WO2000056921A2 - Nukleinsäurekombination - Google Patents

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WO2000056921A2
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Udo Seedorf
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Paul Cullen
Udo Seedorf
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the invention relates to a nucleic acid combination and a method for hybridizing, in particular for identifying nucleic acids.
  • Hybridization techniques ie the targeted attachment of two complementary nucleic acids to one another, represent an essential step in a large number of molecular biological processes. These techniques are used to detect individual genes or parts thereof in a preparation of genomic DNA or the transcription product of a gene (mRNA) [Sambrook, J. , Fritsch, EF, Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2 ⁇ d ed., Vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C. Gillespie, D .: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques.
  • hybridizations are used in genome analysis to determine and characterize the activity or changes in individual genes or to study mutations. They can also use the early detection of cancer, the genetic risk enable co-assessment of common diseases, such as diabetes or hypertension, and serve to predict the development of coronary heart disease [Ausubel, FM; Brent, R., Kingston, RE, Moore, DE, Seidman, JG, Smith, JA, Struhl, K. (ed.) Current protocols in molecular biology, 1998, John Wiley & Sons].
  • Hybridization is usually combined with a detection reaction and subsequent identification of a nucleic acid sequence.
  • one strand of nucleic acid is marked, for example, by dyes, radioactivity or chemiluminescent or fluorescent molecules, while the second is bound to a solid phase.
  • the solid phase is mostly formed by either nitrocellulose or nylon membranes.
  • genomic DNA or RNA the so-called target sequences
  • target sequences are electrophoretically separated using an agarose gel, transferred to the nitro or nylon membrane and hybridized with a known DNA or RNA sequence as a probe.
  • the hybridization is detected by prior marking of the probe and quantified if necessary.
  • Hybridization of a probe with a target can now also be carried out using so-called gene chips [Lockhart, DJ., Dong, H., Byrne, MC, Follettie, MT, Gallo, MV, Chee, MS, Mittmann, M., Wang C, Kobayashi , M., Horton, H. and Brown, EL Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays. Nature Biotechnology. 14: 1675-1680, 1996; Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, MH, and Lockhart, DJ. Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae. Nature Biotechnology.
  • Gene chips consist of a solid support made of, for example, a plastic or glass, on which up to several thousand short oligonucleotides can be applied as probes.
  • the surface of the chip which is only a few square centimeters in size, is covered with a “lawn” of oligonucleotides with which the complementary nucleic acid sequences of a DANN or RNA sample can hybridize. These target sequences are marked beforehand in order to provide later detection of the hybridization.
  • gene chips enables the investigation of up to several thousand different sequences at the same time and thus represents an improvement over the conventional blot method. Furthermore, the hybridization on the chip can be evaluated by a scanner, so that the method is largely can be automated.
  • US Pat. No. 5,837,832 discloses a photo-lithographic process in which the light irradiating a carrier via a defined mask activates a functional group applied to this carrier and this activated group reacts with a nucleoside-forming unit, which in turn is a unit light-activated functional group. This process can be repeated any number of times. Depending on the design of the mask and the choice of nucleoside-forming units, a gene chip with a specific oligonucleotide pattern is created.
  • matrix-bound miniaturized polymer and oligomer libraries are produced by a multi-step synthesis provides by applying a microstructured stamp made of inert material to a substrate that carries a monolayer of a linker with terminally protected functional groups.
  • the stamp is first immersed in a reagent which releases the terminal protective groups, so that the functional groups thus released can subsequently react in a chain extension reaction with a monomer which is subsequently added.
  • nucleic acids, peptides, polysaccharides and other chemical compounds can be synthesized in this method.
  • Gene-specific chips such as e.g. a chip with the "breast cancer gene", BRCA-1 or the gene for the cythochrome p450, to diagnose a known genetic defect or to assess disease predisposition.
  • US Pat. No. 5,837,832 contains considerations for a gene chip which, in addition to known sequences, can also carry so-called combinatorial sequences (including oligonucleotide or nucleic acid combinations) of eight base pairs. These sequences are defined in that they are theoretically determined as possible combinations of the four starting bases adenine, guanine, cytosine and thymine and their analogues. They have not been determined experimentally. The function, regulation or localization of these sequences in the genome of an organism is generally unknown. Nevertheless, the hybridization experiments with these nucleic acid combinations, for example in the comparative analysis of genomes and expression patterns, the investigation of polymorphisms or mutations They are a suitable and important instrument. The particular advantage of combinatorial sequences is their universality, since they can be used equally for all living things.
  • sequence specificity is understood to mean hybridization with a specific sequence and thus the detection of a specific base sequence.
  • binding over a range of about 18 base pairs is required for a sufficiently stable hybridization.
  • the number of all possible combinations of an 18 bp long sequence of four bases is 4 18 and thus exceeds the space available on a chip by orders of magnitude.
