包含結合至奈米顆粒之化合物。在一些實例中，該對照區包含固定化聚(二烯丙基二甲基氯化銨) (PDDA)。
在一些實例中，側向流動分析裝置進一步包含與檢測區流體連通且在其下游之吸收區。
本文揭示之組合物亦可整合至側向流動分析裝置內。因此，本發明亦提供一種用於在樣本中檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之側向流動分析裝置，該裝置包含本文揭示之組合物。
在一些實例中，裝置包含在撐體上乾燥之本發明之組合物。
在一些實例中，裝置包含流體連通之下列組件： i)樣本區； ii)在該樣本區下游之結合區；及 iii)在結合物釋放區下游之檢測區， 其中該結合區包含本發明之組合物且其中該檢測區包含測試區及對照區。
除非另有明確規定，否則本文本發明之任何實例應視為准用於本發明之任何其他實例。例如，本發明之組合物之實例同樣適用於本發明之方法、套組及裝置，且反之亦然。此外，除非內文另有要求，否則本發明之任何實例可與本文提供之任何其他實例組合。
序列表之關鍵  SEQ ID NO: 1 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體1 SEQ ID NO: 2 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體2 SEQ ID NO: 3 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體3 SEQ ID NO: 4 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體4 SEQ ID NO: 5 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體5 SEQ ID NO: 6 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體6 SEQ ID NO: 7 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體7 SEQ ID NO: 8 - SARS-CoV-2刺突蛋白DNA適體8 SEQ ID NO: 9 - DNA連接子1 SEQ ID NO: 10 - DNA連接子2
相關申請案資料 本申請案主張2020年8月18日申請之標題為「Compositions and methods for detecting SARS-COV-2 spike protein」之澳大利亞專利申請案第2020902948號及2021年1月22日申請之標題為「Compositions and methods for detecting SARS-COV-2 spike protein」之澳大利亞專利申請案第2021900143號之優先權。兩個申請案之全部內容均以引用之方式併入本文中。
序列表 本申請案與呈電子形式之序列表一起提交。該序列表之全部內容係以引用之方式併入本文中。
概要  在整個本說明書中，除非另有明確規定或內文另有要求，否則對單個步驟、標的組合物、步驟組或標的組合物組之參考應視為包含彼等步驟、標的組合物、步驟組或標的組合物組中之一及複數者(即一或多者)。
熟習此項技術者應知曉除彼等本文明確描述者外，本發明易受變化及修飾影響。應瞭解本發明包括所有此等變化及修飾。本發明亦個別或共同包括本說明書中提及或指示之步驟、特徵、組合物及化合物中之所有，及該等步驟或特徵之任何及所有組合或其等中之任兩者或更多者。
本發明之範疇不受本文描述之特定實例限制，該等實例僅旨在用於例示之目的。功能等效之產品、組合物及方法顯然於本發明之範疇內。
除非另有明確定義，否則本文使用之所有技術及科學術語應視為具有與如一般技術者(例如，分子生物學、免疫組織化學、蛋白質化學及生物化學中之一般技術者)通常瞭解之含義相同之含義。
除非另有指示，否則熟習此項技術者熟知，本發明中利用之技術係標準程序。此等技術在整個參考文獻中描述並解釋，參考文獻來源於(諸如) J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley及Sons (1984)、J. Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown (編者), Essential Molecular Biology: A Practical Approach，第1及2卷，IRL Press (1991)、D.M. Glover及B.D. Hames (編者), DNA Cloning: A Practical Approach，第1至4卷，IRL Press (1995及1996)，及F.M. Ausubel等人(編者), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates及Wiley-Interscience (1988，包括迄今為止之所有更新)、Ed Harlow及David Lane (編者) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)，及J.E. Coligan等人(編者) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (包括迄今為止之所有更新)。
術語「及/或」，例如，「X及/或Y」應瞭解為意謂「X及Y」或「X或Y」且應視為向兩種含義或為任一含義提供明確支援。
一般而言，術語「約」及「大約」意謂如由一般技術者確定，於指定值可接受之誤差範圍內。因此，如本文使用，除非另有明確規定，否則術語「約」係指該指定值的+/- 20%，或較佳+/- 10%，或更佳+/- 5%。
如本發明中使用，除非內文另有明確規定，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個參考物，且可與「至少一個」及「一或多個」互換使用。因此，對「DNA適體」之參考可包括適體之混合物，及類似物。
在整個本說明書中，應瞭解字組「包含(comprise)」或變化(諸如「包含(comprises)」或「包含(comprising)」)意謂包括規定元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟組，但不排除任何其他元件、整數或步驟，或元件、整數或步驟組。
選定定義  如本文使用，術語「核苷酸」係指去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其修飾形式，及其類似物。核苷酸包括包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黃嘌呤、鳥嘌呤，及其等衍生物及類似物)及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，及其等衍生物及類似物)之物質。如本文使用，「核酸」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」可互換使用以係指核苷酸之聚合物且包括此類核酸、寡核苷酸及多核苷酸之DNA、RNA、DNA/RNA雜合體及修飾，其中包括各種實體或部分對任何位置之核苷酸單元之結合。術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」包括雙股或單股份子及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸及多核苷酸係比術語適體更廣泛之術語，且因此，術語核酸、寡核苷酸及多核苷酸包括核苷酸之聚合物，其等係適體但術語核酸、寡核苷酸及多核苷酸不限於適體。「多核苷酸連接子」係通過非共價及/或共價鍵將一個分子連接至另一分子之多核苷酸。例如，在一些實例中，本文描述之DNA適體可經由結合至金奈米顆粒之多核苷酸連接子可分離地結合至該等金奈米顆粒。
術語「蛋白質」應視為包括單個多肽鏈，即，一系列由肽鍵連接之連續胺基酸或一系列彼此共價或非共價連接之多肽鏈(即，多肽複合物)。例如，該等多肽鏈系列可使用合適之化學或二硫鍵共價連接。非共價鍵之實例包括氫鍵、離子鍵、凡得瓦爾力及疏水相互作用。在一些實例中，該蛋白質係融合蛋白質。
術語「SARS-CoV-2」係指嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2，其係引起冠狀病毒疾病2019 (COVID-19)之冠狀病毒之毒株。SARS-CoV-2先前由其臨時名稱，2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)提及，且亦稱為人類冠狀病毒2019 (HCoV-19或hCoV-19)。SARS-CoV-2係在人類中傳染之巴爾的摩IV類正義單股RNA病毒。美國國立衛生研究院已將其描述為SARS-CoV-1 (引起2002-2004 SARS爆發之毒株)之接替物。
「SARS-CoV-2刺突蛋白」係SARS-CoV-2病毒體表面上存在之跨膜蛋白。其亦稱為「刺突醣蛋白」、「S蛋白」、「S醣蛋白」及「E2」。該SARS-CoV-2刺突蛋白含有三個區段：大胞外域、單通道跨膜錨及短細胞內尾。該胞外域由受體結合次單元S1及膜融合次單元S2構成。該SARS-CoV-2刺突蛋白係具有三個S1頭及三聚體S2莖之丁香形三聚體。在病毒進入期間，S1結合至宿主細胞表面上之受體用於病毒附著，及S2融合該宿主及病毒膜，容許病毒基因體進入宿主細胞內。在一些實例中，本文描述之DNA適體結合至該SARS-CoV-2刺突蛋白之受體結合域。
如本文使用，術語「結合(binding或binds或bound)」係指由化學相互作用(諸如靜電力、氫鍵及疏水效應)驅動之兩個分子之間的物理接觸。兩個分子可根據該等分子之間化學相互作用之類型共價或非共價結合。同樣，兩個分子可直接結合在一起或其等可經由另一分子間接結合。在一些實例中，本文描述之DNA適體直接結合至金奈米顆粒。在其他實例中，該DNA適體間接結合至該金奈米顆粒。「可結合」另一分子之分子係對其他分子具有親和力者，當其等接觸時，藉助於其結構，給予其結合至其他分子之能力。
