KR100969856B1

KR100969856B1 - 간암을 진단하기 위한 마커인 ｍｇｐ, 그를 포함하는 키트및 상기 마커를 이용한 간암 예측 방법

Info

Publication number: KR100969856B1
Application number: KR1020080006208A
Authority: KR
Inventors: 이기호; 김부여; 김상범; 박선후; 한철주; 김상훈
Original assignee: 재단법인 한국원자력의학원
Priority date: 2008-01-21
Filing date: 2008-01-21
Publication date: 2010-07-13
Also published as: KR20090080316A

Abstract

본 발명은 MGP (Matrix Gla protein)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커를 이용하여 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이 및 상기 마커 의 검출 방법에 관한 것이다.

간암, 마커, 마이크로어레이, 혈액, 키트

Description

간암을 진단하기 위한 마커인 ＭＧＰ, 그를 포함하는 키트 및 상기 마커를 이용한 간암 예측 방법 {MGP, the markers for diagnosing hepatocellular carcinoma, a kit comprising the same and method for predicting hepatocellular carcinoma using the marker}

본 발명은 MGP (Matrix Gla protein)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커를 이용하여 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이 및 상기 마커의 검출 방법에 관한 것이다.

간암 (hepatocellular carcinoma)은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서는 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망하고 있다. 간암의 위험 요인은 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의한 고질적인 감염이라고 알려져 있으나, 간암 세포 내의 분자 메커니즘은 아직 명확히 규명되지 않은 상태이며, 따라서 간암 진단에 탁월한 효과가 있는 진단마커가 개발되 어 있지 않은 실정이다. 또한, 간 절제술은 간암 환자 중에서 전이가 발생하지 않은 비교적 초기 환자의 치료법으로서, 현재 전체 간암 환자의 약 20% 내외가 간 절제술에 의한 치료를 받고 있으나, 간 절제술을 받은 간암 환자의 경우에도 장기 생존율은 높지 않은 편이며, 특히 수술 후 1년 안에 사망하는 환자가 많은 실정이다. 또한, 임상 병리분석에 의한 생존율 예측이 예전부터 사용되고 있으나, 보편성과 타당성의 문제로 인해 모든 간암 환자에게 적용되지 못하고 있다. 따라서, 효과적인 간암 진단 마커 및 간 절제술 예후 예측 마커를 개발해야할 필요성이 크다.

간암의 분자 메커니즘을 규명하기 위한 기존의 연구는 개개의 유전자에 대한 연구에 초점이 맞추어져 왔으며, 최근의 연구에 의하면 간암 발생에 있어서 변형된 p53, 베타-카테닌, AXINI, p21(WAF1/CIP1) 및 p27 Kip 등의 유전자가 관여한다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 개개의 유전자의 변화들은 간암 환자들의 외적 특성과 임상 특성을 정확하게 반영하지 못하고 있어, 개체의 간암 내의 세포와 분자의 다양성은 기존의 유전자 연구 외에 새로운 접근 방식을 요구하고 있다.

이와 관련하여, cDNA 마이크로어레이 테크놀로지는 개개의 유전자의 측정범위를 넘어서 한번의 실험으로 수만여 개의 유전자 발현을 동시에 측정할 수 있는 새로운 기술로서 간암을 포함한 거의 대부분의 암 연구에 적용되어 왔으며, 암의 발생에서 활발하게 참여하는 유전자의 측정과 그 유전자에서 발현되는 단백질 또는 효소를 측정함으로써 암 진단의 수준을 분자 수준에서 가능하도록 하였다. 비록 간 암의 진단이 그들의 병리학적 연구결과에 의해 정확하게 결정되는 것은 어렵지만, 그들의 분자 발현 프로파일의 차이점에 의한 비종양 간 조직으로부터 간암의 구별은 가능하다. 왜냐하면, 분자 발현 프로파일의 차이는 간암 발생에 포함된 유전자들의 정확한 세트(set)를 선택하는 것이 가능케 하기 때문이다. 또한 이것은 치료에 대한 적절한 목표를 설정하는 것을 용이하게 할 수 있고 따라서 간암 치료상의 효과를 극대화할 것으로 기대되고 있다.

