CN112010946B - 靶向cxcr4的分子探针以及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子检测领域，更具体地，涉及靶向CXCR4的分子探针。本发明请求保护一种靶向CXCR4的分子探针，所述分子探针是具有以下序列的化合物，或其药学上可接受的盐或脂：环肽(Arg‑Nal‑Gly‑D‑Tyr‑(N‑Me)D‑Lys)‑Rn，其中，R选自由连接基团，螯合剂，放射性核素，另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段，以及小分子抑制剂组成的组；其中，n代表R的数量，n＝0‑4。该探针体外稳定性好，在肿瘤和心脏移植后急性排斥反应中显影清晰，具有很好的特异性。

Description

靶向CXCR4的分子探针以及用途
技术领域
本发明涉及分子检测领域，更具体地，涉及靶向CXCR4的分子探针。
背景技术
趋化因子是细胞因子的一个亚家族，主要介导与细胞归巢和迁移有关的生理和病理过程。趋化因子CXCL12，也称为基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)，通过与细胞表面受体CXCR4结合而发挥其生物学功能。CXCR4属于七次跨膜结构域G蛋白偶联受体超家族，在多达23种人类癌症中过表达。癌细胞过表达CXCR4有助于肿瘤生长、侵袭、血管生成、转移、复发及化疗耐药，与总体预后不良相关。研究表明，CXCR4拮抗作用可破坏肿瘤与基质之间的相互作用，使癌细胞对细胞毒性药物敏感，并抑制肿瘤的生长和转移。内皮细胞表达的多种整合素异二聚体中，整合素αvβ3在体内静止的内皮细胞中低水平表达，但在伤口血管生成，炎症和肿瘤血管生成过程中表达明显升高，是表征肿瘤新生血管生成的重要靶标。特别是，有研究报道，CXCR4和整合素αvβ3在介导癌症转移中具有协同作用。
CXCR4的参与已在多种癌症类型中得到了证明，特别是对于胰腺癌，可能是胰腺上皮内瘤变恶性转化的关键因素，并且表达水平增加也与胰腺上皮内瘤变等级的增加直接相关。此外，CXCR4几乎涉及胰腺癌发生的每个方面，尤其是侵袭和转移，并且与化疗耐药相关，CXCR4拮抗剂联合治疗能改善化疗和放疗的疗效。CXCL12/CXCR4轴通过增加血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的产生和信号传导以及增加基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和细胞粘附受体整合素(特别是整合素αvβ3)的表达，从而协同诱导和促进血管生成。除了癌症之外，心脏移植后急性排斥反应(AR)也是CXCR4的一个应用方向。目前临床上，诊断AR的“金标准”是经颈静脉心内膜心肌活检(EMB)。作为一种侵入性检查，EMB在临床操作中可能导致多种严重的并发症，如局部出血、心律失常、三尖瓣功能障碍、右心室穿孔等。此外，AR作为一种多灶型病变，由于EMB取样范围有限，容易造成假阴性的结果。AR的主要特征是T淋巴细胞和巨噬细胞为主的炎细胞浸润，伴有心肌细胞水肿和坏死。AR的本质是T淋巴细胞介导的免疫损伤，受体的T淋巴细胞能够识别移植物中的异种抗原，进而活化、增殖为不同功能的效应细胞游走至移植部位，通过直接杀伤和释放多种细胞因子发挥作用。而趋化因子主要介导与细胞归巢和迁移有关的生理和病理过程。CXCR4(趋化因子受体4型)在B细胞和T细胞上高表达，通过与趋化因子CXCL12结合而发挥其生物学功能。因此，CXCR4在免疫细胞转运过程中发挥重要作用，被认为是移植物排斥反应和移植物生存的重要调节因子。
因此，开发无创示踪机体CXCR4的分子探针，有助于早期实时动态发现和检测CXCR4高表达的组织，如恶性肿瘤以及心脏移植后急性排斥反应的心肌组织等，在CXCR4高表达疾病的诊断、分期、疗效评估等方面具有很高的临床意义。
但目前为止，靶向CXCR4的分子探针在特异性和在体的药代动力学方面仍有不足。例如，在“Molecular modeling study of cyclic pentapeptide CXCR4 antagonists:Newinsight into CXCR4–FC131 interactions”，Yasushi Yoshikawa等中报道了一个靶向CXCR4的环肽(D-Tyr-Lys-Arg-NaI-Gly)，其IC50为97nM。在“A Conformationally FrozenPeptoid Boosts CXCR4 Affinity andAnti-HIV Activity”，Oliver Demmer等中报道了一个靶向CXCR4的环肽(D-Tyr-(α-6aminohexyl)-D-Ala-Arg-NaI-Gly)，其IC50为0.04nM。
