CN112789684A - 用于预测对pd-1轴导向疗法的应答的方法和系统 - Google Patents

用于预测对pd-1轴导向疗法的应答的方法和系统 Download PDF

Info

Publication number
CN112789684A
CN112789684A CN201980063834.8A CN201980063834A CN112789684A CN 112789684 A CN112789684 A CN 112789684A CN 201980063834 A CN201980063834 A CN 201980063834A CN 112789684 A CN112789684 A CN 112789684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
roi
cell
tumor
radius
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980063834.8A
Other languages
English (en)
Inventor
M·霍贾斯泰
J·马丁
L·佩斯蒂克-德拉戈维奇
L·唐
X·王
W·张
R·安德斯
L·迪亚兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ventana Medical Systems Inc
Johns Hopkins University
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Original Assignee
Ventana Medical Systems Inc
Johns Hopkins University
Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ventana Medical Systems Inc, Johns Hopkins University, Memorial Sloan Kettering Cancer Center filed Critical Ventana Medical Systems Inc
Publication of CN112789684A publication Critical patent/CN112789684A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T7/00—Image analysis
    • G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
    • G06T7/0012—Biomedical image inspection
    • G06T7/0014—Biomedical image inspection using an image reference approach
    • G06T7/0016—Biomedical image inspection using an image reference approach involving temporal comparison
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H10/00—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data
    • G16H10/40—ICT specially adapted for the handling or processing of patient-related medical or healthcare data for data related to laboratory analysis, e.g. patient specimen analysis
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H30/00—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images
    • G16H30/20—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images for handling medical images, e.g. DICOM, HL7 or PACS
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H30/00—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images
    • G16H30/40—ICT specially adapted for the handling or processing of medical images for processing medical images, e.g. editing
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/20—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for computer-aided diagnosis, e.g. based on medical expert systems
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/50—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for simulation or modelling of medical disorders
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/70—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for mining of medical data, e.g. analysing previous cases of other patients
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/10—Image acquisition modality
    • G06T2207/10056—Microscopic image
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
    • G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
    • G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
    • G06T2207/30004—Biomedical image processing
    • G06T2207/30096—Tumor; Lesion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Primary Health Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Quality & Reliability (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种评分函数，所述评分函数经过开发并用于鉴定可能对PD‑1轴导向疗法有应答的患者。所述评分函数通过以下步骤获得：从多重染色切片提取特征，使用特征选择函数选择与对所述疗法的应答有关的特征，以及将所选特征中的一者或多者拟合至多个候选评分函数。然后，可以选择表明预测灵敏度和特异性之间所需平衡的候选评分函数，以纳入至少包括图像分析系统的评分系统中。

Description

用于预测对PD-1轴导向疗法的应答的方法和系统
相关专利申请的交叉引用
本文是根据专利合作条约的国际申请，要求2018年10月1日提交的美国临时专利申请号62/739,828和2018年10月9日提交的美国临时专利申请号62/742,934的优先权，将其各自内容通过引用以其整体并入本文。
作为符合ASCII的文本文件(.txt)提交的序列表的引用
根据EFS-Web法律框架和37CFR§§1.821-825(参见MPEP§2442.03(a))，以符合ASCII的文本文件(标题为“Sequence_Listing_3000022-004977_ST25.txt”)的形式创建于2019年9月30日且大小为23,475字节)的序列表与本申请同时提交，并且序列表的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及肿瘤样品中生物标志物的检测、表征和计数，用于预测对检查点抑制剂疗法的应答。
背景技术
通过在肿瘤细胞上和在肿瘤微环境中上调程序性死亡1(PD-1)途径及其配体程序性死亡配体1(PD-L1)可以使癌症逃避免疫监测和根除。在某些癌症患者中，用针对PD-1或PD-L1的抗体阻滞该途径已导致了显著的临床应答。然而，识别用于患者选择的预测性生物标志物是一个重大挑战。
PD-L1是用于选择待接受PD-1轴定向疗法的患者的最广泛使用的预测性生物标志物。然而，观察到的结果不一致。参见Yi。
错配修复(MMR)缺陷预测了实体瘤对PD-1阻滞的应答。参见Le(I)和Le(II)。然而，并非所有具有错配修复缺陷的患者都对PD-1阻滞治疗有应答。对于研究和肿瘤类型之间可变的关联强度，预测值是有限的。
最近的研究表明，癌细胞与免疫细胞之间的空间排列和相互作用会影响患者的预后、存活以及对治疗的应答。Wang和Barrera。
越来越需要了解肿瘤的微环境和相关的生物标志物，以指导癌症的免疫疗法。
发明内容
本公开总体上涉及鉴定和使用新生物标志物预测实体瘤对PD-1轴导向疗法的应答的系统和方法。
在某一实施例中，一种开发用于预测肿瘤对PD-1轴导向疗法的应答的评分函数的方法，该方法包括：(a)获得：(a1)在用该PD-1轴导向疗法治疗之前，从多个患者获得的肿瘤组织样品的一组数字图像，其中每个患者的至少一个数字图像为以多重亲和组织化学染色针对一种或多种上皮标志物、一种或多种免疫细胞标志物以及一种或多种PD-1轴途径标志物中的每一者而染色的组织切片的数字图像；和(a2)每个患者的治疗后应答数据；(b)从多重染色的组织切片的该数字图像提取多个特征；(c)将特征选择函数应用于所提取的多个特征和该治疗后应答数据，以获得针对与对该PD-1轴导向疗法的应答的相关性强度的每个特征的排序；(d)将建模函数应用于排序的特征和该治疗后应答数据中的一者或多者，以生成多个预测对检查点抑制剂疗法的应答的候选模型，并测试每个候选模型与应答的一致性；(e)选择与该应答具有最高一致性的候选模型作为该评分函数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，并且所述特征选自由表4左栏中的特征组成的组。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PanCK、PD-L1、PD1、CD8、和LAG3(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，并且该特征选自由表4右栏中的特征组成的组。在某一实施例中，该特征选择函数选自由以下项组成的组：集合特征选择方法(包括例如随机森林函数)、过滤方法(包括例如基于互信息的函数(mRMR)/基于相关系数的函数和基于Relief的函数)和/或嵌入特征选择函数(例如弹性网络/最小绝对收缩函数或选择算子(LASSO)函数)。在某一实施例中，使用由该特征选择函数识别的前25、前20、前15、前10、前9、前8、前7、前6、前5、前4或前3个特征中的一者或多者来制作所述候选模型。在另一实施例中，该候选模型使用在该特征选择函数的前10个特征中识别的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个特征。在另一实施例中，该候选模型包括存在于至少2个特征选择函数的前5个特征中的至少一个特征。在某一实施例中，该建模函数选自由以下项组成的组：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供了一种就肿瘤样品对PD-1轴导向疗法有应答的可能性进行评分的方法，该方法包括：(a)从该肿瘤样品获得肿瘤切片的数字图像，其中以多重亲和组织化学染色针对一种或多种上皮标志物、一种或多种免疫细胞标志物、和一种或多种PD-1轴途径标志物中的每一者将该肿瘤切片染色；(b)识别数字图像中的所关注区域(ROI)；(c)从该ROI提取涉及针对相应生物标志物染色的细胞的一个或多个特征；以及(d)将评分函数应用于包括(c)的一个或多个所提取的特征的特征向量以生成评分，其中该评分指示肿瘤将对该PD-1轴导向疗法有应答的可能性。在某一实施例中，该ROI来源于该肿瘤样品的形态学染色的切片的数字图像，其中该形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的样品为连续切片。在某一实施例中，该ROI由使用者在所述形态学染色的切片的数字图像中识别，并且自动地登记至该多重亲和组织化学染色的切片的数字图像中。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由表4左栏中的特征组成的组的特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且该特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的所述前10个最重要的特征中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由以下项组成的组的特征：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数、和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括以下项中的每一项：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PanCK、PD-L1、PD1、CD8和LAG3(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征选自由表4右栏中的特征组成的组。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏的特征中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由以下项组成的组的特征：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的Pd-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括以下项中的每一项：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该评分函数来源于选自由以下项组成的组的建模函数：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供了一种选择待接受PD-1轴导向疗法的患者的方法，所述方法包括：(a)从该肿瘤样品获得肿瘤切片的数字图像，其中以多重亲和组织化学染色针对一种或多种上皮标志物、一种或多种免疫细胞标志物、和一种或多种PD-1轴途径标志物中的每一者将该肿瘤切片染色；(b)识别数字图像中的所关注区域(ROI)；(c)从该ROI提取涉及针对相应生物标志物染色的细胞的一个或多个特征；(d)将评分函数应用于包括(c)的一个或多个所提取的特征的特征向量以生成评分，其中该评分指示肿瘤将对该PD-1轴导向疗法有应答的可能性；(e)比较该评分与预定的截止值；以及(f)基于(e)的比较选择待接受该PD-1轴疗法或替代疗法的患者。在某一实施例中，该ROI来源于该肿瘤样品的形态学染色的切片的数字图像，其中该形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的样品为连续切片。在某一实施例中，该ROI由使用者在所述形态学染色的切片的数字图像中识别，并且自动地登记至该多重亲和组织化学染色的切片的数字图像中。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由表4左栏中的特征组成的组的特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且该特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的所述前10个最重要的特征中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由以下项组成的组的特征：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数、和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括以下项中的每一项：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PanCK、PD-L1、PD1、CD8和LAG3(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征选自由表4右栏中的特征组成的组。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由以下项组成的组的特征：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括以下项中的每一项：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该评分函数来源于选自由以下项组成的组的建模函数：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供了一种治疗具有肿瘤的患者的方法，该方法包括：(a)从该肿瘤样品获得肿瘤切片的数字图像，其中以多重亲和组织化学染色针对一种或多种上皮标志物、一种或多种免疫细胞标志物、和一种或多种PD-1轴途径标志物中的每一者将该肿瘤切片染色；(b)识别数字图像中的所关注区域(ROI)；(c)从该ROI提取涉及针对相应生物标志物染色的细胞的一个或多个特征；(d)将评分函数应用于包括(c)的一个或多个所提取的特征的特征向量以生成评分，其中该评分指示肿瘤将对该PD-1轴导向疗法有应答的可能性；(e)比较该评分与预定的截止值；以及(f)如果(e)的比较指示患者可能对PD-1轴导向疗法有应答，则向该患者施用PD-1轴导向疗法，或者如果(e)的比较指示患者可能对PD-1轴导向疗法无应答，则向该患者施用不包含PD-1轴导向疗法的疗程。在某一实施例中，该ROI来源于该肿瘤样品的形态学染色的切片的数字图像，其中该形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的样品为连续切片。在某一实施例中，该ROI由使用者在所述形态学染色的切片的数字图像中识别，并且自动地登记至该多重亲和组织化学染色的切片的数字图像中。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由表4左栏中的特征组成的组的特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且该特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的所述前10个最重要的特征中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由以下项组成的组的特征：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数、和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括以下项中的每一项：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括使用针对PanCK、PD-L1、PD1、CD8和LAG3(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征选自由表4右栏中的特征组成的组。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏中的至少一个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要的特征之一的表4右栏中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个特征。