또한, 간암을 포함한 인간 암에 관련된 유전자를 규명하기 위하여 현재까지의 연구들은 유전자 발현의 전체 패턴으로 총 상태를 분류하여 밝힐 수 있는 매우 유용한 방법인 언수퍼바이즈드 클러스터링 알고리즘(Unsupervised clustering algorithm)을 개발하였다. 그러나 이 언수퍼바이즈드 클러스터링 분석은 그 측정결과의 통계적인 정확성을 제공하기 어려울 뿐 아니라, 주어진 목표의 많은 정보로부터 발현된 유전자의 특이 형태의 정확한 프로파일을 제공하는 것도 용이하지 않은 문제가 있다. 수퍼바이즈 러닝 알고리즘(Supervised learning algorithm)의 중요성조차도 오직 몇 개의 최근 보고서들만 암의 과 분류에 대한 러닝 알고리즘을 채택했고 암 환자의 임상 결과를 발견했을 뿐이다.

이에, 본 발명자들은 간암 진단 및 간 절제술 예후 예측의 수준을 분자 수준에서 정확하게 확인할 수 있는 마커를 개발하고자 노력한 결과, cDNA 마이크로어레이 및 수퍼바이즈드 러닝 방법인 PAM 및 SMA 분석을 사용하여 MGP 가 매우 높은 간 암특이 발현 유전자임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은, MGP (Matrix Gla protein)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, MGP (Matrix Gla protein)를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 간암 마커 MGP (Matrix Gla protein)를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 MGP (Matrix Gla protein)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 간암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마 커(diagnosis marker)"란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 간암진단 마커는 정상 간 조직의 세포에 비하여, 간암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 MGP (Matrix Gla protein) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다(도 5).

MGP (Matrix Gla protein) 는 비타민 K 를 필요로하는 뼈, 심장, 신장 및 폐 등의 신체 여러 조직에서 발견되며, 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(GeneID:4256, NM_000900). MGP 는 골의 무기질화를 촉진시키는 것으로 알려져 있으나, MGP 의 기능 및 간암과의 연관성은 전혀 알려지지 않았다.

본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 MGP 가 간암 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.

구체적으로, 간암 환자 중 간암 수술을 받은 환자로부터 종양조직 101개 및 인접한 비종양조직 101개를 채취하여 RNA를 분리 정제하였다. 한편, DNA 칩 실험에 사용할 기준으로 태반으로부터 정제한 RNA를 대조 RNA로 사용하였다. 이렇게 조직으로부터 분리한 RNA와 대조 RNA를 역전사(reverse transcription)시켜 cDNA를 제조하였는데, 이 과정에서 Cy5-dUTP, Cy3-dUTP를 cDNA에 각각 결합하도록 하였다 (도 1 참고). 이와 같이 대조 조직을 중간에 삽입시킨 이유는 분석의 용이성을 증대시키고, 분석 결과의 타 기관과의 상호 비교를 가능하게 하기 위해서였다. 이렇게 혼성화시킨 DNA 칩은 레이저 스캐너를 이용하여 각 스폿에서의 Cy3와 Cy5의 강도 (intensity)를 측정하였다. 이 두 가지 종류의 형광강도의 상대적인 비율을 컴퓨터 소프트웨어(IMAGENE program)를 이용하여 수치화하여 발현도를 측정하였다.

본 발명에 사용된 DNA 마이크로어레이 분석방법을 설명하면 다음과 같다.

