WO2023191079A1 - 標的物質の検出試薬及び検出方法 - Google Patents

標的物質の検出試薬及び検出方法 Download PDF

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WO2023191079A1
WO2023191079A1 PCT/JP2023/013644 JP2023013644W WO2023191079A1 WO 2023191079 A1 WO2023191079 A1 WO 2023191079A1 JP 2023013644 W JP2023013644 W JP 2023013644W WO 2023191079 A1 WO2023191079 A1 WO 2023191079A1
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WO
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aptamer
enzyme
substrate
target substance
base sequence
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English (en)
French (fr)
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一典 池袋
竜太郎 浅野
大明 三浦
知子 吉野
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国立大学法人東京農工大学
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a detection reagent for a target substance and a method for detecting the target substance using an aptamer that specifically binds to the target substance.
  • Non-patent Document 1 Enzyme-multiplied immunoassays technology (EMIT)
  • Non-patent Document 2 Fluorescence polarization immunoassay (FPIA)
  • Non-patent Document 3 Fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • Non-Patent Document 4 Chemiluminescence resonance energy transfer (CRET) has been reported.
  • Non-Patent Documents 5 to 7 disclose homogeneous assay systems that detect viruses using magnetic nanoparticles.
  • Non-Patent Documents 8 and 9 detection systems using a donor that emits a signal and an acceptor that specifically receives the signal and emits a detection signal have also been reported (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • the donor is irradiated with light
  • singlet oxygen is released and diffuses through the solution for a very short period of time. If the singlet oxygen reaches the acceptor during that time, energy is transferred from the singlet oxygen to the emit light.
  • This detection system detects a signal of a specific wavelength that is generated when a donor and an acceptor come close to each other via a detection target.
  • Patent Document 1 discloses that by specifically binding a first enzyme and a second enzyme to a substance to be measured, and detecting a reaction catalyzed by the second enzyme, the substance to be measured in a sample can be detected.
  • a method for measuring the concentration of is disclosed.
  • the reaction catalyzed by the second enzyme is a reaction that utilizes the product purified by the reaction catalyzed by the first enzyme. Therefore, when the substance to be measured is present in the reaction solution containing the first enzyme, the second enzyme, and the substrate of each enzyme, the first enzyme and the second enzyme come close to each other, and the second enzyme catalyzes the reaction. The reaction progresses.
  • Patent Document 1 discloses that specific examples of the first enzyme and the second enzyme are glucose oxidase and peroxidase, respectively.
  • the second enzyme, peroxidase utilizes hydrogen peroxide produced by glucose oxidase to proceed with an enzymatic reaction using a substrate such as orthophenyleneamine.
  • an aptamer refers to a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific target substance.
  • Aptamers that specifically bind to growth factors, enzymes, receptors, membrane proteins, viral proteins, etc. have been found, and there are also those that bind to metal ions, low molecular weight organic compounds, viruses, etc.
  • Patent Document 2 discloses an aptamer that has a guanine quadruplex structure (hereinafter also referred to as G4 structure) and specifically binds to hemoproteins such as myoglobin and hemoglobin.
  • the aptamer disclosed in Patent Document 2 has the function of significantly increasing the peroxidase activity of heme proteins.
  • Non-Patent Document 10 discloses an aptamer that specifically binds to porphyrins including heme proteins and hemin having peroxidase activity, and describes its function as a DNA enzyme (DNAzyme).
  • DNAzyme DNA enzyme
  • porphyrin exhibiting peroxidase activity is also disclosed in Non-Patent Document 11.
  • Patent Document 3 and Non-Patent Document 12 disclose a technique for further increasing peroxidase activity by introducing mutations into an aptamer that increases peroxidase activity by specifically binding to hemin. There is.
  • the present invention provides a detection reagent and method for detecting a target substance using an aptamer that increases peroxidase activity in porphyrin, or a detection reagent and method for detecting a target substance that does not use the aptamer. With the goal.
  • the present inventors have developed a practical target substance detection kit and detection method by controlling the three-dimensional structure of an aptamer that increases peroxidase activity in porphyrins. This led to the completion of the present invention.
  • the present invention includes the following. (1) A nucleic acid molecule having a first aptamer that acts on porphyrin exhibiting peroxidase activity to increase peroxidase activity, and a second aptamer linked directly or indirectly to the first aptamer and a first enzyme that has the ability to bind to a target substance to which the second aptamer binds and has an oxidase activity that catalyzes an oxidation reaction to produce hydrogen peroxide, and a substrate for the first enzyme.
  • a detection kit for a target substance comprising a first substrate, a porphyrin having peroxidase activity whose activity is increased by the first aptamer, and a second substrate that is a substrate for the peroxidase activity of the porphyrin.
  • the above-mentioned porphyrin is a second enzyme having peroxidase activity
  • the above-mentioned first aptamer has a base sequence of the formula [I]: ggg(n) 1-2 ggg(n) 1-8 ggg(n ) 1-2
  • the detection kit according to (1) which comprises a polynucleotide represented by ggg [I] and increases the peroxidase activity of the second enzyme.
  • the detection kit according to (2) wherein the base sequence represented by the above formula [I] is a base sequence represented by any of SEQ ID NOS: 2 to 16.
  • the nucleic acid molecule is a polynucleotide consisting of the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 21, 22, and 46.
  • the first aptamer that increases peroxidase activity against hemin has a base sequence of the formula [IV]: ggg(n) 1-3 ggg(n) 1-7 ggg(n) 1-3 gg [IV]
  • the detection kit according to (5) which comprises a polynucleotide represented by: (7)
  • the detection kit according to (6), wherein the base sequence represented by the above formula [IV] is a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 26, 27, 29, 30, and 32 to 42. .
  • the detection kit according to (1), wherein the second aptamer binds to the surface of a virus.
  • the detection kit according to (1), wherein the second aptamer has a guanine quadruplex structure.
  • the detection kit according to (1) further comprising catalase.
  • the detection kit according to (1) wherein the first enzyme and the first substrate are glucose oxidase and glucose, respectively, and the porphyrin and the second substrate are myoglobin and luminol, respectively. .
  • the detection kit according to (1) comprising a first reagent containing at least the first substrate and a second reagent containing at least the first enzyme.
  • a method for detecting a target substance comprising: detecting the target substance in the sample based on the enzymatic reaction.
  • a first enzyme having an oxidase activity that has the ability to bind to a target substance supported on particles exhibiting peroxidase activity and catalyzes an oxidation reaction to produce hydrogen peroxide;
  • a target substance detection kit comprising a first substrate that is a substrate and a second substrate that is a substrate for peroxidase activity in the particles.
  • the first enzyme and the first substrate are glucose oxidase and glucose, respectively, and the second substrate is luminol.
  • the detection kit according to (14), comprising a first reagent containing at least the first substrate and a second reagent containing at least the first enzyme.
  • the particle is a virus
  • the target substance is a protein present on the surface of the virus.
  • the particles are magnetic particles.
  • the above particle is a magnetic particle having on its surface either one of a tag peptide and a tag capture peptide produced by magnetic bacteria, and the target substance is a protein fused to the other of the above tag peptide and the above tag capture peptide.
  • a method for detecting a target substance comprising detecting a target substance in the sample based on the following.
  • (21) a first aptamer that acts on porphyrin exhibiting peroxidase activity to increase peroxidase activity; and a second aptamer that is directly or indirectly linked to the first aptamer and has the ability to bind to a target substance.
  • the first aptamer includes a polynucleotide whose base sequence is represented by the formula [I]: ggg(n) 1-2 ggg(n) 1-8 ggg(n) 1-2 ggg [I] , the nucleic acid molecule according to (20), which increases peroxidase activity in heme proteins.
  • the first aptamer that increases the peroxidase activity against hemin has a base sequence of the formula [IV]: ggg(n) 1-3 ggg(n) 1-7 ggg(n) 1-3 gg [IV]
  • a method for detecting hemoglobin comprising the steps of: mixing a substrate, a second substrate that is a peroxidase substrate, and a sample that may contain hemoglobin; and measuring peroxidase activity by the hemoglobin.
  • a target substance can be detected with high precision using an aptamer that increases the peroxidase activity of a porphyrin that has a predetermined base sequence and exhibits peroxidase activity.
  • hemoglobin can be detected with high accuracy using an aptamer that has a predetermined base sequence and increases the peroxidase activity of heme proteins.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a target substance detection system using a nucleic acid molecule according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing another example of a target substance detection system using a nucleic acid molecule according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing still another example of a target substance detection system using a nucleic acid molecule according to the present invention.
  • 1 is a diagram schematically showing a hemoglobin detection system to which the present invention is applied.
  • 1 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for confirming the antibody-enzyme complex prepared in Example 1.
  • FIG. 2 is a characteristic diagram showing the results of measuring the oxidase activity of the antibody-enzyme complex prepared in Example 1.
  • FIG. 2 is a characteristic diagram showing the results of measuring the structure of a fused aptamer by circular dichroism (CD) spectrum measurement.
  • FIG. 2 is a characteristic diagram showing the results of examining the folding conditions of the fusion aptamer by blotting.
  • FIG. 2 is a characteristic diagram showing the results of examining the concentration ratio of myoglobin and fusion aptamer.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring a virus (inactivated SARS-CoV-2) using the system according to the present invention shown in Example 6.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring a virus (inactivated SARS-CoV-2) using the system according to the present invention shown in Example 7.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring a virus (inactivated SARS-CoV-2) using the system according to the present invention shown in Example 8.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring a virus (inactivated SARS-CoV-2) using the system according to the present invention shown in Example 9.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring a virus (inactivated SARS-CoV-2) using the system according to the present invention shown in Example 10. This is a photograph showing the result of imaging a plate using the camera function of iPhone (registered trademark) 12 in Example 10.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring inactivated influenza viruses using the system according to the present invention shown in Example 13.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring inactivated influenza viruses using the system according to the present invention shown in Example 14.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring a virus (inactivated SARS-CoV-2) using the system according to the present invention shown in Example 15.
  • 12 is a photograph showing the results of dot plot confirmation of the expression of the Mms13-SC-Flag fusion protein in Mms13-SC-Flag-BMP produced in Example 16.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for confirming Mms13-VHH regarding the VHH-presenting BMP (VHH-BMP) produced in Example 17.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring chemiluminescence intensity to confirm the anti-CRP scFv antibody-presented BMP (scFv-BMP) produced in Example 18.
  • 3 is a photograph showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis for confirming the complex of GOx and scFv-ST produced in Example 19.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the chemiluminescence intensity measured for evaluating the binding ability to CRP for the antibody-enzyme complex prepared in Example 19.
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of evaluating the CRP capture ability of the antibody-enzyme complex and anti-CRP scFv antibody-presented BMP in Example 20.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring peroxidase activity in Mms13-SC-Flag-BMP in Example 21.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring the luminol luminescence intensity while changing the CRP concentration for the scFv-BMP, CRP, and GOx-scFv complex (with washing operation) produced in Example 21.
  • FIG. 3 is a characteristic diagram showing the results of measuring the luminol luminescence intensity of the scFv-BMP, CRP, and GOx-scFv complex prepared in Example 21 (no washing operation) while changing the CRP concentration.
  • FIG. 7 is a characteristic diagram showing the results of measuring luminol luminescence intensity while changing the CRP concentration in a reaction system in which catalase was not included in the reaction solution, which was carried out in Example 22.
  • FIG. 12 is a characteristic diagram showing the results of measuring luminol luminescence intensity while changing the CRP concentration in a case where catalase is not included in the reaction solution and a case where catalase is included in the reaction solution, which was carried out in Example 22.
  • the first aptamer refers to a nucleic acid molecule consisting of a polynucleotide that has a predetermined base sequence and has the function of increasing the peroxidase activity of a porphyrin that exhibits peroxidase activity.
  • An example of the nucleic acid molecule is the aptamer molecule disclosed in JP-A-2017-200472.
  • the nucleic acid molecule can be used by linking with another aptamer that binds to the target substance. Therefore, in this embodiment, in order to distinguish the nucleic acid molecule from the other aptamer, the nucleic acid molecule is referred to as a first aptamer.
  • the other aptamer is referred to as a second aptamer.
  • the base sequence of the first aptamer is represented by the formula [I]: ggg(n) 1-2 ggg(n) 1-8 ggg(n) 1-2 ggg.
  • n is adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) (uracil (u) in the case of RNA), or inosine (i), or a modified form of these bases (methyl etc.) and artificial nucleic acids.
  • the base sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 16, which was prepared in JP-A No. 2017-200472 and whose effects were specifically confirmed. (Table 1 below). That is, the base sequence of the first aptamer may be any of SEQ ID NOs: 2 to 16, and is not particularly limited. Among these, the first aptamer is most preferably a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 used in this example.
  • the first aptamer may consist of the base sequence represented by formula [I], but may have one or more nucleotides added to its 5' and/or 3' ends. There may be. It is generally believed that the reason why an aptamer specifically binds to a target substance is that the aptamer exhibits a specific structure (three-dimensional structure or planar structure). Therefore, even if a base sequence that does not exhibit a specific structure is added to one or both ends of the base sequence represented by formula [I], the effect of increasing peroxidase activity is maintained.
  • the base sequence represented by formula [I] contains 1 to 3 natural bases other than ACGT, such as inosine or methylated cytosine, or highly hydrophobic unnatural bases at one or both ends.
  • the first aptamer can exhibit a more excellent effect of increasing peroxidase activity.
  • adenine when added to the 3' end of the base sequence represented by formula [I], it plays a role similar to that of a histidine residue involved in peroxidase activity, and can exert a more excellent effect of increasing peroxidase activity.
  • Whether or not DNA exhibits a certain structure can be determined by computer software analysis (for example, RAMAPO COLLEGE's Mapper published at http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php (Nucleic Acids Research 2006 July; 34 (Web Server issue):W676-W682)), a base sequence that does not exhibit a specific structure can be easily set by a person skilled in the art.
  • a poly-t sequence is widely known as a DNA sequence that does not exhibit a specific structure, and an aptamer represented by formula [I] with a poly-t sequence added to one or both ends is also used for heme protein peroxidase.
  • the first aptamer has a guanine quadruplex structure (also referred to as G4 structure).
  • G4 structure also referred to as G4 aptamers
  • aptamers having a G4 structure include parallel type G4 and antiparallel type G4, and the first aptamer is described in JP-A No. 2017-200472.
  • CD circular dichroism
  • G-quartets formed by arranging four guanines in a plane are arranged in parallel, and it is known that the target substance binds by fitting these G-quartets. .
  • the first aptamer in the present invention is not limited to one that binds to peroxidase as in the first embodiment described above, but specifically binds to porphyrin other than peroxidase, and inhibits peroxidase activity in porphyrin other than peroxidase. It may also have increasing functionality. That is, another embodiment of the first aptamer is an aptamer that specifically binds to a porphyrin other than peroxidase and has a function of increasing peroxidase activity in the porphyrin other than peroxidase.
  • porphyrin means a compound having a structure in which a porphine ring having the following structure is used as a skeleton and a functional group is bonded to the skeleton.
  • porphyrin is not limited to the above-mentioned peroxidases (proteins, enzymes), but also includes organic compounds such as hemin.
  • the porphyrin used in the present invention is not particularly limited, and includes, for example, hemin, chlorin, florin, porphodimethene, porfomethene, bacteriochlorin, isobacteriochlorin, porphyrinogen, phorbin, porphyrazine, phthalocyanine, phytoporphyrin, cytoporphyrin, Uroporphyrin I to IV, coproporphyrin I to IV, hematoporphyrin, mesoporphyrin, protoporphyrin, rhodoporphyrin, filoporphyrin, ethioporphyrin I to IV, pyroporphyrin, deuteroporphyrin, phytochlorin, rhodochlorin, phyllochlorin, pyrochlor
  • porphyrin used in the present invention is hemin having the following structure.
  • the first aptamer having the function of specifically binding to various porphyrins as described above and improving the peroxidase activity of the porphyrins is, for example, Renzo A. Fenati, Zifei Chen, Yasuko Yamagishi, Kaori Tsukakoshi, Kazunori Ikebukuro. , Anjay Manian , Salvy P. Russo , Tomohiko Yamazaki, and Amanda V.Ellis, J. Mater. Chem. B, 2022, 10, 8960-8969. It can be chemically synthesized based on the base sequence obtained.
  • the first aptamer having the function of specifically binding to hemin and improving peroxidase activity in hemin includes, but is not particularly limited to, the formula [IV]: ggg(n) 1-3 ggg(n)
  • Examples include aptamers containing the base sequence represented by 1-7 ggg(n) 1-3 gg.
  • n is adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) (uracil (u) in the case of RNA), or inosine (i), or a modified form of these bases (methyl etc.) and artificial nucleic acids.
  • the first aptamer having the function of improving peroxidase activity in hemin is not particularly limited, but the bases shown in Table 2 disclosed in Cheng et al., Biochemistry, 2009, 48, 7817-7823 can be used. Polynucleotides (also referred to as oligonucleotides) having a sequence can be mentioned.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 26, 27, 29, 30, and 32 to 42 include the base sequence shown in the above formula [IV]. Therefore, as the first aptamer, among the polynucleotides shown in Table 2, an aptamer containing a polynucleotide having a base sequence of any one of SEQ ID NOs: 26, 27, 29, 30, and 32 to 42 is used. It is preferable to do so.
  • the aptamers consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 29, 37, 40 and 41 are aptamers consisting of the polynucleotide shown by the formula [IV], and the aptamers consisting of the base sequences of SEQ ID NOs: 26, 27, 30, 32-36, 38, 39 and
  • the aptamer consisting of a 42 base sequence is an aptamer in which one or more nucleotides are added to the 5' end and/or 3' end of the polynucleotide represented by formula [IV].
  • aptamers containing the polynucleotide represented by the formula [IV] particularly the polynucleotide represented by the formula [V]: ggg(n) 1-2 ggg(n) 1-3 ggg(n) 1-2 gg
  • aptamers containing nucleotides are used.
  • the base sequences of SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 37 and 38 include the base sequence shown in formula [V] above.
  • an aptamer containing a polynucleotide having the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 32, 33, 34, 37, and 38 can be used. More preferred.
  • the first aptamer is most preferably a polynucleotide (PS2.M) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 30 used in this example, which is an aptamer containing a polynucleotide represented by formula [V]. .
  • PS2.M polynucleotide
  • the first aptamer may be composed of the polynucleotide shown in Table 2 or Formula [IV] or Formula [V], or may consist of the polynucleotide shown in Table 2 or Formula [IV] or Formula [V]
  • One or more nucleotides may be added to the 5' end and/or 3' end of the polynucleotide. It is generally believed that the reason why an aptamer specifically binds to a target substance is that the aptamer exhibits a specific structure (three-dimensional structure or planar structure).
  • the base sequence shown in Table 2 or Formula [IV] or Formula [V] contains 1 to 3 natural bases other than ACGT, such as inosine or methylated cytosine, or highly hydrophobic unnatural bases at one or both ends. is preferred. With this configuration, the first aptamer can exhibit a more excellent effect of increasing peroxidase activity.
  • adenine when added to the 3' end of the base sequence shown in Table 2 or Formula [IV] or Formula [V], it plays a role similar to that of histidine residue involved in peroxidase activity, resulting in better peroxidase activity. It can have an increasing effect.
  • Whether or not DNA exhibits a certain structure can be determined by computer software analysis (for example, RAMAPO COLLEGE's Mapper published at http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.php (Nucleic Acids Research 2006 July; 34 (Web Server issue):W676-W682)), a base sequence that does not exhibit a specific structure can be easily set by a person skilled in the art.
  • a poly-t sequence is widely known as a DNA sequence that does not exhibit a specific structure, and a poly-t sequence is added to one or both ends of the aptamer shown in Table 2 or Formula [IV] or Formula [V]. These substances also have the effect of increasing peroxidase of heme proteins and are included within the scope of the present invention.
  • 0 to 10 base sequences preferably 0 to 10 are present at one or both ends of the base sequence shown in Table 2 or Formula [IV] or Formula [V].
  • An aptamer having 1 to 6 nucleotides added, more preferably 0 to 3 nucleotides is preferred (note that "0 nucleotides added” means no nucleotides added).
  • the first aptamer that specifically binds to hemin and has the function of improving peroxidase activity in hemin is not particularly limited, but is described in JP 2020-039300A, which increases peroxidase activity.
  • Polynucleotides (which may also be referred to as oligonucleotides) that are particularly excellent in improving functions can be mentioned.
  • the polynucleotide described in JP-A-2020-039300 also has a sequence containing the polynucleotide represented by formula [IV].
  • the porphyrin used in the present invention is not limited to peroxidase or hemin, but so-called microperoxidase can also be used.
  • Microperoxidase is a compound having a structure in which some amino acid residues constituting peroxidase are bound to a heme moiety, and has peroxidase activity.
  • Microperoxidases include MP-6, which contains peroxidase from the 14th cysteine to the 19th threonine, MP-8, which contains the 14th cysteine to 21st glutamic acid, and the 13th lysine to the 21st lysine.
  • MP-9 which contains up to glutamic acid
  • MP-11 which contains valine at position 11 to glutamic acid at position 21, are known.
  • the first aptamer that has the function of specifically binding to these microperoxidases and improving the peroxidase activity of the microperoxidases is, for example, Renzo A. Fenati, Zifei Chen, Yasuko Yamagishi, Kaori Tsukakoshi, Kazunori Ikebukuro, Anjay
  • the base sequence can be designed by the method described in Manian , Salvy P. Russo , Tomohiko Yamazaki, and Amanda V.Ellis, J. Mater. Chem. B, 2022, 10, 8960-8969, and the designed base It can be chemically synthesized based on the sequence.
  • the nucleic acid molecule according to the present invention includes the above-described first aptamer, and a second aptamer that is linked directly or indirectly to the first aptamer and has the ability to bind to a predetermined target substance.
  • the second aptamer preferably has a guanine quadruplex structure.
  • the target substance includes biomolecules such as proteins, glycoproteins, lipids, glycolipids, polysaccharides, sugar chains, and nucleic acids, but is not particularly limited. Examples of proteins include growth factors, enzymes, receptors, membrane proteins, virus proteins, etc., but are not particularly limited.
  • cells, viruses, and microorganisms on which these biomolecules are displayed can also be targeted.
  • cells include cancer cells, iPS cells, ES cells, and the like.
  • viruses both DNA viruses and RNA viruses can be targeted, and there are enveloped viruses such as coronaviruses and influenza viruses, and non-enveloped viruses such as norovirus and poliovirus. Any of these can be used as a target substance.
  • Structures large enough to allow the second aptamer and antibody to bind, for example, protein aggregates with a diameter of 10 nm or more, liposomes displaying such structures on their surfaces, and the like can also be used as target substances.
  • the second aptamer for example, one having the ability to bind to the receptor binding domain (RBD) in the spike protein can be used.
  • the spike protein is a glycoprotein that exists almost uniformly on the surface of the virus, and is a protein that interacts with cell surface receptors of host cells.
  • the receptor binding domain (RBD) refers to a region that interacts with a cell surface receptor of a host cell.
  • viruses with spike proteins include seasonal influenza viruses, new influenza viruses, coronaviruses, new coronaviruses, orthomyxoviruses, paramyxoviruses, rhabdoviruses, filoviruses, bunyaviruses, arenaviruses, and retroviruses. Here are some viruses that can be used.
  • the second aptamer is preferably one that binds to the receptor binding domain (RBD) of viruses that cause diseases in humans, such as the new coronavirus and seasonal influenza virus.
  • the second aptamer preferably binds to the receptor binding domain (RBD) in the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • the base sequence of the aptamer that binds to the receptor binding domain (RBD) in the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2) is shown in SEQ ID NO: 1. That is, a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 1 (ggggctgctcgggattgcggatatgg) can be used as the second aptamer.
  • the second aptamer is preferably one that binds to the spike protein of seasonal influenza virus.
  • Seasonal influenza viruses have two types of spike proteins: hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Therefore, as the second aptamer, an aptamer that binds to hemagglutinin or neuraminidase in seasonal influenza virus can be designed.
  • the base sequence of an aptamer that binds to hemagglutinin (HA) in seasonal influenza virus is shown in SEQ ID NO: 45. That is, as the second aptamer, a polynucleotide containing the base sequence of SEQ ID NO: 45 (ttggggttattttgggtgtggtgggtgggggggtt) can be used.
  • the nucleic acid molecule according to the present invention may be DNA or RNA, but chemically stable DNA is preferable. Further, this nucleic acid molecule can be easily prepared by chemical synthesis using a commercially available DNA synthesizer or the like.
  • the order of the first aptamer and the second aptamer contained in the nucleic acid molecule is arbitrary. That is, the first aptamer and the second aptamer may be arranged in this order from the 5' end to the 3' end, or the second aptamer and the first aptamer may be arranged in this order. Also good.
  • first aptamer and the second aptamer may be linked directly or indirectly via an oligonucleotide consisting of one to several nucleotides.
  • the distance between the first aptamer and the second aptamer can be one nucleotide, two dinucleotides, three oligonucleotides, four oligonucleotides, or five oligonucleotides. All of these 1 to 5 nucleotides can be thymine, but are not particularly limited.
  • the first aptamer and the second aptamer may be linked via a synthetic linker such as PEG or PEO.
  • the nucleic acid molecule configured as described above exhibits the function of increasing the peroxidase activity in porphyrin caused by the first aptamer described above in a state where the second aptamer is bound to the target substance.
  • the second aptamer when the second aptamer is not bound to the target substance, the guanine quadruplex structure in the first aptamer is not stabilized, and the effect of enhancing peroxidase activity is insufficient. It is not demonstrated.
