ES2330441T3 - Deposito de metal catalizado por una enzima para la deteccion in situ mejorada de epitopos inmunohistoquimicos y secuencias de acido nucleico. - Google Patents

Deposito de metal catalizado por una enzima para la deteccion in situ mejorada de epitopos inmunohistoquimicos y secuencias de acido nucleico. Download PDF

Info

Publication number
ES2330441T3
ES2330441T3 ES04756257T ES04756257T ES2330441T3 ES 2330441 T3 ES2330441 T3 ES 2330441T3 ES 04756257 T ES04756257 T ES 04756257T ES 04756257 T ES04756257 T ES 04756257T ES 2330441 T3 ES2330441 T3 ES 2330441T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
enzyme
reducing
phosphate
labeled
redox activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES04756257T
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher Bieniarz
Casey A. Kernag
Jerome W. Kosmeder
Paula M. Rodgers
Jennifer Wong
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ventana Medical Systems Inc
Original Assignee
Ventana Medical Systems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ventana Medical Systems Inc filed Critical Ventana Medical Systems Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2330441T3 publication Critical patent/ES2330441T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/093—Polyol derivatives esterified at least twice by phosphoric acid groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring
    • C07F9/65517—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6552—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a six-membered ring
    • C07F9/65522—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a six-membered ring condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings

Abstract

Un método de detección in situ de un epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra biológica, que comprende unir una molécula conjugada marcada con una enzima al epítopo o secuencia de interés en presencia de una especie reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble, en el que dicha especie reductora sin actividad redox es un sustrato para dicha molécula conjugada marcada con una enzima y en el que dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima.

