KR20150041375A - 신장독성 평가용 바이오마커 akr7a1 및 이를 이용한 신장독성 평가방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신장독성 평가를 위한 바이오마커 및 이의 활용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 신장독성 평가를 위한 바이오마커 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 검출방법에 관한 것이다.

Description

신장독성 평가용 바이오마커 AKR7A1 및 이를 이용한 신장독성 평가방법 {Biomarker AKR7A1 for detecting nephrotoxicity and method for detecting nephrotoxicity using the same}

본 발명은 신장독성 평가를 위한 바이오마커 및 이의 활용에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 신장독성 평가를 위한 바이오마커 검출용 조성물, 이를 포함하는 키트, 세포시험방법 및 검출방법에 관한 것이다.

신장은 체내에서 대사되어 혈액 속에 존재하는 다양한 물질들을 배출하는 장기로서, 혈액을 사구체 여과, 신세뇨관 흡수 및 재흡수 과정을 통하여 여과함으로써, 체내에 불필요한 물질들을 뇨의 형태로 배출한다. 신장 무게는 몸무게의 0.5%에 불과하지만, 신장으로 흐르는 혈액량은 총 심박출량의 20-25%에 달하므로 혈액에 포함되어 있는 각종 독성물질(toxic xenobiotics)로 인해 손상 받기 쉽다. 예를 들어, 체내에 과다한 약물을 주사하거나, 각종 질환이 발생할 경우, 신장이 손상될 수 있는데, 신장이 손상되면 체내에 존재하는 불필요한 물질이 배출되지 않아, 추가적인 신체손상이 발생하게 된다.

예를 들어, 약물에 의하여 유발되는 신장독성은 임상에서 빈번히 경험되는 사례로, 급성 신기능 저하의 10-20%는 약물에 의한 것이고, 중환자실에서 많이 사용되는 100가지 약물의 1/4 정도가 신장독성을 야기할 위험이 있는 것으로 알려져 있다. 아울러, 신장독성은 다양한 네프론 부위의 세포에 유독한 상해를 입히고, 사구체에 존재하는 특수한 세포에도 영향을 미치게 된다고 보고되고 있다.

또한, 인체는 약물 뿐 아니라 중금속, 화학물질, 환경오염물질 등 다양한 신장독성 유발 물질에 노출되지만, 신장 상피세포의 약 70-80% 이상이 손상되기 전까지는 임상 증상이나 소견이 나타나지 않으며, 일단 증상이 나타난 이후에는 신장의 기능을 회복시키는 것이 어려우므로, 혈액생화학검사와 조직병리검사를 이용한 현재의 신장독성 평가 방법을 개선하여, 신장독성을 조기에 탐지할 수 있는 기술의 개발이 절실히 요구되고 있다. 아울러, 신장 손상을 조기에 발견할 수 있는 비침습적이며 임상적으로도 활용 가능한 바이오마커를 개발하는 것이 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 중금속에 노출된 신장 조직의 프로테오믹스 분석을 통해 신장독성 평가를 위한 신규 바이오마커들을 발굴하였으며, 이들 바이오마커를 활용하여, 중금속 등 다양한 환경 물질에 의한 독성 및 약물의 부작용 등으로 인해 나타나는 신장독성을 예측 및 평가하는 기술을 완성하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 AKR7A1 (Aldo-keto reductase family 7, member A1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장독성 평가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 신장독성 평가용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 개체의 시료로부터 AKR7A1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 를 검출하여 신장독성을 평가하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 신장독성을 평가하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 시료로부터 AKR7A1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은, AKR7A1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 뿐만아니라, GSTP1(glutathione s-transferase pi 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 를 추가로 이용한 신장독성 평가용 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은, AKR7A1 및 GSTP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 뿐만 아니라, ACO2 (Aconitase 2, mitochondrial precursor), PEPD (Xaa-Pro dipeptidase), SPTAN (Nonerythroid alpha-spectrin), ACO1 (Aconitase 1), SELENBP1 (Selenium binding protein 1), ALDH9A1 (Aldehyde dehydrogenase 9A1), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), GDI1 (GDP dissociation inhibitor 1), GSTA3 (Glutathione S-transferase alpha-3), GLG1 (Golgi apparatus protein 1 precursor), SPNA2 (Alpha-spectrin 2), SELENBP2 (Selenium binding protein 1), CCT2 (T-complex protein 1 subunit beta), AKR1B8 (Aldo-keto reductase family 1, member B8), PSMC2 (Proteasome 26S subunit, ATPase 2) 및 GDI2 (GDP dissociation inhibitor 2) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 를 추가로 이용한 신장독성 평가용 조성물, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 중금속에 노출된 신장 조직의 프로테오믹스 분석을 통해 확보된 바이오마커를 활용하여 신장독성 및 부작용을 예측하는 평가방법에 관한 것이다.