  • a combinatorial sequence must therefore be long enough to ensure stable binding, but also short enough to accommodate all of its possible combinations on one gene chip.
  • gene specificity is understood to mean hybridization with a certain sequence on a gene or only a few genes and thus the detection of this gene or these genes. The same applies analogously to the specificity of the detection of certain mRNA species. This will be explained using an oligonucleotide combination of nine bases using the example of humans:
  • each of these 300,000 nonamers occurs between 100 and 1000 times in the human mRNA molecules. It follows that each Theoretically, nonamers can bind to about 500 to 5000 different mRNA species. However, this number is too large to allow the quantification of individual mRNA species and thus reasonable conclusions from a hybridization experiment.
  • the object of the invention is therefore to provide an oligonucleotide combination which enables a defined hybridization with a complementary nucleotide sequence.
  • nucleic acid combination which comprises a multiple sequence and a sequence which is complementary to at least one reference sequence.
  • a reference sequence is a known sequence.
  • the oligonucleotide combination is defined as any sequence of nucleotides which can be combined as a possible combination of the starting bases thymine, adenine, cytosine and guanine, and also their derivatives or analogs. Synthetic purines or pyrimidines can also be used.
  • the respective base pairing is stabilized by extending the combinatorial oligonucleotides with a sequence complementary to a reference sequence. Since all sequence combinations are coupled to only one sequence that is complementary to a reference sequence, the number of potential combinations of a selected n-mer does not increase despite the increase in sequence specificity, so that the difficulties associated with the limited space on a gene chip are avoided .
  • the extended oligonucleotide will also only bind to target sequences of the nucleotides which are complementary both to the combinatorial sequence and to the sequence complementary to the reference sequence (see FIG. 1).
  • the reference sequence can have any length and composition specified by the user. For the calculated human NEN 500 to 5000 mRNA species, which are potentially binding partners of a single combinatorial nonamer, thus considerably reduce the number of actual target sequences.
  • the coupling of a combinatorial oligonucleotide to a sequence complementary to a reference sequence thus also means an increase not only in the sequence but also in the gene specificity of the oligonucleotide probe.
  • the reference sequence of a nonamer can be formed, for example, by an oligoT sequence (see FIG. 2). It is known that the mRNA molecules of all eukaryotic organisms have a sequence of at least 10 adenine residues at their 3 'end.
  • the coupling of an oligoT sequence with a combinatorial nonamer thus enables stable hybridization with mRNA molecules.
  • hybridization can only be carried out with mRNA species which carry a complementary nonamer in the vicinity of the polyA sequence.
  • the presence of a particular nonamer in the vicinity of the PolyA sequence is estimated to be two orders of magnitude lower than the absolute frequency of this nonamer in the entire mRNA of a eukaryotic cell.
  • coupling to a PolyT sequence increases the gene specificity of the combinatorial oligonucleotide.
  • nucleic acids can be cut with a restriction enzyme in standard procedures, so that fragments with the recognition sequence of the restriction enzyme used are formed.
  • this recognition sequence can serve as a reference sequence and a sequence complementary thereto can be applied to a carrier. So this probe only comes with hybridize the n-mers of the target sequence which are adjacent to the recognition sequence of the respective restriction enzyme. These can then be detected and quantified.
  • any other reference sequences e.g. also arbitrarily selected sequences or conserved sequences, e.g. Polyadenylation signals or the Kozak sequence (see Fig. 3) possible. Any mixtures of different reference sequences can also be used for corresponding problems (see FIG. 4).
  • the gene specificity of this probe is then increased again. However, the increase in gene specificity can be achieved simply by coupling the combinatorial oligonucleotides to one or two specific bases.
  • a gene chip with the nucleotide sequences according to the invention has multiple uses. So he can e.g. be used in comparative genome analysis, the study of gene expressions or in DNA fingerprinting.
  • the nucleic acid combination according to the invention can be applied, for example, to supports made of glass coated with gold.
  • the carrier material can also consist of polystyrene or latex beads, which have an iron core.
  • Example 1 Coupling an OligoT sequence to a combinatorial nonamer.
  • the combinatorial oligonucleotides coupled with an OligoT sequence are applied using standard techniques (DE 196 12 356; US 5 837 832) to a suitable support made of glass coated with gold.
  • the carrier is divided into square fields with an edge length of 500 ⁇ m.
  • the oligonucleotide probes are applied to the carrier in such a way that there is only one variant of the oligonucleotide in each of the individual fields.
  • there are 4 9 262 144 fields, field 1, 1, for example, carrying a nucleic acid of the sequence T n ACGTGTACT, field 1, 2 carrying the sequence T n ACGTGTACA etc.
  • T n stands for the coupled constant sequence.