Description

Depósito de metal catalizado por una enzima para la detección in situ mejorada de epítopos inmunohistoquímicos y secuencias de ácido nucleico.
Esta invención se refiere a en general al campo de la química, y en particular se refiere a un nuevo método de detección in situ de epítopos inmunohistoquímicos y secuencias de ácido nucleico usando una reacción mediada por una enzima para el depósito localizado de átomos metálicos.
La tinción tisular es una técnica antigua según los patrones modernos que se remonta a más de cien años atrás. Recientemente, se han realizado esfuerzos para automatizar el procedimiento de aplicación de diferentes tipos de colorantes químicos y bioquímicos a secciones de tejido. Los instrumentos que se han inventado para este fin incluyen la línea de instrumentos de Ventana Medical de instrumentos basados en doble transportador continuo (o carrusel) tales como los 320, ES®, NexES®, BECHMARK® y el BENCHMARK® XT. Las patentes que describen estos sistemas incluyen US 5595707, 5654199, 6093574 y 6296809. Otro tipo de teñidor automatizado es la línea de teñidores TechMate®, descrita en los documentos US 5355439 y 5737499.
Se han desarrollado diversos procedimientos químicos de detección manual para histoquímica a lo largo de los años. Generalmente, una vez que un marcador molecular o diana de interés se ha identificado a través de estudios moleculares, es necesario hacerle visible en el microscopio óptico para que un patólogo u otro especialista médico pueda interpretarlo. La primera etapa de detección implica un anticuerpo primario anti-diana marcado de forma detectable con biotina, digoxigenina, fluoresceína u otro hapteno que se está usando para localizar a la diana biológica de interés. A continuación, se usa un anticuerpo secundario anti-hapteno conjugado a una enzima u otra molécula informadora para localizar al anticuerpo primario. Los sistemas enzimáticos típicos los conocen los expertos en la materia e incluyen peroxidasa de rábano rusticano y fosfatasa alcalina. Estas enzimas catalizan a continuación la precipitación de un sustrato cromogénico en las proximidades inmediatas del complejo anticuerpo primario-secundario. Los cromógenos tales como nitroazul de tetrazolio (NBT/BCIP); tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB); y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) se conocen bien. Como alternativa, interacciones enzima-sustrato pueden producir señales quimioluminiscentes, que pueden capturarse en una película fotográfica.
Otras marcas incluyen marcado con ^{125}-I del anticuerpo secundario, que puede detectarse usando una película fotográfica; anticuerpo secundario marcado con isocianato de fluoresceína, que puede detectarse usando luz UV; Proteína A marcada con ^{125}-I, que puede usarse en lugar de un anticuerpo secundario, puesto que se unirá a la región Fc de moléculas de IgG; anticuerpo secundario marcado con oro, que es visible directamente como un color rojo cuando se une con el anticuerpo secundario al anticuerpo primario; Anticuerpo secundario biotinilado, que cuando se incuba con el anticuerpo secundario, y se incuba a continuación con avidina conjugada a enzima que se une fuertemente a la biotina, dará una señal mejorada, puesto que múltiples moléculas de biotina pueden unirse a una única molécula de anticuerpo. Las enzimas usadas típicamente incluyen fosfatasa alcalina ("AP") o peroxidasa de rábano rusticano ("HRP").
La mejora metálica de la detección inmunohistoquímica se divulga en la Patente de Estados Unidos Nº 5.116.734 (Higgs et al.). La patente '734 se refiere a una composición de materia y a un proceso para detectar la presencia de un catalizador oxidativo en una muestra biológica. La composición comprende un precipitado formado mediante oxidación de un sustrato cromogénico en presencia del catalizador, junto con dos o más metales reducidos co-precipitados. Se forma una señal fuerte con la que detectar un catalizador de oxidación que se localiza en una molécula diana. Las moléculas diana pueden ser ácidos nucleicos, anticuerpos o antígenos de la superficie celular. En particular, Higgs et al., confían en un precipitado cromogénico y dos o más metales, con el fin de detectar un catalizador oxidativo. Merchanthaler et al., J. Histoch. And Cytochem., 37: 10 1563-65 (1989) divulgan la intensificación con plata de DAB polimerizado de forma oxidativa mediante el pre-tratamiento del DAB con iones de níquel.
Un ejemplo más reciente de mejora metálica de la detección inmunohistoquímica incluye la Patente de Estados Unidos Nº 6.670.113 (Hainfeld). La patente '113 se refiere a un método de producción de metal en un estado de oxidación cero a partir de iones metálicos, que comprende: proporcionar iones metálicos de al menos un metal seleccionado entre cesio, grupo de la tabla periódica 1b, 2a, 4a y 8, un agente oxidante que contiene oxígeno y un agente reductor seleccionado entre al menos uno de hidroquinona, un derivado de hidroquinona o galato de n-propilo; proporcionar una enzima oxido-reductasa; combinar la enzima con los iones metálicos, el agente oxidante y el agente reductor; y reducir al menos algunos de los iones metálicos a metal en un estado de oxidación cero. En particular, se divulga la reducción de ión plata a plata metálica en las proximidades de peroxidasa de rábano rusticano cuando se expone a peróxido de hidrógeno e hidroquinona.
Además, el documento US 2002/0142411 describe métodos y materiales para utilizar enzimas para actuar sobre iones metálicos en solución, de modo que los iones se reduzcan a metal.
Además, el documento US 5.073.483 describe un método de tinción de una secuencia de ácido nucleico que se fija sobre un soporte sólido, en el que se emplea un sistema enzimático que fija a esta secuencia para detectarla mediante marcado no radiactivo, haciéndose reaccionar posteriormente al sistema enzimático con un sustrato cromogénico para producir un producto coloreado.
Sigue existiendo una necesidad de mejores técnicas bioquímicas para identificar visualmente epítopos inmunohistoquímicos y dianas de ADN de interés mediante microscopio óptico de campo claro.
La invención se refiere a nuevos métodos de detección in situ de un epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra biológica, que comprenden unir una molécula conjugada marcada con una enzima al epítopo o secuencia de interés en presencia de una especie reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble, en los que dicha especie reductora sin actividad redox es un sustrato para dicha molécula conjugada marcada con una enzima y en los que dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, catalizando de este modo la reducción del ión metálico a un metal en estado de oxidación 0 en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima. Se describen nuevos derivados de fosfato de agentes reductores que, cuando se exponen a una enzima fosfatasa se activan a su forma reductora, reduciendo de este modo iones metálicos a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0.
La invención utiliza un compuesto que tiene la estructura general (IV) que se muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que
R_{1}
puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato;
R_{2}
puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2} o CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato; y
Z
puede ser PO_{3}^{2-}, H, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama; pero ambos Z no pueden ser H. Un compuesto preferido tiene ambos Z = fosfato.
La invención también utiliza un compuesto que tiene la estructura general (V):
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que
R_{1}
puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato; y
Z
puede ser PO_{3}^{2-}, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama. Un compuesto particularmente preferido tiene ambos Z = fosfato.
\newpage
La invención también utiliza un compuesto que tiene la estructura general (VI):
3
en la que
R_{1}
puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato; y
Z
puede ser PO_{3}^{2-}, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama. Un compuesto particularmente preferido tiene ambos Z = fosfato.
La invención también utiliza un compuesto que tiene la fórmula general (VII):
4
en la que
R_{1}
puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato; y
Z
puede ser PO_{3}^{2-}, \alpha-galactosa, \beta-galactosa, \alpha-glucosa, \beta-glucosa, éster y \beta-lactama. Dos compuestos particularmente preferidos tienen R_{1} = metilo o CH_{2}-(CH_{2}-CH_{2}-CH(CH_{3})-CH_{2})_{3}-H y Z = fosfato.
La invención también se refiere a un método de tinción in situ de una muestra biológica que tiene un epítopo o una secuencia de nucleótidos de interés, que comprende las etapas de:
\quad
a) poner en contacto a dicha muestra biológica con una molécula conjugada que tiene un hapteno; b) poner en contacto a dicho hapteno con una molécula conjugada marcada con una enzima; y c) poner en contacto a dicha muestra biológica con una especie reductora sin actividad redox que es un sustrato para dicha marca enzimática en presencia de un ión metálico soluble, donde dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo al ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima. En una realización preferida de este método, la molécula conjugada que tiene un hapteno en la etapa a) es un anticuerpo primario biotinilado, la molécula conjugada marcada con una enzima en la etapa b) es estreptavidina-fosfatasa alcalina, y la especie reductora sin actividad redox en la etapa c) es fosfato de ácido ascórbico en presencia de ión de plata a un pH mayor de 7. También puede aplicarse una etapa opcional de pre-tratamiento con ión de oro para mejorar el depósito de plata.
La figura 1 es una fotografía de ocho pocillos de microvaloración dispuestos en dos columnas de cuatro. La columna A es la columna de control que contiene 100 \mul de nitrato de plata 50 mM y 100 \mul de fosfato sustrato 50 mM en tris 100 mM, pH 9,0. La columna B contiene los mismos componentes con la adición de 5 \mul de 0,2 mg/ml de fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Pierce) en Tris 100 mM, pH 7,0. La columna B demuestra la acción de la liberación del sustrato reductor mediada por fosfatasa alcalina (es decir, ácido ascórbico-2-fosfato a ácido ascórbico) y la reducción concomitante de nitrato de plata a partículas de plata metálica por el sustrato reductor liberado.
La figura 2 es una fotografía de cuatro puntos en papel de nitrocelulosa que se trataron con 5 \mul de 0,2 mg/ml de fosfatasa alcalina intestinal de ternero (Pierce) en Tris 100 mM, pH 7,0, 5 \mul de una solución 50 mM de los fosfatos del Ejemplo 1 en tris 100 mM, pH 9,0 y 5 \mul de nitrato de plata 50 mM. ácido ascórbico-2-fosfato (AAP), fosfato de sesamol (SP), hidroquinona-1,4-difosfato (HQP), fosfato de 2,2,5,7,8-pentametil-6-cromanol (PMCP).
La figura 3 es una microfotografía en escala de grises de tejido de amígdala normal teñido usando conjugado de AP-SA, pre-tratamiento con oro y reducción de plata usando fosfato de ácido ascórbico (AAP).