因此，本领域仍然需求一种特异性高、具备更优在体药代动力学表现的靶向CXCR4的分子探针。其能够用于CXCR4高表达，特别地，癌症和心脏移植后急性排斥反应、心梗等的疾病的诊断和治疗。
发明内容
发明人令人惊奇的发现，将环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)的个别氨基酸进行替换和修饰之后，特别地，将L-Lys替换为D-Lys并在N原子上用甲基化修饰，可以获得一种特异性很高的靶向CXCR4的分子探针。
第一方面，本发明提供了一种靶向CXCR4的分子探针，所述分子探针是具有以下序列的化合物，或其药学上可接受的盐或脂：
环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)-Rn，
其中，R选自由连接基团，螯合剂，放射性核素，另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段，以及小分子抑制剂组成的组；
其中，n代表R的数量，n＝0-4。
在本发明中，如无特别说明，氨基酸均为L-氨基酸。D-氨基酸均在氨基酸前标注D。
在一个具体的实施方案中，本发明的靶向CXCR4的分子探针的具体序列为：环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)。
在一个具体的实施方案中，本发明靶向CXCR4的分子探针的具体序列为：68Ga-NOTA-环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)，其具体结构为：
Figure BDA0002638784070000031
在一些具体的实施方案中，所述连接基团可以调整分子探针在体内的药代动力学性质，改善其在体内的分布与代谢水平，所述连接基团可以是PEGn或者Glyn，其中，n代表数量，即聚合度，n可以为0-10个。
在一些具体的实施方案中，所述螯合剂可以与功能金属配位，所述螯合剂可以是DOTA、NOTA、NETA、AATZA，或者Hynic及它们的衍生物。
在一些具体的实施方案中，所述放射性核酸可以是用于PET显像的正电子核，例如68Ga、18F-Al(18氟铝)、64Cu、89Zr；也可以是用于SPECT显像的单光子核素，例如99mTc、111In；也可以是顺磁性金属用于MRI显像，例如Gd、Mn等,还可以是用于核素靶向治疗的β或者α核素，例如188Re、186Re、177Lu、90Y、223Ra等。
在一些具体的实施方案中，所述另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段可以是靶向整合素的多肽或者单抗、单抗片段。
在一些具体的实施方案中，所述另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段可以是靶向整合素αvβ3的多肽或者单抗、单抗片段。
在一个具体的实施方案中，所述另一个靶向多肽或者单抗、单抗片段是RGDyK(环肽(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys))。
在一个具体的实施方案中，所述靶向CXCR4的分子探针的具体序列为：环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)-NOTA-点击化学-PEG4-c(RGDyK)，其中，点击化学为偶联基团，具体为endo-BCN与N3偶联。
其具体结构为：
Figure BDA0002638784070000041
在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是小分子药物。
在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是治疗癌症的药物。
在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是阿霉素，顺铂、长春碱、喜树碱、紫杉醇等。
在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是靶向整合素αvβ3的化合物。