  • the second aptamer preferably has a guanine quadruplex structure.
  • the effect of enhancing peroxidase activity by the first aptamer is greater depending on whether the second aptamer is bound to the target substance or not. Changes greatly. This is because the second aptamer has a guanine quadruplex structure, so when the second aptamer binds to a target substance, the structure and stability of the nucleic acid molecule change, and the guanine quadruplex structure of the first aptamer changes. It is thought that the heavy chain structure is stabilized and the effect of enhancing peroxidase activity is further increased. In this way, when the second aptamer in the nucleic acid molecule has a guanine quadruplex structure, the detection sensitivity of the target substance can be further increased.
  • Porphyrins on which the first aptamer acts include heme proteins such as peroxidase, myoglobin, hemoglobin, metmyoglobin, catalase, and cytochrome P450. Among these, myoglobin and hemoglobin are preferred. Furthermore, as described above, the porphyrin on which the first aptamer acts may be a compound such as hemin or microperoxidase, and hemin is particularly preferred.
  • FIG. 1 is a scheme for detecting the new coronavirus (SARS-CoV-2) as a target substance using the above nucleic acid molecule.
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • the second aptamer constituting the nucleic acid molecule is not limited to one that binds to the RBD of the new coronavirus (SARS-CoV-2), but can also be used for other viruses, growth factors, enzymes, receptors, Since an aptamer that binds to a membrane protein can be used, the target substance may be the virus, or a cell expressing a predetermined growth factor, enzyme, receptor, or membrane protein may be used as the target substance.
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • a first enzyme 103 that specifically binds to a target substance 102 to which a second aptamer 101 in a nucleic acid molecule 100 binds is prepared.
  • the first enzyme 103 has an oxidase activity that catalyzes an enzymatic reaction using a predetermined substance as a substrate (first substrate 104) and generates hydrogen peroxide.
  • the first enzyme 103 forms a complex with a binding portion 105 that specifically binds to the target substance 102.
  • the binding portion 105 is a target substance 102, that is, an antibody molecule against the RBD of the new coronavirus (SARS-CoV-2) or a nucleic acid aptamer having the ability to bind to the RBD of the new coronavirus (SARS-CoV-2). It can be a molecule that specifically binds to the target substance 102 such as.
  • Examples of the first enzyme 103 include glucose oxidase, aldehyde oxidase, cytochrome oxidase, cytochrome oxidase, catechol oxidase, diphenol oxidase, cholesterol oxidase, cytochrome C oxidase, hypoxanthine oxidase, xanthine oxidase, NADPH oxidase, lactate oxidase, and galactose. Oxidase, alcohol oxidase, etc. can be used. Among these, it is preferable to use glucose oxidase as the first enzyme 103. These enzymes may be enzymes mainly composed of proteins, or may be DNAzymes (Deoxyribozymes), which are enzymes mainly composed of DNA, or ribozymes, which are enzymes mainly composed of RNA. It's okay.
  • first substrate 104 can be appropriately selected and used depending on the type of the first enzyme 103.
  • the pair of first enzyme 103 and first substrate 104 is preferably glucose oxidase and glucose. This is because glucose, which is the first substrate 104, is a stable compound and is inexpensive.
  • the binding portion 105 is used as a means for binding the first enzyme 103 to the target substance 102, and the binding portion 105 uses the RBD of the target substance 102, that is, the new coronavirus (SARS-CoV-2) as an antigen.
  • SARS-CoV-2 the new coronavirus
  • ACE2 fragments that interact with the RBD can also be used.
  • the binding portion 105 may be an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD in the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2), or may be an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2), or an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2), or an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2). It may also be an antibody molecule used as an antigen. Further, the binding portion 105 may be an aptamer mainly composed of a nucleic acid.
  • the first enzyme 103 and the binding portion 105 may be directly bound to form a complex, or may be indirectly bound to form a complex.
  • the method for indirectly binding the first enzyme 103 and the binding portion 105 is not particularly limited, but a method using a tag peptide and a tag capture peptide can be applied.
  • tag peptides and tag capture peptides include the SpyTag/SpyCatcher system (Bijan Zakeri et al., PNAS, 109 (12) E690-E697, 2012) and the SnoopCatcher/SnoopTag system (Gianluca Veggiani et al., PNAS, 113 ( 5) 1202-1207, 2016).
  • the SpyTag2/SpyCatcher2 system (Keeble et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 16521-16525), which is an improvement of the SpyTag/SpyCatcher system described above, and the SpyTag3/ You can also use the SpyCatcher3 system (Keeble et al., PNAS, 116 (52) 26523-26533, 2019).
  • first enzyme 103 or the binding part 105 has either the tag peptide or the tag capture peptide
  • the other of the first enzyme 103 or the binding part 105 has the tag peptide or the tag capture peptide. capture peptide with either the other.
  • the antibody molecule may be an immunoglobulin (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) antibody, a heavy chain antibody, or a fragment antibody.
  • Immunoglobulin antibodies consist of a heavy chain (VH) and a light chain (LH), and the heavy chain and light chain each have three CDRs, CDR1, CDR2, and CDR3.
  • a heavy chain antibody consists only of a heavy chain, and has three CDRs in the heavy chain: CDR1, CDR2, and CDR3.
  • Fragment antibodies are antibodies fragmented using enzymes or genetic engineering methods, and include Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, VHH antibodies, and the like.
  • fragment antibodies are scFab and scF( ab') and scF(ab') 2 are also included.
  • a linker sequence may be attached to the C-terminal side of the light chain, and a heavy chain may be further attached to the C-terminal side.
  • a linker sequence may be attached to the C-terminus of the heavy chain, and a light chain may be further attached to the C-terminus.
  • scFV which is made into a single chain antibody by linking the light chain variable region and the heavy chain variable region via a linker sequence, can also be used as the binding portion 105.
  • the binding portion 105 is an aptamer
  • the second aptamer described above can be used as the aptamer molecule.
  • this system includes a porphyrin 107 having peroxidase activity to which the first aptamer 106 in the nucleic acid molecule 100 can bind, and a second substrate 108 that serves as a substrate for the porphyrin 107.
  • porphyrin 107 is a compound such as an enzyme having peroxidase activity such as peroxidase, myoglobin, hemoglobin, metmyoglobin, catalase, or cytochrome P450, a compound having peroxidase activity such as hemin, or microperoxidase.
  • the second substrate 108 can be appropriately selected and used depending on the type of porphyrin 107, but it is particularly preferable to use a substance that can optically detect the progress of the enzymatic reaction of the porphyrin 107. Specifically, orthophenylenediamine or luminol can be used as the second substrate 108.
  • the second enzyme is used to distinguish these enzymes from the first enzyme 103. It is called the enzyme.
  • the present system preferably includes a third enzyme 109 that consumes hydrogen peroxide produced by the oxidase reaction by the first enzyme 103 as a substrate.
  • the third enzyme 109 is not particularly limited as long as it is an enzyme that consumes hydrogen peroxide as a substrate and, unlike the second substrate 108, does not bind to the first aptamer 106.
  • the third enzyme 109 for example, catalase can be used.
  • the target substance is 102 in a reaction system in which the nucleic acid molecule 100, the first enzyme 103 fused to the binding portion 105, the first substrate 104, the porphyrin 107, and the second substrate 108 are present, the target substance is 102 can be detected. Specifically, when the target substance 102 is present in the reaction system, the porphyrin 107 indirectly binds to the target substance 102 via the nucleic acid molecule 100, and the first enzyme 103 binds to the target substance via the binding part 105. A state indirectly coupled to 102 is formed. In this state, an oxidase reaction using the first substrate 104 proceeds by the first enzyme 103, and hydrogen peroxide is generated.
  • the porphyrin 107 Since the porphyrin 107 is located close to the first enzyme 103, it consumes hydrogen peroxide generated by the enzymatic reaction of the first enzyme 103. As a result, the peroxidase reaction using the second substrate 108 by the porphyrin 107 proceeds.
  • the target substance 102 can be detected by measuring the peroxidase reaction caused by the porphyrin 107 using the second substrate 108.
  • the target substance 102 can be detected by measuring chemiluminescence generated by a so-called luminol reaction.
  • the means for measuring chemiluminescence is not particularly limited, and may be measured visually or by ultra-weak chemiluminescence measuring method.
  • the target substance 102 is not present in the reaction system in which the nucleic acid molecule 100, the first enzyme 103 fused to the binding portion 105, the first substrate 104, the porphyrin 107, and the second substrate 108 are present, the first Although the oxidase reaction using the first substrate 104 proceeds by the enzyme 103 and hydrogen peroxide is generated, the porphyrin 107 is not present in the vicinity. Therefore, the peroxidase reaction by porphyrin 107 using the second substrate 108 hardly proceeds. Therefore, detection is possible only when the nucleic acid molecule 100 and the binding portion 105 are closely bound together, making specific detection possible.
  • the third enzyme 109 when the third enzyme 109 is present in the reaction system, the hydrogen peroxide produced by the enzymatic reaction of the first enzyme 103 can be consumed by the third enzyme 109. In this case, since the hydrogen peroxide necessary for the enzymatic reaction by porphyrin 107 has been consumed, the peroxidase reaction using the second substrate 108 can be stopped more reliably. In this way, in this system, by adding the third enzyme 109 to the reaction system, it is possible to suppress the occurrence of false positives.
  • a first reagent containing at least the first substrate 104 and a second reagent containing at least the first enzyme 103 can be used.
  • components other than the first substrate 104 and the first enzyme 103 may be included in either the first reagent or the second reagent, or may be included in both. You can leave it there.
  • the reagent into the first reagent and the second reagent the progress of the oxidase reaction using the first substrate 104 by the first enzyme 103 can be suppressed during storage of the reagent.
  • the first reagent and the second reagent are mixed, the oxidase reaction using the first substrate 104 by the first enzyme 103 can proceed, and as described above, the target substance 102 can be can be detected.
  • the present system described above is not particularly limited and can be applied to various situations in which the target substance 102 is detected.
  • This system is particularly applicable to a system that detects a virus as the target substance 102.
  • an aptamer that binds to the surface of the virus may be used as a second aptamer.
  • viruses can be detected quickly and easily.
  • the above-mentioned reaction system is constructed by spraying the first reagent and the second reagent onto a place where virus attachment is suspected. Based on the chemiluminescence caused by the peroxidase reaction caused by the porphyrin 107, it can be determined whether the target substance 102 is attached to the location.
  • this system can be applied to a device that detects whether a virus, which is the target substance 102, is contained in the air.
  • Such devices include air purifiers, air conditioners, hand-held simple air collectors, air collectors installed at the entrances and exits of buildings and rooms, exhalation and cough collection equipment installed in hospitals, etc. can be mentioned. These devices have in common that they pass air through a filter, and by applying this system, it is possible to detect viruses attached to the filter.
  • the above-mentioned reaction system may be constructed by spraying the first reagent and the second reagent onto the filter, or the first reagent and the second reagent may be sprayed onto the fine particles or dust repaired by the filter.
  • the above-mentioned reaction system may be constructed by spraying the reagent.
  • the filters disposable in these devices it becomes possible to successively detect viruses, which are the target substances 102.
  • this system can be applied to a device that detects whether a virus, which is the target substance 102, is contained in a liquid.
  • a device that detects whether a virus, which is the target substance 102, is contained in a liquid.
  • examples of such devices include devices that collect saliva and other body fluids collected from patients complaining of fever symptoms, etc., and devices that collect liquids soaked in clothing, masks, etc. worn by medical workers. can.
  • Such a device collects a liquid that may contain the target substance 102, a virus.
  • the above-described reaction system can be constructed by adding the first reagent and the second reagent to the collected liquid. In this way, when detecting the target substance 102 contained in a liquid, a homogeneous detection system can be used, which requires only the addition of reagents and does not require Bound/Free separation.
  • chemiluminescence in a liquid can be easily detected using a solid-state imaging device such as a CCD (charge-coupled device) image sensor or a CMOS image sensor. Therefore, for example, in combination with a microchannel device, a simple and high-performance virus testing device can be produced.
  • a solid-state imaging device such as a CCD (charge-coupled device) image sensor or a CMOS image sensor. Therefore, for example, in combination with a microchannel device, a simple and high-performance virus testing device can be produced.
  • a specific virus new coronavirus (SARS-CoV-2)
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • a second aptamer 101 designed for a different target substance 102 Different target substances 102 can be detected simply by using section 105.
  • this system can be said to be a highly versatile system that can be easily designed for each target substance 102 to be detected.
  • a plurality of different target substances 102 can be detected simultaneously. For example, by using multiple types of nucleic acid molecules 100 with different second aptamers 101, the presence of any one of multiple different target substances 102 can be detected.
  • the first enzyme 103 and the binding part 105 are indirectly bound via a tag peptide and a tag capture peptide
  • different binding parts 105 are used depending on the target substance 102.
  • the same tag peptide and tag capture peptide can be used between the enzyme 103 and the binding part 105.
  • the same first enzyme 103 and other components can be used to target the target substance via the tag peptide and the tag capture peptide.
  • Substance 102 can be detected.
  • the system for detecting the target substance is not limited to the system using the nucleic acid molecule according to the present invention described above, but may be a detection system as shown in FIG. 2.
  • Figure 2 shows a scheme for detecting the new coronavirus (SARS-CoV-2) as a target substance, similar to the system shown in Figure 1.
  • the oxidase of the first enzyme 103 is activated by the coexistence of a virus, particularly the new coronavirus (SARS-CoV-2), which is the target substance 102, and the first enzyme 103 in the same reaction system.
  • the virus By utilizing the phenomenon in which hydrogen peroxide is generated by activation and a series of reactions in which the generated hydrogen peroxide reacts with the second substrate 108 is promoted, the virus, especially the new coronavirus (SARS-CoV-2) ).
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • the mechanism by which a series of reactions is promoted by the coexistence of the virus and the first enzyme 103 in the same reaction system is not clear, but one hypothesis is that weak peroxidase activity exists on the virus surface, and the first enzyme It is believed that the reaction between the hydrogen peroxide generated by 103 and the second substrate is catalyzed.
  • a first enzyme 103 that specifically binds to the target substance 102 is prepared.
  • the first enzyme 103 has an oxidase activity that catalyzes an enzymatic reaction using a predetermined substance as a substrate (first substrate 104) and generates hydrogen peroxide.
  • the first enzyme 103 forms a complex with a binding portion 105 that specifically binds to the target substance 102.
  • the binding portion 105 is a target substance 102, that is, an antibody molecule against the RBD of the new coronavirus (SARS-CoV-2) or a nucleic acid aptamer having the ability to bind to the RBD of the new coronavirus (SARS-CoV-2). It can be a molecule that specifically binds to the target substance 102 such as.
  • Examples of the first enzyme 103 include glucose oxidase, aldehyde oxidase, cytochrome oxidase, cytochrome oxidase, catechol oxidase, diphenol oxidase, cholesterol oxidase, cytochrome C oxidase, hypoxanthine oxidase, xanthine oxidase, NADPH oxidase, lactate oxidase, and galactose. Oxidase, alcohol oxidase, etc. can be used.
  • first substrate 104 can be appropriately selected and used depending on the type of the first enzyme 103.
  • the pair of first enzyme 103 and first substrate 104 is preferably glucose oxidase and glucose. This is because glucose, which is the first substrate 104, is a stable compound and is inexpensive.
  • the binding portion 105 is used as a means for binding the first enzyme 103 to the target substance 102, and the binding portion 105 uses the RBD of the target substance 102, that is, the new coronavirus (SARS-CoV-2) as an antigen.
  • SARS-CoV-2 the new coronavirus
  • ACE2 fragments that interact with the RBD can also be used.
  • the binding portion 105 may be an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD in the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2), or may be an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2), or an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2), or an antibody molecule whose antigen is a region other than the RBD of the spike protein of the new coronavirus (SARS-CoV-2). It may also be an antibody molecule used as an antigen.
  • the antibody molecule may be an immunoglobulin (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) antibody, a heavy chain antibody, or a fragment antibody.
  • Immunoglobulin antibodies consist of a heavy chain (VH) and a light chain (LH), and the heavy chain and light chain each have three CDRs, CDR1, CDR2, and CDR3.
  • a heavy chain antibody consists only of a heavy chain, and has three CDRs in the heavy chain: CDR1, CDR2, and CDR3.
  • Fragment antibodies are antibodies fragmented using enzymes or genetic engineering methods, and include Fab, F(ab'), F(ab') 2 , Fv, VHH antibodies, and the like.
  • fragment antibodies are scFab and scF( ab') and scF(ab') 2 are also included.
  • a linker sequence may be attached to the C-terminal side of the light chain, and a heavy chain may be further attached to the C-terminal side.
  • a linker sequence may be attached to the C-terminus of the heavy chain, and a light chain may be further attached to the C-terminus.
  • scFV which is made into a single chain antibody by linking the light chain variable region and the heavy chain variable region via a linker sequence, can also be used as the binding portion 105.
  • the binding portion 105 is an aptamer
  • the second aptamer described above can be used as the aptamer molecule.
  • this system includes a second substrate 108 that is a substrate for the peroxidase activity on the surface of the target substance 102, which is a virus, particularly the new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • the second substrate 108 is preferably a substance that serves as a substrate for peroxidase activity and allows optical detection of the progress of the peroxidase reaction.
  • orthophenylenediamine or luminol can be used as the second substrate 108.
  • the virus which is the target substance 102
  • the virus which is the target substance 102
  • the virus can detect the new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • the target substance 102 is present in the reaction system, a state is formed in which the first enzyme 103 indirectly binds to the target substance 102 via the binding portion 105.
  • an oxidase reaction using the first substrate 104 proceeds by the first enzyme 103, and hydrogen peroxide is generated.
  • hydrogen peroxide is generated near the surface of viruses, especially the new coronavirus (SARS-CoV-2).
  • the chemical reaction promoted by the presence of a virus, especially the new coronavirus (SARS-CoV-2) and the first enzyme 103 in the same reaction system can be detected.
  • a virus especially the new coronavirus (SARS-CoV-2) and the first enzyme 103 in the same reaction system
  • an optically detectable substance such as luminol
  • the chemiluminescence generated by the so-called luminol reaction can be measured to detect viruses, especially the new coronavirus (SARS-CoV-2), which is the target substance 102. 2
  • the means for measuring chemiluminescence is not particularly limited, and may be measured visually or by ultra-weak chemiluminescence measuring method.
  • the first enzyme 103 if the target substance 102 is not present in the reaction system in which the first enzyme 103 fused to the binding part 105, the first substrate 104, and the second substrate 108 are present, the first enzyme 103 Although the oxidase reaction using the substrate 104 proceeds and hydrogen peroxide is generated, there is no virus, especially the new coronavirus (SARS-CoV-2), which is the target substance 102, in the vicinity of the first enzyme 103. Therefore, the second substrate 108 hardly reacts.
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • a first reagent containing at least the first substrate 104 and a second reagent containing at least the first enzyme 103 can be used.
  • components other than the first substrate 104 and the first enzyme 103 may be contained in either the first reagent or the second reagent, or may be contained in both. May be included.
  • the present system described above is not particularly limited and can be applied to various situations in which a target substance 102 having peroxidase activity is detected.
  • the present system is particularly applicable to systems for detecting viruses, especially the novel coronavirus (SARS-CoV-2).
  • SARS-CoV-2 novel coronavirus
  • viruses can be detected quickly and easily.
  • the above-mentioned reaction system is constructed by spraying the first reagent and the second reagent onto a place where virus attachment is suspected. Based on the chemiluminescence caused by the presence of the virus and the first enzyme 103 contained in the second reagent in the same reaction system, it can be determined whether the virus, which is the target substance 102, is attached to the location. .
  • this system can be applied to a device that detects whether a virus, which is the target substance 102, is contained in the air.
  • Such devices include air purifiers, air conditioners, hand-held simple air collectors, air collectors installed at the entrances and exits of buildings and rooms, exhalation and cough collection equipment installed in hospitals, etc. can be mentioned. These devices have in common that they pass air through a filter, and by applying this system, it is possible to detect viruses attached to the filter.
  • the above-mentioned reaction system may be constructed by spraying the first reagent and the second reagent onto the filter, or the first reagent and the second reagent may be sprayed onto the fine particles or dust repaired by the filter.
  • the above-mentioned reaction system may be constructed by spraying the reagent.
  • the filters disposable in these devices it becomes possible to successively detect viruses, which are the target substances 102.
  • this system can be applied to a device that detects whether a virus, which is the target substance 102, is contained in a liquid.
  • a device that detects whether a virus, which is the target substance 102, is contained in a liquid.
  • examples of such devices include devices that collect saliva and other body fluids collected from patients complaining of fever symptoms, etc., and devices that collect liquids soaked in clothing, masks, etc. worn by medical workers. can.
  • Such a device collects a liquid that may contain the target substance 102, a virus.
  • the above-described reaction system can be constructed by adding the first reagent and the second reagent to the collected liquid. In this way, when detecting the target substance 102 contained in a liquid, a homogeneous detection system can be used, which requires only the addition of reagents and does not require Bound/Free separation.
  • chemiluminescence in a liquid can be easily detected using a solid-state imaging device such as a CCD (charge-coupled device) image sensor or a CMOS image sensor. Therefore, for example, in combination with a microchannel device, a simple and high-performance virus testing device can be produced.
  • a solid-state imaging device such as a CCD (charge-coupled device) image sensor or a CMOS image sensor. Therefore, for example, in combination with a microchannel device, a simple and high-performance virus testing device can be produced.
  • a specific virus new coronavirus (SARS-CoV-2)
  • SARS-CoV-2 new coronavirus
  • a detection system as shown in FIG. 3 may be used as a system that does not utilize the nucleic acid molecule according to the present invention described above.
  • the target substance 102 is captured on the surface of the magnetic particles 110, and the target substance 102 is detected.
  • hydrogen peroxide is generated by the oxidase activity of the first enzyme 103, and the generated hydrogen peroxide and The target substance 102 is detected by utilizing a phenomenon in which a series of reactions in which the second substrate 108 reacts is promoted.
  • a first enzyme 103 that specifically binds to the target substance 102 is prepared.
  • the first enzyme 103 has an oxidase activity that catalyzes an enzymatic reaction using a predetermined substance as a substrate (first substrate 104) and generates hydrogen peroxide.
  • the first enzyme 103 forms a complex with a binding portion 105 that specifically binds to the target substance 102.
  • the binding portion 105 can be a molecule that specifically binds to the target substance 102, such as an antibody molecule for the target substance 102 or a nucleic acid aptamer.
  • the enzyme and substrate described in [Target Substance Detection 2] can be used.
  • an antibody molecule or an aptamer molecule such as the above-mentioned second aptamer can be appropriately used as described in [Target Substance Detection 2].
  • orthophenylenediamine or luminol can be used as the second substrate 108.
  • the magnetic particles 110 are not particularly limited, and commercially available magnetic particles, magnetic particles produced by magnetic bacteria, and the like can be used. Among these, it is preferable to use magnetic particles produced by magnetic bacteria (also referred to as Bacterial Magnetic Particles (BMP)).
  • Magnetic bacteria are not particularly limited, and include, for example, Magnetospirillum magnetotacticum MS-1, M. magneticum AMB-1, M. gryphiswaldense MSR-1, Magnetococcus marinus MC-1, Magnetovibrio blakemorei MV1, Desulfovibrio magneticus RS-1, etc. be able to. Magnetic particles produced by these magnetic bacteria can be used as appropriate.
  • the magnetic particles 110 carry the target substance 102 on their surfaces.
  • the method of supporting the target substance 102 on the surface of the magnetic particles 110 is not particularly limited, and includes a method of chemically reacting a functional group introduced on the surface of the magnetic particle 110 with a functional group introduced on the target substance 102, Examples include a method of providing a means for supporting the target substance 102 on the surface of the magnetic particles 110 produced by bacteria.
  • the target substance 102 has a tag peptide 112, and when the tag peptide 112 binds to the tag capture peptide 111, it is supported on the surface of the magnetic particle 110.
  • the tag capture peptide 111 is introduced onto the surface of the magnetic particle 100, and the tag peptide 112 is introduced onto the target substance 102, but this may be reversed. That is, the tag peptide 112 may be introduced onto the surface of the magnetic particle 100, and the tag capture peptide 111 may be introduced into the target substance 102.
  • tag peptide 112 and tag capture peptide 111 examples include SpyTag/SpyCatcher system (Bijan Zakeri et al., PNAS, 109 (12) E690-E697, 2012) and SnoopCatcher/SnoopTag system (Gianluca Veggiani et al., PNAS, 113 (5) 1202-1207, 2016).
  • SpyTag2/SpyCatcher2 system As the tag peptide 112 and the tag capture peptide 111, the SpyTag2/SpyCatcher2 system (Keeble et al., Angew. Chem. Int. Ed.
  • a magnetosome display technique using a magnetite-binding protein such as Mms13 can be applied.
  • a polynucleotide encoding the tag-capturing peptide 111 is linked downstream of the Mms13 gene, and a fusion protein having the tag-capturing peptide 111 downstream of Mms13 is expressed in magnetic bacteria.
  • magnetic particles 110 displaying the fusion protein on the surface can be produced within the magnetic bacteria.
  • the magnetic particles 110 can be recovered from the magnetic bacteria according to a standard method.
  • a method for supporting the target substance 102 on the surface of the magnetic particles 110 there can be mentioned a method of expressing a fusion protein having an antibody against the target substance 102 downstream of Mms13 in magnetic bacteria. According to this method, there is no need to introduce the tag peptide 112 into the target substance 102, and the target substance 102 can be supported on the surface of the magnetic particles 110 based on the antibody-antigen reaction.
