CN109416359A - 用于分子成像和/或放射免疫疗法的二聚策略和化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于靶向分子成像和/或靶向药物递送的多价化合物，其中两个组分或靶向分子各自与细胞上的一个或多个生物标记物相互作用。本发明还提供了多官能基螯合剂以组合靶向分子。本发明还提供了体外高通量筛选试验以确定间隔团分子的长度。本发明还涉及用于靶向分子成像和/或靶向药物递送的化合物/探针、试剂盒和方法。

Description

用于分子成像和/或放射免疫疗法的二聚策略和化合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月2日提交的美国临时申请号62/330,622、2016年6月7日提交的美国临时申请号62/346,783和2016年8月10日提交的美国临时申请号62/373,036的优先权，其公开内容通过引用全文纳入本文用于所有目的。
资助信息
本发明是在政府支持下由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号EB017317和EB020737资助完成。政府对本发明拥有一定的权利。
1.介绍
本发明涉及多价分子成像和/或靶向的药物递送方法，其中所述多价分子靶向的不同生物标记物携带成像标签和/或药物。因此，多价分子可以结合至少两个标记物(其可以是相同的或不同的)，从而导致灵敏度增强，特异性增强，结合亲和力增强，Bmax增大，血液潴流延长，信噪比改善和药代动力学性能改善。具体地，多价分子可以在早期和/或当生物标记物数量相对低时对癌症或其他疾病/紊乱成像。本发明还涉及能够用于制备多价分子以及其他二聚体分子的螯合剂，包括将配体与染料分子偶联。本发明的螯合剂提供了在不使用其他化学平台的情况下改善偶联分子的能力。本发明还涉及体外高通量筛选平台，用于优化多价分子中的间隔团。
2.背景技术
单价成像探测的临床实用性常常受限于各种因素，包括受体密度、结合亲和力(affinity)和体内药代动力学。经由多重相互作用改善亲合力(avidity)的多价策略是成像和治疗具有前景的方式。例如，由于相对于单受体(mono-receptor)靶向的策略的若干优势，以同时结合针对两个不同受体的两个连接的配体为特征的异质二价性(hetero-bivalency)已经成为具有前景的靶向策略。首先，异质二价性可以容易地将低亲合力单价配体(Kd～μM)转化成具有高亲和力的配体(Kd～nM)。第二，异质二价性存在单体(或同源二聚体)不存在的新型作用机制，并且第二结合位点可以是低密度、低特异性或甚至是低特异性的受体(如单体蛋白质上的疏水性贴片(patch))。因此，如果两个配体以适当的连接接合，预计将增强特异性摄取。第三，由于大小和亲脂性的改变，异质二聚体可以具有改善的药代动力学性能，特别是在清除性质和排泄率针对其单价对应物没有优化的情况中。然而，因为肿瘤的异质性和复杂的肿瘤微环境，迄今为止的探针在早期显示出对鉴定癌症极为有限的能力。
因此，在本技术领域需要这样的分子成像和/或放射免疫疗法方法，其具有增强的灵敏度，增强的特异性，增强的结合亲和力，升高的Bmax，改善的药代动力学(例如，更长的血液潴留，以及清除性质和排泄率没有针对单价配体优化的情况)，改善的信噪比，以及生成待用于分子成像和方式免疫疗法的多聚体的改进方法。
这类方法的一个示例是如本文所公开的用于分子成像和疗法的多价性。广泛地认识是间隔团的长度将在多聚体中显著地影响二价的亲合力。生成多价化合物的传统策略包括制备具有介于配体之间各种长度间隔团的类似物，然后进行对应的体外和/或体内测试以寻找间隔团最合适的长度。然而，该策略涉及漫长而昂贵的合成工作。在一些情况中，合适间隔团的长度可由计算机模型研究预测到，但是该策略受限于两个靶向的受体彼此之间相互作用的情况，同时该预测可能是错误的。因此，存在对于用于生成具有介于多价化合物配体之间适当间隔的多价化合物的改进方法的需求。
3.发明内容
本发明涉及化合物、试剂盒和方法，用于靶向的分子成像和/或疗法。在其最广的范围内，本发明涉及与感兴趣的细胞、组织或结构的生物标记物相互作用的两个组分或分子。这是基于(至少部分基于)这样的发现：靶向细胞(例如肿瘤细胞)的至少两个生物标记物将增强成像标签和/或活性剂的灵敏度和/或特异性，并且还改善分子的药代动力学性质。本发明还涉及靶向的分子成像和/或靶向的药物递送的方法。
本发明提供了用于分子成像的化合物、组合物、方法和试剂盒。在某些非限制性实施方式中，分子成像多价化合物包含：至少一个第一靶向分子，其与至少一个生物标记物结合和/或相互作用；至少一个第二靶向分子，其与至少一个其他生物标记物结合和/或相互作用；和一个可检测标签。在某些实施方式中，化合物可以具有超过一个可检测标签。
在某些非限制实施方式中，分子成像多峰和/或多价化合物包含：至少一个靶向分子，其与至少一个生物标记物结合和/或相互作用；至少一个第一可检测标签；和至少一个第二可检测标签。
在某些非限制性实施方式中，可检测标签是成像标签。在某些非限制性实施方式中，成像标签可以是但不限于选自下述的同位素：64Cu、68Ga、18F、89Zr、111In、Al18F或99mTc。在某些非限制性实施方式中，可检测标签是染料分子。在某些非限制性实施方式中，染料分子可以是但不限于花青素、FluoProbe或DyLight Fluor染料。
本发明提供了用于靶向药物递送的化合物、组合物、方法和试剂盒。在某些非限制性实施方式中，靶向的药物递送多价化合物包含：至少一个第一靶向分子，其与至少一个生物标记物结合和/或相互作用；至少一个第二靶向分子，其与至少一个其他生物标记物结合和/或相互作用；和至少一个活性剂。
在某些非限制性实施方式中，活性剂可以是但不限于蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒、药物或放射性药物。在某些非限制性实施方式中，放射性药物可以包含67Cu、177Lu、90Y、131I、212Bi、211At、225Ac、188Re或111In。药物(可以任选地纳入放射性同位素)的非限制性示例包括抗癌剂，抗感染剂，抗增殖剂，包括增强或减少免疫应答的试剂的调节免疫应答的试剂，抗血栓剂等。在某些非限制性实施方式中，小分子可以是但不限于多柔比星、紫杉醇或氟尿嘧啶。
在某些非限制实施方式中，多价化合物的第一靶向分子和/或第二靶向分子结合感兴趣的生物对象的至少一个生物标记物。在某些非限制性实施方式中，第一靶向分子和/或第二靶向分子可以各自独立地是，但不限于，蛋白质、抗体、肽、小分子、纳米颗粒、多糖或多核苷酸。在某些非限制性实施方式中，第一靶向分子和/或第二靶向分子可以是内在化的或非内在化的。
在某些非限制实施方式中，第一和第二靶向分子以感兴趣的生物对象的相同或不同的生物标记物为靶向。在某些非限制性实施方式中，如果第一和第二靶向分子结合两个不同的生物标记物，那么生物标记物在相同的生物对象上表达。在某些非限制性实施方式中，感兴趣的生物对象可以是，但不限于，细胞。在某些非限制性实施方式中，感兴趣的生物对象可以是，但不限于感兴趣的细胞、组织或结构，例如，肿瘤或癌症细胞。在某些非限制实施方式中，生物标记物可以在细胞的表面或内部表达。在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是，但不限于细胞表面蛋白。在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是，但不限于，整联蛋白。在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是，但不限于CD13和/或整联蛋白αvβ3。在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是，但不限于，uPAR和/或整联蛋白αvβ3。
在某些非限制性实施方式中，靶向分子可以是，但不限于，CD13靶向分子。在某些非限制性实施方式中，CD13靶向分子可以是，但不限于，包含Asn-Gly-Arg(NGR)基序的肽。在某些非限制性实施方式中，CD13靶向分子可以是肽，诸如，但不限于，环(cNGRc)、环(cPNGRc)、环(NGRyK)、线性cNGRc或线性cPNGRc。在某些非限制性实施方式中，靶向分子可以是，但不限于，整联蛋白αvβ3靶向分子。在某些非限制性实施方式中，整联蛋白αvβ3靶向分子可以是但不限于具有暴露的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽基序的蛋白质。在某些非限制性实施方式中，整联蛋白αvβ3靶向分子可以是肽，诸如但不限于环(RGDyK)或环(RADyK)。在某些非限制性实施方式中，靶向分子可以是，但不限于，uPAR靶向分子。在某些非限制性实施方式中，uPAR靶向分子可以是，但不限于，uPA、ATF(尿激酶的氨基末端片段)、AE105或AE105mut。
在某些非限制性实施方式中，至少一个第一靶向分子和至少一个第二靶向分子可以经由间隔团(例如，聚合物)连接。在某些非限制性实施方式中，至少一个第一靶向分子和至少一个第二靶向分子可以经由螯合剂连接。在某些非限制性实施方式中，至少一个第一靶向分子和至少一个第二靶向分子经由间隔团(例如，聚合物)连接螯合剂。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括多官能基螯合剂。在某些非限制实施方式中，螯合剂组合羧酸或活性酯基团成为酰胺键连接，适合点击化学的叠氮基团，和螯合核心。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括基于1,4,7-三氮杂环壬烷(triazacyclonenonane)(TACN)的螯合剂。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括NOTA、DOTA、L-NETA、N3-NOtB2或N3-DOtB3。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合一个靶向分子(例如，第一或第二靶向分子中的任一个)成为单体。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合两个相同的靶向分子(例如，第一或第二靶向分子中的任意两个)成为同源二聚体。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合两个不同的靶向分子(例如，第一或第二靶向分子)成为异质二聚体。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合一个靶向分子(例如，第一或第二靶向分子中的任一个)和一个染料分子成为多峰性(multimodality)。
在某些非限制性实施方式中，本公开的化合物可以用于这样的方法中，所述方法在需要这样处理的对象中对感兴趣的细胞、组织或结构进行成像，例如患有疾病或紊乱、处于患疾病或紊乱风险或正筛选/测试紊乱的疾病的对象，其中所述对象按照本发明被给予化合物。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了体外高通量筛选平台，用于优化多价化合物靶向分子之间间隔团的长度。在某些非限制实施方式中，所述方法将点击化学与放射性化学进行组合以优化间隔团长度。在某些非限制性实施方式中，经由现场形成多价化合物，细胞可以用作筛选平台。在某些非限制性实施方式中，可以分别用反应基团和光不稳定(即可光引发(photo-triggerable))基团将多价化合物的靶向分子功能化。在某些非限制性实施方式中，体外高通量筛选平台包括：将细胞暴露于第一功能化靶向分子和第二功能化靶向分子，其中功能化靶向分子中的至少一个可以连接不同长度的间隔团，并且至少一个其他组的功能化靶向分子以固定长度连接间隔团。在某些非限制性实施方式中，用允许第一功能化靶向分子的间隔团结合第二功能化靶向分子的价格自的官能团将靶向分子功能化。在某些非限制实施方式中，至少一个官能团通过光子能量激活，以允许与其他功能化基团的结合。在某些非限制实施方式中，可以添加放射性金属标签标记的反应基团，以结合功能化靶向分子的至少一个群，所述功能化靶向分子没有经其间隔团与另一功能化靶向分子结合。在某些非限制实施方式中，放射性金属(例如，68Ga、64Cu、Al18F、177Lu、111In和89Zr)标签标记的反应基团经测量以确定怎样的间隔团长度导致两个功能化靶向分子群之间最多的结合。
本发明还提供了用于靶向的医疗成像和/或靶向的药物递送的试剂盒。在某些非限制实施方式中，试剂盒包括至少一个多价化合物，其包括至少一个第一靶向分子，至少一个第二靶向分子和至少一个可检测标签和/或活性剂。在某些非限制实施方式中，试剂盒包括至少一个化合物，其包括一个靶向分子和至少一个可检测标签或活性剂。在某些非限制性实施方式中，试剂盒包括这样的螯合剂，其可以连接于至少一个第一靶向分子和至少一个第二靶向分子。在某些非限制性实施方式中，试剂盒包括酱紫(例如，聚合物)，用于将至少一个第一靶向分子和至少一个第二靶向分子彼此连接或连接螯合剂。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括多官能基螯合剂。在某些非限制实施方式中，试剂盒包含使用试剂盒的说明书。
4.附图简要说明
图1：本发明多价化合物的非限制性示意图。
图2：生成本发明多价化合物的非限制性示意图。
图3：本发明高通量筛选平台的非限制性示意图。
图4：AE105-NOTA-RGD的结构。
图5：放射性标记探针的代表性HPLC结果。
图6：AE105-NODAGA和RGD-NODAGA的结构。
图7：放射性-HPLC结果，其显示将探针在血清中孵育1天后无显著的64Cu-解离。
图8：AE105-PEG4-DOTA-PEG4-RGD的结构。
图9：使用AE105-NOTA-NHCO-Cy3(A)和阻断物(B)的87MG细胞染色。
图10：AE105-NOTA-RGD、AE105-NODAGA和RGD-NODAGA的细胞摄取试验。
图11：注射64CU标签标记的AE105-NOTA-RGD化合物1小时和4小时后，具有人U87MG肿瘤细胞的小鼠的PET成像。
图12：1小时和4小时注射后，64Cu标签标记的异质二聚体和单体之间的PET成像的比较
图13：64Cu标签标记的AE105-NOTA-RGD化合物的离体生物分布，和摄取的肿瘤与非肿瘤的比例。
图14：注射CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体、(68Ga)NOTA(CNGRC)或(68Ga)NOTA(RGDyK)后，具有人bxpc3和4T1肿瘤细胞的小鼠的PET成像。
图15A-15C：原位异种移植小鼠模型中的PET成像。图15A提供了CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体注射后的PET成像。图15B提供了RGD单体注射后的PET成像。图15C提供了NGR单体注射后的PET成像。
图16A-16D：遗传工程改造的小鼠(GEM)模型中的PET成像。图16A提供了CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体注射后的PET成像。图16B提供了18F-FDG注射后的PET成像。图16C提供了RGD单体注射后的PET成像。图16D提供了NGR单体注射后的PET成像。
图17：说明根据本发明的体外筛选平台工作原理的示意图。
图18A-18D：RGD官能化的HPLC监测。图18A显示了RGD的HPLC。图18B显示了光-ODIBO-PEG4-NHS的HPLC。图18C显示了实施例13的反应混合物30分钟后的HPLC。图18D显示了实施例13的反应混合物添加PBS并过夜孵育后的HPLC。
图19：经由研发的平台体外筛选选定的间隔团。(*，P<0.05；**，P<0.01)。
图20A-20B：细胞摄取和流出研究。图20A提供了对根据实施例13具有各种间隔团的异质二聚体的细胞摄取研究的结果。图20B提供了对根据实施例13具有各种间隔团的异质二聚体的细胞流出研究的结果。
图21：使用Ga68标签标记的异质二聚体对u87MG肿瘤进行PET成像，所述Ga68标签标记的异质二聚体具有与选择用于体外筛选的间隔团相同长度的间隔团。
图22：基于PET成像的ROI定量。(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
5.发明详述
本发明涉及用于靶向的分子成像和/或疗法的化合物、试剂盒和方法，其中靶向分子与生物对象上对应的生物标记物相互作用。在某些非限制性实施方式中，生物对象是感兴趣的正常或患病或退化的细胞、组织或其他结构。在某些非限制性实施方式中，生物对象是肿瘤或癌症细胞。本发明还涉及化合物/组合物/分子/螯合剂和试剂盒，用于靶向的分子成像和/或疗法。本发明还涉及体外高通量筛选方法，用于鉴定对多价靶向的分子成像和/或疗法化合物适当的间隔团长度。