術語「可分離地結合」係指兩個分子結合在一起但可由一些其他分子或作用於該等兩個分子上之力分離之狀態。例如，本文描述之DNA適體可藉由通過與DNA鹼基之金屬配位相互作用吸附至奈米顆粒表面上結合至金奈米顆粒。該適體與該奈米顆粒間之此相互作用可由SARS-CoV-2刺突蛋白破壞，其本身結合至該適體，藉此分離該適體及該奈米顆粒。
「接觸」係根據其普通之一般含義使用且係指容許至少兩個不同實體(例如適體及蛋白質)變得足夠近以反應、相互作用或物理接觸之過程。然而，應知曉所得反應產物可由添加試劑間之反應或由反應混合物中可產生之來自該等添加試劑中之一或多者之中間體直接產生。接觸可包括容許兩個實體反應、相互作用或物理接觸，其中該等兩個實體可為本文揭示之組合物及樣本(例如，疑似含有SARS-CoV-2刺突蛋白之樣本)。
「撐體」係指具有分子可直接或間接結合之表面之任何受質。該撐體可包括可為本文描述之組合物提供物理支撐之任何受質材料。該等材料可天然生成、合成，或天然生成之材料之修飾。合適之撐體材料可包括玻璃纖維、聚酯、纖維素、人造絲、矽、矽晶圓晶片、石墨、鏡像表面、層板、膜、陶瓷、塑膠(包括聚合物，諸如，舉例而言，聚(氯乙烯)、環烯烴共聚物、瓊脂糖凝膠或珠、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(對苯二甲酸乙二醇酯)、聚四氟乙烯(PTFE或Teflon®)、耐綸、聚(丁酸乙烯酯))、鍺、砷化鎵、金、銀、朗謬-布洛傑膜(Langmuir Blodgett film)、流控晶片(flow through chip)等，本身單獨使用或結合其他材料一起使用。可考慮另外剛性材料(諸如玻璃)，其包括二氧化矽且進一步包括(例如)可用作生物玻璃之玻璃。可採用之其他材料包括多孔材料，諸如，例如而言，控孔玻璃珠、交聯珠狀Sepharose®或瓊脂糖樹脂，或交聯雙丙烯醯胺及氮代內酯之共聚物。
「診斷(Diagnosis)」或「診斷(diagnosing)」在本發明之內文中係關於在受試者中識別及(早期)檢測疾病或臨床病症(例如，病毒感染)且亦可包含鑑別診斷。在某些實例中，術語「診斷」亦可包含疾病或臨床病症之嚴重程度之評估。根據本發明，來自受試者之樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白指示該受試者中之SARS-CoV-2感染。因此，本發明之組合物及方法可用以診斷SARS-CoV-2感染。
如本文使用，術語「受試者」應視為意謂包括人類之任何動物(例如哺乳動物)。例示性受試者包括(但不限於)人類及非人類靈長類動物。在一項實例中，該受試者係人類。
適體  適體(亦稱為「核酸配體」)係特徵在於以高特異性及高親和力結合至靶分子之能力之核酸分子。
給定標靶之適體(包括本發明之彼等)可藉由指數富集配體之系統進化(SELEX™)方法識別及/或產生。適體及SELEX描述於Tuerk及Gold (Science, 1990, 249:505-10)及W091/19813中。
一般而言，適體可為DNA或RNA分子且可為單股或雙股。適用於本發明之組合物及方法中之適體較佳係DNA適體。如本文使用，術語「DNA適體」係指包含DNA或包含來源於DNA鹼基序列之經修飾骨架核酸(諸如PNA)之適體。在一些實例中，該適體係單股DNA適體。該適體可包含經化學修飾之核酸，例如其中糖及/或磷酸酯及/或鹼基係經化學修飾。此等修飾可改良該適體之穩定性或使該適體更耐降解且可於核糖之2'位置包括修飾。
適體可藉由熟習此項技術者熟知的方法合成。例如，適體可(例如)於撐體上化學合成。固相合成可使用亞磷醯胺化學。簡而言之，將固體支撐之核苷酸去三苯甲基化，然後與經適當活化之核苷亞磷醯胺偶合以形成亞磷酸三酯鍵。然後可發生封端，接著用氧化劑(通常碘)氧化亞磷酸三酯。然後可重複該循以組裝該適體。
可認為適體係單株抗體之核酸等效物且通常具有在例如小於500 nM、100 nM、50 nM、10 nM、1 nM、500 pM、100 pM中之一者之nM或pM範圍內之Kd。與單株抗體一樣，其等實際上可適用於需靶向結合之任何情況，包括活體外或活體內，用於治療及診斷應用中。活體外診斷應用可包括用以檢測靶分子(諸如SARS-CoV-2刺突蛋白)之存在或缺乏。根據本發明使用之適體可以純化或分離形式提供。
根據本發明之適體可視需要具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸中之一者之最小長度。
根據本發明之適體可視需要具有40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個核苷酸中之一者之最大長度。
根據本發明之適體在長度上可含有約30至80個核苷酸(nts)。在一些實例中，該適體係約40至80 nts、40至65 nts、45至55 nts、50至80 nts、60至80 nts或70至80 nts。在一些實例中，包含核酸基序之核酸適體係約30至70 nts、30至65 nts、30至62 nts、30至60 nts、30至50 nts或30至40 nts。在一些特定實例中，該等適體之長度可在約45 nts至約55 nts之範圍內。
根據本發明之適體可視需要具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80個核苷酸中之一者之長度。
可使用許多分析以定性或定量檢測或量測適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合。例如，可使用酶聯吸附分析(ELASA)。可使用涉及擴增結合適體(例如，qPCR)或來自適體結合病毒之RNA (例如，qRT-PCR)之分析。可使用如美國專利第5,853,984號中描述之流式細胞分析技術方法。
如WO 2011/061351中描述可使用微陣列、BIAcore分析、差速離心、層析術、電泳、免疫沈澱、光學生物感測器及其他表面電漿子共振分析。可使用之其他分析係熱量分析及點狀墨點分析。此外，正如酶聯免疫吸附分析(ELISA)適用於該ELASA分析中之適體一樣，任何其他涉及冠狀病毒刺突蛋白結合抗體之分析亦可適用於與本文揭示之DNA適體一起使用以代替該等抗體。此等分析包括免疫測定分析諸如放射免疫分析、流式細胞分析技術分析、印漬應用(blotting application)、各向異性、膜分析、生物感測器，及類似物。亦可使用此項技術中已知的任何其他分析或該等分析適用於檢測或量測DNA適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合。本文描述用於檢測DNA適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合之例示性方法。
「結合親和力」描述分子彼此結合或親和力之強度之量度。本文適體對SARS-CoV-2之結合親和力根據解離常數(Kd)或平衡解離常數(KD)定義。該解離常數可藉由此項技術中已知的方法測定並可甚至針對複合混合物藉由方法計算，諸如彼等(例如) Caceci, M.等人，Byte (1984) 9:340-362中闡述之方法。
量測解離常數之實例描述(例如)於美國專利第7,602,495號(其描述表面電漿子共振分析)、美國專利第6,562,627號、美國專利第6,562,627號及US 2012/00445849中。在另一實例中，使用雙式濾器硝化纖維素過濾器結合分析建立解離常數，諸如由Wong及Lohman, (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432揭示之分析。
或者或另外，用於SARS-CoV-2刺突蛋白之競爭性結合分析可關於已知結合標靶或候選物之物質進行。在理想條件下，發生50%抑制時之濃度值(K)等於KD。K值亦可用以證實本發明之適體結合SARS-CoV-2刺突蛋白。
在一些實例中，本文描述之適體以低於100 nM、低於50 nM、低於40 nM、低於30 nM、低於20 nM、低於10 nM或低於5 nM之解離常數(Kd)結合至SARS-CoV-2刺突蛋白。在此內文中，術語「較低」係指Kd之較低數值，其對應於較高之結合親和力。
在一些實例中，適體特異性結合至SARS-CoV-2刺突蛋白。例如，該適體可以比其結合至另一不同冠狀病毒刺突蛋白更高之親和力結合至SARS-CoV-2刺突蛋白。
本文揭示之DNA適體可具有促進優先結合至SARS-CoV-2之離散核酸結構。DNA之一級序列係一維特異性核苷酸串(A、C、G或T)。該一級序列規定該適體之三維構型。
DNA片段之二級結構由特異性核苷酸之間的二維接觸表示。二級結構可包含華生/克裡克鹼基對(A:T及C:G)及其他穩定較低之鹼基對(例如，G:T、A:C、G:A及T:T)。二級結構包括莖環、對稱及非對稱凸起、假結，及其組合。在一些情況下，此等結構可在不超過約30個核苷酸之核酸序列中形成。當一級序列中距離較遠且不認為通過華生/克裡克及非華生/克裡克鹼基對相互作用之核苷酸實際上相互作用時，此等相互作用(其等通常以二維繪示)亦為該二級結構之部分。
DNA分子之三級結構係DNA原子在空間中之描述。適體之一級序列限制可能之三級結構，固定之二級結構同樣如此。本文揭示之DNA適體具有三維結構，該等結構包含一組DNA基序及二級結構，其等賦予該適體結合SARS-CoV-2之能力。DNA二級及三級結構包括可能概括描述核酸化合物可形成之最穩定之構象組之所有方式。
奈米顆粒  如本文使用，術語「奈米顆粒」係指直徑介於約1 nm至1000 nm之間(例如大於約1 nm)的顆粒。如熟習此項技術者將瞭解，顆粒係三維的。該等奈米顆粒可具有任何合適之形狀，包括(但不限於)球形或半球形、立方形、棒狀、多面體、圓形或半圓形、有角、不規則等。在該等奈米顆粒不具有均勻形狀(例如，棒狀、星形、橢圓形及類似物)之情況下，三個維度中之至少兩者應在1 nm與100 nm之間。例如，認為直徑10 nm及長度大於100 nm之奈米管係奈米顆粒。
在一些實例中，奈米顆粒係球形或半球形。