  • the target substance 102 can be detected in a reaction system in which the first enzyme 103 fused to the binding portion 105, the first substrate 104, and the second substrate 108 are present. can.
  • a state is formed in which the first enzyme 103 indirectly binds to the target substance 102 via the binding portion 105.
  • an oxidase reaction using the first substrate 104 proceeds by the first enzyme 103, and hydrogen peroxide is generated. That is, hydrogen peroxide is generated near the surface of the magnetic particles 110. Therefore, due to the peroxidase activity present on the surface of the magnetic particles 110, a peroxidase reaction using hydrogen peroxide generated in the enzymatic reaction of the first enzyme 103 and the second substrate 108 proceeds.
  • the target substance 102 can be detected by measuring the chemical reaction promoted by the presence of the target substance 102 and the first enzyme 103 in the same reaction system.
  • the target substance 102 can be detected by measuring chemiluminescence generated by a so-called luminol reaction.
  • the means for measuring chemiluminescence is not particularly limited, and may be measured visually or by ultra-weak chemiluminescence measuring method.
  • the target substance 102 is not present in the reaction system in which the first enzyme 103 fused to the binding part 105, the first substrate 104, and the second substrate 108 are present, the first enzyme 103 Although the oxidase reaction using the substrate 104 proceeds and hydrogen peroxide is generated, the second substrate 108 hardly reacts because the magnetic particles 110 are not present in the vicinity of the first enzyme 103.
  • a first reagent containing at least the first substrate 104 and a second reagent containing at least the first enzyme 103 can be used.
  • components other than the first substrate 104 and the first enzyme 103 may be contained in either the first reagent or the second reagent, or may be contained in both. May be included.
  • the present system described above is not particularly limited, and can be applied to various situations in which the target substance 102 is detected by supporting the target substance 102 on the surface of the magnetic particles 110 having peroxidase activity.
  • the virus By using a protein specifically possessed by a virus as the target substance 102, the virus can be detected quickly and easily. Further, by using a specific allergen as the target substance 102, the allergen can be detected quickly and easily.
  • this system can be applied to a device that detects whether the target substance 102 is contained in the air. That is, it is possible to detect a target substance attached to a filter through which air passes.
  • this system can be applied to a device that detects whether the target substance 102 is contained in a liquid.
  • a device collects a liquid that may contain the target substance 102.
  • the above-described reaction system can be constructed by adding the first reagent and the second reagent to the collected liquid.
  • a homogeneous detection system can be used, which requires only the addition of reagents and does not require Bound/Free separation.
  • chemiluminescence in a liquid can be easily detected using a solid-state imaging device such as a CCD (charge-coupled device) image sensor or a CMOS image sensor. Therefore, for example, in combination with a microchannel device, a simple and high-performance virus testing device can be produced.
  • the target substance 102 can be supported on the surface of the magnetic particles 110 and the target substance 102 can be detected.
  • the magnetic particles 110 carrying the target substance 102 can be collected by magnetic force, and chemiluminescence generated by a luminol reaction or the like can be highly sensitive. Therefore, even if the target substance 102 exists only at an extremely low concentration, it can be detected with high precision by using this system.
  • FIG. 4 An outline of this system is shown in Figure 4.
  • an aptamer molecule 200 consisting of the first aptamer described above and a first enzyme 202 that specifically binds to hemoglobin 201 are prepared.
  • the first enzyme 202 has an oxidase activity that catalyzes an enzymatic reaction using a predetermined substance as a substrate (first substrate 203) and generates hydrogen peroxide.
  • the first enzyme 202 forms a complex with an antibody 204 that specifically binds to hemoglobin 201.
  • the antibody 204 can be an antibody molecule against hemoglobin 201.
  • glucose oxidase for example, glucose oxidase, aldehyde oxidase, cytochrome oxidase, cytochrome oxidase, catechol oxidase, diphenol oxidase, cholesterol oxidase, cytochrome C oxidase, hypoxanthine oxidase, xanthine oxidase, NADPH oxidase, etc.
  • glucose oxidase aldehyde oxidase
  • cytochrome oxidase for example, glucose oxidase, aldehyde oxidase, cytochrome oxidase, catechol oxidase, diphenol oxidase, cholesterol oxidase, cytochrome C oxidase, hypoxanthine oxidase, xanthine oxidase, NADPH oxidase, etc.
  • glucose oxidase aldehyde
  • first substrate 203 can be appropriately selected and used depending on the type of the first enzyme 202.
  • the pair of first enzyme 202 and first substrate 203 is preferably glucose oxidase and glucose. This is because glucose, which is the first substrate 203, is a stable compound and is inexpensive.
  • the means for binding the first enzyme 202 to hemoglobin 201 is not limited to the antibody 204 that uses hemoglobin 201 as an antigen, but also aptamer molecules that interact with hemoglobin 201 (aptamers other than aptamer molecule 200), proteins, or the like. Partial fragments can also be used.
  • the antibody 204 may have an epitope in any region of hemoglobin 201.
  • this system includes a second substrate 205 that serves as a substrate for hemoglobin 201 having peroxidase activity.
  • the second substrate 205 is preferably a substance that can optically detect the progress of the peroxidase reaction caused by the hemoglobin 201.
  • orthophenylenediamine or luminol can be used as the second substrate 205.
  • the present system preferably includes a third enzyme that consumes hydrogen peroxide produced by the oxidase reaction by the first enzyme 202 as a substrate.
  • the third enzyme is an enzyme that consumes hydrogen peroxide as a substrate, and for example, catalase can be used.
  • hemoglobin 201 which is the target substance
  • a state is formed in which the aptamer molecule 200 binds to hemoglobin 201 and the first enzyme 202 indirectly binds to hemoglobin 201 via antibody 204.
  • the oxidase reaction using the first substrate 203 proceeds by the first enzyme 202, and hydrogen peroxide is generated.
  • hemoglobin 201 Since the hemoglobin 201 is located close to the first enzyme 202, it consumes hydrogen peroxide generated by the enzymatic reaction of the first enzyme 202. As a result, the peroxidase reaction using the second substrate 205 by hemoglobin 201 proceeds.
  • hemoglobin 201 can be detected by measuring the peroxidase reaction of hemoglobin 201 using the second substrate 205.
  • hemoglobin 201 can be detected by measuring chemiluminescence generated by a so-called luminol reaction.
  • the means for measuring chemiluminescence is not particularly limited, and may be measured visually or by ultra-weak chemiluminescence measuring method.
  • hemoglobin 201 is not present in the reaction system in which the aptamer molecule 200, the first enzyme 202 fused to the antibody 204, the first substrate 203, and the second substrate 205 are present, the first enzyme 202 Although the oxidase reaction using the first substrate 203 proceeds and hydrogen peroxide is generated, the peroxidase reaction using the second substrate 205 caused by hemoglobin 201 does not proceed.
  • a first reagent containing at least the first substrate 203 and a second reagent containing at least the first enzyme 202 can be used.
  • components other than the first substrate 203 and the first enzyme 202 may be included in either the first reagent or the second reagent, or may be included in both. You can leave it there.
  • the reagent into the first reagent and the second reagent the progress of the oxidase reaction using the first substrate 203 by the first enzyme 202 can be suppressed during storage of the reagent.
  • the first reagent and the second reagent are mixed, the oxidase reaction using the first substrate 203 by the first enzyme 202 can proceed, and as described above, hemoglobin 201 can be detected. can do.
  • SpyCatcher-fused glucose oxidase and SpyTag-fused anti-SARS-CoV-2 S protein antibody were prepared by recombinant production using Escherichia coli BL21 (DE3) strain.
  • the SpyCatcher-fused glucose oxidase includes a fusion protein with glucose oxidase (GOx) and SpyCatcher in the order from the N-terminus (referred to as GOx-SpyCatcher), and a fusion protein with SpyCatcher and GOx in the order from the N-terminus (referred to as GOx-SpyCatcher).
  • SpyCatcher-GOx was prepared.
  • two types of SpyTag-fused anti-SARS-CoV-2 S protein antibodies were prepared: one with variable domain of heavy chain of heavy chain antibody: VHH and one with single-chain variable fragment: scFv. .
  • amino acid sequence of GOx-SpyCatcher is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence of SpyCatcher-GOx is shown in SEQ ID NO: 18. Furthermore, the amino acid sequence of the SpyTag fusion anti-SARS-CoV-2 S protein VHH is shown in SEQ ID NO: 19, and the amino acid sequence of the SpyTag fusion anti-SARS-CoV-2 S protein scFv is shown in SEQ ID NO: 20.
  • a complex formation experiment was performed as follows using SpyCatcher-GOx and SpyTag fusion anti-SARS-CoV-2 S protein VHH or SpyTag fusion anti-SARS-CoV-2 S protein scFv. That is, the combination of SpyCatcher-GOx and SpyTag-fused anti-SARS-CoV-2 S protein VHH and the combination of SpyCatcher-GOx and SpyTag-fused anti-SARS-CoV-2 S protein scFv were mixed stoichiometrically and then allowed to stand. Here, they were diluted to 10 ⁇ M and 5 ⁇ M with phosphate buffer (pH 7.0), mixed in equal amounts, and allowed to stand overnight at 4°C.
  • phosphate buffer pH 7.0
  • SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE.
  • Figure 5 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Figure 5 As shown in Figure 5, for all combinations, a clear band was observed near the molecular weight where GOx and antibody (VHH or scFv) were predicted to form a complex due to covalent bond formation between SpyCatcher/SpyTag. . Based on this result, it was determined that a complex was formed between glucose oxidase and the antibody against the SARS-CoV-2 S protein.
  • Example 2 Oxidase activity measurement of antibody-enzyme complex
  • the oxidase activity of GOx, SpyCatcher-fused GOx, and the antibody-enzyme complex prepared in Example 1 was measured.
  • Western at a final concentration of 2 U/mL.
  • 20 ⁇ L of the diluted measurement sample was mixed with 160 ⁇ L of phosphate buffer (pH 7.0) containing horseradish peroxidase.
  • V max was slightly decreased by SpyCatcher fusion, and further decreased by antibody-enzyme complex formation. Furthermore, it was confirmed that V max was slightly higher when SpyCatcher was fused to the N-terminus of GOx than when it was fused to the C-terminus.
  • Example 3 Structural evaluation of fused aptamer by circular dichroism (CD) spectrum measurement and evaluation of structural change due to target binding
  • aptamer RBD-46 that binds to the RBD in the S protein of SARS-CoV-2
  • PDA3-01 aptamer that increases peroxidase activity disclosed in JP2017-200472A.
  • a fusion aptamer was synthesized.
  • the fusion aptamer synthesized in this example consists of RBD-46-PEA3-01 (SEQ ID NO: 21), in which RBD-46 and PEA3-01 are arranged in this order from the 5' end to the 3' end, and the 5' end PEA3-01-RBD-46 (SEQ ID NO: 22) in which PEA3-01 and RBD-46 are arranged in this order toward the 3' end was designed and produced by chemical synthesis. Note that in these RBD-46-PEA3-01 and PEA3-01-RBD-46, a ttt sequence is inserted between PEA3-01 and RBD-46.
  • the synthesized fusion aptamers (RBD-46-PEA3-01, PEA3-01-RBD-46) were prepared with potassium acetate buffer (pH 5.0) to a final concentration of 10 ⁇ M, heat-treated at 95°C for 10 minutes, and incubated for 25 minutes. Folding was performed by slowly cooling to °C.
  • the CD spectrum of the folded fusion aptamer was measured at a wavelength of 220 to 320 nm using a J-720 circular dichroism spectrometer (JASCO) using a quartz cell (light path length 1 cm). The measurement was performed after diluting with potassium phosphate buffer (pH 7.0) to a final concentration of 1 ⁇ M and leaving it at room temperature for 1 hour.
  • inactivated SARS-CoV-2 virus Sugiyamagen
  • 50 dC of inactivated SARS-CoV-2 virus was mixed with myoglobin (Life Diagnostics) at a final concentration of 1 ⁇ M and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Measured later. Data processing was performed by subtracting the measurement results in the absence of the fusion aptamer under each condition.
  • the guanine quadruplex (G4) structure is formed by four guanines arranged in parallel in the vertical direction. This G4 structure is roughly divided into parallel type and antiparallel type, depending on the order in which the guanines are arranged.
  • CD spectrum measurement if a positive peak near 260 nm and a negative peak near 240 nm are observed, it is a parallel type, and if a positive peak near 290 nm and a negative peak near 260 nm are observed, it is an antiparallel type. I can say that.
  • the fused aptamer evaluated this time was considered to be a mixture of parallel and antiparallel types, as a positive peak was observed around 290 nm and a negative peak was observed around 240 nm (Figure 7). This is thought to be due to the fact that the fused aptamer used this time is a combination of two types of aptamers.
  • the inactivated SARS-CoV-2 virus or the inactivated SARS-CoV-2 virus was mixed with myoglobin, a shoulder was observed in the spectrum around 260 nm.
  • Example 4 Examination of folding conditions of fusion aptamer by blotting
  • biotin was purified using a total of four types of buffers, including conditions using sodium acetate buffer (pH 5.0) or sodium phosphate buffer (pH 7.0) and conditions using potassium chloride concentration of 10 mM or 150 mM.
  • the conjugated aptamers (RBD-46-PEA3-01, PEA3-01-RBD-46) were diluted to 1 ⁇ M, and folding was performed in the same manner as in Example 3. 0.35 ⁇ g and 3.5 ⁇ g of myoglobin or 5 dC and 20 dC of inactivated SARS-CoV-2 virus were spotted onto nitrocellulose membranes and fixed by air drying.
  • the membrane was washed with sodium phosphate buffer containing 0.05% Tween-20. It was immersed in biotinylated fusion aptamer diluted to a final concentration of 100 nM with sodium phosphate buffer containing each potassium chloride concentration, and reacted for 1 hour at room temperature. After washing, commercially available streptavidin-fused alkaline phosphatase was diluted 1000 times and reacted at room temperature for 1 hour. After adding the chemiluminescent substrate CDP-Star (Sigma-Aldrich) and reacting at room temperature for 5 minutes, chemiluminescence was observed using a chemiluminescent imager ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare).
  • CDP-Star Sigma-Aldrich
  • Example 5 Examination of myoglobin and fusion aptamer mixing ratio
  • Folding was performed in the same manner as in Example 3 using the fusion aptamer (PEA3-01-RBD-46) diluted to 10 ⁇ M with sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM potassium chloride.
  • molar ratios of myoglobin (Life Diagnostics) at a final concentration of 100 nM and fusion aptamer are 1:10, 1:5, 1:2, 1:1, 1:0.5, 1:0.1, and 1:0.
  • the mixture was diluted with sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM potassium chloride, mixed in 10 ⁇ L portions, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Example 6 Inactivated SARS-CoV-2 virus detection 1
  • An antibody-enzyme complex was prepared using the anti-SARS-CoV-2 S protein antibody scFv prepared in Example 1 and SpyCatcher-GOx.
  • the fusion aptamer (PEA3-01-RBD-46) was folded in sodium phosphate containing 10 mM potassium chloride (pH 7.0).
  • 5 ⁇ L each of 1 ⁇ M antibody-enzyme complex, 2 ⁇ M myoglobin, 10 ⁇ M fusion aptamer, and 50 dC, 30 dC, or 10 dC inactivated SARS-CoV-2 virus were mixed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • FIG. 10 shows the measurement results of chemiluminescence intensity 2 minutes after the start of the measurement.
  • An increase in chemiluminescence intensity dependent on the amount of inactivated virus was confirmed from 10 dC to 50 dC.
  • chemiluminescence intensity comparable to the background was confirmed. Therefore, it was shown that inactivated SARS-CoV-2 is detectable.
  • the sensitivity which is the slope of the calibration curve, was calculated to be 39 dC -1 .
  • the detection limit which is three times the standard deviation of the background, was calculated to be 9.8 dC.
  • Example 7 Inactivated SARS-CoV-2 virus detection 2
  • An antibody-enzyme complex was prepared using the anti-SARS-CoV-2 S protein antibody scFv prepared in Example 1 and SpyCatcher-GOx.
  • a fusion aptamer (PS2.M-RBD-46) consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 43 was used as the fusion aptamer.
  • This fusion aptamer (PS2.M-RBD-46) was designed as a base sequence in which PS2.M and RBD-46 were arranged in this order from the 5' end to the 3' end, and was produced by chemical synthesis.
  • PS.2 is known as an aptamer that binds to hemin and exhibits the activity of increasing peroxidase activity in hemin, as disclosed in Cheng et al., Biochemistry, 2009, 48, 7817-7823.
  • the fusion aptamer (PS2.M-RBD-46) was folded in sodium phosphate (pH 7.0) containing 10 mM potassium chloride.
  • PSH 7.0 sodium phosphate
  • a 96-well plate mix 5 ⁇ L each of 1 ⁇ M antibody-enzyme complex, 1 ⁇ M hemin, 1 ⁇ M fusion aptamer, and 50 dC, 25 dC, 12.5 dC, 5 dC, or 2.5 dC of inactivated SARS-CoV-2 virus and incubate at room temperature. It was left to stand for 1 hour.
  • FIG. 11 shows the results of measuring chemiluminescence intensity in this example. As shown in FIG. 11, a viral load-dependent increase in chemiluminescence was observed within the range of inactivated SARS-CoV-2 virus tested. This example shows that inactivated SARS-CoV-2 can be detected using hemin as a porphyrin and an aptamer that increases peroxidase activity in hemin as a fusion aptamer.
  • Example 8 Detection of inactivated SARS-CoV-2 virus 3 with changed conditions
  • An antibody-enzyme complex was prepared using the anti-SARS-CoV-2 S protein antibody scFv prepared in Example 1 and SpyCatcher-GOx.
  • the fusion aptamer PS2.M-RBD-466 was folded in sodium phosphate containing 10 mM potassium chloride (pH 7.0).
  • FIG. 12 The results of measuring chemiluminescence intensity in this example are shown in FIG. 12. As shown in FIG. 12, similar to Example 7, a viral load-dependent increase in chemiluminescence was observed within the range of inactivated SARS-CoV-2 virus tested. In particular, in this example, it was confirmed that the overall chemiluminescence intensity was further increased than under the conditions of Example 7. On the other hand, for the inactivated influenza virus and bovine serum albumin used for comparison, chemiluminescence intensity comparable to the background was confirmed.
  • Example 9 Study for visual detection of inactivated SARS-CoV-2 virus
  • the mixing ratio of the fusion aptamer (PS2.M-RBD-46) and hemin was changed, and a reaction system for visually detecting the inactivated SARS-CoV-2 virus was investigated.
  • the fusion aptamer (PS2.M-RBD-46) was folded in sodium phosphate (pH 7.0) containing 10 mM potassium chloride.
  • a 96-well protein low-binding plate add 5 ⁇ L each of 10 ⁇ M of the fusion aptamer and various concentrations of hemin (100 ⁇ M, 70 ⁇ M, 50 ⁇ M, 20 ⁇ M, 10 ⁇ M, or 5 ⁇ M) and sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM potassium chloride. 10 ⁇ L of each was mixed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • FIG. 13 shows the results of measuring chemiluminescence intensity in this example. As shown in Figure 13, it is extremely effective when the mixing ratio of the fusion aptamer (PS2.M-RBD-46) and hemin (fusion aptamer: hemin) is 1:5, that is, the hemin concentration exceeds 5 times the aptamer concentration. It was found that high chemiluminescence intensities can be achieved.
  • Example 10 Visual detection of inactivated SARS-CoV-2 virus
  • a system for visually detecting inactivated SARS-CoV-2 virus was constructed.
  • An antibody-enzyme complex was prepared using the anti-SARS-CoV-2 S protein antibody scFv prepared in Example 1 and SpyCatcher-GOx.
  • the fusion aptamer PS2.M-RBD-466 was folded in sodium phosphate containing 10 mM potassium chloride (pH 7.0).
  • FIG. 14 The results of measuring chemiluminescence intensity in this example are shown in FIG. 14, and the results of imaging with iPhone (registered trademark) 12 are shown in FIG. 15.
  • FIG. 14 a significantly high chemiluminescence intensity could be observed under the conditions of this example, and it was confirmed that the chemiluminescence intensity increased depending on the amount of virus.
  • FIG. 15 under the conditions of this example, it was shown that chemiluminescence on the plate could be detected using the camera function of iPhone (registered trademark) 12 (ISO sensitivity: 8000, F value: 1.6, shutter speed: 1.1 seconds (3 seconds shot in night mode)). Note that under this condition, it was possible to detect up to about 1.5 ⁇ 10 7 au.
  • Example 11 Inactivated SARS-CoV-2 virus detection experiment by spraying reaction solution
  • the aim was to construct a system that could detect the presence of the virus on-site, and it was verified whether inactivated SARS-CoV-2 virus could be detected by spraying the reaction solution.
  • inactivated SARS-CoV-2 at 50 dC, 25 dC or 0 dC was spotted onto a nitrocellulose membrane and allowed to dry for several minutes at room temperature.
  • 15 ⁇ L of a reaction solution containing 333 nM antibody-enzyme complex, 3.3 ⁇ M fusion aptamer, and 16.7 ⁇ M hemin was spotted, and then incubated at room temperature for 20 minutes.
  • BM chemiluminescent ELISA substrate (POD) solution A (Roche) containing glucose (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 250 mM and catalase (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a final concentration of 30 ng/mL. Filled the dispenser. Finally, the detection solution was sprayed onto the membrane, and chemiluminescence was detected by imaging the membrane using the camera function of iPhone (registered trademark) 12.
  • the surface of the membrane was imaged with an iPhone (registered trademark) 12, and the results are shown in FIG. 16.
  • the inactivated SARS-CoV-2 virus spotted on the nitrocellulose membrane could be detected using the camera function of the iPhone® 12 by spraying the detection solution (iso Sensitivity: 4000, F value: 1.6, Shutter speed: 3.3 seconds (29 seconds shot in night mode)). Under these conditions, it was possible to detect up to about 9.0 ⁇ 10 5 au.
  • Example 12 Preparation of antibody-enzyme complex for influenza virus detection
  • a SpyTag-fused anti-influenza virus hemagglutinin antibody scFv was prepared by recombinant production using Escherichia coli BL21 (DE3) strain (SEQ ID NO: 44).
  • an antibody-enzyme complex was prepared by mixing SpyCatcher-GOx prepared in the same manner as in Example 1 and a SpyTag-fused anti-influenza virus hemagglutinin antibody scFv.
  • Example 13 Detection of inactivated influenza virus
  • a fusion aptamer of an aptamer (2R-01, SEQ ID NO: 45) that binds to hemagglutinin of influenza virus and an aptamer (PEA3-01) that increases peroxidase activity disclosed in JP-A No. 2017-200472 was used. was synthesized.
  • the fusion aptamer synthesized in this example was designed as PEA3-01-2R-01 (SEQ ID NO: 46), in which PEA3-01 and 2R-01 are arranged in this order from the 5' end to the 3' end, and Produced by synthesis. Note that in PEA3-01-2R-01, a ttt sequence is inserted between PEA3-01 and 2R-01.
  • PEA3-01-2R-01 was folded using a sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM potassium chloride.
  • a sodium phosphate buffer pH 7.0
  • 5 ⁇ L of each of 55 ⁇ 10 2 particles of inactivated influenza virus was mixed and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • reagents were mixed and chemiluminescence intensity was measured.
  • FIG. 18 shows the measurement results of chemiluminescence intensity 2 minutes after the start of the measurement. As shown in FIG. 18, an increase in chemiluminescence intensity depending on the amount of inactivated influenza virus from 55 ⁇ 10 4 to 55 ⁇ 10 2 particles was confirmed. This example showed that influenza virus can be detected similarly to SARS-CoV-2 virus.
  • Example 14 Detection of inactivated SARS-CoV-2 using antibody-enzyme complex
  • FIG. 19 shows the results of measuring chemiluminescence intensity in this example.
  • an increase in chemiluminescence intensity dependent on the amount of inactivated SARS-CoV-2 virus from 2.5 to 25 dC was confirmed.
  • virus in this example, it was found that inactivated SARS-CoV-2 can be detected.
  • Example 15 Detection of inactivated SARS-CoV-2 virus, study of reaction time
  • 5 ⁇ L each of 1 ⁇ M antibody-enzyme complex, 2 ⁇ M myoglobin, 10 ⁇ M fusion aptamer, and 50 dC, 30 dC, or 10 dC inactivated SARS-CoV-2 virus were mixed and left at room temperature for 15 minutes.
  • the chemiluminescence intensity was measured in the same manner as in Example 6.
  • FIG. 20 shows the measurement results of chemiluminescence intensity 2 minutes after the start of the measurement. As shown in FIG. 20, an increase in chemiluminescence intensity dependent on the amount of inactivated virus was confirmed from 50 dC to 500 dC.
  • the results of this example revealed that the inactivated SARS-CoV-2 virus can be detected in a shorter time.
  • Example 16 Preparation of Mms13-SC-Flag-BMP
  • Mms13-SC-Flag-BMP magnetic particles having a fusion protein of Mms13 protein and spy catcher (hereinafter referred to as SC) on the surface were created.
  • SC spy catcher
  • the fusion protein of Mms13 protein and SC has a Flag tag fused downstream (C-terminal side) of SC so that it can be detected with a tag antibody.
  • An expression vector pUMtOR13-SC-Flag was constructed by fusing Mms13 with SpyCatcher (SC) and a Flag tag, and the magnetic bacterium M. magneticum AMB- 1 strain was transformed by electroporation. Recovery culture was performed for 6 to 12 hours in spirillum growth medium (MSGM) medium.