在某些非限制实施方式中，公开的靶向的分子成像和/或靶向的药物递送方法能延长快速清除可检测标签和/或活性剂的潴留，因此将显著增加细胞摄取。在某些非限制性实施方式中，公开的方法提供了增强的灵敏度和/或增强的特异性。例如，公开的方法可以将低亲合力单价靶向分子(～μM)转化成具有高亲合力(～nM)的一个。在某些实施方式中，公开的靶向的细胞成像和/或靶向的药物递送方法可以广泛地应用于各种双/多重生物标记物组合和靶标(例如，肿瘤和癌症)。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物，其更加紧密地结合感兴趣的细胞(例如，肿瘤或癌症细胞)，而这导致更少的非特异性结合和更少的假阳性结果。更紧密结合的靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物可以导致更少量的化合物由感兴趣的生物对象分离。在某些非限制的实施方式中，更紧密结合的化合物增加了细胞的更新和/或降低非靶向细胞的摄取。举例而非限制性地，在肿瘤细胞的情况中，实现高亲合力可以显著增强对同时过表达两个靶向的生物标记物的肿瘤的结合亲和力，但是不增加对仅表达两个靶向的生物标记物中的一个(或都不表达)的非肿瘤组织的结合亲和力，因此，肿瘤/非肿瘤比将显著增加。在某些非限制性实施方式中，通过由于总结合位点增加而增加靶向分子的局部浓度以及通过由于药代动力学(如清除性质和排泄率)改善而增加靶向分子的循环时间，本发明的方法提供了较高的临床转化潜能，因为纳入放射性/药物分子的靶向配体/分子可以在感兴趣的位点累积，从而增加摄取。例如，靶向的受体的密度可以通过以互补细胞表面受体的适当组合为靶向来增加。在某些非限制性实施方式中，由于大小和亲脂性的改变，多聚体还可以具有改善的药代动力学性能。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了用于将靶向分子与相同的靶向分子中的至少一个、至少一个不同的靶向分子和/或染料分子组合的螯合剂，。在某些非限制性实施方式中，螯合剂能够偶联至少两个靶向分子。在某些非限制性实施方式中，螯合剂能够参与固相肽合成。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以简化开发靶向的单体、同源二聚体、异质二聚体和多峰性作为诊断示踪剂和/或放射治疗剂。
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了体外高通量筛选平台，用于优化多聚物靶向分子之间间隔团的长度。在某些非限制性实施方式中，体外高通量筛选平台为敏感试验，其对各测试能够利用以nM范围的靶向分子。
在某些非限制实施方式中，所述方法将点击化学与放射性化学组合以优化间隔团长度。在某些非限制性实施方式中，经由现场(即体外)形成多聚物(例如，异质二聚体)，细胞可以用作筛选平台。在某些非限制性实施方式中，可以分别用反应基团(例如，可点击基团(clickable group))和光不稳定基团(例如，可点击基团)将多聚物的靶向分子功能化。
本文所用术语“生物标记物”表示这样的标志物(例如，包括但不限于蛋白质，包括单体和多聚体蛋白质，糖蛋白，脂蛋白等，碳水化合物，脂质，核酸及其组合)，所述标志物能够在个体中检测疾病或紊乱，包括检测处于其早期的疾病或紊乱。疾病或紊乱包括但不限于增殖的紊乱，包括但不限于癌性(cancersl)自身免疫病症，退化性病症，血管疾病，神经性疾病和传染病；本领域已知与人和非人动物中的许多疾病和紊乱相关的生物标记物。在某些非限制性实施方式中，生物标志物的存在或缺失通过成像确定。在某些非限制性实施方式中，对象的生物样品中生物标志物的存在或缺失与参照对照比较。
术语“活性剂”表示当给予对象时能够具有生理作用的试剂。在某些非限制性实施方式中，术语“活性剂”表示蛋白质、肽、小分子或放射性药物。在某些非限制性实施方式中，活性剂是化疗剂。在某些非限制性实施方式中，活性剂是免疫疗法试剂。
本文所用术语“治疗有效量”表示足够治疗、预防或管理疾病的活性剂的量。此外，对于本公开的第二靶向探针的治疗有效量可以指代单独的活性剂的量，或在与其他疗法的组合，其在疾病的治疗或管理中提供治疗益处，这可以包括降低疾病组装的严重程度，增加无疾病症状周期的频率和持续时间，或预防由于病痛引起的损伤或失能。该术语可涵盖这样的量，其改善全体治疗，降低或避免不需要的作用，或者增强其它治疗剂疗效或增强与其它治疗剂的协同作用。
本文所用术语“生物对象”表示但不限于蛋白质、病毒、细胞、组织、器官或生物体。在某些非限制性实施方式中，生物对象是正常或患病或变性或感染的细胞、组织或其他结构。在某些非限制性实施方式中，细胞可以是肿瘤或癌症细胞。
本文所用术语“官能化”表示修饰存在的分子区段以引入新的官能团，所述官能团能够与另一官能团(例如，叠氮化物)进行反应。
例如，除非另行定义，本文所公开的范围“约X和约Y之间”包括约X和月Y以及X和Y的范围界限。
为了清楚说明而非限制本公开，将本发明分为以下小章节详细描述。
(i)靶向的分子成像和/或药物递送化合物和使用方法；
(ii)用于制备所述靶向的分子成像和/或药物递送化合物的方法和螯合剂；
(iii)用于优化多聚物靶向分子之间间隔团长度的高通量筛选平台；
(iv)生物标记物；以及
(v)试剂盒。
5.1.靶向的分子成像和/或药物递送化合物和使用方法
本发明提供了靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物。在某些非限制实施方式中，本发明提供了两个组分或靶向分子各自与至少一个生物标记物(例如，在细胞上)相互作用。
5.1.1.靶向分子
本发明提供了靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物，其具有至少一个第一靶向分子。在某些非限制性实施方式中，本发明提供了靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物，其具有至少一个第一靶向分子和至少一个第二靶向分子。在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物可以具有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或至少五个涉及相同或不同生物标记物的不同的靶向分子。在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物可以具有至少一个、两个、三个、四个、五个或更多个靶向分子。在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物可以具有的各靶向分子超过一个。
在某些非限制性实施方式中，靶向分子可以是与生物标记物结合的抗体、蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒、多糖或多核苷酸。在某些非限制性实施方式中，靶向分子是活性剂。在某些非限制性实施方式中，靶向分子可以是内在化的或非内在化的。
在某些非限制性实施方式中，靶向分子可以是蛋白质。在某些非限制性实施方式中，第一靶向探针是抗体。本文所用术语“抗体”包括但不限于抗体、抗体衍生物，由其衍生的有机化合物，单克隆抗体，抗体片段，经修饰的抗体，单链抗体和其片段和小抗体(miniantibody)，双特异性抗体，双抗体(diabody)，三抗体(triabody)，或其二聚体、寡聚体或多聚体。在某些非限制性实施方式横纵，经修饰的抗体包括合成抗体，嵌合或人源化抗体或其混合物，或部分或完全缺少恒定区抗体片段，例如，Fv、Fab、Fab′或F(ab)′2等。在某些非限制性实施方式中，抗体是单克隆抗体。
在某些非限制性实施方式中，靶向分子市售可得。在某些非限制性实施方式中，可以针对特异性生物标记物通过本领域技术人员所理解的任何技术生产靶向分子。
在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像化合物包括一个或两个可检测标签。在某些非限制性实施方式中，可检测标签是成像标签和/或治疗探针。
在某些非限制实施方式中，成像标签可以是但不限于110In、111In、177Lu、52Fe、62Cu、64Cu、32P、11C、13N、15O、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、18F、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr和其他γ-、β-或正电子-发射体。在某些非限制性实施方式中，治疗探针为治疗放射性同位素，诸如但不限于67Cu、177Lu、90Y、131I、212Bi、211At或225Ac。在某些非限制性实施方式中，治疗探针可以是抗癌药物，诸如多柔比星、紫杉醇或氟尿嘧啶等。
在某些非限制性实施方式中，靶向的药物递送化合物包括一个或两个活性剂。在某些非限制性实施方式中，活性剂可以是但不限于蛋白质、肽、小分子、肽核酸(PNA)或放射性药物。
在某些非限制性实施方式中，可检测标签是染料分子。在某些非限制性实施方式中，化合物可以具有超过一个染料分子。在某些实施方式中，染料分子连接一种类型的靶向分子(一种类型的一个或多个)。在某些非限制性实施方式中，染料分子连接至少两种类型的靶向分子(各种类型至少一个)。在某些非限制实施方式中，染料分子可以是但不限于花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、Cy5.5、Cy7.5)、GFP、钙黄绿素、FITC、FluorX、Alexa染料、若丹明染料、5-FAM、俄勒冈绿、德克萨斯红。
在某些非限制性实施方式中，活性剂可以是但不限于曲妥珠单抗、T-DM1、拉帕替尼泊、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、吉非替尼、阿法替尼、达克替尼、KD-019埃罗替尼、顺铂，卡铂，吉西他滨，培美曲塞，伊立替康，5-氟尿嘧啶，紫杉醇，多西他赛或卡培他滨。在某些非限制性实施方式中，放射性药物可以是111In-替伊莫单抗、90Y-替伊莫单抗、131I-托西莫单抗、131I-拉贝珠单抗、131I-利妥昔单抗、212Pb-曲妥珠单抗、131I-曲妥珠单抗、111In-曲妥珠单抗、188Re-曲妥珠单抗。
如下表1提供了结合特异性生物标记物的靶向分子(即第一靶向分子和/或第二靶向分子)的非限制性示例。
表1：靶向分子的示例
在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物包括至少一个第一靶向分子，至少一个第二靶向分子，和可检测标签和/或活性剂。在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物包括第一靶向分子，第二靶向分子，和可检测标签和/或活性剂。在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像化合物包括第一靶向分子，第二靶向分子，可检测标签，和任选地活性剂。在某些非限制性实施方式中，第一靶向分子和第二靶向分子可以是蛋白质。在某些非限制性实施方式中，可检测标签可以是成像标签。在某些非限制性实施方式中，可检测标签可以是64Cu、68Ga或18F。在某些非限制性实施方式中，第一靶向分子可以是但不限于uPAR靶向分子。在某些非限制性实施方式中，uPAR靶向分子可以是但不限于uPA、ATF(尿激酶的氨基末端片段)、AE105或AE105mut。在某些非限制性实施方式中，第一靶向分子可以是但不限于CD13靶向分子。在某些非限制性实施方式中，CD13靶向分子可以是但不限于包含Asn-Gly-Arg(NGR)基序的肽。在某些非限制性实施方式中，CD13靶向分子可以是肽，诸如但不限于环(cNGRc)、环(cPNGRc)、环(NRGyK)、线性cNGRc或线性cPNGRc。在某些非限制性实施方式中，第二靶向分子可以是但不限于整联蛋白αvβ3靶向分子。在某些非限制性实施方式中，整联蛋白αvβ3靶向分子可以是但不限于具有暴露的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽基序或精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(RAD)序列的蛋白质。在某些非限制性实施方式中，整联蛋白αvβ3靶向分子可以是肽，诸如但不限于环(RGDyK)(RGD)或环(RADyK)(RAD)。在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是但不限于CD13和/或整联蛋白αvβ3(参见例如图1)。在某些非限制性实施方式中，生物标志物可以是但不限于uPAR和/或整联蛋白αvβ3。
在某些实施方式中，本发明提供了上述化合物在需要这样处理的对象中对感兴趣的细胞、组织或结构进行成像的方法中的用途，例如患有疾病或紊乱、处于患疾病或紊乱风险或正筛选/测试紊乱的疾病的对象。按照这样的方法，想对象给予有效量的至少一个第一靶向分子和可检测标签。在相关实施方式中，还可以向所述对象对于第二靶向剂和螯合剂化合物，如上所述。例如，所述方法可以用于诊断对象中的肿瘤、感染、退化性病症等。在某些实施方式中，所述方法可以用于确定疾病的传播，例如，器官或结构(例如，骨骼)中肿瘤转移或入侵的存在与否。
5.1.2.活性剂递送
在某些非限制性实施方式中，向对象提供治疗有效量的本发明的靶向的药物递送化合物。在某些实施方式中，本发明提供了治疗疾病的方法，诸如但不限于癌症、充血性心力衰竭、糖尿病、哮喘、肺气肿、梗塞、缺血、动脉硬化、毒性、精神疾病、抑郁或心律失常。本领域技术人员可以选择适当的生物标记物以使活性剂靶向疾病细胞。
因此，在某些实施方式中，本发明提供了上述化合物用于治疗对象的或对象中感兴趣细胞、组织或结构的疾病或紊乱的用途，包括向对象给予有效量的至少一个靶向分子和可检测标签。在相关实施方式中，还可以向所述对象对于第二靶向剂和螯合剂化合物，如上所述。
在某些非限制性实施方式中，对象包括任何人或非人动物。在某些非限制性实施方式中，对象为儿科患者。在某些非限制性实施方式中，对象为儿科患者。在某些非限制性实施方式中，非人动物包括但不限于所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、啮齿动物、兔、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
在某些非限制性实施方式中，靶向的分子成像化合物可以通过但不限于下述方式给予：注射(静脉、皮下、腹腔内)、输注、吸入、口服、局部、肠外、经皮、直肠或经由植入的储库(reservoir)。
5.1.3.分子成像
在某些非限制性实施方式中，给予靶向的分子成像化合物后，对对象进行成像。在某些非限制性实施方式中，成像可以通过正电子成象术(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、平面γ相机、X射线CT、平面X射线、磁共振成象(MRI)、光学成像仪或其他诊断成像技术进行。
在某些非限制性实施方式中，对象包括任何人或非人动物。在某些非限制性实施方式中，对象为儿科患者。在某些非限制性实施方式中，对象为儿科患者。在某些非限制性实施方式中，非人动物包括但不限于所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长动物、绵羊、狗、猫、啮齿动物、兔、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
靶向的分子成像化合物可以通过与靶向的药物递送化合物所公开的相同途径给予。
5.2用于制备靶向的分子成像和/或药物递送化合物的方法和螯合剂
本发明提供了靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物。在某些非限制实施方式中，本发明提供了两个组分或靶向分子各自与至少一个生物标记物(例如，在细胞上)相互作用。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以用于连接靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物的各种部分。例如，螯合剂可以将各种靶向分子连接在一起(参见图2的示例)。在某些非限制性实施方式中，螯合剂还可以连接可检测标签、染料分子和/或活性剂到至少一个靶向分子。在某些非限制性实施方式中，螯合剂还可以连接可检测标签、染料分子和/或活性剂至至少两个靶向分子。
在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合一个靶向分子。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合两个靶向分子。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合超过一个相同的靶向分子。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合超过一种类型的靶向分子。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合两种类型的靶向分子。
