KR101921212B1 - 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101921212B1
KR101921212B1 KR1020170085104A KR20170085104A KR101921212B1 KR 101921212 B1 KR101921212 B1 KR 101921212B1 KR 1020170085104 A KR1020170085104 A KR 1020170085104A KR 20170085104 A KR20170085104 A KR 20170085104A KR 101921212 B1 KR101921212 B1 KR 101921212B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
breast cancer
peptide
present
cells
peptides
Prior art date
Application number
KR1020170085104A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180004681A (ko
Inventor
이병헌
이윤기
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Publication of KR20180004681A publication Critical patent/KR20180004681A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101921212B1 publication Critical patent/KR101921212B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 펩타이드는 유방암에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 유방암의 진단, 치료 또는 영상화용 조성물의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도{Peptides for targeting breast cancer and uses thereof}
본 발명은 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
유방암은 여성에 있어 가장 흔한 암이며, 두 번째로 사망률이 높은 암이다. 2001년 유방암의 유병률은 미국에서 100,000명당 90-100이었으며, 유럽에서는 100,000 명당 50-70이었다. 이 질환의 발병은 세계적으로 점점 증가하는 추세에 있다. 유방암의 위험 인자는 인종, 나이 및 암 억제 유전자 BRCA-1 및 BRCA-2 및 p53에서의 돌연변이 등을 포함한다. 알코올 섭취, 고지방 식이, 운동 부족, 외인성 폐경 후 호르몬 및 이온화 방사선 또한 유방암의 발명 위험을 증가시킨다. 에스트로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체 음성 유방암(각각 "ER-" 및 "PR-"), 큰 종양 크기, 높은 등급의 세포진단결과, 및 35세 이하인 경우 그 예후가 나쁘다(Goldhirsch et al. (2001). J. Clin. Oncol. 19: 3817-27). 2005년 약 212,000건의 새로운 침습성 유방암 증례 및 58,000건의 새로운 비침습성 유방암증례가 진단될 것으로 추산되며, 40,000명의 여성이 유방암으로 사망할 것으로 예상된다.
현재의 유방암에 대한 치료 방법은 수술 이후, 항암 치료, 항호르몬 치료, 표적 치료 혹은 방사선 치료 등 향후 재발을 줄이기 위한 추가 보조적인 치료가 필요한 경우가 많다, 유방암은 유방암 주요 수용체의 상태에 따라 암의 특성이 다르며, 따라서 조직검사를 통해 호르몬 수용체(ER 및 PR) 발현 유무와 ‘HER-2’ 과발현 여부 및 전이 상태 확인 및 림프절 전이 여부(양성 또는 음성)를 고려하여 추후 치료 방법에 대한 근거를 확립하고 있다. 비록 이러한 임상적 정보들이 치료를 결정짓는 지표로 널리 사용되고 있지만 임상적 지표의 표현형보다 암의 이질성이 더 커 모든 암의 예후를 판단할 수 없을뿐더러, 그 효용성에서도 한계를 드러내고 있다.
호르몬 수용체 양성인 유방암의 경우 호르몬 치료제인 타목시펜(Tamoxifen)이 효과적인 표적 치료제로 사용되고 있고, Her-2 과발현 유방암의 경우 항체치료제인 허셉틴(Herceptin)이 효과적인 표적 치료제로 사용되고 있다. 반면 삼중음성 유방암의 경우 표적 치료제가 아직 없으며 기존의 항암화학요법을 주로 시행하고 있으나 재발이 흔하고 재발시는 약물에 반응을 잘 하지 않아 예후가 나쁜 편이다.
한편, 약물을 특정 조직으로 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 치료제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문이다. 또한 유전자 치료에 적용할 경우 바이러스를 특정 조직에 선택적으로 전달시킴으로써 치료 효율을 올리고 심각한 부작용을 줄일 수 있다. 이를 위해 지금까지는 주로 특정 조직에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔다. 그러나 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제가 존재한다. 반면 펩타이드의 경우는 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 것이 장점이다. 따라서 표적 펩타이드를 기존의 치료제와 연결하게 되면 특정 조직에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있으므로, 유방암의 표적 펩타이드 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 유방암의 치료 및 진단에 사용될 수 있는 유방암 표적 펩타이드를 개발하기 위하여 연구들 거듭하던 중, 파지 펩타이드 디스플레이 기술을 이용하여 유방암 조직에 특이적인 펩타이드를 탐색하고, 상기 펩타이드가 유방암의 진단 마커 및 지능형 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 마커를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 영상화용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 영상화용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드를 제공한다.