在一些實例中，奈米顆粒具有小於約1000 nm、小於約900 nm、小於約800 nm、小於約700 nm、小於約600 nm、小於約500 nm、小於約400 nm、小於約300 nm、小於約200 nm、小於約100 nm、小於約75 nm、小於約50 nm、小於約30 nm或小於約20 nm之平均直徑。在一些實例中，該等奈米顆粒具有大於約10 nm、約20 nm、約30 nm、約40 nm、約50 nm、約60 nm、約70 nm、約80 nm、約90 nm、約100 nm、約200 nm、約300 nm、約400 nm或約500 nm之平均直徑。該直徑亦可以此等上限及/或下限中之任兩者之間的範圍提供。
在一些實例中，奈米顆粒具有介於約5至200 nm、10至100 nm、10至30 nm、10至20 nm、35 nm至1000 nm、35 nm至900 nm、35 nm至800 nm、35 nm至700 nm、35 nm至600 nm、35 nm至500 nm、35 nm至400 nm、35 nm至300 nm、35 nm至200 nm或35 nm至100 nm之間的平均直徑。
直徑可藉由熟習此項技術者已知的任何合適之方式量測，包括動態光散射(DLS)、雷射繞射及/或電子顯微術。
奈米顆粒可為熟習此項技術者已知的任何合適之材料。在一些實例中，自該等奈米顆粒分離DNA適體導致指示該DNA適體結合至SARS-CoV-2刺突蛋白之可檢測信號。因此，可基於所需之可檢測信號選擇合適之奈米顆粒材料。取決於使用之奈米顆粒材料，該信號可為例如比色、螢光或電化學的。
例如，在需比色信號之情況下可使用貴金屬奈米顆粒。因此，在一些實例中，該等奈米顆粒係貴金屬奈米顆粒。貴金屬包括金(Au)、銀(Ag)、釕(Ru)、銠(Rh)、鈀(Pd)、鋨(Os)、銥(Ir)、鉑(Pt)、汞(Hg)、錸(Re)及銅(Cu)。在一些實例中，該等奈米顆粒係金奈米顆粒或銀奈米顆粒。在一些實例中，該等奈米顆粒包含金或銀或由其構成。
貴金屬奈米顆粒與光之相互作用取決於其等環境、尺寸及物理尺寸。在貴金屬奈米顆粒附近傳播之光纖之振盪電場與自由電子相互作用，引起與可見光頻率共振之電子電荷之協同振盪。此等共振振盪稱為表面電漿子。例如，針對小(~30 nm)單分散金奈米顆粒，表面電漿子共振現象引起吸收光譜中藍綠色部分(~450 nm)之光，同時反射紅光(~700 nm)，產生濃鬱之紅色。隨著粒度增加，與表面電漿子共振相關之吸收波長轉移至更長、更紅之波長。然後吸收紅光並反射藍光，產生具有淡藍色或紫色之溶液。隨著粒度繼續向體積極限增加，表面電漿子共振波長移入光譜之IR部分內並反射大部分可見波長，使該等奈米顆粒呈清晰或半透明之顏色。藉由改變該等奈米顆粒之尺寸或形狀，可調整該表面電漿子共振，從而為不同應用提供具有訂製光學性質之顆粒。
當將過量鹽添加至奈米顆粒溶液時，亦觀察到此聚集顏色變化現象。該等奈米顆粒之表面電荷變為中性，使得其等聚集。因此，溶液顏色自紅色變為藍色。可利用此性質來使用本文揭示之方法。
可使用此項技術中已知的任何方法以產生適用於本文描述之組合物中之奈米顆粒。例如，已開發多種基於溶液之方法來控制尺寸(Sardar等人，AM. Chem. Soc. 2011, 133:8179-8190；Hussain等人，J. AM. Chem. Soc. 2005, 127:16398-16399；Jana等人，Langmuir. 2001, 17:6782-6786)、形狀(Grzelczak等人，Chem. Soc. Rev. 2008, 37:1783-1791)及表面功能性(Wilton-Ely JDET. Dalton Trans. 2008:25-29；Roux等人，Langmuir. 2005, 21:2526-2536；Ackerson等人，J. AM. Chem. Soc. 2005, 127:6550-6551；Daniel等人，Chem. Rev. 2004, 104:293-346)。
作為一實例，用於產生金奈米顆粒之最常見方法中之一者係最初由Turkevich等人，(Discuss. Faraday Soc. 1951, 11:55-75)開發之方法，該方法涉及在沸水中用檸檬酸處理四氯金酸氫(HAuCl 4)，其中該檸檬酸鹽充當還原劑及穩定劑兩者。此方法可藉由改變金與檸檬酸鹽之比率來控制粒度而進一步細化(Frens Nature: Phys. Sci. 1973, 241:20-22)。此方案已廣泛用以製備直徑10至40 nm之中等穩定之球形金奈米顆粒之稀釋溶液，但亦可製備更大之AuNP (例如，100 nm)。
對於關於金奈米顆粒之其他方法，參見例如Schmid, G. (編) Clusters and Colloids (V C H, Weinheim, 1994)；Hayat, M. A. (編) Colloidal Gold: Principles, Methods, and Applications (Academic Press, San Diego, 1991)；Massart, R., IEEE Transactions On Magnetics, 17, 1247 (1981)；Ahmadi, T. S.等人，Science, 272, 1924 (1996)；Henglein, A.等人，J. Phys. Chem., 99, 14129 (1995)；Curtis, A. C.等人，Angew. Chem. Int. ED. Engl., 27, 1530 (1988)。合適之金奈米顆粒可自(例如) Ted Pella, Inc. (金)、Amersham Corporation (金)、Nanoprobes, Inc. (金)購買獲得。
用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之方法及裝置  在臨床診斷、治療及/或研究之內文中基於適體對SARS-CoV-2刺突蛋白之結合，本文揭示之組合物可用於特異性、定性及/或定量檢測SARS-CoV-2病毒。例如，本文描述之組合物可用於在測試樣本中檢測SARS-CoV-2刺突蛋白，作為該測試樣本含有SARS-CoV-2病毒之指示。
如本文使用，術語「樣本」包括(但不限於)可包含SARS-CoV-2病毒之流體、可包含SARS-CoV-2病毒之溶液及獲自人類或動物受試者之生物樣本。生物樣本包括(但不限於)唾液、口腔或鼻拭子、血清、血液、尿液或呼出氣冷凝物。在某些實例中，該樣本可為新鮮的。應知曉新鮮樣本包括(但不限於)獲自受試者之樣本且在獲得該樣本後，於數分鐘內(例如，小於約5至約30分鐘)經受本文描述之方法。在某些實例中，該樣本可為儲存樣本。應知曉可已自受試者製備及/或獲得儲存樣本，且在使該樣本經受本文描述之方法之前經受儲存(例如在冷凍器或冷凍機中)。在某些實例中，可使用一種樣本，其中在用於本文描述之方法中之前，該樣本未經受任何處理(例如，稀釋、過濾、濃縮)。在其他實例中，該樣本係經處理。該樣本之處理可涉及組分之過濾、稀釋、離心、蒸餾、萃取、濃縮、固定、滅活，及類似物中之一或多者。在一些實例中，在使用前將該樣本稀釋、過濾或離心。
在一些實例中，樣本係唾液。當使用來自受試者之唾液時，在獲得該唾液樣本之前，該受試者使用漱口水(有時亦稱為「漱口液」)可為有利的。例如，可使用含酒精(例如，乙醇)漱口水。該漱口水可包含精油(諸如薄荷醇、百里酚、水楊酸甲酯及/或桉葉油素)。該漱口水可包含其他合適之成分，諸如山梨醇、泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆407)、苯甲酸、氯化鋅、蔗糖素、調味劑及著色劑、糖精等。合適之市售漱口水包括彼等在商標名「李施德林」下銷售者。在一些實例中，使用不含酒精之漱口水。
一些樣本可包含捕獲或預濃縮之SARS-CoV-2病毒或蛋白質。術語「捕獲或預濃縮」係指SARS-CoV-2病毒或蛋白質已與原始樣本大體上分離。例如，樣本可與本文揭示之適體或任何其他結合分子接觸，及結合之SARS-CoV-2病毒或蛋白質可然後與該樣本之殘餘部分大體上分離。
在一些實例中，樣本係環境樣本。術語「環境樣本」係指取自或來源於任何特定環境之樣本。例如，環境樣本可取自或來源於水(例如，淡水、鹽水、廢水及引用水)、土壤、污水、污泥，或生物體或來自生物體之組織，諸如貝類，其等係諾羅病毒之潛在儲庫。環境樣本亦可為在特定位置(諸如餐廳、遊輪、醫院、療養院、學校或其他位置)中取自或來源於特定表面或物體(「病媒」)之樣本。在某些情況下，環境樣本係取自或來源於疑似SARS-CoV-2來源之特定環境。
在一些實例中，樣本係食物樣本。術語「食物樣本」係指取自或來源於任何食物或飲料產品之樣本。此等食物或飲料產品之實例包括新鮮農產品、熟食肉類、沙拉棒、預製食品(例如，三明治、肉類沙拉、砂鍋菜)、生及熟軟體動物貝類，及高酸性食品(諸如橙汁及冷凍覆盆子)。在某些情況下，食物樣本係取自疑似SARS-CoV-2來源之食物或飲料產品。
檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之一些方法包括使樣本與本文揭示之組合物接觸，並檢測該樣本中SARS-CoV-2刺突蛋白之存在。SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測可指示SARS-CoV-2病毒之存在。
在一些實例中，在足以允許DNA適體結合至SARS-CoV-2刺突蛋白之條件及時間量下使樣本與本文揭示之組合物接觸。例如，樣本可用至少約10 nM、至少約100 nM、至少約200 nM、至少約300 nM或至少約400 nM可分離地結合至該DNA適體之奈米顆粒培養。在一些情況下，該培養可在室溫下進行。在其他情況下，該培養可在4℃下進行。在一些情況下，該培養可為過夜的。在其他情況下，該培養可為至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約20分鐘、至少約30分鐘、至少約45分鐘、至少約1小時、至少約2小時、至少約3小時、至少約4小時、至少約5小時、至少約6小時、至少約12小時或至少約24小時。在一些實例中，該培養係不超過1小時、不超過45分鐘、不超過30分鐘、不超過15分鐘或不超過10分鐘。
