KR20190003722A - 분자 영상화를 위한 이량체화 전략 및 화합물 및/또는 방사선 면역요법 - Google Patents

분자 영상화를 위한 이량체화 전략 및 화합물 및/또는 방사선 면역요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달용 다가성(multivalent) 화합물로서, 두 개의 구성요소 또는 표적화 분자가 각각 세포 상의 하나 이상의 바이오마커와 상호작용하는 다가성 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 표적화 분자에 결합하는 다기능성(multifunctional) 킬레이트제를 제공한다. 본 발명은 또한 스페이서 분자의 길이를 결정하기 위한 시험관내(in vitro) 고속대량 스크리닝 분석법(high-throughput screening assay)을 제공한다. 본 발명은 또한 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달에 사용되는 화합물/프로브, 키트 및 방법에 관한 것이다.

Description

분자 영상화를 위한 이량체화 전략 및 화합물 및/또는 방사선 면역요법
관련 출원에 대한 교차 -참조
본 출원은 2016년 5월 2일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/330,622호, 2016년 6월 7일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/346,783호, 및 2016년 8월 10일자로 출원된 미국 가출원번호 제62/373,036호에 대해 우선권을 주장하며, 상기 문헌 각각 및 모두는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
승인 정보
본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 승인 번호 EB017317 및 EB020737 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
도입
본 발명은 다가성(multivalent) 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달 방법에 관한 것으로, 상기에서 상이한 바이오마커들을 표적화하는 다가성 분자 는 영상화 표지자 및/또는 약물을 운반한다. 따라서, 다가성 분자는 동일하거나 상이할 수 있는 2 이상의 바이오마커에 결합하여 민감도 증가, 특이도 증가, 결합 친화도 증가, Bmax 증가, 더 긴 혈액체류(blood retention), 신호대 잡음비의 개선, 및 약물동력학적 퍼포먼스의 개선을 가져올 수 있다. 보다 상세하게, 다가성 분자는 초기 단계에서 및/또는 바이오마커의 양이 상대적으로 낮을 때에도 암 또는 다른 질환/질병들을 영상화할 수 있다. 본 발명은 또한, 염료 분자에 대한 리간드의 커플링을 포함하는, 다가성 분자 및 다른 이량체 분자를 제조하는데 유용한 킬레이트제에 관한 것이다. 본 발명의 킬레이트제는 추가적인 화학 플랫폼의 사용 없이 분자들을 커플링하는 개선된 능력을 제공한다. 본 발명은 또한 다가성 분자에서 스페이서를 최적화하기 위한 시험관내(in vitro) 고속대량 스크리닝 플랫폼(high-throughput screening platform)에 관한 것이다.
다가성 영상 프로브의 임상적 유용성은 수용체 밀도, 결합 친화도, 및 생체내(in vivo) 약물동력학을 포함하는 다양한 인자들에 의해 제한되곤 한다. 다중 상호작용을 통한 결합력(avidity)을 개선시키는 다가성 전략은 영상화 및 치료에 대한 유망한 접근법이다. 예를 들어, 두개의 다른 수용체에 대한 두개의 연결 리간드의 동시 결합을 특징으로 하는 이종-이가성(hetero-bivalency)이, 단일-수용체 표적화된 전략에 비해 여러 잇점이 있어, 유망한 표적화 전략으로 부상하고 있다. 첫째, 이종-이가성은 저-친화성 일가(monovalent) 리간드 (Kd ~ μM)에서 높은 결합력(avidity)을 가지는 리간드(Kd ~ nM)로 쉽게 전환할 수 있다. 둘째, 이종-이가성은 단량체(또는 동종이량체(homodimer))에 대해서는 이용가능하지 않은 새로운 작용기전을 제시하며, 두번째 결합 부위가 저밀도, 저특이성 또는 비-특이성의 수용체가 될 수 있다 (예를 들어, 단량체성 단백질 상의 소수성 패치(hydrophobic patch)). 따라서, 만약 두 리간드가 적절한 연결(linkage)를 통해 연결된 경우 특이적 흡수(uptake)의 증가가 매우 기대된다. 셋째, 특히 제거(clearance) 특성과 배설 속도가 이들의 일가 상대자(counterpart)에 대해 최적이 아닌 경우, 크기 및 친유성(lipophilicity)의 변화로 인해, 이종이량체(heterodimer)가 개선된 약물동력학적 퍼포먼스를 가질 수 있다. 그러나, 지금까지 프로브는 종양의 이질성(heterogeneity) 및 복잡한 종양 미세환경으로 인해 초기 단계에서 암을 식별하는데 제한된 능력을 나타내었다.
따라서, 당업계에는 증가된 민감도, 증가된 특이도, 증가된 결합 친화도, 증가된 Bmax, 개선된 약물동력학 (예를 들어, 더 긴 혈액체류, 및 제거 특성 및 배설 속도가 일가 리간드에 최적이 아닌 경우) 및 개선된 신호대 잡음비를 가지는 분자 영상화 및/또는 방사선 면역치료 방법과, 분자 영상화 및 방사선 면역요법에 사용하기 위한 다량체(multimer)를 생성하는 개선된 방법이 요구된다.
이러한 접근법의 예는 본원에 개시된 바와 같은 분자 영상화 및 치료법에 대한 다가성(multivalency)이다. 스페이서의 길이가 다량체에서 이가성의 결합력(avidity)에 크게 영향을 준다는 것이 널리 알려져 있다. 다가성 화합물의 제조의 종래 전략은 가장 적절한 길이의 스페이서를 찾기 위하여 다양한 길이의 스페이서를 가진 유사체들을 제조하는 단계 및 대응되는 시험관내(in vitro) 및/또는 생체내(in vivo) 테스트를 수행하는 단계를 포함한다. 그러나, 이러한 전략은 시간과 비용이 많이 드는 인위적 작업이다. 일부 경우에서, 적절한 스페이서의 길이는 컴퓨터 모델 연구로부터 예측될 수 있으나, 이 전략은 두 개의 표적화된 수용체들이 서로 상호작용하는 상황으로 제한되고 예측은 부정확할 수 있다. 따라서, 다가성 화합물의 리간드들 사이에 적절한 간격(spacing)을 가진 다가성 화합물의 개선된 생성 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 표적화된 분자 영상화 및/또는 치료를 위한 화합물, 키트 및 방법에 관한 것이다. 포괄적 양태로서, 본 발명은 세포, 조직 또는 관심 구조물 상의 바이오마커와 상호작용하는 두 개의 구성요소 또는 분자에 관한 것이다. 이는, 적어도 일부분은, 세포(예, 종양 세포) 상의 2 이상의 바이오마커를 표적화하는 것이 영상화 표지자 및/또는 활성제의 민감도 및/또는 특이도를 증가시키고 상기 분자의 약물동력학적 특성들 역시 개선시킨다는 발견에 기초한 것이다. 본 발명은 또한 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달에 관한 것이다.
본 발명은 분자 영상화를 위한 화합물, 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 분자 영상화 다가성(multivalent) 화합물은 하나 이상의 바이오마커와 결합 및/또는 상호작용하는 하나 이상의 제1 표적화 분자; 하나 이상의 바이오마커와 결합 및/또는 상호작용하는 하나 이상의 제2 표적화 분자; 및 검출가능한 표지자를 포함한다. 일부 구체예에서, 화합물은 하나 이상의 검출가능한 표지자를 가질 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 분자 영상화 다중모드(multimodal) 및/또는 다가성(multivalent) 화합물은 하나 이상의 바이오마커에 결합 및/또는 상호작용하는 하나 이상의 표적화 분자; 하나 이상의 제1 검출가능한 표지자; 및 하나 이상의 제2검출가능한 표지자를 포함한다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 검출가능한 표지자는 영상화 표지자(imaging label)이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 표지자는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 64Cu, 68Ga,18F, 89Zr, 111In, Al18F 또는 99mTc 로 이루어진 군에서 선택되는 동위원소이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 검출가능한 표지자는 염료 분자이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 염료 분자는, 시아닌, FluoProbes, 또는 DyLight Fluor 염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 표적화된 약물 전달을 위한 화합물, 조성물, 방법 및 키트를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 약물 전달 다가성 화합물은 하나 이상의 바이오마커와 결합 및/또는 상호작용하는 하나 이상의 제1 표적화 분자; 하나 이상의 바이오마커와 결합 및/또는 상호작용하는 하나 이상의 제2 표적화 분자; 및 하나 이상의 활성제를 포함한다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는, 단백질, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 의약품, 또는 방사성 의약품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 방사성 의약품은 67Cu, 177Lu, 90Y, 131I, 212Bi, 211At, 225Ac, 188Re, 또는 111In를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. (방사성 동위원소를 선택적으로 포함할 수 있는) 의약품의 비-제한적인 예시는 항암제, 항감염제, 항증식제, 면역 반응을 증가시키거나 감소시키는 제제를 포함하는 면역 반응을 조절하는 제제, 항혈전제 등을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 소분자는 독소루비신(doxorubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 또는 플루오로우라실(fluorouracil)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 다가성 화합물의 제1 표적화 분자 및/또는 제2 표적화 분자는 관심있는 생물학적 대상체의 하나 이상의 바이오마커에 결합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자 및/또는 제2 표적화 분자는 각각 개별적으로 단백질, 항체, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 다당류 또는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자 및/또는 제2 표적화 분자는 내재화가능하거나(internalizable) 내재화 가능하지 않다(non-internalizable).
일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 및 제2 표적화 분자는 관심있는 생물학적 대상체의 동일하거나 상이한 바이오마커를 표적화한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 및 제2 표적화 분자가 두 개의 상이한 바이오마커에 결합하는 경우, 바이오마커는 동일한 생물학적 대상체에서 발현된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 관심있는 생물학적 대상체는 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 관심있는 생물학적 대상체는 세포, 조직, 관심 구조물, 예를 들어 종양 또는 암 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 세포 표면 또는 내부적으로 발현될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 세포 표면 단백질일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 인테그린일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 CD13 및/또는 인테그린 αvβ3 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 uPAR 및/또는 인테그린 αvβ3 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는, CD13 표적화 분자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, CD13 표적화 분자는 Asn-Gly-Arg (NGR) 모티프를 포함하는 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, CD13 표적화 분자는 펩타이드일 수 있고, 예를 들어, 사이클로(cNGRc), 사이클로(cPNGRc), 사이클로(NGRyK), 선형 cNGRc, 또는 선형 cPNGRc 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 인테그린 αvβ3 표적화 분자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 인테그린 αvβ3 표적화 분자는 외부로 노출된 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 트리펩타이드 모티프를 가진 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 인테그린 αvβ3 표적화 분자는 사이클로(RGDyK) 또는 사이클로(RADyK)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 uPAR 표적화 분자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, uPAR 표적화 분자는 uPA, ATF (amino terminal fragment of urokinase), AE105, 또는 AE105mut 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자는 스페이서(예, 중합체)를 통해 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자는 킬레이트제(chelator)를 통해 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자는 스페이서(예, 중합체)를 통헤 킬레이트제에 결합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 다기능성 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 아마이드 결합(amide bond) 연결을 생성하기 위한 카르복시산 또는 활성 에스테르기, 클릭 화학(click chemistry)에 적절한 아자이드기(azide group), 및 킬레이팅 코어(chelating core)를 조합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 1, 4, 7-트리아자사이클로노네인(TACN)-기반의 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 NOTA, DOTA, L-NETA, N3-NOtB2 또는 N3-DOtB3 를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 단량체에 대한 하나의 표적화 분자(예, 제1 또는 제2 표적화 분자)에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 동종이량체(homodimer)에 대한 두 개의 동일한 표적화 분자(예, 두 개의 제1 또는 두 개의 제2 표적화 분자)에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 이종이량체(heterodimer)에 대한 두 개의 다른 표적화 분자(예, 제1 및 제2 표적화 분자)에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 다중모드성(multimodality)에 대한 하나의 표적화 분자(예, 제1 또는 제2 표적화 분자) 및 하나의 염료 분자에 결합될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 본원에 개시된 화합물은 치료가 필요한 대상체, 예를 들어 질환 또는 질병을 가지거나, 질환 또는 질병을 가질 위험성이 있거나, 질병 또는 질환을 위해 스크리닝/테스트되는 대상체에서, 세포, 조직 또는 관심 구조물을 영상화 하는 방법에 사용될 수 있고, 여기에서 대상체는 본원 발명에 따른 화합물을 투여받는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 다가성 화합물의 표적화 분자들 간의 스페이서 길이를 최적화하기 위한 시험관내(in vitro) 고속대량 스크리닝 플랫폼(high-throughput screening platform) 을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 방법은 스페이서 길이를 최적화하기 위한 클릭 화학 및 방사선 화학(radio chemistry)을 조합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 다가성 화합물의 현장(on-site) 형성을 통한 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 다가성 화합물의 표적화 분자들은 반응기 및 광분해성(photolabile)(예, 광-촉발성(photo-triggerable))기로 별도로 관능화될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 시험관내 고속대량 스크리닝 플랫폼은 제1의 관능화된 표적화 분자 및 제2의 관능화된 표적화 분자에 노출된 세포를 포함하며, 여기에서 하나 이상의 관능화된 표적화 분자는 상이한 길이의 스페이서들에 부착될 수 있고, 하나 이상의 관능화된 표적화 분자의 다른 세트는 정해진 길이의 스페이서이 부착된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 제1의 관능화된 표적화 분자의 스페이서가 제2의 관능화된 표적화 분자의 스페이서에 결합하도록 하는 관능기로 관능화된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 하나 이상의 관능기는 다른 관능기에 결합되도록 광자 에너지(photon energy)에 의해 활성화된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 방사성-금속(radio-metal) 표지된 반응기들이, 스페이서를 통해 다른 관능화된 표적화 분자에 결합하지 않은 관능화된 표적화 분자들의 하나 이상의 집단에 결합하도록 첨가될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서 길이가 두 관능화된 표적화 분자 집단 사이에 최상의 결합을 가져오는지를 결정하기 위하여, 결합된 방사성-금속(예, 68Ga, 64Cu, Al18F, 177Lu, 111In, 및 89Zr)-표지된 반응기의 양이 측정된다.
본 발명은 또한 표적화된 의료 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달을 위한 키트를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 키트는 하나 이상의 제1 표적화 분자, 하나 이상의 제2 표적화 분자, 및 하나 이상의 검출가능한 표지자 및/도는 활성제를 포함하는 하나 이상의 다가성 화합물을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 키트는 하나의 표적화 분자 및 하나 이상의 검출가능한 표지자 또는 활성제를 포함하는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 키트는 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자에 부착할 수 있는 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 키트는 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자가 서로 또는 킬레이트제에 부착하기 위한 스페이서(예, 중합체)를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 킬레이트제는 다기능성(multifunctional) 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 키트는 키트를 사용하기 위한 지시서(instruction)를 포함한다.
본 발명은 화합물, 키트, 표적화된 분자 영상화 및/또는 치료에 관한 것으로, 여기에서 표적화 분자는 생물학적 대상체에서 대응되는 바이오마커와 상호작용한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 생물학적 대상체는 정상 또는 질환을 가진 또는 변성된(degenerated) 세포, 조직 또는 기타 관심 구조물이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 생물학적 대상체는 종양 또는 암 세포이다. 본 발명은 표적화된 분자 영상화 및/또는 치료를 위한 화합물/조성물/분자/킬레이트제 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 다가성 표적화된 분자 영상화 및/또는 치료 화합물에 대한 적절한 스페이서를 식별기 위한 시험관내(in vitro) 고속대량 스크리닝(high-throughput screening) 방법에 관한 것이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 개시된 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달 방법은 빠르게-소거되는 검출가능한 표지자 및/또는 활성제의 지속된 잔류를 가능하게 함으로써, 세포 흡수를 유의적으로 증가시킨다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 개시된 방법은 증가된 민감도 및/또는 증가된 특이도를 제공한다. 예를 들어, 개시된 방법은 저-친화성 일가 표적화 분자(~μM)를 높은 결합력(avidity)을 가지는 리간드(~nM)로 전환할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 개시된 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달 방법은 다양한 이중/다중-바이오마커 조합물들 및 표적들(예, 종양 또는 암)에 포괄적으로 적용될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 관심있는 세포(예, 종양 또는 암세포)에 보다 단단히 결합함으로써 보다 적은 비-특이적 결합 및 보다 적은 위양성 결과를 초래하는 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달 화합물을 제공한다. 더 단단히 결합하는 표적화된 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달 화합물은 관심있는 생물학적 대상체로부터 해리되는 화합물의 양이 더 적어지도록 할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 더 단단히 결합하는 화합물은 세포 흡수를 증가시키고/증가시키거나 비-표적 세포에 의한 흡수를 감소시킨다. 예시로서, 이에 제한되는 것은 아니지만, 종양 세포의 경우, 높은 결합력(avidity)을 달성하는 것이 동시에 두 개의 표적 바이오마커를 과발현하는 종양 상에서 결합 친화도를 유의적으로 증강시키지만, 두 개의 표적 바이오마커 중 하나만을 발현하는(또는 둘 다 발현하지 않는) 비-종양 세포에 대한 결합 친화도는 증가시키지 않으므로, 종앙/비-종양 비율이 유의적으로 증가할 것이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 총 결합 부위의 증가로 인해 표적화 분자들의 국소적인 농도가 증가함으로써, 및 약물동력학(예를 들어, 제거(clearance) 특성과 배설 속도)의 개선으로 인해 표적화 분자의 순환 시간(circulation time)이 증가함으로써, 표적화 리간드/분자가 통합된 방사성/약물 분자가 관심있는 조직에 축적될 수 있고 이에 따라 흡수가 증가되므로, 본 발명의 방법은 임상적 중개(clinical translation)의 높은 잠재력을 제공한다. 예를 들어, 표적 수용체의 밀도는 보족 세포(complementary cell)-표면 수용체들의 적절한 조합을 표적화함으로써 증가될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 크기 및 친유성(lipophilicity)의 변화로 인해, 다량체(multimer)들은 또한 개선된 약물동력학적 퍼포먼스를 가질 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 동일한 표적화 분자, 하나 이상의 상이한 표적화 분자, 및/또는 염료 분자를 결합하기 위한 킬레이트제를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 2 이상의 표적화 분자를 커플링할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 고체상 펩타이드 합성에 참여할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 표적화된 단량체, 동종이량체, 이종이량체, 및 진단 추적자 및/또는 방사선 치료제로서의 다중모드성을 개발하는 방법을 간소화할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 다량체의 표적화 분자들 간의 스페이서의 길이를 최적화하기 위한 시험관내 고속대량 스크리닝 플랫폼을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 시험관내 고속대량 스크리닝 플랫폼은 각 테스트에서 nM 범위에서 표적화 분자들을 사용할 수 있는 민감한 분석법이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 방법은 스페이서 길이를 최적화하기 위한 클릭 화학 및 방사선 화학(radio chemistry)을 조합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 다량체(예, 이종이량체)의 현장(예, 시험관내) 형성을 통한 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 다량체의 표적화 분자는 반응기(예, 클릭가능한 기(clickable group)) 및 광분해성기(예, 클릭가능한 기)로 각각 관능화될 수 있다.
본원에서 사용된 용어, "바이오마커"는 초기 단계에서 질환 또는 질병의 검출을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 질병의 검출을 가능하게 하는 마커를 말한다(예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 단백질(단량체 및 다량체 단백질, 당단백질, 지질단백질 등 포함), 탄수화물, 지질, 핵산 및 이들의 조합을 포함함). 질환 또는 질병은, 증식성 질병, 예를 들어, 암, 자가면역 질환, 퇴행성 질환, 혈관 질환, 신경 질환, 감염성 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다; 인간 및 비-인간 동물에서 수많은 질환 또는 질병과 관련된 바이오마커들이 당업계 공지되어 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커의 존재 또는 부재는 영상화에 의해 결정된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체의 생물학적 샘플에서 바이오마커의 존재 또는 부재는 기준 대조군(reference control)과 비교된다.
용어 "활성제(active agent)"는 대상체에 투여되었을 때 생리학적 효과를 가질 수 있는 제제를 말한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 용어 "활성제"는 단백질, 펩타이드, 소분자, 또는 방사성 의약품(radiopharmaceutical)을 말한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는 화학치료제를 말한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는 면역치료제를 말한다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 유효량"은 질병의 치료, 예방 또는 관리에 충분한 활성제의 양을 말한다. 또한, 본 발명의 제2의 표적 프로브에 대한 치료학적 유효량은 활성제 단독의 양, 또는 질병의 치료 또는 관리에 치료적 유익을 제공하는 다른 치료제들과 조합된 활성제의 양을 의미할 수 있고, 여기에서 치료적 유익이란 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 증상이 없는 기간의 지속 및 빈도의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 예방을 포함할 수 있다. 상기 용어는 전제적 치료를 개선하고, 원하지 않는 효과를 감소 내지 회피하고, 다른 치료제와의 상승적 치료 효과를 증대시키는 양을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물학적 대상체"는 단백질, 바이러스, 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 말하나, 이제 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 생물학적 대상체는 정상 또는 질환을 가진 또는 변성된 또는 감염된 세포, 조직, 또는 기관일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 종양 또는 암 세포일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "관능화된"은 다른 관능기(예, 아자이드)와 반응할 수 있는 새로운 관능기를 도입하기 위한, 현존하는 분자 단편(molecular segment)의 변형을 말한다.
본원에 개시된 범위, 예를 들어, "약 X 내지 약 Y"는, 달리 정의되지 않는 한, X 및 Y뿐만 아니라 약 X 및 약 Y 의 한계 범위를 포함한다.
설명의 명확성을 위하여, 이에 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 상세한 설명은 다음의 세부항목으로 나뉜다:
(i) 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물 및 사용 방법;
(ii) 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물의 제조를 위한 방법 및 킬레이트제;
(iii) 다량체의 표적화 분자들 간의 스페이서 길이를 최적화하기 위한 고속대량 스크리닝 플랫폼;
(iv) 바이오마커; 및
(v) 키트.
5.1. 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물 및 사용 방법
본 발명은 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 (예를 들어, 세포 상에서) 하나 이상의 바이오마커와 각각 상호작용하는 두 개의 구성요소 또는 표적화 분자를 제공한다.
5.1.1. 표적화 분자
본 발명은 하나 이상의 제1 표적화 분자를 가지는 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자를 가지는 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 동일 또는 상이한 바이오마커에 대해 하나 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 또는 5 이상의 상이한 표적화 분자를 가질 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 표적화 분자를 가질 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 하나 이상의 각 표적화 분자를 가질 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 바이오마커에 결합하는, 항체, 단백질, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 다당류, 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 활성제이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 내재화가능하거나(internalizable) 내재화 가능하지 않을(non-internalizable) 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 단백질일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적 프로브는 항체이다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 항체, 항체 유도체, 이들로부터 유래된 유기 화합물, 단클론 항체, 항체 단편, 변형된 항체, 단쇄 항체 및 이의 단편, 미니항체, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 또는 이들의 이량체(dimer), 올리고머(oligomer) 또는 다량체(multimer)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 변형된 항체는 합성 항체, 키메라 또는 인간화 항체, 또는 이들의 혼합물, 또는 불변영역이 전부 또는 일부 결핍된 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab)'2 등을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 항체는 단클론 항체이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 상업적으로 이용가능하다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자는 당업자에게 이해되는 임의의 기법을 사용하여 특이적 바이오마커에 대해 제조될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 화합물은 하나 또는 두 개의 검출가능한 표지자를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 검출가능한 표지자는 영상화 표지자, 및/또는 치료적 프로브이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 표지자는, 110In, 111In, 177Lu, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 32P, 11C, 13N, 15O, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 18F, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154- 158Gd, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 및 기타 감마-, 베타- 또는 양전자-방사체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 치료적 프로브는 치료적 방사성 동위원소, 예를 들어 67Cu, 177Lu, 90Y, 131I, 212Bi, 211At 또는 225Ac 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 치료적 프로브는 항암제, 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 플루오로우라실 등이나, 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자 전달 화합물은 하나 또는 두 개의 활성제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는 단백질, 펩타이드, 소분자, 펩타이드 핵산(PNA), 또는 방사성 의약품일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 검출가능한 표지자는 염료 분자이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 화합물은 하나 이상의 염료 분자를 가질 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 염료 분자는 한 종류의 표적화 분자(한 종류의 하나 이상의 표적화 분자)에 부착된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 염료 분자는 두 종류의 표적화 분자(각각 하나 이상)에 부착된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 염료 분자는 시아닌 염료(Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7, Cy5.5, Cy7.5), GFP, Calcein, FITC, FluorX, Alexa dyes, Rhodamine dyes, 5-FAM, Oregon Green, Texas Red 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는 트라스투주맙(trastuzumab), T-DM1, 라파티닙(lapatinib), 페르투주맙(pertuzumab), 세툭시맘(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 제피티닙(gefitinib), 아파티닙(afatinib), 다코미티닙(dacomitinib), KD-019, 엘로티닙(erlotinib), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 젬시타빈(gemcitabine), 페메트렉세드(pemetrexed), 이리노테칸(irinotecan), 5-플루오로우라실(5-fluoruracil), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel) 또는 카페시타빈 (Capecitabine) 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는 방사성 의약품은 111In- 이브리투모맙 튜세탄(ibritumomab tiuxetan), 90Y-이브리투모맙 튜세탄, 131I-토시투모맙(tositumomab), 131I- 라베투주맙(labetuzumab), 131I-리툭시맙(rituximab), 212Pb-트라스투주맙, 131I-트라스투주맙, 111In-트라스투주맙, 188Re-트라스투주맙 일 수 있다.
아래 표 1은 특이적 바이오마커에 결합하는 표적화 분자(즉, 제1 표적화 분자 및/또는 제2 표적화 분자)의 비-제한적 예시를 제공한다.
표적화 분자의 예시
바이오마커 표적화 분자
항체 펩타이드(또는 소분자) 리간드
CD13 N/A NGR (펩타이드)
인테그린 α4β3 N/A LLP2A (펩타이드)
uPAR N/A AE105 (펩타이드)AE105mut (펩타이드)
가스트린-방출 펩타이드 (GRP) N/A BBN(7-14) (펩타이드)
SSTR2 N/A Tyr(3)-octreotate (펩타이드)
CCR5 N/A DAPTA (펩타이드)
인테그린 αvβ3 에타라시주맙(Etaracizumab) RGD (펩타이드)RAD (펩타이드)
EGFR 세툭시맙(Cetuximab) 엘로티닙(Erlotinib)(소분자)
VEGF 베바시주맙(Bevacizumab) N/A
CA19-9 1116NS19-9, Human 5B1 N/A
CD40 CP-870,893 N/A
PD-L1 아테졸리주맙(Atezolizumab) N/A
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 하나 이상의 제1 표적화 분자, 하나 이상의 제2 표적화 분자, 및 검출가능한 표지자 및/또는 활성제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 제1 표적화 분자, 제2 표적화 분자, 및 검출가능한 표지자 및/또는 활성제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 화합물은 제1 표적화 분자, 제2 표적화 분자, 검출가능한 표지자, 및 선택적으로 활성제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자 및 제2 표적화 분자는 단백질일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 검출가능한 표지자는 영상화 표지자일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 표지자는 64Cu, 68Ga, 또는 18F 일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자는 uPAR 표적화 분자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, uPAR 표적화 분자는 uPA, ATF (amino terminal fragment of urokinase), AE105, 또는 AE105mut 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자는 CD13 표적화 분자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, CD13 표적화 분자는 Asn-Gly-Arg (NGR) 모티프를 포함하는 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, CD13 표적화 분자는 펩타이드, 예를 들어, 사이클로(cNGRc), 사이클로(cPNGRc), 사이클로(NGRyK), 선형 cNGRc, 또는 선형 cPNGRc 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제2 표적화 분자는 인테그린 αvβ3 표적화 분자일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 인테그린 αvβ3 표적화 분자는 외부로 노출된 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 트리펩타이드 서열 또는 아르기닌-알라닌-아스파르트산(RAD) 서열을 가진 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 인테그린 αvβ3 표적화 분자는 사이클로(RGDyK) (RGD) 또는 사이클로(RADyK) (RAD)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 CD13 및/또는 인테그린 αvβ3 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다 (예를 들어, 도 1 참조). 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 uPAR 및/또는 인테그린 αvβ3 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 구체예에서, 본 발명은 치료가 필요한 대상체, 예를 들어 질환 또는 질병을 가지거나, 질환 또는 질병을 가질 위험성이 있거나, 질병 또는 질환을 위해 스크리닝/테스트되는 대상체에서, 세포, 조직 또는 관심 구조물을 영상화하기 위한, 상기 기술된 화합물의 용도를 제공한다. 이러한 방법에서, 대상체는 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 검출가능한 표지자의 유효량을 투여받는다. 관련된 구체예에서, 상기 대상체는 상술한 바와 같은, 제2 표적화 분자, 및 킬레이트제 화합물을 추가로 투여받을 수 있다. 상기 방법은, 예를 들어, 대상체에서 종양, 감염, 퇴행성 질환 등을 진단하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 질환의 전파, 예를 들어, 기관 또는 구조물(예, 뼈)에서 종양 전이 또는 침투의 존재 또는 부재를 결정하는데 사용될 수 있다.
5.1.2. 활성제 전달
일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 본 발명의 표적화된 약물 전달 화합물의 치료학적 유효량을 제공받는다. 일부 구체예에서, 본 발명은 암, 울혈성 심부전(congestive 심장 failure), 당뇨, 천식, 폐기종(emphysema), 경색(infarction), 허혈(ischemia), 동맥경화증(arteriosclerosis), 독성(toxicity), 정신 질환(mental disease), 우울증(depression) 또는 부정맥(arrhythmia)과 같은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 당업자는 질환을 가진 세포에 대한 활성제를 표적화하는 적절한 바이오마커를 선택할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 검출가능한 표지자의 유효량을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 세포, 조직 또는 관심 구조물 또는 대상체의 질환 또는 질병을 치료하기 위한, 상기 기술된 화합물의 용도를 제공한다. 관련 구체예에서, 상기 대상체는 상술한 바와 같은, 제2 표적화 분자, 및 킬레이트제 화합물을 추가로 투여받을 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 소아 환자이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 성인 환자이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 설치류, 토끼, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 화합물은, 주사(예, 정맥, 피하, 복강내), 주입, 흡입, 경구, 국소, 비경구, 경피, 직장, 또는 이식된 저장소(implanted reservoir)를 통해 투여될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
5.1.3. 분자 영상화
일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자의 투여 후 대상체가 영상화된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화는 PET(Positron Emission Tomography), SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography), 평면 감마 카메라(Planar gamma camera), X-ray, CT, 평면 X-ray, MRI(Magnetic Resonance Imaging), 광학 영상기(optical imager), 또는 기타 진단 영상화 기법 에 의해 수행될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 소아 환자이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 대상체는 성인 환자이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 비인간 동물은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 설치류, 토끼, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
표적화된 분자 영상화 화합물은 표적화된 약물 전달 화합물에 대해 기술한 바와 동일한 경로에 의해 투여될 수 있다.
5.2. 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물의 제조를 위한 방법 및 킬레이트제
본 발명은 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 (예를 들어, 세포 상에서) 하나 이상의 바이오마커와 각각 상호작용하는 두 개의 구성요소 또는 표적화 분자를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물의 다양한 모이어티를 부착하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 킬레이트제는 다양한 표적화 분자를 부착할 수 있다 (예를 들어, 도 2 참조). 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 또한 검출가능한 표지자, 염료 분자, 및/또는 활성제를 하나 이상의 표적화 분자에 부착할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 검출가능한 표지자, 염료 분자, 및/또는 활성제를 2 이상의 표적화 분자에 부착할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 하나의 표적화 분자에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 두 개의 표적화 분자에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 하나 이상의 동일한 표적화 분자에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 하나 이상의 종류의 표적화 분자에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 두 종류의 표적화 분자에 결합될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 단량체에 대한 하나의 표적화 분자(예, 제1 또는 제2 표적화 분자)에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 동종이량체(homodimer)에 대한 두개의 동일 표적화 분자(예, 두 개의 제1 또는 두 개의 제2 표적화 분자)에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 이종이량체(heterodimer)에 대한 두 개의 다른 표적화 분자(예, 제1 및 제2 표적화 분자)에 결합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 다중모드성(multimodality)에 대한 하나의 표적화 분자(예, 제1 또는 제2 표적화 분자) 및 하나의 염료 분자에 결합될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 스페이서를 통해 하나 이상의 표적화 분자에 부착될 수 있다. 일부 비-제한적인 예시에서, 스페이서는 중합체 또는 생물분자(biomolecule)일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 중합체는 합성 또는 천연일 수 있다. 일부 비-제한적인 예시에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)일 수 있다. 예를 들어, 중합체는 약 5 내지 40 Da, 최대 약 100 Da, 최대 약 200 Da, 최대 약 300 Da, 최대 약 400 Da, 최대 약 1,000 Da, 최대 약 10,000 Da, 최대 약 25,000 Da, 최대 약 30,000 Da, 최대 약 35,000 Da, 또는 최대 약 Da 40,000의 분자량을 가질 수 있고, 또는 추가적인 예시로, 약 40 Da 내지 약 100,000 Da, 약 40 Da 내지 약 5,000 Da, 약 40 Da 내지 약 10,000 Da, 약 40 Da 내지 약 25,000 Da, 약 1,000 Da 내지 약 25,000 Da, 약 200 Da 내지 약 100,000 Da, 약 10,000 Da 내지 약 100,000 Da, 약 25,000 내지 약 100,000 Da, 또는 약 25,000 Da 내지 약 50,000 Da의 분자량을 가질 수 있다.
추가적인 예시로, 중합체는 폴리아크릴산; HES(hydroxyethyl starch); 폴리락티드-코-글리콜라이드; PLA-DX-PEG (poly-D, L-p-dioxanonepoly lacticacid-ethylene glycol block copolymer); 폴리 (오르소) 에스테르; 폴리-글루타메이트; 폴리아스파테이트; α-β-불포화 단량체, 예를 들어, (메스)아크릴산, 크로톤산, 말레산, 말레산무수물, 푸마르산, 이타콘산 또는 무수물 등; 비닐 에테르, 비닐 에스테르, 비닐아민 아마니드, 올레핀, 디알릴 디알킬 암모늄 할라이드, 바람직하게는 비닐 에테르를 포함하는 공단량체(comonomer); 폴리 (디에틸렌글리콜아디페이트); 폴리에틸렌이민; 폴리글리콜라이드; 폴리우레아; 폴리리모넨 (또는 Polylimo); 폴리 (2-메틸-l, 3-프로필렌 아디페이트); 그라프트 중합체; 다른 중합체들과의 그라프트 (블록) 중합체일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 중합체는 선형, 분지형 또는 수지상(dendrimic)이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 중합체는 PEG 이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, PEG 스페이서는 약 44 Da 내지 20 kDa 의 분자량을 가질 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, PEG 스페이서는 비-PEG 부분 및/또는 비-PEG 단량체를 포함할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서는 약 2 내지 약 30 단량체를 포함할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서는 약 2 내지 약 20, 약 2 내지 10, 약 4 내지 10, 약 4 내지 9, 약 4 내지 8, 약 4 내지 7, 약 4 내지 6, 또는 약 4 내지 5의 단량체를 포함할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서는 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 55 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 또는 30 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 또는 약 30 단량체를 포함할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 일반 화학식 I의 다기능성 킬레이트제를 포함한다:
Figure pct00001
(n=0 내지 10, 바람직하게 n=0 또는 1),
상기에서 킬레이팅 코어(chelating core) 그룹은 NOTA, NETA, CB-TE2A, CB-TE1A1P, TETA, Pycu2A, DiAmSar, DOTA, DTPA, PCTA, DFO 등으로부터 선택된다.
Figure pct00002
일부 구체예에서, 킬레이팅 코어는 소정의 금속 이온과 배위하고 안정한 킬레이트를 형성할 수 있는 그룹이다. 킬레이팅 코어는 방사성 금속과 착물을 형성하기 위한 핵심 그룹니다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는, 64Cu, 68Ga, Al18F 등과 같은 방사성 동위원소와 배위할 수 있는 킬레이팅 코어와 더불어, 아마이드 결합(amide bond) 연결을 카르복시산 또는 활성 에스테르기, 및 아자이드-알킨 기반의 클릭 화학(click chemistry)에 적절한 아자이드기(azide group)와 결합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 1, 4, 7-트리아자사이클로노네인(TACN)-기반의 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸(사이클렌)-기반의 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.2] 헥사데칸-기반의 킬레이트제를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는 NOTA, DOTA, L-NETA, N3-NOtB2 또는 N3-DOtB3 를 포함한다. 실시예 1 및 2는 본 발명에 따른 샘플 합성 방법을 제공한다.
Figure pct00003
금속 킬레이팅 코어에 더하여, 개시된 킬레이트제는 두 개의 생물직교적 (bioorthogonal)관능기를 포함할 수 있다: 어시스트 아마이드 형성을 통해 제1 표적화 분자 및 클릭 화학을 통해 제2 표적화 분자 (또는, 검출가능한 표지자, 또는 활성제)를 각각 부착하기 위한 카르복시산기 및 아자이드기. 하나의 관능기만을 포함하는 다른 분자 킬레이트제들과 비교하여, 이들 새로이 개발된 이중기능성 킬레이트제(bifunctional chelators, BFC)들은 다양한 잇점들이 입증되었다. 첫째, 킬레이트제와 스페이서 모두의 역할을 하는 BFC의 사용으로 인해 합성 전략이 보다 간단해질 수 있다; 따라서, 광범위한 보호 및/또는 탈보호 및/또는 다기능성 스페이서 제조가 필요하지 않다. 둘째, 반응(SPPS 및 클릭 반응)이 거의 정량적 수율(quantitative yield)에서 쉽게 완료되기 때문에 조건 최적화가 필요없어, 제조가 용이해진다. SPPS및 클릭 반응의 최대한의 사용이 순수한 영상화 프로브를 얻기 위한 단 한번의 크로마토그래피 정제 단계의 사용을 허용한다. 마지막으로, 본원에서 예로 든 것들에 제한되지 않는 임의의 관심있는 리간드, 염로 및 기타 관능성 모이어티를 포함하는 다가성 및 다중모드 영상화 프로브의 제조에 적용될 수 있는 보편적이고 내구성있는 플랫폼이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는, PPh3와 같은 통상 사용되는 환원제를 사용하여 아자이드를 아마이드기로 환원시킴으로써 고체상 펩타이드 합성 (solid phase peptide synthesis, SPPS)에 적합하도록 변형될 수 있다. SPPS는 카르복시산과 아미노기 간의 아마이드 형성 반응에 기초한다. 아자이드의 환원은 하기 아미노산 접합을 위항 아미노기를 제공한다. 따라서, 아미노기와 함께, 킬레이트제는 SPPS 시스템에 대해 양립가능하다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 자동 펩타이드 합성이 아자이드기의 아마이드기로의 레진상(on-resin) 환원 후 합성 과정을 간소화하기 위해 사용될 수 있다. 자동 펩타이드 합성은 SPPS 와 동일한 원리로 작동하여 시간과 노력을 절감할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 킬레이트제는, 아자이드기 및 카르복시산 또는 에스테르기 모두를 가지는 활성 펜던트 암(pendant arm)을, 친핵성 치환 반응에 의해, 킬레이팅 코어에 접합시킴으로서 합성될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 검출가능한 표지자는 킬레이트제를 방사성 핵종(radionuclide)과 인큐베이션함으로써 부착될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제2 검출가능한 표지자는 클릭 화학, 에스테르화 반응, 아마이드화 반응, 또는 다른 접합 반응을 통해 킬레이트제를 염료와 반응시킴으로써 부착될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 활성제는 클릭 화학, 에스테르화 반응, 아마이드화 반응, 또는 다른 접합 반응을 통해 킬레이트제를 활성제와 반응시킴으로써 첨가될 수 있다.
5.2. 다량체의 표적화 분자들 간의 스페이서 길이를 최적화하기 위한 고속대량 스크리닝 플랫폼
일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달 화합물들의 표적화 분자들 간의 스페이서 길이를 최적화하기 위한 시험관내 고속대량 스크리닝 플랫폼을 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 시험관내 고속대량 스크리닝 플랫폼은 각 테스트에서 nM 범위에서 표적화 분자들만을 사용할 수 있는 민감한 분석법이다. 보다 적은 표적화 분자들을 사용하는 것은 스크리닝 분석의 비용을 절감시킬 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명은 하나 내지 두 단계와만 관련되는 반응을 제공한다. 도 3은 본 발명의 시험관내 고속대량 스크리닝 분석법의 비-제한적 예시이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 상기 방법은 스페이서 길이를 최적화하기 위한 클릭 화학 및 방사선 화학(radio chemistry)을 조합한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물의 현장(on-site) 형성을 통한 스크리닝 플랫폼으로 사용될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화된 분자 영상화 및/또는 약물 전달 화합물의 표적화 분자는, 광자 생성원(photon generating source)에 의해 일단 활성화되면 광분해성 기능기에 결합하는 반응성 관능기 또는 불활성화된 광분해성 관능기(즉, 광-촉발성(photo-triggerable) 관능기)로 별도로 관능화될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 고속대량 스크리닝 플랫폼은 제1의 관능화된 표적화 분자 및 제2의 관능화된 표적화 분자에 노출된 세포를 포함하며, 여기에서 제1의 관능화된 표적화 분자 및/또는 제2의 관능화된 표적화 분자는 표적화 분자와 반응성 관능기 사이에 상이한 길이의 스페이서를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1의 관능화된 표적화 분자 또는 제2의 관능화된 표적화 분자는 표적화 분자와 반응성 관능기 사이에 정해진 길이의 스페이서를 포함한다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 불활성화된 광분해성 관능기를 활성화시키기 위해 광자 에너지(photon energy)에 노출되며, 이는 두 개의 표적화 분자가 이들의 각 스페이서를 통해 연결되도록 한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 분석은 결합되지 않은 활성화된 광분해성 관능기에 결합할 수 있는 과량의 방사성 금속 표지된 킬레이트제로 소광(quenched)될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 결합된 방사성-금속 표지된 킬레이트제의 양이 측정될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 측정된 방사능의 감소는 스페이서 길이가 적절하거나 최적임을 나타낸다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 제1의 관능화된 표적화 분자는 광분해성 관능기를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 광분해성 관능기는 Photo-OIDBO 또는 Photo-테트라졸(tertrazole) 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 제2의 관능화된 표적화 분자는, 일단 광분해성 관능기가 광자 에너지에 노출되면 광분해성 관능기만 결합하는 반응성 관능기를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제2의 관능화된 표적화 분자의 반응성 관능기는 아자이드 또는 알켄일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
5.2.1.다가성 화합물의 제조
일부 비-제한적인 구체예에서, 제1의 관능화된 표적화 분자는 불활성화된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1의 관능화된 표적화 분자는 다양한 단량체 길이의 스페이서(예, PEG)를 포함하는, 불활성화된 광분해성 관능기-(단량체)n-표적화 분자 (예를 들어, 도 3에서 p-ODIBO)이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서는 (상술한 바와 같이) 약 2 내지 약 30 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, n 은 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 또는 30 단량체와 동등할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 불활성화된 광분해성 관능기-(단량체)n-표적화 분자는, Boc-(단량체)n-NHS 을 관심있는 표적화 분자에 첨가한 후 Boc 탈보호함으로써 먼저 NH2-(단량체)n-표적화 분자를 형성함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Boc-(단량체)n-NHS 은 적절한 완충액(예, 인산염 완충 식염수(PBS))에서 표적화 분자와 결합된 후 TFA(trifluoroacetic acid)(예, 95%)로 탈보호될 수 있다. 그 후, 제조된 NH2-(단량체)n-표적화 분자는 불활성화된 광분해성 관능기-NHS 와 혼합되어 불활성화된 광분해성 관능기-(단량체)n-표적화 분자를 생성할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 제2의 관능화된 표적화 분자는 정해진 단량체 길이의 스페이서를 포함하는, 반응성 관능기-스페이서-표적화 분자 (예를 들어, 도 3에서 N3)이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 스페이서는 (상술한 바와 같이) 약 2 내지 약 30 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 4 또는 8 단량체일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 반응성 관능화된 표적화 분자는 적절한 완충액(예, PBS)에서 표적화 분자와 반응성 관능기-스페이서-NHS 를 혼합함으로써 제조될 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 반응성 관능화된 표적화 분자는 광분해성 관능화된 표적화 분자 대신 다른 길이의 스페이서들을 포함한다. 비-제한적인 일예로, 반응성 관능화된 표적화 분자가 더 쉽게 제조될 수 있기 때문에, 광분해성 관능화된 표적화 분자 대신 반응성 관능화된 표적화 분자를 사용하여 스페이서 길이를 테스트하는 것이 더 간편할 수 있다.
예시로서, 광분해성 관능화된 표적화 분자는 photo-ODIBO-PEGn-RGD 펩타이드 (예를 들어, n= 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 예시로서, 반응성 관능화된 표적화 분자는 N3-PEGn-AE105 및/또는 N3-PEGn-NGR 펩타이드일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
5.2.2. 시험관내 고속대량 분석법
일부 비-제한적인 구체예에서, 반응성 관능기-스페이서-표적화 분자는 특정 단량체 길이를 가진 스페이서를 가지는 불활성화된 광분해성 관능기-(단량체)n-표적화 분자의 한 세트와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 구체예에서, 각 스페이서 길이 조합의 하나의 혼합물이 존재할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 불활성화된 광분해성 관능기-스페이서-표적화 분자는 특정 단량체 길이를 가진 스페이서를 가지는 반응성 관능기-(단량체)n-표적화 분자의 한 세트와 혼합될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 반응성 관능화된 표적화 분자 및 불활성화된 광분해성 관능화된 표적화 분자는 약 1:1 몰비(molar ratio)로 혼합되어 혼합된-표적화 분자 저장액(stock solution)을 제조할 수 있다. 이 비율은 두 표적화된 수용체의 밀도에 따라 조정될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 각 반응 혼합물은 각각 하나의 특정 스페이서 길이를 가지는 관능화된 표적화 분자를 포함한다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 혼합된-표적화 분자 저장액의 하나는 관심있는 바이오마커를 포함하는 세포에 첨가될 수 있다. 과잉의 표적화 분자 존재를 가지는 것이 바람직하다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 표적화 분자가 표적화된 바이오마커에 결합한 후, 결합하지 않은 표적화 분자들은 세척될 수 있다 (예를 들어, 적절한 완충액을 사용하여).
일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는, 예를 들어 약 1분 내지 1시간(포함됨) 동안, 즉, 관능화된 표적화 분자 상의 불활성화된 광분해성 관능기가 활성화된 광분해성 관능기로 전환되기에 효과적인 시간 동안, 광자 에너지(레이저 및/또는 기타 광원(light source)을 포함하나 이에 제한되지 않음)에 노출된다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 활성화된 광분해성 관능기에 결합하는 방사성 표지된 반응성 관능기가 세포에 첨가된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 방사성 표지된 반응성 관능기가 첨가되기 전 2-4시간 인큐베이션 된다. 일부 구체예에서, 방사성 표지된 관능기는 N3-방사성 원소-킬레이트제 (예를 들어, N3-(64Cu)NOTA)일 수 있고, 비-제한적인 구체예에서, 광 조사(photo irradiation) 후 2-4시간에 첨가되어 두 개의 상이한 표적화 분자 간의 클릭 반응을 위한 충분한 시간을 허용할 수 있다. 이러한 N3-방사성 원소-킬레이트제의 첨가의 목적은 두 개의 상이한 표적화 분자들 간의 클릭 반응의 정도를 측정하기 위해 반응하지 않은 광분해성 관능기의 양을 검출하기 위한 것이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 방사성 표지된 반응성 관능기는, 바이오마커에 결합되지만 관능화된 표적화 분자의 반응성기에는 결합하지 않았던 "과잉의" 활성화된 광분해성기에 결합한다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 적절한 완충액으로 세척되어, 당업자에게 공지된 방법으로 방사능 수준을 검출하기 전에 과잉의 방사선 표지된 반응기들이 제거된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 가장 낮은 "과잉의(excess)" 방사성 표지된 반응기들을 포함하는, 가장 낮은 방사성-계수(radio-counts)를 가지는 관능화된 표적화 분자들의 조합은, 대응되는 스페이서들이 적절하거나 최적의 길이임을 나타낸다.
예시로서, 이에 제한되지 않으나, 반응성 관능기-스페이서-표적화 분자 (예를 들어, N3-PEG4-AE105)는 하나 이상의 (예를 들어, 10개의) 불활성화된 광분해성 관능기-(단량체)n-표적화 분자들(예를 들어, photo-ODIBO-PEGn-RGD 펩타이드; n= 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20)과 1:1 몰비로 혼합되어, 하나 이상의(예를 들어, 10개의) 혼합된-표적화 분자 저장액을 제조할 수 있다. 혼합된-표적화 분자 저장액 각각은 세포로 미리 접종된 분리된 세포 배양 웰에 첨가될 수 있고, 세포는 혼합된-표적화 분자들과 인큐베이션될 수 있다 (예를 들어, 결합 평형(binding equilibrium)이 달성될 때까지). 일부 구체예에서, 세포는 24, 48, 96, 384, 또는 1536 웰 플레이트에 미리 접종된다. 혼합된 표적화 분자들과 인큐베이션된 후, 세포들은 적절한 완충액(예를 들어, PBS)로 세척되어 결합하지 않은 표적화 분자들이 제거된다. 그 후 세포는 광자 에너지 (예를 들어, UV 램프(365 nm)) 에 노출되어 광분해성 관능기를 활성화시킨 뒤(예를 들어, 아자이드-활성화 "ODIBO"를 생성하기 위함), 세포 상의 바이오마커에 결합한 활성화된 광분해성기(예를 들어, N3-PEGn-AE105 및 ODIBO-PEGn-RGD)와 반응기 사이의 연결을 촉발한다. 두 표적화 분자가 결합하도록 인큐베이션한 후(예를 들어, 2-4시간), 방사성 표지된 반응기(예를 들어, N3-(64Cu)NOTA))를 세포에 첨가할 수 있고, 이는 관능화된 표적화 분자들의 반응기에 결합하지 않는 활성화된 광분해성기에 결합할 것이다. 결합하지 않은 방사성표지된 반응기는 세척하여 제거될 수 있고, 세포의 플레이트는 플레이트 판독기(예를 들어, 고속대량 MicroBeta2 Plate Counter)로 판독되도록 처리되어 방사성 표지된 반응기들을 측정할 수 있다.
5.2.3. 세포주
일부 구체예에서, 이 방법은, 당업계에 공지된 일차 세포 배양물, 조직 외식편(tissue explant), 또는 형질전환된 세포 배양물을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 세포 배양물을 사용하여 적용될 수 있다. 이러한 세포 배양물의 비-제한적인 예시는 다음을 포함한다: 일차(Primary)-인간 BM SC; 일차(Primary)-인간 피부 FB; 일차(Primary)-소(cow) CC; 일차(Primary)-랫트 BMSC; 일차(Primary)-인간 CC; MC3T3-E1; 일차(Primary)-인간 UVEC; 일차(Primary)-토끼 CC; NIH 3T3; 일차(Primary)-CC; 일차(Primary)-랫트 간 Hep; 일차(Primary)-인간 피부 케라티노사이트; MG63; HEP-G2; L929; 일차(Primary)-BM SC; 일차(Primary)-토끼 BM SC; 일차(Primary)-돼지 CC; 일차(Primary)-인간 뼈 OB; MCF-7; 일차(Primary)-랫트 심장 CM; 일차(Primary)-인간 포피 FB; 일차(Primary)-인간 Adipose SC; 일차(Primary)-인간FB; 일차(Primary)-인간Adipose SC; 일차(Primary)-FB; 일차(Primary)-랫트 대동맥 SMC; 일차(Primary)-뼈; 일차(Primary)-개 CC; 3T3 (비특이적); C2C12; MDA-MB-231; SaOS-2; 일차(Primary)-마우스 BM SC; 일차(Primary)-랫트 CC; 일차(Primary)-인간 중배엽 Mes Pre C; 일차(Primary)-랫트 뇌 Neuronal; PC12; 일차(Primary)-암; 일차(Primary)-인간피부 EC; 일차(Primary)-랫트 BM OB; 일차(Primary)-마우스 배아 SC; MCF-10A; 일차(Primary)-인간 뼈 OB-유사; 일차(Primary)-염소 BMSC; 일차(Primary)-인간 대동맥 SMC; MDCK (Madin-Darby Canine Kidney); 일차(Primary)-hi DAnnulus C; 일차(Primary)-랫트 뼈 OB; 일차(Primary)-인간 Adipose Preadipocyte; 일차(Primary)-SC; 일차(Primary)-랫트 Skeletal Muscle Myoblast; 일차(Primary)-심장 CM; 일차(Primary)-소(cow) 대동맥 EC; 일차(Primary)-개 BM SC; 일차(Primary)-양 BM SC; 일차(Primary)-양 CC; 일차(Primary)-돼지 BMSC; 일차(Primary)-소(cow) BMSC; 일차(Primary)-인간Bladder SMC; 일차(Primary)-돼지 대동맥 EC; 일차(Primary)-인간 각막 Epi C; 일차(Primary)-인간 대동맥 EC; 일차(Primary)-인간 각막 FB; 일차(Primary)-돼지 대동맥 SMC; 일차(Primary)-마우스 간 Hep; A549; 일차(Primary)-Bone OB; 일차(Primary)-인간 방광 Uro; 일차(Primary)-인간 UV SMC; Swiss 3T3; 일차(Primary)-Liver Hep; 일차(Primary)-인간 Lig FB; 일차(Primary)-인간 Coronary Artery SMC; 일차(Primary)-OB-유사; 일차(Primary)-인간 teeth Mes Pre C; HT1080; 일차(Primary)-랫트 심장 FB; 일차(Primary)-돼지 HV Intersticial C; C3A; 일차(Primary)-인간 유방 암; 일차(Primary)-인간 포피 케라티노사이트; 일차(Primary)-인간 Oral Mucosa 케라티노사이트; 일차(Primary)-마우스 난소 Oocytes; 일차(Primary)-인간 Vase SMC; 3T3-L1; 일차(Primary)-인간 폐 FB; 일차(Primary)-닭 Ganglia Neuronal; 일차(Primary)-인간 U CStC; 일차(Primary)-소(cow) 대동맥 SMC; 일차(Primary)-마우스 배아 FB; 일차(Primary)-인간 Bronchi EpiC; CHO-K1; 일차(Primary)-인간 간 Hep; 일차(Primary)-인간SaphVEC; 일차(Primary)-인간TeethPDL; 일차(Primary)-랫트 피부 FB; 일차(Primary)-돼지 간 Hep; PC-3; 일차(Primary)-SMC; 일차(Primary)-인간MVEC; 일차(Primary)-마우스 FB; 일차(Primary)-인간 Nasal Chondrocyte; 일차(Primary)-인간각막 케라티노사이트; 일차(Primary)-인간난소암; 일차(Primary)-인간 U CBSC; 일차(Primary)-랫트 심장 EC; 일차(Primary)-Vasc; 일차(Primary)-마우스 피부 FB; 일차(Primary)-인간 Tendon TC; 일차(Primary)-랫트 뇌 Astrocyte; 일차(Primary)-랫트 Nerve SC; Ha CaT; 일차(Primary)-인간 Gingiva FB; 일차(Primary)-Neural; 일차(Primary)-소(cow) 뼈 OB; 일차(Primary)-랫트 Adipose SC; 일차(Primary)-마우스 뼈 OB; 일차(Primary)-인간 치아 PC; 일차(Primary)-인간 Blood Mononuclear; 일차(Primary)-랫트 해마 Neuronal; D3; HeLa; HEK293; C17.2; 일차(Primary)-인간 피부 멜라노사이트; 일차(Primary)-인간 Blood EC-유사; HOSTE85; 일차(Primary)-인간 UC SC-유사; 일차(Primary)-인간 각막 SC; 일차(Primary)-랫트 대동맥 EC; 일차(Primary)-인간 Saph VSMC; 일차(Primary)-인간 UCBEC; 일차(Primary)-마우스 심장 CM; D10RL UVA; 일차(Primary)-인간 Coronary Artery EC; 일차(Primary)-인간 대동맥 Myo FB; HT-29; 일차(Primary)-인간 Tendon FB; RAW 264; 일차(Primary)-랫트 Dental Pulp SC; 3T3-J2; H1; 일차(Primary)-돼지 Teeth; 일차(Primary)-랫트 Sciatic Schwann; 일차(Primary)-토끼 뼈 OB-유사; 일차(Primary)-양 대동맥 EC; 일차(Primary)-토끼 각막 Epi C; 일차(Primary)-인간 난소 Epi C; 일차(Primary)-토끼 Ear Chondrocyte; SH-SY5Y; 일차(Primary)-인간 치아 FB; 일차(Primary)-인간 Oral Mucosa FB; 일차(Primary)-토끼 FB; C6; 일차(Primary)-랫트 고환 Stertoli; 일차(Primary)-소(cow) Arterial EC; 일차(Primary)-pigHVEC; 일차(Primary)-소(cow) Nucleus Pulposus Cells; 일차(Primary)-랫트 Ganglia Neuronal; 일차(Primary)-개 방광 SMC; 일차(Primary)-Vasc SMC; 129/SV; 일차(Primary)-돼지 Ear Chondrocyte; ED27; 일차(Primary)-토끼 뼈 B; 일차(Primary)-인간 뇌 Glioblast; 일차(Primary)-랫트 Adipose Preadipocyte; 일차(Primary)-인간 연골 Synov; 일차(Primary)-랫트 췌장 Insulin; 일차(Primary)-인간EC; 일차(Primary)-양 대동맥 SMC; 일차(Primary)-인간 Endometrium EpiC; U251; 일차(Primary)-인간 Endometrium StC; 일차(Primary)-돼지 방광 SMC; 일차(Primary)-인간 HVIintersticial C; 일차(Primary)-돼지 Esoph SMC; 일차(Primary)-인간 NP Neuronal; 일차(Primary)-토끼 대동맥 SMC; 일차(Primary)-인간 NSC; 일차(Primary)-토끼 CorneaFB; 일차(Primary)-인간 ral 암; 일차(Primary)-토끼 Lig FB; 일차(Primary)-인간 SC; 일차(Primary)-랫트 BMOB-유사; 일차(Primary)-인간 Skeletal Muscle Myoblast; COS-7; C-28/12; HK-2; 일차(Primary)-인간 자궁 암; 일차(Primary)-랫트 뇌실 CM; 일차(Primary)-인간 Vase EC; 일차(Primary)-양 Carotid Artery SMC; HCT-116; ROS 17/2.8; 일차(Primary)-인간 Vocal FB; UMR-106; 일차(Primary)-마우스 대동맥 SMC; H9; R1; 일차(Primary)-랫트 Fetal Neuronal; 일차(Primary)-닭 Ear EpiC; Huh7; 일차(Primary)-랫트 Vasc SMC; 일차(Primary)-인간 NP SC; ES-D3; IMR-90; 일차(Primary)-랫트 방광 SMC; 293T; 일차(Primary)-인간 포피 VascularEC; 일차(Primary)-인간 Placenta EC; 일차(Primary)-인간 폐 EpiC; 일차(Primary)-인간 전립선 EpiC; U-87 MG; 일차(Primary)-개 Carotid Artery SMC; 일차(Primary)-토끼 각막 StC; 일차(Primary)-개 ID Annulus Fibrosus; 일차(Primary)-닭 배아 Chondrocyte; 일차(Primary)-EC; HFF; Vero; HFL-1; 일차(Primary)-인간 Adipose FB; 일차(Primary)-소(cow) FB; 일차(Primary)-인간 UTSMC; 일차(Primary)-랫트 뇌실 FB; AH 927; 일차(Primary)-양 Vasc FB; DU-145; ST2; B16.F10; 일차(Primary)-인간 Nasal EpiC; 일차(Primary)-ID Annulus C; 일차(Primary)-인간 Dental Pulp SC; 3H10T1/2; 일차(Primary)-Heart Valve; 일차(Primary)-인간 뼈 Alveolar; 일차(Primary)-토끼 Tendon FB; 일차(Primary)-마우스 신장 Insulin; HEPM; 일차(Primary)-baboon 대동맥 SMC; HTK; 일차(Primary)-마우스 MDSC; 일차(Primary)-랫트 Esoph EpiC; 일차(Primary)-마우스 Nerve SC; 일차(Primary)-인간 Fetus OB-유사; 일차(Primary)-마우스 Skeletal Muscle SC; hFOB 1.19; 일차(Primary)-Nerve Schwann; 일차(Primary)-인간 Ganglia Neuronal; Caco-2; 일차(Primary)-인간 신장 Renal; 일차(Primary)-인간 유방 EpiC; 일차(Primary)-인간 간 SC; 일차(Primary)-돼지 방광 Uro; 일차(Primary)-인간 폐 EC; 일차(Primary)-인간 유방 FB; 일차(Primary)-양 Jugular Vein EC; 일차(Primary)-돼지 Esoph EpiC; 일차(Primary)-인간 Lymph EC; 일차(Primary)-닭 CC; 일차(Primary)-인간 Lymph TCell; 일차(Primary)-인간 Colon Adenocarcinoma; 일차(Primary)-인간 Mammary EC; 일차(Primary)-돼지 Vocal FB; 일차(Primary)-인간 Mammary EpiC; 일차(Primary)-토끼 Adipose SC; 일차(Primary)-인간 각막 EC; H9c2; 일차(Primary)-인간 UT StC; 일차(Primary)-cat 심장 CM; 일차(Primary)-마우스 췌장 EpiC; HS-5; 일차(Primary)-양 Skeletal Muscle Fetus Myoblast; 일차(Primary)-소(cow) ID; 일차(Primary)-마우스 BM OCpre; 일차(Primary)-소(cow) Knee Meniscus C; Hep-3B; 일차(Primary)-소(cow) Lig FB; HL-1; HuS-E/2; RWPE1; 일차(Primary)-소(cow) 망막 EpiC; 일차(Primary)-인간VascMyoFB; IEC-6; 일차(Primary)-마우스 Fetal Hep; HS68; OVCAR-3; 일차(Primary)-개 Knee MeniscusC; 일차(Primary)-토끼 중배엽 Mes PreC; 일차(Primary)-개 Lig FB; 일차(Primary)-랫트 폐 Alveolar; 일차(Primary)-개 피부 케라티노사이트; CRL-11372; 일차(Primary)-개 Vase SMC; HMEC-1; 일차(Primary)-배아 SC; T-47D1; 일차(Primary)-염소 CC; 일차(Primary)-인간 UVSC-유사; 일차(Primary)-기니아피그 Ear EpiC; 일차(Primary)-Ligament; 일차(Primary)-기니아피그 피부 FB; 일차(Primary)-마우스 Cortical Neuronal; 일차(Primary)-인간Adipose Adipocyte; 일차(Primary)-마우스 간 SC; 일차(Primary)-인간 Adipose FB-유사; CAL72; J774; P19; 일차(Primary)-인간 Amniotic fluid; 일차(Primary)-토끼 각막 EC; 일차(Primary)-인간 Amniotic FSC; 일차(Primary)-랫트 BMFB-유사; ARPE-19; 일차(Primary)-랫트 신장 Mesangial; K-562; 일차(Primary)-랫트 Nasal Ensheathing; 일차(Primary)-인간 방광 StC; 일차(Primary)-닭 배아 Proepicardium; ATDC5; 일차(Primary)-양 FB; Kasumi-1; 일차(Primary)-Skeletal Muscle; 일차(Primary)-인간 뼈 Mes PreC; HMT-3522; 일차(Primary)-인간 뼈 Periosteal; A431; 일차(Primary)-인간 뇌 EC; 일차(Primary)-인간 UTFB; KLE; 143b OST; BALB/3T3; 일차(Primary)-인간 Vasc FB; LLC-PKI; 일차(Primary)-인간 Vasc Pericyte; BHK21-C13; 일차(Primary)-Mammary EpiC; M.DUNNI; C4-2B; ZR-75; HEC-1B; 일차(Primary)-인간 Gingiva 케라티노사이트; U178; 일차(Primary)-인간 HN 암; 일차(Primary)-마우스 Mammary EpiC; 일차(Primary)-인간 케라티노사이트; 일차(Primary)-마우스 Sciatic N Schwann; OVCA429; 일차(Primary)-인간 신장 EpiC; 일차(Primary)-돼지 Esoph FB; MBA-15; 일차(Primary)-돼지 Mandible FB-유사; 일차(Primary)-인간 간 암; 일차(Primary)-토끼 방광 Uro; GD25betalA; 일차(Primary)-토끼 ID AnnulusC; HSC-T6; 일차(Primary)-토끼 NP Neuronal; DOV13; HEY; 일차(Primary)-인간 Mammary FB; HTB-94; BZR-T33; 일차(Primary)-닭 CorneaFB; MiaPaCa2; 일차(Primary)-랫트 Mucosa Ensheathing; 일차(Primary)-인간난소FB; 일차(Primary)-랫트 Salivary Acinar; 일차(Primary)-인간 난소 Oocyte; 일차(Primary)-랫트 고환 Germ; 일차(Primary)-인간 췌장 암; 일차(Primary)-닭 배아 StC; 일차(Primary)-인간 췌장 Stellate Cells; 일차(Primary)-양 Carotid Artery FB; ML0-Y4; 일차(Primary)-닭 망막 SC-유사; 일차(Primary)-인간 전립선 암; 일차(Primary)-닭 Ten TC; 일차(Primary)-인간 Saph V Myo FB; 일차(Primary)-Synoviocyte; MTLn3; 일차(Primary)-Vasc EC; 일차(Primary)-인간 Skeletal Muscle Pre; RT4-D6P2T; C2; SCA-9; HOC-7; T31; 일차(Primary)-인간 UC EpiC; TR146; HCS-2/8; EA.hy926; 일차(Primary)-랫트 Ebryo; SW480; 일차(Primary)-양 Fetus CC; 일차(Primary)-개 췌장 Insulin; KS-IMM; BPH-1; 일차(Primary)-랫트 췌장 SC; M2139; RIN-5F; 일차(Primary)-인간담낭암; E14/TG2a; M4E; HES3; G8; 일차(Primary)-인간결막FB; 일차(Primary)-dogSaphVEC; LN CaP; 일차(Primary)-개 Saph V SMC; M4T; 일차(Primary)-인간 Fetus CC; BR-5; 일차(Primary)-돼지 UT Uro; 일차(Primary)-해마 Neuronal; PE-0041; 일차(Primary)-개 피부 FB; 일차(Primary)-토끼 Skeletal Muscle MyoBlast; 일차(Primary)-소(cow) Denta ipulp; CGR8; 일차(Primary)-개 치아 PDL; 일차(Primary)-랫트 Fetus Hep; 일차(Primary)-개 Tendon FB; 일차(Primary)-랫트 Mammary; 일차(Primary)-인간 Knee C; 일차(Primary)-랫트 SMC; BRC6; 일차(Primary)-양 Artery FB; 일차(Primary)-개 Vasc EC; 일차(Primary)-소(cow) Mammary Alveolar; pZIP; 293 cell line; BMC9; 일차(Primary)-인간 폐 암; SKOV-3; IOSE; TEC3; MCF-12A; 일차(Primary)-rabbitBladderEpiC; Gli36DeltaEGFR; 일차(Primary)-토끼 결막 EpiC; 일차(Primary)-인간 폐 Neuronal; 일차(Primary)-토끼 Endometrium EpiC; 1205Lu; 일차(Primary)-토끼 MDSC; 3T3-A31; 일차(Primary)-토끼 Tendon Tenocyte; MDA-MB-435; 일차(Primary)-인간 암; 일차(Primary)-소(cow) EC; 일차(Primary)-랫트 각막 FB; 일차(Primary)-EpiC; 일차(Primary)-랫트 Fetal Cardiac; 일차(Primary)-인간 Meninges Arachnoidal; COS-1; 일차(Primary)-Eye; 일차(Primary)-랫트 간 Oval C; GLUTag-INS; 일차(Primary)-랫트 Oral Mucosa 케라티노사이트; GM3348; CRFK; 21NT; 일차(Primary)-랫트 고환 EC; 일차(Primary)-인간 Nasal FB; 일차(Primary)-인간 Dura MaterSC; 일차(Primary)-인간 Nasal OB; 일차(Primary)-개 NP Neuronal; 일차(Primary)-인간 Nasal Secretory; 일차(Primary)-양 폐 FB; AC-1M59; BHPrE1; MIN6; 일차(Primary)-UT; MKN28; RAT-2; MLO-A5; RT112; CRL-2266; S91; GM5387; SK-ChA-1; 일차(Primary)-말 CC; SPL201; 일차(Primary)-말 Tendon FB; 일차(Primary)-인간 Fetus Mes PreC; D283; 일차(Primary)-돼지 갑상선 EpiC; H1299; Par-C10; AE-6; 일차(Primary)-토끼 Blood Platelet; 일차(Primary)-염소 Carotid EC; 일차(Primary)-토끼 뼈 OC; 일차(Primary)-염소 Carotid FB; 일차(Primary)-소(cow) 각막 FB-유사; 일차(Primary)-인간 췌장 SC; 일차(Primary)-토끼 CT Pericyte; 일차(Primary)-염소 Carotid SMC; 일차(Primary)-토끼 Esophagus SMC; 일차(Primary)-인간 Parotid Acinar; 일차(Primary)-baboon Blood EC; A498; 일차(Primary)-인간 Bronchi SMC; 일차(Primary)-인간 Placenta SC; 일차(Primary)-토끼 Sphincter SMC; 일차(Primary)-소(cow) 망막 SC; 7F2; MM-Sv/HP; A10; 일차(Primary)-인간 전립선 StC; 일차(Primary)-buffalo 배아 SC-유사; 일차(Primary)-인간 타액선 암; CHO-4; 일차(Primary)-인간 타액선 Salisphere; 일차(Primary)-랫트 Cortical Neuronal; H13; 일차(Primary)-랫트 배아 Neuronal; 일차(Primary)-기니아피그 췌장 EpiC; 일차(Primary)-랫트 Fetal OB; H144; CNE-2; MPC-11; 21PT; 일차(Primary)-소(cow) Synovium; 일차(Primary)-랫트 간 EC; 일차(Primary)-소(cow) Fetus CC; BEAS-2B; H2122; LM2-4; Detroit 551; C18-4; FLC4; Ishikawa; 일차(Primary)-랫트 피부 케라티노사이트; H35; 일차(Primary)-랫트 Tendon; 일차(Primary)-인간 SMC; HTR8; 일차(Primary)-인간 Synovial CC; E8.5; H460M; HL-60; MUM-2B; CRL-1213; MUM-2C; CRL-12424; W20-17; Lovo; 일차(Primary)-개 Blood EC; 일차(Primary)-양 Nasal CC; HAK-2; 일차(Primary)-양 피부 FB; 일차(Primary)-인간 고환 Sertoli; 일차(Primary)-인간 갑상선 암; 일차(Primary)-Trachea; 일차(Primary)-인간 Trachea; LRM55; 일차(Primary)-인간 UASC-유사; 일차(Primary)-Colon FB; 일차(Primary)-인간UASMC; r-CHO; HAT-7; RN22; HC-11; 일차(Primary)-인간 Eye Vitreous; AEC2; S2-020; HCC1937; CRL-2020; AG1522; SCC-71; N18-RE-105; SK-N-AS; 일차(Primary)-인간 자궁 SMC; SLMT-1; IMR-32; STO; NB4; Swan 71; 일차(Primary)-인간 Alveolar Perosteum; 일차(Primary)-개 Oral Mucosa EpiC; 일차(Primary)-인간 Amnion EP; 일차(Primary)-인간 Fetus Schwann; 일차(Primary)-개 뼈 OB; 일차(Primary)-돼지 UTSMC; 184A1; Panc 1; NCTC 2544; 46C; 일차(Primary)-소(cow) 각막 EC; B6-RPE07; 일차(Primary)-햄스터 EC; cBAL111; 일차(Primary)-햄스터 망막 Neuronal; HEPA-1Clc7; NEB1; CCE; NHPrE1; 일차(Primary)-토끼 결막 FB; 410; Hepa RG; 일차(Primary)-케라티노사이트; PMC42-LA; 일차(Primary)-개 연골 Synov; 21MT; NOR-P1; 일차(Primary)-토끼 Endometrium StC; 일차(Primary)-림프절 림프구; DLD-1; 일차(Primary)-림프절 TCell; 일차(Primary)-토끼 Lacrimal Gland Acinar; AB2.1; 일차(Primary)-토끼 폐 Pneumocyte; 일차(Primary)-원숭이 배아; ES-2; 일차(Primary)-원숭이 신장 FB-유사; 일차(Primary)-토끼 Penis SMC; 일차(Primary)-마우스 Adipose StC; 일차(Primary)-토끼 피부 FB; NR6; 일차(Primary)-Blood SC; 일차(Primary)-마우스 BM Macrophage; 786-0; AT2; 일차(Primary)-랫트 Adrenal Chromaffin; AT3; CCF-STTGI; 일차(Primary)-마우스 뼈 Calvarial; 일차(Primary)-랫트 방광 Uro; HCT-8/E11; CE3; 일차(Primary)-마우스 뇌 Neuronal; CFK2; 일차(Primary)-마우스 유방 암; L6; 일차(Primary)-마우스 콘드로사이트; HeyA8; 일차(Primary)-마우스 Colon EpiC; 일차(Primary)-랫트 Cortical Astrocyte; 일차(Primary)-개 CFB; 일차(Primary)-buffalo 난소 EpiC; 일차(Primary)-개 각막 Chondrocyte; 일차(Primary)-랫트 배아 CM; 일차(Primary)-마우스 배아 Neuronal; A2780; C5.18; 일차(Primary)-개 MV EpiC; 일차(Primary)-마우스 Esophagus SC; 일차(Primary)-랫트 Fetal Renal; HEK001; A357; EFO-27; 일차(Primary)-닭 뼈 OB; 일차(Primary)-마우스 Fetal Lung; 일차(Primary)-랫트 심장 SC-유사; 일차(Primary)-마우스 Germ; 일차(Primary)-랫트 Kidney; EN Stem-A?; 일차(Primary)-랫트 Lacrimal Acinar; U-251 MG; 일차(Primary)-개 Myofibroblasts; A4-4; 일차(Primary)-랫트 간 SC-유사; 일차(Primary)-소(cow) 뇌 EC; 일차(Primary)-랫트 폐 FB; 일차(Primary)-마우스 신장 Renal; BEL-7402; NT2; HIAE-101; 일차(Primary)-인간 BM Mononuclear; 일차(Primary)-랫트 난소; 일차(Primary)-마우스 Lymph FB-유사; 일차(Primary)-랫트 췌장 Islets; 일차(Primary)-개 Esophageal EpiC; 일차(Primary)-랫트 Renal EpiC; 일차(Primary)-마우스 Mast; 일차(Primary)-닭 배아 Blastoderm; NTera2/c1.D1; G-415; Null; 일차(Primary)-랫트 Small Intestine; 일차(Primary)-마우스 난소 Cumulus C; 일차(Primary)-랫트 치아 SC-유사; HEL-299; 일차(Primary)-랫트 Tendon Tenocyte; KB; b-End-2; 일차(Primary)-마우스 췌장 Insulin; 일차(Primary)-랫트 Vase EC; 일차(Primary)-마우스 Salivary Salisphere; 일차(Primary)-인간 Duodenum EpiC; 일차(Primary)-인간 뼈 Fetus OB; 일차(Primary)-Respiratory EpiC; 일차(Primary)-마우스 Skeletal Muscle Myoblast; 일차(Primary)-양 Amniotic fluid; OC2; 일차(Primary)-닭 심장 CM; Daudi; 일차(Primary)- 양 Artery MyoFB; 일차(Primary)-마우스 피부 케라티노사이트; 일차(Primary)-양 뼈 OB-유사; 일차(Primary)-마우스 Small Intestine; 일차(Primary)-닭 심장 ECM; 일차(Primary)-마우스 비장 Tcell; LNZ308; 일차(Primary)-마우스 치아 Odontoblast; 일차(Primary)-양 ID Annulus Fibrosus; 일차(Primary)-마우스 고환 SC; 일차(Primary)-양 Jugular Vein SMC; 일차(Primary)-마우스 고환 정자; 일차(Primary)-양 폐 SC; 일차(Primary)-마우스 UT Uro; 일차(Primary)-양 Saph VEC; 일차(Primary)-마우스 자궁 EpiC; 일차(Primary)-양 피부 EC; OCT-1; 일차(Primary)-양 Vasc EC; HELF; 일차(Primary)-양 Vasc SMC; CAC2; HL-7720; OPC1; 일차(Primary)-Teeth PDL; 일차(Primary)-개 심장 SC; 일차(Primary)-UCB Mononuclear; 일차(Primary)-돼지 Artery Carotid EC; 일차(Primary)-인간 Endometriotic CystStC; 일차(Primary)-돼지 Artery Carotid SMC; 일차(Primary)-Colon 암; 일차(Primary)-돼지 Artery Coronary SMC; QCE-6; 일차(Primary)-돼지 방광 FB; R221A; OSCORT; LS180; B35; RIF-1; Calu-1; RL-65; Calu-3; 일차(Primary)-소(cow) Adrenal ChrC; B5/EGFP; RT-112; 일차(Primary)-pigEC; RW.4; 일차(Primary)-돼지 ESC; S2-013; OVCAR-5; S5Y5; 일차(Primary)-인간 뼈 OC-유사; SA87; INT-407; SAV-I; 일차(Primary)-돼지 Fetus Hep; SCC-68; P69; HNPSV-1; CaSki; SK-CO15; 일차(Primary)-돼지 Iliac EC; SK-N-DZ; Hep2; SKOV31p.1; 일차(Primary)-돼지 Mandible Ameloblast; SNB 19; 일차(Primary)-소(cow) Joint Synovial; 일차(Primary)-인간 Fetus FB; 일차(Primary)-돼지 Mandible Odontoblast; SW1353; 일차(Primary)-돼지 NP Neuronal; SW948; 일차(Primary)-돼지 Oral MucosaEpiC; CRL-2102; 일차(Primary)-돼지 PancreasIslets; T4-2; 일차(Primary)-돼지 PulmonarySMC; TE-85; 일차(Primary)-돼지 Salivary Acinar; THP-1; 일차(Primary)-돼지 SynoviumSC; BME-UV1; KG-1; D4T; HUES-9; 일차(Primary)-마우스 해마 Neuronal; ECV304; NRK; 일차(Primary)-마우스 신장 Mesangial; D407; 10T1/2 세포주; 및 일차(Primary)-인간 포피 멜라노사이트.
5.3. 바이오마커
일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자 및 제2 표적화 분자는 관심있는 생물학적 대상체의 하나 이상의 바이오마커를 표적화한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 및 제2 표적화 분자는 관심있는 생물학적 대상체의 동일하거나 상이한 바이오마커를 표적화할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자 및 제2 표적화 분자가 두 개의 상이한 바이오마커를 표적화할 때, 바이오마커는 동일한 세포 상에 발현된다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 하나의 바이오마커를 표적화하는 하나의 표적화 분자만이 존재한다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 세포의 표면 또는 내부에 발현될 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 세포 표면 단백질, 수용체, 수용체 서브유닛, 조직-특이적 항원, 바이러스 유래 단백질, 바이러스 코딩된 외피 단백질, 박테리아 유래 단백질, 박테리아 표면 단백질 등 일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 인테그린이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 생물학적 대상체는 단백질, 바이러스, 세포, 조직, 기관 또는 유기체이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 세포는 종양, 암, 또는 질환을 가진 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 제1 표적화 분자 및 제2 표적화 분자는 (종양 또는 암 세포를 포함하는) 세포에 결합하며, 예를 들어 췌장암, 유방암, 대장암, NSCLC, 폐암, 골암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부위암, 위암, 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 질암, 외음부암, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상샘암, 부갑상샘암, 부신암, 연부조직육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장암, 요관암, 신장세포암, 신우암, 악성중피종, 간세포암, 담관암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구성 림프종, CNS 종양, 척추축 암, 뇌간교종, 다형성아교모세포종, 별아교세포종, 신경초종, 뇌실막종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종 및 뇌하수체 샘종 종양, 또는 종양 전이를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커의 수준은 다른 방법에 의해 검출가능한 정도보다 낮다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본원의 방법은 질환(예, 암)의 초기단계를 검출할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본원의 방법은 낮은 수준의 바이오마커 존재를 검출할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 EGFR(epidermal growth factor receptor), 인테그린 α1β1, 인테그린 α2β1, 인테그린 α3β1, 인테그린 α4β1, 인테그린 α5β1, 인테그린 α6β1, 인테그린 αvβ3, uPAR, GRP(gastrin-releasing peptide), SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, 엽산 수용체, CCR5, CXCR4, 플렉틴-1(plectin-1), VEGF, CA19-9, PD-I1, Her2/neu, 5-알파 리덕타아제, α-태아단백(α-fetoprotein), AM-1, APC, APRIL, BAGE, β-카테닌, Bc12, bcr-abl (b3a2), CA 125, CASP-8/FLICE, 카텝신, CD13, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD38, CD33, CD35, CD40, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55, CD59 (791Tgp72), CDC27, CDK4, CEA, c-myc, COX-2, 사이토케라틴, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, 에스트로겐 수용체 (ER), FGF8b and FGF8a, FLK 1/KDR, G250, GAGE-Family, 가스트린 17, 가스트린-방출 호르몬(봄베신), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, gp100/Pme117, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, 헤파란나제(Heparanase), Her3, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerase), IGFR1, IL 13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, MAGE Family (MAGE1, MAGE3 등), 맘마글로빈, MAP17, 멜란-A/MART-1, 메소텔린, MIC A/B, MT-MMP's, 예를 들어,MMP2, MMP3, MMP7, MMP9, Mox1, 뮤신, 예를 들어 MUC-1, MUC-2, MUC-3, 및 MUC-4, MUM-1, NY-ESO-1, 오스테오넥틴, p15, P170/MDR1, p53, p97/멜라노트랜스페린, PAI-1, PDGF, 플라스미노겐 (uPA), PRAME, 프로베이신(Probasin), 프로제니포이에틴(Progenipoietin), 프로게스테론 수용체 (PR), PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, SSX 유전자 패밀리, STAT3, STn (mucin assoc.), TAG-72, TGF-α, TGF-β, 티모신 β-15, IFN-γ, TPA, TPI, TRP-2, 티로시나아제, VEGF, ZAG, p16INK4, Myo D1, 글루타치온, 또는 S-트랜스퍼라제일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 EGFR(epidermal growth factor receptor), 인테그린 αvβ3, uPAR, 가스트린-방출 펩타이드(GRP), SSTR2, CCR5, 인테그린 α4β1, VEGF, CA19-9, CD13, CD40, 또는 PD-L1일 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 uPAR 및/또는 인테그린 αvβ3이다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 바이오마커는 CD13 및/또는 인테그린 αvβ3이다.
인테그린은 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 매개하고 이동, 증식, 혈관신생, 종양 침투, 및 전이에 기여하는 세포 부착 분자이다. 인테그린 αvβ3는 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD) 트리펩타이드 서열에 노출된 세포외 기질 단백질들에 대한 수용체 역할을 한다. 중요하게, 인테그린 αvβ3 는 보통 대부분의 성인 상피 세포에서는 매우 낮은(또는 검출가능하지 않은) 수준으로 발현하나, 다양한 종양 세포들에서는 고도로 상향조절된다. 최근 발현 분석은 높은 αvβ3 발현을 가진 환자들이 낮은 αvβ3 발현을 가진 환자들보다 생존 시간이 유의적으로 더 짧다는 것이 증명되었다. 종양 성장, 침투 및 전이 동안 이의 제한된 발현은 급격하게 성장하고 전이성인 종양의 치료 및 진단에 대한 흥미로운 분자 표적을 제시하며, 따라서, αvβ3 는 본 발명의 바이오마커의 하나의 예시이다.
막관통 단백질 분해효소인, 아미노펩티다아제 N(Aminopeptidase N, APN)/CD13는, 또다른 중요한 바이오마커이다. 인테그린 αvβ3와 유사하게, CD13 또한, 종양의 신생혈관에서 상향조절되나 정상 혈관에서는 거의 발현하지 않고, CD13의 고발현이 다수의 인간 고형암, 예를 들어 흑색종, 전립선암, 폐암, 난소암 및 췌장암에서 관찰되었다. NGR 서열을 포함하는 펩타이드들이 CD13 결합에 높은 효율성/선택성을 나타내었다. 따라서, CD13은 본 발명에 따른 바이오마커의 또다른 예시를 제공한다.
uPAR 는 암 영상화의 또다른 중요한 바이오 마커인데, 이는 임상적 연구 및 실험실 연구 모두에서 uPA/uPAR 의 과발현이 악성 종양에서 나쁜 예후와 강력한 관련성이 있는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 또한, uPAR 는 다양한 악성 종양들(보통 세포당 수천개의 수용체들을 발현함)에서 과발현되나, 정상 및 인접 조직에서는 발현하지 않거나 매우 낮은 수준으로 발현한다. 따라서, uPAR 는 본 발명의 바이오마커의 또다른 예시이다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 인테그린 αvβ3 및 CD13에 관한 본 발명의 다가성 화합물은(예를 들어, CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체) 암의 초기 단계의 검출에 사용된다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 인테그린 αvβ3 및 CD13에 관한 본 발명의 다가성 화합물은 인테그린 αvβ3 및/또는 CD13의 낮은 수준을 검출하는데 사용될 수 있다.
5.4. 키트
본 발명은 또한 본 발명을 실행하기 위해 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 키트는 하나 이상의 영상화 및/또는 약물 전달 화합물을 포함할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명의 키트는 분자 영상화 및/또는 표적화된 약물 전달을 위해 키트를 사용하는 방법에 대한 지시서(instruction)를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 키트는 주사기 및/또는 카테터 및/또는 의료용 유도관(introducer sheath)과 같은 투여 장치를 더욱 포함할 수 있다.
일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 검출가능한 표지자 및/또는 활성제를 가진 단량체를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 검출가능한 표지자 및/또는 활성제를 가진 동종이량체(homodimer)를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 검출가능한 표지자 및/또는 활성제를 가진 이종이량체(heterodimer)를 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 영상화 및/또는 약물 전달 화합물은 화합물은 검출가능한 표지자 및/또는 활성제를 가진 염료 분자를 가진 표적화 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 영상화 및/또는 약물 전달 화합물을 제조하기 위한 키트를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명의 키트는 제1 표적화 분자 (건조 또는 액체 형태) 및/또는 제2 표적화 분자 (건조 또는 액체 형태) 및/또는 영상화 및/또는 약물 전달 화합물로 조립하기 위한 킬레이트제를 포함한다. 상기 분자가 건조된 형태로 제공될 때, 키트는 용액 또는 조성물를 생성하기 위한 적절한 완충액 또는 용매를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 영상화 및/또는 약물 전달 화합물의 스페이서의 최적의 길이를 결정하기 위한 키트를 제공한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 본 발명의 키트는 고속대량 스크리닝 플랫폼을 위하여 제1 표적화 분자 (건조 또는 액체 형태) 및/또는 제2 표적화 분자 (건조 또는 액체 형태) 및/또는 다른 길이의 스페이서들 및/또는 방사성-금속 표지된 킬레이트들을 포함한다. 일부 비-제한적인 구체예에서, 키트는 고속대량 분석 플랫폼을 생성하기 위해 적절한 완충액 또는 용매를 포함할 수 있다.
도 1: 본 발명의 다가성 화합물의 비-제한적인 도식.
도 2: 본 발명의 다가성 화합물 제조에 대한 비-제한적인 도식.
도 3: 본 발명의 고속대량 스크리닝 플랫폼(high-throughput screening platform)에 대한 비-제한적인 도식.
도 4: AE105-NOTA-RGD 의 구조.
도 5: 프로브의 방사성 표지의 대표적인 HPLC 결과.
도 6: AE105-NODAGA 및 RGD-NODAGA 의 구조.
도 7: 1일동안 혈청에서 프로브를 인큐베이션한 후 유의성 없는 64Cu-해리(disassociation)를 보여주는 방사성-HPLC 결과.
도 8: AE105-PEG4-DOTA-PEG4-RGD 의 구조.
도 9: AE105-NOTA-NHCO-Cy3 (A) 및 차단(blockade)을 사용한 U87MG 세포 염색.
도 10: AE105-NOTA-RGD, AE105-NODAGA 및 RGD-NODAGA 의 세포-흡수 분석(Cell-uptake assay).
도 11: 64CU-표지된 AE105-NOTA-RGD 화합물의 주사 후 1시간 및 4시간 후 인간 U87MG 종양 세포를 가진 마우스의 PET 영상.
도 12: 주사 후 1시간 및 4시간에 64CU-표지된 이종이량체와 단량체 간의 PET 영상 비교.
도 13: 64CU-표지된 AE105-NOTA-RGD 화합물의 생체외(ex vivo) 생물학적 분포(biodistribution), 및 흡수의 종양-대-비-종양 비율.
도 14: CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체, (68Ga)NOTA(CNGRC), 또는 (68Ga)NOTA(RGDyK) 주사 후 인간 bxpc3 및 4T1 종양 세포를 가진 마우스의 PET 영상.
도 15A-15C: 동소 이종이식 마우스 모델에서의 PET 영상. 도 15A는 CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체 주사 후의 PET 영상을 제공한다. 도 15B는 RGD 단량체 주사 후의 PET 영상을 제공한다. 도 15C는 NGR 단량체 주사 후의 PET 영상을 제공한다.
도 16A-16D: 유전공학적으로 조작된 마우스(GEM) 모델에서의 PET 영상. 도 16A는 CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체 주사 후의 PET 영상을 제공한다. 도 16B는 18F-FDG 주사 후의 PET 영상을 제공한다. 도 16C는 RGD 단량체 주사 후의 PET 영상을 제공한다. 도 16D는 NGR 단량체 주사 후의 PET 영상을 제공한다.
도 17: 본 발명에 따른 시험관내(in vitro) 스크리닝 플랫폼의 작용 이유에 대한 도식화된 설명.
도 18A-18D: RGD 관능화의 HPLC 모니터링. 도 18A는 RGD 의 HPLC 를 보여준다. 도 18B는 광(Photo)-ODIBO-PEG4-NHS 의 HPLC를 보여준다. 도 18C는 30분 후 실시예 13의 반응 혼합물의 HPLC를 보여준다. 도 18D는 PBS 의 첨가 및 밤새 인큐베이션 후 실시예 13의 반응 혼합물의 HPLC를 보여준다.
도 19: 개발된 플랫폼을 통해 선택된 스페이서들의 시험관내(in vitro) 스크리닝 (*, P<0.05; **, P<0.01.).
도 20A-20B: 세포 흡수(uptake) 및 유출(efflux) 연구. 도 20A 는 실시예 13에 따른 다양한 스페이서를 가진 이종이량체들의 세포 흡수 연구 결과를 제공한다. 도 20B는 실시예 13에 따른 다양한 스페이서를 가진 이종이량체들의 세포 유출 결과를 제공한다.
도 21: 시험관내(in vitro) 스크리닝을 위해 선택된 동일 길이의 스페이서를 가진 Ga68 표지된 이종이량체들을 사용한 u87MG 종양의 PET 영상.
도 22: PET 영상에 기초한 ROI 정량화 (*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001).
이하의 실시예들은 본 발명의 개시내용을 보다 충분히 이해하기 위하여 제공되나, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 실시예에 기재된 방법과 재료들은 본 발명의 상세한 설명에 참조로서 통합된다.
6. 실시예
실시예 1:본 발명의 금속 킬레이트제의 합성
1, 4, 7-트리아자사이클로노네인(TACN)-기반의 킬레이트제 (N3-NOtB2)를 반응식 1에 나타낸 바와 같이 제조하였다:
반응식 1: N3-NOtB2의 합성
Figure pct00004
반응조건: a) MeCOCl, MeOH; b)이미다졸-1-설포닐 아자이드 염산염, CuSO4, K2CO3, MeOH; c) TsCl, TEA, DCM; d) NO2A(tBu), CsCO3, MeCN; e) 30% nBu3NOH, MeOH
4-아미노-2- 하이드록시부타노에이트 (2)
MeCOCl (15 mL)를 0℃ 에서 무수 메탄올(100 mL)에 방울단위로 첨가하였다. 결과 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 다음으로, 출발 물질(1) (10 g, 84 mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거하고 잔류물을 에테르(50 mL)로 처리하고 여과 후 백색 고체로서 (2)를 수득하였다(12.67 g, 88.5%). 추가적인 정제가 필요하지 않다는 것이 TLC 및 NMR 에 의해 제시되었다. 1H NMR (400 MHz, D2O) δ4.53 - 4.44 (m, 1H, -CH(COOH)-), 3.82 (s, 3H, -CH3), 3.27 - 3.11 (m, 2H, -CH2N3), 2.31 - 2.19 (m, 1H, -CH2CH2N3), 2.13 - 1.98 (m, 1H, -CH2CH2N3). 13C NMR (101 MHz, D2O) δ 175.16, 68.50, 52.89, 36.66, 30.42. ESI-MS: observed, m/z (M+H)+ =133.92, calculated, (M+H)+=134.08.
메틸 4- 아지도 -2- 하이드록시부타노에이트 (3)
이미다졸-1-설포닐 아자이드 염산염 (2.5 g, 12 mmol) 을 MeOH (30 mL) 내 (2)(1.7 g, 5 mmol), K2CO3 (3.2 g, 23 mmol), 및 CuSO4.5H2O (30 mg, 100 μmol)의 슬러리에 첨가하였고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 농축하고, H2O (100 mL)로 희석하고, 농축 HCl로 산성화하고, EtOAc (50 X 3 mL)로 추출하였다. 결합된 유기층을 건조하고(MgSO4), 여과 및 농축하여 무색 액체로서 조생성물(crude) 상태의 (3) (1.22 g, 76.6%)을 수득하였다. 상기 조생성물은 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. NMR 스펙트럼을 위해, 조생성물 약간을 실리카겔 크로마토그래피(DCM/MeOH, 10:1)로 정제하여 무색 액체의 순수한 (3)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31 (dd, J = 7.6, 4.0 Hz, 1H, -CH(COOH)-), 3.83 (s, 3H, -CH3), 3.59 - 3.43 (m, 2H, -CH2N3), 2.93 (brs, 1H, -OH), 2.15 - 2.04 (m, 1H, -CH2CH2N3), 1.99 - 1.86 (m, 1H, -CH2CH2N3).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 175.06, 67.60, 52.81, 47.18, 33.16.
메틸 4- 아지도 -2- (토실옥시)부타노에이트(4)
TsCl (2.7 g, 14 mmol)을 DCM (50 mL) 내 (3) (1.5 g, 9.4 mmol) 및 TEA 의 용액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 물(30 X 2 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하였다. 여과물을 농축하고 플래쉬 크로마토그래피로 백색 고체로서 (4) (2.37 g, 70.8%) 를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.38 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 4.97 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H, -CH(COOH)-), 3.72 - 3.68 (m, 3H, -CH3), 3.47 - 3.39 (m, 1H, -CH2CH2N3), 3.37 - 3.27 (m, -CH2CH2N3), 2.47 (s, 3H, Ar-CH3), 2.13 - 1.98 (m, 2H, -CH2N3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 168.68, 145.46, 132.89, 129.88, 128.08, 74.36, 52.77, 46.36, 31.53, 21.69.
디-터트-부틸 2,2'-(7-(4-아지도-1-메톡시-1-옥소부탄-2-일)-1,4,7-트리아조난 -1,4-디일)디아세테이트(5)
MeCN (20 mL) 내 NO2A(tBu) (0.8 g, 2.24 mmol) 및 Cs2CO3 (1.1 g, 3.36 mmol)의 슬러리에, (4) (0.95 g, 2.67 mmol)를 첨가하고 혼합물을 50℃에서 1일간 가열하였다. 실온으로 식힌 후, 혼합물을 여과하고 농축하였다. 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 10:1)로 정제하여 노란색 액체로서 (5) (0.73 g, 65.2%)를 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.73 - 3.60 (m, 3H, -OCH3), 3.58 - 3.44 (m, 2H, -CH2N3), 3.39 (s, 1H-NCH-), 3.28 (s, 4H, 2*-CH2CO-), 3.02 - 2.58 (m, 12H, 6*-NCH2-), 2.01 - 1.79 (m, 2H, -CH2CH2N3), 1.43 (s, 18H, 6*-CH3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.51, 171.54, 80.70, 63.83, 59.40, 56.11, 55.77, 53.31, 51.23, 48.52, 29.52, 28.21. ESI-MS: observed, m/z (M+H)+ =499.266, calculated, (M+H)+=499.32. ESI-HRMS: observed, m/z (M+H)+ = 499.3239, calculated, (M+H)+= 499.3239.
4- 아지도 -2-(4,7- 비스 (2-( 터트 - 부톡시 )-2- 옥소에틸 )-1,4,7- 트리아조난 -1-일)부탄산 (N 3 - NO t B 2 , 6)
피리딘(2 mL) 내 (5) (100 mg, 0.2 mmol)의 용액에, LiI (134 mg, 1 mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM (20 mL)으로 처리하고, 포화된 시트르산(10 X 2 mL) 및 물(20 mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 조생성물 ( 6)을 수득하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 20:3)로 정제한 후 백색 고체로서 순수 (6) (50 mg, 51.5%)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.72 (d, J = 7.1 Hz, 1H, -NCH(COOH)-), 3.70 - 3.41 (m, 6H, 2*-CH2CO- & - CH2N3), 3.43 - 2.75 (m, 12H, 6*-NCH2-), 2.36 - 2.21 (m, 1H, -CH2CH2N3), 1.91 (dd, J = 12.9, 5.2 Hz, 1H, -CH2CH2N3), 1.46 (s, 18H, 6*-CH3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.17 (-COOH), 169.51 (2*-CO2C(CH3)3), 82.28 (-CO2C(CH3)3), 63.12 (-NCH(COOH)-), 56.35 (2*-NCH2CO2C(CH3)3), 50.79 (-N-CH2-), 49.80 (-N-CH2-), 49.16 (-N-CH2-), 49.04 (-CH2N3), 28.62 (-CH2CH2N3), 28.12 (6*-CH3). ESI-MS: observed, m/z (M+H)+ = 485.45, calculated, (M+H)+= 485.31. ESI-HRMS: observed, m/z (M+H)+ = 485.3064, calculated, (M+H)+ = 485.3082.
N3-NOtB2 는 총 수율 15%로 합성되었다.
실시예 2: 본 발명의 금속 킬레이트제의 합성
TACN-기반의 킬레이트제(N3-DOtB3)를 반응식 2 에 나타낸 바와 같이 제조하였다:
반응식 2: N3-DOtB3의 합성. 시약: a) 4, CsCO3, MeCN; b) LiI, 피리딘
Figure pct00005
트리- 터트 - 부틸 2,2',2''-(10-(4- 아지도 -1- 메톡시 -1- 옥소부탄 -2-일)- 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7-트리일) 트리아세테이트 (S2)
MeCN (1 mL) 내 (S1) (DO3A(tBu)) (51.4 mg, 0.1 mmol) 및 Cs2CO3 (49 mg, 0.15 mmol)의 슬러리에, (4) (38 mg, 0.12 mmol)을 첨가하고 혼합물을 50℃ 에서 1일간 흔들었다. 실온까지 식힌 후, 혼합물을 여과 및 농축하였다. 반응을 LC-MS로 모니터하였다. 실리카겔 크로마토그래피 (DCM/MeOH, 10:1)로 정제한 후 순수한 (S2) (30 mg, 38.4%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ3.70 - 3.18 (m, 10H, -CHCO- & -NCH2CO- & -OCH3), 3.04 - 2.07 (m, 16H -NCH2-), 1.97 - 1.81 (m, 2H, -CH2N), 1.71 - 1.63 (m, 2H, -CH2CH2N3), 1.48 - 1.45 (m, 27H, 9*-CH3). ESI-MS: observed, m/z (M+H)+ = 656.455, calculated, (M+H)+= 656.435. ESI-HRMS: observed, m/z (M+H)+ = 656.4322, calculated, (M+H)+= 656.4347.
4- 아지도 -2-(4,7,10- tris (2-( 터트 - 부톡시 )-2- 옥소에틸 )-1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸 -1-일)부탄산 (S3)
피리딘(0.5 mL) 내 S2 (10 mg, 0.015 mmol)의 용액에, LiI (10 mg, 0.075 mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 흔들었다. 혼합물을 DCM으로 처리하고 포화된 시트르산 및 물로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고 여과 및 농축하여 조생성물 (S3)를 얻었다. 실리카겔 크로마토그래피(DCM/MeOH, 10:1)를 적용하여 순수 S3 (3 mg, 31.2%)을 얻었다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.87 - 3.74 (m, 2H, -CH2CO-), 3.63 - 3.53 (m, 1H, -NCH(COOH)-), 3.46 - 3.33 (m, 4H, -CH2CO-), 3.08 - 1.98 (m, 18H, -NCH2- & -CH2N), 1.67- 1.56 (m, 2H, -CH2CH2N3), 1.51 - 1.46 (m, 27H, 9*-CH3). ESI-MS: observed, m/z (M+H)+ = 642.439, calculated, (M+H)+= 642.419. ESI-HRMS: observed, m/z (M-H)- = 640.4046, calculated, (M-H)-= 640.4034.
N3-DOtB3 은 총 수율 12%로 합성되었다.
실시예 3: 본 발명의 AE105-이량체의 합성
실시예 1에 제공된 바와 같이 TACN-기반의 킬레이트제를 제조하였다. 그 후 TACN-기반의 킬레이트제를를 고체상 합성(SPS)을 통해 AE105 펩타이드에 부착하였다. 보다 상세하게, N3-NOtB2 을 SPS 를 통해 고수율로 펩타이드 AE105의 N-말단에 부착하였다.
표준 SPS 프로토콜을 사용하여 펩타이드 합성기에 의해 펩타이드를 레진 상에서(Resin-AE105*, Resin-AE105-PEG8-NH2) 제조하였다. DMF 내 HATU (5 eq.) 및 DIEA (10 eq.) 와 실온에서 2시간 동안 혼합함으로써, (실시예 1로부터) 화합물 6 (3 eq.)을 레신에 커플링시켰다. TFA/H2O/TIS/페놀 (90:5:2.5:2.5) 및 HPLC 정제를 사용하여 레진 지지체로부터 절단 후 Moiety-A-NOTA-N3 (7)를 수득하였다.
이종이량체성(hetero-dimeric), 동종이량체성(homo-dimeric) 및 이중-모드성(dual-modality) 화합물을 수득하기 위해, 단량체(AE105-NOTA-N3)를 링크 아마이드 레진(Rink amide resin)으로부터 절단한 다음, 반응식 3에 나타난 바와 같이 고수율로 SPAAC(strain-promoted alkyne-azide cycloaddition)를 통해 BCN-관능화된 RGDyk (또는 AE105 또는 시아닌 염료 Cy3 또는 Cy5)에 접합시켰다:
반응식 3: 다음의 제조: A) AE105-RGD 이종이량체; B) AE105 동종이량체; C) AE105-클릭-Cy5; D) AE105-논클릭-Cy3; BCN 은 아자이드와 직접 반응하여 촉매로 Cu(I)를 사용하지 않고도 높은 반응 속도로 트리아졸기를 형성할 수 있는 사이클로옥틴이다.
Figure pct00006
무금속(metal-free) 클릭 반응에 의해, 단량체(AE105-NOTA-N3)를 1.0 당량의 BCN-부탁된 펩타이드 또는 염료와 37℃에서 밤새 인큐베이션 한 후 > 95% 의 수율이 달성되었다. 결과 화합물을 직접 사용할 수 있었다. 0% 아세토나이트릴 100% 물부터 시작하여 100% 아세토나이트릴 까지의 구배 용출 (gradient elution)을 통한 HPLC 정제로 합성된 프로브들의 순도를 더 증가시킬 수 있었다.
상기 제조된 프로브들을 37℃, 70℃, 및 90℃에서 각각 64Cu, 68Ga, 및 Al18F 로 성공적으로 표지하였다. 일반적으로, 1 nmol 프로브 및 1 mCi 방사능을 사용하였을 때, 64Cu 및 68Ga 표지에 대해 거의 100% 표지 수율이 달성되었다. 도 5는 방사성 표지화의 방사성-HPLC 결과의 대표적인 예시를 제공한다.
상기 모든 화합물들이 온화한 조건(mild condition)에서 1.0 mCi/nmol의 비활성(specific activity )으로 64Cu 로 표지될 수 있었다. 결과물인 방사성 추적자는 37℃에서 24시간 인큐베이션된 후 인간 혈청에서 높은 안정성을 나타내었다(< 2% 64Cu 해리).
결과물인 이종이량체(AE105-NOTA-RGD; 도 6) 및 단량체(AE105-NODAGA and RGD-NODAGA; 도 6)를 70℃에서 NH4OAc 완충액 (pH ~ 6.8) 에서 64Cu 로 방사능표지하고, 이들의 혈청 안정성을 평가하였다. 결과물인 방사성 추적자는 37℃에서 24시간 인큐베이션된 뒤 온전하게 남아있어, 높은 혈청 안정성을 나타내었다. 도 7은 방사성-HPLC 결과를 제공하는데, 이는 1일간 혈청에서 인큐베이션한 후 프로브로부터 유의적인 64Cu-해리가 없었음을 증명한다. 우수한 혈청 안정성은 프로브가 생체내 혈류에서 순환하는 동안 온전함을 유지할 수 있다는 것을 입증한다. 더 큰 분자량 및 크기가 혈액 내 프로브의 체류 역시 증가시킬 것이다.
화합물의 방사성 표지(Radiolabeling): Cu-64 표지를 위해, 모든 화합물들을 0.1 M NH4OAC 완충액 (pH = 6.8) 내에서 수행하였다. 간략히 말하면, 먼저, 64CuCl2 (usually in 0.1 N HCl)를 0.1 M NH4OAC 완충액 (pH = 6.8)내에서 완충한 후, 준비된 NOTA-생물접합체를 첨가하였다. 결과 혼합물을 10초간 볼텍싱하고 37℃에서 0.5시간 열혼합기(thermomixer)에서 인큐베이션한 후, 방사성-HPLC로 64Cu 통합 수율을 결정하였다.
도 8은 N3-DOtB3-AE105-PEG4-DOTA-PEG4-RGD 로 만들어진 이량체를 나타낸다.
세포 염색 연구: 실험하기 24시간 전에 세포를 8 웰 챔버 슬라이드 안에 접종하였다(웰당 100,000 세포). 실험 전, 세포들을 PBS로 2회 세척하고 배양 배지에 첨가하였다. 그 다음 시험관내 비-특이적 흡수를 결정하기 위해 block agent(10 μg AE105)를 콜드 블록(cold block)으로서 웰의 절반에 첨가하고 1시간 인큐베이션하였다. 그 다음 각 웰에 AE105-NOTA-NHCO-Cy3 (웰당 10 pmol)을 첨가하고 2시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 그 다음 배지를 제거하고 세포들을 PBS로 2회 세척하였다. 1% 파라포름알데히드를 사용하여 세포를 고정한 후, DAPI로 핵을 염색하였다. 슬라이들을 봉입하고 형광현미경으로 관찰하였다(40 X, oil).
도 9에 나타난 바와 같이, U87MG 인간 교모세포종 세포주 상에서 염색 및 블록킹이 관찰되었는데, 이는 uPAR 수용체에 대한 펩타이드 AE105의 강한 친화도을 확인시켜 주며, AE105-NOTA-NHCO-Cy3가 광학 프로브(optical probe)로도 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 세포-흡수(Cell-uptake) 및 결합 연구
U87MG 인간 암세포에서 세포 흡수 및 염색 연구를 진행하였다. 보다 상세하게, AE105-RGD이종이량체(도 4) 및 단량체 AE105-NODAGA 및 RGD-NODAGA(도 6)을 비교하였다.
세포-흡수 분석: U87MG 인간 암세포를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)에서 구입하였다. 모든 세포 취급은 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)에서 무균성으로 수행하였다. U87MG 세포들을 10% FBS, 페니실린 (100 unit/mL), 스트렙토마이신 (100 μg/mL) L-글루타민 (300 μg/mL) 및 피루브산 나트륨 (100 mg/mL), 글루코스 (4.5 g/L)가 보충된 Dulbecco's Modified Eagle 배지에서 배양하였고, 37℃, 5% CO2를 유지하였다.
실험하기 24시간 전에 세포를 12-웰 플레이트에 접종하였다(웰당 200,000 세포). 실험 전, 세포를 1 mL HBSS로 2회 세척하고 1 mL 배지 (DMEM with 0.1% BSA and 1 mM Mn2 +)를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 세포를 64Cu-표지된 접합체들(웰당 10 pmol 64Cu-GYK12, 64Cu-RGD 또는 64Cu-AE105)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 HBSS (pH 7.2)로 2회 세척하고 0.5% SDS에 녹였다. 각 분획의 방사능을 감마선 계수기(gamma counter)로 측정하였다. 각 세포 용해물 샘플의 단백질 함량을 결정하였다. 세포와 관련하여 측정된 방사능을 웰당 동량의 세포단백질로 정상화하였다. 세포 흡수를 붕괴 보정(decay correction) 후 퍼센트 첨가된 용량으로 표현하였다.
실험된 모든 시점에서 이종이량체는 AE105-NODAGA 및 RGD-NODAGA 단량체들과 비교하여 세포 흡수에 있어 유의적인 개선을 나타내었다(p<0.1)(도 10).
세포 포화 결합 분석(Cell saturation binding assay): 실험하기 24시간 전에 세포를 24-웰 플레이트에 접종하였다(웰당 100,000 세포). 실험 전, 세포를 1 mL HBSS로 2회 세척하고 0.5 mL 결합 배지(HBSS with 0.1% BSA and 1 mM Mn2 +)를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음 시험관내 비-특이적 결합을 결정하기 위해 block agent(10 μg AE105 및/또는 10 μg RGD)를 콜드 블록(cold block)으로서 웰의 절반에 첨가하고 증가된 농도(1-100 nM)로 64Cu-AE105-RGD, 64Cu-RGD 및 64Cu-AE105를 첨가하였다. 샘플들을 아이스(4 ℃)에서 2시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 방사성 배지를 제거하였다. 세포 펠렛을 냉각(ice-cold) 결합 완충액(1 mL)으로 2회 헹구고 0.5% SDS 용액 내에 녹였다. 각 분획의 방사능을 감마선 계수기(gamma counter)로 측정하였다. 각 세포 용해물 샘플의 단백질 함량을 결정하였다(BCA Protein Assay Kit, Pierce). 세포와 관련되어 측정된 방사능을 존재하는 세포 단백질의 양으로 정상화하였다(fmol/mg).
그 결과 64Cu-GYK12 가 두 개의 64Cu-단량체들과 비교하여 유의적으로 증대된 Bmax (488 ± 73 fmol/mg) 및 결합 친화도(9.9 ± 4.2 nM)를 나타내었는데, 두 개의 64Cu-단량체들의 값은 다음과 같다: 64Cu-AE105 (Bmax 269 ± 43 fmol/mg, Kd 65 ± 49nM), 및 64Cu-RGD (Bmax 260 ± 44 fmol/mg, Kd 91 ± 36 nM).
통계적 분석: 모든 실험은 3회씩 수행하였다. 실험들에서 상이한 군들 간의 비교는 two-way ANOVA 테스트 (GraphPad Prism 6)를 사용하였다. 2 이상의 데이터 세트를 비교할 때, two-way ANOVA 분석과 함께 Bonferroni post-test를 적용하였다. P값 <0.05 을 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
실시예 5: AE105- RGD 이종이량체를 사용한 PET 영상화
U87MG 종양 이종이식을 가진 NCr 누드 마우스에서 생체내(in vivo) PET/CT 영상화를 수행하였다.
누드 마우스의 오른쪽 어깨 측면에 U87MG 세포(150 μL PBS 내 5백만 세포)를 피하 주사하였다. AE105-RGD 이종이량체(도 4), AE105-NODAGA, 또는 RGD-NODAGA를 꼬리에 정맥 주사하여 혈류 안으로 주입하였다. AE105 및 RGD의 100배를 공동-주사함으로써 이종이량체 연구를 위한 블로킹(blocking) 연구를 수행하였다. 추적자 주사 후 1시간 및 4시간에 소동물 PET/CT 를 수행하였다. ROI 분석으로 기관 흡수(Organ uptake)를 결정하였다. AE105-RGD 이량체에 대해, 생체외(ex vivo) 생물학적 분포(biodistribution)를 또한 수행하였다. 마우스의 기관들을 취하고 감마선-계수기를 사용하여 계수하였다.
주사 후 1시간 및 4시간 후 모두에서 모든 이종이식된 종양들이 가시화되었다(도 11). 기관 흡수를 PET 영상 정량화로 결정하였다. 그 결과 두 개의 단량체성 PET 프로브로 마우스를 주사한 경우와 비교하여, 64Cu-이종이량체로 주사한 마우스에서 더 높은 종양 흡수(p < 0.01)가 관찰되었는데(1시간 3.13 ± 0.49 %ID/g, 4시간 3.27 ± 0.25 %ID/g), 두 개의 단량체성 PET 프로브의 기관 흡수는 다음과 같다: 64Cu-AE105 (1시간 1.45 ± 0.15 %ID/g, 4 시간 1.55 ± 0.31 %ID/g) and 64Cu-RGD (1시간 1.50 ± 0.42 %ID/g, 4 시간 1.73 ± 0.51 %ID/g). 64Cu-이종이량체의 근육에 대한 종양의 비율은 4시간에 7.6 ± 1.9으로, 64Cu-AE105 (4.2 ± 1.1)의 경우보다 유의적으로 높았다. 64Cu-이종이량체의 간에 대한 종양의 비율은 4시간에 1.5 ± 0.4으로, 역시 64Cu-AE105 (0.43 ± 0.1) 의 경우보다 유의적으로 높았다. 상기 높은 장 흡수는 αvβ3 인테그린 및 uPAR 역시 젊은 마우스에서 장에 높이 발현된다는 사실에 기인할 수 있다. 표지되지 않은 사이클로(RGDyK) 및 AE105 (각각에 대해 100 μg)의 공동-주사에 의해 수행된 블로킹 연구에서(도 12), 64Cu-이종이량체의 종양 흡수가 1.01 ± 0.18 %ID/g (4 h, p < 0.01)로 감소되었는데, 이는 U87MG 이종이식에서 αvβ3 인테그린 및 uPAR을 표적화하는 이종 이량체의 특이성을 추가로 확인한 것이다. AE105-RGD 에 대한 생체 외(ex vivo) 생물학적 분포(biodistribution)를 수행하여 PET 영상 정량화 데이터를 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
통계적 분석: 모든 실험은 3회씩 수행하였다. 실험들에서 상이한 군들 간의 비교는 two-way ANOVA 테스트 (GraphPad Prism 6)를 사용하였다. 2 이상의 데이터 세트를 비교할 때, two-way ANOVA 분석과 함께 Bonferroni post-test를 적용하였다. P값 <0.05 을 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
실시예 6: 이중 표적화를 위한 이종이량체의 합성
이 실시예는 이중 표적화를 위한 이종이량체를 합성하는 대안적 방법을 제공한다. 이 방법은 다양한 펩타이드들과 결합한 이종이량체를 제조하기 위해 변형될 수 있다.
표준 SPS 프로토콜을 사용하여 펩타이드 합성기에 의해 제1 펩타이드(펩타이드 A)를 레진 상에서(Resin-Peptide A-PEGn-NH2) 제조하였다. N3-NOtB2는 레진 및 펩타이드에 커플링될 수 있다. 결과물인 펩타이드 A-PEGn-NOTA-N3 를 TFA 및 HPLC 정제를 사용하여 레진 지지체로부터 절단할 수 있다. 반응식 4에 나타난 바와 같이, 펩타이드 B와 추가적으로 조합하여 이종이량체를 제조할 수 있다(예를 들어, 펩타이드 B-PEG4-BCN).
반응식 4: 두 펩타이드의 이종이량체의 합성
Figure pct00007
반응식 4에 나타난 바와 같이, 펩타이드 A 및B 는 다수의 적절한 펩타이드들로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이들은 표적 인테그린 및 CD13 에 대해 선택될 수 있다. 따라서, 펩타이드 A 는 AE105 및 AE105mut 으로부터 선택될 수 있으며 펩타이드 B는 사이클로(RGDyK) 및 사이클로(RADyK)로부터 선택될 수 있다. 추가적으로, PEG 스페이서는 길이가 다양할 수 있는데, 예를 들어 n=0 내지 n=12 일 수 있다. 예를 들어, AE105 및 사이클로(RGDyK)의 이종이량체는 실시예 4에서 상술한 바와 동일하다(예를 들어, GYK4, GYK8, GYK12, 및 GYK16). 그러나, 이 실시예는 이종이량체가 AE105mut 및 사이클로(RADyK)와 같이, 대안적인 표적화 분자를 이용하여 제조될 수 있음을 추가적으로 증명한다.
제조된 이종이량체는 각각 시험관내 및/또는 생체내 평가를 위해 방사성표지될 수 있다. 세포 흡수 및/또는 유츨 분석은, 하기 실시예 13에서 매우 상세히 기술할 바와 같이, 세포 흡수 및 체류에 가장 우수한 잠재력을 가지는 하나 이상의 이종이량체를 식별하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 세포 포화 결합 분석은 단량체들 대비 이종이량체의 Bmax 및 결합 친화도를 평가하기 위하여 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
실시예 7: 인테그린 -CD13 이중 표적화 화합물의 합성
인테그린-CD13 이중 표적화 분자를 반응식 4에 나타난 바와 같이 제조하였다:
반응식 4: 인테그린-CD13 이중 표적화 분자의 합성
Figure pct00008
이중기능성 킬레이트제 (BFC) N3-NOtB2를 사용하여, CD13 및 αvβ3 에 각각 표적화하는 펩타이드성 리간드 c(CNGRC) 및 c(RGDyK)를 무-금속 클릭 반응 및 아마이드 형성 반응을 통해 공유결합으로 연결하였다. 도 1은 N3-NOtB2-c(CNGRC)-PEG4-NOTA-PEG4-RGD 로 제조된 이량체를 나타낸다.
Fmoc-PEG4-OH 및 TACN-기반의 킬레이트제를 고체상 합성(SPS)을 통해 사이클로(CNGRC)에 순차적으로 부착하였다. 보다 상세하게, N3-NOtB2 를 SPS 를 통해 고수율로 펩타이드 사이클로(CNGRC)-PEG4-NH2 의 N-말단에 부착하였다.
표준 SPS 프로토콜을 사용하여 펩타이드 합성기에 의해 레진 상에서(Resin-CNGRC) 펩타이드를 제조하고, 시스테인의 측쇄를 탈보호화한 다음, 탈륨(III) 트리플루오로아세테이트로 처리하여 고리화하였다. Fmoc-PEG4-OH a 및 N3-NOtB2 는 DMF 내 HATU (5 eq.) 및 DIEA (10 eq.)와 실온에서 2시간 혼합함으로써 순차적으로 레진에 부착하였다. TFA/H2O/TIS/페놀 (90:5:2.5:2.5) 및 HPLC 정제를 사용하여 레진 지지체로부터 절단 후 c(CNRGC)-PEG4-NOTA-N3 를 수득하였다.
무-금속(metal-free) 클릭 반응 후 트리아졸 형성에 의해, 정제된 이종이량체(NGR-NOTA-RGD)가 37℃, 70℃, 및 90℃에서 각각 64Cu, 68Ga, 및 Al18F 로 성공적으로 표지되었다. 표지 결과는 방사성 HPLC 에 의해 모니터하였다. 표지 수율은 64Cu 및 68Ga에 대해 90% 이상이며 Al18F 에 대해 50%에 가까웠다.
실시예 8: 인테그린 -CD13 이중 표적화 화합물의 합성
인테그린-CD13 이중 표적화 화합물을 반응식 5에 나타난 바와 같이 제조하였다. 아마이드 형성(펩타이드의 아미노기와 BFC의 카르복시산기 간의 반응)에 사용된 커프링제들이 쉽게 제거될 수 있기 때문에, 고체상 합성(반응식 4)가 합성 측면에서 더 간편하다. 그러나, 고체상 합성(반응식 5)이 보다 적은 양의 펩타이드와 BFC 를 소비하므로, 이용가능한 펩타이드 및/또는 BFC의 양이 제한될 때 소규모 제조에 적합할 수 있다.
반응식 5: 인테그린-CD13 이중 표적화 화합물의 합성
Figure pct00009
이중기능성 킬레이트제(bifunctional chelator, BFC)를 사용하여, 아마이드 형성을 통해 N3-NOtB2 를 완전히 보호된 c(RGDyK)에 접합시킨 다음, 보호기를 강산 조건에서 제거하였다. 결과물인 펩타이드를 무-금속 클릭 반응을 통해 BCN-c(CNGRC)에 연결하였다.
도 1은 N3-NOtB2-c(CNGRC)-PEG4-NOTA-PEG4-RGD 로 만들어진 이량체를 나타낸다. 보호된 선형 RGDyK를 고체상 합성(SPS)을 통해 제조한 다음, DCM 내 2% TFA를 사용하여 레진으로부터 절단하였다. DPPA(Diphenyl phosphoryl azide)를 처리하여 보호된 RGDyK의 고리화를 수행하였다. 라이신 상에서 ivDde를 탈보호한 후, Fmoc-PEG4-OH를 라이신 측쇄상의 일차 아민에 부착한 다음, DMF 내 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc를 탈보호하였다. HPLC 정제 후, 결과물인 보호된 사이클로(RGDyK)-PEG4-NH2를, EDCI 및 DMAP를 사용하여 N3-NOtB2 와 접합시켰다. 정제된 사이클로(RGDyK)-PEG4-NOTA-N3 를, N3및 BCN 모이어티 간의 SPAAC(strain-promoted alkyne-azide cycloaddition)를 통해, 사이클로(CNGRC)-PEG4-BCN (pH ~ 8.5 PBS 완충액에서 BCN-PEG4-NHS를 사이클로(CNGRC)과 혼합하여 제조함)에 연결하였다
무-금속 클릭 반응 후 트리아졸 형성에 의해, 정제된 이종이량체(NGR-NOTA-RGD)가 37℃, 70℃, 및 90℃에서 각각 64Cu, 68Ga, 및 Al18F 로 성공적으로 표지되었다. 표지 결과는 방사성 HPLC 에 의해 모니터하였다. 표지 수율은 64Cu 및 68Ga에 대해 90% 이상이며 Al18F 에 대해 50%에 가까웠다.
실시예 9: 피하 이종이식 마우스 모델에서 c( cNGRc )-c( RGDyK ) 이종이량체를 사용한 PET 영상화
bxpc3(인간 췌장암 세포주) 및 4T1 (인테그린 αvβ3 및 CD13를 과발현하는 쥐의 유방암 세포주) 종양 이종이식을 가진 NCr 누드 마우스에서 생체내(in vivo) PET/CT 영상화를 수행하였다.
마우스의 오른쪽 어깨 측면에 bxpc3 세포(150 μL PBS 내 1백만 세포)를 피하 주사하고 왼쪽 어깨 측면에 4T1 세포(150 μL PBS 내 1백만 세포)를 피하 주사하였다. CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체, (68Ga)NOTA(CNGRC), 또는 (68Ga)NOTA(RGDyK) 를 꼬리에 정맥 주사하여 혈류 안으로 주입하였다. 사이클로(CNGRC) 및 사이클로(RGDyK)의 100배를 공동-주사함으로써 이종이량체 연구를 위한 블로킹(blocking) 연구를 수행하였다. 추적자 주사 후 1시간에 소동물 PET/CT 를 수행하였다(도 14). 이종이량체 CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK는 개선되고 증대된 생체내(in vivo) 퍼포머스를 보여주었다(예를 들어, 더 긴 혈액체류, 더 나은 종양/비-종양 비율).
실시예 10:동소 이종이식 마우스 모델에서 c( cNGRc )-c( RGDyK ) 이종이량체를 사용한 PET 영상화
Balb/c 마우스에서 생체내(in vivo) PET/CT 영상화를 수행하였다. Balb/c 마우스의 췌장 안으로 1 x 106 루시페라제-형질감염된 KPCP 암 세포들을 동소 이식한 1주일 후, 마우스를 PEG 영상화에 사용하였다. CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체, (68Ga)NOTA(CNGRC), 또는 (68Ga)NOTA(RGDyK)]를 꼬리에 정맥 주사하여 혈류 안으로 주입하였다. CNGRC 및 RGDyK 의 100배를 공동-주사함으로써 이종이량체 연구를 위한 블로킹(blocking) 연구를 수행하였다. 추적자 주사 후 1시간에 소동물 PET/CT 를 수행하였다(도 15A-15C). 이종 이량체 CNGR-(68Ga)NOTA-RGDyK 가 개선된 생체내 퍼포먼스를 나타내었다(예를 들어, 더 긴 혈액체류, 더 나은 종양/비-종양 비율)(도 15A). 근육, 혈액, 간, 비장, 신장, 췌장 및 동소 종양에서 RGD-NGR 이종이량체의 흡수는 각각 0.1%ID/g, 0.1%ID/g, 1.8%ID/g, 1.1%ID/g, 2.2%ID/g, 0.36%ID/g, 및 1.4%ID/g 였다.
실시예 11: 피하 트랜스제닉 마우스 모델 에서 c( cNGRc )-c( RGDyK ) 이종이량체를 사용한 PET 영상화
유전공학적으로 조작된 KCH (Pdx1-Cre;K-RasG12D/+; HMGB1-/-) 마우스 모델에서 생체내(in vivo) PET/CT 영상화를 수행하였다. HMGB1(High mobility group box 1)은, 이펙터 단백질과 세포소기관의 분해의 주요 경로인 자가포식(autophagy)의 중요한 조절자이고, 췌장에 제한된 HMGB1의 조건적인 유전적 제거(genetic ablation)는 자가포식을 저해하고, 증식을 촉진하고, 정상적으로 정지된 경로들을 활성화하고, 마우스가 K-RasG12D/+-에 의한 췌장암 발생에 매우 민감하도록 한다.낮은 등급 PanIN1 부터 높은 등급 PanIN1 로의 PanIN1의 진행은 KCH (Pdx1-Cre;K-RasG12D/+;HMGB1-/-) 의 출현 후 7일에 조기 관찰될 수 있다(정상적으로는 3-9개월). ~6주령의 KCH 마우스에서 PET 영상화를 정상적으로 수행하였다.
CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK 이종이량체, (68Ga)NOTA(CNGRC), 또는 (68Ga)NOTA(RGDyK)를 꼬리에 정맥 주사하여 혈류 안으로 주입하였다. CNGRC 및 RGDyK 100x 를 공동-주사함으로써 이종이량체 연구를 위한 블로킹(blocking) 연구를 수행하였다. 추적자 주사 후 1시간에 소동물 PET/CT 를 수행하였다(도 16A-16D). 이종이량체 CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK는 개선된 생체내(in vivo) 퍼포머스를 보여주었다(예를 들어, 더 긴 혈액체류, 더 나은 종양/비-종양 비율)(도 16A). 근육, 혈액, 간, 비장, 신장, 및 악성 췌장에서 RGD-NGR 이종이량체의 흡수는 각각 0.38%ID/g, 0.23%ID/g, 4.7%ID/g, 3.1%ID/g, 5.0%ID/g, 및 5.9%ID/g 였다.
또한, 피하 트랜스제닉 마우스 모델에서 아무런 특이적 종양 흡수를 나타내지 않는 임상적으로 널리 사용되는 18F-FDG와 비교했을 때(도 16B), 이종이량체 CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyK는 특이적 종양 흡수 및 우수한 종양/비-종양 비율을 나타내었다(도 16A).
실시예 12: 시험관내 고속대량 스크리닝 플랫폼
개념 증명 연구(proof of concept study)에서, RGD 및 AE105 사이의 PEG 스페이서들(PEG4, 8, 12 및 16)의 상이한 길이를 스크리닝하기 위한 플랫폼을 αvβ3 및 uPAR 을 표적화하는 이종이량체에 대해 개발하였다. 결과는 PEG12 가 생체내 PEG 영상화에 의해 유효성이 검증된 최고의 스페이서임을 보여준다.
상기 최적화를 위한 화학 물질의 제조를 도 3에 개괄적으로 나타내었다(RGD 및 AE105는 바이오마커 αvβ3 및 uPAR 각각을 표적화하는 펩타이드임):
1) 다양한 PEG 길이의 스페이서를 포함하는 10개의 NH2-PEGn-RGD 펩타이드들(n = 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20)은, 대응되는 Boc-PEGn-NHS 를 PBS 완충액 (pH = 8.2) 내 RGD 에 첨가하고 95% TFA로 Boc 탈보호함으로써 제조될 수 있다. 그 다음, 제조된 NH2-PEGn-RGD를 PBS 완충액(pH = 8.2) 내 photo-ODIBO-NHS와 혼합하여 photo-OIDBO-PEGn-RGD를 제조한다(도 3에서 약어로 p-ODIBO로 표시됨).
2) N3-PEG4-AE105 는 AE105를 PBS 완충액(pH = 8.2) 내 N3-PEG4-NHS와 혼합시켜 제조할 수 있다.
시험관내 최적화 과정:
1) N3-PEG4-AE105는 10개의 photo-ODIBO-PEGn-RGD 펩타이드들(n= 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20) 중 하나와 1:1 몰비로 혼합되어 10개의 혼합된-표적화 분자 저장액을 제조할 수 있을 것이다;
2) 10개의 혼합된-표적화 분자 저장액 중 하나는 세포로 미리 접종된 96-웰 플레이트의 웰 안으로 첨가될 것이다(10개의 혼합된-표적화 분자 저장액을 위해 총 10개의 웰이 필요함);
3) 표적화 분자들이 표적 수용체에 결합한 후, 결합하지 않은 표적화 분자들은 PBS 완충액을 사용하여 씻겨없어질 것이다;
4) UV 램프(365 nm)가 아자이드-비활성화 photo-ODIBO를 탈보호하고 아자이드-활성화 "ODIBO"를 생성하기 위해 적용될 것이며, N3-PEG4-AE105 및 ODIBO-PEGn-RGD 사이의 연결이 촉발될 것이다 (둘 다 세포 상의 바이오마커에 결합함);
5) 추가적인 2-4시간 동안의 인큐베이션 후, N3-(64Cu)NOTA가 "과잉의(excess)" ODIBO-PEGn-RGD(이는 암 세포에 결합하나 N3-PEG4-AE105와 반응하지 않음)와 반응하기 위해 첨가될 것이다;
6) 과잉의 N3-(64Cu)NOTA가 PBS 완충액을 사용하여 씻겨없어질 것이다; N3-(64Cu)NOTA 는 "과잉의(excess)" ODIBO-PEGn-RGD에 연결된 후에만 세포 상에 유지될 수 있다.
7) 세포 상에서 "과잉의(excess)" ODIBO-PEGn-RGD에 연결된 N3-(64Cu)NOTA를 측정하기 위하여 96-웰 플레이트가 고속대량(high-throughput) MicroBeta2 Plate Counter 안으로 로딩될 것이다.
가장 낮은 "과잉의(excess)" ODIBO 를 포함하는, 가장 낮은 방사성-계수(radio-counts)를 가지는 웰은, (AE105-PEG4-N3 및 ODIBO-PEGn-RGD 간의) 연결 산물들의 최대 양을 가질 것이므로, 대응되는 스페이서는 적절한 길이이다.
실시예 13: 이종이량체 스페이서 최적화를 위한 고속대량 스크리닝 플랫폼
높은 결합력(avidity) 효과를 가지는 이종이량체를 생성하기 위하여, 신속한 이종이량체 스페이서 최적화를 위한 고속 처리(high throughput) 세포-기반의 보편적인 플랫폼을 개발하였다. 개발된 플랫폼을 사용함으로써, 이종이량체 라이브러리의 반복된 합성과 평가를 필요로 항는 전통적인 접근법의 반복을 피할 수 있다. 플랫폼은 시험관내 및/또는 생체내 평가들에서 최고의 퍼포먼스를 가진 이종이량체를 식별하기 위해 다양한 스페이서를 가진 이종이량체들을 스크리닝할 수 있다.
방법론
이종이량체의 인-시츄(in-situ) 형성을 위해, 두 개의 관심 리간드, RGD(인테그린 αvβ3 를 표적화함) 및 AE105 (uPAR(urokinase-type plasminogen activator receptor)를 표적화함)를 photo ODIBO기 및 N3기로 각각 관능화하였다. 본원에서, photo-ODIBO기는 광-촉발된 무-금속 클릭 화학 모이어티로, ODIBO로 탈보호되고 UV 365nm 조사에서 SPAAC(strain-promoted alkyne-azide cycloadditions)를 통해 아자이드와 반응할 수 있다. 고속 처리 스크리닝의 역량을 제공하고 연구 그룹들에서 이의 적용을 촉진하기 위하여, 화학적 도구의 준비가 착물 정제를 피하도록 설계되었다(반응식 6 참조). 보다 상세하게, DMSO에 용해된 RGD를 6 eqv. DIEA 및 3 eqv. ODIBO-PEG4-NHS 로 처리하여 photo-ODIBO-PEG4-RGD를 제조하였다. 페길화가 종료된 후, 1X PBS를 반응 혼합물에 첨가하여 과잉의 가 비-세포 반응성 photo-ODIBO -PEG4-COOH로 가수분해될 수 있도록 하였다. AE105 를 N3-PEGn-NHS (각 유사체에 대해 네 개의 선택된 PEG 스페이서들 중 하나)로 인큐베니션한 후 과잉의 NHS를 1X PBS 로 가수분해하는 것과 유사한 방식을 통하여 네 개의 N3 관능화된 AE105 유사체들을 상이한 스페이서들로 병렬합성(parallel synthesis)을 수행하였다. 추가적 정제 없이, 결과물인 photo-ODIBO-PEG4-RGD 및 네 개의 N3-PEGPn-AE105 용액을 이후의 이종이량체 스페이서 최적화 실험에 바로 적용할 수 있었다.
반응식 6: 화학적 도구의 준비(Preparation of chemical tools)
Figure pct00010
스페이서 최적화는 도 17에 나타난 바와 같이 수행하였다. photo-ODIBO-PEG4-RGD 및 상기 제조된 the N3-PEGn-AE105 중 하나를 혼합한 다음 u87MG 세포들(인테그린 αvβ3 수용체 및 uPAR 를 모두 과발현하는 인간 뇌암 세포주)이 미리 접종된 96-웰 플레이트 안에 첨가하였다. 이 세포들을 4% 파라포름알데히드에 미리-고정하여 내재화를 최소화하였다. RGD 및 AE105가 각각 인테그린 αvβ3 및 uPAR 에 충분히 결합하도록 2시간의 인큐베이션 후, 과잉의(결합하지 않은) 리간드들을 PBS 완충액으로 씻어냈다. 그 다음 플레이트를 UV 램프(365 nm)로 2분간 조사하여 아자이드-불활성화 photo-ODIBO를 아자이드-활성화 "ODIBO"로 탈보호하여, N3-PEGn-AE105 및 ODIBO-PEG4-RGD 간의 무-금속 클릭 반응을 촉발하였다. 무-금속 클릭 반응이 완료되도록 추가적인 2시간의 인큐베이션 후, (64Cu)NOTA-N3 를 방사성 소거제(radio scavenger)로서 "과잉의" ODIBO-PEG4-RGD (이는 세포에 결합하나 N3-PEGn-AE105 으로 클릭하지 않음)로 클릭하기 위해 첨가하였다. 결합하지 않은 (64Cu)NOTA-N3의 제거에 따라, ODIBO-PEGn-RGD 에 클릭한 (64Cu)NOTA-N3 은 MicroBeta2 Plate Counter상에서 측정하였다. UV 조사를 하지 않은 하나의 그룹을 백그라운드 대조군으로 사용하여 (64Cu)NOTA-N3의 비-특이적 결합으로 인한 계수(count)를 얻었다. 비-특이적 결합으로 인한 백그라운드 계수를 뺀 후, 가장 낮은 방사능을 가진 웰이 (64Cu)NOTA-click-PEG4-RGD 의 가장 적은 양과 인-시츄 생성된 이종이량체(AE105-PEGn-click-PEG4-RGD)의 가장 많은 양을 포함하였는데, 이는 대응되는 스페이서 길이(PEGn + 4)가 높은 결합력(avidity)을 달성하는데 가장 적합할 것임을 나타낸다.
전통적인 전략과 비교했을 때, 본원의 플랫폼은 다양한 스페이서들을 포함하는 이종이량체들로 구성된 이종이량체 라이브러리의 많은 합성 및 평가들을 피한다. 또한, 베타 계수기(beta counter)의 높은 민감도로 인해, 리간드들이 각 테스트에서 나노몰 단위로 소비되어, 값비싼 출발 물질들의 비용을 현저히 절감하였다. 고속처리 스크리닝의 편의성, 민감도 및 역량의 잇점들을 고려했을 때, 본원의 보편적이고 신속한 스페이서 최적화 플랫폼은 연구 목적의 및/또는 임상적 적용을 위한 이종이량체 약제들의 개발을 대단히 촉진할 수 있다.
결과 및 고찰
첫째, 세포 표면 상의 하나의 인테그린 αvβ3 수용체와 하나의 uPAR 사이의 거리가 스크리닝 동안 적절한 길이의 스페이서를 선택하기 위해 추산되었고, 두 수용체 사이의 가능한 거리가 5nm 또는 그 이하일 수 있다는 것이 발견되었다. 단일 결합의 길이가 약 1.5Å (0.15nm)임을 고려하면, 결합각을 고려할 때 12 단일 결합들로 이루어진 PEG4 단위의 길이는 약 1.2nm일 것이다. 따라서, 1nm 내지 5nm의 길이를 커버하기 위해서, PEG4, PEG8, PEG12, 및 PEG16로 이루어진 4개의 스페이서가 스크리닝 목적으로 선택되었다 (표 2 참조).
시험관내 스크리닝을 위해 선택된 스페이서들
entrance RGD에 부착된 PEG 유닛들 AE105에 부착된 PEG 유닛들 총 PEG 유닛 추산된 길이 (nm)
1 4 0 4 1.2
2 4 4 8 2.4
3 4 8 12 3.6
4 4 12 16 4.8
그 후, RGD-PEG4-photo-ODIBO 및 AE105-PEGn-N3 (n= 0, 4, 8, 및 12)을 반응식 6에 나타난 바와 같이 제조하였다. 3 eqv. R-PEG-NHS 에스테르의 사용으로 인해, 펩타이드성 리간드의 전환 수율은 30분 내에 95% 이상에 도달하였다. 도 18은 RGD가 RGD-PEG4-photo-ODIBO로 전환된 예시를 보여주는데, 여기에서, RGD-PEG4-photo-ODIBO, photo-ODIBO-PEG4-COOH, 및 photo-ODIBO-PEG4-NHS이 각각 13, 19, 20, 및 21분에 용출되었다. 도 18에서, HPLC 조건은 다음과 같다: 0-2 분, 100% H2O; 2-12 분, 100% H2O 에서 80% H2O 및 20% CAN로 변화함; 12-22 분, 80% H2O 및 20% ACN에서 10% H2O 및 90% CAN로 변화함; 22-26 분, 10% H2O 및 90% ACN; 26-27 분 10% H2O 및 90% ACN 에서 100% H2O로 변화함; 27-35 분, 100% H2O, 유속 1.5ml/분. HPLC 스펙트럼으로부터 얻은 정량적 결과에 기초하면, 실온에서 0.5시간 동안 반응 혼합물을 교반한 후, RGD 전환 수율은 95% 이상이었고, 5% 미만의 photo-ODIBO-PEG4-NHS가 photo-ODIBO-PEG4-COOH로 가수분해되었다.
1X PBS의 첨가 후, 반응 혼합물을 밤새 두어 photo-ODIBO-PEG4-NHS 의 가수분해를 최대화하였고, RGD-PEG4-photo-ODIBO 및 photo-ODIBO-PEG4-COOH만이 반응 혼합물 내에 남았다. AE105-PEGn-N3 (n= 0, 4, 8, 및 12)를 제조할 때 비슷한 관찰이 얻어졌다. photo-ODIBO-PEG4-COOH 및 N3-PEGn-COOH의 어느것도 표적화 분자의 결핍으로 인해 세포에 결합하지 않았을 것이므로, 이들은 결합되지 않은 RGD-PEG4-photo-ODIBO 또는 AE105-PEGn-N3와 함께 씻겨 제거되었다. 따라서, 결과물인 5개의 혼합물은 추가적인 정제 없이 스크리닝에 기초하여 세포 내에 직접 적용될 수 있다.
그 후, RGD-PEG4-photo-ODIBO는 AE105- PEG0-N3 또는 AE105-PEG4-N3 또는 AE105-PEG8-N3 또는 AE105-PEG12-N3 와 병렬 혼합되어, 각각 RGD-PEG4-photo-ODIBO 및 AE105-PEGn-N3 (n= 0, 4, 8, 12)의 하나를 모두 함유하는 네 그룹의 저장액을 만들었다. 도 17에 나타난 바와 같이, 네 그룹의 저장액은 4% 파라포름알데히드로 미리 고정된 u87MG 세포를 사용하여, 고안된 세포 기반의 스크리닝 방법에 적용되었다. 네 개의 실험군에 더하여, 세포가 with RGD-PEG4-photo-ODIBO 및 NH2-PEG0-AE105로 처리된 음성 대조군을 제조하였다; 따라서, 음성 대조군은 ODIBO 및 NH2 사이에 연결이 없기 때문에 음성 대조군에는 이종이량체가 생성될 수 없다. 추가적으로, UV 조사가 적용되지 않은 백그라운드 대조군이 있었다; 따라서, 이의 세포에 대한 비-특이적 결합에 의해 (64Cu)NOTA-N3 의 양이 검출되었다. 백그라운드 대조군에서 기록된 비-특이적 결합을 뺀 후, RGD-PEG4-ODIBO와의 연결로 야기된 다른 그룹들에서 (64Cu)NOTA-N3 의 비특이적 결합을 비교하였다. 도 19에 나타난 바와 같이, N3-PEG4-AE105 및 N3-PEG8-AE105 로 처리된 그룹들은 (64Cu)NOTA-N3의 특이적 결합의 양이 더 적게 나타났는데, 이는 RGD-PEG8-AE105 및 RGD-PEG12-AE105가 u87MG 세포 상에 형성된 가장 많은 이종이량체임을 제시한다. 따라서, 두 개의 대응되는 스페이서들(entrance 2 & 3)이 네 개의 테스트된 스페이서들 중에 가장 강력했다.
마지막으로, 상기 스크리닝 분석에서 얻어진 결과는 시험관내 및 생체내 모두에서 유효한 것으로 인정되었다. 다양한 PEG 스페이서들(각각 PEG4, PEG8, PEG12 및PEG16)을 포함하는 네 개의 RGD-AE105 이종이량체들을 전술한 실시예에 기재한 바와 같이 제조하였다. 제조된 이종이량체는 Cu-64 또는 Ga-68 으로 방사성 표지되어 각각 시험관내 및 생채내 평가되었다. 도 20A에 나타난 바와 같은 세포 흡수 결과에 기초하면, PEG16-함유 이종이량체는 가장 높은 세포 흡수를 나타내었고, 그 다음으로 PEG12-, PEG8-, 및 PEG4-함유 이종 이량체 순서였고, 이들의 4시간 흡수 값은 각각 0.46 %, 0.38 %, 0.24 % 및 0.16 % 이었다. 세포 유출(efflux) 연구에서(도 20B), PEG8 및 PEG12-함유 이종이량체들이 가장 우수한 세포 체류를 나타내었고,다음으로 PEG4-, 및 PEG16-함유 이종이량체 순서였고, 이들의 2시간 체류 값은 각각 44%, 43%, 35% 및 26% 이었다. 네 개의 테스트된 이종이량체들에서의 세포 흡수와 유출 결과 모두를 고려했을 때, PEG12-함유 이종이량체가 이 시험관내 평가에서 가장 높은 잠재력이 증명되었고, 이는 고안된 세포 기반 스크리닝 분석에서 얻어진 결과와 일치하였다.
또한 생체내 유효성 확인이 u87MG 이종이식편을 가지는 마우스로부터 얻어진 PET 영상화 결과를 비교함으로써 수행되었다. 도 21에 나타난 바와 같이, 종양들은 네 개의 테스트된 이종이량체성 PET 추적자들 모두를 사용하여 시각화될 수 있었고, PEG12-함유 이종이량체는 백그라운드 대조군에 비해 가장 높은 종양을 나타내었고, 그 다음으로 PEG8-, PEG16-, 및 PEG4-함유 이종이량체 순서였다. 다음으로, 정량적인 종양 흡수 값이 ROI(region of interest) 분석에 의해 밝혀졌다(도 22). PEG12-함유 이종이량체의 종양 흡수 값은 2.8% 였고, PEG8-, PEG16-, 및 PEG4-함유 이종이량체들은 각각 2.4%, 2.1% 및 1.7% 이었는데, 이는 고안된 세포 기반의 스크리닝 분석에서 얻어진 결과를 재확인한 것이다. 집합적으로, 시험관내 및 생체내 평가들 모두로부터의 결과는 신속한 스페이서-최적화 플랫폼의 정확성과 신뢰도를 성공적으로 검증하였다. 선택된 AE105-PEG12-RGD는 누드 마우스에서 u87MG 이종이식편의 PET 영상화를 통해 대응되는 단량체 AE105 및 RGD와 추가로 비교되었다. 이종이량체를 투여한 마우스에서 우수한 영상화 결과가 얻어졌는데, 이는 결합력(avidity) 효과로 인한 두 개의 단량체 상대방(counterpart)에 비해 더 나은 생체내 퍼포먼스를 나타낸다.
따라서, 광-촉발된 무-금속 클릭 반응을 사용하여, 보편적인 시험관내 스크리닝 플랫폼이 높은 결합력(avidity) 이종이량체 개발과 관련된 스페이서 최적화 과정을 간소화하기 위해 확립될 수 있고, 이는 다양한 이중-바이오마커 조합들 및 상이한 질환들에 폭넓게 적용될 수 있다. 개발된 스크리닝 플랫폼은 인테그린 αvβ3-uPAR 이중-표적화된 이종이량체성 리간드의 스페이서 최적화에 성공적으로 적용되었다. 이 플랫폼의 정확도와 신뢰도는 시험관내 및 생체내 평가를 통해 추가로 검증되었는데, 여기에서 모든 테스트된 스페이서들을 포함하는 이종이량체들이 제조되고 개별적으로 평가되었다. (도 17에 나타난 바와 같은) 고속 처리 스크리닝의 입증된 역량과 더불어, 이 보편적인 플랫폼은 다양한 바이오의학 분야에서, 특 표적화된 수용체가 낮은 양으로 발현할 때 및/또는 높은 결합력(및/또는 특이성) 일가 리간드가 이용가능하지 않을 때, 이중-수용체-표적화 전략의 응용을 현저히 촉진 및/또는 증대할 수 있다.
실시예 14:스페이서 길이 탐구
다양한 PEG 길이(n= 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16)의 스페이서들을 포함하는 8개의 NH2-PEGn-RGD 펩타이드가, 대응되는 Boc-PEGn-NHS를 PBS 완충액 (pH = 8.2) 내 RGD를 첨가한 후 Boc 를 탈보호화함으로써 제조될 수 있다. 앞서 보고된 과정들을 사용하여 제조된 Photo-ODIBO-NHS는 PBS 완충액 (pH = 8.2) 내 상기 제조된 NH2-PEGn-RGD와 함께 혼합되어 photo-OIDBO-PEGn-RGD를 생산할 것이다. N3-PEG4-세툭시맙은 앞서 보고된 과정들을 사용하여 제조될 것이다. N3-PEG4-세툭시맙 및 8개의 photo-ODIBO-PEGn-RGD 펩타이드들(n= 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16)이 시험관내 스크리닝을 위해 사용될 것이다(표적 프로브의 내재화를 최소화하기 위해, 4 ℃에서). 도 11에 나타난 바와 같이: 1) 8개의 혼합된-리간드 저장액들은 N3-PEG4-세특시맘을 8개의 photo-OIDBO-PEGn-RGD 펩타이드들 중 하나와 혼합함으로써 제조될 것이다; 2) U87MG 세포는 96-웰 플레이트에서 배양될 것이다; 3) 상기 8개의 혼합된-리간드 저장액 중 하나는 U87MG로 미리-접정된 각 웰(총 8개 웰)에 첨가될 것이다; 2)리간드가 표적화된 수용체에 결합한 후 과잉의(결합하지 않은) 표적화 리간드들이 PBS 완충액을 사용하여 씻겨없어질 것이다(완전한 제거를 보장하기 위해 5회 반복함); 3) UV 램프 (365 nm)가 아자이드-비활성화 photo- ODIBO를 탈보호하고 아자이드-활성화 "ODIBO"를 생성하기 위해 적용되고, 이에 의해 N3-PEG4-세툭시맙 및 ODIBO-PEGn-RGD 간의 연결이 촉발될 것이다; 4) 추가적인 2시간의 인큐베이션 후, 64Cu-labeled N3-NOTA이 "과잉의" ODIBO-PEGn-RGD(이는 세포에는 결합하나 N3-PEG4-세툭시맙에 클릭하지 않음)로 클릭하기 위해 첨가될 것이다; 및 5) 과잉의 N3-(64Cu)NOTA는 제거될 것이며, "과잉의" ODIBO-PEGn-RGD에 대해 클릭한 N3-(64Cu)NOTA 이 MicroBeta2 Plate Counter 상에서 측정될 것이다. UV 조사되지 않은 하나의 그룹이 N3-(64Cu)NOTA의 비-특이적 결합으로부터의 계수를 얻기 위해 음성대조군으로 사용될 것이다. 비-특이적 결합을 뺀 후, 8개의 ODIBO-PEGn-RGD (n= 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16) 로부터 수득된 N3-(64Cu)NOTA의 특이적 결합이 비교될 것이다. 가장 낮은 특이적 결합을 가진 웰이 가장 높은 양의 클릭 산물(clicking product)(세툭시맙-PEG4-N3 및 ODIBO-PEGn-RGD 사이)을 포함할 것이므로, 그 대응되는 스페이서가 가장 강력할 것이다.
가장 강력한 PEG 스페이서를 포함하는 ODIBO-PEGn-RGD는 Tz-NOTA-N3 와 함께 클릭할 것이며 그 후 64Cu 로 방사성 표지될 수 있고, 결과물인 Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD는 U87MG 세포에 대한 시험관내 결합력(avidity) 연구에 사용될 것이다. Tz-(64Cu)NOTA-RGD (PEG 스페이서 없음)는 결과물인 이종이량체 내에서 RGD와 세툭시맙 사이의 거리가 너무 짧아 결합력(avidity) 효과를 달성할 수 없어 음성대조군으로 사용될 것이다 (도 5B, 기초 연구에서 제공됨). 요컨대, Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD/TCO-PEG4-세툭시맙 연결 산물 (세툭시맙-PEG4-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD)은 U87MG 세포에서 세포 흡수/유출, 결합 친화도 및 Bmax 측정에 사용될 것이다. 높은 결합력(avidity) 효과가 상기 연결 산물에서 확인된 후, 생체내 평가가 수행될 것이다. U87MG 이종이식편을 가지는 마우스가 100 μg 의 TCOPEG4-세툭시맙으로 예비-주시되고 24시간 후 ~ 250-350 μCi의 Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD (또는 음성 대조군 내 Tz-(64Cu)NOTA-RGD)가 주사될 것이다. 그 후 1시간 동적 PET 스캔이 여러 시점에서 수행될 것이다 (p.i., 4, 18, 및/또는 28h). 세툭시맙이 간을 통해 소거되므로, 중간 및 늦은 시점에서 종양 및 간에 대한 동력학이 평가될 수 있다. 중간/늦은 시점(4, 18, 28h)에서 연결되지 않은 Tz-(64Cu)NOTAPEGn-RGD 의 대부분이 씻겨없어질 때, (Tz-(64Cu)NOTA-RGD에 비해) 상대적으로 느린 종양 워싱 아웃(washing out) 및 더 빠른 간 클리어링(clearing)의 관찰은 종양 세포에 대한 훨씬 더 강한 결합을 나타낼 수 있으므로, 생체내 연결 산물(세툭시맙-PEG2-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD)의 결합력(avidity) 효과가 달성되었다.
다양한 참고문헌들이 본 명세서에 인용되며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

Claims (68)

  1. 하나 이상의 제1 표적화 분자; 및
    검출가능한 표지자
    를 포함하는, 생물학적 대상체의 분자 영상화용 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 제2 표적화 분자를 더욱 포함하는, 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 킬레이트제(chelator)를 추가로 포함하는, 화합물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1분자가 생물학적 대상체의 바이오마커에 결합하는 것인, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제2 표적화 분자가 생물학적 대상체의 바이오마커에 결합하는 것인, 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자가 생물학적 대상체에서 서로 다른 바이오마커에 결합하는 것인, 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 표적화 분자가 단백질, 항체, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 다당류 또는 폴리뉴클레오타이드인, 화합물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 제2 표적화 분자가 단백질, 항체, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 다당류 또는 폴리뉴클레오타이드인, 화합물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 검출가능한 표지자가 110In, 111In, 177Lu, 52Fe, 62Cu, 64Cu, 32P, 11C, 13N, 15O, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 86Y, 90Y, 18F, 89Zr, 94mTc, 94Tc, 99mTc, 120I, 123I, 124I, 125I, 131I, 154- 158Gd, 186Re, 188Re, 51Mn, 52mMn, 55Co, 72As, 75Br, 76Br, 82mRb, 83Sr, 및 다른 감마-, 베타- 또는 양전자-방사체(emitter)인, 화합물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자에 대한 바이오마커가 독립적으로 uPAR, CD13, 또는 αvβ3 인, 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 uPAR에 대한 표적화 분자가 AE105 또는 AE105mut인, 화합물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 CD13에 대한 표적화 분자가 사이클로(cNGRc)인, 화합물.
  13. 제10항에 있어서, 상기 αvβ3 에 대한 표적화 분자가 사이클로(RGDyK) 또는 사이클로(RADyK)인, 화합물.
  14. 하나 이상의 제1 표적화 분자; 및
    활성제
    를 포함하는, 활성제가 필요한 대상체에게 치료학적 유효량의 활성제를 전달하기 위한 약물 전달 화합물.
  15. 제14항에 있어서, 하나 이상의 제2 표적화 분자를 더 포함하는, 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 킬레이트제를 추가로 포함하는, 화합물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 제1 분자가 생물학적 대상체의 바이오마커에 결합하는 것인, 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 분자가 생물학적 대상체의 바이오마커에 결합하는 것인, 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자가 생물학적 대상체에서 서로 다른 바이오마커에 결합하는 것인, 화합물.
  20. 제14항에 있어서, 상기 제1 표적화 분자가 단백질, 항체, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 다당류 또는 폴리뉴클레오타이드인, 화합물.
  21. 제15항에 있어서, 상기 제2 표적화 분자가 단백질, 항체, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 다당류 또는 폴리뉴클레오타이드인, 화합물.
  22. 제14항에 있어서, 상기 활성제가 단백질, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 또는 방사성 의약품인, 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 방사성 의약품이 67Cu, 177Lu, 90Y, 131I, 212Bi, 211At, 225Ac, 188Re, 또는 111In 인, 화합물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 소분자가 독소루비신, 파클리탁셀, 또는 플루오로우라실인, 화합물.
  25. 제19항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 표적화 분자 및 하나 이상의 제2 표적화 분자에 대한 바이오마커가 독립적으로 uPAR, CD13, 또는 αvβ3 인, 화합물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 uPAR에 대한 표적화 분자가 AE105 또는 AE105mut인, 화합물.
  27. 제25항에 있어서, 상기 CD13에 대한 표적화 분자가 사이클로(cNGRc)인, 화합물.
  28. 제25항에 있어서, 상기 αvβ3 에 대한 표적화 분자가 사이클로(RGDyK) 또는 사이클로(RADyK)인, 화합물.
  29. (a) 아마이드 결합(amide bond) 연결을 생성하기 위한 카르복실기 또는 활성 에스테르기;
    (b) 아자이드기(azide group); 및
    (c) 킬레이팅 코어(chelating core)
    를 포함하는, 다기능성(multifunctional) 킬레이트제.
  30. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가 1, 4, 7-트리아자사이클로노네인(TACN)-기반의 킬레이트제인, 다기능성 킬레이트제.
  31. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가 N3-NOtB2 또는 N3-DOtB3 을 포함하는, 다기능성 킬레이트제.
  32. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가
    Figure pct00011

    인, 다기능성 킬레이트제.
  33. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가
    Figure pct00012

    인, 다기능성 킬레이트제.
  34. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가 하나의 표적화 분자에 결합하는 것인, 다기능성 킬레이트제.
  35. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가 두 개의 동일한 표적화 분자에 결합하는 것인, 다기능성 킬레이트제.
  36. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가 두 개의 다른 표적화 분자에 결합하는 것인, 다기능성 킬레이트제.
  37. 제29항에 있어서, 상기 킬레이트제가 하나의 표적화 분자 및 하나의 염료 분자에 결합하는 것인, 다기능성 킬레이트제.
  38. (a) 하나 이상의 제1 표적화 분자, 하나 이상의 제2 표적화 분자, 및 검출가능한 표지자를 포함하는 다가성(multivalent) 화합물; 및
    (b) 키트를 사용하기 위한 지시서
    를 포함하는, 표적화된 의료 영상화용 키트.
  39. 제38항에 있어서, 상기 다가성 화합물이 킬레이트제를 더욱 포함하는 것인, 키트.
  40. 제38항에 있어서, 상기 검출가능한 표지자가 64Cu, 68Ga, 18F, 89Zr, 111In, 또는 99mTc 인, 키트.
  41. (a) 하나 이상의 제1 표적화 분자, 하나 이상의 제2 표적화 분자, 및 활성제를 포함하는 다가성 화합물; 및
    (b) 키트를 사용하기 위한 지시서
    를 포함하는, 표적화된 약물 전달용 키트.
  42. 제41항에 있어서, 상기 다가성 화합물이 킬레이트제를 더욱 포함하는 것인, 키트.
  43. 제41항에 있어서, 상기 활성제가 단백질, 펩타이드, 소분자, 나노입자, 또는 방사성 의약품인, 키트.
  44. 제41항에 있어서, 상기 제1 표적화 분자 및 제2 표적화 분자가 생물학적 대상체의 서로 다른 바이오마커에 결합하는 것인, 키트.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제1 표적화 분자 및 제2 표적화 분자에 대한 바이오마커가 독립적으로 uPAR, CD13, 또는 αvβ3 인, 키트.
  46. 제45항에 있어서, 상기 uPAR에 대한 표적화 분자가 AE105 또는 AE105mut인, 키트.
  47. 제45항에 있어서, 상기 αvβ3 에 대한 표적화 분자가 사이클로(RGDyK) 또는 사이클로(RADyK)인, 키트.
  48. (a) 제1의 관능화된 표적화 분자로서, 상기 표적화 분자와 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기 사이에 다양한 길이의 스페이서를 포함하는 제1의 관능화된 표적화 분자;
    (b) 제2의 관능화된 표적화 분자로서, 상기 표적화 분자와 제2의 관능화된 표적화 분자의 관능기 사이에 정해진 길이의 스페이서를 포함하는 제2의 관능화된 표적화 분자;
    (c) 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기에 결합하는 방사성 표지된 관능기; 및
    (d) 제1 및 제2의 관능화된 표적화 분자의 표적화 분자에 의해 표적화되는 바이오마커를 발현하는 세포
    를 포함하는, 고속대량 스크리닝 플랫폼(high-throughput screening platform).
  49. 제48항에 있어서, 상기 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기가 광분해성(photolabile) 관능기이고, 제2의 관능화된 표적화 분자의 관능기가 반응성 관능기이고, 광자 에너지(photon energy)로 상기 광분해성 관능기의 활성화 후에 상기 반응성 관능기가 광분해성 관능기에 결합할 수 있는 것인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  50. 제48항에 있어서, 제2의 관능화된 표적화 분자의 관능기가 광분해성 관능기이고, 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기가 반응성 관능기이고, 광자 에너지로 상기 광분해성 관능기의 활성화 후에 상기 반응성 관능기가 광분해성 관능기에 결합할 수 있는 것인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 광분해성 관능기가 Photo-OIDBO 이고, 반응성 관능기가 아자이드(azide)인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  52. 제51항에 있어서, 상기 방사성 표지된 관능기가 방사성 표지된 아자이드인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  53. 제51항에 있어서, 상기 제1의 관능화된 표적화 분자가 photo-ODIBO-PEGn-RGD 펩타이드이고, 상기 PEG가 단량체이고, n 이 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20에서 선택되는 것인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  54. 제51항에 있어서, 상기 제1의 관능화된 표적화 분자가 photo-N3-PEGn-AE105이고, 상기 PEG가 단량체이고, n 이 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 및 20에서 선택되는 것인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  55. 제51항에 있어서, 상기 방사성 표지된 관능기가 N3-(64Cu)NOTA인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  56. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 광자 에너지가 자외선(UV radiation)인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  57. 제48항에 있어서, 상기 스페이서가 중합체를 포함하는 것인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  58. 제57항에 있어서, 상기 스페이서가 PEG 단량체를 포함하는 것인, 고속대량 스크리닝 플랫폼.
  59. (a) 표적화 분자와 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기 사이에 다양한 길이의 스페이서를 포함하는 제1의 관능화된 표적화 분자를, 표적화 분자와 제2의 관능화된 표적화 분자의 관능기 사이에 정해진 길이의 스페이서를 포함하는 제2의 관능화된 표적화 분자와 혼합하여, 혼합된 표적화 분자 저장액(stock solution)을 생성하는 단계;
    (b) 상기 혼합된 표적화 분자 저장액을, 제1 및 제2의 관능화된 표적화 분자의 표적화 분자에 의하여 표적화된 바이오마커를 발현하는 세포와 인큐베이션하는 단계;
    (c) 비-결합된 제1 및 제2의 관능화된 표적화 분자를 제거하는 단계;
    (d) 세포를, 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기에 결합한 방사성 표지된 관능기와 인큐베이션하는 단계;
    (e) 비-결합된 방사성 표지된 관능기를 제거하는 단계; 및
    (f) 세포의 방사능(radioactivity)을 측정하는 단계
    를 포함하는, 고속대량 스크리닝(high-throughput screening) 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 제1의 관능화된 표적화 분자의 관능기가 광분해성(photolabile) 관능기이고, 제2의 관능화된 표적화 분자의 관능기가 반응성 관능기이고, 광자 에너지(photon energy)로 상기 광분해성 관능기의 활성화 후에 상기 반응성 관능기가 광분해성 관능기에 결합할 수 있는 것인, 고속대량 스크리닝 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 광분해성 관능기가 Photo-OIDBO 이고, 반응성 관능기가 아자이드(azide)인, 고속대량 스크리닝 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 방사성 표지된 관능기가 방사성 표지된 아자이드인, 고속대량 스크리닝 방법.
  63. 제59항에 있어서, 상기 제1의 관능화된 표적화 분자가 photo-ODIBO-PEGn-RGD 펩타이드이고, 상기 PEG가 단량체이고, n 이 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 이들의 조합에서 선택되는 것인, 고속대량 스크리닝 방법.
  64. 제59항에 있어서, 상기 제1의 관능화된 표적화 분자가 photo-N3-PEGn-AE105이고, 상기 PEG가 단량체이고, n 이 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 이들의 조합에서 선택되는 것인, 고속대량 스크리닝 방법.
  65. 제59항에 있어서, 상기 방사성 표지된 관능기가 N3-(64Cu)NOTA 인, 고속대량 스크리닝 방법.
  66. 제60항에 있어서, 상기 광자 에너지가 자외선(UV radiation)인, 고속대량 스크리닝 방법.
  67. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 대상체, 예를 들어 질환 또는 질병을 가지거나, 질환 또는 질병을 가질 위험성이 있거나, 질병 또는 질환을 위해 스크리닝/테스트되는 대상체에서, 세포, 조직 또는 관심 구조물의 영상화 방법.
  68. 치료가 필요한 대상체, 예를 들어 질환 또는 질병을 가지거나, 질환 또는 질병을 가질 위험성이 있거나, 질병 또는 질환을 위해 스크리닝/테스트되는 대상체에서, 세포, 조직 또는 관심 구조물의 영상화 방법에 있어서, 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
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