La figura 4 es una microfotografía en escala de grises de tejido de amígdala normal teñido usando conjugado de AP-SA, pre-tratamiento con oro y reducción de plata usando AAP, siendo la única diferencia el completo desarrollo en línea de la señal de plata.
La figura 5 es una microfotografía en escala de grises del control positivo para las figuras 3-4.
La figura 6 es una microfotografía de anticuerpo anti-Desmina en músculo esquelético detectado con pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 20 minutos de incubación.
La figura 7 es una microfotografía de anti-S100 en el cerebro, detectado con pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 20 minutos de incubación.
La figura 8 es una microfotografía de Control Negativo de Conejo en Cerebro detectado con pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 20 minutos de incubación.
La figura 9 es una microfotografía de anticuerpo anti-S100 en tejido cerebral, usando la detección con VRed de Ventana.
La figura 10 es una microfotografía de anticuerpo anti-Desmina en músculo esquelético, pre-tratamiento con oro, AAP y AgNO_{3}, 10 minutos de incubación y 10 minutos de amplificación con 4-metilaminofenol.
La figura 11 es una microfotografía de anticuerpo anti-Desmina en músculo esquelético sin amplificación no enzimática alguna. Las mismas condiciones que en la figura 9, excepto que no hay etapa de amplificación.
La invención se refiere a un método de detección de un epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico de interés uniendo en primer lugar una molécula conjugada al epítopo o secuencia de interés. La molécula conjugada se marca con una enzima que cataliza la transformación de una especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, permitiendo de este modo la reducción de un metal detectable cromogénicamente en o alrededor del punto en el que la enzima se ancla. Más específicamente, se basa en un nuevo método de uso de fosfatasa alcalina y otras enzimas, es decir glucosidasas, esterasas, \beta-galactosidasas como marcas capaces de catalizar la desfosforilación de un sustrato(s) enzimático(s) sin actividad redox, por ejemplo fosfato de ácido ascórbico, que después de la desfosforilación catalizada por la enzima se convierte en un agente reductor extremadamente eficaz capaz de reducir iones de plata y/o oro a átomos metálicos de plata y/o oro. Puesto que la reducción se produce cerca de o en el epítopo o secuencia de nucleótidos de interés, la plata/oro metálica precipitada en estado de oxidación 0 se acumula en las proximidades del epítopo o secuencia, mejorando enormemente la detectabilidad visual del epítopo en los procedimientos de diagnóstico microscópico.
La invención utiliza nuevos compuestos que se han sintetizado específicamente para su uso en el método anterior. El más preferido es el fosfato de ácido ascórbico (véase la fórmula general I en la que Z es el sustrato PO_{3}^{-2}, que cuando es desfosforilado por su enzima fosfatasa alcalina, da como resultado ión ascorbato, un buen reductor de cationes de plata y oro. Generalmente, los compuestos que tienen las fórmulas (I)-(VII) que se muestran a continuación son excelentes sustratos.
5
6
Para las estructuras generales I-VII, Z puede ser PO_{3}^{2-}, galactosilo, glucosilo, éster o beta-lactama. Para las estructuras generales II-IV, uno de los dos Z también puede ser H.
Para las estructuras generales II-IV, al menos un Z debe ser PO_{3}^{2-}, galactosilo, glucosilo, éster o beta-lactama.
Para la estructura general II, R puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato.
Para las estructuras generales III-VII, R_{1} puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato.
Para las estructuras generales III-IV, R_{2} puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato.
Los términos usados en este documento son conocidos por el químico experto en la materia. Sin embargo, para proporcionar una comprensión clara y consecuente de la memoria descriptiva, de las reivindicaciones y del alcance que se da a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones:
Detectar in situ significa ser capaz de visualizar la característica biológica de interés en muestras de tejido o celulares intactas. El tejido es por ejemplo, secciones de tejido de 4-8 \mum de grosor fijadas e incluidas en parafina tales como las que se montan habitualmente en portaobjetos de microscopio de vidrio y después se preparan y se tiñen para inmunohistoquímica o hibridación in situ usando sondas de oligonucleótidos. Las células intactas incluyen citospinas, ThinPreps^{TM} (Cytyc, Inc., Boxborough, MA) y otros métodos de preparación de células intactas para tinción. In situ solamente puede referirse a matrices de tejidos montadas en portaobjetos de microscopio de vidrio.
Cromógeno: Sustrato enzimático que produce un producto de reacción detectable que habitualmente está teñido. Los ejemplos de cromógenos típicos incluyen Nuclear Fast Red; nitroazul de tetrazolio (NBT/BCIP); tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB); y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC). Muchos más se conocen y están disponibles a través de proveedores tales como Pierce Chemical, Rockford, IL.
Molécula conjugada: puede ser cualquier molécula que tiene una porción de unión complementaria que, cuando se sitúa en las proximidades de su punto de unión complementario, se une al punto. Anticuerpos y oligómeros de ARN/ADN que tienen secuencias capaces de hibridar con su ARN o ADN diana, son dos ejemplos de moléculas conjugadas. Otro par conjugado más es el par de estreptavidina-biotina, también llamados "socios de afinidad" en este documento. La proteína conjugada estreptavidina tiene una afinidad natural por biotina. La biotina se usa de forma dominante en el laboratorio de patología anatómica como socio de unión a estreptavidina. Casi todos los anticuerpos primarios disponibles en el mercado están marcados con biotina de modo que pueden usarse conjugados de estreptavidina para localizar el anticuerpo primario. En la presente invención, el motivo de unión biotina-estreptavidina se usa para co-localizar estreptavidina con AP los anticuerpos secundarios marcados con biotina se dirigen al sitio de unión en el tejido, y el conjugado de estreptavidina-AP lleva a AP a la misma ubicación a través de la unión de estreptavidina a biotina.
Kit: una combinación envasada de dos o más contenedores, recipientes, dispositivos o similares que contiene los reactivos necesarios para detectar un biomarcador de interés. Junto con el kit se suministran instrucciones por escrito para la realización del método. El kit puede contener un anticuerpo, ácido nucleico, ligando o similar marcado con AP. El kit para detectar un biomarcador de interés en una muestra biológica comprende uno o más recipientes, cada recipiente adaptado para contener una molécula conjugada marcada con una enzima, una especie reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble.
La marca enzimática puede ser fosfatasa alcalina u otra enzima conjugada a un anticuerpo, ácido nucleico o proteína conjugada tal como estreptavidina. La función de la marca enzimática es catalizar la creación de una especie reductora con actividad redox a partir de un precursor reductor sin actividad redox. Otras enzimas pueden ser alfa- y beta-galactosidasas, alfa- y beta-glucosidasas, esterasas en general, y beta-lactamasas, específicamente cafalosporinasas y penicilinasas.
La especie reductora sin actividad redox es la precursora de la especie reductora/agente reductor tal como dianión ascorbato o hidroquinona, que, en las condiciones apropiadas, reducirá iones metálicos solubles tales como plata(+) u oro(3+) a un átomo de plata o de oro de modo que se vuelva visible en un microscopio óptico de campo claro al ojo como un punto específico. Una especie reductora sin actividad redox preferida de la presente invención es fosfato de ascorbato, aunque en este documento se divulgan muchas más.
Otros agentes reductores que pueden usarse para amplificar la señal de plata son hidroquinona, ácido ascórbico, 2-aminofenol y 4-aminofenol. Estos actúan para reducir adicionalmente iones metálicos al estado de oxidación metálica 0, y se usan típicamente para suplementar o amplificar la señal. Otros agentes reductores los conocen bien los expertos en la materia, y pueden sustituirse por los que se divulgan en este documento.
La invención descrita en este documento utiliza una nueva serie de fosfatos y difosfatos y derivados relacionados que, aunque completamente inactivos como agentes reductores, se vuelven reactivos y capaces de reducir iones metálicos a estado de oxidación (0) después de la hidrólisis catalizada con fosfatasa alcalina de los grupos fosfato. El agente reductor precursor inactivo mostrado en las estructuras a continuación es fosfato de ácido ascórbico, un compuesto particularmente preferido. En presencia de fosfatasa alcalina, se hidroliza al agente reductor activo ácido ascórbico, que es capaz de reducir oro, plata y otros cationes metálicos a metal (0):
7
Otros nuevos precursores de agente reductor orgánico más incluyen fosfato de \alpha-tocoferol, fosfato de sesamol y fosfato de eugenol, mostrados en las estructuras generales V-VII, en las que Z = PO_{3}^{-2}; y R puede ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato.
Existen varias ventajas del uso de fosfatasa alcalina como marca y fosfato de ascorbato como sustrato en la presente invención:
1)
La fosfatasa alcalina es una de las enzimas perfectamente evolucionadas con un Kcat/Km que se aproxima al límite controlado por difusión de 1 x 10^{9} litros/mol-seg.
2)
El pH óptimo de la fosfatasa alcalina es 9-10, coincidiendo con los potenciales más rápidos de reducción de las hidroquinonas liberadas por la desfosforilación de los sustratos.
3)
Los fosfatos y difosfatos de arilo y de alquilo pueden sintetizarse de forma razonablemente económica.
4)
Los fosfatos y difosfatos de arilo y de alquilo son excelentes sustratos de fosfatasa alcalina.
5)
Los fosfatos y difosfatos de arilo y de alquilo son generalmente razonablemente estables y pueden formularse para resistir la descomposición durante periodos prolongados.
6)
Las fosfatasas alcalinas son enzimas muy estables que resisten a la degradación térmica y química mejor que la mayoría de las enzimas.
7)
Las fosfatasas alcalinas son razonablemente pequeñas y se han desarrollado métodos de conjugación a otras moléculas biológicas.
8)
El fosfato de ácido ascórbico es un excelente sustrato de AP y el ascorbato tiene un potencial de reducción muy alto, es decir reduce Ag+ y Au3+ cuantitativa y rápidamente, con deshidroascorbato como único sub-producto.
Otro excelente agente reductor es el dianión hidroquinona. Las estructuras a continuación muestran las estructuras en equilibrio de hidroquinona-benzoquinona, a un pH a partir de 9-10, en presencia de un aceptor de electrones como catión plata. El dianión hidroquinona es la auténtica especie responsable de reducir cationes de plata a metal insoluble. La formación de benzoquinona se favorece a pH alto:
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
Las estructuras generales II-TV son algunos derivados de hidroquinona que también son útiles en esta invención. El difosfato de hidroquinona (estructura general II con ambos Z = fosfato) es un sustrato preferido para la desfosforilación mediante la enzima fosfatasa alcalina, que a pH 7-11 se desfosforila a dianión hidroquinona, un agente reductor preferido para el catión plata. Otros derivados similares a hidroquinona se representan en las estructuras generales III-IV, y son naftohidroquinona (III) y antrahidroquinona (IV). Estos pueden sustituirse como se muestra en los anillos arilo en cualquier posición con R_{1} y R_{2}, y en los oxígenos con Z. Los sustituyentes R_{1} y R_{2} pueden ser casi cualquier resto que pueda reaccionar en estos puntos, que siguen conservando la capacidad de generar un dianión al pH deseado. En este documento no se incluye una lista exhaustiva de sustituyentes orgánicos, pero algunos sustituyentes probables incluyen los siguientes: H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter y sulfonato.
En la presente invención pueden usarse diversas marcas enzimáticas, dependiendo del par de marca-sustrato seleccionado, como se muestra en las estructuras a continuación. Por ejemplo, pueden usarse esterasas junto con mono- y diésteres. También pueden emplearse galactosidasas y glucosidasas para la desprotección de los sustratos mono- y di-galactósidos y mono- y di-glucósidos. Los grupos "Z" que se muestran a continuación incluyen fosfato, galactosilo, glucosilo, ésteres y beta-lactamas. Una beta-lactama preferida es la cefalosporina. Los sacáridos que entran dentro del alcance de la invención incluyen cualquiera con extremo reductor conjugado al oxígeno de la especie reductora. Los grupos R pueden ser H, alquilo, arilo, carboxilo, carboxialquilo, NH_{2}, (CH_{2})_{n}-COOH-, nitro, éter, tioéter o sulfonato.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
10
100
La última estructura, una C3' beta-lactama (es decir, cefalosporinas) también puede usarse junto con las beta-lactamasas como marcas enzimáticas. El grupo R de las beta-lactamas puede ser un alquil arilo, es decir tiofeno, metilo o bencilo.
De particular valor e interés son galactosilo, glucosilo y otros derivados sacarídicos de hidroquinona y ascorbato en los que el metabolismo enzimático del sustrato inactivo produce DOS agentes reductores, concretamente hidroquinona o ascorbato y el carbohidrato con su extremo reductor también capaz de reducir el ión plata a plata metálica:
11
Además de la fosfatasa alcalina, también puede usarse fosfatasa ácida como marca, en cuyo caso la desprotección de los grupos fosfato en los sustratos debe realizarse a pH < 7. El ácido ascórbico liberado en dichas reacciones sigue conservando excelentes capacidades reductoras a pH < 7.
Puede utilizarse una etapa de pre-tratamiento con oro para "sembrar" el área inmediatamente adyacente a la fosfatasa alcalina inmovilizada, aprovechando de este modo la bien conocida propensión de la plata metálica a depositarse en un punto de nucleación tal como partículas de oro ("metalografía"). Como se ha demostrado en los ejemplos en este documento, una vez que el conjugado SA-AP estaba unido a la molécula conjugada biotinilada, el ión oro en forma de AuCl_{3} se co-depositó junto con fosfato de ascorbato. La AP desfosforilaba el fosfato de ascorbato dando como resultado la producción del agente reductor ascorbato, que después reducía los iones oro a oro metálico. El oro metálico servía después como punto de nucleación para una amplificación adicional de la señal mediante reducción de iones plata a plata metálica.
Los siguientes ejemplos se incluyen con el fin de ilustrar algunos aspectos de la invención y no deben considerarse limitantes.
Ejemplo 1 Fosfatos para Reducción de Plata (I) Mediada por Fosfatasa Alcalina
Se depositaron alícuotas de nitrato de plata (100 \mul de AgNO_{3} 50 mM) en los pocillos de una placa de microvaloración (véase la figura 1). La adición de 100 \mul de una solución 50 mM de ácido ascórbico-2-fosfato (pocillos A1, B1), fosfato de sesamol (pocillos A2, B2), hidroquinona-1,4-difosfato (pocillos A3, B3) o fosfato de 2,2,5,7,8-pentametil-6-cromanol (pocillos A4, B4) a la solución de plata no produjo ninguna reacción. Si se añadía fosfatasa alcalina intestinal de ternero (5 \mul de 0,2 mg/ml) a los pocillos de la columna B, cada solución formaba plata metálica (0) como un precipitado fino, negro o un baño de plata en las paredes del recipiente. A: 100 \mul de AgNO_{3} 50 mM y 100 \mul de fosfato sustrato 50 mM, B: 100 \mul de AgNO_{3} 50 mM, 100 \mul de fosfato sustrato 50 mM y 5 \mul de fosfatasa alcalina intestinal de ternero 0,2 mg/ml (Pierce Chemical, Rockford, IL) en Tris 100 mM, pH 7,0.
Ejemplo 2 Fosfatasa alcalina, nitrato de plata y sustratos fosfato en Nitrocelulosa
Se añadió fosfatasa alcalina (5 \mul de 0,2 mg/ml) a papel de nitrocelulosa y se secó (véase la figura 2). Cada uno de los fosfatos se depositaba en un punto de la nitrocelulosa como 5 \mul de solución 0,05 M en Tris 1,0 M, pH 9. Cuando se añadían 5 \mul de AgNO_{3} 0,05 M a cada punto seco, se observaba un precipitado negro solamente en el punto en el que se aplicaba fosfatasa alcalina.
Ejemplo 3 Desarrollo fuera de línea de nanopartículas de Ag en amígdala usando el conjugado AP-SA a pH alto
La preparación de los portaobjetos para el análisis se realizó en un instrumento de señalización automatizado Benchmark® de Ventana (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Los portaobjetos se extrajeron para el desarrollo manual de la señal. El uso del término "tampón" en este ejemplo se refiere a tampón Tris 0,1 M (Trizma base (Sigma-Aldrich) en H_{2}O desionizada pH a 9 usando ácido acético glacial (Sigma-Aldrich). El siguiente es el procedimiento adaptado a partir del instrumento: el tejido recubierto de parafina en el portaobjetos se calentó a 75ºC durante 4 minutos y se trató dos veces con EZPrep^{TM} (Ventana, Tucson, AZ) volumen ajustado a 75ºC antes de la aplicación del cubreobjetos líquido con ajuste de volumen de EZPrep. Después de 4 minutos a 75ºC, el portaobjetos se aclaró y se añadió un ajuste de volumen de desparafinización automatizada junto con cubreobjetos líquido para desparafinar el tejido a 76ºC durante 4 minutos. El portaobjetos se enfrío a 40ºC y se aclaró 3 veces antes de la adición de anticuerpo Anti-CD20 (clon L26, Ventana, Tucson, AZ) seguido de cubreobjetos líquido e incubación a 40ºC durante 16 minutos. Después de aclarar el portaobjetos, el tejido se trató con el cóctel Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente 760-4205) para co-localizar biotina con el anticuerpo Anti-CD20, seguido de cubreobjetos líquido e incubación a 40ºC durante 8 minutos. El portaobjetos se aclaró dos veces y se extrajo del instrumento y se almacenó en 1x Tampón de Reacción (Ventana, Tucson, AZ) hasta que estaban preparados para el desarrollo.
El portaobjetos se extrajo de 1x Tampón de Reacción y se aclaró 10 veces con tampón seguido de la adición de 300 \mul de tampón al portaobjetos así como 100 \mul de conjugado de AP-SA (0,14 mg/ml en tampón, Sigma-Aldrich). El portaobjetos se incubó a 37ºC durante 15 minutos seguido de aclarado diez veces con tampón. El portaobjetos se trató con 300 \mul del tampón seguido de 50 \mul de AuCl_{3} (Sigma-Aldrich) (2,5 \mug/ml en tampón) y 50 \mul de fosfato de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) (0,1 M en tampón). El portaobjetos se incubó a 37ºC durante 20 minutos y seguidamente se aclaró 10 veces con tampón. El portaobjetos se trató con 300 \mul de tampón seguido de 50 \mul de acetato de plata (Sigma-Aldrich) (0,1 M en tampón) y 50 \mul de la solución de fosfato de ácido ascórbico y se incubó a 37ºC durante 20 minutos. El portaobjetos se aclaró de nuevo 10 veces con tampón seguido de la aplicación de ISH Red Counterstain (Ventana, Tucson, AZ) como contra-colorante. El portaobjetos se incubó con el contra-colorante durante 3 minutos y se aclaró con tampón. La deshidratación del portaobjetos con etanol y xileno precedía a la aplicación del cubreobjetos, después de lo cual los portaobjetos se observaban al microscopio.
Como se muestra mediante las fotografías en escala de grises en la figura 3, la tinción está presente en la membrana plasmática y en regiones citoplasmáticas de células B normales en amígdala normal. La intensidad de la tinción es comparable a un control positivo (figura 5) detectado con el kit Enhanced V-Red Detection Kit (Ventana, Tucson, AZ).
Ejemplo 4 Desarrollo en línea de nanopartículas de Ag en amígdala usando el conjugado AP-SA a pH alto
La principal diferencia entre este ejemplo y el ejemplo 3 es que este ejemplo muestra una automatización completa de las etapas de tinción, mientras que en el ejemplo 3 el portaobjetos se extraía del instrumento antes del desarrollo con AP-SA. La preparación de los portaobjetos para el análisis se realizó en un Instrumento Benchmark de Ventana. El uso del término "tampón" en este ejemplo se refiere a tampón Tris 0,1 M (Trizma base-Sigma-Aldrich) en H_{2}O desionizada pH a 9 usando ácido acético glacial (Sigma-Aldrich). El siguiente es el procedimiento adaptado a partir del instrumento: el tejido recubierto de parafina en el portaobjetos se calentó a 75ºC durante 4 minutos y se trató dos veces con ajuste de volumen de EZPrep a 75ºC antes de la aplicación del cubreobjetos líquido con ajuste de volumen de EZPrep. Después de 4 minutos a 75ºC, el portaobjetos se aclaró y se añadió un ajuste de volumen de desparafinización automatizada junto con cubreobjetos líquido para desparafinar el tejido a 76ºC durante 4 minutos. El portaobjetos se enfrío a 40ºC y se aclaró tres veces antes de la adición de anticuerpo Anti-CD20 (clon L26, Ventana, Tucson, AZ) seguido de cubreobjetos líquido e incubación a 40ºC durante 16 minutos. Después de aclarar el portaobjetos, el tejido se trató con cóctel Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente 760-4205) para co-localizar biotina con el anticuerpo Anti-CD20, seguido de cubreobjetos líquido e incubación a 40ºC durante 8 minutos. El portaobjetos se aclaró dos veces con tampón seguido de la aplicación de cubreobjetos líquido y la adición de conjugado de AP-SA (Sigma-Aldrich, 100 \mul, 0,14 mg/ml en tampón) e incubación a 37ºC durante 16 minutos. El portaobjetos se aclaró con tampón, se aplicó el cubreobjetos líquido y a esto le seguía la adición de 100 \mul de una solución 1:1 de AuCl_{3} (Sigma-Aldrich) (1,25 \mug/ml) y fosfato de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) (0,05 M) en tampón. El portaobjetos se incubó a 37ºC durante 20 minutos, se aclaró con tampón y se recubrió con cubreobjetos líquido. Un total de 100 \mul de una solución 1:1 de acetato de plata (Sigma-Aldrich) (0,05 M) y fosfato de ácido ascórbico (0,05 M) se añadieron al portaobjetos, y el portaobjetos se incubó durante 20 minutos a 37ºC. El portaobjetos se aclaró tres veces con tampón y se trató con un lavado con detergente antes de la deshidratación con etanol y xileno y la posterior aplicación de un cubreobjetos al portaobjetos, después de lo cual el portaobjetos se observó a través de un microscopio.