在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合一个靶向分子(例如，第一或第二靶向分子中的任一个)成为单体。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合两个相同的靶向分子(例如，第一或第二靶向分子中的任意两个)成为同源二聚体。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合两个不同的靶向分子(例如，第一或第二靶向分子)成为异质二聚体。在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以结合一个靶向分子(例如，第一或第二靶向分子中的任一个)和一个染料分子成为多峰性(multimodality)。
在某些非限制性实施方式中，螯合剂可以经由间隔团连接一个或多个靶向分子。在某些非限制性实施方式中，间隔团可以是聚合物或生物分子。在某些非限制性实施方式中，聚合物可以是合成的或天然的。在某些非限制性实施方式中，聚合物可以是聚乙二醇(PEG)。例如，聚合物可以具有这样的分子量：介于约5和40Da之间，约40Da，上至约100Da，上至约200Da，上至约300Da，上至约400Da，上至约1,000Da，上至约10,000Da，上至约25,000Da，上至约30,000Da，上至约35,000Da或上至约Da 40,000，或对于其他示例，从约40Da至约100,000Da，从约40Da至约5,000Da，从约40Da至约10,000Da，从约40Da至约25,000Da，从约1,000Da至约25,000Da，从约200Da至约100,000Da，从约10,000Da至约100,000Da，从约25,000至约100,000Da或从约25,000Da至约50,000Da。对于其他示例，聚合物可以是聚丙烯酸；羟乙基淀粉(HES)；聚丙交酯-共-乙交酯；聚-D，L-对二噁烷酮聚乳酸-乙二醇嵌段共聚物(PLA-DX-PEG)；聚(邻)酯；聚谷氨酸酯；聚天冬氨酸酯；α-β-不饱和单体，如(甲基)丙烯酸，巴豆酸，马来酸，马来酸酐，富马酸，衣康酸或酸酐等的聚合物；包含乙烯基醚，乙烯基酯，乙烯基胺酰胺，烯烃，己二烯二烷基卤化铵的共聚单体，优选乙烯基醚；聚(二甘醇己二酸酯)；聚乙烯亚胺；聚乙交酯；聚脲；聚柠檬烯(或Polylimo)；聚(2-甲基-1,3-丙烯己二酸酯)；接枝聚合物；具有其他聚合物的接枝(嵌段)聚合物。在某些非限制性实施方式中，聚合物可以为直链、支链或树突状(dendrimic)。
在某些非限制性实施方式中，聚合物是PEG。在某些非限制性实施方式中，PEG间隔团可以具有约44Da至20kDa的分子量。在某些非限制性实施方式中，PEG间隔团可以包含非PEG部分和/或非PEG单体。
在某些非限制性实施方式中，间隔团可以包含约2个至约30个单体。在某些非限制性实施方式中，间隔团可以包含约2至约20，约2至约10，约4至约10，约4至约9，约4至约8，约4至约7，约4至约6，约4至约5个单体。在某些非限制性实施方式中，间隔团可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少55、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个单体。在某些非限制性实施方式中，间隔团可包含约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30个单体。
在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括具有通式I的多官能基螯合剂：
(n＝0至10，优选n＝0或1)，
其中，螯合核心基团选自：NOTA、NETA、CB-TE2A、CB-TE1A1P、TETA、Pycu2A、DiAmSar、DOTA、DTPA、PCTA、DFO等。
在某些实施方式中，螯合核心是可以协调某些金属离子并形成稳定螯合物的基团。螯合核心是络合放射性金属的关键基团。在某些非限制实施方式中，螯合剂组合羧酸或活性酯基团成为酰胺键连接，和适合基于叠氮化物-炔烃的点击化学的叠氮基团，还有可以与放射性同位素如64Cu、68Ga、Al18F等协调的螯合核心。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括基于1,4,7-三氮杂环壬烷(triazacyclonenonane)(TACN)的螯合剂。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷(cyclen)的螯合剂。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括基于1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷的螯合剂。在某些非限制性实施方式中，螯合剂包括NOTA、DOTA、L-NETA、N3-NOtB2或N3-DOtB3。实施例1和2提供了根据本发明的样品合成方案。
除了金属螯核心，所公开的螯合剂可以含有两个生物正交(bioorthogonal)官能团：分别通过辅助的酰胺形成连接第一靶向分子和通过点击化学连接第二靶向分子(或可检测标记，或活性剂)的羧酸基团和叠氮基团。相较于仅含有一个官能团的其他分子螯合剂，这些新开发的双功能螯合剂(BFC)显示了若干优势。首先，由于使用了同时作为螯合剂和间隔物的BFC，合成策略可以更直接；因此，不需要大量保护和/或去保护和/或多功能间隔物制备。其次，不需要条件优化，因为反应(SPPS和点击反应)以几乎定量产率可以容易地完成，这有利于制备的容易性。SPPS和点击反应的最大利用允许仅使用一个色谱纯化步骤来获得纯化的成像探针。最后，这是一种通用且稳健的平台，其可用于制备含有任何感兴趣的配体，染料和其他功能性部分的多价和多峰成像探针，不限于此处举例说明的那些。
在某些非限制性所述方法中，通过使用常用还原剂如PPh还原叠氮化物至酰胺基团,螯合剂可以经修饰以适合用于固相肽合成(SPPS).SPPS基于羧酸和氨基基团之间的酰胺形成反应。叠氮化物的还原为后续氨基酸偶联提供了氨基基团。因此，由于氨基基团，螯合剂与SPPS系统兼容。在某些非限制性实施方式中，树脂上叠氮基团还原为酰胺基团后，可以使用自动肽合成来简化合成过程。自动肽合成以与SPPS相同的原理工作，这可以节约时间和效力。
在某些非限制性实施方式中，可以通过将活性侧臂(含有叠氮基团和羧酸或酯基团两者)与螯合核心经亲核取代反应偶联来合成螯合剂。
在某些非限制性实施方式中，可检测标签可以通过用放射性核素孵育螯合剂连接。在某些非限制实施方式中，通过使螯合剂与染料经由点击化学、酯化反应、酰胺化反应或其他偶联反应可以连接第二可检测标签。
在某些非限制实施方式中，通过使螯合剂与活性剂经由点击化学、酯化反应、酰胺化反应或其他偶联反应可以添加活性剂。
5.2.用于优化多聚物靶向分子之间间隔团长度的高通量筛选平台
在某些非限制性实施方式中，本发明提供了体外高通量筛选平台，用于优化成像和/或靶向的药物递送化合物的靶向分子之间间隔团的长度。在某些非限制性实施方式中，体外高通量筛选平台为敏感试验，其对各测试仅利用以nM范围的靶向分子。使用较少的靶向分子可以降低筛选试验的成本。在某些非限制性实施方式中，本发明提供了仅包括一到两个步骤的反应。图3是本发明体外高通量筛选试验的非限制性示例。
在某些非限制实施方式中，所述方法将点击化学与放射性化学组合以优化间隔团长度。在某些非限制性实施方式中，经由现场形成靶向的分子成像和/或靶向实施方式药物递送化合物，细胞可以用作筛选平台。在某些非限制性实施方式中，可以分别用未激活的光不稳定官能团(即，可光引发官能团)或一旦被光子生成源激活后就结合光不稳定官能团的反应官能团将靶向的分子成像和/或靶向的药物递送化合物的靶向分子功能化。
在某些非限制性实施方式中，高通量筛选平台包括将细胞暴露于第一功能化靶向分子和第二功能化靶向分子，其中第一功能化靶向分子和/或第二功能化靶向分子包含介于靶向分子和反应官能团之间不同长度的间隔团。在某些非限制性实施方式中，第一功能化靶向分子和第二功能化靶向分子中任一个包含介于靶向分子和反应官能团之间固定长度的间隔团。
在某些非限制实施方式中，细胞暴露于光子能量以将未激活的光不稳定官能团激活，这将允许两个靶向分子经由其各自的间隔团连接。在某些非限制性实施方式中，该试验可以用过量的放射性金属标签标记的螯合剂淬灭，所述放射性金属标签标记的螯合剂能够结合未被结合的活化的光不稳定官能团。在某些非限制性实施方式中，可以测量结合的放射性金属标签标记的螯合剂量。在某些非限制实施方式中，测量的放射性降低指示间隔团长度是合适的或经优化的。
在某些非限制实施方式中，第一功能化靶向分子包含光不稳定官能团。在某些非限制性实施方式中，光不稳定官能团可以是但不限于光-OIDBO或光-四唑(tertrazole)。
在某些非限制性实施方式中，第二功能化靶向分子包含这样的反应官能团，一旦光不稳定官能团已经暴露于光子能量，所述反应官能团仅结合光不稳定官能团。在某些非限制性实施方式中，第二功能化靶向分子的反应官能团可以是但不限于叠氮化物或烯烃。
5.2.1.多价化合物的制备
在某些非限制性实施方式中，第一功能化靶向分子未激活的光不稳定官能团-(单体)n-靶向分子(在图3中以p-ODIBO例示)，其包含各种单体长度的间隔团(例如，PEG)。在某些非限制性实施方式中，间隔团可以包括约2个至约30个单体(如上所讨论)。例如但不限于，n可以等于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或30个单体。在某些非限制性实施方式中，未激活的光不稳定官能团-(单体)n-靶向分子可以这样制备，首先通过添加Boc-(单体)n-NHS至感兴趣的靶向分子形成NH2-(单体)n-靶向分子，然后进行Boc去保护。例如，Boc-(单体)n-NHS可与靶向分子在合适的缓冲液中(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))中组合，然后用三氟乙酸(TFA)(例如95％)去保护。然后，制备的NH2-(单体)n-靶向分子可以与未激活的光不稳定官能团-NHS混合以产生未激活的光不稳定官能团-(单体)n-靶向分子。
在某些非限制性实施方式中，第二功能化靶向分子是反应官能-间隔团-靶向分子(在图3中以N3例示)，其包含具有固定单体长度的间隔团。在某些非限制性实施方式中，间隔团可以包括约2个至约30个单体(如上所讨论)。例如但不限于，间隔团可以是4或8个单体。在某些非限制性实施方式中，可以通过将靶向分子和反应官能团-间隔团-NHS在合适缓冲液(例如PBS)中混合制备反应功能化靶向分子。
在某些非限制实施方式中，反应功能化靶向分子包括不同长度的间隔团，而不是光不稳定功能化靶向分子。作为一个非限制性示例，使用反应功能化靶向分子而不是光不稳定的功能化靶向分子测试间隔物长度可能更方便，因为前者可以更容易制备。
例如但不限于，光不稳定功能化靶向分子可以是光-ODIBO-PEGn-RGD肽(例如，n＝2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)。同样列入但不限于，反应官能化靶向分子可以是N3-PEGn-AE105和/或N3-PEGn-NGR肽。
5.2.2.体外高通量试验
在某些非限制性实施方式中，反应官能团-间隔团-靶向分子可以与具有特定单体长度的一组未激活的光不稳定官能团-(单体)n-靶向分子混合。例如，在这样的实施方式中，可以存在各间隔团长度组合的一种混合物。在某些非限制性实施方式中，未激活的光不稳定官能团-间隔团-靶向分子可以与具有特定单体长度的一组反应官能团-(单体)n-靶向分子混合。在某些非限制性实施方式中，反应功能化靶向分子和未激活的光不稳定功能化靶向分子可以约1:1摩尔比率混合以制备混合的靶向分子储液。可以根据两个靶向的受体的密度调整该比例。在某些非限制性实施方式中，各反应混合物包含具有特定间隔团长度的功能化靶向分子。
在某些非限制性实施方式中，可以将混合的靶向分子储液中的一种添加到含有感兴趣生物标记物的细胞。希望存在大量的靶向分子。在某些非限制性实施方式中，靶向分子结合靶向的生物标记物后，未结合的靶向分子将被洗去(例如使用合适的缓冲液)。
在某些非限制性实施方式中，例如细胞暴露于光子能量(包括但不限于激光和/或其他光源)约1分钟至1小时(包括端值)之间，即将功能化靶向分子上未激活的光不稳定官能团有效转化成激活的光不稳定官能团的一段时间。
在某些非限制性实施方式中，向细胞添加结合激活的光不稳定官能团的放射性标签标记的反应官能团。某些非限制性实施方式中，在添加放射性标签标记的反应官能团前将细胞孵育2-4小时。在某些实施方式中，放射性标签标记的官能团可以是N3-放射性元素-螯合剂(例如N3-(64Cu)NOTA)，并且在非限制性的实施方式中，可在光辐照后2-4小时添加以为两个不同靶向分子之间的点击反应提供足够时间。添加该N3-放射性元素-螯合剂的目的是检测未反应的光不稳定功能体基团的量，用于测量两个不同靶向分子之间点击化学的程度。在某些非限制性实施方式中，放射性标签标记的官能团结合“过度”激活的光不稳定基团，其结合生物标记物但是没有结合功能化靶向分子的反应基团。
在某些非限制性实施方式中，在通过本领域技术人员已知检测放射性水平之前，用适当缓冲液洗涤细胞以去除过量放射性标签标记的反应基团。在某些非限制性实施方式中，功能化靶向分子与最低放射性计数且含有最低过量摂放射性标签标记的反应基团组合，这表面对应的间隔团具有适当的或优选长度。
例如但不限于，反应官能团-间隔团-靶向分子(例如N3-PEG4-AE105)可与一个或多个(例如，10个)未激活的光不稳定官能团-(单体)n-靶向分子(例如，光-ODIBO-PEGn-RGD肽；n＝2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)以1:1摩尔比例混合以制备一个或多个(例如，10个)混合的靶向分子储液。可以将混合的靶向分子储液各自添加到预接种细胞的分开的细胞培养孔，并且可以用混合的把性分子孵育细胞(例如，直到实现结合平衡)。在某些实施方式中，将细胞预接种于24、48、96、384或1536孔板。用混合物的靶向分子孵育后，用合适的缓冲液(例如PBS)洗涤细胞以去除未结合的靶向分子。然后，可以将细胞暴露于光子能量(例如，UV灯(365nm))以旧货光不稳定官能团(例如，以生产叠氮化物激活的“ODIBO”)之后，引发反应基团和与细胞上生物标记物结合的激活的光不稳定基团(例如，N3-PEGn-AE105和ODIBO-PEGn-RGD)之间的连接。孵育以允许两个靶向分子结合(例如，2-4小时)后，放射性白偶极的反应基团(例如N3-(64Cu)NOTA)可以添加于细胞，其将集合激活的光不稳定基团，不解和功能化靶向分子的反应基团。未结合的放射性标签标记的反应基团可以被细胞，并且细胞的平板可经除，以用酶标仪(例如，高通量MicroBeta2平板计数器)读取，测量放射性标签标记的反应基团。
5.2.3.细胞系