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括至少一个选自由以下项组成的组的特征：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该多重亲和组织化学染色包括第2组，该ROI是根据表3的ROI，并且所述特征包括以下项中的每一项：上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该评分函数来源于选自由以下项组成的组的建模函数：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供的方法包括：(a)在肿瘤的测试样品的数字图像上标注所关注区域(ROI)，其中所述数字图像为针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK(第1组)进行多重亲和染色的样品的数字图像；(b)从该ROI提取表9的一个或多个特征；(c)将评分函数应用于包括(b)的一个或多个特征的特征向量，其中所述评分函数的输出值是预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的值。在某一实施例中，该一个或多个特征确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答是重要的。在某一实施例中，该特征是确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要特征之一。在某一实施例中，该至少一个特征选自由以下项组成的组：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数、和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该特征向量包括以下每一项：间质中PD-L1+巨噬细胞的分数、间质中PD-L1+CD3+CD8-细胞的分数、和间质中PD-L1+CD3+细胞的分数。在某一实施例中，该特征向量包括对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的所述前10个最重要特征的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在某一实施例中，所述评分函数通过将象限判别分类模型拟合至所选择的特征而导出，以预测对治疗的应答。在某一实施例中，用于拟合象限判别分类模型的治疗结果以选自由以下项组成的组的配置组合在一起：PD相对于SD相对于PR+CR；PD相对于SD+PR+CR；和PD+SD相对于PR+CR。在某一实施例中，其中在测试样品的第一连续切片的数字图像中识别ROI，其中该第一连续切片用苏木精和曙红染色，并且其中在所述测试样品的至少第二连续切片的数字图像中自动显示该ROI，其中该第二连续切片用第1组染色。在某一实施例中，该方法是计算机实现的。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供的方法包括：(a)在肿瘤的测试样品的数字图像上标注所关注区域(ROI)，其中所述数字图像为针对PanCK、PD-L1、PD1、CD8和LAG3(第2组)进行多重亲和染色的样品的数字图像；(b)从该ROI提取表16的一个或多个特征；(c)将评分函数应用于包括(b)的一个或多个特征的特征向量，其中所述评分函数的输出值是预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的值。在某一实施例中，该一个或多个特征是确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答重要的的特征。在某一实施例中，该一个或多个特征是确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要特征之一的特征。在某一实施例中，该特征向量包括选自由以下项组成的组的至少一个特征：“上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量、”PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该特征向量包括上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量的每一项，并且任选地进一步包括选自由以下项组成的组的一个或多个额外的特征：PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度CD8+细胞的平均值#、CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值、PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均值#、和CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。在某一实施例中，该特征向量包括确定为对于通过ReliefF和/或随机森林预测患者对PD-1轴导向疗法的应答的前10个最重要特征之一的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个特征。在某一实施例中，所述评分函数通过将象限判别分类模型拟合至所选择的特征而导出，以预测对治疗的应答。在某一实施例中，用于拟合象限判别分类模型的治疗结果以选自由以下项组成的组的配置组合在一起：PD相对于SD相对于PR+CR；PD相对于SD+PR+CR；和PD+SD相对于PR+CR。在某一实施例中，其中在测试样品的第一连续切片的数字图像中识别ROI，其中该第一连续切片用苏木精和曙红染色，并且其中在所述测试样品的至少第二连续切片的数字图像中自动显示该ROI，其中该第二连续切片用第2组染色。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供了一种用于预测患者对PD-1轴疗法的应答的系统，该系统包括：处理器；以及与该处理器耦合的存储器，该存储器用于存储计算机可执行指令，当处理器执行时，该计算机可执行指令使该处理器进行包括预测患者对本申请所述的PD-1导向疗法应答的一种或多种方法的操作。在某一实施例中，该系统进一步包括扫描仪或显微镜，所述扫描仪或显微镜适于捕获该组织样品的切片的数字图像并将该图像传送至计算机设备。在某一实施例中，该系统进一步包括自动载玻片染色器，该自动载玻片染色器编程为用第1组或第2组对该组织样品的切片进行组织化学染色。在某一实施例中，该系统进一步包括自动苏木精和曙红染色器，该自动苏木精和曙红染色器编程为对由该自动载玻片染色器染色的切片的一个或多个连续切片进行染色。在某一实施例中，所述系统进一步包括用于跟踪样品和图像工作流程以及诊断信息的实验室信息系统(LIS)，该LIS包括配置为接收和存储与所述组织样品相关的信息的中央数据库，该信息包括以下项中的至少一项：待要对该肿瘤组织样品进行的处理步骤、待要对该肿瘤组织样品的切片的数字图像进行的处理步骤、该肿瘤组织样品和数字图像的处理历史记录；以及与该患者对该疗法有应答的可能性相关的一个或多个临床变量(例如MMR或MSI状态)。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
在某一实施例中，提供了一种用于存储计算机可执行指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机可执行指令由处理器执行以进行操作，该操作包括患者对本申请所述的PD-1导向疗法的应答的预测的一种或多种方法。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。在某一实施例中，该PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在提出请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩图的本专利或专利申请公布的拷贝。
图1是示出导出本文公开的评分函数的示例性方法的流程图。
图2是示出使用本文所述的评分函数为测试样品评分的示例性方法的流程图。
图3示出了整合本文所述的评分函数的示例性评分系统。
图4A示出了在本文公开的图像分析系统上实现的示例性工作流程，其中在执行ROI生成器功能之前，在整个图像上执行对象识别功能。
图4B示出了在本文公开的图像分析系统上实现的示例性工作流程，其中在执行ROI生成器功能之后，在仅ROI上执行对象识别功能。
图5示出了使用如实例I中所述的第1组的多重染色过程。
图6示出了用第1组染色的示例性载玻片。
图7示出了在所有情况下，用第1组染色的所有特征的重要性排名。
图8示出了在MMR缺陷情况下，用第1组染色的特征的重要性排名。
图9是用第1组染色的样品的IHC图像，该样品来自显示对PD-1轴导向疗法治疗完全应答的患者。
图10是用第1组染色的样品的IHC图像，该样品来自用PD-1轴导向疗法治疗的治疗后具有进展性疾病的患者。
图11示出了实例II中针对第2组使用的染色和图像分析过程。
图12示出了使用ReliefF特征选择函数针对第2组的前15个特征的排名。特征如下：(1)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的最大数量；(2)来自PD-L1+/CD8+细胞的PD-L1强度的最大值；(3)在panCK–区域中PD-1+/PD-L1-/Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比；(4)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的数量的空间方差；(5)来自所有PD-L1+细胞的PD-L1强度的最大值；(6)panCK–区域中Lag3+细胞的数量；(7)panCK–区域中PD-L1+/panCK–细胞的密度；(8)panCK+区域中PD-L1+细胞的数量；(9)panCK–区域中PD-L1+细胞的数量；(10)panCK–区域中PD-1+细胞的数量；(11)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的最大数量；(12)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的平均数量；(13)来自CD8+/Lag3+细胞的Lag3强度的最大值；(14)panCK–区域中CD8+细胞的数量；以及(15)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的数量的方差。
图13示出了使用随机森林特征选择函数针对第2组的前15个特征的排名。特征如下：(1)从PD-L1+细胞到其最近的PD-1+细胞的平均距离；(2)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的最大数量；(3)PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的最大数量；(4)从PD-L1+细胞到最近的PD-1+细胞的标准距离；(5)panCK–区域中Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比；(6)panCK–区域中PD-L1+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比；(7)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的平均数量；(8)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低强度/CD8+细胞的数量的方差；(9)来自所有PD-1+细胞的PD-1强度的平均值；(10)来自所有Lag3+细胞的Lag3强度的最小值；(11)panCK–区域中PD-L1+细胞的密度；(12)PD-L1+/CD8+细胞的10μm半径内PD-1低强度/CD8+细胞的最大数量；(13)panCK+区域中PD-1+细胞的数量；(14)panCK–区域中PD-1+/PD-L1–/Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比；以及(15)来自Lag3+/CD8+细胞的Lag3强度的最大值。
图14A含有说明以下的图表：PD-L1+细胞的10μm半径内的空间方差#PD-1+细胞的预测值(F1)、PD-L1+细胞的20μm半径内的平均值#PD-1低强度CD8+细胞的预测值(F2)、和CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值的预测值(F3)。
图14B是显示以下的预测值的散点图：PD-L1+细胞的10μm半径内的空间方差#PD-1+细胞(F1)和PD-L1+细胞的20μm半径内的平均值#PD-1低强度CD8+细胞(F2)。
图14C是显示以下的预测值的散点图：PD-L1+细胞的10μm半径内的空间方差#PD-1+细胞(F1)、PD-L1+细胞的20μm半径内的平均值#PD-1低强度CD8+细胞(F2)、和CD8+Lag3+细胞Lag3强度的最大值(F3)。
图15示出了无应答者和应答者的示例性IHC图像，以及显示PD-L1+细胞的位置(灰色点)、PD-L1+细胞的20μm内的PD-1低细胞(白色点)、和PD-L1+细胞的10μm内的PD-1+细胞(黑色点)的图形重构。框(a)是无应答者的原始荧光图像。框(b)是来自框(a)的白色方框的图形重构，显示了无应答者中PD-L1+细胞的20μm内的PD-L1+细胞和PD-1低细胞之间的空间关系。框(c)是来自框(a)的灰色方框的图形重构，显示了无应答者中PD-L1+细胞的10μm内的PD-L1+细胞和PD-1+细胞之间的空间关系。框(d)是应答者的原始荧光图像。框(e)是来自框(d)的白色方框的图形重构，显示了应答者PD-L1+细胞的20μm内的PD-L1+细胞和PD-1低细胞之间的空间关系。框(f)是来自框(d)的灰色方框的图形重构，显示了应答者PD-L1+细胞的10μm内的PD-L1+细胞和PD-1+细胞之间的空间关系。
图16A是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于panCK-阴性区域中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的总数量的比。
图16B是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于panCK-阴性区域中Lag3-/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比。
图16C是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于Lag3+/panCK–细胞的数量除以panCK-阴性面积。
图16D是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于panCK阴性区域中Lag3阳性细胞的数量。
图16E是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于CD8+细胞中Lag3强度的最大值。
图16F是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于panCK-阳性区域中Lag3+细胞的数量。
图16G是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+/panCK+细胞的10μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量。
图16H是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量。
图16I是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的数量的方差。
图16J是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的数量的方差。
图16K是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差。
图16L是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量。
图16M是用于预测派姆单抗治疗后总体存活的Kaplan-Meier存活曲线，该曲线基于PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量。对于每个特征指标，使用特征量度分布的中位数作为截止值，将队列分为两组。
具体实施方式
I.定义
除非另外指明，否则本文所用的科学技术术语具有如本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。参见，例如，Lackie,DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier(第4版2007)；Sambrook等人,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,ColdSprings Harbor Press(Cold Springs Harbor,N.Y.1989)。术语“一个”或“一种”旨在意指“一个(种)或多个(种)”。当在步骤或元件的叙述之前时，术语“包含(comprise、comprises和comprising)”旨在意指添加另外的步骤或元件是任选的且不被排除。
抗体：本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
抗体片段：“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
生物标志物：如本文所用的术语“生物标志物”应指在生物样品中发现的可用于表征生物样品或从中获得生物样品的受试者的任何分子或分子组。例如，生物标志物可以是一种分子或一组分子，其存在、不存在或相对丰度是特定细胞或组织类型或状态的特征；或是特定病理状况或状态的特征；或指示病理状况的严重性、病理状况进展或消退的可能性、和/或病理状况对特定治疗响应的可能性的指征。作为另一个实例，生物标志物可以是细胞类型或微生物(例如细菌、分枝杆菌、真菌、病毒等)，或取代基分子或其分子组。
生物标志物特异性试剂：一种能够直接特异性结合至细胞样品中的一种或多种生物标志物的特异性检测试剂，例如一级抗体。
细胞样品：如本文所用的术语“细胞样品”是指含有完整细胞的任何样品，例如取样用于病理学、组织学或细胞学解释的细胞培养物、体液样品或外科手术样本。
检测试剂：“检测试剂”是用于在细胞样品中生物标志物特异性试剂附近沉积染色剂的任何试剂。非限制性实例包括生物标志物特异性试剂(例如一级抗体)、二级检测试剂(例如能够结合一级抗体的二级抗体)、三级检测试剂(例如能够结合二级抗体的三级抗体)、直接或间接与生物标志物特异性试剂相关的酶、与此类酶具有反应性以影响荧光或显色染色的沉积的化学品、染色步骤之间使用的洗涤试剂等。
可检测部分：可以产生可检测信号(例如可视、电子或其他方式的)的分子或材料，该可检测信号指示沉积在样品上的可检测部分的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分析)。可检测信号可以通过任何已知或尚未发现的机制生成，包括光子(包括无线电频率、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外线频率光子)的吸收、发射和/或散射。术语“可检测部分”包括显色、荧光、磷光、和发光分子和材料，将一种物质转化为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(例如酶)(例如通过将无色物质转化为有色物质或反之亦然，或通过产生沉淀物或增加样品的浊度)。在一些实例中，可检测部分是荧光团，其属于几种常见的化学类别，包括香豆素、荧光素(或荧光素衍生物和类似物)、罗丹明、试卤灵、发光体和青色素。荧光分子的额外的实例可见于Molecular Probes Handbook—A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies,Molecular Probes,Eugene,OR,ThermoFisherScientific,第11版。在其他实施例中，该可检测部分是经由明视野显微镜可检测的分子，例如包括二氨基联苯胺(DAB)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、四甲基罗丹明(DISCOVERY紫)、N,N’-双羧戊基-5,5’-二磺酸-吲哚-二碳花青(Cy5)、和罗丹明110(罗丹明)的染料。
特征度量：指示样品中生物标志物水平或生物标志物之间关系的值。实例包括：表达强度(例如，在0+、1+、2+、3+量表)、对于生物标志物阳性的细胞的数量、细胞密度(例如ROI的区域上生物标志物-阳性细胞的数量、定义ROI边缘的线性距离上生物标志物-阳性细胞的数量等)、像素密度(即ROI的区域上生物标志物阳性像素的数量、定义ROI边缘的线性距离上生物标志物阳性像素的数量等)、表达一种或多种生物标志物的细胞之间的平均值或中位数等。特征度量可以是总度量或总体度量。