在一些實例中，本文描述之方法亦可包括進一步檢測除SARS-CoV-2刺突蛋白外之標靶。例如，本文揭示之組合物可另外包含或可結合一或多種優先結合至其他分子或藥劑之其他檢測化合物(例如，核酸適體、肽適體、抗體，或類似物)一起使用。其他類型之標靶包括病毒或細菌，或結合至SARS-CoV-2刺突蛋白之抗體。在一些情況下，用一或多種其他檢測化合物檢測之其他類型之病毒或細菌可在病患中引起與彼等由SARS-CoV-2感染引起者相似之症狀。可差異標記諾羅病毒結合適體及其他檢測化合物使得結合適體之檢測可指示SARS-CoV-2感染，而其他檢測化合物之結合之檢測可指示不同類型之感染或病症。
樣本中適體之結合可與對照樣本中適體之結合比較。術語「對照樣本」係指未知或疑似包括SARS-CoV-2病毒或蛋白質之樣本。此等樣本可與疑似包括SARS-CoV-2病毒或蛋白質之測試樣本、臨床樣本、環境樣本或食物樣本同時獲得，或其等可在不同場合獲得。此等樣本可獲自相同來源或不同來源。該對照樣本可為與其比較之測試樣本、臨床樣本、環境樣本或食物樣本相同類型之樣本。例如，若該臨床樣本包含唾液，則該對照樣本可包含來自非SARS-CoV-2感染受試者之唾液。在其他實例中，該對照樣本可為水、緩衝液或其他水溶液。在一些實例中，比較由本文揭示之組合物在其與該樣本接觸後產生之可檢測信號與尚未與樣本接觸之組合物，以確定是否存在SARS-CoV-2刺突蛋白。
可在多個場合評估多個測試樣本及多個對照樣本以防止與該等樣本之間的差異無關之隨機變化。然後可在該等測試樣本與該等對照樣本之間進行直接比較以確定該等測試樣本中之適體結合(即，SARS-CoV-2之存在)相對於該等對照樣本中之適體結合是否增加、減少或相同。相對於該等對照樣本，該等測試樣本中適體之增加之結合指示該等測試樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白。在一些情況下，相對於該對照樣本，增加之結合具有統計學顯著性。例如，統計學顯著性可意謂p≦0.1，p≦0.05，p≦0.01，或p≦0.001。在一些情況下，術語「增加之結合」係指由測試樣本中之適體結合產生之可檢測信號比對照樣本中信號之水平高至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍或至少約20倍。
在一些實例中，本文描述之方法係在溶液中進行。例如，如本文描述，某些奈米顆粒一經在溶液中聚集或解聚即在可見光譜中顯示顏色變化。例如，當將過量鹽添加至該奈米顆粒溶液時，金奈米顆粒在溶液中聚集。此係因為該等奈米顆粒之表面電荷變為中性，使得其等聚集。因此，該溶液顏色自紅色變化至藍色。可利用此性質來使用本文揭示之方法。例如，DNA適體在吸附至該奈米顆粒之表面時可防止該等奈米顆粒在溶液中存在鹽(例如，NaCl)之情況下聚集。然而，當該適體結合至SARS-CoV-2刺突蛋白時，該適體與該等奈米顆粒分離，藉此導致可檢測(例如，視覺或藉由分光光度法)該等奈米顆粒之聚集及該溶液之顏色變化。
在溶液中進行之方法之實例中，使樣本與包含可分離地結合至DNA適體之奈米顆粒之溶液接觸。若該樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白，則一經分離該適體與該等奈米顆粒即產生可檢測信號。針對此信號評估該溶液並與對照溶液比較。在一些實例中，該可檢測信號係顏色變化。在一些實例中，視覺檢測該顏色變化。在一些實例中，藉由分光光度法檢測該顏色變化。在一些實例中，藉由在610 nm及520 nm波長下量測該溶液之吸光度檢測該信號，其中相對於對照，610 nm對520 nm下之吸光度比率之增加指示SARS-CoV-2刺突蛋白或SARS-CoV-2感染之存在。
可使用機器學習演算法以確定樣本中是否存在SARS-CoV-2刺突蛋白。例如，可使用來自樣本(諸如「已知樣本」)之可檢測信號以「訓練」機器學習演算法。「已知樣本」係經預先分類之樣本(例如，已知存在或缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白)。來源於已知樣本中之可檢測信號並用以訓練演算法之資料可稱為「訓練資料集」。一經訓練，則該演算法可識別來源於未知樣本之資料中之模式。然後該演算法可用以將未知樣本分類，即，存在或缺乏SARS-CoV-2刺突蛋白。因此，在一些實例中，該機器學習演算法係分類模型，諸如二元分類器。
在一些實例中，本文描述之方法係以側向流動分析(LFA)形式進行。LFA (亦稱為「免疫層析條帶測試(immunochromatographic strip test)」)自1980年代中期推出以來，一直為快速免疫分析之流行平臺。
LFA特別適用於需快速測試或無法使用專業實驗室設備之情況。在醫院、診所、醫師辦公室及臨床實驗室中，基於LF之測試係用於定性及定量檢測液體樣本中特異性分析物之存在。
LFA之操作原理與酶聯免疫吸附分析(ELISA)相同。本質上，此等測試沿膜或濾紙表面運行具有反應性分子之液體樣本，根據特定分析物之存在顯示視覺上呈陽性或陰性結果。
側向流動分析裝置係經組態以於樣本區接受樣本並藉由毛細管作用使該樣本經由(例如)芯吸自該樣本區側向移動至檢測區之裝置。在某些實例中，該側向流動分析裝置進一步包含一或多個結合區，其中該側向流動分析裝置係經組態以使樣本在到達檢測區之前自樣本區側向流動至一或多個結合區。在側向流動分析裝置之相關實例中，樣本區係與結合區接觸及該結合區與檢測區之一端接觸，使得該側向流動分析裝置係經組態以容許樣本自該樣本區流動至結合區且最終至檢測區。在側向流動分析裝置之相關實例中，樣本區係與第一結合區接觸，該第一結合區係與第二結合區接觸，且該第二結合區係與檢測區之一端接觸，使得該側向流動分析裝置係經組態以容許樣本自該樣本區流動至第一結合區，接著第二結合區，且最終至檢測區。在該側向流動分析裝置之某些實例中，該裝置進一步包含與檢測區接觸之吸收區使得該裝置係經組態以容許樣本自樣本區流動至檢測區且最終至該吸收區。
側向分析裝置通常具有撐體，其上安裝可選樣本區、可選結合區、檢測區及可選吸收區。該撐體(「背襯卡」)為實際分析之墊及膜提供支撐但不額外參與該樣本及分析物之反應或流動。背襯卡係由例如聚氯乙烯(PVC)製成。該背襯卡上墊及膜通常係組裝在塑膠外殼中，然而此非必需的。該外殼於樣本墊上具有至少一個開口(「樣本埠」)用於施加該樣本。對照區及測試區係可見的(例如經由開口或視窗)以檢測或量測結合標記。該外殼可防止用戶將樣本施加至該樣本墊外之任何地方。該外殼亦用以保護條帶免受意外濺至膜上。該外殼上之外部標記亦可用以指示測試線及對照線之位置並提供其他資訊。外殼可作為現成片匣獲得或經訂製設計以安裝在該條帶周圍。內部栓釘及桿可用以將該條帶固定在相對於樣本埠及觀察窗位置。當測試條帶運行時，內部栓釘及桿使材料彼此保持流體連通。
「樣本區」(若存在)一經施加即接受樣本並促進該樣本均勻分佈於檢測區或結合區(若存在)上。其亦可影響液體進入該檢測區之速率，從而防止該裝置溢流。另外，樣本墊亦可包含另外組分(諸如蛋白質、清潔劑、增黏劑及緩衝鹽)以處理該樣本(例如在血液樣本之情況下分離樣本組分、去除干擾物、調節pH、增加黏度、溶解組分及/或防止結合物與分析物或其他組分之間或對反應膜之非特異性結合)。
「結合區」(若存在)包含經乾燥且可移動之組合物，該組合物包含本文描述之DNA適體及奈米顆粒。當樣本流入該結合區內時，結合物自結合區材料上抬起，並與該樣本前沿一起移動至檢測區內。若適用，則該結合區亦將包含經乾燥且可移動之對照結合物。
在其他實例中，LFA裝置不包含單獨之結合區。在此等實例中，樣本在沿該LFA裝置遷移之前與包含結合物探針之組合物(即，本文揭示之組合物)混合於單獨容器中。此等裝置可稱為LFA量油尺。例如，來自受試者之樣本可與本文描述之組合物在單獨容器中接觸以產生混合溶液，及然後包含檢測區之LFA裝置可浸入該溶液內使得其沿該檢測區遷移至測試區及對照區。
「檢測區」通常係包含測試區及對照區之膜，其包含不可逆結合之捕獲試劑(例如，鏈黴親和素)。通常，反應膜由聚合物(諸如硝化纖維素、聚偏二氟乙烯、耐綸或聚醚碸)製成。硝化纖維素係該反應膜之例示性選擇。硝化纖維素膜通過於蛋白質內硝酸酯之強偶極子與肽鍵之強偶極子之相互作用而靜電結合蛋白質(諸如抗體或生物素結合蛋白)。
LFA裝置亦可包含「吸收區」。該吸收區放置於檢測區之遠端並保留殘餘樣本。該吸收區通過膜芯吸流體並收集經處理之液體。此外，該吸收區增加可進入該檢測區之樣本之總體積。
適用於可包含在本文描述之側向流動分析裝置中之樣本區、結合區或檢測區之材料包括(但不限於)有機或無機聚合物，及天然及合成聚合物，包括玻璃纖維、纖維素、耐綸、交聯聚葡糖、各種層析紙及硝化纖維素。應知曉合適之材料將使樣本經由毛細管作用沿本文描述之裝置側向流動。在某些實例中，該檢測區係硝化纖維素膜。在某些實例中，樣本區及結合區可由相同材料構成。在某些實例中，側向流動分析裝置包含與檢測區毛細管接觸之樣本區。熟習此項技術者將已知合適之市售材料。市售材料可用於可包含在本文描述之側向流動分析裝置中之樣本區、結合區及/或檢測區。
側向流動分析裝置可進一步包含應用於樣本區之樣本濾膜。該樣本濾膜可由任何合適之材料組成，包括(但不限於)可自流體濾除細胞(例如血球)之疏水材料。在某些實例中，市售膜(諸如Vivid血漿分離膜或與其相似之膜)可用於本文描述之裝置中。合適之樣本膜可具有約0.22 pm至約10 pm之過濾器尺寸。在某些實例中，該樣本濾膜具有小於約10 pm、小於約5 pm、或小於約1 pm之過濾器尺寸。在某些實例中，該樣本濾膜具有約0.5 pm之尺寸。在某些實例中，該樣本濾膜具有約0.25 pm或更小之尺寸。
在一些實例中，將樣本施加至LFA裝置之樣本區及然後培養該裝置。培養包括容許將該裝置維持在一溫度例如室溫(例如約20℃至約25℃)下，使得該樣本自該樣本區流動至檢測區。在進一步包含結合區之實例中，培養包括容許將LFD維持在一溫度例如室溫(例如約20℃至約25℃)下，使得該樣本自該樣本區流動至該結合區，接著流動至該檢測區。
在一些實例中，在將樣本施加至樣本區後將LFA裝置培養約2分鐘至約20分鐘、約2分鐘至約15分鐘、或約2分鐘至約10分鐘。在某些實例中，將該LFD培養約10分鐘至約15分鐘。