在某些实施方式中，可使用各种细胞培养物来实施该方法，包括但不限于本领域已知的原代细胞培养物、组织移植物或转化的细胞培养物。这类细胞培养物的非限制性示例包括：原代-hBM SC；原代-h皮肤FB；原代-奶牛CC；原代-大鼠BMSC；原代-h CC；MC3T3-E1；原代-hUVEC；原代-兔CC；NIH 3T3；原代-CC；原代-大鼠肝Hep；原代-h皮肤角化细胞；MG63；HEP-G2；L929；原代-BM SC；原代-兔BM SC；原代-猪CC；原代-h骨OB；MCF-7；原代-大鼠心脏CM；原代-h包皮FB；原代-h脂肪SC；原代-hFB；原代-h脂肪SC；原代-FB；原代-大鼠主动脉SMC；原代-骨；原代-狗CC；3T3(非特异性)；C2C12；MDA-MB-231；SaOS-2；原代-小鼠BM SC；原代-大鼠CC；原代-h中胚层Mes Pre C；原代-大鼠脑神经元；PC12；原代-癌；原代-h皮肤EC；原代-大鼠BM OB；原代-小鼠胚胎SC；MCF-10A；原代-h骨OB样；原代-山羊BMSC；原代-h主动脉SMC；MDCK(MD犬肾)；原代-hi D环状C；原代-大鼠骨OB；原代-h脂肪前脂肪细胞；原代-SC；原代-大鼠骨骼肌肉成肌细胞；原代-心脏CM；原代-奶牛主动脉EC；原代-狗BM SC；原代-绵羊BM SC；原代-绵羊CC；原代-猪BMSC；原代-奶牛BMSC；原代-h膀胱SMC；原代-猪主动脉EC；原代-h角膜Epi C；原代-h主动脉EC；原代-h角膜FB；原代-猪主动脉SMC；原代-小鼠肝Hep；A549；原代-骨OB；原代-h膀胱Uro；原代-h UV SMC；Swiss 3T3；原代-肝Hep；原代-h LigFB；原代-h冠状动脉SMC；原代-OB样；原代-h牙齿Mes Pre C；HT1080；原代-大鼠心脏FB；原代-猪HV间隙水C；C3A；原代-h乳腺癌；原代-h包皮角化细胞；原代-h口腔粘膜角化细胞；原代-小鼠卵巢卵母细胞；原代-h Vase SMC；3T3-L1；原代-h肺FB；原代-鸡神经节神经元；原代-h U CStC；原代-奶牛主动脉SMC；原代-小鼠胚胎FB；原代-h支气管EpiC；CHO-K1；原代-h肝Hep；原代-hSaphVEC；原代-h牙齿PDL；原代-大鼠皮肤FB；原代-猪肝Hep；PC-3；原代-SMC；原代-hMVEC；原代-小鼠FB；原代-h鼻软骨细胞；原代-h角膜角化细胞；原代-h卵巢癌；原代-h U CBSC；原代-大鼠心脏EC；原代-Vasc；原代-小鼠皮肤FB；原代-h腱TC；原代-大鼠脑星形胶质细胞；原代-大鼠神经SC；Ha CaT；原代-h齿龈FB；原代-Neural；原代-奶牛骨OB；原代-大鼠脂肪SC；原代-小鼠骨OB；原代-h牙齿PC；原代-h血液单核细胞；原代-大鼠海马神经元；D3；HeLa；HEK293；C17.2；原代-h皮肤黑素细胞；原代-h血液EC样；HOSTE85；原代-h UC SC样；原代-h角膜SC；原代-大鼠主动脉EC；原代-h Saph VSMC；原代-h UCBEC；原代-小鼠心脏CM；D10RL UVA；原代-h冠状动脉EC；原代-h主动脉Myo FB；HT-29；原代-h腱FB；RAW 264；原代-大鼠牙髓SC；3T3-J2；H1；原代-猪牙齿；原代-大鼠坐骨神经施旺细胞；原代-兔骨OB样；原代-绵羊主动脉EC；原代-兔角膜Epi C；原代-h卵巢Epi C；原代-兔Ear软骨细胞；SH-SY5Y；原代-h牙齿FB；原代-h口腔粘膜FB；原代-兔FB；C6；原代-大鼠睾丸Stertoli；原代-奶牛动脉EC；原代-猪HVEC；原代-奶牛椎间盘髓核细胞；原代-大鼠神经节神经元；原代-狗膀胱SMC；原代-Vasc SMC；129/SV；原代-猪Ear软骨细胞；ED27；原代-兔骨B；原代-h脑成胶质细胞；原代-大鼠脂肪前脂肪细胞；原代-h软骨滑膜；原代-大鼠胰腺胰岛素；原代-hEC；原代-绵羊主动脉SMC；原代-h子宫内膜EpiC；U251；原代-h子宫内膜StC；原代-猪膀胱SMC；原代-h HVI间隙水C；原代-猪Esoph SMC；原代-h NP神经元；原代-兔主动脉SMC；原代-h NSC；原代-兔角膜FB；原代-h ral癌；原代-兔Lig FB；原代-h SC；原代-大鼠BMOB样；原代-h骨骼肌肉成肌细胞；COS-7；C-28/12；HK-2；原代-h子宫癌；原代-大鼠心室CM；原代-h Vase EC；原代-绵羊颈动脉SMC；HCT-116；ROS 17/2.8；原代-h声带FB；UMR-106；原代-小鼠主动脉SMC；H9；R1；原代-大鼠胎儿神经元；原代-鸡耳EpiC；Huh7；原代-大鼠Vasc SMC；原代-h NPSC；ES-D3；IMR-90；原代-大鼠膀胱SMC；293T；原代-h包皮血管EC；原代-h胎盘EC；原代-h肺EpiC；原代-h前列腺EpiC；U-87MG；原代-狗颈动脉SMC；原代-兔角膜StC；原代-狗ID纤维环；原代-鸡胚胎软骨细胞；原代-EC；HFF；Vero；HFL-1；原代-h脂肪FB；原代-奶牛FB；原代-hUTSMC；原代-大鼠心室FB；AH 927；原代-绵羊Vasc FB；DU-145；ST2；B16.F10；原代-h鼻EpiC；原代-ID环状C；原代-h牙髓SC；3H10T1/2；原代-心脏瓣膜；原代-h骨肺泡；原代-兔腱FB；原代-小鼠肾脏胰岛素；HEPM；原代-狒狒主动脉SMC；HTK；原代-小鼠MDSC；原代-大鼠Esoph EpiC；原代-小鼠神经SC；原代-h胎儿OB样；原代-小鼠骨骼肌肉SC；hFOB 1.19；原代-神经施旺细胞；原代-h神经节神经元；Caco-2；原代-h肾脏；原代-h乳腺EpiC；原代-h肝SC；原代-猪膀胱Uro；原代-h肺EC；原代-h乳腺FB；原代-绵羊颈静脉EC；原代-猪Esoph EpiC；原代-h淋巴EC；原代-鸡CC；原代-h淋巴T细胞；原代-h结肠腺癌；原代-h乳腺EC；原代-猪声带FB；原代-h乳腺EpiC；原代-兔脂肪SC；原代-h角膜EC；H9c2；原代-h UT StC；原代-cat心脏CM；原代-小鼠胰腺EpiC；HS-5；原代-绵羊骨骼肌肉胎儿成肌细胞；原代-奶牛ID；原代-小鼠BM OCpre；原代-奶牛膝半月板C；Hep-3B；原代-奶牛Lig FB；HL-1；HuS-E/2；RWPE1；原代-奶牛视网膜EpiC；原代-hVascMyoFB；IEC-6；原代-小鼠胎儿Hep；HS68；OVCAR-3；原代-狗膝MeniscusC；原代-兔中胚层Mes PreC；原代-狗Lig FB；原代-大鼠肺肺泡；原代-狗皮肤角化细胞；CRL-11372；原代-狗Vase SMC；HMEC-1；原代-胚胎SC；T-47D1；原代-山羊CC；原代-hUVSC样；原代-几内亚猪耳EpiC；原代-韧带t；原代-几内亚猪皮肤FB；原代-小鼠皮质神经元；原代-h脂肪脂肪细胞；原代-小鼠肝SC；原代-h脂肪FB样；CAL72；J774；P19；原代-h羊水；原代-兔角膜EC；原代-h羊膜FSC；原代-大鼠BMFB样；ARPE-19；原代-大鼠肾脏肾小球系膜；K-562；原代-大鼠鼻神经鞘Ensheathing；原代-h膀胱StC；原代-鸡胚胎前心外膜；ATDC5；原代-绵羊FB；Kasumi-1；原代-骨骼肌肉；原代-h骨Mes PreC；HMT-3522；原代-h骨膜；A431；原代-h脑EC；原代-h UTFB；KLE；143b OST；BALB/3T3；原代-h Vasc FB；LLC-PKI；原代-h Vasc周皮细胞；BHK21-C13；原代-乳腺EpiC；M.DUNNI；C4-2B；ZR-75；HEC-1B；原代-h齿龈角化细胞；U178；原代-h HN癌；原代-小鼠乳腺EpiC；原代-h角化细胞；原代-小鼠坐骨神经N施旺细胞；OVCA429；原代-h肾脏EpiC；原代-猪Esoph FB；MBA-15；原代-猪下颌骨FB样；原代-h肝癌；原代-兔膀胱Uro；GD25betalA；原代-兔ID环状C；HSC-T6；原代-兔NP神经元；DOV13；HEY；原代-h乳腺FB；HTB-94；BZR-T33；原代-鸡角膜FB；MiaPaCa2；原代-大鼠粘膜神经鞘；原代-h卵巢FB；原代-大鼠唾液腺泡；原代-h卵巢卵母细胞；原代-大鼠睾丸胚芽；原代-h胰腺癌；原代-鸡胚胎StC；原代-h胰腺星形细胞；原代-绵羊颈动脉FB；ML0-Y4；原代-鸡视网膜SC样；原代-h前列腺癌；原代-鸡Ten TC；原代-h Saph V Myo FB；原代-滑膜细胞；MTLn3；原代-VascEC；原代-h骨骼肌肉Pre；RT4-D6P2T；C2；SCA-9；HOC-7；T31；原代-h UC EpiC；TR146；HCS-2/8；EA.hy926；原代-大鼠Ebryo；SW480；原代-绵羊胎儿CC；原代-狗胰腺胰岛素；KS-IMM；BPH-1；原代-大鼠胰腺SC；M2139；RIN-5F；原代-h胆囊癌；E14/TG2a；M4E；HES3；G8；原代-h结膜FB；原代-狗SaphVEC；LN CaP；原代-狗Saph V SMC；M4T；原代-h胎儿CC；BR-5；原代-猪UTUro；原代-海马神经元；PE-0041；原代-狗皮肤FB；原代-兔骨骼肌肉成肌细胞；原代-奶牛Denta ipulp；CGR8；原代-狗牙齿PDL；原代-大鼠胎儿Hep；原代-狗腱FB；原代-大鼠乳腺；原代-h膝C；原代-大鼠SMC；BRC6；原代-绵羊动脉FB；原代-狗Vasc EC；原代-奶牛乳腺肺泡；pZIP；293细胞系；BMC9；原代-h肺癌；SKOV-3；IOSE；TEC3；MCF-12A；原代-兔膀胱EpiC；Gli36δEGFR；原代-兔结膜EpiC；原代-h肺神经元；原代-兔子宫内膜EpiC；1205Lu；原代-兔MDSC；3T3-A31；原代-兔腱肌腱细胞；MDA-MB-435；原代-h癌；原代-奶牛EC；原代-大鼠角膜FB；原代-EpiC；原代-大鼠胎儿Cardiac；原代-h脑膜蛛网膜；COS-1；原代-Eye；原代-大鼠肝卵状C；GLUTag-INS；原代-大鼠口腔粘膜角化细胞；GM3348；CRFK；21NT；原代-大鼠睾丸EC；原代-h鼻FB；原代-h Dura MaterSC；原代-h鼻OB；原代-狗NP神经元；原代-h鼻分泌腺；原代-绵羊肺FB；AC-1M59；BHPrE1；MIN6；原代-UT；MKN28；大鼠-2；MLO-A5；RT112；CRL-2266；S91；GM5387；SK-ChA-1；原代-马CC；SPL201；原代-马腱FB；原代-h胎儿Mes PreC；D283；原代-猪甲状腺EpiC；H1299；Par-C10；AE-6；原代-兔血小板；原代-山羊颈动脉EC；原代-兔骨OC；原代-山羊颈动脉FB；原代-奶牛角膜FB样；原代-h胰腺SC；原代-兔CT周皮细胞；原代-山羊颈动脉SMC；原代-兔食管SMC；原代-h腮腺腺泡；原代-狒狒血液EC；A498；原代-h支气管SMC；原代-h胎盘SC；原代-兔括约肌SMC；原代-奶牛视网膜SC；7F2；MM-Sv/HP；A10；原代-h前列腺StC；原代-水牛胚胎SC样；原代-h唾液癌；CHO-4；原代-h唾液Salisphere；原代-大鼠皮质神经元；H13；原代-大鼠胚胎神经元；原代-几内亚猪胰腺EpiC；原代-大鼠胎儿OB；H144；CNE-2；MPC-11；21PT；原代-奶牛滑膜；原代-大鼠肝EC；原代-奶牛胎儿CC；BEAS-2B；H2122；LM2-4；Detroit 551；C18-4；FLC4；Ishikawa；原代-大鼠皮肤角化细胞；H35；原代-大鼠腱；原代-h SMC；HTR8；原代-h滑膜CC；E8.5；H460M；HL-60；MUM-2B；CRL-1213；MUM-2C；CRL-12424；W20-17；Lovo；原代-狗血液EC；原代-绵羊鼻CC；HAK-2；原代-绵羊皮肤FB；原代-h睾丸Sertoli；原代-h甲状腺癌；原代-气管；原代-h气管；LRM55；原代-h UASC样；原代-结肠FB；原代-hUASMC；r-CHO；HAT-7；RN22；HC-11；原代-h眼玻璃体；AEC2；S2-020；HCC1937；CRL-2020；AG1522；SCC-71；N18-RE-105；SK-N-AS；原代-h子宫SMC；SLMT-1；IMR-32；STO；NB4；Swan 71；原代-h肺泡Perosteum；原代-狗口腔粘膜EpiC；原代-h羊膜EP；原代-h胎儿施旺细胞；原代-狗骨OB；原代-猪UTSMC；184A1；Panc 1；NCTC 2544；46C；原代-奶牛角膜EC；B6-RPE07；原代-仓鼠EC；cBAL111；原代-仓鼠视网膜神经元；HEPA-1Clc7；NEB1；CCE；NHPrE1；原代-兔结膜FB；410；Hepa RG；原代-角化细胞；PMC42-LA；原代-狗软骨滑膜；21MT；NOR-P1；原代-兔子宫内膜StC；原代-淋巴结淋巴细胞；DLD-1；原代-淋巴结T细胞；原代-兔泪腺腺泡；AB2.1；原代-兔肺肺细胞；原代-猴胚胎；ES-2；原代-猴肾脏FB样；原代-兔阴茎SMC；原代-小鼠脂肪StC；原代-兔皮肤FB；NR6；原代-血液SC；原代-小鼠BM巨噬细胞；786-0；AT2；原代-大鼠肾上腺嗜铬细胞；AT3；CCF-STTGI；原代-小鼠骨颅盖；原代-大鼠膀胱Uro；HCT-8/E11；CE3；原代-小鼠脑神经元；CFK2；原代-小鼠乳腺癌；L6；原代-小鼠软骨细胞；HeyA8；原代-小鼠结肠EpiC；原代-大鼠皮质星形胶质细胞；原代-狗CFB；原代-水牛卵巢EpiC；原代-狗角膜软骨细胞；原代-大鼠胚胎CM；原代-小鼠胚胎神经元；A2780；C5.18；原代-狗MV EpiC；原代-小鼠食管SC；原代-大鼠胎儿肾；HEK001；A357；EFO-27；原代-鸡骨OB；原代-小鼠胎儿肺；原代-大鼠心脏SC样；原代-小鼠胚芽；原代-大鼠肾脏；EN Stem-ATM；原代-大鼠泪腺腺泡；U-251MG；原代-狗肌成纤维细胞；A4-4；原代-大鼠肝SC样；原代-奶牛脑EC；原代-大鼠肺FB；原代-小鼠肾脏肾；BEL-7402；NT2；HIAE-101；原代-h BM单核细胞；原代-大鼠卵巢；原代-小鼠淋巴FB样；原代-大鼠胰腺Islets；原代-狗食管EpiC；原代-大鼠肾EpiC；原代-小鼠Mast；原代-鸡胚胎胎盘；NTera2/c1.D1；G-415；失效的；原代-大鼠小肠；原代-小鼠卵巢堆积物C；原代-大鼠牙齿SC样；HEL-299；原代-大鼠腱肌腱细胞；KB；b-End-2；原代-小鼠胰腺胰岛素；原代-大鼠Vase EC；原代-小鼠唾液Salisphere；原代-h十二指肠EpiC；原代-h骨胎儿OB；原代-呼吸道EpiC；原代-小鼠骨骼肌肉成肌细胞；原代-绵羊羊水；OC2；原代-鸡心脏CM；Daudi；原代-绵羊动脉MyoFB；原代-小鼠皮肤角化细胞；原代-绵羊骨OB样；原代-小鼠小肠；原代-鸡心脏ECM；原代-小鼠脾脏T细胞；LNZ308；原代-小鼠牙齿成牙质细胞；原代-绵羊ID环状Fibrosus；原代-小鼠睾丸SC；原代-绵羊颈静脉SMC；原代-小鼠睾丸精子；原代-绵羊肺SC；原代-小鼠UT Uro；原代-绵羊Saph VEC；原代-小鼠子宫EpiC；原代-绵羊皮肤EC；OCT-1；原代-绵羊Vasc EC；HELF；原代-绵羊Vasc SMC；CAC2；HL-7720；OPC1；原代-牙齿PDL；原代-狗心脏SC；原代-UCB单核细胞；原代-猪颈动脉EC；原代-h子宫内膜异位CystStC；原代-猪颈动脉SMC；原代-结肠癌；原代-猪冠状动脉SMC；QCE-6；原代-猪膀胱FB；R221A；OSCORT；LS180；B35；RIF-1；Calu-1；RL-65；Calu-3；原代-奶牛肾上腺ChrC；B5/EGFP；RT-112；原代-猪EC；RW.4；原代-猪ESC；S2-013；OVCAR-5；S5Y5；原代-h骨OC样；SA87；INT-407；SAV-I；原代-猪胎儿Hep；SCC-68；P69；HNPSV-1；CaSki；SK-CO15；原代-猪髂EC；SK-N-DZ；Hep2；SKOV31p.1；原代-猪下颌骨造釉细胞；SNB 19；原代-奶牛关节滑膜；原代-h胎儿FB；原代-猪下颌骨成牙质细胞；SW1353；原代-猪NP神经元；SW948；原代-猪口腔粘膜EpiC；CRL-2102；原代-猪胰岛；T4-2；原代-猪肺SMC；TE-85；原代-猪唾液腺泡；THP-1；原代-猪滑膜SC；BME-UV1；KG-1；D4T；HUES-9；原代-小鼠海马神经元；ECV304；NRK；原代-小鼠肾脏肾小球系膜；D407；10T1/2细胞系和原代-h包皮黑素细胞。
5.3.生物标志物
在某些非限制实施方式中，第一靶向分子和第二靶向分子靶向感兴趣的生物对象的至少一个生物标记物。在某些非限制实施方式中，第一和第二靶向分子靶向感兴趣的生物对象相同的或不同的生物标记物。在某些非限制性实施方式中，当第一和第二靶向分子靶向两个不同的生物标记物时，那么生物标记物表达于相同的细胞。
在某些非限制性实施方式中，仅有一个靶向分子靶向生物标志物。
在某些非限制实施方式中，生物标记物可以表达于细胞的表面或内部。在某些非限制实施方式中，生物标记物可以是细胞表面蛋白，受体、受体亚基，抗原，病毒衍生的蛋白质，病毒编码的包封蛋白，细菌衍生的蛋白质，细菌表面蛋白等。在某些非限制性实施方式中，生物标记物为整联蛋白。
在某些非限制性实施方式中，生物对象是蛋白质、病毒、细胞、组织、器官或生物体。在某些非限制性实施方式中，细胞可以是但不限于肿瘤、癌症或疾病细胞。在某些非限制性实施方式中，第一和第二把峡谷内分子结合细胞(包括肿瘤或癌症)，诸如但不限于，胰腺癌，乳腺癌，结直肠癌，NSCLC，肺癌，骨癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤黑色素瘤，眼内黑色素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区域癌，胃癌，胃部癌症，结肠癌，乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾癌，输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆道癌，慢性白血病，急性白血病，淋巴细胞淋巴瘤，CNS肿瘤，脊髓轴癌，脑干胶质瘤，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiform)，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，鳞状细胞癌和垂体腺瘤肿瘤或肿瘤转移。在某些非限制性实施方式中，生物标记物的水平比通过其他方法可以检测的低。在某些非限制性实施方式中，当前的方法能够检测疾病(例如癌症)的早期阶段。在某些非限制性实施方式中，当前的方法能够检测低水平的生物标记物存在。