신장독성은 중금속 등 다양한 환경 물질에 의한 독성 및 약물의 부작용으로 인해 널리 나타나며, 이러한 독성을 예측하고 평가하는 기술이 시급하게 요구된다. 본 발명에서는 신규 바이오마커로서 AKR7A1 의 발현을 측정하여 환경 물질 또는 약물의 신장 독성 및 부작용의 위험을 예측하거나 평가하는 데에 유용하게 활용하는 기술을 제공한다. 또한, 본 발명에서는 AKR7A1 와 함께 사용이 가능한 바이오마커로서 GSTP1 를 활용하는 기술을 제공한다. 또한, 본 발명은 AKR7A1 와 함께 사용이 가능한 바이오마커 ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2, 및/또는 GDI2 를 활용하는 기술을 제공한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 AKR7A1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장독성 평가용 조성물에 관한 것이다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물에서 GSTP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는, 신장독성 평가용 조성물에 관한 것이다.

바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물에서 ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2 및 GDI2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는, 신장독성 평가용 조성물에 관한 것이다.

신장독성은 중금속, 약물, 환경노출 화학물질 등 신장독성을 유발하는 다양한 환경에 노출되었을 때 발생할 수 있다. 본 발명에서 약물은, 개체의 신장에 독성을 유발하는 자연계에 존재하는 모든 물질을 의미한다. 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 4-아미노페놀(4-aminophenol, PAP), 아리스토로크산(aristolochic acid), 2-브로모에틸아민(2-bromoethylamine, BEA), DCVC, 카드뮴(cadmium), 카드뮴클로라이드(cadmium chloride), 세포페라존(cefoperazone), 세팔로틴(cephalothin), 세륨나이트레이트(cerium nitrate), 진사(cinnabar), 사이클로스포틴(cyclospotine), 시롤리무스(sirolimus), 독소루비신(doxorubicin), 육종용 (herba cistanches), 헥사클로로부타디엔(hexachlorobutadiene), 하이드로코르티손(hydrocortisone), 겐타마이신(gentamicin), 리튬클로라이드(lithium chloride), 란탄나이트레이트(lanthanum nitrate), 나노 구리(nanocopper), 머큐릭클로라이드(mercuric chloride), 멜라민(melamine), 시아눌릭산(cyanuric acid), 오크라톡신에이(ochratoxin A), 프로필렌이민(propyleneimine), 푸로마이신(puromycin), 디-세린(D-serine), 크로뮴산나트륨(sodium chromate), 타크로리무스(tacrolimus), TCTFP, 토브라마이신(tobramycin), 질산우라닐(uranylnitrate), 반코마이신(vancomycin) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 중금속은 수은(Hg), 카드뮴(Cd), 백금(Pt), 납(Pb) 또는 크롬(Cr) 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

기타, 신장독성을 유발하는 물질로 할로겐화 탄화수소 (예를 들어, 사염화탄소, 클로로포름 등)나 각종 환경오염물질(2,4,5-Trichlorophenacetic acid, 제초제 Paraquat, polychlorobiphenyl, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-ρ-dioxin 등) 을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "평가" 는 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 평가는 신장독성의 발생 여부 및 발생 가능성 여부를 진단, 예측, 검색 또는 확인하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어, "평가용 마커, 평가하기 위한 마커, 또는 평가 마커"란 신장독성이 발생한 또는 발생 가능성이 있는 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분할 수 있는 물질로, 정상 세포 또는 조직에 비하여 신장독성 세포 또는 조직에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 단백질, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 신장독성 평가 마커는 정상 신장 조직의 세포에 비하여, 신장독성 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 AKR7A1 이다. 또한, 본 발명은 신장독성 평가 마커로서, 신장독성 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 GSTP1 를 제공한다. 또한, 본 발명은 신장독성 평가 마커로서, ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2 및/또는 GDI2을 제공한다. 여기에서 ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2 및/또는 GDI2 는 신장독성 유발 물질에 노출된 조직의 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 나타내는 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 신장독성 평가용 바이오마커의 단백질 또는 유전자 정보는 공지된 유전자데이터베이스를 통하여 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오마커 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 mRNA 의 염기 서열은 공지된 유전자데이터베이스인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록되어 있다. 아래 표 1은 각 바이오마커의 정보를 정리한 것이다.