在一些實例中，LFA裝置可進一步包含固定於檢測區之對照區中之控制組件。在一些實例中，該控制組件係結合至本文描述之組合物中之奈米顆粒之化合物，諸如結合至金奈米顆粒之PDDA。在相關實例中，側向流動分析裝置之檢測區係經組態使得樣本在對照區前流動通過測試區。相關實例可進一步包括檢查對照線之信號以確認側向流動分析裝置之有效操作。檢查可包括視覺確認對照線上之信號。
在某些實例中，評估包括定量量測測試區及/或對照區上捕獲之分子。在某些實例中，評估可包括半定量或定量評估測試區，例如檢測高於預定臨限值之信號。評估測試區之合適方式將取決於由測試區產生之信號。例如，評估可包括定量量測來自(例如)螢光染料或膠體金屬之信號。評估可目視進行。評估可由智慧型手機進行。在某些實例中，評估可包括使用可攜式螢光劑量計。熟習此項技術者將熟悉用於自側向流動分析裝置量測信號之市售裝置。
核苷酸序列  用於本文描述之組合物及方法中之例示性核苷酸序列提供於下表中。 表1：例示性核苷酸序列
名稱 序列 SEQ ID NO
DNA適體1 ATCCAGAGTGACGCAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACACGGTGGCTTAGT 1
DNA適體2 ATCCAGAGTGACGCAGCATCGAGTGGTGGGCTGGTCGGGTTTGGATTCCCTTAGATGCTGGACACGGTGGCTTAGT 2
DNA適體3 ATCCAGAGTGACGCAGCACTGCGTAGGCGCGGCCAATGTGTAGGATTGCTCAGGTCTGCTGGACACGGTGGCTTAGT 3
DNA適體4 ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAAAGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGGTGGCTTAGT 4
DNA適體5 ATCCAGAGTGACGCAGCAGGACTGCTTAGGATTGCGAAGCTGAGGAGCTCCCCCGCCTTGGACACGGTGGCTTAGT 5
DNA適體6 ATCCAGAGTGACGCAGCAGTAGGGGGATTGGCTCCAGGGCCTGGCTGACGGTTGCACGTGGACACGGTGGCTTAGT 6
DNA適體7 CAGCACCGACCTTGTGCTTTGGGAGTGCTGGTCCAAGGGCGTTAATGGACA 7
DNA適體8 ATCCAGAGTGACGCAGCATTTCATCGGGTCCAAAAGGGGCTGCTCGGGATTGCGGATATGGACACGT 8
DNA連接子1 CCCAGGTGTCCATTA 9
DNA連接子2 GGTGCTGTGGGAAG 10
如熟習此項技術者知曉，用於本發明之組合物及方法中之DNA適體及連接子之序列未必係表1中之精確序列。該等序列可經修飾，限制條件為該DNA適體仍可結合至SARS-CoV-2刺突蛋白。在一些實例中，該DNA適體包含與SEQ ID NO: 1至8中之任一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少98%一致性之序列之核苷酸。在一些實例中，該DNA適體包含與SEQ ID NO: 1至8中之任一者具有100%一致性之序列之核苷酸。
在其他實例中，相較於參考序列諸如SEQ ID NO: l至8中之任一者，本文描述之DNA適體可含有多達10 (例如包括多達9、8、7、6、5、4、3、2或1)個核苷酸變化。可引入此等變化之位置可基於(例如)可使用計算機演算法(諸如MfolD)預測之適體之二級結構確定。例如，雙股莖區中之鹼基對可突變為不同之鹼基對。此等突變將該鹼基對維持在雙股區中之該位置處且因此將對該適體之整體二級結構無顯著影響。熟習此項技術者熟知此類型之突變。例如，A-T對可突變為T-A對。或者，其可突變為G-C或C-G對。在另一實例中，G-C對可突變為C-G對。或者，其可突變為A-T對或T-A對。
本文描述之核苷酸序列可包括一或多個反應性部分。如本文使用，術語反應性部分包括可與另一分子(例如，核酸、如本文提供之連接子或多肽)通過共價、非共價或其他相互作用反應之任何基團。以實例說明之，該核酸可包括可與蛋白質或多肽上之胺基酸通過共價、非共價或其他相互作用反應之胺基酸反應性部分。
該術語亦包含含有已知核苷酸類似物或經修飾骨架殘基或鍵聯之核酸，其等係合成、天然生成及非天然生成的，其等具有與參考核酸相似之結合性質，且其等以類似於該等參考核苷酸之方式代謝。此等類似物之實例包括(但不限於)磷酸二酯衍生物，包括(例如)胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、硫磷酸酯(亦稱為硫代磷酸酯)、二硫代磷酸酯、膦醯基羧酸、膦醯基羧酸鹽、膦醯乙酸、膦甲酸、膦酸甲酯、膦酸硼或O-甲基亞磷醯胺鍵聯(參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press)；及肽核酸主鏈及鍵聯。其他類似物核酸包括彼等具有正主鏈；非離子主鏈、經修飾糖及非核糖主鏈(例如磷醯二胺嗎啉基寡核苷酸或鎖核酸(LNA))者，包括彼等描述於美國專利第5,235,033及5,034,506號，及第6及7章，ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook編中者。含有一或多個碳環糖之核酸亦包括於核酸之一種定義內。核糖-磷酸酯骨架之修飾可出於各種原因進行，例如，為增加此等分子在生理環境中或作為生物晶片上之探針之穩定性及半衰期。可製得天然生成之核酸及類似物之混合物；或者，可製得不同核酸類似物之混合物，及天然生成之核酸及類似物之混合物。在實例中，DNA中之核苷酸間鍵聯係磷酸二酯、磷酸二酯衍生物，或兩者之組合。
或者或另外，如本文描述之DNA適體可包含一或多個鎖核酸(LNA)。LNA係經修飾核苷酸，其中核糖部分用連接2'氧及4'碳之額外橋修飾。此橋將該核糖「鎖」在3'-內(北)構象中，該構象通常在A型雙鏈體中發現。LNA核苷酸可用於本文描述之任何DNA適體中。
測定序列一致性在兩個或更多個核苷酸序列之內文中之一致性百分比係指於該等核苷酸序列之給定區域內相同核苷酸之百分比。例如，如使用下列序列比較演算法中之一者或藉由手動比對及目視檢查量測，當於比較視窗或指定區域內針對最大對應進行比較及比對時，於該等序列之區域內或在指定時於整個序列內，兩個序列可具有(例如) 60%一致性，視需要70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%,81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性。視需要，在長度為至少約20個核苷酸之區域，長度為30、40、50、60、70或更多個核苷酸之區域內存在一致性。
針對序列比較，通常一個序列充當參考序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入計算機內，必要時指定子序列坐標，並指定序列演算法程式參數。可使用默認程式參數，或可指定替代參數。然後該序列比較演算法基於該等程式參數計算該等測試序列相對於該參考序列之序列一致性百分比。此項技術中熟知用於比較之序列比對方法。用於比較之序列之最佳比對可例如由Smith及Waterman之演算法(Adv. Appl. Math. 2:482c, 1970)、Needleman及Wunsch之比對演算法(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、藉由Pearson及Lipman之方法(Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)、藉由此等演算法之計算機化實施(例如，Wisconsin Genetics套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，Genetics Computer Group)，或藉由手動比對及目視檢查(參見例如Brent等人，Current Protocols in Molecular Biology, 2003)進行。
適用於確定序列一致性百分比及序列相似性之演算法之兩個實例係BLAST及BLAST 2.0演算法，該等演算法分別描述於Altschul等人，(Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977)；及Altschul等人，(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)中。用於進行BLAST分析之軟體可通過國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
亦可使用Meyers及Miller之演算法(Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988) (該演算法已併入ALIGN 程式(2.0版)內)，使用PAM120權重殘差表，間隙長度懲罰為12及間隙懲罰為4，測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比。另外，可使用已併入GCG套裝軟體(可於www.gcg.com獲得)中之GAP程式內之Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)演算法，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重，測定核苷酸序列之間的一致性百分比。
套組  本發明亦提供包含本文揭示之組合物及使用說明之套組。此等套組可用於(例如)進行上文描述之檢測及診斷方法。套組亦可包括標籤。套組通常亦含有提供該套組之使用說明之標籤。標籤一般係指套組在其製造、運輸、銷售或使用期間之任何時間下附在或另外伴隨之任何書面或記錄材料。例如，術語標籤包含廣告傳單及小冊子、包裝材料、說明書、錄音或視訊卡帶、計算機光盤及直接印刷在套組上之文字。此等套組亦可提供陽性對照，例如，經純化之SARS-CoV-2刺突蛋白溶液。該套組亦可包含陰性對照，諸如包含本文揭示之組合物但不與樣本接觸之溶液。在其中該組合物係乾燥組合物之套組之實例中，此等套組可進一步提供其上乾燥該組合物之撐體，諸如包含玻璃纖維、聚酯、纖維素或人造絲之材料。