  • Each of the fields of the support thus contains a nonamer with the general formula T n X 1 X 2 X 3 X 4 X 5 X 6 X 7 X 8 X 9 (X n is an arbitrary component of the nucleic acids, adenine , Guanine, cytosine, thymidine).
  • the polyadenylated mRNA is isolated from eukaryotic cells or tissues by binding to an oligoT matrix. With the help of an oligoT primer that is linked to a T7 RNA polymerase promoter sequence, the representative cDNA molecules are produced from the RNA by reverse transcription. CRNA molecules are synthesized from the cDNA molecules in the presence of a biotin-labeled nucleoside triphosphate by an / n- ⁇ ro transcription with a T7 RNA polymerase.
  • biotin-labeled cRNA molecules obtained in this way are taken up in a hybridization buffer (0.5 M Na phosphate; pH 7.2; 7% sodium lauryl sulfate; 0.5% bovine serum albumin; 1 mM EDTA).
  • a hybridization buffer 0.5 M Na phosphate; pH 7.2; 7% sodium lauryl sulfate; 0.5% bovine serum albumin; 1 mM EDTA.
  • Hybridization The carrier is overlaid with the hybridization solution and incubated at 42 ° C. Unbound nucleic acids of the probe solution are removed by repeated washing with a washing solution prewarmed to 50 ° C. (0.1 M (Na) phosphate, pH 7.2, 1% sodium lauryl sulfate, 1 mM EDTA).
  • the washed supports are incubated for 10 min at 25 ° C. with a solution of a streptavidin-phycoerythrin conjugate and then washed several times at 25 ° C. and 30 ° C.
  • the detection is done by measuring the fluorescence zenzemission after excitation of phycoerythrin by a suitable laser and a suitable detection system.
  • Example 2 Coupling of a sequence complementary to the Sau 3AI recognition sequence to a combinatorial nonamer.
  • a sequence complementary to the recognition sequence of the restriction enzyme Sau 3AI is coupled to the combinatorial nonamer.
  • the RNA is digested with RNase according to the prior art.
  • the single-stranded, representative biotin-labeled DNA molecules obtained in this way are incubated with the restriction enzyme Sau 3AI (recognition sequence GATC, cleavage of the nucleic acid before the 5 'end) at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Sau 3AI recognition sequence GATC, cleavage of the nucleic acid before the 5 'end
  • Example 3 Coupling a polyadenylation signal to a combinatorial nonamer
  • the conserved sequence of the polyadenylation signal is coupled to the nonameric oligonucleotide.
  • the RNA is transcribed into the representative cDNA using a primer of the type X ⁇ yXyXyTATT in the presence of a biotin-labeled nucleoside triphosphate.
  • the labeled cDNA is used as a probe in the hybridization solution.
  • Fig. 1 Principle of the gene chip with an extended by a reference sequence oligonucleotide using the example of a nonamer.
  • the figure shows the general principle of a composition applied to a support, consisting of a sequence complementary to a reference sequence and a combinatorial nucleotide sequence.
  • a combinatorial nonamer is shown here - but other lengths are also conceivable.
  • the reference sequence can have any composition and length specified by the user. As a rule, these will be conserved, frequently occurring or existing sequences in any DNA or RNA.
  • the application of the chip is based on
  • Hybridization of the oligomers applied to the support with isolated, synthetic or amplified nucleic acids the complementary sequences of the nucleic acids hybridize specifically with the oligomers of the carrier.
  • sequence specificity required for this is achieved by combining the reference sequence and a combinatorial sequence with 4 9 possible oligomer combinations.
  • T thymidine
  • Xn any sequence of the nucleic acid sequence of the RNA.

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Abstract

Eine Nukleinsäurekombination wird an eine zu mindestens einer Referenzsequenz komplementäre Nukleotidsequenz gekoppelt.

Description

"Nukleinsäurekombination"
Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäurekombination und ein Verfahren zum Hybridisieren, insbesondere zum Identifizieren von Nukleinsäuren.
Hybridisierungstechniken, d.h. die gezielte Anlagerung zweier komplementärer Nukleinsäuren aneinander, stellen einen wesentlichen Schritt in einer Vielzahl molekularbiologischer Verfahren dar. Mit diesen Techniken werden einzelne Gene oder Teile davon in einer Präparation genomischer DNA oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen [Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2πd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C. Gillespie, D.: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger, S.R. and Kimmel, A.R., Academic Press Inc., San Diego: Methods in Enzy- mology 1987, 152: p582-87; Schena, M. et al.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995;270: p467-470].
So werden Hybridisierungen beispielsweise in der Genomanalyse zur Bestimmung und Charakterisierung der Aktivität oder Veränderungen einzelner Gene oder der Untersuchungen von Mutationen eingesetzt. Ebenso können sie die Früherkennung von Krebserkrankungen, die genetische Risi- koabschätzung bei Volkskrankheiten, wie beispielsweise Diabetes oder Hypertonie ermöglichen, sowie der Voraussage für die Entstehung der koro- naren Herzerkrankung dienen [Ausubel, F.M.; Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.E., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. (Hrsg.) Current protocols in molecular biology, 1998, John Wiley & Sons].