Como se muestra mediante las fotografías en escala de grises en la figura 4, la tinción está presente en la membrana plasmática y en regiones citoplasmáticas de células B normales en amígdala normal. La intensidad de la tinción es comparable a un control positivo (figura 5) detectado con el kit Enhanced V-Red Detection Kit (Ventana, Tucson, AZ).
Ejemplo 5 Anti-Desmina en Músculo Esquelético
Músculo esquelético incluido en parafina y fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en un teñidor de portaobjetos Benchmark de Ventana Medical Systems. Mientras permanecía en el Benchmark, la sección se trataba con Proteasa 1 (Ventana) durante 4 minutos. Las secciones se incubaron a continuación con anticuerpo monoclonal Anti-Desmina (Ventana Nº de cat. 760-2513) durante 16 minutos a 37ºC. Después del lavado con Tampón de Reacción en el instrumento, se incubó un anticuerpo anti-ratón de conejo durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon a continuación con Tampón de Reacción y se incubaron con un anticuerpo anti-conejo de ratón durante 8 minutos a 37ºC (Amplification Kit, Ventana Nº de cat. 760-080). Seguidamente, las secciones se aclararon con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente 760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon y una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181) se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron después del teñidor de portaobjetos Benchmark. Los portaobjetos se lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500 \mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato (Aldrich Nº de cat. 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM (Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a los portaobjetos durante 20 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se aclararon con H_{2}O desionizada y se cubrieron sin contra-colorante. Los resultados se muestran en la figura 6.
Ejemplo 6 Anti-S100 en el Cerebro
Tejido cerebral incluido en parafina y fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en un teñidor de portaobjetos Benchmark de Ventana. Las secciones se incubaron después con anticuerpo policlonal Anti-S 100 (Ventana Nº de cat. 760-2523) durante 16 minutos a 37ºC. Seguidamente, las secciones se aclararon con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente 760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon y una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181) se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron después del teñidor de portaobjetos BenchMark. Los portaobjetos se lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500 \mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato (Aldrich Nº 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM (Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a los portaobjetos durante 20 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se contratiñeron con Nuclear Fast Red y se cubrieron. Los resultados se muestran en la figura 7.
Ejemplo 7 Control Negativo de Conejo en el Cerebro
Músculo esquelético incluido en parafina y fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en un teñidor de portaobjetos Benchmark de Ventana. Las secciones se incubaron después con Control Negativo de Conejo (Ventana Nº de cat. 760-2023) durante 16 minutos a 37ºC. Seguidamente, las secciones se aclararon con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente 760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon y una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181) se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron después del teñidor de portaobjetos BenchMark. Los portaobjetos se lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500 \mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato (Aldrich Nº 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM (Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a los portaobjetos durante 20 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se contratiñeron con Nuclear Fast Red y se cubrieron. Los resultados se muestran en la figura 8.
La tinción gris-negra observada con la figura 7 en comparación con la falta de tinción gris-negra observada con la figura 8 demuestra que el patrón de tinción de la figura 7 es específico para el antígeno, puesto que la figura 8 se realizó con Control Negativo de Conejo. La figura 9 es el mismo caso de tejido cerebral realizado con Anti-S100 pero detectado utilizando el kit Enhanced V-Red Detection Kit de Ventana. Obsérvese que el patrón de tinción es el mismo que el descubierto en la figura 7.
Ejemplo 8 Anti-Desmina en Músculo Esquelético con amplificación no enzimática
Este ejemplo muestra que la amplificación química de la señal de plata puede usarse para amplificar la plata depositada original en función de la reducción mediante ascorbato. Músculo esquelético incluido en parafina y fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en un teñidor de portaobjetos BenchMark de Ventana. Mientras permanecía en el BenchMark, la sección se trataba con Proteasa 1 (Ventana) durante 4 minutos. Las secciones se incubaron a continuación con anticuerpo monoclonal Anti-Desmina (Ventana Nº de cat. 760-2513) durante 16 minutos a 37ºC. Después del lavado con Tampón de Reacción en el instrumento, se incubó un anticuerpo anti-ratón de conejo durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon a continuación con Tampón de Reacción y se incubaron con un anticuerpo anti-conejo de ratón durante 8 minutos a 37ºC (Amplification Kit, Ventana Nº de cat. 760-080). Seguidamente, las secciones se aclararon con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados Universal Secondary Antibody biotinilado (Ventana Medical Systems, Nº de componente 760-4205) durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon y una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina (Enhanced SA-/ALK Phos/V Red Ventana Nº de cat. 253-2181) se incubó durante 16 minutos a 37ºC. Las secciones se extrajeron después del teñidor de portaobjetos BenchMark. Los portaobjetos se lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500 \mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato (Aldrich Nº 44.212) durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM (Sigma Nº S-0139) en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM (Sigma A-8960) en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000 Sigma Nº P-1763) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a los portaobjetos durante 10 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se aclararon con H_{2}O desionizada. La señal se amplificó después incubando durante 10 minutos a 37ºC en una solución de 4-metil aminofenol 25 mM (Aldrich Nº 129720), AgNO_{3} 12 mM en un Tampón Citrato 0,1 M a pH 3,8. La figura 10 demuestra la señal con la amplificación en comparación con el ejemplo 9 (figura 11), que es sin amplificación no enzimática alguna.
Ejemplo 9 Anti-Desmina en Músculo Esquelético sin amplificación no enzimática
Músculo esquelético incluido en parafina y fijado con formalina se seccionó y se colocó en portaobjetos de vidrio para microscopio óptico. Las secciones se desparafinaron en un teñidor de portaobjetos BenchMark de Ventana Medical Systems. Mientras permanecía en el BenchMark, la sección se trataba con Proteasa 1 durante 4 minutos. Las secciones se incubaron a continuación con anticuerpo monoclonal Anti-Desmina durante 16 minutos a 37ºC. Después del lavado con Tampón de Reacción, en el instrumento, se incubó un anticuerpo anti-ratón de conejo durante 8 minutos a 37ºC. Las secciones se aclararon a continuación con Tampón de Reacción y se incubaron con un anticuerpo anti-conejo de ratón durante 8 minutos a 37ºC. Seguidamente, las secciones se aclararon con Tampón de Reacción y se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios biotinilados. Las secciones se aclararon y una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina se incubó durante 16 minutos. Las secciones se extrajeron después del teñidor automatizado de portaobjetos Benchmark. Los portaobjetos se lavaron después con H_{2}O desionizada y se incubaron con 500 \mul de 2,5 \mug/ml de tetrabromoaurato (III) de hidrógeno hidrato durante 4 minutos a 37ºC. La solución se aclaró con H_{2}O desionizada y 250 \mul de AgNO_{3} 50 mM en Tampón Tris 0,5 M a pH 9,0 y 250 \mul de fosfato de ácido ascórbico 100 mM en un tampón DEA 0,5 M a pH 10,0 con PVA al 5% (peso molecular medio 70.000 a 100.000) se aplicaron a cada sección. Se dejó incubar a los portaobjetos durante 10 minutos a 37ºC. Los portaobjetos se aclararon con H_{2}O desionizada. La figura 11 demuestra la señal sin la amplificación en comparación con el ejemplo 8 (figura 10).
Ejemplo 10 Síntesis de Hidroquinona-1,4-difosfato
Se hizo reaccionar hidroquinona con dos equivalentes de oxicloruro de fósforo y dos equivalentes de piridina anhidra en tolueno anhidro (a 0,1 M) durante 30 minutos. La mezcla se llevó a la temperatura de reflujo durante 30 minutos adicionales y se dejó enfriar a temperatura ambiente. El cloruro de piridinio se retiró por filtración a través de un filtro de tierra de diatomeas y se aclaró con un pequeño volumen de tolueno seco. El filtrado se concentró al vacío a 40ºC y el residuo se hidrolizó con carbonato de amonio acuoso a pH 7. El producto se purificó mediante separación en fase inversa en columna de gel de sílice C18 ultra-rápida para dar el producto deseado como se demuestra mediante Espectrometría de Masas (MS), ^{1}H y ^{13}C-RMN.
Ejemplo 11 Síntesis de Antrahidroquinona-1,4-difosfato y naftohidroquinona-1,4-difosfato
Se realiza el procedimiento del ejemplo 10 con la excepción del uso de antrahidroquinona o naftohidroquinona como materiales de partida.
Ejemplo 12 Síntesis general de fosfatos sustrato: Síntesis de fosfato de sesamol
POCl_{3} (89,5 mmoles) se transfirió a un matraz de fondo redondo de 500 ml seco en una atmósfera de nitrógeno. Una solución de sesamol (35,8 mmoles, 1 eq.) y trietilamina (71,7 mmoles) en 200 ml de diclorometano seco se añadió gota a gota durante cuatro horas a la solución de POCl_{3}. Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, el disolvente se retiró mediante evaporación rotatoria. El residuo se disolvió en 100 ml de diclorometano y las sales se retiraron filtrando a través de Celite. El producto se separó en agua enfriando rápidamente con 100 ml de carbonato de amonio saturado. La capa orgánica se desechó y la fase acuosa se secó mediante evaporación rotatoria para dar 8,2 gramos (rendimiento del 90%) del fosfato deseado. La identidad del producto se confirmó mediante MS, y el análisis mediante HPLC a 214 nm mostraba que el producto era puro a más del 99%.
Ejemplo 13 Síntesis general de fosfatos sustrato: Síntesis de fosfatos de eugenol y PMCP
Se realiza el procedimiento del ejemplo 12 con la excepción del uso de eugenol o PMCP (2,2,5,7,8-pentametil-6-cromanol) como materiales de partida.