在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是表皮生长因子受体(EGFR)，整联蛋白α1β1，整联蛋白α2β1，整联蛋白α3β1，整联蛋白α4β1，整联蛋白α5β1，整联蛋白α6β1，整联蛋白αvβ3，uPAR，胃泌激素释放肽(GRP)，SSTR2，SSTR3，SSTR4，SSTR5，叶酸受体，CCR5，CXCR4，网蛋白-1，VEGF，CA19-9，PD-I1，Her2/neu，5-α还原酶，α-胎蛋白，AM-1，APC，APRIL，BAGE，β-连环蛋白，Bc12，bcr-abl(b3a2)，CA 125，CASP-8/FLICE，组织蛋白酶，CD13，CD19，CD20，CD21，CD23，CD22，CD38，CD33，CD35，CD40，CD44，CD45，CD46，CD5，CD52，CD55，CD59(791Tgp72)，CDC27，CDK4，CEA，c-myc，COX-2，细胞角蛋白，DCC，DcR3，E6/E7，EGFR，EMBP，Ena78，雌激素受体(ER)，FGF8b和FGF8a，FLK1/KDR，G250，GAGE-家族，胃泌激素17，胃泌素释放激素(韩蛙皮素)，GD2/GD3/GM2，GnRH，GnTV，gp100/Pme117，gp-100-in4，gp15，gp75/TRP-1，hCG，类肝素酶，Her3，HMTV，Hsp70，hTERT(端粒酶)，IGFR1，IL 13R，iNOS，Ki 67，KIAA0205，K-ras，H-ras，N-ras，KSA(CO17-1A)，LDLR-FUT，MAGE家族(MAGE1，MAGE3等)，乳腺珠蛋白，MAP17，Melan-A/MART-1，间皮素，MIC A/B，MT-MMP's，如MMP2，MMP3，MMP7，MMP9，Mox1，粘蛋白，如MUC-1，MUC-2，MUC-3，和MUC-4，MUM-1，NY-ESO-1，骨粘连蛋白，p15，P170/MDR1，p53，p97/黑素转铁蛋白，PAI-1，PDGF，血纤维蛋白溶酶原(uPA)，PRAME，前列腺碱性蛋白(Probasin)，祖细胞生成素(Progenipoietin)，孕酮受体(PR)，PSA，PSM，RAGE-1，Rb，RCAS1，SART-1，SSX基因家族，STAT3，STn(粘蛋白assoc.)，TAG-72，TGF-α，TGF-β，胸腺素β-15，IFN-γ，TPA，TPI，TRP-2，酪氨酸酶，VEGF，ZAG，p16INK4，Myo D1，谷胱甘肽或S-转移酶。在某些非限制性实施方式中，生物标记物可以是表皮生长因子受体(EGFR)，整联蛋白αvβ3，uPAR，胃泌素释放肽(GRP)，SSTR2，CCR5，整联蛋白α4β1，VEGF，CA19-9，CD13，CD40或PD-L1。在某些非限制性实施方式中，生物标记物为uPAR和/或整联蛋白αvβ3。在某些非限制性实施方式中，生物标记物为CD13和/或整联蛋白αvβ3。
整联蛋白为这样的细胞粘附分子，其介导细胞间和细胞与基质间相互作用，并且有助于迁移、增殖、血管生成、肿瘤侵袭和新陈代谢。整联蛋白ανβ3作为胞外基质蛋白具有暴露的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列。重要地，整联蛋白ανβ3通常以非常低的(或不可检测的)水平在成人上皮细胞中表达，但是在各种肿瘤细胞被高度上调。最近的表达分析证明具有高ανβ3表达的患者显示出比那些具有低ανβ3表达的患者明显更短的存活时间。其在肿瘤生长、侵袭和转移过程中限制性的表达为快速生长和转移性肿瘤的诊断和治疗提供了一个有趣的分子靶点，因此，ανβ3是本发明一个生物标记物的示例。
氨基肽酶N(APN)/CD13(跨膜蛋白酶)是另一种重要的生物标记物。与整联蛋白ανβ3相似，CD13在肿瘤的新生血管中也被上调，但在正常血管中几乎不表达，并且在许多人类实体肿瘤中观察到CD13的高表达，包括黑色素瘤、前列腺癌、肺癌和卵巢癌以及胰腺癌。包含肽的NGR序列在与CD13结合中显示出高亲和力/选择性。因此，CD13提供了根据本发明的另一示例生物标记物。
uPAP是另一种用于癌症成像的重要生物标记物，因为临床研究和实验室研究都证明了uPA/uPAR的过表达与恶性肿瘤中的不良预后紧密关联。此外，uPAP在各种恶性肿瘤中过表达(通常每个细胞表达数千个受体)，但是在正常和邻近组织中不存在或在非常低地表达。因此，uPAR是本发明另一生物标记物的示例。
在某些非限制性实施方式中，涉及整联蛋白ανβ3和CD13(例如，NGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体)的本发明的多价化合物可以用于检测癌症的早期阶段。在某些非限制性实施方式中，本发明的多价化合物涉及整联蛋白ανβ3和CD13(例如，NGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体)可以用于检测癌症的早期阶段。
5.4.试剂盒
本发明还提供了可用实施本发明的试剂盒。例如但不限于，本发明的试剂盒可以包括至少一个成像和/或药物递送化合物。在某些非限制性实施方式中，本发明的试剂盒可以然选地包括如何使用该试剂盒进行分子成像和/或靶向的药物递送的说明书。在某些非限制实施方式中，试剂盒还可以包括给药装置，如注射器和/或导管和/或导管套。
在某些非限制性实施方式中，分子成像和/或药物递送化合物包括具有可检测标签和/或活性剂的单体。在某些非限制性实施方式中，分子成像和/或药物递送化合物包括具有可检测标签和/或活性剂的同源二聚体。在某些非限制性实施方式中，分子成像和/或药物递送化合物包括具有可检测标签和/或活性剂的异质二聚体。在某些非限制性实施方式中，分子成像和/或药物递送化合物包括具有染料分子具有可检测标签和/或活性剂的靶向分子。
本发明还提供了用于制备成像和/或药物递送化合物的试剂盒。在某些非限制实施方式中，本发明的试剂盒包含第一靶向分子(处于干燥或液体形式)和/或第二靶向分子(处于干燥或液体形式)和/或螯合剂，用于组装成成像和/或药物递送化合物。当分子以干燥形式提供，试剂盒可以含有适当的缓冲液或溶剂以生产溶液或组合物。
本发明还提供了用于确定成像和/或药物递送化合物优选间隔团长度的试剂盒。在某些非限制实施方式中，本发明的试剂盒包含第一靶向分子(处于干燥或液体形式)和/或第二靶向分子(处于干燥或液体形式)和/或不同长度的间隔团和/或放射性金属标签标记的螯合剂，用于高通量筛选平台。在某些非限制性实施方式中，试剂盒可以含有适当的缓冲液或溶剂以进行高通量试验。
提供以下实施例来更完整地说明本发明，但其不意在限制本发明的保护范围。实施例中所述方法和材料通过引用纳入本发明的详细的描述中。
6.实施例
实施例1：合成本发明的金属螯合剂
如方案1所示制备基于1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)的螯合剂(N3-NOtB2)：
方案1：合成N3-NOtB2
反应条件：a)MeCOCl.MeOH：b)咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐，CuSO4，K2CO3，MeOHc)TsCL，TEA，DCM；d)NO2A(tBu)，CsCO3，MeCN；e)30％nBu3NOH，MeOH
4-氨基-2-羟基戊酸酯(2)
于0℃将MeCOCl(15mL)逐滴添加至无水甲醇(100mL)。室温搅拌获得的混合物1小时。然后，添加起始材料(1)(10g,84mmol)，并在室温搅拌混合物2小时。减压去除溶剂，用乙醚(50mL)处理残留物以在过滤后获得白色固体(2)(12.67g,88.5％)。TLC和NMR表明，不需要其他纯化。1H NMR(400MHz,D2O)δ4.53–4.44(m,1H,-CH(COOH)-)，3.82(s,3H,-CH3)，3.27–3.11(m,2H,-CH2N3)，2.31–2.19(m,1H,-CH2CH2N3)，2.13–1.98(m,1H,-CH2CH2N3)。13C NMR(101MHz,D2O)δ175.16,68.50,52.89,36.66,30.42。ESI-MS：观测值，m/z(M+H)+＝133.92，计算值，(M+H)+＝134.08。
4-叠氮基-2-羟基丁酸甲酯(3)
将咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐(2.5g,12mmol)添加于(2)(1.7g,5mmol)、K2CO3(3.2g,23mmol)和CuSO4.5H2O(30mg,100μmol)的MeOH(30mL)浆料，并将混合物搅拌过夜。将混合物浓缩，用H2O(100mL)稀释，用浓HCL酸化并用EtOAc(50X 3mL)提取。将合并的有机层干燥(MgSO4)，过滤并浓缩以生成作为无色液体的粗产物(3)(1.22g,76.6％)。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。对于NMR光谱，通过硅胶层析(DCM/MeOH,10:1)将少许粗产物纯化以获得作为无色液体的纯化(3)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.31(dd,J＝7.6,4.0Hz,1H,-CH(COOH)-)，3.83(s,3H,-CH3)，3.59–3.43(m,2H,-CH2N3)，2.93(brs,1H,-OH)，2.15–2.04(m,1H,-CH2CH2N3)，1.99–1.86(m,1H,-CH2CH2N3).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.06，67.60，52.81，47.18，33.16。
4-叠氮基-2-(甲苯磺酰基氧基(tosyloxy))丁酸甲酯(4)
将TsCl(2.7g,14mmol)添加到(3)(1.5g,9.4mmol)和TEA(3g,30mmol)的DCM溶液(50mL)中，并在室温搅拌混合物过夜。然后用水(30X 2mL)洗涤混合物，用MgSO4干燥并过滤。浓缩滤液并进行快速色谱(EtOAc/Hexane,1:4)，获得作为白色固体的(4)(2.37g,70.8％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝8.3Hz,2H,Ar-H)，7.38(d，J＝8.1Hz，2H，Ar-H)，4.97(dd，J＝7.6，5.0Hz，1H，-CH(COOH)-)，3.72–3.68(m，3H，-CH3)，3.47–3.39(m，1H，-CH2CH2N3)，3.37–3.27(m，-CH2CH2N3)，2.47(s，3H，Ar-CH3)，2.13–1.98(m，2H，-CH2N3)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ168.68，145.46，132.89，129.88，128.08，74.36，52.77，46.36，31.53，21.69。
2,2'-(7-(4-叠氮基-1-甲氧基-1-氧代丁烷-2-基)-1,4,7-三氮杂壬烷-1,4-二基)二乙酸二叔丁酯(5)
向NO2A(tBu)(0.8g，2.24mmol)和Cs2CO3(1.1g,3.36mmol)的MeCN(20mL)浆料添加(4)(0.95g,2.67mmol)，然后将混合物于50℃加热1天。冷却到室温后，将混合物过滤并浓缩。通过硅胶层析(DCM/MeOH,10:1)将残留物纯化以获得作为微黄色液体的(5)(0.73g,65.2％)，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.73–3.60(m，3H，-OCH3)，3.58–3.44(m，2H，–CH2N3)，3.39(s，1H-NCH-)，3.28(s，4H，2*-CH2CO-)，3.02–2.58(m，12H，6*-NCH2-)，2.01–1.79(m，2H，-CH2CH2N3)，1.43(s，18H，6*-CH3)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ173.51，171.54，80.70，63.83，59.40，56.11，55.77，53.31，51.23，48.52，29.52，28.21。ESI-MS：观测值，m/z(M+H)+＝499.266，计算值，(M+H)+＝499.32。ESI-HRMS：观测值，m/z(M+H)+＝499.3239，计算值，(M+H)+＝499.3239。
4-叠氮基-2-(4,7-双(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7-三氮杂壬烷-1-基)丁酸(N3-NOtB2,6)
向(5)(100mg，0.2mmol)的吡啶溶液(2mL)添加LiI(134mg,1mmol)，并且在室温搅拌混合物4小时。用DCM(20mL)处理混合物，并用饱和的柠檬酸(10X 2mL)和水(20mL)洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩以生成粗产物(6)。用硅胶层析(DCM/MeOH，20:3)纯化后获得作为白色固体的纯化的(6)(50mg，51.5％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.72(d，J＝7.1Hz，1H，-NCH(COOH)-)，3.70–3.41(m，6H，2*-CH2CO-&–CH2N3)，3.43–2.75(m，12H，6*-NCH2-)，2.36–2.21(m，1H，-CH2CH2N3)，1.91(dd，J＝12.9，5.2Hz，1H，-CH2CH2N3)，1.46(s，18H，6*-CH3)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ172.17(-COOH)，169.51(2*-CO2C(CH3)3)，82.28(-CO2C(CH3)3)，63.12(-NCH(COOH)-)，56.35(2*-NCH2CO2C(CH3)3)，50.79(-N-CH2-)，49.80(-N-CH2-)，49.16(-N-CH2-)，49.04(-CH2N3)，28.62(-CH2CH2N3)，28.12(6*-CH3)。ESI-MS：观测值，m/z(M+H)+＝485.45，计算值，(M+H)+＝485.31。ESI-HRMS：观测值，m/z(M+H)+＝485.3064，计算值，(M+H)+＝485.3082。
合成N3-NOtB2的总体产率为15％。
实施例2：合成本发明的金属螯合剂。
如方案2所示制备基于TACN的螯合剂(N3-DOtB3)：
方案2。合成N3-DOtB3。试剂：a)4，CsCO3，MeCN；b)LiI，吡啶
2,2',2”-(10-(4-叠氮基-1-甲氧基-1-氧代丁烷-2-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯(S2)
向(S1)(DO3A(tBu))(51.4mg,0.1mmol)和Cs2CO3(49mg,0.15mmol)的MeCN(1mL)的浆料添加(4)(38mg，0.12mmol)，并将混合物在50℃振荡1天。冷却至室温后，将混合物过滤并浓缩。反应通过LC-MS监测。用硅胶层析(DCM/MeOH,10:1)过滤后获得纯化的(S2)(30mg，38.4％)，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ3.70–3.18(m，10H，-CHCO-&-NCH2CO-&-OCH3)，3.04–2.07(m，16H-NCH2-)，1.97–1.81(m，2H，-CH2N)，1.71–1.63(m，2H，-CH2CH2N3)，1.48–1.45(m，27H，9*-CH3)。ESI-MS：观测值，m/z(M+H)+＝656.455，计算值，(M+H)+＝656.435。ESI-HRMS：观测值，m/z(M+H)+＝656.4322，计算值，(M+H)+＝656.4347。
4-叠氮基-2-(4,7,10-三(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)丁酸(S3)
向S2(10mg，0.015mmol)的吡啶溶液(0.5mL)添加LiI(10mg，0.075mmol)，并且将混合物在室温振荡2小时。用DCM处理混合物，并用饱和柠檬酸和水洗涤。有机层用MgSO4干燥，过滤并浓缩以生成粗产物(S3)。使用硅胶层析(DCM/MeOH,10:1)获得纯化的S3(3mg，31.2％)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ3.87–3.74(m，2H，-CH2CO-)，3.63–3.53(m，1H，-NCH(COOH)-)，3.46–3.33(m，4H，-CH2CO-)，3.08–1.98(m，18H，-NCH2-&-CH2N)，1.67–1.56(m，2H，-CH2CH2N3)，1.51–1.46(m，27H，9*-CH3)。ESI-MS：观测值，m/z(M+H)+＝642.439，计算值，(M+H)+＝642.419。ESI-HRMS：观测值，m/z(M-H)-＝640.4046，计算值，(M-H)-＝640.4034。
合成N3-NotB3的总体产率为12％。
实施例3：合成本发明的AE105-二聚体。
如实施例1所述制备基于TACN的螯合剂。然后将基于TACN的螯合剂经由固相合成(SPS)连接AE105肽。具体地，N3-NOtB2以高产率经由SPS连接肽AE105的N末端。
使用标准SPS方案通过肽合成器在树脂(树脂-AE105*，树脂-AE105-PEG8-NH2)制备肽。化合物6(来自实施例1)(3当量)通过与HATU(5当量)和DIEA(10当量)在DMF中于室温混合2小时偶联树脂。使用TFA/H2O/TIS/苯酚(90:5:2.5:2.5)从树脂支持物脱离和HPLC纯化后，获得部分-A-NOTA-N3(7)。.