Üblicherweise wird eine Hybridisierung mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz kombiniert. Dazu wird ein Nukleinsäurestrang beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemolumineszierende oder fluoreszierende Moleküle markiert, während der zweite an einer festen Phase gebunden ist. In den häufig angewandten Southern-Blots für DNA-Analysen und Northern-Blots für RNA- Analysen wird die feste Phase meist entweder von Nitrozellulose- oder Nylonmembranen gebildet.
In diesen herkömmlichen Blot-Systemen wird genomische DNA oder RNA, die sogenannten Targetsequenzen, über ein Agarosegel elektrophoretisch getrennt, auf die Nitro- oder Nylonmembran transferiert und mit einer bekannten DNA- bzw. RNA-Sequenz als Sonde hybridisiert. Die Hybridisie- rung wird durch eine vorherige Markierung der Sonde nachgewiesen und ggf. quantifiziert. Diese Verfahren sind durch eine hohe Spezifität gekennzeichnet. Sie besitzen aber den Nachteil, daß die Durchführung eines Blot- vorgangs sehr arbeits- und zeitintensiv ist, und in einem Durchgang jeweils nur wenige Sequenzen gleichzeitig untersucht werden können.
Das Hybridisieren einer Sonde mit einem Target kann neuerdings auch durch sogenannte Genchips erfolgen [Lockhart, DJ., Dong, H., Byrne, M.C., Follettie, M.T., Gallo, M.V., Chee, M.S., Mittmann, M., Wang C, Kobayashi, M., Horton, H. and Brown, E.L. Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oligonucleotide Arrays. Nature Biotechnology. 14:1675-1680, 1996; Wodicka, L., Dong, H., Mittmann, M., Ho, M.H., and Lockhart, DJ. Genome-Wide Expression Monitoring in Saccharomyces Cerevisiae. Nature Biotechnology. 15:1359-1367,1997]. Genchips bestehen aus einem festen Träger aus beispielsweise einem Kunstoff oder Glas, auf den bis zu mehrere tausend kurze Oligonukleotide als Sonden aufgebracht werden können. So wird die Oberfläche des nur wenige Quadratzentimeter großen Chips mit einem „Rasen,, von Oligonukleotide bedeckt, mit denen die komplementären Nukleinsäuresequenzen einer DANN- oder RNA-Probe hybridisieren können. Diese Targetsequenzen werden zuvor markiert, um den späteren Nachweis der Hybridisierung zu erbringen.
Die Verwendung von Genchips erlaubt die Untersuchung von bis zu mehreren tausend verschiedenen Sequenzen zur gleichen Zeit und stellt gegen- über den herkömmlichen Blot-Verfahren somit eine Verbesserung dar. Weiterhin kann die Hybridisierung auf dem Chip über einen Scanner ausgewertet werden, so daß das Verfahren weitgehend automatisiert werden kann.
Für die Herstellung von Genchips sind verschiedene Techniken entwickelt worden, beispielsweise lithographische Verfahren, Siebdruck- oder Reaktionskanalverfahren, elektrochemische/-synthetische Verfahren, ink-jet- Systeme, micropin-Verfahren, open capillary tips. Auch wird die Verwendung von Microbeads beschrieben [Lackner, K.J. et al. Multiplex DNA- und RNA- Analyse an fluoreszenten Microbeads als Alternative zum DNA-Array. Sta- tusseminar Chiptechnologie für DNA-Diagnostik und Sequenzanalyse in Deutschland. DECHEMA 1999].
Die US-Patentschrift 5 837 832 offenbart ein photo-lithographisches Verfahren, bei dem das über eine definierte Maske auf einen Träger einstrahlende Licht eine auf diesem Träger aufgebrachte funktionelle Gruppe aktiviert und diese aktivierte Gruppe mit einer nukleosid-bildenden Einheit reagiert, die ihrerseits wiederum eine licht-aktivierte funktionelle Gruppe trägt. Dieser Vorgang kann beliebig wiederholt werden. In Abhängigkeit von der Gestaltung der Maske und der Wahl der nukleosid-bildenden Einheiten entsteht ein Genchip mit einem bestimmten Oligonukleotidmuster.