Claims (19)

1. Un método de detección in situ de un epítopo inmunohistoquímico o una secuencia de ácido nucleico de interés en una muestra biológica, que comprende unir una molécula conjugada marcada con una enzima al epítopo o secuencia de interés en presencia de una especie reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble,
en el que dicha especie reductora sin actividad redox es un sustrato para dicha molécula conjugada marcada con una enzima y
en el que dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha molécula conjugada marcada con una enzima comprende un anticuerpo, avidina, estreptavidina o una secuencia de nucleótidos.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que dicha enzima se selecciona entre el grupo constituido por fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, alfa- y beta-galactosidasas, alfa- y beta-glucosidasas, esterasas en general y beta-lactamasas.
4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha especie reductora sin actividad redox se selecciona entre el grupo constituido por mono- y di-fosfatos de hidroquinona, mono- y di-fosfatos de naftohidroquinona, mono- y di-fosfatos de antrahidroquinona, fosfato de sesamol, fosfato de eugenol y fosfato de alfa-tocoferol o un derivado de los mismos.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha enzima es fosfatasa alcalina y dicho sustrato se selecciona entre el grupo constituido por fosfato de ácido ascórbico y un derivado de fosfato de hidroquinona.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho metal se selecciona entre el grupo constituido por plata y oro.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de pre-tratamiento de la muestra biológica con oro se realiza antes de la reducción de plata metálica.
8. Un kit para detectar un biomarcador de interés en una muestra biológica, que comprende uno o más 
\hbox{recipiente(s),}
comprendiendo el(los) recipiente(s) una molécula conjugada marcada con una enzima, una especie reductora sin actividad redox y un ión metálico soluble,
en el que dicha especie reductora sin actividad redox es un sustrato para dicha enzima, y
en el que dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima.
9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha molécula conjugada marcada con una enzima se selecciona entre el grupo constituido por un anticuerpo o una secuencia de oligonucleótidos.
10. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que dicha enzima es una fosfatasa.
11. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha especie reductora sin actividad redox es fosfato de ácido ascórbico.
12. Un método de tinción in situ de una muestra biológica que tiene un epítopo o una secuencia de nucleótidos de interés, que comprende las etapas de:
a)
poner en contacto a dicha muestra biológica con una molécula conjugada que tiene un hapteno;
b)
poner en contacto a dicho hapteno con una molécula conjugada marcada con una enzima, molécula conjugada marcada con una enzima que es un socio de unión al hapteno; y
c)
poner en contacto a dicha muestra biológica con una especie reductora sin actividad redox que es un sustrato para dicha marca enzimática en presencia de un ión metálico soluble,
en el que dicha enzima de dicha molécula conjugada marcada con una enzima cataliza la transformación de la especie reductora sin actividad redox en un agente reductor, reduciendo de este modo el ión metálico a partículas metálicas insolubles en estado de oxidación 0, en o alrededor del punto en el que se ancla la enzima.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la molécula conjugada de la etapa a) se selecciona entre el grupo constituido por anticuerpos, secuencias de nucleótidos y socios de afinidad.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en el que dicho hapteno se selecciona entre el grupo constituido por fluoresceína, biotina, digoxigenina y dinitrofenol.
15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicha enzima es una fosfatasa.
16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que dicha especie reductora sin actividad redox se selecciona entre el grupo constituido por mono- y di-fosfatos de hidroquinona, mono- y di-fosfatos de naftohidroquinona, mono- y di-fosfatos de antrahidroquinona, fosfato de sesamol, fosfato de eugenol y fosfato de alfa-tocoferol o un derivado de los mismos.
17. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que dicho metal se selecciona entre el grupo constituido por plata y oro.
18. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que la etapa de pre-tratamiento de la muestra biológica con oro se realiza antes de la reducción de plata metálica.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la molécula conjugada que tiene un hapteno en la etapa a) es un anticuerpo primario biotinilado, la molécula conjugada marcada con una enzima en la etapa b) es estreptavidina-fosfatasa alcalina, y la especie reductora sin actividad redox en la etapa c) es fosfato de ácido ascórbico en presencia de ión plata a un pH mayor de 7.
ES04756257T 2003-06-24 2004-06-24 Deposito de metal catalizado por una enzima para la deteccion in situ mejorada de epitopos inmunohistoquimicos y secuencias de acido nucleico. Active ES2330441T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48259603P 2003-06-24 2003-06-24
US482596P 2003-06-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2330441T3 true ES2330441T3 (es) 2009-12-10