신장독성에 의해 발현이 증가하는 바이오마커

symbol	full name	상대적 발현(배)	랫트( rat )		인간( Human )
			단백질	mRNA	단백질	mRNA
ACO2	Aconitase 2, mitochondrial precursor	5.3	NP_077374.2	NM_024398.2	NP_001089.1 (96%)	NM_001098.2 (87%)
GSTP1	Glutathione S-transferase pi 1	4.8	NP_036709.1	NM_012577.2	NP_000843.1 (86%)	NM_000852.3 (83%)
PEPD	Xaa-Pro dipeptidase	4.6	NP_001009641.1	NM_001009641.1	CAG46470.1 (89%)	CR541669.1 (86%)
SPTAN	Nonerythroid alpha-spectrin	3.8	AAA40770.1	J04828.1	AAA51790.1 (97%)	J05243.1 (88%)
ACO1	Aconitase 1	3.5	NP_059017.1	NM_017321.1	AAH18103.1 (93%)	BC018103.1 (87%)
SELENBP1	Selenium binding protein 1	3.5	NP_543168.1	NM_080892.1	AAH09084.1 (89%)	BC009084.1 (87%)
ALDH9A1	Aldehyde dehydrogenase 9A1	3.4	NP_071609.2	NM_022273.2	NP_000687.3 (90%)	NM_000696.3 (85%)
GAPDH	Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase	3.4	NP_058704.1	NM_017008.4	AAA86283.1 (94%)	M17851.1 (89%)
GDI1	GDP dissociation inhibitor 1	3.2	NP_058784.2	NM_017088.2	NP_001484.1 (99%)	NM_001493.2 (90%)
GSTA3	Glutathione S-transferase alpha-3	3.2	NP_113697.1	NM_031509.2	NP_000838.3 (76%)	NM_000847.4 (82%)
GLG1	Golgi apparatus protein 1 precursor	3.1	NP_058907.1	NM_017211.2	NP_001139139.1 (95%)	NM_001145667.1 (87%)
SPTAN1	Alpha-spectrin 2	3.1	NP_741984.2	NM_171983.2	NP_003118.2 (98%)	NM_003127.3 (89%)
SELENBP1 CCT2	Selenium binding protein 1 or T-complex protein 1 subunit beta	3	NP_543168.1 NP_001005905.1	NM_080892.1 NM_001005905.1	NP_003935.2 (89%) NP_006422.1 (98%)	NM_003944.3 (87%) NM_006431.2 (89%)
AKR7A1	Aldo-keto reductase family 7, member A1	3	NP_037347.1	NM_013215.1	NP_036199.2 (81%)	NM_012067.2 (0%)
AKR1B8	Aldo-keto reductase family 1, member B8	3	NP_775159.1	NM_173136.1	정보 없음	정보 없음
PSMC2 GDI2	Proteasome 26S subunit, ATPase 2 or GDP dissociation inhibitor 2	3	AAH61542.1 NP_058972.2	BC061542.1 NM_017276.2	NP_002794.1 (99%) AAP35514.1 (96%)	NM_002803.3 (89%) BT006868.1 (89%)

본 발명에서 AKR7A1 은 NCBI 등의 유전자데이터베이스에서 AKR7A3, AFAR, AFB1-AR, rAFAR1, aflatoxin B1 aldehyde reductase, aflatoxin B1 aldehyde reductase member 1, aflatoxin B1 aldehyde reductase member 3 등과 동일한 단백질로 서열정보가 등록되어 있으며, 위 표의 서열정보를 참고하여 본 발명에서 당업자가 AKR7A1 을 명확히 이해할 수 있다.