组织化学检测：一种过程，其涉及用生物标志物特异性试剂和检测试剂标记组织样品中的生物标志物或其他结构，其方式允许在组织样品的结构之间的横截面关系的背景下对生物标志物或其他结构进行微观检测。实例包括免疫组化(IHC)、显色原位杂交(CISH)、荧光原位杂交(FISH)、银原位杂交(SISH)、和苏木精和曙红(H&E)染色的福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片。
免疫检查点分子：由免疫细胞表达的蛋白质，其活化下调细胞毒性T细胞应答。实例包括PD-1、TIM-3、LAG-4、和CTLA-4。
免疫逃逸生物标志物：肿瘤细胞表达的生物标志物可帮助肿瘤避免T细胞介导的免疫应答。免疫逃逸生物标志物的实例包括PD-L1、PD-L2、和IDO。
免疫学生物标志物：特征在于或影响对异常细胞的免疫应答的生物标志物包括但不限于以下的生物标志物：指示特定类别的免疫细胞(例如CD3)，表征免疫应答(例如细胞因子蛋白或一种或多种特定免疫细胞亚型的存在、不存在、或量)，或者由影响免疫细胞应答类型或程度的非免疫细胞结构表达、通过其呈递或以其他方式位于其。
单克隆抗体：从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，包含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以微量存在)之外，包括该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用包含全部或部分或其组合的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法。
多重组织化学染色：一种组织化学染色方法，其中将与不同生物标志物结合的多种生物标志物特异性试剂应用于单个切片，并用不同颜色的染色剂染色。
PD-1轴导向疗法：一种破坏PD-1下调T细胞活性的能力的治疗剂。示例性PD-1轴导向疗法包括PD-1特异性单克隆抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和替雷利珠单抗)、PD-L1特异性单克隆抗体(例如，阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、和LY3300054)、和PD-1小分子抑制剂(例如，CA-170，由Li和Tian在临床前开发中综述的其他)。
样品：如本文所用的术语“样品”应指获得自能够测试生物标志物存在或不存在的受试者的任何材料。
二级检测试剂：特异性检测试剂能够特异性与生物标志物特异性试剂结合。
切片：当用作名词时，适用于显微镜分析的组织样品的薄片，通常使用切片机进行切割。当用作动词时，生成切片的过程。
连续切片：如本文所用的术语“连续切片”应指由切片机从组织样品逐一切下的一系列切片中的任何一个。对于将两个切片视为彼此的“连续切片”，它们不一定需要是组织的连续切片，但是它们通常应含有具有相同空间关系的足够相似的组织结构，以便组织学染色后可以将结构彼此匹配。
单一组织化学染色：一种组织化学染色方法，其中将单一生物标志物特异性试剂应用于单个切片，并用单一颜色的染色剂染色。
特异性检测试剂：在细胞样品的背景下，能够与目标化学结构特异性结合的任何物质的组合物。如本文所用的短语“特异性结合”、“特异性结合至”或“特异于”或其他类似重复是指可测量和可再现的靶与特异性检测试剂之间的相互作用，在分子(包括生物分子)的异质群体的存在下，其确定靶的存在。例如，与靶标特异性结合的抗体是与其结合其他靶标相比具有更大亲和力、亲合力、更容易和/或持续时间更长的结合该靶标的抗体。在一个实施例中，特异性检测试剂与无关靶标的结合程度为该抗体与抗原结合的小于约10％，例如，通过放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施例中，与靶特异性结合的生物标志物特异性试剂的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。在另一实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。示例性特异性检测试剂包括对特定核苷酸序列具有特异性的核酸探针；抗体及其抗原结合片段；以及工程化的特异性结合组合物，包括ADNECTIN(基于第10FN3纤连蛋白的支架；Bristol-Myers-Squibb Co.)、AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白质A的Z结构域的支架；Affibody AB,Solna,Sweden)、AVIMER(基于结构域A/LDL受体的支架；Amgen,Thousand Oaks,CA)、dAb(基于VH或VL抗体结构域的支架；GlaxoSmithKline PLC,Cambridge,UK)、DARPin(基于锚蛋白重复序列蛋白的支架；Molecular Partners AG,Zürich,CH)、ANTICALIN(基于脂质运载蛋白的支架；Pieris AG,Freising,DE)、NANOBODY(基于VHH(骆驼Ig)的支架；Ablynx N/V,Ghent,BE)、TRANS-BODY(基于转铁蛋白的支架；Pfizer Inc.,New York,NY)、SMIP(Emergent Biosolutions,Inc.,Rockville,MD)、和TETRANECTIN(基于C型凝集素结构域(CTLD)，四连接素的支架；BoreanPharma A/S,Aarhus,DK)。由Wurch等人在以下综述了此类工程化特异性结合结构的描述：Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodiesfor Imaging and Therapy:Status on Discovery Research and Clinical Validation,Current Pharmaceutical Biotechnology,第9卷,第502-509页(2008),将其内容通过引用并入。
染色：当用作名词时，术语“染色”应指可用于可视化用于显微镜分析的细胞样品中的特定分子或结构的任何物质，包括明视野显微镜、荧光显微镜、电子显微镜等。当用作动词时，术语“染色”应指导致染色剂在细胞样品上沉积的任何过程。
受试者：如本文所用的术语“受试者”或“个体”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，个体或受试者为人。
测试样品：从在获得该样品时具有位置的结果的受试者获得肿瘤样品。
组织样品：如本文所用的术语“组织样品”应指保持细胞之间的横截面空间关系的细胞样品，因为细胞存在于从其获得样品的受试者体内。
肿瘤样品：从肿瘤获得组织样品。
Ⅱ.生物标志物说明
CD3：CD3是一种细胞表面受体复合物，通常用作具有T细胞谱系的细胞的定义性生物标志物。CD3复合物由4条相异的多肽链组成：CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链、和CD3-ζ链。CD3-γ和CD3-δ与CD3ε各自形成异源二聚体(εγ-同源二聚体和εδ-异源二聚体)，而与CD3-ζ链形成同源二聚体(ζζ-同源二聚体)。在功能上，εγ-同源二聚体、εδ-异源二聚体、和ζζ-同源二聚体与T细胞受体复合物形成信号传导复合物。用于人CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链、和CD3-ζ链(及其亚型和变体)的示例性序列分别可见于Uniprot登录号P09693(用于本文在SEQ ID NO:1中公开的序列的经典氨基酸序列)、P04234(用于本文在SEQ ID NO:2中公开的序列的经典氨基酸序列)、P07766(用于本文在SEQ ID NO:3中公开的序列的经典氨基酸序列)、和P20963(用于本文在SEQ ID NO:4中公开的序列的经典氨基酸序列)。如本文所用的术语“人CD3蛋白质生物标志物”涵盖具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链、和CD3-ζ链多肽；包括具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的CD3-γ链、CD3-δ链、CD3ε链、和CD3-ζ链的多肽的一者或多者的εγ-同源二聚体、εδ-异源二聚体、和ζζ-同源二聚体；和包括前述CD3同源二聚体或异源二聚体的一者或多者的任何信号传导复合物。在一些实施例中，人CD3蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与CD3-γ链多肽(例如在SEQ ID NO:1的多肽)、CD3-δ链多肽(例如在SEQ ID NO:2的多肽)、CD3-ε链多肽(例如在SEQ ID NO:3的多肽)、或CD3-ζ链多肽(例如在SEQ ID NO:4的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的、或与位于εγ-同源二聚体、εδ-异源二聚体、或ζζ-同源二聚体内的结构(例如表位)结合的任何生物标志物特异性药剂。
CD8：CD8是异源二聚的、二硫键连接的跨膜糖蛋白，存在于细胞毒性抑制T细胞亚组、胸腺细胞、某些自然杀伤细胞、和骨髓亚群中。用于人CD8受体的α-和β-链(及其亚型和变体)的示例性序列分别可见于Uniprot登录号P01732(用于本文在SEQ ID NO:5中公开的序列的经典氨基酸序列)和P10966(用于本文在SEQ ID NO:6中公开的序列的经典氨基酸序列)。如本文所用的术语“人CD8蛋白质生物标志物”涵盖具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-α链多肽；具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-β链多肽；包括具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-α链多肽和/或具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD8-β链多肽的二聚体。在一些实施例中，人CD8蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与CD8-α链多肽(例如在SEQ ID NO:5的多肽)、CD8-β链多肽(例如在SEQ ID NO:6的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的、或与位于CD8二聚体内的结构(例如表位)结合的任何生物标志物特异性药剂。
CD68：CD68是由位于第17号染色体上17p13.1处的CD68基因编码的糖蛋白。CD68蛋白存在于各种不同的血细胞和肌细胞的细胞质颗粒中，经常用作巨噬细胞谱系细胞(包括单核细胞、组织细胞、巨细胞、枯氏细胞和破骨细胞)的生物标志物。用于人CD68(及其亚型和变体)的示例性序列可见于Uniprot登录号P34810(用于本文在SEQ ID NO:7中公开的序列的经典氨基酸序列)。如本文所用的术语“人CD68蛋白质生物标志物”涵盖具有经典人序列和其保持经典序列的功能的天然变体的任何CD68多肽。在一些实施例中，人CD20蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与人CD68多肽(例如在SEQ ID NO:7的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性药剂。
全细胞角蛋白：如本文所用的，“全细胞角蛋白”和“PanCK”是指特异性结合足够多的细胞角蛋白以特异性地染色组织样品中的上皮组织的任何生物标志物特异性试剂或生物标志物特异性试剂的组。示例性全细胞角蛋白生物标志物特异性试剂通常包括：(a)识别多种细胞角蛋白共有的表位的单一细胞角蛋白特异性试剂，其中组织的大多数上皮细胞表达多种细胞角蛋白中的至少一种；或(b)生物标志物特异性试剂的混合物，使得该混合物与多种细胞角蛋白具有特异性的反应性，其中组织的大多数上皮细胞表达多种细胞角蛋白中的至少一种。在该定义中对“混合物”的提及既包括包含多个组分中的每个成员的单一组合物，也包括提供多个组分中的每个成员作为单独的组合物，但是用单一染料或其组合对它们进行染色。由NordiQC审查PanCK混合物。在一些实施例中，PanCK生物标志物特异性试剂包括抗体混合物，该抗体混合物含有选自由以下项组成的组的两个或更多个抗体克隆：5D3、LP34、AE1、AE2、AE3、MNF116、和PCK-26。在某一实施例中，PanCK混合物选自由以下项组成的组：AE1和AE3的混合物，AE1、AE3、和5D3的混合物，以及AE1、AE3、和PCK26的混合物。AE1和AE3的混合物可商购自Agilent Technologies(目录号GA05361-2、IS05330-2、IR05361-2、M351501-2和M351529-2)。AE1、AE3、和5D3的混合物可商购自BioCare(目录号CM162、IP162、OAI162、和PM162)和Abcam(目录号ab86734)。AE1、AE3、和PCK26的混合物可获得自Roche(目录号760-2135)。
PD-1：程序性死亡-1(PD-1)是2号染色体上PDCD1基因编码的CD28受体家族的成员。用于人PD-1蛋白质(及其亚型和变体)的示例性序列可见于Uniprot登录号Q15116(用于本文在SEQ ID NO:8中公开的序列的经典氨基酸序列)。在一些实施例中，人PD-1蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与人PD-1多肽(例如在SEQ ID NO:8的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性药剂。
PD-L1：程序性死亡配体1(PD-L1)是由9号染色体上的CD274基因编码的1型跨膜蛋白。PD-L1充当PD-1和CD80的配体。用于人PD-L1蛋白质(及其亚型和变体)的示例性序列可见于Uniprot登录号Q9NZQ7(用于本文在SEQ ID NO:9中公开的序列的经典氨基酸序列)。在一些实施例中，人PD-L1蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与人PD-L1多肽(例如在SEQ IDNO:9的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性药剂。
LAG3：淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG3)是人12号染色体上LAG3基因编码的免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。用于人LAG3蛋白质(及其亚型和变体)的示例性序列可见于Uniprot登录号P18627(用于本文在SEQ ID NO:10中公开的序列的经典氨基酸序列)。在一些实施例中，人LAG3蛋白质生物标志物特异性药剂涵盖与人LAG3多肽(例如在SEQ ID NO:10的多肽)内的结构(例如表位)特异性结合的任何生物标志物特异性药剂。
III.评分函数的生成
图1是示出导出本文公开的评分函数的示例性方法的流程图。本方法和系统的评分函数通常衍生自PD-1轴导向疗法治疗前从患者队列中获得的肿瘤样品，并且可获得其结果数据(例如3年或5年总存活、无进展存活、复发自由存活、进展性疾病、稳定性疾病、部分应答、完全应答等)101。选择一组待测试的生物标志物，对队列样品进行生物标志物102染色并成像(通常与形态学染色的连续切片一起)103。在一个或多个数字图像104中识别所关注区域(ROI)并从一个或多个ROI 105提取多生物标志物特征。通过特征选择函数来评估所提取的特征，以通过使用特征选择函数106来识别与对PD-1轴应答相关的那些特征。使用一个或多个建模函数针对结果对一个或多个所选特征进行建模，识别候选评分函数，并任选地选择一个或多个截止值以根据其评分将队列分组(例如“可能应答”和“不太可能应答”组或“应答可能性高”和“应答可能性低”)(例如，使用ROC曲线)，并使用Kaplan-Meier曲线相比各组测试截止值107。然后选择显示出组之间所需间隔的评分函数和截止值组合以包括在本文所述的评分系统和方法中。
III.A.用于生成评分函数的样品和样品制剂
通常在从具有肿瘤并且已知对PD-1轴导向疗法有应答的受试者的队列中获得的组织切片上对评分函数进行建模101。在一些实施例中，该肿瘤是实体瘤，例如癌、淋巴瘤或肉瘤。在某一实施例中，该肿瘤是皮肤、乳房、头和/或颈、肺、上胃肠道(包括食道和胃)、女性生殖系统(包括子宫、输卵管和卵巢肿瘤)、下胃肠道(包括结肠、直肠和肛门肿瘤)、泌尿生殖道、外分泌、内分泌、肾、神经或淋巴细胞起源的肿瘤。在某一实施例中，受试者患有黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、头颈癌、肺癌、食道癌、胃癌、结肠直肠癌(包括结肠癌、直肠癌和肛门癌)、前列腺癌、尿路上皮癌或淋巴瘤。在特定的实施例中，该肿瘤是非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、霍奇金淋巴瘤、尿路上皮癌、胃癌、肾细胞癌、肝细胞癌、或结直肠癌。
获得的样品101通常是以与组织化学染色相容的方式处理的组织样品，包括例如固定、在蜡基质(例如石蜡)中包埋、和切片(例如用切片机)。本公开不需要特定的处理步骤，只要获得的样品与用于所关注生物标志物的样品的组织化学染色相容并生成染色的样品的数字图像即可。在特定实施例中，使用福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)样品的切片机切片对评分函数进行建模。此外，为了生成评分函数，队列的样品101应是具有已知结果的样品，例如疾病的复发、疾病的进展、因疾病导致的死亡、总体死亡、进展性疾病、稳定性疾病、部分应答和/或完全应答。
III.B.生物标志物组
当生成评分函数时，样品的至少一个切片用一组生物标志物特异性试剂染色102。这些组通常包括至少一种上皮标志物特异性试剂(例如Pan-CK特异性试剂)、至少一种免疫细胞特异性试剂(例如CD3-、CD8-、和/或CD68特异性试剂)、和至少一种PD-1轴生物标志物特异性试剂(例如PD-1-、PD-L1-、和/或PD-L2特异性试剂)。在一些实施例中，该组可以进一步包含一种或多种额外的免疫检查点生物标志物特异性试剂，例如LAG3特异性试剂。在某一实施例中，该生物标志物特异性试剂组选自由以下项组成的组：第1组，包括CD8、上皮标志物(EM)、CD68、CD3、和PD-L1；以及第2组，包括CD8、上皮标志物(EM)、PD-L1、PD-1、和LAG3。在第1组和第2组中有用的上皮标志物的实例包括细胞角蛋白。在某一实施例中，该上皮标志物是一组PanCK生物标志物特异性试剂染色的一组细胞角蛋白。
将生物标志物特异性试剂的组与一组适当的检测试剂组合使用，以生成生物标志物染色的切片。生物标志物染色通常是通过在使生物标志物和生物标志物特异性试剂之间特异性结合的条件下使样品的切片与生物标志物特异性试剂接触来完成的。然后使样品与一组与生物标志物特异性试剂相互作用的检测试剂接触，以促进可检测部分在紧邻生物标志物处沉积，从而生成定位生物标志物的可检测信号。通常，在应用不同试剂之间进行洗涤步骤，以防止组织发生不需要的非特异性染色。可将生物标志物染色的切片任选地用造影剂(例如苏木精染色剂)另外地染色以可视化大分子结构。此外，可以用形态学染色将生物标志物染色切片的连续切片染色，以促进ROI的识别。
III.C.1.标记方案和相关试剂
生物标志物特异性试剂通过介导紧邻生物标志物特异性试剂的可检测部分的沉积来促进生物标志物的检测。
在一些实施例中，可检测部分与生物标志物特异性试剂直接缀合，因此在生物标志物特异性试剂与其标靶结合时沉积在样品上(通常称为直接标记方法)。直接标记方法通常可以更直接地定量，但是常常缺乏敏感性。在其他实施例中，可检测部分的沉积通过使用与生物标志物特异性试剂相关的检测试剂来实现(通常称为间接标记方法)。间接标记方法增加了可沉积在生物标志物特异性试剂附近的可检测部分的数量，因此间接标记方法通常比直接标记方法更敏感，尤其是与染料组合使用时。
在一些实施例中，使用间接方法，其中可检测部分经由定位生物标志物特异性试剂的酶促反应沉积。用于此类反应的合适的酶是众所周知的，包括但不限于氧化还原酶、水解酶和过氧化物酶。明确包括的特定酶是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、和β-内酰胺酶。该酶可以直接缀合至生物标志物特异性试剂，或可以经由标记缀合物与生物标志物特异性试剂间接缔合。如本文所用的，“标记缀合物”包括：
(a)特异性检测试剂；和
(b)与特异性检测试剂缀合的酶，其中该酶在适当的反应条件下与显色底物、信号传导缀合物或酶反应性染料发生反应，以实现染料的原位生成和/或染料在组织样品上的沉积。