为了获得异质性二聚化、同源性二聚化和双峰性(dual-modality)化合物，将单体(AE105-NOTA-N3)由Rink酰胺树脂切下，然后经由张力促进的(strain-promoted)炔烃-叠氮化物环加成作用(SPAAC)以如方案3所概述的高产率结合BCN功能化的RGDyk(或AE105或花青素染料Cy3或Cy5)。
方案3：制备A)AE105-RGD异质二聚体；B)AE105同源二聚体；C)AE105-点击-Cy5；D)AE105-无点击(nonclick)-Cy3；BCN为环辛炔，其可以直接与叠氮化物反应并以高反应速率形成三唑基团，不需要使用Cu(I)作为催化剂。
由于不含金属的点击反应，在将单体(AE105-NOTA-N3)与1.0等量的BCN连接的肽或染料37℃过夜孵育后实现了>95％的产率。获得的化合物可以直接使用。通过梯度洗脱的HPLC纯化可以进一步这些合成探针的纯度，所述梯度洗脱从0％乙腈100％水至100％乙腈。
上述制备的探针分别成功地用64Cu、68Ga和Al18F在37℃、70℃和90℃标签标记。通常，当使用1nmol探针和1mCi放射性时，对于64Cu和68Ga标签标记可以实现100％的标签标记产率。图5提供了放射性标签标记的放射性HPLC结果的代表性示例。
上述所有化合物可以用64Cu在温和条件下标签标记，具有1.0mCi/nmol的特异性活性。获得的放射性示踪剂在7℃孵育24小时(以<2％64Cu解离)后在人血清中显示出很好的稳定性。
获得的异质二聚体(AE105-NOTA-RGD；图6)和单体(AE105-NODAGA和RGD-NODAGA；图6)用64Cu于70℃的NH4OAc缓冲液(pH～6.8)中放射性标签标记；并且评估它们的血清稳定性。获得的放射性示踪剂在37℃孵育24小时后保持完整，这显示出很好的血清稳定性。图7提供了放射性-HPLC结果，其证明了在血清中孵育1天后探针不存在显著的64Cu-解离。良好的血清稳定性证明探针能够在体内血流循环期间保持完整。较大的分子量和大小也将提高探针在血液中的潴留。
化合物的方式标签标记：对于Cu-64标签标记，所有的化合物在0.1M NH4OAC缓冲液(pH＝6.8)中进行。简言之，64CuCl2(通常在0.1N HCl中)首先在0.1M NH4OAC缓冲液(pH＝6.8)中缓冲，然后添加制备的NOTA生物共轭物。将所得混合物涡旋10秒，并在热搅拌器中以37℃孵育0.5小时，在这之后通过放射性HPLC确定64Cu纳入率。
图8显示了用N3-DOtB3-AE105-PEG4-DOTA-PEG4-RGD制备的二聚体。
细胞染色研究：实验之前24小时将细胞接种到8孔载玻片(100,000个细胞/孔)。实验前，用PBS洗涤细胞两次并添加培养基。然后将封闭剂(10μg AE105)添加到半数的孔作为冷封闭(cold block)以确定体外非特异性摄取，并且孵育1小时。然后，将AE105-NOTA-NHCO-Cy3(10pmol/孔)添加到各孔，并进一步孵育2小时。然后去除培养基，并用PBS洗涤细胞两次。在用1％多聚甲醛固定细胞后，通过DAPI对细胞核染色。密封载玻片，并在荧光显微镜(40X，油镜)下观察。
如图9所示，在U87MG人成胶质细胞瘤细胞系上观测染色和封闭，这证明了肽AE105对uPAR受体的强亲和力，并且表明AE105-NOTA-NHCO-Cy3还可以用作光学探针。
实施例4：细胞摄取和结合研究。
细胞摄取和染色研究在U87MG人癌细胞中测量。具体地，进行AE105-RGD异质二聚体(图4)和单体AE105-NODAGA和RGD-NODAGA之间的比较(图6).
细胞-摄取试验：U87MG人癌细胞购自美国典型培养物保藏中心(鼠乳腺腺癌(carcinoma)(4T1)细胞系购买自ATCC()。所有细胞处理在层流罩中无菌进行。U87MG细胞培养于补充有10％FBS、盘尼西林(100单位/mL)、链霉素(100μg/mL)L-谷氨酰胺(300μg/mL)和丙酮酸钠(100mg/mL)、葡萄糖(4.5g/L)的杜尔贝科改良的伊格培养基(Dulbecco’sModified Eagle Medium)中，并且维持于37℃、5％CO2下。
实验之前24小时将细胞接种到12孔(200,000个细胞/孔)。实验前，用1mL HBSS洗涤细胞两次，并将1mL培养基(含0.1％BSA和1mM Mn2+的DMEM)添加到各孔。然后用64Cu标签标记的偶联物(各孔10pmol 64Cu-GYK12、64Cu-RGD或64Cu-AE105)孵育细胞。在各时间点(1、2和4小时)，吸取放射性培养基。用HBSS(pH 7.2)洗涤细胞两次并溶解于0.5％SDS中。用γ计数器测量各部分中的放射性。测定各细胞裂解物样品的蛋白质含量。将与细胞相关的测量的放射性标准化至每孔相同量的细胞蛋白质。细胞摄取表示为衰变校正后的添加剂量百分比。
异质二聚体相比单体AE105-NODAGA和RGD-NODAGA在所有的检测时间点显示出显著改善的细胞摄取(p<0.1)(图10)。
细胞饱和结合试验：实验之前24小时将细胞接种到24孔(100,000个细胞/孔)。实验前，用1mL HBSS洗涤细胞两次，并将0.5mL结合培养基(含0.1％BSA和1mM Mn2+的HBSS)添加到各孔。然后将封闭剂(10μg AE105和/或10μg RGD)添加到半数的孔作为冷块以确定体外非特异性结合，然后以递增浓度(1-100nM)添加64Cu-AE105-RGD、64Cu-RGD和64Cu-AE105。所有样品在冰上(4℃)孵育2小时。孵育后，去除放射性培养基。用冰冷结合缓冲液(1mL)清洗细胞团块两次，并溶解于0.5％SDS溶液中。在γ计数器测量各部分中的放射性。测定各细胞裂解物样品的蛋白质含量(BCA蛋白质试验试剂盒，皮尔斯公司(Pierce))。将与细胞相关的测量的放射性标准化至存在的细胞蛋白质量。
结果显示相较于64Cu-AE105(Bmax 269±43fmol/mg，Kd 65±49nM)和64Cu-RGD(Bmax260±44fmol/mg,Kd 91±36nM)这两种64Cu-单体，64Cu-GYK12具有显著增强的Bmax(488±73fmol/mg)和结合亲和力(9.9±4.2nM)。
统计学分析：所有实验都重复三次进行。不同实验组之间的比较使用双尾ANOVA测试(GraphPad Prism 6)进行。当比较超过两个数据组时，使用具有邦弗朗尼后测试(Bonferroni post-test)的双尾ANOVA分析。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
实施例5：使用AE105-RGD异质二聚体进行PET成像。
在具有U87MG肿瘤异种移植物的NCr裸小鼠中进行PET/CT成像。
将U87MG细胞(150μL PBS中5百万个细胞)注射到裸小鼠的右肩皮下侧腋中。AE105-RGD异质二聚体(图4)、AE105-NODAGA或RGD-NODAGA经由尾静脉注射注射到血流中。通过共注射100倍的AE105和RGD针对异质二聚体研究进行封闭研究。注射示踪剂1小时和4小时后进行小型动物PET/CT。通过分析ROI确定器官摄取。对于AE105-RGD二聚体，还进行离体生物分布。取出小鼠的器官并使用γ计数器进行计数。
所有的异种移植的肿瘤在注射后(p.i)1小时和4小时可见。器官摄取有PET成像定量确定。结果显示相较于注射64Cu-AE105(1小时：1.45±0.15％ID/g，4小时：1.55±0.31％ID/g)和64Cu-RGD(1小时：1.50±0.42％ID/g，4小时：1.73±0.51％ID/g)两种单体PET探针的小鼠，在注射64Cu-异质二聚体(1小时：3.13±0.49％ID/g，4小时：3.27±0.25％ID/g)中观测到较高的肿瘤摄取(p<0.01)。64Cu-异质二聚体的肿瘤与肌肉比在4小时为7.6±1.9，这显著高于64Cu-AE105(4.2±1.1)的肿瘤与肌肉比。64Cu-异质二聚体的肿瘤与肝脏比在4小时为1.5±0.4，这也显著高于64Cu-AE105(0.43±0.1)的肿瘤与肝脏比。高肠摄取可以归因于αvβ3整联蛋白和uPAR在年幼小鼠肠中也高度表达的事实。在通过共注射环(RGDyK)和AE105(每一个为100μg)进行的封闭研究(图12)中，64Cu-异质二聚体的肿瘤摄取降至1.01±0.18％ID/g(小时，p<0.01)，而这进一步证明了异质二聚体在U87MG异种移植物中靶向αvβ3整联蛋白和uPAR的特异性。还进行了AE105-RGD的离体生物分布以验证PET成像定量数据。结果示于图13。
统计学分析：所有实验都重复三次进行。不同实验组之间的比较使用双尾ANOVA测试(GraphPad Prism 6)进行。当比较超过两个数据组时，使用具有邦弗朗尼后测试(Bonferroni post-test)的双尾ANOVA分析。P值<0.05被认为具有统计学显著性。
实施例6：合成异质二聚体用于双重靶向。
该实施例提供了合成异质二聚体用于双重靶向的其他方法。该方法可以经修饰以制备结合各种肽的异质二聚体。
第一肽(肽A)可以使用标准SPS方案通过肽合成器在树脂(树脂-肽A-PEGn-NH2)上制备。N3-NOtB2可以偶联树脂和肽。可以使用TFA和HPLC纯化从树脂支持物切割所得肽A-PEGn-NOTA-N3。异质二聚体可以通过进一步与肽B制备(例如，肽B-PEG4-BCN)，如方案4所示。
方案4：合成两个肽的异质二聚体。
如方案4所示，肽A和B可以选自许多合适的肽。例如，它们可经选择以靶向整联蛋白和CD13。如此，肽A可以选自AE105和AE105mut，而肽B可以选自环(RGDyK)和环(RADyK)。此外，PEG间隔团可为各种长度，例如，从n＝0至n＝12。例如，AE105和环(RGDyK)的异质二聚体如上述实施例4所述是相同的(即GYK4、GYK8、GYK12和GYK16)。然而，该实施例进一步证明了异质二聚体可以用其他靶向分子制备，如AE105mut和环(RADyK)。
制备的异质二聚体可以经放射性标签标记，分别用于体外和/或体内评估。细胞摄取和/或流出试验可以用于鉴定具有细胞摄取和潴留最大潜能的一种或多种异质二聚体，如将在下述实施例13中进一步描述。此外，细胞饱和结合试验可以如实施例4中所述进行以评估异质二聚体相较于单体的Bmax和结合亲和力。
实施例7：合成整联蛋白-CD13双重靶向化合物。
如方案4所示制备整联蛋白-CD13双重靶向化合物。
方案4：合成整联蛋白-CD13双重靶向化合物。
使用生物双功能螯合剂(BFC)N3-NOtB2将分别靶向CD13和ανβ3的肽配体c(CNGRC)和c(RGDyK)经由不含金属的点击反应和酰胺形成反应共价连接。图1显示了用N3-NOtB2-c(CNGRC)-PEG4-NOTA-PEG4-RGD制备的二聚物。
Fmoc-PEG4-OH和基于TACN的螯合剂经由固相合成(SPS)依次连接环(CNGRC)肽。具体地，N3-NOtB2以高产率经由SPS连接肽环(CNGRC)-PEG4-NH2的N末端。
使用标准SPS方案通过肽合成器制备树脂上的肽(树脂-CNGRC)，然后将半胱氨酸的侧链去保护，并且然后通过用铊(III)三氟乙酸盐使其环化。Fmoc-PEG4-OH和N3-NOtB2通过将其与HATU(5当量)和DIEA(10当量)在DMF中于室温混合2小时依次连接于树脂。使用TFA/H2O/TIS/苯酚(90:5:2.5:2.5)和HPLC纯化由树脂支持物切割后，获得了c(CNRGC)-PEG4-NOTA-N3，然后经由张力促进的炔烃-叠氮化物环加成作用(SPAAC)在N3和BCN部分之间连接环(RGDyK)-PEG4-BCN(通过将BCN-PEG4-NHS与环(RGDyK)在pH～8.5PBS缓冲液中混合制备)。
由于不含金属点击反应后三唑形成，纯化的异质二聚体(NGR-NOTA-RGD)分别在37℃、70℃和90℃被64Cu、68Ga和Al18F成功地标签标记。通过放射性HPLC检查标签标记结果。64Cu的68Ga的标签标记产率高于90％，接近于Al18F的50％。
实施例8：合成整联蛋白-CD13双重靶向化合物。
如方案5所示制备整联蛋白-CD13双重靶向化合物。从合成的方面来说，固相合成(方案4)更方便，因为用于酰胺形成(来自肽的氨基基团和来自BFC的羧酸基团之间反应)的偶联剂可以容易地去除。然而，液相合成(方案5)消耗较少量的肽和BFC；因此，其可以适合当肽和/或BFC可用量有限时的小规模制备。
方案5：合成整联蛋白-CD13双重靶向化合物。
使用双功能螯合剂(BFC)，N3-NOtB2与完全保护的c(RGDyK)经由酰胺形成反应偶联，然后在强酸性条件中去除保护基团。所得肽经由不含金属的点击反应连接BCN-c(CNGRC)。
图1显示了用N3-NOtB2-c(CNGRC)-PEG4-NOTA-PEG4-RGD制备的二聚物。受保护的线性RGDyK经由固相合成(SPS)制备，然后使用DCM中的2％TFA从树脂切割。通过用苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)处理进行受保护的RGDyK的环化。在将赖氨酸上的ivDde去保护后，Fmoc-PEG4-OH连接赖氨酸侧链上的伯胺基，然后是使用DMF中的20％哌啶将Fmoc去保护。HPLC纯化后，所得受保护的环(RGDyK)-PEG4-NH2使用EDCI和DMAP与N3-NOtB2偶联。纯化的环(RGDyK)-PEG4-NOTA-N3经由张力促进的炔烃-叠氮化物环加成作用(SPAAC)在N3和BCN部分之间连接环(CNGRC)-PEG4-BCN(通过将BCN-PEG4-NHS与环(CNGRC)在pH～8.5PBS缓冲液中混合制备)。
由于不含金属点击反应后三唑形成，纯化的异质二聚体(NGR-NOTA-RGD)分别在37℃、70℃和90℃被64Cu、68Ga和Al18F成功地标签标记。通过放射性HPLC检查标签标记结果。64Cu的68Ga的标签标记产率高于90％，接近于Al18F的50％。
实施例9：使用c(cNGRc)-c(RGDyK)异质二聚体在皮下异种移植小鼠模型中进行 PET成像。
体内PET/CT成像在具有bxpc3(人胰腺癌细胞系)和4T1(过表达整联蛋白ανβ3和CD13的鼠乳腺癌细胞系)肿瘤异种移植物的NCr裸小鼠中进行。
将bxpc3细胞(150μL PBS中的1百万个细胞)注射到小鼠的右肩皮下侧腋中，而将4T1细胞(150μL PBS中的1百万个细胞)小鼠的左肩皮下侧腋中。.CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体、(68Ga)NOTA(CNGRC)或(68Ga)NOTA(RGDyK)经由尾静脉注射注射到血流中。通过共注射环(CNGRC)和环(RGDyK)针对异质二聚体研究进行封闭研究。注射示踪剂1小时后进行小型动物PET/CT(图14)。异质二聚体CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK显示出体内表现改善的增强(诸如较长的血液潴留，更好的肿瘤/非肿瘤比)。
实施例10：使用c(cNGRc)-c(RGDyK)异质二聚体在原位异种移植小鼠模型中进行 PET成像。