유방암은 하나의 질환으로 여겨져 왔지만, 최근 유방암에는 다양한 종류의 아형(subtype)이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서 상기 유방암은 암의 발병과 밀접하게 관련이 되어 있는 단백질에 따라 크게 세 종류의 그룹으로 구분되어질 수 있다. 즉, HER-2(human epidemal growth factor receptor 2) 과발현 유방암, 에스트로겐 수용체 양성인 루미날형 유방암 및 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER-2가 모두 발현되어 있지 않은 삼중음성 유방암으로 구분될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 루미날형 유방암 세포인 MCF7, HER-2형 유방암 세포인 Skbr3 또는 삼중음성 유방암 세포인 MDA-MB-231세포에 각각 처리한 결과, 모든 아형의 유방암 세포에 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도, 상기 펩타이드는 삼중 음성 유방암 세포에 더 높은 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다.
삼중음성 유방암은 전체 유방암의 15%정도로서 그 빈도는 낮은 편이나 다른 유방과는 달리 표적 수용체가 발현되어 있지 않아 마땅한 타겟 치료제가 없으며, 항암화학요법 이후 잘 재발하여 예후가 나쁜 편이다. 따라서, HER-2형 유방암 및 루미날형 유방암보다 삼중 음성 유방암 세포에 더 높은 특이성을 나타내는 본 발명의 펩타이드들은 현재 효과적인 치료제가 부족하고 잘 재발하는 삼중음성 유방암에 대한 효율적인 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명에서 상기 유방암은 루미날형, HER-2형 또는 삼중음성 유방암일 수 있고, 가장 바람직하게는 삼중음성 유방암일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드'라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명에서 상기 서열번혼 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 이의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. “기능적 변이체”란 유방암 세포에 결합하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 아미노산 위치에서 일부 아미노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다.
한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기에서 기재한 바와 같이 수득할 수 있으며, 바람직하게는 각각 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열을 가질 수 있다. 발현벡터는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(예. 프로모터, 인핸서 등), 선별 마커(selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다. 바람직하게는 형질전환체는 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세포에 도입하여 수득할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 펩타이드 단독 또는 펩타이드 및 이와 결합하는 유방암 치료물질을 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 유방암을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 약제는 종래 유방암의 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 유방암을 예방하는 약물로 허가 받은 라록시펜 하이드로클로라이드(Raloxifene hydrochloride), 타목시펜 시트레이트(Tamoxifen citrate) 등 이거나, 또는 유방암을 치료하는 약물로 허가 받은 메쏘트렉세이트(Methotrexate), 파클리탁셀(Paclitaxel), 트라스투주맙(Trastuzumab), 에버로리무스(Everolimus) 등일 수 있다.
본 발명의 펩타이드와 유방암 치료물질의 결합은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있으며, 본 발명의 펩타이드와 유방암 치료물질이 직접적으로 결합되거나 또는 매개체를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있다. 아울러, 상기 결합은 생체 외에서 수행될 수도 있으나, 본 발명의 펩타이드 및 유방암 치료물질은 개별적으로 투여되어 생체 내에서 결합될 수도 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드 또는 유방암 치료물질은 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 유방암 세포에 결합되어 유방암 치료물질이 적절하게 투여되었는지 여부를 용이하게 확인하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소 등으로 표지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합되는 유방암 치료물질의 양은 결합되는 약제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며, 바람직하게는 유방암 세포에 충분히 전달되어, 유효한 효과를 보이는 양일 수 있다. 그러나, 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드를 약제와 결합시켜 유방암을 치료하기 위한 용도에 따른 본 발명의 펩타이드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 예컨대, 본 발명의 펩타이드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩타이드를 L형 아미노산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주사, 근육내 주사, 정맥 주사 등이 있는데, 바람직하게는 정맥 주사일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다
또한, 본 발명의 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 예를 들면, 주사제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington'sPharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는, 예컨대 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및/또는 안정화제를 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드를 포함하는 유방암에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 펩타이드는 유방암 치료제와 같은 약물을 유방암 조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 유방암 치료제와 연결하여 유방암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 유방암 치료제가 유방암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 이에 한정되지는 않으나, 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin) 마리마스타트(Marimastat)및 트로케이드(Trocade) 등일 수 있다.
본 발명의 펩타이드와 상기 약물은 공유결합으로 연결될 수 있고, 특히, 링커(Linker)에 의해 연결될 수 있으나, 이에 제한을 두지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다.