非限制性实例中，标记缀合物的特异性检测试剂可以是二级检测试剂(例如与一级抗体结合的物种特异性二级抗体、与半抗原缀合的一级抗体结合的抗半抗原抗体、或与生物素化的一级抗体结合的生物素结合蛋白质)、三级检测试剂(例如与二级抗体结合的物种特异性三级抗体、与半抗原缀合的二级抗体结合的抗半抗原抗体、或与生物素化的二级抗体结合的生物素结合蛋白质)、或其他此类排列。因此定位于样品结合的生物标志物特异性试剂的酶然后可用于多种方案中以沉积可检测部分。
在一些情况下，酶与显色化合物/底物反应。显色化合物/底物的具体的非限制性实例包括4-硝基苯基磷酸酯(pNPP)、固红、溴氯吲哚基磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2’-连氮基-二-[3-苯并噻唑啉磺酸酯](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β–半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β–D-葡糖苷酸(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、碱性品红、碘硝基四唑(INT)、四氮唑蓝、或四氮唑紫。
在一些实施例中，可以在金相检测方案中使用该酶。金相检测方法包括将例如碱性磷酸酶的酶与水溶性金属离子和该酶的氧化还原无活性底物结合使用。在一些实施例中，底物被酶转化为氧化还原活性剂，并且该氧化还原活性剂还原金属离子，使其形成可检测的沉淀。(参见例如，于2004年12月20日提交的美国专利申请号11/015,646，PCT公开号2005/003777和美国专利申请公开号2004/0265922；它们各自通过引用以其全文并入本文。)金相检测方法包括使用氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，再次形成可检测沉淀物。(参见例如，美国专利号6,670,113，将其通过引用以其全文并入本文。)
在一些实施例中，酶促作用发生在酶和染料本身之间，其中反应将染料从非结合物质转变为沉积在样品上的物质。例如，DAB与过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)的反应会氧化DAB，使其沉淀。
在其他实施例中，可检测部分是经由包含潜在反应性部分的信号传导缀合物沉积的，所述潜在反应性部分被配置为与酶反应以形成可以与样品或其他检测组分结合的反应性物质。这些反应性物质能够在其生成的近端即在酶附近与样品反应，但是迅速转化为非反应性物质使得信号传导缀合物不会沉积在远离沉积酶的位点的远端。潜在的反应性部分的实例包括：醌甲基化物(QM)类似物(例如描述于WO2015124703A1中的那些)、和酪胺缀合物(例如描述于WO2012003476A2中的那些)，其各自通过引用以其整体并入本文。在一些实例中，潜在的反应性部分直接与染料缀合物，该染料例如N,N’-双羧戊基-5,5’-二磺酸-吲哚-二碳花青(Cy5)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、四甲基罗丹明(DISCO紫)、和罗丹明110(罗丹明)。在其他实例中，潜在的反应性部分与特异性结合对的一个成员缀合，并且染料与特异性结合对的另一个成员连接。在其他实例中，潜在的反应性部分与特异性结合对的一个成员连接，并且酶与特异性结合对的另一个成员连接，其中该酶(a)与显色底物发生具有反应性以实现染料的生成，或(b)与染料具有反应性以实现染料(例如DAB)的沉积。特异性结合对的实例包括：
(1)与潜在的反应性部分连接的生物素或生物素衍生物(例如脱硫生物素)、和连接至染料或者与显色底物具有反应性或与染料具有反应性的生物素结合实体(例如亲和素、链霉亲和素、去糖基化亲和素(例如NEUTRAVIDIN)、或在生物素结合位点上具有硝化酪氨酸的生物素结合蛋白质(例如CAPTAVIDIN))(例如，当染料为DAB时，连接至生物素结合蛋白的过氧化物酶)；和
(2)连接至潜在反应性部分的半抗原，以及连接至染料或与显色底物具有反应性或与染料具有反应性的酶(例如，当染料为DAB时，连接至生物素结合蛋白的过氧化物酶)的抗半抗原抗体。
具体包括在表1中列出的生物标志物特异性试剂和检测试剂组合的非限制性实例。
表1
Figure BDA0002995203900000291
Figure BDA0002995203900000301
Figure BDA0002995203900000311
Figure BDA0002995203900000321
Figure BDA0002995203900000331
Figure BDA0002995203900000341
Figure BDA0002995203900000351
在特定实施例中，表1中列出的生物标志物特异性试剂和特异性检测试剂是抗体。如本领域普通技术人员将理解的，每种生物标志物特异性试剂的检测方案可以是相同的，或者可以是不同的。
可商购的检测试剂或包括适用于本发明方法的检测试剂的试剂盒的非限制性实例包括：VENTANA ultraView检测系统(与酶缀合的二级抗体，所述酶包括HRP和AP)；VENTANA iVIEW检测系统(生物素化的抗物种二级抗体和链霉亲和素缀合的酶)；VENTANAOptiView检测系统(OptiView)(与半抗原缀合的抗物种二级抗体和与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体)；VENTANA扩增试剂盒(未缀合的二级抗体，该未缀合的二级抗体可与前述VENTANA检测系统中的任何一种一起使用，以扩增沉积在一级抗体结合位点处的酶的数量)；VENTANA OptiView扩增系统(与半抗原缀合的抗物种二级抗体、与酶多聚体缀合的抗半抗原三级抗体以及与相同半抗原缀合的酪胺。在使用中，将二级抗体与样品接触，以实现与一级抗体的结合。然后使用抗半抗原抗体孵育样品，以实现酶与二级抗体的联合。然后使用酪胺孵育样品，以实现额外的半抗原分子的沉积。然后使用抗半抗原抗体再次孵育样品，以实现额外的酶分子的沉积。然后使用可检测部分孵育样品以实现染料沉积)；VENTANADISCOVERY、DISCOVERY OmniMap、DISCOVERY UltraMap抗半抗原抗体、二级抗体、色原、荧光团和染料试剂盒，上述产品中的每种均可从Ventana Medical Systems,Inc.(Tucson,Arizona)获得；PowerVision和PowerVision+IHC检测系统(直接与HRP或AP聚合成携带高比例的酶比抗体的紧凑型聚合物的二级抗体)；以及DAKO EnVisionTM+系统(与二级抗体缀合的酶标记聚合物)。
III.C.2.多重标记方案
在某一实施例中，该生物标志物特异性试剂和检测试剂以多重染色方法施加。在多重方法中，生物标志物特异性试剂和检测试剂以允许对不同生物标志物进行差异标记的方式应用。
一种完成不同生物标志物差异标记的方法是选择生物标志物特异性试剂、检测试剂和酶组合的组合，这些组合不会导致不同抗体或检测试剂之间的脱靶交叉反应性(称为“组合染色”)。例如，在使用二级检测试剂的情况下，每种二级检测试剂仅能够结合在切片上使用的一级抗体中的一种。例如，可以选择衍生自不同动物物种(例如小鼠、兔、大鼠和山羊抗体)的一级抗体，在这种情况下，可以使用物种特异性的二级抗体。作为另一个实例，每个一级抗体可以包括不同的半抗原或表位标签，并且选择二级抗体以特异性结合半抗原或表位标签。此外，每组检测试剂应适于在该切片上沉积不同的可检测实体，例如通过在每种生物标志物特异性试剂附近沉积不同的酶。在US 8,603,765中示出了此类排列的实例。此类排列具有潜在的优点，即能够使每组生物标志物特异性试剂和相关的特异性结合试剂同时存在于样品上和/或用生物标志物特异性试剂和检测试剂的混合物进行染色，从而减少了染色步骤的数量。然而，由于试剂可能与不同的酶交叉反应，并且各种抗体可能彼此交叉反应，从而导致异常染色，因此此类排列可能并不总是可行的。
完成不同生物标志物差异标记的另一种方法是依次对每种生物标志物进行样品染色。在此类实施例中，使第一生物标志物特异性试剂与该切片反应，随后是第二检测试剂至第一生物标志物特异性试剂和其他检测试剂与该切片反应，导致第一可检测实体的沉积。然后对该切片进行处理，以从切片中去除生物标志物特异性试剂和相关的检测试剂，同时适当保留沉积的染色剂。对随后的生物标志物特异性试剂重复该过程。去除生物标志物特异性试剂的方法的实例和相关检测试剂包括在存在缓冲液的情况下加热样品，该洗脱液从样品洗脱抗体(称为“热杀方法”)，例如Stack等人在以下公开的那些,Multiplexedimmunohistochemistry,imaging,and quantitation:A review,with an assessment ofTyramide signal amplification,multispectral imaging and multiplex analysis,Methods,第70卷,第1期,第46–58页(2014年11月),和PCT/EP2016/057955，其内容通过引用并入本文。
如本领域技术人员将理解的，可以将组合染色和顺序染色方法组合。例如，在一级抗体的仅子集与组合染色兼容的情况下，可以修改顺序染色方法，其中使用组合染色方法将与组合染色兼容的抗体应用于样品，并使用顺序染色方法应用残余抗体。
III.C.3.复染
如果需要，可以对生物标志物染色的载玻片进行复染，以帮助用于手动或自动识别ROI而识别形态学相关区域。复染的实例包括显色核复染，例如苏木精(从蓝色到紫色的染色)、亚甲基蓝(染成蓝色)、甲苯胺蓝(将核染成深蓝色并将多糖染成粉色至红色)、核固红(也称为Kernechtrot染料，染成红色)、和甲基绿(染成绿色)；非核显色染色剂，例如曙红(染成粉色)；银光和染色剂，包括4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，染成蓝色)、碘化丙啶(染成红色)、Hoechst染色剂(染成蓝色)、核绿DCS1(染成绿色)、和核黄(Hoechst S769121，在中性pH下染成黄色，在酸性pH下染成蓝色)、DRAQ5(染成红色)、DRAQ7(染成红色)；荧光非核染色，例如荧光团标记的鬼笔环肽，(为纤维状肌动蛋白染色，颜色取决于缀合的荧光团)。
III.C.4.样品的形态学染色
在某些实施例中，还期望对生物标志物染色的切片102的系列切片进行形态学染色。该切片可以用于识别从中进行评分的ROI 103。基本的形态学染色技术通常依赖于用第一染料对核结构进行染色，并使用第二染色剂对细胞质结构进行染色。已知许多形态学染色剂，包括但不限于苏木精和曙红(H&E)染色剂和李氏染色剂(亚甲基蓝和碱性品红)。在特定实施例中，每个生物标志物染色的载玻片的至少一个连续切片是H&E染色的。可以使用任何应用H&E染色的方法，包括手动和自动方法。在某一实施例中，样品的至少一个切片是在自动染色系统上染色的H&E染色的样品。用于进行H&E染色的自动化系统通常基于以下两种染色原理之一进行操作：批量染色(也称为“浸入式篮”)或单个载玻片染色。批量染色器通常使用试剂的桶或缸，其中许多载玻片同时浸入其中。另一方面，单个载玻片染色器直接将试剂应用到每个载玻片上，并且没有两个载玻片共享相同等份的试剂。可商购的H&E染色器的实例包括来自Roche的VENTANA SYMPHONY(单个载玻片染色器)和VENTANA HE 600(单个载玻片染色器)系列H&E染色器；来自Agilent Technologies的CoverStainer(批量染色器)；来自Leica Biosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020 Small Linear Stainer(批量染色器)、Leica ST5020 Multistainer(批量染色器)、和Leica ST5010 Autostainer XL系列(批量染色器)H&E染色器。
III.D.ROI、对象、和特征
在某一实施例中，在生物标志物染色的样品104的数字图像中识别与生物标志物的组相关的一个或多个对象。对象的数量和/或不同对象与另一个对象之间的关系用于定义要为评分函数的开发而评估的特征。可以从每个组中检测到的潜在对象的非限制性示例组在下面的表2中列出：
Figure BDA0002995203900000381
Figure BDA0002995203900000391
表2
在一些实施例中，还在生物标志物染色的样品104的数字图像中识别一个或多个所关注区域(ROI)。ROI涵盖组织切片的生物学相关位置，从中识别出相关对象以进行特征计算。在某一实施例中，该ROI含肿瘤的组织切片的形态学区域，例如肿瘤区域(TR)、浸润前沿和癌周(PT)区域。
ROI可能仅限于形态学区域，可以扩展到包括形态区域之外的区域(即，通过将ROI的边缘扩展到形态学区域之外的规定距离)，也可以限于形态学区域的次区域(例如，通过将ROI缩小到形态学区域的圆周内的定义距离，或通过识别ROI中具有某些特征(例如某些细胞类型的基线密度)的区域)。在边缘定义的形态区域(例如浸润前沿)处，ROI可以定义为例如边缘的任何点的定义距离内的所有点、边缘的任何点的定义距离内地一侧的所有点、一个最小的几何区域(例如圆形、椭圆形、正方形、矩形等)，涵盖了整个边缘区域，具有以边缘区域的中心点为中心的定义半径的圆内的所有点等。
在一些实施例中，相同的ROI可以用于所有切片和生物标志物。例如，可以在样品的H&E染色切片中识别出形态学定义的ROI，并将其用于所有生物标志物染色的切片。在其他实施例中，不同的ROI可以用于不同的生物标志物。例如，H&E染色的载玻片可以用于识别用作第一ROI的特定形态学区域，例如肿瘤区域。然后可以在生物标志物染色的切片之一中识别出第二ROI或多个ROI，例如，用于识别具有以一定阈值密度的一类细胞的区域(例如上皮相对于间质区域)。然后可以将第二ROI或多个ROI用于特征计算。
表3展示了不同ROI的非限制性实例：
Figure BDA0002995203900000401
表3
在一些实施例中，在数字图像中手动识别ROI。例如，受过训练的专家可以在样品的数字图像上手动描绘一个或多个形态学区域(例如肿瘤区域和/或浸润前沿)。图像中所描绘的一个或多个区域然后可以用作用于特征计算的ROI或用作用于计算ROI的参考点。
在其他实施例中，计算机实现的系统可以协助使用者标注ROI(称为“半自动ROI标注”)。例如，用户可以在数字图像上描绘一个或多个区域，然后系统将其自动转换为完整的ROI。例如，如果期望的ROI是PI、PO和/或PR区域，则用户可以描绘出肿瘤区域和浸润前沿，并且系统根据用户的定义自动绘制PI、PO和PR区域。在另一实施例中，在ROI是EA或SA的情况下，用户可以在图像中绘制肿瘤区域以及任选地浸润前沿，然后将其登记至生物标志物染色的图像中，并且系统通过以下创建相关的EA和SA ROI：将EM+细胞的预定距离内的所有细胞标记为在EA内并将超出预定距离的所有细胞标记为在SA内。在另一实施例中，该系统还可以应用模式识别功能，该模式识别功能使用计算机视觉和机器学习来识别具有与所描绘的和/或自动生成的区域相似的形态学特征的区域。因此，例如，可以通过以下方法以半自动化的方式标注肿瘤区域：
(a)用户通过在样品的H&E图像中描绘肿瘤区域的轮廓标注肿瘤区域；以及
(b)计算机系统应用模式识别功能来识别具有轮廓区域的形态学特征的样品的额外的区域，其中整个肿瘤区域包括由用户标注的区域和由系统自动识别的区域。
在另一个实例中，PR、PI和/或PO ROI可以通过包括以下的方法以半自动化的方式进行标注：
(a)用户通过在样品的H&E图像中描绘肿瘤区域和浸润前沿的轮廓标注肿瘤区域；以及
(b)该计算机系统自动定义PR、PI和/或PO区域，该PR、PI和/或PO区域涵盖在带标注的浸润前沿的定义距离内的所有像素；以及
(c)计算机系统应用模式识别功能来识别样品的额外的区域，这些区域具有通过步骤(b)识别的PI、PO和/或PR区域的形态学特征。
也可以使用许多其他排列。在半自动生成ROI的情况下，可以给予用户修改计算机系统标注的ROI的选项，例如通过放大ROI、标注ROI的区域或ROI内的对象以将其从分析中排除等。
在其他实施例中，计算机系统可以自动建议ROI，而无需来自用户的任何直接输入(称为“自动ROI标注”)。例如，可以将先前染色的组织分割函数或其他模式识别函数应用于未标注的图像，以识别期望的形态学区域以用作ROI。可以给予用户修改计算机系统标注的ROI的选项，例如通过放大ROI、标注ROI的区域或ROI内的对象以将其从分析中排除等。
从一个或多个ROI中提取一个或多个特征，并对其进行量化以获得每个样品105的特征量度。示例性特征包括例如ROI中对象的总数量、ROI中特定对象的密度、ROI中不同对象之间的空间关系、ROI内特定对象的空间分布、ROI内不同对象的数量和/或密度的比率、不同ROI中相同对象的比(例如，EA ROI相对于SA ROI中的特定细胞的比或PI ROI相对于POROI中的特定细胞的比)、落入更小的ROI落入更大的ROI的更大的ROI总对象的分数(例如，落入EA、SA、PI、PO、或PT ROI内的TA ROI的特定细胞类型的分数)。表4列出了每个组的特定示例性特征：
表4
Figure BDA0002995203900000421
Figure BDA0002995203900000431
除非另有说明，否则表4中特征的ROI为肿瘤面积。除非另有说明，否则表4中所列的任何密度均为面积密度(即，整个ROI面积上阳性细胞的数量)。如表4中所用，“PD1低”，“PD1中”和“PD1高”是指具有低、中和高PD-1染色强度的单个细胞。在某一实施例中，“PD1低”细胞是在所有测试样品中在所有测量的PD-1+细胞的染色强度最低的三分之一的PD-1+细胞，“PD1中”细胞是在所有测试样品中在所有测量的PD-1+细胞的染色强度中等的三分之一的PD-1+细胞，和“PD1高”细胞是在所有测试样品中在所有测量的PD-1+细胞的染色强度最高的三分之一的PD-1+细胞。
III.F.建模评分函数
为了识别评分函数，对特征进行建模以预测其对PD-1轴定向治疗过程应答的相对可能性的能力。
在某一实施例中，可以通过执行特征选择函数106来选择特征。将队列中每个成员的特征量度和结果数据输入特征选择函数，然后使用该数据根据不同特征与期望结果的相对相关性对这些特征进行排名。示例性特征选择函数包括集合特征选择函数(包括例如随机森林函数)、过滤方法函数(包括例如基于互信息的函数(mRMR)/基于相关系数的函数和基于Relief的函数)和/或嵌入特征选择函数(例如弹性网络/最小绝对收缩函数或选择算子(LASSO)函数)。在某一实施例中，使用由所述特征选择函数识别的前25、前20、前15、前10、前9、前8、前7、前6、前5、前4或前3个特征来制作所述候选模型。在另一实施例中，该候选模型使用在至少两个特征选择函数的前10个特征中识别的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个特征。在另一实施例中，该候选模型包括存在于至少2个特征选择函数的前5个特征中的至少一个特征。在某一实施例中，“应答者”被认为是具有部分应答或完全应答的患者。在某一实施例中，“应答者”被认为是具有稳定性疾病、部分应答或完全应答的患者。
候选模型是通过将队列中每个成员的所选的特征度量和结果数据输入建模函数来生成的。选择与应答具有最高一致性的模型作为评分函数。示例性建模函数包括象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。在某一实施例中，候选函数仅在从数字图像提取的特征上建模。在其他实施例中，候选函数包括其他临床变量，例如年龄、性别、错配修复状态、和/或微卫星不稳定性状态。在某一实施例中，该模型用于预测治疗后进展性疾病相对于治疗后稳定性疾病相对于对疗法的部分或完全应答的可能性。在某一实施例中，该模型用于预测患者在治疗后将患有进展性疾病的可能性相对于患者将患有稳定性疾病、对疗法部分应答或完全应答的可能性。在某一实施例中，该模型用于预测患者在治疗后将患有进展性疾病或稳定性疾病的可能性相对于患者对疗法具有部分或完全应答的可能性。
此外，可以选择一个或多个分层截止值以根据相对风险将患者区分为“风险区间”(例如“高风险”和“低风险”四分位数、十分位数等)107。在一个实例中，使用接收器操作特性(ROC)曲线选择分层截止值。ROC曲线使用户可以在模型的敏感性(即，优先捕获尽可能多的“阳性”或“可能应答”的候选对象)与模型的特异性(即，将“可能应答”的候选对象的假阳性最小化)之间取得平衡。在某一实施例中，在可能应答和不太可能应答的风险区间之间选择截止值，所选择的截止值具有平衡的敏感性和特异性。在某一实施例中，分层截止值区分(a)可能在治疗后患有进展性疾病的患者和(b)可能对疗法患有稳定性疾病、部分应答或完全应答的患者。在某一实施例中，分层截止值区分(a)可能在治疗后患有进展性疾病的患者，(b)可能在治疗后患有稳定性疾病的患者，和(c)可能对疗法具有部分应答或完全应答的患者。在某一实施例中，分层截止值区分(a)可能在治疗后患有进展性疾病或稳定性疾病的患者和(b)可能对疗法具有部分或完全应答的患者。
如果需要，可以使用计算机统计分析软件套件(例如，用于统计计算的R项目(可从https://www.r-project.org/获得),SAS,MATLAB等)来进行模型。
IV.用评分函数评分