Ein anderes Verfahren ist in der deutschen Offenlegungsschrift 195 43 232 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden matrix-gebundene miniaturisierte Polymer- und Oligomerbibliotheken durch eine Mehrschrittsynthese herge- stellt, indem ein mit einer Mikrostrukturierung versehener Stempel aus inertem Material auf ein Substrat aufgebracht wird, das eine Monoschicht aus einem Linker mit terminal geschützten funktioneilen Gruppen trägt. Zuvor wird der Stempel in ein die terminalen Schutzgruppen befreiendes Reagenz getaucht, so daß im folgenden die so freigesetzten funktionellen Gruppen mit einem im weiteren hinzugefügten Monomer in einer Kettenverlängerungsreaktion reagieren können. Je nach Wahl der durch den Synthesealgorithmus vorbestimmten Mikrostrukturierung des Stempels und der eingesetzten Monomere können in diesem Verfahren Nukleinsäuren, Peptide, Polysac- charide und andere chemische Verbindungen synthetisiert werden.
Herkömmlicherweise werden auf einen Genchip bekannte Nukleotidsequen- zen aufgebracht. Besonders bedeutsam sind dabei genspezifische Chips, wie z.B. ein Chip mit dem „Brustkrebsgen,, BRCA-1 oder dem Gen für das Cythochrome p450, um einen bekannten genetischen Defekt zu diagnostizieren oder eine Krankheitsdisposition abzuschätzen.
Die Verwendung der Genchips in dieser Form der Diagnostik und Prediktion ist begrenzt, da dafür die Kenntnis der krankheitsrelevanten spezifischen Nukleinsäuresequenzen erforderlich ist. Bisher ist aber nur eine geringer Teil der genetischen Information vieler Organismen sequenziert und einer Funktion zugeordnet.
Die US-Patentschrift 5 837 832 enthält Überlegungen zu einem Genchip, der neben bekannten Sequenzen auch sog. kombinatorische Sequenzen (auch Oligonukleotid- oder Nukleinsäurekombination) aus acht Basenpaaren tragen kann. Dabei sind diese Sequenzen dadurch definiert, daß sie theoretisch als Kombinationsmöglichkeiten der vier Ausgangsbasen Adenin, Gua- nin, Cytosin und Thymin und deren Analoga bestimmt sind. Sie sind nicht experimentell ermittelt. Auch ist die Funktion, Regulation oder Lokalisation dieser Sequenzen im Genom eines Organismus in der Regel unbekannt. Dennoch stellen die Hybridisierungsversuche mit diesen Nukleinsäurekom- binationen beispielsweise bei der vergleichenden Analyse von Genomen und Expressionsmustern, der Untersuchung von Polymorphismen oder Mutatio- nen ein geeignetes und wichtiges Instrument dar. Der besondere Vorteil kombinatorischer Sequenzen besteht zudem in ihrer Universalität, da sie für alle Lebewesen gleichermaßen zu verwenden sind.
Die in der US-Patentschrift 5 837 832 theoretisch offenbarten kombinatorischen Oktamere haben jedoch in der Praxis eine nur geringe Bedeutung, da ihre Länge nicht ausreicht, um eine stabile Bindung mit einer komplementären zweiten Nukleinsäure zu gewährleisten. Ist die Bindung nicht ausreichend stabil, ist die Sequenz-Spezifität der Hybridisierungsreaktion zu gering. Dabei wird hier unter Sequenz-Spezifität das Hybridisieren mit einer bestimmten Sequenz und damit der Nachweis einer bestimmten Basenfolge verstanden. Für eine ausreichend stabile Hybridisierung ist bekanntermaßen eine Bindung über einen Bereich von etwa 18 Basenpaaren erforderlich. Die Anzahl aller Kombinationsmöglichkeiten einer 18 bp langen Sequenz von vier Basen liegt aber bei 418 und übersteigt damit um Größenordnungen den auf einem Chip zur Verfügung stehenden Raum. Somit muß eine kombinatorische Sequenz lang genug sein, um eine stabile Bindung zu gewährleisten, aber auch kurz genug, um alle ihre Kombinationsmöglichkeiten auf einem Genchip Platz finden zu lassen.
Ein weiteres Problem liegt in der mangelnden Gen-Spezifität eines nur wenige bp langen Oligonukleotids. Dabei wird unter der Gen-Spezifität das Hybridisieren mit einer bestimmten Sequenz auf einem Gen oder nur wenigen Gene und damit der Nachweis dieses Gens bzw. dieser Gene verstan- den. Analoges gilt für die Spezifität des Nachweises bestimmter mRNA-Spe- zies. Dies soll anhand einer Oligonukleotikombination aus neun Basen am Beispiel des Menschen erläutert werden:
Auf einer Strecke von neun Basen sind 49 = 262 144 (zur Vereinfachung etwa 300000) verschiedene Kombinationen möglich. Die Länge des kodierenden Anteils des menschlichen Genoms liegt etwa bei 3 *107 bis 3 * 108 Basen. Diese verteilen sich auf etwa 50000 mRNA-Spezies. Rechnerisch kommt jedes dieser 300000 Nonamer folglich zwischen 100- und 1000-mal in den mRNA-Molekülen des Menschen vor. Hieraus ergibt sich, daß jedes Nonamere theoretisch an etwa 500 bis 5000 verschiedene mRNA-Spezies binden kann. Diese Anzahl ist jedoch zu groß, um die Quantifizierung einzelner mRNA-Spezies und somit sinnvolle Schlußfolgerungen aus einem Hybri- disierungsversuch zu erlauben.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Oligonukleotidkombination bereitzustellen, die eine definierte Hybridisierung mit einer komplementären Nukleotidsequenz ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst mit einer Nukleinsäurekombination, die eine n- mere Sequenz und mindestens zu einer Referenzsequenz komplementären Sequenz umfaßt.