수치화한 발현도를 정규화 과정을 거쳐 (normalization process) 표준화 하였다. 이렇게 정규화한 발현도의 자료를 바탕으로 PAM (Prediction Analysis of Microarray) 분석 및 SAM (Significance Analysis of Microarray)을 실시하였다. PAM 분석 및 SAM 분석은 마이크로어레이 결과를 이용하여 샘플의 상태를 예측할 수 있게 하는 프로그램, 본 발명의 경우 주변 비종양성 간조직 과 간암 조직간의 상이성을 예측하기 위해 사용하였다. PAM 분석의 경우, 간암 조직을 가장 적은 에러율로 예측하는 간암 특이 유전자군을 선별하기 위하여 각 threshold 값에 따른 교차평가의 에러율을 비교한 결과, threshold 5.5에서 40개의 간암 특이 유전자를 선별하였다. 선별한 유전자를 이용하여 주변 비종양성 간조직 과 간암 조직의 교차평가를 수행한 결과 주변 비종양성 간조직과 간암 조직 모두 95%의 정확도로 예측하였다(도 2 참조). SAM 분석의 경우, 1,000번의 가상 조합과정을 거쳐서 유전자를 선별하였으며 (도 3 참조), 간암조직에서 발현이 증가하는 유전자 80개를 선별하였다. PAM 및 SAM 양쪽 분석결과에서 모두 간암조직에서 발현이 증가하는 유전자를 선별하였다. 간암조직에서 발현이 감소하는 유전자도 선별가능하나 그 응용목적상 간암조직에서 발현이 증가하는 유전자만을 대상으로 분석하였다.

선별한 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위하여 계층적 클러스터링을 수행하였다. 계층적 클러스터링 (clustering) 방법은 측정한 유전자의 발현도에 따라 가장 유사한 발현 패턴을 보이는 샘플들이 클러스터링 되도록 하는 방법이다. 이렇게 클러스터링 분석을 수행하여 간암 특이 유전자의 발현을 측정한 결과, 주변 비종양성 간조직 이 서로 발현이 유사한 하나의 클러스터로 모여있는 것을 확인하였다 (도 4 참조). 이는 예측유전자의 발현 패턴을 분석함으로써 신규 간암절제 수술을 받은 환자의 예후를 미리 예측할 수 있음을 보여주며, 이런 예측을 바탕으로 환자의 예후 치료에 활용할 수 있을 것으로 판단한다.

한편, 환자의 혈액에서 간암의 유무를 손쉽게 측정하는 등 보다 효과적인 진단 방법을 위하여 프로그램을 통해 세포 밖으로 배출되는 간암 특이단백질을 선별하였다 (도 5 참조). 사용한 단백질 위치확인 및 추정 프로그램으로 모두 최근 논문에 발표되어 신빙성이 확보된 Wolf PSORT (Nucleic Acid Research 2007) 및 SLPFA (BMC Bioinformatics 2007)를 이용하였다.

본 발명에서 용어, "MGP (Matrix Gla protein)의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 간암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 MGP 의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.

MGP 의 발현 수준은 MGP 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질 의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 간암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 간암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 간암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 간암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, MGP 유전자의 핵산 서열이 NM_000900(NCBI) 에 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 MGP 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 MGP 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 간암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 MGP 에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 간암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능 적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 간암 진단 마커 검출용 조성물을 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 간암 진단 마커인 MGP 의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 간암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 MGP 의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조 구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 MGP 의 단밸질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 마커를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명의 마이크로어레이는 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 MGP 의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 간암 마커 MGP 를 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 “환자의 시료”란 간암 마커 유전자인 MGP 의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 간암 의심환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 간암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 간암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 간암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 간암으로 추정되는 세포를 간암으로 예측할 수 있는 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 간암 절제 수술의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 간암 절제 수술을 받은 환자의 시료로부터 MGP (Matrix Gla protein)의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 간암 마커 MGP (Matrix Gla protein)를 검출하는 방법에 관한 것이다.

상기 검출 방법을 통하여, 예측 유전자의 발현 패턴을 분석함으로써 신규 간암절제 수술을 받은 환자의 예후를 미리 예측할 수 있으며, 이런 예측을 바탕으로 환자의 예후 치료에 활용할 수 있을 것이다.