  • MSGM spirillum growth medium
  • the transformant was inoculated into 40 mL of MSGM medium (Amp, fc 0.5 ⁇ g/mL), and the culture was statically cultured at 28° C. for about 5 days under microaerobic conditions by replacing with argon. Thereafter, it was subcultured into 40 mL of MSGM medium (Amp, fc 5 ⁇ g/mL) and cultured under the same conditions until the stationary phase.
  • the culture solution was centrifuged at 8,000g at 4°C for 15 minutes, and the resulting bacterial cells were suspended in 10mM HEPES buffer (pH 7.4) and crushed using a French press (manufactured by Ohtake Seisakusho Co., Ltd.). Thereafter, magnetic separation was performed using a neodymium-iron-boron (Nd-Fe-B) magnet, and the supernatant was removed and resuspended in HEPES. By repeating this operation 10 times, purified Mms13-SC-Flag-BMP was obtained.
  • the base sequence encoding the Mms13-SC-Flag fusion protein and the amino acid sequence of the fusion protein are shown in SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively.
  • the 1st to 127th positions counting from the N-terminus are Mms13
  • the 128th to 243rd positions are spy catcher
  • the 244th to 251st positions are a Flag tag.
  • the membrane protein fraction was extracted from BMP by adding 5 ⁇ L of 1% SDS to purified Mms13-SC-Flag-BMP (100 ⁇ g) and heating at 99°C for 15 minutes. 5 ⁇ L of the supernatant collected by magnetic separation was spotted on a nitrocellulose membrane and fixed by air drying. Next, blocking was performed by shaking for 1 hour with PBS-T in which 2% (w/v) bovine serum albumin (BSA) had been dissolved.
  • BSA bovine serum albumin
  • This membrane was washed three times with PBS-T (0.05% (v/v) Tween20 in PBS buffer) and then shaken for 1 hour with anti-Flag antibody diluted 5000 times with PBS-T. After washing three times with PBS-T, it was shaken for 1 hour with HRP-modified anti-mouse antibody diluted 5000 times with PBS-T. After washing three times with PBS-T, Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Roche) was added dropwise. After standing at room temperature for 5 minutes in the dark, chemiluminescence intensity was measured using a chemiluminescence intensity imager ImageQuant LAS4000 (GE Healthcare). As a negative control, the same operation was performed on Mms13-BMP to which SC-Flag was not fused.
  • Example 17 Functional evaluation of Mms13-SC-Flag-BMP (complex formation evaluation)] 1.5 mg of Mms13-SC-Flag-BMP prepared in Example 16 and 7.5 ⁇ M Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody-SpyTag (VHH- ST) and incubated overnight at 4°C.
  • VHH-ST Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody-SpyTag
  • a VHH-presenting BMP VHH-BMP
  • the nucleotide sequence encoding the VHH-ST fusion protein produced in this example and the amino acid sequence of the fusion protein are shown in SEQ ID NOs: 49 and 50, respectively.
  • the 23rd to 149th positions from the N-terminus are VHH, and the 156th to 168th positions are spy tags.
  • VHH-ST was removed by magnetic separation. It was suspended in 100 ⁇ L of 20mM P.P.B. 0.2M NaCl (pH 7.0), and the supernatant was removed by magnetic separation. This operation was repeated three times for washing.
  • the membrane protein fraction was extracted from BMP by adding 5 ⁇ L of 1% SDS to BMP and heating at 99°C for 15 minutes. The extracted membrane proteins were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After transferring from the gel to a nitrocellulose membrane and washing with PBS-T, blocking was performed by shaking with PBS-T containing 5% skim milk (PBS-MT) for 1 hour.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • scFv-ST was prepared by adding SpyTag to an anti-CRP scFv antibody against C-reactive protein (CRP), and an anti-CRP scFv antibody-presenting BMP (scFv-BMP) was produced.
  • CRP C-reactive protein
  • scFv-BMP anti-CRP scFv antibody-presenting BMP
  • Example 19 Preparation of antibody-enzyme complex and evaluation of binding ability
  • SpyCatcher-GOx prepared in the same manner as in Example 1 and scFv-ST prepared by adding SpyTag to the anti-CRP scFv antibody prepared in Example 18 were mixed stoichiometrically and then allowed to stand.
  • each was diluted with phosphate buffer (pH 7.0) to give a 5 ⁇ M solution, mixed in equal amounts, and left at 4° C. overnight.
  • Example 20 CRP capture evaluation using scFv-BMP and antibody-enzyme complex
  • a CRP capture evaluation test was conducted using the antibody-enzyme complex prepared in Example 19 and the anti-CRP scFv antibody-presenting BMP (scFv-BMP) prepared in Example 18.
  • scFv-BMP anti-CRP scFv antibody-presenting BMP
  • reaction solution f.c. 2U/mL horseradish peroxidase, f.c. 1.5mM N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline (TOOS), f.c. 1.5mM 4-aminoantipyrine ( 4AA), f.c. 200mM glucose (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) and 20mM P.P.B. (pH 7.0)) were added and reacted. After magnetic separation, the absorbance of the separated reaction solution at 555 nm was measured.
  • Example 21 Peroxidase activity of Mms13-SC-Flag-BMP, CRP detection
  • peroxidase activity in Mms13-SC-Flag-BMP was measured.
  • Mms13-SC-Flag-BMP produced in Example 16 was washed three times, and then 40 ⁇ g/5 ⁇ L of Mms13-SC-Flag-BMP was added to a 96-well plate (NUNK, clear).
  • reaction solution fc0, 6, 30, 60, 150, 300 or 600mM H 2 O 2 (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries), TMB (Nacalai Tesque)
  • reaction stop solution 100 ⁇ L of reaction stop solution from the kit (ELISA POD substrate TMB kit (HYPER) was added to stop the reaction. The absorbance of this solution at 450 nm was measured, and the kinetic parameters (K M, V max ) were calculated.
  • K M was calculated to be 14.5 mM
  • V max was calculated to be 0.61 ⁇ 10 ⁇ 8 Ms ⁇ 1 , confirming that the peroxidase activity was approximately equivalent to the literature values.
  • a complex of scFv-BMP, CRP, and GOx-scFv was formed in the same manner as in Example 20 (i.e., with a washing operation), and a 96-well plate (Thermo Fisher, polypropylene, white) was formed. 40 ⁇ g/10 ⁇ L each was added to.
  • 100 ⁇ L of the reaction solution f.c. 200 mM glucose, f.c. 24 ng/mL catalase (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries), Luminol (Tokyo Kasei Kogyo)
  • the reaction solution f.c. 200 mM glucose, f.c. 24 ng/mL catalase (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries)
  • Luminol Tokyo Kasei Kogyo
  • Example 20 it was investigated whether CRP could be similarly detected without a washing operation. That is, scFv-BMP blocked with 2% BSA/TBS, CRP (f.c. 0, 10, 50, 100, 150 or 250 nM) diluted with 2% BSA/TBS-T, GOx-scFv (f.c. 100 nM) 90 ⁇ L of was added. After dispersing BMP by ultrasound, it was incubated at 25°C for 30 minutes. At this time, BMP was dispersed by ultrasound every 10 minutes. Then, 40 ⁇ g/30 ⁇ L of BMP was added to a 96-well plate (Thermo Fisher, polypropylene, white). To this, 80 ⁇ L of the reaction solution (f.c. 200 mM glucose, f.c. 24 ng/mL catalase and luminol) was added, and the chemiluminescence intensity was measured using a plate reader.
  • the reaction solution f.c. 200 mM glucose,
  • Example 22 Peroxidase activity of Mms13-SC-Flag-BMP, CRP detection
  • a system for detecting a target substance without the washing operation as examined in Example 21 was examined, and a case in which catalase was not included in the reaction solution was examined. That is, in this example, the complex of scFv-BMP, CRP and GOx-scFv was added to a 96-well plate in the same manner as in Example 21 without the washing operation, and the reaction solution (fc 200mM glucose and luminol) was added. 80 ⁇ L was added and the chemiluminescence intensity was measured using a plate reader.
  • FIG. 31 shows the results compared with the results of Example 21 using catalase. As shown in FIG. 31, the results showed that the sensitivity was improved when catalase was not included. The reason for this was thought to be that when catalase was added, not only free hydrogen peroxide but also hydrogen peroxide on the acceptor surface was decomposed, causing a decrease in signal and sensitivity. Therefore, it has become clear that in a system that utilizes peroxidase activity on the surface of magnetic particles, it is better not to include catalase in the reaction solution.

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Abstract

所定のアプタマーを用いた実用可能なアッセイ系、特にホモジニアスな標的物質の検出試薬や検出方法を提供する。本検出試薬や検出方法に使用される核酸分子は、ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンに対して作用して、ペルオキシダーゼ活性を増大させる第１のアプタマーと、第１のアプタマーと連結され標的物質に対する結合能を有する第２のアプタマーとを有する。

Description

標的物質の検出試薬及び検出方法
　本発明は、標的物質に対して特異的に結合するアプタマーを用いた、当該標的物質の検出試薬及び当該標的物質の検出方法に関する。
　一般に抗原-抗体反応を用いた免疫測定システムのように、試料中の標的物質を検出する技術が知られている。特に、抗原-抗体反応を用いた免疫測定システムでは、酵素標識体の結合型（B）と遊離型（F）の分離（B/F分離）が不要なホモジニアスアッセイ（均一系免疫測定法、ホモジニアス検出系とも称す）が簡便且つ迅速な測定系として注目されている。これまでに、抗体を用いたホモジニアス検出系として、非特許文献１：Enzyme-multiplied immunoassays technology (EMIT)、非特許文献２：Fluorescence polarization immunoassay (FPIA)、非特許文献３：Fluorescence resonance energy transfer (FRET)及び非特許文献４：Chemiluminescence resonance energy transfer (CRET)が報告されている。
　これら非特許文献１～４に記載された方法では、いずれも抗体に酵素や蛍光物質、化学発光物質を標識することが求められる。
　また、非特許文献５～７には、磁性ナノ粒子を用いてウイルスを検出するホモジニアスアッセイ系が開示されている。
　一方で、シグナルを発出するドナーと、そのシグナルを特異的に受容して、検出シグナルを発出するアクセプターとを用いた検出系も報告されている（非特許文献８及び９）。ドナーに光が照射されると一重項酸素が放出され、非常にわずかな時間溶液中を拡散し、その間に一重項酸素がアクセプターに到達した場合、一重項酸素からエネルギーが伝達され特定の波長の光を放出する。この検出系では、検出対象を介してドナーとアクセプターが近接したとき生じる当該特定の波長のシグナルを検出する。
　また、特許文献１には、第1の酵素と第2の酵素をそれぞれ測定対象物質に特異的に結合させ、第2の酵素により触媒される反応を検出することで、試料中の測定対象物質の濃度を測定する方法が開示されている。ここで、第2の酵素により触媒される反応は、第1の酵素が触媒する反応により精製する生成物を利用する反応である。したがって、第1の酵素と第2の酵素とそれぞれの酵素の基質とを含む反応液に測定対象物質が存在すると第1の酵素と第2の酵素とが近接し、第2の酵素が触媒する反応が進行する。特許文献１には、第1の酵素及び第2の酵素の具体的な例として、それぞれグルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼとすることが開示されている。この場合、グルコースオキシダーゼが生成する過酸化水素を第2の酵素であるペルオキシダーゼが利用してオルトフェニレンアミン等の基質を用いた酵素反応が進行する。
　ところで、アプタマーとは、特定の標的物質に対して特異的に結合する核酸分子を意味する。アプタマーとしては、増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウイルスタンパク質等に対して特異的に結合するなどのアプタマーが見つかっており、さらに金属イオン、低分子量有機化合物、ウイルスなどと結合するものが知られている。例えば、特許文献２には、グアニン四重鎖構造（以下、G4構造とも称す）を有し、ミオグロビンやヘモグロビン等のヘムタンパク質に対して特異的に結合するアプタマーが開示されている。特許文献２に開示されたアプタマーは、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を大幅に増大させる機能を有している。
　また、非特許文献１０には、上述したペルオキシダーゼ活性を有するヘムタンパク質やヘミンを包含するポルフィリンに対して特異的に結合するアプタマーが開示されており、DNA酵素（DNAzyme）としての機能について記載されている。なお、ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンについては、非特許文献１１にも開示されている。さらに、特許文献３及び非特許文献１２には、ヘミンに特異的に結合することでペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーに対して変異を導入することで、そのペルオキシダーゼ活性をさらに増大させる技術が開示されている。
特開2003-28874号公報 特開2017-200472号公報 特開2020-39300号公報
Rubenstein KE, Schneider RS, Ullman EF, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1972, 47, 846-851. Dandliker WB and Feigen GA, Biochemical and Biophysical Research Communications, 1961, 5, 299-304. Ullman EF, Schwarzberg M, Rubenstein KE, Journal of Biologiacl Chemistry, 1976, 251, 4172-4178. Campbell AK and Patel A, Biochemical Journal, 1983, 216, 185-194. Zhong J, Rosch EL, Viereck T, Schilling M, Ludwig F, ACS Sensors, 2021, 6, 976-984. Zhang X, Reeves DB, Perreatd IM, Kett WC, Griswold KE, Gimi B, Weaver JB, Biosensors and Bioelectronics, 2013, 50, 441-446. Wu K, Liu J, Saha R, Su D, Krishna VD, Cheeran MCJ, Wang JP, ACS Applied Material and Interfaces, 2020, 12, 13686-13697. Ulluman EF, Kirakossian H, Switchenko AC, Ishkanian J, Ericson M, Wartchow CA, Pirio M, Pease J, Irvin BR, Singh S, Singh R, Patel R, Dafforn A, Davalian D, Skold C, Kurn N, Wagner DB, Clinical Chemistry, 1996, 42, 1518-1526. Eglen RM, Reisine T, Roby P, Rouleau N, Illy C, Bosse R, Bielefeld M, Current Chemical Genomics, 2008, 1, 2-10. Genevieve Pratviel, Coordination Chemistry Reviews 308 (2016) 460-477 Bettina Neumann and Ulla Wollenberger, Sensors 2020, 20, 3692 Renzo A. Fenati, Zifei Chen, Yasuko Yamagishi, Kaori Tsukakoshi, Kazunori Ikebukuro, Anjay Manian , Salvy P. Russo , Tomohiko Yamazaki, and Amanda V.Ellis, J. Mater. Chem. B, 2022, 10, 8960-8969
　ところが、ペルオキシダーゼやヘミンといったポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーを用いた実用可能なアッセイ系、特にホモジニアスな標的物質の検出試薬や検出方法は知られていなかった。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーを用いた標的物質の検出試薬や検出方法又は、当該アプタマーを用いない標的物質の検出試薬や検出方法を提供することを目的とする。
　上述した目的を達成するため本発明者らが鋭意検討した結果、ポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーの立体構造を制御することで、実用可能な標的物質の検出キットや検出方法等を開発することに成功し、本発明を完成するに至った。
　本発明は以下を包含する。
　（１）ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンに対して作用して、ペルオキシダーゼ活性を増大させる第１のアプタマーと、第１のアプタマーと直接的に又は間接的に連結された第２のアプタマーとを有する核酸分子と、上記第２のアプタマーが結合する標的物質に対して結合能を有し、酸化反応を触媒して過酸化水素を生じるオキシダーゼ活性を有する第１の酵素と、当該第１の酵素の基質である第１の基質と、上記第１のアプタマーにより活性が増大するペルオキシダーゼ活性を有するポルフィリンと、当該ポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性の基質である第２の基質と、を備える標的物質の検出キット。
　（２）上記ポルフィリンは、ペルオキシダーゼ活性を有する第２の酵素であり、上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg    [I]で示されるポリヌクレオチドを含み、上記第２の酵素におけるペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（３）上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする（２）記載の検出キット。
　（４）上記核酸分子は、配列番号２１、２２及び４６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（５）上記ポルフィリンは、ヘミンであり、上記第１のアプタマーは、ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（６）ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させる上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[IV]：ggg(n)1-3ggg(n)1-7ggg(n)1-3gg    [IV]で示されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする(５)記載の検出キット。
　（７）上記式[IV]で示される塩基配列が、配列番号２６、２７、２９、３０及び３２～４２のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする（６）記載の検出キット。
　（８）上記第２のアプタマーは、ウイルス表面に結合することを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（９）上記第２のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を有することを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（１０）カタラーゼを更に備えることを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（１１）上記第１の酵素と上記第１の基質はそれぞれグルコースオキシダーゼとグルコースであり、上記ポルフィリン及び上記第２の基質はそれぞれミオグロビンとルミノールであることを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（１２）少なくとも上記第１の基質を含む第１の試薬と、少なくとも上記第１の酵素を含む第２の試薬とから構成されることを特徴とする（１）記載の検出キット。
　（１３）（１）乃至（１２）いずれか記載の検出キットと標的物質を含みうる試料とを混合する工程と、上記検出キットに含まれるポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性に基づく酵素反応を測定する工程とを含み、上記酵素反応に基づいて上記試料中の標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
　（１４）ペルオキシダーゼ活性を示す粒子に担持された標的物質に対して結合能を有し、酸化反応を触媒して過酸化水素を生じるオキシダーゼ活性を有する第１の酵素と、当該第１の酵素の基質である第１の基質と、上記粒子におけるペルオキシダーゼ活性の基質である第２の基質とを備える標的物質の検出キット。
　（１５）上記第１の酵素と上記第１の基質はそれぞれグルコースオキシダーゼとグルコースであり、上記第２の基質はルミノールであることを特徴とする（１４）記載の検出キット。
　（１６）少なくとも上記第１の基質を含む第１の試薬と、少なくとも上記第１の酵素を含む第２の試薬とから構成されることを特徴とする（１４）記載の検出キット。
　（１７）上記粒子がウイルスであり、上記標的物質がウイルス表面に存在するタンパク質であることを特徴とする（１４）記載の検出キット。
　（１８）上記粒子が磁性粒子であることを特徴とする（１４）記載の検出キット。
　（１９）上記粒子は磁性細菌が産生するタグペプチド及びタグ捕捉ペプチドのいずれか一方を表面に有する磁性粒子であり、上記標的物質は上記タグペプチド及び上記タグ捕捉ペプチドのいずれか他方と融合したタンパク質であり、上記タグペプチド及び上記タグ捕捉ペプチドを介して上記磁性粒子に結合していることを特徴とする（１４）記載の検出キット。
　（２０）（１４）乃至（１９）いずれか記載の検出キットと標的物質を含みうる試料とを混合する工程と、上記粒子におけるペルオキシダーゼ活性に基づく酵素反応を測定する工程とを含み、上記酵素反応に基づいて上記試料中の標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