用於特定類型之分析之試劑亦可提供於套組中。因此，該等套組可包括一組奈米顆粒、珠(例如，適用於凝集分析或側向流動分析)或盤(例如，適用於ELISA分析之盤)。在其他實例中，該等套組包含一種裝置，諸如側向流動分析裝置、分析轉子或電化學、光或光電感測器。該組奈米顆粒、珠、盤及裝置適用於進行免疫分析。在其中該套組包含側向流動分析裝置之實例中，本發明之組合物可包含於與該裝置分開之套組內，或其可包含於該裝置本身內，例如其可於該裝置內之結合區上乾燥。
另外，套組可包括各種稀釋劑及緩衝液、經標記結合物或用於進行上文描述之方法之其他藥劑，及其他產生信號之試劑，諸如酶受質、輔因子及色素原。熟習此項技術者可容易確定該套組之其他組件。此等組件可包括塗層試劑、用於比色比較之指標圖、一次性手套、去汙說明書、塗抹棒或容器、樣本預備杯等。在一項實例中，套組包含適用於構成其中本文揭示之組合物與樣本接觸之反應介質之緩衝液或其他試劑。
在某些實例中，套組進一步包含說明書。例如，在某些實例中，該等套組包含指示使用該套組檢測SARS-CoV-2刺突蛋白，或診斷疾病(諸如SARS-CoV-2感染)之方式之說明書。在某些實例中，該等套組包含指示製備樣本之方式之說明書。在某些實例中，該等套組提供用於在針對SARS-CoV-2刺突蛋白之存在分析樣本之前使該樣本與本文揭示之組合物以任何順序接觸之說明書。該等套組亦可提供用於最佳化緩衝液、最佳化各種組分之比率、最佳化該樣本之稀釋，及最佳化混合物及應用步驟之順序(例如，在應用前混合所有組分、僅混合某些組分並單獨應用其他組分)之說明書。
在一些實例中，套組適用於在溶液中進行本發明之方法。例如，該套組可包含一個容器，該容器包含於溶液中之本文揭示之組合物。此等套組可包含用於獲得樣本，混合該樣本與本發明之組合物，及然後檢測該樣本一經與該組合物接觸即產生之信號之說明書。在一些實例中，包含該溶液之容器適用於由該溶液使用分光光度法量測吸光度(例如，在600至620 nm及/或510至530 nm之範圍內之波長下)。因此，在一些實例中，包含本發明之組合物之容器係比色皿。在一些實例中，該套組包含兩個容器，各包含於溶液中之本發明之組合物。第一容器可用於與該樣本接觸，及第二容器可用作陰性對照。在一些實例中，該套組包含分光光度計(例如掌上型分光光度計)用於量測該溶液之吸光度。在溶液中之DNA適體及奈米顆粒之分離改變在該溶液之特定波長下之吸光度之情況下，可使用該分光光度計。例如，在使用金奈米顆粒之情況下，自該DNA適體分離可引起峰值吸光度自藍綠色光譜中之波長(例如，450至550 nm)移動至橙紅色光譜中之波長(例如，580至680 nm)。該分光光度計(若存在)可適用於量測在此等波長下之吸光度。
在一些實例中，套組進一步包含用於獲得、容納、製備、量測及/或混合樣本之組件。例如，該套組可包含用於在該套組中轉移特定體積之樣本或其他溶液之移液管。在一些實例中，該移液管適用於分配唾液。
在一些實例中，套組包含漱口水之容器。例如在自受試者口腔獲得樣本(例如，唾液)之前，該受試者使用含酒精漱口水。
在一些實例中，本發明之套組及方法提供許多優勢。例如，其等可容許簡單、便宜、快速、靈敏及精確檢測SARS-CoV-2，而不產生明顯之假陽性或背景信號。此容許在護理點環境中進行精確且靈敏之診斷。
實例  實例1：可分離地結合至DNA適體之金奈米顆粒之製備
HAuCl 4·3H 2O獲自Sigma (#520918-1g, MW:393.83 g/mol)及檸檬酸鈉獲自Sigma (#S1804-500g, MW=294,1 g/mol)。Turkevich方法用於製備大約15至20 nm尺寸之金奈米顆粒。具體言之，在攪拌下加熱1 mM HAuCl 4.3H 2O之溶液及然後將檸檬酸鈉添加至38.8 mM之最終濃度。使該混合物再反應15 min及然後緩慢冷卻至室溫。
藉由電子顯微術分析所得顆粒且代表性影像顯示於圖1中。該等顆粒尺寸之統計學分析結果顯示於下表2中。 表2：金奈米顆粒之尺寸性質
Figure 02_image001
表2顯示平均直徑為16.45 nm之金奈米顆粒。圖1顯示該等奈米顆粒係球形或半球形形狀且具有低尺寸分散度。
為製備適體-奈米顆粒探針(即，可分離地結合至DNA適體之金奈米顆粒)，在室溫下用DNA適體的水溶液將金奈米顆粒培養30 min。針對各適體及一批金奈米顆粒根據經驗確定適體之最佳濃度。DNA適體之最佳濃度通常在200至500 nM之範圍內。
針對各種濃度之氯化鈉測試適體用於防止鹽誘導之金奈米顆粒聚集之效應。針對各適體及一批金奈米顆粒根據經驗確定氯化鈉之最佳濃度。氯化鈉之最佳濃度通常在50至500 mM之範圍內。
用於測定適體及氯化鈉濃度之代表性實驗顯示於圖2中。在此實驗中，適體之最佳濃度係300 nM及氯化鈉之最佳濃度係100 mM。
亦進行類似實驗以評估奈米顆粒尺寸對由DNA適體防止鹽誘導之聚集之影響。具體言之，平均直徑大約40 nm之奈米顆粒與上文描述之16 nm奈米顆粒進行比較。圖3顯示相對於該等16 nm奈米顆粒，該等40 nm奈米顆粒無法同樣有效用於檢測由該DNA適體防止鹽誘導之聚集。
實例2：SARS-CoV-2刺突蛋白及適體最佳化之檢測 評估如實例1中製備之適體-奈米顆粒溶液檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之結合之能力。最初，使用對應於SEQ ID NO:1之適體(DNA適體1)。
DNA適體1吸附至如實例1中描述之16 nm金奈米顆粒上及然後在室溫下用各種濃度經純化之重組SARS-CoV-2刺突蛋白在氯化鈉之存在下培養30 min。培養後，使用溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率(AU610/520)量測奈米顆粒聚集之程度。
圖4顯示AU610/520比率隨刺突蛋白濃度增加而增加，指示DNA適體1結合至該刺突蛋白，藉此導致鹽誘導之奈米顆粒聚集。在此實例中，SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限係約5 nM。圖5顯示當在用該DNA適體吸附之前離心該等奈米顆粒時，可進一步增強該檢測極限。在此實驗中，SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限在缺乏離心之情況下自8 nM (即，變得更靈敏)降低至當離心時之2 nM。
然後比較DNA適體1至8 (即，SEQ ID NO: 1至8)在吸附至如上文描述之金奈米顆粒時結合至SARS-CoV-2刺突蛋白之能力。各適體吸附至如實例1中描述之16 nm金奈米顆粒上及然後在室溫下用各種濃度經純化之重組SARS-CoV-2刺突蛋白(0至60 nM)培養30 min，及然後添加氯化鈉以誘導該等奈米顆粒之聚集。結果顯示於下表3中。 表3：奈米顆粒-適體探針之靈敏度
適體 LOD (nM) Max AU610/520 Min AU610/520 Max-Min
SEQ ID NO:1 8 0.714 0.348 0.366
SEQ ID NO:2 8 0.861 0.364 0.497
SEQ ID NO:3 10 0.777 0.371 0.406
SEQ ID NO:4 9 1.012 0.459 0.553
SEQ ID NO:5 9.7 0.708 0.325 0.386
SEQ ID NO:6 7.8 0.669 0.341 0.328
SEQ ID NO:7 7 1.112 0.442 0.672
SEQ ID NO:8 8.9 0.891 0.362 0.529
藉由自最大AU610/520 (即，在刺突蛋白之存在下，引起該等奈米顆粒之聚集)減去檢測到之最低AU610/520 (即，無刺突蛋白且因此抑制奈米顆粒聚集)評估該等適體在吸附至金奈米顆粒時之靈敏度。根據此度量，當吸附至該等奈米顆粒時，DNA適體7 (即，SEQ ID NO:7)經測定為最敏感之適體，及在此實例中，SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限(LOD)係約7 nM。
然後藉由量測由來自冠狀病毒之下列毒株之100 nM刺突蛋白引起之鹽誘導之(400 mM NaCl)奈米顆粒聚集程度(根據AU610/520)評估DNA適體7-金奈米顆粒探針之特異性：SARS-CoV-2、HCoV229E、HCoVNL63、MERS及HCoVHKU。
圖6顯示DNA適體7-金奈米顆粒探對SARS-CoV-2刺突蛋白具高度特異性，及對MERS刺突蛋白具有一些交叉反應性。
實例3：唾液中SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測 評估適體-奈米顆粒探針檢測唾液中重組SARS-CoV-2刺突蛋白之能力。然而，發現唾液引起該等奈米顆粒聚集，此降低用於檢測刺突蛋白之分析之靈敏度。因此，當使用唾液作為樣本時，評估許多不同之策略以改良該分析：稀釋；過濾；離心；及使用漱口水。
如圖7中顯示，針對DNA適體1及DNA適體7兩者，以1:600因子稀釋適體-奈米顆粒探針導致在唾液中成功檢測SARS-CoV-2刺突蛋白。DNA適體1之檢測極限係約13 nM及DNA適體7之檢測極限係約9 nM。在1:100至1:10,000範圍內之其他稀釋因子亦成功。
圖8顯示過濾及離心唾液樣本(經1:300稀釋)之結果。針對兩個樣本均成功檢測SARS-CoV-2刺突蛋白。相對於離心，針對在與DNA適體7-奈米顆粒溶液接觸之前經過濾之樣本觀察到更大之檢測靈敏度。
圖9顯示在提供唾液樣本之前，由受試者使用漱口水之結果。在此情況下，該受試者用10 mL李施德林漱口水清洗其口腔，然後用水沖洗其口腔，然後吐至收集瓶內以提供該唾液樣本。然後將經純化之SARS-CoV-2刺突蛋白添加至該唾液樣本。該樣本在與DNA適體7-金奈米顆粒接觸時以1:300之因子稀釋且隨後添加400 mM NaCl以誘導該等奈米顆粒之聚集(該適體一經結合至該刺突蛋白即已自其中分離)。如由在存在及缺乏樣本之情況下AU610/520比率之間的差異確定，使用該漱口水改良檢測之靈敏度。