在一些具体的实施方案中，所述小分子抑制剂可以是MK-0429、索拉非尼、伊马替尼、吉非替尼等。
本发明的靶向CXCR4的分子探针，其IC50为0.02±0.005nM，低于环肽(D-Tyr-(α-6aminohexyl)-D-Ala-Arg-NaI-Gly)，远低于环肽(D-Tyr-Lys-Arg-NaI-Gly)的IC50。该探针体外稳定性好，在肿瘤和心脏移植后急性排斥反应以及心肌梗塞中显影清晰，显像效果好于环肽(D-Tyr-(α-6aminohexyl)-D-Ala-Arg-NaI-Gly)，具有很好的特异性。
第二方面，本发明提供上述分子探针在制备用于分子成像试剂盒中的用途。
本发明提供了上述分子探针在制备用于癌症诊断试剂盒中的用途。
本发明提供了上述分子探针在制备用于癌症治疗试剂中的用途。
进一步地，所述癌症为CXCR4高表达的癌症。
在一些具体的实施方案中，所述癌症为胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等。
在一个具体的实施方案中，所述癌症为胰腺癌。
本发明提供了上述分子探针在制备用于诊断心脏移植后急性排斥反应的试剂盒中的用途。
本发明提供了上述分子探针在制备用于诊断心肌梗塞的试剂盒中的用途。
目前为止，尚未出现靶向CXCR4的分子探针用于诊断心脏移植后急性排斥反应的用途。本发明的靶向CXCR4的分子探针在出现心脏移植后急性排斥反应的移植心处，出现了较高的放射性聚集，以及良好的靶与非靶比值，因此，本发明的分子探针在用于诊断心脏移植后急性排斥反应中具有很好的特异性。
附图说明
图1中A为68Ga-yG5的分析型radio-HPLC图谱；B为68Ga-yG5 4h体外PBS稳定性；C为68Ga-yG5 4h血清稳定性；D为68Ga-yG5 2h尿液代谢稳定性；
图2中A为68Ga-yG6的分析型radio-HPLC图谱；B为68Ga-yG6 4h体外PBS稳定性；C为68Ga-yG6 4h血清稳定性；D为68Ga-yG6 2h尿液代谢稳定性；
图3中A为68Ga-yG5-RGD的分析型radio-HPLC图谱；B为68Ga-yG5-RGD 4h体外PBS稳定性；C为68Ga-yG5-RGD 4h血清稳定性；D为68Ga-yG5-RGD 2h尿液代谢稳定性；
图4中A：在30min、1h和2h时间点，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD、68Ga-yG5和68Ga-RGD的摄取；B：在30min、1h和2h时间点，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD的摄取以及用100倍过量的阻断剂RGD、AMD3100和RGD+AMD3100阻断后的摄取；C：BXPC3和MX-1细胞对68Ga-yG5-RGD在30min、1h和2h时间点的摄取(每组设置3个复孔，均数±标准差)(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)；
图5中A：在30min、1h和2h时间点，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD的内化率；B：在30min、1h和2h时间点，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD的保留率(每组设置3个复孔，均数±标准差)。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图6为心脏移植大鼠在注射5.5-7.4MBq 68Ga-yG5 1小时后的代表性静态PET/CT图像。红色箭头表示移植心。ALL：异体移植组；ALL B：异体移植阻断组；ISO：同系移植组；