　（２１）ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンに対して作用して、ペルオキシダーゼ活性を増大させる第１のアプタマーと、第１のアプタマーと直接的に又は間接的に連結され、標的物質に対する結合能を有する第２のアプタマーとを有する核酸分子。
　（２２）上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg    [I]で示されるポリヌクレオチドを含み、ヘムタンパク質におけるペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする（２０）記載の核酸分子。
　（２３）上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする（２１）記載の核酸分子。
　（２４）配列番号２１、２２及び４６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする（２０）記載の核酸分子。
　（２５）上記第１のアプタマーは、ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする（２１）記載の核酸分子。
　（２６）ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させる上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[IV]：ggg(n)1-3ggg(n)1-7ggg(n)1-3gg    [IV]で示されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（２５）記載の核酸分子。
　（２７）上記式[IV]で示される塩基配列が、配列番号２６、２７、２９、３０及び３２～４２のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする（２６）記載の核酸分子。
　（２８）上記第２のアプタマーは、ウイルス表面に結合することを特徴とする（２１）記載の核酸分子。
　（２９）上記第２のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする（２１）記載の核酸分子。
　（３０）塩基配列が式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg    [I]で示されるポリヌクレオチドであってヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマー分子と、ヘモグロビンに対する特異的な結合能を有し、酸化反応を触媒して過酸化水素を生じるオキシダーゼ活性を有する第１の酵素と、当該第１の酵素の基質である第１の基質と、ペルオキシダーゼの基質である第２の基質と、ヘモグロビンを含みうる試料とを混合する工程と、上記ヘモグロビンによるペルオキシダーゼ活性を測定する工程とを含む、ヘモグロビンの検出方法。
　（３１）上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする（３０）記載のヘモグロビンの検出方法。
　（３２）上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２の塩基配列であることを特徴とする（３０）記載のヘモグロビンの検出方法。
　（３３）上記第１の酵素と上記第１の基質はそれぞれグルコースオキシダーゼとグルコースであり、上記第２の基質はルミノールであることを特徴とする（３０）記載のヘモグロビンの検出方法。
　本発明によれば、所定の塩基配列を有し、ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンの当該ペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーを用いて、高精度に標的物質を検出することができる。
　また、本発明によれば、所定の塩基配列を有し、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーを用いて、高精度にヘモグロビンを検出することができる。
本発明に係る核酸分子を利用した標的物質の検出システムを模式的に示す図である。 本発明に係る核酸分子を利用した標的物質の検出システムの他の例を模式的に示す図である。 本発明に係る核酸分子を利用した標的物質の検出システムの更に他の例を模式的に示す図である。 本発明を適用したヘモグロビンの検出システムを模式的に示す図である。 実施例１で作製した抗体酵素複合体を確認するためのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。 実施例１で作製した抗体酵素複合体の酸化酵素活性を測定した結果を示す特性図である。 円偏光二色性(Circular Dichroism: CD)スペクトル測定で融合アプタマーの構造を測定した結果を示す特性図である。 融合アプタマーのフォールディング条件をブロッティングにより検討した結果を示す特性図である。 ミオグロビンと融合アプタマーの濃度比を検討した結果を示す特性図である。 実施例６に示した本発明に係るシステムを用いてウイルス（不活化SARS-CoV-2）を測定した結果を示す特性図である。 実施例７に示した本発明に係るシステムを用いてウイルス（不活化SARS-CoV-2）を測定した結果を示す特性図である。 実施例８に示した本発明に係るシステムを用いてウイルス（不活化SARS-CoV-2）を測定した結果を示す特性図である。 実施例９に示した本発明に係るシステムを用いてウイルス（不活化SARS-CoV-2）を測定した結果を示す特性図である。 実施例１０に示した本発明に係るシステムを用いてウイルス（不活化SARS-CoV-2）を測定した結果を示す特性図である。 実施例１０において、iPhone (登録商標) 12に備わるカメラ機能によりプレートを撮像した結果を示す写真である。 実施例１１において、iPhone (登録商標) 12に備わるカメラ機能によりメンブレンを撮像した結果を示す写真である。 実施例１２で作製した抗体酵素複合体を確認するためのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。 実施例１３に示した本発明に係るシステムを用いて不活性化インフルエンザウイルスを測定した結果を示す特性図である。 実施例１４に示した本発明に係るシステムを用いて不活性化インフルエンザウイルスを測定した結果を示す特性図である。 実施例１５に示した本発明に係るシステムを用いてウイルス（不活化SARS-CoV-2）を測定した結果を示す特性図である。 実施例１６で作製したMms13-SC-Flag-BMPにおけるMms13-SC-Flag融合タンパク質の発現をドットプロットにより確認した結果を示す写真である。 実施例１７において作製したVHH提示BMP(VHH-BMP)に関して、Mms13-VHHを確認するためのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。 実施例１８で作製した抗CRPscFv抗体提示BMP(scFv-BMP)を確認するため化学発光強度を測定した結果を示す特性図である。 実施例１９で作製したGOxとscFv-STとの複合体を確認するためのSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。 実施例１９で作製した抗体酵素複合体についてCRPに対する結合能を評価するために測定した化学発光強度を示す特性図である。 実施例２０において、抗体酵素複合体と抗CRPscFv抗体提示BMPとによるCRP捕捉能を評価した結果を示す特性図である。 実施例２１において、Mms13-SC-Flag-BMPにおけるペルオキシダーゼ活性を測定した結果を示す特性図である。 実施例２１で作製したscFv-BMP、CRP及びGOx-scFvの複合体（洗浄操作あり）について、CRP濃度を変えてルミノール発光強度を測定した結果を示す特性図である。 実施例２１で作製したscFv-BMP、CRP及びGOx-scFvの複合体（洗浄操作なし）について、CRP濃度を変えてルミノール発光強度を測定した結果を示す特性図である。 本実施例２２で実施した、カタラーゼを反応液に含まない反応系でCRP濃度を変えてルミノール発光強度を測定した結果を示す特性図である。 本実施例２２で実施した、カタラーゼを反応液に含まない場合とカタラーゼを含む場合とで、CRP濃度を変えてルミノール発光強度を測定した結果を示す特性図である。
　以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
　［第１のアプタマー］
　本発明において、第１のアプタマーとは、所定の塩基配列を有し、ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンの当該ペルオキシダーゼ活性を増大させる機能を有するポリヌクレオチドからなる核酸分子を意味する。当該核酸分子の一例としては、特開2017-200472号公報に開示されたアプタマー分子が挙げられる。なお、詳細を後述するが、当該核酸分子は、標的物質に結合する他のアプタマーと連結して利用することができる。よって、この実施形態において、当該核酸分子と当該他のアプタマーとを区別するため、当該核酸分子を第１のアプタマーと称する。なお、この実施形態においては、当該他のアプタマーを第２のアプタマーと称する。
　第１のアプタマーの塩基配列は、１つの実施形態においては、式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2gggで表される。ここで、nは、アデニン（a）、シトシン（c）、グアニン（g）、チミン（t）（RNAの場合にはウラシル（u）)、又はイノシン（i）若しくはこれら塩基の修飾体（メチル化体等）や人工核酸である。また、第１のアプタマーの塩基配列としては、式[I]で示される塩基配列のうち、式[II]：ggg(n)1-2ggg(n)1-6ggg(n)1-2gggで示されるものが好ましく、さらには、式[III]：gggngggnnggg(n)1-2gggで示されるものがより好ましい。
　前記式[I]で示される塩基配列の好ましい具体例としては、特開2017-200472号公報において作製され、効果が具体的に確認された、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列を挙げることができる（下記表１）。すなわち、第１のアプタマーの塩基配列、これら配列番号２～１６のいずれであってもよく、特に限定されない。なかでも、第１のアプタマーは、本実施例で使用した配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドとすることが最も好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　第１のアプタマーは、式[I]で示される塩基配列からなるものであってもよいが、その5'末端及び/又は3'末端に、１個又は複数個のヌクレオチドが付加されたものであってもよい。一般にアプタマーが標的物質と特異的に結合する理由は、アプタマーが特定の構造（立体構造又は平面構造）を呈することによるものであると考えられている。したがって、式[I]で示される塩基配列の一端又は両端に、特定の構造を呈さない塩基配列が付加されていてもペルオキシダーゼ活性の増大作用は維持される。特に、式[I]で示される塩基配列の一端又は両端にイノシンやメチル化シトシンなどACGT以外の天然塩基、疎水性の強い非天然塩基を１～３個含むことが好ましい。このように構成することで第１のアプタマーは、より優れたペルオキシダーゼ活性の増大作用を奏することができる。また、式[I]で示される塩基配列の3’末端にアデニンを付加すると、ペルオキシダーゼ活性に関与するヒスチジン残基と同様の役割を果たし、より優れたペルオキシダーゼ活性の増大作用を奏することができる。ＤＮＡが何らかの構造を呈するか否かは、コンピューターソフトによる解析（例えば、http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.phpで公開されているRAMAPO COLLEGEのMapper（Nucleic Acids Research 2006 July; 34 (Web Server issue):W676-W682））により知ることができるので、特定の構造を呈さない塩基配列は、当業者によって容易に設定可能である。例えば、ポリt配列は、特定の構造を呈さないＤＮＡ配列として広く知られており、式[I]で表されるアプタマーの一端又は両端にポリt配列が付加されたものも、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼを増大する作用を有し、本発明の範囲に含まれる。もっとも、特開2017-200472号公報において具体的に示されるように、式[I]で示される塩基配列の5'末端及び3'末端にヌクレオチドが付加されていなくても優れた効果を発揮し、また、アプタマーの長さが長くなると合成のコストも手間もかかるので、式[I]の一端又は両端にそれぞれ０個～１０個、好ましくは０個～６個、さらに好ましくは０個～３個のヌクレオチドが付加されたアプタマーが好ましい（なお、「０個のヌクレオチドが付加された」は、ヌクレオチドが付加されていないことを意味する）。
　また、特開2017-200472号公報において示されているように、第１のアプタマーは、グアニン四重鎖構造（G4構造とも称する）を有している。一般にG4構造を有するアプタマー（G4アプタマーとも称する）には、パラレル型G4とアンチパラレル型G4があることが知られているが、第１のアプタマーは、特開2017-200472号公報に記載されるように、円偏光二色性(circular dichroism; CD)スペクトル測定の結果、パラレル型G4であることが確認されている。なお、G4アプタマーでは、グアニンが平面に4つ並ぶことで形成されるG-カルテットが平行に並んでおり、標的物質は、このG-カルテットが嵌入される形で結合することが知られている。
　ところで、本発明における第１のアプタマーは、上述した第１の実施形態のようにペルオキシダーゼに結合するものに限定されず、ペルオキシダーゼ以外のポルフィリンに特異的に結合し、ペルオキシダーゼ以外のポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大する機能を有するものであってもよい。すなわち、第１のアプタマーの他の実施形態は、ペルオキシダーゼ以外のポルフィリンに特異的に結合し、ペルオキシダーゼ以外のポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大する機能を有するアプタマーである。
　ここで、ポルフィリンとは、下記構造を有するポルフィン環を骨格とし、当該骨格に官能基が結合した構造を有する化合物を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　よって、ポルフィリンは、上述したペルオキシダーゼ（タンパク質、酵素）に限らず、ヘミンに代表される有機化合物をも含む意味である。本発明において使用されるポルフィリンは、特に限定されず、例えば、ヘミン、クロリン、フロリン、ポルホジメテン、ポルホメテン、バクテリオクロリン、イソバクテリオクロリン、ポルフィリノゲン、ホルビン、ポルフィラジン、フタロシアニン、フィトポルフィリン、シトポルフィリン、ウロポルフィリンＩ～ＩＶ、コプロポルフィリンＩ～ＩＶ、ヘマトポルフィリン、メソポルフィリン、プロトポルフィリン、ロドポルフィリン、フィロポルフィリン、エチオポルフィリンＩ～ＩＶ、ピロポルフィリン、ジュウテロポルフィリン、フィトクロリン、ロドクロリン、フィロクロリン及びピロクロリン等を挙げることができる。また、本発明において使用されるポルフィリンとしては、Genevieve Pratviel, Coordination Chemistry Reviews 308 (2016) 460-477に開示された一群の化合物も挙げられる。
　本発明において使用されるポルフィリンの一例として、下記構造を有するヘミンを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上述したような各種ポルフィリンに対して特異的に結合し、当該ポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を向上させる機能を有する第１のアプタマーは、例えば、Renzo A. Fenati, Zifei Chen, Yasuko Yamagishi, Kaori Tsukakoshi, Kazunori Ikebukuro, Anjay Manian , Salvy P. Russo , Tomohiko Yamazaki, and Amanda V.Ellis, J. Mater. Chem. B, 2022, 10, 8960-8969に記載された方法によってその塩基配列を設計することができ、設計した塩基配列に基づいて化学的に合成することができる。
　例えば、ヘミンに対して特異的に結合し、ヘミンにおけるペルオキシダーゼ活性を向上させる機能を有する第１のアプタマーとしては、特に限定されないが、式[IV]：ggg(n)1-3ggg(n)1-7ggg(n)1-3ggで表される塩基配列を含むアプタマーを挙げることができる。ここで、nは、アデニン（a）、シトシン（c）、グアニン（g）、チミン（t）（RNAの場合にはウラシル（u）)、又はイノシン（i）若しくはこれら塩基の修飾体（メチル化体等）や人工核酸である。また、ヘミンにおけるペルオキシダーゼ活性を向上させる機能を有する第１のアプタマーとしては、特に限定されないが、Cheng et al., Biochemistry, 2009, 48, 7817-7823に開示されている、表２に示した塩基配列を有するポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドと呼称してもよい）を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２に示したポリヌクレオチドのうち、特に、配列番号２６、２７、２９、３０及び３２～４２の塩基配列は、上記式[IV]に示す塩基配列を含んでいる。したがって、第１のアプタマーとしては、表２に示したポリヌクレオチドのうち、特に、配列番号２６、２７、２９、３０及び３２～４２のうちいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアプタマーを使用することが好ましい。なお、配列番号２９、３７、４０及び４１の塩基配列からなるアプタマーは、式[IV]で示されるポリヌクレオチドからなるアプタマーであり、配列番号２６、２７、３０、３２～３６、３８、３９及び４２の塩基配列からなるアプタマーは、式[IV]で示されるポリヌクレオチドの5'末端及び/又は3'末端に、１個又は複数個のヌクレオチドが付加されたアプタマーである。
　また、式[IV]で示されるポリヌクレオチドを含むアプタマーの中でも、特に、式[V]：ggg(n)1-2ggg(n)1-3ggg(n)1-2ggで示されるポリヌクレオチドを含むアプタマーを使用することが好ましい。表２に示したポリヌクレオチドのうち、配列番号３２、３３、３４、３７及び３８の塩基配列は、上記式[V]に示す塩基配列を含んでいる。したがって、第１のアプタマーとしては、表２に示したポリヌクレオチドのうち、特に配列番号３２、３３、３４、３７及び３８のうちいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むアプタマーを使用することがより好ましい。これら、EAD2（配列番号３３）、c-Myc（配列番号３８）、EAD（配列番号３２）、EAD3（配列番号３４）及びVEGF（配列番号３７）は、kcat（代謝回転数：基質から生成物への変換の触媒定数）を向上させる効果が極めて高いことがCheng et al., Biochemistry, 2009, 48, 7817-7823に開示されている。また、第１のアプタマーは、式[V]で示されるポリヌクレオチドを含むアプタマーである、本実施例で使用した配列番号３０の塩基配列からなるポリヌクレオチド（PS2.M）とすることが最も好ましい。
　また、第１のアプタマーは、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示したポリヌクレオチドからなるものであってもよいが、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示したポリヌクレオチドの5'末端及び/又は3'末端に、１個又は複数個のヌクレオチドが付加されたものであってもよい。一般にアプタマーが標的物質と特異的に結合する理由は、アプタマーが特定の構造（立体構造又は平面構造）を呈することによるものであると考えられている。したがって、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示した塩基配列の一端又は両端に、特定の構造を呈さない塩基配列が付加されていてもペルオキシダーゼ活性の増大作用は維持される。特に、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示した塩基配列の一端又は両端にイノシンやメチル化シトシンなどACGT以外の天然塩基、疎水性の強い非天然塩基を１～３個含むことが好ましい。このように構成することで第１のアプタマーは、より優れたペルオキシダーゼ活性の増大作用を奏することができる。また、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示した塩基配列の3’末端にアデニンを付加すると、ペルオキシダーゼ活性に関与するヒスチジン残基と同様の役割を果たし、より優れたペルオキシダーゼ活性の増大作用を奏することができる。ＤＮＡが何らかの構造を呈するか否かは、コンピューターソフトによる解析（例えば、http://bioinformatics.ramapo.edu/QGRS/analyze.phpで公開されているRAMAPO COLLEGEのMapper（Nucleic Acids Research 2006 July; 34 (Web Server issue):W676-W682））により知ることができるので、特定の構造を呈さない塩基配列は、当業者によって容易に設定可能である。例えば、ポリt配列は、特定の構造を呈さないＤＮＡ配列として広く知られており、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示したアプタマーの一端又は両端にポリt配列が付加されたものも、ヘムタンパク質のペルオキシダーゼを増大する作用を有し、本発明の範囲に含まれる。また、アプタマーの長さが長くなると合成のコストも手間もかかるので、表２又は式[IV]若しくは式[V]に示した塩基配列の一端又は両端にそれぞれ０個～１０個、好ましくは０個～６個、さらに好ましくは０個～３個のヌクレオチドが付加されたアプタマーが好ましい（なお、「０個のヌクレオチドが付加された」は、ヌクレオチドが付加されていないことを意味する）。
　また、ヘミンに対して特異的に結合し、当該ヘミンにおけるペルオキシダーゼ活性を向上させる機能を有する第１のアプタマーは、特に限定されないが、特開2020-039300号公報に記載されている、ペルオキシダーゼ活性を向上させる機能が特に優れているポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドと呼称してもよい）を挙げることができる。特開2020-039300号公報に記載されているポリヌクレオチドも、式[IV]に示されるポリヌクレオチドを含む配列となっている。
　一方、本発明において使用されるポルフィリンとしては、上述のように、ペルオキシダーゼやヘミンに限定されず、いわゆるマイクロペルオキシダーゼを使用することもできる。マイクロペルオキシダーゼとは、ヘム部に対してペルオキシダーゼを構成する一部のアミノ酸残基が結合した構造を有し、ペルオキシダーゼ活性を有する化合物である。マイクロペルオキシダーゼとしては、ペルオキシダーゼを構成する14番目のシステインから19番目のスレオニンまでを含むMP-6、同14番目のシステインから21番目のグルタミン酸までを含むMP-8、同13番目のリシンから21番目のグルタミン酸までを含むMP-9及び同11番目のバリンから21番目のグルタミン酸までを含むMP-11等が知られている。
　これらマイクロペルオキシダーゼに対して特異的に結合し、当該マイクロペルオキシダーゼにおけるペルオキシダーゼ活性を向上させる機能を有する第１のアプタマーは、例えば、Renzo A. Fenati, Zifei Chen, Yasuko Yamagishi, Kaori Tsukakoshi, Kazunori Ikebukuro, Anjay Manian , Salvy P. Russo , Tomohiko Yamazaki, and Amanda V.Ellis, J. Mater. Chem. B, 2022, 10, 8960-8969に記載された方法によってその塩基配列を設計することができ、設計した塩基配列に基づいて化学的に合成することができる。
　［本発明に係る核酸分子］
　本発明に係る核酸分子は、上述した第１のアプタマーと、第１のアプタマーと直接的に又はオリゴヌクレオチドを介して間接的に連結され、所定の標的物質に対する結合能を有する第２のアプタマーとを有している。特に限定されないが、第２のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を有することが好ましい。ここで標的物質とは、タンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、多糖類、糖鎖、核酸等の生体分子を挙げることができるが特に限定されない。タンパク質としては、増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質、ウイルスタンパク質等を挙げることができるが特に限定されない。また、標的物質としては、表面にこれらの生体分子が提示されている細胞、ウイルス、微生物を対象とすることもできる。細胞としては、例えば、がん細胞、iPS細胞、ES細胞等を挙げることができる。ウイルスとしては、DNAウイルスとRNAウイルスのいずれも標的物質とすることができ、また、コロナウイルスやインフルエンザウイルスのようなエンベロープを有するウイルスと、ノロウイルスやポリオウイルスのようなエンベロープを有さないウイルスのいずれも標的物質とすることができる。第２のアプタマーと抗体が結合できる程度の大きさの構造、例えば、直径10nm以上のタンパク質凝集体や、当該構造を表面に提示しているリポソームなども標的物質とすることができる。
　第２のアプタマーとしては、一例としてスパイクタンパク質における受容体結合ドメイン（RBD）に対する結合能を有するものを使用することができる。スパイクタンパク質とは、ウイルス表面に複数ほぼ均一に存在する糖タンパクであり、宿主細胞の細胞表面受容体と相互作用するタンパク質である。なお、受容体結合ドメイン（RBD）とは、宿主細胞の細胞表面受容体と相互作用する領域を意味する。スパイクタンパク質を有するウイルスとしては、例えば、季節性インフルエンザウイルス、新型インフルエンザウイルス、コロナウイルス、新型コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レトロウイルス等に代表されるウイルスを挙げることができる。
　特に、第２のアプタマーは、新型コロナウイルスや季節性インフルエンザウイルス等のヒトに対して疾患を惹起するウイルスにおける受容体結合ドメイン（RBD）に対して結合するものが好ましい。さらに、第２のアプタマーは、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質における受容体結合ドメイン（RBD）に対して結合するものが好ましい。新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質における受容体結合ドメイン（RBD）に対して結合するアプタマーの塩基配列を配列番号１に示す。すなわち、第２のアプタマーとしては、配列番号１の塩基配列（ggggctgctcgggattgcggatatgg）を含むポリヌクレオチドを使用することができる。
　また、第２のアプタマーは、季節性インフルエンザウイルスにおけるスパイクタンパク質に結合するものが好ましい。季節性インフルエンザウイルスには、ヘマグルチニン（HA）とノイラミニダーゼ（NA）の二種類のスパイクタンパク質が存在する。したがって、第２のアプタマーとしては、季節性インフルエンザウイルスにおけるヘマグルチニン又はノイラミニダーゼに対して結合するアプタマーを設計することができる。一例として、季節性インフルエンザウイルスにおけるヘマグルチニン（HA）に対して結合するアプタマーの塩基配列を配列番号４５に示す。すなわち、第２のアプタマーとしては、配列番号４５の塩基配列（ttggggttattttgggtgtggtgggtgggggtt）を含むポリヌクレオチドを使用することができる。
　本発明に係る核酸分子は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、化学的に安定なＤＮＡが好ましい。また、この核酸分子は、市販のＤＮＡ合成装置等を用いた化学合成により容易に調製することができる。ここで、核酸分子に含まれる第１のアプタマーと第２のアプタマーの順序は任意である。すなわち、５’末端から３’末端に向かって第１のアプタマーと第２のアプタマーがこの順で並列していても良いし、第２のアプタマーと第１のアプタマーがこの順で並列していても良い。
　また、第１のアプタマーと第２のアプタマーとは、直接的に連結されていても良いし、１～数個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを介して間接的に連結されていても良い。例えば、第１のアプタマーと第２のアプタマーとの間は、１個のヌクレオチド、２個のジヌクレオチド、３個のオリゴヌクレオチド、４個のオリゴヌクレオチド、５個のオリゴヌクレオチドとすることができる。これら１～５個のヌクレオチドは、特に限定されないが、全てチミンとすることができる。また、第１のアプタマーと第２のアプタマーとの間は、PEGやPEO等の合成リンカーを介して連結しても良い。
　以上のように構成された核酸分子は、第２のアプタマーが標的物質と結合した状態で、上述した第１のアプタマーによる、ポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大させる機能を発揮する。換言すると、本発明に係る核酸分子においては、第２のアプタマーが標的物質と結合していない状態では、第１のアプタマーにおけるグアニン四重鎖構造が安定せず、ペルオキシダーゼ活性を増強する効果が十分に発揮されない。また、以上のように構成された核酸分子において、第２のアプタマーはグアニン四重鎖構造を有することが好ましい。第２のアプタマーがグアニン四重鎖構造を有する場合には、第２のアプタマーが標的物質と結合している状態と結合していない状態とで、第１のアプタマーによるペルオキシダーゼ活性の増強効果がより大きく変化する。これは、第２のアプタマーがグアニン四重鎖構造を有することにより、第２のアプタマーが標的物質と結合した場合に核酸分子の構造や安定性が変化することで、第１のアプタマーにおけるグアニン四重鎖構造が安定化し、ペルオキシダーゼ活性の増強効果がさらに増大すると考えられる。このように、核酸分子における第２のアプタマーがグアニン四重鎖構造を有する場合には、標的物質の検出感度を更に高めることができる。
　第１のアプタマーが作用するポルフィリンとしては、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ヘモグロビン、メトミオグロビン、カタラーゼ、シトクロムP450などのヘムタンパク質が挙げられる。これらのうち、ミオグロビン及びヘモグロビンが好ましい。また、第１のアプタマーが作用するポルフィリンとしては、上述のように、ヘミンやマイクロペルオキシダーゼといった化合物であっても良く、特にヘミンであることが好ましい。
　［標的物質の検出１］
　上述した本発明に係る核酸分子を利用することで、標的物質を高精度に検出するシステムを構築することができる。本システムの概略を図１に示す。なお、図１に示す例は、上記核酸分子を利用して標的物質として新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）を検出するスキームである。上述したように、核酸分子を構成する第２のアプタマーとして、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDに結合するものに限定されず、他のウイルスや、増殖因子、酵素、受容体、膜タンパク質に結合するアプタマーを利用できることから、標的物質としては当該ウイルスであっても良いし、所定の増殖因子、酵素、受容体又は膜タンパク質を発現する細胞を標的物質としても良い。
　本システムでは、図１に示すように、核酸分子１００における第２のアプタマー１０１が結合する標的物質１０２に対して特異的に結合する第１の酵素１０３を準備する。ここで、第１の酵素１０３は、所定の物質を基質（第１の基質１０４）として酵素反応を触媒し、過酸化水素を発生するオキシダーゼ活性を有している。また、第１の酵素１０３は、標的物質１０２に対して特異的に結合する結合部１０５と複合体を形成している。ここで、結合部１０５は、標的物質１０２、すなわち新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDに対する抗体分子又は新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDに対して結合能を有する核酸アプタマー等の標的物質１０２に対して特異的に結合する分子とすることができる。