圖11顯示當以1:1000之因子稀釋唾液及受試者使用漱口水時，達成4.5 nM之檢測極限。在此實驗中，該受試者用李施德林漱口水連續漱口三次，然後用水沖洗其口腔。然後獲得唾液樣本並1:1000稀釋於水中，然後與如上文描述之DNA適體7-金奈米顆粒及各種濃度之重組SARS-CoV-2刺突蛋白(0至40 nM)混合。針對不同濃度之刺突蛋白中之各者在350至750 nm之波長之間記錄吸收光譜(圖11A)。亦計算各光譜之一階導數以確定峰值吸光度波長(圖11B)。然後使用該等峰值吸光度波長之比率(即645 nm下之吸光度除以525 nm下之吸光度)以確定該檢測極限(圖11C)，其在此實驗中經計算係約4.5 nM。
實例4：用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之側向流動分析 使用上文描述之適體-奈米顆粒探針開發用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之側向流動分析。在此情況下，如實例1中描述，DNA適體7係經生物素化並吸附至金奈米顆粒表面上。然後所得溶液與包含0至100 nM重組SARS-CoV-2刺突蛋白之樣本接觸並在室溫下培養30 min。然後將側向流動分析量油尺裝置浸入該混合物內且容許該溶液流動通過該量油尺。在此情況下，該LFA量油尺包含具有固定化鏈黴親和素測試區及聚(二烯丙基二甲基氯化銨) (PDDA)對照區之硝化纖維素膜檢測區。該量油尺亦具有位於該檢測區下游之吸收區以捕獲流動通過該檢測區之溶液。
圖10顯示側向流動分析在不同濃度之SARS-CoV-2刺突蛋白下之結果。在缺乏刺突蛋白之情況下，金奈米顆粒仍結合至生物素化適體，於鏈黴親和素測試區導致深紅色斑點(圖10)。該SARS-CoV-2刺突蛋白對適體之結合自該等金奈米顆粒分離該適體，藉此於SARS-CoV-2刺突蛋白濃度增加之對照區降低顏色強度。於PDDA對照區觀察到暗線，因為無論該適體是否仍結合，此聚合物均結合至該等金奈米顆粒。此側向流動分析之檢測極限經測定係大約60 nM。
實例5：使用市售快速測試套組之比較研究 已顯示傳染性程度與可培養病毒相關。亦已顯示RT-PCR檢測充當瞭解傳染性之替代物，因為循環臨限(Ct)值與可培養病毒之程度存在強相關性(即，較高Ct值指示較低病毒載量及較低Ct值指示較高病毒載量)。此進一步提供對COVID診斷測試之有效性之瞭解。
使用RT-PCR Ct值作為SARS-CoV-2病毒載量之半定量量度，已顯示SARS-CoV-2 RNA量在症狀出現前後最大，在疾病發作後前10天內穩步下降及然後趨於平衡(表4；資料來自Singanayagam等人，2020)。 表4：幾何平均Ct值
   GM Ct值
症狀出現第1週後(第2至7天) 28.18
第2週後(第8至14天) 30.65
14天後 31.60
使用RT-PCR之Ct值，比較DNA適體7-金奈米顆粒探針之靈敏度與數種市售快速測試套組，包括Panbio TM(Abbott)、標準Q (SD Biosensor)、Respi-Strip (Coris Bioconcept)及NADAL®COVID-19 (Nal von Minden)。結果顯示於表5中。 表5：與市售快速測試套組之靈敏度比較
   Ct值
快速測試 14,7 15,3 23,3 24,2 26,0 28/29 31 32
Panbio TM 100%       83%    68%    11%平均Ct
標準Q    100% 88%               
Respi-Strip    88% 17%          0%   
NADAL®COVID-19    77% 23%          0%   
DNA適體7-金奈米顆粒             91% 77.6%    75.69% Ct截止值
如上表5中顯示，儘管快速抗原測試在高病毒載量下(即Ct值≤ 25)具有高靈敏度，但在低病毒載量下該靈敏度於廣泛範圍內下降。特定言之，市售快速測試套組之靈敏度自~28之Ct值(Ct 28.3)下降，而本文描述之DNA適體7-金奈米顆粒之靈敏度維持在77.6%。
實例6：唾液中SARS-CoV-2刺突蛋白之確效研究 在具有分光光度計之比色皿中進行使用適體-奈米顆粒探針來檢測唾液中重組SARS-CoV-2刺突蛋白之確效研究。
指示受試者使用15 mL不含酒精之漱口水(例如，李施德林) 30秒，作為第一漱口水。指示該受試者不漱口並要求藉由在口腔內滾動舌頭來清洗其口腔。接著用一口水將其口腔沖洗30秒，至少3次。自口腔去除所有液體及唾液。
受試者主動用舌頭抵住齒齦、臉頰及上顎一分鐘，以刺激新鮮唾液之產生。此後收集最少1.5 mL新鮮唾液。
將原唾液樣本稀釋。將20 µL原唾液添加至預先填充9980 µL HPLC級水之10-mL試管(1:5000稀釋)，並藉由倒置混合。
使用比色皿量測下列樣本： 1.     無樣本之比色皿之基線量測。 2.     使用含有360 µL上文描述之適體-奈米顆粒探針之經預先填充之比色皿之陰性對照量測。 3.     使用含有360 µL上文描述之適體-奈米顆粒探針、40 µL重組SARS-CoV-2刺突蛋白及40 µL 500 mM NaCl溶液之經預先填充之比色皿之陽性對照。 4.     使用含有360 µL上文描述之適體-奈米顆粒探針、40 µL經1:5000稀釋之唾液及40 µL 500 mM NaCl溶液之經預先填充之比色皿之受試者樣本量測。
UV分光光度計獲取範圍係450 nm至650 nm。
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圖1係用以產生用於檢測SARS-CoV-2刺突蛋白之適體-奈米顆粒探針之金奈米顆粒之電子顯微鏡照片。
圖2係包含各種濃度之氯化鈉及適體之金奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之條形圖。
圖3係包含各種濃度之氯化鈉及適體之金奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之條形圖。A圖係平均直徑約16 nm之奈米顆粒及B圖係平均直徑約40 nm之奈米顆粒。
圖4係顯示包含各種濃度之SARS-CoV-2刺突蛋白之DNA適體1-金奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之線圖。
圖5係顯示包含各種濃度之SARS-CoV-2刺突蛋白之DNA適體1-金奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之線圖。評估用該DNA適體吸附之前該等奈米顆粒之離心效應(CS)相對於未離心(VS)。
圖6係包含不同冠狀病毒刺突蛋白之DNA適體7-奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之條形圖。
圖7顯示線圖，其顯示在經稀釋唾液樣本中包含各種濃度之SARS-CoV-2刺突蛋白之DNA適體1-金奈米顆粒(A圖)及DNA適體7-金奈米顆粒(B圖)溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率。
圖8係顯示在經稀釋唾液樣本中包含各種濃度之SARS-CoV-2刺突蛋白之DNA適體7-金奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之線圖。該樣本在與該DNA適體7-金奈米顆粒溶液接觸之前經離心(「c」)或過濾(「F」)。
圖9係在與自樣本收集之前使用(「李施德林(listerine)」)或未使用(「無李施德林」)漱口水之受試者獲得經稀釋唾液樣本接觸後，DNA適體7-奈米顆粒溶液在610 nm對520 nm下之吸光度比率之條形圖。
圖10係在硝化纖維素膜量油尺上進行之一系列側向流動分析之像片。測試區顏色強度之降低指示樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白。
圖11係一系列線圖，其等顯示：(A) DNA適體7-奈米顆粒溶液在與經稀釋唾液樣本接觸後之吸光度光譜，(B)A圖中光譜之一階導數，及(C)用於確定檢測極限之校準曲線。
 

          <![CDATA[<110>  西班牙商雷勁那賽克斯公司(Regenacellx.SL)]]>
          <![CDATA[<120>  用於檢測SARS-COV-2刺突蛋白之組合物及方法]]>
          <![CDATA[<130>  535305TW]]>
          <![CDATA[<150>  AU 2020902948]]>
          <![CDATA[<151>  2020-08-18]]>
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          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  76]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          atccagagtg acgcagcacc gaccttgtgc tttgggagtg ctggtccaag ggcgttaatg       60
          gacacggtgg cttagt                                                       76
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          atccagagtg acgcagcatc gagtggtggg ctggtcgggt ttggattccc ttagatgctg       60