在Balb/c小鼠中进行体内PET/CT成像。在将1x 106个荧光素酶转染的KPCP癌细胞原位移植到Balb/c细胞胰腺1周后，将小鼠用于PET成像。CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体、(68Ga)NOTA(CNGRC)或(68Ga)NOTA(RGDyK)经由尾静脉注射注射到血流中。通过共注射100倍的CNGRC和RGDyK针对异质二聚体研究进行封闭研究。注射示踪剂1小时后进行小型动物PET/CT(图15A-15C)。异质二聚体CNGR-(68Ga)NOTA-RGDyK显示出体内表现改善(诸如较长的血液潴留，更好的肿瘤/非肿瘤比)(图15A)。RGD-NGR异质二聚体在肌肉、血液、肝、脾、肾和原位肿瘤中的摄取分别为0.1％ID/g、0.1％ID/g、1.8％ID/g、1.1％ID/g、2.2％ID/g、0.36％ID/g和1.4％ID/g。
实施例11：使用c(cNGRc)-c(RGDyK)异质二聚体在自发性转基因小鼠模型中进行PET成像。
体内PET/CT成像在遗传工程改造的KCH(Pdx1-Cre；K-RasG12D/+；HMGB1-/-)鼠模型中进行。高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种自噬的重要调节因子，其是降解衰老(effete)蛋白和受损细胞器的主要途径，而受限于胰腺的HMGB1的条件性遗传消融抑制自噬，促进增殖，激活通常静止的途径，并且使小鼠对K-RasG12D/+驱动的胰腺致癌租用极度敏感。PanIN由低级PanIN1向高级PanIN3的进展可以在产生KCH(Pdx1-Cre；K-RasG12D/+；HMGB1-/-)后早至7天(通常为3-9个月)观察到。PET成像通常在约6周龄KCH小鼠上进行。
CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK异质二聚体、(68Ga)NOTA(CNGRC)或(68Ga)NOTA(RGDyK)经由尾静脉注射注射到血流中。通过共注射100倍的CNGRC和RGDyK针对异质二聚体研究进行封闭研究。注射示踪剂1小时后进行小型动物PET/CT(图16A-16D)。异质二聚体CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK显示出体内表现改善(诸如较长的血液潴留，更好的肿瘤/非肿瘤比)(图16A)。RGD-NGR异质二聚体在肌肉、血液、肝、脾、肾和恶性胰腺中的摄取分别为00.38％ID/g、0.23％ID/g、4.7％ID/g、3.1％ID/g、5.0％ID/g和5.9％ID/g。
此外，当于临床上广泛使用的18F-FDG比较时，异质二聚体CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK显示出特异性的肿瘤摄取和良好的肿瘤/非肿瘤比例(图16A)，所述18F-FDG在自发性转基因小鼠模型并不显示任何特异性肿瘤摄取(图16B)。
实施例12：体外高通量筛选平台
在概念研究证明中，研发了筛选RGD和AE105之间不同长度PEG间隔团(PEG4、8、12和16)的平台，用于异质二聚体靶向ανβw和uPAR。结果显示通过体内PET成像证明PEG12是最好的结构域。
制备用于上述优化的化学物质在图3中概述(RGD和AE105为分别靶向生物标记物ανβ3和uPAR的肽)。
1)通过将对应的Boc-PEGn-NHS添加于RGD的PBS缓冲液(pH＝8.2)中，然后用95％TFA进行Boc去保护，可以制备含有不同PEG长度间隔团的10个NH2-PEGn-RGD肽(n＝2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)。然后，将制备的NH2-PEGn-RGD与光-ODIBO-NHS在PBS缓冲液(pH＝8.2)中混合以产生光-OIDBO-PEGn-RGD(在图3中缩写为p-ODIBO)。
2)N3-PEG4-AE105可以通过将AE105与N3-PEG4-NHS在PBS缓冲液(pH＝8.2)中混合制备。
体外优化方法：
1)N3-PEG4-AE105将10个光-ODIBO-PEGn-RGD肽(n＝2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)中的1个以1:1摩尔比例混合以制备10个混合的靶向分子储液；
2)将10个混合的靶向分子储液中的1个添加到预接种细胞的96孔板中的孔中，(10个混合的靶向分子储液踪迹需要10个孔)；
3)靶向分子结合靶向的受体后，使用PBS缓冲液将未结合的靶向分子洗去。
4)应用UV灯(365nm)将叠氮化物-失活的光-ODIBO去保护并生成叠氮化物-激活的“ODIBO”，随后引发N3-PEG4-AE105和ODIBO-PEGn-RGD之间的连接(两者结合细胞的生物标记物)；
5)孵育额外的2-4小时后，添加N3-(64Cu)NOTA以与“过量的”ODIBO-PEGn-RGD(其结合癌细胞，但是不与N3-PEG4-AE105反应)反应；
6)使用PBS洗去过量的N3-(64Cu)NOTA；只有当N3-(64Cu)NOTA与“过量的”ODIBO-PEGn-RGD连接后，N3-(64Cu)NOTA可以保留于细胞。
7)然后将96孔板加载于高通量MicroBeta2酶标仪以测量连接于细胞上“过量”ODIBO-PEGn-RGD的N3-(64Cu)NOTA。
具有最低放射性计数的孔包含最少的“过量”ODIBO，其将获得最高量的连接产物(介于AE105-PEG4-N3和ODIBO-PEGn-RGD之间)，因此对应的间隔团为适当的长度。
实施例13：用于异质二聚体间隔团优化的高通量筛选平台
已经研发了用于快速异质二聚体间隔团优化的基于睾酮来那个细胞的通用平台以生成具有高亲合力作用的异质二聚体。通过使用该研发的平台，避免了传统方法需要重复的合成和评估异质二聚体文库的重复性。该平台可以各种间隔团筛选异质二聚体以鉴定在体外和/或体内评估中具有最佳性能的异质二聚体。
方法
感兴趣的两个配体RGD(靶向于整联蛋白αvβ3)和AE105(靶向与尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR))分别经光ODIBO基团和N3基团功能化用于原位形成异质二聚体。因此，光-ODIBO基团为光引发的不含金属的点击化学部分，其可以经去保护成为ODIBO，并在UV365nm辐照后经由张力促进的炔烃-叠氮化物环加成作用(SPAAC)与叠氮化物反应。为了提供高通量筛选的能力并促进其在研究基团中的应用，化学工具的制备旨在避免复杂的纯化。具体而言，光-ODIBO-PEG4-RGD经由用6当量的DIEA和3当量的ODIBO-PEG4-NHS处理溶解于DMSO的RGD来制备。聚乙二醇化完成后，将1X PBS添加与反应混合物，从而使过量的光-ODIBO-PEG4-NHS可以被水解成不细胞反应的光-ODIBO-PEG4-COOH。经由类似的方法通过孵育AE105与N3-PEGn-NHS(针对各类似物选定的4个PEG间隔团中的1个)，然后通过用1X PBS水解过量的NHS，进行具有不同间隔团的4个N3功能化AE105类似物的平行合成。不需要进一步的纯化，所得光-ODIBO-PEG4-RGD和4个N3-PEGPn-AE105溶液可以直接应用于下述异质二聚体间隔团优化实验中。
方案6.制备化学工具
如图17所示进行间隔团优化：将上述制备的光-ODIBO-PEG4-RGD和N3-PEGn-AE105中的一个混合，然后添加到u87MG细胞(过表达整联蛋白αvβ3受体和uPAR的人脑癌细胞系)预接种的96孔板中。将这些细胞用4％多聚甲醛预固定以将内化最小化。2小时孵育以允许RGD和AE105分别与整联蛋白αvβ3和uPAR足够的结合后，过量的(未结合的)配体使用PBS缓冲液洗去。然后，用UV灯(365nm)辐照平板2分钟以将叠氮化物失活的光-ODIBO去保护成叠氮化物激活的“ODIBO”，引发N3-PEGn-AE105和ODIBO-PEG4-RGD之间不含金属的点击反应。进行额外2小时孵育以允许不含金属的点击反应完成后，将(64Cu)NOTA-N3作为放射性清除剂添加到“过量的”ODIBO-PEG4-RGD(其结合细胞，但是不与N3-PEGn-AE105点击(click))。在将未结合的(64Cu)NOTA-N3去除后，在MicroBeta2酶标仪上测量点击ODIBO-PEGn-RGD的(64Cu)NOTA-N3。.将没有进行UV辐照的一组作为背景对照以获得由于(64Cu)NOTA-N3而导致的非特异性结合的计数。在减去由于非特异性结合而导致的背景计数后，具有最低放射性计数的孔包含最少量的(64Cu)NOTA-click-PEG4-RGD，因此原位产生的异质二聚体(AE105-PEGn-点击-PEG4-RGD)的量最高，这表明对应的间隔团长度(PEGn+4)将最适合实现高亲合力。
相较于传统策略，该平台避免了大量合成并评估由具有不同间隔团的异二聚体组成的异二聚体文库。此外，归功于β计数器的高灵敏度，对于每个测试，配体以纳摩尔级消耗，显着降低昂贵的起始材料的成本。考虑到高通量筛选方便性、灵敏度和能力的优势，这种通用快速间隔团优化平台可以极大地促进用于研究和/或临床应用的异质二聚体药物的开发。
结果和讨论
首先，估计细胞表面的一个uPAR和一个整联蛋白αvβ3受体之间的距离以选择适当长度的间隔团用于筛选，并且发现两个受体之间可能的距离可以是5nm或更小。考虑到单键的长度约为(0.15nm)，考虑到键角，由12个单键组成的PEG4单元的长度将约为1.2nm。因此，为了覆盖从1nm至5nm的距离，由PEG4、PEG8、PEG12和PEG16组成的4个间隔团被选择用于筛选目的(参见表2)。
表2.选定的用于体外筛选的间隔团
如方案6所示制备RGD-PEG4-光-ODIBO和AE105-PEGn-N3(n＝0、4、8和12)。用于使用了3当量的R-PEG-NHS酯，肽配体的转化率在30分钟通过HPLC所监测达到约95％。图18显示了将RGD转化成RGD-PEG4-光-ODIBO的示例，其中RGD、RGD-PEG4-光-ODIBO、光-ODIBO-PEG4-COOH和光-ODIBO-PEG4-NHS分别在13、19、20和21分钟被洗脱。在图18中，HPLC条件如下：0-2分钟，100％H2O；2-12分钟，由100％H2O变成80％H2O和20％ACN；12-22分钟，由80％H2O和20％CAN变成10％H2O和90％ACN；22-26分钟，10％H2O和90％ACN；26-27分钟，由10％H2O和90％CAN变成100％H2O；27-35分钟，1.5ml/分钟流速的100％H2O。根据获自HPLC光谱的定量结果，在反应混合物于室温搅拌0.5小时后，the RGD转化产率为约95％，并且少于5％的photo-ODIBO-PEG4-NHS被水解成光-ODIBO-PEG4-COOH。
添加1X PBS后，允许反应混合物静置过夜以使光-ODIBO-PEG4-NHS的水解作用最大化，仅有RGD-PEG4-光-ODIBO以及光-ODIBO-PEG4-COOH保留在反应混合物中。当制备AE105-PEGn-N3(n＝0、4、8和12)时，获得相似的观测数据。因为光-ODIBO-PEG4-COOH或N3-PEGn-COOH将由于缺少靶向配体而结合细胞，它们与未结合的RGD-PEG4-光-ODIBO或AE105-PEGn-N3一起洗掉。因此，所得5个反应混合物可以直接应用于基于细胞的筛选，不需要进一步纯化。
其后，RGD-PEG4-光-ODIBO平行地与AE105-PEG0-N3或AE105-PEG4-N3或AE105-PEG8-N3或AE105-PEG12-N3混合，产生4组储液，其各自含有RGD-PEG4-光-ODIBO和AE105-PEGn-N3(n＝0、4、8、12)中的一种。如图17所述，将4组储液应用于指定的基于细胞的筛选试验，其使用用4％多聚甲醛预固定的u87MG细胞。除了4个实验组，制备阴性对照组，其中细胞用RGD-PEG4-光-ODIBO和NH2-PEG0-AE105处理；因此，在该阴性对照组中不可以生成异质二聚体，因为ODIBO和NH2之间不存在连接。此外，存在不施用UV辐照的背景对照组；因此，检测到的(64Cu)NOTA-N3量是因其细胞上的非特异性结合而导致的。在将背景对照组中记录的非特异性结合减去后，对不同组中因其与RGD-PEG4-ODIBO连接而导致的(64Cu)NOTA-N3特异性结合进行比较。如图19所示，用N3-PEG4-AE105和N3-PEG8-AE105处理的组显示出较少量的(64Cu)NOTA-N3特异性结合，这表明RGD-PEG8-AE105和RGD-PEG12-AE105为u87MG细胞上形成最充裕的两种异质二聚体。因此，两个相应的间隔团(入口2和3)在测试的4个间隔团中为最有效的。
最终，由上述筛选试验获得的结果在体外和体内进行验证。如之前实施例所述，制备拥有不同PEG间隔团(分别为PEG4、PEG8、PEG12和PEG16)的4种RGD-AE105异质二聚体。然后，用Cu-64或Ga-68放射性标签标记制备的异质二聚体，分别用于体外和体内评估。根据如图20A所示的细胞摄取结果，含PEG16的异质二聚体显示出最高的细胞摄取，然后是含有PEG12、PEG8和PEG4的异质二聚体，4小时摄取值分别为0.46％、0.38％、0.24％和0.16％。在细胞流出实验中(图20B)，含有PEG8和PEG12的异质二聚体显示最好的细胞潴留，然后是含有PEG4和PEG16的异质二聚体，其2小时潴留值分别为44％、43％、35％和26％。考虑到4种测试的异质二聚体中的细胞摄取和潴留结果两者，含有PEG12的异质二聚体在该体外评估中展现出最高的潜能，这与由基于筛选试验设计的细胞获得的结果相一致。
通过比较获自具有u87MG异种移植物的小鼠的PET成像结果进一步进行体内验证。如图21所示，通过使用4种测试的异质二聚体PET示踪剂可以将肿瘤可视化，而含有PEG12的异质二聚体展现出最高的肿瘤对背景对比，然后是含有PEG8-、PEG16-和PEG4的异质二聚体。随后通过感兴趣区域(ROI)分析揭示了肿瘤摄取定量值(图22)。含有PEG12的异质二聚体的肿瘤摄取值为2.8％，而含有PEG8-、PEG16-和PEG4-的异质二聚体的肿瘤摄取值分别为2.4％、2.1％和1.7％，再次证明由根据筛选试验设计的细胞获得的结果。共同地，获自体外和体内评估的结果成功地验证了快速间隔团-优化平台的准确性和可靠性。经由对裸小鼠u87MG异种移植物体的PET成像，选定的AE105-PEG12-RGD进一步与两个对应的单体AE105和RGD比较。在给予异质二聚体的小鼠中获得了优秀的成像结果，这表明其由于亲合力作用比两个单体对应物更好的体内表现。
因此，使用光引发的不含金属的点击反应，通用体外筛选平台可以建立，用于简化涉及研发高亲合力异质二聚体的间隔团优化过程，其可以被广泛地用于各种双重生物标记物组合和不同的疾病。研发的筛选平台成功地应用于整联蛋白αvβ3-uPAR双重靶向的异质二聚体配体的间隔团优化。经由体外和体内评估进一步验证该平台的准确性和可靠性，其中单独地制备和评估含有所有测试的间隔团的异质二聚体。此外，为了证明高通量筛选的能力(如图17所示)，通用平台可以显著地加快和/或增强将双重受体靶向策略应用于各种生物医疗领域中，特别是当靶向的分子以低丰度暴露和/或当高亲和力(和/或特异性)单价配体不存在时。
实施例14：探索间隔团长度。