　第１の酵素１０３としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、シトクロムオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、シトクロムCオキシダーゼ、ヒポキサンチンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、NADPHオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ等を使用することができる。中でも、第１の酵素１０３としては、グルコースオキシダーゼを使用することが好ましい。これらの酵素は、主としてタンパク質により構成される酵素であってもよく、また、主としてDNAにより構成される酵素であるDNAzyme（Deoxyribozyme）や、主としてRNAにより構成される酵素であるリボザイム（Ribozyme）であってもよい。
　また、第１の基質１０４は、第１の酵素１０３の種類に応じて適宜選択して使用することができる。第１の酵素１０３及び第１の基質１０４のペアは、グルコースオキシダーゼ及びグルコースとすることが好ましい。第１の基質１０４であるグルコースが安定した化合物であり、安価であるためである。
　なお、第１の酵素１０３を標的物質１０２に結合させる手段として結合部１０５を利用するが、結合部１０５は、標的物質１０２、すなわち新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDを抗原とする抗体分子に限定されず、当該RBDと相互作用するACE2断片を利用することもできる。また、結合部１０５は、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質におけるRBD以外の領域を抗原とする抗体分子でも良いし、スパイクタンパク質以外の例えば、Nタンパク質やMタンパク質、Eタンパク質を抗原とする抗体分子であっても良い。また、結合部１０５は、主として核酸により構成されるアプタマーであってもよい。
　ここで、第１の酵素１０３と結合部１０５とは、直接結合して複合体を形成しても良いが、間接的に結合して複合体を形成しても良い。第１の酵素１０３と結合部１０５とを間接的に結合させる方法は、特に限定されないが、タグペプチドとタグ捕捉ペプチドを使用する方法を適用できる。タグペプチドとタグ捕捉ペプチドの例としては、SpyTag/SpyCatcherシステム（Bijan Zakeri et al., PNAS, 109 (12) E690-E697, 2012）やSnoopCatcher/SnoopTagシステム（Gianluca Veggiani et al., PNAS, 113 (5) 1202-1207, 2016）を挙げることができる。また、タグペプチドとタグ捕捉ペプチドとしては、上記SpyTag/SpyCatcherシステムの改良であるSpyTag2/SpyCatcher2システム（Keeble et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 16521-16525）や、SpyTag3/SpyCatcher3システム（Keeble et al., PNAS, 116 (52) 26523-26533, 2019）を使用することもできる。
　すなわち、第１の酵素１０３と結合部１０５のいずれか一方が、タグペプチドとタグ捕捉ペプチドのいずれか一方を有し、第１の酵素１０３と結合部１０５のいずれか他方が、タグペプチドとタグ捕捉ペプチドのいずれか他方を有する。これにより、第１の酵素１０３と結合部１０５とを間接的に結合させることができ、上記複合体を形成することができる。
　結合部１０５が抗体分子である場合、抗体分子としては、免疫グロブリン（IgG、IgA、IgM、IgD、IgE）抗体、重鎖抗体及びフラグメント抗体のいずれであってもよい。免疫グロブリン抗体は、重鎖（VH）及び軽鎖（LH）からなり、重鎖及び軽鎖がそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3の３つのCDRを有する。重鎖抗体は、重鎖のみからなり、重鎖におけるCDR1、CDR2及びCDR3の３つのCDRを有する。フラグメント抗体は、酵素や遺伝子工学的な手法を用いて断片化された抗体であり、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、VHH抗体等を含む。また、フラグメント抗体は、Fab、F(ab')、F(ab')2を構成する軽鎖と重鎖を、リンカー配列を介して結合させて、それぞれ一本鎖抗体としたscFab、scF(ab')、scF(ab')2も含まれる。ここで、scFab、scF(ab')、scF(ab')2において、軽鎖のC末端側にリンカー配列を、そして更にそのC末端側に重鎖を結合させてなるものでもよい。さらにまた、重鎖のC末端側にリンカー配列を、そして更にそのC末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。さらには、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたscFVもまた結合部１０５として利用できる。
　結合部１０５がアプタマーである場合、アプタマー分子としては、上述した第２のアプタマーを利用することができる。
　また、図１に示すように、本システムには、核酸分子１００における第１のアプタマー１０６が結合できる、ペルオキシダーゼ活性を有するポルフィリン１０７と、ポルフィリン１０７の基質となる第２の基質１０８が含まれる。ポルフィリン１０７は、上述のように、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ヘモグロビン、メトミオグロビン、カタラーゼ、シトクロムP450等のペルオキシダーゼ活性を有する酵素や、ヘミンといったペルオキシダーゼ活性を有する化合物、マイクロペルオキシダーゼといった化合物である。第２の基質１０８は、ポルフィリン１０７の種類に応じて適宜選択して使用することができるが、特にポルフィリン１０７の酵素反応の進行を光学的に検出できる物質とすることが好ましい。具体的には、第２の基質１０８としては、オルトフェニレンジアミン又はルミノールを使用することができる。
　なお、ポルフィリン１０７として、上述のように、ペルオキシダーゼ、ミオグロビン、ヘモグロビン、メトミオグロビン、カタラーゼ、シトクロムP450等のペルオキシダーゼ活性を有する酵素を使用する場合、これら酵素を第１の酵素１０３と区別するため第２の酵素と称する。
　さらに、図１に示すように、本システムには、第１の酵素１０３によるオキシダーゼ反応により生じる過酸化水素を基質として消費する第３の酵素１０９を含むことが好ましい。第３の酵素１０９は、過酸化水素を基質として消費する酵素であって、第２の基質１０８と異なり、第１のアプタマー１０６が結合しない酵素であれば特に限定さない。第３の酵素と１０９としては、例えば、カタラーゼを使用することができる。
　以上のように構成された本システムでは、核酸分子１００、結合部１０５と融合した第１の酵素１０３、第１の基質１０４、ポルフィリン１０７及び第２の基質１０８が存在する反応系において、標的物質１０２を検出することができる。具体的には、当該反応系に標的物質１０２が存在すると、核酸分子１００を介してポルフィリン１０７が標的物質１０２に間接的に結合するとともに、結合部１０５を介して第１の酵素１０３が標的物質１０２に間接的に結合する状態が形成される。この状態で第１の酵素１０３により第１の基質１０４を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生する。ポルフィリン１０７は、第１の酵素１０３と近接した位置にあるため、当該第１の酵素１０３の酵素反応で発生した過酸化水素を消費する。これにより、ポルフィリン１０７による第２の基質１０８を用いたペルオキシダーゼ反応が進行する。
　したがって、本システムによれば、ポルフィリン１０７による第２の基質１０８を用いたペルオキシダーゼ反応を測定することで、標的物質１０２を検出することができる。例えば第２の基質１０８としてルミノール等の光学的に検出可能な物質を使用した場合、いわゆるルミノール反応により生じる化学発光を測定することで標的物質１０２を検出することができる。なお、化学発光を測定する手段は、特に限定されず、目視により測定しても良いし、極微弱化学発光計測法により測定しても良い。
　一方、核酸分子１００、結合部１０５と融合した第１の酵素１０３、第１の基質１０４、ポルフィリン１０７及び第２の基質１０８が存在する反応系において標的物質１０２が存在しない場合には、第１の酵素１０３により第１の基質１０４を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生するものの、近接した位置にポルフィリン１０７が存在しない。このため、ポルフィリン１０７による第２の基質１０８を用いたペルオキシダーゼ反応が殆ど進行することはない。したがって核酸分子１００と結合部１０５が近接して結合した場合にしか検出されないので、特異的検出が可能になる。
　また、当該反応系に第３の酵素１０９が存在する場合には、第１の酵素１０３の酵素反応で生じた過酸化水素を第３の酵素１０９により消費することができる。この場合には、ポルフィリン１０７による酵素反応に必要な過酸化水素が消費されているため、第２の基質１０８を用いたペルオキシダーゼ反応がより確実に停止することができる。このように、本システムでは、反応系に第３の酵素１０９を加えることで、偽陽性の発生を抑えることができる。
　さらに、上述した本システムを用いた標的物質１０２の検出方法では、少なくとも第１の基質１０４を含む第１の試薬と、少なくとも第１の酵素１０３を含む第２の試薬と用いることができる。なお、第１の基質１０４及び第１の酵素１０３以外の成分（例えば、核酸分子１００等）は、第１の試薬及び第２の試薬の何れに含まれていても良いし、両方に含まれていても良い。第１の試薬と第２の試薬とに分けることで、試薬の保管時において、第１の酵素１０３による第１の基質１０４を用いたオキシダーゼ反応の進行を抑えることができる。そして、第１の試薬と第２の試薬とを混合したときに、第１の酵素１０３による第１の基質１０４を用いたオキシダーゼ反応を進行させることができ、上述したように、標的物質１０２を検出することができる。
　以上で説明した本システムは、特に限定されず、標的物質１０２を検出する様々な場面に適用することができる。本システムは、特に、標的物質１０２としてウイルスを検出する系に適用することができる。本システムによりウイルスを検出するには、ウイルス表面に結合するアプタマーを第２のアプタマーとして使用すればよい。本システムをウイルスの検出に適用することで、ウイルスを迅速且つ簡便に検出することができる。本システムによりウイルスを検出する系の一例としては、ウイルスの付着が疑われる場所に上記第１の試薬及び第２の試薬を噴霧して上述した反応系を構築する。ポルフィリン１０７によるペルオキシダーゼ反応に起因する化学発光に基づいて当該場所に標的物質１０２が付着しているかを判断することができる。
　また、本システムは、標的物質１０２であるウイルスが空気中に含まれているか検出する装置に適用することができる。このような装置としては、空気清浄機、エアコン、ハンディタイプの簡易型空気捕集機、建物や部屋の出入り口に設置する空気捕集装置、病院等に設置した呼気や咳などの捕集装置等を挙げることができる。これら装置では、空気をフィルターに通過させる点が共通しており、本システムを適用することでフィルターに付着したウイルスを検出することができる。この場合、フィルターに対して上記第１の試薬及び第２の試薬を噴霧して上述した反応系を構築しても良いし、フィルターで補修した微細粒子や埃に上記第１の試薬及び第２の試薬を噴霧して上述した反応系を構築しても良い。また、これら装置においてフィルターをディスポーザブルとすることで、標的物質１０２であるウイルスの逐次検出が可能となる。
　さらに、本システムは、標的物質１０２であるウイルスが液体中に含まれているか検出する装置に適用することができる。このような装置としては、発熱症状等を訴える患者から採取した唾液やその他体液を捕集する装置、医療従事者が着用した衣類やマスク等を浸漬した液体を捕集する装置などを挙げることができる。このような装置は、標的物質１０２であるウイルスを含みうる液体を回収する。回収した液体に上記第１の試薬及び第２の試薬を添加して上述した反応系を構築することができる。このように液体に含まれる標的物質１０２を検出する際には、試薬類の添加のみでBound/Free分離を行う必要のないホモジニアス検出系とすることができる。特に、液体における化学発光は、CCD（電荷結合素子）イメージセンサやCMOSイメージセンサ等の固体撮像素子を用いて簡易に検出することができる。よって、例えばマイクロ流路デバイスと組み合わせて、簡易且つ高性能なウイルス検査装置を作製することができる。
　なお、上述したシステムでは、標的物質１０２として特定のウイルス（新型コロナウイルス（SARS-CoV-2））を検出していたが、これとは異なる標的物質１０２について設計した第２のアプタマー１０１と結合部１０５を使用するだけで、異なる標的物質１０２を検出することができる。すなわち、本システムは、検出対象の標的物質１０２ごとに容易に設計変更することができる、汎用性の高いシステムといえる。また、本システムによれば、異なる複数の標的物質１０２を同時に検出することもできる。例えば、第２のアプタマー１０１が異なる複数種の核酸分子１００を利用することで、異なる複数の標的物質１０２のうちいずれかの存在を検出することができる。
　特に、第１の酵素１０３と結合部１０５とをタグペプチドとタグ捕捉ペプチドを介して間接的に結合させる場合、標的物質１０２に応じて異なる結合部１０５を使用することになるものの、第１の酵素１０３と結合部１０５の間では同じタグペプチドとタグ捕捉ペプチドを使用することができる。この場合、標的物質１０２が異なっても、標的物質１０２に応じて結合部１０５を準備すれば、タグペプチドとタグ捕捉ペプチドを介して同じ第１の酵素１０３及びその他の構成を利用して、標的物質１０２を検出することができる。
　［標的物質の検出２］
　また、標的物質を検出するシステムとしては、上述した本発明に係る核酸分子を利用する系に限定されず、図２に示すような検出システムでもよい。なお、図２には、図１に示したシステムと同様に、標的物質として新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）を検出するスキームを示している。図２に示すシステムは、標的物質１０２であるウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）と、第１の酵素１０３とが同一反応系に共存することによって、第１の酵素１０３のオキシダーゼ活性により過酸化水素が発生し、発生した過酸化水素と第２の基質１０８とが反応する一連の反応が促進される現象を利用して、当該ウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）を検出するものである。ウイルスと第１の酵素１０３が同一反応系に共存することにより一連の反応が促進されるメカニズムは明らかではないが、１つの仮説として、ウイルス表面に微弱なペルオキシダーゼ活性が存在し、第１の酵素１０３により発生した過酸化水素と第２の基質との反応が触媒されることが考えられる。
　図２に示すシステムでは、標的物質１０２に対して特異的に結合する第１の酵素１０３を準備する。ここで、第１の酵素１０３は、所定の物質を基質（第１の基質１０４）として酵素反応を触媒し、過酸化水素を発生するオキシダーゼ活性を有している。また、第１の酵素１０３は、標的物質１０２に対して特異的に結合する結合部１０５と複合体を形成している。ここで、結合部１０５は、標的物質１０２、すなわち新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDに対する抗体分子又は新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDに対して結合能を有する核酸アプタマー等の標的物質１０２に対して特異的に結合する分子とすることができる。
　第１の酵素１０３としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、シトクロムオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、シトクロムCオキシダーゼ、ヒポキサンチンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、NADPHオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ等を使用することができる。
　また、第１の基質１０４は、第１の酵素１０３の種類に応じて適宜選択して使用することができる。第１の酵素１０３及び第１の基質１０４のペアは、グルコースオキシダーゼ及びグルコースとすることが好ましい。第１の基質１０４であるグルコースが安定した化合物であり、安価であるためである。
　なお、第１の酵素１０３を標的物質１０２に結合させる手段として結合部１０５を利用するが、結合部１０５は、標的物質１０２、すなわち新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のRBDを抗原とする抗体分子に限定されず、当該RBDと相互作用するACE2断片を利用することもできる。また、結合部１０５は、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）のスパイクタンパク質におけるRBD以外の領域を抗原とする抗体分子でも良いし、スパイクタンパク質以外の例えば、Nタンパク質やMタンパク質、Eタンパク質を抗原とする抗体分子であっても良い。
　結合部１０５が抗体分子である場合、抗体分子としては、免疫グロブリン（IgG、IgA、IgM、IgD、IgE）抗体、重鎖抗体及びフラグメント抗体のいずれであってもよい。免疫グロブリン抗体は、重鎖（VH）及び軽鎖（LH）からなり、重鎖及び軽鎖がそれぞれCDR1、CDR2及びCDR3の３つのCDRを有する。重鎖抗体は、重鎖のみからなり、重鎖におけるCDR1、CDR2及びCDR3の３つのCDRを有する。フラグメント抗体は、酵素や遺伝子工学的な手法を用いて断片化された抗体であり、Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、VHH抗体等を含む。また、フラグメント抗体は、Fab、F(ab')、F(ab')2を構成する軽鎖と重鎖を、リンカー配列を介して結合させて、それぞれ一本鎖抗体としたscFab、scF(ab')、scF(ab')2も含まれる。ここで、scFab、scF(ab')、scF(ab')2において、軽鎖のC末端側にリンカー配列を、そして更にそのC末端側に重鎖を結合させてなるものでもよい。さらにまた、重鎖のC末端側にリンカー配列を、そして更にそのC末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。さらには、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたscFVもまた結合部１０５として利用できる。
　結合部１０５がアプタマーである場合、アプタマー分子としては、上述した第２のアプタマーを利用することができる。
　また、図２に示すように、本システムには、標的物質１０２であるウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）表面のペルオキシダーゼ活性の基質となる第２の基質１０８が含まれる。第２の基質１０８は、ペルオキシダーゼ活性の基質となり、ペルオキシダーゼ反応の進行を光学的に検出できる物質とすることが好ましい。具体的には、第２の基質１０８としては、オルトフェニレンジアミン又はルミノールを使用することができる。
　以上のように構成された本システムでは、結合部１０５と融合した第１の酵素１０３、第１の基質１０４、及び第２の基質１０８が存在する反応系において、標的物質１０２であるウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）を検出することができる。具体的には、当該反応系に標的物質１０２が存在すると、結合部１０５を介して第１の酵素１０３が標的物質１０２に間接的に結合する状態が形成される。この状態で第１の酵素１０３により第１の基質１０４を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生する。すなわち、ウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）の表面の近傍に過酸化水素が発生する。よって、１つの仮説では、ウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）表面のペルオキシダーゼ活性により、当該第１の酵素１０３の酵素反応で発生した過酸化水素と第２の基質１０８を用いたペルオキシダーゼ反応が進行する。
　したがって、本システムによれば、ウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）と第１の酵素１０３が同一反応系に存在することにより促進される化学反応を測定することで、標的物質１０２を検出することができる。例えば第２の基質１０８としてルミノール等の光学的に検出可能な物質を使用した場合、いわゆるルミノール反応により生じる化学発光を測定することで標的物質１０２であるウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）を検出することができる。なお、化学発光を測定する手段は、特に限定されず、目視により測定しても良いし、極微弱化学発光計測法により測定しても良い。
　一方、結合部１０５と融合した第１の酵素１０３、第１の基質１０４及び第２の基質１０８が存在する反応系において標的物質１０２が存在しない場合には、第１の酵素１０３により第１の基質１０４を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生するものの、第１の酵素１０３に近接した位置に標的物質１０２であるウイルス、特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）が存在しないため、第２の基質１０８は殆ど反応することはない。
　さらに、上述した本システムを用いた標的物質１０２の検出方法では、少なくとも第１の基質１０４を含む第１の試薬と、少なくとも第１の酵素１０３を含む第２の試薬と用いることができる。なお、第１の基質１０４及び第１の酵素１０３以外の成分（例えば、第２の基質１０８等）は、第１の試薬及び第２の試薬の何れに含まれていても良いし、両方に含まれていても良い。第１の試薬と第２の試薬とに分けることで、試薬の保管時において、第１の酵素１０３による第１の基質１０４を用いたオキシダーゼ反応の進行を抑えることができる。そして、第１の試薬と第２の試薬とを混合したときに、第１の酵素１０３による第１の基質１０４を用いたオキシダーゼ反応を進行させることができ、上述したように、標的物質１０２を検出することができる。
　以上で説明した本システムは、特に限定されず、ペルオキシダーゼ活性を有する標的物質１０２を検出する様々な場面に適用することができる。本システムは、特に、ウイルス特に新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）を検出する系に適用することができる。本システムをウイルスの検出に適用することで、ウイルスを迅速且つ簡便に検出することができる。本システムによりウイルスを検出する系の一例としては、ウイルスの付着が疑われる場所に上記第１の試薬及び第２の試薬を噴霧して上述した反応系を構築する。第２の試薬に含まれる第１の酵素１０３とウイルスとが同一反応系に存在するに起因する化学発光に基づいて当該場所に標的物質１０２であるウイルスが付着しているかを判断することができる。
　また、本システムは、標的物質１０２であるウイルスが空気中に含まれているか検出する装置に適用することができる。このような装置としては、空気清浄機、エアコン、ハンディタイプの簡易型空気捕集機、建物や部屋の出入り口に設置する空気捕集装置、病院等に設置した呼気や咳などの捕集装置等を挙げることができる。これら装置では、空気をフィルターに通過させる点が共通しており、本システムを適用することでフィルターに付着したウイルスを検出することができる。この場合、フィルターに対して上記第１の試薬及び第２の試薬を噴霧して上述した反応系を構築しても良いし、フィルターで補修した微細粒子や埃に上記第１の試薬及び第２の試薬を噴霧して上述した反応系を構築しても良い。また、これら装置においてフィルターをディスポーザブルとすることで、標的物質１０２であるウイルスの逐次検出が可能となる。
　さらに、本システムは、標的物質１０２であるウイルスが液体中に含まれているか検出する装置に適用することができる。このような装置としては、発熱症状等を訴える患者から採取した唾液やその他体液を捕集する装置、医療従事者が着用した衣類やマスク等を浸漬した液体を捕集する装置などを挙げることができる。このような装置は、標的物質１０２であるウイルスを含みうる液体を回収する。回収した液体に上記第１の試薬及び第２の試薬を添加して上述した反応系を構築することができる。このように液体に含まれる標的物質１０２を検出する際には、試薬類の添加のみでBound/Free分離を行う必要のないホモジニアス検出系とすることができる。特に、液体における化学発光は、CCD（電荷結合素子）イメージセンサやCMOSイメージセンサ等の固体撮像素子を用いて簡易に検出することができる。よって、例えばマイクロ流路デバイスと組み合わせて、簡易且つ高性能なウイルス検査装置を作製することができる。
　なお、上述したシステムでは、標的物質１０２として特定のウイルス（新型コロナウイルス（SARS-CoV-2））を検出していたが、これとは異なる標的物質１０２について設計した結合部１０５を使用するだけで、異なる標的物質１０２を検出することができる。すなわち、本システムは、検出対象の標的物質１０２ごとに容易に設計変更することができる、汎用性の高いシステムといえる。
　［標的物質の検出３］
　また、標的物質を検出するシステムとしては、上述した本発明に係る核酸分子を利用しない系として図３に示すような検出システムでもよい。なお、図３に示したシステムでは、標的物質１０２を磁性粒子１１０の表面に捕捉し、当該標的物質１０２を検出する。図３に示すシステムは、標的物質１０２と、第１の酵素１０３とが同一反応系に共存することによって、第１の酵素１０３のオキシダーゼ活性により過酸化水素が発生し、発生した過酸化水素と第２の基質１０８とが反応する一連の反応が促進される現象を利用して、当該標的物質１０２を検出するものである。なお、磁性粒子１１０がペルオキシダーゼ活性を有することについては、Nat. Nanotechnol., 2007, 2, 577-583を参照することができる。すなわち、本システムでは、磁性粒子１１０の表面にあるペルオキシダーゼ活性により第１の酵素１０３により発生した過酸化水素と第２の基質との反応が触媒される。
　図３に示すシステムでは、標的物質１０２に対して特異的に結合する第１の酵素１０３を準備する。ここで、第１の酵素１０３は、所定の物質を基質（第１の基質１０４）として酵素反応を触媒し、過酸化水素を発生するオキシダーゼ活性を有している。また、第１の酵素１０３は、標的物質１０２に対して特異的に結合する結合部１０５と複合体を形成している。ここで、結合部１０５は、標的物質１０２に対する抗体分子又は核酸アプタマー等の標的物質１０２に対して特異的に結合する分子とすることができる。
　第１の酵素１０３及び第１の基質１０４としては、［標的物質の検出２］で説明した酵素及び基質を使用することができる。また、結合部１０５についても、［標的物質の検出２］で説明したように抗体分子や上述した第２のアプタマー等のアプタマー分子を適宜使用することができる。第２の基質１０８は、［標的物質の検出２］で説明したように、オルトフェニレンジアミン又はルミノールを使用することができる。
　特に本システムにおいて、磁性粒子１１０としては、特に限定されず、市販の磁性粒子や磁性細菌が産生する磁性粒子などを使用することができる。なかでも、磁性細菌が産生する磁性粒子（磁性細菌微粒子、Bacterial Magnetic Particles（BMP）とも称される）を使用することが好ましい。磁性細菌としては、特に限定されず、例えば、Magnetospirillum magnetotacticum MS-1、M. magneticum AMB-1、M. gryphiswaldense MSR-1、Magnetococcus marinus MC-1、Magnetovibrio blakemorei MV1, Desulfovibrio magneticus RS-1等を挙げることができる。これら磁性細菌が産生する磁性粒子を適宜使用することができる。
　磁性粒子１１０は、表面に標的物質１０２を担持している。磁性粒子１１０の表面に標的物質１０２を担持させる方法は、特に限定されず、磁性粒子１１０の表面に導入された官能基と標的物質１０２に導入した官能基とを化学的に反応させる方法、磁性細菌が産生する磁性粒子１１０の表面に標的物質１０２を担持させるための手段を持たせる方法などを挙げることができる。
　詳細には、磁性粒子１１０の表面に所謂タグ捕捉ペプチド１１１を導入する方法が挙げられる。この場合、標的物質１０２は、タグペプチド１１２を有しており、タグペプチド１１２がタグ捕捉ペプチド１１１と結合することで、磁性粒子１１０の表面に担持されることとなる。なお、図３に示した例では、磁性粒子１００の表面にタグ捕捉ペプチド１１１を導入し、標的物質１０２にタグペプチド１１２を導入したが、これは逆でも良い。すなわち、磁性粒子１００の表面にタグペプチド１１２を導入し、標的物質１０２にタグ捕捉ペプチド１１１を導入してもよい。
　タグペプチド１１２とタグ捕捉ペプチド１１１の例としては、SpyTag/SpyCatcherシステム（Bijan Zakeri et al., PNAS, 109 (12) E690-E697, 2012）やSnoopCatcher/SnoopTagシステム（Gianluca Veggiani et al., PNAS, 113 (5) 1202-1207, 2016）を挙げることができる。また、タグペプチド１１２とタグ捕捉ペプチド１１１としては、上記SpyTag/SpyCatcherシステムの改良であるSpyTag2/SpyCatcher2システム（Keeble et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 16521-16525）や、SpyTag3/SpyCatcher3システム（Keeble et al., PNAS, 116 (52) 26523-26533, 2019）を使用することもできる。
　磁性粒子１１０の表面にタグ捕捉ペプチド１１１を導入するには、例えば、Ｍｍｓ１３といったマグネタイト結合タンパク質を用いたマグネトソームディスプレイ法の技術を応用することができる。詳細には、Ｍｍｓ１３遺伝子の下流にタグ捕捉ペプチド１１１をコードするポリヌクレオチドを連結し、磁性細菌内でＭｍｓ１３の下流にタグ捕捉ペプチド１１１を有する融合タンパク質を発現させる。これにより、表面に当該融合タンパク質をディスプレイした磁性粒子１１０が磁性細菌内に産生することができる。なお、磁性粒子１１０は、定法に従い当該磁性細菌から回収することができる。
　また、磁性粒子１１０の表面に標的物質１０２を担持させる方法としては、磁性細菌内でＭｍｓ１３の下流に標的物質１０２に対する抗体を有する融合タンパク質を発現させる方法を挙げることができる。当該方法によれば、標的物質１０２にタグペプチド１１２を導入する必要が無く、抗体抗原反応に基づいて標的物質１０２を磁性粒子１１０の表面に担持させることができる。
　以上のように構成された本システムでは、結合部１０５と融合した第１の酵素１０３、第１の基質１０４、及び第２の基質１０８が存在する反応系において、標的物質１０２を検出することができる。具体的には、当該反応系に標的物質１０２が存在すると、結合部１０５を介して第１の酵素１０３が標的物質１０２に間接的に結合する状態が形成される。この状態で第１の酵素１０３により第１の基質１０４を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生する。すなわち、磁性粒子１１０の表面の近傍に過酸化水素が発生する。よって、磁性粒子１１０の表面に存在するペルオキシダーゼ活性により、当該第１の酵素１０３の酵素反応で発生した過酸化水素と第２の基質１０８を用いたペルオキシダーゼ反応が進行する。
　したがって、本システムによれば、標的物質１０２と第１の酵素１０３が同一反応系に存在することにより促進される化学反応を測定することで、標的物質１０２を検出することができる。例えば第２の基質１０８としてルミノール等の光学的に検出可能な物質を使用した場合、いわゆるルミノール反応により生じる化学発光を測定することで標的物質１０２を検出することができる。なお、化学発光を測定する手段は、特に限定されず、目視により測定しても良いし、極微弱化学発光計測法により測定しても良い。
