JP2006075103A - 磁性細菌内でのタンパク質の効率的な発現方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 磁性細菌Magnetospirillum magneticumAMB−1の磁気微粒子膜上で発現されているタンパク質Msp1、Msp2およびMsp3をコードする遺伝子のプロモーターが、細菌中で高い効率でタンパク質を発現させることが見いだされた。これらの遺伝子のプロモーター領域(Pmsp1、Pmsp2およびPmsp3)の特定な塩基配列を提供する。また、これらのプロモーターを利用して細菌においてタンパク質を発現させる方法も開示される。また、磁気微粒子膜上にアンカータンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質が発現されており、前記アンカータンパク質がMms13であることを特徴とする磁気微粒子も提供される。
【選択図】図4
Description
al., Anal. Chem., 72, 3518-22 (2000))、Gタンパク質共役受容体 (Yoshino, T., et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 2880-5 (2004))
等の有用タンパク質を発現させる方法が開発されている。当該技術分野においては、このような系を用いて、タンパク質をさらに効率よく大量に発現させるシステムの構築が求められている。
ATCC31632, DSM3856), SR-1 (IFO 15272 DSM 6361)、およびDesulfovibrio 種の微生物(例えば、Desulfovibrio sp.
RS-1 (FERM P-13283))等が挙げられる。磁性細菌の菌体内においては、粒径約50−150nmのマグネタイトからなる微粒子が産生され、これは磁気微粒子と称される。
磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB−1(ATCC700264)はMSGM培地(pH6.75)を用いて培養を行った(Yang, C. D. et al., Enzyme Microb. Technol..,. 29, 13-19 (2001))。培養定常期の菌体を回収し、HEPESで洗浄した後、フレンチプレスに3回通して破砕した。次に、フレンチプレス破砕試料から磁石を用いて磁気微粒子を分離し、残りの試料を10000g、4℃で10分間遠心分離し、その上清をさらに160000g、4℃で1時間超遠心分離した。沈殿物をHEPES緩衝液に再懸濁し、160000gで4℃で1時間超遠心分離して、沈殿物を回収した。これをPBS緩衝液に再懸濁して、細胞膜画分とした。
実施例1で同定された高発現タンパク質について、AMB−1のゲノムDNAの配列情報に基づいて、Msp1、Msp2およびMsp3のコーディング配列の上流領域の配列を調べ、細菌プロモーターのコンセンサス配列を比較することにより、プロモーター領域を探索した。これらのプロモーター領域を含むDNAの塩基配列をそれぞれ配列番号1,2および3に示す。また、これらのプロモーター領域の−35位および−10位付近の配列ならびにリボソーム結合部位の配列を図3に示す。このようにして、Pmsp1、Pmsp2およびPmsp3のプロモーター領域を同定した。
磁気微粒子膜上へ効率的に機能性タンパク質を局在させるために、アンカータンパク質の選定を行った。図6に示すように、Pmms16プロモーターの制御下にMagA、Mms16およびMms13とルシフェラーゼとの融合タンパク質が発現するよう、発現コンストラクトを構築した。実施例2と同様にしてこれらの発現ベクターを磁性細菌に導入し、細菌を培養した。菌体を回収し、フレンチプレスに3回通して菌体を破砕し、磁石を用いて磁気微粒子を単離した。得られた磁気微粒子をHEPESバッファーで洗浄後、PBSバッファーに懸濁し、ルシフェラーゼ発光基質(プロメガ社)を加えて発光強度を測定した。また、実施例1の方法により細胞破砕物、細胞質、細胞膜画分を調整し、各画分のルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図7に示す。図から明らかなように、アンカータンパク質としてMms13を用いたとき、細胞内でのルシフェラーゼ発現量が最も多く、また磁気微粒子膜上へのアンカリング効率がMagA、Mms16と比較して顕著に高いことが示された。これは、Mms13が膜2回貫通型の小さなタンパク質であるため、磁気微粒子膜に安定してアンカリングしていると考えられる。さらにPmms16プロモーターに代わり、Pmsp1またはPmsp3プロモーターの制御下におけるMms13−ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現を評価したところ、Pmsp3プロモーターを用いることで3倍の発現量が得られた(図8)。
アンカータンパク質Mms13とレポーターであるルシフェラーゼとの間にトロンビン切断部位を含む融合タンパク質を設計した。トロンビン切断部位としては、LVPRGS配列を用いた。プロモーターPmms16の制御下にこの融合タンパク質を発現するベクターを構築し、磁性細菌に導入して培養した後に、実施例3と同様にして磁気微粒子を単離した。50 mgの磁気微粒子を100 μlのPBSバッファーに懸濁した後、示される量のトロンビンを加えて25 ℃で60 分インキュベートして、融合タンパク質を切断させた。磁石を用いて磁気微粒子と上清とに分離した後、それぞれのルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図9に示す。図から明らかなように、加えたトロンビンの量に依存して、ルシフェラーゼ活性が磁気微粒子画分から上清画分に移行したことがわかった。
アンカータンパク質Mms13とProtein AのIgG結合部位を持つ融合タンパク質を設計した。この融合タンパク質を発現するよう、発現ベクターを構築し実施例2と同様にしてこれらの発現ベクターを磁性細菌に導入した。野生株および発現ベクターを導入した磁性細菌を培養後、実施例3と同様にして磁気微粒子を単離した。50 mgの磁気微粒子をアルカリフォスファターゼ標識したウサギ由来抗ヒツジ抗体と1時間反応後、洗浄を3回行った。アルカリフォスファターゼの発光基質を添加した後、1分後の発光強度を測定した。結果を図10に示す。図から明らかなように、発現ベクターを保持した磁性細菌から得られた磁気微粒子において、抗体濃度の増加に伴い抗体が導入されたことが確認された。
Claims (14)
- 配列番号1、2および3のいずれかにより表される塩基配列を有するDNA断片。
- 配列番号1、2および3のいずれかにより表される塩基配列において1またはそれ以上の塩基が置換、欠失、付加されている塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するDNA断片。
- 配列番号1、2および3のいずれかにより表される塩基配列と80%以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつ細菌においてプロモーター活性を有するDNA断片。
- プロモーターとして請求項1−3のいずれかに記載のDNA断片を含む発現ベクター。
- 請求項4記載の発現ベクターの前記DNA断片の下流にタンパク質をコードするDNAが挿入されているDNAコンストラクト。
- 請求項5記載のDNAコンストラクトにより形質転換された細菌。
- 細菌においてタンパク質を発現させる方法であって、請求項5記載のDNAコンストラクトを細菌に導入し、前記細菌を培養し、発現されたタンパク質を回収する、の各工程を含む方法。
- 前記細菌が磁性細菌である、請求項7記載の方法。
- 前記細菌が磁性細菌であり、前記タンパク質が磁性細菌の磁気微粒子膜、細胞膜または細胞質において発現される、請求項7記載の方法。
- 前記タンパク質がアンカータンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質である、請求項7記載の方法。
- アンカータンパク質がMms13である、請求項10記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、アンカータンパク質の領域と目的タンパク質の領域との間にプロテアーゼによる切断部位を有する、請求項10記載の方法。
- 磁気微粒子膜上にアンカータンパク質と目的タンパク質との融合タンパク質が発現されており、前記アンカータンパク質がMms13であることを特徴とする磁気微粒子。
- 配列番号4に示されるアミノ酸配列のアミノ酸1−87を有するタンパク質を含む融合タンパク質。
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