Family

ID=33563868

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES04756257T Active ES2330441T3 (es) 2003-06-24 2004-06-24 Deposito de metal catalizado por una enzima para la deteccion in situ mejorada de epitopos inmunohistoquimicos y secuencias de acido nucleico.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7632652B2 (es)
EP (1) EP1636586B1 (es)
JP (1) JP4648902B2 (es)
AT (1) ATE437369T1 (es)
AU (1) AU2004254386B2 (es)
CA (2) CA2530287C (es)
DE (1) DE602004022165D1 (es)
DK (1) DK1636586T3 (es)
ES (1) ES2330441T3 (es)
WO (1) WO2005003777A2 (es)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7888060B2 (en) * 2001-03-30 2011-02-15 Nanoprobes, Inc. Method for detecting a target using enzyme directed deposition of elemental metal
US7691598B2 (en) * 2001-03-30 2010-04-06 Nanoprobes, Inc. Method for detecting a target molecule by metal deposition
US7642064B2 (en) * 2003-06-24 2010-01-05 Ventana Medical Systems, Inc. Enzyme-catalyzed metal deposition for the enhanced detection of analytes of interest
US20060246523A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Christopher Bieniarz Antibody conjugates
JP5199880B2 (ja) * 2005-11-23 2013-05-15 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 分子コンジュゲート
DK2444807T3 (da) 2006-11-01 2014-08-11 Ventana Med Syst Inc Mono- og dinitropyrazolhaptenkonjugater
JP4920553B2 (ja) * 2006-11-08 2012-04-18 富士フイルム株式会社 イムノクロマトグラフキット
DK2167963T3 (da) 2007-05-23 2019-06-24 Ventana Med Syst Inc Polymerbærere til immunhistokemi og in situ-hybridisering
FR2924601A1 (fr) * 2007-12-07 2009-06-12 Oreal Composes diphosphate d'hydroquinone et leur utilisation pour depigmenter la peau.
CA2720728C (en) 2008-06-05 2018-04-03 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes
DK2334827T3 (da) 2008-08-22 2015-06-15 Ventana Med Syst Inc Metode til kromogen påvisning af to eller flere målmolekyler i en enkelt prøve
KR101027036B1 (ko) * 2009-05-28 2011-04-11 주식회사 인포피아 금 이온의 환원에 의한 측방유동 분석에서의 신호 증폭 방법 및 이를 이용한 측방유동 분석 디바이스
SG182303A1 (en) 2009-12-31 2012-08-30 Ventana Med Syst Inc Methods for producing uniquely specific nucleic acid probes
DK2539355T3 (da) 2010-02-26 2017-01-02 Ventana Med Syst Inc IN-SITU-hybridisering med polytag-prober
EP2564203B1 (en) 2010-04-27 2017-06-07 Ventana Medical Systems, Inc. Antibody-nanoparticle conjugates and methods for making and using such conjugates
ES2676183T3 (es) 2010-07-02 2018-07-17 Ventana Medical Systems, Inc. Detección de dianas usando marcas de masa y espectrometría de masas
EP2633061B1 (en) 2010-10-28 2019-12-11 ETH Zurich Method for electrical detection of biomolecules by metal dissolution and assay kit therefor
ES2689593T3 (es) 2010-12-30 2018-11-14 Ventana Medical Systems, Inc. Depósito potenciado de cromógenos que utilizan análogos de piridina
US8703439B1 (en) 2011-01-31 2014-04-22 Linda Lester Point of care iodine sensor
CN103534359B (zh) 2011-03-14 2016-07-06 文塔纳医疗系统公司 分析染色体易位的方法及其系统
CA2834976C (en) 2011-05-04 2016-03-15 Htg Molecular Diagnostics, Inc. Quantitative nuclease protection assay (qnpa) and sequencing (qnps) improvements
WO2013167387A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Ventana Medical Systems, Inc. Uniquely specific probes for pten, pik3ca, met, top2a, and mdm2
ES2648176T3 (es) 2012-07-12 2017-12-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Métodos de predicción del tiempo de supervivencia y de la respuesta al tratamiento de un paciente que padece un cáncer sólido con un distintivo de al menos 7 genes
WO2014048942A1 (en) 2012-09-25 2014-04-03 Ventana Medical Systems, Inc. Probes for pten, pik3ca, met, and top2a, and method for using the probes
US9938523B2 (en) * 2013-03-15 2018-04-10 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Nucleic acid-tagged compositions and methods for multiplexed protein-protein interaction profiling
WO2015036405A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing and treating basal cell carcinoma
EP3066218B1 (en) 2013-11-05 2018-12-26 HTG Molecular Diagnostics, Inc. Methods for detecting nucleic acids
EP3110966A1 (en) 2014-02-24 2017-01-04 Ventana Medical Systems, Inc. Automated rna detection using labeled 2'-o-methyl rna oligonucleotide probes and signal amplification systems
AU2015270575B2 (en) 2014-06-06 2019-07-25 Ventana Medical Systems, Inc. Significance of intratumoral HER2 heterogeneity in breast cancer and uses therefore
WO2016050913A2 (en) 2014-10-02 2016-04-07 Ventana Medical Systems, Inc. Polymers and conjugates comprising the same
EP3009147A1 (en) 2014-10-16 2016-04-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for treating resistant glioblastoma
DK3254110T3 (da) 2015-02-03 2020-05-18 Ventana Med Syst Inc Histokemisk test til vurdering af ekspression af programmeret død-ligand 1 (pd-l1)
CA2977000A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for detecting androgen receptor splice variants and uses thereof
WO2016166169A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Spring Bioscience Corporation Antibodies, compositions, and immunohistochemistry methods for detecting c4.4a
WO2016189065A1 (en) 2015-05-26 2016-12-01 Ventana Medical Systems, Inc. Method and system for assessing stain quality for in-situ hybridization and immunohistochemistry
WO2017029391A1 (en) 2015-08-20 2017-02-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method for treating cancer
WO2017055319A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of b cells in a tissue sample
WO2017055322A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of neutrophils in a tissue sample
WO2017055326A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of myeloid dendritic cells in a tissue sample
WO2017055321A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of fibroblasts in a tissue sample
WO2017055324A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of cells of monocytic origin in a tissue sample
WO2017055320A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of cytotoxic lymphocytes in a tissue sample
WO2017055327A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of endothelial cells in a tissue sample
WO2017055325A1 (en) 2015-09-29 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of nk cells in a tissue sample
WO2017060397A1 (en) 2015-10-09 2017-04-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of subjects suffering from melanoma metastases
WO2017067944A1 (en) 2015-10-19 2017-04-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of subjects suffering from triple negative breast cancer
WO2017132276A1 (en) 2016-01-26 2017-08-03 Ventana Medical Systems, Inc. Predictive diagnostic workflow for tumors usnig automated dissection, next generation sequencing, and automated slide stainers
EP3426684A1 (en) 2016-03-08 2019-01-16 Ventana Medical Systems, Inc. Multiplexed immunohistochemistry using recombinant antibodies with epitope tags
WO2017182834A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method for treating resistant glioblastoma
US20190292259A1 (en) 2016-05-24 2019-09-26 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of non small cell lung cancer (nsclc) that coexists with chronic obstructive pulmonary disease (copd)
WO2018011107A1 (en) 2016-07-11 2018-01-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of er-alpha 46 in methods and kits for assessing the status of breast cancer
WO2018011166A2 (en) 2016-07-12 2018-01-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for quantifying the population of myeloid dendritic cells in a tissue sample
WO2018046736A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from cancer
US20200016177A1 (en) 2016-09-22 2020-01-16 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for reprograming immune environment in a subject in need thereof
CN110073218A (zh) 2016-09-23 2019-07-30 文塔纳医疗系统公司 用于对肿瘤样品中的细胞外基质生物标志物评分的方法和系统
EP3541958A1 (en) 2016-11-15 2019-09-25 Ventana Medical Systems, Inc. Compositions and methods for prognosing and treating colorectal cancer
CN110337588B (zh) 2016-12-19 2023-02-17 文塔纳医疗系统公司 用于定量免疫组织化学的方法和系统
WO2018118759A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Ventana Medical Systems, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
WO2018122249A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting the survival time of patients suffering from a microsatellite stable colorectal cancer
WO2018122245A1 (en) 2016-12-28 2018-07-05 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting the survival time of patients suffering from cms3 colorectal cancer
WO2018146239A1 (en) 2017-02-10 2018-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Biomarker for outcome in aml patients
WO2018162404A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Biomarker for outcome in aml patients
WO2018172540A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method to predict the progression of alzheimer's disease
WO2018189215A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for predicting the survival time of a patient suffering from hepatocellular carcinoma
CN107189988B (zh) * 2017-07-17 2019-08-30 江南大学 一株分泌抗丁香酚单克隆抗体的杂交瘤细胞株cs12及其应用
WO2019020556A1 (en) 2017-07-24 2019-01-31 Ventana Medical Systems, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR ASSESSING INFILTRAT OF IMMUNE CELLS IN TUMOR SAMPLES
WO2019038219A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) NEW PROGNOSTIC METHOD OF PANCREATIC CANCER
WO2019043138A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) METHOD FOR PREDICTING OUTCOME OF CANCER
US11579147B2 (en) 2017-09-25 2023-02-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of VNN1 as a biomarker and a therapeutic target in sarcomas
WO2019120635A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 Ventana Medical Systems, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
EP3746790B1 (en) 2018-01-31 2023-10-04 Ventana Medical Systems, Inc. Methods and systems for evaluation of immune cell infiltrate in stage iii colorectal cancer
WO2019207030A1 (en) 2018-04-26 2019-10-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting a response with an immune checkpoint inhibitor in a patient suffering from a lung cancer
WO2019224153A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Genentech, Inc. Her2 heterogeneity as a biomarker in cancer
EP3824288A1 (en) 2018-07-17 2021-05-26 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for detecting fusion proteins
JP2022500633A (ja) 2018-09-13 2022-01-04 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． Ｎｔｒｋ融合タンパク質を検出するための組織化学的および細胞化学的方法
CN112789684A (zh) 2018-10-01 2021-05-11 文塔纳医疗系统公司 用于预测对pd-1轴导向疗法的应答的方法和系统
WO2020089432A1 (en) 2018-11-02 2020-05-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New prognostic method of pancreatic cancer
WO2020089428A1 (en) 2018-11-02 2020-05-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New prognostic method of pancreatic cancer
EP3884259A1 (en) 2018-11-20 2021-09-29 Ventana Medical Systems, Inc. Methods and systems for preparing and analyzing cellular samples for morphological characteristics and biomarker expression
MX2021008121A (es) 2019-01-03 2021-12-10 Inst Nat Sante Rech Med Metodos y composiciones farmaceuticas para mejorar las respuestas inmunitarias dependientes de celulas t cd8+ en sujetos que sufren de cancer.
JP2022522265A (ja) 2019-01-16 2022-04-15 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル エリスロフェロンの変異体及びその使用
EP3921648A1 (en) 2019-02-05 2021-12-15 Ventana Medical Systems, Inc. Methods and systems for evaluation of immune cell infiltrate in stage iv colorectal cancer
WO2020165370A1 (en) 2019-02-13 2020-08-20 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for selecting a cancer treatment in a subject suffering from cancer
WO2020182932A1 (en) 2019-03-13 2020-09-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New gene signatures for predicting survival time in patients suffering from renal cell carcinoma
WO2020193740A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy for treating pancreatic cancer
EP3947737A2 (en) 2019-04-02 2022-02-09 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions
JP2022530390A (ja) 2019-04-24 2022-06-29 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 抗精神病剤の応答を予測するための方法
WO2020229521A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for inhibiting or reducing bacterial biofilms on a surface
WO2021001539A1 (en) 2019-07-04 2021-01-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy to detect and treat eosinophilic fasciitis
EP4025712A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Method of treatment and pronostic of acute myeloid leukemia
EP4045686A1 (en) 2019-10-17 2022-08-24 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Methods for diagnosing nasal intestinal type adenocarcinomas
WO2021173674A1 (en) 2020-02-26 2021-09-02 A2 Biotherapeutics, Inc. Polypeptides targeting mage-a3 peptide-mhc complexes and methods of use thereof
WO2021170777A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for diagnosing, prognosing and managing treatment of breast cancer
US20230086718A1 (en) 2020-03-20 2023-03-23 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for predicting the survival time of a patient suffering from a cancer
JP2023524568A (ja) 2020-05-07 2023-06-12 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 腫瘍試料中のｅｇｆｒおよびｅｇｆｒリガンドの発現を評価するための組織化学的システムおよび方法
EP4165214A1 (en) 2020-06-10 2023-04-19 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Method for treating and prognosing cancer like glioblastoma
EP4168006A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) New strategy for treating pancreatic cancer
WO2022018163A1 (en) 2020-07-22 2022-01-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for predicting survival time in patients suffering from cancer
WO2022063787A1 (en) 2020-09-22 2022-03-31 Roche Diagnostics Gmbh Antibodies specific for alpha-1,6-core-fucosylated psa and fucosylated fragments thereof
WO2022064049A1 (en) 2020-09-28 2022-03-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing brucella infection
EP4232603A1 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Method for predicting the response to tnf inhibitors
CN116917502A (zh) 2020-11-06 2023-10-20 Inserm(法国国家健康医学研究院) 诊断和治疗多囊卵巢综合征（pcos）的方法
WO2022136252A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for prognosis the humoral response of a subject prior to vaccination
WO2022135753A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for prognosis the humoral response of a subject prior to vaccination
WO2022152698A1 (en) 2021-01-12 2022-07-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of npdk-d to evaluate cancer prognosis
US20240044901A1 (en) 2021-02-09 2024-02-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New method to pronostic lung cancer
EP4308934A1 (en) 2021-03-17 2024-01-24 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing pancreatic cancer
WO2022207566A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New method to evaluate pancreatic cancer prognosis
WO2022223791A1 (en) 2021-04-23 2022-10-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cell senescence accumulation related disease
WO2023280790A1 (en) 2021-07-05 2023-01-12 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Gene signatures for predicting survival time in patients suffering from renal cell carcinoma
WO2023089159A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) New strategy targeting stroma/tumor cell crosstalk to treat a cancer
WO2023144303A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Cd38 as a biomarker and biotarget in t-cell lymphomas
WO2023152133A1 (en) 2022-02-08 2023-08-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method for diagnosing colorectal cancer
WO2024061930A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale New method to treat and diagnose peripheral t-cell lymphoma (ptcl)