Dabei handelt es sich bei einer Referenzsequenz um eine bekannte Sequenz. Die Oligonukleotidkombination ist definiert als eine beliebige Folge von Nukleotiden, die sich als Kombinationsmöglichkeit der Ausgangsbasen Thymin, Adenin, Cytosin und Guanin, auch deren Derivate oder Analoga können enthalten sein. Auch können synthetische Purine oder Pyrimidine verwendet werden.
Durch die Verlängerung der kombinatorischen Oligonukleotide mit einer zu einer Referenzsequenz komplementären Sequenz wird die jeweilige Basenpaarung stabilisiert. Da alle Sequenzkombinationen an nur eine zu einer Referenzsequenz komplementären Sequenz gekoppelt sind, nimmt die Anzahl der potentiellen Kombinationen eines gewählten n-Mers trotz der Erhöhung der Sequenz-Spezifität nicht zu, so daß die Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem limitierten Raum auf einem Genchip vermieden werden.
Das verlängerte Oligonukleotid wird ferner nur an Targetsequenzen der Nukleotide binden, die sowohl zu der kombinatorischen Sequenz als auch zu der zu der Referenzsequenz komplementär Sequenz komplementär sind (siehe Fig. 1). Die Referenzsequenz kann jede von dem Anwender vorgegebene Länge und Zusammensetzung aufweisen. Für die errechneten huma- nen 500 bis 5000 mRNA-Spezies, die als Bindungspartner eines einzigen kombinatorischen Nonamers potentiell in Frage kommen, reduziert sich damit die Anzahl tatsächlicher Targetsequenzen erheblich. Die Kopplung eines kombinatorischen Oligonukleotids an eine zu einer Referenzsequenz komplementären Sequenz bedeutet somit auch eine Erhöhung nicht nur der Sequenz- sondern auch der Genspezifität der Oligonukleotid-Sonde. Diese reicht bereits bei kurzen n-Meren aus, z.B. bei Genexpressionsanalysen, die differentiell exprimierten Gensequenzen anhand der Sequenz auf dem Chip identifizieren und daher sequenzieren zu können. Dies ist aber nur möglich, wenn die Zahl der zu sequenzierenden Nukleinsäuren durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Oligonukleotids überschaubar wird (z.B. weniger als 50).
Die Referenzsequenz eines Nonamers kann beispielsweise von einer oligoT- Sequenz gebildet werden (siehe Fig. 2). Es ist bekannt, daß die mRNA- Moleküle aller eukaryontischen Organismen an ihrem 3'-Ende eine Sequenz von mindestens 10 Adeninresten tragen. Die Kopplung einer oligoT-Sequenz mit einem kombinatorischen Nonamer erlaubt somit eine stabile Hybridisierung mit mRNA-Molekülen. Außerdem kann die Hybridisierung nur mit mRNA-Spezies erfolgen, die in Nachbarschaft zu der PolyA-Sequenz ein komplementäres Nonamer tragen. Das Vorkommen eines bestimmten Nonamers in Nachbarschaft zur PolyA-Sequenz liegt schätzungsweise um zwei Größenordnungen niedriger als die absolute Häufigkeit dieses Nonamers in der gesamten mRNA einer eukaryontischen Zelle. Somit erhöht die Kopplung an eine PolyT-Sequenz die Gen-Spezifität des kombinatorischen Oligonukleotids.
Die Verlängerung kombinatorischer n-Mere mittels Sequenzen, die zu anderen Referenzsequenzen komplementär sind, ist ebenfalls möglich. Nuklein- säuren können in Standardverfahren mit einem Restriktionsenzym geschnitten werden, so daß Fragmente mit der Erkennungssequenz des verwendeten Restriktionsenzyms entstehen. Erfindungsgemäß kann diese Erkennungssequenz als Referenzsequenz dienen, und eine dazu komplementäre Sequenz auf einen Träger aufgebracht werden. So wird diese Sonde nur mit den n-Meren der Targetsequenz hybridisieren, die zu der Erkennungssequenz des jeweiligen Restriktionsenzyms benachbart liegen. Diese können im weiteren detektiert und quantifiziert werden.