이 때, 본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 유방암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다. 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 상기 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 유방암 세포에 대해서 유용하게 표적되므로 유방암 진단을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.
상기 진단용 조성물에는 본 발명의 펩타이드 이외에도 펩타이드 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있으며, 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃가 유지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 펩타이드가 유방암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 바이오틴(biotin), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 자기공명영상조영제(예: 수퍼파라마그네틱 산화철(superparamagnetic iron oxides, SPIO), 울트라수퍼파라마그네틱 산화철(ultrasuperparamagnetic iron oxides, USPIO)) 등 일 수 있다. 유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 유방암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 유방암으로 진단된다. 또한 검출가능한 표지로 방사선 물질을 이용하는 경우에는 양전자단층촬영(Positron emission tomography:PET)으로 펩타이드에 의한 방사능을 관찰하여 유방암을 진단할 수 있다. 이 경우에는 보다 민감하게 유방암의 진단 및 분자영상이 가능할 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에는 상기한 바와 같은 발색효소 또는 방사선 동위원소 등으로 표지된 펩타이드가 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 펩타이드 이외에 상기 펩타이드와 유방암 세포의 결합 반응을 위한 적당한 완충용액 또는 배지 및 대조군 세포(정상 뇌세포)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 펩타이드의 표지를 위한 검출가능한 표지가 추가로 키트에 포함될 수 있다. 양자택일적으로, 본 발명의 펩타이드에 대한 항체, 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등이 상기 키트에 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명의 펩티드에 대한 항체는 상기 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 통상적인 항체의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 유방암 세포를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 유방암 세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 유방암을 진단할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유방암 영상화용 조성물은 본 발명의 펩타이드를 함유하여 유방암을 영상화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 영상화용 조성물은 반음영부를 영상화하거나 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 종래 음영부의 영상화 기술을 이용하여 반음영부와 음영부의 상대적 크기 및 정도를 측정함으로써 약물 치료를 통한 예후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 펩타이드는, 이에 한정되지는 않으나, 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(superparamagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 루미날형 유방암 세포인 MCF7, 삼중음성 유방암 세포인 MDA-MB-231세포, 폐암 세포인 A549 세포, 정상 폐 세포인 BEAS-2B 세포, 정상 콩팥 세포임 HEK-293 세포에 각각 처리한 결과, 상기 폡타이드는 삼중음성유방암세포에 결합능이 상대적으로 더 높은 것으로 보아, 삼중 음성 유방암 세포에 더 높은 특이성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서는 MDA-MB-231 세포를 마우스의 피부 아래 이식한 뒤 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 정맥 주사로 투여한 뒤, 각 종양을 적출하여 형광 세기를 측정한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 4의 펩타이드를 처리한 종양 조직이 대조군에 비해 높은 형광 세기를 나타냈으며, 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 종양 조직이 다른 펩타이드를 처리한 종양 조직에 비하여 더 높은 형광 세기를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 펩타이드는 유방암에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 유방암의 진단, 치료 또는 영상화용 조성물의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 파지 라이브러리 스크리닝을 위해 본 발명에서 사용된 두 가지 전략인 negative subtraction(A) 및 positive selection(B) 스크리닝 과정을 나타낸다.
도 2는 MCF7, SKBR3, MDA-MB-231 세포를 대상으로 negative subtraction 스크리닝한 결과, 각 라운드(R1 ~ R5)에서 회수된 파지 역가를 나타낸다.
도 3은 MDA-MB-231 세포를 대상으로 positive selection 스크리닝한 결과, 각 라운드(R1　~ R5)에서 회수된 파지 역가를 나타낸다.
도 4는 negative subtraction 스크리닝(A) 및 positive selection 스크리닝(B)을 통해 선별한 파지 클론에 삽입된 펩타이드 코딩 유전자 서열을 읽은 다음, 이를 아미노산 서열로 전환 및 유사 아미노산 서열끼리 배열한 결과의 일부를 나타낸다.
도 5A는 negative subtraction 스크리닝 전략으로부터 선별된 6개의 파지 클론의 MDA-MB-231 세포에 대한 결합능을 플라크 에세이를 통해 조사한 결과를 나타낸다.
도 5B는 상기 도 5A의 6개의 파지 클론 중 5-14(CVLKKPR)의 SKBR3 유방암 세포주 또는 MDA-MB-231 유방암 세포주에서의 결합능을 플라크 에세이를 통해 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 positive selection 스크리닝 전략으로부터 선별된 7개의 파지 클론의 MDA-MB231, SKBR3, 및 MCF7 세포에 대한 각각의 특이적 결합능을 플라크 에세이를 통해 조사한 결과를 나타낸다.