在对评分函数进行建模并且选择了任选的分层截止值后，可以将评分函数应用于测试样品的图像以计算测试样品的评分。图2是示出使用上文所述的评分函数为测试样品评分的示例性方法的流程图。首先从正在考虑PD-1轴导向疗法的患者中获得肿瘤组织切片201。组织切片通常类似于用于对评分函数进行建模的样品类型，不同之处在于结果尚不清楚。如果需要ROI选择，则至少一个组织切片被染色以用于与评分函数相关的生物标记，并且用形态学染色剂(例如H&E)染色其连续切片202。对染色的切片成像203，以及在生物标志物染色的图像中标注与评分函数相关的一个或多个ROI以及在相关特征度量的计算中使用的任何对象204。从ROI提取的相关特征，并且计算每个特征的特征度量205。然后组装包括由评分函数206使用的所有变量的特征向量，并将评分函数应用于特征向量207。在一些情况下，变量只是从ROI中提取的特征量度。在其他情况下，额外的临床变量可以包括，例如年龄、性别、错配修复状态(例如患者具有缺陷MMR(dMMR)或无缺陷MMR(pMMR))、微卫星不稳定状态(例如患者是MSI高或MSI低。如果使用分层截止值，则输出评分还可以评估相关风险区间。然后可以由临床医生将评分整合到诊断和/或治疗决策中，包括例如通过将评分与可能权衡是否要施用PD-1轴导向疗法的决策的其他临床变量进行整合。
在某一实施例中，将该评分函数整合至评分系统。示例性评分系统示于图3。
评分系统包括图像分析系统300。图像分析系统300可以包括一个或多个计算设备，例如台式计算机、膝上型计算机、平板电脑、智能手机、服务器、专用计算设备或能够进行本文所述的技术和/或操作的任何其他一种或多种类型的一种或多种电子设备。在一些实施例中，图像分析系统300可以作为单一设备实现。在其他实施例中，图像分析系统300可以作为两个或更多个设备的组合实现，一起实现本文讨论的各种功能。例如，图像分析系统300可以包括经由一个或多个局域网和/或诸如因特网之类的广域网彼此通信地耦合的一台或多台服务器计算机和一台或多台客户端计算机。
如图3所示，图像分析系统300可以包括存储器314、处理器315、和显示器316。存储器314可以包括任意类型的易失性或非易失性存储器的任意组合，例如随机存取存储器(RAM)、诸如电可擦可编程只读存储器(EEPROM)的只读存储器、闪存、硬盘驱动器、固态驱动器、光盘等。为了简洁起见，在图3中作为单一设备描绘了存储器314，但是应当理解，存储器314也可以分布在两个或更多个设备上。
处理器315可包括一个或多个任何类型的处理器，例如中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)、专用信号或图像处理器、现场可编程门阵列(FPGA)、张量处理单元(TPU)等。为了简洁起见，在图3中作为单一设备描绘了处理器315，但是应当理解，处理器315也可以分布在任何数量的设备上。
可以使用例如LCD,LED,OLED,TFT,等离子体等任何适合的技术实现显示器316。在一些实施中，显示器316可以是触敏显示器(触摸屏)。
如图3所示，图像分析系统300还可以包括对象识别器310、所关注区域(ROI)生成器311、用户界面模块312和评分引擎313。尽管这些模块在图3中作为独立模块示出，对于本领域普通技术人员显而易见的是，每个模块可以作为子模块替代地被实现，并且在一些实施例中，任何两个或更多个模块可以被组合成单个模块。此外，在一些实施例中，系统100可以包括图3中为简洁起见未示出的额外的引擎和模块(例如，输入设备、网络和通信模块等)。此外，在一些实施例中，图3中所描绘的一些方框可以被禁用或省略。如将在下面更详细地讨论的，系统100的一些或所有模块的功能可以以硬件、软件、固件或其任何组合来实现。可用于实现如本文公开的模块的示例性可商购的软件包包括VENTANA VIRTUOSO；Definiens TISSUE STUDIO、DEVELOPER XD、和IMAGE MINER；和Visopharm BIOTOPIX、ONCOTOPIX、和STEREOTOPIX软件包。
在获取图像之后，图像分析系统300可以将图像传递给对象识别器310，该对象识别器的作用是识别并标记图像中的相关对象和其他特征，这些对象和特征随后将用于评分。对象识别器310可以从每个图像中提取(或为每个图像生成)表征图像中各个对象以及代表一种或多种生物标志物表达的像素的多个图像特征。提取的图像特征可以包括例如纹理特征，诸如Haralick特征、词袋特征等。可以将多个图像特征的值组合成高维向量，下文称为“特征向量”，其表征与评分函数的特征有关的生物标志物的表达。例如，如果针对每个对象和/或像素提取了M个特征，则每个对象和/或像素可以由M维特征向量来表征。对象标识符310的输出有效地是图像的地图，其标注对象和所关注像素的位置，并将那些对象和像素与描述对象或像素的特征向量相关联。
对于基于生物标志物与特定类型的对象(例如膜、核、细胞等)的关联进行评分的生物标志物，对象识别器310提取的特征可包括足以将样品中的对象分类为所关注生物标志物-阳性对象或所关注生物标志物-阴性标志物的特征或特征向量和/或通过对象的生物标志物染色的强度的水平分类的特征或特征向量。在生物标志物可以根据表达生物标志物的对象类型而被不同地加权的情况下，由对象识别器310提取的特征可以包括与确定与生物标志物阳性像素相关联的对象的类型有关的特征。因此，然后可以至少基于生物标志物的表达(例如，生物标志物阳性或生物标志物阴性细胞)以及对象的亚型(例如肿瘤细胞、免疫细胞等)将对象分类。在不考虑与对象的关联而对生物标志物表达的程度进行评分的情况下，由对象识别器310提取的特征可以包括例如生物标志物-阳性像素的位置和/或强度。从图像中提取的精确特征将取决于所应用的分类函数的类型，并且对于本领域普通技术人员而言将是众所周知的。
下表5中列出了为某些生物标志物组识别的对象的实例：
Figure BDA0002995203900000481
Figure BDA0002995203900000491
表5
图像分析系统300还可以将图像传递到ROI生成器311。ROI生成器311用于从计算免疫内容评分的图像识别图像的一个或多个ROI。在对象识别器310未应用于整个图像的情况下，由ROI生成器311生成的一个或多个ROI也可以用于定义在其上执行对象识别器310的图像的子集。
在一个实施例中，可通过用户界面模块312访问ROI生成器311。在用户界面模块112的图形用户界面上显示生物标志物染色的样品的图像(或生物标志物染色的样品的形态学染色的连续切片)，并且用户在被视为ROI的图中标注一个或多个区域。在该实例中，ROI标注可以采用多种形式。例如，用户可以手动定义ROI(以下称为“手动ROI标注”)。在其他实例中，ROI生成器311可以协助使用者标注ROI(称为“半自动ROI标注”)。例如，用户可以在数字图像上描绘一个或多个区域，然后系统将其自动转换为完整的ROI。例如，如果期望的ROI是肿瘤区域，则用户描绘肿瘤区域，并且系统例如使用计算机视觉和机器学习来识别相似的形态学区域。作为另一个实例，用户可以标注图像中的边缘(例如，通过描画定义肿瘤的浸润前沿的线)，并且ROI生成器311可以基于用户定义的边缘自动定义ROI。例如，用户可以在用户界面模块312中标注浸润前沿或肿瘤区域的边缘，并且ROI生成器311使用该边缘作为指导来创建ROI，例如，通过绘制涵盖了该边缘预定距离内(例如PT ROI)、或者在边缘的一侧的预定义距离内(例如PO或PI ROI)、或者在边缘的第一侧的第一预定义距离内和在边缘的第二侧的第二预定距离内(例如，PT ROI，其中具有距离浸润前沿不同的标准距离的其内部和外部)的所有对象的ROI。
在其他实施例中，ROI生成器311可以自动建议ROI，而无需来自用户的任何直接输入(例如，通过将组织分割函数应用于未标注的图像)，然后用户可以选择适当地接受、拒绝或编辑。
在一些实施例中，ROI生成器311还可以包括登记功能，由此在一组连续切片的一个切片中标注的ROI被自动登记至该一组连续切片的其他切片中。当H&E染色的连续切片与生物标志物标记的切片同时提供时，此功能特别有用。在此类实施例中，用户可以例如在H&E染色的切片的数字图像中绘制肿瘤区域。然后，ROI生成器311将来自H&E图像的ROI显示到生物标志物染色的连续切片的图像中，从而将来自H&E图像的组织结构与连续切片中的相应组织结构进行匹配。示例性显示方法可见于例如WO2013/140070和US 2016-0321809。
对象识别器310和ROI生成器311可以以任何顺序实现。例如，首先可以将对象识别器310应用于整个图像。然后，当实现ROI生成器311时，随后可以存储并唤醒所识别的对象的位置和特征。在此类排列中，评分引擎313可以在生成ROI时立即生成评分。此工作流程在图3A中示出。如在图4A处可以看到的，所获得的图像具有不同对象的混合物(由深椭圆形和深菱形示出)。实现对象识别任务后，将识别图像中的所有菱形(以空心菱形表示)。当将ROI附加到图像时(用虚线表示)，在ROI的度量计算中仅包括位于ROI区域中的菱形。然后计算特征向量，包括特征度量和由评分引擎313执行的评分函数所使用的任何额外的度量。可替代地，可以首先实现ROI生成器311。在该工作流程中，对象识别器310可以仅在ROI上实现(这可以最小化计算时间)，或者它仍可以在整个图像上实现(这可以允许在不重新运行对象识别器310的情况下进行即时调整)。此工作流程在图4B中示出。如在图4B处可以看到的，所获得的图像具有不同对象的混合物(由深椭圆形和深菱形示出)。ROI附加在图像上(由虚线表示)，但尚未标记对象。在ROI上实现对象识别任务后，将识别ROI中的所有菱形(以空心菱形表示)，并将其包括在ROI的特征量度计算中。然后计算特征向量，包括一个或多个特征度量和由评分引擎313执行的评分函数所使用的任何额外的度量。同时实现对象识别器310和ROI生成器311也是可能的。
在已经实现了对象识别器310和ROI生成器311后，实现了评分引擎313。评分引擎313计算ROI的一个或多个特征量度，并且如果使用，则计算预定的最大和/或最小截止值。包括计算的特征度量和由评分函数使用的任何其他变量的特征向量通过评分引擎组装，并将评分函数应用于特征向量。
表6列出了每个组的特定示例性特征：
表6
Figure BDA0002995203900000511
Figure BDA0002995203900000521
如图3中所示，在一些实施例中，图像分析系统300可以通信地耦合到图像采集系统320。图像采集系统320可以获取样品的图像，并将那些图像提供给图像分析系统300，以进行分析并呈现给用户。
图像采集系统320可以包括扫描平台325，例如载玻片扫描仪，其可以以20倍、40倍或其他放大倍数扫描染色的载玻片以产生高分辨率的全载玻片数字图像，包括例如载玻片扫描仪。在基本层面上，典型的载玻片扫描仪至少包括：(1)带有物镜的显微镜，(2)光源(例如卤素、发光二极管、白光和/或多光谱光源，具体取决于染料)，(3)自动装置使载玻片在周围移动(或使光学器件在载玻片周围移动，(4)一个或多个用于图像捕获的数码相机，(5)计算机和相关软件，以控制自动装置并操纵、管理和查看数字载玻片。相机的电荷耦合器件(CCD)捕获载玻片上许多不同X-Y位置(在一些情况下，在多个Z平面上)的数字数据，并将图像合并在一起以形成整个扫描的表面的合成图像。实现此目的的常用方法包括：
(1)基于图块的扫描，其中载物台或光学器件以非常小的增量移动，以捕获正方形图像帧，这些图像帧与相邻的正方形略有重叠。然后将捕获的正方形自动彼此匹配以构建合成图像；和
(2)基于行的扫描，其中载物台在采集过程中在单个轴上移动，以捕获许多合成图像“条”。然后，图像条可以彼此匹配以形成较大的合成图像。
各种扫描仪(荧光和明视野)的详细概述可见于Farahani等人,Whole slideimaging in pathology:advantages,limitations,and emerging perspectives,Pathology and Laboratory Medicine Int’l,第7卷,第23–33页(2015年6月)，将其内容通过引用以其整体并入本文。可商购的载玻片扫描仪的实例包括：3DHistech PANNORAMICSCAN II；DigiPath PATHSCOPE；Hamamatsu NANOZOOMER RS、HT、和XR；Huron TISSUESCOPE4000、4000XT、和HS；Leica SCANSCOPE AT、AT2、CS、FL、和SCN400；Mikroscan D2；OlympusVS120-SL；Omnyx VL4、和VL120；PerkinElmer LAMINA；Philips ULTRA-FAST SCANNER；Sakura Finetek VISIONTEK；Unic PRECICE 500、和PRECICE 600x；VENTANA ISCAN COREO和ISCAN Ht；和Zeiss AXIO SCAN.Z1。其他示例性系统和特征可见于，例如WO2011-049608)或2011年9月9日提交的标题为“IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THESAME”的美国专利申请号61/533,114，其内容通过引用以其全文并入本文。
可以将由扫描平台325生成的图像传送到图像分析系统300或图像分析系统300可访问的服务器或数据库。在一些实施例中，可以经由一个或多个局域网和/或广域网自动传送图像。在一些实施例中，图像分析系统300可以与扫描平台325和/或图像采集系统320的其他模块集成或包含在扫描平台325和/或图像采集系统320的其他模块中，在这种情况下，图像可以例如通过平台325和系统320可访问的存储器被传送到图像分析系统。在一些实施例中，图像采集系统320可以不与图像分析系统300通信地联接，在这种情况下，图像可以存储在任何类型的非易失性存储介质(例如，闪存驱动器)上，并且可以从该介质下载到图像分析系统300或与之通信地耦合的服务器或数据库。在以上任何实例中，图像分析系统300可以获得生物样品的图像，其中样品可能已经被固定在载玻片上并被组织化学染色平台323染色，并且载玻片可能已经被载玻片扫描仪或其他类型的扫描平台325扫描。然而，应当理解，在其他实施例中，下述技术也可以应用于通过其他手段获取和/或染色的生物样品的图像。
图像采集系统320还可以包括自动组织化学染色平台323，例如自动IHC/ISH载玻片染色器。自动IHC/ISH载玻片染色器通常至少包括：染色方案中使用的各种试剂的储液器、与储液器流体连通的用于将试剂分配到载玻片上的试剂分配单元、用于从载玻片上去除使用的试剂或其他废物的废物清除系统，以及用于协调试剂分配单元和废物清除系统的动作的控制系统。除了执行染色步骤外，许多自动载玻片染色器还可以执行染色辅助步骤(或与执行此类辅助步骤的单独系统兼容)，包括：载玻片烘烤(用于将样品粘附到载玻片上)、脱蜡(也称为脱石蜡)、抗原修复、复染、脱水和清除以及盖玻。Prichard,Overview ofAutomated Immunohistochemistry,Arch Pathol Lab Med.，第138卷，第1578–1582页(2014)(其全文以引用方式并入本文)描述了自动IHC/ISH载玻片染色器的几个特定实例及其各种特征，包括intelliPATH(Biocare Medical)、WAVE(Celerus Diagnostics)、DAKOOMNIS和DAKO AUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK(VentanaMedical Systems,Inc.)、Leica BOND和Lab Vision Autostainer(Thermo Scientific)自动载玻片染色器。此外，Ventana Medical Systems,Inc.是公开用于进行自动分析的系统和方法的多项美国专利的受让人，包括美国专利号：5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029，以及美国公开专利申请号：20030211630和20040052685，它们中各自的全文以引用方式并入本文。可商购的染色装置通常按照以下原理之一进行操作：(1)打开单个载玻片染色，其中将载玻片水平放置并将试剂作为水坑分配在载有组织样品的载玻片表面上(例如在DAKO AUTOSTAINER Link 48(Agilent Technologies)和intelliPATH(Biocare Medical)染色器上实现)；(2)液体覆盖技术，其中试剂被沉积在样品上的惰性流体层覆盖或分配(例如在VENTANA BenchMark和DISCOVERY染色器上实现)；(3)毛细间隙染色，其中将载玻片表面放置在另一个表面(可能是另一个载玻片或盖板)附近，以形成一个狭窄的间隙，通过毛细作用力吸出并保持液体试剂与样品接触(例如DAKOTECHMATE、Leica BOND和DAKO OMNIS染色器使用的染色原理)。毛细管间隙染色的一些迭代不会将间隙中的流体混合(诸如，在DAKO TECHMATE和Leica BOND上)。在称为动态间隙染色的毛细管间隙染色的变体中，使用毛细管力将样品施加到载玻片上，然后将平行表面彼此相对平移以在孵育期间搅动试剂以实现试剂混合(诸如，在DAKO OMNIS染色器上实现的染色原理)。在平移间隙染色中，可平移头部位于载玻片上。头部的下表面与载玻片间隔开第一间隙，该第一间隙足够小，以允许在载玻片平移期间由在载玻片上的液体形成液体的弯液面。具有小于载玻片的宽度的侧向尺寸的混合延伸部从可平移的头部的下表面延伸，以定义小于混合延伸部和载玻片之间的第一间隙的第二间隙。在头部平移期间，混合延伸部的横向尺寸足以在载玻片上的液体中沿通常从第二间隙延伸到第一间隙的方向生成横向运动。参见WO 2011-139978 A1。最近建议使用喷墨技术将试剂沉积在载玻片上。参见WO2016-170008 A1。染色技术列表并不旨在全面，并且可以将用于进行生物标志物染色的任何全自动或半自动系统整合到组织化学染色平台323中。
图像采集系统320可包括自动H&E染色平台324。用于进行H&E染色的自动化系统通常基于以下两种染色原理之一进行操作：批量染色(也称为“浸入式篮”)或单个载玻片染色。批量染色器通常使用试剂的桶或缸，其中许多载玻片同时浸入其中。另一方面，单个载玻片染色器直接将试剂应用到每个载玻片上，并且没有两个载玻片共享相同等份的试剂。可商购的H&E染色器的实例包括来自Roche的VENTANA SYMPHONY(单个载玻片染色器)和VENTANA HE 600(单个载玻片染色器)系列H&E染色器；来自Agilent Technologies的CoverStainer(批量染色器)；来自Leica Biosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020Small Linear Stainer(批量染色器)、Leica ST5020 Multistainer(批量染色器)、和Leica ST5010 Autostainer XL系列(批量染色器)H&E染色器。H&E染色平台324通常用于需要生物标志物染色切片的形态学染色的连续切片的工作流程中。
评分系统可以进一步包括实验室信息系统(LIS)330。LIS 330通常会进行选自以下的一项或多项功能：对样品以及在从样品衍生的载玻片和图像上进行的记录和跟踪过程，指示评分系统的不同组件对样品、载玻片和/或图像进行特定过程，以及跟踪有关应用于样品和/或载玻片的特定试剂的信息(例如批号、有效期、分配的体积等)。LIS 330通常至少包括一个数据库，该数据库含有关于样品的信息；与样品、载玻片和/或图像文件相关的标签(例如条形码(包括一维条形码和二维条形码)、射频识别(RFID)标签、粘贴在样品上的字母数字代码等)；和读取所述样品或载玻片上的标签和/或在LIS 330与免疫环境评分系统的其他组件之间传递关于所述载玻片的信息的通信设备。因此，例如，可以将通信设备放置在样品处理站、自动组织化学染色器323、H&E染色平台324和扫描平台325的每一者上。当样品最初被处理为切片时，有关样品的信息(例如患者ID、样品类型、要在一个或多个切片上进行的过程)可以输入到通信设备中，并为从样品中生成的每个切片创建标签。在每个后续站点，将标签输入到通信设备中(例如，通过扫描条形码或RFID标签或通过手动输入字母数字代码)，并且站点与数据库进行电子通信，例如，指示站点或站点操作员在该切片上进行特定的过程和/或记录正在该切片上进行的过程。在扫描平台325处，扫描平台325还可以利用计算机可读标签或代码对每个图像进行编码，所述计算机可读标签或代码关联回图像所源自的切片或样品，从而当图像被发送至图像分析系统300时，可以将要进行的图像处理步骤从LIS 330的数据库发送到图像分析系统，和/或通过图像分析系统300对图像进行的图像处理步骤记录在LIS 330的数据库中。在本方法和系统中有用的可商购的LIS系统包括，例如，VENTANA Vantage Workflow系统(Roche)。
实例
I.使用5Plex IHC和全载玻片图像分析对关于患者错配修复状态和抗PD-1治疗结果的胃肠道肿瘤的肿瘤微环境中PD-L1、CD8、CD3、CD68和PanCK的表征
I.A.背景技术
越来越需要了解肿瘤的微环境标志物，以指导癌症的免疫疗法。多重免疫组织化学(IHC)通过检测多个生物标志物及其在单个载玻片上的共表达，从而能够表征肿瘤微环境，同时保留组织形态。提取有关多种生物标志物共表达及其空间关系的信息需要针对单个测定及其预期用途定制的完整载玻片图像分析算法。通过在肿瘤细胞上和在肿瘤微环境中上调程序性死亡1(PD-1)途径及其配体程序性死亡配体1(PD-L1)可以使癌症逃避免疫监测和根除。在某些癌症患者中，用针对PD-1或PD-L1的抗体阻滞该途径已导致了显著的临床应答。