图7为注射68Ga-yG5和68Ga-yG6后，在30min和1h时间点行PANC-1荷瘤小鼠PET扫描，经衰减校正所得冠状位和横断位图像(每组n＝4)以及PANC-1肿瘤对68Ga-yG5和68Ga-yG6摄取的ROI定量分析(箭头指示肿瘤；每组4只荷瘤小鼠；均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图8中A为注射68Ga-yG5-RGD 30min、1h和2h时间点BXPC3荷瘤小鼠的PET/CT图像；B为注射68Ga-yG5 30min、1h和2h时间点BXPC3荷瘤小鼠的PET/CT图像；C为注射68Ga-RGD30min、1h和2h时间点BXPC3荷瘤小鼠的PET/CT图像(衰减校正；冠状位和横断位图像；箭头指示BXPC3肿瘤；注射剂量：5.55～7.4MBq(150～200μCi))；D为BXPC3肿瘤对68Ga-yG5-RGD、68Ga-yG5和68Ga-RGD摄取的ROI定量分析(每组4只荷瘤小鼠；均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图9中A为注射68Ga-yG5-RGD后，在30min、1h和2h时间点行BXPC3和对照组MX-1荷瘤小鼠的小动物PET/CT扫描，经衰减校正所得冠状位和横断位图像(每组n＝4)；B为BXPC3和对照组MX-1肿瘤对68Ga-yG5-RGD摄取的ROI定量分析(箭头指示肿瘤；每组4只荷瘤小鼠；均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图10为68Ga-yG5和68Ga-yG6注射2h后的PANC-1荷瘤鼠的生物分布研究。68Ga-yG5和68Ga-yG6的肿瘤(tumor)、肝脏(liver)和脾脏(spleen)统计分析。(每组n＝4，％ID/g均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图11中A为68Ga-yG5-RGD、68Ga-yG5和68Ga-RGD注射90min后的BXPC3荷瘤鼠的生物分布研究；B为68Ga-yG5-RGD、68Ga-yG5和68Ga-RGD的肿瘤(tumor)、肿瘤/血液(tumor/blood)、肿瘤/肌肉(tumor/muscle)、肿瘤/肾脏(tumor/kidney)和肿瘤/肝脏(tumor/liver)分析。(每组n＝4，％ID/g均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图12中A为单独注射68Ga-yG5-RGD或共注射阻断剂AMD3100(10mg/kg)、RGD(10mg/kg)和双阻断AMD3100(10mg/kg)+RGD(10mg/kg)，90min后的BXPC3荷瘤鼠的生物分布研究；B为未阻断组、AMD3100阻断组、RGD阻断组及AMD3100+RGD双阻断组的肿瘤摄取差异的统计分析(每组n＝4，％ID/g均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图13中A为注射68Ga-yG5-RGD 90min后BXPC3和对照组MX-1荷瘤小鼠的生物分布研究；B为BXPC3和对照组MX-1肿瘤对68Ga-yG5-RGD摄取差异的统计分析(每组n＝4；％ID/g均数±标准差；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；
图14为本发明靶向CXCR4的分子探针一个实例的具体结构图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、分子探针制备
环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)的制备
1、合成多肽yG5：环肽(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)，简称为yG5，使用Fmoc固相多肽合成法制备，其中，D-Lys具有甲基化修饰；2、合成NOTA-yG5：yG5与螯合剂p-SCN-Bn-NOTA缀合，经HPLC纯化后得到NOTA-yG5；3、68Ga标记：将NOTA-yG5(20nmol)溶解到醋酸钠缓冲液(1mL，0.25M，pH 6.8)中，加入4mL 68GaCl3的0.05M盐酸溶液。混合物在100℃加热10分钟。通过C18固相萃取小柱进行纯化，2mL 50％乙醇淋洗，并通过无菌滤膜进入产品瓶，再用8mL生理盐水淋洗至产品瓶得到68Ga-NOTA-yG5，简称68Ga-yG5。通过radio-HPLC测定放化纯。
c(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)-NOTA-click-PEG4-c(RGDyK)的制备