Ebenso ist nach dem gleichen Prinzip die Verwendung beliebig anderer Referenzsequenzen, z.B. auch willkürlich ausgewählter Sequenzen oder konservierter Sequenzen, wie z.B. Polyadenylierungssignale oder die Kozak- Sequenz (siehe Fig. 3) möglich. Beliebige Mischungen verschiedener Referenzsequenzen können für entsprechende Problemstellungen ebenfalls ver- wendet werden (siehe Fig. 4). Die Gen-Spezifität dieser Sonde ist dann nochmals erhöht. Die Erhöhung der Gen-Spezifität läßt sich allerdings schon allein durch die Kopplung der kombinatorischen Oligonukleotide an eine oder zwei bestimmte Basen erreichen.
Ein Genchip mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen hat vielfache Verwendungsmöglichkeiten. So kann er z.B. in der vergleichenden Genomanalyse, der Untersuchung von Genexpressionen oder bei dem DNA- Fingerprinting eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäurekombination kann beispielsweise an Träger aus mit Gold beschichtetem Glas aufgebracht werden. Das Trägermaterial kann auch aus Polystyrol- oder Latexkügelchen bestehen, die einen Eisenkern aufweisen.
Im folgenden wird die Erfindung anhand verschiedener Ausführungsbeispiele erläutert.
Beispiel 1 : Kopplung einer OligoT-Sequenz an ein kombinatorisches Nonamer.
Vorbereitung des Trägers
Die mit einer OligoT-Sequenz gekoppelten kombinatorischen Oligonukleotide werden mit Hilfe von Standardtechniken (DE 196 12 356; US 5 837 832) auf einen geeigneten Träger aus mit Gold beschichtetem Glas aufgebracht. Dabei ist der Träger in quadratische Felder mit einer Kantenlänge von 500 μm eingeteilt. Die Oligonukleotidsonden werden so auf dem Träger aufgebracht, daß sich auf den einzelnen Feldern jeweils nur eine Variante der Oligonukleotide befindet. Bei einem Nonamer ergeben sich 49= 262 144 Felder, wobei z.B. das Feld 1 ,1 eine Nukleinsäure der Sequenz TnACGTGTACT, das Feld 1 ,2 mit der Sequenz TnACGTGTACA etc. trägt. Tn steht dabei für die gekoppelte konstante Sequenz. Somit befindet sich auf jedem der Felder des Trägers jeweils ein Nonamer mit der allgemeinen Formel TnX1X2X3X4X5X6X7X8X9 (Xn ist dabei ein beliebiger Baustein der Nukleinsäu- ren, Adenin, Guanin, Cytosin, Thymidin).
Vorbereitung der Sondenlösung
Aus eukaryotischen Zellen oder Geweben wird mit Hilfe von Standardverfahren die polyadenylierte mRNA durch Bindung an eine oligoT-Matrix isoliert. Mit Hilfe eines oligoT-Primers, der mit einer T7-RNA-Polymerase-Promotor- Sequenz verknüpft ist, werden aus der RNA die repräsentativen cDNA-Mole- küle durch reverse Transkription hergestellt. Durch eine /n- ϊro-Transkription mit einer T7-RNA-Polymerase werden aus den cDNA-Molekülen in Gegenwart eines biotinmarkierten Nukleosidtriphosphats cRNA-Moleküle syntheti- siert. Die so erhaltenen biotin-markierten cRNA-Moleküle werden in einem Hybridisierungspuffer (0,5 M NaPhosphat; pH 7,2; 7% Natriumlaurylsulfat; 0,5% Rinderserum-Albumin; 1 mM EDTA) aufgenommen.
Hybridisierung Der Träger wird mit der Hybridisierungslösung überschichtet und bei 42°C inkubiert. Nicht gebundene Nukleinsäuren der Sondenlösung werden durch mehrmaliges Waschen mit einer auf 50°C vorgewärmten Waschlösung (0,1 M (Na-)Phosphat, pH 7,2, 1 % Natriumlaurylsulfat, 1 mM EDTA) entfernt.
Markierung und Detektion
Die gewaschenen Träger werden für 10 min bei 25°C mit einer Lösung eines Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugats inkubiert und danach mehrfach bei 25°C und 30°C gewaschen. Die Detektion erfolgt über Messung der Fluores- zenzemission nach Anregung des Phycoerythrins durch einen geeigneten Laser und ein geeignetes Detektionssystem.
Beispiel 2: Kopplung einer zu der Sau 3AI Erkennungssequenz komplementären Sequenz an ein kombinatorisches Nonamer.
Bei der Vorbereitung des Trägers wird eine zu der Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms Sau 3AI komplementäre Sequenz an das kombinatorische Nonamer gekoppelt.