도 7은 negative subtraction 스크리닝 및 positive selection 스크리닝 전략을 통해 선별해 낸 네 가지 펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 MDA-MB231, MCF7, 및 SKBR3 세포에 대한 결합능을 형광현미경을 통해 조사한 결과를 나타낸다.
도 8은 네 가지 펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 MDA-MB231, MCF7, 및 SKBR3 세포에 대한 결합능을 유세포분석기(FACS)를 이용해 조사한 결과를 나타낸다.
도 9는 네 가지 펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 유방암세포가 아닌 다른 종류의 암세포와 정상 폐, 콩팥 세포(MDA-MB-231, MCF7, A549, BEAS-2B 및 HEK-293 세포)에 대한 결합능을 유세포분석기(FACS)를 이용해 조사한 결과를 나타낸다.
도 10은 MDA-MB-231 세포를 투여하여 만든 유방암 마우스 모델에 형광표지된 후보 펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CRPMRPR)를 처리하고 종양을 적출한 후, 생체광학영상시스템(IVIS)을 이용해 형광 세기를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 MDA-MB-231 세포를 투여하여 만든 유방암 마우스 모델에 형광표지된 후보 펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CRPMRPR)를 처리한 다음, 적출해낸 종양과 간을 얇게 단면화한 후, 형광현미경을 이용해 그 결합능을 검증한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
삼중음성유방암세포를 특이적으로 표적하는 펩타이드의 발굴
<1-1> Negative subtraction 통한 파지 라이브러리의 스크리닝
파지 스크리닝은 T7 파지 소수성 아미노산(hydrophobic amino acid) 라이브러리 (1 X 107 pfu/ul)를 이용하여 수행하였다. 본 라이브러리는 양말단에 시스테인과 중간에 7 개의 무작위 아미노산으로 구성된 CXXXXXXXC (X = random sequence)의 아미노산 서열을 가지면서, 7 개의 무작위 아미노산 중 최소 한 개 이상에서 소수성 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하고 있다. 유방암세포주로는 MCF7(에스트로젠 수용체/프로제스테론 수용체 양성, luminal type), SKBR3(Her2 수용체 양성, Her2 type), 및 MDA-MB231(에스트론젠 수용체/프로제스테론 수용체/Her2 수용체 삼중음성, basal type)를 이용하였다. Negative subtraction 스크리닝의 과정은 도 1에서 간단하게 도시하였다. 즉, 삼중음성유방암세포가 아닌 MCF7 및 SKBR3 세포에 결합하는 파지를 제거하는 negative subtraction을 하고, 삼중음성유방암세포인 MDA-MB231 세포에 결합하는 파지를 회수하는 positive selection으로 진행하였다. 먼저 109 pfu의 T7 파지를 80만개의 MCF7 세포가 부착되어 있는 35 mm culture dish에 넣고 4℃에서 30분간 결합시켰다. 이후 MCF7 세포에 결합하지 않은 파지가 있는 상층액을 회수하여 SKBR3 세포가 부착되어 있는 35 mm culture dish에 옮겨 4℃에서 30분간 결합시켰다. SKBR3 세포에 결합하지 않는 파지가 있는 상층액을 회수하여 MDA-MB231 세포가 부착되어 있는 dish에 상기 회수한 파지를 넣고 4℃에서 한 시간 동안 결합시켰다. 이후 상층액을 제거하여 MDA-MB231 세포에 결합하지 않은 파지를 제거한 후, 세포층에 O.D 1.0 까지 배양한 BL21 호스트 대장균을 300ul 넣고 5분간 반응시켜 MDA-MB231 세포에 결합된 파지를 용출(elution)시키고 회수하였다. 회수된 파지 용출액 300ul 중 10ul을 이용해 플라크 어세이(plaque assay)를 수행하여 그 수(titer)를 계산하였다. 나머지 용출액은 호스트 대장균을 이용해 파지 증폭을 수행함으로써 그 다음 라운드에 사용할 파지를 확보하였다. 이와 같은 과정을 5 라운드까지 반복하여 수행하였다.