通过双功能螯合剂NO2AtBu-N3将yG5和c(RGDyK)肽偶联起来构建靶向CXCR4/整合素αvβ3的多肽异二聚体配体。简言之，首先将yG5与NO2AtBu-N3偶联，然后在三氟乙酸(Trifluoroacetic Acid,TFA)的作用下，脱掉氨基的保护基，HPLC纯化之后得到N3-NOTA-yG5。然后通过无铜点击化学的方法将N3-NOTA-yG5和BCN-PEG4-c(RGDyK)按照摩尔比1:1进行反应得到多肽异二聚体c(Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys)-NOTA-click-PEG4-c(RGDyK)(简称为NOTA-yG5-RGD)。分别取4nmol NOTA-yG5-RGD、NOTA-c(RGDyK)和NOTA-yG5，加入到150μL乙酸钠缓冲液(0.25M,pH 6.8)中。随后，加入500μL[68Ga]GaCl3(0.05M HCl,～111MBq)，涡旋混匀。反应混合溶液的最终pH值约为4.0。然后加热至100℃，反应5～7min，得到68Ga-NOTA-yG5-RGD(简称68Ga-yG5-RGD)、68Ga-NOTA-c(RGDyK)(简称68Ga-RGD)和68Ga-yG5
另参照文献合成对比例环肽(D-Tyr-(α-6aminohexyl)-D-Ala-Arg-NaI-Gly)(简称yG6)。修饰螯合剂后，标记68Ga，得到68Ga-NOTA-yG6，简称68Ga-yG6。
实施例2、分子探针体内、外稳定性鉴定和脂水分配系数Log P值测定
将68Ga-yG5和68Ga-yG6与人新鲜血清及PBS分别孵育4h后，用分析型radio-HPLC进行鉴定。如图1和2所示，完整探针所占比仍大于90％，说明68Ga-yG5和68Ga-yG6体外稳定性好。用正常的Balb/c裸鼠来检测两个探针的体内代谢稳定性，2h时，尿液中的不到10％的68Ga-yG5和68Ga-yG6出现降解和脱标，完整探针所占比例仍大于90％，说明两个探针在体内稳定性较好。68Ga-yG5、68Ga-yG6的Log P值分别为-0.35±0.09、0.17±0.02。
将68Ga-yG5-RGD与人新鲜血清及PBS分别孵育2h后，用分析型radio-HPLC进行鉴定。如图3B和3C所示，完整探针所占比仍大于99％，说明68Ga-yG5-RGD在体外非常稳定。用正常的Balb/c裸鼠来检测68Ga-yG5-RGD的体内代谢稳定性，如图3D示，2h时，尿液中的68Ga-yG5-RGD几乎没有观察到降解和脱标，完整探针所占比例仍大于99％，说明该探针在体内稳定性很好。68Ga-yG5-RGD、68Ga-RGD的Log P值分别为-2.47±0.04、-3.22±0.02。
实施例3、分子探针的体外靶向效率检测
取对数期增长的BXPC3细胞，计数，然后以每孔1.5×105个细胞接种在24孔板中，培养过夜。弃去培养液，每孔加入800μL不含血清和双抗的DMEM培养基继续培养30min～1h。随后每孔分别加入50μL 68Ga-yG5-RGD(1pmol，74kBq)、50μL 68Ga-yG5(1pmol，74kBq)和50μL 68Ga-RGD(1pmol，74kBq)，37℃培养箱中孵育30min、1h和2h(每个时间点设置3个复孔)。孵育结束时，收集上清于试管中，每个孔用预冷的PBS洗两遍并收集于同一试管中。随后，每孔加入800μL NaOH溶液(1M)作用5min裂解细胞，收集细胞裂解液于另一试管中，每孔用PBS洗两遍，并收集于同一试管中。用全自动γ计数仪测量每管的放射性计数。细胞摄取率表示为：细胞放射性计数/(上清放射性计数+细胞放射性计数)×100％。如图4A所示，随着时间的延长，BXPC3对三个探针的摄取均成上升趋势。在30min、1h和2h时，BXPC3对68Ga-yG5-RGD的摄取分别为2.45±0.33％、4.32±0.29％和5.71±1.13％，68Ga-RGD的摄取分别0.43±0.05％(P<0.001)、0.49±0.02％(P<0.001)和0.58±0.06％(P<0.001)，68Ga-yG5的摄取分别为1.35±0.10％(P<0.001)、1.44±0.17％(P<0.001)和1.87±0.16％(P<0.001)。