본 발명에서 용어, "단백질 또는 mRNA 의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 신장독성에 의해 발현이 변화하는 바이오마커의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다.

해당 바이오마커의 발현수준은 마커 단백질의 발현수준 또는 이를 코딩하는 유전자 mRNA 의 발현수준을 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명에서 "단백질의 발현수준 측정"이란 신장독성을 평가하기 위하여 개체의 생물학적 시료에서 신장독성 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, 상기 해당 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 복합체의 검출에 의하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 구체적인 분석 방법의 예시로는, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay),방사면역확산법(radioimmunodiffusion),오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게, 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩 되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 신장독성 평가용 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 "mRNA의 발현수준 측정"이란 신장독성을 평가하기 위하여 개체의 생물학적 시료에서 신장독성 마커 단백질을 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 예를 들어, mRNA 의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 구체적인 분석 방법의 예시로는, RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명 바이오마커의 핵산 서열이 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 디자인 할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍 (base pair)를 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4기지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서는 마커 단백질을 코딩하는 mRNA 에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드이 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 신장독성을 평가할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRAN와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 마커 mRNA 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 신장독성을 평가할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드" 는 타겟으로 하는 바이오마커 유전자의 mRNA 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 마커 유전자의 mRNA와 이합체를 형성할 수 있는 핵산 기반의 분자를 의미한다.

이때, 상보적으로 결합한다는 것은, 소정의 혼성화 또는 어닐링(annealing) 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 RORC 유전자의 mRNA 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포함하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 AKR7A1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 포함하는, 신장독성 평가용 키트에 관한 것이다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 키트에서 GSTP1(glutathione s-transferase pi 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는, 신장독성 평가용 키트에 관한 것이다.

바람직한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물에서 ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2 및 GDI2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는, 신장독성 평가용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 신장독성 평가용 마커의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 신장독성 평가용 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 신장독성 평가용 마커 단백질 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용 될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 해당 마커의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대하여 당업자가 디자인한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액 (pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드 (dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (DEPC-water), 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구에 대한 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 신장독성 평가용 마커 검출용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 신장독성을 평가하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여 개체의 시료로부터 AKR7A1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 있어서, GSTP1 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 를 추가로 검출하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 있어서, ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2 및 GDI2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 를 추가로 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어, "개체" 란 자연계에 존재하는 생명체들 중에서 신체 장기 중 신장을 갖고 있는 동물을 의미하며, 바람직하게는 포유류를 의미한고, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다. 상기 포유류의 예로는 쥐(랫트, 마우스 등), 토끼, 말, 소, 양, 개, 고양이, 원숭이 및 인간 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 개체의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "개체의 시료"란 신장독성 평가용 마커 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 신장 조직 또는 이를 구성하는 세포일 수 있다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현수준을 신장독성 의심 개체에서의 유전자 발현수준과 비교함으로써 신장독성 의심 환자의 실제 신장독성 여부를 확인 또는 예측할 수 있다. 즉, 신장독성이 일어난 것으로 추정되는 세포 또는 조직 등의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하고, 정상 세포 또는 조직 등의 시료로부터 본 발명의 마커의 발현수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현수준이 정상 세포의 것보다 신장독성이 일어난 것으로 추정되는 세포 유래에서 유의적인 발현 증가가 확인될 경우, 해당 개체를 신장독성 환자로 예측할 수 있는 것이다.

마커 단백질을 검출하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 신장독성 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 신장독성 평가용 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 신장독성 의심 개체의 실제 신장독성 발생 여부를 예측 또는 확인할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 신장독성 평가용 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 신장독성 평가용 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 신장독성 발생 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 신장독성 평가용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 예를 들어, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다.　생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 신장독성 발생 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 신장독성이 발생한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 신장독성 평가용 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 예를 들어, 정상 신장 조직 또는 세포, 및 신장독성으로 의심되는 세포 또는 조직 등의 시료를 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 신장독성 평가용 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다.　예를 들어, 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 신장독성 발생 여부를 확인할 수 있다.