          gacacggtgg cttagt                                                       76
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          atccagagtg acgcagcact gcgtaggcgc ggccaatgtg taggattgct caggtctgct       60
          ggacacggtg gcttagt                                                      77
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          cagcaccgac cttgtgcttt gggagtgctg gtccaagggc gttaatggac a                51
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          <![CDATA[<211>  67]]>
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          <![CDATA[<400>  8]]>
          atccagagtg acgcagcatt tcatcgggtc caaaaggggc tgctcgggat tgcggatatg       60
          gacacgt                                                                 67
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成DNA連接子]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          cccaggtgtc catta                                                        15
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成DNA連接子]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          ggtgctgtgg gaag                                                         14
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (46)

  1. 一種包含可分開地結合至DNA適體之奈米顆粒之組合物，該DNA適體可結合至SARS-CoV-2刺突蛋白，其中該DNA適體包含與SEQ ID NO: 1至8中之任一者具有至少90%一致性之序列之核苷酸。
  2. 如請求項1之組合物，其中該DNA適體包含具有SEQ ID NO: 7中提供之序列之核苷酸。
  3. 如請求項1或請求項2之組合物，其中該等奈米顆粒係貴金屬奈米顆粒。
  4. 如請求項1至3中任一項之組合物，其中該等奈米顆粒係金奈米顆粒。
  5. 如請求項1至4中任一項之組合物，其中該等奈米顆粒具有10至30 nm範圍內之平均直徑。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該等奈米顆粒具有小於20%之尺寸分散度。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該DNA適體係經生物素化。
  8. 如請求項7之組合物，其中該DNA適體在其5’端係經生物素化。
  9. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該DNA適體係未經生物素化或硫醇化。
  10. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中該DNA適體係吸附至該等奈米顆粒表面上。
  11. 如請求項1至9中任一項之組合物，其中該組合物包含： i) 結合至第一多核苷酸連接子之奈米顆粒；及 ii) 結合至第二多核苷酸連接子之奈米顆粒， 其中該DNA適體包含與該第一多核苷酸連接子雜交之區域及與該第二多核苷酸連接子雜交之區域。
  12. 如請求項11之組合物，其中： i) 該第一及第二多核苷酸連接子係經硫醇化； ii) 該等奈米顆粒係金奈米顆粒；及 iii) 該第一及第二多核苷酸連接子係經由硫醇-金鍵結合至該等金奈米顆粒。
  13. 如請求項11或請求項12之組合物，其中該第一多核苷酸連接子或該第二多核苷酸連接子係經生物素化。
  14. 如請求項11至13中任一項之組合物，其中該DNA適體包含未與該第一多核苷酸連接子或該第二多核苷酸連接子雜交之區域。
  15. 如請求項11至14中任一項之組合物，其中該第一多核苷酸連接子及該第二多核苷酸連接子具有10至20個核苷酸之範圍內之長度。
  16. 如請求項11至15中任一項之組合物，其中該第一多核苷酸連接子包含具有SEQ ID NO: 9中提供之序列之核苷酸及/或該第二多核苷酸連接子包含具有SEQ ID NO: 10中提供之序列之核苷酸。
  17. 如請求項1至16中任一項之組合物，其係水溶液。
  18. 如請求項17之組合物，其中可分離地結合至該DNA適體之該等奈米顆粒係以200至500 nM範圍內之濃度存在。
  19. 如請求項17或請求項18之組合物，其進一步包含50至500 mM範圍內之濃度之氯化鈉。
  20. 如請求項1至16中任一項之組合物，其係乾燥組合物。
  21. 如請求項20之組合物，其係乾燥在撐體上。
  22. 如請求項21之組合物，其中該撐體包含玻璃纖維、聚酯、纖維素或人造絲。
  23. 一種用於檢測樣本中SARS-CoV-2刺突蛋白之方法，其包括使該樣本與如請求項1至22中任一項之組合物接觸，其中該SARS-CoV-2刺突蛋白與該DNA適體之結合誘導該DNA適體自該等奈米顆粒分離，藉此產生指示該樣本中存在SARS-CoV-2刺突蛋白之可檢測信號。
  24. 一種用於診斷受試者中SARS-CoV-2感染之方法，其包括使來自該受試者之樣本與如請求項1至22中任一項之組合物接觸，其中SARS-CoV-2刺突蛋白與該DNA適體之結合誘導該DNA適體自該等奈米顆粒分離，藉此產生指示SARS-CoV-2感染之可檢測信號。
  25. 如請求項23或請求項24之方法，其中該可檢測信號係比色信號(colorimetric signal)。
  26. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該可檢測信號係使用機器學習演算法評估以確定該樣本中是否存在SARS-CoV-2刺突蛋白。
  27. 如請求項23至26中任一項之方法，其係在溶液中進行。
  28. 如請求項27之方法，其中SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限在99%信賴度下係小於20 nM。
  29. 如請求項27或請求項28之方法，其進一步包括在610 nm及520 nm波長下量測溶液之吸光度，其中相對於對照溶液，610 nm對520 nm下吸光度比率之增加指示存在SARS-CoV-2刺突蛋白或SARS-CoV-2感染。
  30. 如請求項23至26中任一項之方法，其係使用側向流動分析進行。
  31. 如請求項30之方法，其中SARS-CoV-2刺突蛋白之檢測極限在99%信賴度下係小於75 nM。
  32. 如請求項23至31中任一項之方法，其中該樣本係唾液樣本。
  33. 如請求項32之方法，其中當該唾液與如請求項1至22中任一項之組合物接觸時，係將該唾液以至少1:50、至少1:100、至少1:250、至少1:500、至少1:1000或至少1:5000之因子稀釋於水溶液中。
  34. 如請求項32之方法，其中該唾液係以1:600至1:10,000範圍內之因子稀釋於水溶液中。
  35. 如請求項32至34中任一項之方法，其中該唾液係在受試者已使用漱口水後30分鐘內自該受試者獲得。
  36. 如請求項24至35中任一項之方法，其中該受試者係人類。
  37. 一種用於檢測樣本中SARS-CoV-2刺突蛋白之套組，該套組包含如請求項1至22中任一項之組合物。
  38. 如請求項37之套組，其包括包含如請求項17至19中任一項之組合物之容器。
  39. 如請求項37或請求項38之套組，其進一步包含分光光度計。
  40. 一種用於檢測樣本中SARS-CoV-2刺突蛋白之側向流動分析套組，該套組包含如請求項1至22中任一項之組合物及側向流動分析裝置。
  41. 如請求項40之側向流動分析套組，其中該套組包含如請求項17至19中任一項之組合物，且其中該側向流動裝置包括包含測試區及對照區之檢測區。
  42. 如請求項40之側向流動分析套組，其中該測試區包含固定化鏈黴親和素。
  43. 如請求項41或請求項42之側向流動分析套組，其中該對照區包含固定化聚(二烯丙基二甲基氯化銨) (poly(diallyldimethylammonium chloride)；PDDA)。
  44. 如請求項41至43中任一項之側向流動分析套組，其進一步包含與該檢測區流體連通並在其下游之吸收區。
  45. 一種用於檢測樣本中SARS-CoV-2刺突蛋白之側向流動分析裝置，該裝置包含如請求項1至22中任一項之組合物。
  46. 如請求項45之側向流動分析裝置，其包含流體連通之下列組件： i) 樣本區； ii) 在該樣本區下游之結合區；及 iii) 在結合物釋放區下游之檢測區， 其中該結合區包含如請求項20至22中任一項之組合物且其中該檢測區包含測試區及對照區。
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