用BXPC3细胞进行细胞阻断实验。其中一组细胞每孔仅加入50μL68Ga-yG5-RGD(1pmol，74kBq)，其余组的细胞每孔分别加入100pmol未标记的AMD3100、RGD及AMD3100+RGD，孵育15min后，每孔再加入50μL68Ga-yG5-RGD(1pmol，74kBq)，37℃孵育30min、1h和2h，分别收集上清和细胞，测量放射性计数。如图4B所示，当分别加入100倍过量的阻断剂RGD(1.21±0.08％，P<0.001；1.06±0.09％，P<0.001；1.18±0.09％，P<0.001)、AMD3100(1.12±0.09％，P<0.001；1.14±0.15％，P<0.001；1.44±0.16％，P<0.001)和AMD3100+RGD(双阻断剂)(1.22±0.13％，P<0.001；1.34±0.08％，P<0.001；1.43±0.12％，P<0.001)时，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD的摄取均明显降低。对照组MX-1细胞对68Ga-yG5-RGD的摄取在30min(1.10±0.15％，P<0.001)、1h(1.06±0.08％，P<0.001)和2h(1.58±0.06％，P<0.001)时间点均明显低于BXPC3细胞(图4C)。
用BXPC3细胞进行细胞内化实验。每孔常规加入68Ga-yG5-RGD孵育30min、1h和2h。孵育结束时，收集上清于试管中，用预冷的PBS洗两遍并收集于同一试管中。随后，每孔加入800μL乙酸缓冲液(50mM甘氨酸、100mM NaCl、pH 2.8)孵育3min。收集乙酸缓冲液并用PBS洗两遍。然后加入NaOH溶液裂解细胞并收集细胞裂解液。测定上清液、乙酸缓冲液和细胞裂解液的放射性计数，计算内化率：细胞放射性计数/(上清放射性计数+乙酸缓冲液放射性计数+细胞放射性计数)×100％。实验结果如图5所示，30min时，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD的内化率为51.30±2.09％。随着时间的延长，内化率增高，1h时，达到最高值为79.41±11.11％。随后，内化率下降，到2h时，内化率为59.80±11.87％(图5A)。
用BXPC3细胞进行细胞流出实验。每孔常规加入68Ga-yG5-RGD孵育2h。孵育结束时，收集上清于试管中。随后，每孔加入800μL DMEM培养基(不含血清和双抗)，继续孵育30min、1h和2h。孵育结束时，分别收集上清和细胞裂解液并测量放射性计数。计算流出率：细胞放射性计数/(上清1放射性计数+上清2放射性计数+细胞放射性计数)×100％。实验结果如图5所示，30min时，BXPC3细胞对68Ga-yG5-RGD的保留率为93.5±19.03％。随着孵育时间的延长，68Ga-yG5-RGD逐渐流出，1h时，保留率降至80.89±13.55％。接着，68Ga-yG5-RGD继续流出，2h时，保留率下降至58.52±6.04％(图5B)。
实施例4、单靶点分子探针的心脏成像
异体移植组模型由BN大鼠的心脏移植至Lewis大鼠体内，同系移植组模型由Lewis大鼠的心脏移植至Lewis大鼠体内。建模后5天行PET显像，三组大鼠分别经尾静脉注射68Ga-yG5(5.5-7.4MBq)后，分别在注射后0.5、1、2h后行PET显像。异体移植阻断组在注射探针0.5h前提前注射100倍剂量的阻断剂(AMD3100，CXCR4抑制剂)。结果如图6所示，探针在异体移植鼠的移植心处有较高的放射性聚集及良好的靶与非靶比值，在异体移植阻断组中放射性聚集较低，而同系移植因未发生急性排斥反应，故移植心处无放射性浓聚。异体移植组、异体移植阻断组和同系移植组移植心的摄取值((％ID/g,均数±标准差)(n＝5))分别为：13.24±0.97、2.95±0.12、1.03±0.03，表明该靶向探针对心脏移植后急性排斥反应有很好的特异性。
实施例5、单靶点分子探针的肿瘤成像
注射68Ga-yG5和68Ga-yG6后，在30min和1h时间点行PANC-1荷瘤小鼠PET扫描，经衰减校正所得冠状位和横断位图像(每组n＝4)。之后对68Ga-yG5和68Ga-yG6摄取的ROI定量分析。如图7所示，68Ga-yG5的肿瘤显影清晰于68Ga-yG6，且勾画ROI计算摄取值可以看出68Ga-yG5(1.42±0.17％ID/g,30min；1.20±0.10％ID/g,60min)的肿瘤摄取显著高于68Ga-yG6(0.93±0.10％ID/g,30min,P<0.01；0.65±0.10％ID/g,60min,P<0.01)。由此可见，68Ga-yG5的特异性远高于68Ga-yG6。
实施例6、双靶点分子探针的肿瘤成像