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5491098A (en) * 1987-03-09 1996-02-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Method for depositing metal particles on a marker
FR2680374B1 (fr) * 1988-03-25 1993-11-12 Bioprobe Systems Sa Procede de coloration d'acides nucleiques detectes par marquage non radioactif et ensemble de reactifs pour la mise en óoeuvre de ce procede.
US5143854A (en) * 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US6040138A (en) 1995-09-15 2000-03-21 Affymetrix, Inc. Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5424186A (en) * 1989-06-07 1995-06-13 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis
US5116734A (en) * 1989-09-01 1992-05-26 Digene Diagnostics, Inc. Highly sensitive method for detecting peroxidase
US5252743A (en) 1989-11-13 1993-10-12 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces
US5595707A (en) * 1990-03-02 1997-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Automated biological reaction apparatus
ATE244065T1 (de) 1990-12-06 2003-07-15 Affymetrix Inc Verfahren und reagenzien für immobilisierten polymersynthese in sehr grossem masstab
US5696887A (en) * 1991-08-05 1997-12-09 Biotek Solutions, Incorporated Automated tissue assay using standardized chemicals and packages
US5355439A (en) * 1991-08-05 1994-10-11 Bio Tek Instruments Method and apparatus for automated tissue assay
US5412087A (en) * 1992-04-24 1995-05-02 Affymax Technologies N.V. Spatially-addressable immobilization of oligonucleotides and other biological polymers on surfaces
CA2124087C (en) 1991-11-22 2002-10-01 James L. Winkler Combinatorial strategies for polymer synthesis
US5384261A (en) * 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
US5631734A (en) * 1994-02-10 1997-05-20 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials
AU2360195A (en) * 1994-05-05 1995-11-29 Beckman Instruments, Inc. Oligonucleotide repeat arrays
US5571639A (en) * 1994-05-24 1996-11-05 Affymax Technologies N.V. Computer-aided engineering system for design of sequence arrays and lithographic masks
US5599695A (en) * 1995-02-27 1997-02-04 Affymetrix, Inc. Printing molecular library arrays using deprotection agents solely in the vapor phase
US5624711A (en) * 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
US6165734A (en) * 1995-12-12 2000-12-26 Applied Spectral Imaging Ltd. In-situ method of analyzing cells
US6093574A (en) * 1997-08-11 2000-07-25 Ventana Medical Systems Method and apparatus for rinsing a microscope slide
US6083726A (en) * 1998-02-03 2000-07-04 Lucent Technologies, Inc. Methods for polynucleotide synthesis and articles for polynucleotide hybridization
US6451683B1 (en) * 2000-08-28 2002-09-17 Micron Technology, Inc. Damascene structure and method of making
US6670113B2 (en) * 2001-03-30 2003-12-30 Nanoprobes Enzymatic deposition and alteration of metals
JP2003038173A (ja) * 2001-05-18 2003-02-12 Takeda Chem Ind Ltd 抗体の選別方法、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体及びその用途
GB0125532D0 (en) 2001-10-24 2001-12-12 Burton Michael Enzyme activity indicators

Also Published As

Publication number Publication date
CA2773566A1 (en) 2005-01-13
DE602004022165D1 (de) 2009-09-03
EP1636586B1 (en) 2009-07-22
CA2530287C (en) 2012-06-19
DK1636586T3 (da) 2009-11-23
US20040265922A1 (en) 2004-12-30
JP4648902B2 (ja) 2011-03-09
ATE437369T1 (de) 2009-08-15
EP1636586A2 (en) 2006-03-22
WO2005003777A3 (en) 2005-06-09
CA2773566C (en) 2015-09-15
US7632652B2 (en) 2009-12-15
CA2530287A1 (en) 2005-01-13
AU2004254386B2 (en) 2009-09-24
JP2007528986A (ja) 2007-10-18
AU2004254386A1 (en) 2005-01-13
WO2005003777A2 (en) 2005-01-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2330441T3 (es) Deposito de metal catalizado por una enzima para la deteccion in situ mejorada de epitopos inmunohistoquimicos y secuencias de acido nucleico.
JP6644713B2 (ja) キノンメチドアナログシグナル増幅
US8329401B2 (en) Enzyme-catalyzed metal deposition for the enhanced detection of analytes of interest
EP0747706B1 (en) Adduct protection assay
US20180299456A1 (en) In Situ Chemiluminescent Substrates and Assays
JPS60256398A (ja) 試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在を測定するための組成物及び試験具
US5030721A (en) Novel N-acetyl-β-D-glucosamine derivatives and a process for production thereof as well as application to reagents for assaying N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity
EP0375723B1 (en) Substrates for the assay of enzymes
JPS63185971A (ja) ジヒドロレソルフイン化合物、その製造方法および該化合物を含有するヒドロラーゼ測定試薬
EP3475287B1 (en) Compounds, linked with haptens, for the detection of senescent cells
KR101847027B1 (ko) Ｚｎ(ⅱ)계 색측정 센서 및 이의 제조 방법
US20060241308A1 (en) Probe for measuring phytase activity
US7741506B2 (en) Probe for measuring phytase activity
JPH0662569B2 (ja) 色原体アクリジノン酵素基質及びその製造方法
JP2678609B2 (ja) 新規な２−クロルニトロフェニルリン酸塩及びこれを用いるホスファターゼ活性測定法
EP0933355A1 (en) Preparation of tyramide conjugates
US6448422B1 (en) Chromogenic compound
WO2023232829A1 (en) Compositions and methods for nucleic acid sequencing
Roy et al. Enzyme histochemistry: A review of its history and applications
WO2002002570A1 (en) Chromogenic compound
Sheu Stereochemical and mechanistic study of enzyme catalyzed phosphoryl and nucleotidyl transfer reactions.
Sasamoto et al. Chelator-conjugated substrates for N-acetyl-β-D-glucosaminidase
JPH07126281A (ja) 非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体の製造法