본 발명자들은 간암과 비종양 간 조직 사이의 다른 발현 패턴을 나타내는 유전자를 확인하였고, 이 유전자 중에서 세포 밖으로 배출된다고 예측되는 단백질의 유전자를 선별하여 진단 마커로 활용가능성을 평가하였다. 따라서, 본 발명에 따른 간암 진단 마커인 MGP 를 사용하면 간암의 유무를 정확하고 손쉽게 측정할 수 있으며, 나아가 간암의 종양 형성의 연구에 활용될 수 있고, 간암의 조기 진단에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 판단된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 시험군 및 시험조직 샘플의 선택

시험용 표본은 원자력병원에서 간암 치료로 수술을 받은 101명의 환자로부터 수득하였다. 연구 목적으로 수술 표본과 임상병리학적 데이터를 사용하겠다는 동의를 환자로부터 받았다. 모든 조직은 외과적으로 적출되고 즉시 액체 질소에서 재빨리 냉각한 후 영하 80℃에서 저장하였다. RNA는 시험 매뉴얼 (Trizol, Gibco/BRL)에 따라 페놀/클로로포름 추출에 의해서 냉각된 조직으로부터 분리하였다. 총 RNA 의 품질(quality)은 아가로즈 겔 전기영동 후 28S와 18S RNA 사이의 밴드 비율로부터 판단하였다.

실시예 2: cDNA 마이크로어레이

실험에 사용한 마이크로어레이는 인간 cDNA 클론 총 14,080개로 구성되었다. 마이크로어레이 실험 방법은 3DNA 어레이 검출 키트 (Genisphere Inc. PA, USA)를 사용하여 제조사가 제시하는 방법에 따라 수행하였다. 간단히 말하면, 각각 실험용 RNA 10 ㎍과 일반적인 대조 태반 RNA 10 ㎍을 각각 2 시간 동안 역전사효소를 사용하여 역전사시키고 Cy5-dUTP와 Cy3-dUTP로 태깅하였다. 두 종류의 cDNA는 마이크로콘 칼럼 (Millipore, Bedford, MA)을 통과시켜 정제하였다. 대조 샘플과 실험용 샘플로부터 정제한 형광 cDNA는 ExpressHyb^TM 하이브리드 용액 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)과 혼합하여 65℃에서 하룻밤 동안 반응한 후 스캔어레이 스캐너 (PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 스캔하였다.

실시예 3: 데이터 분석 및 간암 특이 유전자 선별

스캔한 이미지 파일로부터 IMAGENE 4.0 (Biodiscovery, Marina del Rey, CA, USA)를 이용하여 수치화된 데이터를 얻었고, 형광 강도 (intensity)와 스폿 위치를 고려하여(spatially dependent method) 표준화 (normalization)하였다. 적어도 샘플의 80% 이상에서 측정되지 않은 유전자는 차후 분석에서 배제하였다. 발현 비율 은 클러스터 프로그램 (Cluster)의 사용으로 계층적으로 클러스터링하였으며, 트리뷰 (treeview) 프로그램을 사용하여 도식화하였다. 간암 특이 유전자를 선별하기 위해서 PAM (Prediction Analysis of Microarray) 분석 및 SAM (Significance Analysis of Microarray) 분석을 사용하였다. PAM 분석의 경우, 교차평가에서 가장 적은 에러를 보이는 유전자군을 선별한 뒤 예측평가를 수행하였다. 여기에서 에러율은 간암 조직을 간암 조직으로, 또는 주변 비종양성 간조직을 주변 비종양성 간조직으로 정확하게 예측했는가에 대한 전체 에러율이다. threshold 값에 따라 에러율이 가장 낮은 곳이 존재하는데, 그 값에 해당하는 유전자 리스트를 확보할 수 있으며, 이 유전자 리스트가 간암을 가장 적은 에러율로 예측할 수 있다. 상기에서 결정한 threshold 값에 해당하는 유전자 리스트를 이용하여 개별 샘플의 상태를 예측한 결과, 샘플을 95% 확률로 정확하게 예측하였다. SAM 분석의 경우, 1,000번의 가상 조합과정을 거쳐서 가장 높은 점수 (가상조합의 무작위 확률보다 더 높게 측정되는 유전자)를 보이는 유전자를 순차적으로 선별하였다.

이렇게 선별된 유전자를 보다 효과적인 진단을 목적으로 다음과 같은 방법으로 선별하였다. 우선 프로그램을 통해 각 단백질에 대한 세포 내외의 분포도를 작성하여 세포 밖으로 분비되는 단백질만을 선별하여 진단 유전자로 선택하였다 (도 5). 사용한 단백질 위치확인 및 추정 프로그램으로 모두 최근 논문에 발표되어 신빙성이 확보된 Wolf PSORT (Nucleic Acid Research 2007) 및 SLPFA (BMC Bioinformatics 2007)를 이용하였다.