收集对数期增长的BXPC3和MX-1细胞，常规胰酶消化，收集细胞沉淀并计数。随后，用预冷的PBS洗两遍，离心收集细胞沉淀。按照体积比PBS:基质胶＝1:1配制细胞重悬液，充分吹打细胞，然后接种于小鼠右上肢靠近腋窝处的皮下，每只小鼠接种1×107个细胞(体积为125μL/只)。待肿瘤直径长至8mm～10mm时，用作后续实验。
分别注射68Ga-yG5-RGD、68Ga-RGD和68Ga-yG5(5.55-7.4MBq,150μL)，30min、1h及2h后进行PET/CT扫描(10min PET扫描+6min CT扫描)。扫描结束之后，经衰减校正后重建PET图像和CT图像，并用Amide软件勾画感兴趣区(Region of interest,ROI)计算摄取值(％ID/g)。
用BXPC3模型鼠评估双靶向探针68Ga-yG5-RGD的体内靶向特异性，每组小鼠(n＝4)分别共注射68Ga-yG5-RGD(5.55-7.4MBq,150μL)与阻断剂，即未标记的AMD3100(10mg/kg)、RGD(10mg/kg)及AMD3100(10mg/kg)+RGD(10mg/kg)(双阻断)，30min后进行PET/CT扫描。
对照组MX-1乳腺癌模型鼠(n＝4)经尾静脉注射68Ga-yG5-RGD(5.55-7.4MBq,150μL)，30min、1h及2h后进行PET/CT扫描。
如图8A所示，68Ga-yG5-RGD主要累积于腹部(肝脏和双肾)与膀胱，说明该探针主要经肝胆、胃肠道及肾脏代谢。注射68Ga-yG5-RGD 30min后肿瘤即显影十分清晰；至1h和2h时，肿瘤轮廓仍十分清晰。注射68Ga-yG5后，放射性主要累积于腹部和膀胱，说明该探针主要经肝胆、胃肠道及肾脏代谢。在观察的30min至2h内，肿瘤显影较清晰，但由于68Ga-yG5的代谢路径，整体背景放射性很高(图8B)。68Ga-RGD主要经肾脏-膀胱代谢，肝脏累积较少。注射68Ga-RGD 30min时，肿瘤显影较清晰，随着探针的代谢，至1h和2h时，肿瘤轮廓仍可见(图8C)。通过冠状位图像对肿瘤组织区域进行ROI勾画和定量分析，如图8D所示，BXPC3肿瘤对68Ga-yG5-RGD的摄取在30min、1h和2h时分别为4.03±0.10％ID/g、3.12±0.16％ID/g和2.69±0.18％ID/g，68Ga-yG5的摄取在30min、1h和2h时分别为1.97±0.12％ID/g、1.81±0.13％ID/g和1.46±0.09％ID/g，和68Ga-RGD的摄取在30min、1h和2h时分别为2.97±0.41％ID/g、1.92±0.20％ID/g和1.63±0.10％ID/g(每组n＝4)。
同时，也在MX-1肿瘤模型中研究68Ga-yG5-RGD的体内表现，该模型不表达或弱表达CXCR4和整合素ανβ3。如图9A所示，注射68Ga-yG5-RGD 30min、1h和2h后，MX-1肿瘤显示不清晰，接近于或低于整体背景。对肿瘤组织勾画ROI进行定量分析，如图9B所示，注射探针30min、1h和2h后，MX-1肿瘤对68Ga-yG5-RGD的摄取值分别为1.42±0.16％ID/g(P<0.001)、1.11±0.19％ID/g(P<0.001)和0.74±0.13％ID/g(P<0.001)，均明显低于BXPC3。
实施例7、分子探针的生物分布
生物分布研究分组与PET/CT显像分组一致。每组模型鼠(n＝4)经尾静脉单独注射探针或探针+阻断剂，探针剂量为5.55-7.4MBq(150μL)，阻断剂剂量为10mg/kg，90min后，颈椎脱臼处死小鼠，收集感兴趣组织或器官：血液、脑组织、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、胃、小肠、大肠、肌肉、骨、全尾、肿瘤组织及胰腺。清洗、称重，并用全自动γ计数仪测量这些组织或器官的放射性计数(counts per minute,CPM)。进行衰减校正之后，每个组织或器官的摄取值表示为：每克组织注射剂量百分比(％ID/g)＝
Figure BDA0002638784070000131
如图10所示，68Ga-yG5和68Ga-yG6两个探针均主要分布于肝脏、脾脏和肾脏，与显像结果一致。68Ga-yG5在肝脏(3.42±0.10％ID/g)和脾脏(0.84±0.27％ID/g)的累积均明显低于68Ga-yG6(11.26±0.84％ID/g,P<0.001；1.48±0.23％ID/g；P<0.05)。PANC-1肿瘤对68Ga-yG5(0.77±0.07％ID/g)的摄取显著高于68Ga-yG6(0.45±0.05％ID/g,P<0.001)。