错配修复(MMR)缺陷预测了实体瘤对PD-1阻滞的应答。然而，并非所有具有错配修复缺陷的患者都对PD-1阻滞治疗有应答。为了理解不同的应答，我们通过检测与肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞有关的PD-L1表达来评估肿瘤的微环境。
I.B.样品、染色、和图像采集
本研究可获得60个具有用于自动分析的可接受的图像和组织质量的治疗(抗PD-1派姆单抗)前患者胃肠道肿瘤样本的队列。消除无法评估的应答后，剩下54例。表7显示了关于错配修复缺陷的应答的衰弱。
错配修复无缺陷 错配修复缺陷
进展性疾病 13 5
稳定性疾病 3 10
部分应答+完全应答 1 22
表7
将样品福尔马林固定、石蜡包埋、切片、并安装在显微镜载片上。
如表8所示，在酪胺信号扩增程序中，将载玻片在BenchMark ULTRA IHC/ISH自动载玻片染色器上用荧光酪胺染料缀合物以多重形式染色：
Figure BDA0002995203900000581
表8
酪胺信号扩增的一般概念由US 6,593,100描述。染色步骤与由Zhang I所述的程序基本相同。如图5中所述顺序应用染色剂。在每种染色剂沉积之后，应用热杀死步骤，其包括由Zhang I所述的过程。示例性染色的载玻片示于图6。还使用VENTANA HE 600自动载玻片染色器对每个样品的连续切片进行H&E染色。
将IHC-染色的载玻片在Zeiss AxioScan Z1载玻片扫描仪上扫描，将H&E染色的载玻片在VENTANA ISCAN COREO载玻片扫描仪上扫描。所有图像均已导出到来自Roche的专有的数字病理图像分析套件软件套件DPath中。
I.C.图像标注和ROI生成
由病理学家在图像中标注肿瘤区域ROI和肿瘤的浸润前沿(如果可以)。此外，病理学家标注了从分析中排除的坏死区域和其他区域。
DPath系统自动从panCK+细胞的聚集体、和间质区域标注上皮肿瘤ROI。首先，将肿瘤区域细分为图块。对于每个图块，首先通过标记每个panCK+细胞并找到标记的细胞之间的联合来生成panCK掩膜。然后在掩膜上进行后处理，以补偿通过以下方式浸润的淋巴细胞：
(a)半径为10个像素的圆盘状结构元件(每像素的分辨率为0.325μms)进行形态学闭合操作；
(b)关闭掩膜中大于80个像素(8.5μm2)的任何孔，以生成“填充孔的PanCK掩膜”。
(c)将带有孔的PanCK掩膜转换为多边形。
然后将所有图块的多边形组装在一起，以在整个幻灯片水平创建多边形。然后将整个载玻片水平多边形转换为掩膜(较低分辨率(尺寸减小3^3))，并放大8.8μm以在整个载玻片水平上生成用于“PanCK+细胞聚集体”的最终掩膜。
此外，从浸润前沿进入肿瘤的距离为0.5mm的区域自动生成癌周内侧ROI，从浸润前沿远离肿瘤的距离为0.5mm的区域自动生成癌周外侧ROI。
I.C.特征计算和数据分析
为每个ROI计算了以下特征：所有表型的面积密度；是PD-L1+的panCK+细胞的分数；是PD-L1+的CD3+细胞的分数；是PD-L1+的CD8+细胞的分数；也是PD-L1+的CD3+CD8-细胞的分数；CD8+细胞与其最近的毗邻的PD-L1+/CD68+的距离的描述性统计；CD8+细胞与其最近的毗邻的PD-L1+/panCK+的距离的描述性统计；CD8+细胞与其最近的毗邻的PD-L1+/CD3+的距离的描述性统计；panCK+细胞与其最近的毗邻的CD8+的距离的描述性统计；和CD8+细胞的10、30μm内的平均#PD-L1+/panCK+细胞。表9列出了计算特征的完整列表：
表9
Figure BDA0002995203900000591
Figure BDA0002995203900000601
Figure BDA0002995203900000611
Figure BDA0002995203900000621
Figure BDA0002995203900000631
Figure BDA0002995203900000641
Figure BDA0002995203900000651
Figure BDA0002995203900000661
对特征进行ReliefF特征选择，以确定每个特征在根据抗PD-1治疗结果对病例进行分类中的重要性，然后选择10个最重要的特征，并对其进行拟合象限判别分类模型以预测对治疗的应答。将治疗结果分为3种表形(PD＝进展性疾病；SD＝稳定性疾病；PR＝部分应答；CR＝完全应答)；PD相对于SD相对于PR+CR；PD相对于SD+PR+CR；PD+SD相对于PR+CR。54个样本中的大多数没有明确的肿瘤浸润前沿，因此该特征被排除在对癌周内侧和外侧区域的分析之外。使用1)所有特征、2)仅肿瘤特征、和3)仅上皮和间质特征对每种配置进行分析。这样做的目的是删除与高度关联的功能，以探索对最终分类的影响。由于样品量较小，因此没有进行交叉验证，并且报告的分类结果表示染色集上的分类准确率。
表10总结了来自不同配置和不同特征集的分类准确率。
Figure BDA0002995203900000662
表10
阴影单元格显示，对于第三种配置(二进制应答)，多重(Mpx)IHC数据可达到89％的准确率，而错配修复(MMR)状态仅可达到70％。图7示出了在所有情况下，所有特征的重要性排名。以下特征鉴定为最重要的：
(1)间质中PD-L1+巨噬细胞的分数,
(2)间质中PD-L1+T辅助细胞的分数，和
(3)间质中PD-L1+T细胞的分数。
过去已经显示错配修复(MMR)缺陷以预测对抗PD-1治疗的应答。进行了一项仅针对错配修复缺陷病例的分析，目的是鉴定多重(Mpx)IHC数据是否可以识别出哪些MMR缺陷病例对抗PD-1治疗有应答。图8显示了在MMR缺陷情况下在所述分析配置中特征的重要性排名。图9是显示对治疗完全应答的患者的染色的样品的图像，而图10是治疗后具有进展性疾病的患者。表11显示了使用上皮和间质Mpx IHC数据可以达到将PD+SD结果与PR+CR区分的分类准确率为92％。
Figure BDA0002995203900000671
表11
表12显示了所述分类的混淆矩阵。在37例缺陷病例中，通过Mpx IHC数据，有34例被正确鉴定为应答者和无应答者，只有3例被错误分类。相比之下，MMR缺乏病例的53.7％对抗PD-1治疗有应答。
应答 通过Mpx预测的SD+PD 通过Mpx预测的PR+CR
实际SD+PD(15) 13 2
实际PR+CR(22) 1 21
表12
II.通过自动多重IHC定量图像分析探索PD-1/PD-L1的空间相互作用以预测胃肠道肿瘤对免疫疗法的应答
II.A.背景技术
在一些癌症患者中，PD-1/L1轴的阻滞是一种有效的免疫疗法。然而，识别用于患者选择的预测性生物标志物是一个重大挑战。基于通过IHC测得的PD-L1表达水平和新兴的生物标志物肿瘤突变负荷和错配修复(MMR)状态的当前临床实践是不充分的。对于研究和肿瘤类型之间可变的关联强度，预测值是有限的。最近的研究表明，癌细胞与免疫细胞之间的空间排列和相互作用会影响患者的预后、存活以及对治疗的应答。多重免疫组织化学(IHC)组织染色可基于特定的肿瘤和免疫分子特征提供详细的肿瘤微环境概况。
II.B.样品、染色、和图像采集
本研究可获得50个具有用于自动分析的可接受的图像和组织质量的治疗(抗PD-1派姆单抗)前患者胃肠道肿瘤样本的队列。表13显示了应答的衰弱。
抗PD-1应答 患者(所有治疗前样本)中的#
PD(进展性疾病) 15
SD(稳定性疾病) 17
NE(不可评估) 3
PR(部分应答) 11
CR(完全应答) 4
总计 50
表13
将样品福尔马林固定、石蜡包埋、切片、并安装在显微镜载片上。
染色和图像分析的概述如图11所示。如表14所示，在酪胺信号扩增程序中，将载玻片针对PanCK、PD-L1、PD1、CD8、LAG3在BenchMark ULTRA IHC/ISH自动载玻片染色器上用荧光酪胺染料缀合物在多重IHC中染色：
Figure BDA0002995203900000681
表14
如实例I中顺序应用染色剂。在每种染色剂沉积之后，应用热杀死步骤，其包括由Zhang(I)所述的过程。还使用VENTANA HE 600自动载玻片染色器对每个样品的连续切片进行H&E染色。
用Zeiss AXIO Z1扫描仪扫描整个载玻片，病理学家在其上标注肿瘤区域。HaloHi-Plex软件用于图像分析。使用MatLab Computer Vision、Image Processing、和MachineLearning Toolbox用于(a)从Halo输出的csv文件中的空间位置重建每种细胞类型的图；(b)制定量化度量，以表征不同细胞信号之间的相互影响；(c)排名和挖掘与抗PD-1应答有关的最具预测性的特征组合；和(d)基于所选特征建立和优化预测模型。
II.C.图像标注和ROI生成
由病理学家在图像中标注肿瘤区域ROI和肿瘤的浸润前沿(如果可以)。如实例I所述，DPath系统自动从panCK+细胞的聚集体、和间质区域标注上皮肿瘤ROI。
II.C.特征计算和数据分析
表16中的每个特征均针对每个图像进行了分析，并通过ReliefF和随机森林进行排名：
Figure BDA0002995203900000691
Figure BDA0002995203900000701
Figure BDA0002995203900000711
Figure BDA0002995203900000721
Figure BDA0002995203900000731
Figure BDA0002995203900000741
表16
来自ReliefF和随机森林每一者排名的前15个特征的排名分别在图12和图13中说明。在所分析的190个特征中，Relieff和随机森林在预测对治疗的应答中的前两个特征中对以下特征排名：“上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量”。具有5倍交叉验证的象限判别分析(QDA)可产生85％的预测准确率。当与“PD-L1+细胞的20μm半径内的平均值#PD-1+细胞”和“CD8+细胞上Lag3+强度的最大值”组合使用时，无论MMR状态如何，其准确率达到90.2％(参见图14和表17和18)。
抗PD-1应答 MMR无缺陷 MMR缺陷
PD+SD+NE 17 18
PR+CR 1 14
表17
预测因子 MPX MMR MPX+MMR
准确率 90.2％ 62％ 80％
表18
其他特征的准确率较低(例如60％-70％)。
图14A–14C示出了：(a)PD-L1+细胞的10μm半径内的空间方差#PD-1+细胞的预测值；(b)PD-L1+细胞的20μm半径内的平均值#PD-1低强度CD8+细胞的预测值；(c)CD8+Lag3+细胞中Lag3强度的最大值的预测值；和(d)显示(a)相对于(b)的散点图。
图15示出了无应答者的示例性IHC图像，以及显示PD-L1+细胞的位置(灰色点)、PD-L1+细胞的20μm内的PD-1低细胞(白色点)、和PD-L1+细胞的10μm内的PD-1+细胞(黑色点)的图形重构。可以看出，在无应答者和应答者中也有PD-L1+细胞的类似的存在。然而，在应答者和无应答者中PD-L1+细胞的20μm内，应答者显示CD8+PD-1低细胞更高的存在。此外，与无应答者相比，应答者中PD-L1+细胞的10μm内的PD-1+细胞分布更加均匀。
II.D.存活分析
有46例患者的子集的总存活(OS)数据可用。对表14中的每个变量进行了存活分析。以下变量可显着预测存活益处：(a)panCK-阴性区域中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的总数量的比；(b)panCK-阴性区域中Lag3–/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，(c)Lag3+/panCK–细胞的数量除以panCK-阴性面积，(d)panCK阴性区域中Lag3阳性细胞的数量，(e)CD8+细胞中Lag3强度的最大值，(f)panCK-阳性区域中Lag3+细胞的数量，(g)PD-L1+/panCK+细胞的10μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量，(h)PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量，(i)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的数量的方差，(j)PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的数量的方差，(k)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差，(l)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量，以及(m)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量。对于每个特征指标，使用特征量度分布的中位数作为截止值，将队列分为两组。Kaplan-Meier存活曲线在图16A–16M中示出。
IV.示例性图像分析系统和临床工作流程
在临床实践中，可以将评分函数集成到预后分析和制定治疗决策中。在对肿瘤进行活检或手术切除之后，选择显示来自患者肿瘤样品的肿瘤横截面的代表性组织块进行分析。从该组织块上切下至少三个4μm厚的切片，并将其转移到玻璃载玻片上。将切片染色为：
1.IHC阴性对照(即用一级抗体稀释剂代替一级抗体进行染色的方案)；
2.多重IHC(包括至少PD-L1、PD1、CD8、和LAG3一级抗体)；和
3.H&E。
将所有切片在载玻片扫描仪上扫描。将图像与幻灯片元数据一起传输到数字病理系统。载玻片元数据包括肿瘤样品的鉴定和载玻片的染色(H&E、IHC或阴性对照)，可以由用户在扫描载玻片时输入，也可以从实验室信息系统自动获取。数字病理学系统使用载玻片元数据触发执行表9或表16的一个或多个特征的自动计算。例如，该特征至少包括上皮肿瘤中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低强度细胞的最大数量，和任选地进一步包括“PD-L1+细胞的20μm半径内的平均#PD-1+细胞”和"CD8+细胞上Lag3+强度的最大值”。
在数字病理学系统中，病理学家或专业观察员会在查看软件中打开H&E载玻片的数字图像，以了解要评分的相关形态学区域。然后，用户使用查看软件提供的标注工具对肿瘤进行标注。通常，通过创建一个或多个轮廓并将其标识为肿瘤轮廓来定义肿瘤。为此，用户创建与肿瘤轮廓交叉的其他轮廓。交叉点定义了浸润过程中涉及的肿瘤轮廓上切片的开始和结束。新轮廓被确定为浸润边缘。
然后，用户触发将标注自动转移到相邻的IHC载玻片上。数字病理系统提供显示功能，可将标注转移到相邻的载玻片上，同时考虑组织切片的位置、方向和局部变形。用户在查看器软件中打开IHC载玻片图像，并控制自动显示的标注的位置。查看器软件提供了必要时用于修改和编辑标注的工具。编辑功能包括移动标注，旋转标注以及局部修改其轮廓。用户进一步在查看器软件中检查IHC载玻片图像的组织、染色或成像矫作物。用户用标注描绘出此类矫作物区域，并识别出它们以排除在分析之外。
在数字病理学系统中，用户可以选择一个或多个IHC载玻片并触发报告生成。用户可以获得质量控制报告，该报告可能包括以下组件：
1.载玻片显示载玻片上的所有组织的低至中分辨率的图像
2.相同的低至中分辨率图像覆盖有轮廓和/或透明的着色区域，这些区域指示所关注的形态区域，如肿瘤边缘。此外，在该图像中覆盖了被标注为要从分析中排除的区域。
3.带有自动生成的小矩形标记的相同的低至中分辨率图像，这些标记指示用于质量控制的高分辨率FOV的位置
4.每个高分辨率FOV
5.每个高分辨率FOV都覆盖有标志物，这些标志物指示通过自动细胞计数确定的每种细胞表型的存在。
作为选择，所关注的形态区域和标志物指示来自自动细胞计数的细胞也可以显示在查看器软件中。
用户审查QC数据，并决定接受或拒绝该病例。对于已接受的病例，数字病理系统报告定量读数并将其传递给评分模块。这些定量读数可能包括：
1.每个所关注的形态区域的面积(用mm2表示)。
2.所关注的形态区域中细胞的数量。
3.描述性统计数据描述了每个所关注的形态区域中不同表型的细胞的空间分布和/或细胞之间的空间关系。
关于样品的额外的信息可以进一步输入到数字病理系统中，例如，MMR状态(受试者暴露于疗法(例如化学疗法、放射疗法和/或靶向疗法)之前)，用TNM分期系统和/或整体肿瘤分期的肿瘤评分，以及临床变量(例如年龄、肿瘤的方向性、收获的淋巴结数量和患者的性别)，系统可以使用上述信息以例如，选择适当的评分函数以应用于图像。另外地或可替代地，用户可以基于此类标准或其他标准来选择适当的评分函数。评分模块基于所提取的特征来计算评分，其可以被报告为原始数字。此外，区间函数可应用于评分以评估患者归属的风险区间(例如，通过应用基于对检查点抑制剂“可能应答”或“不可能应答”的群体之间的截止值)和/或群体分层区间(例如，基于评分的四分位数或十分位数区间)；和/或特征选择函数以排名该评分。临床医生查看该报告并基于临床病理学家决定的结果与患者讨论结果，然后可将其用于为患者做出治疗决策。
参考文献
Barrera等人，Computer-extracted features relating to spatialarrangement of tumor infiltrating lymphocytes to predict response tonivolumab in non-small cell lung cancer(NSCLC).ASCO Annual Meeting 2018:Abstract#:12115.
Le等人，PD-1 Blockade in Tumors with Mismatch-Repair Deficiency,N EnglJ Med.2015 Jun 25；372(26):2509-20(“Le(I)”).
Le等人，Mismatch-repair deficiency predicts response of solid tumorsto PD-1blockade,Science,10.1126/science.aan6733(2017)(“Le(II)”).
Li&Tian,Development of small-molecule immune checkpoint inhibitors ofPD-1/PD-L1 as a new therapeutic strategy for tumour immunotherapy,J.of DrugTargeting,DOI:10.1080/1061186X.2018.1440400(网络出版日期2018年2月20日).
Nordic Immunohistochemical Quality Control,CK-Pan run 47(2016),参考http://www.nordiqc.org/downloads/assessments/82_85.pdf(最后访问2018年10月4日)(“NordiQC”).
Topalian,Suzanne L.等人。"Safety,activity,and immune correlates ofanti–PD-1antibody in cancer."New England Journal of Medicine 366.26(2012):2443-2454.
Wang等人，Prediction of recurrence in early stage non-small cell lungcancer using computer extracted nuclear features from digital H&E images.,Scientific Reports 7.1(2017):13543.
Woodcock-Mitchell等人。Immunolocalization of keratin polypeptides inhuman epidermis using monoclonal antibodies.J Cell Biol.1982；95(2):580-588.
Yi等人，Biomarkers for predicting efficacy of PD-1/PD-L1 inhibitors,Mol Cancer.2018；17:129.(网络出版日期2018年8月23日)
Zhang等人。"Automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry withtyramide signal amplification using antibodies from the same species."JImmunother Cancer.2015；3(Suppl 2):P111(“Zhang(I)”).
Zhang等人。"An automated 5-plex fluorescent immunohistochemistryenabled characterization of PD-L1 expression and tumor infiltrating immunecells in lung and bladder cancer specimens."Cancer Research 2016,76(14Supplement):5117(“Zhang(II)”).