그 결과, 각 라운드 별 회수된 파지의 수를 계산하여 도 2에 나타내었다. 라운드가 진행함에 따라, 용출해 낸 파지의 수가가 점진적으로 증가함을 볼 수 있었다. 1 라운드를 수행했을 때, 용출된 파지의 수는 약 2.2 X 106개였고, 최종적으로 5라운드를 진행한 이후 2.3 X 108개의 파지가 용출되었음을 알 수 있었다. 즉, 1라운드에서 5라운드 까지 진행한 결과, 약 10.4배의 파지 수의 증가를 볼 수 있었다. 아미노산 서열분석을 위해, 3, 4, 5 라운드의 역가 측정에 쓰인 플라크 어세이의 결과물로부터, 각각 10, 20, 40개의 클론들을 각각 취합하여 10ul Tris-buffered saline 완충액에 보관하였으며, PCR을 통해 이들 파지에 삽입된 펩타이드를 코딩하는 유전자의 염기서열 파악과 이에 따른 아미노산 서열분석을 수행하였다.
<1-2> Positive selection을 통한 파지 라이브러리의 스크리닝
35mm culture plate에 준비된 MDA-MB231 세포에 109 개의 T7 파지를 주입하여 4℃조건 하에서 한 시간 동안 세포와 결합시킨 후, 상층액을 제거한 다음, LB 배지에서 O.D 1.0 까지 배양한 BL21 호스트 대장균을 300ul 넣고 5분간 반응시킨 후 MDA-MB-231 세포와 결합한 파지를 용출해 내었다. 회수된 파지 용출액 300ul 중 10ul을 이용해 플라크 어세이(plaque assay)를 수행하여 그 수(titer)를 계산하였다. 나머지 용출액은 호스트 대장균을 이용해 파지 증폭을 수행함으로써 그 다음 라운드에 사용할 파지를 확보하였다. 이와 같은 과정을 5 라운드까지 반복하여 수행하였다.
그 결과, 각 라운드 별 회수된 파지의 수를 계산하여 도3에 나타내었다. 각 라운드를 진행함에 따라 용출된 파지의 숫자가 증가하였으며 1라운드의 역가에 비해 5라운드에서 약 360배의 용출 파지 수의 증가를 관찰할 수 있었다. 아미노산 서열분석을 위해, 3, 4, 5 라운드의 역가 측정에 쓰인 플라크 어세이의 결과물로부터, 각각 20, 30, 50개의 클론들을 각각 취합하여 10ul Tris-buffered saline 완충액에 보관하였으며, PCR을 통해 이들 파지에 삽입된 펩타이드를 코딩하는 유전자의 염기서열 파악과 이에 따른 아미노산 서열분석을 수행하였다.
<1-3> 파지 클론의 유전자 및 번역된 아미노산의 서열 분석
실시예 1-1, 1-2에서 각각 수집한 70, 100개의 파지 클론에 삽입된 펩타이드 코딩 유전자의 염기서열 파악을 마크로젠(주) 사에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 염기서열을 그에 상응하는 아미노산 서열로 변환하였으며, 유사한 서열 또는 모티프를 분석하기 위하여 Clustal X 프로그램을 이용하여 서열을 정렬하였다.
그 결과, 도 4에서 보듯이, 염기성 성질을 가진 아미노산인 아르기닌(R) 또는 라이신(K)이 공통적으로 많이 분포되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 펩타이드의 아미노산 서열상 6개 이상 잔기를 지니는 펩타이드를 다음 단계의 실험 후보로 선별하였다.
<1-4> 파지 클론의 삼중음성유방암세포에 대한 선택적 결합능 평가
삼중음성유방암세포에 대한 선별된 파지의 결합력을 세포에 결합된 파지의 수를 측정함으로써 평가하였다. 이를 위해 세포가 5만개 배양된 96-well dish에 6개의 후보 파지 각각을 109 pfu만큼 넣고 각각 한 시간 동안 4℃에서 결합시킨 다음, 결합한 파지를 용출하여 그 수를 계산하였다.
그 결과, 도 5에서 보듯이, negative subtraction 스크리닝으로부터 선별해 낸 6개 후보군 중 3-6 및 5-14 파지 클론이 MDA-MB231세포에 대한 높은 결합을 보였다. 또한 MDA-MB-231 cell에 가장 높은 결합력을 보인 5-14 파지 클론은 MDA-MB-231 세포와 비교하여 Skbr3 세포에 현저히 낮은 결합을 보였다.
또한 도 6에서 보듯이, positive selection 스크리닝으로부터 선별해 낸 7개의 후보군의 MDA-MB-231, Skbr3, MCF7 세포에 대한 결합을 조사한 결과, 7개의 후보 모두 Skbr3 및 MCF7 세포와 비교해 MDA-MB-231 세포에 더 높은 결합력을 보였다. 특히 4R-28(CRPMRPR)의 경우 MDA-MB-231 세포에 7개 후보 중 가장 높은 결합을 보였으며, 4R-12(CSLKKPR)는 MCF7 및 Skbr3 세포 대비 MDA-MB-231 세포에 상대적으로 가장 높은 결합력을 보였다(MCF7 에 비해 약 11배, Skbr3 에 비해 약 38배). 이를 바탕으로 하여 CRPMRPR 및 CSLKKPR 펩타이드를 추가 실험 후보로서 택하였다.
<실시예 2>
펩타이드의 삼중음성유방암세포에 대한 선택적 결합능 평가
<2-1> 펩타이드의 합성
(주) 펩트론(Peptron Co, Daegeon, Korea.)에 의뢰하여 카복시말단에 형광물질인 fluorescein isothiocyanate(FITC)가 접합된 펩타이드를 합성하였다. 각 펩타이드들은 표준 Fmoc 방법에 의하여 합성되었고 질량분석기에 의하여 정제되었다.
<2-2> 면역형광현미경법을 이용한 펩타이드의 삼중음성유방암세포에 대한 결합능 평가
Negative subtraction 스크리닝에서 선별한 CVRAKGKPC 및 CVLKKPR 펩타이드와 positive selection 스크리닝에서 선별한 CSLKKPR 및 CRPMRPR 펩타이드의 삼중음성유방암세포 특이적인 결합을 확인하기 위해 면역형광현미경법을 수행하였다. 이를 위해 삼중음성유방암세포인 MDA-MB-231 세포 및 비삼중음성유방암세포인 luminal A type의 MCF7 세포와 HER2 type의 Skbr3 세포를 4-well 배양용기에 5 X 104 cells/well 배양하고 1% 소혈청알부민이 포함된 세포배양액을 전처리한 후, 10 μM의 펩타이드를 4℃에서 한 시간 동안 결합시켰다. 이후 핵을 카운터염색한 후 형광현미경을 통한 촬영 및 Nuance program (Perkin elmer사)을 이용한 분석을 하였다.
그 결과, 도 7에서 보듯이, CVRAKGKPC, CVLKKPR, 및 CRPMRPR 펩타이드는 MCF7 및 Skbr3 세포와 비교해 MDA-MB-231 세포에 더 강한 결합 및 FITC 형광 신호를 보였다. 특히, 이들 중 CRPMRPR 펩타이드는 MDA-MB-231 세포에 대해 가장 높은 특이성을 보였다. 반면, CSLKKPR 펩타이드는 MDA-MB-231 세포 뿐만아니라 MCF7 및 Skbr3 세포에도 비교적 잘 결합하여 삼중음성유방암세포에 대한 특이성은 적었다. 한편, 대조군 펩타이드(NSSSVDK)는 상기 세포들에 대한 결합이 상대적으로 약하였다.
<2-3> 유세포분석기법을 이용한 펩타이드의 삼중음성유방암세포에 대한 결합능 평가
펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 삼중음성유방암세포에 대한 선택적 결합력을 유세포분석기법을 이용하여 평가하였다. 이를 위해, 세포를 각각 1.5mL 튜브에 3 X 105 cells/tube로 준비한 후, 1% 소혈청알부민이 포함된 세포배양액으로 37℃에서 30분간 전처리를 거친 다음, FITC 형광이 표지된 펩타이드와 4℃에서 한 시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 후, 유세포분석기를 이용하여 세포에 대한 펩타이드의 결합 분석하였다.
그 결과, 도 8에서 보듯이, 상기 4개의 펩타이드 모두 MCF7 및 Skbr3 세포와 비교해 MDA-MB231 세포에 더욱 잘 결합하고 이에 따라 MFI(Mean Fluorescence Intensity: 평균형광강도) 값이 더 높은 것을 알 수 있었다.
한편, 각 펩타이드의 선택성을 보다 더 다양한 세포에서 검증하기 위하여, 유방암 세포인 MDA-MB-231 및 MCF7 세포, 폐암세포주인 A549 세포, 정상 폐 세포주인 BEAS-2B 세포 및 정상 콩팥 세포주인 HEK-293 세포를 이용하여 유세포분석기법을 실시하였다. 세포를 각각 1.5mL 튜브에 3 X 105 cells/tube로 준비한 후, 1% 소혈청알부민이 포함된 세포배양액으로 37℃에서 30분간 전처리를 실시하였다. 그 다음, FITC 형광표지된 펩타이드를 4℃에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 유세포분석기를 이용하여 펩타이드의 결합력을 분석하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR 펩타이드는 비삼중음성유방암세포인 MCF7 세포, 폐암세포인 A549 세포 및 정상세포인 BEAS-2B 세포와 HKE-293 세포에 비하여, 삼중음성유방암세포인 MDA-MB-231 세포에서 펩타이드의 결합력 및 평균형광강도(MFI)가 상대적으로 더 높은 것으로 나타났다. 이를 통해, 이들 후보 펩타이드가 삼중음성유방암세포주에 특이적인 결합능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
<2-4> 마우스 종양모델을 이용한 펩타이드의 삼중음성유방암에 대한 생체내 표적능 평가
세 가지 펩타이드(CVRAKGKPC, CVLKKPR, CRPMRPR)의 삼중음성유방암세포에 대한 생체내 표적능을 종양 마우스 모델을 이용하여 검증하였다.
모든 동물 실험은 위원회 지침서(institutional guidelines)에 따라, 그리고 경북대학교 IACUC의 가이드라인(guideline of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Kyungpook National University)에 의해 승인받은 동물실험 프로토콜(permission No. KNU 2014-0001-121)에 따라 수행되었다. 8 주령 Balb/c 마우스를 Orient laboratories(Seongnam, Korea)로부터 구입하였고, 사료 및 물을 자유식이하며 SPF(specific-pathogen-free condition)에서 사육되었다.
MDA-MB-231 세포를 마우스의 피부 아래 이식하여 그 종양을 성장시켰다. 이후 FITC 형광표지된 대조군 펩타이드 NSSSVDK와 상기 세 가지의 펩타이드를 종양 마우스에 각각 정맥 주사하였다. 이 후 두 시간이 지난 다음 각 종양을 적출해 내어 이를 생체광학영상시스템(IVIS)을 이용해 ROI(Region of Interest)의 형광 세기를 측정하였다. ROI 값이 높을수록 종양조직에 형광이 강하며, 이는 종양조직에 형광표지 펩타이드가 많이 표적 및 축적되었음을 나타낸다.
그 결과 도 10에 나타난 바와 같이, CVRKGKPC 및 CRPMRPR 펩타이드를 처리한 종양세포는 음성대조군인 NSSSVDK 펩타이드를 처리한 종양세포에 비해 형광 값의 수치가 더 높은 것으로 나타났다. 특히, CVRAKGKPC 펩타이드를 처리한 종양세포에서 형광 값의 수치가 가장 높은 것으로 나타났다. 반면, CVLKKPR 펩타이드를 처리한 종양세포는 대조군에 비해 형광 값이 낮은 것으로 나타났다.
이를 통해, CVRAKGKPC 펩타이드가 유방암 마우스 모델에서 다른 펩타이드에 비해 상대적으로 더 높은 생체내 표적능을 가지는 것을 확인할 수 있었고, CVLKKPR 펩타이드는 생체내 표적능이 대조군 대비 우수하지 않은 것을 확인할 수 있었다.
한편, 적출한 종양조직의 동결절편을 제작하고, 형광 현미경을 통해 관찰하였다. 또한 펩타이드의 조직 특이성을 검증하기 위하여 간조직의 형광도 관측하였다.
그 결과 도 11에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 NSSSVDK 펩타이드를 정맥 주사한 마우스의 종양조직에서는 형광이 상당히 낮은 것으로 나타났으며, CVRAKGKPC 펩타이드를 정맥 주사한 쥐의 종양 조직에서 다른 펩타이드에 비해 형광이 가장 높은 것으로 관측되었다. 이는 생체형광영상시스템(IVIS)을 이용한 실험의 결과와 유사한 것을 확인할 수 있었다. 또한 CVRAKGKPC 펩타이드는 종양에서 관찰된 형광 신호와는 달리 간 조직에서는 형광신호가 낮은 것으로 나타났다.
본 발명의 펩타이드는 유방암에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 유방암의 진단, 치료 또는 영상화용 조성물의 제조에 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Peptides for targeting breast cancer and uses thereof <130> NP16-0047P <150> KR 10-2016-0084357 <151> 2016-07-04 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for targeting breast cancer 1 <400> 1 Cys Val Arg Ala Lys Gly Lys Pro Cys 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for targeting breast cancer 2 <400> 2 Cys Val Leu Lys Lys Pro Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for targeting breast cancer 3 <400> 3 Cys Ser Leu Lys Lys Pro Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptides for targeting breast cancer 4 <400> 4 Cys Arg Pro Met Arg Pro Arg 1 5 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding peptides for targeting breast cancer 1 <400> 5 tgcgtgcgtg cgaagggtaa gccttgc 27 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding peptides for targeting breast cancer 2 <400> 6 tgcgttctga agaagccgcg t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding peptides for targeting breast cancer 3 <400> 7 tgcagtctga agaagccgcg t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide encoding peptides for targeting breast cancer 4 <400> 8 tgccggccta tgcgtccgcg t 21

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유방암은 삼중 음성(triple-negative) 유방암인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  5. 제4항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  6. 제1항의 펩타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항의 펩타이드를 포함하는 유방암에 특이적인 약물 전달용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), 알테플라제(alteplase), 안지오텐신(angiotensin) II 억제제, 알도스테론(aldosterone) 수용체 억제제, 에리트로포이에틴(erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제, 로바스타틴(Lovastatin), 라파마이신(Rapamycin), 셀레브렉스(Celebrex), 티클로핀(Ticlopin) 마리마스타트(Marimastat)및 트로케이드(Trocade) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물.
  10. 제1항의 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 키트.
  11. 제1항의 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 마커.
  12. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 영상화용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(superparamagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020170085104A 2016-07-04 2017-07-04 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도 KR101921212B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160084357 2016-07-04
KR20160084357 2016-07-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180004681A KR20180004681A (ko) 2018-01-12
KR101921212B1 true KR101921212B1 (ko) 2018-11-22

Family

ID=60912919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170085104A KR101921212B1 (ko) 2016-07-04 2017-07-04 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101921212B1 (ko)
WO (1) WO2018008942A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110746489B (zh) * 2019-10-21 2021-09-10 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 一种特异性靶向三阴乳腺癌的多肽及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040102382A1 (en) * 2002-11-27 2004-05-27 Transgene, S.A. Targeting peptides
WO2014186364A2 (en) * 2013-05-13 2014-11-20 Tufts University Methods and compositions for prognosis, diagnosis and treatment of adam8-expressing cancer

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NEMUDRAYA, Anna A., et al. Tumor-specific peptide, selected from a phage peptide library, enhances antitumor activity of Lactaptin. PloS one, 2016, 11.8: e0160980.
NOBREGA, Franklin L., et al. Screening and characterization of novel specific peptides targeting MDA-MB-231 claudin-low breast carcinoma by computer-aided phage display methodologies. BMC cancer, 2016
Zhu, Guangyu, CELL-BASED AND BIOCHEMICAL SCREENS FOR SMALL-MOLECULE INHIBITORS OF DYNEIN AND OF HSP70. Doctoral Dissertation, University of Pittsburgh (2007)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180004681A (ko) 2018-01-12
WO2018008942A1 (ko) 2018-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10124077B2 (en) Plectin-1 targeted agents for detection and treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma
US7968081B2 (en) Peptide for diagnosing, preventing and treating atherosclerosis and uses thereof
US11851496B2 (en) Antibodies against the human fshr extracellular domain
US8188051B2 (en) Metadherin polypeptides, encoding nucleic acids and methods of use
US11643437B2 (en) Tandem repeat cancer-targeting peptides for molecular conjugation or engineering and uses thereof in cancer theranostics
WO2010019884A1 (en) Methods and compositions for the detection of cancer
JP2014520510A (ja) 腫瘍ターゲティング腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド変異体及びその応用
TW201124725A (en) Bladder cancer specific ligand peptides
CN109420177A (zh) 用于有效体内递送dna纳米结构至动脉粥样硬化斑块的材料和方法
WO2017214050A1 (en) Detection of pancreatic cancer with an engineered anti-thy1 single-chain antibody
US20190211088A1 (en) Polypeptide targeting aptamers for characterization, capture, and clinical management of circulating tumor cells
KR20140123311A (ko) 암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도
KR101921212B1 (ko) 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도
US8247378B2 (en) Homing peptide for tumor vasculature
WO2001068679A9 (en) Peptides targeting specifically tumor-derived endothelial cells
US9581598B2 (en) Diagnosis and treatment of brain tumor
CA2367256A1 (en) Surface localized colligin/hsp47 in carcinoma cells
CN112010946B (zh) 靶向cxcr4的分子探针以及用途
CN112876538B (zh) 靶向新生血管标记物cd105的多肽及其应用
KR102194026B1 (ko) Trail 수용체에 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
KR20160068345A (ko) 사멸세포와 특이적으로 결합하는 고리형 펩타이드 및 이의 용도
CN117777237A (zh) 一种靶向bcma的多肽及其应用
CN113784735A (zh) 诊断肺癌的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right