如图11所示，68Ga-yG5-RGD在肝脏和肾脏中的摄取最高，分别为5.58±0.24％ID/g和2.89±0.40％ID/g，进一步说明68Ga-yG5-RGD主要经肝脏和肾脏代谢。同样，68Ga-yG5和68Ga-RGD在肝脏和肾脏中的摄取最高，分别为7.08±0.88％ID/g、2.67±0.10％ID/g和1.27±0.15％ID/g、1.58±0.11％ID/g。BXPC3肿瘤对68Ga-yG5-RGD(2.54±0.44％ID/g)的摄取显著高于对68Ga-yG5(0.90±0.18％ID/g，P<0.01)和68Ga-RGD(1.21±0.06％ID/g，P<0.01)的摄取。68Ga-yG5-RGD的肿瘤/血液(14.48±0.80 vs 2.01±0.43，P<0.001)、肿瘤/肌肉(13.58±0.81 vs 3.86±1.29，P<0.001)、肿瘤/肾脏(0.90±0.29 vs 0.34±0.06，P<0.05)及肿瘤/肝脏(0.46±0.10 vs 0.13±0.04，P<0.05)均高于68Ga-yG5。68Ga-RGD的肿瘤/血液(10.76±2.04，P<0.05)、肿瘤/肌肉(8.61±0.61，P<0.01)低于68Ga-yG5-RGD，但68Ga-RGD的肿瘤/肾脏(0.77±0.06，P>0.05)与68Ga-yG5-RGD没有差异，68Ga-RGD的肿瘤/肝脏(0.96±0.15，P>0.05)高于68Ga-yG5-RGD。
为了进一步研究68Ga-yG5-RGD的体内靶向特异性，用BXPC3荷瘤鼠进行阻断实验的生物分布研究。每只BXPC3荷瘤小鼠经尾静脉单独注射68Ga-yG5-RGD(5.55-7.4MBq)或共注射阻断剂AMD3100(10mg/kg)、RGD(10mg/kg)和双阻断AMD3100(10mg/kg)+RGD(10mg/kg)，90min后处死小鼠进行生物分布研究。如图12所示，未阻断组肿瘤对68Ga-yG5-RGD的摄取(2.54±0.44％ID/g)明显高于AMD3100阻断组(0.89±0.28％ID/g，P<0.001)、RGD阻断组(0.47±0.05％ID/g，P<0.001)以及AMD3100+RGD双阻断组(0.37±0.07％ID/g，P<0.001)。
同时，也用MX-1荷瘤鼠(弱表达CXCR4和整合素ανβ3)进行68Ga-yG5-RGD的生物分布研究。注射68Ga-yG5-RGD 90min后进行BXPC3和MX-1荷瘤鼠的生物分布研究。如图13所示，MX-1肿瘤对68Ga-yG5-RGD的摄取(0.42±0.11％ID/g，P<0.001)明显低于BXPC3。

Claims (9)

1.一种靶向CXCR4的化合物，所述化合物是以下结构的化合物，或其药学上可接受的盐或脂：
环肽-Rn，
其中，环肽为Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys
其中，R选自由连接基团，螯合剂，放射性核素，另一个靶向多肽，以及小分子抑制剂组成的组；
其中，n代表R的数量，n＝0-4。
2.根据权利要求1所述的靶向CXCR4的化合物，其中，所述化合物的具体序列为：Arg-Nal-Gly-D-Tyr-(N-Me)D-Lys。
3.根据权利要求1所述的靶向CXCR4的化合物，其中，所述连接基团是PEGn或者Glyn，其中，n为0-10。
4.根据权利要求1所述的靶向CXCR4的化合物，其中，所述螯合剂是DOTA、NOTA、NETA、AATZA，或者Hynic。
5.根据权利要求1所述的靶向CXCR4的化合物，其中，所述放射性核素是68Ga、18F-Al(18氟铝)、64Cu、89Zr、99mTc、111In、188Re、186Re、177Lu、90Y，或者223Ra。
6.根据权利要求1所述的靶向CXCR4的化合物，其中，所述另一个靶向多肽是靶向整合素的多肽。
7.根据权利要求6所述的靶向CXCR4的化合物，其中，所述靶向整合素的多肽是Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys。
8.权利要求1-7中任一项所述的靶向CXCR4的化合物在制备用于癌症诊断试剂盒中的用途。
9.权利要求1-7中任一项所述的靶向CXCR4的化合物在制备用于诊断心脏移植后急性排斥反应的试剂盒中的用途。
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