마커의 mRNA 를 검출하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 신장독성 의심 개체에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 신장독성 평가 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 신장독성 의심 개체의 실제 신장독성 발생 여부를 평가할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 신장독성 평가용 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다. 상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 신장독성 평가용 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 신장독성 발생 여부를 간편하게 확인 또는 예측할 수 있다. 한편, DNA 칩은 상기 신장독성 평가용 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 신장독성의 발생 여부를 판독할 수 있다.

상기와 같은 검출 방법을 통하여, 바이오마커의 발현 패턴을 분석함으로써 중금속이나 약물 등 신장독성 유발 물질에 노출된 환자의 신장독성 여부를 정확하고 간단하게 확인 또는 예측할 수 있으며, 이를 바탕으로 신장독성 환자의 치료 및 신약 개발에 활용할 수 있을 것이다.

본 발명의 바이오마커 및 이의 활용 기술은 중금속 등 다양한 환경 물질에 의한 독성 및 약물의 부작용으로 인한 신장독성을 예측 및 평가하는 데 유용하게 사용될 수 있고, 나아가 신장독성이 없는 안전한 신약의 개발 및 신장독성을 일으키는 작용 기작 연구에도 널리 활용될 수 있다.

도 1은 랫트에 중금속 수은 노출 후 신장 조직의 프로테오믹스 분석을 통해 AKR7A1 및 GSTP1 단백질의 증가를 확인한 결과를 나타낸다. Con (대조군)은 중금속 수은에 노출되지 않은 랫트의 신장 조직, Hg 는 중금속 수은에 노출된 랫트의 신장 조직에서의 결과를 각각 나타낸다.
도 2는 랫트에 중금속 수은 노출 후 신장 조직의 mRNA 분석을 통해 AKR7A1 및 GSTP1 유전자의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다. 또한, 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 와의 비교 결과도 함께 나타내었다.
도 3은 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에서 수은에 의한 세포 독성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에 수은을 노출시킨 후 mRNA 분석을 통해 AKR7A1 및 GSTP1 유전자의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에 수은을 노출시킨 후 mRNA 분석을 통해 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 유전자의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에서 카드뮴에 의한 세포 독성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 7은 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에 카드뮴을 노출시킨 후 mRNA 분석을 통해 AKR7A1 및 GSTP1 유전자, 그리고 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 유전자의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에서 시스플라틴에 의한 세포 독성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 9는 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에 시스플라틴을 노출시킨 후 mRNA 분석을 통해 AKR7A1 및 GSTP1 유전자, 그리고 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 유전자의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험동물 랫트에 중금속 수은 노출 후 프로테오믹스 방법을 활용하여 신규바이오마커 발굴

Sprague-Dawley 랫트(나라바이오텍, 3주령, 20마리)에 2일에 한번씩 총 14일간 경구투여함으로써 중금속 수은(Hg)을 노출하고, 신장 조직을 분리하였다. 수은 노출량을 농도별로 나누어, 저농도(0.203 mg/kg HgCl2; 0.15 mg/kg Hg 해당), 중간 농도(2.03 mg/kg HgCl2; 1.5 mg/kg Hg 해당) 및 고농도(10.15 mg/kg HgCl2; 7.5 mg/kg Hg 해당)로 각각 투여하였다. 또한, 수은에 노출되지 않은 랫트의 경우 물 2 ml/kg을 투여하였고 신장 조직을 분리하여 대조군으로 사용하였다.

상기 수은이 노출된 또는 노출되지 않은 랫트의 신장 조직 시료에 대하여 각각 프로테오믹스 기술을 활용하여, 두 신장 조직 시료에서 유의적으로 발현수준의 차이를 나타내는 단백질들을 발굴하였다. 프로테오믹스는 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 중금속에 노출된 랫트의 신장조직에 sample lysis buffer를 첨가하여 조직분쇄기를 사용하여 조직을 용해하였다. 분쇄된 조직은 약 10,000 x g에서 15분간 원심분리를 시행하여 상층액을 분리한 후, BCA protein assay를 통해 단백질 농도를 정량 하였다. 추출된 단백질은 일차적 전기영동으로 Protean isoelectric focusing (IEF) cell에서 18 cm의 pH 4-7 IPG (immobilized pH gradient) strip에 시행하고, 이차적 전기영동은 9~17% SDS-PAGE gel에서 시행하였다. 완료된 gel은 Coomassie blue로 염색한 후 발현되는 단백질 반점을 관찰하였다. 염색된 gel은 스캔 후 2% acetic acid 용액에 보관한 후 영상은 Image analysis software로 이미지 분석을 하였다. 대조군과 비교하여 3배 이상 과 발현되는 spot들을 선택, 이 spot들의 protein identification 분석을 진행하였다. Trypsin으로 처리된 단백질이 여러 개의 펩타이드 조각으로 분해하여 이를 matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF)를 사용하여 질량분석 후 등전점 (isoelectric point)과 분자량 (molecular weight)에 적합한 단백질을 Nation Center for Biotechnology Information (NCBI) 의 단백질 데이터베이스를 통해 검색하였다.