　一方、結合部１０５と融合した第１の酵素１０３、第１の基質１０４及び第２の基質１０８が存在する反応系において標的物質１０２が存在しない場合には、第１の酵素１０３により第１の基質１０４を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生するものの、第１の酵素１０３に近接した位置に磁性粒子１１０が存在しないため、第２の基質１０８は殆ど反応することはない。
　さらに、上述した本システムを用いた標的物質１０２の検出方法では、少なくとも第１の基質１０４を含む第１の試薬と、少なくとも第１の酵素１０３を含む第２の試薬と用いることができる。なお、第１の基質１０４及び第１の酵素１０３以外の成分（例えば、第２の基質１０８等）は、第１の試薬及び第２の試薬の何れに含まれていても良いし、両方に含まれていても良い。第１の試薬と第２の試薬とに分けることで、試薬の保管時において、第１の酵素１０３による第１の基質１０４を用いたオキシダーゼ反応の進行を抑えることができる。そして、第１の試薬と第２の試薬とを混合したときに、第１の酵素１０３による第１の基質１０４を用いたオキシダーゼ反応を進行させることができ、上述したように、標的物質１０２を検出することができる。
　以上で説明した本システムは、特に限定されず、ペルオキシダーゼ活性を有する磁性粒子１１０の表面に標的物質１０２を担持することで、当該標的物質１０２を検出する様々な場面に適用することができる。標的物質１０２をウイルスが特異的に有するタンパク質とすることで、ウイルスを迅速且つ簡便に検出することができる。また、標的物質１０２を特定のアレルゲンとすることで、アレルゲンを迅速且つ簡便に検出することができる。　　　
　また、本システムは、［標的物質の検出２］で説明したシステムと同様に、標的物質１０２が空気中に含まれているか検出する装置に適用することができる。すなわち、空気を通過するフィルターに付着した標的物質を検出することができる。
　さらに、本システムは、［標的物質の検出２］で説明したシステムと同様に、標的物質１０２が液体中に含まれているか検出する装置に適用することができる。このような装置としては、標的物質１０２を含みうる液体を回収する。回収した液体に上記第１の試薬及び第２の試薬を添加して上述した反応系を構築することができる。このように液体に含まれる標的物質１０２を検出する際には、試薬類の添加のみでBound/Free分離を行う必要のないホモジニアス検出系とすることができる。特に、液体における化学発光は、CCD（電荷結合素子）イメージセンサやCMOSイメージセンサ等の固体撮像素子を用いて簡易に検出することができる。よって、例えばマイクロ流路デバイスと組み合わせて、簡易且つ高性能なウイルス検査装置を作製することができる。
　特に、本システムでは、磁性粒子１１０の表面に標的物質１０２を担持して、当該標的物質１０２を検出することができる。標的物質１０２を担持した磁性粒子１１０を磁力により集積することができ、ルミノール反応等により生じる化学発光を高感度化することができる。このため、極めて低濃度にしか存在しない標的物質１０２であっても、本システムを利用することで高精度に検出することができる。
　［ヘモグロビンの検出］
　上述した第１のアプタマーを利用することで、ヘモグロビンを高精度に検出するシステムを構築することができる。本システムの概略を図４に示す。本システムでは、図４に示すように、上述した第１のアプタマーからなるアプタマー分子２００と、ヘモグロビン２０１に対して特異的に結合する第１の酵素２０２を準備する。ここで、第１の酵素２０２は、所定の物質を基質（第１の基質２０３）として酵素反応を触媒し、過酸化水素を発生するオキシダーゼ活性を有している。また、第１の酵素２０２は、ヘモグロビン２０１に対して特異的に結合する抗体２０４と複合体を形成している。ここで、抗体２０４は、ヘモグロビン２０１に対する抗体分子とすることができる。
　第１の酵素２０２としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、シトクロムオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、ジフェノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、シトクロムCオキシダーゼ、ヒポキサンチンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、NADPHオキシダーゼ等を使用することができる。中でも、第１の酵素２０２としては、グルコースオキシダーゼを使用することが好ましい。
　また、第１の基質２０３は、第１の酵素２０２の種類に応じて適宜選択して使用することができる。第１の酵素２０２及び第１の基質２０３のペアは、グルコースオキシダーゼ及びグルコースとすることが好ましい。第１の基質２０３であるグルコースが安定した化合物であり、安価であるためである。
　なお、第１の酵素２０２をヘモグロビン２０１に結合させる手段としては、ヘモグロビン２０１を抗原とする抗体２０４に限定されず、ヘモグロビン２０１と相互作用するアプタマー分子（アプタマー分子２００以外のアプタマー）やタンパク質若しくはその部分断片を利用することもできる。また、抗体２０４はヘモグロビン２０１における如何なる領域をエピトープとするものでも良い。
　また、図４に示すように、本システムには、ペルオキシダーゼ活性を有するヘモグロビン２０１の基質となる第２の基質２０５が含まれる。第２の基質２０５は、特にヘモグロビン２０１によるペルオキシダーゼ反応の進行を光学的に検出できる物質とすることが好ましい。具体的には、第２の基質２０５としては、オルトフェニレンジアミン又はルミノールを使用することができる。
　さらに、図４には示さないが、本システムには、第１の酵素２０２によるオキシダーゼ反応により生じる過酸化水素を基質として消費する第３の酵素を含むことが好ましい。第３の酵素は、過酸化水素を基質として消費する酵素であって、例えば、カタラーゼを使用することができる。
　以上のように構成された本システムでは、アプタマー分子２００、抗体２０４と融合した第１の酵素２０２、第１の基質２０３及び第２の基質２０５が存在する反応系において、標的物質であるヘモグロビン２０１を検出することができる。具体的には、当該反応系にヘモグロビン２０１が存在すると、アプタマー分子２００がヘモグロビン２０１に結合するとともに、抗体２０４を介して第１の酵素２０２がヘモグロビン２０１に間接的に結合する状態が形成される。この状態で第１の酵素２０２により第１の基質２０３を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生する。ヘモグロビン２０１は、第１の酵素２０２と近接した位置にあるため、当該第１の酵素２０２の酵素反応で発生した過酸化水素を消費する。これにより、ヘモグロビン２０１による第２の基質２０５を用いたペルオキシダーゼ反応が進行する。
　したがって、本システムによれば、ヘモグロビン２０１による第２の基質２０５を用いたペルオキシダーゼ反応を測定することで、ヘモグロビン２０１を検出することができる。例えば第２の基質２０５としてルミノール等の光学的に検出可能な物質を使用した場合、いわゆるルミノール反応により生じる化学発光を測定することでヘモグロビン２０１を検出することができる。なお、化学発光を測定する手段は、特に限定されず、目視により測定しても良いし、極微弱化学発光計測法により測定しても良い。
　一方、アプタマー分子２００、抗体２０４と融合した第１の酵素２０２、第１の基質２０３、第２の基質２０５が存在する反応系においてヘモグロビン２０１が存在しない場合には、第１の酵素２０２により第１の基質２０３を利用したオキシダーゼ反応が進行し、過酸化水素が発生するものの、ヘモグロビン２０１による第２の基質２０５を用いたペルオキシダーゼ反応が進行することはない。
　また、上述した本システムを用いたヘモグロビン２０１の検出方法では、少なくとも第１の基質２０３を含む第１の試薬と、少なくとも第１の酵素２０２を含む第２の試薬と用いることができる。なお、第１の基質２０３及び第１の酵素２０２以外の成分（例えば、アプタマー分子２００等）は、第１の試薬及び第２の試薬の何れに含まれていても良いし、両方に含まれていても良い。第１の試薬と第２の試薬とに分けることで、試薬の保管時において、第１の酵素２０２による第１の基質２０３を用いたオキシダーゼ反応の進行を抑えることができる。そして、第１の試薬と第２の試薬とを混合したときに、第１の酵素２０２による第１の基質２０３を用いたオキシダーゼ反応を進行させることができ、上述したように、ヘモグロビン２０１を検出することができる。
　以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１：抗体酵素複合体の調製〕
　本実施例では、大腸菌BL21(DE3)株を用いた組換え生産により、SpyCatcher融合グルコース酸化酵素と、SpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク抗体を調製した。SpyCatcher融合グルコース酸化酵素としては、N末端からグルコース酸化酵素（グルコースオキシダーゼ：GOx）及びSpyCatcherの順とした融合タンパク質（GOx-SpyCatcherと称す）と、N末端からSpyCatcher及びGOxの順とした融合タンパク質（SpyCatcher-GOxと称す）を調製した。また、SpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体としては、抗体部分をVariable domain of heavy chain of heavy chain antibody: VHHとしたものと、Single-chain variable fragment: scFvとしたものの２種類を調製した。
　なお、GOx-SpyCatcherのアミノ酸配列を配列番号１７に示し、SpyCatcher-GOxのアミノ酸配列を配列番号１８に示した。また、SpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質VHHのアミノ酸配列を配列番号１９に示し、SpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質scFvのアミノ酸配列を配列番号２０に示した。
　これらのうちSpyCatcher-GOxとSpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質VHH又はSpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質scFvを用いて複合体形成実験を以下のようにして行った。すなわち、SpyCatcher-GOxとSpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質VHHの組み合わせ、SpyCatcher-GOxとSpyTag融合抗SARS-CoV-2 Sタンパク質scFvの組み合わせを量論的に混合後、静置した。ここでは、10μMと5μMにそれぞれリン酸バッファー(pH 7.0)で希釈し、等量混合して、4℃で一晩静置した。
　その後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によりバンドを確認した。SDS-PAGEの結果を図５に示した。図５に示すように、いずれの組み合わせについても、GOxと抗体（VHH又はscFv）がSpyCatcher/SpyTag間の共有結合形成により複合体形成をしたと予測される分子量付近に明瞭なバンドが観察された。この結果から、グルコースオキシダーゼとSARS-CoV-2 Sタンパク質に対する抗体との複合体が形成できたと判断した。
〔実施例２：抗体酵素複合体の酸化酵素活性測定〕
　本実施例では、GOx、SpyCatcher融合GOx、実施例１で作製した抗体酵素複合体の酸化酵素活性を測定した。終濃度1.5 mMの4-アミノアンチピリン(4AA)、終濃度1.5mMのN-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン(TOOS)、終濃度2U/mLの西洋ワサビペルオキシダーゼを含むリン酸バッファー(pH 7.0)160μLに20μLの希釈した測定試料を混合した。終濃度0、10、20、50、100、200mMのグルコースを20μL添加後、すぐに分光光度計(Shimadzu)で555 nmにおける吸光度を30秒間経時的に測定した。得られた吸光度変化量とセル長(1 cm)、および4AAとTOOSとの反応生成物のモル吸光係数ε(39.2 mM-1cm-1)から、Kinetic parameters(Km, Vmax)を算出した。
　結果を図６及び表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、Kmに関しては、SpyCatcherの融合および複合体形成による大きな変化は見られなかった。一方で、Vmaxに関しては、SpyCatcherの融合によって若干の低下が見られ、またさらに抗体酵素複合体形成による低下が見られた。さらに、SpyCatcherをGOxのN末端に融合した場合の方が、Ｃ末端に融合した場合と比較してわずかにVmaxが高いことが確認された。
〔実施例３：円偏光二色性(Circular Dichroism: CD)スペクトル測定による融合アプタマーの構造評価とターゲット結合による構造変化評価〕
　本実施例では、SARS-CoV-2のSタンパク質におけるRBDに結合するアプタマー（RBD-46）と、特開2017-200472号公報に開示されたペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマー（PEA3-01）との融合アプタマーを合成した。本実施例で合成した融合アプタマーは、5’末端から3’末端に向かってRBD-46及びPEA3-01がこの順で並んだRBD-46-PEA3-01（配列番号２１）と、5’末端から3’末端に向かってPEA3-01及びRBD-46がこの順で並んだPEA3-01-RBD-46（配列番号２２）とを設計し、化学合成により作製した。なお、これらRBD-46-PEA3-01及びPEA3-01-RBD-46には、PEA3-01とRBD-46との間にttt配列を挿入している。
　合成した融合アプタマー(RBD-46-PEA3-01、PEA3-01-RBD-46)は、酢酸カリウムバッファー(pH 5.0)で終濃度10μMとなるように調製し、95℃で10分間熱処理し、25℃まで徐冷することでフォールディングした。フォールディングさせた融合アプタマーについて、石英セル(光路長1 cm)を用い、J-720型円二色性分散計(JASCO)にて、波長220～320nmにおけるCDスペクトルを測定した。測定は終濃度1μMとなるようにリン酸カリウムバッファー(pH 7.0)で希釈し、室温で１時間静置した後に行った。また、50 dCの不活化SARS-CoV-2ウイルス(スギヤマゲン)、または50 dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスと終濃度1μMのミオグロビン(Life Diagnostics)と混合し、室温で1時間静置した後に測定した。データ処理に関しては、それぞれの条件における融合アプタマー非存在下での測定結果を差し引きして行った。
　グアニン四重鎖(G4)構造は、グアニンが4つ並んだ平面で形成されたものが鉛直方向に平行に並ぶことで形成される。このG4構造は、そのグアニンの並び方の順番により、パラレル型とアンチパラレル型に大別される。CDスペクトル測定において、260nm付近における正のピークと240nm付近における負のピークが観察されればパラレル型、290nm付近における正のピークと、260nm付近における負のピークが観察されればアンチパラレル型であると言える。今回評価した融合アプタマーは、290nm付近に正のピーク、240nm付近に負のピークが観察されたことから、パラレル型とアンチパラレル型の混合であると考えられた(図７)。これは今回使用した融合アプタマーが2種類のアプタマーを連結させたものに由来すると考えられる。一方、不活化SARS-CoV-2ウイルス、又は不活化SARS-CoV-2ウイルスとミオグロビンと混合した場合、260nm付近のスペクトルに肩が観察されるようになった。この結果から、融合アプタマーは、RBD-46部分がSARS-CoV-2と結合することでパラレル型の構造が安定化し、ミオグロビンと混合してもその状態を維持しているということが示された。
〔実施例４：ブロッティングによる融合アプタマーのフォールディング条件検討〕
　本実施例では、酢酸ナトリウムバッファー(pH 5.0)又はリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)を用いる条件と、塩化カリウム濃度を10mM又は150mMとする条件とを組み合わせた計4種類のバッファーを用いて、ビオチン化融合アプタマー(RBD-46-PEA3-01、PEA3-01-RBD-46)を1μMに希釈して、実施例３と同様にフォールディングを行った。0.35μgと3.5μgのミオグロビン、または5dCと20dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをニトロセルロースメンブレンにスポットし、風乾させることで固定した。2％ウシ血清アルブミンでブロッキングし、0.05%のTween-20を含むリン酸ナトリウムバッファーでメンブレンを洗浄した。各塩化カリウム濃度を含むリン酸ナトリウムバッファーで終濃度100nMに希釈したビオチン化融合アプタマーに浸漬して、室温にて1時間反応させた。洗浄後、市販のストレプトアビジン融合アルカリフォスファターゼを1000倍に希釈し、室温にて1時間反応させた。化学発光基質CDP-Star(Sigma-Aldrich)を添加し、室温にて5分反応させた後、化学発光イメージャーImageQuant LAS4000(GEヘルスケア)を用いて、化学発光を観察した。
　結果を図８に示した。図８に示すように、酢酸ナトリウムバッファー及びリン酸ナトリウムバッファーのいずれを用いた場合であっても、さらに塩化カリウムの濃度が10mM及び150mMのいずれであっても強い化学発光を観察することができた。特に、10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー (pH 7.0)を用いてフォールディングさせた融合アプタマーに関して、いずれのターゲットに対しても強い化学発光が観察された。
〔実施例５：ミオグロビンと融合アプタマー混合比の検討〕
　10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)で10μMに希釈した融合アプタマー(PEA3-01-RBD-46)について実施例３と同様にフォールディングを行った。96穴プレートに、終濃度100nMのミオグロビン(Life Diagnostics)と融合アプタマーのモル比が1:10、1:5、1:2、1:1、1:0.5、1:0.1、1:0となるように10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)で希釈してそれぞれ10μLずつ混合し、室温で1時間静置した。終濃度0.5mMの過酸化水素(関東化学)、終濃度100μMのルミノール(東京化成工業)、終濃度10mM塩化カリウムを含む50mMトリスバッファー(pH 8.0)を80μL添加して、すぐにプレートリーダー(Thermo fisher scientific)にて1分ごとの化学発光強度を測定した。
　結果を図９に示した。図９に示すように、混合比1:5まで、混合比依存的に化学発光強度が大きくなった。測定開始から3分経過後には、融合アプタマー非存在下での化学発光強度と比較して、5倍量の融合アプタマーを添加した場合は最大374倍まで大きくなっていることが分かり、融合アプタマーによりミオグロビンのペルオキシダーゼ活性が大きく増強されていることが示された。
〔実施例６：不活化SARS-CoV-2ウイルス検出１〕
　実施例1で作製した、抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体scFvとSpyCatcher-GOxを用いて抗体酵素複合体を調製した。実施例4で示したように、融合アプタマー(PEA3-01-RBD-46)を10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウム(pH 7.0)中でフォールディングした。96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、2μMのミオグロビン、10μMの融合アプタマー、50dC、30dC又は10dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをそれぞれ5μLずつ混合し、室温で1時間静置した。また、比較として、不活化SARS-CoV-2ウイルスに代えて、50粒子の不活化インフルエンザウイルス(Sino Bio)又は500ngのウシ血清アルブミン(Thermo fisher Scientific)を用いて同様に実験した。終濃度100mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)と終濃度100μMのルミノール(東京化成工業)、終濃度0.1nMのカタラーゼ(富士フイルム和光純薬)、終濃度10mM塩化カリウムを含むトリスバッファー(pH 8.0)を80μL添加して、すぐにプレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　測定開始から2分後の化学発光強度の測定結果を図１０に示す。10dCから50dCまで不活化ウイルス量依存的な化学発光強度の増加が確認された。一方、比較として用いた不活化インフルエンザウイルスやウシ血清アルブミンにおいては、バックグラウンドと同程度の化学発光強度が確認された。従って、不活化SARS-CoV-2が検出可能であることが示された。検量線の傾きである感度は39dC-1と算出された。バックグラウンドの標準偏差の3倍の値を示す検出下限は、9.8dCと算出された。
〔実施例７：不活化SARS-CoV-2ウイルス検出２〕
　実施例1で作製した、抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体scFvとSpyCatcher-GOxを用いて抗体酵素複合体を調製した。本例では、融合アプタマーとして、実施例４で使用した融合アプタマー(PEA3-01-RBD-46)と異なり、配列番号４３の塩基配列からなる融合アプタマー（PS2.M-RBD-46）を使用した。この融合アプタマー（PS2.M-RBD-46）は、5’末端から3’末端に向かってPS2.M及びRBD-46がこの順で並んだ塩基配列として設計し、化学合成により作製した。なお、PS.2は、Cheng et al., Biochemistry, 2009, 48, 7817-7823に開示されるように、ヘミンに結合してヘミンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大させる活性を示すアプタマーとして知られている。
　本実施例では、融合アプタマー(PS2.M-RBD-46)を10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウム(pH 7.0)中でフォールディングした。96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、1μMのヘミン、1μMの融合アプタマー、50dC、25dC、12.5dC、5dC又は2.5dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをそれぞれ5μLずつ混合し、室温で1時間静置した。終濃度200mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)とBM化学発光ELISA基質（POD）のA液(Roche)から成る反応溶液80μL添加して、すぐにプレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　本実施例で化学発光強度を測定した結果を図１１に示す。図１１に示したように、供試した不活化SARS-CoV-2ウイルス量の範囲においてウイルス量依存的な化学発光の増大が観察された。本実施例より、ポルフィリンとしてヘミンを使用し、ヘミンにおけるペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマーを融合アプタマーとして使用して、不活化SARS-CoV-2が検出可能であることが示された。
〔実施例８：条件を変更した不活化SARS-CoV-2ウイルス検出３〕
　実施例１で作製した、抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体scFvとSpyCatcher-GOxを用いて抗体酵素複合体を調製した。本例では、実施例７と同様に、融合アプタマー(PS2.M-RBD-46)を10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウム(pH 7.0)中でフォールディングした。96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、1μMのヘミン、1μMの融合アプタマー、50dC、25dC、12.5dC、5dC又は2.5dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをそれぞれ5μLずつ混合し、室温で1時間静置した。また、比較として、不活化SARS-CoV-2ウイルスに代えて、50粒子の不活化インフルエンザウイルス(Sino Bio)又は500ngのウシ血清アルブミン(Thermo fisher Scientific)を用いて同様に実験した。終濃度154mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)と終濃度24ng/mLのカタラーゼ(富士フイルム和光純薬)、BM化学発光ELISA基質（POD）のA液(Roche)から成る反応溶液80μL添加して、すぐにプレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　本実施例で化学発光強度を測定した結果を図１２に示す。図１２に示したように、実施例７と同様に、供試した不活化SARS-CoV-2ウイルス量の範囲においてウイルス量依存的な化学発光の増大が観察された。特に、本実施例では、実施例７の条件よりも、全体的に化学発光強度は更に増大していることが確認できた。一方、比較として用いた不活化インフルエンザウイルスやウシ血清アルブミンにおいては、バックグラウンドと同程度の化学発光強度が確認された。
〔実施例９：目視による不活化SARS-CoV-2ウイルス検出のための検討〕
　本実施例では、融合アプタマー(PS2.M-RBD-46)とヘミンとの混合比を変更し、目視により不活化SARS-CoV-2ウイルスを検出するための反応系を検討した。本実施例でも、融合アプタマー(PS2.M-RBD-46)を10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウム(pH7.0)中でフォールディングした。96穴タンパク質低吸着プレートに、10μMの融合アプタマーと種々の濃度のヘミン（100μM、70μM、50μM、20μM、10μM又は5μM）をそれぞれ5μLずつと10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)を10μLずつ混合し、室温で1時間静置した。終濃度200mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)と終濃度0.1mMの過酸化水素(富士フイルム和光純薬)、BM化学発光ELISA基質（POD）のA液(Roche)から成る反応溶液80μL添加して、すぐにプレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　本実施例で化学発光強度を測定した結果を図１３に示す。図１３に示したように、融合アプタマー(PS2.M-RBD-46)とヘミンとの混合比（融合アプタマー：ヘミン）が1:5、すなわちヘミン濃度がアプタマー濃度の5倍を超えると極めて優れた化学発光強度が達成できることが判った。
〔実施例１０：目視による不活化SARS-CoV-2ウイルス検出〕
　本実施例では、目視により不活化SARS-CoV-2ウイルス検出する系を構築した。実施例１で作製した、抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体scFvとSpyCatcher-GOxを用いて抗体酵素複合体を調製した。本例では、実施例７と同様に、融合アプタマー(PS2.M-RBD-46)を10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウム(pH 7.0)中でフォールディングした。96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、50μMのヘミン、10μMの融合アプタマー、50dC、40dC、25dC又は15dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをそれぞれ5μLずつ混合し、室温で1時間静置した。また、比較として、不活化SARS-CoV-2ウイルスに代えて、50粒子の不活化インフルエンザウイルス(Sino Bio)又は500ngのウシ血清アルブミン(Thermo fisher Scientific)を用いて同様に実験した。終濃度200mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)と終濃度24ng/mLのカタラーゼ(富士フイルム和光純薬)、BM化学発光ELISA基質（POD）のA液(Roche)から成る反応溶液80μL添加して、すぐにプレートリーダーにて化学発光強度を測定した。また、同様に調整した反応後の液をプレートで、iPhone (登録商標) 12に備わるカメラ機能でプレートを撮像して化学発光を検出した。
　本実施例で化学発光強度を測定した結果を図１４に示し、iPhone (登録商標)12で撮像した結果を図１５に示す。図１４に示したように、本実施例の条件において著しく高い化学発光強度を観察することができ、且つ、ウイルス量依存的に化学発光強度が増大することを確認できた。さらに、図１５に示したように、本実施例の条件において、iPhone (登録商標) 12に備わるカメラ機能によりプレート上での化学発光を検出できることが示された（iso感度:8000、F値:1.6、シャッター速度:1.1秒（ナイトモードで3秒撮影））。なお、この条件では、1.5×107 a.u.程度まで検出可能であった。
〔実施例１１：反応液噴霧による不活化SARS-CoV-2ウイルス検出実験〕
　本実施例では、ウイルスの存在をオンサイトで検出できる系を構築することを目的とし、反応液を噴霧することで不活化SARS-CoV-2ウイルスを検出できるか検証した。本実施例では、50dC、25dC又は0dCの不活性化SARS-CoV-2をニトロセルロースメンブレンにスポットし、室温で数分間乾燥させた。次に、333nMの抗体酵素複合体と3.3μMの融合アプタマー及び16.7μMのヘミンを含む反応溶液15μLをスポットした後、室温で20分間インキュベートした。終濃度250mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)と終濃度30ng/mLのカタラーゼ(富士フイルム和光純薬)を含む、BM化学発光ELISA基質（POD）のA液 (Roche)から成る検出溶液を800μLディスペンサーに満たした。最後に、検出溶液をメンブレンに噴霧し、iPhone(登録商標) 12に備わるカメラ機能でメンブレンを撮像して化学発光を検出した。
　メンブレンの表面をiPhone(登録商標) 12で撮像した結果を図１６に示す。図１６に示したように、検出溶液を噴霧することで、iPhone (登録商標) 12に備わるカメラ機能によりニトロセルロースメンブレンにスポットした不活化SARS-CoV-2ウイルスを検出できることが示された（iso感度:4000、F値:1.6、シャッター速度:3.3秒（ナイトモードで29秒撮影））。この条件では、9.0×105 a.u.程度まで検出可能であった。
〔実施例１２：インフルエンザウイルス検出のための抗体酵素複合体の調製〕
　本実施例では、大腸菌BL21(DE3)株を用いた組換え生産により、SpyTag融合抗インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体scFvを調製した(配列番号４４)。また、本実施例においても、実施例１と同様に調製したSpyCatcher-GOxとSpyTag融合抗インフルエンザウイルスヘマグルチニン抗体scFvとを混合することで抗体酵素複合体を調製した。
　その後、調製した抗体酵素複合体に関して、SDS-PAGEによりバンドを確認した。SDS-PAGEの結果を図１７に示した。SpyCatcher/SpyTag間の共有結合形成により複合体形成をしたと予測される分子量付近に明瞭なバンドが観察された。この結果から、グルコースオキシダーゼとインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する抗体との複合体が形成できたと判断した。
〔実施例１３：不活化インフルエンザウイルス検出〕