通过将对应的Boc-PEGn-NHS添加于RGD的PBS缓冲液(pH＝8.2)中，然后进行Boc去保护，可以制备含有不同PEG长度间隔团的8个NH2-PEGn-RGD肽(n＝2、4、6、8、10、12、14、16)。然后，将使用之前所报道的过程制备的光-ODIBO-NHS与制备的NH2-PEGn-RGD的PBS缓冲液(pH＝8.2)混合以生成光-OIDBO-PEGn-RGD。使用之前所报道的过程制备N3-PEG4-西妥昔单抗。N3-PEG4-西妥昔单抗和8种光-ODIBO-PEGn-RGD肽(n＝2、4、6、8、10、12、14、16)将用于体外筛选(于4℃，以使靶向探针的内化最小化)。如图11所示：1)：通过将N3-PEG4-西妥昔单抗与8种光-OIDBO-PEGn-RGD肽中的一种混合来制备8种混合的配体储液；2)在96孔板中培养U87MG细胞；3)将上述8种混合的配体储液添加到用U87MG预接种的各孔中(总计8个孔)；2)在将配体连接靶向的受体后，使用PBS缓冲液(重复5次以保证完全去除)，将过量的(未结合的)靶向配体将被洗掉；3)将使用UV灯(365nm)来使叠氮化物-失活的光-ODIBO，并生成叠氮化物-激活的“ODIBO”，随后，引发N3-PEG4-西妥昔单抗和ODIBO-PEGn-RGD之间的连接；4)在额外孵育2小时后，将64Cu标签标记的N3-NOTA与“过量的”ODIBO-PEGn-RGD(其将结合细胞，但不点击N3-PEG4-西妥昔单抗)添加至点击(click)；和5)将过量的N3-(64Cu)NOTA去除，而点击“过量的”ODIBO-PEGn-RGD的N3-(64Cu)NOTA将在MicroBeta2酶标仪上测量。将没有进行UV辐照的一组作为阴性对照以获得来自N3-(64Cu)NOTA非特异性结合的计数。在减去非特异性结合后，将对从8个ODIBO-PEGn-RGD(n＝2、4、6、8、10、12、14、16)获得的N3-(64Cu)NOTA的特异性结合进行比较。具有最低特异性结合的孔将含有最高量的点击产物(clicking product)(介于西妥昔单抗-PEG4-N3和ODIBO-PEGn-RGD)，因此，对应的结构中将会使最有效的。
含有ODIBO-PEGn-RGD的最有效力的PEG间隔团将于Tz-NOTA-N3点击，然后用64Cu标签标记，这导致Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD将会导用于对U87MG细胞的体外试验研究。Tz-(64Cu)NOTA-RGD(不存在PEG间隔团)将用用作阴性对照，因为所得异质二聚体中西妥昔单抗和RGD之间的距离太短而不能实现亲合力作用(在之前研究中证明，图5B)。简言之Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD/TCO-PEG4-西妥昔单抗连接产物(西妥昔单抗-PEG4-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD)将用于U87MG细胞的细胞摄取/流出，结合亲和力和Bmax测量。高亲合力作用在上述连接产物上确认后，将进行体内评估。用100μg TCOPEG4-西妥昔单抗预注射具有U87MG异种移植物的小鼠，而24小时后，将会注射约250-350μCi的Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD(或阴性对照组中的Tz-(64Cu)NOTA-RGD)。然后，在多个时间点(注射后(p.i.)4、18和/或28小时感染后)进行1小时动力学PET扫描。当西妥昔单抗通过肝脏清除，可以评估中期和晚期时间点肿瘤和肝脏的动力学。在中期/晚期时间点(4、18、28小时)，当大多数未连接的Tz-(64Cu)NOTAPEGn-RGD已经被洗去后，观察相对较慢的肿瘤冲洗和更快的肝脏清除(与Tz-(64Cu)NOTA-RGD进行比较)可以指示与肿瘤细胞更强的结合，并且因此，实现了体内连接产物(西妥昔单抗-PEG2-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD)的亲合力作用。
通过引用其全部内容，将本文所引用的各种参考文献的全部内容纳入本文。

Claims (68)

1.一种用于生物对象的分子成像的化合物，其包括：
至少一个第一靶向分子；和
可检测标签。
2.如权利要求1所述的化合物，其还含有至少一个第二靶向分子。
3.如权利要求2所述的化合物，其还含有螯合剂。
4.如权利要求2所述的化合物，其中，所述第一分子结合生物对象的生物标记物。
5.如权利要求4所述的化合物，其中，所述第二靶向分子结合生物对象的生物标记物。
6.如权利要求5所述的化合物，其中，所述至少一个第一靶向分子和所述至少一个第二靶向分子结合生物对象中不同的生物标记物。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述第一靶向分子是蛋白质、抗体、肽、小分子、纳米颗粒、多糖或多核苷酸。
8.如权利要求2所述的组合物，其中，所述第二靶向分子是蛋白质、抗体、肽、小分子、纳米颗粒、多糖或多核苷酸。
9.如权利要求1所述的化合物，其中，所述可检测标签是110In、111In、177Lu、52Fe、62Cu、64Cu、32P、11C、13N、15O、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、18F、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr,和其他γ-、β-或正电子-发射体。
10.如权利要求6所述的化合物，其中，所述至少一个第一靶向分子和所述至少一个第二靶向分子的生物标记物独立地是uPAR、CD13或αvβ3。
11.如权利要求10所述的化合物，其中，所述uPAR的靶向分子是AE105或AE105mut。
12.如权利要求10所述的化合物，其中，所述CD13的靶向分子是环(cNGRc)。
13.如权利要求10所述的化合物，其中，所述αvβ3的靶向分子是环(RGDyK)或环(RADyK)。
14.一种药物递送化合物，用于递送治疗有效量的活性剂至需要所述活性剂的对象，所述药物递送化合物包括：
至少一个第一靶向分子；和
活性剂。
15.如权利要求14所述的化合物，其还含有至少一个第二靶向分子。
16.如权利要求15所述的化合物，其还含有螯合剂。
17.如权利要求15所述的化合物，其中，所述第一分子结合生物对象的生物标记物。
18.如权利要求17所述的化合物，其中，所述第二分子结合生物对象的生物标记物。
19.如权利要求18所述的化合物，其中，所述至少一个第一靶向分子和所述至少一个第二靶向分子结合生物对象中不同的生物标记物。
20.如权利要求14所述的组合物，其中，所述第一靶向分子是蛋白质、抗体、肽、小分子、纳米颗粒、多糖或多核苷酸。
21.如权利要求15所述的组合物，其中，所述第二靶向分子是蛋白质、抗体、肽、小分子、纳米颗粒、多糖或多核苷酸。
22.如权利要求14所述的组合物，其中，所述所述活性剂是蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或放射性药物。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述放射性药物是67Cu、177Lu、90Y、131I、212Bi、211At、225Ac、188Re或111In。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述小分子是多柔比星、紫杉醇或氟尿嘧啶。
25.如权利要求19所述的化合物，其中，对于所述至少一个第一靶向分子和所述至少一个第二靶向分子的生物标记物独立地是uPAR、CD13或αvβ3。
26.如权利要求25所述的化合物，其中，所述uPAR的靶向分子是AE105或AE105mut。
27.如权利要求25所述的化合物，其中，所述CD13的靶向分子是环(cNGRc)。
28.如权利要求25所述的化合物，其中，所述αvβ3的靶向分子是环(RGDyK)或环(RADyK)。
29.一种多官能基螯合剂，其包含：
(a)羧基或活性酯基团，以生成酰胺键连接；
(b)叠氮基团；和
(c)螯合核心。
30.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂包含基于1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)的螯合剂。
31.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂包含N3-NOtB2或N3-DOtB3。
32.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂是：
33.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂是：
34.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂结合一个靶向分子。
35.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂结合相同靶向分子中的两个。
36.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂结合2个不同的靶向分子。
37.如权利要求29所述的多官能基螯合剂，其中，所述螯合剂结合一个靶向分子和一个染料分子。
38.一种用于靶向的医疗成像的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)多价化合物，其包含至少一个第一靶向分子、至少一个第二靶向分子和可检测标签；和
(b)使用所述试剂盒的说明书。
39.如权利要求38所述的试剂盒，其中，所述多价化合物还包括螯合剂。
40.如权利要求38所述的试剂盒，其中，所述可检测标签是64Cu、68Ga、8F、89Zr、111In或99mTc。
41.一种用于靶向的药物递送的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)多价化合物，其包含至少一个第一靶向分子、至少一个第二靶向分子和活性剂；和
(b)使用所述试剂盒的说明书。
42.如权利要求41所述的试剂盒，其中，所述多价化合物还包括螯合剂。
43.如权利要求41所述的试剂盒，其中，所述所述活性剂是蛋白质、肽、小分子、纳米颗粒或放射性药物。
44.如权利要求41所述的试剂盒，其中，所述第一靶向分子和第二靶向分子结合生物对象中不同的生物标记物。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其中，所述第一靶向分子和所述第二靶向分子的生物标记物独立地是uPAR、CD13或αvβ3。
46.如权利要求45所述的化合物，其中，所述uPAR的靶向分子是AE105或AE105mut。
47.如权利要求45所述的化合物，其中，所述αvβ3的靶向分子是环(RGDyK)或环(RADyK)。
48.一种高通常筛选平台，其包括：
(a)第一功能化靶向分子，其包含所述第一功能化靶向分子的官能团和靶向分子之间各种长度的间隔团；
(b)第二功能化靶向分子，其包含所述第二功能化靶向分子的官能团和靶向分子之间固定长度的间隔团；
(c)放射性同位素标记的官能团，其结合所述第一功能化靶向分子的官能团；和
(d)表达生物标记物的细胞，所述生物标记物被所述第一和第二功能化靶向分子的靶向分子靶向。
49.如权利要求48所述的高通量筛选平台，其中，所述第一功能化靶向分子的官能团是光不稳定官能团，而所述第二功能化靶向分子的官能团是反应性官能团，其中在用光子能量激活所述光不稳定官能团后，所述反应性官能团可以结合所述光不稳定官能团。
50.如权利要求48所述的高通量筛选平台，其中，所述第二功能化靶向分子的官能团是光不稳定官能团，而所述第一功能化靶向分子的官能团是反应性官能团，其中在用光子能量激活所述光不稳定官能团后，所述反应性官能团可以结合所述光不稳定官能团。
51.如权利要求49-50所述的高通量筛选平台，其中，所述光不稳定官能团是光-OIDBO，而所述反应性官能团是叠氮化物。
52.如权利要求51所述的高通量筛选平台，其中，所述放射性同位素标记的官能团是放射性同位素标记的叠氮化物。
53.如权利要求51所述的高通量筛选平台，其中，所述第一功能化靶向分子是光-ODIBO-PEGn-RGD肽，其中PEG为单体，而n选自2、4、6、8、10、12、14、16、18和20。
54.如权利要求51所述的高通量筛选平台，其中，所述第一功能化靶向分子是光-N3-PEGn-AE105，其中PEG为单体，而n选自2、4、6、8、10、12、14、16、18和20。
55.如权利要求51所述的高通量筛选平台，其中，所述放射性同位素标记的官能团是N3-(64Cu)NOTA。
56.如权利要求49-50所述的高通量筛选平台，其中，所述光子能是UV辐照。
57.如权利要求48所述的高通量筛选平台，其中，所述间隔团包含聚合物。
58.如权利要求57所述的高通量筛选平台，其中，所述间隔团包含PEG单体。
59.一种高通常筛选方法，其包括：
(a)将第一功能化靶向分子与第二功能化靶向分子混合以产生混合物靶向分子储液，所述第一功能化靶向分子包含所述第一功能化靶向分子的官能团和靶向基团之间各种长度的间隔团，而所述第二功能化靶向分子包含所述第二功能化靶向分子的官能团和靶向分子之间固定长度的间隔团；
(b)将所述混合的靶向分子储液与表达生物标记物的细胞孵育，所述生物标记物被所述第一和第二功能化靶向分子的靶向分子靶向；
(c)取出未结合的第一和第二功能化靶向分子；
(d)用放射性同位素标记的官能团孵育所述细胞，所述放射性同位素表位剂的官能团结合所述第一功能化靶向分子的官能团；
(e)取出未结合的放射性同位素标记的官能团；和
(f)测量所述细胞的放射性水平。
60.如权利要求59所述的高通量筛选方法，其中，所述第一功能化靶向分子的官能团是光不稳定官能团，而所述第二功能化靶向分子的官能团是反应性官能团，其中在用光子能量激活所述光不稳定官能团后，所述反应性官能团可以结合所述光不稳定官能团。
61.如权利要求59所述的高通量筛选方法，其中，所述光不稳定官能团是光-OIDBO，而所述反应性官能团是叠氮化物。
62.如权利要求61所述的高通量筛选方法，其中，所述放射性同位素标记的官能团是放射性同位素标记的叠氮化物。
63.如权利要求59所述的高通量筛选方法，其中，所述第一功能化靶向分子是光-ODIBO-PEGn-RGD肽，其中PEG为单体，而n选自下组：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和其组合。
64.如权利要求59所述的高通量筛选方法，其中，所述第一功能化靶向分子是光-N3-PEGn-AE105，其中PEG为单体，而n选自下组：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和其组合。
65.如权利要求59所述的高通量筛选方法，其中，所述放射性同位素标记的官能团是N3-(64Cu)NOTA。
66.如权利要求60所述的高通量筛选方法，其中，所述光子能是UV辐照。
67.一种在需要这样处理的对象中对感兴趣的细胞、组织或结构进行成像的方法，例如患有疾病或紊乱、处于患疾病或紊乱风险或正筛选/测试紊乱的疾病的对象，所述方法包括向所述对象给以如权利要1-28中任一项所述的一种或多种化合物。
68.如权利要求1-28中任一项所述的化合物在需要这样处理的对象中对感兴趣的细胞、组织或结构进行成像的方法中的用途，例如患有疾病或紊乱、处于患疾病或紊乱风险或正筛选/测试紊乱的疾病的对象。
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