그 결과, 대조군에 비하여 수은에 노출된 랫트의 신장 조직에서 AKR7A1 및 GSTP1 단백질이 유의적으로 증가하였음을 확인하였다 (도 1). 아울러, ACO2, PEPD, SPTAN, ACO1, SELENBP1, ALDH9A1, GAPDH, GDI1, GSTA3, GLG1, SPNA2, SELENBP2, CCT2, AKR1B8, PSMC2 및 GDI2 단백질 역시 유의적으로 증가하였음을 확인하였다 (표 2).

신장독성에 의해 발현이 증가하는 바이오마커

symbol	full name	상대적 발현(배)
ACO2	Aconitase 2, mitochondrial precursor	5.3
GSTP1	Glutathione S-transferase pi 1	4.8
PEPD	Xaa-Pro dipeptidase	4.6
SPTAN	Nonerythroid alpha-spectrin	3.8
ACO1	Aconitase 1	3.5
SELENBP1	Selenium binding protein 1	3.5
ALDH9A1	Aldehyde dehydrogenase 9A1	3.4
GAPDH	Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase	3.4
GDI1	GDP dissociation inhibitor 1	3.2
GSTA3	Glutathione S-transferase alpha-3	3.2
GLG1	Golgi apparatus protein 1 precursor	3.1
SPTAN1	Alpha-spectrin 2	3.1
SELENBP1 CCT2	Selenium binding protein 1 or T-complex protein 1 subunit beta	3
AKR7A1	Aldo-keto reductase family 7, member A1	3
AKR1B8	Aldo-keto reductase family 1, member B8	3
PSMC2 GDI2	Proteasome 26S subunit, ATPase 2 or GDP dissociation inhibitor 2	3

실시예 2. 실험동물에 중금속 수은 노출 후 신장조직 mRNA 분석을 통한 신규 바이오마커 증가 확인

실시예 1에 기재한 바와 같이, 랫트에 중금속 수은을 노출하고 신장 조직을 분리하였다. 상기 신장 조직으로부터 총 mRNA를 분리한 후, AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA 의 발현량을 각각 qRT-PCR 로 분석하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분간 pre-denaturation 후, denaturation 94℃ 10초, annealing 55℃ 30초, extension 72℃ 10초를 45 cycles 수행하였고, 이 후 95℃와 60℃에서 각각 1분씩 반응하였고, 60℃에서 95℃까지 온도를 낮추며 각 0.5℃마다 형광값을 측정함으로써 생성된 PCR 산물 각각의 용융온도분석(melting temperature analysis)를 실시하였다. 사용된 프라이머 염기서열은 다음 표와 같다.

symbol	Primer (5'-3')		서열번호
18s	Forward	GTAACCCGTTGAACCCCATT	1
	Reverse	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	2
KIM1	Forward	TGGCACTGTGACATCCTCAGA	3
	Reverse	GCAACGGACATGCCAACATA	4
Spp1	Forward	GATCGATAGTGCCGAGAAGC	5
	Reverse	TGAAACTCGTGGCTCTGATG	6
TMP1	Forward	ACAGCTTTCTGCAACTCG	7
	Reverse	CTATAGGTCTTTACGAAGGCC	8
Lcn2	Forward	GATTCGTCAGCTTTGCCAAGT	9
	Reverse	CATTGGTCGGTGGGAACAG	10
AKR7A1	Forward	ATTTGTACCCTCTGCAAGAA	11
	Reverse	TTGAAGGCGTAGAACCTTAG	12
GSTP1	Forward	GCTCAAGTCCACTTGTCTGT	13
	Reverse	CAAGATGGCATTAGATTGGT	14

그 결과, 수은에 노출된 랫트의 신장 조직에서 분리한 mRNA 로부터, AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA 의 발현량이 수은에 노출되지 않은 경우에 비하여 상대적으로 증가되어 있음을 확인하였다. 또한, 수은 노출량이 증가할수록(0.15, 1.5, 7.5 mg/kg) AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA 의 발현량도 크게 증가함을 확인하였다. 아울러, 수은에 노출된 경우 AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA 발현량 증가는, 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 보다도 큰 수준으로 나타나, 신규 바이오마커로 적합함을 확인할 수 있었다 (도 2).

실시예 3. 랫트 유래 신장 세뇨관 세포에서 수은에 의한 독성 및 신규 바이오마커의 활용도 검증

랫트 유래 신장 세뇨관 세포(normal rat kidney tubular epithelial cell; NRK52E)에 수은을 노출시키고 세포 독성을 평가하였다. 독성 평가는 세포 활성 평가인 MTT assay, 독성에 의한 세포막 손상 지표인 LDH assay로 검증하였다. 우선, 배양된 NRK-52E 세포(ATCC CRL-1571)를 5*10³ cells/well로 96 well plate에 seeding, 24시간 동안 37℃ 배양하였다. 각 농도 별 수은 (0, 0.1, 1, 5 μM HgCl₂)을 섞은 배양액으로 교체한 뒤 다시 24시간 배양하고 세포 독성 정도를 MTT 방법으로 측정하였다. 중금속이 처리 된 세포는 배양액과 섞은 MTT 용액 (5 mg/ml)을 10%로 처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 4시간 뒤 MTT 용액은 제거하고 DMSO를 첨가하여 MTT formazan을 녹인 후, 570nm에서 흡광도 측정하였다. 또한, 수은 노출 후 24 시간 동안의 배양액을 따로 취합하여 LDH assay에 사용하였다. LDH assay의 경우 PROMEGA CytoTox 96®kit를 사용하여 측정하였다. Assay 방법은 kit protocol과 동일하게 진행하였다.

그 결과 수은의 노출량이 증가할수록 신장 세포 독성이 증가함을 확인할 수 있었다(도 3).

또한, 상기 NRK52E 세포에 수은을 노출시킨 후 총 mRNA를 분리하여, 실시예 2와 같은 방법으로 AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA 의 발현량을 각각 qRT-PCR 로 분석하였다. 그 결과 수은 노출량이 증가함에 따라 AKR7A1 의 mRNA 의 발현량이 크게 증가함을 확인할 수 있었고, GSTP1 의 mRNA도 유의적인 발현 증가를 나타내었다(도 4).

또한, 상기 결과를 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 의 mRNA 발현 변화와 비교해본 결과, 본 발명에서 발굴한 AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA 발현량 변화가 종래 바이오마커 군에 비하여 민감하게 측정됨을 파악할 수 있었다 (도 5).

실시예 4. 수은 이외 다른 신장독성 유발 물질(카드뮴, 시스플라틴 )에 의한 신규 바이오마커의 예측력 평가

본 발명에서 발굴한 바이오마커 AKR7A1 및 GSTP1 이, 수은 뿐 아니라, 신장독성 유발이 크게 문제시되고 있는 중금속 다른 종인 카드뮴, 및 의약품 중 신장 독성이 문제시되는 시스플라틴에 대한 신장 독성 평가에도 사용될 수 있는지를 확인해보았다. 우선, 랫트 유래 신장 세뇨관 세포주 NRK52E 에 카드뮴 및 시스플라틴에 각각 노출시킨 후, 실시예 3에서 기재한 바와 같은 MTT assay 를 통하여 세포 독성을 평가한 결과, 카드뮴 및 시스플라틴 모두 노출량에 비례하여 신장 세포 독성이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 6 및 도 8). 아울러, 이는 신규 바이오마커 AKR7A1 및 GSTP1의 mRNA 변화량에 민감하게 반영됨을 확인할 수 있었고, 이는 종래 알려진 신장 독성 평가용 바이오마커인 Kim1, Spp1, TIMP1, Lcn2 보다도 민감성이 월등히 높음을 확인할 수 있었다 (도 7 및 도 9).

종합적으로, 본 발명에서는 Akr7a1 및 GSTP1 를 신장 독성을 예측하기 위한 지표로 발굴하였다. 신장 세뇨관 세포를 활용한 실험에서 이들 두 바이오마커는 신장 세포 독성과 이들 바이오마커의 발현량이 잘 일치하여 탁월한 예측력을 보였다. 따라서, 이를 활용하여 의약품 및 환경물질 등의 신장 독성 가능성을 예측하고 평가하는 데에 기여할 수 있다.

<110> INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION HANYANG UNIVERSITY ERICA CAMPUS <120> Biomarker AKR7A1 for detecting nephrotoxicity and method for detecting nephrotoxicity using the same <130> DPP20134361KR <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for 18s rRNA <400> 1 gtaacccgtt gaaccccatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for 18s rRNA <400> 2 ccatccaatc ggtagtagcg 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KIM1 <400> 3 tggcactgtg acatcctcag a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for KIM1 <400> 4 gcaacggaca tgccaacata 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Spp1 <400> 5 gatcgatagt gccgagaagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Spp1 <400> 6 tgaaactcgt ggctctgatg 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TMP1 <400> 7 acagctttct gcaactcg 18 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TMP1 <400> 8 ctataggtct ttacgaaggc c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Lcn2 <400> 9 gattcgtcag ctttgccaag t 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Lcn2 <400> 10 cattggtcgg tgggaacag 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for AKR7A1 <400> 11 atttgtaccc tctgcaagaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for AKR7A1 <400> 12 ttgaaggcgt agaaccttag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GSTP1 <400> 13 gctcaagtcc acttgtctgt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GSTP1 <400> 14 caagatggca ttagattggt 20

Claims (13)

1. AKR7A1 (Aldo-keto reductase family 7, member A1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장독성 평가용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, GSTP1(glutathione s-transferase pi 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는, 신장독성 평가용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, ACO2 (Aconitase 2, mitochondrial precursor), PEPD (Xaa-Pro dipeptidase), SPTAN (Nonerythroid alpha-spectrin), ACO1 (Aconitase 1), SELENBP1 (Selenium binding protein 1), ALDH9A1 (Aldehyde dehydrogenase 9A1), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), GDI1 (GDP dissociation inhibitor 1), GSTA3 (Glutathione S-transferase alpha-3), GLG1 (Golgi apparatus protein 1 precursor), SPNA2 (Alpha-spectrin 2), SELENBP2 (Selenium binding protein 1), CCT2 (T-complex protein 1 subunit beta), AKR1B8 (Aldo-keto reductase family 1, member B8), PSMC2 (Proteasome 26S subunit, ATPase 2) 및 GDI2 (GDP dissociation inhibitor 2) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는, 신장독성 평가용 조성물.
   
4. 제1항에서, 상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 해당 단백질에 특이적인 항체인 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 AKR7A1 및 GSTP1 의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 신장독성은 중금속 또는 약물에 의한 신장독성인 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 신장독성 평가용 키트.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
   
9. 신장독성을 평가하는 데 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 AKR7A1 (Aldo-keto reductase family 7, member A1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 개체의 시료로부터 GSTP1(glutathione s-transferase pi 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 개체의 시료로부터 ACO2 (Aconitase 2, mitochondrial precursor), PEPD (Xaa-Pro dipeptidase), SPTAN (Nonerythroid alpha-spectrin), ACO1 (Aconitase 1), SELENBP1 (Selenium binding protein 1), ALDH9A1 (Aldehyde dehydrogenase 9A1), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), GDI1 (GDP dissociation inhibitor 1), GSTA3 (Glutathione S-transferase alpha-3), GLG1 (Golgi apparatus protein 1 precursor), SPNA2 (Alpha-spectrin 2), SELENBP2 (Selenium binding protein 1), CCT2 (T-complex protein 1 subunit beta), AKR1B8 (Aldo-keto reductase family 1, member B8), PSMC2 (Proteasome 26S subunit, ATPase 2) 및 GDI2 (GDP dissociation inhibitor 2) 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA를 검출하여 그 발현수준을 정상 대조구 시료의 해당 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 의 발현수준과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 단백질의 검출은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용한 항원-항체 반응에 의해 수행되는 것인 방법.

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