Nach der Synthese der cDNA-Moleküle durch reverse Transkription mit einem einfachen oligoT-Primer und in Gegenwart eines biotinmarkierten Nukleosidtriphosphats wird die RNA nach dem Stand der Technik mit RNase verdaut. Die so erhaltenen einzelsträngigen, repräsentativen biotinmarkierten DNA-Moleküle werden mit dem Restriktionsenzym Sau 3AI (Erkennungsequenz GATC, Spaltung der Nukleinsäure vor dem 5'-Ende) bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Anstelle der markierten cRNA aus Beispiel 1 wird die markierte restriktionsverdaute DNA in den Hybridisierungspuffer gegeben.
Beispiel 3: Kopplung eines Polyadenylierungssignals an ein kombinatorisches Nonamer
In Abweichung zu Beispiel 1 werden folgende Änderungen vorgenommen:
Als zu der Referenzsequnez komplementäre Sequenz wird die konservierte Sequenz des Polyadenylierungssignals an das nonamere Oligonukleotid gekoppelt. Die RNA wird mit Hilfe eines Primers der Art X^yXyXyTATT in Gegenwart eines biotinmarkierten Nukleosidtriphosphats in die repräsenta- tive cDNA umgeschrieben. Die markierte cDNA wird als Sonde in der Hybridisierungslösung eingesetzt.
Fig. 1 Prinzip des Genchips mit einem durch eine Referenzsequenz verlängerten Oligonukleotid am Beispiel eines Nonamers . Die Abbildung zeigt das allgemeine Prinzip einer auf einen Träger aufgebrachten Zusammensetzung aus einer zu einer Referenzsequenz komplementären Sequenz und einer kombinatorischen Nukleotidsequenz. Hier wird ein kombinatorisches Nonamer dargestellt - aber auch andere Längen sind denkbar. Die Referenzsequenz kann prinzipiell jede vom Anwender vorgegebene Zusammensetzung und Länge haben. In der Regel wird es sich dabei um konservierte, häufig vorkommende oder in jeder DNA bzw. RNA vorhan- dene Sequenzen handeln. Die Anwendung des Chips beruht auf
Hybridisierung der auf dem Träger aufgebrachten Oligomere mit isolierten, synthetischen oder amplifizierten Nukleinsäuren. Bei diesem Vorgang hybridisieren die komplementären Sequenzen der Nukleinsäuren spezifisch mit den Oligomeren des Trägers. Die dazu not- wendige Sequenz-Spezifität wird durch Kombination der Referenzsequenz und einer kombinatorischen Sequenz mit 49 möglichen Oli- gomerkombinationen erreicht.
Fig. 2 Beispiel eines Chips mit einem an eine OligoT-Sequenz gekoppelten kombinatorischen Oligonukleotid. Die Buchstaben stehen für die
Basen der Nukleinsäuren (A=Adenin, C=Cytosin, G=Guanin und T=Thymidin, Xn=beliebige Abfolge der Nukleinsäuresequenz der RNA). Ein derartiger Chip kann zu Expressionsuntersuchungen verwendet werden. Mit einer Kombination der oligomere, variablen Nonamersequenz und einer decameren oligo(T)-Sequenz ist eine spezifische Hybridisierung mit cDNAs bzw. amplifizierten cDNAs möglich. Die 49 möglichen Varianten der kombinatorischen noname- ren Sequenz erlauben das Erfassen und Quantifizieren des gesamten exprimierten Gen-Pools einer Zelle ohne die Kenntnis der Gen- Sequenzen. Im Anschluß an derartige Versuche ist eine Sequenzierung unbekannter RNAs mit Hilfe der kombinierten Oligomere als Sequenzierprimer möglich. Fig. 3 Genchip mit einem an einer zu der Kozak-Sequenz als Referenzsequenz komplementären Sequenz gekoppeltem nonameren kombinatorischen Oligonukleotid.
Fig. 4 Allgemeines Beispiel einer Kopplung von zwei zu verschiedenen Referensequenzen komplementären Sequenzen an eine kombinatorische Oligonukleotidsequenz.

Claims

Patentansprüche:
1. Nukleinsäurekombination mit Sequenzen, die eine n-Mere und eine zu mindestens einer Referenzsequenz komplementären Sequenz enthal- ten.
2. Nukleinsäurekombination nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine nonamere kombinatorische Nukleotidsequenz.
3. Nukleinsäurekombination nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren an einen Träger gebunden sind.
4. Nukleinsäurekombination nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus mit Gold beschichtetem Glas besteht. 5
5. Nukleinsäurekombination nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Polystyrol besteht.
6. Nukleinsäurekombination nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, o daß der Träger aus Latex besteht.
7. Nukleinsäurekombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenz die Kozak-Sequenz umfaßt.
5 8. Nukleinsäurekombination nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenz eine Plasmidsequenz umfaßt.
9. Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäuren mit einer 0 komplementären Nukleinsäurekombination hybridisiert werden, die eine zu mindestens einer Referenzsequenz komplementäre Sequenz umfaßt.
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