　本実施例では、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに結合するアプタマー(2R-01、配列番号４５)と、特開2017-200472号公報に開示されたペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマー（PEA3-01）との融合アプタマーを合成した。本実施例で合成した融合アプタマーは、5’末端から3’末端に向かってPEA3-01及び2R-01がこの順で並んだPEA3-01-2R-01（配列番号４６）を設計し、化学合成により作製した。なお、PEA3-01-2R-01には、PEA3-01と2R-01との間にttt配列を挿入している。
　本実施例においても、実施例４と同様に、10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.0)を用いてPEA3-01-2R-01をフォールディングさせた。96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、2μMのミオグロビン、10μMのPEA3-01-2R-01、55×104、40×104、20×104、55×103、22×103又は55×102粒子の不活化インフルエンザウイルスをそれぞれ5μLずつ混合し、室温で1時間静置した。本実施例においても、実施例６と同様に、試薬を混合し、化学発光強度を測定した。
　測定開始から2分後の化学発光強度の測定結果を図１８に示す。図１８に示すように、55×104から55×102粒子までの不活化インフルエンザウイルス量依存的な化学発光強度の増加が確認された。本実施例により、SARS-CoV-2ウイルス同様に、インフルエンザウイルスの検出が可能であることが示された。
〔実施例１４：抗体酵素複合体による不活化SARS-CoV-2検出〕
　本実施例では、融合アプタマーを使用せず、実施例１で作製した、抗SARS-CoV-2 Sタンパク質抗体scFvとSpyCatcher-GOxからなる抗体酵素複合体を用いて不活化SARS-CoV-2ウイルスを検出するシステムを構築した（図２）。
　本例では、先ず、96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、50dC、25dC、12.5dC、5dC又は2.5dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをそれぞれ5μLずつ、更に10mM塩化カリウムを含むリン酸ナトリウム(pH 7.0)を10μL混合し、室温で1時間静置した。また、比較として、不活化SARS-CoV-2ウイルスに代えて、50粒子の不活化インフルエンザウイルス(Sino Bio)又は500ngのウシ血清アルブミン(Thermo fisher Scientific)を用いて同様に実験した。終濃度154mMのグルコース(富士フイルム和光純薬)と終濃度24ng/mLのカタラーゼ(富士フイルム和光純薬)、BM化学発光ELISA基質（POD）のA液(Roche)から成る反応溶液80μL添加して、すぐにプレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　本実施例で化学発光強度を測定した結果を図１９に示す。図１９に示したように、2.5から25dCまでの不活化SARS-CoV-2ウイルス量依存的な化学発光強度の増大が確認された。本実施例により、ウイルスと抗体酵素複合体が同一反応系に存在することによるルミノール反応の促進を利用して、実施例１で作製した抗体酵素複合体、ルミノール試薬及びグルコースを用いてウイルス（本例では不活化SARS-CoV-2）を検出できることが分かった。
〔実施例１５：不活化SARS-CoV-2ウイルス検出、反応時間の検討〕
　96穴プレートに、1μMの抗体酵素複合体、2μMのミオグロビン、10μMの融合アプタマー、50dC、30dC又は10dCの不活化SARS-CoV-2ウイルスをそれぞれ5μLずつ混合し、室温で15分間静置した以外は、実施例６と同様にして化学発光強度を測定した。測定開始から2分後の化学発光強度の測定結果を図２０に示す。図２０に示したように、50dCから500dCまで不活化ウイルス量依存的な化学発光強度の増加が確認された。本実施例の結果より、不活化SARS-CoV-2ウイルスをより短時間で検出できることが明らかとなった。
〔実施例１６：Mms13-SC-Flag-BMPの調製〕
　本実施例では、図３に示したシステムを構築するため、Mms13タンパク質とスパイキャッチャー（以下、SC）との融合タンパク質を表面に有する磁性粒子（Mms13-SC-Flag-BMPと称する）を作製した。なお、Mms13タンパク質とSCとの融合タンパク質は、タグ抗体により検出できるよう、SCの下流（C末端側）にFlagタグを融合している。
　先ず、磁性細菌 Magnetospirillum magneticum AMB-1野生株をOD660＝0.3まで好気培養した後、8,000g、4℃で10分間遠心分離し、菌体ペレットをTESバッファー(10mM TES、272mM Glyserol、pH7.4)により洗浄することで、コンピテント細胞を調製した。Mms13にSpyCatcher(SC)とFlag tagを融合させた発現ベクターpUMtOR13-SC-Flagを構築し、磁性細菌M. magneticum AMB-1 株をエレクトロポレーション法により形質転換し、10mM Mg2+を含むMagnetic spirillum growth medium(MSGM)培地で6～12時間回復培養した。その後、形質転換体をMSGM培地(Amp, f.c. 0.5μg/mL)40mLに植菌し、アルゴン置換により微好気条件にした上で、28℃で約5日間、静置培養した。その後、MSGM培地(Amp, f.c. 5μg/mL)40mLに継代し、同条件で定常期まで培養した。5000mL三角フラスコ中の4000mL MSGM培地(Amp, f.c. 5μg/mL)に初期菌体濃度1.0×105cells/mLで植菌し、28℃で培養後、対数増殖期中期(3.0～5.0×107cells/mL)に、発現誘導のためのATc(f.c. 100 ng/mL)、コハク酸(f.c. 1.52mM)、硝酸ナトリウム(f.c. 3.16mM)、硫酸鉄(II)七水和物(f.c. 0.194mM)をフィルター滅菌し、培地中に添加し、遮光条件下で2日間培養を行った。培養液を4℃、8,000gで15分間遠心し、得られた菌体を10mM HEPESバッファー(pH7.4)で懸濁した後、フレンチプレス(大岳製作所社製)により破砕した。その後、ネオジウム-鉄－ボロン(Nd-Fe-B)磁石を用いて磁気分離し、上清を取り除き、HEPESで再懸濁した。この操作を10回繰り返すことにより、精製されたMms13-SC-Flag-BMPを得た。Mms13-SC-Flag融合タンパク質をコードする塩基配列及び当該融合タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４７及び４８に示した。なお、配列番号４８に示したアミノ酸配列において、N末端側から数えて1～127番目がMms13であり、128～243番目がスパイキャッチャーであり、244～251番目がFlagタグである。
　次に、精製したMms13-SC-Flag-BMPにおけるMms13-SC-Flag融合タンパク質の発現を確認した。精製したのMms13-SC-Flag-BMP(100μg)に1%SDS 5μLを添加し、99℃で15分間加熱することで膜タンパク質画分をBMPから抽出した。磁気分離によって分取した上清5μLをニトロセルロースメンブレンにスポットし、風乾させることで固定した。次に、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を溶解させたPBS-Tで1時間振盪し、ブロッキングを行った。このメンブレンをPBS-T(0.05%(v/v)Tween20 in PBS buffer)で3回洗浄した後、PBS-Tで5000倍希釈した抗Flag抗体で1時間振盪した。PBS-Tで3回洗浄した後、PBS-Tで5000倍希釈したHRP修飾抗マウス抗体で1時間振盪した。PBS-Tで3回洗浄した後、Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(Roche)を滴下した。遮光して5分間室温で静置した後、化学発光強度イメージャーImageQuant LAS4000(GEヘルスケア)で化学発光強度を測定した。ネガティブコントロールとしてSC-Flagを融合していないMms13-BMPについても同様の操作を行った。
　結果を図２１に示す。図２１に示したように、Mms13-SC-Flag-BMPの膜画分の方がMms13-BMPの膜画分よりも強い化学発光強度が確認された。このことから、磁性細菌内でMms13-SC-Flag融合タンパク質が発現し、Mms13-SC-Flag融合タンパク質を表面に有する磁性粒子(Mms13-SC-Flag-BMP)が作製できていることが示された。
〔実施例１７：Mms13-SC-Flag-BMPの機能評価(複合体形成評価)〕
　実施例１６で調製した1.5mgのMms13-SC-Flag-BMPと、大腸菌BL21(DE3)株を用いた組換え生産により調製した7.5μMのVariable domain of heavy chain of heavy chain antibody-SpyTag(VHH-ST)50μLとを混合し、4℃で一晩インキュベーションした。これにより、Mms13-SC-Flag-BMPにおけるSC、VHH-STにおけるSTとの間の反応（SC/ST反応）によりVHH提示BMP(VHH-BMP)を作製した。本実施例で作製したVHH-ST融合タンパク質をコードする塩基配列及び当該融合タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４９及び５０に示した。なお、配列番号５０に示したアミノ酸配列において、N末端側から数えて23～149番目がVHHであり、156～168番目がスパイタグである。
　また、未反応のVHH-STを磁気分離によって除去した。20mM P.P.B. 0.2M NaCl(pH7.0)100μLで懸濁し、磁気分離によって上清を除去した。この操作を3回繰り返すことで洗浄した。BMPに1%SDS 5μLを添加し、99℃で15分間加熱することで膜タンパク質画分をBMPから抽出した。抽出した膜タンパク質についてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を行った。ゲルからニトロセルロースメンブレンに転写し、PBS-Tで洗浄した後、5% Skim milkを含むPBS-T(PBS-MT)で1時間振盪し、ブロッキングを行った。PBS-Tで洗浄後、PBS-MTで15000倍希釈したHRP修飾抗His抗体(QIAGEN)で30分間振盪した。PBS-Tで洗浄後、実施例１６と同様に化学発光強度を測定した。ネガティブコントロールとしてSC-Flagを融合していないMms13-BMPについても同様の操作を行った。
　結果を図２２に示す。図２２に示したように、VHH-STのみを泳動したレーンではVHH-ST(19kDa)由来の化学発光強度のみが確認されたのに対し、VHH-BMPの膜タンパク質を泳動したレーンでは、Mms13-VHHの理論分子量(46kDa)付近に化学発光強度が確認された。このことから、Mms13-SC-Flag-BMPとVHH-STがSC/ST反応により結合し、VHH-BMPが形成されたことが示唆された。この結果より、STを有する標的物質を表面に担持可能なMms13-SC-Flag-BMPが調製できたことが示された。
〔実施例１８：scFv-BMPの結合能評価〕
　本実施例では、C反応性タンパク質（C reactive protein: CRP）に対する抗CRP scFv抗体にSpyTagを付加したscFv-STを準備し、抗CRPscFv抗体提示BMP(scFv-BMP)を作製した。本実施例で作製したscFv-ST融合タンパク質をコードする塩基配列及び当該融合タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５１及び５２に示した。なお、配列番号５２に示したアミノ酸配列において、N末端側から数えて27～269番目が抗CRP scFv抗体であり、284～296番目がスパイタグである。
　先ず、炭酸-重炭酸バッファーで懸濁したscFv-BMPを40μgずつ96穴プレート(Thermo Fisher社、白色のMaxiSorp)に添加し、1時間静置することでプレート上に固定化した。PBS-Tで3回洗浄後、2% BSAを含む1×PBSを300μＬずつ添加し、2時間静置することでブロッキングを行った。PBS-Tで3回洗浄後、2% BSAを含むPBS(2% BSA/PBS)で希釈した100nMのC反応性タンパク質（C reactive protein: CRP、オリエンタル酵母工業)を100μLずつ添加し、1時間静置した。PBS-Tで3回洗浄後、2% BSA/PBSで希釈したMouse抗CRP IgG(Cat.# 4C28 Mab C2)(HyTest)を100nM 100μLずつ添加し、1時間静置した。PBS-Tで3回洗浄後、2% BSA/PBSで10000倍希釈したHRP修飾抗マウスIgG(Promega)を100μL添加し、1時間静置した。PBS-Tで3回洗浄後、HRP基質(Roche)100μLを添加し、プレートリーダー(Thermofisher scientific)にて化学発光強度を測定した。また、ネガティブコントロールとしてscFv-STとインキュベートしていないMms13-SC-Flag-BMP、scFv-STとインキュベートしたMms13-BMP、ポジティブコントロールとして14.7ng/mL scFv-STについて同様の操作を行った。
　結果を図２３に示す。図２３に示したように、ポジティブコントロールにおいて、強い化学発光強度を確認したことから、この系で正しく結合能の有無を確認できることが分かった。また、図２３に示したように、CRPを添加しなかったネガティブコントロールと比較して、CRPを添加した場合に、有意に高い化学発光強度を示したことから、抗CRP scFv-BMPがCRPへの結合能を有していることが示された。一方、図２３に示したように、CRPを添加しなかったネガティブコントロール、マウス抗CRP IgGを添加しなかったネガティブコントロールにおいても化学発光強度が確認された。この原因として、Mms13-SC-Flag-BMPでは化学発光強度がほとんど確認されなかったことから、HRP修飾抗マウスIgGがBMP上のscFvに非特異吸着していると考えられた。
〔実施例１９：抗体酵素複合体の調製、結合能評価〕
　実施例１と同様に調製したSpyCatcher-GOxと、実施例１８で作製した抗CRPscFv抗体にSpyTagを付加したscFv-STとを、量論的に混合後、静置した。本例では、それぞれリン酸バッファー(pH7.0)で希釈してそれぞれ5μMの溶液とし、等量混合して、4℃で一晩静置した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による評価の結果(図２４)、GOxとscFv-STがSpyCatcher/SpyTag間での共有結合形成により複合体形成をしたと予測される分子量付近に明瞭なバンドが観察された。そのため、CRPに対して特異的結合能を有し、且つグルコースオキシダーゼ活性を有する抗体酵素複合体が形成されたと判断した。
　そして、本実施例では、作製した抗体酵素複合体についてCRPに対する結合能を評価した。先ず、炭酸-重炭酸バッファーで懸濁した100nMのCRPを100μLずつ96穴プレート(Thermo Fisher、白色のMaxiSorp)に添加し、1時間25℃で静置した。0.05% Tweenを含むTBSバッファー(TBS-T)で3回洗浄後、1% BSAを含む1×TBS-T(1% BSA/TBS-T)を300μＬずつ添加し、1時間25℃でブロッキングを行った。TBS-Tで3回洗浄後、1% BSA/TBS-Tで希釈した種々の濃度(0、1.25、2.5、5、12.5、25、50及び100nM)の抗体酵素複合体を100μLずつ添加し、1時間25℃で静置した。この際、ネガティブコントロールには1% BSA/TBS-T、ポジティブコントロールには100nM scFv-STを添加した。TBS-Tで3回洗浄後、1% BSA/TBS-Tで5000倍希釈したHRP修飾抗c-myc抗体を100μLずつ添加し、1時間25℃で静置した。TBS-Tで3回洗浄後、HRP基質(Roche)を100μL添加し、化学発光強度を測定した。
　結果を図２５に示す。図２５に示したように、抗体酵素複合体濃度依存的な化学発光強度の増加が確認された。このことから、本実施例で調製した抗体酵素複合体がCRPへの結合能を有していることが示された（解離定数KD=37.3nM）。
〔実施例２０：scFv-BMPと抗体酵素複合体によるCRP捕捉評価〕
　本実施例では、実施例１９で作製した抗体酵素複合体と、実施例１８で作製した抗CRPscFv抗体提示BMP(scFv-BMP)とを用いて、CRP捕捉評価試験を行った。
　先ず、0.5mL protein LoBind tubeに120μgの抗CRP scFv抗体提示BMP(scFv-BMP)を添加した。そこに、2% BSA/TBS 200μL添加し、超音波によりscFv-BMPを分散させた後、25℃で1時間インキュベートした。この際、15分おきに超音波によりscFv-BMPを分散させた。そして、TBS-T 100μLを添加し、超音波によりscFv-BMPを分散させた後、磁気分離を行い上清を除いた。この洗浄操作を5回行った。次に、20mM P.P.B. pH7.0で希釈したCRP(濃度：0、100、250nM)を100μL添加し、超音波によりBMPを分散させ、25℃で1時間インキュベートした。また、ネガティブコントロールとしてBSA(Thermo Scientific)及びEGFR 250nMをそれぞれ100μL添加し、同様にインキュベートした。そして、5回洗浄後、2% BSA/TBS-Tで希釈した100nM 抗体酵素複合体(GOx-scFv)を100μL添加した。超音波によりscFv-BMPを分散させた後、25℃で1時間インキュベートした。5回洗浄後、20mM P.P.B. pH7.0、30μLを添加し、超音波によりscFv-BMPを分散させた後、96穴プレート(NUNK、クリア)に40μg/10μLずつscFv-BMPを添加した。ここに、反応溶液(f.c.2U/mL 西洋ワサビペルオキシダーゼ、f.c. 1.5mM N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3-メトキシアニリン(TOOS)、f.c. 1.5mM 4-アミノアンチピリン(4AA)、f.c. 200mMグルコース(富士フイルム和光純薬)及び20mM P.P.B.(pH 7.0))を100μL添加して反応させた。磁気分離後、分取した反応溶液の555nmにおける吸光度を測定した。
　結果を図２６に示す。図２６に示したように、CRPを添加しなかった場合、ネガティブコントロールであるBSA又はEGFRを添加した場合では、ほとんど吸光度の増加は見られなかったのに対し、CRPを添加した場合には、濃度依存的な吸光度の増加が確認された。このことから、scFv-BMPと抗体酵素複合体との双方によってCRPを捕捉できることが示された。
〔実施例２１：Mms13-SC-Flag-BMPのペルオキシダーゼ活性、CRP検出〕
　本実施例では、先ず、Mms13-SC-Flag-BMPにおけるペルオキシダーゼ活性を測定した。なお、磁性粒子におけるペルオキシダーゼ活性についてはNat. Nanotechnol., 2007, 2, 577-583を参照することができる。実施例１６で作製したMms13-SC-Flag-BMPを3回洗浄し、その後、Mms13-SC-Flag-BMPを40μg/5μLずつ96穴プレート(NUNK、クリア)に添加した。そこに、反応溶液(f.c.0、6、30、60、150、300又は600mMのH2O2(富士フイルム和光純薬)、TMB(ナカライテスク))を95μL添加し、十分に反応させた後に同キット(ELISA POD基質 TMBキット(HYPER))の反応停止液を100μL添加し、反応を停止した。この溶液の450nmにおける吸光度を測定し、Kinetic parameters (KM、Vmax)を算出した。
　その結果(図２７)、KMは14.5mM、Vmaxは0.61×10-8Ms-1と算出され、文献値とほぼ同等のペルオキシダーゼ活性を有していることが確認された。
　次に、本実施例では、実施例２０と同様にして、scFv-BMP、CRP及びGOx-scFvの複合体を形成させ(すなわち、洗浄操作あり)、96穴プレート(Thermo Fisher、ポリプロピレン、白)に40μg/10μLずつ添加した。ここに、反応溶液(f.c.200mM グルコース、f.c.24ng/mLカタラーゼ(富士フイルム和光純薬)、ルミノール(東京化成工業))を100μL添加し、プレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　結果を図２８に示す。図２８に示したように、CRPを添加しなかった場合、ネガティブコントロールであるBSA、EGFRを添加した場合では、バックグラウンド程度のシグナルしか見られなかったのに対し、10～250nMの濃度範囲でCRP濃度依存的な化学発光強度の増加が確認された。このことから、scFv-BMP、CRP及びGOx-scFvの複合体がCRP濃度依存的に形成され、複合体に含まれるGOxの酵素反応により生じたH2O2とルミノールをscFv-BMPのペルオキシダーゼ活性が基質として利用することでルミノール反応が進行することが示された。したがって、ルミノール反応に伴う発光を検出することで、当該複合体の形成、すなわち、CRPの存否を検出可能であることが示された。
　一方、本実施例では、実施例２０とは異なり、洗浄操作無しで同様にCRPが検出可能か検討した。すなわち、2% BSA/TBSでブロッキングを行ったscFv-BMPに、2% BSA/TBS-Tで希釈したCRP(f.c.0、10、50、100、150又は250nM)、GOx-scFv(f.c.100nM)を90μL添加した。超音波によりBMPを分散させた後、25℃で30分間インキュベートした。この際、10分おきに超音波によりBMPを分散させた。その後、96穴プレート(Thermo Fisher, ポリプロピレン、白)に40μg/30μLずつBMPを添加した。ここに、反応溶液(f.c.200mM グルコース、f.c.24ng/mL カタラーゼ及びルミノール)を80μL添加し、プレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　結果を図２９に示す。図２９に示したように、10～250nMの濃度範囲でCRP濃度依存的な化学発光強度の増加が確認された。このことから、scFv-BMPをアクセプターとして用いて標的物質を検出するシステムであって、洗浄操作不要な簡便なシステムを構築できることが示された。また、10～250nMの範囲における感度は、5.81nM-1と算出された。
〔実施例２２：Mms13-SC-Flag-BMPのペルオキシダーゼ活性、CRP検出〕
　本実施例では、実施例２１で検討した洗浄操作無しで標的物質を検出する系であって、カタラーゼを反応液に含まない場合を検討した。すなわち、本実施例では、実施例２１における洗浄操作無しの場合と同様にして、scFv-BMP、CRP及びGOx-scFvの複合体を96穴プレートに添加し、反応溶液(f.c.200mM グルコース及びルミノール)を80μL添加し、プレートリーダーにて化学発光強度を測定した。
　結果を図３０に示す。図３０に示したように、カタラーゼを使用しない場合であっても10～250nMの範囲でCRP濃度依存的な化学発光強度の増加が確認された。また、10～250nMの範囲における感度は、15.6nM-1と算出された。カタラーゼを使用した実施例２１の結果と比較した結果を図３１に示す。図３１に示したように、カタラーゼを含まない場合のほうが感度が向上するという結果が得られた。この原因として、カタラーゼを添加した場合では、遊離の過酸化水素だけでなく、アクセプター表面の過酸化水素も分解されてしまったことで、シグナルの低下および感度の低下が引き起こされたと考えられた。よって、磁性粒子表面のペルオキシダーゼ活性を利用する系では、反応液にカタラーゼを含まないほうが良いことが明らかとなった。

Claims (33)

  1. 　ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンに対して作用して、ペルオキシダーゼ活性を増大させる第１のアプタマーと、第１のアプタマーと直接的に又は間接的に連結され、第２のアプタマーとを有する核酸分子と、
    　上記第２のアプタマーが結合する標的物質に対して結合能を有し、酸化反応を触媒して過酸化水素を生じるオキシダーゼ活性を有する第１の酵素と、
    　当該第１の酵素の基質である第１の基質と、
    　上記第１のアプタマーにより活性が増大するペルオキシダーゼ活性を有するポルフィリンと、
    　当該ポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性の基質である第２の基質と、
    　を備える標的物質の検出キット。
  2. 　上記ポルフィリンは、ペルオキシダーゼ活性を有する第２の酵素であり、上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg    [I]で示されるポリヌクレオチドを含み、上記第２の酵素におけるペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  3. 　上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項２記載の検出キット。
  4. 　上記核酸分子は、配列番号２１、２２及び４６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  5. 　上記ポルフィリンは、ヘミンであり、上記第１のアプタマーは、ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  6. 　ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させる上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[IV]：ggg(n)1-3ggg(n)1-7ggg(n)1-3gg    [IV]で示されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項５記載の検出キット。
  7. 　上記式[IV]で示される塩基配列が、配列番号２６、２７、２９、３０及び３２～４２のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項６記載の検出キット。
  8. 　上記第２のアプタマーは、ウイルス表面に結合することを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  9. 　上記第２のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を有することを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  10. 　カタラーゼを更に備えることを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  11. 　上記第１の酵素と上記第１の基質はそれぞれグルコースオキシダーゼとグルコースであり、上記ポルフィリン及び上記第２の基質はそれぞれミオグロビンとルミノールであることを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  12. 　少なくとも上記第１の基質を含む第１の試薬と、少なくとも上記第１の酵素を含む第２の試薬とから構成されることを特徴とする請求項１記載の検出キット。
  13. 　請求項１乃至１２いずれか一項記載の検出キットと標的物質を含みうる試料とを混合する工程と、
    　上記検出キットに含まれるポルフィリンにおけるペルオキシダーゼ活性に基づく酵素反応を測定する工程とを含み、
    　上記酵素反応に基づいて上記試料中の標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
  14. 　ペルオキシダーゼ活性を示す粒子に担持された標的物質に対して結合能を有し、酸化反応を触媒して過酸化水素を生じるオキシダーゼ活性を有する第１の酵素と、
    　当該第１の酵素の基質である第１の基質と、
    　上記粒子におけるペルオキシダーゼ活性の基質である第２の基質と、
    　を備える標的物質の検出キット。
  15. 　上記第１の酵素と上記第１の基質はそれぞれグルコースオキシダーゼとグルコースであり、上記第２の基質はルミノールであることを特徴とする請求項１４記載の検出キット。
  16. 　少なくとも上記第１の基質を含む第１の試薬と、少なくとも上記第１の酵素を含む第２の試薬とから構成されることを特徴とする請求項１４記載の検出キット。
  17. 　上記粒子がウイルスであり、上記標的物質がウイルス表面に存在するタンパク質であることを特徴とする請求項１４記載の検出キット。
  18. 　上記粒子が磁性粒子であることを特徴とする請求項１４記載の検出キット。
  19. 　上記粒子は磁性細菌が産生するタグペプチド及びタグ捕捉ペプチドのいずれか一方を表面に有する磁性粒子であり、上記標的物質は上記タグペプチド及び上記タグ捕捉ペプチドのいずれか他方と融合したタンパク質であり、上記タグペプチド及び上記タグ捕捉ペプチドを介して上記磁性粒子に結合していることを特徴とする請求項１４記載の検出キット。
  20. 　請求項１４乃至１９いずれか一項記載の検出キットと標的物質を含みうる試料とを混合する工程と、
    　上記粒子におけるペルオキシダーゼ活性に基づく酵素反応を測定する工程とを含み、
    　上記酵素反応に基づいて上記試料中の標的物質を検出することを特徴とする標的物質の検出方法。
  21. 　ペルオキシダーゼ活性を示すポルフィリンに対して作用して、ペルオキシダーゼ活性を増大させる第１のアプタマーと、第１のアプタマーと直接的に又は間接的に連結され、標的物質に対する結合能を有する第２のアプタマーとを有する核酸分子。
  22. 　上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg    [I]で示されるポリヌクレオチドを含み、ヘムタンパク質におけるペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする請求項２１記載の核酸分子。
  23. 　上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項２２記載の核酸分子。
  24. 　配列番号２１、２２及び４６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２１記載の核酸分子。
  25. 　上記第１のアプタマーは、ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させることを特徴とする請求項２１記載の核酸分子。
  26. 　ヘミンに対するペルオキシダーゼ活性を増大させる上記第１のアプタマーは、塩基配列が式[IV]：ggg(n)1-3ggg(n)1-7ggg(n)1-3gg    [IV]で示されるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項２５記載の核酸分子。
  27. 　上記式[IV]で示される塩基配列が、配列番号２６、２７、２９、３０及び３２～４２のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項２６記載の核酸分子。
  28. 　上記第２のアプタマーは、ウイルス表面に結合することを特徴とする請求項２１記載の核酸分子。
  29. 　上記第２のアプタマーは、グアニン四重鎖構造を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２１記載の核酸分子。
  30. 　塩基配列が式[I]：ggg(n)1-2ggg(n)1-8ggg(n)1-2ggg    [I]で示されるポリヌクレオチドであってヘムタンパク質のペルオキシダーゼ活性を増大させるアプタマー分子と、ヘモグロビンに対する特異的な結合能を有し、酸化反応を触媒して過酸化水素を生じるオキシダーゼ活性を有する第１の酵素と、当該第１の酵素の基質である第１の基質と、ペルオキシダーゼの基質である第２の基質と、ヘモグロビンを含みうる試料とを混合する工程と、　上記ヘモグロビンによるペルオキシダーゼ活性を測定する工程とを含む、ヘモグロビンの検出方法。
  31. 　上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２～１６のいずれかに示される塩基配列であることを特徴とする請求項３０記載のヘモグロビンの検出方法。
  32. 　上記式[I]で示される塩基配列が、配列番号２の塩基配列であることを特徴とする請求項３０記載のヘモグロビンの検出方法。
  33. 　上記第１の酵素と上記第１の基質はそれぞれグルコースオキシダーゼとグルコースであり、上記第２の基質はルミノールであることを特徴とする請求項３０記載のヘモグロビンの検出方法。
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