序列表
<110> 文塔纳医疗系统公司（Ventana Medical Systems, Inc.）
约翰斯霍普金斯大学（Johns Hopkins University）
纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）
<120> 用于预测对 PD-1 轴导向疗法的应答的方法和系统
<130> 3000022-004977
<150> US 62/739,828
<151> 2018-10-01
<150> US 62/742,934
<151> 2018-10-09
<160> 10
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 182
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Glu Gln Gly Lys Gly Leu Ala Val Leu Ile Leu Ala Ile Ile Leu
1 5 10 15
Leu Gln Gly Thr Leu Ala Gln Ser Ile Lys Gly Asn His Leu Val Lys
20 25 30
Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val Leu Leu Thr Cys Asp Ala
35 40 45
Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp Gly Lys Met Ile Gly Phe
50 55 60
Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu Gly Ser Asn Ala Lys Asp
65 70 75 80
Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser Gln Asn Lys Ser Lys Pro
85 90 95
Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys Ile Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Ala Thr Ile Ser Gly Phe Leu Phe Ala Glu Ile Val Ser Ile Phe Val
115 120 125
Leu Ala Val Gly Val Tyr Phe Ile Ala Gly Gln Asp Gly Val Arg Gln
130 135 140
Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Pro Asn Asp Gln Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Asp Asp Gln Tyr Ser His Leu Gln Gly
165 170 175
Asn Gln Leu Arg Arg Asn
180
<210> 2
<211> 171
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Asn Cys Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Ser Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Thr Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser His Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys
165 170
<210> 3
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 4
<211> 164
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu
1 5 10 15
Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys
20 25 30
Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
65 70 75 80
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
85 90 95
Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
100 105 110
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
115 120 125
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
130 135 140
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
145 150 155 160
Leu Pro Pro Arg
<210> 5
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr
20 25 30
Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser
35 40 45
Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala
65 70 75 80
Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp
85 90 95
Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe
115 120 125
Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
130 135 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His
195 200 205
Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser
210 215 220
Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val
225 230 235
<210> 6
<211> 210
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Arg Pro Arg Leu Trp Leu Leu Leu Ala Ala Gln Leu Thr Val Leu
1 5 10 15
His Gly Asn Ser Val Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln
20 25 30
Thr Asn Lys Met Val Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser
35 40 45
Asn Met Arg Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp
50 55 60
Ser His His Glu Phe Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile
65 70 75 80
His Gly Glu Glu Val Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala
85 90 95
Ser Arg Phe Ile Leu Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly
100 105 110
Ile Tyr Phe Cys Met Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Gln Leu Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro
130 135 140
Thr Lys Lys Ser Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro
145 150 155 160
Glu Thr Gln Lys Gly Pro Leu Cys Ser Pro Ile Thr Leu Gly Leu Leu
165 170 175
Val Ala Gly Val Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Val Ala Ile His
180 185 190
Leu Cys Cys Arg Arg Arg Arg Ala Arg Leu Arg Phe Met Lys Gln Phe
195 200 205
Tyr Lys
210
<210> 7
<211> 354
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Arg Leu Ala Val Leu Phe Ser Gly Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Gly Thr Gly Asn Asp Cys Pro His Lys Lys Ser Ala Thr Leu
20 25 30
Leu Pro Ser Phe Thr Val Thr Pro Thr Val Thr Glu Ser Thr Gly Thr
35 40 45
Thr Ser His Arg Thr Thr Lys Ser His Lys Thr Thr Thr His Arg Thr
50 55 60
Thr Thr Thr Gly Thr Thr Ser His Gly Pro Thr Thr Ala Thr His Asn
65 70 75 80
Pro Thr Thr Thr Ser His Gly Asn Val Thr Val His Pro Thr Ser Asn
85 90 95
Ser Thr Ala Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Ala Thr His Ser Pro Ala
100 105 110
Thr Thr Ser His Gly Asn Ala Thr Val His Pro Thr Ser Asn Ser Thr
115 120 125
Ala Thr Ser Pro Gly Phe Thr Ser Ser Ala His Pro Glu Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Ser Pro Ser Pro Ser Pro Thr Ser Lys Glu Thr Ile Gly Asp Tyr
145 150 155 160
Thr Trp Thr Asn Gly Ser Gln Pro Cys Val His Leu Gln Ala Gln Ile
165 170 175
Gln Ile Arg Val Met Tyr Thr Thr Gln Gly Gly Gly Glu Ala Trp Gly
180 185 190
Ile Ser Val Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Val Gln Gly Ser Cys Glu
195 200 205
Gly Ala His Pro His Leu Leu Leu Ser Phe Pro Tyr Gly His Leu Ser
210 215 220
Phe Gly Phe Met Gln Asp Leu Gln Gln Lys Val Val Tyr Leu Ser Tyr
225 230 235 240
Met Ala Val Glu Tyr Asn Val Ser Phe Pro His Ala Ala Gln Trp Thr
245 250 255
Phe Ser Ala Gln Asn Ala Ser Leu Arg Asp Leu Gln Ala Pro Leu Gly
260 265 270
Gln Ser Phe Ser Cys Ser Asn Ser Ser Ile Ile Leu Ser Pro Ala Val
275 280 285
His Leu Asp Leu Leu Ser Leu Arg Leu Gln Ala Ala Gln Leu Pro His
290 295 300
Thr Gly Val Phe Gly Gln Ser Phe Ser Cys Pro Ser Asp Arg Ser Ile
305 310 315 320
Leu Leu Pro Leu Ile Ile Gly Leu Ile Leu Leu Gly Leu Leu Ala Leu
325 330 335
Val Leu Ile Ala Phe Cys Ile Ile Arg Arg Arg Pro Ser Ala Tyr Gln
340 345 350
Ala Leu
<210> 8
<211> 288
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 9
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 10
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Trp Glu Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gln Pro Leu Trp
1 5 10 15
Val Ala Pro Val Lys Pro Leu Gln Pro Gly Ala Glu Val Pro Val Val
20 25 30
Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys Ser Pro Thr Ile
35 40 45
Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly Val Thr Trp Gln
50 55 60
His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly His Pro Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp Gly Pro Arg Pro
85 90 95
Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly Leu Arg Ser Gly
100 105 110
Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu Arg Gly Arg Gln
115 120 125
Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg Arg Ala Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg Ala Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr Ala Ser Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn Cys Ser Phe Ser
180 185 190
Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg Asn Arg Gly Gln
195 200 205
Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His Leu Ala Glu Ser
210 215 220
Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser Gly Pro Trp Gly
225 230 235 240
Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser Ile Met Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu Thr Val Tyr Ala
260 265 270
Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu Pro Ala Gly Val
275 280 285
Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro Pro Gly Gly Gly
290 295 300
Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe Thr Leu Arg Leu
305 310 315 320
Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr Cys His Ile His
325 330 335
Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu Ala Ile Ile Thr
340 345 350
Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu Gly Lys Leu Leu
355 360 365
Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe Val Trp Ser Ser
370 375 380
Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro Trp Leu Glu Ala
385 390 395 400
Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys Gln Leu Tyr Gln
405 410 415
Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr Glu Leu Ser Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala Leu Pro Ala Gly
435 440 445
His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser Leu Leu Leu Leu
450 455 460
Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg Gln Trp Arg Pro
465 470 475 480
Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro Pro Gln Ala Gln
485 490 495
Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro
500 505 510
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln Leu
515 520 525

Claims (43)

1.一种就肿瘤样品对PD-1轴导向疗法有应答的可能性进行评分的方法，所述方法包括：
(a)从所述肿瘤样品获得肿瘤切片的数字图像，其中以多重亲和组织化学染色针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和上皮标志物(EM)中的每一者将所述肿瘤切片染色；
(b)从所述图像中的所关注区域(ROI)提取特征度量，所述特征度量选自由以下项组成的组：
(i)所述ROI中CD8+细胞与最近的PD-L1+/CD68+细胞之间的平均距离，
(ii)所述ROI中CD8+细胞与最近的PD-L1+/CD3+细胞之间的平均距离，
(iii)所述ROI中上皮细胞与最近的CD8+细胞之间的平均距离，
(iv)所述ROI中在CD8+细胞的10μm内的PD-L1+上皮细胞的数量，
(v)所述ROI中在CD8+细胞的30μm内的PD-L1+上皮细胞的数量
(vi)所述ROI中在上皮细胞的10μm内的CD8+细胞的数量
(vii)所述ROI中在上皮细胞的30μm内的CD8+细胞的数量
(viii)所述ROI中PD-L1+/CD3+细胞的密度
(ix)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的密度
(x)所述ROI中PD-L1+/CD8+细胞的密度
(xi)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的密度
(xii)所述ROI中PD-L1+上皮细胞的密度
(xiii)所述ROI中CD3+细胞的密度
(xiv)所述ROI中CD8+细胞的密度
(xv)所述ROI中CD68+细胞的密度
(xvi)所述ROI中上皮细胞的密度
(xvii)所述ROI中PD-L1+上皮细胞所占面积与所述ROI的总面积之间的比
(xviii)所述ROI中上皮细胞所占面积与所述ROI的总面积之间的比
(xix)所述ROI中PD-L1+上皮细胞的数量与所述ROI中上皮细胞的总数量之间的比
(xx)所述ROI中PD-L1+/CD3+细胞的数量与所述ROI中CD3+细胞的总数量之间的比
(xxi)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之间的比
(xxii)所述ROI中PD-L1+/CD8+细胞的数量与所述ROI中CD8+细胞的总数量之间的比
(xxiii)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述ROI中CD68+细胞的总数量之间的比
(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之间的比，
(xxv)所述ROI中CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+细胞的总数量之间的比，
(xxvi)CD3+细胞所占总面积，和
(xxvii)CD3+细胞所占总面积；以及
(c)将评分函数应用于包括所述特征度量的特征向量以生成指示肿瘤将对所述PD-1轴导向疗法有应答的可能性的评分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROI选自由以下项组成的组：肿瘤ROI、间质(stromal)ROI、上皮标志物阳性(EM+)ROI、上皮标志物阴性(EM–)ROI、癌周内侧(PI)ROI、癌周外侧(PO)ROI和癌周区域(PR)ROI。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述ROI为所述间质ROI或所述EM–ROI，并且所述特征向量包括选自由以下项组成的组的一个或多个特征度量：
(xx)所述ROI中PD-L1+/CD3+细胞的数量与所述ROI中CD3+细胞的总数量之间的比，
(xxii)所述ROI中PD-L1+/CD8+细胞的数量与所述ROI中CD8+细胞的总数量之间的比，
(xxiii)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述ROI中CD68+细胞的总数量之间的比，和
(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+CD8–细胞的总数量之间的比。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述特征向量包括以下每一项：所述间质ROI或所述EM–ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述间质ROI或所述EM–ROI中CD68+细胞的总数量之间的比，所述间质ROI或所述EM–ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述间质ROI或所述EM–ROI中CD3+/CD8–细胞的总数量之间的比，和
所述间质ROI或所述EM–ROI中PD-L1+/CD3+细胞的数量与所述间质ROI或所述EM–ROI中CD3+细胞的总数量之间的比。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述ROI为所述肿瘤ROI或所述EM+ROI，并且所述特征向量包括选自由以下项组成的组的一个或多个特征度量：
(i)所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD8+细胞与最近的PD-L1+/CD68+细胞之间的平均距离，
(ix)所述ROI中的PD-L1+/CD3+/CD8–密度，
(xx)所述ROI中PD-L1+/CD3+细胞的数量与所述ROI中CD3+细胞的总数量之间的比，
(xxii)所述EM+ROI或肿瘤ROI中PD-L1+/CD8+细胞的数量与所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD8+细胞的总数量之间的比，
(xxiii)所述ROI中PD-L1+/CD68+细胞的数量与所述ROI中CD68+细胞的总数量之间的比，
(xxiv)所述ROI中PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与所述ROI中CD3+CD8–细胞的总数量之间的比，和
(xxv)所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD3+/CD8–细胞的数量与所述EM+ROI或肿瘤ROI中CD3+细胞的总数量之间的比。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROI来源于所述肿瘤样品的形态学染色的切片的数字图像，其中所述形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的样品为连续切片。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述ROI由使用者在所述形态学染色的切片的数字图像中标识，并且自动地登记在所述多重亲和组织化学染色的切片的数字图像中。
8.一种就肿瘤样品对PD-1轴导向疗法有应答的可能性进行评分的方法，所述方法包括：
(a)从所述肿瘤样品获得肿瘤切片的数字图像，其中以多重亲和组织化学染色针对PD-1、PD-L1、CD8、Lag3以及一种或多种上皮标志物中的每一者将所述肿瘤切片染色；
(b)从所述图像中的所关注区域(ROI)提取特征度量，所述特征度量选自由表9中列出的特征度量组成的组；以及
(c)将评分函数应用于包括所述特征度量的特征向量以生成指示肿瘤将对所述PD-1轴导向疗法有应答的可能性的评分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述ROI选自由以下项组成的组：肿瘤ROI、间质ROI、上皮标志物阳性(EM+)ROI、上皮标志物阴性(EM–)ROI、癌周内侧(PI)ROI、癌周外侧(PO)ROI和癌周区域(PR)ROI。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述特征度量选自由以下项组成的组：
(i)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+的最大数量，
(ii)CD8+细胞PD-L1强度的最大值，
(iii)上皮区域中PD-1+/PD-L1–/Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，
(iv)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的空间方差数(spatial variancenumber)，
(v)所有细胞PD-L1强度的最大值，
(vi)EM+ROI中Lag3阳性细胞的数量，
(vii)EM-ROI中PD-L1+/EM–细胞的密度，
(viii)EM+ROI中PD-L1+细胞的数量，
(ix)EM-ROI中PD-L1+细胞的数量，
(x)EM-ROI中PD-1+细胞的数量，
(xi)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的最大数量，
(xii)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的平均数量，
(xiii)来自CD8+Lag3+细胞的最大值Lag3强度，
(xiv)EM+ROI中CD8+细胞的数量，
(xv)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差，
(xvi)从PD-L1+细胞到其最近的PD-1+细胞的平均距离，
(xvii)PD-L1+/EM+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的最大数量，
(xviii)所述ROI中从PD-L1+细胞到其最近的PD-1+细胞的距离的标准偏差，
(xix)EM+ROI中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的数量的比，
(xx)EM+ROI中PD-L1+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的数量的比，
(xxi)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的平均数量，
(xxii)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差，
(xxiii)来自所有PD-1+细胞的PD-1强度的平均值，
(xxiv)来自所有Lag3+细胞的Lag3强度的最小值，
(xxv)EM+ROI中PD-L1+/EM+细胞的密度，
(xxvi)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的最大数量，
(xxvii)EM+ROI中PD-1+细胞的数量，
(xxviii)EM-ROI中PD-1+/PD-L1–/Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，和
(xxix)来自CD8+/Lag3+细胞的Lag3强度的最大值，
(xxx)EM-ROI中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的数量的比，和
(xxxi)EM+ROI中Lag3阳性细胞的数量。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述特征度量选自由以下项组成的组：
所述EM+ROI或所述肿瘤ROI中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低细胞的最大数量，
PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的平均数量，
CD8+/Lag3+细胞中的Lag3强度的最大值，
PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均数量，和
CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。
12.根据权利要求8所述的方法，其中所述特征向量包括以下每一项：
EM+ROI中PD-L1+细胞的20μm内的CD8+/PD-1低细胞的最大数量，
PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的平均数量，
CD8+/Lag3+细胞中的Lag3强度的最大值，
PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的平均数量，和
CD8+细胞上的Lag3+强度的最大值。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述特征度量选自由以下项组成的组：
EM–区域中Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，
Lag3+/EM–细胞的数量除以所述EM–ROI的面积，
所述EM–ROI中Lag3+细胞的数量，
CD8+细胞中Lag3强度的最大值，
所述EM+ROI中Lag3+细胞的数量，
PD-L1+/EM+细胞的10μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量，
PD-L1+/EM+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量，
PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的方差，
PD-L1+/EM+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的方差，
PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的方差，
PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量，和
PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述ROI来源于所述肿瘤样品的形态学染色的切片的数字图像，其中所述形态学染色的切片和多重亲和组织化学染色的样品为连续切片。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述ROI由使用者在所述形态学染色的切片的数字图像中标识，并且自动地登记在所述多重亲和组织化学染色的切片的数字图像中。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述评分函数来源于选自由以下项组成的组的建模函数：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述评分函数为拟合至所选特征以预测对治疗的应答的QDA模型，并且其中用于拟合所述QDA模型的治疗结果以选自由以下项组成的组的配置组合在一起：
进展性疾病(PD)相对于稳定性疾病(SD)相对于部分应答(PR)+完全应答(CR)；
PD相对于SD+PR+CR；和
PD+SD相对于PR+CR。
18.一种选择待接受PD-1轴导向疗法的患者的方法，所述方法包括：
根据权利要求1至17中任一项所述的方法生成评分，
比较所述评分与预定的截止值，以及
基于所述评分是高于还是低于所述预定的截止值，选择待接受所述PD-1轴疗法或替代疗法的患者。
19.一种用PD-1轴导向疗法治疗患者的方法，所述方法包括：
根据权利要求19所述的方法，选择待接受所述PD-1轴导向疗法的患者；以及
向所述患者施用所述PD-1轴导向疗法。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述PD-1轴导向疗法为PD-1特异性单克隆抗体或PD-L1特异性单克隆抗体。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述PD-1轴导向疗法选自由以下项组成的组：派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、德瓦鲁单抗、西米普利单抗、替雷利珠单抗和LY3300054。
22.一种开发用于预测肿瘤对PD-1轴导向疗法的应答的评分函数的方法，所述方法包括：
(a)获得：
(i)在用所述PD-1轴导向疗法治疗之前，从多个患者获得的肿瘤组织样品的一组数字图像，其中每个患者的至少一个数字图像为以多重亲和组织化学染色针对一种或多种上皮标志物、一种或多种免疫细胞标志物以及一种或多种PD-1轴途径标志物中的每一者而染色的组织切片的数字图像；和
(ii)每个患者的治疗后应答数据；
(b)从多重染色的组织切片的所述数字图像提取多个特征度量，所述多个特征度量选自由表4的特征组成的组；
(c)将特征选择函数应用于所提取的多个特征度量和所述治疗后应答数据，以获得针对与对所述PD-1轴导向疗法的应答的相关性强度的每个特征的排序；
(d)将建模函数应用于排序的特征中的一者或多者和所述治疗后应答数据，以生成多个预测对检查点抑制剂疗法的应答的候选模型，并测试每个候选模型与应答的一致性；以及
(e)选择与所述应答具有最高一致性的候选模型作为所述评分函数。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和上皮标志物(EM)(第1组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，并且所述特征选自由表4左栏中的特征组成的组。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述多重亲和组织化学染色包括使用针对PD-L1、PD1、CD8、LAG3和上皮标志物(EM)(第2组)中的每一者的生物标志物特异性试剂的组织化学染色，并且所述特征选自由表4右栏中的特征组成的组。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述特征选择函数选自由以下项组成的组：集合特征选择方法(包括例如随机森林函数)、过滤方法(包括例如基于互信息的函数(mRMR)/基于相关系数的函数和基于Relief的函数)和/或嵌入特征选择函数(例如弹性网络/最小绝对收缩函数或选择算子(LASSO)函数)。
26.根据权利要求22所述的方法，其中使用由所述特征选择函数识别的前25、前20、前15、前10、前9、前8、前7、前6、前5、前4或前3个特征中的一者或多者来制作所述候选模型。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述候选模型使用在所述特征选择函数的前10个特征中识别的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个特征。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述候选模型包括存在于至少2个特征选择函数的前5个特征中的至少一个特征。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述建模函数选自由以下项组成的组：象限判别分析(QDA)、线性判别分析(LDA)、支持向量机(SVM)和人工神经网络(ANN)。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述评分函数为拟合至所选特征以预测对治疗的应答的QDA模型。
31.根据权利要求30所述的方法，其中用于拟合所述QDA模型的治疗结果以选自由以下项组成的组的配置组合在一起：
进展性疾病(PD)相对于稳定性疾病(SD)相对于部分应答(PR)+完全应答(CR)；
PD相对于SD+PR+CR；和
PD+SD相对于PR+CR。
32.一种方法，所述方法包括：
(a)在肿瘤的测试样品的数字图像上标注所关注区域(ROI)，其中所述数字图像为针对PD-L1、CD8、CD3、CD68和上皮标志物(EM)(第1组)进行多重亲和染色的样品的数字图像；
(b)从所述ROI提取表4左栏的一个或多个特征度量；以及
(c)将根据权利要求29至31中任一项所述的方法获得的评分函数应用于包括(b)的一个或多个特征的特征向量。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述ROI在所述测试样品的第一连续切片的数字图像中标注，其中所述第一连续切片用苏木精和曙红染色，并且其中所述ROI自动登记至所述测试样品的至少第二连续切片的数字图像中，其中所述第二连续切片用第1组染色。
34.一种方法，所述方法包括：
(a)在肿瘤的测试样品的数字图像上标注所关注区域(ROI)，其中所述数字图像为针对PD-L1、PD-1、CD8、LAG3和上皮标志物(第2组)进行多重亲和染色的样品的数字图像；
(b)从所述ROI提取表4右栏的一个或多个特征度量；以及
(c)将根据权利要求29至31中任一项所述的方法获得的评分函数应用于包括(b)的一个或多个特征的特征向量。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述ROI在所述测试样品的第一连续切片的数字图像中识别，其中所述第一连续切片用苏木精和曙红染色，并且其中所述ROI自动登记至所述测试样品的至少第二连续切片的数字图像中，其中所述第二连续切片用第2组染色。
36.一种用于预测患者对PD-1轴疗法的应答的系统，所述系统包括：处理器；以及与所述处理器耦合的存储器，所述存储器用于存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述处理器执行时使所述处理器进行包括根据权利要求1至35中任一项所述的一种或多种方法的操作。
37.根据权利要求36所述的系统，其进一步包括扫描仪或显微镜，所述扫描仪或显微镜适于捕获所述组织样品的切片的数字图像并将所述图像传送至计算机设备。
38.根据权利要求36所述的系统，其中所述系统进一步包括自动载玻片染色器，所述自动载玻片染色器编程为用第1组或第2组对所述组织样品的切片进行组织化学染色。
39.根据权利要求38所述的系统，其中所述系统进一步包括自动苏木精和曙红染色器，所述自动苏木精和曙红染色器编程为对由所述自动载玻片染色器染色的所述切片的一个或多个连续切片进行染色。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的系统，所述系统进一步包括用于跟踪样品和图像工作流程以及诊断信息的实验室信息系统(LIS)，所述LIS包括配置为接收和存储与所述组织样品相关的信息的中央数据库，所述信息包括以下项中的至少一项：待要对所述肿瘤组织样品进行的处理步骤、待要对所述肿瘤组织样品的切片的数字图像进行的处理步骤、所述肿瘤组织样品和数字图像的处理历史记录；以及与所述患者将对所述疗法有应答的可能性相关的一个或多个临床变量(例如MMR或MSI状态)。
41.一种用于存储计算机可执行指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述计算机可执行指令由处理器执行以进行操作，所述操作包括根据权利要求1至35中任一项所述的方法。
42.一种治疗具有肿瘤的患者的方法，所述方法包括鉴定表明所述肿瘤可能对PD-1轴导向疗法有应答的肿瘤特征水平，并向所述患者施用所述PD-1轴导向疗法，其中所述特征选自由以下项组成的组：
(a)间质PD-L1+/CD3+细胞的数量与间质CD3+细胞的总数量之间的比，
(b)间质PD-L1+/CD8+细胞的数量与间质CD8+细胞的总数量之间的比，
(c)间质PD-L1+/CD68+细胞的数量与间质CD68+细胞的总数量之间的比，和
(d)间质PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与间质CD3+CD8–细胞的总数量之间的比
(e)上皮CD8+细胞与最近的PD-L1+/CD68+细胞之间的平均距离，
(f)上皮PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的密度，
(g)上皮PD-L1+/CD3+细胞的数量与上皮CD3+细胞的总数量之间的比，
(h)EM+ROI或肿瘤ROI中上皮PD-L1+/CD8+细胞的数量与EM+ROI或肿瘤ROI中上皮CD8+细胞的总数量之间的比，
(i)ROI中上皮PD-L1+/CD68+细胞的数量与ROI中上皮CD68+细胞的总数量之间的比，
(j)ROI中上皮PD-L1+/CD3+/CD8–细胞的数量与ROI中上皮CD3+/CD8–细胞的总数量之间的比，
(k)EM+ROI或肿瘤ROI中上皮CD3+/CD8–细胞的数量与EM+ROI或肿瘤ROI中上皮CD3+细胞的总数量之间的比，
(l)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+的最大数量，
(m)CD8+细胞PD-L1强度的最大值，
(n)上皮区域中PD-1+/PD-L1–/Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，
(o)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1+细胞的空间方差数，
(p)所有细胞PD-L1强度的最大值，
(q)EM+ROI中Lag3阳性细胞的数量，
(r)EM-ROI中PD-L1+/EM–细胞的密度，
(s)EM+ROI中PD-L1+细胞的数量，
(t)EM-ROI中PD-L1+细胞的数量，
(u)EM-ROI中PD-1+细胞的数量，
(v)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的最大数量，
(w)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的平均数量，
(x)来自CD8+Lag3+细胞的最大值Lag3强度，
(y)EM+ROI中CD8+细胞的数量，
(z)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差，
(aa)从PD-L1+细胞到其最近的PD-1+细胞的平均距离，
(bb)PD-L1+/EM+细胞的20μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的最大数量，
(cc)从PD-L1+细胞到其最近的PD-1+细胞的距离的标准偏差，
(dd)EM+ROI中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的数量的比，
(ee)EM+ROI中PD-L1+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的数量的比，
(ff)PD-L1+细胞10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的平均数量，
(gg)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差，
(hh)来自所有PD-1+细胞的PD-1强度的平均值，
(ii)来自所有Lag3+细胞的Lag3强度的最小值，
(jj)EM+ROI中PD-L1+/EM+细胞的密度，
(kk)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的最大数量，
(ll)EM+ROI中PD-1+细胞的数量，
(mm)EM-ROI中PD-1+/PD-L1–/Lag3+/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，
(nn)来自CD8+/Lag3+细胞的Lag3强度的最大值，
(oo)EM-ROI中Lag3+/CD8+细胞的数量与CD8+细胞的数量的比，和
(pp)EM+ROI中Lag3阳性细胞的数量。
43.一种治疗具有肿瘤的患者的方法，所述方法包括鉴定表明所述肿瘤可能对PD-1轴导向疗法有应答的肿瘤特征水平，并向所述患者施用所述PD-1轴导向疗法，其中所述特征选自由以下项组成的组：
(a)panCK-阴性区域中Lag3+/CD8+细胞与总CD8+细胞的数量的比；
(b)panCK-阴性区域中Lag3–/CD8+细胞与CD8+细胞的数量的比，
(c)Lag3+/panCK–细胞的数量除以panCK-阴性面积，
(d)panCK阴性区域中Lag3阳性细胞的数量，
(e)CD8+细胞中Lag3强度的最大值，
(f)panCK-阳性区域中Lag3+细胞的数量，
(g)PD-L1+/panCK+细胞的10μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量，
(h)PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的平均数量，
(i)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的数量的方差，
(j)PD-L1+/panCK+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的数量的方差，
(k)PD-L1+细胞的10μm半径内的PD-1低/CD8+细胞的数量的方差，
(l)PD-L1+/CD8+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量，和
(m)PD-L1+细胞的20μm半径内的PD-1中/CD8+细胞的最大数量。
CN201980063834.8A 2018-10-01 2019-09-30 用于预测对pd-1轴导向疗法的应答的方法和系统 Pending CN112789684A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862739828P 2018-10-01 2018-10-01
US62/739,828 2018-10-01
US201862742934P 2018-10-09 2018-10-09
US62/742,934 2018-10-09
PCT/US2019/053774 WO2020072348A1 (en) 2018-10-01 2019-09-30 Methods and systems for predicting response to pd-1 axis directed therapeutics

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112789684A true CN112789684A (zh) 2021-05-11

Family

ID=68296689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980063834.8A Pending CN112789684A (zh) 2018-10-01 2019-09-30 用于预测对pd-1轴导向疗法的应答的方法和系统

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210374962A1 (zh)
EP (1) EP3861556A1 (zh)
JP (2) JP7510943B2 (zh)
CN (1) CN112789684A (zh)
WO (1) WO2020072348A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022226284A1 (en) * 2021-04-22 2022-10-27 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Quantifying the tumor-immune ecosystem in non-small cell lung cancer (nsclc) to identify clinical biomarkers of therapy response
CN113933505B (zh) * 2021-12-15 2022-04-05 北京市肿瘤防治研究所 一组多维分析预测胃癌免疫治疗疗效的tiic指标及其应用
WO2023192946A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Ventana Medical Systems, Inc. Methods and systems for predicting response to pd-1 axis directed therapeutics in colorectal tumors with deficient mismatch repair
WO2024035612A1 (en) * 2022-08-08 2024-02-15 Ventana Medical Systems, Inc. System and method for quantification of digitized pathology slides
CN117218139B (zh) * 2023-09-12 2024-05-24 珠海横琴圣澳云智科技有限公司 样本细胞密度的确定方法和装置

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160106836A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Definiens Ag Immunotherapy Using a Logical AND Combination for Immune Response Activation
WO2017079763A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Ventana Medical Systems, Inc. Representative diagnostics
WO2017096248A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 Clearlight Diagnostics Llc Methods for preparing and analyzing tumor tissue samples for detection and monitoring of cancers
US20170285029A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Agilent Technologies, Inc. Immunohistochemistry scoring methods and compositions
WO2017181073A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Creatv Microtech, Inc. Methods of using pd-l1 expression in treatment decisions for cancer therapy
WO2018145023A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Novartis Ag Method of predicting response to immunotherapy

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1564604A (en) 1925-06-12 1925-12-08 Chas S Hodges Water wheel
US5595707A (en) 1990-03-02 1997-01-21 Ventana Medical Systems, Inc. Automated biological reaction apparatus
US6582962B1 (en) 1998-02-27 2003-06-24 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US20030211630A1 (en) 1998-02-27 2003-11-13 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US6296809B1 (en) 1998-02-27 2001-10-02 Ventana Medical Systems, Inc. Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters
US6372937B1 (en) 1998-11-09 2002-04-16 Mark Norman Bobrow Enhanced catalyzed reporter deposition
US6670113B2 (en) 2001-03-30 2003-12-30 Nanoprobes Enzymatic deposition and alteration of metals
DK1636586T3 (da) 2003-06-24 2009-11-23 Ventana Med Syst Inc Enzymkatalyseret metaldeponering til foröget in situ-detektion af immunhistokemisker epitoper og nucleinsyresekvenser
US20050186642A1 (en) 2004-02-24 2005-08-25 Biocare Medical, Inc. Immunoassay reagents and methods of use thereof
CA2842723C (en) 2009-10-19 2016-02-16 Ventana Medical Systems, Inc. Imaging system and techniques
WO2011139978A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Ventana Medical Systems, Inc. Moving meniscus rinsing and mixing in cell staining
JP2013531801A (ja) 2010-07-02 2013-08-08 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 標的検出のためのハプテンコンジュゲート
FR2988549B1 (fr) 2012-03-22 2015-06-26 Bodysens Procede, terminal et casque de communication vocale sans fil avec auto-synchronisation
US8995740B2 (en) 2013-04-17 2015-03-31 General Electric Company System and method for multiplexed biomarker quantitation using single cell segmentation on sequentially stained tissue
EP3053139B1 (en) 2013-10-01 2020-10-21 Ventana Medical Systems, Inc. Line-based image registration and cross-image annotation devices, systems and methods
EP3111224B1 (en) 2014-02-24 2018-12-26 Ventana Medical Systems, Inc. Quinone methide analog signal amplification
WO2016170008A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Ventana Medical Systems, Inc. Inkjet deposition of reagents for histological samples
US20180134771A1 (en) 2015-05-07 2018-05-17 Bioxcel Corporation Novel immunomodulatory therapeutic strategies targeting tumors in cancer
WO2017085307A1 (en) 2015-11-22 2017-05-26 Ventana Medical Systems, Inc. Methods of identifying immune cells in pd-l1 positive tumor tissue
EP3516397A1 (en) 2016-09-23 2019-07-31 Ventana Medical Systems, Inc. Methods and systems for scoring extracellular matrix biomarkers in tumor samples
US20180112277A1 (en) * 2016-10-26 2018-04-26 Expression Pathology, Inc. Signal directed dissection to inform cancer therapy strategy
CN110546277B (zh) 2017-03-01 2024-06-11 豪夫迈·罗氏有限公司 用于癌症的诊断和治疗方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160106836A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 Definiens Ag Immunotherapy Using a Logical AND Combination for Immune Response Activation
WO2017079763A1 (en) * 2015-11-06 2017-05-11 Ventana Medical Systems, Inc. Representative diagnostics
WO2017096248A1 (en) * 2015-12-02 2017-06-08 Clearlight Diagnostics Llc Methods for preparing and analyzing tumor tissue samples for detection and monitoring of cancers
US20170285029A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Agilent Technologies, Inc. Immunohistochemistry scoring methods and compositions
WO2017181073A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Creatv Microtech, Inc. Methods of using pd-l1 expression in treatment decisions for cancer therapy
WO2018145023A1 (en) * 2017-02-06 2018-08-09 Novartis Ag Method of predicting response to immunotherapy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EDWIN R. PARRA等: ""Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues"", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 7, no. 1, 17 October 2017 (2017-10-17), pages 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020072348A1 (en) 2020-04-09
JP2024096691A (ja) 2024-07-17
JP7510943B2 (ja) 2024-07-04
US20210374962A1 (en) 2021-12-02
JP2022513316A (ja) 2022-02-07
EP3861556A1 (en) 2021-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11783478B2 (en) Methods and systems for evaluation of immune cell infiltrate in tumor samples
US20220051804A1 (en) Image Analysis for Breast Cancer Prognosis
JP7510943B2 (ja) Ｐｄ－１軸指向型治療薬に対する応答を予測するための方法およびシステム
Holten-Rossing et al. Optimizing HER2 assessment in breast cancer: application of automated image analysis
JP2019502398A (ja) 自動ダイセクション、次世代シークエンシング、及び自動スライド染色装置を用いる、腫瘍のための予測診断ワークフロー
Lara et al. Quantitative image analysis for tissue biomarker use: a white paper from the digital pathology association
US20190219579A1 (en) Methods and systems for scoring extracellular matrix biomarkers in tumor samples
US20210373024A1 (en) Methods and systems for evaluation of immune cell infiltrate in stage iv colorectal cancer
US20200355688A1 (en) Methods and systems for evaluation of immune cell infiltrate in stage iii colorectal cancer
EP3797296A1 (en) Her2 heterogeneity as a biomarker in cancer
US20230204585A1 (en) Histochemical systems and methods for evaluating egfr and egfr ligand expression in tumor samples
WO2023192946A1 (en) Methods and systems for predicting response to pd-1 axis directed therapeutics in colorectal tumors with deficient mismatch repair
CONGRESS Quantitative Image Analysis for Tissue Biomarkers use: A White Paper From the Digital Pathology Association

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination