KR20110097497A - 전자파 노출을 진단하기 위한 마커 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전자파 노출을 진단하기 위한 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전자파 노출 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 전자파 노출 진단용 키트, 상기 마커의 검출 방법, 및 상기 마커를 이용하여 전자파 노출을 진단하기 위해 필요한 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 전자파 노출 진단용 마커는 환경이나 실생활에서 전자기장 노출 여부를 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 전자기장 노출에 의해 유발되는 생리학적 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

Description

전자파 노출을 진단하기 위한 마커 및 이를 포함하는 키트 {Maker for diagnosing exposure to electromagnetic wave and a kit including the maker}

본 발명은 전자파 노출을 진단하기 위한 마커 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전자파 노출 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 전자파 노출 진단용 키트, 상기 마커의 검출 방법, 및 상기 마커를 이용하여 전자파 노출을 진단하기 위해 필요한 정보 제공방법에 관한 것이다.

현대인은 가정에서든 직장에서든 불가피하게 전자파에 대해 노출된다. 이동전화 단말기를 비롯하여 개인용 컴퓨터, 텔레비전, 전기 면도기 등 일상생활에서 매일 사용하고 있는 가전제품 모두가 전자파를 발산한다. 전자파의 유해성 논란이 제기됨에 따라 보건복지부는 1996년에 「전자파 주의에 관한 공식 경보」 발표를 통하여 전자파 유해 가능성을 인정하고 그에 대한 노출을 줄이도록 경고한 바 있다.

전자파란 전기 및 자기의 흐름에서 발생하는 전자기 에너지다. 전기가 흐를 때 그 주위에 전기장과 자기장이 동시에 발생하고 이들이 주기적으로 바뀌면서 발생되는 파동을 전자파라고 한다. 전자파는 전기가 흐르는 곳이면 어디에나 존재한다.

전자파 영역 중 TV, 휴대전화, 라디오, 통신 등 일상생활에서 많이 이용되는 무선주파수 방사선(radiofrequency radiation)은 거대입자의 공유 결합을 깰 정도의 강한 에너지를 전달하지는 못하지만 이들 에너지 자극은 세포사 또는 세포 증식과 같은 분자 반응은 유도한다 (Moulder, J.E et al., (1999) Cell phones and cancer: what is the evidence for a connection? Radiat Res 151, 513-531). 무선주파수 방사선 그 자체가 DNA 및 단백질에 직접적인 영향을 미치는 것은 아니나 그것은 막 유동성 또는 이온 분배에의 변화를 통해 신호 전달을 유도할 수 있다. 게다가, 유전자와 무선주파수 방사선 간의 상호 작용은 다양한 생리적 조건을 유도하여 생리적 변화의 역치를 낮출 수가 있다.

예컨대, 뇌는 무선주파수 방사선이 휴대전화 이용자들에게 미치는 생물학적 영향력 연구의 가장 중요한 타겟 조직이다(Hardell, L et al., (1999) Use of cellular telephones and the risk of brain tumours: a case control study. Int J Oncology 15, 113-116). 몇몇 전자생물리학계에서는 휴대전화-빈도수 무선주파수 방사선에 노출된 뇌의 인지 및 생리 기능의 변화를 보고한 바 있다. 요약하면, 무선주파수 방사선에의 노출 특히 알파 빈도 밴드(8-13 Hz)에서의 인간 뇌 전기적 활동에의 측정가능한 변화를 유도한다. 게다가, 무선주파수 방사선에 노출된 랫트들은 피질(cortex), 해마(hippocampus), 및 기초 신경절(basal ganglia)에 상해를 준다. 무선 주파수가 인간 뇌와 인지와 행동 행태에서의 결과에 영향을 미치는지 여부에 관해 고려할 많은 점들이 남아있다.

마이크로어레이를 이용한 유전자 발현 프로파일링은 생리적·병리적 조건 변화 특징에 중요한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 방사된 Jukat cells의 유전자 발현 프로파일은 NF-B 경로의 p-53-개별 활성을 보여주었다(Park, W.Y et al., (2002) Identification of radiation-specific responses from gene expression profile. Oncogene21, 8521-8528).

이에, 본 발명자들은 세포를 전자파에 노출시킨 후 발현 수준이 변화된 유전자를 탐색하고 유전자 변화 양상의 관찰을 통해 변화가 가장 많은 유전자를 찾아내어 이들 유전자들을 통해 개체가 전자파에 노출되었는가를 판단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 표 6에 기재된 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전자파 노출 진단용 조성물을 제공하는 것이다

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 전자파 노출 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자들을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전자파 노출 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 표 6에 기재된 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전자파 노출 진단을 위한 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "전자파"는 전기자기파와 동일한 의미를 가지는 것으로, 전기장과 자기장의 두 가지 성분으로 구성된 파동으로서 전기 및 자기의 흐름에서 발생하는 일종의 전자기 에너지로서 전기가 흐를 때 그 주위에 전기장과 자기장이 동시에 발생하는데 이들의 주기적으로 바뀌면서 생기는 파동을 전자파라고 한다. 전자파의 성질에는 파장, 진폭, 파형의 3가지 요소와 광전자에너지 등을 포함한다. 파장이 짧을수록 열 에너지는 크게 된다. 여기에서 파장이란 주기적으로 반복되는 파동과 파동 사이의 간격을 말하며 그 크기에 따라 극저주파, 장파, 종파, 단파, 초단파, 마이크로파, 적외선, 가시광선(레이저 포함), 자외선, X-선, 감마선 등으로 구분할 수 있고 단위시간 당 즉 1초 동안 진동하는 횟수를 주파수라 한다. 주파수의 단위는 헤르츠(Hz)인데 주파수와 파장은 반비례 관계에 있다. 본 발명에서 전자파란 TV, 휴대전화, 라디오, 통신 등 일상생활에서 많이 이용되는 영역인 무선주파수 영역(100kHz~300GHz)을 의미하며, 본 발명의 전자파 노출 진단용 마커는 실생활에서 전자기장 노출여부를 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 1762.5MHz의 전자파를 60W/kg SAR(specific absorption rate) 강도로 사용하였다.

본 발명에서 용어, "진단"은 이력의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상 진단은 전자파에의 노출 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단을 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 전자파에 노출된 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 전자파에 노출된 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 것으로 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 진단 마커는 정상 세포에 비하여, 전자파에 노출된 세포에서 특이적으로 발현 수준의 변화를 보이는 유전자 뱅크 등록 번호(GenBank number) NM_006933, NM_002214, NM_020422, NM_018018, NM_001039966, NM_001135599, NM_000867, NM_012098, NM_000287,NM_000593, NM_018370, NM_006702, NM_006645, NM_030941, NM_004540, NM_001034194, NM_001280, BC063625, NM_017858, NM_001099286, NM_005915, NM_005320, NM_130398, NM_004153, NR_002562, NM_022170, NM_004900, NM_003524, NM_182751, NR_002559, NR_002564, NM_006743, NR_002561, NM_003504, NM_003521, NM_002915, NM_005325, NR_002612, NR_002563 및 NR_002565 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

전자파 노출에 있어서의 상기 유전자들의 구체적인 기능 및 전자파 노출과의 연관성은 전혀 알려져 있지 않았다. 본 발명자는 다음과 같은 과정을 통하여 상기 유전자들이 전자파 노출 진단용 마커가 될 수 있음을 규명하였다. 본 발명자들은 전자파를 인간 정상 섬유아세포 WI-38 세포에 처리하고 이로부터 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후 비오틴(biotin)으로 표지하였다. 상기 표지된 cDNA를 3GeneChip Human Gene 1.0 ST Array 칩과 혼성화 하였고 스트렙타비딘-피코에리틴(Streptavidin-phycoerythrin) 또는 비오틴화 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin antibody)를 이용한 형광 염색 후 형광이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다.

분석 결과, 발현정도가 유의하게 변화된 유전자는 788개 였으며 이 중 358개는 전자파 노출에 의해 발현이 증가하였고 430개는 발현 수준이 감소하였다. 발현이 증가된 유전자는 주로 "negative regulation of developmental process/organ morphogenesis", "response to protein stimulus", "developmental process" 에 관여하는 유전자였으며 (표 1) "Antigen processing and presentation", "MAPK signaling pathway", "Notch signaling pathway" 와 관련되어 있는 것으로 나타났다 (표 2). 또한, 발현이 감소된 유전자는 주로 "cell cycle", "chromosome organization and biogenesis", "response to DNA damage stimulus" 에 관여하는 유전자였으며 (표 3), "cell cycle pathway", "DNA polymerase/pyrimidine-, purine-metabolic pathway"와도 관련되어 있는 것으로 나타났다(표 4).

이들 데이터를 이용하여 moderated t-test 시행하여 p value가 가장 작은 순서대로 유전자를 선택하고 leave-one-out 방법에 의해 각 샘플을 예측하였다. 그 결과 선택된 유전자의 개수가 35-40개 정도일 때 사용한 모든 알고리즘에서 예측 에러율이 0%로 나타남을 알 수 있었다(표 5).

이에 추가적으로 40개 유전자를 대상으로 8개 샘플로 나누고 그 중 1개를 선택하여 실험 집단으로 선정하고 나머지 7개 샘플을 학습 집단으로 하여 t-test를 시행하였다. pre-validation 결과 Diagonal Linear Discriminant Analysis, support vector machine 방법이 가장 효율적임을 알 수 있었다(표 7).

본 발명에서 용어, "상기 마커들의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 전자파에의 노출 세포에서 발현이 증가하는 마커인 표 6에 기재된 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.

표 6의 유전자, 즉 유전자 뱅크 등록 번호(GenBank number) NM_006933,NM_002214,NM_020422, NM_018018, NM_001039966, NM_001135599, NM_000867, NM_012098, NM_000287,NM_000593, NM_018370, NM_006702, NM_006645, NM_030941, NM_004540, NM_001034194, NM_001280, BC063625, NM_017858, NM_001099286, NM_005915, NM_005320, NM_130398, NM_004153, NR_002562, NM_022170, NM_004900, NM_003524, NM_182751, NR_002559, NR_002564, NM_006743, NR_002561, NM_003504, NM_003521, NM_002915, NM_005325, NR_002612, NR_002563 및 NR_002565 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준은 상기 유전자들의 mRNA 발현 수준 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 전자파에의 노출 여부를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 서열이 진 뱅크에 등록되어 있어 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 전자파 노출 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작 될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 전자파 노출 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 로의 변형이 있다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 전자파에의 노출 여부를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게 항체이다. 본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 전자파에의 노출 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또, 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 전자파에의 노출 진단 마커 검출용 조성물을 포함하는, 전자파에의 노출 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 마커 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현수준을 확인하여 마커를 검출함으로써 전자파에의 노출 여부를 진단할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 전자파에의 노출 진단 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 코딩에 의해 발현된 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용 될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트일 수 있다. DNA 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, DNA 마이크로어레이 칩은 표 6에 기재된 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적되어 있을 수 있다. 상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 마커 유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. DNA 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 전자파에의 노출 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 시료로부터 상기 마커의 발현수준을 정상 조직의 발현 수준과 비교하여 마커를 검출하는 방법 및 상기 방법을 이용하여 전자파에의 노출 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 개체의 시료란 마커 유전자의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 섬유아세포 WI-38 세포를 대상으로 하였다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 전자파에의 노출 의심 개체에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 전자파에의 노출 의심 개체의 실제 전자파에의 노출 여부를 진단할 수 있다. 즉, 전자파에 노출된 것으로 추정되는 개체의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 개체의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커 중 유전자 뱅크 등록 번호(GenBank number) NM_006933, NM_002214, NM_020422, NM_018018, NM_001039966, NM_001135599, NM_000867, NM_012098, NM_000287, NM_000593, NM_018370, NM_006702, NM_006645 유전자의 발현 수준이 정상 개체의 것보다 전자파에 노출된 것으로 추정되는 개체 유래에서 더 많이 발현되면 이 개체를 전자파에 노출된 것으로 예측할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명의 마커 중 유전자 뱅크 등록 번호(GenBank number) NM_030941, NM_004540, NM_001034194, NM_001280, BC063625, NM_017858, NM_001099286, NM_005915, NM_005320, NM_130398, NM_004153, NR_002562, NM_022170, NM_004900, NM_003524, NM_182751, NR_002559, NR_002564, NM_006743, NR_002561, NM_003504, NM_003521, NM_002915, NM_005325, NR_002612, NR_002563 및 NR_002565 유전자의 발현 수준이 정상 개체의 것보다 전자파에 노출된 것으로 추정되는 개체 유래에서 더 적게 발현되면 이 개체를 전자파에 노출된 것으로 예측할 수 있는 것이다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 전자파에의 노출 의심 개체에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 전자파에의 노출 의심 개체의 실제 전자파에의 노출 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 전자파에의 노출 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 전자파에의 노출 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

한편, DNA　 마이크로어레이 칩은 상기 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 전자파에의 노출 여부를 판독할 수 있다. 보다 구체적으로 하기의 단계를 포함하여 수행될 수 있다: 개체의 시료로부터 본 발명의 마커 유전자의 mRNA를 분리하는 단계; 상기 개체의 시료에서 분리한 mRNA와 정상대조군의 mRNA를 cDNA로 합성하면서 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하여 본 발명의 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교하는 단계. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다. 또한, DNA 마이크로어레이 칩은 36 k Human V4.0 OpArray 올리고마이크로어레이(Operon, Germany) 또는 Whole human genome oligo microarray(Agilent, USA) 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자가 탑재된 DNA 칩이라면 사용 가능하다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 전자파에의 노출 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 전자파에의 노출 의심 개체의 실제 전자파에의 노출 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

단백질 발현수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 전자파에의 노출 여부를 확인할 수 있다.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다.　 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 전자파에의 노출 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 단백질의 발현량과 전자파에 노출된 세포에서의 마커 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.　

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시할 수 있다. 전자파에 노출된 것으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 전자파에의 노출 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 전자파 노출 진단용 마커는 환경이나 실생활에서 전자기장 노출 여부를 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 전자기장 노출에 의해 유발되는 생리학적 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.

도 1은 전자파 노출에 의해 발현 정도가 유의하게 변한 유전자 787개의 상대적인 발현 정도를 heatmap으로 나타낸 것이다.
도 2는 전자파 노출에 의해 발현 정도가 유의하게 변한 유전자 40개의 상대적인 발현 정도를 heatmap으로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 실험 방법

1-1. 전자파 노출

사람의 정상 섬유아세포 WI-38 세포를 1762.5 MHz의 전자파에 60W/kg 전자파 흡수율(Specific Absorption Ratio;SAR) 강도로 24시간 동안 노출시켰다. 대조군으로는 전자파에 노출시키지 않은 정상 WI-38 세포를 37℃ 세포배양기에서 24시간 배양한 후 사용하였다.

b. mRNA 마이크로어레이

칩은 Affymetrix의 GeneChip　 Human Gene 1.0 ST Array를 사용하였다. 100ng의 전체 RNA를 RT-PCR을 이용한 증폭과정을 거쳐 증폭하여 Affymetrix Whole-Transcript (WT) Sense Target Labeling Protocol에 따라 비오틴(biotin)으로 표지하였다. Biotin으로 표지된 센스 DNA 5.5 μg을 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST arrays에 혼성화(hybridization) 한 후 프로토콜에 따라 스트렙타비딘-피코에리틴(Streptavidin-phycoerythrin) 또는 비오틴화 항-스트렙타비딘 항체(biotinylated anti-streptavidin antibody)를 사용하여 염색하고 스캐닝하였다.

1-3. mRNA 마이크로어레이 분석 및 전자파 노출 예측

a. 예측 알고리즘에 사용될 알고리즘 및 유전자 선택

전자파 노출군과 비노출군으로 나누고 moderated t-test를 이용하여 두 군에서 mRNA 발현양에 차이가 있는가를 검정하였다. t-test 결과에서 나온 p value를 기준으로 p value가 작은 순서대로 각 유전자의 순서를 결정한 후 가장 순위가 높은 5개의 유전자를 시작으로 5개씩 유전자를 증가해 가며 분류 알고리즘(classification algorithm)을 적용하였다. 여러 지도 기계 학습 알고리즘(supervised machine learning algorithm)을 적용하여 예견 정확성(prediction accuracy)이 가장 높은 알고리즘 선택하였다. 사용한 알고리즘은 다음과 같다: k-Nearest Neighbor, Linear Discriminant Analysis (LDA), Diagonal Linear Discriminant Analysis, Random Forest, naive Bayes, Neural Networks, Support Vector Machines (SVM), Generalized Linear Models (GLM)

b. Pre-validation

Leave one out (LOO) validation 방법을 사용하여 검증하였다. 샘플을 8개로 나누어 이중 1개를 선택하여 실험집합(test set)으로 설정하고 나머지 7개를 학습집합(training set)으로 설정하였다. 학습집합(training set)만을 이용하여 moderated t-test에 의해 전자파 예측에 사용될 유전자를 선택하였다. 전자파 노출군과 비노출군으로 나누어 moderated t-test 적용하고 p value가 작은 순서대로 각 유전자의 순서를 결정한 후 가장 순위가 높은 순으로 해당 개수만큼의 유전자를 선택하였다. 선택된 유전자를 이용하여 주어진 지도 기계 학습 알고리즘을 학습시킨 후 실험집합(test set)의 방사선 노출 여부를 예측하였다. 이 과정을 돌아가며 8번 반복하게 되면 각 샘플의 방사선 노출 여부 예측 결과를 얻을 수 있다. 이 결과를 통합하여 에러율을 계산하였다.

실시예 2. 실험 결과

2-1. 전자파 노출에 의하여 변화된 유전자

전자파 노출에 의해 발현 정도가 유의하게 변한 유전자는 788개 였으며 이 중 358개는 전자파 노출에 의해 발현이 증가하였고 430개는 발현이 감소하였다. 유의 정도는 다중비교에 의해 증가되는 type I 에러율을 Benjamini-Hochberg false discovery rate (BH FDR) 방법을 적용하여 보정 후 5% 유의수준을 적용하였다. 이 유전자 788개의 상대적인 발현 정도를 도 1에 heatmap으로 나타내었다.

분석 결과, 발현이 증가된 유전자는 주로 "negative regulation of developmental process/organ morphogenesis", "response to protein stimulus", "developmental process" 에 관여하는 유전자였으며 (표 1) "Antigen processing and presentation", "MAPK signaling pathway", "Notch signaling pathway" 와 관련되어 있는 것으로 나타났다 (표 2).

또한, 전자파에 의해 발현이 감소된 유전자는 주로 "cell cycle", "chromosome organization and biogenesis", "response to DNA damage stimulus" 에 관여하는 유전자였으며 (표 3), "cell cycle pathway", "DNA polymerase/pyrimidine-, purine-metabolic pathway"와도 관련되어 있는 것으로 나타났다(표 4).

2-2. 전체 데이터를 이용하여 선택된 유전자를 이용한 예측

전체 데이터 [전자파 노출군 (n=3) vs. 전자파 비노출군 (n=5)]를 이용해 moderated t-test 시행하여 p value가 가장 작은 순서대로 유전자를 선택하고 leave-one-out 방법에 의해 각 샘플을 예측하였다. 그 결과 표 5에서 나타나 있듯이 선택된 유전자의 개수가 35-40개 정도일 때 사용한 모든 알고리즘에서 예측 에러율이 0%로 나타났다. 표 5에 제시된 바와 같이 40개의 유전자를 대상으로 8가지 [k-Nearest Neighbor, Linear Discriminant Analysis (LDA), Diagonal Linear Discriminant Analysis, Random Forest, naive Bayes, Neural Networks, Support Vector Machines (SVM), Generalized Linear Models (GLM)] supervised machine learning 알고리즘에 적용하였을 때 100% 예견 정확율을 얻었다.

이 유전자 40개 중에서 대조군에 비하여 전자파 노출군에서 발현이 증가된 유전자는 13개였으며 발현이 감소된 유전자는 27개였다 (표 6).

이 유전자 40개의 상대적인 발현 정도를 도 2에 heatmap으로 나타내었다.

2-3. 학습 집단 데이터를 이용하여 선택된 유전자를 이용한 예측

8개 샘플 중 1개를 선택하여 실험 집단으로 선정하고 나머지 7개 샘플을 학습 집단으로 하여 t-test를 시행하였다. 그 결과 얻어진 유의한 유전자 중 p-value가 작은 순서대로 선택하여 예측 알고리즘에 적용하여 전자파 노출을 예측하였다. 그 결과를 표 7에 도시하였다. pre-validation 결과 Diagonal Linear Discriminant Analysis, support vector machine 방법이 가장 효율적임을 알 수 있었다(100% 예견 정확성).

따라서, 전자파 노출로 인해 발현이 가장 유의하게 변화한 40개의 유전자를 바이오마커로써 검출하고 그 검출 결과를 Diagonal Linear Discriminant Analysis, Support Vector Machines 알고리즘을 이용하여 분석하면 특정 세포 혹은 개체의 전자파 노출 여부에 대한 판단이 가능하다.

Claims (16)

1. 표 6에 기재된 유전자의 mRNA 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 전자파 노출 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 전자파는 1762.5 MHz로 60W/kg SAR(specific absorption rate) 강도인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브인 조성물.　
   
4. 제1항에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체인 조성물.
   
5. 제1항에 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 전자파 노출 진단용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 전자파 노출 진단용 키트.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 마이크로어레이 칩 키트는 표 6의 유전자 또는 그 단편에 해당하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된, 전자파 노출 진단용 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 것을 특징으로 하는 전자파 노출 진단용 키트.
   
8. 전자파 노출 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 시료로부터 표 6에 기재된 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 전자파 노출 진단 마커인 표 6의 유전자를 검출하는 방법.
   
9. 개체의 시료로부터 표 6에 기재된 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 전자파 노출 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 표 6에 기재된 유전자 중 유전자 뱅크 등록 번호(GenBank number) NM_006933, NM_002214, NM_020422, NM_018018, NM_001039966, NM_001135599, NM_000867, NM_012098, NM_000287,NM_000593, NM_018370, NM_006702, NM_006645 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 개체의 전자파 노출에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 표 6에 기재된 유전자 중 유전자 뱅크 등록 번호(GenBank number) NM_006933, NM_002214, NM_020422, NM_018018, NM_001039966, NM_001135599, NM_000867, NM_012098, NM_000287,NM_000593, NM_018370, NM_006702, NM_006645 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준은 개체의 전자파 노출에 의해 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍 또는 프로브를 이용하는 것인 방법.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 또는 DNA 마이크로어레이 칩 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하는 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    개체의 시료로부터 표 6에 기재된 유전자의 mRNA를 분리하는 단계; 상기 개체의 시료에서 분리한 mRNA와 정상대조군의 mRNA를 cDNA로 합성하면서 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분석하여 표 6에 기재된 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교하는 단계.
    
15. 제9항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
    
16. 제9항에 있어서, 상기 개체의 시료는 섬유아세포 WI-38 세포인 것을 특징으로 하는 방법.

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