실시예 4: 예측유전자에 의한 간암 예측

PAM 분석의 교차평가 수행결과 예측정확도는 95% 이었으며, 이는 간암의 유전자 판별이 매우 정확하다는 것을 보여준다 (도 2참조). PAM 분석에 의해 얻어진 간암 특이 유전자를 언수퍼바이즈드 클러스터링 알고리즘(Unsupervised clustering algorithm) 방법에 의해 클러스터링하였다. 클러스터링 결과, 예측유전자들의 발현 패턴에 의해 주변 비종양성 간조직이 한 군으로 클러스터링됨을 확인하였다 (도 4참조). 이는 예측유전자의 발현 패턴을 분석함으로써 신규 간암절제 수술을 받은 환자의 예후를 미리 예측할 수 있음을 보여주며, 이런 예측을 바탕으로 환자의 예후 치료에 활용할 수 있을 것으로 판단한다.

도 1은 간암 진단 유전자의 발현 프로파일을 측정하기 위한 mRNA의 역전사와 DNA 칩에서 혼성화 및 분석 과정을 나타낸 모식도이다.

도 2은 도 1로부터 얻어진 유전자에 대한 선별기준수치를 이용하여 교차평가를 실시하여 측정한 예측의 정확도를 도식화한 것이다.

도 3은 도 1로부터 얻어진 유전자에 대한 선별기준수치를 이용하여 조합분석에 의한 유전자의 분포를 도식화한 것이다.

도 4는 선별된 간암 특이 유전자의 발현 프로파일링의 도식화이다.

도 5는 선별된 간암 진단 유전자인 MGP의 유전자 서열 및 단백질 서열을 나타낸 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> MGP, the markers for diagnosing hepatocellular carcinoma, a kit comprising the same and method for predicting hepatocellular carcinoma using the marker <130> PA070830/KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(12) <223> SIGNAL SEQUENCE OF MGP <220> <221> PEPTIDE <222> (13)..(103) <223> MGP <400> 1 Met Lys Ser Leu Ile Leu Leu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Ala Val Val 1 5 10 15 Thr Leu Cys Tyr Glu Ser His Glu Ser Met Glu Ser Tyr Glu Leu Asn 20 25 30 Pro Phe Ile Asn Arg Arg Asn Ala Asn Thr Phe Ile Ser Pro Gln Gln 35 40 45 Arg Trp Arg Ala Lys Val Gln Glu Arg Ile Arg Glu Arg Ser Lys Pro 50 55 60 Val His Glu Leu Asn Arg Glu Ala Cys Asp Asp Tyr Arg Leu Cys Glu 65 70 75 80 Arg Tyr Ala Met Val Tyr Gly Tyr Asn Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe 85 90 95 Arg Lys Arg Arg Gly Thr Lys 100 <210> 2 <211> 312 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaagagcc tgatccttct tgccatcctg gccgccttag cggtagtaac tttgtgttat 60 gaatcacatg aaagcatgga atcttatgaa cttaatccct tcattaacag gagaaatgca 120 aataccttca tatcccctca gcagagatgg agagctaaag tccaagagag gatccgagaa 180 cgctctaagc ctgtccacga gctcaatagg gaagcctgtg atgactacag actttgcgaa 240 cgctacgcca tggtttatgg atacaatgct gcctataatc gctacttcag gaagcgccga 300 gggaccaaat ga 312

Claims

서열번호 1의 MGP (matrix Gla protein) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 조성물.
삭제
삭제
삭제
제1항의 조성물을 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마커 검출용 키트.
MGP (Matrix Gla protein)를 포함하는, 간암을 진단하기 위한 마이크로어레 이.
간암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터 MGP (Matrix Gla protein)의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 간암 마커 MGP (Matrix Gla protein)를 검출하는 방법.
간암 절제 수술의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여 간암 절제 수술을 받은 환자의 시료로부터 MGP (Matrix Gla protein)의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 간암 마커 MGP (Matrix Gla protein)를 검출하는 방법.